TW201429991A - Ｃｄｈ１９及ｃｄ３抗體構築體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種抗體構築體，其包含能夠結合於目標細胞表面上之人類CDH19的第一人類結合域及能夠結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結構域。此外，本發明係關於編碼該抗體構築體之核酸序列、包含該核酸序列之載體，及經該載體轉型或轉染之宿主細胞。此外，本發明係關於產生本發明之抗體構築體之方法、該抗體構築體之醫學用途，及包含該抗體構築體之套組。

Description

CDH19及CD3抗體構築體 相關申請案
本申請案係關於2013年3月15日提交(與本申請案在同一天提交)之題為「Antibodies targeting CDH19 for melanoma」之美國臨時申請案。此相關申請案以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於一種抗體構築體，其包含能夠結合於目標細胞表面上之人類CDH19的第一人類結合域及能夠結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結構域。此外，本發明提供編碼抗體構築體之核酸序列、包含該核酸序列之載體及經該載體轉型或轉染之宿主細胞。此外，本發明提供產生本發明之抗體構築體之方法、該抗體構築體之醫學用途及包含該抗體構築體之套組。
黑素瘤為由黑色素細胞(其為皮膚色素產生細胞)之致癌轉型引起的皮膚癌。至2009年為止，黑素瘤之發病率僅在美國便超過870,000例(美國國立衛生研究院(US National Institutes of Health))。每年，在美國診斷出超過75,000例新的黑素瘤病例，且約25%患者在診斷時患有晚期疾病。儘管原發性黑素瘤病例在足夠早的偵測到的情況下可藉由手術治癒，但在美國黑素瘤仍為由皮膚病引起之死亡的主要原因，在美國每年引起約10,000人死亡。一旦疾病擴散且變為轉移性，則預後較弱且5年相對存活率為15%。
存在四種基本類型的黑素瘤。在皮膚頂層中發現三種類型且第四種為侵襲性且更深地滲透至皮膚中且可擴散至身體之其他區域。
淺表性擴散黑素瘤為黑素瘤之最常見類型，其占所有病例之約70%。在更深入地滲透之前，其沿皮膚頂層生長極長的時間。其首先呈現為具有不規則邊界且形狀可能稍微不對稱的平坦或輕微凸起的變色斑塊。顏色可變化，且可發現棕褐色、棕色、黑色、紅色、藍色或白色區域。此類型之黑素瘤可出現於先前良性的黑痣中且最通常在年輕人群中發現。
惡性雀斑樣痣(Lentigo maligna)與淺表性擴散型類似，因此其亦在極長時間內保持接近於皮膚表面，且通常呈現為平坦或略微凸起的斑點狀棕褐色、棕色或深棕色變色。其最通常在老年人中發現。當此癌症變為侵襲性時，其稱為惡性雀斑樣痣黑素瘤(lentigo maligna melanoma)。
肢端雀斑樣痣黑素瘤(Acral lentiginous melanoma)亦在更深入地滲透之前進行淺表性擴散。不過其與其他黑素瘤顯著不同，因為其通常呈現為指甲下或腳掌或手掌上的黑色或棕色變色。此類型之黑素瘤有時可見於黑色皮膚人群中，且通常可比淺表性擴散黑素瘤及惡性雀斑樣痣更快地發展。
結節性黑素瘤通常在其首次診斷時便為侵襲性的。惡性腫瘤在其變為凸塊時被識別。其通常為黑色，但有時為藍色、灰色、白色、棕色、棕褐色、紅色或膚色。此為侵襲性最高之黑素瘤，且在10%至15%病例中發現。
轉移性黑素瘤之常用治療包括化學療法、用於合格患者之靶向療法(例如用於BRAF突變患者之BRAF抑制劑治療)及免疫療法。轉移性黑素瘤為這樣一種腫瘤類型：其中已證實免疫療法不僅可減緩疾病進程，且亦可引起晚期患者痊癒。1998年已批准將介白素-2用於轉移 性黑素瘤，且靶向CTLA4之抗體(新一代免疫檢查點抑制劑之成員)在2011年獲得FDA批准。
CDH19為功能未知的II型鈣黏素跨膜蛋白質。在2000年基於人類基因與CDH7之序列相似性而選殖人類基因(Kools,P.等人Genomics.2000)。自黑素細胞cDNA文庫分離針對CDH19之經表現之序列標籤(EST)，表明CDH19之表現可限於神經脊來源細胞(Kools,P.等人Genomics.2000)。支持此概念的是，發現大鼠CDH19在大鼠胚胎發育期間主要表現於神經節及神經鞘細胞(Schwann cell)中(Takahashi,M.及Osumi,O.Devl Dynamics.2005.)。
在西方墨點法(Western Blot)、免疫組織化學或流動式細胞測量術中偵測CDH19之診斷抗體在此項技術中已知且可商購。該等抗體包含動物宿主中產生之多株抗體及單株抗體。
本發明提供經分離之多特異性抗體構築體，其包含能夠結合於目標細胞表面上之人類CDH19的第一人類結合域及能夠結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結構域。
在本發明之抗體構築體之一個實施例中，第一結合域包含選自由以下組成之群之包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區：(a)如SEQ ID NO：52中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：54中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：222中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：84中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：252中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：84中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：927中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：909中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：927中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：52中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：54中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：926中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：52中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：904中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID 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在本發明之抗體構築體之另一實施例中，第一結合域包含選自由以下序列中所描繪之VH區組成之群的VH區(a)SEQ ID NO：362，SEQ ID NO：364，SEQ ID NO：485，SEQ ID NO：486，SEQ ID NO：487，SEQ ID NO：492，SEQ ID NO：493，SEQ ID NO：494，SEQ ID NO：495，SEQ ID NO：1133，SEQ ID NO：1172，SEQ ID NO：1341，SEQ ID NO：1354，SEQ ID NO：1367，SEQ ID NO：1432，SEQ ID NO：1445及SEQ ID NO：2174；(b)SEQ ID NO：342，SEQ ID NO：366，SEQ ID NO：370，SEQ ID NO：344，SEQ ID NO：372，SEQ ID NO：368，SEQ ID NO：496，SEQ ID NO：497，SEQ ID NO：498，SEQ ID NO：499，SEQ ID NO：500，SEQ ID NO：508，SEQ ID NO：509，SEQ ID NO：510，SEQ ID NO：511，SEQ ID NO：512，SEQ ID NO：519，SEQ ID NO：520，SEQ ID NO：521，SEQ ID NO：522，SEQ ID NO：523，SEQ ID NO：524，SEQ ID NO：525，SEQ ID NO：526，SEQ ID NO：527，SEQ ID NO：528，SEQ ID NO：529，SEQ ID NO：530，SEQ ID NO：531，SEQ ID NO：532，SEQ ID NO：533，SEQ ID NO：534，SEQ ID NO：535，SEQ ID NO：536，SEQ ID NO：537，SEQ ID NO：538，SEQ ID NO：1016，SEQ ID NO：1029，SEQ ID NO：1042，SEQ ID NO：1081，SEQ ID NO：1107，SEQ ID NO：1120，SEQ ID NO：1250，SEQ ID NO：1263，SEQ ID NO：1276，SEQ ID NO：1289，SEQ ID NO：1302，SEQ ID NO：1654，SEQ ID NO：1667，SEQ ID NO：1901，SEQ ID NO：1914，SEQ ID NO：1940，SEQ ID NO：1953，SEQ ID NO：1966，SEQ ID NO：1979，SEQ ID NO：1992，SEQ ID NO：2005，SEQ ID NO：2018，SEQ ID NO：2031，SEQ ID NO：2044及SEQ ID NO：2057；(c)SEQ ID NO：338，SEQ ID NO：354，SEQ ID NO：378，SEQ ID NO：356，SEQ ID NO：476，SEQ ID NO：477，SEQ ID NO：478，SEQ ID NO：479，SEQ ID NO：480，SEQ ID NO：481，SEQ ID NO：482，SEQ ID NO：483，SEQ ID NO：484，SEQ ID NO：501，SEQ ID NO：502，SEQ ID NO：503，SEQ ID NO：504，SEQ ID NO：505，SEQ ID NO：506，SEQ ID NO：517，SEQ ID NO：518，SEQ ID NO：1003，SEQ ID NO：1055，SEQ ID NO：1094，SEQ ID NO：1615，SEQ ID NO：1628，SEQ ID NO：1641，SEQ ID NO：1680，SEQ ID NO：1693，SEQ ID NO：1706，SEQ ID NO：1719，SEQ ID NO：1732，SEQ ID NO：1745，SEQ ID NO：1758，SEQ ID NO：1771及SEQ ID NO：1927；(d)SEQ ID NO：352，SEQ ID NO：360，SEQ ID NO：388，SEQ ID NO：386，SEQ ID NO：340，SEQ ID NO：346，SEQ ID NO：374，SEQ ID NO：348，SEQ ID NO：390，SEQ ID NO：463，SEQ ID NO：464，SEQ ID NO：465，SEQ ID NO：466，SEQ ID NO：467，SEQ ID NO：468，SEQ ID NO：469，SEQ ID NO：470，SEQ ID NO：471，SEQ ID NO：472，SEQ ID NO：473，SEQ ID NO：474，SEQ ID NO：475，SEQ ID NO：488，SEQ ID NO：489，SEQ ID NO：490，SEQ ID NO：491，SEQ ID NO：513，SEQ ID NO：514，SEQ ID NO：515，SEQ ID NO：516，SEQ ID NO：540，SEQ ID NO：541，SEQ ID NO：542，SEQ ID NO：543，SEQ ID NO：977，SEQ ID NO：1068，SEQ ID NO：1146，SEQ ID NO：1159，SEQ ID NO：1185，SEQ ID NO：1198，SEQ ID NO：1211，SEQ ID NO：1224，SEQ ID NO：1237，SEQ ID NO：1315，SEQ ID NO：1328，SEQ ID NO：1380，SEQ ID NO：1393，SEQ ID NO：1406，SEQ ID NO：1419，SEQ ID NO：1469，SEQ ID NO：1478，SEQ ID NO：1485，SEQ ID NO：1494，SEQ ID NO：1501，SEQ ID NO：1508，SEQ ID NO：1519，SEQ ID NO：1526，SEQ ID NO：1533，SEQ ID NO：1542，SEQ ID NO：1549，SEQ ID NO：1558，SEQ ID NO：1565，SEQ ID NO：1784，SEQ ID NO：1797，SEQ ID NO：1810，SEQ ID NO：1823，SEQ ID NO：1836，SEQ ID NO：1849，SEQ ID NO：1862，SEQ ID NO：1875，SEQ ID NO：1888，SEQ ID NO：2070，SEQ ID NO：2083，SEQ ID NO：2096，SEQ ID NO：2109，SEQ ID NO：2122，SEQ ID NO：2135，SEQ ID NO：2148，SEQ ID NO：2161，SEQ ID NO：2187，SEQ ID NO：2200及SEQ ID NO：2213；及(e)SEQ ID NO：376，SEQ ID NO：392，SEQ ID NO：358，SEQ ID NO：350，SEQ ID NO：507，SEQ ID NO：990，SEQ ID NO：1589及SEQ ID NO：1602。
在本發明之抗體構築體之另一實施例中，第一結合域包含選自由以下序列所描繪之VL區組成之群的VL區(a)SEQ ID NO：418，SEQ ID NO：420，SEQ ID NO：580，SEQ ID NO：581，SEQ ID NO：582，SEQ ID NO：587，SEQ ID NO：588，SEQ ID NO：589，SEQ ID NO：590，SEQ ID NO：1135，SEQ ID NO：1174，SEQ ID NO：1343，SEQ ID NO：1356，SEQ ID NO：1369，SEQ ID NO：1434，SEQ ID NO：1447及SEQ ID NO：2176；(b)SEQ ID NO：398，SEQ ID NO：422，SEQ ID NO：426，SEQ ID NO：400，SEQ ID NO：428，SEQ ID NO：424，SEQ ID NO：591，SEQ ID NO：592，SEQ ID NO：593，SEQ ID NO：594，SEQ ID NO：595，SEQ ID NO：603，SEQ ID NO：604，SEQ ID NO：605，SEQ ID NO：606，SEQ ID NO：607，SEQ ID NO：614，SEQ ID NO：615，SEQ ID NO：616，SEQ ID NO：617，SEQ ID NO：618，SEQ ID NO：619，SEQ ID NO：620，SEQ ID NO：621，SEQ ID NO：622，SEQ ID NO：623，SEQ ID NO：624，SEQ ID NO：625，SEQ ID NO：626，SEQ ID NO：627，SEQ ID NO：628，SEQ ID NO：629，SEQ ID NO：630，SEQ ID NO：631，SEQ ID NO：632，SEQ ID NO：633，SEQ ID NO：1018，SEQ ID NO：1031，SEQ ID NO：1044，SEQ ID NO：1083，SEQ ID NO：1109，SEQ ID NO：1122，SEQ ID NO：1252，SEQ ID NO：1265，SEQ ID NO：1278，SEQ ID NO：1291，SEQ ID NO：1304，SEQ ID NO：1656，SEQ ID NO：1669，SEQ ID NO：1903，SEQ ID NO：1916，SEQ ID NO：1942，SEQ ID NO：1955，SEQ ID NO：1968，SEQ ID NO：1981，SEQ ID NO：1994，SEQ ID NO：2007，SEQ ID NO：2020，SEQ ID NO：2033，SEQ ID NO：2046及SEQ ID NO：2059；(c)SEQ ID NO：394，SEQ ID NO：410，SEQ ID NO：434，SEQ ID NO：412，SEQ ID NO：571，SEQ ID NO：572，SEQ ID NO：573，SEQ ID NO：574，SEQ ID NO：575，SEQ ID NO：576，SEQ ID NO：577，SEQ ID NO：578，SEQ ID NO：579，SEQ ID NO：596，SEQ ID NO：597，SEQ ID NO：598，SEQ ID NO：599，SEQ ID NO：600，SEQ ID NO：601，SEQ ID NO：612，SEQ ID NO：613，SEQ ID NO：1005，SEQ ID NO：1057，SEQ ID NO：1096，SEQ ID NO：1617，SEQ ID NO：1630，SEQ ID NO：1643，SEQ ID NO：1682，SEQ ID NO：1695，SEQ ID NO：1708，SEQ ID NO：1721，SEQ ID NO：1734，SEQ ID NO：1747，SEQ ID NO：1760，SEQ ID NO：1773及SEQ ID NO：1929；(d)SEQ ID NO：408，SEQ ID NO：416，SEQ ID NO：444，SEQ ID NO：442，SEQ ID NO：396，SEQ ID NO：402，SEQ ID NO：430，SEQ ID NO：404，SEQ ID NO：446，SEQ ID NO：558，SEQ ID NO：559，SEQ ID NO：560，SEQ ID NO：561，SEQ ID NO：562，SEQ ID NO：563，SEQ ID NO：564，SEQ ID NO：565，SEQ ID NO：566，SEQ ID NO：567，SEQ ID NO：568，SEQ ID NO：569，SEQ ID NO：570，SEQ ID NO：583，SEQ ID NO：584，SEQ ID NO：585，SEQ ID NO：586，SEQ ID NO：608，SEQ ID NO：609，SEQ ID NO：610， SEQ ID NO：611，SEQ ID NO：635，SEQ ID NO：636，SEQ ID NO：637，SEQ ID NO：638，SEQ ID NO：979，SEQ ID NO：1070，SEQ ID NO：1148，SEQ ID NO：1161，SEQ ID NO：1187，SEQ ID NO：1200，SEQ ID NO：1213，SEQ ID NO：1226，SEQ ID NO：1239，SEQ ID NO：1317，SEQ ID NO：1330，SEQ ID NO：1382，SEQ ID NO：1395，SEQ ID NO：1408，SEQ ID NO：1421，SEQ ID NO：1471，SEQ ID NO：1480，SEQ ID NO：1487，SEQ ID NO：1496，SEQ ID NO：1503，SEQ ID NO：1510，SEQ ID NO：1521，SEQ ID NO：1528，SEQ ID NO：1535，SEQ ID NO：1544，SEQ ID NO：1551，SEQ ID NO：1560，SEQ ID NO：1567，SEQ ID NO：1786，SEQ ID NO：1799，SEQ ID NO：1812，SEQ ID NO：1825，SEQ ID NO：1838，SEQ ID NO：1851，SEQ ID NO：1864，SEQ ID NO：1877，SEQ ID NO：1890，SEQ ID NO：2072，SEQ ID NO：2085，SEQ ID NO：2098，SEQ ID NO：2111，SEQ ID NO：2124，SEQ ID NO：2137，SEQ ID NO：2150，SEQ ID NO：2163，SEQ ID NO：2189，SEQ ID NO：2202及SEQ ID NO：2215；及(e)SEQ ID NO：432，SEQ ID NO：448，SEQ ID NO：414，SEQ ID NO：406，SEQ ID NO：602，SEQ ID NO：992，SEQ ID NO：1591及SEQ ID NO：1604。
本發明進一步提供本發明之抗體構築體之實施例，其中第一結合域包含選自由以下組成之群的VH區及VL區：(1)如SEQ ID NO：362+418，SEQ ID NO：364+420，SEQ ID NO：485+580，SEQ ID NO：486+581，SEQ ID NO：487+582，SEQ ID NO：492+587，SEQ ID NO：493+588，SEQ ID NO：494+589，SEQ ID NO：495+590，SEQ ID NO：1133+1135，SEQ ID NO：1172+1174，SEQ ID NO：1341+1343，SEQ ID NO：1354+1356，SEQ ID NO：1367+1369， SEQ ID NO：1432+1434，SEQ ID NO：1445+1447及SEQ ID NO：2174+2176中所描繪之VH區與VL區之配對；(2)如SEQ ID NO：342+398，SEQ ID NO：366+422，SEQ ID NO：370+426，SEQ ID NO：344+400，SEQ ID NO：372+428，SEQ ID NO：368+424，SEQ ID NO：496+591，SEQ ID NO：497+592，SEQ ID NO：498+593，SEQ ID NO：499+594，SEQ ID NO：500+595，SEQ ID NO：508+603，SEQ ID NO：509+604，SEQ ID NO：510+605，SEQ ID NO：511+606，SEQ ID NO：512+607，SEQ ID NO：519+614，SEQ ID NO：520+615，SEQ ID NO：521+616，SEQ ID NO：522+617，SEQ ID NO：523+618，SEQ ID NO：524+619，SEQ ID NO：525+620，SEQ ID NO：526+621，SEQ ID NO：527+622，SEQ ID NO：528+623，SEQ ID NO：529+624，SEQ ID NO：530+625，SEQ ID NO：531+626，SEQ ID NO：532+627，SEQ ID NO：533+628，SEQ ID NO：534+629，SEQ ID NO：535+630，SEQ ID NO：536+631，SEQ ID NO：537+632，SEQ ID NO：538+633，SEQ ID NO：1016+1018，SEQ ID NO：1029+1031，SEQ ID NO：1042+1044，SEQ ID NO：1081+1083，SEQ ID NO：1107+1109，SEQ ID NO：1120+1122，SEQ ID NO：1250+1252，SEQ ID NO：1263+1265，SEQ ID NO：1276+1278，SEQ ID NO：1289+1291，SEQ ID NO：1302+1304，SEQ ID NO：1654+1656，SEQ ID NO：1667+1669，SEQ ID NO：1901+1903，SEQ ID NO：1914+1916，SEQ ID NO：1940+1942，SEQ ID NO：1953+1955，SEQ ID NO：1966+1968，SEQ ID NO：1979+1981，SEQ ID NO：1992+1994，SEQ ID NO：2005+2007，SEQ ID NO：2018+2020，SEQ ID NO：2031+2033，SEQ ID NO：2044+2046及SEQ ID NO：2057+2059中所描繪之VH區與VL區之配對；(3)如SEQ ID NO：338+394，SEQ ID NO：354+410，SEQ ID NO：378+434，SEQ ID NO：356+412，SEQ ID NO：476+571，SEQ ID NO：477+572，SEQ ID NO：478+573，SEQ ID NO：479+574，SEQ ID NO：480+575，SEQ ID NO：481+576，SEQ ID NO：482+577，SEQ ID NO：483+578，SEQ ID NO：484+579，SEQ ID NO：501+596，SEQ ID NO：502+597，SEQ ID NO：503+598，SEQ ID NO：504+599，SEQ ID NO：505+600，SEQ ID NO：506+601，SEQ ID NO：517+612，SEQ ID NO：518+613，SEQ ID NO：1003+1005，SEQ ID NO：1055+1057，SEQ ID NO：1094+1096，SEQ ID NO：1615+1617，SEQ ID NO：1628+1630，SEQ ID NO：1641+1643，SEQ ID NO：1680+1682，SEQ ID NO：1693+1695，SEQ ID NO：1706+1708，SEQ ID NO：1719+1721，SEQ ID NO：1732+1734，SEQ ID NO：1745+1747，SEQ ID NO：1758+1760，SEQ ID NO：1771+1773及SEQ ID NO：1927+1929中所描繪之VH區與VL區之配對；(4)如SEQ ID NO：352+408，SEQ ID NO：360+416，SEQ ID NO：388+444，SEQ ID NO：386+442，SEQ ID NO：340+396，SEQ ID NO：346+402，SEQ ID NO：374+430，SEQ ID NO：348+404，SEQ ID NO：390+446，SEQ ID NO：463+558，SEQ ID NO：464+559，SEQ ID NO：465+560，SEQ ID NO：466+561，SEQ ID NO：467+562，SEQ ID NO：468+563，SEQ ID NO：469+564，SEQ ID NO：470+565，SEQ ID NO：471+566，SEQ ID NO：472+567，SEQ ID NO：473+568，SEQ ID NO：474+569，SEQ ID NO：475+570，SEQ ID NO：488+583，SEQ ID NO：489+584，SEQ ID NO：490+585，SEQ ID NO：491+586，SEQ ID NO：513+608，SEQ ID NO：514+609，SEQ ID NO：515+610，SEQ ID NO：516+611，SEQ ID NO：540+635，SEQ ID NO：541+636，SEQ ID NO：542+637，SEQ ID NO：543+638，SEQ ID NO：977+979，SEQ ID NO：1068+1070，SEQ ID NO：1146+1148，SEQ ID NO：1159+1161， SEQ ID NO：1185+1187，SEQ ID NO：1198+1200，SEQ ID NO：1211+1213，SEQ ID NO：1224+1226，SEQ ID NO：1237+1239，SEQ ID NO：1315+1317，SEQ ID NO：1328+1330，SEQ ID NO：1380+1382，SEQ ID NO：1393+1395，SEQ ID NO：1406+1408，SEQ ID NO：1419+1421，SEQ ID NO：1469+1471，SEQ ID NO：1478+1480，SEQ ID NO：1485+1487，SEQ ID NO：1494+1496，SEQ ID NO：1501+1503，SEQ ID NO：1508+1510，SEQ ID NO：1519+1521，SEQ ID NO：1526+1528，SEQ ID NO：1533+1535，SEQ ID NO：1542+1544，SEQ ID NO：1549+1551，SEQ ID NO：1558+1560，SEQ ID NO：1565+1567，SEQ ID NO：1784+1786，SEQ ID NO：1797+1799，SEQ ID NO：1810+1812，SEQ ID NO：1823+1825，SEQ ID NO：1836+1838，SEQ ID NO：1849+1851，SEQ ID NO：1862+1864，SEQ ID NO：1875+1877，SEQ ID NO：1888+1890，SEQ ID NO：2070+2072，SEQ ID NO：2083+2085，SEQ ID NO：2096+2098，SEQ ID NO：2109+2111，SEQ ID NO：2122+2124，SEQ ID NO：2135+2137，SEQ ID NO：2148+2150，SEQ ID NO：2161+2163，SEQ ID NO：2187+2189，SEQ ID NO：2200+2202及SEQ ID NO：2213+2215中所描繪之VH區與VL區之配對；及(5)如SEQ ID NO：376+432，SEQ ID NO：392+448，SEQ ID NO：358+414，SEQ ID NO：350+406，SEQ ID NO：507+602，SEQ ID NO：990+992，SEQ ID NO：1589+1591及SEQ ID NO：1602+1604中所描繪之VH區與VL區之配對。
在本發明之另一實施例中，抗體構築體呈選自由(scFv)2、(單域mAb)2、scFv-單域mAb、雙功能抗體及其寡聚物組成之群的格式。
在較佳實施例中，第一結合域包含選自由以下序列中所描繪之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列 (a)SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：1137，SEQ ID NO：1176，SEQ ID NO：1345，SEQ ID NO：1358，SEQ ID NO：1371，SEQ ID NO：1436，SEQ ID NO：1449及SEQ ID NO：2178；(b)SEQ ID NO：1020，SEQ ID NO：1033，SEQ ID NO：1046，SEQ ID NO：1085，SEQ ID NO：1111，SEQ ID NO：1124，SEQ ID NO：1254，SEQ ID NO：1267，SEQ ID NO：1280，SEQ ID NO：1293，SEQ ID NO：1306，SEQ ID NO：1658，SEQ ID NO：1671，SEQ ID NO：1905，SEQ ID NO：1918，SEQ ID NO：1944，SEQ ID NO：1957，SEQ ID NO：1970，SEQ ID NO：1983，SEQ ID NO：1996，SEQ ID NO：2009，SEQ ID NO：2022，SEQ ID NO：2035，SEQ ID NO：2048及SEQ ID NO：2061；(c)SEQ ID NO：1007，SEQ ID NO：1059，SEQ ID NO：1098，SEQ ID NO：1619，SEQ ID NO：1632，SEQ ID NO：1645，SEQ ID NO：1684，SEQ ID NO：1697，SEQ ID NO：1710，SEQ ID NO：1723，SEQ ID NO：1736，SEQ ID NO：1749，SEQ ID NO：1762，SEQ ID NO：1775及SEQ ID NO：1931；(d)SEQ ID NO：981，SEQ ID NO：1072，SEQ ID NO：1150，SEQ ID NO：1163，SEQ ID NO：1189，SEQ ID NO：1202，SEQ ID NO：1215，SEQ ID NO：1228，SEQ ID NO：1241，SEQ ID NO：1319，SEQ ID NO：1332，SEQ ID NO：1384，SEQ ID NO：1397，SEQ ID NO：1410，SEQ ID NO：1423，SEQ ID NO：1473，SEQ ID NO：1482，SEQ ID NO：1489，SEQ ID NO：1498，SEQ ID NO：1505，SEQ ID NO：1512，SEQ ID NO：1523，SEQ ID NO：1530，SEQ ID NO：1537，SEQ ID NO：1546，SEQ ID NO：1553，SEQ ID NO：1562，SEQ ID NO：1569，SEQ ID NO：1788，SEQ ID NO：1801，SEQ ID NO：1814，SEQ ID NO：1827，SEQ ID NO：1840，SEQ ID NO：1853，SEQ ID NO：1866，SEQ ID NO：1879，SEQ ID NO：1892，SEQ ID NO：2074，SEQ ID NO：2087，SEQ ID NO：2100，SEQ ID NO：2113，SEQ ID NO：2126，SEQ ID NO：2139，SEQ ID NO：2152，SEQ ID NO：2165，SEQ ID NO：2191，SEQ ID NO：2204及SEQ ID NO：2217；及(e)SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：1593及SEQ ID NO：1606。
在本發明之抗體構築體之另一實施例中，第二結合域能夠結合於人類及普通狨(Callithrix jacchus)、棉頂狨(Saguinus Oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε。
在較佳實施例中，本發明之抗體構築體具有選自由以下序列中所描繪之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列(a)SEQ ID NO：1138，SEQ ID NO：1177，SEQ ID NO：1346，SEQ ID NO：1359，SEQ ID NO：1372，SEQ ID NO：1437，SEQ ID NO：1450及SEQ ID NO：2179；(b)SEQ ID NO：1021，SEQ ID NO：1034，SEQ ID NO：1047，SEQ ID NO：1086，SEQ ID NO：1112，SEQ ID NO：1125，SEQ ID NO：1255，SEQ ID NO：1268，SEQ ID NO：1281，SEQ ID NO：1294，SEQ ID NO：1307，SEQ ID NO：1659，SEQ ID NO：1672，SEQ ID NO：1906，SEQ ID NO：1919，SEQ ID NO：1945，SEQ ID NO：1958，SEQ ID NO：1971，SEQ ID NO：1984，SEQ ID NO：1997，SEQ ID NO：2010，SEQ ID NO：2023，SEQ ID NO：2036，SEQ ID NO：2049及SEQ ID NO：2062；(c)SEQ ID NO：1008，SEQ ID NO：1060，SEQ ID NO：1099，SEQ ID NO：1620，SEQ ID NO：1633，SEQ ID NO：1646，SEQ ID NO：1685，SEQ ID NO：1698，SEQ ID NO：1711，SEQ ID NO：1724，SEQ ID NO：1737，SEQ ID NO：1750，SEQ ID NO：1763，SEQ ID NO：1776及SEQ ID NO：1932； (d)SEQ ID NO：982，SEQ ID NO：1073，SEQ ID NO：1151，SEQ ID NO：1164，SEQ ID NO：1190，SEQ ID NO：1203，SEQ ID NO：1216，SEQ ID NO：1229，SEQ ID NO：1242，SEQ ID NO：1320，SEQ ID NO：1333，SEQ ID NO：1385，SEQ ID NO：1398，SEQ ID NO：1411，SEQ ID NO：1424，SEQ ID NO：1474，SEQ ID NO：1475，SEQ ID NO：1476，SEQ ID NO：1483，SEQ ID NO：1490，SEQ ID NO：1491，SEQ ID NO：1492，SEQ ID NO：1499，SEQ ID NO：1506，SEQ ID NO：1513，SEQ ID NO：1514，SEQ ID NO：1515，SEQ ID NO：1516，SEQ ID NO：1517，SEQ ID NO：1524，SEQ ID NO：1531，SEQ ID NO：1538，SEQ ID NO：1539，SEQ ID NO：1540，SEQ ID NO：1547，SEQ ID NO：1554，SEQ ID NO：1555，SEQ ID NO：1556，SEQ ID NO：1563，SEQ ID NO：1570，SEQ ID NO：1571，SEQ ID NO：1572，SEQ ID NO：1573，SEQ ID NO：1574，SEQ ID NO：1575，SEQ ID NO：1576，SEQ ID NO：1577，SEQ ID NO：1578，SEQ ID NO：1579，SEQ ID NO：1580，SEQ ID NO：1581，SEQ ID NO：1789，SEQ ID NO：1802，SEQ ID NO：1815，SEQ ID NO：1828，SEQ ID NO：1841，SEQ ID NO：1854，SEQ ID NO：1867，SEQ ID NO：1880，SEQ ID NO：1893，SEQ ID NO：2075，SEQ ID NO：2088，SEQ ID NO：2101，SEQ ID NO：2114，SEQ ID NO：2127，SEQ ID NO：2140，SEQ ID NO：2153，SEQ ID NO：2166，SEQ ID NO：2192，SEQ ID NO：2205及SEQ ID NO：2218至2228；及(e)SEQ ID NO：995、SEQ ID NO：1594及SEQ ID NO：1607。
本發明進一步提供編碼本發明之抗體構築體之核酸序列。
此外，本發明提供包含本發明之核酸序列之載體。此外，本發明提供經本發明之核酸序列轉型或轉染之宿主細胞。
在另一實施例中，本發明提供產生本發明之抗體構築體之方 法，該方法包含在允許本發明之抗體構築體之表現的條件下培養本發明之宿主細胞及自培養物回收所產生之抗體構築體。
此外，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體。
在一個實施例中，本發明提供本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體，其係用於預防、治療或改善黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病。
本發明亦提供治療或改善黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病之方法，其包含投與有需要之個體本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體之步驟。
在本發明之使用方法之較佳實施例中，黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病係選自由淺表性擴散黑素瘤、惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端雀斑樣痣黑素瘤及結節性黑素瘤組成之群。
在另一實施例中，本發明提供套組，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體、本發明之載體及/或本發明之宿主細胞。
圖1：
圖1描繪Colo-699細胞之細胞活力資料，該等Colo-699細胞已用完全人類抗CDH19抗體及高濃度的某一藥物-抗體比率(DAR)(約1.3)之山羊抗人類Fc單價Fab與DM1(DM1-Fab)之結合物處理。
圖2：
圖2描繪針對來自Colo-699分析法之平均細胞活力資料標繪之來自CHL-1分析法之平均細胞活力資料。
圖3：
圖3展示轉移性及原發性黑素瘤樣品中CDH19 mRNA之相對表 現。
圖4：
圖4展示藉由IHC之人類腫瘤樣品中CDH19蛋白質之表現。
圖5：
圖5展示用於鑑別模型系統之藉由流動式細胞測量術及IHC之腫瘤細胞株分析結果，其中基於細胞表面上CDH19受體之數目，CDH19表現與人類腫瘤類似。
圖6：
所示細胞株上CDH19/CD3雙特異性抗體之FACS分析：1)未轉染之L1.2，2)經人類CDH19穩定轉染之L1.2細胞，3)黑素瘤細胞株CHL-1，4)黑素瘤細胞株A2058，5)人類CD3陽性人類T細胞株HBP-ALL，6)獼猴T細胞株4119 LnPx。陰性對照[1)至6)]：不含先前CDH19/CD3雙特異性抗體之偵測抗體。
圖7：
如48小時基於FACS之細胞毒性分析法中量測之CDH19/CD3雙特異性抗體之細胞毒素活性。效應細胞：未受刺激之人類PBMC。目標細胞：如所示。效應細胞與目標細胞(E：T)比率：10：1。
圖8：
藉由CDH19 BiTE 2G6之投藥進行之Colo699細胞之腫瘤生長活體內抑制。雙特異性抗體構築體在0.5mg/kg劑量下抑制腫瘤生長。
圖9：
藉由CDH19 BiTE 2G6之投藥進行之CHL-1細胞之腫瘤生長活體內抑制。雙特異性抗體構築體在0.5mg/kg劑量下抑制腫瘤生長。
圖10：
如48小時基於成像之細胞毒性分析法中量測之CDH19/CD3雙特異性抗體之細胞毒素活性。效應細胞：未受刺激之人類T細胞。目標 細胞：如所示。效應細胞與目標細胞(E：T)比率：10：1。
圖11：
層析IMAC捕捉及溶離CH19 2G6 302×I2C SA21
在CDH19 BiTE抗體之純化期間獲得之典型IMAC溶離概況。紅線表示254nm下之吸收，藍線表示280nm下之吸收。棕色線表示傳導性。1-捕獲。2-預先溶離50mM咪唑。3.BiTE溶離500mM咪唑
圖12：
層析圖Protein_A捕獲及溶離CH19 2G6 302×F12Q
在CDH19 BiTE抗體之純化期間獲得之典型Protein_A溶離概況。紅線表示254nm下之吸收，藍線表示280nm下之吸收。棕色線表示傳導性。綠色線表示所施用之梯度百分比。1-捕獲。2-BiTE溶離
圖13：
CDH19 BiTE抗體2G6 302×I2C SA21之SEC溶離概況
在CDH19 BiTE抗體之純化期間獲得之典型SEC溶離概況。標示對應於單體及二聚BiTE抗體同功異型物之蛋白質峰值。LMW=低分子量。紅線表示254nm下之吸收，藍線表示280nm下之吸收。棕色線表示傳導性。1-SEC排斥體積中無BiTE聚集。2.BiTE二聚體。3.BiTE單體。4.低分子量污染物及鹽
圖14：
CDH19 BiTE單體CH19 2G6 302×I2C SA21之還原型SDS PAGE分析(左側)及分子量標記Novex Sharp蛋白質標準(Life Technologies)。
圖15：
HP-SEC層析圖表明在37℃下儲存七天之後，CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21之溶離。粉紅色線表示210nm波長下之光學吸收。棕色線表示傳導性。
1.BiTE二聚體。2.BiTE單體
圖16：
HP-SEC層析圖表明在三次冷凍/解凍循環之後，CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21之溶離。粉紅色線表示210nm波長下之光學吸收。棕色線表示傳導性。1.BiTE單體
圖17：
CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21之溶離之CatIEX層析圖。藍線表示280nm下之光學吸收。紅線表示254nm下之光學吸收。
圖18：
CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21之HIC溶離概況。藍線表示280nm下之光學吸收。紅線表示254nm下之光學吸收。棕色線表示傳導性。
圖19：
所示細胞株上CDH19/CD3雙特異性抗體之FACS分析：1)經人類CDH19穩定轉染之HEK293細胞，2)人類CD3陽性人類T細胞株HBP-ALL；陰性對照[1)及2)]：不含先前CDH19/CD3雙特異性抗體細胞培養物上清液之偵測抗體。
圖20：
如18小時基於鉻釋放之細胞毒性分析法中量測之CDH19/CD3雙特異性抗體之細胞毒素活性。效應細胞：經刺激之人類CD8+ T細胞。目標細胞：經人類CDH19轉染之HEK293。效應細胞與目標細胞(E：T)比率：10：1。
定義：
必須注意的是，如本文中所用，除非上下文明確說明，否則單數形式「一」及「該」包括複數形式。因此，舉例而言，對「一種試劑」之參考包括該等不同試劑中之一或多種且對「方法」之參考包括 對一般熟習此項技術者已知的等效步驟及方法之參考，該等等效步驟及方法可修改或取代本文中所描述之方法。
除非另有說明，否則一系列元素前之術語「至少」應理解為指代該系列中之每一元素。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文中所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲由本發明涵蓋。
本文中使用之術語「及/或」均包括「及」、「或」以及「由該術語連接之元素之所有或任何其他組合」之含義。
如本文中所用之術語「約(about/approximately)」意謂在既定值或範圍之±20%以內，較佳在±15%以內，更佳在±10%以內且最佳在±5%以內。
除非上下文需要，否則遍及本說明書及下文之申請專利範圍，詞「包含」及變體應理解為意謂涵蓋所述整數或步驟或整數群或步驟群而不排除任何其他整數或步驟或整數群或步驟群。當在本文中使用時，術語「包含」可由術語「含有」或「包括」取代，或當在本文中使用時，有時可由術語「具有」取代。
當在本文中使用時，「由...組成」不包括所主張元素中未說明的任何元素、步驟或成分。當在本文中使用時，「本質上由...組成」不排除不會實質上影響申請專利範圍之基本及新穎特徵的材料或步驟。
在本文中之每一個實例中，術語「包含」、「本質上由...組成」及「由...組成」中之任一者均可由其他兩個術語中之任一者置換。
術語「抗體」之定義包括諸如單株、嵌合、單鏈、人類化及人類抗體以及抗體片段(尤其例如Fab片段)之實施例。抗體片段或衍生物進一步包含F(ab')2、Fv、scFv片段或單域抗體，諸如結構域抗體或奈米抗體、包含僅一個可變域(其可為VHH、VH或VL)之單可變域抗體或免疫球蛋白單可變域，其獨立於其他V區或結構域而特異性結合 抗原或抗原決定基；參見例如Harlow及Lane(1988)及(1999),在上述引文中；Kontermann及Dübel,Antibody Engineering,Springer,第2版2010及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009。該免疫球蛋白單可變域不僅涵蓋經分離之抗體單可變域多肽，且亦涵蓋較大的多肽，其包含抗體單可變域多肽序列之一或多個單體。
與此定義一致，術語抗體之所有上述實施例均可歸入「抗體構築體」中。該術語亦包括雙功能抗體或雙親和性重靶向(DART)抗體。此外涵蓋(雙特異性)單鏈雙功能抗體、串聯雙功能抗體(Tandab's)、由如下結構例示之「微型抗體」：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2、「Fc DART」抗體及「IgG DART」抗體，及多功能抗體，諸如三功能抗體。免疫球蛋白單可變域不僅涵蓋經分離之抗體單可變域多肽，且亦涵蓋較大的多肽，其包含抗體單可變域多肽序列之一或多個單體。
多種程序係在此項技術中已知且可用於產生該等抗體構築體(抗體及/或片段)。因此，(抗體)衍生物可由肽模擬物產生。此外，所描述之用於產生單鏈抗體之技術(尤其參見美國專利4,946,778,Kontermann及Dübel(2010),在上述引文中，及Little(2009),在上述引文中)可經調試以產生對所選多肽具有特異性之單鏈抗體。又，可使用轉殖基因動物表現對本發明之多肽及融合蛋白質具有特異性之人類化抗體。對於單株抗體之製備，可使用任何提供由連續細胞株培養物產生之抗體的技術。該等技術之實例包括融合瘤技術(Köhler及Milstein Nature 256(1975),495-497)、三源雜交瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)及用於產生人類單株抗體之EBV-融合瘤技術(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。舉例而言，BlAcore 系統中使用之表面電漿子共振可用於增加結合於目標多肽(諸如CD3ε)之抗原決定基之噬菌體抗體的效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。本發明之上下文中亦涵蓋的是術語「抗體」包含抗體構築體，該等抗體構築體可表現於如下文所描述之宿主中，例如可尤其經病毒或質體載體轉染及/或轉導之抗體構築體。
此外，如本發明中使用之術語「抗體」亦係關於本文中所描述之抗體之衍生物或變異體，其顯示與所描述之抗體相同的特異性。
當在本文中使用時，術語「抗原結合域」、「抗原結合片段」及「抗體結合區」係指抗體分子之一部分，其包含負責抗體與抗原之間的特異性結合的胺基酸。由抗體特異性識別及結合之抗原部分稱為如上文所描述之「抗原決定基」。如上文所提及，抗原結合域可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)；然而，其無需同時包含該兩者。舉例而言，Fd片段具有兩個VH區且通常保留完整抗原結合域之一些抗原結合功能。抗體之抗原-結合片段之實例包括(1)Fab片段，其為具有VL、VH、CL及CH1結構域之單價片段；(2)F(ab')2片段，其為在絞鏈區具有兩個由二硫鍵連接之Fab片段的二價片段；(3)Fd片段，其具有兩個VH及CH1結構域；(4)Fv片段，其具有抗體之單臂之VL及VH結構域，(5)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH結構域；(6)經分離之互補決定區(CDR)，及(7)單鏈Fv(scFv)。儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由獨立基因編碼，但其可使用重組型方法藉由合成連接子相連，該合成連接子使其能夠成為單一蛋白質鏈，其中VL區與VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。該等抗體片段係使用熟習此項技術者已知的習知技術獲得，且片段之功能係以與完整抗體相同之方式評 估。
如本文中所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質的抗體之群獲得之抗體，亦即除可少量存在的可能天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)以外，包含該群之個別抗體為相同的。單株抗體具有針對單一抗原位點之高特異性。此外，與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相反，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除其特異性以外，單株抗體由於其係由未受其他免疫球蛋白污染之融合瘤培養物合成而為有利的。修飾語「單株」表示自實質上均質的抗體群獲得之抗體之特性，且不應理解為需要任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可由首先由Kohler等人,Nature,256：495(1975)描述之融合瘤方法產生，或可由重組型DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)產生。亦可例如使用Clackson等人,Nature,352：624-628(1991)及Marks等人,J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中描述之技術自噬菌體抗體文庫分離「單株抗體」。
術語「人類抗體」包括具有與此項技術中已知的人類生殖系免疫球蛋白序列實質上對應之可變區及恆定區的抗體，包括例如由Kabat等人(參見，Kabat等人(1991),在上述引文中)描述之抗體。本發明之人類抗體可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如由活體外隨機或位點特異性突變誘發或由活體內體細胞突變引入之突變)，例如在CDR中且詳言之，在CDR3中。人類抗體可具有至少一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上由並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基置換的位置。強調的是，如本文中所用之人類抗體之定義亦涵蓋完全人類抗體，其僅包括抗體之非人工及/或遺傳改變之人類序列，如可藉由使用諸如Xenomice之系統的技術衍生之抗體。
「抗體變異體」之實例包括非人類抗體之人類化變異體、「親和力成熟抗體」(參見例如Hawkins等人J.Mol.Biol.254,889-896(1992)及Lowman等人,Biochemistry 30,10832-10837(1991))及具有經改變之效應子功能的抗體突變體(參見例如美國專利5,648,260,Kontermann及Dübel(2010),在上述引文中及Little(2009),在上述引文中)。
如本文中所用，「活體外產生之抗體」係指其中所有或部分可變區(例如至少一個CDR)係在非免疫細胞選擇(例如活體外噬菌體呈現、蛋白質晶片或任何其他可測試候選序列結合於抗原之能力的方法)中產生之抗體。因此，此術語較佳不包括由免疫細胞中之基因組重組產生之序列。
VH與VL之配對共同形成單一抗原結合位點。將最靠近VH的CH域指定為CH1。各L鏈藉由一個共價雙硫鍵連接至H鏈，而視H鏈同型而定，兩個H鏈藉由一或多個雙硫鍵彼此連接。VH及VL結構域由稱為構架區之四個相對保存序列區域(FR1、FR2、FR3及FR4)組成，該等構架區形成三個高變序列區域(互補決定區，CDR)之骨架。CDR含有負責抗體與抗原之特定相互作用的殘基中的大部分。CDR稱為CDR1、CDR2及CDR3。因此，將重鏈上的CDR成分稱為H1、H2及H3，而將輕鏈上的CDR成分稱為L1、L2及L3。
術語「可變」係指免疫球蛋白域中呈現序列可變性且與確定特定抗體之特異性及結合親和力有關的部分(亦即「可變域」)。可變性在抗體之整個可變域中並非均勻分佈；其集中於各重鏈及輕鏈可變區之子結構域中。該等子結構域稱為「高變」區或「互補決定區」(CDR)。可變域中保存性更高(亦即非高變)的部分稱為「構架」區(FRM)。天然存在之重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FRM區，其主要呈由三個高變區連接之β片組態，該三個高變區形成連接β片結構之 迴路且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之高變區藉由FRM緊密結合在一起且與來自其他鏈之高變區一起促進抗原結合位點形成(參見Kabat等人,在上述引文中)。恆定域不與抗原結合直接相關，但呈現各種效應子功能，諸如抗體依賴性、細胞介導之細胞毒性及補體活化。
術語「CDR」及其複數「CDRS」係指互補決定區(CDR)，其中三個互補決定區組成輕鏈可變區之結合特性(CDRL1、CDRL2及CDRL3)且三個互補決定區組成重鏈可變區之結合個性(CDRH1、CDRH2及CDRH3)。CDR促進抗體分子之功能活性且由包含骨架區或構架區之胺基酸序列分離。精確定義的CDR邊界及長度視不同分類及編號系統而定。因此可藉由Kabat、Chothia、接觸型或任何其他邊界定義(包括本文中所描述之編號系統)對CDR進行參考。儘管邊界不同，但該等系統中之每一者在組成可變序列內之所謂的「高變區」的部分中均具有一定程度的重疊。因此，相對於相鄰構架區，根據該等系統之CDR定義可在長度及邊界區域方面不同。參見例如Kabat、Chothia及/或MacCallum(Kabat等人,在上述引文中；Chothia等人,J.Mol.Biol,1987,196：901；及MacCallum等人,J.MoI.Biol,1996,262：732)。然而，較佳為根據所謂Kabat系統之編號。輕鏈之CDR3及特定言之，重鏈之CDR3可組成輕鏈及重鏈可變區內結合之抗原之最重要的決定子。在一些抗體構築體中，重鏈CDR3似乎組成抗原與抗體之間的主要接觸區域。可使用僅CDR3變化之活體外選擇方案以改變抗體之結合性質或確定何種殘基有助於抗原之結合。
「本質上由...組成」意謂胺基酸序列與所述SEQ ID NO：序列相比，其中約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%部分可發生變化，且仍保留本文中所描述之生物活性。
在一些實施例中，本發明之抗體構築體為經分離之蛋白質或實質上純的蛋白質。「經分離之」蛋白質不含至少一些在其自然狀態下通常相結合之物質，例如占既定樣品中全部蛋白質之至少約5重量%或至少約50重量%。應理解，視環境而定，經分離之蛋白質可占總蛋白質含量之5重量%至99.9重量%。舉例而言，可經由使用可誘導啟動子或高表現啟動子使得以增加之濃度位準產生蛋白質來產生顯著較高濃度之蛋白質。該定義包括在此項技術中已知的多種有機物及/或宿主細胞中產生抗原結合蛋白質。
對於胺基酸序列，使用此項技術中已知的標準技術確定序列一致性及/或相似性，包括(但不限於)Smith及Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2：48之局部序列一致性演算法、Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443之序列一致性對準演算法、Pearson及Lipman,1988,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444之類似方法之尋求、該等演算法之電腦化實施例(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)、由Devereux等人,1984,Nucl.Acid Res.12：387-395描述之最佳擬合序列程式，較佳使用預設設定，或藉由檢驗。較佳基於以下參數藉由FastDB計算一致性百分比：失配罰分為1；間隙罰分為1；間隙尺寸罰分為0.33；及接合罰分為30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149頁(1988),Alan R.Liss,Inc.。
適用演算法之實例為PILEUP。PILEUP使用進行性成對對準自一組相關序列產生多重序列對準。亦可標繪樹狀圖，其展示用於產生對準之叢集關係。PILEUP使用Feng及Doolittle,1987,J.Mol.Evol.35：351-360之進行性對準方法之簡化形式；與由Higgins及Sharp,1989, CABIOS 5：151-153所描述類似的方法。適用的PILEUP參數包括預設間隙權數為3.00、預設間隙長度權數為0.10及加權端隙。
適用演算法之另一實例為BLAST演算法，描述於：Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；及Karin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787中。尤其適用BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其係自Altschul等人,1996,Methods in Enzymology 266：460-480獲得。WU-BLAST-2使用若干搜尋參數，其中大部分設定為預設值。藉由以下值設定可調參數：重疊間隔=1，重疊部分=0.125，字臨限值(T)=II。HSP S及HSP S2參數為動態值且係由程式本身視特定序列之組成及特定資料庫(正針對其搜尋相關序列)之組成而產生；然而，可調節該等值以增加敏感性。
另一種適用演算法為間隙BLAST，如由Altschul等人,1993,Nucl.Acids Res.25：3389-3402所報導。間隙BLAST使用BLOSUM-62取代分數；臨限值T參數設定為9；使用二次打擊方法觸發無間隙擴展，電荷間隙長度k(使用10+k)；Xu設定為16，且Xg設定為40以用於資料庫搜尋階段且設定為67以用於演算法之輸出階段。藉由對應於約22個位元之分數來觸發間隙對準。
通常，個別變異型CDR與本文中描繪之序列之間的胺基酸同源性、相似性或一致性為至少80%，且更典型地較佳為更高的同源性或一致性，如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及幾乎100%。以類似方式，相對於本文中鑑別之結合蛋白質之核酸序列之「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與抗原結合蛋白質之編碼序列中之核苷酸殘基一致的核苷酸殘基之百分比。特定方法使用WU-BLAST-2之BLASTN模組(設定成預設參數)，其中重疊間隔及重疊部分分別設定為1及0.125。
通常，編碼個別變異型CDR之核苷酸序列與本文中描繪之核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或一致性為至少80%，且更典型地較佳為更高的同源性或一致性，如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，及幾乎100%。
因此，「變異型CDR」為這樣一種CDR：其與本發明之親本CDR具有指定同源性、相似性或一致性，且共用生物功能，包括(但不限於)親本CDR之特異性及/或活性之至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
儘管預先確定用於引入胺基酸序列變化之位點或區域，但無需預先確定突變本身。舉例而言，為了最佳化既定位點處突變之效能，可在目標密碼子或區域處進行隨機突變誘發且針對所需活性之最佳組合來篩檢經表現之抗原結合蛋白質CDR變異體。用於在具有已知序列之DNA中的預定位點處產生取代突變的技術已為吾人所熟知，例如M13引子突變誘發及PCR突變誘發。突變體之篩檢係使用抗原結合蛋白質活性之分析法(諸如CDH19結合)進行。
術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」典型地係指具有在此項技術中所識別之定義的胺基酸，諸如選自由以下組成之群的胺基酸：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)：白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(VaI或V)，但亦可視需要使用經修飾的、合成的或稀有的胺基酸。通常，胺基酸可分組為具有非極性側鏈(例如 Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；帶負電荷側鏈(例如Asp、Glu)；帶正電荷側鏈(例如Arg、His、Lys)；或不帶電極性側鏈(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp及Tyr)。
當在本文中使用時，術語「高變區」(亦稱為「互補決定區」或CDR)係指抗體之胺基酸殘基，其(通常為具有極端序列可變性的三個或四個短區)位於形成抗原結合位點之免疫球蛋白之V區結構域內且為抗原特異性之主要決定子。存在至少兩種用於鑑別CDR殘基之方法：(1)基於跨物種序列可變性之方法(亦即Kabat等人,在上述引文中)；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶研究的方法(Chothia,C.等人,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。然而，就兩種殘基鑑別技術定義重疊區域而非一致區域而言，其可經組合以定義雜合CDR。然而，通常，較佳根據所謂Kabat(編號)系統鑑別CDR殘基。
術語「構架區」係指此項技術中識別之抗體可變區中存在於分歧性更高的(亦即高變)CDR之間的部分。該等構架區典型地稱為構架1至4(FR1、FR2、FR3及FR4)且提供用於在三維空間中呈現六個CDR(三個來自重鏈且三個來自輕鏈)之骨架，以便形成抗原結合表面。
典型地，CDR形成可歸類為正則結構的迴路結構。術語「正則結構」係指由抗原結合(CDR)迴路採用之主鏈構形。由比較性結構研究，已發現六種抗原結合迴路中的五種僅具有受限制的可用構形譜系。各正則結構可由多肽主結構之扭轉角表徵。因此，儘管大部分迴路中具有高胺基酸序列可變性，但抗體之間的對應迴路可具有極類似的三維結構(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.,1987,196：901；Chothia等人,Nature,1989,342：877；Martin及Thornton,J.Mol.Biol,1996,263：800，其各以全文引用的方式併入本文中)。此外，所採用之迴路結構與圍繞其之胺基酸序列之間存在某種關係。藉由迴路長度以及迴路內及保守性構架內(亦即迴路外)關鍵位置處駐留的胺基酸殘基來確定特 定正則類別之構形。因此可基於是否存在該等關鍵胺基酸殘基來進行對特定正則類別之指定。術語「正則結構」亦可包括如抗體之線性序列之考慮因素，例如由Kabat(Kabat等人,在上述引文中)編目。Kabat編號方案(系統)為廣泛採用之以一致方式對抗體可變域之胺基酸殘基進行編號的標準且如本文中其他地方亦提及，其為用於本發明之較佳流程。亦可使用其他結構考慮因素確定抗體之正則結構。舉例而言，該等未由Kabat編號完全反映之差異可由Chothia等人之編號系統描述及/或由其他技術顯示，例如結晶學及二維或三維電腦模型化。因此，可將既定抗體序列歸入正則類別，其尤其允許鑑別合適的基礎序列(例如基於文庫中包括多種正則結構之需求)。抗體胺基酸序列之Kabat編號以及如由Chothia等人(在上述引文中)描述之結構考慮因素及其涉及分析抗體結構之正則態樣的內容描述於文獻中。
CDR3典型地為抗體結合位點內分子多樣性之最大來源。舉例而言，H3可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。不同類別之免疫球蛋白之子單元結構及三維組態在此項技術中已為吾人所熟知。關於抗體結構之評述，參見Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow等人編,1988。熟習此項技術者將認識到各子單元結構(例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR結構)包含活性片段，例如VH、VL或CDR子單元中結合於抗原之部分(亦即抗原結合片段)，或例如CH子單元中結合於及/或活化例如Fc受體及/或補體之部分。CDR典型地係指Kabat CDR，如Sequences of Proteins of immunological Interest,US Department of Health and Human Services(1991),Kabat等人編中所描述。另一種用於表徵抗原結合位點之標準為參考高變迴路，如由Chothia所描述。參見例如Chothia,等人(1987；J.Mol.Biol.227：799-817)；及Tomlinson等人(1995)EMBO J.14：4628-4638。另一標準為Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體使用 之AbM定義。通常參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In：Antibody Engineering Lab Manual (Duebel,S.及Kontermann,R.編,Springer-Verlag,Heidelberg)。或者，關於Kabat CDR所描述之實施例可使用類似的關於Chothia高變迴路或AbM定義之迴路所描述的關係實施。
抗體基因之序列在組合及體細胞突變後顯著變化，且估計該等變化之基因編碼1010種不同抗體分子(Immunoglobulin Genes,第2版,Jonio等人編,Academic Press,San Diego,CA,1995)。因此，免疫系統提供免疫球蛋白之譜系。術語「譜系」係指至少一種完全或部分地由至少一種編碼至少一種免疫球蛋白之序列衍生的核苷酸序列。序列可由重鏈之V、D及J區段以及輕鏈之V及J區段之活體內重組產生。或者，序列可由細胞產生，其中重組係回應於該細胞而發生，例如活體外刺激。或者，部分或所有序列可由DNA剪接、核苷酸合成、突變誘發及其他方法獲得，參見例如美國專利5,565,332。譜系可包括僅一個序列或可包括複數個序列，包括遺傳上互異的集合中之序列。
在本發明之含義上，術語「結合分子」或「抗體構築體」表示任何能夠(以特異性方式)結合於目標分子CDH19及CD3、與目標分子CDH19及CD3相互作用或識別目標分子CDH19及CD3之分子。該等分子或構築體可包括蛋白質部分及非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑，諸如戊二醛)。
若使用連接子，則此連接子較佳具有足以確保第一結構域及第二結構域中之每一者可彼此獨立地保留其不同結合特異性的長度及序列。最佳且如隨附實例中所述，本發明之抗體構築體為「雙特異性單鏈抗體構築體」，更佳為雙特異性單鏈Fv(scFv)。雙特異性單鏈分子在此項技術中已知且描述於WO 99/54440；Mack,J.Immunol.(1997),158,3965-3970；Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025；Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,(1997),45,193-197；Löffler,Blood,(2000),95,6,2098-2103；Brühl,Immunol.,(2001),166,2420-2426；Kipriyanov,J.Mol.Biol.,(1999),293,41-56中。
本文中所描述之抗體構築體中所包含之該等可變域可由其他連接序列連接。根據本發明，術語「肽連接子」定義一種胺基酸序列，其中本發明之抗體構築體之第一結構域及第二結構域之胺基酸序列藉由該胺基酸序列而彼此連接。該肽連接子之一個必要技術特徵為該肽連接子不包含任何聚合活性。合適肽連接子包括美國專利4,751,180及4,935,233或WO 88/09344中所描述之肽連接子。肽連接子之較佳實施例由胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(亦即Gly4Ser，或其聚合物，亦即(Gly4Ser)x，其中x為整數1或大於1)表徵。該肽連接子之特徵(其中不存在二級結構之促進作用)在此項技術中已知且描述於例如Dall’ Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)；Cheadle等人(Mol Immunol(1992)29,21-30)以及Raag及Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。較佳為亦不促進任何二級結構之肽連接子。如實例中所描述，該等結構域彼此之間的鍵聯可由例如遺傳工程提供。用於製備融合且操作性連接之雙特異性單鏈構築體且在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法係在此項技術中熟知(例如WO 99/54440或Sambrook等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。
對於肽連接子(其連接本發明之抗體構築體中至少兩個結合域)，較佳為包含僅少數胺基酸殘基(例如12個胺基酸殘基或小於12個胺基酸殘基)之肽連接子。因此，較佳為包含12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基之肽連接子。具有小於5個胺基酸之預期肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸，其中較佳為富含Gly之連接子。在該「肽連接子」之情形中，尤其較佳「單」胺基酸為Gly。因此，該肽連接子可 由單胺基酸Gly組成。
如本文中所用之術語「多特異性」係指結合分子(其為抗體構築體)且至少包含第一結合域及第二結合域，其中第一結合域能夠結合於一個抗原或目標，且第二結合域能夠結合於另一抗原或目標。因此，本發明之抗體構築體至少包含針對兩種不同抗原或目標之特異性且為至少雙特異性。本發明之「抗體構築體」亦包含多特異性結合分子，諸如三特異性結合分子，其中三特異性結合分子包括三個結合域。
亦預期本發明之抗體構築體除其結合於目標分子CDH19及CD3之功能外，亦具有其他功能。在此格式中，抗體構築體借助於經由結合於CDH19而靶向血漿細胞、經由CD3結合而介導細胞毒性T細胞活性及提供其他功能(諸如經由效應細胞(例如NK細胞)之募集而介導抗體依賴性細胞毒性之完全功能性Fc恆定域、治療劑(諸如毒素或放射性核種)及/或增強血清半衰期之手段等等)而為三功能或多功能抗體構築體。
就本發明而言，術語「結合域」表徵能夠特異性結合於目標分子CDH19及CD3上之既定目標抗原決定基或既定目標位點/與目標分子CDH19及CD3上之既定目標抗原決定基或既定目標位點相互作用的結構域。
結合域可來源於結合域供體，諸如抗體。預期本發明之結合域至少包含上述結合域中之任一者之該一部分，其中該一部分為結合於目標分子CDH19及CD3上之既定目標抗原決定基或既定目標位點/與目標分子CDH19及CD3上之既定目標抗原決定基或既定目標位點相互作用所需的。
預期上述結合域供體之結合域由該等供體中負責結合各別目標之部分表徵，亦即當自結合域供體移除該部分時，該供體失去其結合 能力。「失去」意謂與結合供體相比結合能力降低至少50%。用於映射定位該等結合位點之方法在此項技術中已為吾人所熟知-因此其屬於技術人員用於鎖定/定位結合域供體之結合位點且藉此自各別結合域供體「衍生」該結合域之標準知識範疇內。
術語「抗原決定基」係指抗原上由結合域(諸如抗體或免疫球蛋白或抗體或免疫球蛋白之衍生物或片段)特異性結合之位點。「抗原決定基」為抗原性的且因此術語抗原決定基在本文中有時亦稱為「抗原結構」或「抗原決定子」。因此，結合域為「抗原相互作用位點」。該結合/相互作用亦理解為定義「特異性識別」。在一個實例中，該結合域(其(以特異性方式)結合於目標分子CDH19及CD3上之既定目標抗原決定基或既定目標位點/與目標分子CDH19及CD3上之既定目標抗原決定基或既定目標位點相互作用)為抗體或免疫球蛋白，且該結合域為抗體或免疫球蛋白之VH及/或VL區。
「抗原決定基」可由鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸形成，該等鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸藉由蛋白質之三級摺疊而相鄰。「線性抗原決定基」為這樣一種抗原決定基：其中胺基酸一級序列包含所識別之抗原決定基。線性抗原決定基在單一序列中典型地包括至少3個或至少4個，且更通常至少5個或至少6個或至少7個，例如約8個至約10個胺基酸。
與線性抗原決定基不同，「構形抗原決定基」為這樣一種抗原決定基：其中包含抗原決定基之胺基酸之一級序列並非所識別之抗原決定基之唯一定義組分(例如其中胺基酸之一級序列未必由結合域識別之抗原決定基)。典型地，構形抗原決定基與線性抗原決定基相比包含增加之數目之胺基酸。關於構形抗原決定基之識別，結合域識別抗原(較佳肽或蛋白質或其片段)之三維結構(在本發明之上下文中，一個結合域之抗原包含於CDH19蛋白質內)。舉例而言，當蛋白質分子摺 疊形成三維結構時，某些形成構形抗原決定基之胺基酸及/或多肽主結構變為相鄰，從而使抗體能夠識別抗原決定基。確定抗原決定基之構形之方法包括(但不限於)X射線結晶學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜學及位點引導之自旋標記及電子順磁共振(EPR)光譜學。此外，所提供之實例描述另一種藉由分級來表徵既定結合域之方法，其包括用於確定既定結合域是否結合於既定蛋白質(尤其CDH19)之一或多個抗原決定基叢集的測試。
如本文中所用，術語「抗原決定基叢集」表示屬於抗原之所定義之鄰接延伸子中的全部抗原決定基。抗原決定基叢集可包含一個、兩個或兩個以上抗原決定基。抗原決定基叢集之概念亦用於本發明之抗體構築體之特徵之表徵。
根據本發明，術語「(能夠)結合於」、「特異性識別」、「針對」及「與……反應」意謂結合域能夠與抗原決定基之一或多個，較佳至少兩個，更佳至少三個且最佳至少四個胺基酸相互作用。
如本文中所用，術語「特異性相互作用」或「特異性結合」意謂結合域對特定蛋白質或抗原呈現顯著親和力且通常不對除CDH19或CD3以外的蛋白質或抗原呈現顯著反應性。「顯著親和力」包括以約10-6M(KD)或更強的親和力結合。較佳在結合親和力為約10-12至10-8M、10-12至10-9M、10-12至10-10M、10-11至10-8M，較佳約10-11至10-9M時認為結合為特異性的。可尤其藉由將該結合域與目標蛋白質或抗原之反應與該結合域與除CDH19或CD3以外的蛋白質或抗原之反應進行比較來測試結合域是否與目標特異性反應或特異性結合於目標。本發明之結合域較佳本質上不結合於或不能結合於除CDH19或CD3以外的蛋白質或抗原(亦即第一結合域不能結合於除CDH19以外的蛋白質且第二結合域不能結合於除CD3以外的蛋白質)。
術語「本質上不結合」或「不能結合」意謂本發明之結合域不 與除CDH19或CD3以外的另一蛋白質或抗原結合，亦即對除CDH19或CD3以外的蛋白質或抗原所展示的反應性不超過30%，較佳不超過20%，更佳不超過10%，尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%，藉此分別將結合於CDH19或CD3設定為100%。
咸信特異性結合係由結合域及抗原之胺基酸序列中之特異性主結構實現。因此，結合係作為其一級、二級及/或三級結構之結果以及該結構之二級修飾之結果實現。抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用可引起該位點與抗原之簡單結合。此外，抗原相互作用位點與其特異性抗原之特異性相互作用可或者或另外引起信號起始，例如由於抗原之構形之改變之誘導、抗原之寡聚等。
蛋白質(包括其片段，較佳生物學活性片段，及肽，通常具有小於30個胺基酸)包含一或多個經由共價肽鍵彼此偶合之胺基酸(產生胺基酸鏈)。如本文中所用之術語「多肽」描述一組分子，其由超過30個胺基酸組成。多肽可進一步形成多聚物，諸如二聚物、三聚物及更高級寡聚物，亦即由一個以上多肽分子組成。形成該等二聚物、三聚物等之多肽分子可相同或不同。因此，將該等多聚體之相應更高級結構稱為均二聚物或雜二聚物，均三聚物或雜三聚物等。雜多聚物之實例為抗體分子，其天然存在之形式由兩個相同輕多肽鏈及兩個相同重的多肽鏈組成。術語「多肽」及「蛋白質」亦係指經天然修飾之多肽/蛋白質，其中修飾係例如藉由轉譯後修飾(例如糖基化作用、乙醯化作用、磷酸化作用及其類似作用)實現。當在本文中參考時，「多肽」亦可經化學修飾，諸如聚乙二醇化。該等修飾在此項技術中已為吾人所熟知。
當用於描述本文中揭示之抗體構築體時，「經分離」意謂自其產生環境之組分經鑑別、分離及/或回收之抗體構築體。經分離之抗體構築體較佳不與其產生環境中之所有其他組分相結合。其產生環境中 之污染物組分(諸如由經重組型轉染之細胞產生之組分)為將典型地妨礙多肽之診斷性或治療性用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，抗體構築體將按以下方式純化(1)使用旋杯式序列分析儀達到足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或(2)使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色法在非還原性或還原性條件下藉由SDS-PAGE達到均質。然而，通常將藉由至少一個純化步驟製備經分離之抗體。
涵蓋本文中所描述之抗體構築體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。藉由將適當核苷酸改變引入抗體構築體核酸或藉由肽合成來製備抗體構築體之胺基酸序列變異體。
該等修飾包括例如抗體構築體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或其中之插入及/或取代。可產生缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，限制條件為最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變抗體構築體之轉譯後方法，諸如改變糖基化作用位點之數目或位置。較佳為CDR中之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸可經取代，而構架區(FR)中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸可經取代。取代較佳為如本文中所描述之保守性取代。另外或替代性地，可在每一個CDR中插入或刪除1、2、3、4、5或6個胺基酸(當然視CDR之長度而定)，而可在每一個FR中插入或刪除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。
一種鑑別抗體構築體中作為突變誘發之較佳位置之某些殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham及Wells於Science,244：1081-1085(1989)中描述。此處，抗體構築體內之殘基或目標殘基之群經鑑別(例如帶電荷殘基，諸如arg、asp、his、lys及 glu)且由中性或帶負電荷胺基酸(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)置換以實現胺基酸與抗原決定基之相互作用。
接著藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外或其他的變異體來改進該等表示對取代之功能敏感性的胺基酸位置。因此，儘管用於引入胺基酸序列變化之位點係預定的，但突變本身之性質無需預定。舉例而言，為了分析既定位點處突變之效能，在目標密碼子或區域處進行ala掃描或隨機突變誘發，且針對所需活性篩檢經表現之抗體構築體變異體。
胺基酸序列插入較佳包括與含有一百個或一百個以上殘基之多肽的長度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單胺基酸殘基或多胺基酸殘基之序列內插入。抗體構築體之插入變異體包括與針對酶之抗體之N端或C端之融合或與增加抗體之血清半衰期之多肽之融合。
另一類變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體較佳在抗體構築體中具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基經不同殘基置換。最受關注的取代性突變誘發位點包括重鏈及/或輕鏈之CDR，詳言之，高變區，但亦涵蓋重鏈及/或輕鏈中之FR變化。
舉例而言，若CDR序列涵蓋6個胺基酸，則預期此等胺基酸中之一個、兩個或三個經取代。類似地，若CDR序列涵蓋15個胺基酸，則預期此等胺基酸中之一個、兩個、三個、四個、五個或六個經取代。
通常，若重鏈及/或輕鏈之一或多個CDR或所有CDR中之胺基酸經取代，則較佳由此獲得之「經取代之」序列與「原始」CDR序列具有至少60%，更佳65%，甚至更佳70%，尤其較佳75%，更尤其較佳80%一致性。此意謂CDR與「經取代之」序列之一致程度視CDR之長度而定。舉例而言，具有5個胺基酸之CDR較佳與其經取代之序列具有80%一致性以便使至少一個胺基酸經取代。因此，抗體構築體之 CDR可與其經取代之序列具有不同程度之一致性，例如CDRL1可具有80%，而CDRL3可具有90%。
較佳取代(或置換)為保守性取代。然而，涵蓋任何取代(包括非保守性取代或以下表1中列舉之「例示性取代」中之一或多者)，只要抗體構築體保留其經由第一結合域結合於CDH19及經由第二結合域結合於CD3ε之能力及/或其CDR與由此經取代之序列具有一致性(與「原始」CDR序列具有至少60%，更佳65%，甚至更佳70%，尤其較佳75%，更尤其較佳80%一致性)即可。
保守性取代展示於表1中之「較佳取代」標題下。若該等取代引起生物活性改變，則可引入表1中命名為「例示性取代」或如下文關於胺基酸類別進一步描述的更顯著改變，且針對所需特徵篩檢產物。
本發明之抗體構築體之生物學性質之顯著改良係藉由選擇在保持以下各者之作用方面顯著不同的取代來實現：(a)取代區域中多肽 主結構之結構，例如呈片狀或螺旋狀構形，(b)目標位點處分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈之主體。基於常見側鏈性質將天然存在之殘基分類：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：asn、gin、his、lys、arg；(5)影響鏈定向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。
非保守性取代需要將該等類別中之一者之成員變換為另一種。任何與保持抗體構築體之適當構形無關的半胱胺酸殘基均可經取代(通常經絲胺酸取代)以改良分子之氧化穩定性及防止異常交聯。相反，可向抗體中添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性(尤其當抗體為抗體片段(諸如Fv片段)時)。
取代性變異體之尤其較佳類型涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體與產生其之親本抗體相比將具有經改良之生物學性質。產生該等取代性變異體之便利方式涉及使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，若干高變區位點(例如6-7個位點)經突變以產生各位點處之所有可能胺基酸取代。由此產生之抗體變異體自絲狀噬菌體粒子以單價方式呈現，如與封裝於各粒子內之M13之基因III產物融合。接著如本文中所揭示篩檢經噬菌體呈現之變異體之生物活性(例如結合親和力)。為了鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別對抗原結合起顯著作用的高變區殘基。或者或另外，可有利地分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別結合域與例如人類CDH19之間的接觸點。根據本文中詳細說明之技術，該等接觸殘基及相鄰殘基為用於取代之候選物。一旦產生該等變異體，則本文中所描述使變異體之板經歷篩檢且可選擇在一或多個相關分析法中具有更優良性質的抗體以用於進一步研究。
本文中涵蓋抗體構築體之其他修飾。舉例而言，抗體構築體可連接至多種非蛋白質聚合物中之一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚環氧烷或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。亦可在藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別例如為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中捕獲抗體構築體。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Oslo,A.編,(1980)中。
本文中揭示之抗體構築體亦可調配為免疫脂質體。「脂質體」為由各種類型之脂質、磷脂及/或表面活性劑組成的小型微脂粒，其適用於向哺乳動物遞送藥物。與生物膜之脂質配置類似，脂質體之組分通常以雙層形式排列。含有抗體之脂質體係藉由此項技術中已知的方法製備，諸如Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77：4030(1980)；美國專利第4,485,045號及第4,544,545號；以及1997年10月23日公開之WO 97/38731中所描述。具有增強之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其適用脂質體可使用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生型磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物藉由逆相蒸發法產生。經由具有預定微孔尺寸之過濾器擠壓脂質體以產生具有所需直徑的脂質體。本發明之抗體之Fab'片段可經由二硫化物互換反應與如Martin等人J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所描述之脂質體結合。脂質體內可視情況含有化學治療劑。參見Gabizon等人J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
當使用重組技術時，抗體構築體可在細胞內、在壁膜間隔中產生，或直接分泌至培養基中。若在細胞內產生抗體構築體，則作為第一步驟，藉由例如離心或超濾作用移除顆粒碎屑(宿主細胞或細胞溶 解片段)。Carter等人,Bio/Technology 10：163-167(1992)描述用於分離抗體(其分泌至大腸桿菌(E.coli)之壁膜間隙中)之程序。
由細胞製備之抗體構築體組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析純化，其中親和層析為較佳純化技術。
術語「核酸」已為技術人員所熟知且涵蓋DNA(諸如cDNA)及RNA(諸如mRNA)。核酸可為雙股及單股，直線形及環形。該核酸分子較佳包含於載體中，該載體較佳包含於宿主細胞中。該宿主細胞，例如在經本發明之核酸序列轉型或轉染後，能夠表現抗體構築體。為達成該目的，核酸分子與控制序列操作性連接。
載體為核酸分子，其係用作媒劑以將(外部)遺傳物質轉移至細胞中。術語「載體」涵蓋(但不限於)質體、病毒、黏質體及人工染色體。通常，經工程改造之載體包含複製起點、多選殖位點及可選擇標記。載體本身通常為核苷酸序列，通常為DNA序列，其包含插入物(轉殖基因)及充當載體之「主結構」的較大序列。現代載體可涵蓋除轉殖基因插入物及主結構以外的其他特徵：啟動子、遺傳標記、抗生素抗性、報導基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。特定稱為表現載體(表現構築體)之載體係用於目標細胞中轉殖基因之表現，且通常具有控制序列，諸如驅動轉殖基因之表現的啟動子序列。通常將載體插入目標細胞中稱為「轉型」(對於細菌)、「轉染」(對於真核細胞)，但病毒載體之插入亦稱為「轉導」。
如本文中所用，術語「宿主細胞」意欲指其中藉由轉型、轉染及其類似方法而引入編碼本發明之抗體構築體之核酸的細胞。應理解，該等術語意欲不僅指代特定個體細胞，且亦指代該細胞之後裔或潛在後裔。因為後代中可能由於突變或環境影響而存在某些修飾，因此實情為，該後裔可不與母細胞相同，但仍屬於如本文中使用之術語之範疇內。
如本文中所用，術語「表現」包括任何與本發明之抗體構築體之產生有關的步驟，包括(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。
術語「控制序列」係指特定宿主有機物中可操作地連接之編碼序列之表現所必需的DNA序列。舉例而言，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。
當核酸與另一核酸序列之間存在功能關係時，其為「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽之分泌的前蛋白質，則其與多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或強化子影響序列之轉錄，則其與編碼序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經安置以促進轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。通常，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列鄰接，且在分泌性前導序列情況下，相鄰且在讀取相(reading phase)中。然而，強化子無需為相鄰的。連接係由便利的限制位點處之接合實現。若該等位點不存在，則根據習知實踐使用合成性寡核苷酸接附子或連接子。
術語「宿主細胞」、「目標細胞」或「接受細胞」意欲包括任何可成為或已成為載體之接受者或可合併或已合併外源核酸分子、聚核苷酸及/或蛋白質的個別細胞或細胞培養物。其亦意欲包括單一細胞之後裔，且由於天然、偶然或故意的突變，該後裔可無需與原始母細胞完全相同的(形態方面或基因組方面或全部DNA補體方面)。細胞可為原核細胞或真核細胞，且包括(但不限於)細菌、酵母細胞、動物細胞及哺乳動物細胞，例如鼠類、大鼠、獼猴或人類。
合適宿主細胞包括原核生物及真核生物的宿主細胞，包括酵母、真菌、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。
本發明之抗體構築體可在細菌中產生。在表現後，本發明之抗 體構築體，較佳抗體構築體係在可溶部分中自大腸桿菌細胞糊狀物分離且可經由例如親和層析及/或尺寸排阻而純化。可與用於純化表現於例如CHO細胞中之抗體之方法類似地進行最終純化。
除原核生物外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為適用於本發明之抗體構築體之選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見的麵包酵母(baker's yeast)為最常用的。然而，多種其他屬、物種及品系通常可用且適用於本文中，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母宿主(Kluyveromyces hosts)，諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、魏氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC 24178)、克魯維雄酵母(K.waltii)(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；解脂耶氏酵母(yarrowia)(EP 402 226)；甲醇酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070)；念珠菌屬(Candida)；里氏木黴(Trichoderma reesia)(EP 244 234)；粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa)；許旺酵母(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，諸如脈孢菌(Neurospora)、青黴菌(Penicillium)、彎頸黴素(Tolypocladium)及麴菌(Aspergillus)宿主，諸如構巢麯黴(A.nidulans)及黑麯黴(A.niger)。
適用於本發明之糖基化抗體構築體(較佳為抗體衍生型抗體構築體)之表現的宿主細胞係來源於多細胞有機物。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已發現許多桿狀病毒株及變異體以及相應的來自宿主(諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)(毛蟲(caterpillar))、、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子(mosquito))、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子(mosquito))、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果 蠅(fruit fly))及家蠶(Bombyx mori))之容許昆蟲宿主細胞。多種用於轉染之病毒株可公開獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5品系，且根據本發明，該等病毒可用作本文中之病毒，尤其用於草地黏蟲細胞之轉染。
棉花、玉蜀黍、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿、芥菜(Arabidopsis)及菸草之植物細胞培養亦可用作宿主。適用於植物細胞培養中蛋白質之產生的選殖及表現載體為熟習此項技術者已知。參見例如Hiatt等人,Nature(1989)342：76-78；Owen等人(1992)Bio/Technology 10：790-794；Artsaenko等人(1995)The Plant J 8：745-750；及Fecker等人(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。
然而，最關注脊椎動物細胞，且脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中之繁殖已變為常規程序。合適哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7、ATCC CRL 1651)；人類胎腎細胞株(293細胞或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人,J.Gen Virol.36：59(1977))；倉鼠仔腎細胞(BHK、ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell)/-DHFR(CHO，CHO,Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76、ATCC CRL1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138、ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2、1413 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562、ATCC CCL5 1)；TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
當使用重組技術時，本發明之抗體構築體可在細胞內、在壁膜 間隔中產生，或直接分泌至培養基中。若在細胞內產生抗體構築體，則作為第一步驟，藉由例如離心或超濾作用移除顆粒碎屑(宿主細胞或細胞溶解片段)。Carter等人,Bio/Technology 10：163-167(1992)描述用於分離抗體(其分泌至大腸桿菌(E.coli)之壁膜間隙中)之程序。簡言之，細胞糊狀物在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下經約30分鐘解凍。可藉由離心來移除細胞碎片。當抗體分泌至培養基中時，來自該等表現系統之上清液通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮。任一個上述步驟中均可包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白水解作用且可包括抗生素以防止偶生污染物之生長。
由宿主細胞製備之本發明之抗體構築體可使用例如羥磷灰石、層析、凝膠電泳、透析及親和層析純化，其中親和層析為較佳純化技術。
親和性配位體所附著之基質最通常為瓊脂糖，但亦可使用其他基質。機械穩定基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)與瓊脂糖相比可實現更快的流動速率及更短的處理時間。當本發明之抗體構築體包含CH3結構域時，Bakerbond ABXMresin(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。亦可視所回收之抗體而使用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換柱上之部分分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽上之層析、肝素上之層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)上之SEPHAROSETM層析、聚焦層析、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
術語「培養」係指細胞在培養基中於合適條件下之活體外保持、分化、生長、增殖及/或繁殖。
如本文中所用，術語「醫藥組合物」係關於用於投與患者，較佳人類患者之組合物。本發明之特定較佳醫藥組合物包含本發明之抗 體構築體。醫藥組合物較佳包含載劑、穩定劑及/或賦形劑之合適調配物。在較佳實施例中，醫藥組合物包含用於非經腸、經皮、管腔內、動脈內、鞘內腔及/或鼻內投與或藉由直接注入組織中來投與的組合物。尤其涵蓋該組合物係經由輸注或注射來投與患者。合適組合物之投藥可由不同方式實現，例如藉由靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或皮內投藥。詳言之，本發明提供合適組合物之不間斷投藥。作為非限制性實例，不間斷(亦即連續)投藥可借助於由患者使用的小型泵系統實現，該小型泵系統實現係用於對流入患者體內之治療劑進行計量。包含本發明之抗體構築體之醫藥組合物可使用該等泵系統投與。該等泵系統通常此項技術中已知，且通常依賴於含有待注入治療劑之藥筒之週期性更換。當更換該泵系統中之藥筒時，可能會暫時中斷治療劑不間斷地流入患者體內。在該情況下，在藥筒置換之前的投藥階段及藥筒置換之後的投藥階段仍將視為屬於醫藥學手段之含義內且本發明之方法共同組成該治療劑之一次「連續投藥」。
本發明之該等抗體構築體之連續或不間斷投藥可藉由流體遞送裝置或小型泵系統(包括用於驅動流體離開儲集層之流體驅動機構及用於啟動驅動機構之啟動機構)以靜脈內或皮下方式進行。用於皮下投藥之泵系統可包括用於滲透患者皮膚及將合適組合物遞送至患者體內之針或套管。該等泵系統可與靜脈、動脈或血管無關地直接固定或附著至患者皮膚，藉此實現泵系統與患者皮膚之間的直接接觸。泵系統可附著至患者皮膚保持24小時至若干天。泵系統可為小型尺寸，其具有用於小體積之儲集層。作為非限制性實例，用於待投與之合適醫藥組合物之儲集層的體積可介於0.1ml與50ml之間。
連續投藥可藉由在皮膚上使用貼片且不時地進行更換而以經皮方式進行。熟習此項技術者將意識到用於藥物遞送之貼片系統適用於此目的。應注意，經皮投藥尤其適用於不間斷投藥，因為更換第一張 廢棄的貼片可有利地與放置新的第二張貼片(例如在與第一張廢棄的貼片緊鄰的皮膚表面上且在即將移除第一張廢棄的貼片之前)同時完成。不會出現流動中斷或電池故障等問題。
本發明之組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑。合適的醫藥載劑之實例在此項技術中已為吾人所熟知且包括溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液)、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型的濕潤劑、無菌溶液、脂質體等。可藉由熟知的習知方法調配包含該等載劑之組合物。調配物可包含碳水化合物、緩衝溶液、胺基酸及/或界面活性劑。碳水化合物可為非還原糖，較佳為海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、山梨糖醇或木糖醇。通常，如本文中所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意謂任何及所有與醫藥投藥相容之溶劑、分散介質、塗層、抗微生物劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑。該等介質及試劑在醫藥學活性物質中之用途在此項技術中已為吾人所熟知。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑係在所用劑量及濃度下對接受者無毒性且包括：其他緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；螯合劑，諸如EDTA；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；生物可降解聚合物，諸如聚酯；成鹽相對離子，諸如鈉、多羥糖醇；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、天冬醯胺、2-苯丙胺酸及蘇胺酸；糖或糖醇，諸如海藻糖、蔗糖、八硫酸鹽、山梨糖醇或木糖醇、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、內消旋肌糖(myoinisitose)、半乳糖、乳糖醇、核糖醇、內消旋肌醇、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如麩胱甘肽、硫辛酸、氫硫乙酸鈉、硫甘油、[α]-單硫甘油及硫基硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；及親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮。該等調配物可藉由及/或不藉由泵系統而用於連續投藥(可以靜脈內或皮下方式進行)。胺基酸可為帶電胺基酸，較佳為離胺酸、 乙酸離胺酸、精胺酸、麩胺酸及/或組胺酸。界面活性劑可為清潔劑(其分子量較佳>1.2KD)及/或聚醚(其分子量較佳>3KD)。較佳清潔劑之非限制性實例為Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80或Tween 85。較佳聚醚之非限制性實例為PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000或PEG 5000。本發明中使用之緩衝液系統可具有5-9之較佳pH值且可包含檸檬酸鹽、丁二酸鹽、磷酸鹽、組胺酸及乙酸鹽。
本發明之組合物可以合適劑量投與個體，該合適劑量可例如藉由投與非黑猩猩類靈長類動物(例如獼猴)呈現本文中所描述之跨物種特異性之遞增劑量之本發明之多肽由劑量遞增研究確定。如上文所闡述，呈現本文中所描述之跨物種特異性之本發明之抗體構築體可有利地以相同形式用於非黑猩猩類靈長類動物中之臨床前測試中及作為藥物用於人類中。該等組合物亦可與其他蛋白質及非蛋白質藥物組合投與。該等藥物可與包含如本文中定義之本發明之多肽的組合物同時投與，或在該多肽之投藥之前或之後以即時定義之時間間隔及劑量單獨投與。給藥方案將由主治醫師及臨床因素確定。如醫藥技術中所熟知，用於任一個患者之劑量均視多種因素而定，包括患者體型、體表面積、年齡、所投與之特定化合物、性別、投藥時間及途徑、一般健康狀況及同時投與的其他藥物。
用於非經腸投藥之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、乙醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括生理食鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖及氯化鈉、乳酸化林格氏溶液(lactated Ringer's)或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養物補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之補充劑)及其類似物。亦可存在防腐劑及其他添加劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、 螯合劑、惰性氣體及其類似物。此外，本發明之組合物可包含蛋白質載劑，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，較佳為人類來源。視組合物之所欲用途而定，除本文中定義之本發明之多肽外，預期本發明之組合物可進一步包含生物活性劑。該等試劑可為作用於胃-腸系統之藥物、充當抗癌藥(cytostatica)之藥物、預防高尿酸血症之藥物、抑制免疫反應之藥物(例如皮質類固醇)、調節發炎性反應之藥物、作用於循環系統之藥物及/或此項技術中已知的諸如細胞激素之試劑。亦涵蓋本發明之抗體構築體用於共同療法中，亦即與另一種抗癌藥劑組合。
本文中定義之醫藥組合物之生物活性可例如藉由細胞毒性分析法確定，如以下實例、WO 99/54440中或由Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)所描述。如本文中所用之「功效」或「活體內功效」係指對本發明之醫藥組合物之療法的反應，使用例如標準化NCI反應準則。使用本發明之醫藥組合物之療法的成果或活體內功效係指組合物達成其所欲目的之有效性，亦即組合物引起其所需效果(亦即消耗病理性細胞，例如腫瘤細胞)之能力。活體內功效可由用於各別病種之公認的標準方法監測，包括(但不限於)白血球計數、差異、螢光活化細胞分類、骨髓穿刺。此外，可使用各種疾病特定臨床化學參數及其他公認的標準方法。此外，可使用電腦輔助斷層攝影術、X射線、核磁共振斷層攝影術(例如用於基於國立癌症研究所(National Cancer Institute)準則之反應評估[Cheson BD,Horning SJ,Coiffier B,Shipp MA,Fisher RI,Connors JM,Lister TA,Vose J,Grillo-Lopez A,Hagenbeek A,Cabanillas F,Klippensten D,Hiddemann W,Castellino R,Harris NL,Armitage JO,Carter W,Hoppe R,Canellos GP.Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas.NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol.1999年4月；17(4)：1244])、正電子發射斷層攝影術掃描、白血球計數、差異、螢光活化細胞分類、骨髓穿刺、淋巴結活組織檢驗/組織學及各種淋巴瘤特定臨床化學參數(例如乳酸脫氫酶)及其他公認的標準方法。
藥物(諸如本發明之醫藥組合物)研究過程中的另一主要挑戰為藥物動力學性質之可預測的調節。為此，可確定候選藥物之藥物動力學概況，亦即影響特定藥物治療既定病狀之能力的藥物動力學參數之概況。藥物之影響藥物治療某一病種之能力的藥物動力學參數包括(但不限於)：半衰期、分佈體積、肝臟首次代謝及血清結合程度。既定藥物試劑之功效可受以上所提及之參數中的每一者影響。
「半衰期」意謂所投與之藥物之50%經由生物過程(例如代謝排泄等)而清除所需的時間。
「肝臟首次代謝」意謂藥物在與肝臟首次接觸時(亦即在其首次通過肝臟期間)的代謝傾向。
「分佈體積」意謂體內各區域(例如細胞內及細胞間隙、組織及器官等)中藥物之滯留程度，及該等區域內藥物之分佈。
「血清結合程度」意謂藥物與血清蛋白(諸如白蛋白)相互作用及結合於血清蛋白(引起藥物之生物活性降低或損失)的傾向。
藥物動力學參數亦包括所投與之既定量藥物之生物可用性、延遲時間(Tlag)、Tmax、吸收率、更高的作用(more onset)及/或Cmax。「生物可用性」意謂血液腔中之藥物量。「延遲時間」意謂藥物投藥與其在血液或血漿中之偵測及可量測性之間的時間延遲。
「Tmax」為達到藥物之最大血液濃度所需的時間，且「Cmax」為使用既定藥物獲得之最大血液濃度。達到藥物之生物效應所需的血液或組織濃度所需要的時間受所有參數影響。呈現跨物種特異性之雙特異性單鏈抗體之藥物動力學參數(其可如上文所概述在非黑猩猩類 靈長類動物中於臨床前動物測試中確定)亦闡述於例如Schlereth等人之公開案中(Cancer Immunol.Immunother.20(2005),1-12)。
如本文中所用之術語「毒性」係指在不良事件或嚴重不良事件中呈現之藥物之毒性作用。該等副作用可指全身性藥物可耐受性不足及/或投藥後局部耐受性不足。毒性亦可包括由藥物引起之畸形發生或致癌作用。
如本文中所用之術語「安全性」、「活體內安全性」或「可耐受性」定義投與藥物而不在投藥後(局部耐受性)及較長藥物施用週期期間引起嚴重的不良事件。「安全性」、「活體內安全性」或「可耐受性」可例如在治療及後續處理週期期間每隔一定時間進行評估。量測包括臨床評估(例如器官表現)及實驗室檢查異常(laboratory abnormalities)之篩檢。可根據NCI-CTC及/或MedDRA標準進行臨床評估且記錄/編碼與正常結果之偏差。器官表現可包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律不整、凝血及其類似物之準則，如例如常見不良事件評價標準v3.0(Common Terminology Criteria for adverse events；CTCAE)中所闡述。可測試之實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血概況及尿分析以及其他體液(諸如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液劑(liquor)及其類似物)之檢驗。因此可例如藉由物理檢驗、成像技術(亦即超音波、X射線、CT掃描、磁共振成像(MRI))、使用技術裝置進行之其他量測方法(亦即心電圖)、生命徵象，由量測實驗室參數及記錄不良事件來評估安全性。舉例而言，可藉由組織病理學及/或組織化學方法檢驗本發明之用途及方法中非黑猩猩類靈長類動物中之不良事件。
術語「有效劑量」定義為足以實現或至少部分實現所需作用的量。術語「治療有效劑量」定義為足以在已罹患疾病之患者中治癒或至少部分阻滯該疾病及其併發症之量。可有效實現此用途之量將視感 染之嚴重性及個體自身免疫系統之一般狀況而定。術語「患者」包括接受預防性或治療性處理之人類及其他哺乳動物個體。
如本文中所用之術語「有效且無毒性劑量」係指本發明之抗體構築體之可耐受劑量，其足夠高以引起消耗病理性細胞、腫瘤消除、腫瘤縮小或疾病穩定而不存在或本質上不存在主要毒性作用。該等有效且無毒性劑量可例如藉由此項技術中所描述之劑量擴大研究確定且應低於可引起嚴重不良副作用(劑量限制性毒性，DLT)之劑量。
以上術語亦可參考例如Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；1997年7月16日舉行之ICH Steering Committee會議。
本發明之抗體構築體之合適劑量或治療有效量將視所治療之病狀、病狀之嚴重性、先前療法以及患者之病史及對治療劑之反應而定。可根據主治醫師之判斷調節適當劑量使得其可一次性或經一系列投藥投與患者。醫藥組合物可作為單一治療物或視需要與其他療法(諸如抗癌症療法)組合投與。
本發明之醫藥組合物尤其適用於非經腸投藥，亦即皮下、肌肉內、靜脈內、關節內及/或滑膜內投藥。非經腸投藥可藉由快速注射或連續輸注進行。
若醫藥組合物經凍乾，則在投藥之前首先在合適液體中將凍乾物質復原。凍乾物質可在例如抑菌注射用水(BWFI)、生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或與在凍乾之前蛋白質所處之調配物相同的調配物中復原。
在專利mRNA表現資料之內部分析中，意外發現與正常、未轉型組織相比，原發性及轉移性黑素瘤中之CDH19表現升高。內部分析亦證實正常組織中CDH19之表現僅限於神經脊衍生之周邊神經結及神經纖維。正常及腫瘤組織中之不同CDH19表現使此蛋白質具有用於細胞 表面靶向治療之吸引力。儘管已將CDH19論述為作為與一些癌症類型(參見例如WO2009/055937)或帕金森氏病(Parkinson's disease)(參見例如WO2005/067391)相關聯之長標記列表之一部分的一個標記，但從未將CDH19論述為與黑素瘤有關之預後標記或藥物目標。
如上文所述，本發明提供經分離之多特異性抗體構築體，其包含能夠結合於目標細胞表面上之人類CDH19的第一人類結合域及能夠結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結構域。
「CDH19細胞外結構域」或「CDH19 ECD」係指CDH19之本質上不含CDH19之跨膜結構域及細胞質結構域的形式。熟練技術人員將理解，所鑑別之本發明之CDH19多肽之跨膜結構域係根據此項技術中通常用於鑑別該類型之疏水性結構域的準則鑑別。跨膜結構域之精確邊界可變化，但該變化在本文中特定提及之結構域之任一端處通常不超過約5個胺基酸。較佳人類CDH19 ECD展示於SEQ ID NO：948中。在此情形下，應理解，CDH19 ECD表示CDH19在目標細胞表面上之部分。
T細胞CD3受體複合物為蛋白質複合物且由四個不同鏈組成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ鏈、CD3δ鏈及兩個CD3ε(ε)鏈。該等鏈與稱為T細胞受體(TCR)之分子相關聯且ζ鏈產生T淋巴細胞中之啟動信號。
由多特異性(至少雙特異性)抗體構築體經由T細胞募集進行之目標細胞之重新引導溶解涉及細胞溶解突觸形成以及穿孔素及顆粒酶之遞送。嚙合T細胞能夠進行連續目標細胞溶解，且不受免疫逃避機能(其妨礙肽抗原處理及呈現)或純系T細胞分化影響；參見例如WO 2007/042261。
第一結合域對人類CDH19之親和力較佳15nM，更佳10nM，甚至更佳5nM，甚至更佳1nM，甚至更佳0.5nM，甚至更佳0.1 nM且最佳0.05nM。第一結合域對獼猴CDH19之親和力較佳15nM，更佳10nM，甚至更佳5nM，甚至更佳1nM，甚至更佳0.5nM，甚至更佳0.1nM，且最佳0.05nM或甚至0.01nM。可例如在Biacore分析法或Scatchard分析法中量測親和力，例如實例中所描述。與獼猴CDH19之結合之親和力間隙與人類CDH19相比較佳為[1：10-1：5]或[5：1-10：1]，更佳為[1：5-5：1]，且最佳為[1：2-3：1]或甚至[1：1-3：1]。其他確定親和力之方法為技術人員所熟知。
人類抗體(分別地，人類抗體構築體)避免一些與具有鼠類或大鼠可變區及/或恆定區之抗體/抗體構築體有關的問題。該等鼠類或大鼠衍生型蛋白質之存在可引起抗體/抗體構築體之快速清除或可引起患者產生針對抗體/抗體構築體之免疫反應。為了避免使用鼠類或大鼠衍生型抗體/抗體構築體，可經由將人類抗體功能引入嚙齒動物使得嚙齒動物產生完全人類抗體來產生人類或完全人類抗體。
在YAC中選殖及重建構兆鹼基規模的人類基因座且將其引入小鼠生殖系中之能力提供強大的說明極大或粗略地定位之基因座之功能組分以及產生人類疾病之有效模型的方法。此外，使用該技術用小鼠基因座之人類等效物取代小鼠基因座可提供對研究期間人類基因產物之表現及調節、其與其他系統之通信以及其與疾病誘導及進程之關聯的獨特見解。
該策略之重要實際應用為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源Ig基因已經不活化之小鼠可提供研究程式化表現之潛在機制及抗體之組合以及其在B細胞發育中之作用的機會。此外，該策略可提供產生完全人類單株抗體(mAb)之理想來源--實現可在人類疾病中使用抗體療法之重要里程碑。預期完全人類抗體/抗體構築體可最小化小鼠或小鼠衍生型mAb所固有的免疫原性及過敏性反應，且因此增加所投與之抗體/抗體構築體之功效及安全 性。預期使用完全人類抗體/抗體構築體可在需要重複化合物投藥之慢性及復發性人類疾病(諸如炎症、自體免疫及癌症)之治療中提供顯著優點。
一種達成此目標之方法為用人類Ig基因座之大型片段對小鼠抗體產生不足的小鼠品系進行工程改造，預期該等小鼠將在無小鼠抗體情況下產生人類抗體之大型譜系。大型人類Ig片段將保留大的可變基因多樣性以及抗體產生及表現之適當調節。藉由利用小鼠機制實現抗體多樣化及選擇以及對人類蛋白質之免疫耐受性不足，該等小鼠品系中所再生的人類抗體譜系應產生針對任何相關抗原(包括人類抗原)之高親和力抗體。使用融合瘤技術，可容易地產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類mAb。結合吾人進行之第一XenoMouse小鼠品系之產生來證明此一般策略，如1994年所公開(參見Green等人Nature Genetics 7：13-21(1994))。XenoMouse品系分別經含有人類重鏈基因座之245kb及190kb尺寸之生殖系組態片段及κ輕鏈基因座的酵母人工染色體(YAC)工程改造，該等片段含有核心可變區及恆定區序列識別符。已證明含有YAC之人類Ig在抗體之重排及表現方面均與小鼠系統相容且能夠取代不活化小鼠Ig基因。此係由其誘導B細胞發育、產生完全人類抗體之類成熟人類譜系及產生抗原特異性人類mAb之能力證明。該等結果亦表明引入含有較大數目之V基因、其他調節元素及人類Ig恆定區之人類Ig基因座的較大部分可實質上概括完全譜系，亦即對感染及免疫之人類體液反應之特徵。Green等人之工作最近擴展至經由分別引入人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之兆鹼基尺寸、生殖系組態YAC片段來引入超過約80%人類抗體譜系。參見Mendez等人Nature Genetics 15：146-156(1997)及1996年12月3日申請之美國專利申請案第08/759,620號，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
XenoMouse小鼠之產生進一步論述及描繪於1990年1月12日申請 之美國專利申請案第07/466,008號、1990年11月8日申請之第07/610,515號、1992年7月24日申請之第07/919,297號、1992年7月30日申請之第07/922,649號、1993年3月15日申請之第08/031,801號、1993年8月27日申請之第08/112,848號、1994年4月28日申請之第08/234,145號、1995年1月20日申請之第08/376,279號、1995年4月27日申請之第08/430,938號、1995年6月5日申請之第08/464,584號、1995年6月5日申請之第08/464,582號、1995年6月5日申請之第08/463,191號、1995年6月5日申請之第08/462,837號、1995年6月5日申請之第08/486,853號、1995年6月5日申請之第08/486,857號、1995年6月5日申請之第08/486,859號、1995年6月5日申請之第08/462,513號、1996年10月2日申請之第08/724,752號及1996年12月3日申請之第08/759,620號，及美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號及第5,939,598號以及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號。亦參見Mendez等人Nature Genetics 15：146-156(1997)以及Green及Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)。亦參見1996年6月12日授予之歐洲專利第EP 0 463151 B1號、1994年2月3日公開之國際專利申請案第WO 94/02602號、1996年10月31日公開之國際專利申請案第WO 96/34096號、1998年6月11日公開之WO 98/24893、2000年12月21日公開之WO 00/76310、WO 03/47336。以上引用之專利、申請案及參考文獻中之每一者之揭示內容均以全文引用的方式併人本文中。
在替代性方法中，其他機構(包括GenPharm International,Inc.)利用「微型基因座」方法。在微型基因座方法中，經由包含來自Ig基因座之片段(個別基因)來模仿外源Ig基因座。因此，一或多個V.sub.H基因、一或多個D.sub.H基因、一或多個J.sub.H基因、μ恆定區及第二恆定區(較佳為γ恆定區)形成為用於插入動物中之構築體。此方法描 述於Surani等人之美國專利第5,545,807號以及Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號及第6,255,458號；Krimpenfort及Berns之美國專利地5,591,669號及第6,023,010號；Berns等人之美國專利第5,612,205號、第5,721,367號及第5,789,215號；及Choi及Dunn之美國專利第5,643,763號；以及1990年8月29日申請之GenPharm國際美國專利申請案第07/574,748號、1990年8月31日申請之第07/575,962號、1991年12月17日申請之第07/810,279號、1992年3月18日申請之第07/853,408號、1992年6月23日申請之第07/904,068號、1992年12月16日申請之第07/990,860號、1993年4月26日申請之第08/053,131號、1993年7月22日申請之第08/096,762號、1993年11月18日申請之第08/155,301號、1993年12月3日申請之第08/161,739號、1993年12月10日申請之第08/165,699號、1994年3月9日申請之第08/209,741號，其揭示內容均以引用的方式併入本文中。亦參見歐洲專利第0 546 073 B1號、國際專利申請案第WO 92/03918號、第WO 92/22645號、第WO 92/22647號、第WO 92/22670號、第WO 93/12227號、第WO 94/00569號、第WO 94/25585號、第WO 96/14436號、第WO 97/13852號及第WO 98/24884號以及美國專利第5,981,175號，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。亦參見Taylor等人,1992；Chen等人,1993；Tuaillon等人,1993；Choi等人,1993；Lonberg等人,(1994)；Taylor等人,(1994)；及Tuaillon等人,(1995)；Fishwild等人,(1996)，其揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。
Kirin亦證明自小鼠產生人類抗體，該等小鼠中已經由微細胞融合而引入染色體之大型片段或整個染色體。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號，其揭示內容以引用的方式併入本文中。 Xenerex Biosciences正研究用於人類抗體之潛在產生之技術。在此技術中，用人類淋巴細胞(例如B細胞及/或T細胞)將SCID小鼠復原。接著用抗原使小鼠免疫且可產生針對抗原之免疫反應。參見美國專利第5,476,996號、第5,698,767號及第5,958,765號。
人類抗小鼠抗體(HAMA)反應引導企業製備嵌合型或以其他方式人類化之抗體。儘管嵌合抗體具有人類恆定區及鼠類可變區，但預期將觀測到某些人類抗嵌合抗體(HACA)反應，尤其在抗體之長期或多劑量使用中。因此，需要提供針對EGFRVIII之完全人類抗體以使HAMA或HACA反應之問題及/或作用失效。
可以各種方式量測由CDH19/CD3雙特異性抗體構築體介導之細胞毒性。效應細胞可為例如受刺激之經增殖之(人類)CD8陽性T細胞或未受刺激之(人類)末梢血液單核細胞(PBMC)。若目標細胞具有獼猴起源或表現或經獼猴CDH19轉染，則效應細胞亦應具有獼猴起源，諸如獼猴T細胞株，例如4119LnPx。目標細胞應表現CDH19(至少其細胞外結構域)，例如人類或獼猴CDH19。目標細胞可為經CDH19(例如人類或獼猴CDH19)穩定或短暫轉染之細胞株(諸如CHO)。或者，目標細胞可為CDH19陽性天然表現體細胞株，諸如人類骨髓瘤細胞株CHL-1或Colo-699。通常，預期在細胞表面上以較高量表現CDH19之目標細胞株的情況下之EC50值較低。效應子與目標細胞(E：T)之比率通常為約10：1，但亦可變化。可在51-鉻釋放分析法(約18小時培育時間)中或在基於FACS之細胞毒性分析法(約48小時培育時間)中量測CDH19/CD3雙特異性抗體構築體之細胞毒素活性。亦可修改分析法培育時間(細胞毒性反應)。其他量測細胞毒性之方法已為技術人員熟知且包含MTT或MTS分析法。基於ATP之分析法包括生物發光分析法、磺醯羅丹明B(sulforhodamine B；SRB)分析法、WST分析法、細胞群落分析法及ECIS技術。
較佳在基於細胞之細胞毒性分析法中量測由本發明之CDH19/CD3雙特異性抗體構築體介導之細胞毒素活性。其由EC50值表示，EC50值對應於最大有效濃度的一半(引起基線值與最大值之間的一半細胞毒素反應之抗體構築體之濃度)。CDH19/CD3雙特異性抗體構築體之EC50值較佳20.000pg/ml，更佳5000pg/ml，甚至更佳1000pg/ml，甚至更佳500pg/ml，甚至更佳350pg/ml，甚至更佳320pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳10pg/ml且最佳5pg/ml。
任一種上述既定EC50值均可與基於細胞之細胞毒性分析法中之任一種所示情形組合。舉例而言，當使用(人類)CD8陽性T細胞或獼猴T細胞株作為效應細胞時，CDH19/CD3雙特異性抗體構築體之EC50值較佳1000pg/ml，更佳500pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳10pg/ml且最佳5pg/ml。若在此分析法中目標細胞為經(人類或獼猴)CDH19轉染之細胞(諸如CHO細胞)，則CDH19/CD3雙特異性抗體構築體之EC50值較佳150pg/ml，更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳30pg/ml，甚至更佳10pg/ml且最佳5pg/ml。
若目標細胞為CDH19陽性天然表現體細胞株，則EC50值較佳350pg/ml，更佳320pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳200pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳150pg/ml，甚至更佳100pg/ml且最佳50pg/ml或更低。當使用(人類)PBMC作為效應細胞時，CDH19/CD3雙特異性抗體構築體之EC50值較佳1000pg/ml，更佳750pg/ml，更佳500pg/ml，甚至更佳350pg/ml，甚至更佳320pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml且最佳50pg/ml或更低。
個別CDH19/CD3雙特異性抗體構築體之單體同功異型物與二聚 同功異型物之間的細胞毒素活性的差異稱為「效能間隙」。此效能間隙可例如計算為分子之單體形式之EC50值與二聚形式之EC50值之間的比率。本發明之CDH19/CD3雙特異性抗體構築體之效能間隙較佳5，更佳4，甚至更佳3，甚至更佳2且最佳1。
本發明之抗體構築體為包含至少兩個結合域(具有或不具有肽連接子(間隔肽))之融合蛋白質。合適肽連接子包括美國專利4,751,180及4,935,233或WO 88/09344中所描述之肽連接子。另一種製備寡聚抗體構築體衍生物之方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈結構域為促進蛋白質(白胺酸拉鏈結構域產生於該等蛋白質中)之寡聚作用的肽。白胺酸拉鏈最初發現於若干DNA結合蛋白中(Landschulz等人,1988,Science 240：1759)，且隨後在多種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈包括天然存在之肽及其衍生物(二聚物或三聚物)。適用於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈結構域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且來源於肺界面活性蛋白質D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人,1994,FEBS Letters 344：191中，其以引用的方式併入本文中。可實現所融合之異源蛋白質之穩定三聚作用之經修飾之白胺酸拉鏈之用途描述於Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.6：267-78中。在一種方法中，包含與白胺酸拉鏈肽融合之CDH19抗體片段片段或衍生物之重組型融合蛋白質表現於合適宿主細胞中，且自培養物上清液回收所形成之可溶性寡聚CDH19抗體片段或衍生物。
抗原結合蛋白質之共價修飾包括於本發明之範疇內，且通常(但並非始終)在轉譯後進行。舉例而言，藉由使抗原結合蛋白質之特定胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N端殘基或C端殘基反應之有機衍生劑反應來將抗原結合蛋白質之若干種共價修飾引入分子中。
半胱胺醯基殘基最通常與α-鹵代乙酸酯(及相應胺)(諸如氯乙酸或 氯乙醯胺)反應以產生羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。亦藉由與溴三氟乙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、磷酸氯乙醯酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧-1,3-二唑。
藉由與焦碳酸二乙酯在pH 5.5-7.0下之反應來衍生組胺醯基殘基，因為此試劑對組胺醯基側鏈具有相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴化物亦適用；反應較佳在0.1M二甲胂酸鈉中於pH 6.0下進行。賴胺醯基及胺基末端殘基與丁二酸或其他羧酸酐反應。由該等試劑進行之衍生作用具有逆轉賴胺醯基殘基之電荷的作用。其他適用於衍生含有α-胺基之殘基的試劑包括亞胺酸酯，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2,4-戊二酮；及與乙醛酸之轉胺酶催化反應。
精胺醯基殘基係藉由與一種或若干種習知試劑反應來修飾，該等試劑包括苯甲醯甲醛、2,3-丁二酮、1,2-環己烷二酮及茚三酮。由於胍官能基之高pKa，精胺酸殘基之衍生作用需要在鹼性條件下進行反應。此外，該等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
可進行酪胺醯基殘基之特定修飾，尤其關注藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷之反應將光譜標記引人酪胺醯基殘基中。最通常，分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。使用125I或131I將酪胺醯基殘基碘化以製備經標記之蛋白質以用於放射免疫分析法中，上述氯胺T方法為合適的。
藉由與碳化二亞胺(R'-N=C=N--R')反應來選擇性修飾羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)，其中R及R'為視情況選用之不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽離子-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，藉由與銨離子之反應將天冬胺醯基及麩胺醯基殘基轉化為天冬醯胺醯基及穀胺醯胺醯基殘基。
與雙功能試劑之衍生作用適用於使抗原結合蛋白質與用於多種方法之水不溶物載體基質或表面交聯。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基醯亞胺酯(例如與4-疊氮基水楊酸形成之酯)、同型雙功能性亞胺酸酯(包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫基雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯))及雙功能性順丁烯二醯亞胺，諸如雙-N-馬來醯亞胺-1,8-辛烷。諸如甲基-3-[(對疊氮基苯基)二硫基]丙醯亞胺酸酯之衍生劑產生可光活化中間物，其能夠在光存在下形成交聯。或者，使用反應性水不溶基質(諸如溴化氰活化之碳水化合物)及美國專利第3,969,287號；第3,691,016號；第4,195,128號；第4,247,642號；第4,229,537號；及第4,330,440號中描述之反應性受質進行蛋白質固定。
通常將穀胺醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別脫醯胺化為相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，該等殘基在溫和酸性條件下脫醯胺化。該等殘基之任一種形式均屬於本發明之範疇內。
其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化作用；絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基之磷酸化作用；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983,第79-86頁)；N端胺之乙醯化作用；及任何C端羧基之醯胺化作用。
本發明之範疇內所包括的抗原結合蛋白質之另一種共價修飾包含改變蛋白質之糖基化作用模式。如此項技術中已知，糖基化作用模式可視蛋白質序列(例如存在或不存在特定糖基化作用胺基酸殘基，下文中論述)或產生蛋白質之宿主細胞或有機物而定。特定表現系統論述於下文中。
多肽之糖基化作用通常為N-連接型或O-連接型。N-連接型係指碳水化物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲 胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸)為碳水化物部分與天冬醯胺側鏈之酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在該等三肽序列中之任一種均可產生潛在糖基化作用位點。O-連接型糖基化作用係指糖類N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接至羥胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基賴胺酸。
藉由改變胺基酸序列使得其含有一或多個上述三肽序列來便利地實現在抗原結合蛋白質中添加糖基化作用位點(對於N-連接型糖基化作用位點)。亦可藉由在起始序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或進行一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來進行改變(對於O-連接型糖基化作用位點)。為方便起見，較佳經由DNA含量變化來改變抗原結合蛋白質胺基酸序列，尤其藉由使編碼目標多肽之DNA中預先選擇之鹼基突變使得產生將轉譯為所需胺基酸的密碼子來改變。
另一增加抗原結合蛋白質上碳水化合物部分之數目之方法為藉由醣苷與蛋白質之化學或酶促偶合。該等程序之有利之處在於其無需在具有進行N-連接型及O-連接型糖基化作用之糖基化作用能力的宿主細胞中產生蛋白質。視所用偶合模式而定，糖可連接至(a)精胺酸及組胺酸，(b)自由羧基，(c)自由硫氫基，諸如半胱胺酸之自由硫氫基，(d)自由羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之自由羥基，(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基或(f)麩醯胺酸之醯胺基。該等方法描述於1987年9月11日公開之WO 87/05330以及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.,第259-306頁中。
可由化學或酶促方式實現移除起始抗原結合蛋白質上之碳水化合物部分。化學去糖基化作用需要使蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理過程引起除連接糖(N-乙醯基葡萄糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)以外的大部分或所有糖裂解而保留多肽完整。化學去 糖基化作用由Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等人,1981,Anal.Biochem.118：131描述。多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解可使用多種內醣苷酶及外醣苷酶實現，如由Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.138：350描述。可藉由使用化合物衣黴素(tunicamycin)來防止潛在糖基化作用位點處之糖基化作用，如由Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.257：3105描述。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷鍵聯形成。
抗原結合蛋白質之另一種共價修飾包含將抗原結合蛋白質以美國專利第4,640,835號；第4,496,689號；第4,301,144號；第4,670,417號；第4,791,192號；或第4,179,337號中闡述之方式連接至各種非蛋白質聚合物，包括(但不限於)各種多元醇，諸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚環氧烷。此外，如此項技術中已知，可在抗原結合蛋白質內的各種位置進行胺基酸取代以促進聚合物(諸如PEG)之添加。
在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質之共價修飾包含添加一或多個標記。
術語「標記基團」意謂任何可偵測標記。合適標記基團之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學螢光基團、生物素基或由二級報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈配對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，標記基團經各種長度之間隔臂(spacer arm)與抗原結合蛋白質偶合以降低潛在位阻。此項技術中已知多種用於標記蛋白質之方法且可用於進行本發明。
通常，標記視其將在何種分析法中被偵測而屬於多種類別：a)同 位素標記，其可為放射性同位素或重同位素；b)磁性標記(例如磁粉)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素化基團；及f)由二級報導子識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈配對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中，標記基團經各種長度之間隔臂(spacer arm)與抗原結合蛋白質偶合以降低潛在位阻。此項技術中已知多種用於標記蛋白質之方法且可用於進行本發明。
特定標記包括光學染料，包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團，其中螢光團在許多實例中具有特異性。螢光團可為「小分子」氟或蛋白質氟。
「螢光標記」意謂任何可經由其固有的螢光性質而被偵測的分子。合適螢光標記包括(但不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹明、曙紅(eosin)、藻紅(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基-香豆素、芘、孔雀綠(Malacite green)、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、Cascade BlueJ(Cascade BlueJ)、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade藍(Cascade Blue)、Cascade黃(Cascade Yellow)及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及德克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。合適光學染料(包括螢光團)由Richard P.Haugland描述於分子探針手冊(Molecular Probes Handbook)中，其以引用的方式明確併入本文中。
合適蛋白質螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白質，包括GFP之海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)品種(Chalfie等人,1994,Science 263：802-805)、EGFP(Clontech Laboratories,Inc.，Genbank寄存編號U55762)、藍色螢光蛋白質(BFP，Quantum Biotechnologies,Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West,第8層,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechniques 24：462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.6：178-182)、增強型黃色螢光蛋白質(EYFP，Clontech Laboratories,Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.150：5408-5417)、β-半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。所有以上引用之參考文獻均以引用的方式明確併入本文中。
本發明之抗體構築體亦可包含其他結構域，其例如有助於分子之分離或與分子之經調試之藥物動力學概況有關。
有助於抗體構築體之分離的結構域可自肽主結構或次要的引入部分中選出，其可以分離方法(例如分離管柱)捕獲。該等其他結構域之非限制性實施例包含稱為Myc-標籤、HAT-標籤、HA-標籤、TAP-標籤、GST-標籤、甲殼素結合域(CBD-標籤)、麥芽糖結合蛋白質(MBP-標籤)、Flag-標籤、Strep-標籤及其變異體(例如StrepII-標籤)以及His-標籤的肽主結構。所有本文中揭示之由所鑑別之CDR表徵的抗體構築體均較佳包含His-標籤結構域，其通常稱為分子之胺基酸序列中連續His殘基之重複，較佳為六個His殘基。
如隨附實例2中所描述，已關於鑑別結合特徵來表徵多種CDH19特異性結合劑，且將該等結合劑分為五個不同組，其係指CDH19特異 性結合域之五個不同子群。因此，在一個實施例中，本發明之抗體構築體之第一結合域包含VH區及VL區，該VH區包含選自由以下組成之群的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3且該VL區包含選自由以下組成之群CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3：(a)如SEQ ID NO：52中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：54中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：222中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：84中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：252中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：84中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：927中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：909中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：927中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：52中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：54中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：926中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：52中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID 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NO：2210中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：2211中所描繪之CDR-L3，其均表徵分類為第4組之CDH19之結合域；及(e)如SEQ ID NO：76中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：77中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：78中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：244中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：245中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：246中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：88中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：89中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：90中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：256中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：257中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：258中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：106中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：107中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：108中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：274中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：275中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：276中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：112中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：113中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：114中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：280中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：281中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：282中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：106中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：107中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：108中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：274中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：275中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：276中所描繪之CDR-L3， 如SEQ ID NO：983中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：984中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：985中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：986中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：987中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：988中所描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：1582中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：1583中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：1584中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：1585中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：1586中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：1587中所描繪之CDR-L3，及如SEQ ID NO：1595中所描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：1596中所描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：1597中所描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：1598中所描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：1599中所描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：1600中所描繪之CDR-L3，其均表徵分類為第5組之CDH19之結合域。
在本發明之抗體構築體之另一實施例中，第一結合域包含選自由以下VH區組成之群的VH區(a)如SEQ ID NO：362，SEQ ID NO：364，SEQ ID NO：485，SEQ ID NO：486，SEQ ID NO：487，SEQ ID NO：492，SEQ ID NO：493，SEQ ID NO：494，SEQ ID NO：495，SEQ ID NO：1133，SEQ ID NO：1172，SEQ ID NO：1341，SEQ ID NO：1354，SEQ ID NO：1367，SEQ ID NO：1432，SEQ ID NO：1445及SEQ ID NO：2174中所描繪，其分類為第1組；(b)如SEQ ID NO：342，SEQ ID NO：366，SEQ ID NO：370，SEQ ID NO：344，SEQ ID NO：372，SEQ ID NO：368，SEQ ID NO：496，SEQ ID NO：497，SEQ ID NO：498，SEQ ID NO：499，SEQ ID NO：500，SEQ ID NO：508，SEQ ID NO：509，SEQ ID NO：510， SEQ ID NO：511，SEQ ID NO：512，SEQ ID NO：519，SEQ ID NO：520，SEQ ID NO：521，SEQ ID NO：522，SEQ ID NO：523，SEQ ID NO：524，SEQ ID NO：525，SEQ ID NO：526，SEQ ID NO：527，SEQ ID NO：528，SEQ ID NO：529，SEQ ID NO：530，SEQ ID NO：531，SEQ ID NO：532，SEQ ID NO：533，SEQ ID NO：534，SEQ ID NO：535，SEQ ID NO：536，SEQ ID NO：537，SEQ ID NO：538，SEQ ID NO：1016，SEQ ID NO：1029，SEQ ID NO：1042，SEQ ID NO：1081，SEQ ID NO：1107，SEQ ID NO：1120，SEQ ID NO：1250，SEQ ID NO：1263，SEQ ID NO：1276，SEQ ID NO：1289，SEQ ID NO：1302，SEQ ID NO：1654，SEQ ID NO：1667，SEQ ID NO：1901，SEQ ID NO：1914，SEQ ID NO：1940，SEQ ID NO：1953，SEQ ID NO：1966，SEQ ID NO：1979，SEQ ID NO：1992，SEQ ID NO：2005，SEQ ID NO：2018，SEQ ID NO：2031，SEQ ID NO：2044及SEQ ID NO：2057中所描繪，其分類為第2組；(c)如SEQ ID NO：338，SEQ ID NO：354，SEQ ID NO：378，SEQ ID NO：356，SEQ ID NO：476，SEQ ID NO：477，SEQ ID NO：478，SEQ ID NO：479，SEQ ID NO：480，SEQ ID NO：481，SEQ ID NO：482，SEQ ID NO：483，SEQ ID NO：484，SEQ ID NO：501，SEQ ID NO：502，SEQ ID NO：503，SEQ ID NO：504，SEQ ID NO：505，SEQ ID NO：506，SEQ ID NO：517，SEQ ID NO：518，SEQ ID NO：1003，SEQ ID NO：1055，SEQ ID NO：1094，SEQ ID NO：1615，SEQ ID NO：1628，SEQ ID NO：1641，SEQ ID NO：1680，SEQ ID NO：1693，SEQ ID NO：1706，SEQ ID NO：1719，SEQ ID NO：1732，SEQ ID NO：1745，SEQ ID NO：1758，SEQ ID NO：1771及SEQ ID NO：1927中所描繪， 其分類為第3組；(d)如SEQ ID NO：352，SEQ ID NO：360，SEQ ID NO：388，SEQ ID NO：386，SEQ ID NO：340，SEQ ID NO：346，SEQ ID NO：374，SEQ ID NO：348，SEQ ID NO：390，SEQ ID NO：463，SEQ ID NO：464，SEQ ID NO：465，SEQ ID NO：466，SEQ ID NO：467，SEQ ID NO：468，SEQ ID NO：469，SEQ ID NO：470，SEQ ID NO：471，SEQ ID NO：472，SEQ ID NO：473，SEQ ID NO：474，SEQ ID NO：475，SEQ ID NO：488，SEQ ID NO：489，SEQ ID NO：490，SEQ ID NO：491，SEQ ID NO：513，SEQ ID NO：514，SEQ ID NO：515，SEQ ID NO：516，SEQ ID NO：540，SEQ ID NO：541，SEQ ID NO：542，SEQ ID NO：543，SEQ ID NO：977，SEQ ID NO：1068，SEQ ID NO：1146，SEQ ID NO：1159，SEQ ID NO：1185，SEQ ID NO：1198，SEQ ID NO：1211，SEQ ID NO：1224，SEQ ID NO：1237，SEQ ID NO：1315，SEQ ID NO：1328，SEQ ID NO：1380，SEQ ID NO：1393，SEQ ID NO：1406，SEQ ID NO：1419，SEQ ID NO：1469，SEQ ID NO：1478，SEQ ID NO：1485，SEQ ID NO：1494，SEQ ID NO：1501，SEQ ID NO：1508，SEQ ID NO：1519，SEQ ID NO：1526，SEQ ID NO：1533，SEQ ID NO：1542，SEQ ID NO：1549，SEQ ID NO：1558，SEQ ID NO：1565，SEQ ID NO：1784，SEQ ID NO：1797，SEQ ID NO：1810，SEQ ID NO：1823，SEQ ID NO：1836，SEQ ID NO：1849，SEQ ID NO：1862，SEQ ID NO：1875，SEQ ID NO：1888，SEQ ID NO：2070，SEQ ID NO：2083，SEQ ID NO：2096，SEQ ID NO：2109，SEQ ID NO：2122，SEQ ID NO：2135，SEQ ID NO：2148，SEQ ID NO：2161，SEQ ID NO：2187，SEQ ID NO：2200及SEQ ID NO：2213中所描繪，其分類為第4組；及 (e)如SEQ ID NO：376，SEQ ID NO：392，SEQ ID NO：358，SEQ ID NO：350，SEQ ID NO：507，SEQ ID NO：990，SEQ ID NO：1589及SEQ ID NO：1602中所描繪，其分類為第5組。
在本發明之抗體構築體之另一實施例中，第一結合域包含選自由以下序列所描繪之VL區組成之群的VL區(a)如SEQ ID NO：418，SEQ ID NO：420，SEQ ID NO：580，SEQ ID NO：581，SEQ ID NO：582，SEQ ID NO：587，SEQ ID NO：588，SEQ ID NO：589，SEQ ID NO：590，SEQ ID NO：1135，SEQ ID NO：1174，SEQ ID NO：1343，SEQ ID NO：1356，SEQ ID NO：1369，SEQ ID NO：1434，SEQ ID NO：1447及SEQ ID NO：2176中所描繪，其分類為第1組；(b)如SEQ ID NO：398，SEQ ID NO：422，SEQ ID NO：426，SEQ ID NO：400，SEQ ID NO：428，SEQ ID NO：424，SEQ ID NO：591，SEQ ID NO：592，SEQ ID NO：593，SEQ ID NO：594，SEQ ID NO：595，SEQ ID NO：603，SEQ ID NO：604，SEQ ID NO：605，SEQ ID NO：606，SEQ ID NO：607，SEQ ID NO：614，SEQ ID NO：615，SEQ ID NO：616，SEQ ID NO：617，SEQ ID NO：618，SEQ ID NO：619，SEQ ID NO：620，SEQ ID NO：621，SEQ ID NO：622，SEQ ID NO：623，SEQ ID NO：624，SEQ ID NO：625，SEQ ID NO：626，SEQ ID NO：627，SEQ ID NO：628，SEQ ID NO：629，SEQ ID NO：630，SEQ ID NO：631，SEQ ID NO：632，SEQ ID NO：633，SEQ ID NO：1018，SEQ ID NO：1031，SEQ ID NO：1044，SEQ ID NO：1083，SEQ ID NO：1109，SEQ ID NO：1122，SEQ ID NO：1252，SEQ ID NO：1265，SEQ ID NO：1278，SEQ ID NO：1291，SEQ ID NO：1304，SEQ ID NO：1656，SEQ ID NO：1669，SEQ ID NO：1903，SEQ ID NO：1916，SEQ ID NO：1942，SEQ ID NO：1955，SEQ ID NO：1968，SEQ ID NO：1981，SEQ ID NO：1994，SEQ ID NO：2007，SEQ ID NO：2020，SEQ ID NO：2033，SEQ ID NO：2046及SEQ ID NO：2059中所描繪，其分類為第2組；(c)如SEQ ID NO：394，SEQ ID NO：410，SEQ ID NO：434，SEQ ID NO：412，SEQ ID NO：571，SEQ ID NO：572，SEQ ID NO：573，SEQ ID NO：574，SEQ ID NO：575，SEQ ID NO：576，SEQ ID NO：577，SEQ ID NO：578，SEQ ID NO：579，SEQ ID NO：596，SEQ ID NO：597，SEQ ID NO：598，SEQ ID NO：599，SEQ ID NO：600，SEQ ID NO：601，SEQ ID NO：612，SEQ ID NO：613，SEQ ID NO：1005，SEQ ID NO：1057，SEQ ID NO：1096，SEQ ID NO：1617，SEQ ID NO：1630，SEQ ID NO：1643，SEQ ID NO：1682，SEQ ID NO：1695，SEQ ID NO：1708，SEQ ID NO：1721，SEQ ID NO：1734，SEQ ID NO：1747，SEQ ID NO：1760，SEQ ID NO：1773及SEQ ID NO：1929中所描繪，其分類為第3組；(d)如SEQ ID NO：408，SEQ ID NO：416，SEQ ID NO：444，SEQ ID NO：442，SEQ ID NO：396，SEQ ID NO：402，SEQ ID NO：430，SEQ ID NO：404，SEQ ID NO：446，SEQ ID NO：558，SEQ ID NO：559，SEQ ID NO：560，SEQ ID NO：561，SEQ ID NO：562，SEQ ID NO：563，SEQ ID NO：564，SEQ ID NO：565，SEQ ID NO：566，SEQ ID NO：567，SEQ ID NO：568，SEQ ID NO：569，SEQ ID NO：570，SEQ ID NO：583，SEQ ID NO：584，SEQ ID NO：585，SEQ ID NO：586，SEQ ID NO：608，SEQ ID NO：609，SEQ ID NO：610，SEQ ID NO：611，SEQ ID NO：635，SEQ ID NO：636，SEQ ID NO：637，SEQ ID NO：638，SEQ ID NO：979，SEQ ID NO：1070，SEQ ID NO：1148，SEQ ID NO：1161，SEQ ID NO：1187，SEQ ID NO：1200，SEQ ID NO：1213，SEQ ID NO：1226，SEQ ID NO：1239，SEQ ID NO：1317，SEQ ID NO：1330，SEQ ID NO：1382，SEQ ID NO：1395，SEQ ID NO：1408，SEQ ID NO：1421，SEQ ID NO：1471，SEQ ID NO：1480，SEQ ID NO：1487，SEQ ID NO：1496，SEQ ID NO：1503，SEQ ID NO：1510，SEQ ID NO：1521，SEQ ID NO：1528，SEQ ID NO：1535，SEQ ID NO：1544，SEQ ID NO：1551，SEQ ID NO：1560，SEQ ID NO：1567，SEQ ID NO：1786，SEQ ID NO：1799，SEQ ID NO：1812，SEQ ID NO：1825，SEQ ID NO：1838，SEQ ID NO：1851，SEQ ID NO：1864，SEQ ID NO：1877，SEQ ID NO：1890，SEQ ID NO：2072，SEQ ID NO：2085，SEQ ID NO：2098，SEQ ID NO：2111，SEQ ID NO：2124，SEQ ID NO：2137，SEQ ID NO：2150，SEQ ID NO：2163，SEQ ID NO：2189，SEQ ID NO：2202及SEQ ID NO：2215中所描繪，其分類為第4組；及(e)如SEQ ID NO：432，SEQ ID NO：448，SEQ ID NO：414，SEQ ID NO：406，SEQ ID NO：602，SEQ ID NO：992，SEQ ID NO：1591及SEQ ID NO：1604中所描繪，其分類為第5組。
本發明進一步提供本發明之抗體構築體之實施例，其中第一結合域包含選自由以下組成之群的VH區及VL區：(1)如SEQ ID NO：362+418，SEQ ID NO：364+420，SEQ ID NO：485+580，SEQ ID NO：486+581，SEQ ID NO：487+582，SEQ ID NO：492+587，SEQ ID NO：493+588，SEQ ID NO：494+589，SEQ ID NO：495+590，SEQ ID NO：1133+1135，SEQ ID NO：1172+1174，SEQ ID NO：1341+1343，SEQ ID NO：1354+1356，SEQ ID NO：1367+1369，SEQ ID NO：1432+1434，SEQ ID NO：1445+1447及SEQ ID NO：2174+2176中所描繪之VH區與VL區之配對，所有配對均分類為第1組；(2)如SEQ ID NO：342+398，SEQ ID NO：366+422，SEQ ID NO：370+426，SEQ ID NO：344+400，SEQ ID NO：372+428，SEQ ID NO：368+424，SEQ ID NO：496+591，SEQ ID NO：497+592，SEQ ID NO：498+593，SEQ ID NO：499+594，SEQ ID NO：500+595，SEQ ID NO：508+603，SEQ ID NO：509+604，SEQ ID NO：510+605，SEQ ID NO：511+606，SEQ ID NO：512+607，SEQ ID NO：519+614，SEQ ID NO：520+615，SEQ ID NO：521+616，SEQ ID NO：522+617，SEQ ID NO：523+618，SEQ ID NO：524+619，SEQ ID NO：525+620，SEQ ID NO：526+621，SEQ ID NO：527+622，SEQ ID NO：528+623，SEQ ID NO：529+624，SEQ ID NO：530+625，SEQ ID NO：531+626，SEQ ID NO：532+627，SEQ ID NO：533+628，SEQ ID NO：534+629，SEQ ID NO：535+630，SEQ ID NO：536+631，SEQ ID NO：537+632，SEQ ID NO：538+633，SEQ ID NO：1016+1018，SEQ ID NO：1029+1031，SEQ ID NO：1042+1044，SEQ ID NO：1081+1083，SEQ ID NO：1107+1109，SEQ ID NO：1120+1122，SEQ ID NO：1250+1252，SEQ ID NO：1263+1265，SEQ ID NO：1276+1278，SEQ ID NO：1289+1291，SEQ ID NO：1302+1304，SEQ ID NO：1654+1656，SEQ ID NO：1667+1669，SEQ ID NO：1901+1903，SEQ ID NO：1914+1916，SEQ ID NO：1940+1942，SEQ ID NO：1953+1955，SEQ ID NO：1966+1968，SEQ ID NO：1979+1981，SEQ ID NO：1992+1994，SEQ ID NO：2005+2007，SEQ ID NO：2018+2020，SEQ ID NO：2031+2033，SEQ ID NO：2044+2046及SEQ ID NO：2057+2059中所描繪之VH區與VL區之配對，所有配對均分類為第2組；(3)如SEQ ID NO：338+394，SEQ ID NO：354+410，SEQ ID NO：378+434，SEQ ID NO：356+412，SEQ ID NO：476+571，SEQ ID NO：477+572，SEQ ID NO：478+573，SEQ ID NO：479+574，SEQ ID NO：480+575，SEQ ID NO：481+576，SEQ ID NO：482+577，SEQ ID NO：483+578，SEQ ID NO：484+579，SEQ ID NO：501+596，SEQ ID NO：502+597，SEQ ID NO：503+598，SEQ ID NO：504+599，SEQ ID NO：505+600，SEQ ID NO：506+601，SEQ ID NO：517+612，SEQ ID NO：518+613，SEQ ID NO：1003+1005，SEQ ID NO：1055+1057，SEQ ID NO：1094+1096，SEQ ID NO：1615+1617，SEQ ID NO：1628+1630，SEQ ID NO：1641+1643，SEQ ID NO：1680+1682，SEQ ID NO：1693+1695，SEQ ID NO：1706+1708，SEQ ID NO：1719+1721，SEQ ID NO：1732+1734，SEQ ID NO：1745+1747，SEQ ID NO：1758+1760，SEQ ID NO：1771+1773及SEQ ID NO：1927+1929中所描繪之VH區與VL區之配對，所有配對均分類為第3組；(4)如SEQ ID NO：352+408，SEQ ID NO：360+416，SEQ ID NO：388+444，SEQ ID NO：386+442，SEQ ID NO：340+396，SEQ ID NO：346+402，SEQ ID NO：374+430，SEQ ID NO：348+404，SEQ ID NO：390+446，SEQ ID NO：463+558，SEQ ID NO：464+559，SEQ ID NO：465+560，SEQ ID NO：466+561，SEQ ID NO：467+562，SEQ ID NO：468+563，SEQ ID NO：469+564，SEQ ID NO：470+565，SEQ ID NO：471+566，SEQ ID NO：472+567，SEQ ID NO：473+568，SEQ ID NO：474+569，SEQ ID NO：475+570，SEQ ID NO：488+583，SEQ ID NO：489+584，SEQ ID NO：490+585，SEQ ID NO：491+586，SEQ ID NO：513+608，SEQ ID NO：514+609，SEQ ID NO：515+610，SEQ ID NO：516+611，SEQ ID NO：540+635，SEQ ID NO：541+636，SEQ ID NO：542+637，SEQ ID NO：543+638，SEQ ID NO：977+979，SEQ ID NO：1068+1070，SEQ ID NO：1146+1148，SEQ ID NO：1159+1161，SEQ ID NO：1185+1187，SEQ ID NO：1198+1200，SEQ ID NO：1211+1213，SEQ ID NO：1224+1226，SEQ ID NO：1237+1239，SEQ ID NO：1315+1317，SEQ ID NO：1328+1330，SEQ ID NO：1380+1382，SEQ ID NO：1393+1395，SEQ ID NO：1406+1408，SEQ ID NO：1419+1421，SEQ ID NO：1469+1471，SEQ ID NO：1478+1480，SEQ ID NO：1485+1487，SEQ ID NO：1494+1496，SEQ ID NO：1501+1503，SEQ ID NO：1508+1510，SEQ ID NO：1519+1521，SEQ ID NO：1526+1528，SEQ ID NO：1533+1535，SEQ ID NO：1542+1544，SEQ ID NO：1549+1551，SEQ ID NO：1558+1560，SEQ ID NO：1565+1567，SEQ ID NO：1784+1786，SEQ ID NO：1797+1799，SEQ ID NO：1810+1812，SEQ ID NO：1823+1825，SEQ ID NO：1836+1838，SEQ ID NO：1849+1851，SEQ ID NO：1862+1864，SEQ ID NO：1875+1877，SEQ ID NO：1888+1890，SEQ ID NO：2070+2072，SEQ ID NO：2083+2085，SEQ ID NO：2096+2098，SEQ ID NO：2109+2111，SEQ ID NO：2122+2124，SEQ ID NO：2135+2137，SEQ ID NO：2148+2150，SEQ ID NO：2161+2163，SEQ ID NO：2187+2189，SEQ ID NO：2200+2202及SEQ ID NO：2213+2215中所描繪之VH區與VL區之配對，所有配對均分類為第4組；及(5)如SEQ ID NO：376+432，SEQ ID NO：392+448，SEQ ID NO：358+414，SEQ ID NO：350+406，SEQ ID NO：507+602，SEQ ID NO：990+992，SEQ ID NO：1589+1591及SEQ ID NO：1602+1604中所描繪之VH區與VL區之配對，所有配對均分類為第5組。
在本發明之另一實施例中，抗體構築體呈選自由(scFv)2、(單域mAb)2、scFv-單域mAb、雙功能抗體及其寡聚物組成之群的格式。
在較佳實施例中，第一結合域包含選自由以下序列中所描繪之胺基酸組成之群的胺基酸(a)如SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：1137，SEQ ID NO：1176，SEQ ID NO：1345，SEQ ID NO：1358，SEQ ID NO：1371，SEQ ID NO：1436，SEQ ID NO：1449及SEQ ID NO：2178中所描繪，所有結合劑均分類為第1組；(b)如SEQ ID NO：1020，SEQ ID NO：1033，SEQ ID NO：1046，SEQ ID NO：1085，SEQ ID NO：1111，SEQ ID NO：1124，SEQ ID NO：1254，SEQ ID NO：1267，SEQ ID NO：1280，SEQ ID NO：1293，SEQ ID NO：1306，SEQ ID NO：1658，SEQ ID NO：1671，SEQ ID NO：1905，SEQ ID NO：1918，SEQ ID NO：1944，SEQ ID NO：1957，SEQ ID NO：1970，SEQ ID NO：1983，SEQ ID NO：1996，SEQ ID NO：2009，SEQ ID NO：2022，SEQ ID NO：2035，SEQ ID NO：2048及SEQ ID NO：2061中所描繪，所有結合劑均分類為第2組；(c)如SEQ ID NO：1007，SEQ ID NO：1059，SEQ ID NO：1098，SEQ ID NO：1619，SEQ ID NO：1632，SEQ ID NO：1645，SEQ ID NO：1684，SEQ ID NO：1697，SEQ ID NO：1710，SEQ ID NO：1723，SEQ ID NO：1736，SEQ ID NO：1749，SEQ ID NO：1762，SEQ ID NO：1775及SEQ ID NO：1931中所描繪，所有結合劑均分類為第3組； (d)如SEQ ID NO：981，SEQ ID NO：1072，SEQ ID NO：1150，SEQ ID NO：1163，SEQ ID NO：1189，SEQ ID NO：1202，SEQ ID NO：1215，SEQ ID NO：1228，SEQ ID NO：1241，SEQ ID NO：1319，SEQ ID NO：1332，SEQ ID NO：1384，SEQ ID NO：1397，SEQ ID NO：1410，SEQ ID NO：1423，SEQ ID NO：1473，SEQ ID NO：1482，SEQ ID NO：1489，SEQ ID NO：1498，SEQ ID NO：1505，SEQ ID NO：1512，SEQ ID NO：1523，SEQ ID NO：1530，SEQ ID NO：1537，SEQ ID NO：1546，SEQ ID NO：1553，SEQ ID NO：1562，SEQ ID NO：1569，SEQ ID NO：1788，SEQ ID NO：1801，SEQ ID NO：1814，SEQ ID NO：1827，SEQ ID NO：1840，SEQ ID NO：1853，SEQ ID NO：1866，SEQ ID NO：1879，SEQ ID NO：1892，SEQ ID NO：2074，SEQ ID NO：2087，SEQ ID NO：2100，SEQ ID NO：2113，SEQ ID NO：2126，SEQ ID NO：2139，SEQ ID NO：2152，SEQ ID NO：2165，SEQ ID NO：2191，SEQ ID NO：2204及SEQ ID NO：2217中所描繪，所有結合劑均分類為第4組；及(e)如SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：1593及SEQ ID NO：1606中所描繪，其分類為第5組。
在本發明之一個態樣中，第二結合域能夠結合於人類CD3及獼猴CD3，較佳結合於人類CD3ε及獼猴CD3ε。此外或替代性地，第二結合域能夠結合於普通狨、棉頂狨及/或松鼠猴CD3ε。根據該等實施例，本發明之抗體構築體之一個或兩個結合域較佳具有針對靈長類動物之哺乳動物目之成員的跨物種特異性。跨物種特異性CD3結合域描述於例如WO 2008/119567中。
對於本發明之抗體構築體，尤其較佳為能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合域包含有包含選自以下各者之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3的VL區： (a)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：27中所描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：28中所描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：29中所描繪之CDR-L3；(b)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：117中所描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：118中所描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：119中所描繪之CDR-L3；及(c)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：153中所描繪之CDR-L1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：154中所描繪之CDR-L2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：155中所描繪之CDR-L3。
在本發明之抗體構築體之替代性較佳實施例中，能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合域包含有包含選自以下各者之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3的VH區：(a)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：12中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：13中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：14中所描繪之CDR-H3；(b)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：30中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：31中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：32中所描繪之CDR-H3；(c)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：48中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：49中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：50中所描繪之CDR-H3；(d)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：66中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：67中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：68中所描繪之CDR-H3；(e)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：84中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：85中所描繪之CDR-H2及如 WO 2008/119567中之SEQ ID NO：86中所描繪之CDR-H3；(f)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：102中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：103中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：104中所描繪之CDR-H3；(g)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：120中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：121中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：122中所描繪之CDR-H3；(h)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：138中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：139中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：140中所描繪之CDR-H3；(i)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：156中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：157中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：158中所描繪之CDR-H3；及(j)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：174中所描繪之CDR-H1、如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：175中所描繪之CDR-H2及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：176中所描繪之CDR-H3。
此外對於本發明之抗體構築體，較佳為能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合域包含選自由如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：35、39、125、129、161或165中所描繪之VL區組成之群的VL區。
或者較佳為能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合域包含選自由如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177或181中所描繪之VH區組成之群的VH區。
更佳的是，本發明之抗體構築體由能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合域表徵，該第二結合域包含選自由以下組成之群VL 區及VH區：(a)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：17或21中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：15或19中所描繪之VH區；(b)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：35或39中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：33或37中所描繪之VH區；(c)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：53或57中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：51或55中所描繪之VH區；(d)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：71或75中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：69或73中所描繪之VH區；(e)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：89或93中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：87或91中所描繪之VH區；(f)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：107或111中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：105或109中所描繪之VH區；(g)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：125或129中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：123或127中所描繪之VH區；(h)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：143或147中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：141或145中所描繪之VH區；(i)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：161或165中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：159或163中所描繪之VH區；及(j)如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：179或183中所描繪之VL區及如WO 2008/119567中之SEQ ID NO：177或181中所描繪之VH區。
根據本發明之抗體構築體(尤其能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合域)之較佳實施例，VH區與VL區之配對係呈單鏈抗體(scFv)格式。VH區及VL區係以次序VH-VL或VL-VH排列。較佳為VH區經安置以N端連接至連接子序列。VL區經安置以C端連接至連接子 序列。
本發明之上述抗體構築體之較佳實施例係由能夠結合於T細胞CD3受體複合物之第二結合域表徵，該第二結合域包含選自由WO 2008/119567中之SEQ ID NO：23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185或187組成之群的胺基酸序列。
在較佳實施例中，本發明之抗體構築體具有選自由以下序列中所描繪之胺基酸序列組成之群的胺基酸序列(a)如SEQ ID NO：1138，SEQ ID NO：1177，SEQ ID NO：1346，SEQ ID NO：1359，SEQ ID NO：1372，SEQ ID NO：1437，SEQ ID NO：1450及SEQ ID NO：2179中所描繪；(b)如SEQ ID NO：1021，SEQ ID NO：1034，SEQ ID NO：1047，SEQ ID NO：1086，SEQ ID NO：1112，SEQ ID NO：1125，SEQ ID NO：1255，SEQ ID NO：1268，SEQ ID NO：1281，SEQ ID NO：1294，SEQ ID NO：1307，SEQ ID NO：1659，SEQ ID NO：1672，SEQ ID NO：1906，SEQ ID NO：1919，SEQ ID NO：1945，SEQ ID NO：1958，SEQ ID NO：1971，SEQ ID NO：1984，SEQ ID NO：1997，SEQ ID NO：2010，SEQ ID NO：2023，SEQ ID NO：2036，SEQ ID NO：2049及SEQ ID NO：2062中所描繪；(c)如SEQ ID NO：1008，SEQ ID NO：1060，SEQ ID NO：1099，SEQ ID NO：1620，SEQ ID NO：1633，SEQ ID NO：1646，SEQ ID NO：1685，SEQ ID NO：1698，SEQ ID NO：1711，SEQ ID NO：1724，SEQ ID NO：1737，SEQ ID NO：1750，SEQ ID NO：1763，SEQ ID NO：1776及SEQ ID NO：1932中所描繪；(d)如SEQ ID NO：982，SEQ ID NO：1073，SEQ ID NO：1151，SEQ ID NO：1164，SEQ ID NO：1190，SEQ ID NO：1203，SEQ ID NO：1216，SEQ ID NO：1229，SEQ ID NO：1242，SEQ ID NO：1320，SEQ ID NO：1333，SEQ ID NO：1385，SEQ ID NO：1398，SEQ ID NO：1411，SEQ ID NO：1424，SEQ ID NO：1474，SEQ ID NO：1475，SEQ ID NO：1476，SEQ ID NO：1483，SEQ ID NO：1490，SEQ ID NO：1491，SEQ ID NO：1492，SEQ ID NO：1499，SEQ ID NO：1506，SEQ ID NO：1513，SEQ ID NO：1514，SEQ ID NO：1515，SEQ ID NO：1516，SEQ ID NO：1517，SEQ ID NO：1524，SEQ ID NO：1531，SEQ ID NO：1538，SEQ ID NO：1539，SEQ ID NO：1540，SEQ ID NO：1547，SEQ ID NO：1554，SEQ ID NO：1555，SEQ ID NO：1556，SEQ ID NO：1563，SEQ ID NO：1570，SEQ ID NO：1571，SEQ ID NO：1572，SEQ ID NO：1573，SEQ ID NO：1574，SEQ ID NO：1575，SEQ ID NO：1576，SEQ ID NO：1577，SEQ ID NO：1578，SEQ ID NO：1579，SEQ ID NO：1580，SEQ ID NO：1581，SEQ ID NO：1789，SEQ ID NO：1802，SEQ ID NO：1815，SEQ ID NO：1828，SEQ ID NO：1841，SEQ ID NO：1854，SEQ ID NO：1867，SEQ ID NO：1880，SEQ ID NO：1893，SEQ ID NO：2075，SEQ ID NO：2088，SEQ ID NO：2101，SEQ ID NO：2114，SEQ ID NO：2127，SEQ ID NO：2140，SEQ ID NO：2153，SEQ ID NO：2166，SEQ ID NO：2192，SEQ ID NO：2205及SEQ ID NO：2218至2228中所描繪；及(e)如SEQ ID NO：995、SEQ ID NO：1594及SEQ ID NO：1607中所描繪。
本發明進一步提供編碼本發明之抗體構築體之核酸序列。
此外，本發明提供包含本發明之核酸序列之載體。此外，本發明提供經本發明之核酸序列轉型或轉染之宿主細胞。
在另一實施例中，本發明提供產生本發明之抗體構築體之方法，該方法包含在允許本發明之抗體構築體之表現的條件下培養本發 明之宿主細胞及自培養物回收所產生之抗體構築體。
此外，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體。
本文中所描述之調配物適用作醫藥組合物以治療、改善及/或預防有需要之患者中之如本文中所描述之病理學醫學病狀。術語「治療」係指治療性處理及預防性或防護性措施。治療包括向患有疾病/病症、疾病/病症之症狀或具有疾病/病症誘因之患者之身體、經分離之組織或細胞施用或投與調配物，以達到痊癒、治癒、緩和、緩解、改變、醫治、改善、改良或影響疾病、疾病症狀或疾病誘因之目的。
「需要治療」之患者包括已罹患病症以及需要預防病症之個體。術語「疾病」為任何將由用本文中所描述之蛋白質調配物進行之治療獲益的病狀。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易感染所述疾病之病理學條件。本文中所治療之疾病/病症之非限制性實例包括增生性疾病、腫瘤疾病或免疫學病症。
在一些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含治療有效量之一種或複數種本發明之抗體構築體以及醫藥學上有效的稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。本發明之醫藥組合物包括(但不限於)液體、冷凍及凍乾組合物。
調配物質較佳在所用劑量及濃度下對接受者無毒性。在特定實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之本發明之抗體構築體。
在某些實施例中，醫藥組合物可含有用於改良、維持或保持例如組合物之pH、容積莫耳滲透濃度(osmolarity)、黏度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透之調配物質。在該等實施例中，合適調配物質包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸、脯胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩 衝液(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；增積劑(諸如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥基丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洗必太(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克(pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、triton、緩血酸胺(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；滲性增強劑(諸如鹼金屬鹵化物，較佳為氯化鈉或氯化鉀、甘露醇山梨糖醇)；遞送媒介；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。參見REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版,(A.R.Genrmo編),1990,Mack Publishing Company。
在某些實施例中，最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如所欲投藥途徑、遞送方式及所需劑量決定。參見例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,見上文。在某些實施例中，該等組合物可影響本發明之抗原結合蛋白質之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑本質上可為水性或非水性。舉例而言，合適媒劑或載劑可為注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊髓液，其可補充有用於非經腸投藥之組合物中常用的其他物質。中性緩衝鹽水或生理食鹽水與血清 白蛋白之混合物亦為例示性媒劑。在特定實施例中，醫藥組合物包含約pH 7.0-8.5之Tris緩衝液，或約pH 4.0-5.5之乙酸鹽緩衝液，且可進一步包括山梨糖醇或其合適取代物。在本發明之某些實施例中，本發明之人類抗體或其抗原結合片段或本發明組合物之抗體構築體可藉由將具有所需純度之所選組合物與視情況選用之調配劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,見上文)以凍乾餅狀物或水溶液形式混合來準備用於儲存。此外，在某些實施例中，本發明之人類抗體或其抗原結合片段或本發明之抗體構築體可使用適當賦形劑(諸如蔗糖)調配為凍乾產物。
本發明之醫藥組合物可經選擇用於非經腸遞送。或者，可選擇組合物用於吸入或用於經消化道(諸如經口)遞送。該等醫藥學上可接受之組合物之製備方法屬於此項技術之範疇內。調配物組分較佳以投藥位點可接受之濃度存在。在某些實施例中，使用緩衝液將組合物保持在生理學pH值或稍微較低的pH值，pH值通常在約5至約8範圍內。
當預期非經腸投藥時，本發明中所用治療性組合物可以無熱原質、非經腸可接受之水溶液形式提供，該水溶液包含有含所需的本發明之人類抗體或其抗原結合片段或本發明之抗體構築體的醫藥學上可接受之媒劑。對於非經腸注射，尤其合適媒劑為無菌蒸餾水，其中本發明之抗體構築體調配為無菌、等滲溶液(適當儲存)。在某些實施例中，製備方法可涉及用試劑(諸如可注射微球體、生物易侵蝕粒子、聚合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體)進行之所需分子之調配，該試劑可提供產物之控制釋放或持續釋放，該產物可經積存注射來遞送。在某些實施例中，亦可使用玻尿酸(hyaluronic acid)，玻尿酸具有促進循環中持續時間之作用。在某些實施例中，可植入藥物遞送裝置可用於引入所需抗原結合蛋白質。
熟習此項技術者將顯而易見其他醫藥組合物，包括與持續遞送 或控制遞送調配物中本發明之抗體構築體有關之調配物。熟習此項技術者亦已知用於調配多種其他持續遞送或控制遞送工具(諸如脂質體載劑、生物易侵蝕微粒或多孔珠粒及積存注射物)之技術。參見例如國際專利申請案第PCT/US93/00829號，其以引用的方式併入且描述用於遞送醫藥組合物之多孔聚合微粒之控制釋放。持續釋放製劑可包括呈特型製品形式之半滲透性聚合物基質，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(如美國專利第3,773,919號及歐洲專利申請公開案第EP 058481號中所揭示，其各以引用的方式併入本文中)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.15：167-277及Langer,1982,Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,見上文)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(歐洲專利申請公開案第EP 133,988號)。持續釋放組合物亦可包括脂質體，該等脂質體可藉由此項技術中已知的若干種方法中之任一種製備。參見例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；歐洲專利申請公開案第EP 036,676號；第EP 088,046號及第EP 143,949號，其以引用的方式併入。
用於活體內投藥之醫藥組合物通常以無菌製劑形式提供。可藉由經無菌過濾膜過濾來實現滅菌。當將組合物凍乾時，使用此方法之滅菌可在凍乾及復原之前或之後進行。用於非經腸投藥之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。通常將非經腸組合物置放於具有無菌出入孔之容器(例如具有可由皮下注射針穿透之阻塞物的靜脈內溶液袋或小瓶)中。
本發明之態樣包括本發明調配物之自緩衝型抗體構築體，其可用作醫藥組合物，如國際專利申請案WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。 如上文所論述，某些實施例提供本發明蛋白質組合物(尤其本發明之醫藥組合物)之抗體構築體，該等組合物除本發明之抗體構築體外亦包含一或多種賦形劑，諸如本章節及本文中其他地方以說明性方式描述之賦形劑。在此方面，本發明中可使用賦形劑達成多種目的，諸如調節調配物之物理、化學或生物學性質，諸如調節黏度，及/或用於本發明之方法中以改良有效性及/或使該等調配物及方法對由例如應力引起之降解及損壞穩定，該等應力係在製造、裝運、儲存、使用前準備、投藥及隨後過程期間發生。可獲得關於在此方面有效的蛋白質穩定及調配物質及方法之多種說明，諸如Arakawa等人,「Solvent interactions in pharmaceutical formulations」,Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等人,「Physical stabilization of proteins in aqueous solution」,RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY AND PRACTICE,Carpenter and Manning編,Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)，及Randolph等人,「Surfactant-protein interactions」,Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，其各以全文引用的方式併入本文中，尤其與用於本發明之自緩衝型蛋白質調配物之物質及方法的賦形劑及方法有關的部分，尤其用於獸醫及/或人類醫療用途之蛋白質醫藥產品及方法。
根據本發明之某些實施例，可使用鹽例如調節調配物之離子強度及/或等滲性及/或改良本發明之組合物中之蛋白質或其他成分之溶解度及/或物理穩定性。
如所熟知，離子可藉由結合於蛋白質表面上之帶電殘基以及藉由遮蔽蛋白質中之帶電及極性基因及降低其靜電相互作用、吸引力及互相推斥作用之強度來使蛋白質之天然狀態穩定。詳言之，離子亦可藉由結合於蛋白質之變性肽鍵(--CONH)使蛋白質之變性狀態穩定。 此外，與蛋白質中帶電及極性基因之離子相互作用亦可降低分子間靜電相互作用且藉此防止或降低蛋白質聚集及不可溶性。
離子物質在對蛋白質之作用方面顯著不同。已研究多種等級之離子及其對蛋白質之作用，該等離子可用於調配本發明之醫藥組合物。一個實例為郝夫麥士特離子序列(Hofmeister series)，其藉由離子性及極性非離子溶質對溶液中蛋白質之構形穩定性之作用而將該等溶質分級。穩定化溶質稱為「親液(kosmotropic)」。穩定性降低之溶質稱為「離液(chaotropic)」。親液通常以高濃度(例如>1莫耳硫酸銨)使用以使蛋白質自溶液沈澱(「鹽析」)。離液通常用於齒列及/或使蛋白質溶解(「鹽溶」)。離子針對「鹽溶」及「鹽析」之相對有效性定義其在郝夫麥士特離子序列中之位置。
根據本發明之多種實施例，游離胺基酸可用於本發明調配物之抗體構築體中作為增積劑、穩定劑及抗氧化劑以及其他標準用途。離胺酸、脯胺酸、絲胺酸及丙胺酸可用於使調配物中之蛋白質穩定。甘胺酸適用於凍乾以確保正確的餅狀結構及性質。精胺酸可有效抑制液體及凍乾調配物中之蛋白質聚集。甲硫胺酸適用作抗氧化劑。
聚醇(Polyol)包括糖，例如甘露醇、蔗糖及山梨糖醇，及多元醇(polyhydric alcohol)，諸如甘油及丙二醇以及(本文中為達成論述目的)聚乙二醇(PEG)及相關物質。聚醇為親液。其為液體及凍乾調配物中之有效穩定劑，可保護蛋白質免於物理及化學降解過程。多元醇亦適用於調節調配物之滲性。
適用於本發明之選擇實施例之聚醇為甘露醇，其通常用於確保凍乾調配物中餅狀物之結構穩定性。其確保餅狀物之結構穩定性。其通常與凍乾保護劑(例如蔗糖)一起使用。用於調節滲性及作為穩定劑以保護在製造過程期間、在主體之傳送或製備期間免受凍融應力影響之較佳試劑包括山梨糖醇及蔗糖。還原糖(其含有游離醛或酮基)，諸 如葡萄糖及乳糖可使表面離胺酸及精胺酸殘基糖化。因此，其通常不屬於根據本發明使用之較佳聚醇。此外，在此方面，形成該等反應性物質之糖(諸如蔗糖，其在酸性條件下水解為果糖及葡萄糖且因此引起糖基化)亦不屬於本發明之較佳聚醇。在此方面，PEG適用於使蛋白質穩定及作為低溫保護劑且可用於本發明。
本發明調配物之抗體構築體之實施例進一步包含界面活性劑。蛋白質分子可對表面吸附以及空氣-液體、固體-液體及液體-液體界面處之變性及後續聚集敏感。該等作用之程度通常與蛋白質濃度成反比。該等有害相互作用之程度通常與蛋白質濃度成反比且典型地由物理攪拌(諸如在產品裝運及操作期間產生之物理攪拌)加重。
界面活性劑通常用於防止、最小化或降低表面吸附。在此方面，適用於本發明之界面活性劑包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫水山梨糖醇聚乙氧基化物之其他脂肪酸酯及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。
界面活性劑亦通常用於控制蛋白質構形穩定性。在此方面，界面活性劑之用途為蛋白質特異性，因為任何既定界面活性劑典型地將使一些蛋白質穩定且使其他蛋白質穩定性降低。
聚山梨醇酯對氧化降解敏感且通常(在供應時)含有足量過氧化物以引起蛋白質殘基側鏈(尤其甲硫胺酸)之氧化。因此，應小心使用聚山梨醇酯，且當使用時，應以其最低有效濃度使用。在此方面，聚山梨醇酯例示賦形劑應以其最低有效濃度使用之一般規則。
本發明調配物之抗體構築體之實施例進一步包含一或多種抗氧化劑。在某種程度上，可藉由保持適當環境氧含量及溫度以及藉由避免曝光來防止醫藥調配物中蛋白質之有害氧化。亦可使用抗氧化賦形劑以防止蛋白質之氧化降解。在此方面，有效抗氧化劑包括還原劑、氧/自由基清除劑及螯合劑。用於本發明之治療性蛋白質調配物之抗 氧化劑較佳為水可溶且在產物之存放期期間始終保持其活性。在此方面，EDTA為根據本發明之較佳抗氧化劑。
抗氧化劑可損害蛋白質。舉例而言，還原劑，詳言之諸如麩胱甘肽可使分子內二硫鍵斷裂。因此，選擇用於本發明之抗氧化劑以尤其消除或充分降低其本身損害調配物中之蛋白質的可能性。
本發明之調配物可包括金屬離子，其為蛋白質輔助因子且為形成蛋白質配位複合物所必需，諸如形成某些胰島素懸浮液所必需的鋅。金屬離子亦可抑制一些使蛋白質降解的過程。然而，金屬離子亦催化使蛋白質降解的物理及化學過程。
鎂離子(10-120mM)可用於抑制天冬胺酸異構化為異天冬胺酸。Ca+2離子(至多100mM)可提高人類脫氧核糖核酸酶之穩定性。然而，Mg+2、Mn+2及Zn+2可使rhDNase穩定性降低。類似地，Ca+2及Sr+2可使因子VIII穩定，因子VIII可由Mg+2、Mn+2及Zn+2、Cu+2及Fe+2降低穩定性且其聚集可由Al+3離子增加。
本發明調配物之抗體構築體之實施例進一步包含一或多種防腐劑。防腐劑為製備涉及自同一個容器之一次以上提取之多劑量非經腸調配物時所必需的。其主要功能為抑制微生物生長及確保產品在藥物產品之存放期或使用期內始終無菌。常用防腐劑包括苯甲醇、苯酚及間甲酚。儘管很久之前防腐劑便與小分子非經腸藥物一起使用，但研發包括防腐劑之蛋白質調配物可能具有挑戰性。防腐劑幾乎始終對蛋白質具有減穩作用(聚集)，且此變為限制其用於多劑量蛋白質調配物中之主要因素。迄今，大部分蛋白質藥物經調配以用於僅單次使用。然而，當可製備多劑量調配物時，其具有實現患者便利性及增加可售性之附加優點。優良實例為人類生長激素(hGH)之多劑量調配物，其中保藏性調配物之發展引起更便利、多用途注射筆呈現之商業化。當前至少有四種該等含有hGH之保藏性調配物之筆裝置出售。健高靈 (Norditropin)(液體，Novo Nordisk)、路歐平AQ(Nutropin AQ)(液體，Genentech)及鍵豪寧(Genotropin)(凍乾--雙室筒，Pharmacia & Upjohn)含有酚而索瑪托普(Somatrope)(Eli Lilly)係用間甲酚調配。在保藏性劑型之調配及製備期間需要考慮若干態樣。藥物產品中之有效防腐劑濃度必須最佳化。此需要在可賦予抗菌劑有效性而不損害蛋白質穩定性的濃度範圍內測試劑型中之既定防腐劑。
如可預期，含有防腐劑之液體調配物之製備比凍乾調配物更具有挑戰性。冷凍乾燥產品可在無防腐劑情況下凍乾且在使用時用含有防腐劑之稀釋劑復原。此縮短防腐劑與蛋白質之接觸時間，顯著最小化相關穩定性風險。在液體調配物情況下，應在整個產品存放期(約18至24個月)內保持防腐劑有效性及穩定性。一個重要的注意點為應在含有活性藥物及所有賦形劑組分之最終調配物中證明防腐劑有效性。
本發明之抗體構築體通常尤其經設計以在某些生物可用性及持續性範圍內用於特定投藥途徑及方法、特定投藥劑量及投藥頻率、特定疾病之特定治療。因此可根據本發明設計調配物以用於藉由任何合適途徑遞送，包括(但不限於)經口、經耳、經眼、經直腸及經陰道，以及藉由非經腸途徑，包括靜脈內及動脈內注射、肌肉內注射及皮下注射。
一旦調配出本發明之醫藥組合物，其可以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、晶體或以脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式或以在投藥之前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。本發明亦提供用於產生單劑量投藥單元之套組。本發明之套組可各含有第一容器(具有乾燥蛋白質)及第二容器(具有水性調配物)。在本發明之某些實施例中，提供含有單腔室及多腔室預裝藥品之注射器(例如液體注射器及冷凍乾燥物注射器)之套組。所使用之本發明之 含有蛋白質之醫藥組合物中之抗體構築體之治療有效量將視(例如)治療情形及目標而定。熟習此項技術者應瞭解，用於治療之合適劑量位準將部分地視所遞送之分子、使用本發明之抗體構築體治療之適應症、投藥途徑以及患者之體型(體重、體表面積或器官大小)及/或條件(年齡及/或一般健康狀況)而定。在某些實施例中，臨床醫師可確定劑量且改良投藥途徑以獲得最佳治療作用。視以上所提及之因素而定，典型劑量可在約0.1μg/kg至約30mg/kg或30mg/kg以上範圍內。在特定實施例中，劑量可在1.0μg/kg至約20mg/kg，視情況10μg/kg至約10mg/kg或100μg/kg至約5mg/kg範圍內。
本發明之抗體構築體之治療有效量較佳引起病徵之嚴重性降低、無病徵週期之頻率或持續時間增加或防止由疾病痛苦引起之損傷或失能。對於治療表現CDH19之腫瘤，與未經治療之患者相比，本發明之抗體構築體(例如抗CDH19/CD3抗體構築體)之治療有效量較佳抑制細胞生長或腫瘤生長達至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可在可預示在人類腫瘤中之功效的動物模型中評估化合物抑制腫瘤生長之能力。
醫藥組合物可使用醫療裝置投與。用於投與醫藥組合物之醫療裝置之實例描述於美國專利第4,475,196號；第4,439,196號；第4,447,224號；第4,447,233號；第4,486,194號；第4,487,603號；第4,596,556號；第4,790,824號；第4,941,880號；第5,064,413號；第5,312,335號；第5,312,335號；第5,383,851號；及第5,399,163號中，其均以引用的方式併入本文中。
在一個實施例中，本發明提供本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體，其係用於預防、治療或改善黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病。
本發明亦提供治療或改善黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病之方 法，其包含投與有需要之個體本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體之步驟。
在本發明之使用方法之較佳實施例中，黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病係選自由淺表性擴散黑素瘤、惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端雀斑樣痣黑素瘤及結節型黑素瘤組成之群。
在另一實施例中，本發明提供套組，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明之方法產生之抗體構築體、本發明之載體及/或本發明之宿主細胞。
應理解，本文中之發明內容不限於特定方法、方案或試劑，因為該等方法、方案或試劑可變化。本文中提供之論述及實例係僅出於描述特定實施例目的而提供且不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇僅由申請專利範圍界定。
本說明書中引用之所有公開案及專利(包括所有專利、專利申請案、科技出版物、製造商說明書、說明書等)(無論上文中或下文中)均以全文引用的方式併入本文中。在本文中，不應視為發明者無權借助於先前發明或出於任何其他原因而先於該揭示內容之許可。當以參考方式併入之材料與本說明書矛盾或衝突時，以本說明書為準。
實例：
出於說明本發明之特定實施例或特徵之目的而提供以下實例。該等實例不應視為限制本發明之範疇。出於說明目的而包括該等實例，且本發明僅由申請專利範圍限制。
實例1-針對CDH19之完全人類單株抗體 1.1 免疫：
使用XENOMOUSE®技術、經工程改造以表現相應同型之完全人類IgGκ及IgGλ抗體之不同譜系的轉殖基因小鼠產生針對鈣黏素-19(CDH19)之完全人類抗體(美國專利第6,114,598號；第6,162,963號； 第6,833,268號；第7,049,426號；第7,064,244號，其以全文引用的方式併入本文中；Green等人,1994,Nature Genetics 7：13-21；Mendez等人,1997,Nature Genetics 15：146-156；Green及Jakobovitis,1998,J.Ex.Med.188：483-495；Kellermann及Green,Current Opinion in Biotechnology 13,593-597,2002)。
用多種形式之鈣黏素-19免疫原使小鼠免疫，包括：(1)全長人類及獼猴(「犬」)鈣黏素-19，(2)分泌型鈣黏素-19胞外域(胺基酸1-596)，及(3)人類鈣黏素-19之經截短之膜結合形式(胺基酸1-624)。以16-18倍增強免疫範圍使小鼠在8至10週時間內免疫。
在第一次注射後約第5週及第9週收集血清且藉由短暫表現於CHO-S細胞上之重組型鈣黏素-19受體之FAC染色測定特定效價。在總共37隻動物中發現特定免疫反應，將該等動物集中為3個組且進一步進行抗體產生。
1.2 製備單株抗體
鑑別呈現合適效價之動物，且自引流淋巴結獲得淋巴細胞且視需要集中以用於各群組。藉由在合適培養基(例如杜貝克改良之伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM)；可自Invitrogen,Carlsbad,CA獲得)中研磨以使細胞自組織釋放且懸浮於DMEM中來自淋巴組織分離淋巴細胞。使用標準方法選擇及/或擴增B細胞，且使用此項技術中已知的技術與合適融合搭配物融合。
在培養若干天之後，收集融合瘤上清液且經歷如以下實例中詳細描述之篩檢分析法，包括確認與人類及獼猴之結合以及在二級抗體-藥物結合物生物分析法中殺死細胞株之能力。接著進一步選擇鑑別具有相關結合及功能性之融合瘤菌株且經歷標準選殖及次選殖技術。活體外擴增純系菌株，且獲得分泌型人類抗體以用於分析且進行V基因定序。
1.3 藉由FMAT選擇鈣黏素-19受體特異性結合抗體
在培養14天之後，藉由螢光微量分析技術(FMAT)(Applied Biosystems,Foster City,CA)針對CDH19特異性單株抗體篩檢融合瘤上清液。針對經人類鈣黏素-19短暫轉染之黏性CHO細胞篩檢上清液，且針對經不含鈣黏素-19基因之相同表現質體轉染之CHO細胞進行複篩。
在多次篩檢操作後，鑑別1570抗鈣黏素-19結合融合瘤菌株之板且進一步進行其他表徵分析法。
實例2-評估針對CDH19之完全人類單株抗體 2.1 藉由流動式細胞測量術(FAC)進行其他結合表徵
進行FACS結合分析法以評估抗鈣黏素-19受體特異性抗體與表現於CHL-1腫瘤細胞株上之內源鈣黏素-19受體之結合。此外，亦使用短暫表現於293T細胞上之各種受體之重組形式藉由FAC評估與鼠類及獼猴鈣黏素-19直系同源物之交叉反應性結合。
FAC分析法係藉由將融合瘤上清液與10,000至25,000個細胞一起在4℃下於PBS/2%胎牛血清/2 mM氯化鈣中培育一小時，接著用PBS/2%胎牛血清/2 mM氯化鈣洗滌兩次來進行。接著在4℃下用螢光染料標記之二級抗體處理細胞，接著進行一次洗滌。細胞再懸浮於50μl PBS/2% FBS中，且使用FACSCaliburTM器具分析抗體結合。
2.2 來源於XenoMouse®融合瘤之完全人類抗體之抗體藥物結合物篩檢
經由抗體藥物結合物殺死細胞需要將結合物經由內化作用遞送至細胞中且藥物-結合物分解代謝為對細胞有毒之形式。為鑑別具有該等性質之抗體，以低細胞密度接種CDH19陽性細胞株(Colo-699或CHL-1)且在384孔板中附著隔夜。接著在高濃度之山羊抗人類Fc單價Fab與DM1之結合物(DM1-Fab)存在下以相對低藥物-抗體比率(DAR) (約1.3)將含有完全人類抗CDH19抗體之XENOMOUSE®融合瘤樣品添加至該等細胞中。細胞在抗體樣品及DM1-Fab存在下於37℃及5% CO2下培育96小時。在培育結束時，使用CellTiter-Glo®螢光細胞活力試劑(Promega)根據製造商說明評估細胞活力。
Colo-699細胞情況下之細胞活力資料之實例展示於圖1及圖2中。用低級螢光信號(RLU)對能夠將DM1-Fab遞送至細胞中且抑制細胞生長之抗體進行讀取。在圖1坐下角觀測來自此篩檢之相關頂部抗體且表示為空心圓形。將該等抗體用於對CHL-1細胞之細胞活力分析法中。針對來自Colo-699分析法之平均細胞活力標繪之來自CHL-1分析法之平均細胞活力資料(圖2)。在圖2左側，對Colo-699及CHL-1細胞均具有活性之抗體表示為空心圓形。
此分析法係與上述FAC抗體結合分析法(2.2)同時進行，且使用該兩項研究之結果選擇抗體以用於進一步表徵。總共1570種抗體經歷該等基於細胞之活力分析法且基於活體外細胞殺死及/或抗體結合選擇約44種抗體用於次選殖、V基因定序及重組形式中之表現以進行如下文描述之其他表徵分析法。
如實例2中所述再次分析該44種抗體且選擇19種含有單一順序之抗體。在該19種抗體中，分析18種抗體且其性質表徵於以下表2中。此表中之資料係使用重組型人類及獼猴CDH-19上之FAC結合、293/CDH-19轉染物上之+/-鈣(Ca+2)結合資料、CHL-1及Colo699腫瘤細胞上與內源CDH-19之結合及與表中指定為4A9之抗體之競爭產生。該等實驗提供將該等抗體分為5個組或等級之進一步表徵。
在該18種抗體中，選擇8抗體進行如下文描述之其抗原決定基結合之進一步分析。自各分級選擇至少一種代表性抗體以用於進一步分析。
實例3-抗原決定基預測 藉由4A9抗體競爭及人類/小鼠鈣黏素-19嵌合體進行抗原決定基預測
研究4A9結合競爭方法以鑑別與4A9結合競爭之抗體。在96孔V形底板(Sarstedt #82.1583.001)中，50,000個經短暫轉染之293T細胞與5μg/ml經純化之抗CDH19抗體一起在4℃下培育1小時，接著用PBS/2% FBS洗滌一次。接著將25μl 5μg/ml經Alexa647標記之4A9添加至各孔中且板在4℃下培育1小時。接著將細胞洗滌兩次且藉由流動式細胞測量術對與細胞關聯之經Alexa647標記之4A9之量進行定量。
實驗所包括之陰性對照僅由PBS/2% FBS組成。將該等陰性對照實驗中觀測到的平均信號用作分析法中之最大可能信號。比較抗體與 此最大信號且計算各孔之抑制百分比(%抑制=(1-(藉由抗CDH19抗體之FL4 Geomean/最大FL4 Geomean信號))。
在經質體短暫轉染之293T細胞上藉由如上所述之流動式細胞測量術測定結構域結合，該等質體係由單一或雙重人類CDH19鈣黏素重複結構域置換物組成，該(該等)置換物位於小鼠鈣黏素19主結構中，該主結構係選殖入pTT5表現載體中，該pTT5表現載體係由原生人類或鼠類CDH19前導序列及Flag標籤(SEQ ID NO：968)前導。實驗包括分析針對小鼠鈣黏素19之抗CDH19抗體以測定在該等人類/小鼠嵌合體上進行分級之合適性。
來自該等實驗之資料呈現於如下命名之下表中：
圖表3 人類及/或鼠類嵌合體構築體
A=huCDH19(44-772)(參見SEQ ID NO：944)
B=huCDH19(44-141)：：muCDH19(140-770)(參見SEQ ID NO：952)
C=huCDH19(44-249)：：muCDH19(248-770)(參見SEQ ID NO：954)
D=muCDH19(44-139)：：huCDH19(142-249)：：muCDH19(248-770)(參見SEQ ID NO：956)
E=muCDH19(44-139)：：huCDH19(142-364)：：muCDH19(363-770)(參見SEQ ID NO：958)
F=muCDH19(44-247)：：huCDH19(250-364)：：muCDH19(363-770)(參見SEQ ID NO：960)
G=muCDH19(44-362)：：huCDH19(365-772)(參見SEQ ID NO：962)
H=muCDH19(44-461)：：huCDH19(464-772)(參見SEQ ID NO：964)
I=muCDH19(44-770)(參見SEQ ID NO：966)
藉由人類/雞鈣黏素-19嵌合體進行抗原決定基預測
在經質體短暫轉染之293T細胞上藉由流動式細胞測量術測定結構域結合，該等質體係由單一或雙重人類CDH19鈣黏素重複結構域置換物組成，該(該等)置換物位於雞鈣黏素19主結構中，該主結構係選殖入pTT5表現載體中，該pTT5表現載體係由原生人類或雞CDH19前導序列及Flag標籤前導。實驗包括分析針對雞鈣黏素19之抗CDH19抗體之子集以測定在該等人類/雞嵌合體上進行分級之合適性。
在2mM CaCl2存在下完成以下結合分析法。在96孔V形底板(Costar 3897)中，50,000個經短暫轉染之293T細胞與5μg/ml經純化 之抗CDH19抗體一起在4℃下培育1小時，接著用PBS/2% FBS洗滌兩次。接著向各孔中添加50μl 5μg/ml經Alexa647標記之抗人類IgG二級抗體(Jackson Immuno 109-605-098)及2μg/ml 7AAD(Sigma A9400)且板在4℃下培育15分鐘。接著將細胞洗滌一次且藉由流動式細胞測量術對與細胞關聯之經Alexa647標記之Ab之量進行定量。實驗包括經模擬物轉染之對照物。來自該等實驗之資料呈現於下表中，n.d.=未確定。
圖表4 人類及/或雞嵌合體構築體
A=huCDH19(44-772)(參見SEQ ID NO：944)
J=ckCDH19(44-776)(參見SEQ ID NO：1451)
K=huCDH19(44-141)：：ckCDH19(142-776)(參見SEQ ID NO：1452)
L=ckCDH19(44-141)：：huCDH19(142-249)：：ckCDH19(250-776)(參見SEQ ID NO：1453)
M=ckCDH19(44-249)：：huCDH19(250-364)：：ckCDH19(365-776)(參見SEQ ID NO：1454)
N=ckCDH19(44-364)：：huCDH19(365-463)：：ckCDH19(469-776)(參見SEQ ID NO：1455)
O=ckCDH19(44-468)：：huCDH19(464-772)(參見SEQ ID NO：1456)
藉由獼猴/犬或大鼠/獼猴鈣黏素-19嵌合體進行抗原決定基預測
在經質體短暫轉染之293T細胞上藉由流動式細胞測量術測定結構域結合，該等質體係由恆河猴CDH19鈣黏素重複結構域1或區段結構域1(稱為EC1a、EC1b、EC1c)置換物(該等置換物係位於犬鈣黏素19主結構中)或大鼠CDH19鈣黏素重複結構域2置換物(該置換物係位於恆河猴鈣黏素19主結構中)組成，該犬鈣黏素19主結構或恆河猴鈣黏素19主結構係選殖入pTT5表現載體中，該pTT5表現載體係由原生恆河猴或犬CDH19前導序列及Flag標籤前導。實驗包括分析針對犬、大鼠及獼猴鈣黏素19之抗CDH19抗體之子集以確定在該等獼猴/犬及大鼠/恆河猴嵌合體上進行分級之合適性。
在2mM CaCl2存在下完成以下結合分析法。在96孔V形底板(Costar 3897)中，50,000個經短暫轉染之293T細胞與5μg/ml經純化之抗CDH19抗體一起在4℃下培育1小時，接著用PBS/2% FBS洗滌兩次。接著向各孔中添加50μl 5μg/ml經Alexa647標記之抗人類IgG二級抗體(Jackson Immuno 109-605-098)及2μg/ml 7AAD(Sigma A9400)且板在4℃下培育15分鐘。接著將細胞洗滌一次且藉由流動式細胞測量術對與細胞關聯之經Alexa647標記之Ab之量進行定量。實驗包括經模擬物轉染之對照物。來自該等實驗之資料呈現於下表中，n.d.=未確定。
圖表5 恆河猴、犬及/或大鼠嵌合體構築體
P=rhCDH19(44-772)(參見SEQ ID NO：1457)
Q=caCDH19(44-770)(參見SEQ ID NO：1458)
R=rhCDH19(44-141)：：caCDH19(141-770)(參見SEQ ID NO：1459)
S=rhCDH19(44-65)：：caCDH19(65-770)(參見SEQ ID NO：1460)
T=caCDH19(44-87)：：rhCDH19(89-114)：：caCDH19(115-770)(參見SEQ ID NO：1461)
U=caCDH19(44-120)：：rhCDH19(122-137)：：caCDH19(137-770)(參見SEQ ID NO：1462)
V=rhCDH19(44-141)：：raCDH19(140-247)：：rhCDH19(250-772)(參見SEQ ID NO：1463)
W=raCDH19(44-770)(參見SEQ ID NO：1464)
表5中概述之資料允許將等級A之結合劑44-141分為以下子群：Bin A.1 44-141
Bin A.2 44-141(44-114)
Bin A.3 44-141(44-65)
藉由大鼠/小鼠或人類/小鼠鈣黏素-19嵌合體進行抗原決定基預測
在經質體短暫轉染之293T細胞上藉由流動式細胞測量術測定結構域結合，該等質體係由大鼠CDH19鈣黏素重複結構域3取代物(稱為EC3a、EC3b)或人類CDH19鈣黏素重複結構域3取代物(稱為EC3c)組成，該(該等)取代物係位於小鼠鈣黏素19主結構中，該小鼠鈣黏素19主結構係選殖入pTT5表現載體中，該pTT5表現載體係由原生小鼠CDH19前導序列及Flag標籤前導。實驗包括分析針對人類、大鼠及小鼠鈣黏素19之抗CDH19抗體之子集以確定在該等大鼠/小鼠及人類/小鼠嵌合體上進行分級之合適性。
在2mM CaCl2存在下完成以下結合分析法。在96孔V形底板(Costar 3897)中，50,000個經短暫轉染之293T細胞與5μg/ml經純化之抗CDH19抗體一起在4℃下培育1小時，接著用PBS/2% FBS洗滌兩次。接著向各孔中添加50μl 5μg/ml經A1exa647標記之抗人類IgG二級抗體(Jackson Immuno 109-605-098)及2μg/ml 7AAD(Sigma A9400)且板在4℃下培育15分鐘。接著將細胞洗滌一次且藉由流動式細胞測量術對與細胞關聯之經Alexa647標記之Ab之量進行定量。實驗包括經模擬物轉染之對照物。來自該等實驗之資料呈現於下表中，n.d.=未確定。
圖表6 大鼠/小鼠或人類/小鼠嵌合體構築體
A=huCDH19(44-772)(參見SEQ ID NO：944)
I=muCDH19(44-770)(參見SEQ ID NO：966)
W=raCDH19(44-770)(參見SEQ ID NO：1464)
X=muCDH19(44-323)：：raCDH19(324-327)：：muCDH19(328-770)(參見SEQ ID NO：1465)
Y=muCDH19(44-770)：：raCDH19(290,299,308)(參見SEQ ID NO：1466)
Z=muCDH19(44-770)：：huCDH19(271)(參見SEQ ID NO：1467)
表6中概述之資料允許將等級B之結合劑250-364分為以下子群：Bin B.1 250-364
Bin B.2 250-364(324-327))，此係藉由如表6中參考之嚙齒動物計數(對應於人類及獼猴CDH19內之殘基(326-329))進行。
實例4-熱點/協變突變體
分析總共18種抗體之潛在熱點及協變違規。所設計之變異體(下文中展示)概括能夠降低及/或避免異構化、脫醯胺作用、氧化、協變違規及其類似作用之胺基酸取代。將80種經工程改造之變異體及15種親本抗體(因此總和95種序列)用於選殖、表現及純化過程。以96孔格式在經工程改造之變異體上進行定點突變誘發。在HEK 293-6E細胞中藉由高通量短暫性轉染表現親本抗體及經工程改造之變異體，使用經改良之AKTA自動採樣器純化且分析活性及生物物理學特徵。具有游離(未配對)Cys或N-糖基化作用位點之3種親本抗體未用於此過程中。該3種抗體由親本抗體之經工程改造之版本置換。所設計之變異體概括能夠降低及/或避免異構化、脫醯胺作用、氧化、協變違規、免疫原性及其類似作用之胺基酸取代。應瞭解，該等變異體序列為本申請案之含義內經工程改造之抗體之實例，但單點及/或多點突變可以任何組合方式組合以產生最終所需抗原結合分子或抗體。
實例5-CDH19 mRNA表現模式
自表示腫瘤(>70%腫瘤含量(由細胞計數))或正常(0%腫瘤含量(由細胞計數))之個別患者組織提取RNA。使用TisssueLyzer(Qiagen,Valencia,CA)將個別組織均質化且藉由mirVana完全RNA提取套組(Life Technologies,Foster City,CA)提取及純化全部RNA。藉由NanoDrop(NanoDrop,Wilmington,DE)分光光度計讀數及Bioanalyzer RNA探測(Agilient Technologies,Santa Clara,CA)檢驗RNA品質及數量。RNA用不含DNA之套組(Life Technologies,Foster City,CA)進行DNAse處理且使用大容量cDNA反轉錄套組(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)(Life Technologies,Foster City,CA)中之隨機六聚物根據製造商說明書進行反轉錄。使用針對CDH19之引子、探針集合Hs00253534_m1(Life Technologies,Foster City,CA)或管家基 因人類ACTB(引子CCT GGC ACC CAG CAC AA；GCC GAT CCA CAC GGA GTA CT；探針ATC AAG ATC ATT GCT CCT CCT GAG CG)對cDNA進行定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)。10μL qRT-PCR反應組分；1.0ng/μL cDNA，2xUniversal PCR Master Mix(Life Technologies,Foster City,CA)，基因表現分析法(ACTB；75nM引子，150nM探針EPOR；300nM引子，250nM探針)。根據qRT-PCR擴增程式：(1)在50℃下活化2分鐘；(2)在95℃下變性10分鐘；(3)在各步驟藉由螢光捕獲來擴增40次循環(95℃下15秒及60℃下1分鐘)(ABI PRISM 7900HT序列偵測系統，Applied Biosystems)。使用序列偵測器軟體版本2.3(Applied Biosystems)確定臨限循環值(CT)，且轉換為2-ΔCT以用於針對ACTB之CDH19特異性轉錄物之相對表現。結果展示於圖3中。在54種獨特轉移性及原發性黑素瘤樣品中，與來自正常組織之樣品中之表現相比，可發現大多數樣品過表現CDH19 mRNA。
實例6-CDH19蛋白質表現
在人類腫瘤樣品中藉由IHC分析CDH19蛋白質之表現且結果展示於圖4中。將樣品固定於10%中性緩衝福馬林(formalin)中24小時，脫水且嵌入石蠟。切割成4μm切片。首先將切片脫蠟且接著在DIVA Decloaker溶液(Biocare)中加熱40分鐘以用於抗原檢索。在DAKO Autostainer中在室溫下進行其餘IHC步驟。切片與過氧化物1(Peroxidazed 1)(Biocare)一起培育10分鐘以阻斷內源過氧化酶，接著與背景狙擊劑(background sniper)(Biocare)一起培育10分鐘以降低非特異性背景。切片以5μg/ml與CDH19抗體(Novo Biologicals，目錄號#H00028513-B01P)一起培育60分鐘，接著與Envision+ HRP抗小鼠聚合物(DAKO)一起培育30分鐘，接著與DAB+(DAKO)一起培育5分鐘。切片用蘇木精(hematoxylin)(DAKO)對比染色約1分鐘。在62%所檢驗之腫瘤中可偵測到CDH19表現(162個樣品中之101個樣品中染色 強度1+)。51%腫瘤樣品顯示中度至高度表現(162個樣品中之83個樣品中染色強度為2+至3+)。儘管在一些腫瘤中發現異質性，但CDH19在許多樣品中展示密集及不同的細胞膜染色。
實例7-模型細胞株之選擇
藉由流動式細胞測量術及IHC分析腫瘤細胞株以鑑別具有與人類腫瘤類似之CDH19表現的模型系統。直接自融合瘤改良之培養基純化人類抗huCDH19 IgG4抗體4A2。對於流動式細胞測量術，2×105個細胞與200nM CDH19 4A2抗體(其與PE以1：1比率結合)一起培育。在1.2mM鈣存在下進行培育及後續洗滌步驟。根據製造商說明書同時製備一管具有四種PE(BD，目錄號340495)含量之QuantiBRITE PE凍乾珠粒。藉由流動式細胞測量術分析珠粒以產生標準曲線。在FACS分析後，接著將自黑素瘤細胞株獲得之PE中值相對於標準曲線進行校準以計算每個細胞結合之抗體(ABC)，其提供各細胞上受體數目之估計值。如實例6中所描述進行IHC且結果提供於圖5中。黑素瘤細胞株CHL-1在細胞表面上表現約10,000個CDH19分子，而Colo699細胞表現約5,000個受體。兩種細胞株均表示具有基於IHC之中度至高度表現量之腫瘤。A2058中之表現極低，而LOX細胞不表現任何可偵測之CDH19蛋白質。
實例8 雙特異性結合及種間交叉反應性
對於確認與人類CDH19以及人類及獼猴CD3之結合，使用所示細胞株藉由流動式細胞測量術測試雙特異性抗體。使用經人類CDH19轉染之L1.2、表現原生人類CDH19之人類黑素瘤細胞株CHL-1及A2058、表現CD3之人類T細胞白血病細胞株HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)及表現CD3之獼猴T細胞株4119LnPx(Knappe A,等人,Blood,2000,95,3256-3261)作為抗原陽性細胞株。此外，使 用未經轉染之L1.2細胞作為陰性對照。
對於流動式細胞測量術，各別細胞株之200,000個細胞以5μg/ml之濃度與50μl經純化之雙特異性抗體一起在冰上培育30分鐘。細胞在PBS/2% FCS中洗滌兩次且用鼠類PentaHis抗體(Qiagen；在50μl PBS/2% FCS中以1：20稀釋)偵測構築體之結合。在洗滌後，用Fc γ-特異性抗體(Dianova)與藻紅素之結合物(在PBS/2% FCS中以1：100稀釋)偵測結合之PentaHis抗體。在FACSCanto II器具上藉由流動式細胞測量術量測樣品且藉由FACSDiva軟體(均來自Becton Dickinson)進行分析。
CDH19/CD3雙特異性抗體將經人類CDH19轉染之L1.2細胞、表現人類CDH19之黑素瘤細胞株CHL-1及A2058以及人類及獼猴T細胞染色。此外，未經轉染之L1.2細胞未發生染色(參見圖6)。
實例9 細胞毒素活性
藉由未受刺激之人類PBMC進行基於FACS之細胞毒性分析法
效應細胞之分離
藉由菲可密度梯度離心(Ficoll density gradient centrifugation)自濃縮淋巴細胞製劑(例如白血球層)(收集用於輸血之血液之血庫的副產物)製備人類末梢血液單核細胞(PBMC)。白血球層係由本地血庫供應且在血液收集的同一天製備PBMC。在菲可密度離心及用杜貝克PBS(Gibco)充分洗滌後，經由與紅血球溶解緩衝液(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、100μM EDTA)一起培育自PBMC移除剩餘紅血球。在PBMC之離心(100 x g)後，經由上清液移除血小板。剩餘淋巴細胞主要涵蓋B淋巴細胞及T淋巴細胞、NK細胞及單核細胞。PBMC在具有10% FCS(Gibco)之RPMI培養基(Gibco)中於37℃/5% CO2下保持於培養物中。
CD14 + 及CD56 + 細胞之消耗
對於CD14+細胞之消耗，使用人類CD14微珠粒(Milteny Biotec,MACS，#130-050-201)，對於NK細胞之消耗，使用人類CD56微珠粒(MACS，#130-050-401)。對PBMC進行計數且在室溫下以300 x g離心10分鐘。廢棄上清液且細胞小球再懸浮於MACS分離緩衝液[80微升/107個細胞；PBS(Invitrogen，#20012-043)、0.5%(v/v)FBS(Gibco，#10270-106)、2mM EDTA(Sigma-Aldrich，#E-6511)]中。添加CD14微珠粒及CD56微珠粒(20微升/107個細胞)且在4℃-8℃下培育15分鐘。細胞用MACS分離緩衝液(1-2毫升/107個細胞)洗滌。在離心(參見上文)後，廢棄上清液且細胞再懸浮於MACS分離緩衝液(500微升/108個細胞)中。接著使用LS管柱(Miltenyi Biotec，#130-042-401)分離CD14/CD56陰性細胞。PBMC w/o CD14+/CD56+細胞在培育箱中於37℃下在補充有10% FBS(Biochrom AG，#S0115)、1x非必需胺基酸(Biochrom AG，#K0293)、10mM Hepes緩衝液(Biochrom AG，#L1613)、1mM丙酮酸鈉(Biochrom AG，#L0473)及100U/mL青黴素/鏈黴素(Biochrom AG，#A2213)之RPMI完全培養基(亦即RPMI1640(Biochrom AG，#FG1215))中培養直至達到要求。
目標細胞標記
對於流動式細胞測量術分析法中細胞溶解之分析，使用螢光細胞膜染料DiOC18(DiO)(Molecular Probes，#V22886)標記人類CDH19(作為目標細胞)且將其與效應細胞區分開。簡言之，收集細胞，用PBS洗滌一次且在含有2%(v/v)FBS及細胞膜染料DiO(5微升/106個細胞)之PBS中調節至106個細胞/毫升。在37℃下培育3分鐘後，細胞在完全RPMI培養基中洗滌兩次且將細胞數目調節至1.25×105個細胞/毫升。使用0.5%(v/v)等滲EosinG溶液(Roth，#45380)測定細胞之活力。
基於流動式細胞測量術之分析
此分析法係經設計以對經人類CDH19轉染之CHO細胞在CDH19雙特異性抗體之連續稀釋物存在下之溶解進行定量。
將等體積的經DiO標記之目標細胞與效應細胞(亦即PBMC w/o CD14+細胞)混合，使得E：T細胞比率為10：1。將160μL此懸浮液轉移至96孔板之各孔中。添加CDH19雙特異性抗體之40μL連續稀釋物及雙特異性陰性對照物(基於CD3之雙特異性抗體，其識別無關目標抗原)或作為另一陰性對照之RPMI完全培養基。雙特異性抗體介導之細胞毒反應在7% CO2濕潤培育箱中進行48小時。接著將細胞轉移至新的96孔板中且藉由添加碘化丙錠(PI)達到1μg/mL之最終濃度監測到目標細胞之細胞膜完整性損失。PI為細胞膜不可滲透染料，其通常被活細胞排斥，而死細胞將其吸收且變為可藉由螢光發射而識別。
在FACSCanto II器具上藉由流動式細胞測量術量測樣品且藉由FACSDiva軟體(均來自Becton Dickinson)進行分析。
鑑別目標細胞為DiO陽性細胞。將PI陰性目標細胞歸類為活目標細胞。根據以下方程式計算細胞毒性之百分比：
n=事件數目
使用GraphPad Prism 5軟體(Graph Pad Software,San Diego)，針對相應雙特異性抗體濃度標繪細胞毒性百分比。藉由用於評估具有固定希爾斜率(hill slope)之S形劑量感應曲線之四參數型羅吉斯回歸模型(four parametric logistic regression models)分析劑量感應曲線且計算EC50值。結果展示於圖7中。
實例10 活體內腫瘤生長抑制實驗
5百萬Colo699或CHL-1腫瘤細胞與250萬新近分離之末梢血液單核細胞(PBMC)混合且在第0天皮下注射至雌性無胸腺裸小鼠之左側腹中。在同一天，小鼠用所示劑量之CDH19 BiTE 2G6或非特異性對照BiTE(MEC14)進行腹膜內處理。在腫瘤接種後的第一個10天保持每天給藥。
分別使用測徑規及分析度盤每週量測腫瘤體積及體重兩次。
Colo699或CHL-1腫瘤細胞實驗之結果展示於圖8及圖9中。
實例11 細胞毒素活性
藉由未受刺激之人類T細胞進行基於成像之細胞毒性分析法
效應細胞
經純化之原生人類T細胞係自AllCells LLC,Alameda,USA獲得。
基於影像之分析
此分析法量測T細胞介導之黑素瘤細胞之溶解。3000個A2058細 胞(CDH19陽性)或2500個LOX IMVI細胞(CDH19陰性)與原生人類T細胞以1：10比率在384孔板之孔中組合。在添加靶向CDH19之BiTE分子之連續稀釋物以及陰性對照雙特異性抗體(識別無關目標抗原之基於CD3之雙特異性抗體)後，細胞在37℃下培育48小時。接著，樣品用30μM Hoechst 33342處理2小時以將所有細胞之細胞核染色且用2μM碘化丙錠(PI)鑑別死細胞。
影像獲取及分析係使用具有10x目鏡之ThermoFisher ArrayScan進行。在386nm(Hoechst 33342)及549nm(碘化丙錠)下收集兩個通道之資料。
活細胞鑑別為Hoechst陽性、PI陰性事件，死細胞鑑別為Hoechst陽性，PI陽性。
如實例7中所描述確定細胞毒性之百分比。代表性結果展示於圖 10中。
實例12 雙特異性結合劑之結構域特異性及生物化學親和力測定 無轉譯後修飾之CDH19子結構域之純化
將甲硫胺酸起始密碼子選殖至合適pET載體中，該起始密碼子後接編碼CDH19子結構域蛋白質A=huCDH19(SEQ ID NO：944之140-367)之核苷酸序列，該CDH19子結構域蛋白質A=huCDH19前面緊接著G4S連接子及聚組胺酸標籤；而藉由此項技術中已知的方法將編碼子結構域蛋白質B=huCDH19(SEQ ID NO：944之44-367)及C=rhCDH19(SEQ ID NO：1457之44-367)之核苷酸序列選殖至pET-SUMO載體(Life Technologies,Invitrogen)中。各表現於大腸桿菌(E.coli)中，自可溶部分分離且藉由金屬螯合物親和層析純化至均質，接著進行陰離子交換，且在HEPES緩衝鹽水、3mM CaCl2(pH 8)中進行尺寸排阻層析。子結構域蛋白質A保留其連接子及C端聚組胺酸標籤，但在陰離子交換之前藉由SUMO蛋白酶(Life Technologies,Invitrogen)消化移除連接至蛋白質B及C之N端之His-SUMO標籤成分。藉由ESI LC/MS確定所有蛋白質均具有其預期分子量。下文描述之結合實驗中所使用的蛋白質係藉由此項技術中已知的典型方法隨機生物素化。
具有轉譯後修飾之CDH19子結構域之純化
CDH19子結構域蛋白質D=huCDH19(SEQ ID NO：944之44-367)及E=rhCDH19(SEQ ID NO：1457之44-367)係由編碼各別胺基酸殘基1-367之核苷酸序列選殖至pSURETech235b載體(Selexis)中產生，各前面緊接著G4S連接子及聚組胺酸標籤，選殖至pSURETech235b載體(Selexis)中，轉染至CHO-S細胞(Life Technologies,Invitrogen)中，且藉由此項技術中已知的方法進行潮黴素選擇產生穩定集合物。將穩定集合物擴增，且在無血清培養基中培養7天後收集條件培養基。CM係 藉由UF/DF使用1平方呎10K PES Pellicon 2膜以5透濾體積(diavolumes)HEPES緩衝鹽水加CaCl2交換且如上文所描述純化至均質。CDH19子結構域蛋白質D及E保留組成連接子及C端聚組胺酸標籤。如所預期，測得各蛋白質之N端序列為G44，而經純化之蛋白質之ESI LC/MS與經PNGase F消化之相同蛋白質者相比顯示存在N-連接之聚糖及O-連接之聚糖。下文描述之結合實驗中所使用的蛋白質係藉由此項技術中熟知的方法隨機生物素化。
藉由Octet進行結合親和力測定之方法
使用Octet RED384生物感測器以表徵蛋白質-蛋白質相互作用之動力學及親和力。最少生物素化之CDH19結構域目標蛋白質A-E在機器中結合於抗生蛋白鏈菌素端(streptavidin tips)，同時在96孔或384孔板中製備分析物雙特異性結合蛋白質之連續稀釋物。由分析研究發現經驗目標負載條件為10-20nM目標濃度且600秒負載產生2nm信號。結合實驗係由建立具有各分析物之30nM起始濃度之1：3連續稀釋液6點(表7-9)或3點(表10)之板進行，其中每行中之兩個參考孔僅具有緩衝液。Octet緩衝液：10mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl、+/- 1mM CaCl2、0.13% Triton X-100及0.10mg/ml BSA。板中之其他基線及解離孔亦僅含有緩衝液。結合方法如下：ForteBio Octet抗生蛋白鏈菌素端係(1)在緩衝液中浸泡10分鐘；(2)轉移至板基線孔中且培育5分鐘；(3)轉移至目標裝載孔中且培育10分鐘；(4)轉移至板基線孔中且培育5分鐘；(5)轉移至樣品孔中且培育5分鐘(表9)或20分鐘(表7、8、10)；(6)轉移至解離孔中且培育8.3分鐘(表9)或1.5小時(表7、8、10)。原始資料係以下列方式處理：(a)取參考端(reference tip)曲線之平均值且自樣品曲線減去；(b)分離結合及解離曲線且與Y軸對準；(c)將結合及解離級間(interstep)對準；(d)進行薩維斯基-戈雷(Savitzky-Golay)過濾以降低信號雜訊及(e)所得各樣品-目標相互作用之結合及 解離曲線之集合與單一1：1結合模型全面擬合以測定結合(Ka)及解離(Kd)速率常數之測量值，以計算平衡解離常數KD。
圖表7 無轉譯後修飾之人類CDH19蛋白質結構域
A=表現huCDH19(SEQ ID NO：944之140-367)之大腸桿菌
B=表現huCDH19(SEQ ID NO：944之44-367)之大腸桿菌
表7中概述之資料證明雙特異性結合劑之CDH19抗原決定基區域特異性及允許其相對親和力分級。
圖表8 無轉譯後修飾之CDH19蛋白質結構域
B=表現huCDH19(SEQ ID NO：944之44-367)之大腸桿菌
C=表現rhCDH19(SEQ ID NO：1457之44-367)之大腸桿菌
表8中概述之資料允許雙特異性結合劑之鈣敏感性之測定及其相對親和力分級。資料進一步提出構形抗原決定基，其中等級B.1與抗原決定基等級A.2相比更依賴於CDH19/Ca2+結合。
圖表9 無轉譯後修飾之CDH19蛋白質結構域
B=表現huCDH19(SEQ ID NO：944之44-367)之大腸桿菌
C=表現rhCDH19(SEQ ID NO：1457之44-367)之大腸桿菌
表9中概述之資料允許針對無糖基化作用之人類及非人類靈長類動物CDH19結構域之雙特異性結合劑之相對親和力分級。
圖表10 糖基化CDH19蛋白質結構域
D=表現huCDH19(SEQ ID NO：944之44-367)之CHO
E=表現rhCDH19(SEQ ID NO：1457之44-367)之CHO
表10中概述之資料允許測定雙特異性結合劑之鈣敏感性及糖基化人類及非人類靈長類動物CDH19結構域蛋白質之相對親和力分級。與表8中之資料相比，親和力與具有無轉譯後修飾之結構域的蛋白質類似。資料進一步提出構形抗原決定基，其中抗原決定基等級B.1及B.2與抗原決定基等級A.2相比更依賴於CDH19/Ca2+結合。
實例13 雙特異性結合及種間交叉反應性：
對於確認與人類CDH19以及人類CD3之結合，使用所示細胞株藉由流動式細胞測量術測試雙特異性抗體。使用經人類CDH19轉染之HEK293(參見實例14)及表現CD3之人類T細胞白血病細胞株HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig，ACC483)作為抗原陽性細胞株。
對於流動式細胞測量術，各別細胞株之200,000個細胞與100μl含有細胞培養物上清液之BiTE一起在冰上培育30分鐘。細胞在PBS/2% FCS中洗滌兩次且使用鼠類抗CD3scFv抗體(3E5.A5，Amgen；稀釋至2μg/ml PBS/2% FCS)偵測構築體之結合。在洗滌後，用Fc γ-特異性抗體(Dianova)與藻紅素之結合物(在PBS/2% FCS中以1：100稀釋)偵測結合之抗CD3scFv抗體。在FACSCanto II器具上藉由流動式細胞測量術量測樣品且藉由FACSDiva軟體(均來自Becton Dickinson)進行分析。
CDH19/CD3雙特異性抗體將經人類CDH19轉染之HEK293細胞以及人類及獼猴T細胞染色(參見圖19)。
實例14 細胞毒素活性
藉由受刺激之人類T細胞進行之鉻釋放分析法
效應細胞之分離
在37℃下用市售抗CD3特異性抗體(OKT3，Orthoclone)以1μg/ml之最終濃度經1小時塗佈皮氏培養皿(petri dish)(145mm直徑，Greiner bio-one GmbH,Kremsmünster)。用PBS藉由一個洗滌步驟移除未結合之蛋白質。將含3-5×107個人類PBMC之120ml RPMI 1640(具有穩定化麩醯胺酸/10% FCS/IL-2 20U/ml(Proleukin®，Chiron))添加至經預塗之皮氏培養皿中且刺激2天。在第三天，收集細胞且用RPMI 1640洗滌一次。添加IL-2達到20U/ml之最終濃度且細胞在相同的上述細胞培養基中再培養一天。
CD4 + 及CD56 + 細胞之消耗
使用Dynal-Beads根據製造商方案藉由消耗CD4+ T細胞及CD56+ NK細胞使CD8+細胞毒素的T淋巴細胞(CTL)增濃。
基於 51 Cr釋放之分析
經人類CDH19轉染之HEK293目標細胞(製備方法參見實例14)用PBS洗滌兩次且在37℃下用11.1 MBq 51Cr以50μl之最終體積(補充有RPMI)標記60分鐘。接著，經標記之目標細胞用5ml RPMI洗滌3次且接著用於細胞毒性分析法中。分析法係在96孔板中以200μl之總體積(補充有RPMI)在10：1之E：T比率下進行。使用0.1-1μg/ml之起始濃度之經純化之雙特異性抗體及其三倍稀釋物。分析法之培育時間為18小時。細胞毒性測定為與最大溶解(添加Triton-X)與自發性溶解(無效應細胞)之差異有關的上清液中釋放之鉻之相對值。所有量測均一式四份地進行。上清液中鉻活性之量測係在Wizard 3" γ計數器(Perkin Elmer Life Sciences GmbH,Köln,Germany)中進行。結果之分析係藉由用於Windows之Prism 6(6.02版本，GraphPad Software Inc.,San Diego,California,USA)進行。將藉由分析程式自S形劑量感應曲線計 算之EC50值用於細胞毒素活性之比較(參見圖20)。
實例15 BiTE抗體之產生及純化
在滾瓶中進行CDH19 BiTE抗體之標準化研究規模級產生。在過濾後，所收集之培養物上清液經歷基於固定金屬親和層析(IMAC)捕獲及後續尺寸排阻層析或Protein_A捕獲及後續尺寸排阻層析(SEC)之兩步驟型BiTE抗體純化。
15.1 BiTE抗體之IMAC捕獲步驟
將由Unicorn®軟體控制之Äkta®探測系統(GE Healthcare)用於層析。固定金屬親和層析(IMAC)係使用Fractogel EMD chelate®(Merck,Darmstadt)進行，根據製造商提供之方案在其中裝載ZnCl2。管柱用緩衝液A(20mM磷酸鈉緩衝液、0.1M NaCl、10mM咪唑(pH 7.2))平衡且將細胞培養物上清液(1000ml)以4ml/min之流動速率施用於管柱(10ml填充體積)。管柱用緩衝液A洗滌以移除未結合之樣品。根據以下程序使用緩衝液B(20mM磷酸鈉緩衝液、0.1M NaCl、0.5M咪唑(pH 7.2))之兩步驟梯度將結合之蛋白質溶離：
步驟1：10%緩衝液B(5倍管柱體積)
步驟2：100%緩衝液B(5倍管柱體積)
收集來自步驟2之溶離之蛋白質部分以用於進一步純化且使用具有PES膜之Vivaspin(Sartorius-Stedim,Göttingen-Germany)離心單元在10kDa之分子量截斷下濃縮至3ml最終體積。所有化學品均為研究級且自Merck(Darmstadt,Germany)購買。圖11
15.2 BiTE抗體之Protein_A捕獲步驟
將由Unicorn®軟體控制之Äkta®探測系統(GE Life Sciences)用於層析。使用含有珠粒之親和管柱進行捕獲步驟，該等珠粒具有共價結合之Protein_A。管柱用平衡緩衝液(pH 7.4)平衡且施用細胞培養物上 清液。在用三倍管柱體積之平衡緩衝液洗滌管柱以洗去未結合之樣品後，藉由施用溶離緩衝液(pH 3.0)使結合之BiTE抗體溶離。溶離之溶液立即用部分收集器中之部分分離管中已含有的參羥基甲基胺三羥甲基胺基甲烷溶液(pH 8.0)進行pH值中和。
收集來自步驟2之溶離之蛋白質部分以用於進一步純化且使用具有PES膜之Vivaspin(Sartorius-Stedim,Göttingen-Germany)離心單元在10kDa之分子量截斷下濃縮至3ml最終體積。所有化學品均為研究級且自Merck(Darmstadt,Germany)購買。圖12
15.3 尺寸排阻層析
尺寸排阻層析係在HiLoad 16/60 Superdex 200製備級管柱(GE Healthcare)上進行，該管柱係使用SEC緩衝液(20mM NaCl、30mM NaH2PO4、100mM L-精胺酸(pH 7.0))以1ml/min之流動速率平衡。收集BiTE抗體單體及二聚體部分且添加24%海藻糖儲備溶液以使最終海藻糖濃度達到4%。溶離之蛋白質樣品經歷還原性SDS-PAGE及抗His標籤西方墨點法(Anti His TAG Western Blot)以進行分析。
在具有1cm光路之聚碳酸酯光析管(Eppendorf,Hamburg-Germany)中在280nm下量測蛋白質池，且基於各蛋白質之Vector NTI序列分析軟體計算因子計算蛋白質濃度。
用額外的BiTE調配緩衝液(20mM NaCl、30mM NaH2PO4、100mM L-精胺酸、4%海藻糖(pH 7.0))將BiTE單體池調節至250μg/ml。使用且轉移最少600μg之量的各BiTE以進行如實例16中所描述之直接蛋白質分析。
BiTE抗體單體及BiTE抗體二聚體之剩餘蛋白質池在15μg及50μg蛋白質等分試樣中等分且在液氮中休克冷凍。在-80℃冷卻器中進行使用前之進一步儲存直至進行生物活動性分析及親和力量測。圖13。
藉由SDS-PAGE測定經分離之BiTE抗體單體之純度>95%。如所 預期，經純化之單體BiTE抗體呈現為54-56kDa分子量範圍內之蛋白質帶。圖14
實例16 蛋白質性質
將實例15中產生之新近製備之BiTE單體溶液用於以下分析方法
˙在250μg/ml及37℃下培育一週後，進行起始單體CDH19 BiTE抗體之高效能尺寸排阻層析(HP-SEC)。
˙藉由三次冷凍/解凍循環，接著進行HP-SEC進行BiTE單體之BiTE單體轉化，使其成為二聚體
˙高解析度分析性陽離子交換
˙在瓊脂糖凝膠辛基FF(Sepharose Octyl FF)基質上進行疏水性相互作用層析。
˙濃縮至2500μg/ml，接著儲存隔夜且進行混濁度量測
˙藉由加熱型動態光散射量測進行聚集溫度TA測定
16.1 藉由培育7天使BiTE單體轉化為二聚體
之15μg單體CDH19 BiTE抗體(濃度為250μg/ml)在37℃下培育7天。
將高解析度SEC管柱TSK Gel G3000 SWXL(Tosoh,Tokyo-Japan)連接至配備有A905自動取樣器之Äkta純化器10 FPLC(GE Lifesciences)。進行管柱平衡且將由100mM KH2PO4-200mM Na2SO4組成之操作緩衝液調節至pH 6.6。在培育7天後，將BiTE抗體溶液(15μg蛋白質)施用於經平衡之管柱且在7MPa之最高壓力下以0.75ml/min之流動速率進行溶離。在280、254及210nm光學吸光度下監測全部操作。藉由Äkta Unicorn軟件執行評估表中記錄之210nm信號之峰值整合進行分析。藉由用二聚體峰值除以單體之總面積加二聚體峰值來計算二聚體含量。圖15
16.2.藉由三次冷凍/解凍循環使BiTE單體轉化為二聚體
15μg單體BiTE抗體(250μg/ml)在-80℃下冷凍30分鐘，接著在室溫下解凍30分鐘。在三次冷凍/解凍循環後，如實例16.1中所描述藉由HP-SEC測定二聚體含量。圖16
CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21：0.50%二聚體含量
16.3 高解析度分析性離子交換層析
將由YMC(YMC Europe GmbH,Dinslaken-Germany)製造之具有與固體珠粒偶合之磺丙基之1ml BioPro SP管柱連接至Äkta Micro FPLC(GE Healthcare)裝置。
對於管柱平衡、樣品稀釋及洗滌，使用由20mM磷酸二氫鈉及30mM氯化鈉組成之用氫氧化鈉調節至pH 5.5之緩衝液。
對於溶離，使用由20mM NaH2PO4及1000mM NaCl組成之用氫氧化鈉調節至pH 5.5之緩衝液。
50μg BiTE抗體單體用稀釋緩衝液稀釋至50ml最終體積。
在管柱平衡後，將40ml經稀釋之蛋白質溶液施用於管柱，接著進行洗滌步驟。
藉由在對應於200倍管柱體積之總體積內溶離緩衝液自零至100%之穩定增加梯度來進行溶離。在280nm(藍線)及254nm(紅線)光學吸收下監測全部操作。
藉由用主峰之峰面積除以所有偵測之峰值之峰面積之總和，接著乘以因子100來計算主峰之百分比。圖17
CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21：89.3%主峰百分比
16.4 瓊脂糖凝膠辛基FF
在具有1ml凝膠體積之疏水性相互作用層析C8瓊脂糖凝膠辛基FF管柱(GE Healthcare)上評估單體BiTE抗體之溶離。
50μg BiTE抗體單體蛋白質用緩衝液(10mM檸檬酸-75mM離 胺酸×HCl-4%海藻糖-pH 7.2)補足至300μl之最終體積。管柱連接至Äkta純化器10系統(GE Healthcare)。500μl樣品迴路連接至系統。系統及管柱用操作緩衝液(10mM檸檬酸-75mM離胺酸×HCl--200mM NaCl-pH 7.2)平衡。
將完全樣品注入樣品迴路中且將樣品迴路之內含物施用於管柱。在樣品注射後，將10ml體積之操作緩衝液以0.2ml/min之流動速率施用於管柱，同時記錄254nm及280nm下之光學吸收以及導電性。
圖18
CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21：快速及完全溶離
16.5 將BiTE單體濃縮至2500μg/ml，接著儲存隔夜且進行混濁度量測
1000μl CDH19 BiTE單體在兩個具有10kDa PES膜之Vivaspin
500離心單元(Sartorius-Stedim,Göttingen-Germany)中濃縮至100μl之最終體積。此體積在冷卻箱中於5℃下儲存隔夜。在340nm光波長吸收下量測混濁度三次。接著計算三次量測值之平均值。
CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21之OD340混濁度：0.034
16.6 藉由加熱型動態光散射量測進行聚集溫度TA測定
將40μl體積之單體BiTE抗體(250μg/ml)轉移至拋棄式塑膠光析管之內核中。用通用BiTE調配緩衝液填充置放在更深處的外核。用橡膠蓋密封光析管之頂部以避免在樣品加熱過程中液體之蒸發損失。
將光析管置放於Nanostar動態光散射裝置(Wyatt)中且以0.5℃/分鐘之加熱增量自40℃加熱至70℃。
在整個加熱過程中始終監測及記錄聚集狀態。使用由裝置製造商提供之套裝軟體進行評估。
CDH19 BiTE CH19 2G6 302×I2C SA21之聚集溫度：52.4℃
16.7 具有Cys環(CysLoop)之BiTE抗體之聚乙二醇化
將含有C端Cys環之單體BiTE抗體(關於方法方面的詳細說明，參見WO 2006/008096)針對Tris/NaCl緩衝液(pH 7.4)進行透析且藉由添加還原劑參(2-羧乙基)膦TCEP(Perbio Pierce)進行還原，以便產生兩個現具有開放式Cys環之經還原之半胱胺酸。
藉由透析移除TCEP以莫耳過量方式添加能夠共價結合於經還原之半胱胺酸的聚乙二醇順丁烯二醯亞胺且在室溫下培育3小時
將瓊脂糖凝膠SP管柱陽離子交換管柱(GE Healthcare)連接至Äkta FPLC系統且用結合緩衝液(低莫耳磷酸鹽(Phosphat)/NaCl緩衝液(pH 5.0))平衡。
蛋白質溶液用調節至pH 5.0的結合緩衝液稀釋以實現BiTE蛋白質與陽離子交換管柱之結合。在用超過10倍管柱體積之其他結合緩衝液(pH 5.0)進行之洗滌步驟移除未結合之PEG。藉由線性增加百分比之溶離緩衝液20mM磷酸鹽1M NaCl使結合之蛋白質溶離。
將在較低莫耳濃度之溶離緩衝液下溶離之聚乙二醇化BiTE抗體與未經修飾之BiTE抗體進行比較。
序列表：
抗CDH19可變區胺基酸序列及聚核苷酸序列
抗CDH19可變區及恆定區聚核苷酸及胺基酸序列
人類及獼猴鈣黏素-19序列
雙特異性結合分子

Claims (18)

  1. 一種經分離之多特異性抗體構築體，其包含能夠結合於目標細胞表面上之人類CDH19的第一人類結合域及能夠結合於T細胞表面上之人類CD3的第二結構域。
  2. 如請求項1之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下組成之群之包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH區及包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL區：(a)如SEQ ID NO：52中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：54中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：222中描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：84中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：252中描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：84中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：927中描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：82中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：83中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：909中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：250中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：251中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：927中描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：52中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：54中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：926中描繪之CDR-L3，如SEQ ID NO：52中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：53中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：904中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：220中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：221中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：926中描繪之CDR-L3，如SEQ ID 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ID NO：1582中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：1583中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：1584中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：1585中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：1586中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：1587中描繪之CDR-L3，及如SEQ ID NO：1595中描繪之CDR-H1、如SEQ ID NO：1596中描繪之CDR-H2、如SEQ ID NO：1597中描繪之CDR-H3、如SEQ ID NO：1598中描繪之CDR-L1、如SEQ ID NO：1599中描繪之CDR-L2及如SEQ ID NO：1600中描繪之CDR-L3。
  3. 如請求項1或2之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下VH區組成之群的VH區(a)如SEQ ID NO：362，SEQ ID NO：364，SEQ ID NO：485，SEQ ID NO：486，SEQ ID NO：487，SEQ ID NO：492，SEQ ID NO：493，SEQ ID NO：494，SEQ ID NO：495，SEQ ID NO：1133，SEQ ID NO：1172，SEQ ID NO：1341，SEQ ID NO：1354，SEQ ID NO：1367，SEQ ID NO：1432，SEQ ID NO：1445及SEQ ID NO：2174中所描繪；(b)如SEQ ID NO：342，SEQ ID NO：366，SEQ ID NO：370，SEQ ID NO：344，SEQ ID NO：372，SEQ ID NO：368，SEQ ID NO：496，SEQ ID NO：497，SEQ ID NO：498，SEQ ID NO：499，SEQ ID NO：500，SEQ ID NO：508，SEQ ID NO：509，SEQ ID NO：510，SEQ ID NO：511，SEQ ID NO：512，SEQ ID NO：519，SEQ ID NO：520，SEQ ID NO：521，SEQ ID NO：522，SEQ ID NO：523，SEQ ID NO：524，SEQ ID NO：525，SEQ ID NO：526，SEQ ID NO：527，SEQ ID NO：528，SEQ ID NO：529，SEQ ID NO：530，SEQ ID NO：531，SEQ ID NO：532，SEQ ID NO：533，SEQ ID NO：534，SEQ ID NO：535，SEQ ID NO：536，SEQ ID NO：537，SEQ ID NO：538，SEQ ID NO：1016，SEQ ID NO：1029，SEQ ID NO：1042，SEQ ID NO：1081，SEQ ID NO：1107，SEQ ID NO：1120，SEQ ID NO：1250，SEQ ID NO：1263，SEQ ID NO：1276，SEQ ID NO：1289，SEQ ID NO：1302，SEQ ID NO：1654，SEQ ID NO：1667，SEQ ID NO：1901，SEQ ID NO：1914，SEQ ID NO：1940，SEQ ID NO：1953，SEQ ID NO：1966，SEQ ID NO：1979，SEQ ID NO：1992，SEQ ID NO：2005，SEQ ID NO：2018，SEQ ID NO：2031，SEQ ID NO：2044及SEQ ID NO：2057中所描繪；(c)如SEQ ID NO：338，SEQ ID NO：354，SEQ ID NO：378，SEQ ID NO：356，SEQ ID NO：476，SEQ ID NO：477，SEQ ID NO：478，SEQ ID NO：479，SEQ ID NO：480，SEQ ID NO：481，SEQ ID NO：482，SEQ ID NO：483，SEQ ID NO：484，SEQ ID NO：501，SEQ ID NO：502，SEQ ID NO：503，SEQ ID NO：504，SEQ ID NO：505，SEQ ID NO：506，SEQ ID NO：517，SEQ ID NO：518，SEQ ID NO：1003，SEQ ID NO：1055，SEQ ID NO：1094，SEQ ID NO：1615，SEQ ID NO：1628，SEQ ID NO：1641，SEQ ID NO：1680，SEQ ID NO：1693，SEQ ID NO：1706，SEQ ID NO：1719，SEQ ID NO：1732，SEQ ID NO：1745，SEQ ID NO：1758，SEQ ID NO：1771及SEQ ID NO：1927中所描繪；(d)如SEQ ID NO：352，SEQ ID NO：360，SEQ ID NO：388， SEQ ID NO：386，SEQ ID NO：340，SEQ ID NO：346，SEQ ID NO：374，SEQ ID NO：348，SEQ ID NO：390，SEQ ID NO：463，SEQ ID NO：464，SEQ ID NO：465，SEQ ID NO：466，SEQ ID NO：467，SEQ ID NO：468，SEQ ID NO：469，SEQ ID NO：470，SEQ ID NO：471，SEQ ID NO：472，SEQ ID NO：473，SEQ ID NO：474，SEQ ID NO：475，SEQ ID NO：488，SEQ ID NO：489，SEQ ID NO：490，SEQ ID NO：491，SEQ ID NO：513，SEQ ID NO：514，SEQ ID NO：515，SEQ ID NO：516，SEQ ID NO：540，SEQ ID NO：541，SEQ ID NO：542，SEQ ID NO：543，SEQ ID NO：977，SEQ ID NO：1068，SEQ ID NO：1146，SEQ ID NO：1159，SEQ ID NO：1185，SEQ ID NO：1198，SEQ ID NO：1211，SEQ ID NO：1224，SEQ ID NO：1237，SEQ ID NO：1315，SEQ ID NO：1328，SEQ ID NO：1380，SEQ ID NO：1393，SEQ ID NO：1406，SEQ ID NO：1419，SEQ ID NO：1469，SEQ ID NO：1478，SEQ ID NO：1485，SEQ ID NO：1494，SEQ ID NO：1501，SEQ ID NO：1508，SEQ ID NO：1519，SEQ ID NO：1526，SEQ ID NO：1533，SEQ ID NO：1542，SEQ ID NO：1549，SEQ ID NO：1558，SEQ ID NO：1565，SEQ ID NO：1784，SEQ ID NO：1797，SEQ ID NO：1810，SEQ ID NO：1823，SEQ ID NO：1836，SEQ ID NO：1849，SEQ ID NO：1862，SEQ ID NO：1875，SEQ ID NO：1888，SEQ ID NO：2070，SEQ ID NO：2083，SEQ ID NO：2096，SEQ ID NO：2109，SEQ ID NO：2122，SEQ ID NO：2135，SEQ ID NO：2148，SEQ ID NO：2161，SEQ ID NO：2187，SEQ ID NO：2200及SEQ ID NO：2213中所描繪；及(e)如SEQ ID NO：376，SEQ ID NO：392，SEQ ID NO：358， SEQ ID NO：350，SEQ ID NO：507，SEQ ID NO：990，SEQ ID NO：1589及SEQ ID NO：1602中所描繪。
  4. 如請求項1或2之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下VL區組成之群的VL區(a)如SEQ ID NO：418，SEQ ID NO：420，SEQ ID NO：580，SEQ ID NO：581，SEQ ID NO：582，SEQ ID NO：587，SEQ ID NO：588，SEQ ID NO：589，SEQ ID NO：590，SEQ ID NO：1135，SEQ ID NO：1174，SEQ ID NO：1343，SEQ ID NO：1356，SEQ ID NO：1369，SEQ ID NO：1434，SEQ ID NO：1447及SEQ ID NO：2176中所描繪；(b)如SEQ ID NO：398，SEQ ID NO：422，SEQ ID NO：426，SEQ ID NO：400，SEQ ID NO：428，SEQ ID NO：424，SEQ ID NO：591，SEQ ID NO：592，SEQ ID NO：593，SEQ ID NO：594，SEQ ID NO：595，SEQ ID NO：603，SEQ ID NO：604，SEQ ID NO：605，SEQ ID NO：606，SEQ ID NO：607，SEQ ID NO：614，SEQ ID NO：615，SEQ ID NO：616，SEQ ID NO：617，SEQ ID NO：618，SEQ ID NO：619，SEQ ID NO：620，SEQ ID NO：621，SEQ ID NO：622，SEQ ID NO：623，SEQ ID NO：624，SEQ ID NO：625，SEQ ID NO：626，SEQ ID NO：627，SEQ ID NO：628，SEQ ID NO：629，SEQ ID NO：630，SEQ ID NO：631，SEQ ID NO：632，SEQ ID NO：633，SEQ ID NO：1018，SEQ ID NO：1031，SEQ ID NO：1044，SEQ ID NO：1083，SEQ ID NO：1109，SEQ ID NO：1122，SEQ ID NO：1252，SEQ ID NO：1265，SEQ ID NO：1278，SEQ ID NO：1291，SEQ ID NO：1304，SEQ ID NO：1656，SEQ ID NO：1669，SEQ ID NO：1903，SEQ ID NO：1916，SEQ ID NO：1942，SEQ ID NO：1955，SEQ ID NO：1968，SEQ ID NO：1981，SEQ ID NO：1994，SEQ ID NO：2007，SEQ ID NO：2020，SEQ ID NO：2033，SEQ ID NO：2046及SEQ ID NO：2059中所描繪；(c)如SEQ ID NO：394，SEQ ID NO：410，SEQ ID NO：434，SEQ ID NO：412，SEQ ID NO：571，SEQ ID NO：572，SEQ ID NO：573，SEQ ID NO：574，SEQ ID NO：575，SEQ ID NO：576，SEQ ID NO：577，SEQ ID NO：578，SEQ ID NO：579，SEQ ID NO：596，SEQ ID NO：597，SEQ ID NO：598，SEQ ID NO：599，SEQ ID NO：600，SEQ ID NO：601，SEQ ID NO：612，SEQ ID NO：613，SEQ ID NO：1005，SEQ ID NO：1057，SEQ ID NO：1096，SEQ ID NO：1617，SEQ ID NO：1630，SEQ ID NO：1643，SEQ ID NO：1682，SEQ ID NO：1695，SEQ ID NO：1708，SEQ ID NO：1721，SEQ ID NO：1734，SEQ ID NO：1747，SEQ ID NO：1760，SEQ ID NO：1773及SEQ ID NO：1929中所描繪；(d)如SEQ ID NO：408，SEQ ID NO：416，SEQ ID NO：444，SEQ ID NO：442，SEQ ID NO：396，SEQ ID NO：402，SEQ ID NO：430，SEQ ID NO：404，SEQ ID NO：446，SEQ ID NO：558，SEQ ID NO：559，SEQ ID NO：560，SEQ ID NO：561，SEQ ID NO：562，SEQ ID NO：563，SEQ ID NO：564，SEQ ID NO：565，SEQ ID NO：566，SEQ ID NO：567，SEQ ID NO：568，SEQ ID NO：569，SEQ ID NO：570，SEQ ID NO：583，SEQ ID NO：584，SEQ ID NO：585，SEQ ID NO：586，SEQ ID NO：608，SEQ ID NO：609，SEQ ID NO：610，SEQ ID NO：611，SEQ ID NO：635，SEQ ID NO：636，SEQ ID NO：637，SEQ ID NO：638，SEQ ID NO：979，SEQ ID NO：1070，SEQ ID NO：1148，SEQ ID NO：1161，SEQ ID NO：1187，SEQ ID NO：1200，SEQ ID NO：1213，SEQ ID NO：1226，SEQ ID NO：1239，SEQ ID NO：1317，SEQ ID NO：1330，SEQ ID NO：1382，SEQ ID NO：1395，SEQ ID NO：1408，SEQ ID NO：1421，SEQ ID NO：1471，SEQ ID NO：1480，SEQ ID NO：1487，SEQ ID NO：1496，SEQ ID NO：1503，SEQ ID NO：1510，SEQ ID NO：1521，SEQ ID NO：1528，SEQ ID NO：1535，SEQ ID NO：1544，SEQ ID NO：1551，SEQ ID NO：1560，SEQ ID NO：1567，SEQ ID NO：1786，SEQ ID NO：1799，SEQ ID NO：1812，SEQ ID NO：1825，SEQ ID NO：1838，SEQ ID NO：1851，SEQ ID NO：1864，SEQ ID NO：1877，SEQ ID NO：1890，SEQ ID NO：2072，SEQ ID NO：2085，SEQ ID NO：2098，SEQ ID NO：2111，SEQ ID NO：2124，SEQ ID NO：2137，SEQ ID NO：2150，SEQ ID NO：2163，SEQ ID NO：2189，SEQ ID NO：2202及SEQ ID NO：2215中所描繪；及(e)如SEQ ID NO：432，SEQ ID NO：448，SEQ ID NO：414，SEQ ID NO：406，SEQ ID NO：602，SEQ ID NO：992，SEQ ID NO：1591及SEQ ID NO：1604中所描繪。
  5. 如請求項1或2之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下組成之群之VH區及VL區：(1)如SEQ ID NO：362+418，SEQ ID NO：364+420，SEQ ID NO：485+580，SEQ ID NO：486+581，SEQ ID NO：487+582，SEQ ID NO：492+587，SEQ ID NO：493+588，SEQ ID NO：494+589，SEQ ID NO：495+590，SEQ ID NO：1133+1135，SEQ ID NO：1172+1174，SEQ ID NO：1341+1343，SEQ ID NO：1354+1356，SEQ ID NO：1367+1369，SEQ ID NO：1432+1434，SEQ ID NO： 1445+1447及SEQ ID NO：2174+2176中所描繪之VH區及VL區之配對；(2)如SEQ ID NO：342+398，SEQ ID NO：366+422，SEQ ID NO：370+426，SEQ ID NO：344+400，SEQ ID NO：372+428，SEQ ID NO：368+424，SEQ ID NO：496+591，SEQ ID NO：497+592，SEQ ID NO：498+593，SEQ ID NO：499+594，SEQ ID NO：500+595，SEQ ID NO：508+603，SEQ ID NO：509+604，SEQ ID NO：510+605，SEQ ID NO：511+606，SEQ ID NO：512+607，SEQ ID NO：519+614，SEQ ID NO：520+615，SEQ ID NO：521+616，SEQ ID NO：522+617，SEQ ID NO：523+618，SEQ ID NO：524+619，SEQ ID NO：525+620，SEQ ID NO：526+621，SEQ ID NO：527+622，SEQ ID NO：528+623，SEQ ID NO：529+624，SEQ ID NO：530+625，SEQ ID NO：531+626，SEQ ID NO：532+627，SEQ ID NO：533+628，SEQ ID NO：534+629，SEQ ID NO：535+630，SEQ ID NO：536+631，SEQ ID NO：537+632，SEQ ID NO：538+633，SEQ ID NO：1016+1018，SEQ ID NO：1029+1031，SEQ ID NO：1042+1044，SEQ ID NO：1081+1083，SEQ ID NO：1107+1109，SEQ ID NO：1120+1122，SEQ ID NO：1250+1252，SEQ ID NO：1263+1265，SEQ ID NO：1276+1278，SEQ ID NO：1289+1291，SEQ ID NO：1302+1304，SEQ ID NO：1654+1656，SEQ ID NO：1667+1669，SEQ ID NO：1901+1903，SEQ ID NO：1914+1916，SEQ ID NO：1940+1942，SEQ ID NO：1953+1955，SEQ ID NO：1966+1968，SEQ ID NO：1979+1981，SEQ ID NO：1992+1994，SEQ ID NO：2005+2007，SEQ ID NO：2018+2020，SEQ ID NO：2031+2033，SEQ ID NO：2044+2046及SEQ ID NO：2057+2059中所描繪之VH區及VL區之配對； (3)如SEQ ID NO：338+394，SEQ ID NO：354+410，SEQ ID NO：378+434，SEQ ID NO：356+412，SEQ ID NO：476+571，SEQ ID NO：477+572，SEQ ID NO：478+573，SEQ ID NO：479+574，SEQ ID NO：480+575，SEQ ID NO：481+576，SEQ ID NO：482+577，SEQ ID NO：483+578，SEQ ID NO：484+579，SEQ ID NO：501+596，SEQ ID NO：502+597，SEQ ID NO：503+598，SEQ ID NO：504+599，SEQ ID NO：505+600，SEQ ID NO：506+601，SEQ ID NO：517+612，SEQ ID NO：518+613，SEQ ID NO：1003+1005，SEQ ID NO：1055+1057，SEQ ID NO：1094+1096，SEQ ID NO：1615+1617，SEQ ID NO：1628+1630，SEQ ID NO：1641+1643，SEQ ID NO：1680+1682，SEQ ID NO：1693+1695，SEQ ID NO：1706+1708，SEQ ID NO：1719+1721，SEQ ID NO：1732+1734，SEQ ID NO：1745+1747，SEQ ID NO：1758+1760，SEQ ID NO：1771+1773及SEQ ID NO：1927+1929中所描繪之VH區及VL區之配對；(4)如SEQ ID NO：352+408，SEQ ID NO：360+416，SEQ ID NO：388+444，SEQ ID NO：386+442，SEQ ID NO：340+396，SEQ ID NO：346+402，SEQ ID NO：374+430，SEQ ID NO：348+404，SEQ ID NO：390+446，SEQ ID NO：463+558，SEQ ID NO：464+559，SEQ ID NO：465+560，SEQ ID NO：466+561，SEQ ID NO：467+562，SEQ ID NO：468+563，SEQ ID NO：469+564，SEQ ID NO：470+565，SEQ ID NO：471+566，SEQ ID NO：472+567，SEQ ID NO：473+568，SEQ ID NO：474+569，SEQ ID NO：475+570，SEQ ID NO：488+583，SEQ ID NO：489+584，SEQ ID NO：490+585，SEQ ID NO：491+586，SEQ ID NO：513+608，SEQ ID NO：514+609，SEQ ID NO：515+610，SEQ ID NO：516+611， SEQ ID NO：540+635，SEQ ID NO：541+636，SEQ ID NO：542+637，SEQ ID NO：543+638，SEQ ID NO：977+979，SEQ ID NO：1068+1070，SEQ ID NO：1146+1148，SEQ ID NO：1159+1161，SEQ ID NO：1185+1187，SEQ ID NO：1198+1200，SEQ ID NO：1211+1213，SEQ ID NO：1224+1226，SEQ ID NO：1237+1239，SEQ ID NO：1315+1317，SEQ ID NO：1328+1330，SEQ ID NO：1380+1382，SEQ ID NO：1393+1395，SEQ ID NO：1406+1408，SEQ ID NO：1419+1421，SEQ ID NO：1469+1471，SEQ ID NO：1478+1480，SEQ ID NO：1485+1487，SEQ ID NO：1494+1496，SEQ ID NO：1501+1503，SEQ ID NO：1508+1510，SEQ ID NO：1519+1521，SEQ ID NO：1526+1528，SEQ ID NO：1533+1535，SEQ ID NO：1542+1544，SEQ ID NO：1549+1551，SEQ ID NO：1558+1560，SEQ ID NO：1565+1567，SEQ ID NO：1784+1786，SEQ ID NO：1797+1799，SEQ ID NO：1810+1812，SEQ ID NO：1823+1825，SEQ ID NO：1836+1838，SEQ ID NO：1849+1851，SEQ ID NO：1862+1864，SEQ ID NO：1875+1877，SEQ ID NO：1888+1890，SEQ ID NO：2070+2072，SEQ ID NO：2083+2085，SEQ ID NO：2096+2098，SEQ ID NO：2109+2111，SEQ ID NO：2122+2124，SEQ ID NO：2135+2137，SEQ ID NO：2148+2150，SEQ ID NO：2161+2163，SEQ ID NO：2187+2189，SEQ ID NO：2200+2202及SEQ ID NO：2213+2215中所描繪之VH區及VL區之配對；及(5)如SEQ ID NO：376+432，SEQ ID NO：392+448，SEQ ID NO：358+414，SEQ ID NO：350+406，SEQ ID NO：507+602，SEQ ID NO：990+992，SEQ ID NO：1589+1591及SEQ ID NO：1602+1604中所描繪之VH區及VL區之配對。
  6. 如請求項1或2之抗體構築體，其中該抗體構築體呈選自由(scFv)2、(單域mAb)2、scFv-單域mAb、雙功能抗體(diabodies)及其寡聚物組成之群的形式。
  7. 如請求項6之抗體構築體，其中該第一結合域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列(a)如SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：1137，SEQ ID NO：1176，SEQ ID NO：1345，SEQ ID NO：1358，SEQ ID NO：1371，SEQ ID NO：1436，SEQ ID NO：1449及SEQ ID NO：2178中所描繪；(b)如SEQ ID NO：1020，SEQ ID NO：1033，SEQ ID NO：1046，SEQ ID NO：1085，SEQ ID NO：1111，SEQ ID NO：1124，SEQ ID NO：1254，SEQ ID NO：1267，SEQ ID NO：1280，SEQ ID NO：1293，SEQ ID NO：1306，SEQ ID NO：1658，SEQ ID NO：1671，SEQ ID NO：1905，SEQ ID NO：1918，SEQ ID NO：1944，SEQ ID NO：1957，SEQ ID NO：1970，SEQ ID NO：1983，SEQ ID NO：1996，SEQ ID NO：2009，SEQ ID NO：2022，SEQ ID NO：2035，SEQ ID NO：2048及SEQ ID NO：2061中所描繪；(c)如SEQ ID NO：1007，SEQ ID NO：1059，SEQ ID NO：1098，SEQ ID NO：1619，SEQ ID NO：1632，SEQ ID NO：1645，SEQ ID NO：1684，SEQ ID NO：1697，SEQ ID NO：1710，SEQ ID NO：1723，SEQ ID NO：1736，SEQ ID NO：1749，SEQ ID NO：1762，SEQ ID NO：1775及SEQ ID NO：1931中所描繪；(d)如SEQ ID NO：981，SEQ ID NO：1072，SEQ ID NO：1150，SEQ ID NO：1163，SEQ ID NO：1189，SEQ ID NO：1202，SEQ ID NO：1215，SEQ ID NO：1228，SEQ ID NO：1241，SEQ ID NO：1319，SEQ ID NO：1332，SEQ ID NO：1384，SEQ ID NO：1397，SEQ ID NO：1410，SEQ ID NO：1423，SEQ ID NO：1473，SEQ ID NO：1482，SEQ ID NO：1489，SEQ ID NO：1498，SEQ ID NO：1505，SEQ ID NO：1512，SEQ ID NO：1523，SEQ ID NO：1530，SEQ ID NO：1537，SEQ ID NO：1546，SEQ ID NO：1553，SEQ ID NO：1562，SEQ ID NO：1569，SEQ ID NO：1788，SEQ ID NO：1801，SEQ ID NO：1814，SEQ ID NO：1827，SEQ ID NO：1840，SEQ ID NO：1853，SEQ ID NO：1866，SEQ ID NO：1879，SEQ ID NO：1892，SEQ ID NO：2074，SEQ ID NO：2087，SEQ ID NO：2100，SEQ ID NO：2113，SEQ ID NO：2126，SEQ ID NO：2139，SEQ ID NO：2152，SEQ ID NO：2165，SEQ ID NO：2191，SEQ ID NO：2204及SEQ ID NO：2217中所描繪；及(e)如SEQ ID NO：994、SEQ ID NO：1593及SEQ ID NO：1606中所描繪。
  8. 如請求項1或2之抗體構築體，其中該第二結合域能夠結合於人類及普通狨(Callithrix jacchus)、棉頂狨(Saguinus Oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε。
  9. 如請求項8之抗體構築體，其具有選自由以下組成之群的胺基酸序列(a)如SEQ ID NO：1138，SEQ ID NO：1177，SEQ ID NO：1346，SEQ ID NO：1359，SEQ ID NO：1372，SEQ ID NO：1437，SEQ ID NO：1450及SEQ ID NO：2179中所描繪；(b)如SEQ ID NO：1021，SEQ ID NO：1034，SEQ ID NO：1047，SEQ ID NO：1086，SEQ ID NO：1112，SEQ ID NO：1125，SEQ ID NO：1255，SEQ ID NO：1268，SEQ ID NO：1281，SEQ ID NO：1294，SEQ ID NO：1307，SEQ ID NO：1659，SEQ ID NO：1672，SEQ ID NO：1906，SEQ ID NO：1919，SEQ ID NO：1945，SEQ ID NO：1958，SEQ ID NO：1971，SEQ ID NO：1984，SEQ ID NO：1997，SEQ ID NO：2010，SEQ ID NO：2023，SEQ ID NO：2036，SEQ ID NO：2049及SEQ ID NO：2062中所描繪；(c)如SEQ ID NO：1008，SEQ ID NO：1060，SEQ ID NO：1099，SEQ ID NO：1620，SEQ ID NO：1633，SEQ ID NO：1646，SEQ ID NO：1685，SEQ ID NO：1698，SEQ ID NO：1711，SEQ ID NO：1724，SEQ ID NO：1737，SEQ ID NO：1750，SEQ ID NO：1763，SEQ ID NO：1776及SEQ ID NO：1932中所描繪；(d)如SEQ ID NO：982，SEQ ID NO：1073，SEQ ID NO：1151，SEQ ID NO：1164，SEQ ID NO：1190，SEQ ID NO：1203，SEQ ID NO：1216，SEQ ID NO：1229，SEQ ID NO：1242，SEQ ID NO：1320，SEQ ID NO：1333，SEQ ID NO：1385，SEQ ID NO：1398，SEQ ID NO：1411，SEQ ID NO：1424，SEQ ID NO：1474，SEQ ID NO：1475，SEQ ID NO：1476，SEQ ID NO：1483，SEQ ID NO：1490，SEQ ID NO：1491，SEQ ID NO：1492，SEQ ID NO：1499，SEQ ID NO：1506，SEQ ID NO：1513，SEQ ID NO：1514，SEQ ID NO：1515，SEQ ID NO：1516，SEQ ID NO：1517，SEQ ID NO：1524，SEQ ID NO：1531，SEQ ID NO：1538，SEQ ID NO：1539，SEQ ID NO：1540，SEQ ID NO：1547，SEQ ID NO：1554，SEQ ID NO：1555，SEQ ID NO：1556，SEQ ID NO：1563，SEQ ID NO：1570，SEQ ID NO：1571，SEQ ID NO：1572，SEQ ID NO：1573，SEQ ID NO：1574，SEQ ID NO：1575，SEQ ID NO：1576，SEQ ID NO：1577，SEQ ID NO：1578，SEQ ID NO：1579，SEQ ID NO：1580，SEQ ID NO：1581，SEQ ID NO：1789，SEQ ID NO：1802，SEQ ID NO：1815，SEQ ID NO：1828，SEQ ID NO：1841，SEQ ID NO：1854，SEQ ID NO：1867，SEQ ID NO：1880，SEQ ID NO：1893，SEQ ID NO：2075，SEQ ID NO：2088，SEQ ID NO：2101， SEQ ID NO：2114，SEQ ID NO：2127，SEQ ID NO：2140，SEQ ID NO：2153，SEQ ID NO：2166，SEQ ID NO：2192，SEQ ID NO：2205及SEQ ID NO：2218至2228中所描繪；及(e)如SEQ ID NO：995、SEQ ID NO：1594及SEQ ID NO：1607中所描繪。
  10. 一種核酸序列，其編碼如請求項1至9中任一項之抗體構築體。
  11. 一種載體，其包含如請求項10之核酸序列。
  12. 一種宿主細胞，其經如請求項10之核酸序列或如請求項11之載體轉型或轉染。
  13. 一種產生如請求項1至9中任一項之抗體構築體之方法，該方法包含將如請求項12之宿主細胞培養在允許如請求項1至9中任一項之抗體構築體表現的條件下及自該培養物回收所產生之抗體構築體。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之抗體構築體或如請求項13之方法產生之抗體構築體。
  15. 如請求項1或2之抗體構築體或如請求項13之方法產生之抗體構築體，其係用於預防、治療或改善黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病。
  16. 一種如請求項1至9中任一項之抗體構築體或如請求項13之方法產生之抗體構築體之用途，其係用於製造用以治療或改善黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病之藥劑。
  17. 如請求項16之用途，其中該黑素瘤疾病或轉移性黑素瘤疾病係選自由淺表擴散性黑素瘤、惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端雀斑樣痣黑素瘤及結節型黑素瘤組成之群。
  18. 一種套組，其包含如請求項1至9中任一項之抗體構築體或如請求項13之方法產生之抗體構築體、如請求項11之載體及/或如請求項12之宿主細胞。
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