JP6522517B2 - Ｃｄｈ１９およびｃｄ３に対する抗体構築物 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、本願の出願と同日の2013年3月15日に出願された「Antibodies targeting CDH19 for melanoma」を表題とする米国仮出願に関連する。この関連出願は、その全体が参照により組み入れられる。
発明の分野
本発明は、標的細胞の表面上のヒトCDH19に結合することができる第1のヒト結合ドメインおよびT細胞の表面上のヒトCD3に結合することができる第2のドメインを含む抗体構築物に関する。さらに、本発明は、該抗体構築物をコードする核酸配列、該核酸配列を含むベクターおよび該ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の抗体構築物の産生のためのプロセス、該抗体構築物の医学的使用および該抗体構築物を含むキットを提供する。
発明の背景
黒色腫は、色素を生成する皮膚細胞であるメラニン細胞の発癌性形質転換によって引き起こされる皮膚癌である。2009年の時点で、黒色腫は、患者数が、米国単独で870,000例を超えている（US National Institutes of Health）。毎年、75,000を上回る新たな黒色腫の症例が米国において診断されており、患者のおよそ25％は診断時に進行疾患を有している。原発性黒色腫の症例はそれらが十分早い時期に検出される場合手術によって治癒可能であるという事実にもかかわらず、黒色腫は、米国における皮膚病による死の最大の原因であり、米国において毎年約10,000件の死に関与している。この疾患が拡散し転移した場合、予後は悪く、5年相対生存率は15％である。
黒色腫には4つの基本的なタイプがある。3つのタイプは皮膚の最上層で見られ、第4のものは侵襲性であり皮膚深層に浸透し、身体の他の領域に拡散し得る。
表在拡大型黒色腫は、最も一般的なタイプの黒色腫であり、全症例の約70％を占める。それは皮膚の最上層に沿って成長し、より深層に浸透するまでかなりの時間を要する。それは最初に、不規則な境界を有しある程度非対称な形態であり得る平坦なまたはわずかに隆起した変色した斑点として顕れる。色は様々であり、黄褐色、茶色、黒色、赤色、青色または白色の領域を見るかもしれない。このタイプの黒色腫は、以前に良性であったほくろで生じ得、そして若者の間で最も多く見られる。
悪性黒子は、これもまた相当な間皮膚表面付近に留まることおよび通常平坦または緩やかに隆起するまだらな黄褐色、茶色または濃茶色の変色のように見えることから、表在拡大型に類似している。それは高齢者で最も多く見られる。この癌が侵襲性になったとき、それは悪性黒子型黒色腫と呼ばれる。
末端黒子型黒色腫もまた、より深層に浸透する前に表層で拡散する。それは通常爪の下または足裏もしくは手掌上の黒色または茶色の変色のように見えるが、他とは全く異なる。このタイプの黒色腫は浅黒い人々で見られることがあり、しばしば表在拡大型黒色腫および悪性黒子よりも迅速に進行し得る。
結節型黒色腫は通常、それが最初に診断された時点で侵襲性である。この悪性腫瘍は、それが隆起物になったときに認識される。それは通常黒色であるが、ときには青色、灰色、白色、茶色、黄褐色、赤色または肌の色合いである。これは最も高悪性度の黒色腫であり、症例の10〜15％で見られる。
転移性黒色腫に対する一般的な処置は、化学療法、適格患者に対する標的化療法（例えば、BRAF変異を有する患者に対するBRAF阻害剤処置）および免疫療法を含む。転移性黒色腫は、免疫療法が疾患の進行を遅らせるだけでなく後期段階の患者において治癒をもたらすことが実証されている腫瘍タイプである。インターロイキン-2が、転移性黒色腫における使用に関して、1998年に承認され、そして2011年には、新世代の免疫チェックポイント阻害剤のメンバーであるCTLA4を標的化する抗体がFDAによる承認を得た。
CDH19は、機能未知のII型カドヘリン膜貫通タンパク質である。そのヒト遺伝子は、CDH7に対するその配列類似性に基づき、2000年にクローニングされた（Kools, P. et al. Genomics. 2000（非特許文献1））。CDH19の発現配列タグ（EST）は、メラニン細胞cDNAライブラリから単離され、CDH19の発現が神経堤起源の細胞に限定され得ることが示された（Kools, P. et al. Genomics. 2000（非特許文献1））。この概念を支持するものとして、ラットCDH19がラットの胚発生時に主として神経節およびシュワン細胞において発現されることが見出された（Takahashi, M. and Osumi, O. Devl Dynamics, 2005（非特許文献2））。
ウェスタンブロット、免疫組織化学またはフローサイトメトリーにおいてCDH19を検出する診断抗体が当技術分野で公知であり、市販されている。これらの抗体は、動物宿主において作製されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。
Kools, P. et al. Genomics. 2000 Takahashi, M. and Osumi, O. Devl Dynamics, 2005
本発明は、標的細胞の表面上のヒトCDH19に結合することができる第1のヒト結合ドメインおよびT細胞の表面上のヒトCD3に結合することができる第2のドメインを含む、単離された多重特異性抗体構築物を提供する。
本発明の抗体構築物の1つの態様において、第1の結合ドメインは、
（a）SEQ ID NO:52に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:53に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:54に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:220に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:221に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:222に示されるCDR-L3、
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SEQ ID NO:2167に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2168に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2169に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2170に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2171に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2172に示されるCDR-L3；
（b）SEQ ID NO:124に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:125に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:126に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:292に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:293に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:294に示されるCDR-L3、
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SEQ ID NO:124に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:125に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:915に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:292に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:293に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:928に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:124に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:125に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:915に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:292に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:293に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:929に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:166に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:167に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:168に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:334に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:335に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:336に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:166に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:167に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:168に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:334に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:335に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:942に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:166に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:167に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:168に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:334に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:335に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:943に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:148に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:149に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:150に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:316に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:317に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:318に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:148に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:149に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:150に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:316に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:317に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:937に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:148に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:149に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:150に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:316に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:317に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:938に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:148に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:149に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:919に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:316に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:317に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:938に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:142に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:143に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:144に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:310に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:311に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:935に示されるCDR-L3、
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SEQ ID NO:130に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:131に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:916に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:298に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:299に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:932に示されるCDR-L3、
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SEQ ID NO:2037に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2038に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2039に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2040に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2041に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2042に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:2050に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2051に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2052に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2053に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2054に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2055に示されるCDR-L3；
（c）SEQ ID NO:94に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:95に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:96に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:262に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:263に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:264に示されるCDR-L3、
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SEQ ID NO:1764に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1765に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1766に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1767に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1768に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1769に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:1920に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1921に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1922に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1923に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1924に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1925に示されるCDR-L3；
（d）SEQ ID NO:4に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:5に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:6に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:172に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:173に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:174に示されるCDR-L3、
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SEQ ID NO:64に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:65に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:66に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:232に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:233に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:234に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:71に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:72に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3、
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SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:902に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:903に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:925に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:907に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:72に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:907に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:908に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:901に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:905に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:906に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:905に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:60に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:921に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:940に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:941に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:901に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:970に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:971に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:972に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:973に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:974に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:975に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1061に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1062に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1063に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1064に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1065に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1066に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1139に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1140に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1141に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1142に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1143に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1144に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1152に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1153に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1154に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1155に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1156に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1157に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1178に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1179に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1180に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1181に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1182に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1183に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1191に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1192に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1193に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1194に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1195に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1196に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1204に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1205に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1206に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1207に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1208に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1209に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1217に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1218に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1219に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1220に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1221に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1222に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1230に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1231に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1232に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1233に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1234に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1235に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1308に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1309に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1310に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1311に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1312に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1313に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1321に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1322に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1323に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1324に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1325に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1326に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1373に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1374に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1375に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1376に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1377に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1378に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1386に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1387に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1388に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1389に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1390に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1391に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1399に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1400に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1401に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1402に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1403に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1404に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1412に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1413に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1414に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1415に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1416に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1417に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1777に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1778に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1779に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1780に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1781に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1782に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1790に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1791に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1792に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1793に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1794に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1795に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1803に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1804に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1805に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1806に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1807に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1808に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1816に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1817に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1818に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1819に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1820に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1821に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1829に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1830に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1831に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1832に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1833に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1834に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1842に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1843に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1844に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1845に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1846に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1847に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1855に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1856に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1857に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1858に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1859に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1860に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1868に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1869に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1870に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1871に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1872に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1873に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1881に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1882に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1883に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1884に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1885に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1886に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2063に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2064に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2065に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2066に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2067に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2068に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2076に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2077に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2078に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2079に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2080に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2081に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2089に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2090に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2091に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2092に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2093に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2094に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2102に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2103に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2104に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2105に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2106に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2107に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2115に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2116に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2117に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2118に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2119に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2120に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2128に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2129に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2130に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2131に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2132に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2133に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2141に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2142に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2143に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2144に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2145に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2146に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2154に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2155に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2156に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2157に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2158に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2159に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2180に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2181に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2182に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2183に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2184に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2185に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2193に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2194に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2195に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2198に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:2206に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2207に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2208に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2209に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2210に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2211に示されるCDR-L3；および
（e）SEQ ID NO:76に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:77に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:78に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:244に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:245に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:246に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:88に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:89に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:90に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:256に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:257に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:258に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:106に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:107に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:108に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:274に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:275に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:276に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:112に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:113に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:114に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:280に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:281に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:282に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:106に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:107に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:108に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:274に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:275に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:276に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:983に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:984に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:985に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:986に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:987に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:988に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1582に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1583に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1584に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1585に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1586に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1587に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:1595に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1596に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1597に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1598に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1599に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1600に示されるCDR-L3
からなる群より選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域ならびにCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む。
本発明の抗体構築物のさらなる態様において、第1の結合ドメインは、
（a）
Figure 0006522517
に示されるVH領域；
（b）
Figure 0006522517
に示されるVH領域；
（c）
Figure 0006522517
に示されるVH領域；
（d）
Figure 0006522517
に示されるVH領域；ならびに
（e）
Figure 0006522517
に示されるVH領域
からなる群より選択されるVH領域を含む。
本発明の抗体構築物の別の態様において、第1の結合ドメインは、
（a）
Figure 0006522517
に示されるVL領域；
（b）
Figure 0006522517
に示されるVL領域；
（c）
Figure 0006522517
に示されるVL領域；
（d）
Figure 0006522517
に示されるVL領域；ならびに
（e）
Figure 0006522517
に示されるVL領域
からなる群より選択されるVL領域を含む。
本発明は、本発明の抗体構築物の1つの態様をさらに提供し、ここで第1の結合ドメインは、
（1）
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；
（2）
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；
（3）
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；
（4）
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；ならびに
（5）
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対
からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む。
本発明のさらなる態様において、抗体構築物は、(scFv)2、(単一ドメインmAb)2、scFv-単一ドメインmAb、ダイアボディおよびそれらのオリゴマーからなる群より選択される形態である。
好ましい態様において、第1の結合ドメインは、
（a）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（b）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（c）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（d）
Figure 0006522517
に示されるもの；ならびに
（e）SEQ ID NO:994、SEQ ID NO:1593およびSEQ ID NO:1606に示されるもの
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明の抗体構築物の別の態様において、第2の結合ドメインは、ヒトの、およびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus Oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）のCD3イプシロンに結合することができる。
好ましい態様において、本発明の抗体構築物は、
（a）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（b）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（c）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（d）
Figure 0006522517
に示されるもの；ならびに
（e）SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:1594およびSEQ ID NO:1607に示されるもの
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明は、本発明の抗体構築物をコードする核酸配列をさらに提供する。
さらに本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターを提供する。さらにまた本発明は、本発明の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、および、産生された抗体構築物を培養物から回収する工程を含む、本発明の抗体構築物の産生のためのプロセスを提供する。
さらにまた本発明は、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物を含む、薬学的組成物を提供する。
1つの態様において、本発明は、黒色腫疾患または転移性黒色腫疾患の予防、処置または寛解において使用するための、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物を提供する。
本発明はまた、黒色腫疾患または転移性黒色腫疾患の処置または寛解のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物を投与する工程を含む、方法も提供する。
本発明の使用の方法の好ましい態様において、黒色腫疾患または転移性黒色腫疾患は、表在拡大型黒色腫、悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫および結節型黒色腫からなる群より選択される。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体構築物もしくは本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物、本発明のベクター、および／または本発明の宿主細胞を含む、キットを提供する。
完全ヒト抗CDH19抗体および薬物抗体比（DAR）（約1.3）でDM1とコンジュゲートされた高濃度のヤギ抗ヒトFc一価Fab（DM1-Fab）で処置されたColo-699細胞の細胞生存データを示している。 Colo-699アッセイ由来の平均細胞生存データに対してプロットされたCHL-1アッセイ由来の平均細胞生存データを示している。 転移性および原発性黒色腫サンプルにおけるCDH19 mRNAの相対発現を示している。 IHCによるヒト腫瘍サンプルにおけるCDH19タンパク質の発現を示している。 細胞表面上に存在するCDH19受容体数に基づきヒト腫瘍と同等のCDH19発現を示すモデルシステムを同定するためのフローサイトメトリーおよびIHCによる腫瘍細胞株の分析の結果を示している。 示された細胞株に対するCDH19/CD3二重特異性抗体のFACS分析：1）未トランスフェクトL1.2、2）ヒトCDH19で安定的にトランスフェクトされたL1.2細胞、3）黒色腫細胞株CHL-1、4）黒色腫細胞株A2058、5）ヒトCD3陽性ヒトT細胞株HBP-ALL、6）マカクT細胞株4119LnPx。陰性対照［1）〜6）］：検出抗体の前にCDH19/CD3二重特異性抗体を用いていない。 図６−０１の続きの図である。 図６−０２の続きの図である。 図６−０３の続きの図である。 図６−０４の続きの図である。 図６−０５の続きの図である。 図６−０６の続きの図である。 図６−０７の続きの図である。 図６−０８の続きの図である。 図６−０９の続きの図である。 48時間FACSベースの細胞毒性アッセイにおいて測定されたCDH19/CD3二重特異性抗体の細胞毒性活性。エフェクター細胞：未刺激ヒトPBMC。標的細胞：示されている通り。エフェクター対標的細胞（E:T）比：10：1。 図７−１の続きの図である。 CDH19 BiTE 2G6の投与によるColo699細胞の腫瘍成長インビボ阻害。二重特異性抗体構築物は、0.5 mg/kg用量で腫瘍の成長を阻害する。 図８−１の続きの図である。 CDH19 BiTE 2G6の投与によるCHL-1細胞の腫瘍成長インビボ阻害。二重特異性抗体構築物は、0.5 mg/kg用量で腫瘍の成長を阻害する。 図９−１の続きの図である。 48時間画像化ベースの細胞毒性アッセイにおいて測定されたCDH19/CD3二重特異性抗体の細胞毒性活性。エフェクター細胞：未刺激ヒトT細胞。標的細胞：示されている通り。エフェクター対標的細胞（E:T）比：10：1。 図１０Ａの続きの図である。 CDH19 BiTE抗体の精製中に得られたクロマトグラムIMAC捕捉・溶出CH19 2G6 302 x I2C SA21代表的IMAC溶出プロフィール。赤色線は254nmでの吸収を示し、青色線は280nmでの吸収を示す。茶色線は伝導率を示す。1-捕捉。2-溶出前50mMイミダゾール。3.BiTE溶出500mMイミダゾール。 CDH19 BiTE抗体の精製中に得られたクロマトグラムプロテインA捕捉・溶出CH19 2G6 302 x F12Q代表的プロテインA溶出プロフィール。赤色線は254nmでの吸収を示し、青色線は280nmでの吸収を示す。茶色線は伝導率を示す。緑色線は適用された勾配率を示す。1-捕捉。2-BiTE溶出。 CDH19 BiTE抗体の精製中に得られたCDH19 BiTE抗体2G6 302 x I2C SA21代表的SEC溶出プロフィールのSEC溶出プロフィール。単量体および2量体BiTE抗体アイソフォームに対応するタンパク質ピークが示されている。LMW = 低分子量。赤色線は254nmでの吸収を示し、青色線は280nmでの吸収を示す。茶色線は伝導率を示す。1 - SEC排除ボリューム中の非BiTE凝集体。2. BiTE 2量体。3. BiTE 単量体。4. 低分子量混入物質および塩。 CDH19 BiTE単量体CH19 2G6 302 x I2C SA21（左）および分子量マーカーNovex Sharp Protein Standard（Life Technologies）の還元型SDS PAGE分析。 37℃で7日間の保管後のCDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21の溶出を示すHP-SECクロマトグラム。ピンク色線は210nmの波長での光吸収を示す。茶色線は伝導率を示す。1. BiTE 2量体。2. BiTE単量体。 3回の凍結／解凍サイクル後のCDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21の溶出を示すHP-SECクロマトグラム。ピンク色線は210nmの波長での光吸収を示す。茶色線は伝導率を示す。1 BiTE 単量体。 CDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21の溶出のCatlEXクロマトグラム。青色線は280nmでの光吸収を示す。赤色線は254nmでの光吸収を示す。 CDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21のHIC溶出プロフィール。青色線は280nmでの光吸収を示す。赤色線は254nmでの光吸収を示す。茶色線は伝導率を示す。 示された細胞株に対するCDH19/CD3二重特異性抗体のFACS分析：1）ヒトCDH19で安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞、2）ヒトCD3陽性ヒトT細胞株HBP-ALL；陰性対照［1）および2）］：検出抗体の前にCDH19/CD3二重特異性抗体細胞培養上清を用いていない。 図１９−０１の続きの図である。 図１９−０２の続きの図である。 図１９−０３の続きの図である。 図１９−０４の続きの図である。 図１９−０５の続きの図である。 図１９−０６の続きの図である。 図１９−０７の続きの図である。 図１９−０８の続きの図である。 図１９−０９の続きの図である。 図１９−１０の続きの図である。 図１９−１１の続きの図である。 図１９−１２の続きの図である。 図１９−１３の続きの図である。 18時間クロム放出ベースの細胞毒性アッセイで測定されたCDH19/CD3二重特異性抗体の細胞毒性活性。エフェクター細胞：刺激されたヒトCD8+ T細胞。標的細胞：ヒトCDH19でトランスフェクトされたHEK293。エフェクター対標的細胞（E:T）比：10：1。 図２０−１の続きの図である。
発明の詳細な説明
定義：
本明細書で使用される場合、単数形（「１つの」、「ある」および「その」）は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「１つの試薬」は、1つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「その方法」に対する言及は、本明細書に記載される方法を修正または置換することができる当業者に公知の等価な工程および方法に対する言及を含む。
そうでないことが示されない限り、要素の系列の前に置かれる「少なくとも」という用語は、この系列のあらゆる要素に言及していると理解されるべきである。当業者は、慣用的以上の実験を用いずとも、本明細書に記載される本発明の具体的態様の多くの等価物を認識するまたは確認することができる。そのような等価物は、本発明に含まれることが意図されている。
「および（ならびに）／または（もしくは）」という用語は、本明細書のいずれの場所で使用される場合でも、「および（ならびに）」、「または（もしくは）」および「この用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含んでいる。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、示された値または範囲の±20％以内、好ましくは±15％以内、より好ましくは±10％以内、最も好ましくは±5％以内を意味する。
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む」という単語および「含んでいる」等の派生語は、言及されている整数値もしくは工程または整数値もしくは工程のグループを含むが、任意のその他の整数値もしくは工程または整数値もしくは工程のグループを排除しないことを暗に示すものと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含む（containing）」もしくは「含む（including）」で、または本明細書で使用される場合「有する（having）」で置き換えられることもある。
本願で使用される場合、「からなる」は、請求項発明の要素の中で指定されていない任意の要素、工程または成分を排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、その請求項発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない物質または工程を排除しない。
本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかと置き換えられ得る。
「抗体」という用語の定義は、モノクローナル、キメラ、単鎖、ヒト化およびヒト抗体、ならびに、特にFabフラグメントのような抗体フラグメント等の態様を含む。抗体フラグメントまたは誘導体はさらに、F(ab')2、Fv、scFvフラグメントまたは単一ドメイン抗体、例えばドメイン抗体またはナノボディ、他のV領域またはドメインから独立して抗原またはエピトープに特異的に結合するVHH、VHまたはVLであり得る唯一の可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体または免疫グロブリン単一可変ドメインを含む；例えば、Harlow and Lane (1988) and (1999), loc. cit.; Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010およびLittle, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009を参照のこと。そのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の1つまたは複数の単量体を含むより大きなポリペプチドも含む。
この定義の下、抗体という用語についての上記態様の全ては、「抗体構築物」という用語に包含され得る。この用語はまた、ダイアボディ（diabodies）またはDual-Affinity Re-Targeting（DART）抗体を含む。さらに、（二重特異性）単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Tandab's）、以下の構造：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2または(scFv-CH3-scFv)2によって例示される「ミニボディ」、「Fc DART」抗体および「IgG DART」抗体、ならびにマルチボディ、例えばトリアボディ（triabodies）が想定されている。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の1つまたは複数の単量体を含むより大きなポリペプチドも含む。
そのような抗体構築物（抗体および／またはフラグメント）の製造に関しては様々な手法が当技術分野で公知であり、かつ使用され得る。したがって、（抗体）誘導体は、ペプチド模倣体によって製造され得る。さらに、単鎖抗体の製造に関して記載された技術（特に、米国特許第4,946,778号、Kontermann and Dubel (2010), loc. cit. およびLittle (2009), loc. cit.を参照のこと）を、選択されたポリペプチドに特異的な単鎖抗体を製造するために適合させることができる。また、トランスジェニック動物が、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現させるために使用され得る。モノクローナル抗体の調製については、継続的な細胞株の培養によって産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。そのような技術の例は、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein Nature 256 (1975), 495-497）、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72）およびヒトモノクローナル抗体を製造するEBVハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96）を含む。BIAcoreシステムで用いられる表面プラズモン共鳴は、標的ポリペプチド、例えばCD3イプシロンのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めるために使用され得る（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13）。本発明との関係で、「抗体」という用語は、本明細書の以下に記載される宿主において発現され得る抗体構築物、例えば、特にウイルスまたはプラスミドベクターを通じてトランスフェクトおよび／または形質導入され得る抗体構築物を含むことも想定されている。
さらに、本発明で用いられる「抗体」という用語はまた、記載されている抗体と同じ特異性を示す本明細書に記載される抗体の誘導体または変種に関する。
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」および「抗体結合領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体と抗原の間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部分を表す。抗体によって特異的に認識および結合される抗原の一部分は、本明細書上記のように「エピトープ」と称される。上記のように、抗原結合ドメインは、典型的に、抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）を含み得るが；両方を含んでいなければならないわけではない。例えば、Fdフラグメントは、2つのVH領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの抗原結合機能をある程度保持している。抗体の抗原結合フラグメントの例は、（1）VL、VH、CLおよびCH1ドメインを有する1価のフラグメントである、Fabフラグメント；（2）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結されている2つのFabフラグメントを有する2価のフラグメントである、F(ab')2フラグメント；（3）2つのVHおよびCH1ドメインを有する、Fdフラグメント；（4）抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインを有する、Fvフラグメント、（5）VHドメインを有する、dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；（6）単離された相補性決定領域（CDR）、ならびに（7）単鎖Fv（scFv）を含む。Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組み換え法を用いて合成リンカーによって接続し、VLおよびVH領域が対になり1価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Fv（scFv）として公知；例えば、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883を参照のこと）として生成することができる。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて取得され、そしてそのフラグメントはインタクトな抗体と同じ様式で機能について評価される。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、その集団を構成している個々の抗体が、微量で存在し得る潜在的な自然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従前の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンの混入していないハイブリドーマ培養物によって合成されるという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しており、その抗体が任意の特定の方法によって製造されることを必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがい使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、または、組み換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載される技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。
「ヒト抗体」という用語は、例えばKabatら（Kabat et al. (1991) loc. cit.を参照のこと）によって記載されたものを含む、当技術分野で公知のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変および定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、例えばCDRに、特にCDR3に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置き換えられた、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の位置を有し得る。本明細書で使用されるヒト抗体の定義は、ゼノマウスなどのシステムを用いる技術を使用することによって導かれうるものなどの抗体の非人工的かつ/または遺伝学的に改変されたヒト配列のみを含む完全ヒト抗体も意図していることが、強調される。
「抗体変種」の例は、非ヒト抗体のヒト化変種、「親和性成熟」抗体（例えば、Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992)およびLowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)を参照のこと）およびエフェクター機能が変更された抗体変異体（例えば、米国特許第5,648,260号、Kontermann and Dubel (2010), loc. cit.およびLittle (2009), loc. cit.を参照のこと）を含む。
本明細書で使用される場合、「インビトロ生成された抗体」は、可変領域（例えば、少なくとも1つのCDR）のすべてまたは一部分が非免疫細胞選択（例えば、インビトロファージディスプレイ、タンパク質チップまたは候補配列をそれらの抗原結合能力について試験することができる任意のその他の方法）によって生成された抗体を表す。したがってこの用語は、好ましくは、免疫細胞内での遺伝子の再配置によって生成される配列を排除する。
VHおよびVLの対は共同で1つの抗原結合部位を形成する。VHに最も近いCHドメインはCH1と呼ばれる。各L鎖は、1つの共有結合的ジスルフィド結合によってH鎖に連結され、2つのH鎖は、H鎖のアイソタイプに依存して、1つまたは複数のジスルフィド結合によって相互に連結される。VHおよびVLドメインは、フレームワーク領域と呼ばれる4つの比較的保存された配列の領域（FR1、FR2、FR3およびFR4）からなり、これらが3つの超可変配列の領域（相補性決定領域、CDR）のスキャホールドを形成する。CDRは、抗体と抗原の特異的相互作用を担う残基の大部分を含んでいる。CDRは、CDR1、CDR2およびCDR3と称される。したがって、重鎖のCDR要素はH1、H2およびH3と称され、軽鎖のCDR要素はL1、L2およびL3と称される。
「可変」という用語は、それらの配列における可変性（variability）を示し、個々の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する、免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち、「可変ドメイン」）を表す。可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく；それは重鎖および軽鎖の各々の可変領域の部分ドメインに集中している。これらの部分ドメインは、「超可変」領域または「相補性決定領域」（CDR）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（FRM）と呼ばれる。天然に存在する重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分がβシート配置をとっている4つのFRM領域を含んでおり、これらが、ループ接続を形成し、いくつかの例ではβシート構造の一部を形成する3つの超可変領域によって接続されている。各鎖の超可変領域は、FRMによって近接状態になってまとめられて保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., loc. cit.を参照のこと）。定常ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存的細胞媒介細胞毒性および補体活性化、を示す。
「CDR」という用語およびその複数形は、相補性決定領域（CDR)を表し、そのうちの3つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（CDRL1、CDRL2およびCDRL3）、3つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（CDRH1、CDRH2およびCDRH3）。CDRは、抗体分子の機能的活性に寄与し、スキャホールドまたはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分断されている。厳密なCDRの境界および長さは、分類および番号付け体系によって異なる。したがってCDRは、本明細書に記載される番号付け体系を含む、Kabat、Chothia、接触（contact）または任意のその他の境界の定義によって表され得る。境界が異なるとしても、これらの体系の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分に関してある程度重複している。したがって、これらの体系にしたがうCDRの定義は、長さおよび隣接するフレームワーク領域との境界領域の点で異なり得る。例えば、Kabat、Chothiaおよび／またはMacCallum（Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901; およびMacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732）を参照のこと。しかし、いわゆるKabat体系にしたがう番号付けが好ましい。軽鎖のCDR3および特に重鎖のCDR3は、軽鎖および重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定要因を構成し得る。いくつかの抗体構築物では、重鎖CDR3が、抗原と抗体の間の主要接触領域を構成するようである。抗体の結合特性を変化させるためおよびどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定するために、CDR3のみを変化させるインビトロ選択スキームが使用され得る。
「から本質的になる」は、そのアミノ酸配列が、言及されているSEQ ID NO:の配列に対して約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15％異なり得、かつそれでもなお本明細書に記載される生物学的活性を保持し得ることを意味する。
いくつかの態様において、本発明の抗体構築物は、単離されたタンパク質または実質的に純粋なタンパク質である。「単離」されたタンパク質は、それがその自然状態では通常付随している物質の少なくともいくつかを伴わない、例えば、与えられたサンプルにおいて総タンパク質の少なくとも約5重量％または少なくとも約50重量％を構成する。単離されたタンパク質は、その環境に依存して総タンパク質含量の5〜99.9重量％を構成し得ることが理解される。例えば、タンパク質は、そのタンパク質が高濃度レベルで生成されるよう、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通じて有意に高い濃度で生成され得る。この定義は、当技術分野で公知の幅広い生物および／または宿主細胞における抗原結合タンパク質の産生を含む。
アミノ酸配列に関して、配列同一性および／または類似性は、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の部分配列同一性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395により記載された、好ましくはデフォルト設定を使用するBest Fit配列プログラムを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の標準的技術を使用することによってまたは目視によって決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメータに基づきFastDBによって計算される：ミスマッチペナルティー 1；ギャップペナルティー 1；ギャップサイズペナルティー 0.33；および接続ペナルティー（joining penalty） 30、"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc。
有用なアルゴリズムの例はPILEUPである。PILEUPは、プログレッシブ、ペアワイズなアラインメントを使用して関連配列群から複数の配列アラインメントを生成する。それはまた、アラインメントを生成するために使用されたクラスター化関係を示すツリーをプロットすることができる。PILEUPは、Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する；この方法はHiggins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153により記載されたものに類似する。有用なPILEUPパラメータは、デフォルトギャップウェイト 3.00、デフォルトギャップ長ウェイト 0.10およびウェイテッドエンドキャップ（weighted end gap）を含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; およびKarin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787に記載されるBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480から得られたWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大部分はデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される：オーバーラップスパン＝1、オーバラップフラクション＝0.125、ワードしきい値（T）＝II。HSP SおよびHSP S2パラメータは動的な値であり、個々の配列の組成および関心対象の配列を検索する特定のデータベースの組成に依存してプログラム自体によって決定されるが；この値は感度を高めるために調節され得る。
さらなる有用なアルゴリズムは、Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402によって報告されたギャップドBLASTである。ギャップドBLASTは、BLOSUM-62置換スコアを使用し；しきい値Tパラメータは9に設定され；ギャップなし伸長をもたらすツーヒット法は、ギャップ長kに10+kのコストをかけ；Xuは16に設定され、そしてXgはデータベース検索段階では40におよびアルゴリズムの出力段階では67に設定される。ギャップありアラインメントは、約22ビットに相当するスコアによってもたらされる。
一般に、個々の変種CDR間のアミノ酸相同性、類似性または同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも80％であり、より典型的には少なくとも85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％およびほぼ100％の好ましくは高い相同性または同一性を有する。同様の様式で、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、抗原結合タンパク質のコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の百分率と定義される。特定の方法は、オーバラップスパンおよびオーバラップフラクションがそれぞれ１および0.125に設定されたデフォルトパラメータに設定されたWU-BLAST-2のBLASTNモジュールを利用する。
一般に、個々の変種CDRをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列の間の核酸配列相同性、類似性または同一性は、少なくとも80％であり、より典型的には少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％およびほぼ100％の好ましくは高い相同性または同一性である。したがって、「変種CDR」は、本発明の親CDRに対して指定された相同性、類似性または同一性を有するものであり、かつ親CDRの特異性および／または活性の少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％を含むがこれらに限定されない生物学的機能を共有している。
アミノ酸配列変化を導入する部位または領域は予め決定されるが、その変異自体は予め決定される必要がない。例えば、与えられた部位における変異の挙動を最適化するために、無作為変異誘発が標的コドンまたは領域において実施され得、そして発現された抗原結合タンパク質CDR変種が所望の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングされ得る。既知配列を有するDNA内の予め決定された部位において置換変異を行う技術は周知であり、例えばM13プライマー変異誘発およびPCR変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、抗原結合タンパク質活性、例えばCDH19結合のアッセイを用いて行われる。
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的に、その当技術分野で知られている定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（AlaまたはA）；アルギニン（ArgまたはR）；アスパラギン（AsnまたはN）；アスパラギン酸（AspまたはD）；システイン（CysまたはC）；グルタミン（GlnまたはQ）；グルタミン酸（GluまたはE）；グリシン（GlyまたはG）；ヒスチジン（HisまたはH）；イソロイシン（HeまたはI）；ロイシン（LeuまたはL）；リジン（LysまたはK）；メチオニン（MetまたはM）；フェニルアラニン（PheまたはF）；プロリン（ProまたはP）；セリン（SerまたはS）；スレオニン（ThrまたはT）；トリプトファン（TrpまたはW）；チロシン（TyrまたはY）；およびバリン（ValまたはV）からなる群より選択されるアミノ酸を表すが、望ましい場合は修飾、合成または希少アミノ酸も使用され得る。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val）；負荷電側鎖（例えば、Asp、Glu）；正荷電側鎖（例えば、Arg、His、Lys）；または非荷電極性側鎖（例えば、Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、TrpおよびTyr）を有する点でグループ化され得る。
「超可変領域」という用語（「相補性決定領域」またはCDRとしても公知）は、本明細書で使用される場合、抗原結合部位を形成しかつ抗原特異性の主要決定基である、免疫グロブリンのV領域ドメイン内の（通常、極めて高い配列可変性を示す3つまたは4つの短い領域である）抗体のアミノ酸残基を表す。CDR残基を同定する方法は少なくとも2つ存在する：（1）種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al., loc. cit.）；および（2）抗原・抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ（Chothia C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）。しかし、2つの残基同定技術が同一領域ではない重複する領域を定義する程度まで、それらを、ハイブリッドCDRを定義するために組み合わせることができる。しかし、一般に、CDR残基は、好ましくは、いわゆるKabat（番号付け）体系にしたがい同定される。
「フレームワーク領域」という用語は、よりばらつきのある（すなわち、超可変性の）CDRの間に存在する、抗体可変領域の当技術分野で知られている部分を表す。そのようなフレームワーク領域は、典型的に、フレームワーク1〜4（FR1、FR2、FR3およびFR4）と称され、6つのCDR（重鎖の3つおよび軽鎖の3つ）を3次元空間に提示し抗原結合表面を形成するためのスキャホールドを提供する。
典型的に、CDRは、カノニカル構造に分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（CDR）ループによって採用される主鎖の立体構造を表す。多くの構造研究により、6つの抗原結合ループのうちの5つは、利用可能な立体構造に関して限られたレパートリーしか有さないことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴づけることができる。したがって抗体間で対応するループは、それらのループの大部分において高度のアミノ酸配列可変性がみられるにもかかわらず、非常によく似た3次元構造を有し得る（各々全体が参照により本明細書に組み入れられる、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800）。さらに、採用されるループ構造とその周囲のアミノ酸配列の間に関連性がある。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さならびにそのループ内および保存されたフレームワーク内（すなわち、ループ外）の鍵となる位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの鍵となるアミノ酸残基の存在に基づいてなされ得る。「カノニカル構造」という用語はまた、例えばKabatによるカタログ（Kabat et al., loc. cit.）にあるように、抗体の直線配列に対する考慮を含み得る。Kabatの番号付けスキーム（体系）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基の番号付けを共通の様式で行うために広く採用されている標準であり、本明細書の他所でも述べられているように本発明に適用される好ましいスキームである。さらなる構造の考慮も、抗体のカノニカル構造を決定するために使用され得る。例えば、Kabatの番号付けによっては十分に反映されない違いは、Chothiaらの番号付け体系によって説明され得および／またはその他の技術、例えば結晶学および2次元もしくは3次元コンピューターモデリング、によって明らかにされ得る。したがって、所定の抗体配列は、（例えば、様々なカノニカル構造をライブラリに含めたいという要望に基づき）特に適当なシャーシ（chassis）配列を見出すことができるカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のKabatの番号付けおよびChothia et al., loc. cit.により記載される構造の考慮ならびに抗体構造のカノニカルな局面を解釈するためのそれらの含意は、文献に記載されている。
CDR3は、典型的に、抗体結合部位における分子的多様性の最大の供給源である。例えば、H3は、2つのアミノ酸残基という短いものまたは26アミノ酸より大きなものであり得る。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および3次元構造が、当技術分野で周知である。抗体構造の見直しをする際には、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988を参照されたい。当業者は、各サブユニット構造、例えばCH、VH、CL、VL、CDR、FR構造が、活性フラグメント、例えば抗原に結合するVH、VLもしくはCDRサブユニットの一部分、すなわち抗原結合フラグメント、または例えば、例えばFc受容体および／もしくは補体に結合するおよび／もしくはこれを活性化するCHサブユニットの一部分、を含むことを理解しているであろう。CDRは、典型的に、Sequences of Proteins of immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.に記載されるようなKabat CDRを表す。抗原結合部位を特徴づける別の標準は、Chothiaによって記載される超可変ループを参照することである。例えば、Chothia, et al. (1987; J. Mol. Biol. 227; 799-817）；およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628-4638を参照のこと。さらに別の標準は、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されるAbM定義である。例えば、概要については、Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)を参照のこと。Kabat CDRに基づいて説明される態様は、代替的に、Chothia超可変ループまたはAbM定義のループに基づいて同様に説明される関係を用いて実施され得る。
アセンブリおよび体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は高度に多様化しており、これらの多様化した遺伝子は1010個の異なる抗体分子をコードすると見積もられる（Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995）。免疫系はそのようにして免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリンをコードする少なくとも1つの配列から全体がまたは一部が派生した少なくとも1つのヌクレオチド配列を表す。これらの配列は、インビボでの重鎖のV、DおよびJセグメントならびに軽鎖のVおよびJセグメントの再配置によって生成され得る。あるいは、これらの配列は、再配置を起こさせるもの、例えばインビトロ刺激、に応じて細胞から生成され得る。あるいは、これらの配列の一部またはすべてが、DNAスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発およびその他の方法によって取得され得る、例えば、米国特許第5,565,332号を参照のこと。レパートリーは、1つのみの配列を含み得、または、遺伝的に多様なコレクションの配列を含む複数の配列を含み得る。
本開示における「結合分子」または「抗体構築物」という用語は、標的分子CDH19およびCD3と／を（特異的に）結合、相互作用または認識することができる任意の分子を示す。そのような分子または構築物は、タンパク質部分および非タンパク質部分（例えば、化学リンカーまたは化学架橋剤、例えばグルタルアルデヒド）を含み得る。
リンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第1および第2のドメインの各々が互いに独立してそれらの異なる結合特異性を保持することができることを保証するのに十分な長さおよび配列のものである。最も好ましくはおよび付属の実施例で実証されているように、本発明の抗体構築物は「二重特異性単鎖抗体構築物」、より好ましくは二重特異性単鎖Fv（scFv）である。二重特異性単鎖分子は当技術分野で公知であり、WO 99/54440、Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970、Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025、Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197、Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103、Bruhl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426、Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56に記載されている。
本明細書に記載される抗体構築物に含まれる可変ドメインは、追加のリンカー配列によって連結され得る。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明にしたがい、本発明の抗体構築物の第1のドメインおよび第2のドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を定義する。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、このペプチドリンカーがいかなる重合活性も含まないということである。特に適当なペプチドリンカーは、米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号またはWO 88/09344に記載されるものである。ペプチドリンカーの好ましい態様は、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、すなわちGly4Ser、またはそのポリマー、すなわち（Gly4Ser)xによって特徴づけられ、ここでxは1またはそれより大きい整数である。2次構造の促進の非存在を含むペプチドリンカーの特徴は当技術分野で公知であり、例えばDall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273)、Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30)およびRaag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)に記載されている。いかなる2次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。ドメインの相互に対する連結は、例えば、実施例に記載されるような遺伝子工学によって提供され得る。融合され機能的に連結された二重特異性単鎖構築物を調製しそれらを哺乳動物細胞または細菌において発現させる方法は、当技術分野で周知である（例えば、WO 99/54440またはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001）。
本発明の抗体構築物において少なくとも2つの結合ドメインを連結するペプチドリンカーの場合、数個のアミノ酸残基、例えば12アミノ酸残基またはそれ未満しか含まないペプチドリンカーが好ましい。したがって、12、11、10、9、8、7、6または5アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。5アミノ酸未満を有する想定されるペプチドリンカーは、4、3、2または1アミノ酸を含み、Glyリッチリンカーが好ましい。「ペプチドリンカー」との関係で言う特定の好ましい「単一」のアミノ酸は、Glyである。したがって、ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Glyからなり得る。
本明細書で使用される場合、「多重特異性」という用語は、抗体構築物であり、かつ第1の結合ドメインが1つの抗原または標的に結合することができ、第2の結合ドメインが別の抗原または標的に結合することができる少なくとも第1および第2の結合ドメインを含む結合分子を表す。したがって、本発明にしたがう抗体構築物は、少なくとも2つの異なる抗原または標的に対する特異性を含み、少なくとも二重特異性である。本発明の「抗体構築物」はまた、多重特異性結合分子、例えば三重特異性結合分子を含み、後者は3つの結合ドメインを含むものである。
本発明の抗体構築物が、標的分子CDH19およびCD3に結合するその機能に加えて、さらなる機能を有することも想定される。この形式で、抗体構築物は、CDH19への結合を通じてプラズマ細胞を標的化し、CD3結合を通じて細胞毒性T細胞活性を媒介し、かつさらなる機能、例えばNK細胞のようなエフェクター細胞の動員を通じた完全機能性Fc定常ドメイン媒介抗体依存細胞毒性、標識（蛍光等）、治療剤、例えば毒素もしくは放射性核種および／または血清半減期を増強する手段等を提供することによる3または多官能性抗体構築物である。
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関係で、標的分子CDH19およびCD3上の与えられた標的エピトープまたは与えられた標的部位に／と特異的に結合／相互作用することができるドメインを特徴づける。結合ドメインは、結合ドメインドナー、例えば抗体から導くことができる。本発明の結合ドメインは、標的分子CDH19およびCD3上の与えられた標的エピトープまたは与えられた標的部位との結合／相互作用に必要とされる上記の結合ドメインのいずれかの少なくとも一部分を含むことが想定されている。
上記の結合ドメインドナーの結合ドメインは、それぞれの標的への結合を担うこれらのドナーの一部分によって、すなわち、その一部分が結合ドメインドナーから除去されたときにそのドナーがその結合能力を喪失することによって特徴づけられることが想定されている。「喪失」は、結合性のドナーと比較してその結合能力が少なくとも50％減少することを意味する。これらの結合部位をマッピングする方法は当技術分野で周知であり、したがって結合ドメインドナーの結合部位を位置決め／マッピングし、それによってそれぞれの結合ドメインドナーから結合ドメインを「得る」ことは当業者の標準的な知識の範囲内である。
「エピトープ」という用語は、結合ドメイン、例えば抗体もしくは免疫グロブリンまたは抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体もしくはフラグメント、が特異的に結合する抗原上の部位を表す。「エピトープ」は抗原性であり、したがってエピトープという用語は本明細書において「抗原性構造」または「抗原性決定基」を表すこともある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。この結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義することが理解されている。1つの例において、標的分子CDH19およびCD3上の所定の標的エピトープまたは所定の標的部位に（特異的に）結合／相互作用する結合ドメインは抗体または免疫グロブリンであり、そして結合ドメインは抗体または免疫グロブリンのVHおよび／またはVL領域である。
「エピトープ」は、連続アミノ酸またはタンパク質の3次元折り畳みによって近接することになる非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「直線状エピトープ」は、アミノ酸の1次配列が認識されるエピトープを含んでいるエピトープである。直線状エピトープは、典型的に、特有の配列内に、少なくとも3つまたは少なくとも4つ、およびより一般には少なくとも5つまたは少なくとも6つまたは少なくとも7つ、例えば約8〜約10のアミノ酸を含む。
「立体構造エピトープ」は、直線状エピトープに対して、エピトープを含むアミノ酸の1次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の1次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。典型的に、立体構造エピトープは、直線状エピトープよりも多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそれらのフラグメント、の3次元構造を認識する（本発明においては、結合ドメインの1つに対する抗原がCDH19タンパク質内に含まれている）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれ3次元構造が形成される場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格は近接した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法は、x線結晶解析、2次元核磁気共鳴（2D-NMR）分光分析および部位特異的スピンラベルおよび電子常磁性共鳴（EPR）分光分析を含むがこれらに限定されない。さらに、提供される実施例には、所定の結合ドメインが所定のタンパク質、特にCDH19の1つまたは複数のエピトープクラスターに結合するかどうかについての試験を含むビニングとして所定の結合ドメインを特徴づけるための、さらなる方法が記載されている。
本明細書で使用される場合、「エピトープクラスター」という用語は、所定の連続する抗原ストレッチの中に存在するエピトープの全体を示す。エピトープクラスターは、1つ、2つまたはそれ以上のエピトープを含み得る。エピトープクラスターという概念は、本発明の抗体構築物の特性を特徴づける際にも使用される。
「結合する（ことができる）」、「特異的に認識する」、「向けられる」および「反応する」という用語は、本発明にしたがい、結合ドメインが、エピトープの1つまたは複数、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、最も好ましくは少なくとも4つのアミノ酸と特異的に相互作用できることを意味する。
本明細書で使用される場合、「特異的に相互作用する」または「特異的に結合する」という用語は、結合ドメインが特定のタンパク質または抗原に対して感知できる親和性を示し、そして通常、CDH19またはCD3以外のタンパク質または抗原に対して有意な反応性を示さないことを意味する。「感知できる親和性」は、約10-6 M（KD）またはそれより強い親和性の結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が約10-12〜10-8 M、10-12〜10-9 M、10-12〜10-10 M、10-11〜10-8 M、好ましくは約10-11〜10-9 Mである場合に特異的とみなされる。結合ドメインが標的に特異的に反応または結合するかどうかは、特に、標的タンパク質または抗原に対するその結合ドメインの反応を、CDH19またはCD3以外のタンパク質または抗原に対するその結合ドメインの反応と比較することによって、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、CDH19またはCD3以外のタンパク質または抗原に本質的に結合しないまたは結合できない（すなわち、第1の結合ドメインは、CDH19以外のタンパク質に結合できず、第2の結合ドメインは、CD3以外のタンパク質に結合できない）。
「本質的に結合しない」または「結合できない」という用語は、本発明の結合ドメインが、CDH19またはCD3以外の別のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、CDH19またはCD3のそれぞれに対する結合を100％として、CDH19またはCD3以外のタンパク質または抗原に対して30％超、好ましくは20％超、より好ましくは10％超、特に好ましくは9％、8％、7％、6％または5％超の反応性を示さないことを意味する。
特異的な結合は、結合ドメインおよび抗原のアミノ酸配列内の特定のモチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらの1次、2次および／または3次構造の結果としてならびにこれらの構造の2次的修飾の結果として達成される。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、抗原に対する該部位の単なる結合をもたらし得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、代替的にまたは付加的に、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化等により、シグナルを開始させ得る。
タンパク質（通常30未満のアミノ酸を有する、そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント、およびペプチドを含む）は、共有結合的ペプチド結合を通じて相互に連結された（それによってアミノ酸の鎖を形成する）1つまたは複数のアミノ酸を含む。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、30超のアミノ酸からなる分子のグループを表す。ポリペプチドはさらに、多量体、例えば2量体、3量体およびより高次のオリゴマーを形成し得る、すなわち、2つ以上のポリペプチド分子からなり得る。そのような2量体、3量体等を形成するポリペプチド分子は、同一または非同一であり得る。その結果、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモまたはヘテロ2量体、ホモまたはヘテロ3量体等と称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、2つの同一の軽ポリペプチド鎖および2つの同一の重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ポリペプチド／タンパク質を表す。本明細書における「ポリペプチド」はまた、化学修飾、例えばペグ化されたものであり得る。そのような修飾は、当技術分野で周知である。
本明細書に開示される抗体構築物を説明するために使用される「単離された」は、その産生環境の成分から特定され、分離されおよび／または回収された抗体構築物を意味する。好ましくは、単離された抗体構築物は、その産生環境由来のすべての他の成分を伴わないものである。その産生環境の混入成分、例えば組み換えトランスフェクト細胞から生じたものは、典型的にそのポリペプチドの診断的または治療的利用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含み得る。好ましい態様において、抗体構築物は、（1）スピンカップ式配列決定装置の使用によって少なくとも15残基のN末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（2）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる非還元または還元条件下でのSDS-PAGEによって均質になるまで、精製される。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
本明細書に記載される抗体構築物のアミノ酸配列修飾が考慮に入れられる。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体構築物のアミノ酸配列変種は、抗体構築物の核酸に適当なヌクレオチド変化を導入することによってまたはペプチド合成によって調製される。
そのような修飾は、例えば、抗体構築物のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を含む。最終構築物が所望の特性を保持する限り、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが、その最終構築物に到達するためになされる。アミノ酸の変化はまた、抗体構築物の翻訳後プロセスを変更し得る、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させ得る。好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸がCDRにおいて置換され得、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または25個のアミノ酸がフレームワーク領域（FR）において置換され得る。置換は、好ましくは、本明細書に記載されるような保存的置換である。付加的にまたは代替的に、1、2、3、4、5または6個のアミノ酸がCDRの各々において挿入または欠失され得（当然、それらの長さに依存して）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または25個のアミノ酸がFRの各々において挿入または欠失され得る。
変異誘発に好ましい位置である抗体構築物の特定の残基または領域の同定に有用な方法は、Science, 244: 1081-1085 (1989)においてCunningham and Wellsによって記載されるように「アラニンスキャン変異誘発」と呼ばれるものである。この方法では、抗体構築物内の残基または標的残基群が、同定され（例えば、荷電残基、例えばarg、asp、his、lysおよびglu）、そしてエピトープに対するそのアミノ酸の相互作用に影響を与えるよう、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えられる。
この置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置は、次いで、その置換部位にまたは置換部位のためにさらなるまたはその他の変種を導入することによって厳選される。したがって、アミノ酸配列変化を導入するための部位は予め決定されるが、変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、所定部位における変異の働きを分析するため、alaスキャンまたは無作為変異誘発が標的のコドンまたは領域において行われ、そして発現される抗体構築物の変種が所望の活性についてスクリーニングされる。
好ましくは、アミノ酸配列挿入は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10残基〜100残基またはそれ以上を含むポリペプチドの長さの範囲の、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。抗体構築物の挿入変種は、酵素への抗体のNまたはC末端の融合または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
別のタイプの変種は、アミノ酸置換変種である。これらの変種は、好ましくは、抗体構築物の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸残基が異なる残基で置き換えられたものである。置換変異誘発に関する最大の関心対象の部位は、重鎖および／または軽鎖のCDR、特に超可変領域を含むが、重鎖および／または軽鎖におけるFRの変更もまた考慮に入れられる。
例えば、CDR配列が6個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうちの1、2または3個が置換されることが想定される。同様に、CDR配列が15個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸の1、2、3、4、5または6個が置換されることが想定される。
一般に、重鎖および／または軽鎖のCDRの1つもしくは複数またはすべてにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列が「当初の」CDR配列と少なくとも60％同一であることが好ましく、より好ましくは65％、さらにより好ましくは70％、特別に好ましくは75％、より特別に好ましくは80％である。これは、それがどの程度「置換された」配列と同一であるのかがCDRの長さに依存することを意味する。例えば、5アミノ酸を有するCDRは、少なくとも1つのアミノ酸が置換される場合、好ましくはその置換されたアミノ酸配列と少なくとも80％同一である。したがって、抗体構築物のCDRは、それらの置換された配列に対して異なる程度の同一性を有し得る、例えば、CDRL1は80％を有し得、CDRL3は90％を有し得る。
好ましい置換（または置き換え）は、保存的置換である。しかし、抗体構築物が第1の結合ドメインを通じてCDH19に結合し第2の結合ドメインを通じてCD3イプシロンに結合する能力を保持する限りおよび／またはそのCDRがそのように置換される配列に対して同一性を有する（「当初」のCDR配列に対して少なくとも60％、より好ましくは65％、さらにより好ましくは70％、特別に好ましくは75％、さらに特別に好ましくは80％同一である）限り、任意の置換（非保存的置換または以下の表1に列挙される「例示的な置換」の1つもしくは複数を含む）が想定されている。
保存的置換は、表1の「好ましい置換」という見出しの下に示されている。そのような置換が生物学的活性を変化させる場合、表1で「例示的な置換」として挙げられたまたはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されるようなより実質的な変更が導入され、そしてその産物が所望の特性についてスクリーニングされ得る。
（表１）アミノ酸置換
Figure 0006522517
本発明の抗体構築物の生物学的特性の実質的修飾は、（a）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシートもしくはらせん立体構造、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（c）側鎖のかさ高さ、の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づきグループ分けされる：（1）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；（2）中性親水性；cys、ser、thr；（3）酸性：asp、glu；（4）塩基性：asn、gin、his、lys、arg；（5）鎖の配向性に影響する残基：gly、pro；および（6）芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーから別のクラスのメンバーへの交換を伴うものであろう。抗体構築物の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、その分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防ぐために、通常セリンで置換され得る。逆に、システイン結合は、抗体に対して、その安定性（特にその抗体が抗体フラグメント、例えばFvフラグメントである場合）を改善するために添加され得る。
特に好ましいタイプの置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含むものである。通常、さらなる開発のために選択される得られた変種は、それらの起源となった親抗体に比して改善された生物学的特性を有するものであろう。そのような置換変種を生成する簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、6〜7部位）が、各部位ですべての可能性のあるアミノ酸置換が生成されるよう変異される。そのようにして生成された抗体変種は、1価の形態で、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたM13の遺伝子III産物との融合物として提示される。ファージディプレイされた変種は、次に、修飾のための超可変領域部位候補を同定するために、本明細書に開示されるようにしてそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされ、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するために、アラニンスキャン変異誘発が行われ得る。あるいはまたは加えて、結合ドメインおよび例えばヒトCDH19の間の接触点を同定するために、抗原・抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技術にしたがう置換の候補である。そのような変種が生成された後、変種のパネルが本明細書に記載されるスクリーニングに供され、そして1つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を示す抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
抗体構築物のその他の修飾も本明細書で考慮に入れられる。例えば、抗体構築物は、様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレンまたはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマー、の1つに連結され得る。抗体構築物はまた、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに捕捉され得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
本明細書に開示される抗体構築物はまた、免疫リポソームとして製剤化され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用な様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は通常、生体膜の脂質の配置と同様の2重層の形式で配置される。抗体を含むリポソームは、例えば、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号；ならびに1997年10月23日公開のWO 97/38731に記載されるような当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が強化されたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径のリポソームを得るために、規定の孔サイズのフィルターを通して押出しされる。本発明の抗体のFab'フラグメントは、ジスルフィド交換反応を通じてMartin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されるようなリポソームにコンジュゲートされ得る。場合により、化学療法剤がリポソーム内に含められる。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)を参照のこと。
組み換え技術を用いる場合、抗体構築物は、ペリプラズム間隙で細胞内産生され得、または培地に直接分泌され得る。抗体構築物が細胞内産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかの粒状の残骸が、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌（E.coli）のペリプラズム間隙に分泌された抗体を単離する手法を記載している。
細胞から調製される抗体構築物組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および親和性クロマトグラフィーを用いて精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。
「核酸」という用語は、当業者に周知であり、DNA（例えば、cDNA）およびRNA（例えば、mRNA）を含む。核酸は、2本鎖および1本鎖、直鎖状および環状であり得る。核酸分子は、好ましくは、好ましくは宿主細胞の中に含まれる、ベクターの中に含まれる。宿主細胞は、例えば、本発明の核酸配列を用いた形質転換またはトランスフェクションの後に、抗体構築物を発現することができる。その目的で、核酸分子は、制御配列に機能的に連結される。
ベクターは、（外来）遺伝子物質を細胞内に運搬するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび人工染色体を含むがこれらに制限されない。一般に、工学ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位および選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）およびベクターの「骨格」の役割をするより大きな配列を含むヌクレオチド配列、通常DNA配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサートおよび骨格に加えて追加の特徴：プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグを含み得る。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞において導入遺伝子を発現させるためのものであり、一般に、制御配列、例えば導入遺伝子の発現を促すプロモーター配列を有する。標的細胞へのベクターの投入は、通常、細菌の場合は「形質転換」、真核生物細胞の場合は「トランスフェクション」と呼ばれるが、ウイルスベクターの投入は「形質導入」とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体構築物をコードする核酸が形質転換、トランスフェクション等によって導入される細胞を表すことが意図されている。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も表すことを理解されたい。後続の世代では変異または環境の影響のいずれかにより一定の修飾が起こり得るので、そのような子孫は、実際には、その親細胞と同一ではないかもしれないが、そうであっても本明細書で使用される場合はこの用語の範囲に含まれる。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むがこれらに限定されない、本発明の抗体構築物の産生に関与する任意の工程を含む。
「制御配列」という用語は、機能的に連結されたコード配列を特定の宿主生物において発現させるのに必要なDNA配列を表す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係の下に置かれている場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのDNAがポリペプチドのためのDNAに機能的に連結されているのは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり；プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されているのは、それがその配列の転写に影響する場合であり；またはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されているのは、それが翻訳を促進するよう配置される場合である。一般に、「機能的に連結」は、連結されるDNA配列が連続していること、および、分泌リーダーの場合は、連続しかつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要がない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の実務にしたがい、合成性のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
「宿主細胞」、「標的細胞」または「レシピエント細胞」という用語は、ベクターまたは外因性の核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質の組み込みのためのレシピエントであり得るまたはすでにレシピエントとなっている任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことが意図されている。それはまた1つの細胞の子孫を含むことも意図されており、その子孫は、自然、偶発的または計画的変異により、必ずしも元の親細胞と（形態またはゲノムもしくは総DNAの補完性の点で）完全に同一でないかもしれない。細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であり得、細菌、酵母細胞、動物細胞および哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカクまたはヒトを含むがこれらに限定されない。
適当な宿主細胞は、原核生物ならびに酵母、真菌、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主細胞を含む。
本発明の抗体構築物は、細菌において産生され得る。発現後、本発明の抗体構築物、好ましくは抗体構築物は、溶液画分において大腸菌細胞ペーストから単離され、そして例えば親和性クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除を通じて精製され得る。最終精製は、例えばCHO細胞において発現させた抗体を精製するためのプロセスと同様に行われ得る。
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母が、本発明の抗体構築物に適したクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）または一般パン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかし、多くの他の属、種および株が一般に利用可能であり、かつ本発明において有用である、例えば、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）宿主、例えばK.ラクチス（K. lactis）、K.フラジリス（K. fragilis）（ATCC 12424）、K.ブルガリクス（K. bulgaricus）（ATCC 16045）、K.ウィッカラミイ（K. wickeramii）（ATCC 24178）、K.ウォルチイ（K. waltii）（ATCC 56500）、K.ドロソフィラルム（K. drosophilarum）（ATCC 36906）、K.サーモトレランス（K. thermotolerans）およびK.マルキシアヌス（K. marxianus）；ヤロウイア（yarrowia）（EP 402 226）；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（EP 183 070）；カンジダ（Candida）；トリコダーマ・リーシア（Trichoderma reesia）（EP 244 234）；ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）；シュワンニオミセス（Schwanniomyces）、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム（Penicillium）、トリポクラジウム（Tolypocladium）およびアスペルギルス（Aspergillus）宿主、例えばA.ニデュランス（A. nidulans）およびA.ニガー（A. niger）。
本発明のグリコシル化抗体構築物の、好ましくは抗体由来抗体構築物の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株および変種ならびにヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（毛虫）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）（蚊）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ショウジョウバエ）およびカイコ（Bombyx mori）等の宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）NPVのL-1変種およびカイコNPVのBm-5株、が公的に入手可能であり、そのようなウイルスが、本発明にしたがい本明細書においてウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ピーナツ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として使用され得る。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニングおよび発現ベクターは当業者に公知である。例えば、Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78、Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794、Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750およびFecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986を参照のこと。
しかし、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の繁殖は慣用手法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胎児腎臓株（293または懸濁培養下での成長に関してサブクローニングされた293細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（CHO、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（TM4、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（CVI ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL1587）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2、1413 8065）；マウス乳癌（MMT 060562、ATCC CCL5 1）；TRI細胞（Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)）；MRC 5細胞；FS4細胞；およびヒトヘパトーマ株（Hep G2）である。
組み換え技術を用いる場合、本発明の抗体構築物は、ペリプラズム間隙で細胞内産生され得、または培地に直接分泌され得る。抗体構築物が細胞内産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかの粒状の残骸が、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌された抗体を単離する手法を記載している。簡潔に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（pH 3.5）、EDTAおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）の存在下で約30分間解凍する。細胞の残骸は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、通常最初に、そのような発現システムの上清が、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて遠心分離される。プロテアーゼ阻害剤、例えばPMSFは、タンパク質分解を阻害するために、上記の工程のいずれかにおいて含められ得、そして抗生物質は、外来混入物の成長を防ぐために、含められ得る。
宿主細胞から調製された本発明の抗体構築物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および親和性クロマトグラフィーを用いて精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。
親和性リガンドを付加するマトリクスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば規定の孔を有するガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成できるよりも速い流速および短い処理時間を実現する。本発明の抗体構築物がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABXMresin（J. T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。他のタンパク質精製技術、例えばイオン交換カラムによる分画、エタノール沈降、逆相HPLC、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（商標）によるクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGEおよび硫酸アンモニウム沈降もまた、回収される抗体に依存して利用可能である。
「培養」という用語は、培地中での適切な条件下での細胞のインビトロ維持、分化、成長、増殖および／または繁殖を表す。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者に投与する組成物を表す。特定の好ましい本発明の薬学的組成物は、本発明の抗体構築物を含む。好ましくは、薬学的組成物は、担体、安定剤および／または賦形剤の適当な配合物を含む。好ましい態様において、薬学的組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、くも膜下腔内および／もしくは鼻腔内投与または組織への直接注射のための組成物を含む。組成物が注入または注射を通じて患者に投与されることが特に想定されている。適当な組成物の投与は、異なる方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所または皮内投与によって、行われ得る。特に、本発明は、適当な組成物の中断のない投与を提供する。非限定的な例として、中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療剤の流入を計量する患者に装着された小型ポンプシステムによって行われ得る。本発明の抗体構築物を含む薬学的組成物は、このポンプシステムを用いることによって投与され得る。そのようなポンプシステムは概ね当技術分野で公知であり、一般には注入される治療剤を含むカートリッジの定期的交換が必要である。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換する際、それ以外では中断されない患者体内への治療剤の流入の一時的中断が生じ得る。そのような場合であっても、カートリッジ交換前の投与フェーズとカートリッジ交換後の投与フェーズは、薬学的手段および本発明の方法のどちらの意味においても、依然としてそのような治療剤の「中断のない投与」を構成するとみなされるであろう。
本発明のこれらの抗体構築物の連続的なまたは中断のない投与は、流体をリザーバから送り出すための流体送出機構および送出機構を作動させるための作動機構を含む、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内または皮下投与であり得る。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に突き入り適当な組成物を患者体内に送達するための針またはカニューレを含み得る。このポンプシステムは、静脈、動脈または血管に関係なく、ポンプシステムと患者の皮膚が直接接触するよう患者の皮膚に直接固定または取り付けられ得る。ポンプシステムは、患者の皮膚に24時間〜数日間取り付けられ得る。ポンプシステムは、少量のリザーバを有する小サイズのものであり得る。非限定的な例として、投与される適当な薬学的組成物のためのリザーバの容量は、0.1〜50mlの間であり得る。
連続的な投与は、皮膚に装着され一定間隔で交換されるパッチによる経皮投与であり得る。当業者は、この目的に適した薬物送達のためのパッチシステムに精通している。経皮投与は、第1の使いきったパッチの交換が、新しい第2のパッチを例えば第1の使いきったパッチのすぐ隣の皮膚表面におよび第1の使いきったパッチの除去直前に設置するのと同時に達成され得る利点があるために、中断のない投与に特に適しているに注目されたい。流れの中断または動力源喪失の問題は生じない。
本発明の組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含み得る。適当な薬学的担体の例は当技術分野で周知であり、溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液、リポソーム等を含む。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化され得る。配合物は、炭水化物、緩衝溶液、アミノ酸および／または界面活性剤を含み得る。炭水化物は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、八硫化物（octasulfate）、ソルビトールまたはキシリトールであり得る。概ね、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬物投与に適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤を意味する。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および薬剤を使用することは当技術分野で周知である。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、追加の緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質；キレート化剤、例えばEDTA；金属錯体（例えば、Zn・タンパク質錯体）；生分解性ポリマー、例えばポリエステル；塩形成性の対イオン、例えばナトリウム、多価糖アルコール；アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、アスパラギン、2-フェニルアラニンおよびスレオニン；糖または糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、八硫化物、ソルビトールまたはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（myoinisitose）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、[アルファ]-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたはその他の免疫グロブリン；ならびに親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンを含む。そのような配合物は、ポンプシステムを用いるおよび／または用いない静脈内または皮下投与であり得る連続的な投与のために使用され得る。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくはリジン、リジン酢酸塩、アルギニン、グルタミン酸塩および／またはヒスチジンであり得る。界面活性剤は、デタージェント（detergent）、好ましくは分子量が>1.2KDのそれ、および／またはポリエーテル、好ましくは分子量が>3KDのそれ、であり得る。好ましいデタージェントの非限定的な例は、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80またはTween 85である。好ましいポリエーテルの非限定的な例は、PEG 3000、PEG 3350、PEG 4000またはPEG 5000である。本発明において使用される緩衝システムは、5〜9の好ましいpHを有し得、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジンおよび酢酸塩を含み得る。
本発明の組成物は、例えば漸増用量の本明細書に記載される種間特異性を示す本発明のポリペプチドを非チンパンジー霊長類、例えばマカク、に投与する用量増加研究によって決定され得る適当な用量で対象に投与され得る。上記のように、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体構築物は、非チンパンジー霊長類における前臨床試験においておよびヒトにおける薬物として同一の形態で使用できる利点がある。これらの組成物はまた、他のタンパク質性および非タンパク質性薬物と組み合わせて投与され得る。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明のポリペプチドを含む組成物を用いて同時に投与され得または該ポリペプチドの投与前もしくは投与後に定義された時間間隔および用量で別々に投与され得る。投薬レジメンは、担当医および臨床的要因によって決定されるであろう。医学分野で周知のように、ある1人の患者に対する投薬量はその患者のサイズ、体の表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間および経路、健康状態全般ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
非経口投与用の調製物は、滅菌された水性または非水性の溶液、懸濁物およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁物を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油を含む。静脈内用ビヒクルは、流体および栄養補給物、電解質補給物（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）等を含む。保存剤および他の添加物、例えば抗菌物質、抗酸化物質、キレート化剤、不活性ガス等もまた存在し得る。加えて、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質性の担体を含み得る。本発明の組成物は、その組成物の意図されている用途に依存して、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えてさらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定されている。そのような薬剤は、胃腸管系に作用する薬物、細胞静止剤として作用する薬物、高尿酸血症（hyperurikemia）を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えば、コルチコステロイド）、炎症応答を調整する薬物、循環器系に作用する薬物および／または当技術分野で公知の薬剤、例えばサイトカイン、であり得る。本発明の抗体構築物は、並行療法で、すなわち、別の抗癌医薬と併用して適用されることも想定されている。
本明細書で定義される薬学的組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例に、WO 99/54440にまたはSchlerethら（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12）によって記載されたような、細胞毒性アッセイによって決定され得る。本明細書で使用される「効能」または「インビボ効能」は、例えば標準化されたNCIの応答基準を用いる、本発明の薬学的組成物による療法に対する応答を表す。本発明の薬学的組成物を用いる療法の成功またはインビボ効能は、その意図されている目的に対する組成物の有効性、すなわち、その所望の効果、すなわち病理学的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇、をもたらす組成物の能力、を表す。インビボ効能は、白血球数、分化、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引を含むがこれらに限定されない、各々の疾患において確立されている標準的方法によってモニタリングされ得る。加えて、様々な疾患に特異的な臨床化学パラメータおよびその他の確立された標準的方法が使用され得る。さらに、コンピューター断層撮影、X線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、National Cancer Institute基準に基づく応答評価のため［Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr; 17(4): 1244］）、ポジトロン放出断層走査、白血球数、分化、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、および様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）ならびにその他の確立されている標準的方法が使用され得る。
薬物、例えば本発明の薬学的組成物、の開発における別の大きな課題は、薬物動態特性を予測できるよう調整することである。この目的で、候補薬物の薬物動態プロフィール、すなわち、所定の状態を処置する特定の薬物の能力に影響する薬物動態パラメータのプロフィール、が確立され得る。特定の疾患を処置する薬物の能力に影響する薬物の薬物動態パラメータは、半減期、分布容積、肝臓の初回通過時代謝および血液血清結合度を含むがこれらに限定されない。所定の薬物の効能は、上記のパラメータの各々によって影響され得る。
「半減期」は、投与された薬物の50％が生物学的プロセス、例えば代謝、排出等を通じて排除される時間を意味する。
「肝臓の初回通過時代謝」は、薬物が肝臓に最初に接したとき、すなわち、肝臓の初回通過の間に、代謝される性質を意味する。
「分布容積」は、例えば細胞内および細胞外空間、組織および臓器等のような、身体の様々な区画における薬物の保持ならびにこれらの区画内での薬物の分配の程度を表す。
「血液血清結合度」は、薬物が血液血清タンパク質、例えばアルブミンに相互作用および結合してその薬物の生物学的活性を減少または喪失させる性質を意味する。
薬物動態パラメータはまた、バイオアベイラビリティ、ラグタイム（Tlag）、Tmax、吸収速度、より多い作用発現（more onset）および／または投与される所定の薬物量についてのCmaxを含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液区画の薬物の量を意味する。「ラグタイム」は、薬物の投与から血液または血漿中でのその検出および測定可能段階までの間の時間の遅れを意味する。
「Tmax」は、それ以降に薬物の最大血中濃度が達成される時間であり、「Cmax」は、所定の薬物によって得られる最大の血中濃度である。その生物学的効果に必要とされる薬物の血中または組織濃度に達するまでの時間は、すべてのパラメータに影響される。上記のような非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験において決定され得る、種間特異性を示す二重特異性単鎖抗体の薬物動態パラメータは、例えばSchlerethら（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12）による刊行物にも示されている。
本明細書で使用される「毒性」という用語は、有害事象または重篤な有害事象において見られる薬物の毒性の効果を表す。これらの副事象は、全体的な薬物の認容性の欠如および／または投与後の局所的な認容性の欠如を表し得る。毒性はまた、その薬物によって引き起こされる催奇形効果または発癌効果を含み得る。
本明細書で使用される「安全性」、「インビボ安全性」または「認容性」という用語は、投与直後に（局所的認容性）およびより長期の薬物適用期間の間に重篤な有害事象を誘導しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」または「認容性」は、例えば、処置中およびフォローアップ期間中に一定間隔で評価され得る。測定は、臨床評価、例えば臓器の兆候、および検査異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、NCI-CTCおよび／またはMedDRA標準にしたがう正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の兆候は、例えばCommon Terminology Criteria for adverse events v3.0（CTCAE）に示されるように、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固等の基準を含み得る。試験され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロフィールおよび尿検査ならびにその他の体液、例えば血清、血漿、リンパまたは脊髄液、リカー等の試験が含まれる。したがって安全性は、例えば身体試験、画像化技術（すなわち、超音波、x線、CTスキャン、磁気共鳴画像化（MRI）、専門的装置を用いるその他の測定（すなわち、心電図）、バイタルサインによって、検査パラメータを測定し有害事象を記録することによって、評価され得る。例えば、本発明にしたがう使用および方法において、非チンパンジー霊長類における有害事象が組織病理学および／または組織化学法により試験され得る。
「有効用量」または「有効投薬量」は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。「治療有効用量」という用語は、疾患にすでに罹患している患者において疾患およびその合併症を治癒するまたは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量は、感染の重篤度および対象自身の免疫系の全体的状態に依存するであろう。「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよびその他の哺乳動物対象を含む。
本明細書で使用される「有効・非毒性用量」という用語は、大きな毒性作用を生じさせずにまたは本質的に生じさせずに病理学的細胞の枯渇、腫瘍の除去、腫瘍の縮退または疾患の安定化をもたらすのに十分高い、本発明の抗体構築物の認容可能な用量を表す。そのような有効・非毒性用量は、例えば当技術分野で記載されている用量増加研究によって決定され得、そしてそれは重篤な有害副事象を誘導する用量以下とされるべきである（用量制限毒性、DLT）。
上記の用語はまた、例えば、Preclinical safety evaluation of biotechnology derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997も参照する。
本発明の抗体構築物の適当な投薬量または治療有効量は、処置される状態、状態の重篤度、これまでの療法ならびに患者の病歴および治療剤に対する応答に依存する。適当な用量は、1度にまたは一連の投与により患者に投与され得るように、担当医の判断にしたがい調節され得る。薬学的組成物は、単独の治療としてまたは必要な場合は追加の療法、例えば抗癌療法と併用して投与され得る。
本発明の薬学的組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋内、静脈内、関節内および／または滑液嚢内投与に特に有用である。非経口投与は、ボーラス注射または連続注入によるものであり得る。
薬学的組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された物質はまず、投与の前に適当な液体中で再構成される。凍結乾燥された物質は、例えば注射用静菌水（BWFI）、生理学的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または凍結乾燥の前にタンパク質を添加したのと同じ製剤中で再構成され得る。
独自のmRNA発現データの内部分析の中で、驚くべきことに、CDH19発現が、正常な非形質転換組織と比較して原発性および転移性の両方の黒色腫腫瘍において上昇することが見出された。内部分析はまた、正常組織におけるCDH19の発現が神経堤由来末梢神経節および神経繊維に限定されることも確認した。正常および腫瘍組織における示差的なCDH19発現によって、細胞表面標的化治療剤はこのタンパク質に引きつけられる。CDH19は、いくつかの癌のタイプ（例えば、WO2009/055937を参照のこと）またはパーキンソン病（例えば、WO2005/067391を参照のこと）に関連するマーカーの長大なリストの一部をなす1つのマーカーとして議論されていたが、CDH19は、黒色腫腫瘍に関連する予後マーカーまたは薬物標的としては議論されてこなかった。
上記のように、本発明は、標的細胞の表面上のヒトCDH19に結合することができる第1のヒト結合ドメインおよびT細胞の表面上のヒトCD3に結合することができる第2のドメインを含む単離された多重特異性抗体構築物を提供する。
「CDH19細胞外ドメイン」または「CDH19 ECD」は、CDH19の膜貫通および細胞質ドメインを本質的に含まないCDH19の形態を表す。本発明のCDH19ポリペプチドにおいて同定される膜貫通ドメインは、その疎水性ドメインのタイプを同定するために当技術分野で慣用的に用いられている基準にしたがい同定されることが当業者によって理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は異なり得るが、本明細書で具体的に言及されているドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸以内である可能性が最も高い。好ましいヒトCDH19 ECDは、SEQ ID NO:948に示されている。この文脈で、CDH19 ECDは、標的細胞の表面上のCDH19の一部分を表すことが理解される。
T細胞CD3受容体複合体は、タンパク質複合体であり、4つの別個の鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、CD3γ鎖、CD3δ鎖および2つのCD3ε（イプシロン）鎖を含む。これらの鎖は、T細胞受容体（TCR）として公知の分子およびζ鎖と会合し、Tリンパ球における活性化シグナルを生成する。
多重特異性、少なくとも二重特異性の抗体構築物によるT細胞の動員を通じた標的細胞のリダイレクト溶解は、細胞溶解シナプスの形成ならびにパーフォリンおよびグランザイムの送達を含む。関係するT細胞は、連続的な標的細胞溶解を行うことができ、ペプチド抗原のプロセシングおよび提示またはクローン性T細胞の分化に干渉する免疫回避機構に影響されない；例えば、WO 2007/042261を参照のこと。
ヒトCDH19に対する第1の結合ドメインの親和性は、好ましくは≦15 nM、より好ましくは≦10 nM、さらにより好ましくは≦5 nM、さらにより好ましくは≦1 nM、さらにより好ましくは≦0.5 nM、さらにより好ましくは≦0.1 nMおよび最も好ましくは≦0.05 nMである。マカクCDH19に対する第1の結合ドメインの親和性は、好ましくは≦15 nM、より好ましくは≦10 nM、さらにより好ましくは≦5 nM、さらにより好ましくは≦1 nM、さらにより好ましくは≦0.5 nM、さらにより好ましくは≦0.1 nMおよび最も好ましくは≦0.05 nMでありまたは≦0.01 nMでさえある。親和性は、例えば、例えば実施例に記載されるような、BiacoreアッセイにおいてまたはScatchardアッセイにおいて測定され得る。マカクCDH19 対 ヒトCDH19への結合の親和性ギャップは、好ましくは［1：10〜1：5］または［5：1〜10：1］、より好ましくは［1：5〜5：1］および最も好ましくは［1：2〜3：1］であり［1：1〜3：1］でさえある。親和性を決定する他の方法は、当業者に周知である。
ヒト抗体、それぞれのヒト抗体構築物は、マウスまたはラットの可変および／または定常領域を有する抗体／抗体構築物に付随する問題のいくつかを回避する。そのようなマウスまたはラット由来タンパク質の存在は、患者による抗体／抗体構築物の迅速なクリアランスを誘導し得るまたは抗体／抗体構築物に対する免疫応答を発生させ得る。マウスまたはラット由来抗体／抗体構築物の利用を避けるために、ヒト抗体機能をげっ歯類に導入しそのげっ歯類に完全ヒト抗体を生成させることを通じてヒトまたは完全ヒト抗体が作製され得る。
YACにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローン化および再構築するならびにそれらをマウス生殖系に導入する能力は、非常に大きいまたは粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明およびヒト疾患の有用なモデルの作製に関する強力なアプローチを提供する。さらに、そのようなマウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換する技術の利用は、発生時のヒト遺伝子産物の発現および調節、それらの他の体系とのコミュニケーションならびに疾患の誘導および進行におけるそれらの関与に関して独自の洞察を提供することができる。
そのようなストラテジーの重要な応用は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ig遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ig)遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現および構築ならびにB細胞の発生におけるそれらの役割の根底にあるメカニズムを研究する機会を提供する。さらに、そのようなストラテジーは、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンである完全ヒトモノクローナル抗体（mAb）の産生のための理想的な供給源を提供し得る。完全ヒト抗体／抗体構築物は、マウスまたはマウス由来mAbに固有の免疫原性およびアレルギー反応を最小化すること、したがって投与される抗体／抗体構築物の有効性および安全性を向上させることが期待される。完全ヒト抗体／抗体構築物の使用は、反復的な化合物投与を必要とする慢性および再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫および癌の処置において大きな利益を提供することが期待され得る。
この目的に対する1つのアプローチは、マウスがマウス抗体の非存在下でヒト抗体の大レパートリーを生成することを見込んでマウス抗体産生を欠くマウス系統をヒトIg遺伝子座の大フラグメントを用いて操作することであった。大きなヒトIgフラグメントは、可変性の高い遺伝子多様性ならびに抗体産生および発現の適切な調節を保存するであろう。抗体の多様化および選択ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することによって、これらのマウス系統において再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む関心対象の任意の抗原に対する高親和性抗体を生ずるはずである。ハイブリドーマ技術を使用することで、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトmAbを容易に産生および選択することができる。この一般的なストラテジーは、1994年に公開された我々の最初のXenoMouseマウス系統の生成と関連して実証された（Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)を参照のこと）。このXenoMouse系統は、それぞれコア可変および定常領域配列を含むヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座の245 kbおよび190 kbサイズの生殖系構成フラグメントを含む酵母人工染色体（YAC）を用いて操作された。同書。このヒトIg含有YACは、抗体の再構成および発現の両方に関してマウスシステムと適合することが証明され、不活性化されたマウスIg遺伝子と置き換わることができた。これは、B細胞の発生を誘導し、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを生じ、そして抗原特異的なヒトmAbを生成するそれらの能力によって実証された。これらの結果はまた、多数のV遺伝子、追加の調節エレメントおよびヒトIg定常領域を含むヒトIg遺伝子座の大きな部分の導入が、感染および免疫刺激に対するヒト液性応答に特徴的な実質的に完全なレパートリーを再現し得ることを示唆した。Greenらの成果は、最近、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれのメガベースサイズの生殖系構成YACフラグメントの導入を通じたヒト抗体レパートリーのおよそ80％超の導入に拡張された。その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)および1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759,620号を参照のこと。
XenoMouseマウスの作製はさらに、1990年1月12日出願の米国特許出願第07/466,008号、1990年11月8日出願の同第07/610,515号、1992年7月24日出願の同第07/919,297号、1992年7月30日出願の同第07/922,649号、1993年3月15日出願の同第08/031,801号、1993年8月27日出願の同第08/112,848号、1994年4月28日出願の同第08/234,145号、1995年1月20日出願の同第08/376,279号、1995年4月27日出願の同第08/430,938号、1995年6月5日出願の同第08/464,584号、1995年6月5日出願の同第08/464,582号、1995年6月5日出願の同第08/463,191号、1995年6月5日出願の同第08/462,837号、1995年6月5日出願の同第08/486,853号、1995年6月5日出願の同第08/486,857号、1995年6月5日出願の同第08/486,859号、1995年6月5日出願の同第08/462,513号、1996年10月2日出願の同第08/724,752号および1996年12月3日出願の同第08/759,620号ならびに米国特許第6,162,963号、同第6,150,584号、同第6,114,598号、同第6,075,181号および同第5,939,598号ならびに日本国特許第3 068 180 B2号、同第3 068 506 B2号および同第3 068 507 B2号で議論され輪郭が描かれている。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)およびGreen and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)も参照のこと。1996年6月12日特許公開の欧州特許第EP 0 463151 B1号、1994年2月3日公開の国際特許出願第WO 94/02602号、1996年10月31日公開の国際特許出願第WO 96/34096号、1998年6月11日公開のWO 98/24893、2000年12月21日公開のWO 00/76310、WO 03/47336も参照のこと。上記の特許、出願および参考文献の各々の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
代替のアプローチにおいて、GenPharm International, Inc.,を含む他社は、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用した。このミニ遺伝子座アプローチにおいては、外因性のIg遺伝子座が、このIg遺伝子座由来の切片（個々の遺伝子）を含めることを通じて模倣される。したがって、1つまたは複数のV.sub.H遺伝子、1つまたは複数のD.sub.H遺伝子、1つまたは複数のJ.sub.H遺伝子、ミュー定常領域および第2の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物に挿入するための構築物を形成する。このアプローチは、Suraniらに対する米国特許第5,545,807号ならびに各々LonbergおよびKayに対する米国特許第5,545,806号、同第5,625,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、同第5,789,650号、同第5,814,318号、同第5,877,397号、同第5,874,299号および同第6,255,458号、KrimpenfortおよびBernsに対する米国特許第5,591,669号および同第6,023.010号、Bernsらに対する米国特許第5,612,205号、同第5,721,367号および同第5,789,215号ならびにChoiおよびDunnに対する米国特許第5,643,763号、ならびにGenPharm Internationalの1990年8月29日出願の米国特許出願第07/574,748号、1990年8月31日出願の同第07/575,962号、1991年12月17日出願の同第07/810,279号、1992年3月18日出願の同第07/853,408号、1992年6月23日出願の同第07/904,068号、1992年12月16日出願の同第07/990,860号、1993年4月26日出願の同第08/053,131号、1993年7月22日出願の同第08/096,762号、1993年11月18日出願の同第08/155,301号、1993年12月3日出願の同第08/161,739号、1993年12月10日出願の同第08/165,699号、1994年3月9日出願の同第08/209,741号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許第0 546 073 B 1号、国際特許出願第WO 92/03918号、同第WO 92/22645号、同第WO 92/22647号、同第WO 92/22670号、同第WO 93/12227号、同第WO 94/00569号、同第WO 94/25585号、同第WO 96/14436号、同第WO 97/13852号および同第WO 98/24884号ならびに米国特許第5,981,175号も参照のこと。さらに、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられるTaylor et al., 1992、Chen et al., 1993、Tuaillon et al., 1993、Choi et al., 1993、Lonberg et al., (1994)、Taylor et al., (1994)およびTuaillon et al., (1995)、Fishwild et al., (1996)を参照のこと。
Kirinもまた、ミクロセル融合を通じて大きな染色体片または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成を実証した。その開示が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願第773 288号および同第843 961号を参照のこと。Xenerex Biosciencesは、ヒト抗体の潜在的生成のための技術を開発中である。この技術において、SCIDマウスは、ヒトリンパ細胞、例えばBおよび／またはT細胞で再構成される。マウスは次いで抗原で免疫され、その抗原に対する免疫応答を生じ得る。米国特許第5,476,996号、同第5,698,767号および同第5,958,765号を参照のこと。
ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答は、産業界がキメラまたはそれ以外の方法でヒト化された抗体を調製する要因となった。キメラ抗体はヒト定常領域およびマウス可変領域を有するものであり、特定のヒト抗キメラ抗体（HACA）応答が、特にこの抗体の慢性的なまたは多用量の利用において観察されるであろうと予想される。したがって、HAMAまたはHACA応答の懸念および／または影響を取り除くために、EGFRvIIIに対する完全ヒト抗体を提供することが望ましいであろう。
CDH19/CD3二重特異性抗体構築物によって媒介される細胞毒性は、様々な方法で測定され得る。エフェクター細胞は、例えば、刺激され濃縮された（ヒト）CD8陽性T細胞または未刺激の（ヒト）末梢血単核細胞（PBMC）であり得る。標的細胞がマカク起源であるまたはマカクCDH19を発現するもしくはマカクCDH19でトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞もまた、マカク起源、例えばマカクT細胞株、例えば4119LnPxであるべきである。標的細胞は、CDH19、例えばヒトまたはマカクCDH19（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するものであるべきである。標的細胞は、CDH19、例えばヒトまたはマカクCDH19で安定的にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞株（例えば、CHO）であり得る。あるいは、標的細胞は、CDH19陽性の自然発現細胞株、例えばヒトミエローマ細胞株CHL-1またはColo-699であり得る。通常、EC50値は、その細胞表面上により高レベルのCDH19を発現する標的細胞株ほど低くなると考えられる。エフェクター対標的細胞（E:T）比は通常約10：1であるが、これはまた異なり得る。CDH19/CD3二重特異性抗体構築物の細胞毒性活性は、51-クロム放出アッセイ（約18時間のインキュベート時間）またはFACSベースの細胞毒性アッセイ（約48時間のインキュベート時間）において測定され得る。アッセイのインキュベート時間（細胞毒性反応）の変更も可能である。細胞毒性を測定する他の方法は、当業者に周知であり、MTTまたはMTSアッセイ、生物発光アッセイを含むATPベースのアッセイ、スルホローダミンB（SRB）アッセイ、WSTアッセイ、クローン形成アッセイおよびECIS技術を含む。
本発明のCDH19/CD3二重特異性抗体構築物により媒介される細胞毒性活性は、好ましくは細胞ベースの細胞毒性アッセイにおいて測定される。それは、最大半量有効濃度（ベースラインと最大の間の半分の細胞毒性応答を誘導する抗体構築物の濃度）に対応するEC50値によって表される。好ましくは、CDH19/CD3二重特異性抗体構築物のEC50値は、≦20.000 pg/ml、より好ましくは≦5000 pg/ml、さらにより好ましくは≦1000 pg/ml、さらにより好ましくは≦500 pg/ml、さらにより好ましくは≦350 pg/ml、さらにより好ましくは≦320 pg/ml、さらにより好ましくは≦250 pg/ml、さらにより好ましくは≦100 pg/ml、さらにより好ましくは≦50 pg/ml、さらにより好ましくは≦10 pg/mlおよび最も好ましくは≦5 pg/mlである。
上記の与えられた任意のEC50値が、細胞ベースの細胞毒性アッセイの示されたシナリオのいずれか1つと組み合わされ得る。例えば、（ヒト）CD8陽性T細胞またはマカクT細胞株がエフェクター細胞として使用される場合、CDH19/CD3二重特異性抗体構築物のEC50値は、好ましくは≦1000 pg/ml、より好ましくは≦500 pg/ml、さらにより好ましくは≦250 pg/ml、さらにより好ましくは≦100 pg/ml、さらにより好ましくは≦50 pg/ml、さらにより好ましくは≦10 pg/mlおよび最も好ましくは≦5 pg/mlである。このアッセイにおいて、標的細胞が（ヒトまたはマカク）CDH19トランスフェクト細胞、例えばCHO細胞である場合、CDH19/CD3二重特異性抗体構築物のEC50値は、好ましくは≦150 pg/ml、より好ましくは≦100 pg/ml、さらにより好ましくは≦50 pg/ml、さらにより好ましくは≦30 pg/ml、さらにより好ましくは≦10 pg/mlおよび最も好ましくは≦5 pg/mlである。
標的細胞がCDH19陽性自然発現細胞株である場合、EC50値は、好ましくは≦350 pg/ml、より好ましくは≦320 pg/ml、さらにより好ましくは≦250 pg/ml、さらにより好ましくは≦200 pg/ml、さらにより好ましくは≦100 pg/ml、さらにより好ましくは≦150 pg/ml、さらにより好ましくは≦100 pg/mlおよび最も好ましくは≦50 pg/mlまたはそれより低い値である。（ヒト）PBMCがエフェクター細胞として使用される場合、CDH19/CD3二重特異性抗体構築物のEC50値は、好ましくは≦1000 pg/ml、より好ましくは≦750 pg/ml、より好ましくは≦500 pg/ml、さらにより好ましくは≦350 pg/ml、さらにより好ましくは≦320 pg/ml、さらにより好ましくは≦250 pg/ml、さらにより好ましくは≦100 pg/mlおよび最も好ましくは≦50 pg/mlまたはそれより低い値である。
個々のCDH19/CD3二重特異性抗体構築物の単量体アイソフォームと2量体アイソフォームの間の細胞毒性活性の違いは、「効果ギャップ（potency gap）」と称される。この効果ギャップは、例えば、その分子の単量体形態のEC50値と2量体形態のEC50値の間の比として計算され得る。本発明のCDH19/CD3二重特異性抗体構築物の効果ギャップは、好ましくは≦5、より好ましくは≦4、さらにより好ましくは≦3、さらにより好ましくは≦2および最も好ましくは≦1である。
本発明の抗体構築物は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含むまたは含まない少なくとも2つの結合ドメインを含む融合タンパク質である。特に適当なペプチドリンカーは、米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号またはWO 88/09344に記載されるものである。
オリゴマー抗体構築物誘導体を調製する別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見いだされるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初、いくつかのDNA結合タンパク質において同定され（Landschulz et al., 1988, Science 240:1759）、そしてその後、様々な異なるタンパク質において見出されている。特に知られているロイシンジッパーは、2量体化または3量体化する天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。可溶性オリゴマータンパク質を作製するのに適したロイシンジッパードメインの例は、PCT出願WO 94/10308に記載されており、肺サーファクタントタンパク質D（SPD）由来のロイシンジッパーがHoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191に記載されており、これらが参照により本明細書に組み入れられる。それに融合された異種タンパク質の安定的な3量体化を実現する修飾されたロイシンジッパーの使用は、Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78に記載されている。1つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合されたCDH19抗体フラグメントまたは誘導体を含む組み換え融合タンパク質が、適当な宿主細胞において発現され、そして形成した可溶性オリゴマーCDH19抗体フラグメントまたは誘導体が培養上清から回収される。
抗原結合タンパク質の共有結合修飾は、本発明の範囲に含まれ、そしてそれは、常にではないが概ね、翻訳後に行われる。例えば、抗原結合タンパク質のいくつかのタイプの共有結合修飾は、抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはNもしくはC末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、分子内に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、α-ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル 2-ピリジルジスルフィド、p-クロロ水銀安息香酸、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノールまたはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるジエチルピロカーボネートとのpH 5.5〜7.0での反応によって誘導体化される。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；この反応は、好ましくは、pH 6.0の0.1M カコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ-アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な剤は、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸メチル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソウレア；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
アルギニル残基は、1つまたは複数の従来的な試薬、特にフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのためにこの反応がアルカリ条件下で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの官能基およびアルギニンイプシロン-アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特定の修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入のために、行われ得る。最も一般的には、N-アセチルイミジゾール（N-acetylimidizole）およびテトラニトロメタンが、それぞれ、O-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、放射免疫アッセイにおいて使用するための標識タンパク質を調製するために、125Iまたは131Iを用いてヨウ化され、上記のクロラミンT法が適している。
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（R'-N=C=N-R'）との反応によって選択的に修飾され、ここで、RおよびR'は任意で異なるアルキル基、例えば1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドである。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
2官能性の剤を用いる誘導体化は、様々な方法において使用するために抗原結合タンパク質を水不溶性の支持マトリックスまたは表面に架橋するのに有用である。広く使用されている架橋剤は、例えば、1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステル、例えば3,3'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含むホモ2官能性イミドエステル、および2官能性マレイミド、例えばビス-N-マレイミド-1,8-オクタンを含む。誘導体化剤、例えばメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。あるいは、反応性水不溶性マトリックス、例えば臭化シアン活性化炭水化物ならびに米国特許第3,969,287号；同第3,691,016号；同第4,195,128号；同第4,247,642号；同第4,229,537号；および同第4,330,440号に記載される反応性基質が、タンパク質の固定化のために使用される。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば脱アミド化され、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にされる。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲に含まれる。
他の修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp.79-86）、N末端アミンのアセチル化ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲に含まれる抗原結合タンパク質の共有結合修飾の別のタイプは、タンパク質のグリコシル化パターンの変更を含む。当技術分野で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で議論される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在もしくは非存在）またはそのタンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現システムが、以下で議論されている。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を表す。Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である3ペプチド配列アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素付加の認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらの3ペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。O結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの1つの付加を表すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも使用され得る。
抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、（N結合型グリコシル化部位のための）上記の3ペプチド配列の1つまたは複数を含むようアミノ酸配列を変更することによって従来法により達成される。変更はまた、（O結合型グリコシル化部位のための）開始配列への1つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換によって行われ得る。簡潔には、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列は、好ましくは、DNAレベルでの変化を通じて、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるよう標的ポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基で変異させることによって、変更される。
抗原結合タンパク質上の炭水化物部分の数を増やす別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの手法は、NおよびO結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有するタンパク質を宿主細胞において産生する必要がない点で有利である。使用されるカップリングの様式に依存して、糖は、（a)アルギニンおよびヒスチジン、（b）遊離カルボキシル基、（c）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのそれら、（d）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのそれら、（e）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのそれら、または（f）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、1987年9月11日公開のWO 87/05330およびAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306に記載されている。
出発抗原結合タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に行われ得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理は、ポリペプチドをインタクトなまま残しつつ、連結糖（N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖を切断する。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52によっておよびEdge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350に記載されるような様々なエンドおよびエキソグルコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位におけるグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105によって記載されるような化合物ツニカマイシンの使用によって防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質-N-グリコシド連結の形成を阻止する。
抗原結合タンパク質の別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第4,640,835号；同第4,496,689号；同第4,301,144号；同第4,670,417号；同第4,791,192号または同第4,179,337号に示される様式での様々なポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質ポリマーへの抗原結合タンパク質の連結を含む。加えて、当技術分野で公知のように、アミノ酸置換は、ポリマー、例えばPEGの付加を容易にするよう抗原結合タンパク質内の様々な位置で行われ得る。
いくつかの態様において、本発明の抗原結合タンパク質の共有結合修飾は、1つまたは複数の標識の付加を含む。
「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を意味する。適当な標識基の例は、以下を含むがこれらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光基（例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基または2次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、2次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの態様において、標識基は、潜在的な立体障害を減らすために、様々な長さのスペーサーアームを通じて抗原結合タンパク質に連結される。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、本発明を実施する上で使用され得る。
一般に、標識は、それらを検出するアッセイに依存して様々なクラスに分類される：a）放射性または重同位体であり得る同位体標識；b）磁気標識（例えば、磁気粒子）；c）酸化還元活性部分；d）光学色素；酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；e）ビオチニル化基；およびf）2次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、2次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）。いくつかの態様において、標識基は、潜在的な立体障害を減らすために、様々な長さのスペーサーアームを通じて抗原結合タンパク質にカップリングされる。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、本発明を実施する上で使用され得る。
特定の標識は、発色団、リン光体および蛍光体を含むがこれらに限定されない光学色素を含み、後者が多くの例で用いられる。蛍光体は、「低分子」蛍光体またはタンパク質蛍光体のいずれかであり得る。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を通じて検出され得る任意の分子を意味する。適当な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル-クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーJ、テキサスレッド、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LCレッド640、Cy 5、Cy 5.5、LCレッド705、オレゴングリーン、Alexa-Fluor色素（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびR-フィコエリトリン（PE）（Molecular Probes, Eugene, OR）、FITC、ローダミンおよびテキサスレッド（Pierce, Rockford, IL）、Cy5、Cy5.5、Cy7（Amersham Life Science, Pittsburg, PA）を含むがこれらに限定されない。蛍光体を含む適当な光学色素は、明示的に参照により本明細書に組み入れられるMolecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandに記載されている。
適当なタンパク質蛍光標識はまた、レニラ（Renilla）、プチロサーカス（Ptilosarcus）またはエクオレア（Aequorea）種のGFP（Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805）、EGFP（Clontech Laboratories, Inc., Genbankアクセッション番号U55762）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182）、強化型黄色蛍光タンパク質（EYFP, Clontech Laboratories, Inc.）、ルシフェラーゼ（Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417）、βガラクトシダーゼ（Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607）およびレニラ（WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、米国特許第5292658号、同第5418155号、同第5683888号、同第5741668号、同第5777079号、同第5804387号、同第5874304号、同第5876995号、同第5925558号）を含むがこれらに限定されない。上記の参考文献はすべて、明示的に参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の抗体構築物はまた、例えばこの分子の単離を助けるまたはこの分子の適合された薬物動態プロフィールに関連する追加ドメインを含み得る。
抗体構築物の単離を助けるドメインは、単離方法、例えば単離用カラムにおいて捕捉され得るペプチドモチーブまたは2次的に導入される部分から選択され得る。そのような追加ドメインの非限定的な態様は、Mycタグ、HATタグ、HAタグ、TAPタグ、GSTタグ、キチン結合ドメイン（CBDタグ）、マルトース結合タンパク質（MBPタグ）、Flagタグ、Strepタグおよびその変種（例えば、StrepIIタグ）ならびにHisタグとして公知のペプチドモチーブを含む。特定のCDRによって特徴づけられる本明細書に開示される抗体構築物はすべて、その分子のアミノ酸配列中の連続するHis残基、好ましくは6つのHis残基の反復として一般に公知のHisタグドメインを含むことが好ましい。
付属の実施例2に記載されるように、多数のCDH19特異的結合体が、示された結合特性に関して特徴づけられ、そしてこれらの結合体は、CDH19特異的結合ドメインの5つの異なるサブグループを表す、5つの異なるビン（bin）にグループ分けされた。したがって、本発明の抗体構築物の1つの態様において、第1の結合ドメインは、
（a）その全てがCDH19に対する結合ドメイン（ビン1にグループ分けされる）を特徴づけている、
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（b）その全てがCDH19に対する結合ドメイン（ビン2にグループ分けされる）を特徴づけている、
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SEQ ID NO:130に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:131に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:916に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:298に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:299に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:932に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1009に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1010に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1011に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1012に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1013に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1014に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1022に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1023に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1024に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1025に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1026に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1027に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1035に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1036に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1037に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1038に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1039に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1040に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1074に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1075に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1076に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1077に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1078に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1079に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1100に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1101に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1102に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1103に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1104に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1105に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1113に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1114に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1115に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1116に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1117に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1118に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1243に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1244に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1245に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1246に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1247に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1248に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1256に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1257に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1258に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1259に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1260に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1261に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1269に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1270に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1271に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1272に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1273に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1274に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1282に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1283に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1284に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1285に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1286に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1287に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1295に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1296に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1297に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1298に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1299に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1300に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1647に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1648に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1649に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1650に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1651に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1652に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1660に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1661に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1662に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1663に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1664に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1665に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1894に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1895に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1896に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1897に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1898に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1899に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1907に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1908に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1909に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1910に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1911に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1912に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1933に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1934に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1935に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1936に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1937に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1938に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1946に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1947に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1948に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1949に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1950に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1951に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1959に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1960に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1961に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1962に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1963に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1964に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1972に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1973に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1974に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1975に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1976に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1977に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1985に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1986に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1987に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1988に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1989に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1990に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1998に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1999に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2000に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2001に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2002に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2003に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2011に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2012に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2013に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2014に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2015に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2016に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2024に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2025に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2026に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2027に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2028に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2029に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2037に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2038に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2039に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2040に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2041に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2042に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:2050に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2051に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2052に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2053に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2054に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2055に示されるCDR-L3；
（c）その全てがCDH19に対する結合ドメイン（ビン3にグループ分けされる）を特徴づけている、
SEQ ID NO:94に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:95に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:96に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:262に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:263に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:264に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:100に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:101に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:102に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:268に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:269に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:270に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:118に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:119に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:120に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:286に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:287に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:288に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:154に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:155に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:156に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:322に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:323に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:324に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:100に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:101に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:912に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:268に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:269に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:270に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:100に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:101に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:913に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:268に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:269に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:270に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:94に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:95に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:910に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:262に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:263に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:264に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:94に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:95に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:911に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:262に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:263に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:264に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:118に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:119に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:120に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:286に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:287に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:288に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:118に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:914に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:120に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:286に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:287に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:288に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:154に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:155に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:920に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:322に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:323に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:324に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:996に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:997に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:998に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:999に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1000に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1001に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1048に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1049に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1050に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1051に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1052に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1053に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1087に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1088に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1089に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1090に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1091に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1092に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1608に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1609に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1610に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1611に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1612に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1613に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1621に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1622に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1623に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1624に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1625に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1626に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1634に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1635に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1636に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1637に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1638に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1639に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1673に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1674に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1675に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1676に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1677に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1678に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1686に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1687に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1688に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1689に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1690に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1691に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1699に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1700に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1701に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1702に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1703に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1704に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1712に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1713に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1714に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1715に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1716に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1717に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1725に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1726に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1727に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1728に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1729に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1730に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1738に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1739に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1740に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1741に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1742に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1743に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1751に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1752に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1753に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1754に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1755に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1756に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1764に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1765に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1766に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1767に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1768に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1769に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:1920に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1921に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1922に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1923に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1924に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1925に示されるCDR-L3；
（d）その全てがCDH19に対する結合ドメイン（ビン4にグループ分けされる）を特徴づけている、
SEQ ID NO:4に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:5に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:6に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:172に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:173に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:174に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:10に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:11に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:12に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:178に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:179に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:180に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:198に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:34に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:35に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:36に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:202に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:203に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:204に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:214に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:59に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:60に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:64に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:65に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:66に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:232に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:233に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:234に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:71に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:72に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:328に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:902に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:903に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:925に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:907に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:72に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:907に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:908に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:901に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:905に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:906に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:905に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:60に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:921に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:940に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:941に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:901に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:970に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:971に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:972に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:973に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:974に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:975に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1061に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1062に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1063に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1064に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1065に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1066に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1139に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1140に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1141に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1142に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1143に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1144に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1152に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1153に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1154に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1155に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1156に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1157に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1178に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1179に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1180に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1181に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1182に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1183に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1191に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1192に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1193に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1194に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1195に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1196に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1204に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1205に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1206に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1207に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1208に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1209に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1217に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1218に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1219に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1220に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1221に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1222に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1230に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1231に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1232に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1233に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1234に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1235に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1308に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1309に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1310に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1311に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1312に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1313に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1321に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1322に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1323に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1324に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1325に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1326に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1373に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1374に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1375に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1376に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1377に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1378に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1386に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1387に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1388に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1389に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1390に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1391に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1399に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1400に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1401に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1402に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1403に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1404に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1412に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1413に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1414に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1415に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1416に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1417に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1777に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1778に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1779に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1780に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1781に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1782に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1790に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1791に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1792に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1793に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1794に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1795に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1803に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1804に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1805に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1806に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1807に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1808に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1816に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1817に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1818に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1819に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1820に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1821に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1829に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1830に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1831に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1832に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1833に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1834に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1842に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1843に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1844に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1845に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1846に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1847に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1855に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1856に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1857に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1858に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1859に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1860に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1868に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1869に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1870に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1871に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1872に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1873に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1881に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1882に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1883に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1884に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1885に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1886に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2063に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2064に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2065に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2066に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2067に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2068に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2076に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2077に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2078に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2079に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2080に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2081に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2089に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2090に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2091に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2092に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2093に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2094に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2102に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2103に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2104に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2105に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2106に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2107に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2115に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2116に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2117に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2118に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2119に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2120に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2128に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2129に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2130に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2131に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2132に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2133に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2141に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2142に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2143に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2144に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2145に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2146に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2154に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2155に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2156に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2157に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2158に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2159に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2180に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2181に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2182に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2183に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2184に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2185に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:2193に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2194に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2195に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2198に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:2206に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2207に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2208に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2209に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2210に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2211に示されるCDR-L3；および
（e）その全てがCDH19に対する結合ドメイン（ビン5にグループ分けされる）を特徴づけている、
SEQ ID NO:76に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:77に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:78に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:244に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:245に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:246に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:88に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:89に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:90に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:256に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:257に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:258に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:106に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:107に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:108に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:274に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:275に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:276に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:112に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:113に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:114に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:280に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:281に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:282に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:106に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:107に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:108に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:274に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:275に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:276に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:983に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:984に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:985に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:986に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:987に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:988に示されるCDR-L3、
SEQ ID NO:1582に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1583に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1584に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1585に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1586に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1587に示されるCDR-L3、ならびに
SEQ ID NO:1595に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1596に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1597に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1598に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1599に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1600に示されるCDR-L3
からなる群より選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域ならびにCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む。
本発明の抗体構築物のさらなる態様において、第1の結合ドメインは、
（a）ビン1にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域；
（b）ビン2にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域；
（c）ビン3にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域；
（d）ビン4にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域；ならびに
（e）ビン5にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域
からなる群より選択されるVH領域を含む。
本発明の抗体構築物の別の態様において、第1の結合ドメインは、
（a）ビン1にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVL領域；
（b）ビン2にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVL領域；
（c）ビン3にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVL領域；
（d）ビン4にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVL領域；ならびに
（e）ビン5にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVL領域
からなる群より選択されるVL領域を含む。
本発明は、本発明の抗体構築物の1つの態様をさらに提供し、ここで第1の結合ドメインは、
（1）全ての対がビン1にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；
（2）全ての対がビン2にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；
（3）全ての対がビン3にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；
（4）全ての対がビン4にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対；ならびに
（5）全ての対がビン5にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるVH領域およびVL領域の対
からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む。
本発明のさらなる態様において、抗体構築物は、(scFv)2、(単一ドメインmAb)2、scFv-単一ドメインmAb、ダイアボディおよびそれらのオリゴマーからなる群より選択される形態である。
好ましい態様において、第1の結合ドメインは、
（a）全ての結合体がビン1にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるもの；
（b）全ての結合体がビン2にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるもの；
（c）全ての結合体がビン3にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるもの；
（d）全ての結合体がビン4にグループ分けされる、
Figure 0006522517
に示されるもの；ならびに
（e）ビン5にグループ分けされる、SEQ ID NO:994、SEQ ID NO:1593およびSEQ ID NO:1606に示されるもの
からなる群より選択されるアミノ酸を含む。
本発明の１つの局面において、第2の結合ドメインは、ヒトCD3およびマカクCD3、好ましくはヒトCD3イプシロンおよびマカクCD3イプシロンに結合できる。付加的にまたは代替的に、第2の結合ドメインは、コモンマーモセット、ワタボウシタマリンおよび／またはコモンリスザルのCD3イプシロンに結合できる。これらの態様によると、本発明の抗体構築物の一方または両方の結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーに対して種間特異的（cross-species specific）である。種間特異的CD3結合ドメインは、例えば、WO 2008/119567に記載されている。
T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインが、
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 27に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 28に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 29に示されるCDR-L3；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 117に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 118に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 119に示されるCDR-L3；ならびに
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 153に示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 154に示されるCDR-L2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 155に示されるCDR-L3
から選択されるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む本発明の抗体構築物が、特に好ましい。
本発明の抗体構築物の代替の好ましい態様において、T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインは：
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 12に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 13に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 14に示されるCDR-H3；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 30に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 31に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 32に示されるCDR-H3；
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 48に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 49に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 50に示されるCDR-H3；
（d）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 66に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 67に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 68に示されるCDR-H3；
（e）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 84に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 85に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 86に示されるCDR-H3；
（f）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 102に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 103に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 104に示されるCDR-H3；
（g）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 120に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 121に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 122に示されるCDR-H3；
（h）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 138に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 139に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 140に示されるCDR-H3；
（i）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 156に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 157に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 158に示されるCDR-H3；ならびに
（j）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 174に示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 175に示されるCDR-H2およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 176に示されるCDR-H3
から選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域を含む。
T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインが、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 35、39、125、129、161または165に示されるVL領域からなる群より選択されるVL領域を含む本発明の抗体構築物が、さらに好ましい。
T細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインが、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177または181に示されるVH領域からなる群より選択されるVH領域を含むことが、代替的に好ましい。
より好ましくは、本発明の抗体構築物は：
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 17または21に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 15または19に示されるVH領域；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 35または39に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 33または37に示されるVH領域；
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 53または57に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 51または55に示されるVH領域；
（d）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 71または75に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 69または73に示されるVH領域；
（e）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 89または93に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 87または91に示されるVH領域；
（f）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 107または111に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 105または109に示されるVH領域；
（g）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 125または129に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 123または127に示されるVH領域；
（h）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 143または147に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 141または145に示されるVH領域；
（i）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 161または165に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 159または163に示されるVH領域；ならびに
（j）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 179または183に示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO: 177または181に示されるVH領域；
からなる群より選択されるVL領域およびVH領域を含むT細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインによって特徴づけられる。
本発明の抗体構築物、特にT細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインの好ましい態様によると、VH領域およびVL領域の対は、単鎖抗体（scFv）の形式にされる。VHおよびVL領域は、VH-VLまたはVL-VHの順で配列される。VH領域がリンカー配列のN末端側に配置されることが好ましい。VL領域は、リンカー配列のC末端側に配置される。
上記の本発明の抗体構築物の好ましい態様は、WO 2008/119567のSEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185または187からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むT細胞CD3受容体複合体に結合できる第2の結合ドメインによって特徴づけられる。
好ましい態様において、本発明の抗体構築物は、
（a）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（b）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（c）
Figure 0006522517
に示されるもの；
（d）
Figure 0006522517
に示されるもの；ならびに
（e）SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:1594およびSEQ ID NO:1607に示されるもの
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明は、本発明の抗体構築物をコードする核酸配列をさらに提供する。
さらに本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターを提供する。さらにまた本発明は、本発明の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体構築物の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、および、産生された抗体構築物を培養物から回収する工程を含む、本発明の抗体構築物の産生のためのプロセスを提供する。
さらにまた本発明は、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物を含む、薬学的組成物を提供する。
本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者における本明細書に記載される病理学的医学状態を処置、寛解および／または予防する薬学的組成物として有用である。「処置」という用語は、治療的処置および予防または抑止手段の両方を表す。処置は、その疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を治癒する、修復する、軽減する、解放する、是正する、救済する、寛解する、改善するまたはそれに影響を与える目的での、疾患／障害、疾患／障害の症状または疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織または細胞に対する製剤の適用または投与を含む。
「処置を必要とする」は、すでに障害を有している者およびその障害を予防したい者を含む。「疾患」という用語は、本明細書に記載されるタンパク質製剤を用いた処置から利益を得るであろう任意の状態である。これは、哺乳動物が問題の疾患にかかりやすくなる病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患を含む。本発明により処置される疾患／障害の非限定的な例は、増殖性疾患、腫瘍性疾患または免疫学的障害を含む。
いくつかの態様において、本発明は、治療有効量の本発明の1つまたは複数の抗体構築物を薬学的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントと共に含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、液体、凍結および凍結乾燥組成物を含むがこれらに限定されない。
好ましくは、配合物質は、用いられる用量および濃度でレシピエントに非毒性である。特定の態様において、薬学的組成物は、治療有効量の本発明の抗体構築物を含む。
特定の態様において、薬学的組成物は、例えば組成物のpH、オスモル濃度、粘性、清澄性、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸収性または浸透性を変化、維持または保存するための配合物質を含み得る。そのような態様において、適当な配合物質は、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリンもしくはリジン）；抗菌剤；抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩もしくはその他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトールもしくはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン）；増量剤；単糖；二糖；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン）；着色、香味および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、ポロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート20、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（tyloxapal））；安定性向上剤（例えば、スクロースもしくはソルビトール）；等張性向上剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくはカリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤ならびに／または医薬用アジュバントを含むがこれらに限定されない。REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Companyを参照のこと。
特定の態様において、最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式および望まれる用量に基づいて、当業者によって決定されるであろう。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、前記を参照のこと。特定の態様において、そのような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響し得る。特定の態様において、薬学的組成物における主ビヒクルまたは担体は、本来的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適当なビヒクルまたは担体は、非経口投与用組成物において一般的な他の物質を補充され得る注射用水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンを混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。特定の態様において、薬学的組成物は、約pH 7.0〜8.5のTris緩衝液または約pH 4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、さらにソルビトールまたはその適当な代替物質を含み得る。本発明の特定の態様において、本発明のヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本発明の抗体構築物は、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で望ましい純度を有する選択された組成物を任意の配合剤（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、前記）と混合することによって保存用に調製され得る。さらに、特定の態様において、本発明のヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本発明の抗体構築物は、適当な賦形剤、例えばスクロースを用いて凍結乾燥物として製剤化され得る。
本発明の薬学的組成物は、非経口送達用に選択され得る。あるいは、組成物は、吸入または消化管を通じた送達用に、例えば経口用に選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当技術分野の技能の範疇である。配合成分は、好ましくは投与部位にとって許容できる濃度で存在する。特定の態様において、緩衝液が、生理学的pHまたは若干低いpHで、典型的には約5〜約8のpH範囲内で組成物を維持するために使用される。
非経口投与が考慮される場合、本発明において使用される治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の望まれるヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは本発明の抗体構築物を含む発熱物質非含有の、非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、本発明の抗体構築物を適切に保存する滅菌性、等張性の溶液として製剤化されている滅菌蒸留水である。特定の態様において、調製物は、望まれる分子と、蓄積注射を通じて送達され得る産物の制御または持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なマイクロスフィア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームとの配合物を含み得る。特定の態様において、循環中での持続時間を向上させる効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。特定の態様において、移植可能な薬物送達デバイスが、望ましい抗原結合タンパク質を導入するために使用され得る。
持続または制御送達製剤中に本発明の抗体構築物を含む製剤を含むさらなる薬学的組成物は、当業者に明らかであろう。様々な他の持続または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロスフィアまたは多孔性ビーズおよび蓄積注射物を配合する技術もまた当業者に公知である。例えば、参照により組み入れられ、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する国際特許出願第PCT/US93/00829号を参照のこと。持続放出調製物は、成形物、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、（各々参照により組み入れられる米国特許第3,773,919号および欧州特許出願公開第EP 058481号に記載されるような）ポリラクチド、L-グルタミン酸およびガンマ エチル-L-グルタメートのコポリマー（Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556）、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277およびLanger, 1982, Chem. Tech. 12:98-105）、エチレンビニル酢酸（Langer et al., 1981, 前記）またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第EP 133,988号）を含み得る。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得るリポソームを含み得る。例えば、参照により組み入れられる、Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；欧州特許出願公開第EP 036,676号；同第EP 088,046号および同第EP 143, 949号を参照のこと。
インビボ投与のために使用される薬学的組成物は、典型的に、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成の前および後のいずれかに実施され得る。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保存され得る。非経口組成物は、通常、滅菌アクセス口を有する容器、例えば皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液用バッグまたはバイアル中に注入される。
本発明の複数の局面は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願WO 06138181A2（PCT/US2006/022599）に記載される薬学的組成物として使用され得る本発明の製剤の自己緩衝用抗体構築物を含む。
上記のように、特定の態様は、本発明の抗体構築物に加えて、1つまたは複数の賦形剤、例えばこの節および本明細書の他箇所に例示的に記載されているものを含む本発明のタンパク質組成物、特に本発明の薬学的組成物の抗体構築物を提供する。この点に関して、賦形剤は本発明において、幅広い目的で、例えば製剤の物理的、化学的または生物学的特性を調節するために、例えば粘性の調節、効能を改善するためおよびまたはそのような製剤を安定化させるための本発明のプロセスならびに例えば製造、輸送、保管、使用前準備、投与の間におよびその後に生じるストレスに起因する分解および損傷に対するプロセスのために、使用され得る。様々な解説、例えば各々その全体が参照により本明細書に組み入れられるArakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002)およびRandolph et al., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)が、特に一部本発明にしたがうタンパク質製剤の自己緩衝のための賦形剤およびそのプロセスに関連する、特に獣医学的および／またはヒト医療用途のタンパク質医薬製品およびプロセスに関連する、タンパク質の安定化ならびにこの点で有用な配合物質および方法に関して利用可能である。
塩は、本発明の特定の態様によると、例えば製剤のイオン強度および／もしくは等張性を調節するためならびに／または本発明にしたがう組成物のタンパク質もしくは他の成分の溶解度および／もしくは物理的安定性を改善するために使用され得る。
周知のように、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによってならびにタンパク質中の荷電および極性基を遮蔽しそれらの静電気相互作用、誘引および反発相互作用の強度を減少させることによってネイティブ状態のタンパク質を安定化させ得る。イオンはまた、特にタンパク質の変性したペプチド結合（--CONH）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化させ得る。さらにタンパク質中の荷電および極性基とのイオン相互作用はまた、分子間静電気相互作用を減少させ、それによってタンパク質の凝集および不溶化を防止または減少させ得る。
イオン種は、タンパク質に対するそれらの効果に関して大きく異なる。多くのイオンおよびタンパク質に対するそれらの効果の分類別順位づけが開発され、これらが本発明にしたがう薬学的組成物の製剤化に使用され得る。1つの例は、イオンおよび極性非イオン溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対するそれらの効果によって順位づけするホフマイスターシリーズである。安定化させる溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化させる溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞1モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性および／または可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」および「塩析」に対するイオンの相対的な効果が、ホフマイスターシリーズにおけるそれらの位置を定義する。
遊離アミノ酸は、バルク剤、安定化剤および抗酸化物質としてならびにその他の標準的用途で、本発明の様々な態様による本発明の製剤の抗体構築物において使用され得る。リジン、プロリン、セリンおよびアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化させるために使用され得る。グリシンは、正確なケークの構造および特性を確保するために凍結乾燥時に有用である。アルギニンは、液体および凍結乾燥の両製剤においてタンパク質の凝集を防ぐために有用であり得る。メチオニンは、抗酸化物質として有用である。
ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロースおよびソルビトールならびに多価アルコール、例えばグリセロールおよびプロピレングリコールならびに、本明細書における議論の目的で、ポリエチレングリコール（PEG）および関連物質を含む。ポリオールはコスモトロピックである。それらは、タンパク質を物理的および化学的分解プロセスから保護するための液体および凍結乾燥の両製剤における安定化剤として有用である。ポリオールは、製剤の等張性を調節するために有用である。
本発明の選択された態様において特に有用なポリオールは、凍結乾燥製剤においてケークの構造安定性を確保するために広く使用されるマンニトールである。それは、ケークの構造安定性を確保する。それは一般に、凍結保護物質、例えばスクロースと共に使用される。ソルビトールおよびスクロースは、等張性を調節するためにおよび輸送中または製造プロセスにおけるバルク調製中の凍結・解凍ストレスから保護するための安定化剤として特に好ましい薬剤である。（遊離アルデヒドまたはケトン基を含む）還元糖、例えばグルコースおよびラクトースは、表面リジンおよびアルギニン残基を糖化し得る。したがって、それらは概ね、本発明にしたがう使用に関して特に好ましいポリオールではない。加えて、そのような反応性種を形成する糖、例えば酸性条件下でフルクトースおよびグルコースに加水分解され、その結果糖化をもたらすスクロースもまたこの点で本発明の特に好ましいポリオールではない。PEGは、タンパク質を安定化させるためにおよび凍結保護物質として有用であり、本発明においてこの点で使用され得る。
本発明の製剤の抗体構築物の複数の態様はさらに、界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面への吸着ならびに空気・液体、固体・液体および液体・液体界面での変性およびその結果としての凝集を引き起こしやすいものであり得る。これらの効果は通常、タンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は通常、タンパク質濃度と反比例し、典型的には、例えば製品の輸送および取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。
界面活性剤は、慣用的に、表面吸着を防止する、最小限に抑えるまたは減少させるために使用される。この点で本発明において有用な界面活性剤は、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ソルビタンポリエトキシレートのその他の脂肪酸エステルおよびポロキサマー188を含む。
界面活性剤はまた、タンパク質の立体構造安定性を制御するために広く使用されている。この点における界面活性剤の使用は、任意の与えられた界面活性剤は典型的に一部のタンパク質を安定化させ他を不安定化させるので、タンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化的分解の影響を受けやすく、しばしば、供給されるときに、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量のペルオキシドを含んでいる。結果として、ポリソルベートは、注意して使用されなければならず、使用される際は、それらの最低有効濃度で用いられるべきである。この点で、ポリソルベートは、賦形剤がそれらの最低有効濃度で使用されるべきとする一般的なルールの一例である。
本発明の製剤の抗体構築物の複数の態様はさらに、1つまたは複数の抗酸化物質を含む。適当なレベルの環境の酸素および温度を維持することによってならびに光への暴露を回避することによって、ある程度まで、薬学的製剤においてタンパク質の有害な酸化を防ぐことができる。タンパク質の酸化分解を防ぐために、抗酸化物質賦形剤も使用され得る。この点で特に有用な抗酸化物質は、還元剤、酸素／フリーラジカル消去剤およびキレート剤である。本発明にしたがう治療用タンパク質製剤において使用される抗酸化物質は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間を通じてそれらの活性を維持する。EDTAが、この点で本発明にしたがう好ましい抗酸化物質である。
抗酸化物質は、タンパク質を損傷し得る。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは特に、分子内ジスルフィド連結を破壊し得る。したがって、本発明において使用するための抗酸化物質は、特に、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するまたは実質的に減少させるよう選択される。
本発明にしたがう製剤は、タンパク質の補因子でありタンパク質配位化合物を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば、特定のインスリン懸濁物を形成するのに必要とされる亜鉛、を含み得る。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害し得る。しかし、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的および化学的プロセスを触媒する。
マグネシウムイオン（10〜120mM）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ca+2イオン（最大100mM）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を向上させ得る。Mg+2、Mn+2およびZn+2は、しかし、rhDNaseを不安定化させ得る。同様にCa+2およびSr+2は、第VIII因子を安定化させ得、それはMg+2、Mn+2およびZn+2、Cu+2ならびにFe+2によって不安定化され得、そしてその凝集はAl+3イオンによって増大され得る。
本発明の製剤の抗体構築物の複数の態様はさらに、1つまたは複数の保存剤を含む。保存剤は、同じ容器からの1回より多い取り出しを行う多用量非経口製剤を開発する際に必要となる。それらの主たる機能は、その医薬品の有効期間または使用期間を通じて微生物の成長を阻害し、製品の滅菌性を確保することである、広く使用されている保存剤は、ベンジルアルコール、フェノールおよびm-クレゾールを含む。保存剤は低分子量非経口薬と共に使用される歴史が長いが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有し、これが多用量タンパク質製剤におけるそれらの使用を制限する大きな要因となっている。今日まで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用途でしか製剤化されていない。しかし、多用量製剤が可能な場合、それらは患者の利便性および高い市場性を実現するという追加の利点を有する。良い例は、保存処理された製剤の開発がより便利な多使用注射ペンの提案の商業化を実現したヒト成長ホルモン（hGH）のそれである。hGHの保存された製剤を含む少なくとも4つそのようなペンデバイスが、現在市場で入手可能である。Norditropin（液体、Novo Nordisk）、Nutropin AQ（液体、Genentech）およびGenotropin（凍結乾燥-デュアルチャンバーカートリッジ、Pharmacia ＆ Upjohn）はフェノールを含み、Somatrope (Eli Lilly）はm-クレゾールを用いて製剤化される。いくつかの局面は、保存された剤形の製剤化および開発の間に考慮される必要がある。医薬品における効果的な保存剤濃度は、最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を損なわずに抗微生物効果を付与する濃度範囲を有する剤形において与えられた保存剤を試験すること必要とする。
予想され得るように、保存剤を含む液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥されそして使用時に保存剤を含む希釈剤で再構成され得る。これにより保存剤がタンパク質と接触している時間が短縮され、関連する安定性リスクが大きく抑制される。液体製剤の場合、保存剤の効果および安定性は、全製品有効期間（約18〜24ヶ月）にわったって維持されるべきである。注意すべき重要な点は、保存剤の効果は活性な薬物およびすべての賦形剤成分を含む最終製剤において示されるべきであることである。
本発明の抗体構築物は、通常、特に、バイオアベイラビリティおよび持続性の範囲で、特定の投与経路および方法のために、特定の投与用量および投与頻度のために、特定の疾患の特定の処置のために設計されるであろう。したがって製剤は、本発明にしたがい、経口、耳、目、直腸および膣を含むがこれらに限定されない任意の適当な経路によるならびに静脈内および動脈内注射、筋内注射および皮下注射を含む非経口経路による送達のために設計され得る。
薬学的組成物が製剤化された後、それは溶液、懸濁物、ゲル、乳化物、固体、結晶としてまたは脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保管され得る。そのような製剤は、即時使用可能（ready-to-use）形態または投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥された）形態のいずれかで保管され得る。本発明はまた、単回用量投与ユニットを作製するためのキットを提供する。本発明のキットは各々、乾燥されたタンパク質を含む第1の容器および水性製剤を有する第2の容器を含み得る。本発明の特定の態様において、単および多チャンバーの充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（lyosyringe））を含むキットが提供される。使用される本発明のタンパク質含有薬学的組成物の抗体構築物の治療有効量は、例えば、治療状況および目的に依存するであろう。当業者は、処置のための適当な用量レベルが、送達される分子、本発明の抗体構築物が使用される適応病、投与経路ならびに患者のサイズ（体重、体表面または臓器サイズ）および／または状態（年齢および全般的健康）に一部依存して変化することを理解するであろう。特定の態様において、臨床医は、最適な治療効果を得るために用量を滴定し投与経路を変更し得る。典型的な用量は、上記の要因に依存して、約0.1 μg/kg〜最大約30 mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。特定の態様において、用量は、1.0 μg/kg〜最大約20 mg/kg、任意で10 μg/kg〜最大約10 mg/kgまたは100 μg/kg〜最大約5 mg/kgの範囲であり得る。
治療有効量の本発明の抗体構築物は、好ましくは、疾患症状の重篤度を低下させ、無疾患症状期の頻度もしくは持続期間を増大させ、または疾患の苦痛に起因する損傷もしくは障害を防止する。CDH19発現腫瘍の処置のために、治療有効量の本発明の抗体構築物、例えば抗CDH19/CD3抗体構築物は、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を未処置患者と比較して少なくとも約20％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％または少なくとも約90％阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効能を推測する動物モデルにおいて評価され得る。
薬学的組成物は、医療デバイスを用いて投与され得る。薬学的組成物を投与するための医療デバイスの例は、すべて参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,475,196号；同第4,439,196号；同第4,447,224号；同第4,447,233号；同第4,486,194号；同第4,487,603号；同第4,596,556号；同第4,790,824号；同第4,941,880号；同第5,064,413号；同第5,312,335号；同第5,312,335号；同第5,383,851号；および同第5,399,163号に記載されている。
1つの態様において、本発明は、黒色腫疾患または転移性黒色腫疾患の予防、処置または寛解において使用するための、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物を提供する。
本発明はまた、黒色腫疾患または転移性黒色腫疾患の処置または寛解のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体構築物または本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物を投与する工程を含む、方法も提供する。
本発明の使用の方法の好ましい態様において、黒色腫疾患または転移性黒色腫疾患は、表在拡大型黒色腫、悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫および結節型黒色腫からなる群より選択される。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体構築物もしくは本発明のプロセスにしたがい産生された抗体構築物、本発明のベクター、および／または本発明の宿主細胞を含む、キットを提供する。
本発明は、特定の方法論、プロトコルまたは試薬に限定されず、それらは変更され得ることを理解されたい。本明細書に提供される議論および実施例は、個々の態様を説明する目的で提供されるにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ定義される。
本明細書の文書を通じて引用されているすべての刊行物および特許（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造元の仕様書、説明書等を含む）は、上記のものも以下のものも、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなる事項も、本発明が先行発明であることを理由としてそのような開示よりも先の日付を主張する資格を有さないことの承認とみなされるべきではない。参照により組み入れられる書類が本明細書と相反または矛盾する程度まで、本明細書は任意のそのような書類よりも優先される。
以下の実施例は、本発明の特定の態様または特徴を説明する目的で提供される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。実施例は説明を目的として含まれるのであり、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例1 - CDH19に対する完全ヒトモノクローナル抗体
1.1 免疫：
カドヘリン-19（CDH19）に対する完全ヒト抗体は、対応するアイソタイプの完全ヒトIgGκおよびIgGλ抗体の多種レパートリーを発現するよう操作されたトランスジェニックマウスであるXENOMOUSE（登録商標）技術を用いて作製した。（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,114,598号；同第6,162,963号；同第6,833,268号；同第7,049,426号；同第7,064,244号；Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green and Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med. 188:483-495; Kellermann and Green, Current Opinion in Biotechnology 13, 593-597, 2002）。
マウスを、（1）全長ヒトおよびカニクイザル（「cyno」）カドヘリン-19、（2）分泌されるカドヘリン-19外部ドメイン（アミノ酸1〜596）および（3）短縮された膜結合形態のヒトカドヘリン-19（アミノ酸1〜624）を含む複数の形態のカドヘリン-19免疫原で免疫した。マウスを、8〜10週の期間、16〜18回の範囲のブーストを用いて免疫した。
第1回の注射からおよそ5および9週後に血清を回収し、CHO-S細胞上に一過的に発現された組み換えカドヘリン-19受容体のFACs染色によって個々の力価を決定した。特定の免疫応答を示す計37匹の動物を特定し、これらの動物を3グループに分け、抗体作製に進めた。
1.2 モノクローナル抗体の調製
適当な力価を示す動物を特定し、リンパ節を吸引することによってリンパ球を入手し、そして必要な場合、各コホートごとにプールした。リンパ球は、組織から細胞を放出させるのに適した培地（例えば、Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)；Invitrogen, Carlsbad, CAから入手可能）中での破砕によってリンパ組織から分離させ、そしてDMEM中に懸濁した。標準的な方法を用いてB細胞を選択および／または拡張し、そして当技術分野で公知の技術を用いて適当な融合パートナーに融合させた。
数日間の培養後、ハイブリドーマ上清を収集し、そして以下の実施例で詳述されている、ヒトおよびカニクイザルへの結合ならびに2次抗体・薬物コンジュゲートバイオアッセイにおいて細胞株を殺傷する能力の確認を含むスクリーニングアッセイに供した。次いで、関心対象の結合および機能的特性を有することが判明したハイブリドーマ株をさらに選択し、標準的なクローニングおよびサブクローニング技術に供した。クローン株をインビトロで拡張し、そして分泌されたヒト抗体を分析のために入手し、V遺伝子の配列決定を行った。
1.3 FMATによるカドヘリン-19受容体特異的結合抗体の選択
14日間の培養後、ハイブリドーマ上清を、フルオロメトリックマイクロボリュームアッセイ技術（FMAT）（Applied Biosystems, Foster City, CA）によりCDH19特異的モノクローナル抗体についてスクリーニングした。上清を、ヒトカドヘリン-19で一過的にトランフェクトさせた接着性のCHO細胞に対してスクリーニングし、そしてカドヘリン-19遺伝子を含まない同一の発現プラスミドで一過的にトランスフェクトさせたCHO細胞に対して反対スクリーニングした。
複数回のスクリーニングキャンペーンの後、1570個の抗カドヘリン-19結合ハイブリドーマ株のパネルを特定し、そしてさらなる特徴づけアッセイに進めた。
実施例2 - CDH19に対する完全ヒトモノクローナル抗体の評価
2.1 フローサイトメトリー（FACs）によるさらなる結合の特徴づけ
CHL-1腫瘍細胞株上で発現させた内因性カドヘリン-19受容体に対する抗カドヘリン-19受容体特異的抗体の結合を評価するため、FACS結合アッセイを行った。加えて、マウスおよびカニクイザルカドヘリン-19オルソログに対する交差反応結合も、293T細胞上に一過的に発現させた組み換え形態の様々な受容体を用いるFACsによって評価した。
FACsアッセイは、ハイブリドーマ上清を、PBS/2％ウシ胎仔血清/2mM塩化カルシウム中、4℃で1時間、10,000〜25,000細胞と共にインキュベートし、その後にPBS/2％ウシ胎仔血清/2mM塩化カルシウムで2回洗浄することによって行った。次いで細胞を、4℃でフロロクローム標識2次抗体を用いて処理し、その後に1回洗浄した。細胞を50μlのPBS/2％FBS中に再懸濁し、そしてFACSCalibur（商標）機器を用いて抗体結合を分析した。
2.2 XenoMouse（登録商標）ハイブリドーマ由来の完全ヒト抗体の抗体薬物コンジュゲートスクリーニング
抗体薬物コンジュゲートを通じた細胞殺傷は、インターナライゼーションを通じた細胞への同コンジュゲートの送達および細胞に有毒な形態への薬物コンジュゲートの異化を必要とする。これらの特性を有する抗体を同定するために、CDH19陽性細胞株（Colo-699またはCHL-1）を384ウェルプレートに低細胞密度で播種し、一晩接着させた。次いで、完全ヒト抗CDH19抗体を含むXENOMOUSE（登録商標）ハイブリドーマサンプルを、比較的低い薬物抗体比（DAR）（約1.3）でDM1にコンジュゲートされた高濃度のヤギ抗ヒトFc 1価値Fab（DM1-Fab）の存在下でこれらの細胞に添加した。この細胞を、抗体サンプルおよびDM1-Fabの存在下、37℃および5％CO2の下で96時間インキュベートした。この時間の最後に、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability試薬（Promega）を製造元の推奨にしたがい用いて細胞生存を評価した。
Colo-699細胞の細胞生存データの例が、図1および図2に示されている。DM1-Fabを細胞に送達しその細胞成長を阻害することができる抗体は、低い発光シグナル（RLU)を示す。このスクリーンからの上位の関心対象の抗体は、図1の左下角で観察され、白抜きの円で示されている。これらの抗体を、CHL-1細胞における細胞生存アッセイに進めた。CHL-1アッセイにおける平均細胞生存データが、Colo-699アッセイにおける平均細胞生存データに対してプロットされている（図2）。Colo-699およびCHL-1の両細胞に対して活性を示した抗体が、図2の左側に、白抜きの円で示されている。
このアッセイは、上記のFACs抗体結合アッセイ（2.2）と同時に行い、そしてこれらの2つの研究の結果を使用して、さらなる特徴づけのための抗体を選択した。合計で、1570個の抗体をこれらの細胞ベースの生存アッセイに供し、およそ44個の抗体をインビトロ細胞殺傷および／または抗体結合に基づきサブクローニング、V遺伝子の配列決定のために選択し、そしてそれらを以下に記載されるようにさらなる特徴づけのアッセイのために組み換え形態で発現させた。
これらの44個の抗体を、再度、実施例2のようにアッセイし、そして特有の配列を含む19個の抗体を選択した。これらの19個の抗体のうち、18個の抗体を分析し、それらの特性が以下の表2で特徴づけられている。この表のデータは、組み換えヒトおよびカニクイザルCDH-19に対するFACs結合、293/CDH-19トランスフェクト体に対する+/-カルシウム（Ca+2）結合データ、CHL-1およびColo699腫瘍細胞上の内因性CDH-19に対する結合ならびに同表で4A9として示されている抗体との競合を用いて生成された。これらの実験は、これらの抗体を5つのグループまたはビンにグループ分けするためのさらなる特徴を提供した。
（表２）抗体結合情報を用いるリードパネルのビニング
Figure 0006522517
これらの18個の抗体のうち、8個の抗体を、以下に記載されるそれらのエピトープ結合のさらなる分析のために選択した。各ビンから少なくとも1つの代表的な抗体をさらなる分析のために選択した。
実施例3 - エピトープ予測
4A9抗体競合によるおよびヒト／マウスカドヘリン-19キメラによるエピトープ予測
4A9結合と競合する抗体を同定するために、4A9結合競合法を構築した。96ウェルV底プレート（Sarstedt ＃82.1583.001）内で、50,000個の一過的にトランスフェクトされた293T細胞を、4℃で1時間、5μg/mlの精製された抗CDH19抗体と共にインキュベートし、その後にPBS/2％FBSで1回洗浄した。次いで25μlの5μg/ml Alexa647標識4A9を各ウェルに添加し、そしてプレートを4℃で1時間インキュベートした。次いで細胞を2回洗浄し、そして細胞に結合したAlexa647標識4A9の量を、フローサイトメトリーによって定量した。
本実験は、PBS/2％FBSのみからなる陰性対照を含むものとした。これらの陰性対照実験において観察された平均シグナルを、本アッセイにおいて生じ得る最大シグナルとして利用した。抗体をこの最大シグナルと比較し、各ウェルのパーセント阻害を計算した（％阻害 = (1-(抗CDH19抗体を用いた場合のFL4幾何平均／最大FL4幾何平均シグナル))）。
ドメイン結合を、ネイティブヒトまたはマウスCDH19リーダー配列およびFlagタグの直後にpTT5発現ベクターにクローニングされたマウスカドヘリン19骨格への1つまたは2つのヒトCDH19カドヘリン反復ドメインの置換からなるプラスミド（SEQ ID NO:968）で一過的にトランスフェクトされた293T細胞における上記のようなフローサイトメトリーによって決定した。本実験は、これらのヒト／マウスキメラにおけるビニングの適性を決定するためのマウスカドヘリン19に対する抗CDH19抗体のアッセイを含むものとした。これらの実験のデータが、以下のような表題を付された以下の表に示されている。
（表３）カルシウム感受性結合およびエピトープ予測の要約
Figure 0006522517
表3の注釈
ヒト（human）および／またはマウス（murine）キメラ構築物
A = huCDH19(44-772)（SEQ ID NO:944を参照のこと）
B = huCDH19(44-141)::muCDH19(140-770)（SEQ ID NO:952を参照のこと）
C = huCDH19(44-249)::muCDH19(248-770)（SEQ ID NO:954を参照のこと）
D = muCDH19(44-139)::huCDH19(142-249)::muCDH19(248-770)（SEQ ID NO:956を参照のこと）
E = muCDH19(44-139)::huCDH19(142-364)::muCDH19(363-770)（SEQ ID NO:958を参照のこと）
F = muCDH19(44-247)::huCDH19(250-364)::muCDH19(363-770)（SEQ ID NO:960を参照のこと）
G = muCDH19(44-362)::huCDH19(365-772)（SEQ ID NO:962を参照のこと）
H = muCDH19(44-461)::huCDH19(464-772)（SEQ ID NO:964を参照のこと）
I = muCDH19(44-770)（SEQ ID NO:966を参照のこと）
ヒト／ニワトリカドヘリン-19キメラによるエピトープ予測
ドメイン結合を、ネイティブヒトまたはニワトリCDH19リーダー配列およびFlagタグの直後にpTT5発現ベクターにクローニングされたニワトリカドヘリン19骨格への1つのヒトCDH19カドヘリン反復ドメインの置換からなるプラスミドで一過的にトランスフェクトされた293T細胞においてフローサイトメトリーによって決定した。本実験は、これらのヒト／ニワトリキメラにおけるビニングの適性を決定するためのニワトリカドヘリン19に対する抗CDH19抗体のサブセットのアッセイを含むものとした。
以下の結合アッセイは、2mM CaCl2の存在下で行った。96ウェルV底プレート（Costar 3897）内で、50,000個の一過的にトランスフェクトされた293T細胞を、4℃で1時間、5μg/mlの精製された抗CDH19抗体と共にインキュベートし、その後にPBS/2％FBSで2回洗浄した。次いで50μlの5μg/ml Alexa647標識抗ヒトIgG 2次抗体（Jackson Immuno 109-605-098）および2ug/ml 7AAD（Sigma A9400）を各ウェルに添加し、そしてプレートを4℃で15分間インキュベートした。次いで細胞を1回洗浄し、そして細胞に結合したAlexa647標識Abの量を、フローサイトメトリーによって定量した。本実験は、モックトランスフェクト対照を含むものとした。これらの実験のデータが、以下の表に示されている。n.d. = 決定されず。
（表４）抗体ビンCエピトープ予測の要約
Figure 0006522517
陽性結合（+）
陰性結合（-）
表4の注釈
ヒトおよび／またはニワトリ（chicken）キメラ構築物
A = huCDH19(44-772)（SEQ ID NO:944を参照のこと）
J = ckCDH19(44-776)（SEQ ID NO:1451を参照のこと）
K = huCDH19(44-141)::ckCDH19(142-776)（SEQ ID NO:1452を参照のこと）
L = ckCDH19(44-141)::huCDH19(142-249)::ckCDH19(250-776)（SEQ ID NO:1453を参照のこと）
M = ckCDH19(44-249)::huCDH19(250-364)::ckCDH19(365-776)（SEQ ID NO:1454を参照のこと）
N = ckCDH19(44-364)::huCDH19(365-463)::ckCDH19(469-776)（SEQ ID NO:1455を参照のこと）
O = ckCDH19(44-468)::huCDH19(464-772)（SEQ ID NO:1456を参照のこと）
マカク／イヌまたはラット／マカクカドヘリン-19キメラによるエピトープ予測
ドメイン結合を、ネイティブアカゲザルまたはイヌCDH19リーダー配列およびFlagタグの直後にpTT5発現ベクターにクローニングされたイヌカドヘリン19骨格へのアカゲザルCDH19カドヘリン反復ドメイン1もしくはセグメントドメイン1（EC1a、EC1b、EC1cで示される）の置換またはアカゲザルカドヘリン19骨格へのラットCDH19カドヘリン反復ドメイン2の置換からなるプラスミドで一過的にトランスフェクトされた293T細胞におけるフローサイトメトリーによって決定した。本実験は、これらのマカク／イヌおよびラット／アカゲザルキメラにおけるビニングの適性を決定するためのイヌ、ラットおよびマカクカドヘリン19に対する抗CDH19抗体のサブセットのアッセイを含むものとした。
以下の結合アッセイは、2mM CaCl2の存在下で行った。96ウェルV底プレート（Costar 3897）内で、50,000個の一過的にトランスフェクトされた293T細胞を、4℃で1時間、5ug/mlの精製された抗CDH19抗体と共にインキュベートし、その後にPBS/2％FBSで2回洗浄した。次いで50μlの5μg/ml Alexa647標識抗ヒトIgG 2次抗体（Jackson Immuno 109-605-098）および2ug/ml 7AAD（Sigma A9400）を各ウェルに添加し、そしてプレートを4℃で15分間インキュベートした。次いで細胞を1回洗浄し、そして細胞に結合したAlexa647標識Abの量を、フローサイトメトリーによって定量した。本実験は、モックトランスフェクト対照を含むものとした。これらの実験のデータが、以下の表に示されている。n.d. = 決定されず。
（表５）抗体ビンAエピトープ予測の要約
Figure 0006522517
陽性結合（+）
陰性結合（-）
決定されず（n.d.）
表5の注釈
アカゲザル（rhesus macaque）、イヌ（dog）および／またはラット（rat）キメラ構築物
P = rhCDH19(44-772)（SEQ ID NO:1457を参照のこと）
Q = caCDH19(44-770)（SEQ ID NO:1458を参照のこと）
R = rhCDH19(44-141)::caCDH19(141-770)（SEQ ID NO:1459を参照のこと）
S = rhCDH19(44-65)::caCDH19(65-770)（SEQ ID NO:1460を参照のこと）
T = caCDH19(44-87)::rhCDH19(89-114)::caCDH19(115-770)（SEQ ID NO:1461を参照のこと）
U = caCDH19(44-120)::rhCDH19(122-137)::caCDH19(137-770)（SEQ ID NO:1462を参照のこと）
V = rhCDH19(44-141)::raCDH19(140-247)::rhCDH19(250-772)（SEQ ID NO:1463を参照のこと）
W = raCDH19(44-770)（SEQ ID NO:1464を参照のこと）
表5にまとめられているデータから、ビンA 44〜141の結合体を以下のサブグループに分類することができた：
ビンA.1 44〜141
ビンA.2 44〜141（44〜114）
ビンA.3 44〜141（44〜65）
ラット／マウスまたはヒト／マウスカドヘリン-19キメラによるエピトープ予測
ドメイン結合を、ネイティブマウスCDH19リーダー配列およびFlagタグの直後にpTT5発現ベクターにクローニングされたマウスカドヘリン19骨格へのラットCDH19カドヘリン反復ドメイン3の置換（EC3a、EC3bで示される）またはヒトCDH19カドヘリン反復ドメイン3の置換（EC3cで示される）からなるプラスミドで一過的にトランスフェクトされた293T細胞におけるフローサイトメトリーによって決定した。本実験は、これらのラット／マウスおよびヒト／マウスキメラにおけるビニングの適性を決定するためのヒト、ラットおよびマウスカドヘリン19に対する抗CDH19抗体のサブセットのアッセイを含むものとした。
以下の結合アッセイは、2mM CaCl2の存在下で行った。96ウェルV底プレート（Costar 3897）内で、50,000個の一過的にトランスフェクトされた293T細胞を、4℃で1時間、5ug/mlの精製された抗CDH19抗体と共にインキュベートし、その後にPBS/2％FBSで2回洗浄した。次いで50μlの5μg/ml Alexa647標識抗ヒトIgG 2次抗体（Jackson Immuno 109-605-098）および2ug/ml 7AAD（Sigma A9400）を各ウェルに添加し、そしてプレートを4℃で15分間インキュベートした。次いで細胞を1回洗浄し、そして細胞に結合したAlexa647標識Abの量を、フローサイトメトリーによって定量した。本実験は、モックトランスフェクト対照を含むものとした。これらの実験のデータが、以下の表に示されている。n.d. = 決定されず。
（表６）抗体ビンBエピトープ予測の要約
Figure 0006522517
陽性結合（+）
陰性結合（-）
決定されず（n.d.）
表6の注釈
ラット／マウスまたはヒト／マウスキメラ構築物
A = huCDH19(44-772)（SEQ ID NO:944を参照のこと）
I = muCDH19(44-770)（SEQ ID NO:966を参照のこと）
W = raCDH19(44-770)（SEQ ID NO:1464を参照のこと）
X = muCDH19(44-323)::raCDH19(324-327)::muCDH19(328-770)（SEQ ID NO:1465を参照のこと）
Y = muCDH19(44-770)::raCDH19(290,299,308)（SEQ ID NO:1466を参照のこと）
Z = muCDH19(44-770)::huCDH19(271)（SEQ ID NO:1467を参照のこと）
表6にまとめられているデータから、ビンB 250〜364の結合体を以下のサブグループに分類することができた：
ビンB.1 250〜364
ビンB.2 表6で参照されているげっ歯類計数法で250〜364（324〜327）、ヒトおよびマカクCDH19内の残基（326〜329）に対応
実施例4 - ホットスポット／共分散変異体（covariant mutant）
合計18個の抗体を、潜在的なホットスポットおよび共分散違反（covariance violation）について分析した。（以下に示される）指定された変種は、異性化、脱アミド化、酸化、共分散違反等を減少および／または回避することができるアミノ酸置換の概略を表している。80個の改変された変種を15個の親抗体と共に、したがって合計95個の配列を、クローニング、発現および精製プロセスに進めた。部位特異的変異誘発を、96ウェルフォーマットで改変された変種に対して行った。親抗体および改変された変種を、HEK 293-6E細胞における高スループット一過的トランスフェクションを通じて発現させ、改良型AKTA自動サンプラーを用いて精製し、そして活性および生物物理学的特徴についてアッセイした。遊離（対を形成していない）CysまたはN-グリコシル化部位のいずれかを有した3個の親抗体は、このプロセスに進めなかった。それらを、その親抗体の改変版と置き換えた。指定された変種は、異性化、脱アミド化、酸化、共分散違反、免疫原性等を減少および／または回避することができるアミノ酸置換の概略を表している。これらの変種配列は本願の意図に含まれる改変抗体の例であるが、最終的な望ましい抗原結合分子または抗体に到達するために任意のコンビナトリアルな様式で一点および／または多点変異が組み合わされ得ることが理解されるであろう。
実施例5 - CDH19 mRNAの発現パターン
RNAを、腫瘍（細胞計数で＞70％の腫瘍量）または正常（細胞計数で0％の腫瘍量）を示す個々の患者組織から抽出した。TisssueLyzer（Qiagen, Valencia, CA）を用いて個々の組織をホモジナイズし、そしてmirVana総RNA抽出キット（Life Technologies, Foster City, CA）によって総RNAを抽出および精製した。RNAの質および量を、NanoDrop（NanoDrop, Wilmington, DE）分光光度計の読み取りおよびBioanalyzer RNAプロファイリング（Agilient Technologies, Santa Clara, CA）によって検査した。RNAを、DNAフリーキット（Life Technologies, Foster City, CA）を用いてDNAse処理し、そしてHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット（Life Technologies, Foster City, CA）において製造元の仕様にしたがいランダムヘキサマーを用いて逆転写した。定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を、CDH19に対するプライマー、プローブセットHs00253534_m1（Life Technologies, Foster City, CA）またはハウスキーピング遺伝子ヒトACTB
Figure 0006522517
を用いてcDNAに対して行った。10μLのqRT-PCR反応成分；1.0 ng/μLのcDNA、2 x Universal PCR Master Mix（Life Technologies, Foster City, CA）、遺伝子発現アッセイ（ACTB；75 nMプライマー、150 nMプローブ、EPOR；300 nMプライマー、250 nMプローブ）。以下のqRT-PCR増幅プログラム：（1）50℃で2分間の活性化；（2）95℃で10分間の変性；（3）95℃で15分間および60℃で1分間の増幅を40サイクル、各工程で蛍光を捕捉（ABI PRISM 7900HT Sequence Detection Systems, Applied Biosystems）。しきいサイクル値（CT）を、Sequence Detectorソフトウェアバージョン2.3（Applied Biosystems）を用いて決定し、これをACTBに対するCDH19特異的転写物の相対発現のために2-ΔCTに変換した。その結果が、図3に示されている。54個の特有の転移性および原発性黒色腫サンプルの大部分が正常組織由来のサンプルにおける発現と比較してCDH19 mRNAを過剰発現することが確認できる。
実施例6 - CDH19タンパク質の発現
CDH19タンパク質の発現を、IHCによってヒト腫瘍サンプルにおいて分析し、その結果が図4に示されている。サンプルを10％中性緩衝化ホルマリン中で24時間固定し、脱水し、パラフィン包埋した。4μm切片を切り取った。切片をまず脱パラフィン処理し、次いで抗原回復のためにDIVA Decloaker溶液（Biacore）中で40分間加熱した。残りのIHC工程は、DAKO Autostainerにおいて室温で行った。切片を、内因性ペルオキシダーゼをブロックするためにPeroxidazed 1（Biacore）と共に10分間インキュベートし、その後に非特異的バックグラウンドを減らすためにバックグラウンドスナイパー（Biacore）と共に10分間インキュベートした。切片を、5μg/mlのCDH19抗体（Novo Biologicals, カタログ＃H00028513-B01P）と共に60分間インキュベートし、次いでEnvision+ HRP抗マウスポリマー（DAKO）と共に30分間、その後にDAB+（DAKO）と共に5分間、インキュベートした。切片を、ヘマトキシリン（DAKO）を用いておよそ1分間対比染色した。CDH19発現は、試験した腫瘍の62％で検出することができた（162サンプル中101サンプルで染色強度≧1+）。腫瘍サンプルの51％は、中〜高発現を示した（162サンプル中83サンプルで染色強度2+〜3+）。CDH19は、多くのサンプルにおいて濃く明確な膜染色を示したが、いくつかの腫瘍では異質性が確認された。
実施例7 - モデル細胞株の選択
ヒト腫瘍に類似するCDH19発現を示すモデルシステムを同定するため、腫瘍細胞株をフローサイトメトリーおよびIHCによって分析した。ヒト抗huCDH19 IgG4抗体4A2を、ハイブリドーマ馴化培地から直接精製した。フローサイトメトリーのために、2 x 105個の細胞を、PEに1：1比でコンジュゲートさせた200 nMのCDH19 4A2抗体と共にインキュベートした。インキュベートおよびその後の洗浄工程は、1.2 mMカルシウムの存在下で行った。4つのレベルのPEを有するQuantiBRITE PE凍結乾燥ビーズのチューブ（BD、カタログ＃340495）を、製造元の指示にしたがい同時に調製した。このビーズを、標準曲線を生成するためにフローサイトメトリーによって分析した。次いで、FACS分析後に黒色腫株から得られたPE中央値を標準曲線に対して補正し、各細胞上の受容体数の見積もりを提供する、1細胞あたりの結合した抗体（ABC）を計算した。IHCは実施例6に記載されるようにして行い、その結果が図5に提供されている。黒色腫細胞株CHL-1は、細胞表面上に約10,000個のCDH19分子を発現し、Colo699細胞は、約5,000個の受容体を発現する。
両方の細胞株は、IHCに基づき、中〜高発現レベルを有する腫瘍を表す。A2058における発現は非常に低く、LOX細胞は検出可能なCDH19タンパク質を発現しない。
実施例8
二重特異性結合および種間交差反応
ヒトCDH19ならびにヒトおよびマカクCD3に対する結合を確認するため、二重特異性抗体を、示されている細胞株を用いるフローサイトメトリーによって試験した。ヒトCDH19でトランスフェクトされたL1.2、ヒト黒色腫細胞株CHL-1およびネイティブヒトCDH19を発現するA2058、CD3発現ヒトT細胞白血病細胞株HPB-ALL（DSMZ, Braunschweig, ACC483）ならびにCD3発現マカクT細胞株4119LnPx（Knappe A, et al., Blood, 2000, 95, 3256-3261）を、抗原陽性細胞株として使用した。さらに、未トランスフェクトL1.2細胞を、陰性対照として使用した。
フローサイトメトリーのために、各細胞株200,000細胞を、5μg/mlの濃度の精製された二重特異性抗体50μlと共に氷上で30分間インキュベートした。この細胞をPBS/2％FCS中で2回洗浄し、構築物の結合をマウスPentaHis抗体（Qiagen；50μl PBS/2％FCS中に1:20希釈）で検出した。洗浄後、結合したPentaHis抗体を、PBS/2％FCS中に1:100希釈された、フィコエリトリンにコンジュゲートされたFcガンマ特異的抗体（Dianova）で検出した。サンプルを、FACSCantoII機器においてフローサイトメトリーによって測定し、FACSDivaソフトウェア（両方ともBecton Dickinson製）によって分析した。
CDH19/CD3二重特異性抗体は、ヒトCDH19でトランスフェクトされたL1.2細胞、ヒトCDH19発現黒色腫細胞株CHL-1およびA2058ならびにヒトおよびマカクT細胞を染色した。さらに、未トランスフェクトL1.2細胞は染色されなかった（図6を参照のこと）。
実施例9
細胞毒性アッセイ
未刺激ヒトPBMCを用いたFACSベースの細胞毒性アッセイ
エフェクター細胞の単離
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、輸血用血液を収集する血液バンクの副産物である濃縮リンパ球調製物（例えば、軟膜）からFicoll密度勾配遠心分離によって調製した。軟膜は当地の血液バンクによって提供され、PBMCを採血と同日に調製した。Ficoll密度遠心分離およびDulbecco's PBS（Gibco）による十分な洗浄の後、残った赤血球を、赤血球溶解緩衝液（155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、100μM EDTA）とのインキュベートを通じてPBMCから除去した。血小板を、100 x gでのPBMCの遠心分離によって上清から除去した。残ったリンパ球は、主としてBおよびTリンパ球、NK細胞および単球を含む。PBMCは、10％FCS（Gibco）を含むRPMI培地（Gibco）中、37℃/5％ CO2下での培養で維持した。
CD14+およびCD56+細胞の枯渇
CD14+細胞の枯渇のために、ヒトCD14 MicroBeads（Milteny Biotec, MACS, ＃130-050-201）を使用し、NK細胞の枯渇のために、ヒトCD56 MicroBeads（MACS, ＃130-050-401）を使用した。PBMCを計数し、そして室温、300 x gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットをMACS単離緩衝液［80μL/107細胞；PBS（Invitrogen, ＃20012-043）、0.5％(v/v)FBS（Gibco, ＃10270-106）、2 mM EDTA（Sigma-Aldrich, ＃E-6511）］に再懸濁させた。CD14 MicroBeadsおよびCD56 MicroBeads（20μL/107細胞）を添加し、4〜8℃で15分間インキュベートした。細胞をMACS単離緩衝液（1〜2 mL/107細胞）で洗浄した。遠心分離（上記）後、上清を廃棄し、細胞をMACS単離緩衝液（500μL/108細胞）に再懸濁させた。次いでCD14/CD56陰性細胞を、LSカラム（Miltenyi Biotec, ＃130-042-401）を用いて単離した。PBMC w/o CD14+/CD56+細胞は、必要になるまで、37℃のインキュベーターにおいて、RPMI完全培地、すなわち10％ FBS（Biochrom AG, ＃S0115）、1 x 非必須アミノ酸（Biochrom AG, ＃K0293）、10 mM Hepes緩衝液（Biochrom AG, ＃L1613）、1 mMピルビン酸ナトリウム（Biochrom AG, ＃L0473）および100 U/mLペニシリン／ストレプトマイシン（Biochrom AG, ＃A2213）を補充したRPMI 1640（Biochrom AG, ＃FG1215）中で培養した。
標的細胞の標識
フローサイトメトリーアッセイにおける細胞溶解の分析のために、蛍光膜色素DiOC18（DiO）（Molecular Probes, ＃V22886）を使用して標的細胞としてヒトCDH19-を標識し、それらをエフェクター細胞から区別した。簡潔に説明すると、細胞を収集し、PBSで1回洗浄し、そして2％(v/v)FBSおよび膜色素DiO（5μL/106 細胞）を含むPBS中106 細胞/mLとなるよう調節した。37℃で3分間のインキュベートの後、細胞を完全RPMI培地で2回洗浄し、そして細胞数を1.25 x 105細胞/mLに調節した。細胞の生存を、0.5％(v/v)等張性EosinG溶液（Roth,＃45380）を用いて決定した。
フローサイトメトリーベースの分析
このアッセイは、CDH19二重特異性抗体の連続希釈物の存在下でのヒトCDH19トランスフェクトCHO細胞の溶解を定量するために設計された。
等量のDiO標識標的細胞およびエフェクター細胞（すなわち、PBMC w/o CD14+細胞）を混合してE:T細胞比を10:1とした。160μLのこの懸濁物を96ウェルプレートの各ウェルに移した。40μLの、CDH19二重特異性抗体の連続希釈物および陰性対照の二重特異性抗体（無関係の標的抗原を認識するCD3ベースの二重特異性抗体）またはさらなる陰性対照としてのRPMI完全培地を添加した。二重特異性抗体を介する細胞毒性反応は、7％CO2加湿インキュベーター中で48時間進めた。次いで細胞を新しい96ウェルプレートに移し、ヨウ化プロピジウム（PI）を1μg/mLの終濃度で添加することによって標的細胞膜の完全性の喪失をモニタリングした。PIは、通常生きた細胞から排除される膜不透過性色素であるが、死んだ細胞はそれを取り込み、蛍光放射によって同定可能となる。
サンプルを、FACSCantoII機器においてフローサイトメトリーによって測定し、FACSDivaソフトウェア（両方ともBecton Dickinson製）によって分析した。標的細胞を、Dio陽性細胞として同定した。PI陰性標的細胞を、生きた標的細胞に分類した。細胞毒性の百分率を、次式にしたがい計算した：
Figure 0006522517
GraphPad Prism 5ソフトウェア（Graph Pad Software, San Diego）を用いて、細胞毒性の百分率を、対応する二重特異性抗体濃度に対してプロットした。用量応答曲線を、一定のヒルスロープ（hill slope）のシグモイド型用量応答曲線の評価のための4パラメータロジスティック回帰モデルを用いて分析し、EC50値を計算した。その結果が図7に示されている。
実施例10
インビボ腫瘍成長阻害実験
第0日に、500万個のColo699またはCHL-1腫瘍細胞を、250万個の新しく単離された末梢血単核細胞（PBMC）と混合し、メス無胸腺ヌードマウスの左脇腹に皮下注射した。同日に、マウスを、示された用量のCDH19 BiTE 2G6または非特異的対照BiTE（MEC14）のいずれかで腹腔内処置した。投薬は、腫瘍接種後最初の10日間の間毎日継続した。
腫瘍容積および体重を、それぞれ、カリパスおよび分析用はかりを用いて週に2回測定した。
Colo699またはCHL-1腫瘍細胞を用いた実験の結果が図8および9に示されている。
実施例11
細胞毒性活性
未刺激ヒトT細胞を用いる画像化ベースの細胞毒性アッセイ
エフェクター細胞
精製されたナイーブヒトT細胞を、AllCells LLC, Alameda, USAから入手した。
画像ベースの分析
このアッセイは、T細胞を介する黒色腫細胞の溶解を測定する。3000個のA2058細胞（CDH19陽性）または2500個のLOX IMVI細胞（CDH19陰性）を、384ウェルプレートのウェルにおいて、1：10比でナイーブヒトT細胞と組み合わせる。CDH19を標的化するBiTE分子の連続希釈物および陰性対照二重特異性抗体（無関係の標的抗原を認識するCD3ベースの二重特異性抗体）の添加後、細胞を37℃で48時間インキュベートする。次に、サンプルを、全ての細胞の核を染色するために30μM Hoechst 33342でおよび死細胞を同定するために2μMヨウ化プロピジウム（PI）で2時間処理する。画像の取得および分析は、10x対物レンズを備えるThermoFisher ArrayScanにおいて行う。386nm（Hoechst 33342）および549nm（ヨウ化プロピジウム）の2つのチャンネルのデータを収集する。生きた細胞はHoechst陽性、PI陰性事象として、死細胞はHoechst陽性、PI陽性として同定する。細胞毒性の百分率は、実施例7に記載されるようにして決定する。代表的な結果が、図10に示されている。
実施例12
二重特異性結合体のドメイン特異性および生化学的親和性の決定
翻訳後修飾を欠くCDH19サブドメインの精製
当技術分野で公知の方法によって、G4Sリンカーおよびポリヒスチジンタグの直前の、メチオニン開始コドンとそれに続くCDH19サブドメインタンパク質A = huCDH19（SEQ ID NO:944の140〜367）をコードするヌクレオチド配列を、適当なpETベクターにクローニングし；サブドメインタンパク質B = huCDH19（SEQ ID NO:944の44〜367）およびC = rhCDH19（SEQ ID NO:1457の44〜367）をコードするヌクレオチド配列をpET-SUMOベクター（Life Technologies, Invitrogen）にクローニングした。各々を大腸菌（E.coli）において発現させ、可溶性フラクションから単離し、そしてHEPES緩衝化生理食塩水、3mM CaCl2、pH 8中での金属キレート親和性クロマトグラフィー、その後にアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって均質になるまで精製した。サブドメインタンパク質AはそのリンカーおよびC末端ポリヒスチジンタグを保持するが、タンパク質BおよびCのN末端のHis-SUMOタグ成分は、アニオン交換の前に、SUMOプロテアーゼ（Life Technologies, Invitrogen）による消化によって除去された。ESI LC/MSによって、すべてのタンパク質が、それらの予想される分子量を有することが決定された。以下に記載される結合実験において使用されたタンパク質を、当技術分野で公知の典型的な方法によって無作為にビオチニル化した。
翻訳後修飾されたCDH19サブドメインの精製
CDH19サブドメインタンパク質D=huCDH19（SEQ ID NO:944の44〜367）およびE=rhCDH19（SEQ ID NO:1457の44〜367）は、各アミノ酸残基1〜367をコードするヌクレオチド配列をpSURETech235bベクター（Selexis）にクローニングすることによって作製した。各々G4Sリンカーおよびポリヒスチジンタグの直前にpSURETech235bベクター（Selexis）にクローニングし、CHO-S細胞（Life Technologies, Invitrogen）にトランスフェクトし、そして安定なプールを当技術分野で公知の方法によるハイグロマイシン選択にしたがい生成した。安定なプールを拡張し、そして無血清培地中での7日間の培養後に馴化培地を収集した。上記のように、CMを、UF/DFによって、1 sq ft 10K PES Pellicon 2メンブレンを用いて5透析量（diavolume）のHEPES緩衝化生理食塩水プラスCaCl2と交換し、均質になるまで精製した。CDH19サブドメインタンパク質DおよびEは、構成リンカーおよびC末端ヒスチジンタグを保持していた。各タンパク質のN末端配列は、予想された通りG44であると決定され、精製されたタンパク質のESI LC/MSとPNGase F消化に供された同一物との比較は、NおよびO結合型の両方のグリカンの存在を明らかにした。以下に記載される結合実験において使用されたタンパク質は、当技術分野で周知に方法によって無作為にビオチニル化されたものであった。
Octetによる結合親和性決定方法
Octet RED384バイオセンサーを使用して、タンパク質・タンパク質相互作用のキネティクスおよび親和性を特徴づけた。最小限のビオチニル化処理がされたCDH19ドメイン標的タンパク質A〜Eを、この機械のストレプトアビジンチップに結合させ、分析物である二重特異性結合体タンパク質の連続希釈物を96ウェルまたは384ウェルプレート上で作製した。経験的な標的投入条件は、アッセイの進展状況から、2nmシグナルをもたらす10〜20 nM標的濃度および600秒間の投入であることが見出された。結合実験は、30 nMの開始濃度の各分析物からの6点（表7〜9）または3点（表10）1：3連続希釈物を含むプレートを設定することによって実施し、カラムあたり2つの参照ウェルは緩衝液のみを含むものとした。Octet緩衝液：10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl、+/- 1 mM CaCl2、0.13％ Triton X-100および0.10 mg/ml BSA。プレートのさらなるベースラインおよび解離ウェルにも緩衝液のみを含めた。結合方法は、以下の通りとした：ForteBio Octetストレプトアビジンチップを（1）10分間緩衝液中に浸し；（2）プレートベースラインウェルに移して5分間インキュベートし；（3）標的投入ウェルに移して10分間インキュベートし；（4）プレートベースラインウェルに移して5分間インキュベートし；（5）サンプルウェルに移して5分間（表9）または20分間（表7、8、10）インキュベートし；（6）解離ウェルに移して8.3分間（表9）または1.5時間（表7、8、10）インキュベートした。生データを、以下の様式で処理した：（a）参照チップ曲線を平均し、そしてサンプル曲線から差し引き；（b）結合および解離曲線を分離し、そしてY軸に整列させ；（c）結合および解離の中間段階（interstep）を整列させ；（d）サビッツキー・ゴーレイフィルタリングを実行してシグナルノイズを減らし；そして（e）各サンプル・標的相互作用に関して得られた結合および解離曲線のセットを、単一の1：1結合モデルとグローバルフィットさせ、結合（Ka）および解離（Kd）速度定数の測定された値を決定して、平衡解離定数KDを計算した。
（表７）翻訳後修飾を欠く単離されたヒトCDH19タンパク質ドメインに対する二重特異性結合体のドメイン特異性および生化学的親和性
Figure 0006522517
（-）陰性結合、20分結合、1.5時間解離
表7の注釈
翻訳後修飾を欠くヒトCDH19タンパク質ドメイン
A = 大腸菌から発現されたhuCDH19（SEQ ID NO:944の140〜367）
B = 大腸菌から発現されたhuCDH19（SEQ ID NO:944の44〜367）
表7に要約されるデータは、二重特異性結合体のCDH19エピトープ領域特異性を確認し、それらの相対的な親和性順位づけを可能にした。
（表８）翻訳後修飾を欠く単離されたヒトおよびマカクCDH19タンパク質ドメインに対する二重特異性結合体のカルシウムにより調整される生化学的親和性
Figure 0006522517
（-）陰性結合、20分結合、1.5時間解離
表8の注釈
翻訳後修飾を欠くCDH19タンパク質ドメイン
B = 大腸菌から発現されたhuCDH19（SEQ ID NO:944の44〜367）
C = 大腸菌から発現されたrhCDH19（SEQ ID NO:1457の44〜367）
表8に要約されるデータは、二重特異性結合体のカルシウム感受性の決定およびそれらの相対的な親和性順位づけを可能にした。データはさらに立体構造エピトープを示唆し、ビンB.1がエピトープビンA.2よりもCDH19/Ca2+結合に依存的である。
（表９）翻訳後修飾を欠く単離されたヒトおよびマカクCDH19タンパク質ドメインに対する二重特異性結合体の生化学的親和性
Figure 0006522517
1mM CaCl2、5分間結合、8.3分間解離
表9の注釈
翻訳後修飾を欠くCDH19タンパク質ドメイン
B = 大腸菌から発現されたhuCDH19（SEQ ID NO:944の44〜367）
C = 大腸菌から発現されたrhCDH19（SEQ ID NO:1457の44〜367）
表９に要約されるデータは、グリコシル化を欠くヒトおよび非ヒト霊長類CDH19ドメインに対する二重特異性結合体の相対的な親和性順位づけを可能にした。
（表１０）単離されたグリコシル化されたヒトおよびマカクCDH19タンパク質ドメインに対する二重特異性結合体のカルシウムにより調整される生化学的親和性
Figure 0006522517
（-）陰性結合、20分結合、1.5時間解離
表１０の注釈
グリコシル化CDH19タンパク質ドメイン
D = CHOにより発現されたhuCDH19（SEQ ID NO:944の44〜367）
E = CHOにより発現されたrhCDH19（SEQ ID NO:1457の44〜367）
表10に要約されるデータは、グルコシル化されたヒトおよび非ヒト霊長類CDH19ドメインタンパク質に対する二重特異性結合体のカルシウム感受性の決定および相対的な親和性順位づけを可能にした。表8のデータと比較すると、親和性は、翻訳後修飾を欠くドメインを有するものと類似する。データはさらに、立体構造エピトープを示唆し、エピトープビンB.1およびB.2がエピトープビンA.2よりもCDH19/Ca2+結合に依存的である。
実施例13
二重特異性結合および種間交差反応：
ヒトCDH19およびヒトCD3に対する結合を確認するため、二重特異性抗体を、示されている細胞株を用いるフローサイトメトリーによって試験した。ヒトCDH19でトランスフェクトされたHEK293（実施例14を参照のこと）およびCD3発現ヒトT細胞白血病細胞株HPB-ALL（DSMZ, Braunschweig, ACC483）を、抗原陽性細胞株として使用した。
フローサイトメトリーのために、各細胞株200,000細胞を、100μlのBiTE含有細胞培養上清と共に氷上で30分間インキュベートした。この細胞をPBS/2％FCS中で2回洗浄し、構築物の結合をマウス抗CD3scFv抗体（3E5.A5、Amgen； 2μg/ml PBS/2％FCSに希釈）で検出した。洗浄後、結合した抗CD3scFv抗体を、PBS/2％FCS中に1:100希釈された、フィコエリトリンにコンジュゲートされたFcガンマ特異的抗体（Dianova）で検出した。サンプルを、FACSCantoII機器においてフローサイトメトリーによって測定し、FACSDivaソフトウェア（両方ともBecton Dickinson製）によって分析した。
CDH19/CD3二重特異性抗体は、ヒトCDH19でトランスフェクトされたHEK293細胞ならびにヒトおよびマカクT細胞を染色した（図19を参照のこと）。
実施例14
細胞毒性活性
刺激されたヒトT細胞を用いるクロム放出アッセイ
エフェクター細胞の単離
ペトリ皿（145 mm径、Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster）を、37℃で1時間、終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体（OKT3、Orthoclone）でコーティングした。未結合のタンパク質を、PBSによる1回の洗浄工程により除去した。安定化型グルタミン/10％ FCS/IL-2 20 U/ml（Proleukin（登録商標）, Chiron）を含む120 mlのRPMI 1640中3〜5 x 107個のヒトPBMCをプレコートされたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。第3日に、細胞を収集し、そしてRPMI 1640で1回洗浄した。IL-2を20 U/mlの終濃度まで添加し、そして細胞を再度上記と同一の細胞培養培地中で1日培養した。
CD4+およびCD56+細胞の枯渇
CD8+細胞毒性Tリンパ球（CTL）を、Dynal-Beadsを製造元のプロトコルにしたがい用いるCD4+ T細胞およびCD56+ NK細胞の枯渇によって濃縮した。
51Cr放出ベースの分析
ヒトCDH19トランスフェクトHEK293標的細胞（作製については実施例14を参照のこと）をPBSで2回洗浄し、そして37℃で60分間、最終容積50μlの補充されたRPMI中で11.1 MBq 51Crにより標識した。その後、標識された標的細胞を5 mlのRPMIで3回洗浄し、次いでこれを細胞毒性アッセイに使用した。アッセイは、96ウェルプレートにおいて、最終容積200μlの補充されたRPMI中、10：1のE:T比で行った。開始濃度0.1〜1μg/mlの精製された二重特異性抗体およびその3倍希釈物を使用した。アッセイのインキュベート時間は、18時間とした。細胞毒性は、最大溶解（Triton-Xの添加）と自然溶解（エフェクター細胞なし）の差に対する上清中の放出されたクロムの相対値として決定した。すべての測定を4連で行った。上清中のクロム活性の測定は、Wizard 3''ガンマカウンター（Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Germany）で行った。結果の分析は、Windows版Prism 6（バージョン6.02、GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA）を用いて行った。シグモイド型の用量応答曲線から分析プログラムによって計算されたEC50値を、細胞毒性活性の比較に使用した（図20を参照のこと）。
実施例15
BiTE抗体の産生および精製
CDH19 BiTE抗体の標準化された研究規模の産生を、ローラーボトル中で行った。収集した培養上清を、ろ過後に、固定化金属親和性クロマトグラフィー（IMAC）捕捉ならびにその後のサイズ排除クロマトグラフィーまたはプロテインA捕捉およびその後のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）のいずれかに基づく2工程BiTE抗体精製に供した。
15.1 BiTE抗体のIMAC捕捉工程
Unicorn（登録商標）ソフトウェアによって制御されるAkta（登録商標）エクスプローラシステム（GE Healthcare）をクロマトグラフィーに使用した。固定化金属親和性クロマトグラフィー（IMAC）は、製造元により提供されたプロトコルにしたがいZnCl2を充填したFractogel EMDキレート（登録商標）（Merck, Darmstadt）を用いて行った。このカラムを緩衝液A（20 mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.1M NaCl、10mMイミダゾール、pH 7.2）で平衡化し、細胞培養上清（1000 ml）を4 ml/分の流速でカラム（10 ml充填容積）に適用した。このカラムを、未結合のサンプルを除去するために、緩衝液Aで洗浄した。結合したタンパク質を、以下の手順にしたがい、緩衝液B（20 mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.1M NaCl、0.5Mイミダゾール、pH 7.2）の2工程勾配を用いて溶出させた：
工程1：5カラム容積の10％緩衝液B
工程2：5カラム容積の100％緩衝液B。
工程2からの溶出されたタンパク質フラクションをさらなる精製のためにプールし、PES膜および10 kDaの分子量カットオフを有するVivaspin（Sartorius-Stedim, Gottingen-Germany）遠心分離ユニットを用いて3 mlの最終容積まで濃縮した。すべての化合物は研究等級のものであり、Merck（Darmstadt, Germany）から購入した。図11。
15.2 BiTE抗体のプロテインA捕捉
Unicorn（登録商標）ソフトウェアによって制御されるAkta（登録商標）エクスプローラシステム（GE Life Sciences）をクロマトグラフィーに使用した。プロテインAが共有結合されたビーズを含む親和性カラムを捕捉工程で使用した。このカラムを平衡緩衝液pH 7.4で平衡化し、そして細胞培養上清を投入した。未結合のサンプルを除去するために3カラム容積の平衡緩衝液で洗浄した後、結合したBiTE抗体を、pH 3.0の溶出緩衝液の投入によって溶出させた。溶出した溶液を、直ちに、フラクションコレクタのフラクションチューブにすでに含まれているトリスヒドロキシメチルアミン トリス溶液 pH 8.0によってpHを中和した。
工程2からの溶出されたタンパク質フラクションをさらなる精製のためにプールし、PES膜および10 kDaの分子量カットオフを有するVivaspin（Sartorius-Stedim, Gottingen-Germany）遠心分離ユニットを用いて3 mlの最終容積まで濃縮した。すべての化合物は研究等級のものであり、Merck（Darmstadt, Germany）から購入した。図12。
15.3 サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィーは、SEC緩衝液（20 mM NaCl、30 mM NaH2PO4、100 mM L-アルギニン、pH 7.0）で平衡化されたHiLoad 16/60 Superdex 200分取等級カラム（GE Healthcare）において、1 ml/分の流速で行った。BiTE抗体の単量体および2量体フラクションをプールし、そして24％トレハロースストック溶液を4％の最終トレハロース濃度に達するよう添加した。溶出したタンパク質サンプルを、分析のために還元型SDS-PAGEおよび抗Hisタグウェスタンブロットに供した。
タンパク質プールを、光路1 cmのポリカーボネートキュベット（Eppendorf, Hamburg-Germany）中、280 nmで測定し、そしてタンパク質濃度を、各タンパク質に対してVector NTI配列分析ソフトウェアが算出した係数に基づき計算した。
BiTE単量体プールを、さらなるBiTE製剤化緩衝液（20 mM NaCl、30 mM NaH2PO4、100 mM L-アルギニン、4％トレハロース、pH 7.0）で250μg/mlに調節した。各BiTEにつき最小600μgの量を取り、実施例16に記載されるような即時のタンパク質分析のために移動させた。
BiTE抗体単量体およびBiTE抗体2量体の残りのタンパク質プールを15および50μgタンパク質アリコートに分け、液体窒素中で急速冷凍させた。使用までのさらなる保存は、生物学的活性および親和性の測定の分析まで-80℃の冷凍庫で行った。図13。
単離されたBiTE抗体単量体の純度を、SDS-PAGEによって、＞95％と決定した。予測されたように、精製された単量体BiTE抗体は、54〜56 kDaの分子量範囲のタンパク質バンドとして表れた。図14。
実施例16
タンパク質の特性
実施例15で作製した新しく調製したBiTE単量体溶液を、以下の分析方法に適用した。
・250μg/mlおよび37℃で1週間のインキュベート後の当初単量体であったCDH19 BiTE抗体の高性能サイズ排除クロマトグラフィー（HP-SEC）
・3回の凍結／解凍サイクルによるBiTE単量体から2量体へのBiTE単量体変換およびその後のHP-SEC
・高分解分析用カチオン交換
・セファロースオクチルFFマトリックス上での疎水性相互作用クロマトグラフィー
・2500μg/mlへの濃縮およびその後の一晩の保存および濁度測定
・加熱動的光散乱測定による凝集温度TAの決定
16.1 7日間のインキュベートによるBiTE単量体から2量体への変換
250μg/mlの濃度の15μgの単量体CDH19 BiTE抗体を37℃で7日間インキュベートした。
高分解SECカラムTSK Gel G3000 SWXL（Tosoh, Tokyo-Japan）を、A905 オートサンプラーを備えるAkta Purifier 10 FPLC（GE Lifescicences）に接続した。カラム平衡化・泳動緩衝液は、pH 6.6に調節された100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4からなるものであった。7日間のインキュベート後、BiTE抗体溶液（15μgタンパク質）を平衡化したカラムに投入し、溶出を、流速0.75 ml/分、最大圧7 MPaで実施した。泳動全体を280、254および210 nmの光吸収でモニタリングした。分析は、Akta Unicornソフトウェア泳動評価シートに記録された210 nmシグナルのピーク積分によって行った。2量体含有量は、2量体ピークの面積を、単量体および2量体ピークの総面積で割ることによって計算した。図15。
16.2 3回の凍結／解凍サイクルによるBiTE単量体の2量体変換
250μg/mlの15μgの単量体BiTE抗体を、-80℃で30分間凍結し、その後に室温で30分間解凍した。3回の凍結／解凍サイクルの後、2量体含量を、実施例16.1に記載されるようにしてHP-SECによって決定した。図16。
CDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21：0.50％ 2量体含量。
16.3 高分解分析用イオン交換クロマトグラフィー
固体ビーズに連結されたスルホプロピル基を有するYMC（YMC Europe GmbH, Dinslaken-Germany）によって製造された1 ml BioPro SPカラムをAkta Micro FPLC（GE Healthcare）デバイスに接続した。
カラムの平衡化のために、水酸化ナトリウム水溶液でpH 5.5に調節された20 mMリン酸二水素ナトリウムおよび30 mM塩化ナトリウムからなるサンプル希釈・洗浄緩衝液を使用した。
溶出のために、水酸化ナトリウムでpH 5.5に調節された20 mM NaH2PO4および1000 mM NaClからなる緩衝液を使用した。
50μgのBiTE抗体単量体を希釈緩衝液で50 mlの最終容積まで希釈した。
カラムの平衡化の後、40 mlの希釈されたタンパク質溶液をカラムに投入し、その後に洗浄工程を行った。
溶出は、200カラム容積に対応する総容積のゼロから100％への溶出緩衝液の一定増加率の勾配により行った。泳動全体を280（青色線）および254 nm（赤色線）の光吸収でモニタリングした。
主要ピークの比率は、主要ピークのピーク面積を、すべての検出されたピークのピーク面積の和で割り、これに100の係数をかけることによって計算した。図17。
CDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21: 89.3％主要ピーク率。
16.4 セファロースオクチルFF
単量体BiTE抗体の溶出を、ゲル容積1 mlの疎水性相互作用クロマトグラフィーC8 セファロースオクチルFFカラム（GE Healthcare）において評価した。
50μgのBiTE抗体単量体タンパク質を緩衝液（10 mMクエン酸 - 75 mMリジン x HCl - 4％トレハロース pH 7.2）で最終容積300μlに増量した。カラムをAkta Purifier 10システム（GE Healthcare）に接続した。500μlのサンプルループをシステムに接続した。このシステムおよびカラムを泳動緩衝液（10 mMクエン酸 - 75 mMリジン x HCl - 200 mM NaCl - pH 7.2）で平衡化した。
完全サンプルをサンプルループに注入し、サンプルループの内容物をカラムに投入した。サンプル注入の後、容積10 mlの泳動緩衝液を、伝導率と共に254および280 nmの光吸収を記録しつつ0.2 ml/分の流速でカラムに投入した。図18。
CDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21：高速および完全溶出。
16.5 2500μg/mlへのBiTE単量体の濃縮およびその後の一晩の保存および濁度測定
1000μlのCDH19 BiTE単量体を、10 kDa PES膜（Sartorius-Stedim, Gottingen-Germany）を有する2つのVivaspin 500遠心分離ユニットで100μlの最終容積に濃縮した。このボリュームを冷却キャビネットにおいて5℃で一晩保管した。濁度は、340 nmの光波長吸収で3回測定した。その後、3回の測定値の平均値を計算した。
CDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21のOD340濁度：0.034
16.6 加熱動的光散乱測定による凝集温度TAの決定
容積40μlの250μg/ml単量体BiTE抗体を、使い捨てプラスチックキュベットの内側コアに移した。深部に位置する外側コアは、汎用BiTE製剤化緩衝液で満たした。サンプル加熱プロセスにおける蒸発による液体の喪失を避けるため、キュベットの上部をラバートップで封鎖した。
このキュベットをNanostar動的光散乱デバイス（Wyatt）に設置し、0.5℃/分の加温で40℃〜70℃に加熱した。
凝集状態は、全加熱プロセスで常時モニタリングおよび記録した。評価は、デバイスの製造元によって供給されたソフトウェアパッケージを用いて行った。
CDH19 BiTE CH19 2G6 302 x I2C SA21の凝集温度：52.4℃
16.7 CysLoopを有するBiTE抗体のPEG化
c末端CysLoop（方法の詳細についてはWO 2006/008096を参照のこと）を含む単量体BiTE抗体を、Tris/NaCl緩衝液pH 7.4に対して透析し、そして還元剤Tris(2-カルボキシエチル)ホスフィンTCEP（Perbio Pierce）の添加によって還元し、この時点で開環しているCysLoopの2つの還元型システインを生成した。
TCEPは、透析によって除去した。還元型システインに共有結合することができるPEGマレイミドをモル過剰で添加し、室温で3時間インキュベートした。
セファロースSPカラムカチオン交換カラム（GE Healthcare）をAkta FPLCシステムに接続し、そして結合緩衝液（pH 5.0の低モルリン酸（Phosphat）/NaCl緩衝液）を用いて平衡化した。
BiTEタンパク質がカチオン交換カラムに結合できるよう、このタンパク質溶液を、pH 5.0に調節した結合緩衝液で希釈した。未結合のPEGは、10カラム容積のさらなる結合緩衝液（binding puffer）pH 5.0を用いる洗浄工程において除去した。結合したタンパク質を、直線的に比率が増加する溶出緩衝液20 mMリン酸 1 M NaClによって溶出した。
PEG化されたBiTE抗体は、未修飾BiTE抗体と比較して低モルの溶出緩衝液で溶出した。
配列一覧：
（表Ｉａ）重鎖CDR
Figure 0006522517
Figure 0006522517
Figure 0006522517
Figure 0006522517
（表Ｉｂ）軽鎖CDR
Figure 0006522517
Figure 0006522517
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抗CDH19可変領域のアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列
（表ＩＩａ）重鎖可変領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
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（表ＩＩＢ）軽鎖可変領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
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（表ＩＩｃ）重鎖可変領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
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（表ＩＩｄ）軽鎖可変領域のアミノ酸配列
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抗CDH19可変領域および定常領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
（表ＩＩＩａ）重鎖可変領域および定常領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
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（表ＩＩＩｂ）軽鎖可変領域および定常領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
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（表ＩＩＩｃ）重鎖可変領域および定常領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
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（表ＩＩＩｄ）軽鎖可変領域および定常領域のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列
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（表ＩＶａ）重鎖CDR
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（表ＩＶｂ）軽鎖CDR
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ヒトおよびカニクイザルのカドヘリン-19配列
（表Ｖ）
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二重特異性結合分子
（表ＶＩ）
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Claims (15)

  1. 標的細胞の表面上のヒトCDH19に結合することができる第1のヒト結合ドメインおよびT細胞の表面上のヒトCD3に結合することができる第2のドメインを含む、単離された多重特異性抗体構築物であって、
    第1の結合ドメインが、以下の(1)〜(60)の組み合わせからなる群より選択されるCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3を含むVH領域ならびにCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含むVL領域を含む、
    抗体構築物：
    (1)SEQ ID NO:4に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:5に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:6に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:172に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:173に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:174に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (2)SEQ ID NO:10に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:11に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:12に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:178に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:179に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:180に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (3)SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:198に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (4)SEQ ID NO:34に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:35に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:36に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:202に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:203に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:204に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (5)SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:214に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (6)SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:59に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:60に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (7)SEQ ID NO:64に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:65に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:66に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:232に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:233に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:234に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (8)SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:71に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:72に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (9)SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:328に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (10)SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (11)SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:902に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (12)SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:903に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:924に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (13)SEQ ID NO:46に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:47に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:48に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:925に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:215に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:216に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (14)SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:907に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:72に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (15)SEQ ID NO:70に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:907に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:908に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:238に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:239に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:240に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (16)SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:901に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (17)SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:905に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:906に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (18)SEQ ID NO:58に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:905に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:60に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:226に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:227に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:228に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (19)SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (20)SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:921に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:940に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (21)SEQ ID NO:160に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:161に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:162に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:941に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (22)SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (23)SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (24)SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:901に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:922に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:923に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (25)SEQ ID NO:28に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:29に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:30に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:939に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:329に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:330に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (26)SEQ ID NO:970に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:971に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:972に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:973に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:974に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:975に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (27)SEQ ID NO:1061に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1062に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1063に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1064に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1065に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1066に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (28)SEQ ID NO:1139に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1140に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1141に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1142に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1143に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1144に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (29)SEQ ID NO:1152に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1153に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1154に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1155に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1156に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1157に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (30)SEQ ID NO:1178に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1179に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1180に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1181に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1182に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1183に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (31)SEQ ID NO:1191に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1192に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1193に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1194に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1195に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1196に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (32)SEQ ID NO:1204に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1205に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1206に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1207に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1208に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1209に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (33)SEQ ID NO:1217に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1218に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1219に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1220に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1221に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1222に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (34)SEQ ID NO:1230に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1231に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1232に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1233に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1234に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1235に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (35)SEQ ID NO:1308に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1309に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1310に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1311に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1312に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1313に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (36)SEQ ID NO:1321に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1322に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1323に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1324に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1325に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1326に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (37)SEQ ID NO:1373に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1374に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1375に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1376に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1377に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1378に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (38)SEQ ID NO:1386に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1387に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1388に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1389に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1390に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1391に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (39)SEQ ID NO:1399に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1400に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1401に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1402に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1403に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1404に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (40)SEQ ID NO:1412に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1413に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1414に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1415に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1416に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1417に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (41)SEQ ID NO:1777に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1778に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1779に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1780に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1781に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1782に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (42)SEQ ID NO:1790に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1791に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1792に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1793に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1794に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1795に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (43)SEQ ID NO:1803に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1804に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1805に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1806に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1807に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1808に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (44)SEQ ID NO:1816に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1817に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1818に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1819に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1820に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1821に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (45)SEQ ID NO:1829に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1830に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1831に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1832に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1833に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1834に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (46)SEQ ID NO:1842に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1843に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1844に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1845に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1846に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1847に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (47)SEQ ID NO:1855に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1856に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1857に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1858に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1859に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1860に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (48)SEQ ID NO:1868に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1869に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1870に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1871に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1872に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1873に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (49)SEQ ID NO:1881に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:1882に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:1883に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:1884に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:1885に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:1886に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (50)SEQ ID NO:2063に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2064に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2065に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2066に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2067に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2068に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (51)SEQ ID NO:2076に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2077に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2078に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2079に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2080に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2081に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (52)SEQ ID NO:2089に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2090に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2091に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2092に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2093に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2094に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (53)SEQ ID NO:2102に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2103に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2104に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2105に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2106に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2107に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (54)SEQ ID NO:2115に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2116に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2117に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2118に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2119に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2120に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (55)SEQ ID NO:2128に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2129に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2130に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2131に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2132に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2133に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (56)SEQ ID NO:2141に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2142に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2143に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2144に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2145に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2146に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (57)SEQ ID NO:2154に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2155に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2156に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2157に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2158に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2159に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (58)SEQ ID NO:2180に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2181に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2182に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2183に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2184に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2185に示されるCDR-L3の組み合わせ、
    (59)SEQ ID NO:2193に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2194に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2195に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2196に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2197に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2198に示されるCDR-L3の組み合わせ、ならびに
    (60)SEQ ID NO:2206に示されるCDR-H1、SEQ ID NO:2207に示されるCDR-H2、SEQ ID NO:2208に示されるCDR-H3、SEQ ID NO:2209に示されるCDR-L1、SEQ ID NO:2210に示されるCDR-L2およびSEQ ID NO:2211に示されるCDR-L3の組み合わせ。
  2. 第1の結合ドメインが、
    Figure 0006522517
    に示されるVH領域からなる群より選択されるVH領域を含む、請求項1記載の抗体構築物。
  3. 第1の結合ドメインが、
    Figure 0006522517
    に示されるVL領域
    からなる群より選択されるVL領域を含む、請求項1または2記載の抗体構築物。
  4. 第1の結合ドメインが、
    Figure 0006522517
    に示されるVH領域およびVL領域の対からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体構築物。
  5. (scFv)2、(単一ドメインmAb)2 、ダイアボディおよびそれらのオリゴマーからなる群より選択される形態である、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体構築物。
  6. 第1の結合ドメインが、
    Figure 0006522517
    に示されるもの
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項5記載の抗体構築物。
  7. 第2の結合ドメインが、ヒトの、およびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus Oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）のCD3イプシロンに結合することができる、請求項1〜6のいずれか一項記載の抗体構築物。
  8. Figure 0006522517
    に示されるもの
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項7記載の抗体構築物。
  9. 請求項1〜8のいずれか一項に定義される抗体構築物をコードする、核酸分子。
  10. 請求項9に定義される核酸分子を含む、ベクター。
  11. 請求項9に定義される核酸分子または請求項10に定義されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
  12. 請求項1〜8のいずれか一項に定義される抗体構築物の発現を可能にする条件下で請求項11に定義される宿主細胞を培養する工程、および、産生された抗体構築物を培養物から回収する工程を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体構築物の産生のためのプロセス。
  13. 請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体構築物または請求項12記載のプロセスにしたがい産生された抗体構築物を含む、薬学的組成物。
  14. 黒色腫疾患または転移性黒色腫疾患の予防、処置または寛解において使用するための、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体構築物または請求項12記載のプロセスにしたがい産生された抗体構築物。
  15. 請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体構築物もしくは請求項12記載のプロセスにしたがい産生された抗体構築物、請求項10に定義されるベクター、および／または請求項11に定義される宿主細胞を含む、キット。
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