TW201219570A - Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton - Google Patents

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201219570 六、發明說明： C 明戶斤屬1 技術領域 本發明係關於一種抑制基因表現之單股核酸分子，更 詳而言之，則是關於一種具有含氮脂環骨架之單股核酸分 子、含有其之組成物及其用途。
Γ ^tr J 背景技術 就抑制基因表現之技術而言，舉例來說，已知有11]^八 干擾(RNAi)(非專利文獻1)。舉例而言，RNA干擾所致之抑 制基因表現一般是藉由將短雙股之RN A分子投予細胞等來 實施。前述雙股RNA分子通常被稱為siRNA(smau interfering RNA)。此外’有報告指出，透過屬環狀RNA分 子且因分子内黏著(anneal)而部分形成雙股之rna分子，亦 可抑制基因表現(專利文獻1)。然而，在此等手法中，誘導 抑制基因表現之RNA分子具有如下述般之問題。 首先，製造前述siRNA時，必須具備一先分別合成出正 意股及反意股，最後使此等股進行雜交之步驟。因此而有 製造效率不佳之問題。此外’將前述siRNA投予細胞時，必 須在抑制朝單股RNA解離之狀態下投予至細胞，因此其處 理條件之設定亦需煞費勞力。其次，在環狀RNA分子之情 況下’還有其合成甚是困難之問題。 此外’此等RNA分子基本上係由核苷酸殘基構成。而 欲賦予前述RNA分子某些機能或標記時，就現狀而言，舉 3 201219570 例來說’ μ對核㈣祕構成要素德基、糖殘基或碟 酸基施加修飾。因此，在·RNA干擾n等的開發 過私中，要在維持基因表現抑制機能之狀態下進行用來賦 予更多機能或標記之改變，是極其困難的。 先行技術文獻 非專利文獻 【非專利文獻 1】Fire et al·, Nature, 1998 Feb 19 ; 391(6669) ： 806-11. 專利文獻 【專利文獻1】美國專利公開公報2〇〇4_〇58886 【明内容j 發明概要 因此，本發明之目的在於提供一種可抑制基因表現之 新穎核酸分子，其可藉容易且有效率之製造方法來製造。 為了達成前述目的，本發明之核酸分子係一種單股核 酉欠为子，其含有抑制目標基因表現之抑制表現序列序列， 且特徵在於：包含區域(X)、連結區域(Lx)及區域(Xc) ’前 述區域(X)與前述區域(Xc)之間連結有前述連結區域(Lx)， 前述區域(X)及前述區域(Xc)中之至少一者含有前述抑制表 現序列，前述連結區域(Lx)具有非核苷酸結構，且該非核 苷酸結構含有吼咯啶骨架及哌啶骨架中之至少一者。 本發明之組成物係用以抑制目標基因表現之組成物， 其特徵在於含有前述本發明之單股核酸分子。 本發明之組成物為藥學組成物，其特徵在於含有前述 201219570 本發明之單股核酸分子。 本發明之抑制表現方法係一種抑制目標基因表現之方 法，其特徵在於使用前述本發明之單股核酸分子。 本發明之疾病治療方法之特徵在於：包含一將前述本 發明之單股核酸分子投予患者之步驟，前述單股核酸分子 具有-抑制基因表現之序列，且該基因為前述疾病之成因。 本發明之單股核酸分子可抑制基因之表現，因非黑環 狀’其合成甚是容易；且因其為單股，無需雙股之黏合步 驟，可效率良好地進行製造。此外，由於前述連結區威含 有前述非核普酸殘基，舉例來說，可不受限於如同習知技 術般之核苦酸殘基改變’例如，亦可作前述連結區域中之 修飾等的改變。 此外’本發明之單股核酸分子之結構可抑制基因表現 -事係由本案發明人所首先發現者。本發明之單股核酸分 子抑制基因表現之效果雖推_由與RNA干擾同樣之現象 所引起，但本發明之基因表現抑制並不受限且不限定於 RNA干擾。 圖式簡單說明 第1(A)至1(B)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子之 一例0 第2(A)至2(B)圖為模式圖，顯示本發明之翠股核酸分子之 另一例。 第3(A)至3(D)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子之 其他例。 201219570 第4圖為圖表，顯示本發明實施例之GApDH基因表現量相 對值。 第5圖為電泳照片，顯示本發明實施例之安定性。 第6圖為圖表’顯示本發明實施例之GApDH基因表現量相 對值。 第7圖為電泳結果，顯示截切蛋白f(Dieer p論⑹對於本 發明實施例之ssRNA的反應性。 第8圖為圖表，顯示本發明實施例之A549細胞的GApDi^ 因表現量相對值。 第9圖為圊表，顯示本發明實施例之293細胞的GApDH基因 表現量相對值。 第ίο圖為圖表，顯示本發明實施例之HCTl 16細胞的 GAPDH基因表現量相對值。 第11圖為圖表’顯不本發明實施例之HCT116細胞的 GAPDH基因表現量相對值。 第η圖為圖表’顯示本發明實施例之TGF_pi基因表現量相 對值。 第13圖為圖表’顯示本發明實施例各投予群之每單位重量 之肺的TGF-βΙ基因表現量。 第14(A)圖為圖表，顯示本發明實施例各投予群之狐罐 本中之TNF-ct量’第M(B)圖為圖表，顯示本發明實施例各投予 群之BALF樣本中之iFN-β量。 第15圖為電泳照#’顯示本發明實施例之核糖核酸酶时 201219570 第16圖為電泳照片’顯示本發明實施例之87核酸酶耐性。 第17圖係一顯示參考例所用ssRNA之圖。 第18圖為圖表，顯示參考例之GAPDH基因表現量相對值。 第19圖為圖表’顯示參考例之TGF_pi基因表現量相對值。 第20圖為圖表’顯示參考例之LAMA基因表現量相對值。 第21圖為圖表，顯示參考例2L_A基因表現量相對值。 第22圖係一顯示參考例所用ssRNA之圖。 第23圖為圖表’顯示參考例之GAPDH基因表現量相對值。 【實方私方式3 本發明之實施型態 本說明書所使用之用語只要未特別提及，即可使用所 屬技術領威通常使用之意義。 l.ssPN分王 如前所述’本發明之單股核酸分子係一種含有可抑制 目標基因表現之抑制表現序列的單股核酸分子，其特徵在 於：包含區域(X)、連結區域(Lx)及區域(xc)，且前述區域 (X)與前述區域(Xc)之間連結有前述連結區域(Lx)，前述區 域(X)及前述區域(XC)中之至少—者含有前述抑制表現序 列’前述連結區域(Lx)則具有非核苷酸結構，該非核苷酸 結構含有°比咯啶骨架及旅啶骨架中之至少一者。 於本發明中，舉例來說，「抑制目標基因表現」意指 抑制前述目標基因之表現。前述抑制之機制並未特別受 限’舉例而言’可為調降（down-regulation)或靜默 (silencing)。前述目標基因表現之抑制，舉例而言，可透過 201219570 :=述目標基因之轉錄產物生成量減少、前述轉錄產物 t述=源自前述目標基因之轉譯產物生成量減少或是 =°物活性減少等予以確認。舉例來說，前述蛋白 ::二::成热蛋白質、或是經處理(pr°cessing)或轉譯後 接又I飾則之前驅蛋白質。
八、 發明之單版核酸分子亦稱為本發明之「ssPN +例來说，由於本發明之3洲分子可在活體内⑼ ㈣外(ln —则於抑制目標基因表現因此亦 '、用於抑制目標基因表現之ssPN分子」戍「目;)：#芙因 表現抑_」。❹卜，舉說，本發明之ssPN分子;：絲 RNA干擾來抑制前述目標基因表現因此亦稱為「諷干 擾用ssPN分子」、「疆干擾誘導用洲分子」、「腿干擾 劑或RNA干擾誘導劑」。再者，舉例來說，本發明之sspN分 子了抑制干擾素誘導(interfer〇n induction)等之副作用。 本發明之SSPN分子的5,端未與3,端連結，亦可稱為線狀單 股核酸分子。 本發明之ssPN分子中’舉例來說，在本發明之ssPN分 子於活體内或活體外之條件下導入細胞内時’前述抑制表 現序列係一會顯示出抑制前述目標基因表現之活性的序 列。刖述抑制表現序列並未特別受限，可因應目的之目標 基因種類來適當設定。舉例來說，前述抑制表現序列可適 當地運用與siRNA所致RNA干擾相關之序列。一般而言， RNA干擾為下述現象：長雙股RNA(dsRNA)在細胞内透過截 切器（Dicer)而被截斷成3’端突出之19〜21鹼基對程度的雙 8 201219570 股RNA(siRNA : small interfering RNA)，其中 __ 單股RNA 與目標mRNA結合，藉由分解前述灿财來抑制前述流撤 之轉譯。舉例來說，與前述目標mRNA結合之前述siRNA 中’單股RNA之序列依目標基因之種類而異，已有各種受 到報告。於本發明中，舉例而言，可將前述siRNA之單股 RNA序列用作前述抑制表現序列。 另，本發明#重點並非在於針對前述目標基因之前述 抑制表現序列的序列資訊，而是關於一種核酸分子之結 構，該核酸分子係用以使前述抑制表現序列所產生之抑制 刖述目標基因表現的活性在諸如細胞内發揮機能。因此， 於本發明中，舉例而言，除了在中請時已屬習知之前述 siRNA的單股RNA序列之外，即便是關於將來才會明朗化 之序列，亦可作為前述抑制抑制表現序列來予以利用。 舉例來說，前述抑制表現序列相對於前述目標基因之 預定區域宜具有90%以上之互補性，且宜為95%，更宜為 98%，而以1〇〇%尤佳。藉由滿足此種互補性舉例來說， 可使脫靶(off-target)情況充分減少。 作為具體例，在目標基因為GAPDH基因時，前述抑制 表現序列可使用例如序列編號4所示19個鹼基長之序列；目 標基因為TGF-βΙ時，前述抑制表現序列可使用例如序列編 號6所示21個鹼基長之序列；目標基因為LAMA1*因時， 前述抑制表現序列可使用例如序列編號6所示19個鹼基長 之序列，目b基因為LMNA基因時，可使用序列編號3 〇所 示19個鹼基長之序列。 9 201219570 5’-GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3，（序列編號 4) 5’-AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3，（序列編號 18) 55-AUUGUAACGAGACAAACAC-35 (序列編號 6) 5,-UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3,(序列編號 30) 推測本發明之SSPN分子所致前述目標基因表現之抑制 係因例如RNA干擾所引起。此外，本發明並不受此機制所 限制。舉例來說，本發明之SSPN分子並非如所謂之siRNA 般以兩條單股RNA所構成之dsRNA形式來導入細胞，此 外’在細胞内未必需要前述抑制表現序列之切斷。因此， 舉例來說’亦可謂本發明之SSPN分子具有類RNA干擾之機 於本發明之ssPN分子中，舉例來說，前述連結區域(Lx) 可具有含前述吡咯啶骨架之非核苷酸結構，亦可具有含前 述哌啶骨架之非核苷酸結構，亦可具有含前述吡咯啶骨架 之非核苷酸結構與含前述哌啶骨架之非核苷酸結構兩者。 舉例來說，本發明之ssPN分子可抑制活體内之干擾素誘導 等副作用，且具有優異之核酸酶耐性。 於本發明之ssPN分子中，舉例來說，前述吡咯啶骨架 亦可為構成鱗咬之5員環的碳有_以上經取代而成之。比 略㈣生物骨架，且在取代時，舉例來說，宜為C-2之碳以 外的碳原子。舉例來說’前述碳亦可經氮、氧或硫取代。 舉例而言，前述鱗。定骨架亦可在十各。定之5員環内含有碳 碳雙鍵或碳-氮雙鍵。於前収_#架中，舉例來說 成料奴5員環的碳及氮可與氫鍵結，亦可與後述之取代 10 201219570 基鍵結。則述連結區域(Lx)亦可透過例如前述π比咯啶骨架 中之任-基而與前舰域(X)及前魏域(Xe)結合且宜為 前述5員環中之任1個碳原子與氮，更宜為前述5員環之2位 碳(C-2)與氮。前述吡咯啶骨架可列舉如脯胺酸(pr〇iine)骨 架及脯胺醇(piOlinol)骨架等。舉例來說，前述脯胺酸骨架 及脯胺醇骨架等由於是活體内物質及其還原物，在安全性 上亦優異。 於本發明之ssPN分子中，舉例來說，前述哌啶骨架亦 "T為構成派°疋之6員ί哀的碳有1個以上經取代而成之派。定衍 生物骨架，且在取代時’舉例來說宜為C_2之碳以外的碳原 子。舉例來說’前述碳亦可經氮、氧或硫取代。舉例而言， 前述派啶骨架亦可在哌啶之6員環内含有碳-碳雙鍵或碳_氮 雙鍵。於前述哌啶骨架中，舉例來說，構成哌啶之6員環的 碳及氮可與氫基鍵結，亦可與如後述之取代基鍵結。舉例 來說’前述連結區域(Lx)可透過前述哌啶骨架中之任一基 而與前述區域(X)及前述區域(Xc)結合，且以前述6員環中之 任一碳原子與氮為佳，更宜為前述6員環之2位碳(C-2)與氮。 舉例來說，前述連結區域可僅含有由前述非核苦酸結 構所構成之非核苷酸殘基，亦可含有由前述非核苷酸結構 所構成之非核苷酸殘基以及核苷酸殘基。 於本發明之ssPN分子中，舉例來說，前述連結區域係 以下述式(I)表示。 【化1】 201219570 R3
前述式(I)中，舉例來說， 各自獨立為H2、〇、S或NH ; 3及¥各自獨立為單鍵、CH2、NH、〇或S ; R係與上之C-3、C-4、C-5或C-6鍵結之氫原子或取 代基； 係由η個原子構成之伸烧基鍵 ，於此，伸烧基碳原子 之氫原子可經〇H、〇Ra、肌、NHRa、NRaRb、阳或把 取代或是非經取代，或者， L為則述伸烷基鏈中之1個以上碳原子經氧原子取代 而成之聚鏈； 1但，Y1為NH、〇或S時，與γι鍵結之Li的原子為碳，與 鍵、、。之L的原子為碳，且氧原子彼此不鄰接；
L係由〇1個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原子 上之氫原子可經OH、〇Rc、Nh2 ' NHRe、NRCRd、SH4SrC 取代或是未經取代，或者， 2 L為則述伸烷基鏈之丨個以上碳原子經氧原子取代而 成之聚驗鏈， 但Y2為NH、〇或S時，與Y2鍵結之L2的原子為碳，與 OR鍵結之L2的原子為碳，氧原子彼此不鄰接； 12 201219570 R、Rb、Re及“各自獨立為取代基或保護基； 1為1或2 ; m為0〜3〇範圍内之整數； η為0〜30範圍内之整數； %八中，前述環八上之c_2以外的丨個碳原子亦可經氮、 氧或硫取代， 於前述環A内’亦可含有碳_碳雙鍵或碳_氮雙鍵， 刚述區域(Yc)及前述區域(γ)各自透過_〇Rl或_〇R2_而 與前述連結區域(Ly)結合， 於此，R及R2可存在亦可不存在，且存在時，r1&r2 各自獨立為料酸殘基或前述結構⑴。 於前述式⑴中，舉例來說，Χ^χ2各自獨立為H2、〇、 或NH於則述式⑴中，χ、Η2意指乂丨與义所鍵結之碳原 子共同形成CH2(亞甲基）。\2亦是相同。 於前述式⑴中，γ1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、 〇或S。 二述式(I)中，私中，1為1或2。1=1時，環人為5員環， 2為剛核㈣骨架。前述鱗咬骨架可列舉如捕胺酸 二架及、脯，骨架等’可例示如其等之二價結構。Η時， %八為6員被’例如為前述旅咬骨架。環A中，環A上之C 2 以㈣丨個碳原子亦可經1、氧或硫取代。此外，環八亦可 =内含有碳·碳雙鍵或碳·氮雙鍵。舉例來說，環人可壯 尘及〇型中之任一者。 於前述式附，R3為與環A上之c_3、c+c w_6 13 201219570 鍵結之氫原子或取代基。R3為前述取代基時，取代基尺3可 為1或多數個，亦可不存在；有多數個時，可相同亦可不同。 舉例來說’取代基R3為鹵素、OH、OR4、NH2、NHR4、 NR4R5、SH、SR4或側氧基(=〇)等。 舉例來說，R4及R5各自獨立為取代基或保護基，且可 相同亦可不同。前述取代基可列舉如_素、烷基、烯基、 炔基、_烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、 %烷基烷基、環基烷基(cyc丨ylalkyl)、羥基烷基、烷氧基烷 基、胺基烷基、雜環基烯基、雜環基烷基、雜芳基烷基、 矽基及矽氧烷基等。以下相同。取代基尺3亦可為此等列舉 之取代基。 舉例來說，前述保護基係將反應性較高之官能基轉換 成不活性之官能基，可列舉如習知之保護基等。前述保護 基可援用例如文獻(J_ F_ W. McOmie，「Protecting Groups in Organic Chemistry」Prenum Press，London and New York， 1973)之記載。前述保護基並未特別受限，可列舉如第三 丁基一甲基矽基(TBDMS)、雙(2_乙醯氧基乙基氧基）甲基 (ace)、三異丙基矽氧基甲基(T〇M)、丨_(2_氰基乙氧基）乙 基(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)及曱苯磺醯基乙氧基甲 基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。尺3為〇尺4時，前述 保護基並未特別受限’可列舉如TBDMS基、ACE基、TOM 基、CEE基、CEM基及TEM基等。此外，亦可列舉如後述[化 5]之含矽基的基團。以下相同。 於前述式(I)中，L1係由n個原子構成之伸烷基鏈。舉例 201219570 來說，前述伸烷基碳原子上之氫原子可經〇H、〇Ra、NH2、 NHR、NRRb、SH或SRa取代，亦可不經取代。此外，l1 亦可為前述伸《狀丨仙切料經㈣子取代而成 之聚醚鏈。舉例來說’前述聚醚鏈為聚乙二醇。此外，γ1 為ΝΗ、〇或S時，與γι鍵結之L1的原子為碳與〇R,鍵結之 L的原子為碳’且氧原子彼此不鄰接。亦即，舉例來說， Y為Ο時’其氧原子與Li之氧原子不鄰接，且⑽之氧原子 與L之氧原子不鄰接。 "…Λ·了、丁W構成之伸烷基鏈。舉例 來說，前述伸烧基碳原子上之氫原子可經〇H、〇Re、νη2、 曹 直、峨d、SH練取代，亦可不經取ι或者，l2 亦可為前述㈣基鏈之丨㈣上碳料經氧原子取代而成 之聚晴。另外，γ2細、〇或8時，與Y2鍵結之L2的原子 為碳嚴與⑽鍵結之l2的原子為碳，氧原子彼此不鄰接。亦 即，舉例來說，Y2為〇時，i氧 Ί原子與l2之氧原子不鄰接， 氧原子與L之氧原子不鄰接。 PMT不特:L之1"1並無特抑限，各自之下限例如為0,上 限亦不特別受限。舉例來說，级啊 、 之所欲長度來適當設定。舉例來雙，=34連結區域(Lx)
觀點來看，nh各自則，為宜，_ t料本及收率等 Λ 1C 句且且更宜為0〜20，尤宜A 〜。n*m可相同（n=m)亦可不同。舉 *、、 _，且宜為〇〜2〇，更宜為〇〜15。例來說，…為 某。=而言，R:Rb、R。及Rd各自獨立為取代基或保護 土月卜取代基及則边保護基例如與前述相同。 15 201219570 别述式⑴中’舉例來說，氫原子亦可各自獨立經α、 Br、F及I等之_素取代。 舉例來說’前述區域(Xc)及前述區域(χ)分別透過_〇]^_ 或_〇R2-而與前述連結區域(Lx)結合。於此，Ri及R2可存在 亦可不存在。Ri及R2存在時，Ri及r2各自獨立為核苷酸殘 基或刚述式(I)之結構。R1及/或R2為前述核苷酸殘基時，舉 例來楗，前述連結區域(Lx)係由前述非核苷酸殘基與前述 核苷酸殘基所構成，且該非核苷酸殘基係由核苷酸殘基R| 及/或尺2除外之前述式⑴結構所構成。R1及/或R2為前述式⑴ 之結構時，舉例來說，前述連結區域(Xc)會成為連結有2個 以上前述式(I)結構所構成之前述非核苷酸殘基的結構。舉 例來說，前述式(I)之結構亦可含有丨個、2個、3個或4個。 如前述般含有多數個前述結構時，舉例來說，前述⑴之結 構可直接連結，亦可透過前述核苷酸殘基而結合。另一方 面，R及R2不存在時，舉例來說，前述連結區域①”可僅 由則述式(I)結構所構成之前述非核苷酸殘基形成。 前述區域(Xc)及前述區域(X)與_〇Ri_及_〇R2_之結合的 組合並未特別受限，舉例來說，可列舉如以下任一條件。 條件（1) 前述區域(Xc)透過-OR2-且前述區域(χ)透過_〇Rl_與前 述式(I)之結構結合。 條件(2) 前述區域(Xc)透過-OR1-且前述區域(X)透過_〇r2與前 述式(I)之結構結合。 16 201219570 前述式(I)之結構可例示如下述式（1-1)〜式(1-9)，於下述 式中，η及m與前述式（I)相同。於下述式中，q為0〜10之整 數。 【化2】
17 201219570 前述式（1-1)〜(1-9)中，η、m及q並未特別受限而如前所 述。具體例則可列舉如：前述式(1-1)中，n=8 ;前述(1-2)中， n=3 ;前述式(1-3)中，n=4或8 ;前述(1-4)中，n=7或8 ;前述 式(1-5)中，n=3及m=4 ;前述(1-6)中，n=8及m=4 ;前述式(1-7) 中，n=8及m=4 ;前述(1-8)中，n=5及m=4 ;前述式(1-9)中， q=l及m=4。茲將前述式（1-4)之一例（n=8)顯示於下述式 (I-4a)，並將前述式（1-8)之一例（n=5、m=4)顯示於下述式 (I-8a)。 【化3】
於本發明之ssPN分子中，前述區域(Xc)與前述區域(X) 互補。因此，於本發明之ssPN分子中，前述區域(Xc)朝向 前述區域(X)回折，且前述區域(Xc)與前述區域(X)可透過自 黏合而形成雙股。本發明之ssPN分子係如前所述般可於分 子内形成雙股，舉例來說，與習知之透過已分離之2條單股 RNA黏合而形成雙股RNA者（諸如使用於RNA干擾之 siRNA)結構明顯不同。 18 201219570 舉例來說，本發明之ssPN分子可僅有前述區域(χ幻回 折而與前述區域(X)形成雙股，亦可更於其他區域形成新的 雙股。以下，將前者之ssPN分子（即丨處形成雙股之分子)稱 為「第一ssPN分子」’將後者之ssPN分子（即2處形成雙股之 分子）稱為「第二ssPN分子」。以下，就前述第一沾分子 及前述第二ssPN分子予以例示，但本發明並不侷限於此。 (1)第一 ssPN分子 舉例來說，前述第ιΡΝ分子係由前述區域(χ)、前述 區域(Xc)及前述連結區域(Lx)所構成之分子。 前述第一 ssPN分子舉例來說可從5,端側至3,端側依序 具有前述區域(Xe)、祕連結區域(Lx)及前述區域(χ)，亦 可從3’端側至5,端難序具有前賴域(Xe)、前述連結區域 (Lx)及前述區域(X)。 於前述第-ssPN分子中，前述區域(Xc)與前述區域(χ) 互補。於此，前述區域(Xc)僅需具有與前述區域(χ)之全區 域或其部純域互補之序浙可，且宜含有與前述區域(χ) 之全區域或其部分W互補之序列，《是由前述互補之序 列所構成。舉例來說，前親域(Xe)對於與前述區域(χ)互 補之前述全區域或前述部分區域可為完全互補，亦可有㈠固 或數個驗基非為互補，但以完全互補為宜。舉例來說，前 述1個驗基紐㈣基為丨〜场基，且宜仙崎基或2個驗 基。 於前述第-ssPN分子中’前述抑制表現序列係如前述 般，包含在前述區域(Xc)及前述區域(χ)中之至少一者。舉 201219570 1個前述抑制表現序列， 例來說，則述第一 SSPN分子可具有 亦可具有2個以上。 在後者的情況下，舉例來說，前述第-咖分子可具 有2個以上針對相同目標基 相同抑制表現序列，亦可具 有2個以上針對相同目標之不同抑制表現序列也可具有2 個以上針對不同目標基因之不同抑制表現序列。前述第- 洲分子具有2個以上之前述抑制表現序列時，各抑制表現 序列之配置處並未_受限，可料述區域(X)及前述區域 ()中之任區域，亦可為不同之區域。前述第一 sspN分 子具有2個以上針董+不问g 卞不门目k基因之前述抑制表現序列 時舉例來》兒，可藉由前述第一SSPN分子來抑制2種以上之 不同目標基因的表現。 纽將刖述第一 sspN分子之一例顯示於第丨圖之模式 圖。第1(A)圖係-模式圖，其就前述sspN分子顯示各區域 順序之概略來作為一例；第丨⑺）圖係一模式圖，其顯示前 述ssPN分子在前述分子内形成雙股之狀態。如第1(B)圖所 示’前述ssPN分子係於前述區域(Xc)與前述區域之間形 成雙股’且前述Lx區域因應其長度而採迴圈（丨〇〇p)結構。第 1圖只不過是用以顯示前述區域之連結順序及形成雙股之 各區域的位置關係者’舉例來說，各區域之長度及前述連 結區域(Lx)之形狀等均不受其限制。 前述第一ssPN分子中，前述區域(xc)及前述區域(X)之 驗基數並未特別受限。茲將各區域之長度例示於下，但本 發明並不受其限制。於本發明中，舉例來說，「鹼基數」意 20 201219570 指「長度」’亦可稱為「驗基長」。於本發明中，舉例來說， 鹼基數之數值範圍係揭示隸屬於該範圍之所有正整數，以 具體例而言’「1〜4驗基」之記載意指「1、2、3、4驗基」之全 部揭示内容（以下相同）。 舉例來說，前述區域(Xc)亦可與前述區域(X)之全區域 完全互補。此時，舉例來說，意指前述區域(Xc)s由與前 述區域(X)從5’末端至3,末端之全區域互補的鹼基序列所構 成，亦即，意味著前述區域(Xc)與前述區域(X)為相同鹼基 長，且前述區域(Xc)之全部鹼基與前述區域(X)之全部驗基 互補。 此外，舉例來說，前述區域(Xc)亦可與前述區域(X)之 部分區域完全互補。此時，舉例來說，意味著前述區域(Xc) 係由與前述區域(X)之部分區域互補的鹼基序列所構成，亦 即’意味著前述區域(Xc)係由鹼基長較前述區域(乂)短丨個鹼 基以上之鹼基序列所構成’且前述區域(Xc)之全部鹼基與 前述區域(X)之前述部分區域的全部鹼基互補。舉例來說， 前述區域(X)之前述部分區域宜為下述鹼基序列所構成之 區域：前述區域(X)中’以前述區域(Xc)側之末端鹼基（第i 個驗基)為始連續下來的鹼基序列。 於前述第一ssPN分子中，舉例來說，前述區域(X)之鹼 基數(X)與前述區域(Xc)之鹼基數(xc)的關係滿足下述(3) 或(5)之條件，且在前者之情況下，具體來說，例如滿足下 述（11)之條件。 x>Xc ... (3) 21 201219570 (Π) X〇CC=卜1〇,且宜為卜2或3,更宜為⑷ X=Xc · . . (5) 前述區域(X)及/或前述區域(Xe)含有前述抑制表現序 列時’舉例來說’前述區域可為僅由前述抑制表現序列所 構成之區域，亦可為含有前述抑制表現序列之區域。前述 抑制表現序列之驗基數例如為19〜3q個驗基，且宜為心加 或21個驗基。舉例來說，含有前述抑制表現序列之區域亦 可在前述抑制表現序列之5,端側及…，端側更具有附加序 列。前述附加序列之驗基數例如為Κ3ι個驗基，且宜為卜21 個驗基’更宜為卜丨丨個鹼基。 前述區域(X)之驗基數並未特別受限。前述區域⑻含 有前述抑制表現序列時，舉例來說，其下限為19個驗基。 其上限例如為50個驗基，且宜為3G個驗基，更宜為25個驗 基。以前述區域(X)之驗基數的具體例而言，例如為19個驗 基〜5〇個驗基’且宜為19㈣基，個驗基，更宜糾個驗 基〜25個驗基。 前述區域(Xc)之驗基數並未特別$限。其下限例如為 19個驗基，且宜為20個驗基’更宜為21個驗基。其上限例 如為50個驗基’且宜為40個驗基，更宜為3〇個鹼基。 於前述ssPN分子中，前述連結區域(Lx)之長度並未特 別受限。舉例來說’前述連結區域(Lx)宜為前述區域(χ)與 前述區域(Xc)可形成雙股之長度。前述連結區域(Lx)除了前 述非核皆酸殘基之外還含有前述核苷酸殘基時，前述連結 區域(Lx)之驗基數的下限例如為丨個鹼基，且宜為2個驗 22 201219570 基，更宜為3個鹼基，其上限則例如為1〇〇個鹼基，且宜為 80個鹼基，更宜為50個鹼基。 前述第一ssPN分子之全長並未特別受限。於前述第一 ssPN分子中，前述鹼基數合計（全長之鹼基數)之下限例如為 38個驗基，且宜為42個驗基，較宜為5〇個驗基，更宜為51 個鹼基，尤宜為52個鹼基；其上限則例如為3〇〇個鹼基，且 宜為200個鹼基，較宜為150個鹼基，更宜為1〇〇個鹼基，而 尤宜為80個鹼基。於前述第—sspN分子中，前述連結區域 (Lx)除外之鹼基數合計的下限例如為38個鹼基，且宜為42 個鹼基，較宜為50個鹼基，更宜為51個鹼基，而尤宜為52 個鹼基；上限則例如為300個鹼基，且宜為200個鹼基，較 宜為150個鹼基，更宜為1〇〇個鹼基，而尤宜為8〇個鹼基。 (2)第二ssPN分子 舉例來說’前述第二ssPN分子係除了前述區域(X)、前 述連結區域(Lx)及前述區域(xc)之外更具有區域(γ)以及與 前述區域(Y)互補之區域(YC)的分子。於前述第二ssPN分子 中’前述區域(X)與前述區域(γ)連結而形成内部區域(z)。 此外’只要未特別表示’前述第二SSPN分子可援用前述第 一 ssPN分子之記載。 舉例來說，前述第二S S P N分子亦可從5，端側至3，端側依 序具有前述區域(Xc)、前述連結區域(Lx)、前述區域(X)、 前述區域(Y)及前述區域(YC)。此時，前述區域(Xc)亦稱為5, 端側區域(Xc)，前述内部區域(Z)中之前述區域(X)亦稱為内 部5’端側區域(X)，前述内部區域(z)中之前述區域(γ)亦稱 23 201219570 為内部3’端區域（γ)，前述區域（Yc)亦稱為3,端側區域 (Yc)。此外，舉例來說，前述第二ssPN分子亦可從3’端側至 5’端側依序具有前述區域(xc)、前述連結區域(Lx)、前述區 域(X)、前述區域(γ)及前述區域(Yc)。此時，前述區域(Xc) 亦稱為3’端側區域(xc)，前述内部區域⑺中之前述區域⑻ 亦稱為内部3’端側區域(X)，前述内部區域〇中之前述區域 (Y) 亦稱為内部5’端區域(Y) ’前述區域(Yc)亦稱為5，端側區 域(Yc)。 舉例來s兒，前述内部區域(z)係如前所述，前述區域(X) 與前述區域(Y)呈連結。舉例來說，前述區域(χ)與前述區 域(Υ)直接連結，其間不具有介入序列。前述内部區域(Ζ) 為了顯示與前述區域(XC)及前述區域(Yc)間之序列關係，而 定義成「前述區域(X)與前述區域(γ)連結而構成」，並非限 定前述内部區域(Z)中前述區域(X)與前述區域(γ)在前述 ssPN分子使用時為各別獨立之領域。亦即，舉例來說，前 述内部區域(Z)具有前述抑制表現序列時，於前述内部區域 (Z) 中，前述抑制表現序列可跨前述區域(χ)與前述區域 來配置。 於前述第二ssPN分子中，前述區域(Xc)與前述區域(X) 互補。於此’前述區域(Xc)僅需具有與前述區域(χ)之全區 或或二心區域互補的序列即可，且宜含有與前述區域(X) 之全區域或其部分區域互補的序列或是由前述互補之序列 所構成。舉例來說，前述區域㈣可對與前述區域(X)互補 之前述全區域或前述部分區域呈完全互補，亦可有丨個或數 24 201219570 個鹼基非為互補，但以完全互補為宜 。前述1個鹼基或數個 鹼基例如為1〜3個鹼基，且宜為1個鹼基或2個鹼基。 於則述第二ssPN分子中，前述區域(yc)與前述區域(γ) 互補。於此’前述區域(Yc)僅需具有與前述區域(Y)之全區 域或其部分11$互補之序列即可，I宜含有與前述區域⑺ 之全區域或其部分區域互補之序列，或是由前述互補之序 列所構成。舉例來說，前述區域(Yc)對於與前述區域(Y)互 補之前述全區域或前述部分領域可呈完全互補，亦可有1個 或數個鹼基非呈互補，但以完全互補為宜。前述丨個鹼基或 數個鹼基例如為丨〜3個鹼基，且宜為1個鹼基或2個鹼基。 於刚述第一SSPN分子中，舉例來說，前述抑制表現序 列包含在由前述區域(χ)與前述區域(γ)所形成之前述内部 區域(Ζ)及前述區域(Xc)之至少一者中，亦可更包含在前述 區域(Yc)中。前述内部區域(z)具有前述抑制表現序列時， 舉例來說，可在前述區域(X)及前述區域(γ)中之任一者具 有前述抑制表現序列，此外，亦可跨前述區域(χ)與前述區 域(γ)來具有前述抑制表現序列。舉例來說，前述第二ssPn 分子可具有1個前述抑制表現序列，亦可具有2個以上。 前述第二ssPN分子具有2個以上前述抑制表現序列 時，各抑制表現序列之配置處並未特別受限，可為前述内 部區域(Z)及前述區域(Xc)中之任一者，亦可為前述内部區 域(Z)及前述區域(xc)中之任一者與其他之不同區域。 於前述第二ssPN分子中，舉例來說，前述區域(Yc)與 前述區域(Y)可直接連結，亦可間接連結。於前者之情況 25 201219570 下’直接連結可列舉如利用磷酸二酯（phosphodiester)鍵之 連結。在後者之情況下，舉例來說可列舉如··前述區域(Yc) 與前述區域(γ)之間具有連結區域(Ly)，且前述區域(Yc)與 前述區域(Y)透過前述連結區域(Ly)而連結的形態。 前述第二SSPN分子具有前述連結區域(Ly)時，舉例來 說，前述連結區域(Ly)可為前述核苷酸殘基所構成之連接子 (linker)，亦可為前述之具有非核苷酸結構(含有吡咯啶骨架 及哌啶骨架中之至少一者）的連接子。在後者之情況下，舉 例來說，前述連結區域(Ly)可以前述式⑴來表示，且可援 用前述連結區域(Lx)中之前述式(I)的全部說明。 舉例來說’前述區域(Yc)及前述區域⑺分別透過_〇Rl_ 或-OR2-而與前述連結區域(Ly)結合。於此，Ri及R2與前述 連結區域(Lx)相同，可存在亦可不存在。 前述區域(Xc)、前述區域(X)以及前述區域(Yc) '前述 (Y)與前述-OR1-及-OR2-之結合的組合並未特別受限，可列 舉如以下任一條件。 條件（1) 刖述區域(Xc)透過-OR2-且前述區域(X)透過_〇Ri_而與 前述式(I)之結構結合，並且 前述區域(Yc)透過-OR1-且前述區域⑺透過_〇R2_而與 前述式(I)之結構結合。 條件(2) 前述區域(Xc)透過-〇R2-且前述區域(X)透過-OrL而與 前述式(I)之結構結合，並且 26 201219570 前述區域(Yc)透過-OR2-且前述區域⑺透過_〇Ri_而與 前述式⑴之結構結合。 條件(3) 前述區域(Xc)透過-OR1-且前述區域(X)透過_〇R2·而與 前述式⑴之結構結合，並且 前述區域(Yc)透過-OR1-且前述區域(γ)透過_〇R2_而與 前述式⑴之結構結合。 條件(4) 前述區域(Xc)透過-OR1-且前述區域(X)透過_〇r2_而與 前述式⑴之結構結合，並且 前述區域(Yc)透過-OR2·且前述區域(γ)透過_〇Ri_而與 前述式(I)之結構結合。 針對前述第二SSPN分子，茲將具有前述連結區域(Ly) 之ssPN分子之一例顯示於第2圖之模式圖中。第2(A)圖為模 式圖，其針對前述ssPN分子，顯示從5,端側向3’端側之各區 域順序的概略作為一例；第2(B)圖為模式圖，顯示前述SSPN 分子在前述分子内形成雙股之狀態。如第2(B)圖所示，前 述ssPN分子在前述區域(Xc)與前述區域(X)之間、前述區域 (Y)與前述區域(Yc)之間形成雙股，且前述Lx領域及前述Ly 領域因應其長度而採迴圈結構。第2圖只不過是用以顯示前 述區域之連結順序及形成雙股之各區域的位置關係者，舉 例來說，各區域之長度及連結區域之形狀等均不受其限 制。此外，雖然第2圖將前述區域(XC)顯示於5’端側，但並 不限於此，前述區域(Xc)亦可位在3’端側。 27 201219570 於前述第二ssPN分子中’前述區域（xc)、前述區域 (X)、前述區域(Y)及前述區域(Yc)之鹼基數並未特別受限。 茲將各區域之長度例示如下，但本發明並不受其限制。 別述區域(Xc)係如前述’舉例來說，亦可與前述區域(X) 之全區域完全互補。此時，舉例來說，前述區域(Xc)宜與 前述區域(X)為相同驗基長，且宜由與前述區域(X)之全部 鹼基互補之鹼基序列所構成。前述區域(Xc)更宜：與前述 區域(X)相同鹼基長且前述區域(乂幻之全部鹼基與前述區域 (X)之全部鹼基互補，亦即，例如完全互補。此外，並不侷 限於此’舉例來說，可如前述般有丨個或數個鹼基非為互補。 此外，舉例來說，前述區域(乂幻亦可與前述區域(x)之 部分區域互補。此時，舉例來說，前述區域0匀宜與前述 區域(X)之部分區域為相同鹼基長，亦即，宜由鹼基長較前 述區域(X)短1個鹼基以上之鹼基序列所構成。前述區域(Xc) 更宜：與前述區域(X)之前述部分區域為相同鹼基長，且前 述區域(Xc)之全部驗基與前述區域(X)之前述部分區域之全 部鹼基互補，亦即，例如完全互補。舉例來說，前述區域 (X)之前述部分區域中宜為下述鹼基序列所構成之區域：前 述區域(X)中，以前述區域(Xc)側之末端鹼基（第i個鹼基) 為始連續下來的鹼基序列。 月IJ述區域(Yc)係如前述’舉例來說’亦可與前述區域(γ) 之全區域互補。此時，舉例來說，前述區域(Yc)宜與前述 區域(Y)為相同鹼基長，且宜由與前述區域(γ)之全區域互 補的鹼基序列所構成。前述區域(Yc)更宜與前述區域(γ)為 28 201219570 相同驗基長且則述區域(Yc)之全部驗基與前述區域(γ)之全 部鹼基互補’亦即，例如完全互補。此外，並不偈限於此， 例如可如前述般’有1個或數個驗基非為互補。 此外，前述區域(Yc)係如前述，舉例來說，亦可與前 述區域(Y)之部分£域互補。此時，舉例來說，前述區域(Yc) 宜與前述區域(Y)之部分區域相同鹼基長，亦即，宜由驗基 長較前述區域(Y)短1個驗基以上之鹼基序列所構成。前述 區域(YC)更宜與前述區域(Y)之前述部分區域為相同鹼基長 且前述區域(Yc)之全部鹼基與前述區域(γ)之前述部分區域 的全部鹼基互補，亦即，例如完全互補。舉例來說，前述 區域（Y)之前述部分區域宜為下述鹼基序列所構成之區 域：前述區域(Y)中，以前述區域(Yc)側之末端鹼基（第 鹼基)為始連續下來的鹼基序列。 於前述第二ssPN分子中，舉例來說，前述内部區域(z) 之鹼基數(Z)與前述區域(X)之鹼基數及前述區域之 鹼基數(Υ)的關係、以及前述内部區域(ζ)之鹼基數(ζ)與前 述區域(X)之鹼基數(X)及前述區域(Xc)之鹼基數(Xc)的關 係滿足下述式（1)及(2)之條件。 Z=X + Y · · · (1) Z^Xc + Yc · · · (2) 於前述第二8_分子中，前述區域(X)之驗基數(X)與 前述區域⑺之驗基數(γ)的關係並未特別受❿，舉例來 說，滿足下述式之任一條件。 X=Y · · · (19) 29 201219570 X< Υ . · . (20) X> Y . · · (21) 於第二ssPN分子中，舉例來說，前述區域(X)之鹼基數 (X)、前述區域(Xc)之鹼基數(Xc)、前述區域(Y)之鹼基數(Y) 及前述區域(Yc)之鹼基數(Yc)的關係滿足下述(a)〜(d)中之 任一條件。 (a) 滿足下述式（3)及(4)之條件。 X>Xc ---(3) Y=Yc ---(4) (b) 滿足下述式（5)及(6)之條件。 X=Xc · · . (5) Y> Yc ---(6) (c) 滿足下述式（7)及（8)之條件。 X>Xc ---(7) Y> Yc ---(8) (d) 滿足下述式（9)及（10)之條件。 X=Xc ---(9) Y=Yc · · · (10) 於前述(a)〜(d)中，舉例來說，前述區域(X)之鹼基數(X) 與前述區域(Xc)之鹼基數(Xc)的差以及前述區域(Y)之鹼基 數(Y)與前述區域(Yc)之鹼基數(Yc)的差宜滿足下述條件。 (a)滿足下述式（11)及（12)之條件。 X-Xc=l〜10，且宜為1、2、3或4，更宜為卜2或3 · · . (11) Y-Yc=0 ... (12) 30 201219570 (b) 滿足下述式（13)及（14)之條件。 X-Xc=0 · · · (13) Y-Yc=l〜10，且宜為卜2、3或4，更宜為1、2或3 · · . (14) (c) 滿足下述式（15)及（16)之條件。 X-Xc=l〜10,且宜為1、2或3,更宜為· · ·(ΐ5) Y-Yc=l〜10,且宜為卜2或3,更宜為丨或2 · · ·(16) (d) 滿足下述式（17)及（18)之條件。 X-Xc=0 · · · (17) Y-Yc=0 · . · (18) 針對前述(a)〜(d)之第二ssPN分子，茲將各個結構之一 例=示於第3圖之模式圖。第3圖為包含前述連結區域㈣ 及前述連結區域(Ly)^ssPN ,且⑷為前述(a)<sspN分子之 例，⑻為前述⑻之洲分子之例，（c)為前述⑷之sspN分 子之例’（D)為前述⑷之ssPN分子之例。於第3圖中，虛線 顯示藉自黏合而形成雙股之狀態。第3圖之ssPN分子雖將前 2區域(X)之驗絲(X)與前《域(Y)之祕數(Y)表示成 二述式(2〇)之「Χ<γ」，但並不限於此，如前所述，可為 别述式（I9)之「χ=γ」’亦可為前述式（叫之「乂〉丫」。 此外’第3圖只不過是用以顯示前述區域⑻與前述區域⑽ ^關係以及前述區域⑺與前述區域(Ye)之關係的模式圖， 均區域之長度、形狀及連一之有無等， 區域==、^⑷〜⑷之咖分子呈下述結構：前述 一 /、則述區域(X)、及前述區域(YC)與前述區域(γ) 31 201219570 分別形成雙股’ n此而於前述内部區域(z)巾具有不與前述 區域(Xc)及前述區域(Ye)中之任—者對準的驗基；亦可稱為 具有不形成雙股之驗基的結構。以τ，將前述㈣區域(z) 中之前述不對準讀基（亦稱為不形成雙股之驗基)稱為「自 由鹼基」。於第3圖中’前述自由鹼基之區域係以「f」表示。 前述區域(F)之縣數並切财限。舉例來說，在前述⑻ 之ssPN分子的情況下，前述區域(F)之驗基數(f)為「x_xc」 之鹼基數；在前述(b)之ssPN分子的情況下，為「Y_Yc」之 鹼基數；而在前述(c)之ssPN分子的情況下，則是「X Xc」 之驗基數與「Y-Yc」之驗基數的合計數。 另一方面，舉例來說，前述(d)2SSpN分子呈現前述内 部區域(z)之全區域與前述區域(Xc)及前述區域(Yc)對準之 結構，亦可稱為前述内部區域(Z)之全區域形成雙股之結 構。此外，前述(d)之ssPN分子中，前述區域(Xc)之5,末端 與前述區域(Yc)之3’末端並未連結。 前述區域(Xc)、前述區域(Yc)及前述内部區域(z)中， 前述自由鹼基(F)之鹼基數合計會成為前述内部區域之 鹼基數。因此’舉例來說，前述區域(XC)及前述區域(Yc) 之長度可因應前述内部區域(Z)之長度、前述自由鹼基之數 量及其位置來適當地決定。 前述内部區域(Z)之鹼基數例如為19個鹼基以上。前述 鹼基數之下限例如為19個鹼基，且宜為20個鹼基，更宜為 21個鹼基。前述鹼基數之上限例如為50個鹼基，且宜為40 個鹼基，更宜為30個鹼基。前述内部區域(Z)之鹼基數具體 32 201219570
I例來心此條件為宜。 例’舉例來說為19個鹼基、20個姑^ 基、23個鹼基、24個鹼基、 基、28個鹼基、29個鹼基或： 有前述抑制表現序列時，舉例來却，、，，, 前述内部區域(Z)含有前述抑制表現序列時，舉例來 說，前述内部區域(Z)可為僅由前述抑制表現序列所構成之 區域’亦可為含有前述抑制表現序列之區域。前述抑制表 現序列之驗綠例如為19〜3(Η崎基，且宜⑽、2〇或21 個驗基，前述内部區域(Ζ)含有前述_表現序列時，前述 抑制表現序列Μ端側及/或3’端側亦可更具有附加序列。 前述附加序狀數例如為，且宜為㈣個 鹼基，更宜為1〜11個鹼基，尤宜為丨〜7個鹼基。 前述區域(Xe)之驗基㈣如為卜29個驗基，且宜為 1〜11個鹼基，較J：為卜7歸基，更宜為卜4㈣基，尤宜 為1個鹼基、2個鹼基或3個鹼基。前述内部區域〇或前述 區域(Ye)含有前述㈣表現相時，舉例來說，以此種驗 基數為宜。作為具體例，前述内部區域(z)之鹼基數為19〜3〇 個鹼基（例如19個鹼基）時，前述區域(Xc)i鹼基數例如為 1〜11個鹼基，且宜為丨〜7個鹼基，較宜為丨〜4個鹼基，且更 宜為1個鹼基、2個鹼基或3個鹼基。 前述區域(Xc)含有前述抑制表現序列時，舉例來說， 前述區域(X c)可為僅由前述抑制表現序列所構成之區域， 亦可為含有前述抑制表現序列之區域。前述抑制表現序列 之長度例如前述者。前述區域(又幻含有前述抑制表現序列 33 201219570 時，前述抑制表現序列之5’端側及/或3’端側可更具有附加 序列。前述附加序列之鹼基數例如為1〜11個驗基，且宜為 1〜7個驗基。 前述區域（Yc)之驗基數例如為1〜29個鹼基，且宜為 1〜11個鹼基，較宜為1~7個鹼基，更宜為1〜4個鹼基，且更 宜為1個鹼基、2個鹼基或3個鹼基。前述内部區域(Z)或前 述區域(Xc)含有前述抑制表現序列時’舉例來說，以此種 鹼基數為宜。作為具體例，前述内部區域(Z)之鹼基數為 19〜30個鹼基(例如19個鹼基）時，前述區域(Yc)之鹼基數例 如為1〜11個鹼基，且宜為1~7個鹼基，較宜為1個鹼基、2 個鹼基、3個鹼基或4個鹼基，且更宜為1個鹼基、2個鹼基 或3個驗基。 前述區域(Yc)含有前述抑制表現序列時，前述區域(Yc) 可為僅由前述抑制表現序列所構成之區域，亦可為含有前 述抑制表現序列之區域。前述抑制表現序列之長度例如前 述者。前述區域(Yc)含有前述抑制表現序列時，前述抑制 表現序列之5,端側及/或3’端側可更具有附加序列。前述附 加序列之鹼基數例如為卜11個鹼基，且宜為卜7個鹼基。 如别所述，舉例來說，前迷内部區域(z”前述區域(Xc) 及前述區域(Yc)之驗基數可以前述式⑺之「z^Xc + Yc」來 表示。作為具體例’舉例來說’「Xe + Ye」之驗基數係與前 述内部區域(Z)相同，或是較前述内部區域(z)更小。後者之 情況下，舉例來說，「Z-(Xc + Yc)」為卜1〇，且宜為卜扣且 更宜為1、2或3。舉例來說，前述「z_(Xc + Yc)」相當於前述 34 201219570 内β區域(Z)中之自由區域(F)的驗基數(？）。 於前述第二ssPN分子中，前述連結區域(Lx)及前述連 結區域(Ly)之長度並未特別受限。前述連結區域。幻係如前 所述。則述連結區域(Ly)之構成單元包含鹼基時，前述連結 區域(Ly)之鹼基數的下限舉例來說為丨個鹼基，且宜為2個鹼 基，更宜為3個鹼基，其上限舉例來說則為1〇〇個鹼基，且 宜為80個鹼基，更宜為50個鹼基。舉例來說，前述各連結 區域之驗基數可例示如1〜5〇驗基、1〜3〇驗基、1〜2〇驗基、 1〜10驗基、1〜7驗基、1〜4驗基等以作為具體例，但並不侷 限於此。 舉例來說，前述連結區域(Ly)可與前述連結區域(Lx) 相同，亦可不同。 前述第二ssPN分子之全長並未特別受限。於前述第二 ssPN分子中’前述鹼基數合計（全長之鹼基數）的下限例如為 38個鹼基，且以42個鹼基為宜，較宜為50個鹼基，更宜為 51個鹼基，且尤宜為52個鹼基；其上限則例如為300個鹼 基，且以200鹼基為宜，較宜為15〇個鹼基，更宜為1〇〇個鹼 基，且尤宜為80個鹼基。於前述第二SSPN分子中，前述連 結區域(Lx)及連結區域(Ly)除外之驗基數合計的下限例如 為38個鹼基’且宜為42個鹼基，較宜為50個鹼基，更宜為 51個鹼基，尤宜為52個鹼基；其上限例如為300個鹼基，且 以200個鹼基為宜，較宜為150個鹼基，更宜為1〇〇個鹼基， 而尤宜為80個鹼基。 本發明之ssPN分子係如前所述，前述連結區域(Lx)僅 35 201219570 =具㈣述非料酸結構即可，其他之構成料並未特別 “構成單元可列舉如核㈣殘基等。前述核苦酸 ^土可列舉如核糖核純殘基及去氧核糖核純殘基等。 則述核㈣殘基可列舉如未經修飾之__純殘基及 經修飾之料核倾縣等。舉㈣說，本發明之ssPN分 由含有前祕飾«酸殘基而提高核_耐性並提 局安定性。此外，舉例來說，本發明之ssPN分子除了前述 核苦酸殘基之外，亦可更含有非核皆酸殘基。’ 前述區域(Xc)、前述區域(X)、前述區域(Y)及前述區域 ()之構成單元各自以前述核_酸殘基為宜。舉例來說， 前述各區域係以下述⑴〜(3)之殘基來構成。 (1) 非修飾核苷酸殘基 (2) 修飾核苷酸殘基 (3) 非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基 舉例來說，前述連結區域(Lx)可僅由前述非核苷酸殘 土構成亦可由則述非核苷酸與前述核苷酸殘基構成。例 如’前述連結區域(Lx)以下述⑷〜⑺之殘基來構成。 (4) 非核苷酸殘基 (5) 非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基 (6) 非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基 (7) 非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘 前述連結區域(Ly)之構成單元並未特別受限，舉例來 說，如前所述，可列舉如前述核苷酸殘基及前述非核苷酸 36 201219570 殘基等。舉例來說，前述連結區域可僅由前述核苷酸殘基 構成’亦可僅由前述非核苷酸殘基構成，亦可由前述核苷 酸殘基與前述非核苷酸殘基所構成。前述連結區域例如係 以下述（1)〜(7)之殘基來構成。 (1) 非修飾核苷酸殘基 (2) 修飾核苷酸殘基 (3) 非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基 (4) 非核苷酸殘基 (5) 非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基 (6) 非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基 (7) 非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘 基 舉例來說’本發明之ssPN分子除了前述連結區域(Lx) 之外’可列舉如僅由前述核苷酸殘基構成之分子以及除前 述核苦酸殘基之外還含有前述非核苷酸殘基之分子等。於 本發明之ssPN分子中，前述核苷酸殘基係如前所述，舉例 來說，可僅為前述非修飾核苷酸殘基，亦可僅為前述修飾 核苷k殘基，亦可為前述非修飾核苷酸殘基及前述修飾核 苦自夂殘基兩者。前述别财子含有前料㈣㈣酸殘基 與前述修倚㈣酸魅時，前述修_賊殘基之個數並 未特别又限’舉例來說為「i或數個」，具體來說則例如是 個’且宜為1〜4個，更宜為1〜3個，而最宜為1或2個。本 發明之SSPN分子含有前《«酸綠時，前述非核芽酸 爱土之個數並未特別受限，舉例來說為「！或數個」，具體 37 201219570 來說則例如是1或2個。 本發明之ssPN分子中，前述核㈣殘基例如宜為核糖 酸殘基。此時’舉例來說，本發明之ssPN分子亦稱為 八分子」或「p—3规分子」。舉例來說，前述ssRna 係除W述連結區域(Lx)之外僅由前述錄核㈣殘基 ^之分子，可列舉如前述核糖核㈣祕之外還含有前 =酸殘基之分子等。於前述域财分子中，前述核 基係如前述’例如可僅為前述非修飾核糖核皆 =基灰’亦可僅為前述修飾核糖核㈣殘基，亦可含有前 ^ 4核糖核聽殘基及前述修飾核糖核純殘基兩 有0 :例來說，前述s亀分子除了前述非修飾核糖㈣ 二 =還含有前述修飾核嶋酸殘基時，前述修飾 具體來/殘基之個數並未特別受限，例如為「丨或數個」， 宜為^例如為1〜5個，且宜為1〜4個，更宜為1〜3個，而最 2或2個。相對於前述非修飾核糖核《殘基之前述修 基可列舉如核糖殘基取代成去氧核糖殘基 /述去氧核糖料酸殘基等。舉說，_ssRNA分 除别述雜飾_核料錄之㈣含㈣述去氧秒糖 亥錢殘基時，前述麵核糖核㈣殘基之個數 受限，舉例來說為。或數個」，具體來說例如為卜5個^ 且為卜4個，更宜為1〜3個，而最宜為鳩2個。 ^舉例來說，本發明之嫩分子亦可含有標記物質 別述標記物質而受到庐 人 心4化。則述標記物質並未特别受 38 201219570 限，可列舉如螢光物質、色素及同位素等。前述標記物質 可列舉如芘、TAMRA、螢光黃（fluorescein)、Cy3色素、Cy5 色素等之螢光團，且前述色素可列舉如Alexa488等之Alexa 色素等。前述同位素可列舉如穩定同位素及放射性同位 ’、且且為穩疋同位素。前述穩定同位素舉例來說由於幅 射外洩之危險性較少，且無需專門設備而具優異之處理 性’此外”亦可減低成本。㈣，舉例來說，經前述穩定 『位素標識之化合物無物性變化，用作示㈣(traeer)之性 ^亦優異。前述穩定同位素並無特別受限，可列舉如2h、 l3C、丨5n、丨7〇、丨8〇、33s、34s及36s。 本發明之ssPN分子係如剛述，舉例來說，宜於前述非 核芽酸結構中導人前述標記物m對前述連結區域(Lx) 之前述非核《殘基導入前述標記物冑。舉例來說，對前 迷非核苷酸殘基之標記物質導入可簡便且價廉地進行。 本發明之ssPN分子係如前述，可抑制前述目標基因之 表現。因此，本發明之ssPN分子可用作基因係之疾病 的治療劑。只要是含有可抑制前述疾病成因之基因表現的 序列來作為前述抑制表現序列之前述防^以分子，舉例來 說，即可透過抑制前述目標基因之表現來治療前述疾病。 μ發明卜&含_前述疾病、改善 疾病及改善預後等之意義，且可為任一者。 本發明之ssPN分子之❹方法並未_㈣，舉例來 說，僅需對具有前述目標基因之投予對象投予前述ssPN分 子即可。 39 201219570 前述投予對象可列舉如細胞、組織或器官。前述投予 對象可列舉如人類以及人類以外之非人哺乳類等之非人動 物。舉例來說，前述投予可為活體内（in vivo)亦可為活體外 (in vitro)。前述細胞並未特別受限，可列舉如HeLa細胞、 293細胞、NIH3T3細胞、COS細胞等之各種培養細胞、ES 細胞、造血幹細胞等之幹細胞、初代培養細胞等由活體單 離出之細胞等。 於本發明中，抑制表現對象之前述目標基因並未特別 受限，可設定所欲之基因，僅需因應前述目標基因之種類 來適當設計前述抑制表現序列即可。 茲將本發明之ssPN分子之具體例顯示如下，但本發明 並不因此而受到任何限制。前述ssPN分子之鹼基序列可例 示如序列編號3、11、14〜17及23之鹼基序列，此外，前述 鹼基序列中，舉例來說亦可是缺損、取代及/或附加有1或 數個之鹼基序列。前述目標基因為GAPDH基因時，可列舉 如序列編號3及11之鹼基序列；目標基因為TGF-βΙ時，可列 舉如序列編號14〜17及23之鹼基序列。 關於本發明之ssPN分子的用途，則可援用後述之本發 明組成物、抑制表現方法及治療方法等之記載。 由於本發明之ssNc分子可抑制目標基因之表現，舉例 來說，作為醫藥品、診斷藥、農藥以及農藥、醫學、生命 科學等之研究工具等甚是有用。 於本發明中，舉例來說「烷基」包含直鏈狀或分枝狀 烷基。前述烷基之碳數並未特別受限，例如為1〜30，且宜 40 201219570
為1〜6或1〜4。前述燒基可列舉如：甲I 異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基甲基第:乙丁，^ 昂二丁基、正戊基、 異戊基、新戍基、正己基、異己基、正庚基、正辛基'正 壬基及正癸基等。較佳者可列舉如甲其 1丞、乙基、正丙基、 異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、 異戊基、新戊基、正己基及異己基等。 於本發明中，舉例來說「稀基」包含直鏈狀或分枝狀 之烯基。前述烯基可列舉如在前述燒基中具有i個或多數個 雙鍵者等。前述職之碳數並轉抑限，舉例來說與前 述烧基相同’且宜為2〜8。前料基可列舉如乙烯基、^丙 稀基、2-丙烯基、1-丁烯基、2_丁歸基、3_丁稀基' 1，3_ 丁二稀基、3-甲基-2-丁烯基等。 於本發明中，舉例來說「炔基」包含直鏈狀或分枝狀 炔基。前述炔基可列舉如在前述貌基中具有i個或多數個東 鍵者等。前麟基之碳數並未_受限，舉例來說與前述 烧基相同，且宜為2〜8。前賴基可列舉如乙炔基、丙块基、 丁炔基等。舉例來說’前述炔基亦可更具有丨個或多數個雔 鍵。 又 夕於本發明中，舉例來說「芳基」包含單環芳香族烴基 及夕^芳香族煙基。前述單環料㈣基可列舉如苯基 和前述多環芳香族烴基可列舉如卜蔡基、2_蔡基、^葱基土、 2蒽基、9-蒽基、卜菲基、2_菲基、3_菲基、4 基等。較佳者可解如苯基、W2.萘斜之蔡基等菲 ;本發明中，舉例來說「雜芳基」包含單環芳香族雜 41 201219570 環基及縮合芳香族雜環基。前述雜芳基可列舉如咬喃基(例 如：2-吱喃基、3-吱喃基）、嘴吩基(例如：塞吩基、3_嚷 吩基）、吡咯基(例如：1-吡洛基、 唾基(例如：1 -°米D坐基、2-°米唾基、 1-。比唑基、3-吡唑基、4-吡哇基） 2-°比"各基、各基）、咪 4-咪唑基）、吡唑基(例如： 、三唑基（例如：丨，2, 4_三 唑-1-基、1，2, 4-三唑-3-基、 如：1-四坐基、2-四。坐基、5 L 2, 4-三唑_4-基）、四唑基（例 -四唑基）、α号唑基(例如：2 〇号 唾基、坐基、5巧錄）、異十坐基⑽如D十坐基、 4-異十坐基、5-異十坐基）、嗟嗤基(例如：2_嘆嗤基、*-嘆 嗤基、5-嗟吐基）、。塞二。坐基、異„塞唾基(例如：3·異嗟。坐基、 4-異嗟絲、5-異嘴。坐基）"比。定基(例如：2令定基、3吼 啶基、4_吼啶基）、塔畊基(例如：3_„荅畊基、^荅畊基）、。密 唆基(例如：2-較基' 4-錢基、5_♦定基）、吱咕基(例如： 3- 呋咕基）、吡畊基(例如：2_吡畊基）、噚二唑基(例如：丨，3, 4- 哼二唑-2-基）、苯并呋喃基(例如：2_笨并[b]呋喃基、苯 并[b]咬喃基、4-苯并[b]吱喃基、5_苯并[b]呋喃基、6_苯并 0]呋喃基、7-苯并[b]呋喃基）、苯并噻吩基(例如：2苯并 噻吩基、3-苯并[b]噻吩基、4-苯并[b]噻吩基、5_笨并[b]噻 吩基、6-苯并[b]噻吩基、7-苯并[b]噻吩基）、苯并咪唑基(例 如：1-苯并咪唑基、2-苯并咪唑基、4_笨并咪唑基、5·笨并 味°坐基）、一本并°夫°南基、笨并。f 〇坐基、苯并D塞嗤基、啥。号 啉基(例如：2-喹噚啉基、5-喹噚啉基、6_喹噚啉基）、呻啉 基(例如：3-咔啉基、4-呻啉基、5_咔啉基、6_咔啉基、7_咔 啉基、8-呻啉基）、喹唑啉基(例如：2-喹唑啉基、4_喹唑啉 42 201219570 基、5-啥唾琳基、6-啥°坐琳基、7-d|：^d林基、8-啥唾琳基）、 啥琳基(例如：2-啥琳基、3-唾淋基、4-喧琳基、5-啥琳基、 6-啥琳基、7-啥琳基、8-唾琳基）、α大讲基(例如：1-吹11井基、 5-吹《井基、6-吹。井基）、異啥琳基(例如：1-異啥琳基、3-異 啥琳基、4-異喧淋基、5-異啥琳基、6-異0f琳基、7-異啥琳 基、8-異喹啉基）、嘌呤基、喋啶基(例如：2-喋啶基、4-喋 啶基、6-喋啶基、7-喋啶基）、咔唑基、啡啶基、吖啶基(例 如：1-吖啶基、2-吖啶基、3-吖啶基、4-吖啶基、9-吖啶基）、 D引0朵基(例如：1-叫卜朵基、2-吲°朵基、3-°引°朵基、4-叫卜朵基、 5-叫丨n朵基、6-叫丨口朵基、7-吲0朵基）、異吲°朵基、啡'>丼基（例如： 1-啡°井基、2-啡讲基）或啡σ塞讲基(例：1-啡。塞讲基、2-啡°塞 畊基、3-啡噻畊基、4-啡噻讲基）等。 於本發明中，舉例來說，「環烷基」為環狀飽和烴基， 碳數則例如3〜15。前述環烷基可列舉如環丙基、環丁基、 環戊基、環己基、環庚基、環辛基、橋接環烴基及螺烴基 等，且宜為環丙基、環丁基、環戊基、環己基及橋接環烴 基等。 於本發明中，「橋接環烴基」可列舉如雙環[2.1.0]戊基、 雙環[2.2.1]庚基、雙環[2.2.2]辛基及雙環[3.2.1]辛基、三環 [2.2.1.0]庚基、雙環[3.3.1]壬烷、1-金剛烷基、2-金剛烷基 等。 於本發明中「螺烴基」可列舉如螺[3.4]辛基等。 於本發明中，舉例來說「環烯基」包含環狀不飽和脂 肪族烴基，碳數則例如3〜7個。前述基可列舉如環丙烯基、 43 201219570 %丁埽基、環戊烯基、環己稀基及環庚稀基等，且宜為产 丙歸基、環丁烯基、環戊烯基及環己烯基等。舉例來說， 前述環烯基亦包含環中具有不飽和鍵之橋接環烴基及螺煙 基。 ’、 於本發明中，「芳烷基」可列舉如苄基、2_苯乙基及 奈甲基等，「環烧基烧基」或「環基烧基(cyclylalky丨)」可 列舉如環己基曱基及金剛烷基甲基等，「羥烷基」則可列 舉如羥甲基及2-羥乙基等。 於本發明中，「烷氧基」包含前述烷基-〇-基，可列舉 如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基及正丁氧基等， 「燒氧基烷基」可列舉如甲氧基曱基等，「胺基烷基」則 可列舉如2-胺基乙基等。 於本發明中’「雜環基(heterocyclyl)」可列舉如1-°比σ各 琳基、2-η比咯啉基、3-吡咯啉基、μ吡咯啶基、2-吡咯啶基、 3_°比°各°定基、°比咯啶、1-咪唑啉基、2-咪唑啉基、4-咪唑 啉基、1-咪唑啶基、2_咪唑啶基、4_咪唑啶基、咪唑啶酮、 1-。比唾琳基、3_„比唑啉基、4_吡唑啉基、卜吡唑啶基、3_吡 定基4-n比σ坐σ定基、旅咬酮、义六氫。比咬基、2_u底咬基、 3哌啶基、4-哌啶基、丨_哌畊基、2_哌讲基、哌畊酮、2_咮 琳基、3-味琳基、N-咮啉基、四氫哌喃基及四氫呋喃基等。 於本發明中’ 「雜環基烷基」可列舉如哌啶基甲基、 底井基甲基等’「雜環基稀基」可列舉如24"定基乙稀基 等， Γ ’雜芳基烧基」則可列舉如D比啶基甲基及喹啉-3-基曱 基等。 44 201219570 於本發明中，「矽基」包含式RsSi-所示之基，尺可獨 立選自前述烧基、芳基及環烧基，可列舉如三甲基石夕基、 第三丁基二曱基矽基等’「矽氧基」可列舉如三甲基石夕氧 基等’ 「矽氧基烷基」可列舉如三甲基矽氧基曱基等。 於本發明中，「伸烷基」可列舉如亞甲基、伸乙基及 伸丙基等。 於本發明中，前述各種基亦可經取代。前述取代基可 列舉如羥基、羧基、鹵素、鹵化烷基(例如：CF3、CH2CF3、 CHKCl3)、琐基、亞硝基、氰基、院基(例如：甲基' 乙基、 異丙基 '第三丁基）、烯基(例如：乙烯基）、快基(例如：乙 炔基）、環烷基(例如：環丙基、金剛烷基）、環烷基烷基(例 如：環己基曱基、金剛烷基甲基）、環烯基(例如：環丙烯基）、 芳基(例如：苯基、萘基）、芳烷基(例如：苄基、苯乙基）、 雜芳基(例如：吡啶基、呋喃基）、雜芳烷基(例如：吡啶基 甲基）、雜環基（例如：哌啶基）、雜環基烷基（例如： Morpholylmethyl)、烷氧基(例如：曱氧基、乙氧基、丙氧 基、丁氧基）、_化烷氧基(例如：〇CF3)、烯氧基(例如：乙 烯氧基、烯丙氧基）、芳氧基(例如：苯氧基）、烷氧羰基(例 如：甲氧羰基、乙氧羰基、第三丁氧羰基）、芳烷氧基(例： 苄氧基）、胺基[烷基胺基(例如：甲基胺基、乙基胺基、二 甲基胺基）、醯基胺基(例如：乙醯基胺基、苯甲醯基胺基）、 芳院基胺基(例如：苄基胺基、三苯甲基胺基）、羥基胺基]、 烧基胺基炫基(例如：二甲基胺基甲基）、胺磺醯基、側氧基 等。 45 201219570 2.核苷酸场其 、舉例來說，前述核苷酸殘基含有糖、鹼基及磷酸作為 構成要素。前述核苦酸殘基係如前述，可列舉如核糖核皆 酸殘基及去氧核糖核練殘基。舉例而言，前述核糖核苦 酸殘基具有核糖殘基作為糖，且具有腺嘌呤(八卜鳥嘌呤 (G)、胞嘧啶(C)及u(尿嘧啶)作為鹼基；前述去氧核糖殘基 則例如具有去氧核糖殘基作為糖，且具有腺嘌呤(A)、烏嘌 呤(G)、胞嘧啶(c)及胸腺嘧啶(τ)作為鹼基。 前述核苷酸殘基可列舉未修飾核苷酸殘基及修飾核苦 酸殘基。舉例㈣，前述未修飾才亥苦酸殘基之前述各構成 要素可與天然存在物相同或實質相同，且宜與天然存在於 人體内者相同或實質相同。 舉例來說，前述修飾核苷酸殘基係將前述未修飾核苷 酸殘基予以修飾而成之核苷酸殘基。又舉例來說，前述修 飾核苷酸殘基之前述未修健#酸殘基的構成要素中之任 一者亦可經修钟。於本發明中，舉例來說，「修飾」即是前 述構成要素之取代、附加及/或缺損、前述構成要素中之原 子及/或官能基之取代、附加及/或缺損，亦可稱為「改變」。 前述修飾核苷酸殘基可列舉如天然存在之核苷酸殘基、經 人工修飾之核苷酸殘基等。前述源自天然之修飾核苷酸殘 基了參照如林巴赫氏等人(Limbach et al.，1994, Summary : the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res.22 ： 2183〜2196)°此外，前述修飾核苷酸殘基舉例來說亦可為 前述核苷酸替代物之殘基。 46 201219570 前述核魏殘基之修飾可崎如婦_餐骨架 稱核糖構酸骨架）之修飾。 、下 前述核糖磷酸骨架中，例如可將核糖殘基進行修錦。 舉例來說’前述核糖殘基可修飾2，位之碳，具體來說例如 可將與r位之碳鍵結之㈣取代錢或㈣。藉由將前述^ 位碳之經基取代成氫’可將核糖殘基取代成去氧核糖。舉 例來說，前述核糖殘基可取代成立體異構物，例如，亦^ 取代成阿拉伯糖殘基。 前述核糖磷酸骨架舉例來說亦可取代成具有非核糖殘 基及/或非磷酸之非核糖磷酸骨架。前述非核糖磷酸骨架可 列舉如前述核糖磷酸骨架之非帶電體。經取代為前述非核 糖磷酸骨架之前述核苷酸替代物可列舉如N_嗎琳基 (morpholino)、環丁基、吡啶等。前述替代物除前述者外還 可列舉如人工核酸單體殘基。作為具體例，可列舉如 PNA(肽核酸）、LNA(鎖固核酸：Locked Nucleic Acid)、 ENA(2’-0，4’-C-伸乙基橋接核酸：2，-0，4，-C-Ethylene bridged Nucleic Acid)等，且宜為PNA。 於前述核糖磷酸骨架中，舉例來說，可將磷酸基予以 修飾。於前述核糖磷酸骨架中，最接近糖殘基之磷酸基被 稱為α磷酸基。前述α磷酸基帶負電，其電荷跨非與糖殘基 結合之2個氧原子而均勻分佈。前述α鱗酸基之4個氧原子 中，在核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵結中非與糖殘基鍵結之2 個氧原子以下亦稱作「非結合(non-linking)氧」。另一方面， 在前述核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵結中’與糖殘基鍵結之2 47 201219570 個氧原子則以下稱為「結合(linking)氧」。舉例來說，前述 α鱗酸基宜進行成為非帶電之修飾，或是使前述非結合氧中 之電荷分佈成為非對稱型之修飾。 舉例而言，前述磷酸基亦可取代前述非結合氧。例如， 前述之氧可藉由S(硫）、Se(砷）、Β(硼）、C(碳）、Η(氫）、Ν(氮) 及〇R(R例如為烧基或芳基）中之任一原子作取代，且宜以s 來取代。舉例來說，前述非結合氧宜兩者均被取代，且更 宜兩者均被S取代。前述修飾磷酸基可列舉如硫代磷酸酯 (phosphorothioate)、二硫代填酸醋（phosphorodithioate)、鱗 石申酸酯（phosphoroselenate)、 删烧礙酸鹽 (boranophosphate)、棚烧填酸 S旨（boranophosphate ester)、氫 碳酸酯、鱗醯胺酯(phosphoroamidate)、院基或芳基填酸酯、 以及填酸三酯(phosphotriester)等，其中尤以前述2個非結合 氧均以S取代之二硫代磷酸酯為佳。 舉例來說，前述磷酸基亦可取代前述結合氧。例如， 前述氧可藉S(硫）、C(碳)及N(氮）中之任一原子作取代。前 述修飾磷酸基可列舉如經N取代之交聯磷酸胺酯、經s取代 之交聯硫代磷酸酯及經C取代之交聯亞甲基磷酸醋等。舉例 來說，前述結合氧之取代宜在本發明之ssPN分子之5 ’末端 核苷酸殘基及3 ’末端核苷酸殘基中之至少一者中進行，且 在5’端側時宜以C作取代，在3’端側時則宜以N作取代。 舉例來說’前述碟酸基亦可取代成前述非含填之連接 子(linker)。前述連接子包含如矽氧烷、碳酸酯、叛曱基、 胺甲酸酯（carbamate)、醯胺、硫趟、環氧乙燒連接子、石黃 48 201219570 酉夂酉日（sulfonate)、石黃醯胺、硫代甲縮路(thi〇formacetai)、曱 縮醛、肟、亞甲基醢亞胺基、亞甲基甲基醯亞胺基、亞甲 基伸肼基、亞甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基醯亞胺 基等，且宜包含亞甲基羰胺基及亞甲基曱基醯亞胺基。 舉例來說’本發明之ssPN分子之3,末端及5,末端中之至 少一者的核苷酸殘基亦可受到修飾。例如，前述修飾可在3, 末端及5,末端中之任一者，亦可在兩者。舉例來說，前述 修飾係如前所述，且宜對末端之磷酸基進行。舉例來說， 前述磷酸基可將全體作修飾，亦可將前述磷酸基中之丨個以 上原子作修飾。在前者之情況下，例如，可為磷酸基全體 之取代’亦可為缺損。 前述末端核苷酸殘基之修飾可列舉如附加其他分子。 前述其他分子可列舉如前述之標記物質及保護基等之機能 性分子。前述保護基可列舉如S(硫）、Si(矽）、B(硼）、含酯 之基團等。前述標記物質等之機能性分子，舉例來說可利 用於本發明ssPN分子之檢測等。 舉例來說，前述其他分子可附加至前述核苷酸殘基之 碟酸基’亦可透過間隔子(啊叫而附力σ至前述碟酸基或前 述糖殘基。舉例來說，前述_子之末端原子可對前述麟 酸基之前述結合氧或者糖殘基之〇、N、作附加或取 代。則述糖殘基之結合部位例如宜為3,位之C或5,位之匸， 或者是與其等結合之原子^例如前述間隔子可對前述 等之核苷酸替代物之末端原子作附加或取代。 前述間隔子並未特別受限，舉例來說可包含_(CH2)n_、 49 201219570 -(CH2)nN- 、 -(CH2)n〇- 、 -(CH2)nS- 、 0(CH2CH2〇)nCH2CH2OH、無鹼基糖、醯胺、羧基、胺、氧 基胺、氧基亞胺、硫醚、二硫化物、硫脲、績醯胺及N-咮 琳基等，以及生物素試劑及螢光黃試劑等。於前述式中，n 宜為正整數’且宜η=3或6。 附加於前述末端之分子除了此等之外，尚可例示如色 素、插入(Intercalate)劑（例如°丫 °定）、交聯劑（例如補骨脂素 (psoralen)、絲裂黴素 Q、紫質（TPPC4、Texaphyrin、 Sapphyrin)、多環式芳香族烴(例如啡讲、二氫啡畊）、人工 内核酸酶(例如EDTA)、親油性載體(例如膽固醇、膽酸、金 剛烷乙酸、1-芘酪酸、二氫睪固酮、1，3-雙-0(十六烷基) 甘油、香葉基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、 1，3-丙二醇、十七烧基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、〇3-(油醯基) 石膽酸、03-(油醯基）膽酸、二曱氧基三苯甲基或啡噚畊) 及肽複合物（例如Antennapedia peptide、Tat肽）、院基化劑、 磷酸、胺基、酼基、PEG(例如 PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、 聚胺基、烷基、經取代院基、放射線標識標記、酵素、半 抗原（例如生物素）、輸送/吸收促進劑（例如阿斯匹靈、維生 素E、葉酸）、合成核糖核酸酶(例如咪唑、雙咪唑、組織胺、 咪唑簇（imidazole cluster)、吖啶-咪唑複合物、四氮巨環 (tetrazamicroring)之 Eu3+複合物）等。 舉例來說，本發明之SSPN分子的前述5,末端亦可經磷 酸基或磷酸基類似物修飾。前述磷酸基可列舉如5,單磷酸 ((HO)2(0)P-〇-5’） 、 5’ 二 磷 酸 50 201219570 ((H0)2(0)P-0-P(H0)(〇)-0-5，）、5’三磷酸((HO)2(0)P-0-(HO) (0)P-0-P(H0)(0)-0-5，）、5，-鳥苷帽（7-曱基化或非甲基化 7m-G-0-5’-(H0)(0)P-0-(H0)(0)P-0-P(H0)(0)-0-5’）、5’- 腺苷帽（Appp)、任意修飾或非修飾核苦酸帽結構 (N-0-5’-(H0)(0)P-0-(H0)(0)P-0-P(H0)(0)-0-5，）、5,單硫 代磷酸(硫代磷酸酯··（H0)2(S)P-0-5，）、5’單二硫代磷酸(二 硫代磷酸酯：（H0)(HS)(S)P-0-5，）、5，-磷硫醇酸 ((H0)2(0)P-S-5，）、經硫取代之單磷酸、二磷酸及三磷酸(例 如5，-α-硫代三磷酸、5，-γ-硫代三磷酸等）、5，-磷醯胺酯 ((Η0)2(0)Ρ-ΝΗ-5，、（ΗΟ)(ΝΗ2)(〇)Ρ-〇-5，）、5，-烷基膦酸(例 如 RP(0H)(0)-0_5’、（0H)2(0)P-5’-CH2 ; R為烷基（例如甲 基、乙基、異丙基、丙基等））、5，·烷基醚膦酸（例如 RP(0H)(0)-0-5’，R為烧基趟(例如甲氧基曱基、乙氧基甲 基等))等。 於前述核苷酸殘基中’前述驗基並未特別受限。舉例 來說，前述鹼基可為天然鹼基，亦可為非天然鹼基。舉例 來說’前述鹼基可源自天然，亦可為合成品。舉例來説， 前述鹼基可使用一般之鹼基，亦可使用其修飾類似物等。 前述鹼基可列舉如腺嘌呤及鳥嘌呤等之嘌呤鹼基、胞 嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等之嘧啶鹼基。前述鹼基除此之 外還可列舉如肉苷、胸腺嘧啶' 黃嗓吟、次黃^票呤、 nubularine、iSOgUanisine、殺結核菌素(tubercidine)等。前述 鹼基可列舉如2-胺基腺嘌呤、6·甲基化嘌呤等之烷基衍生 物；2-丙基化嘌呤等之烷基衍生物；5_鹵基尿嘧啶及5_鹵基 51 201219570 胞'定’ 5-丙炔基尿嘧啶及5_丙炔基胞嘧咬；6-偶氮尿嘴 啶'6-偶氮胞嘧啶及6_偶氮胸腺嘧啶；5_尿嘧啶(假尿嘧啶）、 4-硫代尿嘧啶、5-齒基尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5_ 胺基烯丙基尿嘧啶；8-鹵基化、胺基化、硫醇化、硫烷基 化、羥基化及其他之8-取代嘌呤；5-三氟甲基化及其他之5_ 取代嘧啶；7-甲基鳥嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮雜嘧啶；N-2、 N-6及0-6取代嘌呤（含2-胺基丙基腺嘌呤）；5-丙炔基尿嘴咬 及5-丙炔基胞嘧啶；二氫尿嘧啶；3_去氮_5_氮雜胞嘧啶 (3-deaza-5-azacytosine) ; 2-胺基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷 基鳥嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-去氮腺嘌呤；N6, N6-二甲基 腺嘌呤；2, 6-二胺基嘌呤；5-胺基-烯丙基-尿嘧啶；N3-曱 基尿嘧啶；取代1，2，4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲〇朵；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧乙酸；5-曱氧獄 基甲基尿嘧啶；5-曱基-2-硫代尿嘧啶；5-曱氧羰基甲基_2-硫代尿嘧啶；5-曱基胺基-2-硫代尿嘧啶；3-(3-胺基-3-羧丙 基)尿嘧啶；3-曱基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙醯基胞嘧 啶；2-硫代胞嘧啶；N6-曱基腺嘌呤；N6-異戊基腺嘌呤； 2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤；N-曱基鳥嘌呤；〇-烷基 化驗基等。此外，舉例來說，嘌呤及嘧啶包含：美國專利 第 3,687,808 號「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」，第858〜859頁，克羅修比茲.J. I·氏 (Kroschwitz J.I.)編，John Wiley & Sons，1990 ;及，英格 利修氏等人(Englisch等），Angewandte Chemie，International Edition，1991，第 30卷，p.613所揭示之物。 52 201219570 前述修飾核苦酸殘基除了此等之外，舉例來說，亦可 包含缺損鹼基之殘基，即無鹼基之核糖磷酸骨架。又，舉 例來說，前述修飾核苷酸殘基可使用如美國暫時申請案第 60/465,665號（申請日：2003年4月25日）及國際申請案第 PCT/US04/07070號（申請日：2004年3月8日）所記載之殘 基，本發明可援用此等文獻。 3. 本發明之ssPN分子合成方法 本發明之ssPN分子合成方法並未特別受限，可採用習 用公知之方法。前述合成方法可列舉如利用基因工學手法 之合成法及化學合成法等。基因工學手法可列舉如活體外 轉錄合成法、使用載體之方法、利用PCR卡匣之方法等。 前述載體並未特別受限，可列舉如質體等之非病毒載體以 及病毒載體等。前述化學合成法並未特別受限，可列舉如 亞麟 Si 胺法（phosphoramidites method)及 H-膦酸鹽法 (H-phosphonate method)。舉例來說，前述化學合成法可使 用市售之自動核酸合成機。前述化學合成法一般使用亞醯 胺(amidite)。前述亞醯胺並未特別受限，市售之亞醯胺可列 舉如RNA Phosphoramidites(2’-0-TBDMSi，商品名，三千 里製藥）、ACE亞醯胺及TOM亞醯胺、CEE亞醯胺、CEM亞 醯胺、TEM亞醯胺等。就本發明之ssPN分子而言，舉例來 說，在合成前述式(I)所示連結區域時，宜使用後述之本發 明單體。 4. 組成物 如前述，本發明之抑制表現用組成物係一種用以抑制 53 201219570 目標基因表現之組成物，特徵在於含有前述本發明之sspN 分子。本㈣植賴如含有”本發日狀SSPN分子為 特徵’至於其他構不受任何限制。舉例㈣，本發明 之抑制表現用組成物亦可稱為抑制表現用試劑。 若依本發明，舉例來說，可藉由投藥予存有前述目標 基因之對象’來進行前述目標基因之表現抑制。 此外，本發明之藥學組成物係如前述，其特徵在於含 有前述本發明之_分子。本發明之組成物係以含有前述 本發明之SSPN分子為特徵，至於其他構成則不受任何限 制。例如，本發明之藥學組成物亦可稱為醫藥品。例如， 本發明之藥學組成物亦可稱為醫藥品。 π叫·5又笊丁丞因為疾病成 因之患者而抑制前述基因之表現，進料療前述疾病。於 本發明中’舉例來說，「治療」如前述般包含前述疾病之預 防、疾病之改善及預後之改善等意義，且可為其中任一者。 於本發明中，治療對象之疾病並未特別受限，可列舉如基 因表現為成因之疾病。僅需因應前述疾病之種類，將哕疾 病成因之基因設定為前述目標基因，再因應前述目標基因 來適當設定前述抑制表現序列即可。 作為具體例’若將前述目標基因設為前述Τ(}ρ_βι基 因，並將針對前述基因之抑制表現序列配置於前述ssPN八 子，則可使用於例如炎症性疾病（具體來說則是急性肺傷室） 等的治療上。 本發明之抑制表現用組成物及藥學組成物（以下稱為 54 201219570 組成物)的使用方法並未特別受限，舉例來說， 灿:子投預杨述目料因之投予對象即可。 月〗述0對象可哪如細胞、㈣或^ 象=如人類、人類除外之非人哺乳類等之非人動 勿。舉例來說，前额切輕體師nv_村為活體外 ^叫。前述細胞並未特別受限，可列舉如仏細胞、 =田胞:N訓細胞、咖纟爾之各種騎細胞、即 離出之細胞專之幹細胞及初代培養細胞等從活體單 對象來ΐΐ當未特別受限’舉例來說’可因應投予 可列舉如使用&刖私讀象為培養細胞時，舉例來說， = 之方法及電穿孔法—一 施經口投予或非舌體内之情況下，舉例來說，可實 射、皮下，予投予。前述非經口投予可列舉如注 夂卜杈予、局部投予等。 子，亦可’本發明之組成物可僅含本發明之sspN分 舉例來說…有t他添加物。前述添加物並未特別受限， 類並未特別&為藥予上可接$之添加物。前述添加物之種 選擇。&限’料彳來說可目應投予對象之種類來適當 與前之組成物中，舉例來說，前述sspn分子亦可 錯化劑。藉^成錯合物。前述添加物舉例來說亦可稱為 送前述哪t形成^述錯合物’舉例來說，可有效率地輸 乃子。前述ssPN分子與前述錯化劑之結合並未 55 201219570 ^別丈限’可列舉如非共價結合。前述錯合物可列舉如内 έ 錯合物（inclusion complexation) 〇 前述錯化劑並未特別受限，可列舉如聚合物、環糊精 及金剛紐等。前料_可列舉如綠環姆共聚物: 線狀氧化環糊精共聚物等。 除此之外，前述添加劑可列舉如載子(carrier)、對目栌 細胞之結合物質、縮合劑及融合劑等。 π 舉例來說’前述載子宜為高分子，更宜為生源高分子。 舉例來說’前述載子宜具生分解性。前述載子可列舉如： 人類血清白蛋白（HSA)、低密度脂蛋白（LDL)、ί東蛋白等之 蛋白質；聚葡糖、聚三葡萄糖(pu丨W—、幾丁質、幾丁聚 糖、菊糖、環糊精、破尿酸等之糖質；脂質等。前述載子 舉例來說亦可使用合成聚胺基酸等之合成聚合物。前述聚 胺基酸可列舉如聚離胺酸(PLL)、聚L-天門冬醯胺酸、聚L_ 麵酿胺酸、笨乙稀，丁稀二酸酐共聚物、聚(l•乳酸交酿_ 7、乙交自曰）共聚物、二乙烯醚-順丁烯二酸酐共聚物、N-(2_ 經丙基）甲基丙烯_共聚物(HMPA)、聚乙 二醇(PEG)、聚 乙稀醇(PVA) '聚胺甲動旨、聚(2_乙基丙稀酸）、N_異丙基 丙雜胺聚合物或聚鱗腈_yphGsphazi㈣等。 m述結合物質可列舉如促甲狀腺激素、促黑細胞素、 集素膽蛋白表面張力素蛋白A(surfactant protein A)、 黏蛋白糖質、多價H多價半乳糖、N_乙醯半乳胺糖、 N_乙醯葡萄糖胺 '多價甘露糖、多價海藻糖、醣化聚胺基 西文、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸鹽（酯）類 56 201219570 (Bisphosphonate)、聚數酸胺酸、聚天門冬醯胺酸、脂質、 膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸鹽、維生素B12、生物素、 納普洛仙(Neproxin)、RGD肽、RDG肽擬似物等。 前述融合劑及縮合劑可列舉如聚乙亞胺(PEI)等之聚胺 基酸鏈等。舉例來說，PEI為直鏈狀及分枝狀中之任—者皆 可，且可為合成物及天然物中之任一者。舉例來說，前述 PEI可經烷基取代，亦可經脂質取代。再者，除此之外，前 述融合劑可使用聚組胺酸、聚咪。坐、聚吼咬、聚丙亞胺、 蜂毒肽(melittin)及聚乙縮醛物質（例如陽離子性聚乙縮酸等） 等。舉例而言，前述融合劑亦可具有01螺旋結構。前述融合 劑舉例來說亦可為蜂毒肽等之膜崩解劑。 舉例而言，本發明之組成物就前述錯合物之形成等可 援用美國專利第6,509,323號、美國專利公報第 2003/0008818號及 PCT/US04/07070號等。 除此之外，前述添加劑可列舉如兩親媒性分子。舉例 而吕，前述兩親媒性分子為具有疎水性區域及親水性區域 之分子。前述分子舉例來說宜為聚合物。舉例而言，前述 聚合物為具有二級結構之聚合物，且宜為具有反復性二級 結構之聚合物。作為具體例’聚例來說宜為多肽，更宜為以 螺旋狀多肽等。 α 前述兩親媒性聚合物舉例來說亦可為具有2個以上兩 親媒性次單元之聚合物。前述次單元_响可列舉如具有 環狀結構之次單元’域·結構具有至W錢水性基及 1個疎水性基1述次單元舉例來說亦可具有膽酸等之類固 57 201219570 醇、芳香族結構等。舉例來說，前述聚合物亦可具有芳香 族次單元等之環狀結構次單元與胺基酸兩者。 制泰規，方法 如前述，本發明之抑制表現方法係一種抑制目標基因 表現之方法，特徵在於使用前述本發明iSsPN分子。本發 明之抑制表現方法係以使用前述本發明之ssPN分子作為特 欲’其他步驟及條件則不受任何限制。 本發明之抑制表現方法中，抑制前述基因表現之機制 並未特別受限，可列舉如RNA干擾或類RNA干擾現象所弓丨 起之抑制表現。於此，舉例來說，本發明之抑制表現方法 係-誘導可抑制前述目標基因表狀RNA干擾的方法，亦 可說是以使用㈣本發明之洲分子為賴之表現誘導方 法。 本發明之抑制表現方法舉例來說包含一對存有前述目 標基因之對象好前述ssPN分子的步驟。透過前述投予步 驟’舉例來說’使前述咖分子躺前述投作象。前述 投予對象可列舉如細胞、_«官。前述料對象可列 投予前述 舉:人類、人類以外之非人哺乳類等之非人動物。前述投 予舉例來說可在活體内（inviv〇)亦可在活體外卜岭 舉例而言，本發明之抑制表現方法可單獨 因應投予對 予含有前述-分子之前述本發明組成 物則从予方法並未特別受限，舉例來說可 象之種類來適當選擇。 6.治療方法 58 201219570 本發明之疾病治療方法係如前述，包含一將前述本發 明之ssPN分子投予患者之步驟，且特徵在於：前述ssPN分 子具有一可抑制前述疾病成因之基因表現的序列作為前述 抑制表現序列。本發明之治療方法係以使用前述本發明之 ssPN分子作為特徵，其他步驟及條件則不受任何限制。本 發明之治療方法舉例來說可援用前述本發明之抑制表現方 法。 7. ssPN分子之用途 本發明之用途係一種用以抑制前述目標基因之表現的 前述本發明ssPN分子的用途。此外，本發明之用途係一種 用以誘導RNA干擾之前述本發明ssPN分子的用途。 本發明之核酸分子係一種用於治療疾病之核酸分子， 前述核酸分子為前述本發明之ssPN分子，且前述ssPN分子 之特徵在於：具有可抑制前述疾病成因之基因表現的序列 作為前述表現抑制序列。 8. 單體 本發明之單體係核酸合成用之單體，其特徵在於具有 下述式(II)之結構。本發明之單體只要未特別表示，即可援 用前述本發明之ssPN分子之說明。 【化4】 59 201219570
/«Λ 3 R'O
舉例來說，本發明之單體於前述本發明之SS：PN分子的 合成過程中，可容易地合成前述式⑴所示之連結區域(Lx) 及連結區域(Ly)。舉例來說，本發明之單體可作為核酸自 動合成用之亞醯胺來使用，例如，可應用於一般之核酸自 動合成裝置。前述合成方法可列舉如亞磷醯胺法及Η·鱗酸 酯法等。 於前述式中， X及X各自獨立為Η〗、〇、s或NH ; Y1及Y各自獨立為單鍵、Ch2、NH、〇或s ; R及R各自獨立為Η、保護基或磷酸保護基； R3係與環Α上之C-3、C-4、C-5或C-6鍵結之氫原子或取 代基； L1係由η個原子所構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原 子上之氫原子可經OH、〇Ra、NH2、NHRa、NRaRb、阳或 SRa取代或是未經取代；或者 L係則述伸烷基鏈之丨個以上碳原子經氧原子取代而 成之聚醚鏈； 但’ Y為贿、〇或8時，與γ|鍵結之的原子為碳與 60 201219570 OR1鍵結之L1的原子為碳，且氧原子彼此不鄰接； L·係由m個原子所構成之伸烷基鏈，於此’伸烷基碳原 子上之氫原子可經OH、〇Re、nh2、NHRe、NReRd、SH或 SRe取代，亦可未經取代；或者 L係前述伸烷基鏈之丨個以上碳原子經氧原子取代而 成之聚键鏈； 但，Y2為NH、0或S時，與γ2鍵結之L2的原子為碳，與 OR2結合之L2的原子為碳，且氧原子彼此不鄰接； R、Rb、Re及“各自獨立為取代基或保護基； 1為1或2 ; m為0〜30範圍内之整數； η為0〜30範圍内之整數； 於％ Α中’刚述環a上之c_2以外的丨個碳原子亦可經氮、 氧或硫取代； 且前述環A内亦可包含碳-碳雙鍵或碳_氮雙鍵。 於刚述式(II)中，與前述式⑴相同處可援用前述式⑴ 之說明。具體來說，於前述式(11)中，例如χ1、χ2、γ1、Y2、 R3、L1、L2、卜m、η及環八可全部援用前述式⑴之說明。 於前述式(U)中，Ri及Μ係如前述，各自獨立為Η、保 護基或磷酸保護基。 舉例來6兒，前述保護基與前述式⑴之說明相同，作為 具體例，則可從群ί選出。前述群!可列舉如二甲氧基三苯曱 基(DMTr)、TBDMS基、ACE基、聰基、c職、⑽基、 TEM基及下柄*之含絲之基團，其中，以DMtf基及前 61 201219570 述含矽基之基團中之任一者為佳 【化5】
OuO
o-s'—o-s·—0-/ I 、Si \// 及 舉例來說，前述磷酸保護基可以下式表示。 -P(OR6)(NR7R8) 於前述式中，R6為氫原子或任意之取代基。舉例來說， 取代基R6宜為烴基’且前述烴基可經電子吸引基取代，亦 可未經取代。取代基R6可列舉如鹵素、鹵烧基、雜芳基、 經烧基、烧氧基烧基、胺基燒基、碎基 '碎氧基院基、雜 環基烯基、雜環基烷基、雜芳基烷基以及烷基、烯基、炔 基、芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、環烷基烷基及環基 院基等之烴等，可更經電子吸引基取代，亦可未經取代。 具體而言，取代基R6可列舉如β_氰基乙基、硝基苯基乙基 及甲基等。 R7及R8各自為氫原子或任意之取代基，且可相同亦可 相異。舉例來說，取代基R7及R8宜為烴基，且前述烴基可 更經任意之取代基取代，亦可未經取代。舉例來說，前述 烴基與前述R6之列舉者相同，且宜為甲基、乙基及異丙基。 此時，具體來說，-NR7R8可列舉如二異丙基胺基、二乙基 62 201219570 胺基及乙基曱基胺基等。或者，取代基R7與R8亦可成為一 體，而與其等所鍵結之氮原子共同（即，-NR7R8成為一體） 形成含氮之環(例如哌啶基、N-咮啉基等）。 舉例來說，前述磷酸保護基之具體例可選自下述群II。 群 II 可列舉如-P(OCH2CH2CN)(N(i-Pr)2)及 -P(OCH3)(N(i-Pr)2)等。於前述式中，i-Pr表示異丙基。 於前述式(II)中，舉例來說，R1及R2中之任一者為Η或 保護基，另一者為Η或磷酸保護基。以下述者為宜：例如， R1為前述保護基時，R2宜為Η或前述磷酸保護基；具體來 說，R1選自前述群I時，R2宜為Η或選自前述群II。此外，以 下述者為宜：例如，R1為前述磷酸保護基時，R2宜為Η或前 述保護基；具體來說，R1選自前述群II時，R2宜為Η或選自 前述群I。 舉例來說，前述式(II)之結構可例示如下述式(ΙΙ-1)〜式 (ΙΙ-9)，於下述式中，η及m與前述式(II)相同。又，於下述 式中，q為0〜10之整數。 【化6】 63 201219570
於前述式（Π-l)〜(II-9)中，η、m及q並未特別受限而如 前所述。具體例可列舉如下：前述式(II-1)中，n=8;前述(II-2) 64 201219570 中n 3，則述式(II-3)中，n=^8 ;前述(Π 4)中，n=7或8 ; 中 ’ n-3^m=4 ;前述⑴◦中 ’ n=wm=4 ;前 述式(II 7)中，n-8&m：=4 ;前述(H_8)中，n=5及爪=4 ;以及， 則述式(II-9)中，q=l&m==4。兹將前述式(Π4)之—例(n=8) 顯示於下述式(II-4a) ’並將前述式(Π 8)之―例(n=5、爪=4) 顯示於下述式(II_8a)。 【化7】
舉例來說，本發明之單體宜含有前述標記物質，其中， 以含有前述穩定同位素為宜。前述標記物質係如前所述。 本發明之單體含有前述穩定同位素等之同位素時，舉 例來說，可簡便地將前述同位素導入前述本發明之ssPN分 子。舉例來說，具有同位素之前述單體可從已導入前述同 位素之吡咯啶骨架的原料及哌啶骨架的原料合成出。前述 吡咯啶骨架之原料可列舉如脯胺酸及脯胺醇等。 以下所例示之流程係以已導入穩定同位素之脯胺酸及 脯胺醇為原料，而將導入有穩定同位素之本發明單體予以 同質化者。以下流程為例示’本發明並不侷限於此。 65 201219570 【化8】
脯胺酸-13C
DMTrO—13CH (/•Pr)2N
HO
脯胺酸-15N
舉例來說，導入有穩定同位素之脯胺醇(例如已導入氘 (D)之脯胺醇）可如下式所示般，以LiAlD4處理脯胺酸而調製 出。 【化9】
舉例來說，導入有穩定同位素之脯胺酸(例如已導入重 氧（180)之脯胺酸)可如下式所示般，於鹼性條件下使脯胺酸 甲酯與H2180反應而調製出。 【化10】
66 201219570 舉例來說，可藉以下流程來合成導入有重氮（I5n)之脯 胺酸（脯胺酸-15N)及導入有重氮（I5N)之脯胺醇（脯胺醇 -15N)。亦即，先使呋喃或四氫呋喃與I5nh3反應，調製出 導入有重氮（15N)之吡咯，使其甲醯化而製得導入有重氮 (15N)之2-甲醯基吡咯。可使其氧化成羧酸並使吡咯部位還 原’而合成出捕胺酸-15N。此外，可藉由令導入有前述重 氮（15N)之2-甲醯基吡咯還原，而合成出脯胺醇_i5N。 【化11】
舉例來說，可藉下述流程來合成前述導入有重碳(13c) 之脯胺酸(脯胺酸-13C)及前述導入有重碳（13C)之脯胺醇⑽ 胺醇-13C)。亦即，首先以前述導入有重碳（13c)之 DMF(DMF-13C)使吡咯曱醯化，製得導入有重碳（13〇之2-曱醯基吡咯。將其氧化成羧酸，並使咄咯部位還原，藉此 可合成出脯胺酸-13C。此外，使前述導入有重碳（13c)之2-曱醯基吡咯還原，可藉此合成出脯胺醇-13C。 【化12】 67 201219570
I [Η]
脯胺酸-13C
脯胺醇-13C 可如此這般地合成導入有穩定同位素之單體，此外， 可將前述單體作為合成用亞醯胺來使用，藉此可合成出穩 定同位素已導入至前述連結區域之核酸分子。 以下藉由實施例等來詳細說明本發明，但本發明不受 其等所偈限。 實施例 (實施例A1) 1.脯胺醇之合成 依照下式所示流程1，合成出經二曱氧基三苯曱基保護 之脯胺醇。 【化13】 68 201219570
流程1 (l)Fmoc-L-脯胺醇（化合物2) 將L-脯胺醇（化合物〇(〇 61§ ’ 6 〇mm〇i)溶解於純水 70mL中，調製出L-脯胺醇水溶液。將N_(9_g基曱氧基羰氧 基）號 ίό 醯亞胺（Fm〇C-〇Su)(2.0g，6.〇mm〇l)溶解於 THF 10mL。將泫THF溶液加至前述脯胺醇水溶液，攪拌丨小時 使兩者反應。使該反應液分離成液體部分⑴叩“ fracti〇n) 與沉殿部分，再以乙酸乙§旨將各部份抽提，分別回收有機 層。接著’合併各個有機層後，添加無水硫_，使其吸 化刀（以下稱為乾燥）。過澹前述有機層，回收遽液，減壓 濃縮前述濾液。將所得殘潰以二氧化錢膠管柱層析法(展 開溶劑己院：乙酸乙醋=1 : υ純化，製得化合卿*， 收率74%)。以下顯示化合物之NMR結果。 J =7.7Hz, Ar-H), 'H-NM^CDC^) : 67.77(2H, d, 69 201219570 7·60(2Η，d，J =7.3Hz, Ar-H), 7.40(2H, t, J =7.5Hz, Ar-H), 7.31(2H, t, J =7.6Hz, Ar-H), 4.40-4.50(2H, m, COOCH2), 4.22(1H, t, J =6.5Hz, Ar-CH), 3.20-3.80(5H, m, H-5, H-6), 1.75(3H, m, H-3, H-4), 1.40(1H, m, H-3). (2)Fmoc-DMTr-L-脯胺醇（化合物3) 使前述Fmoc-L-脯胺醇（化合物2)(1.4g，4.3mmol)溶解 於吡啶20mL中，共沸3次。使所得殘留物溶解於吡啶2〇mL 中。將該溶液於氬氣下且在冰浴中一邊攪拌一邊添加4,4，-二甲氧基三苯曱基氣(DMTr-Cl)(1.8g，5.3mmol)。針對該反 應液，以氣仿/甲醇之TLC追縱反應，至Fmoc-L-脯胺醇之點 (spot)消失為止，使其反應4小時。接著，為了使過剩之 DMTr-Cl淬冷(quench) ’於前述反應液中加入甲醇3mL並檀 拌10分鐘。更於前述反應液中加入氣仿後，回收有機層。 對回收之前述有機層進行飽和食鹽水之洗淨及5%碳酸氫 鈉水溶液之洗淨，再次進行飽和食鹽水之洗淨。以無水硫 酸鈉使洗淨後之有機層乾燥。過濾前述有機層，使所得演 液減壓濃縮。以二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑氣 仿，1%吡啶)純化所得殘渣，製得化合物3(2.0g，收率74%)。 茲將化合物之NMR結果顯示如下。 'H-NMR(CDC13) ： 57.77(2H, d, J ^7.7Hz Ar-H)， 7.60(2Η，d， J =7.3Ηζ，Ar-H)，7·40-7.18(13η，m，Ar H)， 6·89(4Η，d，J =8.6Hz，Ar-H)，4.20-4.40(2H, m，c〇〇CH2)， 4·〇2(1Η，t，J =6.5Hz，Ar-CH)，3.80-3.l〇(5H，m，Η·5, H 6)， 3.73(s, 6H, OCH3), 1.84(3H, m, H-3, H-4), 1.58(iHj m, H-3). 70 201219570 (3)DMTr-L-脯胺醇(化合物4) 使前述Ftnoc-DMTr-L-脯胺醇(化合物3)(2 〇g，3 2mm〇l) 溶解於含20%哌啶之DMF溶液25mL中，攪拌12小時。將該 溶液減壓濃縮，使所得殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法（氣 仿：曱醇=85 : 15，含1%吡啶）純化，製得化合物4(1 〇g， 收率78%)。茲將化合物之nmr結果顯示如下。 H-NMR(CDC13) : 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Ηζ, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.31(1H, m, H-6), 3.07(2H, m, H-2, H-6), 2.90(2H, m, H-5), 1.84(3H, m, H-3, H-4)，1.40(1H，m, H-3) 2.亞醯胺衍生物之合成 其-人’依照下式所示流程2，合成出具有脯胺醇之亞醯 胺衍生物。以下’將κ乙基-3-(3-二曱基胺基丙基)碳二酿亞 胺鹽酸鹽稱為「ΕΟρ ^ ^ Λ u n UC」，將Ν, Ν-二甲基胺基吡啶(4-二甲基 胺基吡啶)稱為「DK!Ap 。 【化14】 71 201219570
(l)DMTr-醯胺-L-脯胺醇（化合物5) 使前述DMTr-L-脯胺醇（化合物4)(〇 8〇g，2 0mm〇1)、 EDC(0.46g，2_4mmol^DMAP(〇 29g，2 4麵〇1)溶解於二 氣甲烷20mL並進行攪拌。於該溶液中添加1〇-羥基癸酸 (0_45g，2.4mmol)並攪拌〇針對該反應液，以乙酸乙酯之TLc 追縱反應，至ϋΜΤι··；ί_脯㈣之點消失為止，使其反應2〇 小時。接著，於前述反應液中添加二氣曱烧後，回收有機 層。將回收之《錢h飽和食鹽核淨後，以無水硫 酸鈉使其乾燥。過濾、前述有機層，將所得麟減麗濃縮， 再使其殘糾4化叫料柱層析法（乙酸乙g|，含1%D比 。定)純化，製得化合物5(〇.7lg，收率a。〆。) 。以下顯示化合物 之NMR結果。 ㈣脈(CDa3):S7,4G_7_14(9H，m，Ar_H)，6.82(4H，d， 72 201219570 J =8.6Hz，Ar-H)，3·78(6Η，s，〇ch3)，3.68-2.93(7H, m，H-2, H-5, H-6)，2.27-l_72(6H，m，烷基，H-3, H-4)，1.58(4H，s，烷 基)，1.30(10H, s，烷基)· (2) DMTr-烷基-L-脯胺醇(化合物6) 使前述DMTr-L-脯胺醇(化合物4)(0.8〇g，2.〇mm〇l)溶解 於甲醇15mL，添加5_經基戊酸；(〇 31g，3.〇mm〇i)並授拌。於 /谷液中添加氰基氫化棚鈉(〇.25g，4.〇mmol) ’更進行攪拌。 針對該反應液’以乙酸乙酯/己烷之TLC追蹤反應，至 DMTr-L-脯胺醇之點消失為止，使其反應24小時。接著， 於前述反應液中添加乙酸乙酯，回收有機層。將回收之前 述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾燥。 過據前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，再使其殘渣以二 氧化矽凝膠管柱層析法（己烷：乙酸乙酯=1 : 1，含l。/^比唆） 純化’製得化合物6(0.62g，收率63%)。以下顯示化合物之 NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz，Ar-H)，3.78(6H，s，OCH3)，3·70-2·86(4Η，m， CHzOH，H-6)，2.〇6-l.79(5H，m，烷基，H-2，H-5)， 1·74-1.49(6η，m，烷基，H 3, H 4)，i 45 1 27(4H，m，烷基) (3) DMTr-胺曱酸酯-L-脯胺醇(化合物7) 使 1，4-丁二醇(0.90g，lOmmol)溶解於二氯甲烧3〇mL， 更添加羰基二咪唑（1.4g，8.6mmol)後攪拌3小時。將該反應 液之有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使其乾 燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，使其殘渣以 73 201219570 一氧化矽凝膠管柱層析法（氣仿：曱醇=9 : 1)純化。藉此， 製知·1，4-丁二醇之一側末端業經羰基二咪唑活性化之化合 物（0.25g’ i.5mm〇1)。將該化合物溶解於二氣曱烷15mL中， 添加則述〇MTr-L_脯胺醇（化合物4)(〇 6g，i.5rnm〇l)，攪拌 24小時。於該混合液中更添加乙酸乙酯，回收有機層。將 回收之則述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使 其乾燥。過據前述有機層，將所得濾液減壓濃縮，使其殘 潰以二氧化妙凝膠管柱層析法（己烷：乙酸乙酯=1 : 1 ’含 1%°比咬）純化，製得化合物7(0.61g，收率77%)。以下顯示 化合物之NMR結果。 H-NMR(CDC13) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2)5 3.78(s, 6H, OCH3)，3.72-2.96(7H，m，烷基，H-2, H-5，H-6)， 2.10-1.30(8H，m，烷基，h_3，H-4).
[ 0 0 0 1 ] (4)DMTr-醯脲-L-脯胺醇(化合物8) 使前述DMTr-L-脯胺醇（化合物4)(〇.5〇g，丨2mm〇1)及三 光氣(0.12g、〇.4〇mm〇l)溶解於二氣曱烷8mL，於氬氣下且 在冰浴中攪拌。接著，對前述溶液添加N，N_二異丙基乙基 胺(0.31g，2.4mmol)，攪拌丨小時。更對前述溶液添加8_胺 基-1-辛醇(O.Pg，1.2_〇1)’同樣於冰浴中搜拌3〇分鐘後， 於室溫下攪拌20小時。於前述溶液中加入二氣曱烷，回收 有機層。將回收之前述有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無 水硫酸鈉使其乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃 74 201219570 縮，並使其殘渣以二氧化矽凝膠管柱層析法（己烷：乙酸乙 酯=4 : 1 ’含1〇/〇三乙胺）純化，製得化合物8(〇 44g，收率 62%)。以下顯示化合物之nmR結果。 'H-NMRCCDCb) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, m, Ar-H)，3.78(s，6H, OCH3), 3·68-3·25(9Η，m, CH2NH，CH2OH, H-2, H-5, H-6)，1.74-1.18(16H，m，烷基，H-3, H-4)_ (5)具有脯胺醇之亞醯胺衍生物（化合物9〜12) 將前述經修飾之脯胺醇(化合物5〜8)分別用作原料，藉 以下所示方法合成出化合物9〜12。將前述經修飾之脯胺醇 及5_苄基硫代-1H-四唑溶解於乙腈3mL中。前述經修飾之脯 胺醇的使用量在化合物5時為0.69g(1.2mmol)，在化合物6 時為0.60g(1.2mmol) ’ 在化合物7時為 〇.60g(l_2mmol)，在化 合物8時為〇.25g(0.43mmol)。此外，5-苄基硫代-1H-四唑之 使用量對於化合物5〜7為0.15g(0.78mmol)，對於化合物8則 是54mg(〇· 15mmol)。於1氣下，對前述溶液添加2-氰基乙 基Ν，Ν，Ν’，N，-四異丙基偶磷基二亞醯胺，攪拌2小時。前 述2-氰基乙基n，N，N’，N’-四異丙基偶磷基二亞醯胺之添加 量在使用前述化合物5〜7之系統中為〇.54g(1.8mmol)，使用 前述化合物8之系統則是〇.19g(0.64mmol)。接著，對前述溶 液添加飽和碳酸氫鈉水溶液’更以二氣曱烷抽提並回收有 機層。使回收之前述有機層以無水硫酸納乾燥。過渡前述 有機層，將所得濾液減壓濃縮，將其殘渣以二氧化矽凝膠 管柱層析法（己烷：乙酸乙酯=1 : 1 ’含1%三乙胺）純化，製 得化合物9〜12。以下顯示各化合物之NMR結果。 75 201219570 DMTr-醯胺-L-脯胺醇亞醯胺（化合物9，0.60g，收率55%) 'H-NMR(CDC13)67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.68-2.93(11H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6), 2.58(2H, m, CH2CN), 2·27-1·72(6Η，m，烷基，H-3，H-4), 1.58(4H, s，烧基）， 1.30(22H，s，烷基，CHCH3). DMTr-烷基-L-脯胺醇亞醯胺（化合物10，0.71g，收率60%) 'H-NMR(CDC13) ： 87.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.70-2.86(8H, m, CH20, POCH2j CHCH3j H-6), 2.58(2H, m, CH2CN), 2.06-1.79(5H，m,烷基，H-2, H-5)，1.74-1.49(6H，m,烷基， H-3, H-4)，1.37-1.10(16H，m，烷基，CHCH3)· DMTr-胺曱酸酯-L-脯胺醇亞醯胺(化合物11，0.67g，收率5 2%) 'H-NMR(CDCl3) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.72-2.96(1 1H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6), 2.58(2H, m, CH2CN), 2.10-1.46(8H，m,烧基，H-3, H-4), 1.34-1.10(12H, m, CHCH3). DMTr-醯脲-L-脯胺醇亞醯胺（化合物12，0.20g，收率61%) 'H-NMR(CDC13)： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, m, Ar-H), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.65-3.25(13H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, CH2NH, CH2OH, H-2, H-5, H-6), 2.73(2H, m, CH2CN)，2.10-1.48(16H，m，烷基，H-3,H-4)，1.35-1.10(12H， 76 201219570 m, CHCH3). (實施例A2) 接著，接著，依照下述式所示流程3，合成出具有L-脯胺酸之亞醯胺衍生物。 【化15】 ov
Fmoc-
Fmoc
D or L 〇：L'L：2 DMTrO(H2C)4 D:5, L:6
-HN^ /N I Ji (iPr^N ! \ /8 s HN. .N Ύ O 流程3 77 12 201219570 (1 )DMTr-羥基醯胺胺基-L-脯胺酸(化合物11) 於冰冷下，將乙酸緩衝液(7mL)加入含有DMTr-醯胺-L-脯胺酸（化合物6)(1.0(^，2.05111111〇丨)及5-羥基戊醛（0.33§， 3.07mmol)之乙醇溶液(7mL)。於冰冷下將該混合液攪拌2〇 分鐘後’加入氰基氳化刪納（0.77g，12.28mmol)，更於室溫 下攪拌7小時。以二氣曱烧稀釋前述混合液，再以水洗淨 後，更以飽和食鹽水洗淨之。接著，回收前述有機層，以 硫酸納使其乾燥。過渡前述有機層，針對渡液，於減壓下 顧除溶劑。將所得殘渣供至二氧化矽凝膠管柱層析法(展開 溶劑CH2CI2 : CH3OH=98 : 2，含0.05%口比。定）。接著，將戶斤 得生成物供至二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑 CH2C12 : CH3OH=98 : 2，含0.05%口比。定），更將所得生成物 供予二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑二氣曱烷：丙酮 =7 : 3，含0.05%吡啶）。藉此，製得無色糖漿狀之化合物 ll(0.49g，收率41%)。
Ms(FAB + ) : m/z 575(M+)、303(DMTr+) (2)DMTr-醯胺胺基-L-脯胺酸亞醯胺（化合物12) 將所得前述DMTr-羥基醯胺胺基-L-脯胺酸（化合物 ll)(0.50g，0.87mmol)與無水乙腈混合，在室溫下共沸乾 燥。對所得殘留物添加四σ坐二異丙基敍 (diisopropylammonium tetrazolide)(178mg，1.04mmol)，減 壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物添加無水乙腈（lmL)， 更加入2-氰基乙氧基-N，Ν，Ν’，Ν’-四異丙基偶磷基二亞醯 胺（313mg，1.04mmol)之無水乙腈溶液（lmL)。於氬氣環境 78 201219570 下將該混合物於室溫下攪拌4小時。接著，以二氣曱烷稀釋 前述混合物’再依序以飽和碳酸氫鈉水及飽和食鹽水洗 淨。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。 針對所得前述濾液’於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予 使用胺基一氧化石夕作為充填劑之管柱層析法（展開溶劑己 烧：丙酮=7 : 3，含0.05%吡啶），製得無色糖漿狀之化合物 12(0.5<7g ’純度93%，收率79%)。前述純度係以HPLC測定（以 下相同）。以下顯示化合物之NMR結果。 'Η-ΝΜΚ(€Ό€13)：δ7.41-7.43(ηι, 2Η, Ar-H)'7.28-7.32(m, 4H, Ar-H)、7.25-7.27(m，2H，Ar-H)、7.18-7.21(m, 1H, Ar-H)、6.80-6.84(m，4H, Ar-H)、3.73-3.84(m, lH)、3.79(s, 6H, OCH3)、3.47-3.64(m，3H)、3.12-3_26(m，2H)、3_05(t，J =6.4Hz，2H，CH2)、2.98-2.02(m，2H)、2.61(t，J =5_8Hz，2H， CH2)、2.55-2.63(m，2H)、2.27-2.42(m，1H，CH)、2.31(t，7.8Hz， 2H，CH2)、2.03-2.19(m，1H, CH)、1.40-1.90(m，8H)、 1.23-1.33(m，5H)、1.14-1.20(m，12H，CH3); P-NMR(CDC13) ： 5146.91 ；
Ms(FAB + ) : m/z 774(M + )、303(DMTr + )， 201(C8H19N2OP+). (3)DMTr-羥基醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸(化合物13) 於氬氣環境下，對已溶有DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物 6)(l_00g ’ 2.05mmol)之無水乙腈溶液（l〇mL)，於室溫下加 入已溶有1-咪唑羰氧基-8-羥基辛烷（1.12g，4.92mmol)之無 水乙腈溶液(20mL)。於40〜50°C下將該混合液加熱2天後， 79 201219570 室溫下放置5天。針對前述混合液，減壓下餾除溶劑。將所 得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑二氣曱 烷：丙酮=4 : 1 ’含0.〇5%吡啶）。藉此，製得無色糖漿狀之 化合物13(0.68g，收率50%)。以下顯示化合物之NMR結果。 'H-NMR (CDC13) : 57.40-7.42(m，2H，Ar-H)、7.27-7.31 (m，6H，Ar-H)、7.17-7.21(m，1H，Ar-H)、6.79-6.82(m，4H， Ar-H)、4.23-4.30(m，1H)、4.05-4.10(m, 2H)、3,79(s，6H, OCH3) ' 3.60-3.65(m, 2H) > 3.32-3.55(m, 2H) ' 3.16-3.29(m, 2H), 3.01-3.07(m，2H)、2,38-2.40(m，1H, CH)、l_83-l_90(m， 2H)、1.57-1,69(m，8H)、1.26-1.36(m，2H);
Ms(FAB + ) : m/z 602(M+)、303(DMTr+). (4)DMTr-醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸亞醯胺（化合物14) 將所得前述DMTr-羥基醯胺胺甲醯基-L-脯胺酸（化合 物13)(0.63g，l.OOmmol)與無水吡啶混合，於室溫下共沸乾 燥。對所得殘留物添加四唑二異丙基銨（2〇6mg， 1.20mm〇l) ’減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加入無 水乙腈（lmL)，更加入2-氰基乙氧基_N，N, N，，Ν’-四異丙基 偶碟基二亞醯胺（282mg，1. l2mmol)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下將混合物於室溫下攪拌4小時。接著， 以二氣甲烷稀釋前述混合物，依序以飽和碳酸氫鈉水及飽 和食鹽水洗淨。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前 述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘 渣供予充填劑使用胺基二氧化矽之管柱層析法（展開溶劑 己院.丙嗣=7 : 3，含0.5%吡啶），製得無色糖漿狀之化合 80 201219570
物14(0.74g’純度100%，收率87%)。以下顯示化合物之NMR 結果。 P-NMR(CDC13) ： 8147.19 ；
Ms(FAB + ) ： m/z 860 (Μ + )、303(DMTr + )， 201(C8H19N2OP+). (5) DMTr-t-第三丁基二甲基矽氧基醯胺醯脲-L-脯胺酸(化 合物15) 於氬氣環境及冰冷下’對三光氣（1.22g，4.10mmol)加 入無水四氫呋喃溶液（l〇mL)。於氬氣環境及冰冷下，以30 分鐘對該混合液中滴定溶有DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物 6)(1.00g，2.05mmol)及DIEA(9.80g，75.8mmol)之無水四氫 呋喃溶液（10mL)，之後’室溫下攪拌1小時。於氬氣環境及 冰冷下，對前述混合液以45分鐘滴定溶有ι〇_胺基_ι_第三丁 基二甲基矽氧基癸烷(2.66g，l〇.25mmol)及DlEA(3.20g， 24.76mmol)之無水四氫呋喃溶液(20mL)。接著，於氬氣環 境下將前述混合物於室溫下攪拌一夜。以乙酸乙酯（200mL) 稀釋該混合液’回收有機層。將前述有機層以飽和碳酸氫 鈉水洗淨後，更以飽和食鹽水洗淨。接著，回收有機層， 以硫酸納使其乾燥。過遽前述有機層，針對滤液，於減壓 下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展 開溶劑二氯曱烷：丙酮=4 : 1，含0.05%吡啶）。藉此，製 得無色糖漿狀之化合物15(0.87g，收率55%)。 (6) DMTr-經基醯胺醯脲-L-脯胺酸化合物（μ) 於氬氣環境下，將無水四氫呋喃二氣甲烷溶液（lOmL) 81 201219570 於室溫下加入所得前述DMTr-第三丁基二曱基矽氧基醯胺 醯脲-L-脯胺酸（15)(0.87g，1.12mmol)。於氬氣環境下，於 前述混合液中加入lmol/L含有氟化四丁基銨之四氫呋喃溶 液(4.69mL，東京化成），於室溫下攪拌3天。以二氯甲烷 (15 OmL)稀釋前述混合液，再以水洗淨後，更以飽和食鹽水 洗淨之。回收有機層，以硫酸納乾燥後，過渡前述有機層。 針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧 化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑二氣曱烷：丙酮=1 : 1，含 0.05%吡啶），製得無色糖漿狀之化合物16(0.68g，收率 92%)。以下顯示化合物之NMR結果。 'H-NMR (CDC13) ： 67.41-7.43 (m, 2H, Ar-H)、 7.27-7.31(m, 4H, Ar-H)、7.19-7.26(m, 2H, Ar-H)、 7.19-7.21(m, 1H, Ar-H)、6.80-6.83(m, 4H，Ar-H)、4.34(t，2H， CH2)、3.79(s, 6H, OCH3)、3.63(d, 1H, J =6.4 Hz, CH2)、 3.61(d, 1H, J =6.4Hz, CH2) ' 3.34-3.37(m, 1H, CH)、 3.16-3.27(m, 5H), 3.04(t, J =5.9Hz, 2H, CH2) ' 2.38-2.45(m, 1H, CH)' 1.83-2.05(m, 3H)' 1.45-1.64(m, 8H) ' 1.25-1.38(m, 7H). (7)DMTr-醯胺醯脲-L-脯胺酸亞醯胺（化合物17) 將所得前述DMTr-羥基醯胺醯脲-L-脯胺酸（化合物 16)(0.62g，0.94mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾 燥。於所得殘留物中加入四。坐二異丙基敍（192mg， 1.12mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合液加入無 水乙腈（lmL)，更加入2-氰基乙氧基-Ν,Ν,Ν’，Ν’-四異丙基 82 201219570 偶碳基二亞醯胺（282mg，1.12mmol)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下將該混合物於室溫下攪拌4小時。接 著’以二氣曱烷稀釋前述混合物，再依序以飽和碳酸氫鈉 水及飽和食鹽水洗淨。回收有機層，以硫酸鈉乾燥後，過 濾前述有機層。針對所得前述濾液，於減壓下餾除溶劑。 將所得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽之管柱層析法 (展開溶劑己烷：丙酮=1 : 1，含有0_05°/❶吡啶），製得無色 糖漿狀之化合物17(0.77g，純度88%，收率84%)。以下顯示 化合物之NMR結果。 P-NMR(CDC13) : δ147.27 ;
Ms(FAB + ) : m/z 860(M + + 1) ' 303(DMTr + )， 201(C8H19N2OP + ). (實施例A3)脯胺酸二醯胺亞醯胺之合成 為了生成含有具脯胺酸骨架之連接子的本發明核酸分 子，利用前述流程3合成出L-脯胺酸二醯胺亞醯胺及D-脯胺 酸二醯胺亞醢胺。 (B3-1 )L-脯胺酸二醯胺亞醯胺 (l)Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物4) 將前述流程3之化合物2(Fmoc-L-脯胺酸）作為起始原 料。混合前述化合物2(10.00g，29.64mmol)、4-胺基-1-丁醇 (3.18g，35.56mmol)及 1-經基苯并三坐（10.90g， 70.72mmol)，對前述混合物，於減壓下脫氣後充填氬氣。 於室溫下對前述混合物加入無水乙腈（140mL)，更添加二環 己基碳二亞胺（7.34g，35.56mmol)之無水乙腈溶液(7〇mL) 83 201219570 後，於氬氣環境下，於室溫下攪拌15小時。反應結束後遽’ 別所生成之沉澱’針對所回收之濾液，於減壓下餾除溶劑。 於所得殘渣中加入二氣曱烷（2〇〇mL)，以飽和碳酸氫鈉水 (200mL)洗淨之。接著回收有機層，以硫酸鎂乾燥後，過濾 前述有機層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑，對其殘 渣添加二乙_(2〇〇mL)而粉末化。藉由濾取產生之粉末，獲 得無色粉末狀之化合物4(l〇.34g ’收率84%)。以下顯示前 述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13)： 87.76-7.83(m, 2H, Ar-H)> 7.50-7.63(m, 2H, Ar-H)' 7.38-7.43 (m, 2H, Ar-H)' 7.28-7.33(m, 2H, Ar-H), 4.40-4.46(m, 1H, CH), 4.15-4.31(m, 2H, CH2), 3.67-3.73(m, 2H，CH2)、3.35_3.52(m，2H, CH2)、3.18-3.30(m, 2H，CH2)、 2.20-2.50(m，4H)、1.81-2.03(m，3H)、1.47-1.54(m, 2H);
Ms(FAB + ) : m/z409(M + H+). (2)DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6) 將Fmoc-經基酼胺-L-脯胺酸（化合物4)(7_8〇g， 19.09mmol)與無水吡啶（5mL)混合，於室溫下共沸乾燥2 次。對所得殘留物添加4, 4’-二甲氧基三苯曱基氣(8.20g， 24.20mmol)、DMAP(23mg ’ 0.19mmol)及無水η比^(39mL)。 於室溫下搜摔該混合物1小時後，加入甲醇（7.gmL)，於室 溫下稅掉30分鐘。以二氯曱烧（100mL)稀釋該混合物，並以 飽和碳酸氫鈉水(150mL)洗淨後，分離有機層。將前述有機 層以硫酸鈉乾燥後，過壚'前述有機層。針對所得淚液，於 減壓下餾除溶劑。對所得未純化殘渣添加無水二甲基甲醯 84 201219570 胺(39mL)及哌啶（18.7mL ’ l89mmol)，室溫下攪拌丨小時。 反應結束後，針對前述混合液，於減壓下以室溫餾除溶劑。 將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法（商品名Wak〇gel C-300，展開溶劑 CH2C12 : CH3OH=9 : 1，含〇.〇5%吡啶）， 製得淡黃色油狀之化合物6(9.11g，收率98%)。以下顯示前 述化合物之NMR結果。 H-NMR (CDC13)· 57.39-7.43(m, 2H, Ar-H)'7.30(d, J =8.8Hz，4H，Ar_H)、7, 21(tt，1H, 4.9, 1.3Hz, Ar-H)、6.81(d， J =8.8Hz，4H，Ar-H)、3.78(s, 6H，OCH3)、3.71(dd, H，J =6.3Hz，5.4Hz，CH)、3.21(2H，12.9, ό·3Ηζ，2H，CH2)、3.〇5(t， J =6.3Hz，2H，CH2)、2.85-2.91(m，2H，CH2)、2-08-2.17(m， 1H，CH)、1.85-2.00(m，3H)、1.55-1.65(m，5H);
Ms(FAB + ) ; m/z 489(M + H+)、303(DMTr+). (3)DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸(化合物8) 混合所得前述DMTr-醯胺-L-脯胺酸(化合物6)(6.01g， 12.28mmol)、EDC(2.83g，14.74mmol)、1-經基苯并三 〇坐 (3.98g，29.47mmol)及三乙胺（4.47g，44_21mmol)之無水二 氣甲烷溶液（120mL)。更於氬氣環境下，以室溫對該混合液 添加6-羥基己烧酸（1.95g ’ 14.47mmol)，之後，於氬環境下 以室溫攪拌1小時。以二氣曱烷(6〇〇mL)稀釋前述混合液， 並以飽和食鹽水(800mL)洗淨三次。回收有機層，使前述有 機層以硫酸納乾燥後，過滤前述有機層。針對所得渡液， 於減壓下餾除溶劑。藉此，製得淡黃色泡沫狀之前述化合 物8(6.29g，收率85%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 85 201219570 'H-NMR (CDC13) ： 57.41-7.43(m, 2H, Ar-H)、 7.27-7.3 l(m, 4H, Ar-H)、7.19-7.26(m, 2H, Ar-H)、 7.17-7.21(m, 1H, Ar-H)、6.79-6.82(m, 4H, Ar-H)、 4.51-4.53(m，1H, CH)、3.79(s, 6H，OCH3)、3-61(t，2H, J =6_4Hz，CH2)、3.50-3.55(m，1H，CH)、3.36-3.43(m, 1H，CH), 3.15-3.24(m, 2H, CH2), 3.04(t, J =6.3Hz, 2H，CH2)、 2.38-2.45(m，1H，CH)、2.31(t，6.8Hz, 2H，CH2)、2.05-2.20(m， 1H，CH)、1.92-2.00(m, 1H，CH)、1.75-1.83(m，1H，CH)、 1.48-1.71(m，8H)、1.35-l_44(m，2H，CH2);
Ms(FAB + ) : m/z 602(M+)、303(DMTr+). (4)DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞醯胺（化合物10) 將所得前述DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸（化合物 8)(8.55g，14.18mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥 3次。於所得殘留物中添加四唑二異丙基銨（2.91g， 17.02mmol)，於減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物力口 入無水乙腈（10mL)，更加入2-氰基乙氧基-N, N，N’，Ν’-四異 丙基偶磷基二亞醯胺（5.13g，17.02mmol)之無水乙腈溶液 (7mL)。於氬氣環境下，將該混合物於室溫下攪拌2小時。 接著，以二氯甲烷稀釋前述混合物，並以飽和碳酸氫鈉水 (200mL)洗淨3次後，以飽和食鹽水(200mL)洗淨。回收有機 層並以硫酸鈉乾燥後，過滤前述有機層。針對所得前述滤 液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填劑使用胺基 二氧化矽凝膠之管柱層析法（展開溶劑己烷：乙酸乙酯 =1 : 3，含0.05%吡啶），製得無色糖漿狀之化合物10(10.25g， 86 201219570 純度92%，收率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13)： 57.40-7.42(m, 2H, Ar-H)'7.29-7.3l(m, 4H, Ar-H)、7.25-7.27(m，2H，Ar-H)、7_17-7_21(m, 1H, Ar-H)、6.80-6.82(m, 4H，Ar-H)、4.51-4_53(m，1H，CH)、 3.75-3_93(m，4H)、3.79(s，6H，OCH3)、3.45-3.60(m，4H)、 3_35-3_45(m，1H，CH)、3.20-3.29(m，1H)、3.04(t, J =6.4Hz， 2H，CH2)、2.62(t，J =5_8Hz, 2H，CH2)、2_40-2.44(m，1H, CH)、2_31(t，7.8Hz，2H，CH2)、2.03-2.19(m，1H，CH)、 1.92-2.02(m, 1H, CH) ' 1.70-1.83(m, 1H, CH) ' 1.51-1.71(m, 8H)、1.35-1.44(m，2H, CH2)、1.18(d，J =6.8Hz，6H, CH3)、 1.16(d, J =6.8Hz, 6H, CH3)； P-NMR(CDC13) ： Ms6147.17 ；
Ms(FAB + ) : m/z 802(M + )、303(DMTr + )， 201(C8H19N2OP + ). (B3-2)D-脯胺酸二醯胺亞醯胺 (l)Fmoc-羥基醯胺-D-脯胺酸(化合物3) 將前述流程3之化合物l(Fmoc-D-脯胺酸）用作起始原 料。對於前述化合物l(1.5g，4.45mmol)、二環己基碳二亞 胺（l.lg，5.34mmol)及 1-經基苯并三嗤（i.5g，l〇.69mmol) 之混合物’減壓下脫氣後填充氬氣。於室溫下對前述混合 物添加無水乙腈（24mL)，更添加4-胺基-1-丁醇（〇.48g， 5.34mmol)之無水乙腈溶液(6mL)後，於氬氣環境下，於室 溫下攪拌15小時。反應結束後濾別所生成之沉澱，針對回 收之濾液’於減壓下餾除溶劑。對所得殘渣加入二氣曱烷， 87 201219570 以乙酸緩衝液(PH4.0)洗淨3次，並以飽和碳酸氣鈉水洗淨3 次。接著回收有機層，以硫酸鎂乾燥後，過濾前述有機層。 針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑，於其殘渣中加入二乙 醚(5〇mL) ’使其粉末化。藉由濾取產生之粉末，獲得白色 私末狀之化合物3。以下顯示前述化合物之NMR結果。
'H-NMR (400MHz, CDC13) ： 67.77(d, J =7.3Hz, 2H) · 7-58(br, 2H) ; 7.41(t, J =7.3Hz, 2H) ； 7.32(t, J =7 3H d2， 2H) ； 4.25-4.43(m, 4H) ； 3.25-3.61(m, 6H) ； 1.57-1.92(m, 8H) MS(FAB + ) ： m/z 409(M+H+). (2)DMTr-醯胺-D-脯胺酸(化合物5) 將Fmoc-羥基醯胺-D-脯胺酸(化合物3)(l.〇g，2.45mmQl) 與無水吡啶(5mL)混合，室溫下共沸乾燥2次。對所得殘留 物添加4, 4，-二甲氧基三苯甲基氣（1.〇5g，3 1〇_〇丨）、 DMAP(3mg，〇.024mm〇i)及無水吡啶（5mL)。於室溫下攪拌 §亥混合物1小時後加入曱醇（lmL)，於室溫下搜拌30分鐘。 以二氣曱烷稀釋該混合物，以飽和碳酸氫鈉水洗淨後，分 離有機層。將前述有機層以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機 層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。於所得未純化之 殘渣中加入無水二甲基甲醯胺（5rnL)及哌啶（2.4mL， 24mmol) ’於室溫下攪拌丨小時。反應結束後，針對前述混 合液，於減壓下且於室溫下餾除溶劑。將所得殘渣供予二 氧化矽凝膠管柱層析法（商品名Wak〇gei C-300，展開溶劑 CHfl2 : CH3〇H=9 : 1 ’含〇.〇5%吡啶），製得淡黃色油狀之 化合物5(1.26g，收率96%)。以下顯示前述化合物之NMR結 201219570 果。 'H-NMR(400MHz, CDC13) ： 57.62(br, 1H) ； 7.41-7.44(m, 2H) ； 7.26-7.33(m, 6H) ； 7.17-7.22(m, 1H) ； 6.80-6.84(m, 4H)；3.78(s, 6H)；3.71(dd, J =8.8, 5.4Hz, lH)；3.22(q, 6.5Hz, 2H)；3.07(t, J -6.1Hz, 2H)； 2.97-3.03(m, 1H) ； 2.85-2.91(m, 1H) ； 1.85-2.15(m, 3H) ； 1.55-1.73(m, 6H)； MS (FAB + ) ： m/z 489(M + H+), 303(DMTr+). (3)DMTr-羥基二醯胺-D-脯胺酸(化合物7) 混合所得前述DMTr-醯胺-D-脯胺酸（化合物5)(1 _2g， 2.45mmol)、EDC(566mg，2.95mmol)、1-經基苯并三。圭 (796mg，5.89mmol)及三乙胺（1.2mL，8.84mmol)之無水二 氣曱烷溶液(24mL)。更於氬氣環境下且於室溫下，對該混 合液加入6-羥基己烷酸(390mg，2.95mmol)，之後於氬氣環 境下且於室溫下攪拌1小時。以二氣甲烷稀釋前述混合液， 再以飽和碳酸氫鈉水洗淨3次。回收有機層，以硫酸鈉乾燥 前述有機層後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓 下餾除溶劑。藉此，製得淡黃色油狀之化合物7(1.4g，收率 95%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 1H-NMR(400MHz, CDC13) ： 67.40-7.43(m, 2H) ； 7.25-7.32 (m, 6H) ； 7.17-7.22(m, 1H) ； 6.79-6.83(m, 4H) ； 3.79(s, 6H)； 3.58-3.63(m, 2H) ； 3.49-3.55(m, 1H) ； 3.15-3.26(m, 2H)； 3.02-3.07(m, 2H) ； 2.30-2.33(m, 2H) ； 2.11-2.20(m, 1H)； 1.50-1.99(m, 13H) ； 1.36-1.43(m, 2H)； MS (FAB + ) ： m/z 602(M+), 303(DMTr+). 89 201219570 (4)DMTr-二醯胺-D-脯胺酸亞醯胺(化合物9) 將所得前述DMTr-羥基二醯胺-D-脯胺酸（化合物 7)U，2g，1.99mmol)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾燥3 次°對所得殘留物添加四唑二異丙基銨（41〇mg， 2’40mm〇l) ’減壓下脫氣並充填氬氣。對前述混合物添加無 水乙腈(2.4mL)，更添加2-氰基乙氧基-N，N，N，，N，-四異丙 基偶磷基二亞醯胺（722mg，2.40mmol)。於氬氣環境下且於 室溫下攪拌該混合物2小時。接著，以二氣曱烷稀釋前述混 合物’再以飽和碳酸氫納水洗淨3次後，以飽和食鹽水洗淨 之。回收有機層，並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。 針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予充填 劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法（展開溶劑己烷： 乙酸乙酯=1 : 3)，製得無色油狀之化合物9(1.4g，純度95%， 收率83%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'Η-ΝΜΚ(400ΜΗζ, CDC13) : 57.40-7.43(m, 2H)； 7-25-7.32(m, 6H) ； 7.14-7.21(m, 1H) ； 6.80-6.83(m, 4H)； 3-80-3.85(m, 2H) ； 3.79(s, 6H) ； 3.49-3.65(m, 5H)； 3-02-3.〇6(m, 2H) ； 2.60-2.63(m, 2H) ； 2.29-2.33 (m, 2H)； L77，1.82(m，2H) ; 1.56-1.68(m，8H) ; 1.38-1.43(m, 2H); 18H)； 3IP-NMR( 162MHz, CDC13) ： 6146.94 ； MS(FAB + ) ： m/z 802(M + ), 303(DMTr + ), 2〇1(C8H19N2OP + ). (實施例A4) 90 201219570 為了生成含有具脯胺酸骨架之連接子的本發明核酸分 子，利用下述流程4，合成出L-脯胺酸二醯胺亞醯胺b型。 【化16】
Fmoc·
(CH2)4OH TBDMSO(H2C)4 α -ΝΗ 〜ilH
Vr ► Fmoc， TBDMSO(H2C)4 HIT _ 18
22 Fmoc: 9-劈基甲氧額基 TBDMS·第三丁基一甲基砂基 〇^^11^:4,4'-一甲氧基二本甲基 (Fmoc:9-fluorenylmethyloxycarbonyl) (TBDMS: tert-butyldimethylsilyl) (DMTr:4,4'- dimethoxytrityl) 流程4 (l)Fmoc-第三丁基二甲基矽氧基醯胺_L_脯胺酸(化合物18) 混合Fmoc-羥基醯胺-L-脯胺酸（化合物4)(2.00g， 30mmol)、第三丁基二曱基矽基氣（i Ug，35mmol)及咪唑 (10.90g，71mmol)。對於前述混合物，於減壓下脫氣後充 填鼠氣。於至溫下將無水乙猜(2〇mL)加入前述混合物，於 氬氣環境下且於室溫下攪拌整夜。反應結束後，於前述混 合物中加入二氣甲烷（150mL)，以水洗淨3次，再以飽和食 鹽水洗淨。回收有機層並以硫酸鎂乾燥後，過濾前述有機 91 201219570 層。針對所得濾液，於減壓下餾除溶劑，將其殘渣供予二 氧化矽凝膠管柱層析法(展開溶劑CH2Cl2 :CH3OH=95 : 5)， 製得無色糖漿狀之化合物丨8(2 35g，收率92%)。以下顯示 前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 67.76-7.78(m, 2H, Ar-H)' 7.50-7.63(m, 2H, Ar-H)' 7.38-7.42(m, 2H, Ar-H)' 7.29-7.34(m, 2H, Ar-H), 4.10-4.46(m, 4H, CH2)5 3.47-3.59(m, 4H, CH2)' 3.20-3.26(m, 2H，CH)、1.85-1.95(m，2H)、1.42-1.55(m，6H)、0.96(s, 9H， t-Bu)、〇.〇2(s，6H，SiCH3);
Ms(FAB + ) : m/z 523(M + H+). (2)第三丁基二甲基矽氧基醯胺_L_脯胺酸(化合物19) 對所得前述Fmoc-第三丁基二甲基矽氧基醯胺-L-脯胺 酸（化合物18)(1.18g，2.5mmol)加入無水乙腈（5mL)及哌啶 (2.4mL) ’於室溫下攪拌1小時。反應結束後，對前述混合 物加入乙腈（50mL)，濾別不溶物。針對所得濾液，於減壓 下餾除溶劑，將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法(展 開溶劑CH2C12 : CH3OH=9 : 1)，製得無色糖漿狀之化合物 19(0.61g，收率90%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 53.71(dd, 1H, J =9.0Hz, 5.2Hz, CH)、3.61-3.64(m，2H，CH2)、3.22-3.28(m，2H，CH2)、 2.98-3.04(m，1H，CH)、2.86-2.91(m, 1H，CH)、2.08-2.17(m， 1H，CH)、1.86-1.93(m，1H，CH)、l_66-1.75(m，2H，CH2)、 1.52-1.57(m，4H)、0.89(s, 9H，t-Bu)、0_05(s，6H，SiCH3); Ms(FAB + ) *. m/z 301(M+H+). 92 201219570 (3) 第三丁基二曱基矽氧基醯胺羥基醯胺_L_脯胺酸(化合物 20) 混合所得則述第二丁基二甲基矽氧基醯胺_L_脯胺酸 (化合物 19)(550mg ’ 1.8mmol)、6_經基己烷酸（3〇〇mg， 2.3mmol)、EDC(434mg，2.3mm〇l)及丨_ 羥基苯并三唑 (695mg，4.5mmol)之無水二氯曱烷溶液(2〇mL)。於氬氣環 境下且於室溫下’將二乙胺（689mg，6.8mmol)加入前述混 合物，之後於氬氣裱境且室溫下攪拌整夜。以飽和食鹽水 洗淨前述混合液。回收有機層，使前述者以硫酸鈉乾燥後， 過濾前述有機層。針對所得濾液，於減壓下顧除溶劑。將 所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑 CH2C12 : CH3〇H=9 : 1)，製得無色糖漿狀之化合物 20(696mg，收率92%)。以下顯示前述化合物iNMR結果。 ^-NMRCCDCU) ： 64.54(d, 1H, CH)' 3.58-3.67(m, 5H) ' 3.52-3.56(m, 1H, CH), 3.32-3.39(m, 1H), 3.20-3.25(m, 2H) ' 2.40-2.43(m, 1H, CH) > 2.33(t, J =7.3Hz, 2H, CH2) ' 2.05-2.25(m，2H)、1.93-2.03(m，1H，CH)、1.75-l_85(m, 1H, CH)、1.50-1.73(m，8H)、1.37-1.46(m，2H, CH2)、0.87(s，9H， t-Bu)、0.04(s，6H，SiCH3);
Ms(FAB + ) ： m/z 415(M+ + 1). (4) DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸B型（化合物21) 將所得前述第三丁基二甲基矽氧基醯胺羥基醯胺-L-脯胺酸(化合物20)(640mg，1.54mmol)與無水吡啶（imL)混 合，於室溫下共沸乾燥。於所得殘留物中加入4, 4，-二甲氧 93 201219570 基三苯甲基氣（657mg，1.85mmol)、DMAP(2mg)及無水吡 啶(5mL)，室溫下攪拌4小時後，加入曱醇（lmL)並於室溫下 攪拌30分鐘。以二氣曱烷稀釋前述混合物，並以飽和碳酸 氫鈉水洗淨之。回收有機層並以硫酸鈉乾燥後，過濾前述 有機層。針對所得渡液，於減壓下館除溶劑。於所得殘潰 中加入無水乙腈（5mL)及含有lmol/L氟化四丁基銨之四氫 呋喃溶液（1.42mL，氟化四丁基銨1.42mmol)，室溫下搜拌 一整夜。反應結束後，對前述混合物加入乙酸乙酉旨 (100mL)，以水洗淨後，以飽和食鹽水洗淨。回收有機層並 以硫酸鈉乾燥後，過濾前述有機層。針對所得濾液，於減 壓下餾除溶劑。將所得殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法 (展開溶劑CH2C12 : CH3OH=95 : 5，含0.05%吡啶），製得 無色糖漿狀之化合物21(680mg’收率73%)。以下顯示前述 化合物之NMR結果。 ^^^00013):67.41-7.44^, 2H, Ar-H)^ 7.26-7.33(m, 4H, Ar-H) ' 7.18-7.21(m, 2H, Ar-H) ' 7.17-7.21(m, 1H,
Ar-H)、6.80-6.84(m，4H, Ar-H)、4.51-4.53(d, 6.8Hz，1H， CH)、3.79(s，6H，OCH3)、3.61(dd，2H，J =llHz, 5.4Hz, CH2) ' 3.50-3.54(m, 1H, CH) > 3.36-3.43(m, 1H, CH), 3.20-3.26(m, 2H, CH2), 3.05(t, J =6.4Hz, 2H, CH2) ' 2.38-2.45(m, 1H, CH) ' 2.30(t, J =7.8Hz, 2H, CH2)、 2.05-2.25(m, 1H, CH)、1.92-2.00(m, 1H，CH)、1.75-l_83(m， 1H，CH)、1.52-1.67(m, 8H)、1.35-1.45(m，2H，CH2);
Ms (FAB + ) : m/z 602(M+)、303(DMTr+). 94 201219570 (5)DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞醯胺b型（化合物22) 將所得前述DMTr-羥基二醯胺-L-脯胺酸B型（化合物 2l)(637mg ’ 1.06mm〇l)與無水乙腈混合，於室溫下共沸乾 燥。對所得殘留物加入四唑二異丙基敍（2〇img， 1.16mmol)，於減壓下脫氣並充填氬氣。對前述混合物加入 無水乙腈（lmL) ’更加入2_氰基乙氧基 基偶磷基二亞醯胺（350mg，116mm〇1)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下且室溫下，將該混合物攪拌4小時。 以二氣甲烷稀釋前述混合物，再以飽和碳酸氫鈉水及飽和 食鹽水洗淨。时有機層’以顧純驗，過濾前述有 機層。針對所得濾液’於減壓下鑛_。將所得殘渣供 予充填劑使用胺基-氧切凝膠之管柱層析法(展開溶劑
己烷：丙酮=7 : 3)，製得盔A 评無色糖漿狀之化合物22(680mg， 純度95%，收率76%)。以下骷_ & 卜顯不前述化合物之NMR結果。 ㈣說(CDa3)n7 43(m，2H，Ar_H)、7 25 7 32(m， 4H，Ar-H)、7.17-7.22(m，2Η，Αγ_η)、6 8〇 6 83(m, 4h， Ar-H)'4.53(d, J =7.8Hz, ljj CH)、3_75-3.93(m, 3H)、3.79(s, 6H, OCH3) ' 3.46-3.68(m sh、λ ，5H)、3.34-3.41(m，1H, CH)、
3_10-3.31(m，1H，CH)、3 〇s“ T •U5(t，J =6.3Hz，2H，CH2)、2.62(t， J =6.3Hz, 2H, CH2) ' 2.39ο 2-46(m, 1H, CH) ' 2.29(t, 7.3Hz, 2H，CH2)、2.03-2.19(m，lH rm , ^ n，CH)、I.%·〗.〇〇(m，ih，CH)、 1.70-1.83(m, 1H, CH) ^ 1 5l , Α·51-1.7ΐ(ηι，8Η)、1.35-1.45(m，2H， CH2)、1.18(d，J =6.4 Hz, raj、 ’州，CH3)、i.i6(d，J=6.4Hz，6H， CH3)； 95 201219570 P-NMR (CH3CN) 5146.90 ；
Ms (FAB + ) : m/z 803(M++ l) ' 3〇3(DMTr+) (實施例A5) 為了生成含有具脯胺酸骨架之連接子的本發明核酸分 子，利用下述流程5，合成出DMTr-醯胺伸乙基氧基乙基胺 基-L-脯胺酸亞醯胺（以下，稱為peg間隔子型）。 【化17】 (CH2)4ODMTr
6
HO
(CH2)4ODMTr NH 23
流程5 -► (l)DMTr-醯胺羥基乙氧基乙基胺基-L-脯胺酸(化合物23) 混合DMTr-醯胺-L·脯胺酸（化合物6)(1.〇0g， 2.05mmol)、4-曱苯石夤酸2-(2-經基乙氧基）乙基酯（3.i〇g， 12.30mmol)及石炭酸卸（〇.85g，6.15mmol)之無水二甲基甲醯 胺溶液（10mL)，於氬氣環境下且室溫下攪拌4天。針對前述 混合物，於減壓下且室溫下餾除溶劑後，加入二氣甲烧 (20mL)後過濾。濃縮濾液，將所得殘渣供予二氧化碎凝膠 96 201219570 管柱層析法。前述二氧化矽凝膠管柱層析法之添加溶纲係 首先使用含0.05%吡啶之乙酸乙酯，之後使用含0〇5%α&咬 之CH2C12與CH3OH之混合液(CH2C12: CH3OH=9 : 1)。結果， 製得無色糖漿狀之化合物23(l_15g，收率97%)。以下顯示 前述化合物之NMR結果。 1H-NMR(CDCl3)：67.41-7.45(m, 2H, Ar-H)' 7.27-7.3l(m
6H，Ar-H)、7.17-7.21(m，1H，Ar-H)、6.79-6.82(m, 4H
Ar-H)、3.79(s，6H, OCH3)、3.60-3.70(m，2H)、3.39-3.57(m 4H)，3.13-3.27(m，3H)，3.07-3.08(m，2H)、2.71-2.84(m， 1H)、2.38-2.46(m，1H)、2.14-2.19(m, 1H)、1.84-1,87(m 1H) ' 1.57-1.76(m, 8H). (2) DMTr-醯胺伸乙基氧基乙基胺基-L-脯胺酸亞醯胺(化合物24) 將所得前述DMTr-醯胺羥基乙氧基乙基胺基_L-脯胺酸 (化合物23)(0.63g，l.OOmmol)與無水。比啶混合，室溫下共沸 乾燥。對所得殘留物加入四唑二異丙基銨（206mg， 1.20mmol)，減壓下脫氣後充填氬氣。對前述混合物加入無 水乙腈（lmL)，更加入2-氰基乙氧基-N，N，Ν’ ’ Ν’-四異丙 基偶碟基二亞感胺（282mg ’ l_12mmol)之無水乙腈溶液 (lmL)。於氬氣環境下且於室溫下攪拌該混合物4小時。接 著’以二氯甲炫稀釋前述混合物，並以飽和碳酸氫鈉水及 飽和食鹽水洗淨。回收有機層’以硫酸鈉乾燥後，過濾前 述有機層。針對所得前述濾、液，於減壓下餾除溶劑。將所 得殘渣供予充填劑使用胺基二氧化矽凝膠之管柱層析法 (展開溶劑己烷：丙酮=7 : 3，含0.05%吡啶），製得無色糖 97 201219570 漿狀之化合物24(0.74g，純度100%，收率87%)。以下顯示 前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CD3CN) ： 57.41-7.43(m, 2H, Ar-H)、 7.28-7.31(m, 6H, Ar-H)、7.18-7.22(m, 1H, Ar-H) ' 6.84-6.86(m, 4H, Ar-H) ' 3.73-3.84(m, 2H, CH2) ' 3.79(s, 6H, OCH3)、3.47-3.64(m, 7H)、3.15-3.23(m，1H)、3.11(t，J =6.4Hz, 2H, CH2)'3.01(t, J =5.9Hz, 2H, CH2)' 2.95-2.99(m, 1H) > 2.58-2.63(m, 2H) > 2.31-2.35(m, 1H, CH) ' 2.03-2.19(m, 1H，CH)、l_48-1.78(m，10H)、1.12-1.57(m, 12H，CH3); P-NMR(CD3CN) ： 5148.00 ；
Ms(FAB + ) : m/z776(M+)、303(DMTr+)201(C8Hl9N2OP+). (實施例A6) 1.受保護脯胺醇之合成 依照以下所示流程6，合成受到二甲氧基三苯甲基保護 之脯胺醇(化合物3)。 【化18】 98 201219570
流程6
(1) 三氟乙醯基-L-脯胺醇(4匕合物1) 將L-脯胺醇（2.0g，20mmol)溶解於THF20mL。另一方 面，使三氟乙酸乙S旨（3.0g，21mmol)溶解於THF20mL。接 著，將後者之THF溶液滴定至前者之含L-脯胺醇的THF溶 液，攪拌12小時。使該反應液減壓濃縮，製得化合物1(3.7g， 收率97%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 •H-NMRCCDCla) : 64.28-4, 23(1.OH, m, OH), 3.90-3.41(5H, H-2, H-5, H-6, m), 2.27-1.77(4H, H-3, H-4, m). (2) 三氟乙醯基-DMTr-L-脯胺醇(化合物2) 將所得前述三氟乙醢基-L-脯胺醇（化合物1)(3.7g， 19mmol)溶解於吡啶中，於室溫下共沸乾燥3次。使所得殘 留物溶解於吡啶15mL中，在氬環境下，於冰浴中一邊攪拌 一邊加入4，4’-二甲氧基三苯曱基氣（DMTr-Cl)(8.1g， 99 201219570 24mmol)，更於室溫下反應4小時。接著，為了使過剩之 DMTr-Cl淬冷，於前述反應液中更加入甲醇10mL並槐拌10 分鐘。之後，於前述反應液加入二氯甲烷，以飽和碳酸氫 鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨。使洗淨後之已回收有機層以 硫酸鈉乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮’並 將其殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑 CH2C12 : CH3OH=95 : 5，含0.1%吡啶），製得已純化之化合 物2(8.5g，收率89%)。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： 57.39-7.18(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8·6Ηζ，Ar-H)，3·78(6Η, s，OCH3), 3.70-3.41(5H，H-2, H-5, H-6, m)，2.19-1.85(4H，H-3, H-4, m). (3)DMTr-L-脯胺醇(化合物3) 使所得前述三氟乙醯基-DMTr-L-脯胺醇（化合物 2)(5g，lOmmol)溶解於THF l〇〇mL。於該THF溶液中加入5% 風氧化納水溶液lOOmL並授拌。於此溶液中加入〖Μ之氟化 四正丁基胺(TBAF)溶液5mL，於室溫下攪拌12小時。以飽 和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨該反應液。使洗淨後 之已回收有機層以硫酸鈉乾燥。過濾前述有機層，使所得 ;慮液減壓濃縮，製付化合物3 (3.6g，收率90%) ο以下顯示 前述化合物之NMR結果。 H-NMR(CDC13) ： 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 3.78(6H, s, OCH3), 3.31(1H, m, H-6), 3.07(2H, m, H-2, H-6), 2.90(2H, m, H-5), 1.84(3H, m, H-3, H-4), 1.40(1H, m, H-3). 100 201219570 2.亞醯胺衍生 使用前述「1」所合成之受保瘦膽胺酵（化合物3)，利 用下述流程7，合成出結合形式不同且具有脯胺醇之亞醯胺 衍生物。 【化19】
流程7 (l)DMTr-胺甲酸醋_L_脯胺醇(化合物4) 使 1，8-辛二醇(9 〇g，62mmol)溶解於THF 90mL，置於 氬環境下。另一方面，將幾基二咪η坐(2_〇g，i2mmol)溶解 於THF 10mL中。將後者之THF溶液加入前者之THF溶液 中’於室溫下攪拌1小時。以水洗淨該反應液至1，8-辛二醇 之TLC點消失為止。更將洗淨後所回收之有機層以飽和食 鹽水洗淨，以無水硫酸鈉使回收之有機層乾燥。過濾前述 有機層，將所得渡液減壓濃縮。將其殘渣供予二氧化妙凝 膠管柱層析法(展開溶劑CH2C12 : CH3OH=95 : 5)，製得已 純化之化合物。該化合物為1，8-辛二醇之單側末端已藉羰 基二咪唑而活性化之化合物(2.3g，收率77%)。 將前述化合物〇.9g溶解於乙腈1〇〇1[中，置於氬環境 101 201219570 下。另一方面，使〇]^1>-1^脯胺醇（化合物3)(1.98,4.8111111〇1) 溶解於乙腈20mL中。將後者之乙腈溶液加入前述前者之乙 腈溶液，於室溫下攪拌24小時。接著，以飽和碳酸氫鈉水 溶液與飽和食鹽水洗淨該反應液，以無水硫酸鈉使回收之 有機層乾燥。過濾前述有機層，將所得濾液減壓濃縮。將 其殘渣供予二氧化矽凝膠管柱層析法（展開溶劑二氣甲 烷：丙酮=9 : 1，含〇·1%吡啶），製得已純化之化合物4(脯 胺醇胺曱酸酯亞醯胺）（1.5g，收率65%)。以下顯示前述化合 物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) : 67.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J=8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.72-2.96(7H, m, alkyl, H-2, H-5, H-6) 2.10-1.30(16H, m, alkyl, H-3, H-4)； FAB-MS ： 576 [ M + H] +. (2)DMTr-酿脲-L-脯胺醇(化合物5) 於氬環境下’使三光氣（2.〇g ’ 6.7mmol)溶解於thf 10mL中，並於0°C下攪拌。另一方面，使DMTr-L-脯胺醇(化 合物3)(1.38,3.21!1111〇1)及1^斗二異丙基乙基胺（16§， 124mmol)溶解於THF l〇mL中，滴定至前述三光氣之THF溶 液。將該反應液於0°C下攪拌1小時，接著於室溫下攪拌2小 時。之後’將8-胺基-1-辛醇(2.3g，16mmol)及N，N-二異丙 基乙基胺(5.0g，38mmol)溶解於THF 30mL中。於0。(：下將前 述攪拌後之反應液滴定至該THF溶液中1小時，接著於室溫 下槐拌48小時。將該反應液減壓濃縮，使其殘溃溶解於二 102 201219570 浪與飽和食鹽水洗淨該溶 i有機層乾燥。過渡前述有機 氣甲烷。以飽和碳酸氫鈉水a 液，並以無水硫酸鈉使回收 糾工、、，丄 " 將其殘渣供予!£相二氧化矽 層，將所得濾液減壓濃縮後’ ’ „日.々令，成m人士 展開溶劑使用含有0.1%吡 凝膠管柱層析法而純化。此時 , λ 前述丙酮與水之混合比例採 啶之丙酮與水的混合溶劑，々 # ，則是使丙酮.水之莫耳比依 步進式(stepwise)，具體來説’、 卜 順序變化。以二氯曱烷抽提 照2 : 8、3 : 7、4 : 6及5 : 5厶 <有機層以無水硫酸鈉乾燥。 含有目的化合物5之分液，佚# >濟滅歷濃縮’製得化合物5(脯 過濾前述有機層，使所得濾麻 _ < /iQ%)。以下顯示前述化合物之 胺醇醯脲亞醯胺)(0.9g，收率4y NMR結果。 *H-NMR(CDC13) ： 67.40-7.H(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, m,
Ar-H)，3.78(s，6H，OCH3)，3·68-3.25(9Η, m, CH2NH，CH2OH， H-2, H-5, H-6)，1.74-1.18(16H，m，alky1，H_3, H_4)， FAB-MS : 575〔M + H〕' (3)具有脯胺醇之亞醯胺衍生物（化合物6及7) 作為經修飾脯胺醇，將所得前述化合物4(0.8〇g， 1.4mmol)溶解於乙腈，於室溫下共彿乾燥3次。使所得殘留 物溶解於乙腈lmL，置於氬環境下。對該乙腈溶液添加四 0坐二異丙基銨(0_24g，1.4mmol)而作為反應液。另一方面， 使2-氰基乙基N，N，N’，Ν’-四異丙基偶磷基二亞醯胺 (0.50g，1.7mmol)溶解於乙腈imL中。將其添加至前述反應 液中，於室溫下攪拌4小時。對前述反應液添加二氣曱烧， 以飽和碳酸氫鈉水溶液與飽和食鹽水洗淨。以無水硫酸鈉 103 201219570 使洗淨後之已回收有機層乾燦，過遽前述有機層，將所得 濾液減壓濃縮。將其殘渣供予胺基二氧化矽凝膠管柱層析 法(展開溶劑己烷：丙酮=10 : 1，含0.1%吡啶），製得已純 化之化合物6(DMTr-胺曱酸酿心脯胺醇亞醯胺）(〇 9〇g，收 率83°/。）。以下顯示前述化合物之NMR結果。 'H-NMR(CDC13) ： δ7.40-7.14(9Η, m, Ar-H), 6.82(4H, d, J =8.6Hz, Ar-H), 4.24-3.94(2H, m, COOCH2), 3.78(s, 6H, 〇CH3), 3.72-2.96(11H, m, CH2〇, P〇CH2} CHCH3, H-2, H-5, H-6), 2.58(2H, m, CH2CN), 2.1〇-1.46(16H, m, alkyl, H-3, H-4), 1.34-1.10(12H, m, CHCH3)； 31P-NMR(CD3CN) ： 8146.82 ； FAB-MS : 776〔 M + H〕+. 除了使用前述化合物5取代前述化合物4來作為前述經 修飾脯胺醇以外，同樣地進行處理，製得已純化之化合物 7(DMTr-醯脲-L-脯胺醇亞醯胺)(〇.80g，收率74%)。以下顯 示前述化合物之NMR結果。 'H-NMRCCDCb) ： 57.40-7.14(9H, m, Ar-H), 6.82(4H, m5 Ar-H), 3.78(s, 6H, OCH3), 3.65-3.25(13H, m, CH2〇, P〇CH2, CHCH3, H-2, CH2NHs CH2OHs H-2, H-5, H-6), 2.73(2H, m, CH2CN), 2.10-1.48(16H, m, alkyl, H-3, H-4), 1.35-l.l〇(12H, m, CHCH3)； 3IP-NMR(CD3CN) ： δ 146.83 ； FAB-MS : 775〔M + H〕+. (實施例B1)RNA之固相合成 104 201219570 合成出具有本發明之連接子的RNA。RNA係以亞磷醯 胺法為準且利用核酸合成機（商品名ABI Expedite(註冊商 才示）8909 Nucleic Acid Synthesis System，Applied Biosystems) ’從3’端側朝向5,端側合成。前述合成中，RNA 亞醯胺係使用 RNA Phosphoramidites(2，-0-TBDMSi，商品 名’三千里製藥）(以下相同前述亞醯胺之脫保護係依定 法進行，合成之RNA係以HPLC純化。於以下之實施例中， 只要無特別表示，即相同地進行RNA之合成。 具體來說，作為本實施例之RNA(Ex)，合成出具有前 述流程2之前述化合物〖2作為連接子的ssRNA(pH 〇〇〇丨）。首 先，合成出下述序列編號1所示序列之RNA。接著，於前述 RNA之5’末端連結前述化合物12。再透過前述化合物12， 於前述序列編號1所示RNA之5,端側合成出下述序列編號2 所示序列之RNA。 5’-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3,(序列編號 1) 5，-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3,(序列編號 2) 茲將如此合成之ssRNA稱為實施例之 ssRNA(PH-OOOl)。前述PH-0001係如下述序列編號3所示 般，構造如下：於5’端側具有前述序列編號2之rna序列， 且於3 ’端側具有前述序列編號丨2RNA序列’前述RNA序列 則透過連接子Lx(即前述化合物12)而呈連結。此外，如下 述序列所示，前述序列編號2之RNA序列與前述序列編號1 之RNA序列具有互補之序列。因此，前述pH_〇〇〇1係如下式 所示般’自黏合而採柄結構(stem structure)。此外，於下述 105 201219570 序列中’底線部分guugucauacuucucaugg(序列編號 4)係與GAPDH基因之表現抑制相關的領域。
Ex : PH-0001 (序列編號 3)
5 -CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-Lx-GGCUGUUGU CAUACUUCUCAUGGUIJ-15 【化20】 CCAUGAGAAGUAUGAC7^ACAGCC\ UUGGUACUCUUCAUACUGirUGtrCGG/ ^ 另一方面’作為不具有本發明之連接子的比較例 RNA，則合成RNAi陽性控制組（pc)之下述 shRNA(NH-OOOl)。如下所示般，前述NH-0001中，5,區域 之以大寫字母表示的序列與前述PH-0001同為序列編號2之 RNA序列，3 ’區域之以大寫字母表示的序列則與前述 PH-0001同為序列編號1之RNA序列。且，前述NH-0001在 序列編號2之RNA序列與序列編號1之RNA序列之間，具有 以小寫字母表示之RNA序列來取代前述化合物π作為連接 子。前述NH-0001與前述PH-0001相同地如下式所示般，自 黏合而形成柄，採取shRNA結構。此外，下述序列中，底 線部分GUUGUCAUACUUCUCAUGG(序列編號4)係與表 現抑制相關之區域。
Pc : NH-0001 (序列編號 5)
5，-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCCccacaccGGCUGUU GUCAUACUUCUCAUGGUU-35 【化21】 106 201219570 UU GGUACU CUU CAUACU GUU GU C GG ,
CCA (實施例B2)HCT116細胞中之GAPDH基因表現抑制效果 使用本發明之RNA，確認活體外（in vitro)之GAPDH基 因表現抑制。 (1)材料及方法 使用前述實施例B1之ssRNA(PH-0001)作為實施例之 RNA(Ex)。使前述RNA溶解於注射用蒸餾水（大琢製藥，以 下相同）至所需濃度（Ιμιηοΐ/L、5pmol/L、25pmol/L)，調製 出RNA溶液。 細胞使用 HCT116 細胞（DS Pharma Biomedical Co.，Ltd) ’培養基使用含有l〇%FBS之McCoy’s 5A(Invitrogen)培養基，令培養條件為37°C及5%C〇2下。 首先，於前述培養基中培養HCT116細胞，將400pL之 該培養液分別注入24井皿中而成為2χ104細胞/井。更將前述 井中之細胞培養24小時後’使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商品名，Invitrogen)，依照前述轉染試劑所附規程 (protocol)將前述RNA進行轉染。具體來說，則是將前述每 井之組成設定如下並進行轉染。此外，於前述井中，令前 述RNA之最終濃度為 lnmol/L、5nmol/L、25nmol/L。 107 201219570 表1 (每井之組成：μί) 培養液 400 (A)Lipofectamine 2000 1.5 (B)Opti-MEM (Invitrogen) 98 (C)RNA溶液 0.5 合計 500 轉染後，將前述井中之細胞培養24小時，之後使用 RNeasy Mini Kit(Qiagen，荷蘭）’依照所附規程回收rnA。 接者’使用逆轉錄轉（商品名Superscript III，Invitrogen)， 依照所附規程而從前述RNA合成出cDNA。接著，如同以下 所示般，以合成出之前述cDNA為模板進行PCR，測定 GAPDH基因之表現量以及為内部標準之β-肌動蛋白基因的 表現量。前述GAPDH基因之表現量已藉前述β-肌動蛋白基 因之表現量來修正。 前述PCR使用 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(商品名，Roche)作為試劑，並使用Light Cycler DX400(商品名，Roche)作為機器（以下相同）。前述GAPDH 基因及β-肌動蛋白基因之擴增分別使用以下之引子組。 GAPDH基因用PCR引子組 5 ’-GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3 ’(序列編號 7) 5，-TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3 ’(序列編號 8) β-肌動蛋白基因用引子組 5 ’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3，（序歹丨J 編號 9) 108 201219570 5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(序列編號 i〇) 此外’作為控制組1 ’亦對僅添加前述(Β)1〇〇μΕ之細胞 測定基因表現量(-)。又’作為控制組2，亦對除了在轉染過 程中未添加前述RNA溶液而添加前述(Α)1.5μί與前述(Β)共 ΙΟΟμί以外經同樣處理之細胞測定基因表現量（mock)。 而就修正後之GAPDH基因表現量，則令控制組㈠之表 現量為1，求出已導入各RNA之細胞的表現量相對值。 (2)結果 茲將其等之結果示於第4圖。第4圖為顯示GAPDH基因 表現量相對值之圖表，縱軸為基因表現相對量。如第4圖所 示般’前述實施例B1之PH-0001並未損及抑制表現活性。此 外，可以想見，前述PH-0001已藉由前述化合物12(本發明 之連接子）而安定化。 (實施例B3)人類血清中之安定性 針對本發明之RNA，確認人類血清中之安定性。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例B1之 ssRNA(PH-OOOl)。比較例之RNA則使用前述實施例B1所示 之RNAi陽性控制組(pc)的前述shRNA(NH-0001)。 首先，於lxPBS中，將混有前述RNA及正常人類血清 (MP Biomedicals)之混合液30μ1以37°C保溫。於前述混合液 30μ1中’令前述RNA之添加量為60pmol，前述正常人類血 清之添加量為最終濃度10%。接著，從開始保溫起算，於〇 小時後、0_5小時後、1小時後及2小時後，藉苯酚·氯仿抽 109 201219570 提而使反應停止。使所得抽提液於15%聚丙烯醯胺凝膠電 泳後，以SYBR Green 11(商品名，Lonza)染色，並使用 E-BOX-VX2(MS機器，東京）分析。 (2)結果 故將其結果不於第5圖。第5圖為顯示安定性之電泳照 片。於第5圖中，巷(lane)「M」為分子量標記，⑻表示保 溫時間。 如第5圖所示’由天然核苷酸構成之比較例NH-0001於 保溫0_5小時後即已開始迅速的分解反應，結果，已確認於 0.5〜2小時之全部結果均是RNA尺寸較〇小時之結果更小。 相對於此，含有本發明之連接子的實施例PH-0001則幾乎未 確認到伴隨保溫時間經過之泳動度變化，亦即，幾乎未確 認到因分解而引起的分子量減少。由此一結果證實，可藉 由使用具有本發明之連接子的RNA來提高人類血清中之安 定性。 (實施例B4)HCT 116細胞中GAPDH基因之表現抑制效果 合成出具有含脯胺酸之下式連接子的ssRNA ’確認 GAPDH基因之表現抑制效果。 【化22】
(CH2)4〇-( 110 201219570 (1)材料及方法 (l.l)ssRNA之固相合成 與前述實施例B1同樣地藉由亞磷醯胺法合成出前述 RNA。 實施例之RNA(Ex)使用以下所示之ssRNA(PK-0004)。 於下述序列中，「Lx」及「Ly」分別為含脯胺酸之前述式(化 22)的連接子。合成前述SSRNA時，依序列編號11，使用前 述RNA亞醮胺（商品名RNA Phosphoramidites，三千里製 藥），從3端側起合成RNA，「Lx」及「Ly」之部位連結有 前述實施例A3-1所合成出之DMTr-二醯胺-L-脯胺酸亞醯胺 (流程3之化合物10)。此外，於前述序列中， GUUGUCAUACUUCUCAUGG(序列編號4)之序列係與表 現抑制相關的區域。 【化23】
Ex ssRNA (序列編號11) 5,- ^augagaaguaugacaacagcc^Lx-^GCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGtJUC-Ly-gaa , z Yc 比較例之RNA使用RNAi陰性控制組（Nc)之 ssRNA(PK-0003)。於下述序列中，「Lx」及「Ly」分別為 含脯胺酸之前述式(化22)之連接子。合成前述SSRNA時，依 序列編號12，使用前述RNA亞醯胺（商品名RNA Phosphoramidites ’三千里製藥）’從3，端側起合成RNA，「Lx」 及「Ly」之部位則連結有前述實施例A3合成出之DMTr-二 醯胺-L-脯胺酸亞醯胺（流程3之化合物1〇)。此外，使用擾亂 序列（scramble sequences)來取代前述與表現抑制相關之序 111 201219570 列。 【化24】 N C s s R N A (序列編號12) 5, - ^caucaacgauaagugaaagccrLx-GGCUTJUCAcuUAUCGUUGAUGGCUUC-Ly-gaa -3'
Xc z 代 (1.2)基因之表現抑制 將已冷凍保存之前述RNA溶解於注射用蒸餾水（大琢 製藥）而成為20pmol/L，調製出RNA溶液。 使用前述RNA溶液，與前述實施例B2同樣地確認 HCT116細胞中之GAPDH基因表現量。此外，於轉染過程 中，每井之組成係設定如下。於下述組成中，（B)為 Opti-MEM(Invitrogen)，（C)為 20pmol/L之前述RNA溶液， 兩者合計添加98.5μ1。於前述井中，前述RNA之最終濃度為 lnmol/L、3nmol/L、10nmol/L。 表2 (每井之組成：μΐ^) 培養液 400 (A) Lipofectamine 2000 1.5 (B) +(C) 9^5 合計 500 (2)結果 茲將該等結果示於第6圖。第6圖為圖表，顯示GAPDH 基因表現量之相對值。如第6圖所示，具有本發明之連接子 的實施例PK-0004顯示強烈之抑制基因表現活性，其活性對 投予量呈相依性。另一方面’陰性控制組之PK-0003則未觀 112 201219570 察到抑制效果。 (實施例B5)截切器（dicer)蛋白質之反應性 確認重組人類蛋白質對於s s RN A (業經具有脯胺酸之連 接子取代）的反應性。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例B4之 ssRNA(PK-0004)。比較例之RNA則使用前述實施例B4所示 RNAi陰性控制組(Nc)之ssRNA(PK-0003)及以下所示RNAi 陽性控制組(Pc)之ssRNA(NK-0016)。前述NK-0016構造如 下：前述5’側區域(Xc)及前述内部5’側區域(X)、前述3,側 區域(Yc)及前述内部3 ’側區域(Y)與前述PK-0004為相同序 列，前述Xc與X之間、Yc與Y之間具有聚核苷酸作為連接子 以取代前述PK-0004之前述式（化22)的連接子(Lx、Ly)。 【化25】
Pc :ΝΚ—0016 (序列編號 13) 5’_ caugagaaguaugacaacagccCCACRCCpGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUcuucGaaa -3
Yc 使用 Coldshock-DICER(商品名，Takara-Bio)作為試 劑，依照所附規程調製含有前述戴切器蛋白質與前述rNa 之反應液，於37 C下將其保溫。令保溫時間為〇、3、6、9 小時。對已保溫預定時間後之前述反應液加入前述試劑之 反應停止液，進行15¾聚丙稀醯胺凝膠電泳。之後，以sybr Green II(商品名，Lonza)將前述聚丙烯醯胺凝膠染色，並使 用E-B〇X-VX2(商品名，MS機器）進行分析。 113 201219570 (2)結果與考察 茲將該等結果示於第7圖。第7圖顯示截切器蛋白質對 ssRNA之反應性的電泳結果。於第7圖中，巷「Mj為分子 量標記(20bp、30bp、40bp及5〇bp) ’（h)表示前述保溫時間。 由天然核苷酸構成之比較例NK-0016與前述戴切器蛋 白質迅速反應，至9小時後已消失。相對於此，具有含舖胺 酸之連接子的RNA，即實施例之PK-0004與陰性控制組之 PK-0003則緩緩與前述截切器反應，因此，即使在9小時後 亦未完全消失。由此結果得知，可藉由具有含脯胺酸之連 接子來提高細胞内之安定性。亦即，若一併考慮抑制基因 表現效果之結果’可以想見，具有含脯胺酸之連接子的本 發明RNA具有可使細胞内之RNA干擾效果持續性提高的效 果。 (實施例B6)A549細胞及293細胞中之GAPDH基因的表現 抑制效果 使用業經具有脯胺酸之連接子取代的ssRNA，確認活 體外之GAPDH基因表現抑制。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例B4之 ssRNA(PK-0004)。比較例之RNA則使用前述實施例B4所示 RNAi陰性控制組(Nc)之ssRNA(PK-0003)。使前述RNA溶解 於注射用蒸餾水（大塚製藥）而成為20gmol/L，調製出RNA 溶液。 細胞使用A549細胞及293細胞（DS Pharma 114 201219570
Biomedical)。前者之培養基使用含10%FBS之 DMEM(Invitrogen)，後者之培養基則使用含l〇%FBS之 MEM(Invitrogen)培養基。令培養條件為37°C及5%C〇2下。 首先，於前述培養基中培養細胞，並將該培養液以 400μΕ分別注入24井皿而成為5χ104細胞/井。更將前述井中 之細胞培養24小時後，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(商 品名，Invitrogen)，依照前述轉染試劑所附規程而進行轉 染。具體來說，則是針對A549細胞及293細胞，分別將前述 每井之組成設定如下並進行轉染。於下述組成中，（B)為 Opti-MEM(商品名，Invitrogen)，（C)為20pmol/L之前述RNA 溶液，將兩者合併添加98.5pL或99μΙ^。此外，於前述井中， 令前述RNA之最終濃度為 lnmol/L、3nmol/L、10nmol/L。 表3 (每井之組成：μ!>) Α549細胞 293細胞 培養液 400 400 (A) Lipofectamine 2000 1.5 1 (BVKC) 98.5 99 合計 500 500 轉染後，與前述實施例Β4同樣地進行前述細胞之培 養、RNA回收、cDNA合成及PCR，測定GAPDH基因之相 對表現量。 (2)結果 115 201219570 茲將該等結果示於第8及9圖。第8圖為A549細胞之結 果，第9圖為293細胞之結果。第8及9圖為顯示GApDH基因 表現量相對值之圖表。如第8及9圖所示，得知實施例之 PK-0004顯示出強烈之抑制基因表現活性，且顯示出濃度相 依性之效果。另一方面，陰性控制組之ρκ_〇〇〇3則未觀察到 抑制效果。 (實施例B7)HCT116細胞中之GAPDH基因表現抑制效果 使用業經具脯胺酸或脯胺醇之連接子取代的ssRNA， 確認HCT116細胞中之GAPDH表現抑制效果。 (1)材料及方法 (l.l)ssRNA之固相合成 作為實施例之RNA(Ex ssRNA)，與前述實施例B4相同 地合成出Ex ssRNA。前述RNA之合成只要未特別顯示，gp 以前述實施例B4為準。 【化26】
Ex s s RNA (序列編號11) 5匕 ^augagaaguaugacaacagcc-Lx-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-Ly-jgaa , -3^ Xc Z Yc 連接子用亞醯胺使用前述實施例A3-1合成之L-脯胺酸 二醯胺亞醯胺（流程3之化合物10)、前述實施例A6合成之脯 胺醇胺甲酸酯亞醯胺（流程7之化合物6)、脯胺醇醯脲亞醯胺 (流程7之化合物7)、脯胺酸醯胺-胺亞醯胺（流程3之化合物 12)及脯胺酸醯胺醯脲亞醯胺（流程3之化合物17)。針對合成 出之各RNA，將用於合成連接子部之亞醯胺顯示於下表。 116 201219570 表4 ssRNA 用於.Lx及Ly之亞醯胺 PK-0004 L-脯胺酸二醯胺亞醯胺 (流程3之化合物丨〇) PK-0006 脯胺醇胺甲酸酯亞醯胺 (流程7之化合物6) PK-0010 脯胺酸醯胺-胺亞醯胺 (流程3之化合物12) PK-0012 脯胺酸醯胺醯脲亞醯胺 (流程3之化合物丨7) PK-0016 脯胺醇醯脲亞醯胺 (流程7之化合物7) (1.2)基因之表現抑制 除了使用前述RNA以外，與前述實施例B4同樣地進行 對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及 PCR，測定GAPDH基因之相對表現量。 (2)結果 茲將該等結果示於第10圖。第10圖係顯示HCT116細胞 之GAPDH基因表現量相對值的圖表。如第10圖所示，得知 含脯胺酸或脯胺醇之ssRNA(PK-0004、PK-0006、PK-001 〇、 PK-0012、PK-0016)顯示出強烈的抑制基因表現活性，且顯 示出濃度相依性之效果。 (實施例B8)HCT 116細胞中之GAPDH基因表現抑制效果 使用業經具脯胺酸之連接子取代的ssRNA，確認 HCT116細胞中之GAPDH表現抑制效果。 (1)材料及方法 (l.l)ssRNA之固相合成 作為實施例之RNA(Ex ssRNA)，與前述實施例B4相同 地合成出Ex ssRNA。只要無特別表示，前述RNA之合成係 以前述實施例B4為準。 117 201219570 【化27】
Ex s s R ΝΛ (序列編號11) 5,- caugagaaguaugacaacagcc-Lx-(pGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUUC-Ly-jgaa | -3/ Xc Z Yc 連接子用亞醯胺係使用前述實施例A3-1合成之D-脯胺 酸二醯胺亞醯胺（流程3之化合物9)及前述實施例A4合成之 脯胺酸二醯胺亞醯胺B型（流程4之化合物22)。針對合成出 之各RNA，將用於合成連接子部之亞醯胺顯示於下表。 表5 ssRNA 用於Lx及Ly之亞酿胺 PK-0034 D-脯胺酸二醯胺亞醯胺 (流程3之化合物9) PK-0036 脯胺酸二醯胺亞醯胺B型 (流程4之化合物22) PK-0004 L-脯胺酸二醯胺亞醯胺 (流程3之化合物10) (1.2)基因之表現抑制 除了使用前述RNA以外，與前述實施例B4同樣地進行 對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA合成及 PCR，測定出GAPDH基因之相對表現量。 (2)結果 茲將該等結果顯示於第11圖。第11圖係顯示HCT116細 胞之GAPDH基因表現量相對值的圖表。如第11圖所示，得 知含脯胺酸之ssRNA(PK-0004、PK-0034、PK-0036)顯示出 強烈的抑制基因表現活性，且顯示出濃度相依性之效果。 (實施例B9)活體外之TGF-βΙ基因表現抑制效果 使用業經具有脯胺酸之連接子取代的ssRNA，確認 Hepal-6細胞中之TGF表現抑制效果。 (1)材料及方法 118 201219570 (l.l)ssRNA之固相合成 作為貫施例之RNA，合成出以下所示之ρκ 〇〇〇7、 ΡΚ_0026 ' ΡΚ-0027、ΡΚ-0028。只要無特別表示，前述RNA 之合成係以前述實施例B4為準。連接子用亞醯胺則使用前 述實施例A3-1合成之L_脯胺酸二醯胺亞醯胺（流程3之化合 物10)。各RNA具有可抑制TGF-y基因表現之21個鹼基長的 下述序列。該序列係基於Cheng氏等人所使用的siRNA(Mol. Pharm.，2009，6，772-779)為準而設計者。於下述序列中， 「木」表示自由驗基。 TGF-β 1基因抑制表現序列（序列編號i 8) 5 ’-AAAGUCAAUGUAC AGCUGCUU-3， 【化28】 ΡΚ-0 0 0 7 (序列編號14) 5’- |cagguguacauugacuuuagcc7Lx-GGCUAAAGUCAAUGUACAGCUGCUUC-Ly-gaa| -3' Xc z Yc ΡΚ-0 Ο 2 6 (序列編號15) 5,- ,agcuguacauugacuuuagcc-Lx-gscuAAAGUCftRUGUACAGCUgcwc^Ly-ga^ -3’ Xcl z Yc P K — 0 ◦ 2 7 (序列編號16) 5f- ^gcagcuguacauugacuuuagcc-Lx-GGCUAAAGUCAAUGUACAGCUGClAjc-Ly-^ l~3, Xc z Yc P K - 0 0 2 8 (序列編號17)
5f - ^cagcuguacauugacuuuagcc-Lx-fSGCUAAAGUCAAUGXflVCAGCUGCUUC-Ly-·^ xc z YC (1.2)基因之表現抑制 將已冷凍保存之前述RNA溶解於注射用蒸餾水（大塚 119 201219570 製藥）而成為2(^mol/L，調製出RNA溶液。 細胞使用Hepal-6細胞（理化學研究所BioResource Center)，培養基使用含 i〇%FBS 之 DMEM(Invitrogen)培養 基。令培養條件為37°C、5%C02下。 首先，於前述培養基中培養Hepal-6細胞，將該培養液 以400μί分別注入24井皿中，成為3χ104細胞/井。接著，除 了使用前述RNA溶液以外，與前述實施例Β4同樣地進行對 Hepal-6細胞之前述ssRNA轉染、RNA回收及cDNA合成。此 外，就前述轉染而言，令前述井中之前述RNA的最終濃度 為lnmol/L。接著，除了引子使用下述TGF-βΙ基因用PCR引 子組及β-肌動蛋白基因用引子組以外，與前述實施例B4同 樣地進行PCR，測定TGF-βΙ基因表現量及内部標準之β_肌 動蛋白基因表現量。前述TGF-βΙ基因表現量已藉内部標準 之β-肌動蛋白基因表現量來修正。 TGF-βΙ基因用PCR引子組 5 ’-CC ATTGCTGTCCCGTGC AGAGCTG-3 ’（序歹4 編號 19) 5’-ATGGTAGCCCTTGGGCTCGTGGATC-3’(序列編號20) β-肌動蛋白基因用引子組 5 ’-GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3 ’(序列編號21) 5’-GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3’(序列編號22) 此外’與前述實施例B4同樣地就控制組㈠及控制組 (mock)測定基因表現量。接著，針對修正後之TGF-βΙ基因 表現量，令控制組(-)之細胞表現量為卜求出導入有各RNa 之細胞的表現量相對值。 120 201219570 (2)結果 茲將該等結果示於第12圖。第12圖係顯示TGF-βΙ基因 表現量相對值之圖表。如第12圖所示，含脯胺酸之ssRNA 全部顯示出強烈的抑制基因表現活性。 其中，尤以自由鹼基之位置在前述内部區域(Z)中自3’ 末端起算為第2個及第3個之PK-0027及PK-0028較PK-0007 及PK-0026(自由鹼基之位置在前述内部區域(Z)中自3,末端 起算為第4個及第5個）顯示出更高之抑制表現活性。從此結 果得知，前述内部區域(Ζ)中之自由鹼基的位置與前述内部 領域之中央相較下，越靠3,端側配置越可提高前述抑制表 現活性。另外，舉例來說，前述自由鹼基之位置與前述内 部領域之中央相較下越靠5,端側配置越可提高前述抑制表 現活性’此事亦已確認完畢。此種自由鹼基之位置與抑制 表現活性之關係係與後述參考例之結果顯示出同樣的特性 (behavior)。 (實施例B10)活體内之TGF-βΙ基因表現抑制效果及急性肺 傷害抑制效果 使用業經具有脯胺酸之連接子取代的ssRNA，確認活 體内（m vivo)之基因表現抑制及急性肺傷害抑制的效果。前 述效果之確認係依照Takagi氏等人（J .Thromb Hemost 2009 ; 7 : 2〇53_2〇63)所記載之方法進行。 (B1 〇-1)活體内之TGF-β 1基因表現抑制效果 使用業經具有脯胺酸之連接子取代的ssrna，確認活 體内（in vivo)之TGF-βΙ基因表現抑制效果。 121 201219570 (1)材料及方法
(1.1)對急性肺傷害小鼠投予RNA 實施例之RNA(Ex)使用前述實施例B9中之 ssRNA(PK-0007)。比較例之RNA使用以下所示陰性控制組 (Nc)之ssRNA(PK-0008)、陽性控制組(Pc)之ssRNA(NK-0033) 及其陰性控制組(Nc)之ssRNA(NK-0035)、陽性控制組(Pc) 之dsRNA(NI-0030)及其陰性控制組（Nc)之 dsRNA(NI-0031)。 【化29】 P K — Ο Ο () 7 (序列編號14) 5/ - cagcuguacaLiugacuuuacjcc-Lx-GGCUAAAGUCAAUGOACAGCUGCUOC-Ly-qaa -3/ Xc Z ^ P K — 0 0 () 8 (序列編號23) (3GCUUGUAAAUGAGOtf^GACACUUCr Ly-gaa Z Yc - ^gucagugcucauuuacaagcc-Lx·
Xc N l< — 0 0 3 3 (序列編號24) 5, -cagcuguacauugacuuuagccCCACACC(3GCUAAAGUCAAUg〇ACAGCUGCqucuUCGgaa-3,
Xc Z ye N K - 0 () :3 5 (序列編號25) 5,-ugucagugcucauuuacaagccCCACACCGGCUUGUAAAUGAGCACUGACACTJUCUUCGgaa-3,
Xc Z ^ N I - 0 0 3 0 5，- GCAGCUGUACAUUGACUUUAG -3'(序歹!J編號26) 3'- UUCGUCGACAUGUAACUGAAA -5，（序歹丨J編號27) N I - 0 0 3 1 V- GUGUCAGUGCUCAUUUACAAG -3,(序歹[J編號28) 3f- UUCACAGUCACGAGUAAAUGU -5，（序列編號29) 使lOOpg之前述RNA溶解於滅菌生理食鹽水75μι，調製 出RNA溶液。另一方面，使1〇〇μβ之脂多聽(lps)溶解於滅 菌生理食鹽水50μ1，調製出LPS溶液。 122 201219570 首先’使80μ1之前述rna溶液滴定至小鼠之氣管内。 從滴定起1小時後，使50μ1之前述LPS溶液滴定至前述小鼠 之氣管内而誘發肺傷害。 作為相對於前述LPS之陰性控制組，使用50μ1未添加 LPS之滅菌生理食鹽水來取代前述Lps溶液。此外，相對於 前述RNA溶液之陰性控制組則使用8〇μ丨之滅菌生理食鹽 水。 以下顯示各投予群。各投予群使用4〜6隻小鼠。 •投予群1 自投予75μΙ之滅菌生理食鹽水起5分鐘後，投予滅菌生 理食鹽水50μ1。 •投予群2 自投予75μ1之滅菌生理食鹽水起5分鐘，投予前述LPS 溶液50μ1。 •投予群3 自投予75μ1之RNA溶液(ΡΚ-0007)起5分鐘後，投予前述 LPS 溶液 50μ1。 •投予群4 自投予75μ1之RNA溶液(ΡΚ-0008)起5分鐘後，投予前述 LPS 溶液 50μ1。 •投予群5 自投予75μ1之RNA溶液(ΝΚ-0033)起5分鐘後，投予前 述LPS溶液50μ1。 •投予群6 123 201219570 自投予75μ1之RNA溶液(NK-0035)起5分鐘後，投予前 述LPS溶液50μ1。 •投予群7 自投予75μ1之RNA溶液(ΝΙ-0030)起5分鐘後，投予前述 LPS 溶液 50μ1。 •投予群8 自投予75μ1之RNA溶液(ΝΙ-0031)起5分鐘後，投予前述 LPS 溶液 50μ1。 (1.2)支氣管肺胞洗淨液(BALF)之採樣 自滴定前述LPS溶液或滅菌生理食鹽水(相對於LPS之 陰性控制組）起24小時後，對前述小鼠之腹腔投予過剩量之 戊巴比妥使其安樂死。接著採取肺而製成樣本。 針對前述小鼠之肺樣本，使用TGF-βΙ Quantikine Colorimetric Sandwich ELISA(商品名，R&D Systems社）， 測定每單位重量之肺的TGF-βΙ表現量。 (2)結果 茲將其結果示於第13圖。第13圖為圖表，顯示各投予 群中每單位重量之肺的TGF-βΙ基因表現量，橫軸顯示 TGF-βΙ蛋白質之表現量。LPS(+)/PK-0007(+)之投予群3與 LPS(+)/ssRNA(-)之投予群2相較下，TGF-βΙ蛋白質之表現 量明顯受到抑制》此一抑制效果明顯較LPS( + )/陽性控制組 NK-0033( + )之投予群5及LPS( + )/陽性控制組NI-0030之投 予群7更強。另外，陰性控制組PK-0008( + )之投予群4、陰 性控制組ΝΚ-0035( + )之投予群6及陰性控制組ΝΙ-0031( +) 124 201219570 之投予群8均未確認到抑制效果。 (B10-2)活體内之脫靶效果 使用業經具有脯胺酸之連接子取代 ’確認活 體内之脫乾效果，並評估副作用。 實施例之RNA使用前述實施例B9之 ssRNA(PK-0007)。比較例iRNA則使用前述實施例b1(M 所示RNAi陰性控制組（Nc)之前述ssRNA(pK_〇〇〇8)。將 lOOpg之前述RNA溶解於滅菌生理食鹽水75μι中，調製出各 個RNA溶液。 以下顯示各投予群。各投予群中使用2〜4隻小鼠。 •投予群1 投予滅菌生理食鹽水75μ1 •投予群2 投予 75μ1 之 ssRNA 溶液(ΡΚ-0007) •投予群3 投予 75μ1 之 ssRNA 溶液(PK-0008) 接著，自投予起24小時後，與前述實施例則⑴丨同樣地 使小鼠安樂死。穿刺前述小鼠之心臟，回收血液樣本並添 加至含有3_8%檸檬酸鈉水溶液之試管。令前述檸檬酸鈉水 浴液之直（體積）為前述血液樣本之1/10。依照Yasui氏等人 (Am J Respir Crit Care Med 2001 : 163 : 1660-8)之記载，從 該混合液回收BALF樣本。接著，針對前述BALF樣本之上 清液，測定TNF-α量及IFN-β量。 前述TNF-a量係使用商品名Mouse TNF set 125 201219570
Dickinson and Company) ’依照其使用說明書進行定量。此 外，前述IFN-β量則是使用ELISA盤（使用商品名Rabbk Anti-Mouse Interferonp(PBL InterferonSource)及商 ^ 名
Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化學研究所）製作），依照其等 之使用說明書進行定量。 茲將其結果示於第14圖。第14(A)圖為圖表，顯示各投 予群之BALF樣本中的TNF-α量；第14(B)圖為圖表，顯示各 投予群之BALF樣本中的IFN-β量。於第14圖中，橫軸顯示 各別之量。前述ΡΚ-00〇7( + )之實施例投予群2與ssrna(-) 之投予群1相較下，並未誘發TNF-α及IFN-β之表現。 (實施例B11)核糖核酸酶耐性 針對本發明之ssRNA確認核糖核酸酶耐性。 (1)材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用實施例B9之ssRNA(PK-0007)。 比較例之RNA使用前述實施例B10-1所示陽性控制組(pc)之 dsRNA(NI-0030)。 首先，於20mmol/L之Tris-HCl(pH8)中混入60pmol之前 述 RNA、5χ10_5 單位之 RNase A(Roche)及 5χ10·5 單位之 RNaseTl(Roche) ’於37°C下保溫(incubate)。自開始保溫起 算10分鐘、20分鐘、30分鐘後依定法使RNase反應停止。接 著，使前述反應液於15%聚丙烯醯胺凝膠中電泳後，以 SYBR Green II(Lonza，瑞士）染色，並使用 E-BOX-VX2(MS 機器，東京）進行分析。 (2)結果 126 201219570 茲將該結果示於第15圖。第15圖為顯示核糖核酸酶耐 性之電泳照片。於第15圖中，巷「M」為分子量標記，（min) 表不保溫時間。 如第15圖所示，由天然核苷酸構成之比較例NI_〇〇3〇於 保溫10分鐘後幾乎完全分解。相對於此，實施例之ρκ_0007 即使在保溫10分鐘後亦殘存下來。從此結果得知，本發明 之ssRNA較dsRNA具有更優異之核糖核酸酶耐性。 (實施例B12)核酸酶耐性 針對本發明之ssRNA確認核酸酶財性。 (1) 材料及方法 實施例之RNA(Ex)使用實施例B9之ssRNA(PK-0007)。 比較例之RNA使用實施例B10-1所示RNAi陽性控制組(Pc) 之dsRNA(NI-0030)。
首先，於含有 5mmol/L CaCh之50mmol/L Tris-HCl(pH8) 中’混入60pmol之前述ssRNA、0.5單位之S7核酸酶 (Roche) ’於37°C下保溫。自保溫開始（Oh)起0.5小時後，依 定法使S7核酸酶之反應停止。接著，使前述反應液依定法 而在7M尿素-15%聚丙烯醢胺凝膠中電泳後，以SYBR
GreenII(商品名，Lonza)染色，並使用E-BOX-VX2(商品名， MS機器）分析。 (2) 結果 兹將該結果示於第16圖。第16圖為顯示S7核酸酶耐性 之電泳照片。於第16圖中，巷「M」為分子量標記。此外， (h)表示保溫時間。 127 201219570 如第16圖所示，由天然核 =小時後幾乎全部分解。相對來說，實施例之副謂 rRNir.5小時後亦殘存下來。從此結果得知，本發明 之SSRNA較献NA具有更優異之⑺續崎耐性。 從前述實施例B之各個結果得知，舉例來說本發明之 爾可不依賴目標基因之種類而建構出。據此，本發明之 洲分子在抑祕目之錢上可*_目減社種類來 使用，可說是高泛用性之新穎工具。 (參考例1) 使用自由驗基位置不同之ssRNa，確認活體外之 GAPDH基因表現抑制。 (1)材料及方法 RNA使用第17圖所示SSRNA。於第17圖中’右端之編 號表示序列編號。於第17圖中，自5,端側起，小寫字母底 線區域表示前述區域(Xc)，大寫字母底線區域表示前述内 部區域(Z)，小寫字母底線區域表示前述區域(Yc) ^前述Xc 與前述Z之間為連結區域(Lx)，前述z與前述yc之間為連結 區域(Ly)。此外，「Xc/Yc」表示前述區域(xc)之鹼基長(xc) 與前述區域(Yc)之鹼基長(Yc)的比。於第π圖中，「*」表 示自由驗基。 各ssRNA均是令内部區域(Z)之鹼基長為26個鹼基、連 結區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連結區域(Ly)之鹼基長為4 個鹼基。此外，NK-0036及NK-0040係令前述區域(XC)與前 述區域(Yc)之合計鹼基數(Xc + Yc)為26個鹼基，除此之 128 201219570 外’令前述區域(Xc)與前述區域(Yc)之合計鹼基數(Xc +Yc) 為25個鹼基。接著，在此條件下，使前述區域(xc)及前述 區域(Yc)之鹼基長發生變化。藉此，令NK-0036及NK-0040 成為不具有自由鹼基之分子。又，該等以外之各SSRNA則 是令前述内部區域(Z)中不形成雙股之自由鹼基全部為1個 鹼基，且使前述内部區域(Z)中之前述自由鹼基的位置從3, 端側變動為5’端側。 除了回收前述RNA以外，與前述實施例B2同樣地進行 對HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、CDNA合成及 PCR ’測定GAPDH基因之相對表現量。轉染時之RNA濃度 為 10nmol/L。 (2)結果及考察 茲將該等結果示於第18圖。第18圖為圖表，顯示使用 最終濃度1 〇nmol/L之RNA時GAPDH基因表現量之相對 值。如第18圖所示，使前述5,端側區域(XC)及前述3,端側區 域(Yc0之長度發生變化的任一 SSRNA均已確認GAPDH基因 之表現抑制。 特別是，隨著前述區域(Xc)之鹼基長與前述區域(Yc) 之驗基長的差增大’基因之表現量相對地降低，而確認抑 制表現活性已增加。亦即，越使前述内部區域(Z)中之自由 驗基的位置較前述内部領域中央更靠5’端側或3’端側配 置越可提南前述抑制表現活性。 (參考例2) 使用自由鹼基位置不同之ssRNA，確認活體外之 129 201219570 TGF-βΙ基因的表現抑制效果。 (1)材料及方法 RNA使用下示ssRNA。於下述序列中，「*」表示自 由驗基。 【化30】 NK — 〇 〇 :3 3 (序列編號49) 5, -cagcuguac:auugacuuuagccCCACACCGGCUAAAGUCAAUGUACAGCUGCUUCUL~CGgaa-3,
Xc z Yc N K _ Ο 〇 6 1 (序列編號50) - agcu-guacauugacuuuagccCCACACCGGCUAAAGUCAAUGUACAGCUGCUUCUUCGgaa -3* Xc z Yc NK — 0 0 5 5 (序列編號51) 5,- agcagcuguacauugacuuuagcccCAcaccj3GCUAAAGUCAAU(3UACAGaJGCUUCUUC'Grgi -3'
Xc Z Yc NK — 0 〇 fi 2 (序列編號52)
5, _ ；gcagcuguacauugacuuuagccCCACACC^UAAAGUCAAUGUACAGCUGCUUCUUCGg , -3, XG Z YC (1.2)基因之表現抑制 將已冷凍保存之前述RNA溶解於注射用蒸餾水（大塚 製藥）而成為20pmol/L，調製出RNA溶液。接著，除了使用 前述RNA溶液之外，與前述實施例B9同樣地進行對Hepal-6 細胞之前述ssRNA的轉染、RNA回收、cDNA合成及PCR。 測定TGF-βΙ基因之相對表現量。轉染時之RNA濃度為 lnmol/L。 (2)結果 茲將該等結果示於第19圖。第19圖係顯示TGF-βΙ基因 130 201219570 表現量相對值之圖表n19圖所示，任—s_A均顯示 抑制基因表現之活性。此外，使自由鹼基之位置在前述内 部區域(Z)中自3’末端起算為第2個及第3個之狐_〇〇55及 NK-0062與NK-GG33及NK__(使自由驗基之位置在前述 内部區域(Z)中自3’末端起算為第4個及第5個)相較下，顯示 出更高之抑制表現活性。此結果與以同基因為目標之前 述參考例1具有相同特性。 (參考例3) 使用自由驗基之位置不同的SSRNA，確認活體外之 L AM A1基因的表現抑制。 (1)材料及方法 RNA使用以下所示ssRNA。下述序列中，「*」表示 自由驗基。 【化31】 NK— 0 0 4 3 (序列編號53) - uguuugucucguuacaauauccCCACACC<3qAUAUUGUAACGAGACAAACACUCCUUCG^ga|-3·
Xc Z Yc ΝΚ-0 Ο 6 4 (序列編號54) 5r - aguguuugucucguuacaauauccCCACACCGGAUAWGUAACGAGACAAACACUCCUUCGgi-3’ 1 χί 2 除了使用前述RNA之外，與前述實施例Β6相同地對293 細胞進行轉染，將前述細胞培養48小時。令轉染時之RNA 濃度為10nmol/L。接著，除了引子使用以下之LAMA1基因 用引子組之外，與前述實施例B2相同地進行RNA回收、 cDNA合成及PCR，測定LAMA1基因表現量及内部標準之P- 131 201219570 肌動蛋白基因表現量。前述LAMA1基因之表現量已藉由内 部標準之β-肌動蛋白基因表現量來修正。 LAMA1基因用引子組 5’-AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3 ’（序列編號 55) 5’-TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3 ’(序列編號 56) 此外，與前述實施例Β2同樣地’亦就控制組1㈠及控制 組2(mock〇測定表現量。之後’針對修正後之LAMA1基因表 現量’令控制組㈠之細胞表現量為1，求出已導入各RNA之 細胞的表現量相對值。 (2)結果 I么將該專結果示於第20圖。第2〇圖為圖表，顯示293細 胞中之LAMA1基因表現量的相對值。如第2〇圖所示，任一 ssRNA均顯示出抑制基因表現之活性。此外，使自由驗基 之位置在前述内部區域（Z)中自3,末端起算為第2個之 NK-0064與NK-0043(使自由鹼基之位置在前述内部區域(z) 中自3’末端起算為第4個）相較下顯示出更高之抑制表現活 性。此結果與以不同基因為目標之前述參考例丨及參考例2 具同樣特性。 (參考例4) 使用自由驗基位置不同之ssRNA，確認活體外2LMNA 基因表現抑制。 (1)材料及方法 RNA使用以下所示ssRNA。下述序列中，「*」表示 自由驗基。 132 201219570 【化32】 ΝΚ-0 0 6 3 (序列編號57) 5,- cgucaccaaaaagGgcaauuccCCACACCjSGAAUUGCGCWUWGGUGACGCVUCUUCGgaa, -3
Xc z Yc NK-0 0 6 6 (序列編號58)
5» _ aacaucaccaaaaaqcgcaauuccyCACfiCCjSGaAWSCGCUUUUUSQUGACGCWqUUCqg, -3 xc z YC 除了使用前述RNA之外，與前述實施例B64相同地對 A549細胞進行轉染，培養前述細胞48小時。令轉染時之RNA 濃度為3nmol/L。接著，除了引子使用以下之LMNA基因用 引子組之外，與前述實施例B2相同地進行RNA回收、cDNA 合成及PCR，測定LMNA基因之表現量及内部標準之β-肌動 蛋白基因表現量。前述LMNA基因表現量已藉由内部標準 之β-肌動蛋白基因表現量修正。 LMNA基因用引子組 5，-CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3,(序歹ij 編號 59) 5’-CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3,(序列編號 60) 此外，與前述實施例B2相同地，亦就控制組1㈠及控制 組2(mock)測定表現量。接著，針對修正後之lMNa基因表 現量，令控制組㈠之細胞表現量為丨，求出已導入各RNA之 細胞的表現量相對值。 (2)結果 兹將該等結果顯示於第21圖。第21圖為圖表，顯示A549 細胞之LMNA基因表現量的相對值。如第21圖所示，得知 任一ssRNA均顯示出抑制基因表現活性。此外，使自由鹼 133 201219570 基之位置在前述内部區域(Z)中自3’末端起算為第2個之 NK-0066相較於NK-0063(使自由鹼基之位置在前述内部區 域(Z)中自3,末端起算為第4個）顯示出更高之抑制表現活 性。此一結果與以不同基因為目標之前述參考例丨〜參考例3 具相同之特性。 從參考例1〜參考例4之結果可明確得知，舉例來說，就 自由驗基之位置而言，可不論目標基因之種類及對其之抑 制表現序列而顯示出同樣的特性。且於前述實施例B9中， 顯示出與該等參考例同樣之特性，此係如前所述。 (參考例5) 使用已使前述内部5’端側區域(X)、前述5’端側區域 (Xc)、前述内部3’端側區域(Y)及前述3’端側區域(YC)之各 長度發生變化的ssRNA，確認活體外之GAPDH基因表現抑 制。 (1)材料及方法 RNA使用第22圖所示ssRNA。於第22圖中，右端之編 號表示序列編號。於第22圖中，從5’端側起，劃底線之小 寫字母區域表示前述區域(Xc)，劃底線之大寫字母區域表 示前述内部區域(Z)，劃底線之小寫字母區域表示前述區域 (Yc)。此外，「Xc+Yc/x+y」表示前述區域(xc)之鹼基長(xc) 及前述區域(Yc)之合計鹼基長(Yc)與前述區域(X)及前述區 域(Y)之合計鹼基長的比。於第22圖中，「*」表示自由鹼 基。 各ssRNA均是令連結區域(Lx)之鹼基長為7個鹼基、連 134 201219570 結區域(Ly)之鹼基長為4個驗基、前述區域(Yc)之驗基長為1 個鹼基，且令前述内部區域(Z)自3,端側起算之第2個鹼基為 自由驗基。接著，使前述内部區域(Z)之鹼基長與前述區域 (Xc)之鹼基長發生變動。 只要未特別表示，與前述實施例B2相同地，針對前述 RNA進行對於HCT116細胞之轉染、培養、RNA回收、cDNA 合成及PCR，算出GAPDH基因表現量之相對值。前述轉染 之條件則是令前述每井之組成與實施例B4之表2相同。 (2)結果及考察 茲將該等結果示於第23圖。第23圖為圖表，顯示使用 最終濃度lnmol/L之RNA時，GAPDH基因表現量之相對 值。如第23圖所示，已使前述區域(X)、前述區域(xc)、前 述區域(Y)及前述區域(Yc)之長度發生變化的任一 ssrnA均 已確認GAPDH基因之表現抑制。 以上，參照實施形態來說明本案發明，但本案發明並 非受上述實施形態所限定者。本案發明之構成及詳情可在 本案發明之要旨（scope)範圍内進行業界人士可理解之各種 變更。 本申請案主張以下列申請案為基礎之優先權，並在此 納入其荨之全部揭示内容：已於2〇1〇年8月3日提申之曰本 申請案特願2010-174915號、已於2010年10月13日提申之曰 本申請案特願2010-230806號、已於2〇1〇年12月2日提申之 曰本申請案特願2010-269823號以及已於2〇11年7月8曰提 申之日本申請案特願2〇11-152381號。 135 201219570 產業上之可利用性 為严發明之SSPN分子’可抑制基因之表現，且因# 脾衣5成容易’又’因其為單股，無 ::率良好地進行製造。此外，因前述連=含 殘基，舉例來說，可不限於如同習知』 等的：:變，例如，亦可進行前述連結區域中之修飾 由於本發明之ssPN分子係如前述般_ 基因表現’舉例來說，作為醫藥品、診斷藥及農藥， 以及農藥、醫學及生命科學等之研究卫具均甚有用。 【圖式簡單說明】 第1(A)至1⑻圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子之 一例0 第2(A)至2(B)圖為模式® ’顯示本發明之單股核酸分子之 另一例。 第3(A)至3(D)圖為模式圖，顯示本發明之單股核酸分子之 其他例。 第4圖為圖表’顯示本發明實施例之gapdh基因表現量相 對值。 第5圖為電泳照片，顯示本發明實施例之安定性。 第6圖為圖表，顯示本發明實施例之OAPDH基因表現量相 對值。 第7圖為電泳結果’顯示截切蛋白質(Dicer protein)對於本 發明實施例之ssRNA的反應性。 第8圖為圖表，顯示本發明實施例之A549細胞的GAPDH基 136 201219570 因表現量相對值。 第9圖為圖表’顯示本發明實施例之293細胞的GAPDH基因 表現量相對值。 第10圖為圖表’顯示本發明實施例之HCT116細胞的 GAPDH基因表現量相對值。 第11圖為圖表，顯示本發明實施例之HCT116細胞的 GAPDH基因表現量相對值。 第12圖為圖表，顯示本發明實施例之TGF—pi基因表現量相 對值。 第13圖為圖表，顯示本發明實施例各投予群之每單位重量 之肺的TGF-βΙ基因表現量。 第14(A)圖為圖表，顯示本發明實施例各投予群之BALF樣 本中之TNF-α量，第14(B)圖為圖表，顯示本發明實施例各投予 群之BALF樣本中之IFN-β量。 第15圖為電泳照片，顯示本發明實施例之核糖核酸酶耐 性。 第16圖為電泳照片，顯示本發明實施例之幻核酸酶耐性。 第17圖係一顯示參考例所用ssRNA之圖。 第18圖為圖表，顯示參考例之GAPDH基因表現量相對值。 第19圖為圖表，顯示參考例之TGF—y基因表現量相對值。 第20圖為圖表，顯示參考例之lama基因表現量相對值。 第21圖為圖表，顯示參考例之LMNA基因表現量相對值。 第22圖係一顯示參考例所用ssRNA之圖。 第23圖為圖表，顯示參考例之GApDH基因表現量相對值。 137 201219570 【主要元件符號說明】 (無） 138 201219570 序列表
<110> BONAC CORPORATION <120〉具有含氮脂環骨架之單股核酸分子
<130> TF11004TW <150〉 JP 2010-174915 <151〉 2010-08-03 <150〉 JP 2010-230806 <151〉 2010-10-13 <150> JP 2010-269823 <151〉 2010-12-02 <150> JP 2011-152381 <151〉 2011-07-08 <160> 69 <170> Patentln version 3.1 201219570 <210> 1 <211> 25 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 1 ggcuguuguc auacuucuca ugguu 25 <210〉 2 〈211〉 23 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 2 ccaugagaag uaugacaaca gcc 23 2 201219570 <210〉 3 <211〉 48 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 3 48 ccaugagaag uaugacaaca gccggcuguu gucauacuuc ucaugguu <210> 4 <211> 19 <212〉RNA <213〉人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 4 19 guugucauac uucucaugg 3 201219570 <210〉 5 <211> 55 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 5 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguu 55 <210〉 6 <211> 19 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 6 19 auuguaacga gacaaacac 201219570 <210〉 7 <211〉 23 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉引子 <400> 7 ggagaaggct ggggctcatt tgc 23 <210> 8 <211〉 23 <212〉DNA <213〉 人工的 〈220〉 <223〉引子 <400> 8 23 tggccagggg tgctaagcag ttg 201219570 <210〉 9 <211〉23 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 〈223>引子 <400> 9 gccacggctg cttccagctc etc 23 <210〉 10 <211〉 25 <212〉DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉引子 <400> 10 25 aggtctttgc ggatgtccac gtcac 6 201219570 <210> 11 <211> 51 <212〉RNA <213〉人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 11 51 caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a <210〉 12 <211> 51 <212〉RNA <213〉 人工的 〈220〉 <223〉核酸分子 <400〉 12 51 ccaucaacga uaagugaaag ccggcuuuca cuuaucguug auggcuucga a 7 201219570 <210〉 13 <211> 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400> 13 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 aa 62 <210〉 14 <211〉 51 <212〉 RNA <213> 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 14 8 201219570 cagcuguaca uugacuuuag ccggcuaaag ucaauguaca gcugcuucga a <210> 15 <211〉 50 <212〉 RNA <213> 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400> 15 agcuguacau ugacuuuagc cggcuaaagu caauguacag cugcuucgaa <210> 16 <211〉 51 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400> 16 201219570 agcagcugua cauugacuuu agccggcuaa agucaaugua cagcugcuuc g <210〉 17 <211〉 50 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400> 17 gcagcuguac auugacuuua gccggcuaaa gucaauguac agcugcuucg <210> 18 <211> 21 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400〉 18 201219570 aaagucaaug uacagcugcu u <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213〉 人工的 <220> <223〉 引子 <400〉 19 ccattgctgt cccgtgcaga gctg <210> 20 <211〉 25 <212> DNA <213〉人工的 <220> <223〉引子 <400> 20 201219570 atggtagccc ttgggctcgt ggatc <210〉 21 <211> 24 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉引子 <400〉 21 gtcgtaccac aggcattgtg atgg <210〉 22 <211〉22 <212> DNA <213〉人工的 〈220〉 <223〉引子 <400〉 22 201219570 22 gcaatgcctg ggtacatggt gg <210> 23 <211〉51 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 23 ugucagugcu cauuuacaag ccggcuugua aaugagcacu gacacuucga a 51 <210> 24 <211> 62 <212〉RNA <213〉人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 24 13 201219570 cagcuguaca uugacuuuag ccccacaccg gcuaaaguca auguacagcu gcuucuucgg 60 aa 62 <210〉 25 <211〉 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 25 ugucagugcu cauuuacaag ccccacaccg gcuuguaaau gagcacugac acuucuucgg 60 aa 62
<210〉 26 <211〉 21 <212> RNA 14 201219570 <213〉人工的 <220〉 <223〉正意 <400〉 26 gcagcuguac auugacuuua g <210> 27 <211> 21 <212> RNA 〈213> 人工的 <220〉 <223〉反意 <400〉 27 aaagucaaug uacagcugcu u <210> 28 <211〉 21
<212> RNA 201219570 <213〉 人工的 <220〉 〈223〉正意 <400〉 28 gugucagugc ucauuuacaa g 21 <210> 29 <211〉 21 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉反意 <400> 29 uguaaaugag cacugacacu u 21
<210> 30 〈211〉 19 <212> RNA 16 201219570 <213〉 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400〉 30 uugcgcuuuu uggugacgc 19 <210〉 31 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223> 核酸分子 <400> 31 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu 60 eg 62 17 201219570 <210〉 32 <211〉 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <22〇> <223〉核酸分子 <400> 32 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210〉 33 <211〉 62 <212> RNA <213〉人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 33 18 201219570 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg 60 ga 62 <210〉 34 <211〉 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 34 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau 60 62 gguucuucgg aa
<210> 35 <211〉 62 <212> RNA 19 201219570 <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 35 augagaagua ugacaacagc cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga ac <210〉 36 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 36 ugagaaguau gacaacagcc ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa 201219570 cc <210〉 37 <211〉 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 37 agaaguauga caacagcccc acaccggcug uugucauacu ucucaugguu cuucggaacc au 〈210〉 38 <211〉 62 <212> RNA 〈213> 人工的 <220〉 201219570 <223〉核酸分子 <400〉38 aaguaugaca acagccccac accggcuguu gucauacuuc ucaugguucu ucggaaccau 60 ga 62 <210〉 39 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 39 guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga 60 62 ga 22 201219570 <210〉 40 <211〉 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 40 augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga 60 ag 62 <210〉 41 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 41 23 201219570 acaacagccc cacaccggcu guugucauac uucucauggu ucuucggaac caugagaagu au <210〉 42 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 42 aacagcccca caccggcugu ugucauacuu cucaugguuc uucggaacca ugagaaguau ga
<210> 43 <211〉 62 <212〉 RNA 201219570 <213〉人工的 <220> <223〉核酸分子 <400> 43 cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu cggaaccaug agaaguauga ca <210> 44 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 44 agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga gaaguaugac 201219570 aa 62 <210〉 45 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 45 gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg gaaccaugag aaguaugaca 60 ac 62 <210〉 46 〈211> 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 26 201219570 <223〉核酸分子 <400> 46 ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga aguaugacaa 60 ca 62 <210> 47 <211〉 62 <212〉RNA <213〉人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 47 cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga accaugagaa guaugacaac 60 ag 62 27 201219570 <210〉 48 <211〉 62 <212> RNA <213〉人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉48 ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa ccaugagaag uaugacaaca 60 gc 62 <210> 49 <211〉 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 49 28 201219570 cagcuguaca uugacuuuag ccccacaccg gcuaaaguca auguacagcu gcuucuucgg aa <210〉 50 <211> 61 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> <223〉 核酸分子 <400〉 50 agcuguacau ugacuuuagc cccacaccgg cuaaagucaa uguacagcug cuucuucgga a
<210> 51 <211> 62 <212〉 RNA 201219570 <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 51 agcagcugua cauugacuuu agccccacac cggcuaaagu caauguacag cugcuucuuc gg <210> 52 <211> 61 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 52 gcagcuguac auugacuuua gccccacacc ggcuaaaguc aauguacagc ugcuucuucg 201219570 g 61 <210〉 53 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 53 uguuugucuc guuacaauau ccccacaccg gauauuguaa cgagacaaac acuccuucgg 60 ga 62 <210> 54 <211〉 62 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220> 31 201219570 <223〉核酸分子 〈40〇> 54 aguguuuguc ucguuacaau auccccacac cggauauugu aacgagacaa acacuccuuc gg <210> 55 <211〉 23 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉引子 <400> 55 aaagctgcca atgcccctcg acc
<210> 56 <211〉22 〈212〉 DNA 201219570 <213〉 人工的 <220〉 <223〉 引子 <400> 56 taggtgggtg gccctcgtct tg 22 <210〉 57 <211> 62 <212> RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 57 cgucaccaaa aagcgcaauu ccccacaccg gaauugcgcu uuuuggugac gcuucuucgg 60 aa 62 33 201219570 <210〉 58 <211〉62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220> <223〉核酸分子 <400〉 58 agcgucacca aaaagcgcaa uuccccacac cggaauugcg cuuuuuggug acgcuucuuc 60 gg 62 <210〉 59 <211〉 24 <212> DNA 〈213> 人工的 <220〉 <223〉引子 <400> 59 34 201219570 ctggacatca agctggccct ggac <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213〉人工的 <220〉 <223〉引子 <400〉 60 caccagcttg cgcatggcca cttc <210〉 61 <211> 64 <212〉RNA <213〉人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉 61 201219570 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucgu ucgc <210〉 62 <211> 62 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400〉62 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc gg
<210〉 63 <211〉 60 <212〉 RNA 201219570 <213> 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400〉 63 accaugagaa guaugacaac agcccacacc gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 <210〉 64 <211〉 58 <212〉 RNA <213> 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400> 64 ccaugagaag uaugacaaca gcccacaccg cuguugucau acuucucaug guuuucga 58 <210> 65 <211〉 58 37 201219570 <212> RNA <213> 人工的 <220〉 <223> 核酸分子 <400> 65 accaugagaa guaugacaac agccacaccc uguugucaua cuucucaugg uucuucgg 58 <210> 66 <211〉 56 <212> RNA <213〉 人工的 <220> <223> 核酸分子 <400〉 66 ccaugagaag uaugacaaca gccacacccu guugucauac uucucauggu uuucga 56 <21〇> 67 <211> 54 38 201219570 <212〉 RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 67 caugagaagu augacaacag ccacacccug uugucauacu ucucaugguu ucga 54 <210> 68 <211> 54 <212〉 RNA <213> 人工的 <220〉 <223〉 核酸分子 <400〉 68 ccaugagaag uaugacaaca ccacaccugu ugucauacuu cucaugguuu ucga 54 <210〉 69 <211〉 52 39 201219570 <212〉RNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉核酸分子 <400> 69 52 caugagaagu augacaacac cacaccuguu gucauacuuc ucaugguuuc ga 40

Claims (1)

  1. 201219570 七、申請專利範圍： 1. 一種單股核酸分子，係含有抑制目標基因表現之抑制表 現序列者，其特徵在於： 區域(X)包含連結區域(Lx)及區域(Xc)， 前述區域(X)與前述區域(Xc)之間連結有前述連結 區域(Lx)， 前述區域(Xc)與前述區域(X)互補， 前述區域(X)及前述區域(Xc)中之至少一者含有前 述抑制表現序列，且 前述連結區域(Lx)具有非核苷酸結構，該非核苷酸 結構含有。比咯啶骨架及哌啶骨架中之至少一者。 2. 如申請專利範圍第1項之單股核酸分子，其中前述連結 區域(Lx)係以下述式(I)表示： 【化1】
    前述式中， X1及X2各自獨立為Η2、Ο、S或NH ; Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、Ο或S ; R3係與環A上之C-3、C-4、C-5或C-6鍵結之氫原子 或取代基； 201219570 L1係由η個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳 原子上之氫原子可經OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、 SH或SRa取代或是未經取代，或者， L1係前述伸烧基鏈之一個以上碳原子經氧原子取 代而成之聚醚鏈， 但Y1為NH、Ο或S時，與Y1鍵結之L1的原子為碳， 與OR1鍵結之L1的原子為碳，氧原子彼此不鄰接； L2係由m個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳 原子上之氫原子可經OH、ORe、NH2、NHRe、NReRd、 SH或SRe取代或是未經取代，或者， L2為前述伸烷基鏈之1個以上碳原子經氧原子取代 而成之聚醚鏈， 但Y2為NH、Ο或S時，與Y2鍵結之L2的原子為碳， 與OR2鍵結之L2的原子為碳，氧原子彼此不鄰接； Ra、Rb、Rc及以各自獨立為取代基或保護基； 1為1或2 ; m為0〜30範圍内之整數； η為0〜30範圍内之整數； 環Α中，前述環Α上之C-2以外的1個碳原子亦可經 氮、氧或硫取代， 於前述環A内，亦可含有礙-碳雙鍵或碳-氮雙鍵， 前述區域（Xc)及前述區域（X)各自透過-OR1-或 -OR2-而與前述連結區域(Lx)結合， 於此，R1及R2可存在亦可不存在，且存在時，R1 2 201219570 及R2各自獨立為核苦酸殘基或前述結構⑴。 3.如申睛專鄕圍第！或2項之單股核酸分子，其中前述區 域(X)之驗基數⑻及前述5，端側區域(Xc)之驗基數(Xc) 滿足下述式(3)或式(5)之條件： X > Xc · · · (3) X=Xc · · · (5)。 4·如申睛專利範圍第3項之單股核酸分子，其中前述區域 (X) 之鹼基數(X)及前述5,端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)滿 足下述式（11)之條件： X-Xc=l、2或3 · . . (11)。 5.如申4專職圍第1至4項巾任-項之單股核酸分子， 其中前述區域(Xc)之鹼基數(乂^為19個鹼基〜3〇個鹼 基。 6·如申請專利範圍第丨至5項中任一項之單股核酸分子，其 更具有區域(Y)及區域(Yc)，且前述區域(Yc)與前述區域 (Y) 互補’前述區域(X)與前述區域(γ)連結而形成内部區 域(Ζ)。 7. 如申請專利範圍第6項之單股核酸分子，其更具有連結 區域(Ly)，且前述區域(γ)與前述區域(Yc)之間連結有前 述連接子(Ly)。 8. 如申請專利範圍第7項之單股核酸分子，其中前述連結 區域(Ly)具有非核苷酸結構，且該非核苷酸結構含有吡 **各°定骨架或°底。定骨架。 9. 如申請專利範圍第8項之單股核酸分子，其中前述連結 201219570 區域(Ly)係以下述式⑴表示： 【化2】 R3
    前述式中， X1及X2各自獨立為H2、〇、8或冊； γ1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、0或S ; R3係與環A上之C-3、C-4、C-5或C-6鍵結之氫原子 或取代基； L係由η個原子構成之伸烧基鏈，於此，伸炫基石炭 原子上之氫原子可經OH、〇Ra、、NHRa、NR_aRb、 SH或SRa取代或未經取代，或者， L1係前述伸烷基鏈之1個以上碳原子經氧原子取代 而成之聚醚鏈’ 但Y1為NH、〇或s時，與Y1鍵結之L1的原子為碳， 與OR1鍵結之L1的原子為碳，氧原子彼此不鄰接； L2係m個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原 子上之氫原子可經0H、OR。、NH2、NHRe、NReRd、SH 或SRe取代或是未經取代，或者， L2係前述伸烷基鏈之1個以上碳原子經氧原子取代 而成之聚醚鏈’ 201219570 盥W Y為顺、〇或8時’與γ2鍵結之L2的原子為碳， ” ^、。之1"的原子為碳，氧原子彼此不鄰接； R、R及Rd&自獨立為取代基或保護基； 1為1或2 ; 01為0〜30範圍内之整數； 11為0〜30範圍内之整數； _衣Α中，刖述環Α上之C-2以外的1個碳原子亦可經 氮、氧、硫取代， 則述環A内亦可含有碳_碳雙鍵或碳_氮雙鍵， 月J述區域（Yc)及前述區域（γ)各自透過_〇Ri_或 〇R _而與前述連結區域(Ly)結合， 2於此’ R1及R2可存在亦可不存在，且存在時Ri及 R各自獨立為核苷酸殘基或前述結構⑴。 ίο. 如申請專利範圍第9項之單股核酸分子，其中前述區域 (Xc)及前述區域⑻與前述結合區域(Lx)之前述式⑴結 構的結合、以及前述區域(Yc)及前述區域(γ)與前述連 結區域(Ly)之前述式⑴結構的結合分別滿足下述（丨)〜(4) 中之任一條件： 條件（1) 前述區域(XC)透過-〇R2-且前述區域(X)透過_〇Rl _ 而與前述式(I)之結構結合， 前述區域(Yc)透過-OR1-且前述區域(Y)透過_〇r2_ 而與前述式(I)之結構結合； 條件(2) 201219570 前述區域(Xc)透過-OR2-且前述區域(X)透過-OR1 -而與前述式（I)之結構結合， 前述區域(Yc)透過-OR2-且前述區域(Y)透過-OR1-而與前述式（I)之結構結合； 條件(3) 前述區域(Xc)透過-OR1-且前述區域(X)透過-OR2-而與前述式（I)之結構結合， 前述區域(Yc)透過-OR1-且前述區域(Y)透過-OR2-而與前述式（I)之結構結合； 條件(4) 前述區域(Xc)透過-OR1-且前述區域(X)透過-OR2-而與前述式（I)之結構結合， 前述區域(Yc)透過-OR2-且前述區域(Y)透過-OR1-而與前述式(I)之結構結合。 11. 如申請專利範圍第2至10項中任一項之單股核酸分子， 其中前述式(I)中，L1為前述聚醚鏈，且前述聚醚鏈為聚 乙二醇。 12. 如申請專利範圍第2至11項中任一項之單股核酸分子， 其中前述式⑴中，L1之原子個數(η)與L2之原子個數(m) 的合計（m+η)係在0〜30之範圍内。 13. 如申請專利範圍第2至12項中任一項之單股核酸分子， 其中前述式⑴之結構為下述式（1-1)〜式（1-9)中之任一 者，且於下述式中，η為0〜30之整數，m為0〜30之整數， q為0〜10之整數： 201219570 【化3】
    (I - 2)
    14.如申請專利範圍第13項之單股核酸分子，其中前述式 (1-1)中，n=8 ;前述(1-2)中，n=3 ;前述式(1-3)中，n=4 或8 ;前述(1-4)中，n=7或8 ;前述式(1-5)中，n=3且m=4 ; 前述(1-6)中，n=8且m=4 ;前述式(1-7)中，n=8且m=4 ; 前述(1-8)中，n=5且m=4 ;前述式(1-9)中，q=l且m=4。 201219570 15·如申明專利|&圍第14項之單股核酸分子，其中前述式 (1_4)為下述式(I_4a)，且前述式(1-8)為下述式(I-8a): 【化4】
    * ( I — 4 a ) /^〇—\ \—〇(H2C)5/^n"/\ • · · ( 1 — 8 a ) 16·如申4專利範圍第6至15項中任一項之單股核酸分子， 其中刖述區域(X)之驗基數(χ)、前述區域⑺之驗絲 (Υ)、前述區域(Xe)之驗基數(Xe)及前賴域㈣之驗基 數(Yc)滿足下述式(2)之條件： Z^Xc + Yc · · ·⑺。 Π.如中請專利範圍第6至16項中任一項之單股核酸分子， 其中前述區域（X)之鹼基數(X)、前述（Xc)之鹼基數 (Xc)、前述區域(Y)之驗基數(γ)及前述區域(Yc)之驗基 數(Yc)滿足下述(a)〜(d)中之任一條件： (a) 滿足下述式(3)及(4)之條件； X>Xc ---(3) Y=Yc · · · (4) (b) 滿足下述式（5)及（6)之條件； X=Xc . · · (5) 8 201219570 Y> Yc ---(6) (c) 滿足下述式（7)及（8)之條件； X>Xc ---(7) Y> Yc ---(8) (d) 滿足下述式（9)及（10)之條件； X=Xc ---(9) Y=Yc . · · (10)。 18.如申請專利範圍第17項之單股核酸分子，其中前述 (a)〜(d)中，前述區域(X)之鹼基數(X)與前述區域(Xc)之 鹼基數(Xc)的差以及前述區域(Y)之鹼基數(Y)與前述區 域(Yc)之鹼基數(Yc)的差滿足下述條件： (a) 滿足下述式（11)及（12)之條件； X-Xc=l、2或3 · · · (11) Y-Yc=0 · · · (12) (b) 滿足下述式（13)及（14)之條件； X-Xc=0 ... (13) Y-Yc=l、2或3 · · . (14) (c) 滿足下述式（15)及（16)之條件； X-Xc=l、2或3 · · · (15) Y-Yc=l、2或3 . · · (16) (d) 滿足下述式（17)及（18)之條件； X-Xc=0 · · · (17) Y-Yc=0 . · .(18)。 19.如申請專利範圍第6至18項中任一項之單股核酸分子， 201219570 其中前述區域(Xc)之鹼基數(Xc)為1〜11個鹼基。 20. 如申請專利範圍第19項之單股核酸分子，其中前述區 域(Xc)之鹼基數(Xc)為1〜7個鹼基。 21. 如申請專利範圍第19項之單股核酸分子，其中前述區 域(Xc)之鹼基數(Xc)為1〜3個鹼基。 22. 如申請專利範圍第6至21項中任一項之單股核酸分子， 其中前述區域(Yc)之鹼基數(Yc)為1〜11個鹼基。 23. 如申請專利範圍第22項之單股核酸分子，其中前述區 域(Yc)之鹼基數(Yc)為1〜7個鹼基。 24. 如申請專利範圍第22項之單股核酸分子，其中前述區 域(Yc)之鹼基數(Yc)為1〜3個鹼基。 25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項之單股核酸分子， 其含有至少1個經修飾之殘基。 26. 如申請專利範圍第1至25項中任一項之單股核酸分子， 其含有標記物質。 27. 如申請專利範圍第1至26項中任一項之單股核酸分子， 其含有穩定同位素。 28. 如申請專利範圍第1至27項中任一項之單股核酸分子， 其為RNA分子。 29. 如申請專利範圍第1至28項中任一項之單股核酸分子， 其中前述單股核酸分子中，鹼基數之合計係在50個鹼基 以上。 30. 如申請專利範圍第1至29項中任一項之單股核酸分子， 其中前述基因之抑制表現係RNA干擾所致之抑制表現。 10 201219570 種抑制表現用組成物，係用以抑制目標基因表現者， 其特徵在於：含有如巾請專利範圍第丨至川項中任一項 之單股核酸分子。 32·-種#學組成物，其特徵在於：含有如中請專利範圍第 1至30項中任一項之單股核酸分子。 33.如申請專利範圍第Μ項之藥學組成物，其係供治療炎 症用者。 ’種抑制表現方法，係抑制目標基因表現纟’其特徵 ;使用如申清專利範圍第1至30項中任一項之單股 核酸分子。 申"月專利範圍第34項之抑制表現方法 ’其包含：將 漢單k核酸分子投予細胞、組織或器官之步驟。 36.如申請專利範圍第35項之抑制表現方法 ，其係於活體 内（心叫或活體外伽恤雜予前述單股核酸分子。 去申。月專利範圍第34至36項中任__項之抑制表現方 j其t W述基0之抑制表減RNA干擾所致之抑制表 現。 38. —種誘導表J目·、、i* ,χ / 係誘導抑制目標基因表現之RNA :擾者’其特徵在於：使用如㈣專利範圍第1至30項 任項之單股核酸分子。 人—。療方去，係疾病之治療方法，其特徵在於：包 如申請專利範圍第1至30項中任—項之單股核酸 者之步驟’前述單股誠分子具有—抑制基 現之序列作為前逃抑制表現序列，且該基因係前述 11 39. 201219570 疾病之成因。 40. —種單股核酸分子之用途，係將如申請專利範圍第1至 30項中任一項之單股核酸分子用於抑制目標基因之表 現者。 41. 一種單股核酸分子之用途，係將如申請專利範圍第1至 30項中任一項之單股核酸分子用於誘導RNA之干擾者。 42. —種單股核酸分子，其供用於治療疾病者，其特徵在 於：前述核酸分子係如申請專利範圍第1至30項中任一 項之單股核酸分子，前述單股核酸分子具有一抑制基因 表現之序列作為前述抑制表現序列，且該基因係前述疾 病之成因。 43. —種單體，係供用於合成核酸分子者，其特徵在於具有 下述式(II)之結構： 【化5】
    前述式中， X1及X2各自獨立為Η2、Ο、S或NH ; Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、Ο或S ; R1及R2各自獨為Η、保護基或磷酸保護基； R3係與環Α上之C-3、C-4、C-5或C-6鍵結之氫原子 12 201219570 或取代基； L1係由η個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳 原子上之氫原子可經OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、 SH或SRa取代或是未經取代，或者， L1為前述伸烷基鏈之1個以上碳原子經氧原子取代 而成之聚鱗鍵； 但Y1為NH、0或S時，與Y1鍵結之l1的原子為碳， 與OR1鍵結之L1的原子為碳，氧原子彼此不鄰接； L2係m個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原 子上之風原子可經OH、〇Rc、、NHRC、NR^d、SH 或SRe取代或是未經取代，或者， L2為前述伸烷基鏈之丨個以上碳原子經氧原子取代 而成的聚喊鏈， 但Y2為NH、〇或S時，與γ2鍵結之L2的原子為碳， 與OR鍵名。之L的原子為碳，氧原子彼此不鄰接； R、R、Re及Rd各自獨立為取代基或保護基； 1為1或2 ; m為0〜3〇範圍内之整數； η為0〜30範圍内之整數； 斤％八中，前述環八上之C-2以外的1個碳原子亦可經 氮、氧或硫取代， 且前述環Α内亦可含有碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。 44.如申請專利範圍第43項之單體，其中前述(11)之結構為 式（1)〜式(11_9)中之任—者，且下述式中，福〇〜3〇 13 201219570 之整數，m為0〜30之整數 【化6】
    q為0〜10之整數：
    45. 如申請專利範圍第44項之單體，其中前述式中， 前述(Π_2)中，㈣；前述式㈣中，㈣或8;前 述(ΙΙ-4)中’ η=7或8 ;前述式㈣)中，㈣且㈣；前述 (H-6)中，n=8im=4 ;前述式(117)中，η=8^=4 ;前 述(II-8)中，n=5且㈣；前述式(π_9)中，㈣且㈣。 14 201219570 46.如申請專利範圍第45項之單體，其中前述式(II-4)為下 述式(II-4a)，且前述式(II-8)為下述式(II-8a); 【化7】
    47. 如申請專利範圍第43至46項中任一項之單體，其中前述 式(II)中，L1為前述聚醚鏈，且前述聚醚鏈為聚乙二醇。 48. 如申請專利範圍第43至47項中任一項之單體，其中前述 式(II)中，L1之原子個數(η)與L2之原子個數(m)的合計(m + η)係在0〜30之範圍内。 49. 如申請專利範圍第43至48項中任一項之單體，其含有 標記物質。 50. 如申請專利範圍第43至49項中任一項之單體，其含有穩 定同位素。 51. 如申請專利範圍第43至50項中任一項之單體，其供用於 自動合成核酸。 52. —種合成方法，係核酸之合成方法，其特徵在於：使用 如申請專利範圍第43至51項中任一項之單體。 15
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