TW200922621A - Compositions and methods of use for antibodies against sclerostin - Google Patents

Compositions and methods of use for antibodies against sclerostin Download PDF

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Description

200922621 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於骨硬化素抗體及該等抗體之組合物及治療 由骨硬化素所介導之病理學病症或與骨異f相關之疾病 (諸如骨質疏鬆症）的使用方法。 【先前技術】 SOST基因編碼蛋白質骨硬化素，骨硬化素為含有個 胺基酸之分泌醣蛋白。骨硬化素為含胱胺酸結因子超家族 (之成員。骨硬化素與DAN/Cerberus蛋白家族有關，其藉由 抑制BMP與受體結合而直接干擾BMp信號傳輪且由此干擾 BMP信號傳輸級聯（Avsian_Kretchmer，M〇i End⑽丨⑽ 2004, 18 (1):1-12)。 對於成人，主要在骨及腎臟中偵測到骨硬化素mRNA表 現。骨硬化素蛋白主要可在骨中偵測到。在骨中，其表現 限於成沾及分化末期之骨形成細胞，即骨細胞。 骨硬化素為人類及小鼠骨形成之有效負調控子。缺乏 I S0ST表現導致骨硬化症（Balemans等人。Hum Mol Genet.， 2001，10(5):537-43 ; Bnmkow等人。Am J Hum Genet， 2001，68(3):577-89)。患者遭受終生骨增生，導致骨礦物 岔度及強度增加。其不展示其他内分泌異常’其一生中所 經歷之所有併發症均與異常骨積累有關。該隱性病症之雜 合攜帶者亦展示骨質量增加（Gardner等人。】Ciin
Endocrinol Metab，2005, 90 (12):6392-5)。該表型可在缺乏 SOST之小鼠中再現，且其過度表現導致骨質減少。此 134810.doc 200922621 外，¥狂!131^116111病[]^1]\4 23 9100](骨硬化症之表型相似疾 病）係由遠距骨增強子之基因組缺失所致之SOST誤調節引 起（Balemans等人。J Med Gene, 2002，39(2):91-7 ; Loots 等 人，Genome Res，2005，15(7):928-35)。最後，在骨形成期 間，SOST由副甲狀腺素下調（臨床上驗證之骨形成原理）表 明PTH之合成代謝作用之一部分可能係經由SOST介導 (Keller及 Kneissel Bone，2005, 37(2):148-58) ° 骨硬化素結合BMP(骨成型蛋白）且可充當活體外BMP拮 抗劑（Winkler等人，EMBO J.，2003，22 (23):6267-76)。骨 硬化素亦充當經典Wnt信號傳輸之負調控子，直接藉由與 LRP5/LRP6 結合（Li等人，J Biol Chem·，2005，20; 280 (20) ; Semenov, J Biol Chem. 2006 年 10 月 19 日；van Bezo o ijen等人，J Bone Miner Res, 2006年 10月 10 日）或經 由間接方式（Winkler 等人，J Biol Chem·，2005，28; 280 (4):2498-502) ° 缺乏骨硬化素表現使得骨大量形成，但不干擾骨再吸收 (骨硬化症、Van Buchem 病）(Balemans 等人。2001 ; Brunkow等人。Am J Hum Genet, 2001，68(3):577-89 ; Balemans等人。2006 ; Loots等人，Genome Res, 2005，15(7): 928-35) ° 目前可利用之對於骨路病症之治療中很少會增加成人之 骨密度，且目前可利用之治療中大多數主要藉由抑制進一 步骨再吸收而非刺激新的骨形成來發揮作用。 用於治療骨質流失之藥劑之一實例為雌激素。然而，尚 134810.doc 200922621 未明確雌激素是否具有某些有利的長期作用。此外，雌激 素可能帶來增加多種類型之腫瘤（諸如乳房及子宮内膜癌） 之發病率的風險。骨質疏鬆症之其他當前療法包括雙膦酸 鹽（例如 F〇samax™、Act〇nelTM、B〇nvivaTM，z〇metaTM '奥 帕膦酸鹽（olpadronate)、奈立膦酸鹽（neridr〇nate)、替魯膦 酸鈉（skelid)、骨膦（bonef〇s))、副甲狀腺素、鈣阻滯劑、 擬辦劑（CalCimimetic)(例如西那卡塞（cinacaket))、士他汀 (statin)、合成代謝類固醇、鑭鹽及锶鹽及氟化鈉。然而該 等療法通常伴有不適宜之副作用。 【發明内容】 在本文中，本發明之一實施例提供一種針對骨硬化素多 肽（SEQ ID NO:155)中之標靶之抗體或包含該抗體之抗原 結合部分的功能蛋白’其特徵在於該抗體或功能蛋白與骨 硬化素多肽特異性結合且可增加哺乳動物中骨形成、骨礦 物密度、骨礦物含量、骨質量、骨品質及骨強度中之至少 一者。
在一實施例中’本發明之抗體具有逆轉骨硬化素抑制活 體外骨礦化之能力。在一相關實施例中，其具有逆轉骨硬 化素抑制wnt-Ι介導之信號傳輸路徑之能力。在另一相關 實施例中，其破壞骨硬化素LRP6結合且可阻斷高劑量骨 硬化素對BMP誘導之Smadl磷酸化之抑制作用。在另一實 施例中，本發明之抗體與SEQ ID NO: 155之胺基酸112與 126之間（包括胺基酸112與126)的骨硬化素區域（亦即該區 域由SEQ ID NO:155之胺基酸112至126組成）及/或SEQ ID 134810.doc 200922621 NO: 155之胺基酸160-174(包括160與174)之間的區域（亦即 該區域由SEQ ID NO:155之胺基酸160至174組成）結合，且 更特定言之，其與包含ARLLPNAIGRGKWWR(SEQ ID NO 156)與 RLVASCKCKRLTRFH(SEQ ID NO 157)二者之區域 結合。 骨硬化素抑制HEK293細胞中wntl介導之STF (Supertopflash，經典wnt信號傳輸之報導體讀出結果）活 化。在一些實施例中’本發明之抗體以高度可再現方式恢 復wnt信號傳輸報導體讀出結果。 已展示所觀察到的本發明之抗體對非成骨細胞之Wnt信 號傳輸報導體檢定中骨硬化素作用的抑制作用體現為由於 活體内骨硬化素抑制而誘導骨形成反應。實際上，老齡齧 齒動物之活體内實驗展示本發明之抗體促進較強骨合成代 謝。骨質量增量達至每日以極高合成代謝劑量之副曱狀腺 素（其用作陽性對照）間歇治療的作用水準。 因此，根據另一較佳實施例，本發明之抗體對骨硬化素 具有在低pM範圍内之親和力且以約10 nM之IC50值抑制骨 硬化素對wnt信號傳輸之影響。 更佳地’在另一較佳實施例中，本發明之抗體與包含在 SEQ ID NO:155之胺基酸112與126(包括胺基酸112與126) 之間的骨硬化素區域（亦即該區域由SEQ ID NO: 155之胺基 酸112至126組成）及包含在SEQ ID NO:155之胺基酸160與 174(包括胺基酸160與174)之間的骨硬化素區域（亦即該區 域由SEQ ID NO:155之胺基酸160至174組成）結合，且更特 134810.doc 200922621
疋吕之與分別覆蓋至少以下肽ARLLPNAIGRGKWWR(SEQ ID NO:156)及 RLVASCKCKRLTRFH(SEQ ID NO:157)之區 域結合’且對骨硬化素具有在低pM範圍内之親和力且以 約10 nM之IC5〇值抑制骨硬化素對wnt信號傳輸之影響。該 等抗體具有以母日以極高合成代謝劑量之副甲狀腺素皮下 ^療（1%性對照）之作用水準增加小鼠動物模型之主軸骨路 及附肢骨路中骨質量的能力，且因此適用於治療與骨異常 相關之疾病（諸如骨質疏鬆症）。 其他實施例包括包含本發明之抗體與治療骨質疏鬆症之 替代性療法（諸如雙膦酸鹽、副甲狀腺素、副甲狀腺素釋 放劑（鈣阻滯劑）、LRP4中和抗體及DKKq中和抗體）之組 合的組合物。 【實施方式】 本發明係關於經分離抗體，尤其人類抗體，其與骨硬化 素特異性結合且抑制骨硬化素之功能特性。在某些實施例 中，本發明之抗體來源於特定重鏈及輕鏈序列且/或包含 特，結構特徵’諸如包含特定胺基酸序列之CDR區。本發 明提供經分離抗體’製備該等抗體之方法，包含該等抗體 免疫、、口 口物及夕價或多特異性分子，及含有本發明之抗 體、免疫結合物或雙特異性分子之醫藥組合物。本發明亦 係關於使用該等抗體抑制與骨硬化素表現之存在相關之病 ;或病狀的方法’例如用於治療由骨硬化素所介導或與骨 硬化素含量增加相關之病理學病症：例如骨相關疾病，諸 134810.doc 10 200922621 為使本發明可更易於理解，首 ^ I先弋義某些術語。其他定 義將貝穿整個實施方式進行闡述。 ......組成”，例如"包含"X 能包括其他某物，例如 術語"包含”涵蓋”包括”以及"由 之組合物可能僅由X組成或可 X+Y 〇 與數值X有關之術語"約"意謂（例如）χ±1〇〇/。。 5司語’大體上”不排降”穿各” 排除凡王，例如，，大體上不含"Y之組 合物可能完全不含Y。若雪亜，士& 右南要本發明之定義可省略詞語 "大體上"。 術浯免疫反應’’係指例如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞 巫細胞、粒細胞及由以上細胞或肝臟產生之可溶性巨分子 (包括抗體、細胞激素及補體）對侵襲性病原體、受病原體 感染之細胞或組織、癌細胞或在自體免疫或病理性炎症的 狀況下正常人類細胞或組織產生選擇性損害、破壞或使其 自人體消除的作用。 術語骨硬化素係指如以SEQ ID NO: 1 55定義之人類骨硬 化素。重組人類骨硬化素可由r&D Systems(Minneapolis, MN，USA; 2006目錄號1406-ST-025)獲得。此外，重組小 鼠骨硬化素 /SOST可購自 R&D Systems(Minneapolis, MN， USA; 2006 目錄號 1589-ST-025)。美國專利第 6,395,511 號 及第6,803,453號及美國專利公開案20〇4〇0〇9535及 20050106683—般性提及抗骨硬化素抗體。 如本文中所提及之術語"抗體"包括完整抗體及其任何抗 原結合片段（亦即”抗原結合部分”）或單鏈。天然存在之"抗 134810.doc 200922621 體”為包含經二硫鍵相互連接之至少兩條重（h)鏈及兩條輕 ()鍵的_蛋白。各重鏈由重鏈可變區（本文中縮寫為vH)及 重鏈f疋區，，且成。重鏈怪定區由3個域（C出、〔犯及CH3) 組成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定 區組成。該輕鏈恆定區由一個域CL組成。^及义區可進 步再刀為向變區（稱為互補決定區（Cdr))，.其與更保守 之稱為構架區(FR)之區域交替。各％及、由自胺基末端至 羧基末端按以下順序排列的三個CDR及四個Fr組成： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕 鏈之可變區含有與抗原相互作用的結合域。該等抗體之恆 定區可調節免疫球蛋白與宿主組織或因子（包括免疫系統 之各種細胞（例如效應細胞）及經典補體系統之第一組份 (C1 q))的結合。 如本文中所使用之術語抗體之"抗原結合部分"（或簡言之 ”抗原部分”）係指保留與抗原（例如骨硬化素）特異性結合之 能力的全長抗體或抗體之一或多個片段。已展示抗體之抗 原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之”抗原 結合部分”所涵蓋之結合片段的實例包括Fab片段，其為由 Vl、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，其為 包含在较鏈區由雙硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段； 由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體之單臂之\^及\^域 組成的Fv片段；由VH域組成之dAb片段（Ward等人，1989 Nature 341:544-546);及經分離互補決定區（CDR)。 此外，儘管Fv片段之兩個域（VL及VH)由獨立基因編碼， 134810.doc -12- 200922621 但其可使用重組法由合成連接子接合，該連接子使其能夠 製成vL及vH區配對以形成單價分子之單蛋白鏈（稱為單鏈
Fv(scFv);參見’例如Bird等人，1988 242:423- 426 ;及 Huston等人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879- 5883)。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之，，抗原結合 區''内。該等抗體片段係使用熟習此項技術者已知的習知 技術獲得’且以與完整抗體相同之方式針對效用對該等片 段進行篩檢。 如本文中所用之"經分離抗體，，係指大體上不含具有不同 抗原特異性之其他抗體的抗體（例如特異性結合骨硬化素 之經分離抗體大體上不含特異性結合除骨硬化素以外之抗 原的抗體）。然而，特異性結合骨硬化素之經分離抗體可 對其他抗原（諸如來自其他物種之骨硬化素分子）具有交又 反應性。此外，經分離抗體可能大體上不含其他細胞物質 及/或化學物質。 如本文中所使用之術語"單株抗體”或"單株抗體組份,，係 指具有單一分子組份之抗體分子的製劑。單株抗體組份呈 現對於特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。 如本文中所使用之術語”人類抗體，，意欲包括具有構架區 與CDR區均來源於人類來源之序列之可變區的抗體。此 外，若該抗體含有悝定區，則該恆定區亦來源於該等人類 序列，例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變型 式，或含有來源於人類構架序列分析之一致構架序列之抗 體，如Knappik 等人（2〇〇〇. 1以〇1別〇1 296 57 86)中所述。 134810.doc •13· 200922621 本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸 殘基（例如藉由活體外隨機或特定位點誘變或藉由活體内 體細胞突變所引人之突變）。然而，本文中所使用之術語 ”人類抗體”並不意欲包括來源於另一哺_物物種(諸如小 鼠）之生殖系的CDR序列移植於人類構架序列上之抗體。 術語"人類單株抗體”係指展示單一結合特異性之抗體， 其具有構架區與CDR區均來源於人類序列之可變區。在一 r實施例中，人類單株抗體係由包括與永生化細胞融合之B ^細胞的融合瘤產生，該B細胞係由具有包含人類重鏈轉殖 基因及輕鏈轉殖基因之基因組的轉殖基因非人類動物（例 如轉殖基因小鼠）獲得。 如本文中所使用之術語”重組人類抗體"包括所有藉由重 組方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如自針對 人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物（例如小 鼠）或由其製備之融合瘤分離之抗體，由經轉化以表現人 I 類抗體之宿主細胞（例如由轉染瘤）分離之抗體，由重組組 合人類抗體庫分離之抗體，及藉由涉及所有或一部分人類 免疫球蛋白基因序列與其他D N A序列拼接之任何其他方式 製備表現產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有 構架區與CDR區均來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可 變區然而，在某些實施例中，可對該等重組人類抗體進 行活體外誘變（或當使用針對人類Ig序列之轉殖基因動物 時，進行活體内體細胞誘變）且因此重組抗體之％及、區 之胺基酸序列為儘管來源於人類生殖系v H及V L序列且與之 134810.doc -14 - 200922621 相關但可能不天然存在於活體内人類抗體生殖系譜内之序 列。 如本文中所使用之，，同型”係指重鏈恆定區基因所提供之 抗體種類（例如IgM、IgE、IgG，諸如igGl或igG2)。 短語”識別抗原之抗體"及"對抗原具有特異性之抗體”在 本文中與術語"特異性結合抗原之抗體"可互換使用。 如本文中所使用’，，特異性結合骨硬化素多肽”之抗體意 指以 lxlO·8 Μ或 lxl〇-8 Μ以下、lxl〇-9 μ或 lxl〇-9 M以下或 lxl〇-1G M或lxl〇-1G M以下之Kd與骨硬化素多肽結合之抗 體。"與除骨硬化素之外之抗原交叉反應"之抗體意指以 0.5xl0_8 Μ 或 0.5X10 — 8 Μ 以下、5xl〇-9 Μ 或 5xl〇-9 以下或 2 X 10 Μ或2 X 1 0 9 Μ以下之KD結合抗原之抗體。"不與特定 抗原交叉反應”之抗體意指以1.5X10·8 Μ或l_5xl〇-8 Μ以上 之 KD 或 5xl〇-8 Μ 與 l〇xl〇-8 Μ 之間的 KD 或 lxlO·7 Μ 或 lxl〇-7 Μ以上之KD與該抗原結合之抗體。在某些實施例中，該等 不與抗原交又反應之抗體在標準結合檢定中展示基本上不 可偵測之與該等蛋白的結合。 如本文中所使用，"在基於細胞之wnt信號傳輸檢定中阻 斷骨硬化素之抑制作用"的抗體意指在基於細胞之sUper top flash(STF)檢定中以小於 1 mM、100 nM、20 nM、10 nM或10 nM以下之IC5G值恢復骨硬化素存在下wnt誘導之信 號傳輸的抗體。該STF檢定在以下實例中進行更詳細描 述。 如本文中所使用，”在基於細胞之礦化檢定中阻斷骨硬 134810.doc 15 200922621 化素之抑制作用"的抗體意指在基於細胞之檢定中以小於1 mM、500 nM、100 nM、10 nM、1 nM或 1 nM以下之IC50 值恢復骨硬化素存在下BMP2誘導之礦化作用的抗體。該 檢定在以下實例中進行更詳細描述。 如本文中所使用，"在Smadl磷酸化檢定中阻斷骨硬化素 之抑制作用"的抗體意指在基於細胞之檢定中以小於1 mM、500 nM、100 nM、10 nM、1 nM 或 1 nM以下之 IC50 值恢復骨硬化素存在下BMP2誘導之Smadl磷酸化的抗體。 該檢定在以下實例中進行更詳細描述。 如本文中所使用，"抑制骨硬化素與LRP-6之結合”的抗 體係指以 1 mM、500 nm、100 nM、10 nM、5 nM、3 nM、1 nM或1 nM以下之IC5〇值抑制骨硬化素與LRP-6結合 的抗體。該檢定在以下實例中進行更詳細描述。 如本文中所使用增加骨形成及質量及密度"之抗體係 指能夠達到每日以高合成代謝劑量之PTH間歇治療之水準 的骨形成、質量及密度之抗體，如實例1 0所示。 如本文所使用之術語”Kass。。”或”Ka”意指特定抗體-抗原 相互作用之締合速率’而如本文所使用之術語"Kdis"或 "KD”意指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所 使用之術§吾"Kd思指解離常數’其係自Kd與Ka之比率（亦 即Kd/Ka)獲得且以莫耳濃度（M)表示。抗體之kd值可使用 此項技術中充分確立之方法測定。一種測定抗體KD之方法 係藉由使用表面電聚共振或使用生物感應器系統，諸如 Biacore® 系統。 134810.doc •16- 200922621 :本文中所使用之術語"親和力”係指單一抗原位點處抗 ”抗原之間相互作用之強度。在各抗原位點内，抗體 "臂”之可變區經由微弱的非共價力與抗原在諸多位點處相 互作用；相互作用愈多，親和力愈強。 ^如本文中所使用之術語”親和力強度（avidhy)”係指抗體_ 抗原複合物之總穩定性或強度之資訊性量度。其受三個主 要因素控制：抗體抗原歧基親和力；抗原與抗體二者之 f
價數，及相互作用部分之結構排列。最終該等因素定義抗 體之特異性’亦即特定抗體與正確抗原之抗原決定基結合 之可能性。 為獲得較高結合力探針，可構築二聚結合物’由此使得 低親和力相互作用（諸如與生殖系抗體之相互作用）更易於 由FACS偵測。此外，增加抗原結合之結合力強度的另一 方法涉及產生抗骨硬化素抗體之本文所述構築體中之任一 者的一聚物、三聚物或多聚物。該等多聚物可經由個別模 組之間的共價鍵結而產生，例如藉由模擬天然c末端與N 末端結合或藉由模擬經由恆定區結合在一起之抗體二聚 物。經工程化至Fc/Fc界面之鍵可為共價鍵或非共價鍵。 此外’除Fc之外的二聚或多聚搭配物可用於在骨硬化素雜 交物中產生該等高級結構。舉例而言，可使用多聚域，諸 如Borean(W0200403 9841)中所述之三聚域或公開專利申請 案W098/18943中所述之五聚域。 如本文中所使用之術語••交叉反應性”係指抗體或抗體群 與其他抗原上之抗原決定基結合。此可能係由抗體之低結 134810.doc 200922621 合力強度或特異性或由具有相同或極類似抗原決定基之多 個不同抗原引起。交又反應性有時在需要與相關抗原群普 遍結合時，或在當抗原之抗原決定基序列在進化中並非高 度保守時嘗試進行交又物種標記時為適宜的。 如本文所使用之術語IgG抗體之"高親和力"係指抗體對 靶抗原具有10·8 Μ或ΙΟ-8 Μ以下、10·9 ^^戈丨^ M以下，或 ΙΟ·10 Μ或1〇-】〇 Μ以下之κ〇β然而，，，高親和力”結合可能因 ^其他抗體同型而改變。舉例而言，IgM同型之"高親和力” I 結合係指抗體具有10·7 Μ或ΙΟ·7 Μ以下，或〗〇-8 1^或1〇·8 M 以下之KD。 如本文中所使用之術語"個體"包括任何人類或非人類動 物。術語"非人類動物"包括所有脊椎動物，例如哺乳動物 及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬、貓、 馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。 如本文中所使用之術語，，經最佳化”意謂核苷酸序列經改 〔變以使用較佳在產生細胞或生物體，冑常真核細胞，例如 畢赤酵母（Pzc*/na)或木黴之細胞、中國倉鼠 卵細胞（CHO)或人類細胞中之密碼子編碼胺基酸序列。經 最佳化核苷酸序列經工程化以完全或儘可能多地保留最初 由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列，其亦稱為"親本”序 列。本文中之經最佳化序列已經工程化以具有較佳在哺乳 動物細胞中之密碼子，然而，本文中亦預想該等序列在其 他真核、.、田胞中之經最佳化表現。由經最佳化核芽酸序列編 碼之胺基酸序列亦稱為經最佳化。 134810.doc * 18- 200922621 本發明之多個態樣在以下子部分中進一步詳細描述。 评估抗體與多個物種之骨硬化素的結合能力之標準檢定 為此項技術中已知的，包括（例如）elisa、西方墨點法及 RIA °合適之檢定在實例中進行詳細描述。抗體之結合動 力學（例如結合親和力）亦可藉由此項技術中已知之標準檢 定，諸如藉由Biacore分析來評定。評估抗體對骨硬化素功 能特性（例如受體結合、預防或改善骨質溶解）之作用的檢 定在實例中進一步詳細描述。 因此’如根據此項技術已知及本文中所述之方法所測 疋’抑制"該等骨硬化素功能特性（例如，生物化學活性、 免疫化學活性、細胞活性、生理活性或其他生物活性，或 其類似活性）中之一或多者的抗體應理解為與特定活性相 對於不存在抗體的情況下（或當存在具有不相關特異性之 對照抗體時）所見之活性統計上顯著之減少有關。抑制骨 硬化素活性之抗體所實現的該統計上顯著之減少為量測參 數之至少10%，至少50%、80%或9〇%，且在某些實施例 中’本發明之抗體可抑制大於95%、98%或99°/❶之骨硬化 素功能活性。 術5吾交叉阻斷”意謂在標準競爭性結合檢定中抗體或其 他結合劑干擾其他抗體或結合劑結合骨硬化素之能力。 可使用標準競爭結合檢定測定抗體或其他結合劑能夠干 擾另一抗體或結合分子結合骨硬化素之能力或程度，且因 此判定其能否稱為本發明之交又阻斷。一合適檢定包括使 用Biacore技術（例如藉由使用BlAc〇re 3〇〇〇儀器⑼仏⑽， 1348l0.doc .19- 200922621
Uppsala，Sweden))，其可使用表面電漿共振技術量測相互 作用之程度。量測交叉阻斷之另一檢定使用基於ELISA2 方法。 實例中給出兩種方法之進一步詳述。 根據本發明，在所述BiAcore交又阻斷檢定中，本發明 之交又阻斷抗體或其他結合劑與骨硬化素結合以使所記錄 之抗體或結合劑之組合（混合物）的結合介於呈組合形式之 兩種抗體或結合劑之最大理論結合（如上所定義）的8〇%與 〇.1 %之間（例如80%至4%)，特定言之介於最大理論結合的 75%與〇.1%之間（例如75%至4%)，且更特定言之介於7〇% 與〇· 1 %之間（例如70°/。至4°/。），且更特定言之介於最大理論 結合的65%與0.1%之間（例如65〇/0至4%)。 如實例中所述之ELIS A檢定中，若與不存在液相抗骨硬 化素抗體的情況下（亦即陽性對照孔）獲得之骨硬化素偵測 信號相比，液相抗骨硬化素抗體能夠引起骨硬化素偵測信 號減少60%至100%、特定言70%至1〇〇%，且更特定言之 80%至100% ’則將該抗體定義為具交又阻斷性。 單株抗體
本發明之抗體包括如實例中所述分離之人類單株抗體。 本發明之經分離抗體的νΗ胺基酸序列係如SEQ ID NO:69-77所示。本發明之經分離抗體的Vl胺基酸序列分別係如 SEQ ID NO:80-88所示。本發明之抗體的相應較佳全長重 鏈胺基酸序列係如SEQ ID NO:l 13-121所示。本發明之抗 體的相應較佳全長輕鏈胺基酸序列分別係如SEq ID 134810.doc •20- 200922621 NO: 124-132所示。本發明之其他抗體包括已突變，但在 CDR區中與上述序列中所述之CDR區仍具有至少60%、 70%、80%、90°/。或95。/。或95%以上之一致性的胺基酸。在 一些實施例中，本發明包括突變胺基酸序列，其中當與上 述序列中所述之CDR區相比時CDR區中不超過1、2、3、4 或5個胺基酸已突變。 此外，可變重鏈親本核苷酸序列係如SEQ ID NO 89-90 所示。可變重鏈親本核苷酸序列係如SEq ID NO 100-101 所示。經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之全長輕鏈核苷 酸序列係如SEQ ID NO H6-154所示。經最佳化以於哺乳 動物細胞中表現之全長重鏈核苷酸序列係如SEQ ID NO 1 3 5-143所示。由經最佳化輕鏈核苷酸序列編碼之全長輕 鏈胺基酸序列係如SEQ ID NO 124-132所示。由經最佳化 重鏈核苷酸序列編碼之全長重鏈胺基酸序列係如SEQ ID NO 113-121所示。本發明之其他抗體包括已突變，但與上 述序列仍具有至少60%、70%、80%、90%或95%或95%以 上之一致性的胺基酸或核酸。在一些實施例中，本發明包 括突變胺基酸序列，其中當與上述序列中所述之可變區相 比時可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變，同 時保留大體上相同之治療活性。 由於該等抗體中之每一者可與骨硬化素結合，故vH、 Vl '全長輕鏈及全長重鏈序列（核苷酸序列及胺基酸序列） 可，經混合且匹配’’以產生本發明之其他抗骨硬化素結合分 子。该4經混合且匹配”之抗體之骨硬化素結合可使用上 134810.doc 200922621 述及實例中所述之結合檢定（例如ELISA)來測試。當該等 鏈經混合且匹配時，特定Vh/Vl對之％序列應以結構類似 之VH序列替代。同樣，特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長 重鏈序列應以結構類似之全長重鏈序列替代。同樣，特定 Vh/Vl對之Vl序列應以結構類似之乂1序列替代。同樣，特 定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應以結構類似之 全長輕鏈序列替代。因此，在一態樣中，本發明提供一種 經分離單株抗體或其抗原結合區，其具有：包含選自由 SEQ ID NO.69-77組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區； 及包含選自由SEQ ID NO:80-88組成之群之胺基酸序列的 輕鏈可變區；其中該抗體特異性結合骨硬化素。 在另一態樣中，本發明提供： ⑴一種經分離單株抗體，其具有：包含選自由沾卩m ΝΟ:Π3·121組成之群的經最佳化以於哺乳動物細胞中表現 之胺基酸序列的全長重鏈；及包含選自由SEQm Ν〇:ΐ24_ 132組成之群的經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之胺基 酸序列的全長輕鏈；或 (ii)一種功能蛋白，其包含該抗體之抗原結合部分。 在另一態樣中，本發明提供： ⑴一種經分離單株抗體，其具有：包含選自由讥卩id NO:135-143組成之群的經最佳化以於哺乳動物細胞中表現 之核苷酸序列的全長重鏈；及包含選自由SEQ id Ν〇 ΐ46_ 1 54組成之群的經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之核皆 酸序列的全長輕鏈；或 134810.doc -22- 200922621 (ii)一種功能蛋白，其包含該抗體之抗原結合部分。 在另一態樣中，本發明提供包含抗體之重鏈及輕鏈 CDR1、CDR2及CDR3或其組合之抗體。抗體之VH CDR1之 胺基酸序列係如SEQ ID ΝΟ:1-11所示。抗體之VH CDR2之 胺基酸序列係如SEQIDNO:12-22所示。抗體之VHCDR3 之胺基酸序列係如SEQ ID NO:23-33所示。抗體之VL CDR1之胺基酸序列係如SEQ ID NO:34-44所示。抗體之Vl CDR2之胺基酸序列係如SEQ ID NO:45-55所示。抗體之Vl CDR3之胺基酸序列係如SEQ ID NO:56-66所示。該等CDR 區係使用 Kabat 系統（Kabat, Ε· A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest > 第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開號 91-3242)描繪。 假定該等抗體中之每一者可與骨硬化素結合且主要由 CDR1、2及3區提供抗原結合特異性，則VH CDR1、2及3 序列及VL CDR1、2及3序列可"經混合且匹配"（亦即，不同 抗體之CDR可經混合且匹配）（但各抗體必須含有VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3)以產生本發明之其他抗骨 硬化素結合分子。該等”經混合且匹配”之抗體之骨硬化素 結合可使用上述及實例中所述之結合檢定（例如ELIS A)來 測試。當VH CDR序列經混合且匹配時，特定VH序列之 CDR1、CDR2及/或CDR3序列應以結構類似之CDR序列替 代。同樣，當VL CDR序列經混合且匹配時，特定VL序列 之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應以結構類似之CDR序列 134810.doc -23- 200922621 替代。一般熟習此項技術者應易於想到，新穎vH& vL序列 可藉由以與本文中對本發明之單株抗體所示的CDR序列結 構類似之序列取代一或多個^及/或Vl CDR區序列而產 生。 經分離單株抗體或其抗原結合區具有：包含選自由SEQ ID NO :1-11組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區cdri ; 包含選自由SEQ ID NO: 12-22組成之群之胺基酸序列的重 鏈可變區CDR2 ;包含選自由SEq ID NOJ3-33組成之群之 胺基酸序列的重鏈可變區CDR3 ;包含選自由SEQ ID NO :3 4-44組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區cdRI ;包 含選自由SEQ ID NO:45-55組成之群之胺基酸序列的輕鏈 可變區CDR2 ;及包含選自由SEQ ID NO:56-66組成之群之 胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3 ;其中該抗體特異性結合 骨硬化素。 在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO:3之重鏈可變 區 CDRI ; SEQ ID NO:14之重鍵可變區 CDR2 ; SEQ ID NO:25之重鏈可變區CDR3 ; SEQ ID NO:36之輕鏈可變區 CDRI ; SEQ ID NO:47 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID NO:58之輕鏈可變區CDR3。 在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO:4之重鏈可變 區 CDRI ; SEQ ID NO:15 之重鏈可變區 CDR2 ; SEQ ID NO:26之重鏈可變區CDR3 ; SEQ ID NO:37之輕鏈可變區 CDRI ; SEQ ID NO:48 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID NO:59之輕鏈可變區CDR3。 134810.doc -24- 200922621 在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO:5之重鏈可變 區 CDR1 ; SEQ ID NO:16 之重鏈可變區 CDR2 ; SEQ ID NO:27之重鏈可變區CDR3 ; SEQ ID NO:38之輕鏈可變區 CDR1 ; SEQ ID NO:49 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID ]^〇:60之輕鏈可變區€〇113。 在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO:6之重鏈可變 區 CDR1 ; SEQ ID NO:17 之重鏈可變區 CDR2 ; SEQ ID NO:28之重鏈可變區CDR3 ; SEQ ID NO:39之輕鏈可變區 CDR1 ; SEQ ID NO:50之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID NO:61之輕鏈可變區CDR3。 在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO:7之重鏈可變 區 CDR1 ; SEQ ID NO:18 之重鏈可變區 CDR2 ; SEQ ID NO:29之重鏈可變區CDR3 ; SEQ ID NO:40之輕鏈可變區 CDR1 ； SEQ ID NO:51 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID 1^〇:62之輕鏈可變區0〇113。 在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO:8之重鏈可變 區 CDR1 ; SEQ ID NO:19 之重鏈可變區 CDR2 ; SEQ ID NO:30之重鏈可變區CDR3 ; SEQ ID NO:41之輕鏈可變區 CDR1 ; SEQ ID NO:52 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID 1^〇:63之輕鏈可變區0〇113。
在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID NO:9之重鏈可變 區 CDR1 ; SEQ ID NO:20 之重鏈可變區 CDR2 ; SEQ ID NO:31之重鏈可變區CDR3 ; SEQ ID NO:42之輕鏈可變區 CDR1 ； SEQ ID NO:53 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID 134810.doc -25- 200922621 NO:64之輕鏈可變區CDR3。
在某實施例中’抗體包含：SEQIDNO:10之重鏈可變 區 CDR1，SEQ ID NO:21 之重鏈可變區 CDR2 ; SEq ID 1^0.32之重鏈可變區匸〇尺3;8丑(5 1〇1^0:43之輕鏈可變區 CDR1，SEQ ID NO:54 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ Π) >10:65之輕鏈可變區〇〇113。 在某一實施例中，抗體包含：SEQ ID N〇:u之重鏈可變 區 CDRl ’ SEQ ID NO:22之重鏈可變區 CDR2 ; SEQ Π) (NO:33之重鏈可變區CDR3 ; SEQ m N〇:44之輕鏈可變區
CDR1，SEQ ID NO:55 之輕鏈可變區 CDR2 ;及 SEQ ID NO:66之輕鏈可變區CDR3。 如本文中所使用之人類抗體包含重鏈或輕鏈可變區或全 長重鏈或輕鏈，若該抗體之可變區或全長鏈係由使用人類 生殖系免疫球蛋白基因之系統獲得，則其為特定生殖系序 列之產物’’或”來源於"該特定生殖系序列。該等系統包括 I以所關注之抗原使帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小 鼠免疫，或以所關注之抗原來篩檢在噬菌體上呈現之人類 免疫球蛋白基因庫。為人類生殖系免疫球蛋白序列"之產 物"或”來源於"人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可 如藉由將該人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋 白之胺基酸序列比較，及選擇序列最接近（亦即最大一致 性百分比）該人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序 列來鑑別。為特定人類生殖系免疫球蛋白序列，，之產物，，或 來源於特定人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體與該生 1348I0.doc -26- 200922621 殖系序列相比可含有胺基酸差異，此係歸因於（例如）天然 存在之體細胞突變或定點突變之意向性引入。然而，所選 人類抗體之胺基酸序列通常與由人類生殖系免疫球蛋白基 因編碼之胺基酸序列至少90%—致，且含有當與其他物種 之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列（例如，鼠類生殖系序列） 相比時將該人類抗體鑑別為人類抗體的胺基酸殘基。在某 些情況下，人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋 白基因編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%或至 少95% ’或甚至至少96%、97%、98%或99%—致。一般而 言’來源於特定人類生殖系序列之人類抗體與由人類生殖 系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比將呈現不超過i 〇 個胺基酸之差異。在某些情況下，人類抗體與由生殖系免 疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比可呈現不超過5個， 或甚至不超過4個、3個、2個或1個胺基酸之差異。在一些 實施例中，生殖系免疫球蛋白胺基酸序列係選自包含分別 由SEQ ID NO:67-68組成之可變重鏈序列及分別由SEQ ID N0:78_79組成之可變輕鏈序列之彼等序列。 同源抗艘 在另一實施例中’本發明之抗體具有全長重鏈及輕鏈胺 基酸序列；全長重鏈及輕鏈核苷酸序列、可變區重鏈及輕 鏈核苷酸序列，或與本文所述抗體之胺基酸及核苷酸序列 同源之可變區重鏈及輕鏈胺基酸序列，且其中該等抗體保 留本發明之抗骨硬化素抗體之所需功能特性。 舉例而言’本發明提供一種經分離單株抗體（或包含其 134810.doc •27- 200922621 抗原結合部分之功能蛋白），其包含重鏈可變區及輕鏈可 變區，其中：該重鏈可變區包含與選自由SEq Π) NO:67-77組成之群之胺基酸序列至少80% —致之胺基酸序列；該 輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NOs:77-88組成之群之胺 基酸序列至少80%—致之胺基酸序列；該抗體特異性結合 骨硬化素’且該抗體展現以下功能特性中之至少一者：該 抗體在基於細胞之wnt信號傳輸檢定中阻斷骨硬化素之抑 制作用’該抗體在基於細胞之礦化檢定中阻斷骨硬化素之 抑制作用’或在Smad 1磷酸化檢定中阻斷骨硬化素之抑制 作用’或該抗體抑制骨硬化素與LRP-6之結合或該抗體增 加骨形成及質量及密度。 在另一實例中，本發明提供一種經分離單株抗體（或包 含其抗原結合部分之功能蛋白），其包含全長重鏈及全長 輕鏈’其中：該全長重鏈包含與選自由SEq ID NO 111 -12 1組成之群之胺基酸序列至少8〇% —致之胺基酸序列； 邊全長輕鏈包含與選自由SEq m NO 122-132組成之群之 胺基酸序列至少80%—致之胺基酸序列；該抗體特異性結 合骨硬化素，且該抗體展現以下功能特性中之至少一者： 该抗體在基於細胞之wnt信號傳輸檢定中阻斷骨硬化素之 抑制作用’該抗體在基於細胞之礦化檢定中阻斷骨硬化素 之抑制作用’或在Smad 1磷酸化檢定中阻斷骨硬化素之抑 制作用’或該抗體抑制骨硬化素與Lrp_6之結合或該抗體 增加骨形成及質量及密度。 在另一實例中，本發明提供一種經分離單株抗體（或包 134810.doc •28- 200922621 含其抗原結合部分之功能蛋白）’其包含全長重鏈及全長 輕鏈，其中：該全長重鏈係由與選自由SEq m NO 1 Μ-ΐ 43組成之群之核 苷酸序 列至少 80%一致之核苷酸序列編 碼；該全長輕鏈包含與選自由SEQ ID NO 144-154組成之 群之核苷酸序列至少80% —致之核苷酸序列；該抗體特異 性結合骨硬化素’且該抗體展現以下功能特性中之至少一 者：在基於細胞之wnt信號傳輸檢定中該抗體阻斷骨硬化 素之抑制作用，在基於細胞之礦化檢定中該抗體阻斷骨硬 化素之抑制作用，或在Smad 1填酸化檢定中阻斷骨硬化素 之抑制作用’或該抗體抑制骨硬化素與LRP-6之結合或該 抗體增加骨形成及質量及密度。 在多個實施例中，該抗體可展示上述功能特性中之一或 多者，兩者或兩者以上，或三者。該抗體可為（例如）人類 抗體、人源化抗體或搬合抗體。 在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與上述序列 5 0%、60。/。、70%、80%、90%、95%、96%、97¾、98。/〇 或 99%—致。在其他實施例中，Vh&/或^^胺基酸序列除不 超過1、2、3、4或5個胺基酸位置上之胺基酸取代之外可 為一致的。具有分別與SEQ ID NO 67-77之VH區及SEQ ID NO 78-88 VL區具有高（亦即80%或80%以上）一致性之γΗ區 及VL區的抗體可藉由分別誘變（例如定點誘變或PCR介導 之誘變）編碼SEQ ID NO:89-99及1〇〇_11〇之核酸分子獲得， 繼而使用本文所述之功能檢定測試所編碼之變異抗體所保 留之功能（亦即上述功能）。 134810.doc • 29· 200922621 在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列 可與上述序列 50%、60%、70%、80%、90%、95%、 96%、97%、98%或 99%—致。具有分別與SEQ ID NO 111-121中之任一者之全長重鏈及SEQ ID NO 122-132中之任一 者之全長輕鏈具有高（亦即80%或80%以上）一致性之全長 重鏈及全長輕鏈的抗體可藉由分別誘變（例如定點誘變或 PCR 介導之誘變）編碼 SEQ ID NO:133-143 及 SEQ ID NO 144-154之核酸分子獲得，繼而使用本文所述之功能檢定 測試所編碼之變異抗體所保留之功能（亦即上述功能）。 在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈核苷酸序列 可與上述序列 60%、70%、80%、90%、95%、96%、 97%、98% 或 99%—致。 在其他實施例中，重鏈及/或輕鏈核苷酸序列之可變區 可與上述序列 60%、70°/。、80%、90%、95%、96%、 97%、98% 或 99%—致。 如本文中所使用之兩個序列之間的一致性百分比為該等 序列所共用之相同位置數之函數（亦即一致性％=相同位置 數/位置總數X 100)，考慮為達成兩個序列之最佳比對所需 要引入之空位數及各空位之長度。兩個序列之間的序列比 較及一致性百分比測定可使用如在以下非限制性實例中所 述之數學算法來達成。 兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用已併入 ALIGN程式（2.0版）中之E. Meyers及W. Miller之算法 (Comput. Appl· Biosci·，4:11-17，1988)，使用 ΡΑΜΙ20權重 134810.doc -30- 200922621 殘基表（weight residue table)，空位長度處罰12及空位處罰 4來測定。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可 使用已併入GCG套裝軟體（可在http://www.gcg.com獲得）中 之 GAP程式中的 Needleman及 Wunsch(J. Mol，Biol· 48:444-453，1970)算法，使用b1〇ss⑽62矩陣或PAM250矩陣及空 位權重16、14、12、1〇、8、6或4及長度權重1、2、3、 4、5或6來測定。 此外或其他’本發明之蛋白質序列可進一步用作，，查詢 序列"以執行對公開資料庫搜尋以（例如）鑑別相關序列。該 等搜尋可使用 Ahschul 等人，1990 J.Mol. Biol. 215:403-10 之XBLAST程式（2.0版本）執行。BLAST蛋白質搜尋可以 XBLAST程式，分值=50，字長=3執行，以獲得與本發明 之抗體分子同源之胺基酸序列。為了獲得空位比對以達成 比較目的，可如 Altschul等人，1997 Nucleic Acids Res.
25(17):3 3 89-3402中所述使用空位BLAST。當利用BLAST 及空位BLAST程式時’可使用各別程式（例如XBLAS1^ NBLAST)之預設參數。參見http:www.ncbi.nhn.nih.gov。 具有保守性修飾之抗體 在某些實施例中，本發明之抗體具有包含CDR1、CDR2 及CDR3序列之重鏈可變區及包含cdRI、CDR2及CDR3序 列之輕鏈可變區，其中該等CDR序列中之一或多者具有基 於本文中所述抗體之特定胺基酸序列或其保守性修飾，且 其中該等抗體保留本發明之抗骨硬化素抗體之所需功能特 性。因此，本發明提供一種經分離單株抗體，或包含其抗 134810.doc • 31 · 200922621 原結合部分之功能蛋白，其由包含CDRl、CDR2及CDR3 序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕 鏈可變區組成’其中：該等重鏈可變區CDR1胺基酸序列 係選自由SEQ ID ΝΟ:1-11組成之群及其保守性修飾；該等 重鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO:12-22組 成之群及其保守性修飾；該等重鏈可變區CDR3胺基酸序 列係選自由SEQ ID NO:23-33組成之群及其保守性修飾； 該等輕鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO:34-44組成之群及其保守性修飾；該等輕鍵可變區〔DR]胺基 酸序列係選自由SEQ ID NO:45-55組成之群及其保守性修 飾；該等輕鏈可變區之CDR3胺基酸序列係選自由SEq ID ΝΟ:56·66組成之群及其保守性修飾；該抗體特異性結合骨 硬化素’且該抗體展現以下功能特性中之至少一者：該抗 體在基於細胞之wnt信號傳輸檢定中阻斷骨硬化素之抑制 作用，該抗體在基於細胞之礦化檢定中阻斷骨硬化素之抑 制作用，或在Smadl磷酸化檢定中阻斷骨硬化素之抑制作 用’或該抗體抑制骨硬化素與LRP-6之結合或該抗體增加 骨形成及質量及密度。 在多個實施例中’該抗體可展現上述所列之功能特性中 之一或多者’兩者或兩者以上，或三者或三者以上。該等 抗體可為（例如）人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。 在其他實施例中’本發明之經最佳化以在哺乳動物細胞 中表現之抗體具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中該 4序列中之一或多者具有基於本文所述之抗體之特定胺基 134810.doc •32- 200922621 酸序列或其保守性㈣，且其中該等抗體保留本發明之抗 骨硬化素抗體之所需功能特性。因此，本發明提供一種經 最佳化以在哺乳動物細胞中表現之經分離單株抗體其由 全長重鏈及全長輕鏈組成，其中：該全長重鏈具有選自 SEQ ID N0:11H212群之胺基酸序列及其保守性修飾； 且該全長輕鏈具有選自SEQ ID N〇:122_132之群之胺基酸 序列及其保守性修飾·，該抗體特異性結合f硬化素；且該 抗體展現以下功能特性中之至少一者：在基於細胞之福 信號傳輸檢定中該抗體阻斷骨硬化素之抑制作用；在基於 細胞之礦化檢定中該抗體阻斷骨硬化素之抑制作用；或在
Smadl磷酸化檢定中阻斷骨硬化素之抑制作用；或該抗體 抑制骨硬化素與LRP_6之結合或該抗體增加骨形成及質量 及密度。 在多個實施例中，該抗體可展現上述所列之功能特性中 之一或多者，兩者或兩者以上，或三者或三者以上。該等 抗體可為（例如）人類抗體、人源化或嵌合抗體。 如本文中所使用之術語”保守性序列修飾"意指並不顯著 影響或改變含有該胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸 修飾。該等保守性修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。修 飾可藉由此項技術中已知之標準技術，諸如定點誘變及 PCR介導之誘變來引入本發明之抗體中。 保守性胺基酸取代為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基 酸殘基替代之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已 在此項技術中進行定義。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺 134810.doc -33- 200922621 基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、具有酸性側鏈之胺 基酸（例如天冬胺酸、麩胺酸）、具有不帶電極性側鏈之胺 基酸（例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇 胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、具有非極性側鏈之 胺基酸（例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺 酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、具有分支鏈側鏈之胺基酸 (例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）及具有芳族側鏈之胺基 酸（例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）^因此，本 發明之抗體之CDR區内的一或多個胺基酸殘基可以來自同 一側鏈家族之其他胺基酸殘基替代，且變異抗體可使用本 文中所述之功能檢定來測定其所保留之功能。 與本發明之抗骨硬化素抗體結合相同抗原決定基之抗體 在另一實施例中，本發明提供與本文所述之本發明之各 種特定抗骨硬化素抗體結合相同抗原決定基之抗體。實際 上已令人驚訝地發現實例中所述之具有以下能力之所有抗 體均以高親和力結合骨硬化素中之相同抗原決定基： (i)在基於細胞之wnt信號傳輸檢定中阻斷骨硬化素之抑 制作用； (Π)在基於細胞之礦化檢定中阻斷抑制作用； (iii) 抑制骨硬化素與LRP-6之結合；及 (iv) 增加骨形成、質量及密度， 該抗原決定基為包括SEQ ID NO: 156與SEQ ID NO: 157之 胺基酸的構形抗原決定基。在不受任何特定形式約束的情 況下’本文提出胺基酸序列8£卩11)>^0:156及8丘(5 1〇 134810.doc -34- 200922621 NO: 1 5 7描述由本發明之抗體省 成巧之骨硬化素多肽中的一個 構形抗原決定基區。 因此其他抗體可基於其在標準骨硬化素結合檢定中與本 發明之其他抗體交又競爭（例如，以統計上顯著之方式競 爭性抑制其他抗體之結合） )〈此力來鑑別。測試抗體抑制 本發明之抗體與人類骨硬化素結合之能力展示測試抗體可 與該抗體競爭結合人類骨硬化素，·根據非限制性理論，該 ί 抗體可與跟其競爭之抗體結合人類骨硬化素上之相同或相 關（例如結構類似或空間接近）的抗原決定基。在某一實施 财，與本發明之抗體結合人類骨硬化素上之相同抗原決 定基之抗體為人類單株抗體。該等人類單株抗體可如實例 中所述來製備及分離。 經工程化及修飾之抗體 此外，本發明之抗體可使用具有本文中所示之％序列 及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物將經修飾之 抗體工程化來製備，該經修飾之抗體可具有與起始抗體不 同之特f·生。抗體可藉由修飾一或兩種可變區（意即，及/ 或vL)内，例如在一或多個CDR區内及/或在一或多個構架 區内之一或多個殘基來工程化。此外或其他，抗體可藉由 修飾在恆定區内之殘基（例如）以改變該抗體之效應子功能 來工程化。 可執行之一類可變區工程化為CDR移植。抗體主要經由 位於重鏈及輕鏈之六個互補決定區（CDR)内之胺基酸殘基 與把抗原相互作用。因此，在個別抗體之間，CDR内之胺 134810.doc -35- 200922621 基酸序列比CDR外之序列差異更大。由於cdr序列負責大 部分抗體-抗原相互作用，故可藉由建構包括來自特定天 然產生抗體並移植至具有不同特性之不同抗體之構架序列 上的CDR序列之表現載體來表現模擬特定天然產生抗體之 特性的重組抗體（參見（例如）Riechmann，L.等人，1998
Nature 332:323-327 ; Jones，P.等人，1986 如加代 321:522-525 ; Queen, C.等人 ’ 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S,A. 86:10029-10033 ; Winter之美國專利第 5,225,539 號；及 Queen等人之美國專利第 5,530,101、5,585,089、5,693,762 及 6,180,370號）。 因此’本發明之另一實施例係關於一種經分離單株抗體 或包含其抗原結合部分之功能蛋白，其包含重鏈可變區， 該重鏈可變區包含分別具有選自由SEq ID NO: 1-11組成之 群之胺基酸序列的CDR1序列、具有選自由SEQ ID NO: 12-22組成之群之胺基酸序列的CDR2序列、具有選自由SEQ ID NO :23-33組成之群之胺基酸序列的CDR3序列；及輕鏈 可變區’該輕鏈可變區包含分別具有選自*SEq ID NO:34-44組成之群之胺基酸序列的CDR1序列、具有選自 由SEQ ID NO:45-55組成之群之胺基酸序列的CDR2序列及 由選自由SEQ ID NO :56-66組成之群之胺基酸序列組成之 CDR3序列。因此，該等抗體含有單株抗體之VH及VL CDR 序列’亦可含有與該等抗體不同之構架序列。 該等構架序列可自包括生殖系抗體基因序列之公開DNA 資料庫或已出版參考文獻獲得。舉例而言，人類重鏈及輕 134810.doc 36· 200922621
鏈可變區基因之生殖系DNA序列可發現於"VBase"人類生 殖系序列資料庫（可在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase 上獲得）以及 Kabat，E. A_，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五 版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH
Publication No. 91-3242 ； Tomlinson, I. M. » 等人，1992 J. fol. Biol. 227:776-798 ;及 Cox，J. P· L.等人，1994 Eur. J Immunol. 24:827-836中，該等文獻中每一者之内容係以引 用的方式明確併入本文中。 適用於本發明之抗體的構架序列之一實例為結構類似於 本發明之所選抗體所用之構架序列（例如一致序列）及/或本 發明之單株抗體所用之構架序列的彼等序列。VH CDR1、 2及3序列及VL CDR1、2及3序列可移植至與產生構架序列 之生殖系免疫球蛋白基因中所見的序列具有一致序列之構 架區上’或者CDR序列可移植至與生殖系序列相比含有一 或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現在某些情況 下’使構架區内之殘基突變以保持或增強該抗體之抗原結 合能力為有益的（參見（例如）Queen等人之美國專利第 5,530，101; 5,585,089; 5,693,762及 6,180,370號）。 另一類可變區修飾為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或 CDR3區内之胺基酸殘基突變以由此改良所關注抗體之一 或多種結合特性（例如親和力），稱為”親和力成熟，'。可執 行定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變，且對抗體結合 或所關注之其他功能特性之作用可以如本文中所述及實例 134810.doc -37· 200922621 中所提供之活體外或活體内檢定來評估。可引入保守性修 飾（如上所述）。該等突變可為胺基酸取代、添加或缺失: 此外，通常CDR區内不超過丨個、2個、3個、4個或$個殘 基發生改變。 因此，在另一實施例中，本發明提供經分離抗骨硬化素 單株抗體或包含其抗原結合部分之功能蛋白，其由以下部 分組成：重鏈可變區，其具有由選自具有SEQ ID N〇:i_n 之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO:l-U相比具有一個、兩 個、二個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加的胺基酸 序列組成之VH CDR1區，具有選自由SEQ ID n〇:12_22& 成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO:12-22相比具有— 個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之 胺基酸序列的VH CDR2區，具有選自由SEQ ID n〇:23_33 組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO:23-33相比具有一 個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之 胺基酸序列的VH CDR3區；輕鏈可變區，其具有選自由 SEQ ID NO:34-44組成之群之胺基酸序列或與SEq ID NO:34-44相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸 取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR1區，具有選自 由SEQ ID NO:45-55組成之群之胺基酸序列或與SEq ID NO:45-55相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸 取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR2區，及具有選 自由SEQ ID NO:56-66組成之群之胺基酸序列或與SEq 1]〇 NO:56-66相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸 134810.doc -38· 200922621 取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR3區。 將抗原結合域移植於替代性構架或骨架中 可使用多種抗體/免疫球蛋白構架或骨架，只要所得多 肽包括至少一個特異性結合骨硬化素之結合區即可。該等 構架或骨架包括5種主要個體基因型之人類免疫球蛋白， 或其片段（諸如本文中別處所揭示者），且包括其他動物物 種之免疫球蛋白，較佳具有人源化態樣。單一重鏈抗體 (諸如在駱駝科（camelid)中得以鑑別之單一重鏈抗體）在此 ( 方面備受關注。熟習此項技術者繼續發現及開發新穎構 架、骨架及片段。 在一態樣中，本發明係關於使用可移植有本發明之Cdr 的非免疫球蛋白骨架來產生非免疫球蛋白基抗體。可使用 已知或未來非免疫球蛋白構架及骨架，只要其包含對於 SEQ ID NO:155之靶蛋白具有特異性之結合區即可。本文 中將》亥·#化合物稱為"包含標乾特異性結合區之多肽"。非 (免疫球蛋白構架之實例在以下部分中進行進一步描述（駱 銳科抗體及非抗體骨架）。 駱駝科抗體 由駱駝及單峰駝（雙峰駝⑽似）及單峰駝 家族之成員（包括新世界成員諸 如美洲駝種（羊駝尸如⑶乃、大羊駝及小 羊駝wewg„fl)))獲得之抗體蛋白已針對尺寸、結構複 雜性及對人類個體之抗原性進行表徵β在自然界中發現之 該哺乳動物家族之某些IgG抗體缺乏輕鏈，且因此在結構 1348I0.doc -39- 200922621 上不同於其他動物之抗體的具有兩個重鏈及兩個輕鏈之典 型四鏈四級結構。參見PCT/EP93/02214(1994年3月3日公 開之 WO 94/04678)。 駱駝科抗體中鑑別為VHH之小型單一可變域的區域可藉 由遺傳工程獲得以產生對標靶具有高親和力之小型蛋白 質’產生稱為"駱駝科奈米抗體"之低分子量抗體衍生蛋 白。參見1998年6月2曰頒布之美國專利第5,759,808號；亦 參見 Stijlemans，B.等人，2〇〇4 j Bi〇l Chem 279: 1256- f
1261 ; Dumoulin，Μ.等人，2003 Nature 424: 783-788 ; Pleschberger，μ.等人。2003 Bioconjugate Chem 14: 440- 448 ; Cortez-Retamozo, V.等人。2002 Int J Cancer 89: 456-62 ;及 Lauwereys，M.等人。1998 emb〇 J 17: 3512-3520 〇 駱駝科抗體及抗體片段之工程化庫可購得，例如購自 AMynx，Ghent，Belgium。如同非人類來源之其他抗體一 般，駱駝科抗體之胺基酸序列可經重組改變以獲得更接近 人類序列之序列，亦即奈米抗體可，，人源化”。因此，可進 一步減小駱駝科抗體對人類之天然低抗原性。 路.¾科奈米抗體具有約為人類IgG分子之十分之_的 子量’且該蛋白質具有僅為幾奈米之實體直徑。該小尺 所引起之一結果為駱駝科车半 體結合功能上不可為較 抗體蛋白所見之抗原位點 力’亦即駱駝科奈米 用作偵測使用經典免疫技術障
At 、， ‘臧之抗原之試劑且適用作 月&之治療劑。因此，小 JT所引起之另_ έ士婁盔 米抗體可由於與靶I > 、、Ό果為駱.钆科 胆j w么兴祀蛋白之 飞較乍間隙中之特定位點 134810.doc -40- 200922621 合而具有抑制作用，且 接近經典低分子量¥ ^典抗體之功能相比更 低分子量及緊、，之:的能力發揮作用。 穩定，對極端ΡΗ:Γ寸進一步使路轮科奈米抗體極其熱 心值及蛋白水 性。另—姓果為玖π 穩疋，且具有極弱抗原 中，且甚米抗體易於自猶㈣統移至組織 此外^跨過▲腦屏障且可治療影響神經組織之病症。 恃8=體可有利於藥物跨過血腦屏障輸送。參見 ^ A開之美國專利中請案2G_161738。該等 特徵與對人類之低抗原人 y f °且口扣不較大之治療潛力。此 ’該等分子可在原核細胞（諸如大腸桿_.响）中完全 表現且表現為與噬菌體之融合蛋白且具有功能性。 匕本&月之特徵為一種對骨硬化素具有高親和力之 駱馱科抗體或奈米抗體。在本文之某些實施例中，駱駝科 抗體或奈米抗體係在駱駝科動物中天然產生，亦即由駱駝 科以骨硬化素或其肽片段使用本文對於其他抗體所述之技 術免疫之後產生。或者，將抗骨硬化素駱駝科奈米抗體工 程化，亦即藉由（例如）如本文實例中所述使用淘選程序以 骨硬化素作為標靶自噬菌體呈現之經適當誘變之駱駝科奈 米抗體蛋白的庫選擇產生。工程化奈米抗體可進一步經遺 傳工程定製以在接受個體體内具有45分鐘至兩週之半衰 期。在一特定實施例中，如（例如）PCT/EP93/02214(WO 94/04678)所述，藉由將本發明之人類抗體之重鏈或輕鏈的 CDR序列移植至奈米抗體或單域抗體構架序列中來獲得駱 駝科抗體或奈米抗體。 134810.doc 41 200922621 非抗體骨架 已知非免疫球蛋白構架或骨架包括（但不限於）阿第汀 (Adnectin)(纖維結合蛋白）（Compound Therapeutics，Inc.， Waltham，ΜΑ)、錫蛋白（ankyrin)(Molecular Partners AG, Zurich，Switzerland) ' 域抗體（Domantis，Ltd(Cambridge， MA)及 Ablynx nv(Zwijnaarde，Belgium))、月旨質運載蛋白 (lipocalin)(Anticalin)(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小分子免疫藥物（srnall modular immuno-pharmaceutical)(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、maxybody(Avidia，Inc_(Mountain View, CA))、蛋白 A(Affibody AG，Sweden)及 affilin(y-晶體蛋白或泛素）（Scil Proteins GmbH，Halle, Germany)、蛋白質抗原決定基模擬 劑（Polyphor Ltd, Allschwil，Switzerland)。 (i)阿第汀化合物療法 阿第汀骨架係基於ΠΙ型纖維結合蛋白域（例如，ΠΙ型纖 維結合蛋白之第十個模組（10 Fn3域））。III型纖維結合蛋白 域具有分布於兩個β摺疊之間的7或8條β鏈，該等β摺疊本 身彼此緊挨以形成該蛋白質的核心，且另外含有將該等ρ 鏈彼此連接且暴露於溶劑之環（與CDR類似”在(3摺疊夾層 之各邊緣處存在至少三個該等環，其中該邊緣為該蛋白質 垂直於β鏈之方向的邊界（US 6,818,418)。 該等基於纖維結合蛋白之骨架不為免疫球蛋白，儘管總 摺疊與包含駱駝及美洲駝IgG中之整個抗原識別單元之最 小功能抗體片段(重鏈可變區)的總摺疊密切相關。由於此 134810.doc -42- 200922621 結構，非免疫球蛋白抗體模擬在本質及親和力上與抗體之 抗原結合特性類似之抗原結合特性。該等骨架可用於與活 體内抗體之親和力成熟的過程類似之活體外環隨機化及改 組策略中。該等基於纖維結合蛋白之分子可用作骨架，其 中可使用標準選殖技術將該分子之環區以本發明之CDR替 代。 (ii)錫蛋白·分子搭配物 該技術係基於使用具有錨蛋白衍生之重複模組的蛋白質 作為用於承載可變區之骨架，該等可變區可用於與不同標 靶結合。該錨蛋白重複模組為由兩個反向平行之α_螺旋及 一個β-翻轉組成的具有33個胺基酸之多肽。可變區之結合 主要藉由使用核糖體呈現來最佳化。 (i i i )Maxy body / Av imer-Avidia
Avimer係來源於含天然A域之蛋白質，諸如LRp i。該 4域本性上用於蛋白質-蛋白質相互作用且人類有25〇餘種 蛋白質在結構上基於A域。Avimer係由大量經由胺基酸連 接子連接之不同"A-域”單體（2-1〇個）組成。可使用（例 如）20040175756 、 20050053973 、 20050048512及20060008844 中所述之方法產生可與靶抗原結合之Avimer。 (vi)蛋白 A-Affibody
Affibody®親和配體為由基於蛋白a之一個IgG結合域之 骨架的3螺旋束組成的小型單純蛋白質。蛋白A為來自細菌 金κ色葡萄球函oMrewi)之表面蛋白。此骨 架域由58個胺基酸組成，隨機選擇其中13個胺基酸以產生 I348I0.doc -43· 200922621 具有大量配體變異體之Affibody®庫（參見（例如）US 5,831，〇12)。Affibody®分子模擬抗體，其具有6 kDa之分子 置’與抗體之150 kDa之分子量相比較。儘官Affibody ®分 子尺寸較小，但其結合位點仍與抗體之結合位點類似。 (v)Anticalins-Pieris
Anticalins® 為由 Pieris ProteoLab AG 公司開發之產品。 其係來源於脂質運載蛋白，一群分布廣泛之小型且穩固之 蛋白質，其通常與化學上敏感或不溶性化合物之生理輸送 ' 或儲存有關。若干種天然脂質運載蛋白存在於人類組織或 體液中。 β亥蛋白質結構與免疫球蛋白類似，其中高變環位於剛性 構架之頂部。然而，與抗體或其重組片段相對比，脂質運 載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈（其僅 略大於單一免疫球蛋白域）組成。
構成結合袋之四個環之組展示顯著結構可塑性且容許多 個側鏈L合位點因此可在專有過程中再成型以便以高親 和力及特異性識別具有不同形狀之指定靶分子。 脂質運載蛋白家族之一種蛋白質_大菜粉蝶（尸 如咖.⑽）之後膽色素結合蛋白（BBp)已用以藉由誘變四個 環之組來開發抗運載蛋白。描述"抗運載蛋白"之專利申請 案之一實例為PCT W0 199916873。 (vi)Affilin-Scil Proteins 蛋白質，其經設計以 。新穎Affilin™分子
Affilm釦子為小型非免疫球蛋白 對蛋白質U、分子具有特異性親和力 134810.doc -44 - 200922621 可極快速選自兩個庫，每一個庫係基於不同的人類衍生之 骨架蛋白。
AffilinTM分子並不展示與免疫球蛋白蛋白質的任何結構 同源性。Scil Proteins使用兩種AffilinTM骨架，其中之一者 為γ結晶’人類結構眼晶體蛋白，且另一者為”泛素"超家 族蛋白質。兩種人類骨架均極小，展示高溫穩定性且幾乎 抵抗pH值變化及變性劑。此高穩定性主要係歸因於該等蛋 白質經擴大之β摺疊結構。γ結晶衍生之蛋白質之實例描述 於W0200104144中且"泛素樣”蛋白之實例描述於 W02004106368 中。 (vii)蛋白質抗原決定基模擬劑（ΡΕΜ) PEM為中等尺寸環狀肽樣分子（MW 1-2 kDa)，其模擬蛋 白質之β髮夾二級結構，即蛋白質·蛋白質相互作用所涉及 之主要二級結構。更一般而言，模擬所揭示抗體之抗原決 定基的3D結構之任何多肽均為本發明之一部分。較佳實施 例為至少包含以下多肽Ε1 -L-E2之具有30-100個胺基酸之 多肽，其中 Ε1 為 SEQ ID ΝΟ:156，且 Ε2 為 SEQ ID NO: 1 57，且L為多肽連接子以使El及E2能夠複製為本發明 之抗體識別之區域的3D結構。根據一較佳實施例，L為由 1 0-20個選自胺基酸甘胺酸或絲胺酸之胺基酸組成之連接 子。較佳地，連接子L包含肽GGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:X/SEQ ID NO:158)或 GGGGSGGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: Y/SEQ ID NO: 159)，更佳地連接子L基本上由 SEQ ID NO:X或 SEQ ID NO:Y組成。 134810.doc • 45· 200922621 該等多肽應保留對本發明之抗體的高親和力。該等多肽 亦可有利地用作產生骨硬化素抗體之免疫原。 該等多肽亦可用作骨硬化素之拮抗劑或促效劑且因此具 有類似於對於本發明之抗體所述之應用。 E1及/或E2序列中具有一或多個胺基酸取代或缺失、較 佳不少於1個、2個或3個胺基酸取代或缺失之多肽亦為本 發明之一部分。該等多肽可進一步經工程化以延長半衰期 或改良溶解性。特別地，可產生該等多肽與血清蛋白（諸 如IgG或人類血清白蛋白之Fc片段）之融合構築體以延長半 衰期，其類似於以下段落中對於本發明之抗體片段分子所 述之Fc工程化。 構架或Fc工程化 本發明之經工程化抗體包括已對Vh及/或％内之構架殘 基進行修飾（例如）以改良抗體特性的抗體。通常進行該等 構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為 使或多個構架殘基"逆突變（backmutate)"成相應生殖系 序列。更特定言之’已進行體細胞突變之抗體可含有與產 生抗體之生殖系序列不同的構架殘基。該等殘基可藉由將 °亥等抗體構架序列與產生該抗體之生殖系序列比較來鑑 別。為使該等構架區序列回復至其生殖系組態，可藉由 (例如）定點誘變或PCR介導之誘變來使體細胞突變"逆突
變成生殖系序列。該等經”逆突變”之抗體亦意欲為本發 明所涵蓋。 X
另—類構架修飾涉及使該構架區内或甚至一或多個CDR 1348l〇.(joc -46- 200922621 區内之一或多個殘基突變以移除τ細胞抗原決定基而由此 降低該抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為，，去免疫"，進 一步詳細描述於Can*等人之美國專利公開案第2〇〇3〇153〇43 號中。 除構架區或CDR區内進行之修飾以外，或另外，本發明 之抗體可级工程化以包括F c區内之修飾，通常以改變該抗 體之一或多種功能特性’諸如血清半衰期、補體固定、Fc 受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗 體可經化學修飾（例如，可將一或多個化學部分連接於抗 體上）或經修飾以改變其糖基化，以再改變該抗體之一或 多種功能特性。以下進一步詳細描述該等實施例。Fc區中 之殘基編號為Kabat之EU索引之編號。 在一個實施例中’ CH1之鉸鏈區經修飾以使得該鉸鏈區 中之半胱胺酸殘基數改變，例如增加或減少。此方法進一 步描述於Bodmer•等人之美國專利第5,677,425號中。^扪之 叙鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以例如有利於輕鏈及重 鍵之組裝或增強或降低該抗體之穩定性。 在另一實施例中’抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短該抗體 之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入 Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中以使得該抗體具有葡萄 球菌蛋白A(SpA)結合相對於原Fc鉸鏈域SpA結合減弱。此 方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165，745號 中。 在另一實施例中，該抗體經修飾以延長其生物半衰期。 134810.doc -47- 200922621 多種方法可行。舉例而言，如Ward之美國專利第6,277,375 號中所述，可引入一或多種下列突變：T252L、T254S、 T256F。或者’為延長生物半衰期，如presta等人之美國專 利第5,869,〇46及6，121，022號中所述，可使抗體在ch14cl 區内改變以含有一個取自IgG Fc區之CH2域之兩個環的補 救文體（salvage receptor)結合抗原決定基。 在其他實施例中’以不同胺基酸殘基替代至少一個胺基 酸殘基來改變Fc區以改變該抗體之效應功能。舉例而言， 一或多個胺基酸可以不同胺基酸殘基替代以使得該抗體對 效應配體之親和力改變但保留該親本抗體之抗原結合能 力。對其之親和力改變之效應配體可為（例如受體或補 體之C 1組份。該方法進一步詳細描述於winter等人之美國 專利第 5,624,821 與 5,648,260號中。 在另一實施例中’一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可 以不同胺基酸殘基替代以使該抗體具有改變之C1 q結合及/ 或減少或消除之補體依賴性細胞毒性（CDC)。該方法進一 步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6，194,551號中。 在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以由此改 變該抗體結合補體之能力。此方法進一步詳細描述於 Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。 在另一實施例中，藉由修飾一或多個胺基酸來修飾Fc區 以增加該抗體介導抗體依賴性細胞毒性（ADCC)之能力及/ 或增加該抗體對Fey受體之親和力。此方法進一步詳細描 述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，已對人類 1348I0.doc •48· 200922621
IgGl上FcyRl、FcyRII、FcyRIII及FcRn之結合位點進行定 位且描述具有改良結合之變異體（參見Shields，R L等人， 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604)。 在另一實施例中，抗體之糖基化經修飾。舉例而言，可 製備去糖基化之抗體（亦即缺乏糖基化之抗體）。糖基化可 經改變以（例如）增加該抗體對"抗原"之親和力。該等碳水 化合物修飾可藉由（例如）改變抗體序列内之一或多個糖基 化位點來完成。舉例而言’可進行一或多個胺基酸取代， I 去除一或多個可變區構架糖基化位點由此去除該位點處之 糖基化。該去糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該方法 進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,7 14,350及 6,350,861號中。 此外或其他，可製備糖基化類型改變之抗體，諸如岩藻 糖基殘基量減少之低岩藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增 加之抗體。該等變異糖基化模式已經證實可增加抗體之 ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由（例如）使抗體在 糖基化方式改變之宿主細胞中表現來完成。糖基化方式改 變之細胞在此項技術中已加以描述且可用作表現本發明之 重組抗體由此產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而 言，Hang等人之EP 1，176,195描述具有經功能性破壞之 FUT8基因（其編碼岩藻糖基轉移酶）的細胞株以使在該細胞 株中表現之抗體展現低岩薄糖基化。Presta之PCT公開案 WO 03/035835描述一種變異CHO細胞株Lecl3細胞，其將 岩藻糖連接至Asn(297)連接碳水化合物之能力降低，亦使 I34810.doc •49- 200922621 在該宿主細胞中表現之抗體低岩藻糖基化（亦參見Shields， R.L.等人，2002 J· Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana 4人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程化以表現醣蛋 白-修飾醣基轉移酶（例如β〇,4)-Ν乙醯基葡糖胺基轉移酶 III(GnTIII))之細胞株’以使得在工程化細胞株中表現之抗
體展現之二分GlcNac結構增加，其使得該等抗體之ADCC 活性增加（亦參見 Umana等人，1999 Nat. Biotech. 17:176-180)。 本發明所涵蓋之本文中之抗體的另一種修飾為聚乙二醇 化。抗體可經聚乙二醇化（例如）以延長該抗體之生物（例如 企清）半衰期。為使抗體聚乙二醇化，通常使該抗體或其 片與聚乙二醇（PEG) ’諸如PEG之反應性酯或醛衍生物 在使一或多個PEG基團連接於該抗體或抗體片段上之條件 下反應。聚乙二醇化可藉由與反應性peg分子（或類似之反 應性水溶性聚合物）之醯化反應或烷基化反應來進行。如 本文中所使用之術語”聚乙二醇”意欲涵蓋已用以衍生其他 蛋白質之任何形式之PEG，諸如單（cl_Cl〇)烷氧基聚乙二 醇或單（C1-C10)芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇·順丁烯二醯亞 胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為去糖基化之 抗體。用於使蛋白質聚乙二醇化之方法在此項技術中已知 且了應用於本發明之抗體。參見（例如）Nishimura等人之Ep 〇 154 316或 Ishikawa 等人之 EP 〇 401 384。 本發明所涵蓋之抗體之另一種修飾為本發明之抗體的至 少抗原結合區與血清蛋白（諸如人類血清白蛋白或其片段） 1348I0.doc •50- 200922621 之結合物或蛋白融合體以延長所得分子之半衰期。該方法 (例如）插述於Ballance等人之Ep〇322〇94中。 人另-可能性為本發明之抗體的i少抗原結合區與能夠結 合血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)之蛋白質之融合體以延 長所得分子之半衰期。該方法（例如）描述於Nygren等人之 EP 〇 486 525 中。 使變異抗體工程化之方法 如以上所論述，具有本文所示之VH及VL序列或全長重 鏈及輕鏈序列之抗骨硬化素抗體可用於藉由修飾全長重鏈 及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列或其所連接之恆定區來產 生新的抗骨硬化素抗體。因此，在本發明之另一態樣中， 使用本發明之抗骨硬化素抗體之結構特徵來產生結構相關 之抗硬化素抗體，其保留本發明之抗體之至少一種功能 特性（諸如與人類骨硬化素結合）且亦抑制骨硬化素之一或 多種功能特性（例如受體結合、預防或改善骨質溶解）。 舉例而言，本發明之抗體之一或多個CDR區或其突變體 可與已知構架區及/或其他CDR重組組合以產生如以上所 述之本發明之其他經重組工程化之抗骨硬化素抗體。其他 類型之修飾包括先前部分中所述之修飾。工程化方法之起 。物為本文中所提供之vH及/或vL序列中之一或多者，或 其一或多個CDR區。為產生工程化抗體，並非必需實際上 製備具有本文中所提供之VH序列及/或VL序列中之一或多 者’或其一或多個CDR區的抗體（亦即表現為蛋白質）。實 情為該等序列中所含有之資訊用作產生來源於原始序列之 134810.doc -51 - 200922621 ”第二代"序列的起始物’且隨後製備”第二代"序列且表現 為蛋白質。 因此，在另一實施例中’本發明提供一種製備抗骨硬化 素抗體之方法，該抗骨硬化素抗體由以下部分組成：重鏈 可變區抗體序列，其具有選自由SEQ ID ΝΟ:1-11組成之群 之CDR1序列、選自由SEQ ID ]^〇:12-22組成之群之0〇112 序列及/或選自由SEQ ID N〇:23-33組成之群之CDR3序 列；及輕鏈可變區抗體序列’其具有選自由SEQ ID NO:34-44組成之群的CDR1序列、選自由seQ ID NO:45-55 組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO :5 6-66組成 之群的CDR3序列；改變該重鏈可變區抗體序列及/或該輕 鏈可變區抗體序列内之至少一胺基酸殘基以產生至少一變 異抗體序列；及使該變異抗體序列表現為蛋白質。 因此，在另一實施例中’本發明提供一種製備經最佳化 以於哺乳動物細胞中表現之抗骨硬化素抗體之方法，該抗 骨硬化素抗體由以下部分組成：具有選自SEQ ID NO: 111 -121之群之序列的全長重鏈抗體序列；及具有選自i22_132 之群之序列的全長輕鏈抗體序列；改變該全長重鏈抗體序 列及/或該全長輕鏈抗體序列内之至少一胺基酸殘基以產 生至少一變異抗體序列；及使該變異抗體序列表現為蛋白 質。 變異抗體序列亦可藉由篩檢具有選自由SEq ID NO:23-33組成之群之固定CDR3序列或如US20050255552中所述之 最小必需結合決定子及CDR1及CDR2序列之多樣性的抗體 134810.doc -52- 200922621 庫來製備。篩檢可根據適合於自抗體庫篩檢抗體之任何篩 檢技術（諸如噬菌體呈現技術）執行。 標準分子生物學技術可用以製備及表現變異抗體序列。 由變異抗體序列編碼之抗體為保留本文所述之抗骨硬化素 抗體之一種、一些或所有功能特性之抗體，該等功能特性 包括（但不限於）特異性結合人類骨硬化素；且該抗體展現 以下功能特性中之至少一者：該抗體在基於細胞之wnt信 號傳輸檢定中阻斷骨硬化素之抑制作用，該抗體在基於細 (胞之礦化檢定中阻斷骨硬化素之抑制作用或在Smadi磷酸 化檢定中阻斷骨硬化素之抑制作用，或該抗體抑制骨硬化 素與LRP-6結合或該抗體增加骨形成及質量及密度。 變異抗體可展現以上所述之功能特性中之一或多者，兩 者或兩者以上，或三者或三者以上。 變異抗體之功能特性可使用此項技術中可用及/或本文 中所述之標準檢定，諸如實例中所述之標準檢定（例如 ELISA)來評定。 C .. 在本毛明之使抗體工程化之方法的某些實施例中，可沿 整個或一部分抗骨硬化素抗體編碼序列隨機或選擇性引入 突變，且可對所得經修飾之抗骨硬化素抗體就如本文中所 述之結合活性及/或其他功能特性進行篩檢◊突變方法於 此項技術中已加以描述。舉例而言，Sh〇rt之pCT公開案 WO 02/092780描述使用飽和誘變、合成接合組裝或其組合 產生及篩檢抗體突變之方法。或者，Lazar等人之pcT公開 案WO 03/074679描述使用計算筛檢方法來使抗體之生化特 134810.doc •53· 200922621 性最佳化之方法。 編碼本發明之抗體的核酸分子 本發明之另一態樣係關於編碼本發明之抗體的核酸分 子°全長輕鏈親本核苷酸序列之實例係如SEq ID NO 144-1 45所示。全長重鏈親本核苷酸序列之實例係如SEq m NO 133-134所示。經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之全 長輕鏈核苷酸序列之實例係WSEq ID NO 146-154所示。 經最佳化以於哺乳動物細胞中表現之全長重鏈核苷酸序列 之實例係如SEQ ID NO 135-143所示。 核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或可 為呈部分純或大體上純之形式的核酸。當核酸藉由標準技 術（包括鹼/SDS處理、CsCl結合、管柱層析法、瓊脂糖凝 膠電泳及此項技術中熟知之其他技術）自其他細胞組份或 其他污染物（例如其他細胞核酸或蛋白質）純化時，其為"經 分離"或"變成大體上純的”。參見F. Ausubel等人編輯。 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley lnterscience，New Y〇rk。本發明之核 酸可為（例如）DNA或RNA，且可能含有或可能不含有内含 子序列。在一實施例中，該核酸為cDna分子。核酸可存 在於諸如噬菌體呈現載體之載體中，或存在於重組質體載 體中。 本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲才寻。對於由 融合瘤（例如，如下進-步描述之由帶有人類免疫球蛋白 基因之轉殖基因小鼠製備的融合瘤）表現之抗體而言，編 134810.doc •54- 200922621 碼由該融合瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標 準PCR擴增或eDNA選殖技術獲得。對於由免疫球蛋白基 因庫獲得（例如使用噬菌體呈現技術）之抗體而言，編碼該 抗體之核酸可自作為該庫之成員的多個噬菌體純系回收。 一旦獲得編碼vH及vL區段之DNA片段，該等DNA片段 即可進一步藉由標準重組DNA技術處理（例如）以使該等可 變區基因轉化為全長抗體鏈基因，轉化為Fab片段基因或 scFv基因。在該等處理中，將編碼Vl或^^之DNA片段操作 性連接至另一 DNA分子或編碼另一蛋白質之片段（諸如抗 體恆定區或可撓性連接子卜如此情況下所用之術語"操作 性連接意s胃兩個DNA片段以功能方式接合，例如使得由 該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框，或使得該蛋 白質在所需啟動子的控制下表現。
可藉由將編碼VH之DNA操作性連接至編碼重鏈恆定區 (CH1、CH2及CH3)之另一 DNA分子來將編碼vH區之經分 離DNA轉化為全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列 在此項技術中已知（參見，例如Kabat，Ε· A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest > 第 5版， U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開 號91-3242)且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴 增獲得。重鏈恆定區可為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA、IgE、IgM或IgD恆定區。較佳地，重鍵怪定區在 IgG2同型中選擇。對於Fab片段重鏈基因而言，可將編碼 Vh之DNA操作性連接至僅編碼重鍵CH 1丨互定區之另一 DNA 134810.doc -55- 200922621 分子上。 可藉由將編碼VL之DNA操作性連接至編碼輕鏈恆定區 CL之另一 DNA分子來將經分離之編碼VL區之DNA轉化為 全長輕鏈基因（以及Fab輕鏈基因）。人類輕鏈恆定區基因之 序列在此項技術申已知（參見（例如）Kabat，E. A.等人，1991
Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五 版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公 開號91-3242) ’且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準 PCR擴增獲得。該輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。 為產生scFv基因，將編碼vH及VL之DNA片段操作性連接 至編碼可撓性連接子（例如編碼胺基酸序列（Gly4_Ser)3)之 另一片段上，以使得VH及VL序列可表現為鄰近單鏈蛋白， 其中區由可撓性連接子接合（參見（例如）Bird等人，
1988 Science 242:423-426，· Huston等人，1988 Pr〇c. Natl ACad· Sci. USA 85:5879-5883 ; McCafferty 等人，199〇 Nature 348:552-554) 〇 本發明之單株抗體的產生 單株抗體（mAb)可藉由多種技術來製備，該等技術包括 習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein, 1975胸則 256: 495之標準體細胞雜交技術。可使用產生單株抗體之 多種技術，例如B淋巴細胞之病毒性或致癌性轉化。 用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統。在小鼠中產生 融合瘤為充分確立之程序。分離經免疫脾細胞以供融人之 免疫方案及技術在此項技術中已知。亦已知融合搭配物 134810.doc -56- 200922621 (例如鼠類骨髓瘤細胞）及融合程序。 本發明之敌合抗體或人源化抗體可基於如上所述製備之 鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之 DNA可使用標準分子生物學技術由所關注之鼠類融合瘤獲 得且可經工程化以含有非鼠類（例如人類）免疫球蛋白序 列。舉例而言’為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知 之方法來使鼠類可變區與人類恆定區連接（參見（例 如）Cabilly等人之美國專利第號）。為產生人源化 抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類Cdr區插入人 類構架中。參見（例如）Winter之美國專利第5225539號及 Queen 等人之美國專利第 553〇1〇1 ; 5585〇89 ; 5693762 及 6180370號。 在某一實施例中，本發明之抗體為人類單株抗體。該等 針對骨硬化素之人類單株抗體可使用帶有部分人類免疫系 統而非小鼠系統的轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。該等 轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小 鼠及KM小鼠之小鼠，且在本文中統稱為"人類Ig小鼠"。
HuMAb mouse®(Medarex，Inc.)含有編碼未重排人類重鏈 (μ及γ)及jc輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微小 位點以及使内源κ鏈位點失活之靶向突變（參見（例 如）Lonberg等人，1994 Nature 368(6474): 856-859)。因 此，小鼠展現出小鼠IgM或κ表現減少，且對免疫作用作出 反應，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因進行類別轉換及 體細胞突變以產生高親和力人類IgGjc單株抗體（L〇nberg, 134810.doc -57- 200922621 N.等人，1994前述；評論於Lonberg，N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49-10 1 ; Lonberg，N.及 Huszar, D·, 1995 Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 ;及
Harding, F·及 Lonberg，N.，1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:53 6-546中）。下列文獻中進一步描述HuMAb小鼠之製 備及用途及該等小鼠所帶有之基因組修飾：Taylor，L.等 人，1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295 ； Chen, J. 等人，1993 International Immunology 5:647-656 ； Tuaillon 等人，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi 等人，1993 Nature Genetics 4:117-123 ; Chen，J.等 人，1993 EMBO J. 12:821-830 ; Tuaillon等人，1994 厂 Immunol. 152:2912-2920 ; Taylor, L.等人，1994 International Immunology 579-591 ;及 Fishwild，D.等人，1996 Nature Biotechnology 14: 845-851，所有該等文獻之全部内容係 以引用的方式特別地併入本文中。此外參見皆為Lonberg 及 Kay 之美國專利第 5,545,806、5,569,825、5,625,126、 5,633,425 、 5,789,650 、 5,877,397 、 5,661,016 、 5,814,318、5,874,299及 5,770,429號；81^11丨等人之美國專 利第5,545,807號；皆為Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92/103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/113852、 WO 98/24884 及 WO 99/45962號；及 Korman 等人之 PCT 公 開案第WO 01/14424號。 在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因 及轉染色體上帶有人類免疫球蛋白序列之小鼠’諸如帶有 134810.doc -58- 200922621 人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠產生。該等 小鼠（在本文中稱為"KM小鼠"）詳細描述於Ishida等人之 PCT公開案 WO 02/43478 中。 另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉殖基因動物 系統在此項技術中可得且可用以產生本發明之抗骨硬化素 抗體。舉例而言’可使用稱為Xen〇m〇use(Abgenix，Inc )之 替代性轉殖基因系統《該等小鼠描述於（例如）Kuchedapati 等人之美國專利第 5,939,598 ; 6,075，181 ; 6，1 14,598 ; f 6，150,584及 6，162,963號中。 此外’表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物 系統在此項技術中可得且可用以產生本發明之抗骨硬化素 抗體。舉例而言，可使用稱為”TC小鼠，，之帶有人類重鏈轉 染色體與人類輕鏈轉染色體之小鼠；該等小鼠描述於
Tomizuka等人，2000 Proc. Natl· Acad. Sci. USA 97:722- 727中。此外’帶有人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛於此項 技術中已加以描述（Kuroiwa等人，2002 Nature (
Biotechnology 20:889-894)且可用於產生本發明之抗骨硬 化素抗體。 亦可使用噬菌體呈現方法篩檢人類免疫球蛋白基因庫來 製備本發明之人類單株抗體。該等用於分離人類抗體之嗤 菌體呈現方法在此項技術中已確立或描述於以下實例中。 參見（例如）：Ladner等人之美國專利第5,223,409、 5,403,484及5,571，698號；Dower等人之美國專利第 5,427,908及5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第 134810.doc -59· 200922621 5,969，108及6，172，197號；及Griffiths等人之美國專利第 5,885,793、6,521，404、6,544,73 1、6,555,3 13、6,582,915 及 6,593,081 號。 本發明之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠製備，其中 已將人類免疫細胞重構於該等小鼠中從而可在免疫之後產 生人類抗體反應。該等小鼠係描述於（例如）Wilson等人之 美國專利第5,476,996及5,698,767號中。 產生人類單株抗體之融合瘤之獲得 為獲得產生本發明之人類·%•株抗體之融合瘤，可將經免 疫小鼠之脾細胞及/或淋巴結細胞分離且與適當永生化細 胞株（諸如小鼠骨髓瘤細胞株）融合。可對所得融合瘤就抗 原特異性抗體之產生進行篩檢。舉例而言，可以50% PEG 將來自經免疫小鼠之脾淋巴細胞之單細胞懸浮液與六分之 一數目之P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞（ATCC， CRL 1 5 80)融合。將細胞以約2 X 145塗佈於平底微量滴定板 内，繼而在含有2〇°/。胎純系血清、18% ”653,，改良性培養 基、5% origen(IGEN)、4 mM L-麩醯胺酸、1 mM 丙酮酸 納、5 mM HEPES、0.055 mM 2-疏基乙醇、50單位/毫升青 黴素、50 mg/ml鏈黴素、50 mg/ml慶大黴素及lxHAT (Sigrna ;融合24小時後添加HAT)之選擇性培養基中培育 兩週。約兩週之後’可將細胞在以HT替代HAT之培養基中 培養。隨後可藉由ELISA對個別孔就人類單株IgM及IgG抗 體進行篩檢。出現廣泛融合瘤生長之後，通常可在10-14 曰後觀察培養基。再塗佈分泌抗體之融合瘤，再次篩檢， 134810.doc -60- 200922621 若對人類IgG仍為陽性，則可藉由限制稀釋法將單株抗體 次選瘦至少兩次。隨後可在活體外培養穩定次純系以在組 織培養基内產生少量抗體以供表徵。 為純化人類單株抗體，可使所選融合瘤在2公升旋轉瓶 中生長以進行單株抗體純化。可將上清液過濾且濃縮，隨 後以蛋白A-瓊脂糖（Pharmacia, Piscataway，N.J_)進行親和 層析。經溶離之IgG可由凝膠電泳及高效液相層析檢驗以 確保純度。可將緩衝溶液替換為pBS，且可使用丨43消光 係數藉由OD28〇測定濃度。可將單株抗體等分且儲存於_ 80°C 下。 產生單株抗體之轉染瘤之獲得 本發明之抗體亦可使用（例如）此項技術中熟知之重組 DNA技術與基因轉染方法之組合在宿主細胞轉染瘤中產生 (例如 Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。 舉例而言，為表現該等抗體或其抗體片段，編碼部分或 全長輕鏈及重鏈之DNA可藉由標準分子生物學技術（例 如，PCR擴增或cDNA選殖，使用表現所關注抗體之融合 瘤）獲得，且該等DNA可插入表現載體中以使得該等基因 與轉錄及轉譯控制序列操作性連接。在此情形中，術語 操作性連接"意謂將抗體基因接合至載體内以使載體内之 轉錄及轉譯控制序列發揮其調節抗體基因轉錄及轉譯之預 期功能。表現載體及表現控制序列經選擇以與所用表現宿 主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入獨立 栽體中，或更通常將兩種基因插入同一表現載體中。藉由 13481〇,(j〇c -61 - 200922621 標準方法（例如該抗體基因片段與載體上之互補限制位點 的接合’或若不存在限制位點則為鈍端接合）將該等抗體 基因插入表現載體中》可使用本文所述之抗體之輕鏈及重 鏈可變區產生任何抗體同型之全長抗體基因，此係藉由將 該等可變區插入已編碼所需同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定 區之表現載體中，以使得VH區段與載體内之CH區段操作 性連接且VL區段與載體内之CL區段操作性連接。此外或 其他，重組表現載體可編碼有利於自宿主細胞分泌抗體鏈 之k號肽。該抗體鏈基因可選殖至載體中以使得該信號肽 與該抗體鏈基因之胺基末端同框連接。該信號肽可為免疫 球蛋白彳5號狀或異源彳§號狀（亦即來自非免疫球蛋白蛋白 質的信號肽）。 除抗體鏈基因以外，本發明之重組表現載體帶有控制抗 體鏈基因在宿主細胞中表現之調節序列。術語"調節序列" 意欲包括控制抗體鏈基因之轉錄或轉譯之啟動子、增強子 及其他表現控制元（例如聚腺苷酸化信號）。該等調節序列 描述於（例如）G〇eddel(Gene Expression Techn〇1〇gy
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))中。熟l此項技術者應瞭解，表現載體之設 計，包括調節序列之選擇，可視諸如待轉化宿主細胞之選 擇、所需蛋白質表現量等因素而定。哺乳動物宿主細胞表 現之調節序列包括引導哺乳動物細胞内高蛋白質表現量的 病毒元，諸如來源於細胞巨大病毒（CMV)、猿猴病毒 40(Shnian Virus 40, SV40)、腺病毒（例如腺病毒主要晚期 134810.doc -62- 200922621 啟動子（AdMLP))及多形瘤之啟動子及/或增強子。或者， °使用非病甘!·生調$序列，諸如泛素啟動子或血球蛋白 啟動子。此外，調節元包含來自不同來源之序列，諸如 SRa啟動系統’其含有來自测早期啟動子之序列及1型 人類T、、、田胞白血病病毒之長末端重複序列(祉如，γ.等 人 1988 Mol_ Cell. Biol. 8:466-472)。 除抗體鏈基因及調節序列以外，本發明之重組表現載體 可帶有其他序列，諸如調節載體在宿主細胞中複製之序列 (例如，複製起點)及可選標記基因。該可選標記基因有利 於選擇載體已引入其中之宿主細胞（參見（例如）均為⑽等 人之美國專利第4,399,216、4,634,665號及5，179,〇17號）。 舉例而言’通常可選標記基因賦予載體已引人其中之宿主 細胞對諸如G418、潮黴素（hygromycin)或甲胺喋呤之藥物 的抗性。可選標記基因包括二氫葉酸還原酶（dhfr)基因 (用於dhfr-宿主細胞中之曱胺喋呤選擇/擴增）及ne〇基因（用 於G418選擇）。 為表現輕鏈及重鏈，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之 表現載體轉染至宿主細胞中。多種形式之術語”轉染”意欲 涵蓋通常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中之多 種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及 其類似技術。理論上可使本發明之抗體在原核或真核宿主 細胞中表現。論述了抗體在真核細胞（尤其哺乳動物宿主 細胞）中之表現’此係由於該等真核細胞且尤其哺乳動物 細胞比原核細胞更有可能組裝及分泌經適當摺疊及免疫活 134810.doc -63 - 200922621 性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對於產生尚產率之 活性抗體而言無效（Boss, Μ. A.及Wood，C. R·，1985 Immunology Today 6:12-13) 〇 用於表現本發明之重組抗體之哺乳動物宿主細胞包括中 國倉鼠卵巢（CHO 細胞）（包括 Urlaub &Chasin，1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 中所述之dhfr-CHO 細 胞，與例如 R.J. Kaufman 及 P.A. Sharp，1982 Mol. Biol. 159:601-621中所述之DH FR可選標記一起使用）、NSO骨 髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。詳言之，對於與NSO骨 髓瘤細胞一起使用’另一表現系統為WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中所示之GS基因表現系統。當將編 碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞時，藉 由將該等宿主細胞培養足以使抗體在宿主細胞内表現或將 抗體分泌至宿主細胞所生長之培養基内的一段時期來產生 抗體。 。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體 雙特異性分子 在另態樣中，本發明之特徵為包含本發明之抗骨硬化
、’》口邛为可衍生為或連接至另一功能分子（例 。本發明之抗
134810.doc -64 - 200922621 術語"雙特異性分子"所涵蓋。# 马產生本發明之雙特異性分 子，可將本發明之抗體與—咬多 、 及多個诸如另一抗體、抗體片 丰又、肽或結合模擬劑之其他結合 σ刀子功旎性連接（例如經 由化學偶合、基因融合、非j£僧έ士人十甘^ ^價結合或其他方法）以產生 雙特異性分子。 f k. 因此，本發明包括包含至少-對骨硬化素之第-結合特 異性及對第二純原決定基之第二結合特異性的雙特異性 分子。舉例而[第，抗原決定基為骨硬化素中不同 於第-抗原決定基之另-抗原決定基。另—實例為包含 至少-對骨硬化素之第一結合特異性及對咖内之抗原 決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。另一實例為包 含至少一對骨硬化素之第一結合特異性及對lrp4内之抗 原決定基之第二結合特異性的雙特異性分子。 此外，對於雙特異性分子具有多特異性之發明而言，除 第一及第二靶抗原決定基之外，該分子可另外包括第三結 合特異性。 13
在一實施例中，本發明之雙特異性分子包含至少一抗體 或其抗體片段（包括（例如）Fab、Fab，、F(ab，）2、Fv或單鏈 Fv)作為結合特異性。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚物， 或其任意最小片段，諸如Fv或如Ladner等人之美國專利第 4,946,778號中所述之單鏈構築體，該專利之内容以引用的 方式明確併入本文中D 可用於本發明之雙特異性分子中之其他抗體為鼠類單株 抗體、嵌合單株抗體及人源化單株抗體。 134810.doc -65- 200922621 本發明之雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方 法將結合特異性組份結合來製備。舉例而言，雙特異性分 子各。口特異[生可獨立地產生且隨後彼此結合。當結合 特異性為蛋白質或肤技 令 / 時’多種偶合劑或交聯劑可用於共價 結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、Ν·破㈣ 亞胺基S乙醯基·硫代乙酸醋（s ATA)、w-二硫雙（2_硝基 苯曱fe〇(DTNB)、鄰苯二順丁稀二醯亞胺（QpDM)、破拍 醢亞胺基3 (2-吼咬基二硫基）丙酸醋（spDp)及4_(Ν_順丁婦 -醯亞胺基甲基）¾己院曱酸續酸基號站酿亞胺醋（石黃酸 基-SMCC)(參見（例如）Karp〇vsky等人，i984 j. Εχρ, Med.
160.1686，Liu，ΜΑ等人，1985 Proc· Natl. Acad. Sci_ USA 82:8648)。其他方法包括下列文獻中所述之方法：⑽叫 1985 Behring lns. Mitt. N〇 78 118 132 ; Brennan等人， 1985 Science 229:81_83 ;及—6等人，1987 ; immun〇i 139: 2367-23 75。結合劑為SATA及磺酸基-SMCC，其均可 購自 Pierce Chemical Co. (Rockford，IL)。 當結合特異性為抗體時’其可藉由兩個重鏈之C末端鉸 鏈區之氫硫基鍵結而結合。在一特定實施例中，該鉸鏈區 在結合之前經修飾以含有奇數個氫硫基殘基，例如1個。 或者’兩種結合特異性可在同一載體中編碼且在同一宿 主細胞中表現及組裝。若雙特異性分子為mAbxmAb、 mAbxFab、FabxF(ab·)2或配體X Fab融合蛋白，則此方法尤 其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一單鏈抗體及一 結合決定子的單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙 134810.doc -66- 200922621 特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製 備雙特異性分子之方法描述於（例如）美國專利第5,260,203 就、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881，丨75號、美 國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利 第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第 5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。 雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由（例如）酶聯 免疫吸附檢定（ELISA)、放射免疫檢定（rEA)、facS分 析、生物檢定（例如生長抑制）或西方墨點檢定來證實。該 等檢定中之每一者通常藉由使用對所關注之複合物具有特 異性的經標記試劑（例如抗體）來偵測備受關注之蛋白質_抗 體複合物的存在。 多價抗體 在另一態樣中’本發明提供多價化合物，其包含本發明 之抗體與骨硬化素結合之至少兩個相同或不同抗原結合部 分。較佳地，假設骨硬化素具有三聚性，則本發明之化合 物提供該等抗體之至少三個或四個抗原結合部分。抗原結 合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵聯連接在— 起。或者’鍵聯之方法已對於雙特異性分子進行描述。可 (例如）藉由使本發明之抗體與結合本發明之抗體之恆定區 (例如Fc或鉸鏈區）的抗體交聯來獲得四價化合物。 二聚域描述於（例如）Borean專利EP 1 012 280B1中。五 聚模組描述於（例如）PCT/EP97/05897中。 醫藥組合物 134810.doc -67- 200922621 在另-態樣中，本發明提供一種組合物 物)，其含有與醫藥學上可接 ：、、“ 之一種簞块枋舻弋坌> ® u m &調配的本發明 種早株抗體或其抗原結合部分或單株抗 合部分之組合。該等組合物可包括本發明之一種;:體= 疫結合物或雙特異性分子或（例如，兩種免 抗體或免疫結合物或雙特異性 ° 〇丨土刀千之組合。 + 發明之醫藥組合物可包含與靶^ ° 人之不同抗原決定基結 CT或具有互補活性之抗體之組合。 f
K 本發明之醫藥組合物亦可以组人 口療去’亦即與其他華劑 2合投與。舉例而言’組合療法可包括本發明之抗骨硬化 素抗體與至少一種其他消炎劑或抗骨質疏鬆劑的組合。可 用於組合療法中之治療劑的實例 〗更》f細描述於以下關於本 毛明之抗體之用途的部分中。該蓉&人 系等組合物較佳調配為具有 生理pH值。 如本文中所使用之"醫藥學上可接受之載劑"包括生理學 2容之任何及所有溶劑、分散介質、衣料'抗菌劑及抗 讀劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似載劑。載劑應適合 ;靜脈内肌肉内、皮下、非經腸、經脊椎或經表皮投藥 (例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(亦 即抗體、免疫結合物或雙特異性分子）可包覆於保護該化 合物免受可使該化合物失活之酸及其他自然條件之作用的 材料中。 本發明之醫藥化合物可包括—或多種醫藥學上可接受之 鹽。”醫藥學上可接受之鹽”係指保留母化合物之所需生物 13481〇,d〇c -68- 200922621 活性且並不賦予任何不當毒理學作用的鹽（參見（例 如）Berge，S.M. ’ 等人，1977 J. Pharm· Sci. 66:1-19)。該 等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括來源 於以下各酸之鹽.無毒性無機酸，諸如鹽酸、硝酸、填 酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物；以及無 毒性有機酸，諸如脂族單羧酸及二羧酸、經苯基取代之院 酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族磺酸及芳族磺酸及其類似 物。鹼加成鹽包括來源於以下各鹼之鹽：鹼土金屬，諸如 鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及無毒性有機胺，諸如 N，N'-二苯甲基乙二胺、N_甲基葡糖胺、氣普魯卡因 (chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及 其類似物。 本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化 劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：水溶性抗氧 化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞 硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；油溶性抗氧化劑，諸如 抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基菌香醚（Bha)、丁基化羥 基甲苯（BHT)、印磷脂、沒食子酸丙、&生育⑽其類 似物；及金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸 (EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。 可用於本發明之醫藥組合物中之合適水性及非水性載劑 的實例包括水、乙醇、多元醇（諸如甘油、丙二醇、聚乙 二醇及其類似物)及其合適混合物、植物油(諸如橄欖油)及 可注射有機酿(諸如油酸乙醋）。可(例如)藉由使用包衣材 134810.doc -69- 200922621 料（諸如卵磷脂）、在分者 藓出佔" 情況下藉由保持所需粒度及 藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。 該等組合物亦可合古#兔, 州，诸如防腐劑、濕潤劑、乳化 劑及分散劑。可益+ &丄、. 及^直_ _滅g程序與藉由包括多種抗菌劑 ::菌糊如’對經基苯甲酸醋、氣丁醇、苯 酸及其類似物）二者來確保防止微生物 組合物中包括等張劑u而要在 .. 々糖、氣化鈉及其類似物。此 外’可注射藥物形式之 k長可藉由包括延遲吸收劑 (诸如早硬脂酸鋁及明膠）來達成。 醫藥學上可接受之載劑包拓益 w匕括無讀水性溶液或分散液，及 用於實時製備無菌可注射溶液 散液之無菌粉末。醫藥 予活性物貝之該等介質及試劑之用途在此項技術中已知。 何習知介質或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋 :在本發明之醫藥組合物中使用。補充性活性化合物亦可 併入該專組合物中。 治療組合物通常在製造及儲存條件下必須為無菌且穩定 的。該等組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或其他適 δ於南藥物濃度之有序結構。載劑可為溶劑或分散介質， =含有（例如）水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇及液體 酵，及其類似物）及其合適混合物。可（例如）藉由使 用衣料（諸如㈣脂）、在分散液之情況下藉由保持所需粒 度及藉由使用界面活性劑來保持適當流動性。在多種情兄 下，組合物中可包括等張劑，例如糖、多元醇（諸如甘露 糖醉、山梨糖醇）或氯化鈉。可注射組合物之吸收延長可 134810.doc •70· 200922621 藉由在該組合物中包括延遲吸收劑（例如單硬脂酸鹽及明 膠）來達成。 無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物與上文所 列舉之-種成份或成份組合一起併入適當溶劑中，視需要 繼而進行滅菌微過渡來製備。一般而言，分散液係II由將 活性化合物併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有基本 分散介質及來自上文所列舉之其他所需成份。在用於製備 無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下製備方法為真空乾 燥及冷/東乾燥（/東乾），其產生活性成份外加來自其先前經 無菌過濾之溶液的任何其他所需成份的粉末。 可與載劑物質組合以產生單—劑型之活性成份的量應視 所治粒個體及特定投藥方式而定。可與載劑物質組合以 產生早-劑型之活性成份的量通常為產生治療效應之組合 物的量。大體而言，以100%計，此量將在約〇〇1%至約 99%活性成份，約Q1%至約鳩，或約1%至約㈣與醫藥 學上可接受之載劑組合的活性成份之範圍内。 給藥方案經調整以提供最佳所要反應（例如治療反應）。 舉例而s，可投與單一大丸劑，可隨時間投與若干分劑 f ’或如治療情況之緊急性所*，可按比例減少或增加制 量。將非經腸組合物調配成易於投與且劑量均一之單位劑 型為尤其有利的。如本文中所使用之單位劑型係指適合作 為用於待治療個體之單一劑量的實體上離散之單位；各單 位含有經計算以產生所要治療效應之預定量的與所需醫藥 載劑結合之活性化合物。本發明之單位劑型之規格由活性 I34810.doc 200922621 化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效應，及在混配該 活性化合物用於治療個體之敏感性的技術中所固有之限制 規定且直接視其而定。 為投與抗體，劑量介於每公斤主體體重約0 0001 11^至 100 mg，且更通常母公斤主體體重〇〇1 mg至5 之範圍 内。舉例而言，劑量可為每公斤體重〇.3 mg、每公斤體重 1 mg、每公斤體重3 mg、每公斤體重5 或每公斤體重⑺ mg，或在每公斤丨_1〇 mg範圍内。例示性治療方案需要每 週投藥一次，每兩週投藥一次，每三週投藥一次，每四週 投藥一次，每月投藥一次，每三個月投藥一次或每三至六 個月投藥一次。本發明之抗骨硬化素抗體之給藥方案包括 每公斤體重靜脈内投與i mg或3 mg，其中該抗體係使用以 下、’、n藥方案中之一者給予：每四週一次，6次劑量，隨後 每三個月一次·，每三週一次；每公斤體重3 mg一次，繼而 每三週每公斤體重1 mg。 在一些方法中，兩種或兩種以上具有不同結合特異性之 單株抗體係同時或依次投與，在該情況下，所投與之各抗 體之劑量處於指定範圍内。抗體通常多次投與。單次劑量 之間的時間間隔可為（例如）一週、一個月、三個月或一 年。如藉由量測患者體内靶抗原之抗體的血液含量所指 示，時間間隔亦可為不規則的。在_些方法中，調整劑量 以使血漿抗體濃度達到約K000 gg/ml且在—些方法中為 約 25-3 00 pg/ml。 或者，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在該情況 134810.doc -72- 200922621 下’需要較低頻率之投藥。密> 丨县^ μ 士 手才又樂齊及頻率視抗體在患者體内 ::而I化。一般而言，人類抗體展示最長半衰期， 隨後為人源化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投藥之劑量 及頻率可視治療為預防性抑或治療性而變化。在預防性應 用中，歷經幸父長時期以相對^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 低之劑量。—些患者在其餘生二=間間㈣與相對較 應用中，時常需要相二Γ 治療。在治療性 h吊而要相對較短之時間間隔之相對較高之劑量 直至疾病進程得以減緩或終 ί 卹八七6 A L 、正4置至患者展不疾病症狀的 刀S /〇 ?善。此後’可向患者施以預防性方案。 、月之醫藥組合物中活性成份之實際劑量水準可變化 以獲得有效達成對特定*本 逯风對特疋患者、組合物及投藥方式而言之所 需治療反應，而對串者 者不具有毒性的活性成份之量。選定 劑量水準應視多種藥 選疋 括所用之本發明之素而定，該等因素包 ^ 特疋組合物或其酯、鹽或醯胺的活柯· =徑’·投藥時間；所用特定化合物之排液速率：户療 :時間；與所用特定組合物組合使用的其他藥物、：： 物及，或物質；所治療患者之年齡、性別、體二：： 素。 先别病史’·及醫學技術中熟知之類似因 療有效劑量之本發明之抗骨硬化素抗體可 症狀嚴重性降低， 疋什疾病 '無疾病症狀時期之頻率及持續時間嬋 ^ ^防由疾病病痛所致之損傷或殘疾。 曰 本發明之組合物可藉 令已知之多種方“ 途徑使用此項技術 中之-或多者投與。如熟習此項技術者 1348I0.doc -73- 200922621 所瞭解’投藥途徑及/或投藥古斗.时、 ,& ^ 飞杈樂方式將視所需結果而變化。 本發明之抗體之投藥途徑包括隸hi?向 、仏匕栝靜脈内、肌肉内、、 膜内、皮下、經脊椎或 他非經腸投藥途徑（例如藉由注 射或輸注）。如本文中所使用之 心姐°。非經腸投藥"意謂除腸 内及局部投藥以外’通常藉由注射之投藥模式，且包括 (但不限於)靜脈内、肌肉内、動脈内、鞘内、囊内、眼眶 内、心臟内、皮内、腹膜内、經氣管、皮下、表皮下、關
節内、囊下、蛛網膜下、脊椎内、硬膜外及腦幹内注射及 輸注。 或者，本發明之抗體可藉由钱如 * ,,, 」稽田。t如局部、表皮或黏膜投藥 途徑之經腸途徑，例如鼻内、經口、經陰道、經直腸、舌 下或局部投與。 活性化合物可與將保護該化合物免於快速釋放之載劑一 起製備，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及 微囊化傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合 物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋 白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之諸多方法已申 請專利或通常為熟習技術者所知。參見（例如），Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems » J. R.
Robinson編 ’ Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。 治療組合物可以此項技術中已知之醫療裝置投與。舉例 而言’在一實施例中，本發明之治療組合物可以無針皮下 注射裝置投與，諸如美國專利第5,399，163 ; 5,383,851 ; 5,3 12,335 ; 5,064,413 ; 4,941，880 ; 4,790,824 或 4,596,556 134810.doc -74- 200922621 =二不之裝置。適用於本發明之熟知植人物及模組之實 =括.美料利第4,487,6G3號，其展種用於以控制 =率分配藥物之可植入式微輸注泵；美國專利第4,486，194 』，其展不-種用於經由皮膚投與藥物之治療裝置；美國 ㈣第4,447,233號’其展示-種用於以精確輸注速率傳遞 樂物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其展示一種 用於持續藥物傳遞之可變流速可植人式輸注1置；美國專 利第4’439，196號，其展示一種具有多腔隔室之渗透性藥物 傳遞系統；及美國專利第4,475，196號，其展種渗透性 藥物傳遞系統。該等專利係以引用的方式併入本文中。多 種其他此類植入物、傳遞系統及模組為熟習此項技術者所 知。 在某些實施例中，可調配本發明之人類單株抗體以確保 在活體内適當分布。舉例而言，血腦屏障（ΒΒβ)排除許多 高親水性化合物。為確保本發明之治療化合物跨過 BBB(若需要），可將其調配（例如;)於脂質體中。對於製備 月曰資體之方法’參見（例如）美國專利4，5 2 2，8 11 ; 5,374,548 ;及5,399,331。脂質體可包含一或多個部分，該 等部分經選擇性輸送至特定細胞或器官中，由此增強無向 藥物傳遞（參見（例如）v.v_ Ranade, 1989 j CUne Pharmac〇1 29:685)。例示性靶向部分包括葉酸或生物素（參見（例 如）Low等人之美國專利5,416,〇16);甘露糖苷（1；1^2請&等 人 ’ 1988 Biochem· Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗 體（P，G· Bloeman 等人，1995 FEBS Lett· 357:140 ; M_ 134810.doc -75- 200922621
Owais 等人，1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39： 1 80);界面活性劑蛋白a受體（Briscoe等人，1995 Am. J. Physiol. 1233:134) ; pl20(Schreier 等人，1994 J. Biol. Chem. 269:9090);亦參見K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273 ° 本發明之用途及方法 本發明之抗體具有活體外及活體内診斷及治療效用。舉 例而言，該等分子可投與至培養物中（例如活體外或活體 内），或個體體内（例如活體内）之細胞以治療、預防或診斷 多種病症。如本文中所使用之術語"個體"意欲包括人類動 物及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺 乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、 犬、貓、牛、馬、雞、兩棲動物及爬行動物。 該等方法尤其適合於治療、預防或診斷骨硬化素相關病 症及/或異常骨礦物密度病症，例如骨質疏鬆症。 本發明亦提供增加骨礦物含量及/或礦物密度之方法。 本發明之組合物亦可適用於改良矯形外科程序、牙科程 序、植入手術、關節置換、骨移植、骨整形手術及骨修復 (諸如骨折癒合、骨不連癒合、延遲連接癒合及面部重建） 之結果。可在該程序、置換、移植、手術或修復之前、期 間及/或之後投與一或多種組合物。 如本文中所使用之"骨硬化素相關病症"包括骨礦物密度 (BMD)相對於健康個體異常及/或病理學上較低之病症。以 134810.doc -76- 200922621 低BMD及/或骨易碎性為特徵之病症包括（但不限於）原發性 及繼發性骨質疏鬆症、骨質減少、骨軟化、成骨不全 (01)、無血管性壞死（骨壞死）、骨折及植入物癒合（牙植入 物及髖植入物）、其他病症所致之骨質流失（例如與mv感 染、癌症或關節炎相關）。其他"骨硬化素相關病症"包括 (但不限於）類風濕性關節炎、骨關節炎、關節炎及溶骨病 變之形成及/或存在。 如本文中所使用之”骨硬化素相關病症"包括與異常骨硬
化素含量相關或以異常骨硬化素含量為特徵之病狀。其包 括癌症及骨質疏鬆病狀（例如骨質疏鬆症或骨質減少），其 中有一些與如本文中所定義之"骨硬化素相關病症”相一 致。骨硬化素相關癌症可包括骨髓瘤（例如 之多發性骨髓瘤)、乳癌、結腸癌、黑色素瘤、= 癌、上皮癌、食道癌、腦癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌以 及其任何癌轉移。 ”骨硬化素相關病症”亦可包括至少歸因於骨硬化素在腎 臟及心▲管中表現的腎及心也管病狀。該等病症包括㈠曰 不限於)腎病，諸如腎小球疾病(例如急性及慢性絲球體腎 炎，迅速進行性絲球體腎炎，腎病症候群，局灶性增生# 絲球體腎炎，與全身疾病相關之腎小球病變，諸如全身担 紅斑性狼瘡症、古德帕斯徹氏症候群(G〇〇dpasture， s:d7e)、多發性骨髓瘤、糖尿病、多囊性腎病、瘤， 成鐮狀細胞病及慢性發炎性 疾病）、腎小管疾病(例如'毫 腎小㈠展死及急性腎衰竭、多囊性腎病髓質海綿腎、, 134810.doc •77· 200922621 質囊性病、腎原性糖尿病及腎小管性酸中毒）、腎小管間 質疾病（例如腎盂腎炎、藥物及毒素誘發之腎小管間質腎 炎、咼鈣性腎病及低斜性腎病）、急性及迅速進行性腎衰 竭、慢性腎衰竭、腎石病、痛風、血管疾病（例如高血壓 及腎硬化、微血管病性溶血性貧血、粥樣栓塞性腎病、擴 散性皮層壞死及腎梗塞）或腫瘤（例如腎細胞癌及腎胚細胞 瘤）。 該4病症亦包括（但不限於）心血管病症，諸如缺血性心 臟病（例如心絞痛、心肌梗塞及慢性缺血性心臟病）、高血 壓性心臟病、肺原性心臟病、瓣膜性心臟病（例如風濕熱 及風濕性心臟病、心内膜炎、二尖瓣脫垂及主動脈瓣狹 窄）、先天性心臟病（例如瓣膜及血管阻塞性病變、心房或 心室中隔缺損及開放性動脈導管）或心肌病（例如心肌炎、 充血型心肌病及肥厚型心肌病）。 虽骨硬化素之抗體與另一藥劑一起投與時，兩者可以任 意次序（亦即依次）或同時投與。 κ. 根據本發明之另一實施例，本發明之抗體可用作其他療 法之輔劑或佐劑，例如使用骨再吸收抑制劑之療法，例如 在骨質疏鬆症療法中’尤其使用以下各物之療法H 血妈素或其類似物或衍生物，例如娃魚、鳗魚或人類降血 約素；約阻滯劑；擬約劑（例如西那卡塞）；類固醇激素， 例如雌激素；部分雌激素促效劑或雌激素助二. SERM(選擇性雌激素受體調節劑），例如雷、各：二 (raloxifene)、拉索昔芬（las〇f〇xife /曰分 巴多昔芬 134810.doc •78· 200922621 (bazedoxifene)、阿佐昔芬（arzoxifene)、FC1271、替勃龍 (Livial®) ; SARM(選擇性雄激素受體調節劑）；RANKL抗 體（諸如狄諾塞麥（denosumab));組織蛋白酶K抑制劑；維 生素D或其類似物或PTH，PTH片段或PTH衍生物，例如 ΡΤΗ(1-84)(諸如 PreosTM)、ΡΤΗ(1-34)(諸如 F〇rteoTM)、 ΡΤΗ(1-36)、ΡΤΗ(1-38)、PTH(1-31)NH2 或 PTS 893。根據 另一實施例’本發明之抗體可與其他當前骨質疏鬆症治療 方法組合使用，該等其他當前骨質疏鬆症治療方法包括雙 膦酸鹽（例如Fosamax™(阿余膦酸鹽，alendronate)、 ActonelTM(利塞膦酸鈉，risedronate sodium)、Bonviva™ (伊班膦酸，ibandronic acid)、ZometaTM(。坐來膦酸， zoledronic acid)、AclastaTM/ReclastTM(〇坐來膦酸）、奥帕膦 酸鹽、奈立膦酸鹽、替魯膦酸鈉、骨膦）、士他汀、合成 代謝類固酵、鑭鹽及锶鹽及氟化鈉。 在一特定實施例中，本發明之抗體可與LRP4調節劑（亦 即調節LRP4之表現或活性的藥劑，例如LRP4中和抗體）組 合投與。 在另一特定實施例中，本發明之抗體可與DKK1調節劑 (亦即干擾或中和Dkk-1介導之Wnt信號傳輸拮抗作用之藥 劑，例如DKK1中和抗體）組合投與。 因此，本發明亦提供本發明之抗體或功能蛋白及⑴唑來 膦酸、（ii)抗DKK1抗體、（iii)阿侖膦酸鹽、（iv)抗LRP4抗 體、（v)hPTH及/或（vi)副甲狀腺素釋放劑（鈣阻滞劑）之用 途’其係用於製備治療由骨硬化素所介導或與骨硬化素增 1348l0.doc -79- 200922621 加含量相關之病理學病症之藥劑。 在另一實施例中，本發明提供本發明之抗體或功能蛋白 在製備治療由骨硬化素所介導或與骨硬化素含量增加相關 之病理學病症之藥劑中的用途，其中該藥劑係與以下各物 結合使用⑴唑來膦酸、（iiH^DKK1抗體、（iii)阿侖膦酸 鹽、（iv)抗LRP4抗體、（v)hPTH及/或（Vi)副曱狀腺素釋放劑 (鈣阻滯劑）。 在另一實施例中，本發明提供⑴唑來膦酸、（Η)抗DKK1 抗體、（iii)阿命膦酸鹽、（iv)抗LRP4抗體、（^卩丁^及/或 (VI)副甲狀腺素釋放劑（鈣阻滯劑）在製備治療由骨硬化素 所介導或與骨硬化素含量增加相關之病理學病症之藥劑中 的用途，其中該藥劑係與本發明之抗體或功能蛋白結合使 用。 在另一實施例中’本發明提供本發明之抗體或功能蛋白 在製備治療由骨硬化素所介導或與骨硬化素含量增加相關 之病理學病症之藥劑中的用途，其中該患者已預先投與⑴ 。坐來膦酸、（11)抗DKK1抗體、（Ui)阿侖膦酸鹽、（iv)抗 LRP4抗體、（v)hPTH及/或（W)副曱狀腺素釋放劑（鈣阻滯 劑）。 在另一實施例中，本發明提供⑴唑來膦酸、（HM^DKK1 抗體、（iii)阿侖膦酸鹽、（iv)抗LRP4抗體、（v)hPTH及/或 (vi)副甲狀腺素釋放劑（鈣阻滯劑）在製備治療由骨硬化素 所介導或與骨硬化素含量增加相關之病理學病症之藥劑中 的用途，其中該患者已預先投與本發明之抗體或功能蛋 134810.doc -80- 200922621 白。 在上述組合之—實施例中，hPTH為hPTH(l-34)。 β在實施例中，本發明之抗體可用於偵測骨硬化素之含 量或含有骨硬化素之細胞之含量。此可（例如）藉由使樣品 (= —卜樣)及對照樣品與抗骨硬化素抗體在使該抗 體與骨硬化素之間形成複合物的條件下接觸來達成。债測 樣品及對照物中抗體與骨硬化素之間所形成的任何複合物 將，、進行比較。舉例而言，可使用本發明之組合物來執 订此項技術中所熟知之標準偵測方法，諸如elisa及流式 細胞計數檢定。 因此，在-態樣中’本發明另外提供用於偵測樣品中骨 硬=素（例如人類骨硬化素抗原）之存在，或量測骨硬化素 之里的方法，其包含使該樣品及對照樣品與特異性結合骨 硬化素之本發明之抗體或其抗原結合區在使該抗體或其部 刀與月硬化素之間形成複合物的條件下接觸。隨後偵測複 合物之形成’纟中樣品與對照樣品之間相比較之複合物形 成差異指示樣品中骨硬化素之存在。 由本發明之組合物（例如抗體 '人類抗體及雙特異性分 子）及使用說明書組成的套組亦屬於本發明之範疇。該套 組可另外含有至少一種其他試劑，或本發明之一或多種其 他抗體（例如，具有與靶抗原上不同於第一抗體之抗原決 定基結合之互補活性的抗體）。舉例而言，該等套組可包 含本發明之抗體或功能蛋白及⑴唑來膦酸、（⑴抗〇1(：反1抗 體、（ill)阿侖膦酸鹽、（iv)抗LRP4抗體、（v)hpTH及（vi)副 134810.doc •81 · 200922621 甲狀腺素釋放劑（鈣阻滯劑）中之一口夕 指示該套組之内容物之預期用途：：者二套組通常包括 供於該套組上或與套組— 術5吾標籤包括提 組之任何文字或記錄材料。八，或以其他方式伴隨該套 本發月已加以充分描述，其由以下實例及 進-步說明，該等實例為說 ”專利範圍 π 並不意欲進—弗HP庄丨丄 :明°熟習此項技術者僅使用常規實驗將想 本文所述之特定㈣的諸多等效物。該等等效 ^ 明及申請專利範圍之範疇。貫 、發 貝牙本申π案引用之所有參考 文獻（包括已頒布之專利及公開之專利中請案）之内容係以 引用的方式併入本文中。 ’' 實例： 功能檢定 鹼性磷酸酶檢定（ALP) 細胞 MC3T3 lb細胞為表現〇SE2-luc之MC3T3-JP細胞之純 系。該純系係在使用pcDNA3.1+中之8x-OSE2wt-mOG21uc 穩定轉染MC3T3-JP(MC3T3-E1小鼠成骨細胞，日本純系， Jp ; Dr. T, Kokkubo，Novartis，Japan友情贊助）之後獲得。 培養基 將MC3T3-lb細胞在補充有10%胎牛血清（FCS; Amimed 目錄號2-01F100-I)、2 mM L-麵醢胺酸（Gibco目錄號 25030-024)、50 IU青黴素/50 pg/ml 鏈黴素（Amimed 目錄號 4-01F00-H)及 10 mM Hepes(Gibco 目錄號 15630-056)及 0.75 134810.doc -82- 200922621 mg/mL G418(Gibco目錄號10131-027)之最低必需培養基 α(ΜΕΜα; Invitrogen，目錄號22561-021)(維持培養基）中常 規培養。 儲備溶液 於 DMEM-LG 中之 10 mM抗壞血酸（Wako Pure Chemical 目錄號013-12061)、於5 mM乙酸及0.1%牛血清白蛋白 (BSA，Sigma 目錄號 A-8806)中之 14 nM BMP-2(R&D 目錄號 3 5 5-BM-010);於Tyrode溶液中之1 Μ β-甘油磷酸鹽（Sigma 目錄號 G9891) ; Tyrode溶液：於1 LH20 中之 9.72g Tyrode 鹽（Sigma目錄號T2145)及1 g NaHC03 ; ALP受質缓衝液： 25 mM甘胺酸及 0.5 mM MgCl2，pH 10·5 ; ALP受質溶液： 於3.75 ml ALP受質緩衝液中之5 mg對硝基苯基磷酸鹽 (Sigma 104受質，Sigma 目錄號 50942-200TAB)，pH 10.5 ; 於ALP受質溶液中之1 mM對硝基苯紛（Sigma目錄號1 04-1)〇 檢定 為進行ALP檢定’使MC3T3 lb細胞於檢定培養基（對應 於不存在G418之維持培養基）中生長。若誘導在72 h之後 開始’則將MC3T3 lb以3xl04個細胞/毫升接種於200 μΐ 中，若誘導在96 h之後開始，則將MC3T3 lb以2χ104個細 胞/毫升接種於200 μΐ中。將培養板在37^及5% C02下培育 72 h或96 h，隨後使用完全培養基（藉由向培養基中補充1〇 mM b-甘油-磷酸鹽（bGP)及50 μΜ抗壞血酸（AA))開始誘 導°將待測試抗體以完全培養基稀釋。將抗體以及bmp- 134810.doc -83- 200922621 2(0.7 nM)及骨硬化素（50 nM)於最終體積為200 μΐ之完全培 養基中添加至孔中（一式三份）。在各板上，包括4個内部對 照（一式三份）：溶劑對照（BSA)、ΒΜΡ-2對照、ΒΜΡ-2+骨 硬化素（BMP-2(0.7 nM)及骨硬化素（50 nM))，及骨硬化素 對照（50 nM)。將培養板在37°C及5% C02下再培育72 h。 在誘導期結束時，藉由移除培養基且向各孔中添加150 μΐ ALP受質溶液（新鮮製備）來終止檢定。將培養板培育3_3〇 min。添加1〇〇 μι丨μ NaOH以使反應停止且將培養板在板 震盪器上震盪。相對於空白在405 nm下讀取OD值，且以 nmol/min計算ALP活性。使用50 nM骨硬化素以獲得對 BMP-2誘導之ALP產生[0.7 nM BMP-2]至少70%之抑制。 WNT-檢定 確立該檢定以便基於骨硬化素抑制Wntl介導之STF報導 基因誘導之能力測試抗體。 HEK293細胞之轉染 在第1日，將HEK293細胞以每孔1·3-1·4χ105個細胞（0.5 ml體積）接種於24孔聚D-離胺酸板（BD-Bio目錄號356414) 中含有10%胎牛血清（FCS)、1% L-麩醯胺酸（Gibco，目錄 號25 030.024)、1%非必需胺基酸（Gibco，目錄號11140)且 無抗生素之DMEM(Gibco，目錄號61965-026)中。在第2曰 以 Lipofectamine 2000(Invitrogen，目錄號 11 668-0 19)執行 轉染。對於欲轉染之各孔，將如下量之質體添加至 OptiMEM®I(Gibco，目錄號 3 1985-047)中達 50 μΐ 之最終體 積：對於對照孑L (pcDNA3 +，480 ng ； SuperTopFlash 134810.doc -84- 200922621 (STF)20 ng ; phRL-CMV，0.5 ng)，且對於 Wntl處理孔 (pcDNA-wntl, 20 ng ； pcDNA3 + , 460 ng ； SuperTopFlash (STF)20 ng ; phRL-CMV，0.5 ng)。 在第二管中，將 1·6 μΐ Lipofectamine 2000於 OptiMEM®I 中稀釋至50 μΐ且在室溫下培育5分鐘。隨後藉由將脂質管 中之内容物添加至DNA管中將兩個管之内容物混合且在室 溫下培育30分鐘以使DNA-脂質複合物形成。隨後將DNA-脂質複合物（100 μΐ)均勻添加至孔中且在37°C5% C02下培 育5小時。在5小時培育結束時，準備將細胞以測試試劑 (諸如SOST、抗體等）處理。 確立SOST劑量依賴性抑制 為確立劑量抑制曲線，以160 nM開始，製備rhSOST於 含有10°/〇 FCS、1°/。L-麩醯胺酸及1%非必需胺基酸且無抗 生素之DMEM中之一系列兩倍稀釋液。儲備液rhSOST之濃 度為於具有1°/。FCS之DMEM中260 pg/ml。一般而言，各 條件重複測試兩次。因此，對於各條件製備1 ml培養基且 在自孔移除含有轉染混合物之培養基之後每孔添加450 μΐ。處理時間為18-20小時。培育結束時，如下所述執行螢 光素酶檢定。 抗SOST抗體之測試 將抗體與SOST預混合隨後添加至細胞中。出於該目 的，製備具有20至30 nM rhSOST之DMEM培養基（10% FCS、1% L-麩醯胺酸及1%非必需胺基酸且無抗生素）。隨 後，根據實驗設計將測試抗體之不同稀釋液添加至含有 134810.doc -85 - 200922621 SOST之培養基中。在處理之前4〇分鐘製備該等混合物。 一般而言，各條件重複測試兩次。為此，對於各條件製備 1 ml培養基且在自孔移除含有轉染混合物之培養基之後每 孔添加450 μ卜處理時間為18_2〇小時。培育結束時，如下 所述執行螢光素酶檢定。 螢光素酶檢定 。月、、’σ束時，移除培養基，添加300 μΐ 1X被動溶解緩 衝液（Promega，目錄號Ε194Α)以溶解細胞。隨後使用 'Dual_Gl0螢光素酶系統（Promega，目錄號Ε2940)以30 μΐ溶 解物量測螢光素酶活1生，重複兩:欠。根據套組所提供之說 明冊執行檢定。一般而言，使用3〇 μ1 DuaNGl〇螢光素酶 (螢火蟲螢光素酶；用於STF)及3〇 μ1 Dual_G1〇 St〇p及 Gl〇(水母螢光素酶；用於轉染效率對照）受質。以 LB940儀器（Berth〇ld Technologies)量測螢光信號。 數據計算 冲算螢火蟲螢光素酶與水母螢光素酶之比率。最終結果 ' 藉由將無SOST之Wntl之值設定為1來表示。 礦化檢定 細胞 MC3T3 lb細胞為表現〇SE2-luc之MC3T3-JP細胞之純 系。該純系係在使用pCDNA3_l+中之8x_〇SE2wt-mOG21uc 穩定轉染MC3T3-JP(MC3T3-E1小鼠成骨細胞，曰本純系， Jp ; Dr. T. Kokkubo, Novartis，Japan友情贊助;)之後獲得。 培養基 134810.doc -86- 200922621 將MC3T3-lb細胞在補充有10%胎牛血清（FCS; Amimed 目錄號2-01F100-I)、2 mM L-麩醯胺酸（Gibco目錄號 25030-024)、50 IU 青黴素/50 pg/ml 鏈黴素（Amimed 目錄號 4-01F00-H)及 10 mM Hepes(Gibco 目錄號 15630-056)及 0.75 mg/mL G418(Gibco目錄號10131-027)之最低必需培養基 α(ΜΕΜα; Invitrogen，目錄號22561-021)(維持培養基）中常 規培養。 礦化檢定 使用鈣套組（Axon Lab，目錄號AXON0012)測定MC3T3-lb細胞中沈積於孔中之基質結合鈣。將細胞以每孔6Xl03 個細胞或2X 1 03個細胞接種於96孔板中1 〇〇 μΐ檢定培養基 (無G4 18之維持培養基）中以改良細胞反應性且培育3曰以 達至長滿。隨後更換檢定培養基且與10 mM b-甘油-麟酸 鹽（bGP; Sigma 目錄號 G9891)及 50 μΜ 抗壞血酸（AA; Wako Pure Chemical目錄號01 3-12061)—起添加待測化合物。在 將其添加至細胞中之前，將待測之骨硬化素及Fab預先在 室溫下在獨立培養板中培育2 h·，同時向檢定96孔板提供 2.1 或 2.8 nM BMP-2(R&D Systems，目錄號 355_BM_〇1〇)， 隨後向其中添加骨硬化素_Fab混合物。將細胞培育14日且 每3-4曰替換檢定培養基。簡言之，在培育結束時，將細 胞以每孔200 μΐ PBS洗滌兩次，在各孔中添加5〇 μ 〇 5 M HC1，且將培養板在_2(rc下冷凍降溫最少24卜。在適當時 間，將培養板在室溫下解凍2小時且每孔轉移1〇 μ1至新的 96孔板中。隨後添加鈣工作溶液〇:5)(2〇〇吣且5_3〇分鐘 134810.doc -87- 200922621 之後，將培養板在微板讀取器上在595 nm下讀取。 根據標準曲線將吸光度轉化為鈣之pg值，各數據孔值減 去對照孔（抗壞血酸及β-甘油磷酸鹽）值且最終結果表示為 ΒΜΡ-2誘導之礦化之百分比。 SMAD1磷酸化西方法 材料 MC3T3-E1小鼠成骨細胞（日本純系，Dr. T. Kokkubo, Novartis Japan友情贊助） f C3H10T1/2細胞（小鼠胚胎間葉細胞；ATCC，目錄 號：CCL-226) SCL，非糖基化，大腸桿菌來源（Novartis，PSU5257) 15N SCL，非糖基化，大腸桿菌來源（Novartis, PSU11274) hSOST-APP ，糖基化，HEK-EBNA 來源（Novartis, BTP11100) rhSCL，糖基化，小鼠骨髓瘤細胞來源（R&D Systems， ί ^ 目錄號：1406-ST/CF) 抗 hSOST 抗體（R&D Systems，目錄號：AF1406) PhosphoSafe萃取試劑（Novagen，目錄號：71296-3) 蛋白酶抑制劑混合套裝III(Calbiochem，目錄號：539 1 34) NuPAGE Novex Tris-乙酸鹽凝膠，7%，1.5 mm，1 5 孑L (Invitrogen，目錄號：EA03585)
Tris-乙酸鹽SDS電泳緩衝液（Running Buffer) 2〇x(Invitrogen，目錄號：LA0041) 134810.doc -88 · 200922621
NuPAGE抗氧化劑（Invitrogen，目錄號:NP0005)
Immobilon-P 轉移膜，0.45 pm(Millipore ，目錄 號：IPVH00010)
Wattman層析紙（Merck，目錄號：3587600) XCell SureLock Mini-Cell 及 XCell II 印潰模組 (Invitrogen)
VersaMax微板讀取器（Bucher) 細胞培養及萃取 分別將MC3T3-E1及C3H10T1/2細胞在最低必需培養基 α(ΜΕΜα; Invitrogen，目錄號22561-021)中或在具有高葡 萄糖之DMEM(Invitrogen，目錄號41965-039)中常規培 養。所有培養基中補充有10%胎牛血清（FCS; BioConcept 目錄號2-01F10-I ’批號Z04459P)、2 mM L-麩醯胺酸 (Invitrogen 目錄號 25030-024)、50 IU 青黴素/50 pg/ml 鏈黴 素（Invitrogen目錄號 15 140-122)及 10 mM Hepes (Invitrogen 目錄號15630-056)(維持培養基）。 將細胞接種於6孔板之維持培養基中（每孔3 ml)，且使其 生長直至長滿（對於每孔1.4xl〇5個MC3T3-lb細胞’在第3 曰達至長滿；對於每孔1.〇χ1〇5個C3H10T1/2細胞’在第3 曰達至長滿）。在含有1 % FBS之培養基中去除血清隔夜之 後，將培養基替換為補充有1% FBS ' BMP-6(R&D Systems，目錄號507-BP)及待測物質之新鮮培養基。在將 其添加至細胞之前，如對於C3H10T1/2中之磷酸-Smad 1/3/5 所述（Winkler, EMBO J·，2003，22(23):6267-76),將 134810.doc -89- 200922621 BMP-6及待測物質在室溫下預先培育1 h ^當測試抗骨硬化 素抗體時，將BMP-6及待測物質與骨硬化素一起在4°c下 預培育隔夜，隨後與0.2 nM BMP-6—起在室溫下培育1 h 且最後添加至長滿之細胞中。處理適當時間之後，將細胞 以2 ml冰冷PBS洗滌。隨後將每孔1〇〇 μΐ PhosphoSafe萃取 試劑及1:200稀釋之蛋白酶抑制劑混合物添加至細胞中， 隨後將細胞在冰上培育5 min。將細胞自孔中到下，且轉 移至microfuge管中。將細胞萃取物保持於冰上1 5 min，每 5 min插入渦旋步驟。之後，將細胞萃取物在16,〇〇〇 §及 4°C下離心5 min。最後，將上清液轉移至新鮮microfuge管 中進行蛋白質測定。 使用BCA蛋白質檢定套組根據製造商之說明測定細胞溶 解物中之蛋白質濃度。WBSA用作標準物。為進行變性， 將細胞溶解物以Laemmli緩衝液（Bio-Rad，目錄號161-0737 ’含有新鮮添加之β_巯基乙醇（i:2〇，Merck，目錄號 1.12〇06))1:2稀釋且在95°C下煮沸5 min。冷卻之後，將樣 品儲存在-20C下直至進·一步使用。 西方墨點法
Smad(H-465)抗體（Santa Cruz，目錄號：sc-7153)針對代 表人類來源之全長Smadl之胺基酸1-465產生之兔多株 IgG °其應識別人類、大鼠及小鼠來源之smadl、Smad2、 Smad3、Smad5 及 Smad8。磷酸-Smadl(Ser463/465)/ Smad5(Ser463/465)/Smad8(Ser426/428)抗體（Cell Signalling， 目錄號9511)為針對對應於人類mad5之Ser463/465周圍之殘 134810.doc -90- 200922621 基之合成磷酸肽產生的兔多株4〇。僅在絲胺酸463及絲胺 酸465雙重磷酸化時應偵測Smadl之内源含量，以及僅在人 類、小鼠、大鼠、貂及水檐（xen0p0US)來源之等效位點雙 磷酸化時偵測Smad5及Smad8之内源含量。該抗體不與其 他Smad相關蛋白交叉反應。 根據製造商之說明製備XCell SureLock Mini Cell系統 (Invitrogen)。將蛋白質樣品（對於Smad為2叫，對於磷酸-Smad西方分析為5 pg)以於1 X電泳緩衝液中之等最終體積 裝載於7% NuPAGE Novex Tris-乙酸鹽凝膠上。將SeeBlue Plus2預染色標準物（1〇 μΐ，i:1〇; Invitr〇gen，目錄號 LC5925)及 MagicMark XP Western蛋白質標準物（1〇 μΐ， 1:100 ; (lnvitrogen，目錄號；LC5602)用作分子量標記。 使用恆壓（150 V)跑膠75 min。 將印潰墊及濾紙浸泡在700 ml 1 xNuPAGE轉移緩衝液 中。首先將PVDF轉移膜在甲醇中浸泡3〇 sec且隨後在 NuPAGE轉移緩衝液（invitrogen，目錄號Np〇〇〇6，轉移緩 衝液·甲醇10:1新鮮製備）中轉移。使用凝膠刀將凝膠卡板 分離，將一預先浸泡之濾紙置於凝膠上且小心移除所夾帶 之任何氣泡。將板倒置於Saran wrap上且移除板之後，將 預先次泡之轉移膜置於凝膠上，且移除任何氣泡。將第二 張預先浸泡之濾紙置於凝膠上且移除任何氣泡。將兩個經 浸泡之繪製墊（platting pad)置於Cel丨π印潰模組之陰極核 中。小心拿起凝膠/膜夾層且置於印潰墊上（使凝膠最接近 於陰極核）。最後，將3個經預先浸泡之印潰墊置於膜總成 134810.doc 91 200922621 上，且在上面添加陽極核。根據製造商之說明，將印潰模 組滑至下部緩衝液腔室上之導軌中且將楔鎖定於位置令。 將印潰模組以lxNuPAGE轉移緩衝液填充直至覆蓋凝膠/膜 組件。將外部緩衝液腔室以650 ml去離子水填充，且使用 恆壓（30 V)執行蛋白質至pvDF臈之轉移歷時2小時。 印〉貝之後’首先將膜在PBS中之0.05%吐溫20中洗條1 〇 min且隨後在至溫下在溫和震盈下於Μ mi SuperBi〇ek T20 阻斷緩衝液中阻斷i小時。將第一抗體（磷酸_Smad 1/5/8或
Smad(H-465))以於 SuperBlock T20 阻斷緩衝液（Pierce，目 錄號37516)中之1:1〇00稀釋液添加至膜中且將膜在4°c下在 震盈下培育隔夜。隨後將膜以PBS中之0.05%吐溫 20(Fluka，目錄號93773)洗蘇3次歷時10 min，隨後在室溫 下在震盪下與RP結合第二抗體（1:1 〇〇〇於SuperBlock T20阻 斷緩衝液中）一起培育60 min。執行至少3個各自為10 min 之洗務步驟，隨後將膜與SuperSignal West Femto受質工作 溶液（Pierce ’目錄號34095)—起培育5 min。最後，將膜置 於塑膠袋中且使用Fluor-S Multilmager(Bio-Rad)及相機成 像。藉由比較30 sec至5 min採集之圖像確定最佳曝光時間 為1至2 min。 數據分析 使用Quantity One(Bio-Rad)量測化學發光活性且使用 XLfit4軟體計算EC5Q值。各磷酸-Smad信號係由其相應總 Smad信號標準化。
LRP6/骨硬化素ELISA 134810.doc -92- 200922621 將未經處理之96孔板以每孔100 μΐ於PBS中稀釋之 LRP6/Fc(l gg/ ml，R&D Systems，目錄號 1505-LR)塗佈。 作為非特異性結合（NSB)之對照，將少數孔以每孔100 μΐ PBS填充。將培養板以塑膠薄膜覆蓋且在室溫下培育隔 夜。塗佈之後，將培養板每孔以200 μΐ於PBS中之0.05%吐 溫20(Fluka，目錄號93773)洗滌3次，且藉由每孔添加300 μΐ於TBS中之SuperBlock阻斷緩衝液（Pierce，目錄號37535) 將孔在37°C下阻斷1 h。培育之後，移除阻斷溶液且每孔添 加100 μΐ於PBS中之1% BSA中稀釋之骨硬化素（大腸桿菌來 源，Novartis; 1-1000 ng/ml)。將培養板在室溫下培育2 h，隨後每孔以200 μΐ於PBS中之0.05%吐溫20洗滌3次。之 後，每孔添加100 μΐ於PBS中之1% BSA中稀釋之抗骨硬化 素抗體（1 pg/ml)，且將培養板在室溫下培育2 h，隨後每孔 以200 μΐ於PBS中之0.05%吐溫20洗滌3次。最後，在室溫 下每孔添加100 μΐ於PBS中之1% BSA(Sigma目錄號：Α-7888)中稀釋之ALP結合抗山羊IgG Ab(l:5000; Sigma目錄 號A-7888)歷時1 h，且隨後將培養板每孔以200 μΐ於PBS中 之0.05°/。吐溫20洗滌3次。為測定ALP，將每孔1〇〇 μΐ ALP 受質（Sigma，目錄號S0942)溶液（每5 ml二乙醇胺受質緩衝 液（1 x)l鍵：；Pierce，目錄號34〇64)添加至培養板中歷時90 min且在405 nm下量測光學密度。 HEK293細胞中LRP4過度表現 HEK293細胞（ATCC目錄號CRL-1 573)在補充胎牛血清 10% FCS(BioConcept 目錄號 2-01F10-I，批號 Z04459P)、2 134810.doc -93- 200922621 1111^1^麩醯胺酸（11^心〇§611目錄號25 03 0-024)、100 11；青黴 素/100 pg/ml 鏈黴素（Invitrogen 目錄號 15140-122)及 10 mM HEPES(Invitrogen 目錄號 15630-056)之 DMEM/F12 (In vitrogen目錄號21331-020)中常規培養。Hek293細胞以 每孔5x104個細胞接種於聚-D-離胺酸48孔板形式中且培育 24 h，隨後以Lipofectamine 2000(Invitrogen目錄號 11668-019)執行轉染。對於欲轉染之各孔，將如下量之質體添加 至最終體積 25 μΐ OptiMEM®I(Gibco，目錄號 31985-047)中 並溫和地混合：對於對照孔（pmaxGFP, 62.5 ng，pcDNA3 + , 125 ng ; SuperTopFlash(STF)62.5 ng ; SV40 驅動水母 (Renilla)螢光素酶質體，〇·75 ng)，對於Wntl處理孔 (pmaxGFP, 62.5 ng, pcDNA-wntl, 62.5 ng ； pcDNA3 + , 62.5 ng; SuperTopFlash (STF)，62.5 ng; SV40 驅動水母螢光素 酶質體 ’ 0.75 ng)，對於 LRP4-Wntl 處理孔（pcDNA3 + -LRP4, 62.5 ng, pcDNA3+-wntl, 62.5 ng ； pcDNA3 + , 62.5 ng ; SuperTopFlash (STF), 62.5 ng; SV40驅動水母螢光素 酶質體，0.75 ng)。在第二管中，將 0.8 μΐ Lipofectamine 2000稀釋至最終體積25 μΐ之OptiMEM®I中，且在室溫下 培育5分鐘。隨後藉由將脂質管中之内容物添加至DNA管 中混合兩管之内容物，且在室溫下培育30分鐘以使DNA-脂質複合物形成。隨後將DNA-脂質複合物（5〇 μ1)平均地 添加至各孔中且在37°C下於5% C02中培育5小時。在5小時 培育結束時，細胞準備好以測試試劑（諸如SOST、 DKK1(R&D目錄號1096-DK)、抗體等）處理20h。螢光素酶 134810.doc • 94_ 200922621 檢定如"Wnt檢定"下所述執行，但添加1 50 μΐ被動溶解緩衝 液。 C28A2細胞中LRP4過度表現 C28a2細胞（來自 Mary Goldring，Harvard Institutes of Medicine，Boston，MA，US)在 HEK293相同培養基（參見上 文）中培養，但其中不存在HEPES且添加非必需胺基酸補 充物（Gibco目錄號11140)。C28a2細胞以每孔lxlO5個細胞 接種於24孔板形式中之無抗生素培養基中且培育隔夜，隨 後以 Lipofectamine 2000(Invitrogen目錄號 11668-019)執行 轉染。對於欲轉染之各孔，將如下量之質體（每孔共600 ng)添加至最終體積50 μΐ 〇ptiMEM®I(Gibco，目錄號 3 1985-047)中且溫和地混合：對於對照孔（SuperTop Flash (STF) 100 ng ; SV40驅動水母螢光素酶質體，2 ng，及 pcDNA3+，500 ng補償）’對於 Wntl處理孔（pcDNA-wntl質 體，100 ng ; LRP5 質體，1〇〇 ng ; SuperTopFlash(STF)100 ng ; SV40驅動水母螢光素酶質體，2 ng，及pcDNA3+， 300 ng) ’ 對於 LRP4-Wntl 處理孔（pcDNA-wntl 質體，100 ng ; LRP5 質體，100 ng ; LRP4質體，100 ng ; SuperTopFlash (STF)100 ng，SV40驅動水母螢光素酶質體2 ng及 pcDNA3+ 200 ng)。在第一管中，將 ι_6 μΐ Lipofectamine 2000於48.4 μΐ OptiMEM®I中稀釋且在室溫下培育5分鐘。 隨後藉由將脂質管中之内容物添加至DNA管中將兩個管之 内容物混合且在室溫下培育3 〇分鐘以使DNA-脂質複合物 形成。隨後將DNA-脂質複合物（丨〇〇 μ1)均勻添加至孔中且 134810.doc -95. 200922621 在37°C下在5% C02中培育2小時。在2小時培育結束時，將 轉染培養基替換為每孔450 μΐ無抗生素培養基，且將細胞 培育24 h。隨後將細胞以測試試劑（諸如SOST或DKK1(R & D目錄號1096-DK))處理20 h。如"Wnt檢定"下所述執行螢 光素酶檢定。 HEK293細胞中之LRP4敲除 將Wntl/STF/水母Hek293細胞（以Wntl表現質體、 SuperTopFlash報導質體及SV40驅動水母螢光素酶質體穩 定轉染Hek293細胞（ATCC目錄號CRL-1573)所產生之穩定 純系）在補充有 10% FCS(Amimed 目錄號 2_0F100-I)、2 mM L-麩醯胺酸（Invitrogen 目錄號 25030-081)、100 IU/ml 青黴 素 /1 00 pg/ml鏈黴素（Gibco 目錄號 15140-163)、6 pg/m卜票 °令黴素（Invitrogen 目錄號 ant-pr-Ι) ' 150 pg/ml zeocin (Invitrogen 目錄號 45-0430)及 150 pg/ml 潮黴素（Invitrogen 目錄號 10687-010)之 DMEM(4500 g/L 葡萄糖）（Invitrogen 目 錄號41965-03 5)中常規培養。在敲除實驗期間省去所選抗 生素。將細胞以每孔0.6xl05個細胞接種於聚-D-離胺酸24 孔板形式中且使其附著隔夜，隨後執行LRP4 siRNA經 HiPerFect(Qiagen 目錄號301707)之轉染。所用 LRP4 siRNA 之正義及反義序列如下： LRP4a: TAAATTATCATAMGTCCTAA / AGGACTTTATGATMTTTATT； {SEQ ID N〇S：160/161) LRP4b: ATAGTGGTTAAATAACTCCAG / GGAGTTATTTAACCACTATTT； (SEQ ID NOs:162/163) LRP4c: TAAATTCTCGTGATGTGCCAT / GGCACATCACGAGAATTTATT; (SEQ ID NOs:164/165) LRP4d: mCTTATAGCACAGCTGGTT / CCAGCTGTGCTATMGAAATT; (SEQ ID N0s：166/167) LRP4e： TAGACCTTTCCATCCACGCTG / GCGTGGATGGAAAGGTCTATT; (SEQ ID NOs: 168/169) -96- I34810.doc 200922621 對於待轉染之各孔，製備兩個eppendorf管：第一個含有 0.2 μΐ—種LRP4 siRNA之20 nM儲備液或0.1 μΐ兩種不同 LRP4 siRNA之20 ηΜ儲備液（每孔siRNA之最終總濃度為 6·6 nM)及 5 0 μΐ Optimem，且第二個含有 3 μΐ HiPerFect及 47 μΐ Optimem。將第二管之内容物添加至第一管中，簡短 渦旋且在室溫下靜置10分鐘。隨後將100 μΐ該混合物添加 至各別孔中，且將細胞在37°C下在5% C02下培育30小時。 之後，移除轉染混合物，且替換為新鮮的無抗生素培養基 (每孔450 μΐ)且使其再培育24小時。在SOST或DKK1處理 之前，移除培養基，替換為新鮮的含有SOST或 DKK1(R&D目錄號1 096-DK)之適當稀釋液之無抗生素培養 基，且將細胞在37°C下在5% C02下培育20小時。如"Wnt測 定”下所述執行螢光素酶測定。 動物模型 向八月齡雌性OF1/IC小鼠（n==l 6/組，Charles River, France)每週兩次靜脈内投與抗骨硬化素抗體ANTIBODY A(25 mg/kg, h/mIgG2a)(MOR058 13)或對照抗體（抗-PC-h/mIgG2a)。對照組每日接受皮下每公斤100 pg ΡΤΗ(1-34) 或PBS媒劑。對於所有動物治療均持續2.5週。在組織形態 學分析時處死一半動物（n=8/組）。對於剩餘動物（n=8/組）繼 續治療直至5週。 在開始治療時藉由周邊定量電腦斷層攝影術（pQCT)及微 電腦斷層攝影術（microCT)量測動物之脛骨質量及幾何尺 寸。將動物根據體重及如由pQCT所量測之脛骨總骨礦物 134810.doc -97- 200922621 密度均勻分組。治療2.5週及5週之後評估骨礦物密度、質 量及幾何尺寸變化。每週監測體重。在屍體解剖之前第10 日及第3日，向治療2.5週之後處死之動物投與兩種螢光染 料標記以便標記骨礦化。屍體解剖時採集血液。在屍體解 剖時對切除之脛骨、股骨及腰椎進行雙能量X射線吸光測 定（DEXA)量測。將骨固定、脫水且包嵌以便進行切片機 切片及骨形成動力學之組織形態學分析。 治療方案 C 對照抗體：抗-PC-h/mIgG2a 濃度：2.5 mg/ml，施用體積：10 ml/kg 媒劑：50 mM Citrat、140 mM NaCl 抗骨硬化素抗體：抗-SOST-MOR05813，h/mIgG2a ’ 2.45 mg/ml，施用體積：10 ml/kg 媒劑：50 mM Citrat、140 mM NaCl hPTH( 1-34)(Bachem, Bubendorf, Switzerland) 100 μΒ/kg 媒劑：PBS+BSA 0.1% i 〜 治療組： 1靜脈内同型對照=抗-PC-mIgG2a 2 靜脈内抗-SOST-MOR05813 3皮下媒劑對照=PBS+BSA0.1% 4 皮下 hPTH(l-34) 飼養條件 將動物分成四至五隻動物之組在25°C下在12:12 h之光-暗循環下圈養。向其喂以含有0.8%磷及0.75%鈣之標準實 134810.doc •98- 200922621 驗室腾食（NAFAG 3893.0.25, Kliba, Basel，SwitZeriand)。 隨意提供食品及水。 對動物福利之陳述 根據Canton，Basel City，Switzerland實施之規則進行動 物實驗。 方法 周邊定量電腦斷層攝影術（pQCT) 將動物在吸入麻醉（異氟烷’ 2.5%)下側向位置定位。 將左腿拉伸且固定於該位置中。 如使用經調適之裝備有〇xford 50 AM X射線管及0.5 mm 直徑之視準儀的Stratec-Norland XCT-2000定位掃描所債 測，監測在中腓骨頭部水平面上且距離脛骨近端18 mm之 近端脛骨幹骺端之截面骨質量、密度及幾何尺寸。選擇以 下設置進行量測：體素尺寸：〇.lx〇 lx〇 5 mm ;掃描速 度：定位視圖10 mm/s ;最終掃描：3 mm/s，i塊，輪廓模 式1 ’外殼模式（peel m〇de)2 ;皮層臨限值：61〇 mg/cm3、 内部fe限值· 61 0 rng/cm3 微電腦斷層攝影術（micr〇CT) 將動物在吸入麻醉（異氟烷，2.5%)下側向位置定位。 將左腿拉伸且固定於該位置中。 使用 Scanco vivaCT20(Scanc〇 Medical ag，句 評估左近端脛骨幹骺端之松質骨結構。非等距體素具有 10.5xlG.5xlG.5 μιη之尺寸。由截面圖像，自皮層骨藉由描 摹輪廓來描繪松質骨腔室。在所有其他切片中，基於該描 134810.doc •99- 200922621 摹插入邊界以界定所關注之體積。評估次級松質區域内 143個切片（在生長板側面下部邊緣下方開始）。使用臨限值 370以便進行結構參數之三維評估。 雙能量X射線吸光測定法（DExa) 對左脛骨、左股骨上及第丨·第4腰椎執行離體DEX A量 測。使用乙醇（70%)進行軟組織模擬。使用適合於量測小 動物之普通Hologic QDR-l〇〇〇儀器執行量測。使用具有〇 9 cm直控及超咼解析模式（線距〇 〇254⑽，解析度〇 〇127 C Π1)之視準儀。 螢光染料標記： 茜素（20 mg/kg ’皮下，茜素胺羧絡合劑，Merck, Dietikon，Switzerland)為屍體解剖之前第1〇日投與之標 記物 約黃綠素（30 mg/kg，皮下，Fiuka，Buchs Switzerland)為 屍體解剖之前第3日投與之標記物 組織學及組織形態學 解。〗之後’將右股骨及第5及第6腰椎置於Karno vsky固 定劑中24 h，在4°C下在乙醇中脫水且包嵌於樹脂（曱基丙 烯酸甲酯）中。使用切片機2050 Supercut(ReiChert Jung， Arnsberg，Germany)，沿正中間體平面切割一組5陣厚度 非連續切片以供評估基於螢光染料標記之骨形成之用。使 用裝備有相機（SONY DXC-950P，Tokyo, Japan)及經調適之 Quantimet 600軟體（Leica，Cambridge, United Kingdom)之 Leica DM 顯微鏡（Leica，Heerbrugg，Switzerland)檢查切 134810.doc 100- 200922621 片。每個動物取樣一個切片 陴 丨口刀片將戎樣之顯微圖像數位化且 在螢幕上半自動評估。量測骨周長、經單_標記及雙重標 記之骨周長及内標寬度(放大200倍）。計算礦化周長值 (%)、礦物接合速率（微米/日）(校正松質骨腔室中之切片傾 角）及每日骨形成速率值（每日骨形成速率/骨周長[微米/ 日])。評估遠端股骨幹骺端之次級松質中及一節腰椎中之 所有參數。將另組切片用抗酒石酸鹽酸性碟酸酶（TRAp) 染色。評估次級松質中每骨表面之蝕骨細胞表面（％)。 統計分析 結果表示為平均值+/-SEM。使用司徒頓t檢驗（Student，s t test)(兩尾；不成對）進行統計分析。測試治療（抗骨硬化 素抗體或hPTH(l-34))與對照（對照抗體或pBS)2差異，*， +ρ<0.05 , **，++ρ<〇·〇ι。 親和力測定 使用表面電漿共振（Biacore)進行所選抗人類骨硬化素Fab 之親和力測定 使用 BIAcore 3000儀器（BIAcore，Uppsala，Sweden)以與 共價固定之抗原骨硬化素結合之各別Fab之連續稀釋液測 定動力學常數让⑽及koff。為進行共價抗原固定，使用標準 EDC-NHS 胺偶合化學。在 PBS(136 mM NaCl、2.7 mM KCn、10mMNa2HP04、1.76mMKH2P04，pH7.4)*S2〇
μΐ/min之流速下使用介於1.5-5 00 nM範圍内之Fab濃度進行 動力學量測。各濃度之注入時間為1 min，繼而為3 min解 離階段。為進行再生，使用2x5 μΐ 10 mM甘胺酸（pH 134810.doc -101 - 200922621 1.5)。使用ΒΙΑ評估軟體3.1(BIAcore)擬合所有感應圖 (sensogram) ° 量測溶解物中骨硬化素結合Fab之親和力的基於電化學發 光（BioVeris)之結合分析 為量測大腸桿菌溶解物（BEL萃取物）中骨硬化素結合抗 體片段之親和力，藉由BioVeris M-3 84 SERIES®工作站 (BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)分析結合。 在96孔聚丙烯微量滴定板中且補充有0.5% BSA及0.02% 吐溫20之PBS作為檢定緩衝液進行實驗。根據供應商之說 明將經生物素標記之人類骨硬化素蛋白固定在M-280抗生 蛋白鏈菌素順磁珠粒（Dynal)上。每孔添加珠粒儲備溶液之 1:25稀釋液。將1〇〇 μΐ經稀釋之BEL萃取物及珠粒在震盪 器上在室溫下培育隔夜。為進行偵測，使用根據供應商說 明（BioVeris Europe，Witney, Oxfordshire，UK)以 BV-tag™ 標 §己之抗-人類（Fab)’2(Dianova)。 將隨機選取之純系以上述方法進行分析。選擇產生最高 值之純系以便在溶液平衡滴定中進行進一步分析。 使用溶液平衡滴定（SET)測定Fab與骨硬化素之親和力 為進行KD測定，使用Fab之單體部份（至少9〇。/。之單體含 I ，藉由分析 SEC 分析；Superdex75，Amersham
Pharmacia) 〇 基本上如Haenel等人，2005所述執行溶液中之基於電化 學發光（ECL)之親和力測定及數據評估。將恆定量之 Fab(25 PM)以不同濃度（連續3n稀釋）之未標記人類、小鼠 134810.doc -102· 200922621 或獼猴骨硬化素（起始濃度：500 pM)溶液平衡。添加經生 物素標記之與順磁珠粒M-280抗生蛋白鏈菌素（Dynai)偶合 之人類骨硬化素（0.5 pg/ml)及 BV-tagTM(Bi〇Veris Europe，
Witney，0xfordshire，υκ)標記之抗-人類（Fab)，2 抗體 (Dianova)且培育 30 min。隨後，使用 M-SERIES® 384 分析 器（BioVeris Europe)經由ECL偵測定量未結合Fab之濃度。 藉由基於ECL之高通量親和力篩檢BioVeris檢定鑑別親 和力改良之Fab純系。命中選擇之後，藉由相同方法合併4 個子純系。 使用BioVeris^之受體結合抑制效能檢定 為進行基於BioVeris™之結合抑制效能檢定，根據供應 商說明使重組人類BMP-2與羧酸M-270磁性珠粒（Dynal)直 接偶合。在96孔聚丙烯微量滴定板（Nunc)中執行檢定。將 每孔5〇 μΐ於檢定緩衝液（PBS + 1%吐溫20(嚴格）或0.1%吐 溫20(嚴格度較低）+ 1% BSA)中之經純化Fab以1:3稀釋步驟 (起始濃度：1000 nM)稀釋。將每孔50 μΐ經生物素標記之 人類骨硬化素（4 ηΜ)添加至各Fab稀釋液中。在400 rpm震 盪下在Eppendorf熱混合器上在22T：下培育90 min之後，將 25 μΐ BMP-2塗佈珠粒（每毫升2.7E07個珠粒）及1:500稀釋之 根據供應商說明（BioVeris Europe)以BV-tag™標記之抗生 蛋白鏈菌素添加至各孔中且培育30 min(800 rpm，22。〇。 藉由 BioVeris M-381 SERIES®工作站（BioVeris Europe)執行 偵測。為進行EC5Q值測定，使用4參數邏輯擬合模型 (XLfit，IDBS)。 1348l0.doc -103- 200922621 免疫球蛋白之產生 轉化為人類IgGl形式及人類/小鼠IgG2a形式 為表現全長IgG，將重鏈可變域片段（VH)及輕鏈可變域 片段（VL)自Fab表現載體次選殖於適當pMorph®Ig載體 (pMorph®_h_Igl 及欲合人類 /小鼠 pMorph®2_h/m_Ig2a)中。 分別地，使用限制酶五coRI、M/el、B/pI將VH域片段次選 殖於 pMorph®_h_IgGl 或 pMorph®2_h/m_IgG2a 中，且使用 五、5WWI、//pal將VL域片段次選殖於pMorph®_ h_IgK、pMorph®_h_IgX及 pMorph®2_h/m_IgX載體中。 使用限制酶五c〇RI、M/Η及將VH域片段次選殖於 pMORPH®_h_IgGl中：載體主鏈係藉由五消化及 萃取6400 bp片段而產生，而VH片段（3 50 bp)係藉由以M/el 及β/ρΐ消化及隨後純化而產生。載體及插入物係經由分別 藉由五coRI及M/el消化產生之相匹配突出端及經由5/ρΙ位點 接合。由此，五coRI與M/el限制位點均被破壞。 使用限制酶M/Η及5//?1將VH域片段次選殖於 pMORPH®2_h/m_IgG2a中。在該新一代IgG載體中，進行 其他修飾之後，五aRI位點（其僅允許經由相匹配突出端子 選殖）替換為M/el位點由此允許消化載體與插入 物二者。 VL域片段次選殖於pMORPH® Ji_IgK中係經由五coRV及 BsiWl位點執行，而次選殖於pMORPH®_h_IgX及 pMORPH®2—h/m_IgX中係使用£coRV及丑#進行。 人類IgG之瞬時表現及純化 134810.doc -104- 200922621 將HEK293或HKB11細胞以等莫耳量之IgG重鏈及輕鏈表 現載體轉染。轉染後第4日或第5日，收穫細胞培養物上清 液。將上清液之pH值調整為pH 8 〇及無菌過濾之後，對溶 液進行標準蛋白A管柱層析（poros 2〇A, pE Bi〇systerns)。 實例1:人類及犬重組骨硬化素蛋白之產生 將編碼以天然信號肽（aal_2 13，NPL 005002)為特徵之人 類骨硬化素前軀物之全長cDNA(GenBank登記號AF3 26739) 藉由插入限制位點AsP7 1 8及Xbal中而選殖於哺乳動物表現 載體pRS5a甲。將蛋白質偵測及純化標籤（App=EFRH)添加 至該基因之C末端中。 在瞬時ό孔板轉染檢定中進行小規模表現驗證之後，藉 由以脂質轉染法轉染四個集合（各自i 0χ10Ε6個細胞）來引 發穩定轉染集合之產生。轉染後48小時，藉由添加1 〇〇 Pg/ml濃度之抗生素ZeocinTM開始轉染子之選擇。所有四個 集合均恢復正常生長之後’藉由抗_ App HPLC分析親和層 析評定重組蛋白力價’且選擇最高產生集合-集合2以適應 於無血清培養基及進一步按比例放大。同時，亦使用聚伸 乙基亞胺作為轉染期間質體DNA之載體及Wave™生物反應 器系統（C20SPS-F，Art-No. 100.001，wave Biotech)作為培 養系統執行10 L規模之大規模瞬時表現試驗。在轉染後γ-ΐΟ 曰收穫 12-22 L細胞培養物上清液且藉由 掃流式過濾及 渗渡濃縮隨後純化。 藉由免疫親和層析法純化人類及犬SOST。簡言之，將 10-20 L組織培養物上清液批料藉由掃流式過濾（截留1〇 134810.doc -105- 200922621 kDa)濃縮為1-2 L且以2 ml/min施加於50 ml藉由根據製造 商之說明將專屬單株抗Abl-40/APP(6E10-A5)與CNBr活化 瓊脂糖4B偶合（每毫升樹脂1 0 mg抗體）來製備之抗APP瓊脂 糖管柱上。以PB S進行基線洗務之後，將所結合之物質以 100 mM甘胺酸溶離，中和為pH 2.7且進行無菌過濾。藉由 A280使用所計算之吸附因子測定蛋白質濃度。最後將經純 化之蛋白質藉由SDS-PAGE、N末端測序及LC-MS表徵。使 用1 mM磺酸基-NHS-Ic-生物素（Uptima; UP54398A)將經純 化人類SOST之等分試樣在37°C下在PBS中生物素標記1小 時。隨後藉由針對PBS廣泛透析移除過量試劑。
大腸桿菌來源之人類SOST 藉由再指疊產生His6-PreScission標記之SOST aa24-213(NPL006071 ， 質 體 pXI504)及 SOST aa24- 213(NPL006690，質體pXI515)。將大腸桿菌 Tuner(DE3)以 任一質體轉化。 使用改良TB培養基（實驗室112版）以20公升規模（V94〇5) 醱酵批料PSU5257。將細胞在OD600 3.90下以1 mM IPTG 誘導且在37°C下誘導3.5小時。使用連續流動離心收穫細 胞，產生重量為19 0 g之濕細胞離心塊。 在16 L補充有15N標記之氯化銨之最低M9-1培養基中以 20公升規模醱酵批料PSU1 1274。達到OD600 1.5之後，將 細胞以1 mM IPTG誘導且在OD600 3.3下使用連續流動離 心收穫，產生重量為5 0 g之濕細胞離心塊。 使用Avestin C-50乳化器將以上醱酵所得之濕細胞離心 134810.doc -106- 200922621 塊溶解於8體積50 mM Tris(pH 8.0，含有各5 mM之EDTA、 0丁丁及苯曱脒-11(：1)中且在12,000吓111下離心3〇111丨11。棄去 上清液且將所得離心塊再懸浮於1 0體積溶解緩衝液中且再 次離心。將該過程再重複3次，之後將溶解缓衝液以含有5 mM DTT之Milli-Q水替換。將離心塊再在該等條件下洗滌 兩次。將包涵體在環境溫度下溶解於8 Μ胍-HC1(含有100 mM DTT、50 mM Tris(pH 8)及 5 mM EDTA)中歷時 3-4 h， 隨後在20,000 rpm下離心30 min，經由0.45 μΜ過渡器過 濾。藉由以88體積（PSU11274)及92體積（PSU5257)冰凍再 摺疊缓衝液（含有0.9 Μ精胺酸-HC1、5 mM GSH及0.5 mM GSSG之0.5 M Tris，pH 8)快速稀釋引發再摺疊。將溶液在 4°C下儲存1週。在此階段，對兩種製備物進行略微不同之 處理，因為在完成再摺疊之前需要自PSU5257移除his6-標 籤。 PSU5257 將經稀釋之摺疊溶液針對1.5體積50 mM Tris(pH 8)、5 mM GSH、0.5 mM GSSG滲濾濃縮2倍，隨後稀釋回原始體 積。將此步驟進行3次，之後，添加PreScission蛋白酶且 將溶液在4°C下靜置48 h。所有濃縮/滲濾均使用具有1 0 KDa截留膜之Pellicon II超濾盒進行。最後將溶液濃縮10 倍。 PSU11274 將經稀釋之再摺疊溶液濃縮10倍。使用LC-MS來證實濃 縮之前所有4個二硫橋之形成。 134810.doc -107- 200922621 隨後將兩種製備物針對2 χ 1 0體積5 0 mM乙酸納（pH 5)透 析。經由玻璃棉及3.0 μιη膜連續過濾以移除沈澱之蛋白質 之後，使用SP-SepharoseTM高效陽離子交換層析進行純 化。將管柱以透析緩衝液平衡且隨後以於相同緩衝液中之 0-1 M NaCl梯度經20管枉體積溶離。將溶離為具有微小肩 部之單峰的骨硬化素棄去《在PSU5257之情況下，將主岭 收集，濃縮’使用以50 mM Tris，150 mM NaCl平衡之 Superdex 751^管柱進行尺寸排阻層析。對於psuil274而 言，陽離子交換之後直接提供樣品。 藉由RT-PCR以基於非洲綠猴SOST序列之引子（GenBank 登記號 AF326742)擴增獼猴 SOST cDNA(cySOST)。5’引子 (ATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTTGT)(SEQ ID NO:170)對應於信號肽序列之N末端且並不在最終分泌之蛋 白質中；3'引子（AATCAGGCCGAGCTGGAGAACGCC 丁八<：丁八0)(8丑(^10>10:171)對應於在人類、非洲綠猴及小 鼠間保守之區域。將經擴增之片段次選殖於pcDNA3.1(+) 之Bam HI/Eco RI位點中且證實其序列。該質體另外充當 犬-SOST PCR擴增之模板以添加C末端APP標籤及attB重組 位點以便根據Gateway技術最終選殖於pDESTRS5a中 [cySOST-pDESTRS5a]。 藉由大規模瞬時轉染以10 L規模在WaveTM生物反應器系 統中進行表現，在轉染後第9日收穫且如上所述進行純 化。 實例2 ··自HuCAL GOLD®庫產生人類骨硬化素特異性抗體 134810.doc -108- 200922621 藉由使用市售嘆鹵體呈現庫（MorphoSys HuCAL GOLD® 庫）作為k體變異蛋白之來源選擇具有高結合親和力之純 系來產生人類骨硬化素蛋白之治療性抗體。HuCAL GOLD®庫為—種Fab庫（Knappik等人，2〇〇〇)，其中所有六 個CDR藉由適當突變而多樣化且其使用CysDisplay®技術使 Fab與4菌體表面連接（w〇〇1/〇595〇，匕〇1^叫等人， 2001) 〇 藉由自庫中淘選骨硬化素特異性抗體來選擇 為選擇識別人類骨硬化素之抗體，應用多種淘選策略。 總而言之，將HuCAL GOLD®抗體噬菌體分為三個包含 不同Vh主基因之集合。 使該等集合個別地進行以下步驟： a) 固相淘選，其中將抗原（人類及小鼠骨硬化素）直接塗佈 於 Maxisorp 96孔微量滴定板（Nunc，Wiesbaden, Germany) 上，或 b) 捕獲及不完全溶液淘選，其中抗原（經生物素標記之骨硬 化素），各別噬菌體-抗原複合物捕獲於N/a透明帶上，或 c) 使用經生物素標記之骨硬化素的溶液淘選，其中對於各 淘選集合，噬菌體-抗原複合物由抗生蛋白鏈菌素磁性珠 粒（Dynabeads M-280; Dynal)捕獲。 •骨硬化素上之固相淘選 對於第一輪骨硬化素上之淘選，將河虹丨8〇卬板之孔以 300 μ1(5 pg/ml)於PBS中稀釋之人類骨硬化素（在hEK細胞 中產生）塗佈隔夜。以400 μΐ PBS進行兩次洗滌步驟之後， 1348J0.doc -109- 200922621 將該等孔以含有於PBS中稀釋之5%奶粉之阻斷緩衝液培 在選擇之前’在室溫下將HuCAL GOLD®嗔菌體在阻斷 緩衝液（5%奶粉/PBS ’ 0.5%吐溫20)中預吸附2 h以避免抗 體之非特異性選擇。 將經塗佈及阻斷之Maxisorp板洗滌（2x400 μΐ PBS)之 後，將300 μΐ經預吸附之噬菌體添加至經塗佈孔中且在室 溫下溫和震盪培育2h。該培育之後在室溫下以PBS及 PBS/0.05%吐溫20進行10次洗滌循環。 猎由在室溫下向每孔添加300 μΐ於1 〇 mM Tris/HCl(pH 8.0)中之20 mM DTT使經結合之噬菌體溶離1 〇分鐘。將溶 離液移出且添加至15 ml生長至0.6-0.8之OD6GQnm之大腸桿 菌TG1F+細胞中。使大腸桿菌之噬菌體感染在37。〇下無振 盪情況下進行45分鐘。在412〇xg下離心5 min之後，將細 菌離心塊各自再懸浮於600 μΐ 2xYT培養基中，塗佈於LB-CG填脂板上且在3(rc下培育隔夜。隨後自板上刮下菌落， 且援救並擴增噬菌體。 第二及第三輪選擇以與第一輪選擇相同之方法進行，其 中唯一區別為在噬菌體結合後洗滌條件更為嚴格。在第二 輪選擇中對於一些淘選條件’使用小鼠骨硬化素作為抗原 以富集小鼠交又反應性抗體。對於一些淘選條件，塗佈另 一批人類重组骨硬化素（在大腸桿菌中產生）。 •骨硬化素上之不完全溶液淘選 對於該類為選執行兩種不同方法：捕獲不完全溶液淘選 134810.doc -110· 200922621 及標準不完全溶液淘選程序。 詳言之，對於經生物素標記之骨硬化素上之不完全溶液 淘選’在室溫下將100 μ丨抗原塗佈在中性鏈親和素 (NeutrAVidin)(N/A)透明帶（來自Pierce，每孔活化量i 〇〇 μΐ，結合能力15 pmol)上2 h。將N/A帶在4〇C下以200 μ1 Chemiblock阻斷隔夜且以PBS洗滌兩次。 將經阻斷之噬菌體溶液（chemibl〇ck/0.05%吐溫2〇)添加 至經阻斷之N/A孔中歷時30 min，且將該步驟再重複3〇 min以移除中性鏈親和素結合物。隨後將預淨化之噬菌體 轉移至固定於N/A透明帶上的經生物素標記之骨硬化素 中，以箔密封且在室溫下震盪培育隔夜。 次曰，將噬菌體溶液自經抗原塗佈之孔中移除且洗滌該 等孔。 對於標準不完全溶液淘選，將經阻斷（Chemibl〇ck/〇 吐溫20)、預淨化之噬菌體添加至新的經預阻斷之i5 W反 應管（ChemibIock/0.05%吐溫20)中，且隨後添加經生物素 標記之人類骨硬化素至1〇〇 nM之最終濃度且在室溫下震盪 培育隔仪。 次日，將1.5 ml反應管中之噬菌體-抗原溶液添加至中性 鏈親和素帶之新的阻斷孔中且使其在室溫下結合3〇爪化且 隨後洗滌。 對於兩種淘選程序，在洗滌之後藉由在室溫下向每孔添 加 300 μΐ於 1〇 mM Tris/HC1(pH 8 〇)中之 2〇 瓜河 dtt將經結 合之噬菌體溶離10 min。將溶離液移出且添加至15 m丨生長 134810.doc 200922621 至0.6-0.8之OD6〇0nm之大腸桿菌TG1細胞中。使大腸桿菌之 嗟菌體感染在3 7。(：下無震盪的情況下進行45 min。在 412(^§下離心5 111丨11之後，將細菌離心塊各自再懸浮於6〇〇 μ12χΥΤ培養基中，塗佈於LB_CG瓊脂板上且在3〇〇c下培育 隔夜。隨後自板上刮下菌落，且援救並擴增噬菌體。 第一及第二輪選擇以與第一輪選擇相同之方法進行，其 唯一區別為在噬菌體結合後之洗滌條件更為嚴格。 •骨硬化素上之溶液淘選 對於此類淘選，將200 μΐ抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒 (Dynabeads M-280; Dynal)以PBS洗滌一次，且在室溫下以 Chemiblock阻斷2 h。在室溫下將500 μΐ噬菌體以 Chemiblock旋轉阻斷1 h。將經阻斷之噬菌體針對5〇…經 阻斷之抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒預吸附兩次歷時3〇 min。 將嗤菌體上清液轉移至新的經阻斷之2…反應管中，且添 加不同濃度之人類生物素標記骨硬化素（參見表5、6及7)且 在室溫下旋轉培育1 h。將1 〇〇 μ1經阻斷抗生蛋白鏈菌素磁 性珠粒添加至各淘選集合中且在旋轉器上培育丨〇 min。將 珠粒以粒子分離器（Dynal MPC_E)收集約2 5 min且將溶液 小心移除。 洗蘇循環（表2)之後’藉由在室溫下向每孔添加3〇〇…於 10 mM Tris/HCl(pH 8.0)中之20 mM DTT將經結合之噬菌體 浴離10 min °將溶離液移出且添加至15 mi生長至〇 8之 〇D6〇0 nm之大腸桿菌tGif+細胞中。使大腸桿菌之噬菌體感 染在37°C下無振盪情況下進行45分鐘。在412〇xg下離心5 134810.doc 212 200922621 min之後’將細菌離心塊各自再懸浮於6〇〇 w & γτ谇養其 t，塗佈於LB-CG瓊脂板上且在3(TC下培育隔夜。隨後自 板上刮下菌落，且援救並擴增噬菌體。 第二與第三輪選擇以與第一輪選擇相同之方法進行，其 唯一區別為在噬菌體結合後之洗滌條件更為嚴格。在第二 及第三輪選擇中對於一些淘選條件，降低抗原濃度。 所選Fab片段之次選殖及表現 所選Fab片段之微表現 為有利於可溶性Fab快速表現，將所選HuCAL G〇LD®噬 邊體之Fab編碼插入物經由^^^丨及自各別呈現載體次 選殖於大腸桿菌表現載體pM〇RpH®X9 MH中 (Rauchenberger等人，2003)。將表現質體轉化至大腸桿菌 TGI F細胞中之後’選取抗氯黴素單純系至以1〇〇 μ1 2xYT-CG培養基預填充之無菌96孔微量滴定板之孔中且在 37°C下生長隔夜。將5 μΐ各大腸桿菌TG-1培養物轉移至以 100 μΐ每孔補充有34 gg/ml氣黴素及0.1%葡萄糖之2χγΤ培 養基預填充之新鮮、無菌96孔微量滴定板中。在30°c下將 微重滴疋板在微板震盡器上以400 rpm震盈培養直至培養 物略顯混濁（約2-4小時）’且〇D6〇〇 nm為約0.5。對於該等表 現板，每孔添加2〇 μΐ補充有34 pg/ml氣黴素及3 IPTG(異丙基-β-D-疏代半乳糖苷）之2χγτ培養基（最終濃 度：0.5 mM IPTG)，將微量滴定板以透氣帶密封，且在 30°C下以400 rpm震盈培育隔夜。 全細胞溶解物（BEL萃取物）之產生：向表現板之各孔添 134810.doc -113- 200922621 加40 μΐ BEL緩衝液且在22°C下在微量滴定板震盪器（400 rpm)上培育1 h。 大腸桿菌中HuCAL®-Fab抗體之表現及純化 在震盪燒瓶培養物中使用750 ml補充有34 pg/ml氣黴素 之2xYT培養基進行大腸桿菌TGI F_細胞中由 pMORPH®X9_Fab_MH編碼之Fab片段之大規模表現。將培 養物在30°C下震盪直至OD6GQnm達到0.5。藉由添加0.75 mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導Fab表現且將其在 30°C下再培養20 h。收穫細胞且使用溶菌酶將其破壞且藉 由Ni-NTA層析分離Fab片段。藉由尺寸排阻層析（SEC)以 校準標準測定表觀分子量。由UV-分光光度計測定濃度 (Krebs等人，2001)。 實例2:骨硬化素特異性HuCAL®抗體之鑑別 在直接塗佈之骨硬化素上偵測骨硬化素結合Fab之酶聯免 疫吸附檢定（ELISA) 在 4°C 下將 Maxisorp(Nunc, Rochester, NY，USA)384孔板 以20 μΐ於PBS(pH 7.4)中之2.5 pg/ml抗原（HEK細胞中所產 生之人類骨硬化素，大腸桿菌細胞中所產生之人類骨硬化 素，及小鼠骨硬化素）塗佈隔夜。 在室溫下將培養板以含有5%奶粉之PBS/0.05%吐溫 20(PBST)阻斷1 h。以PBST洗滌孔之後，將在PBS中稀釋 之BEL萃取物、經純化HuCAL® Fab或對照Fab添加至孔中 且在室溫下培育1小時。為偵測第一抗體施加以下第二抗 體：鹼性磷酸酶（AP)結合AffiniPure F(ab')2片段、山羊抗 134810.doc -114- 200922621 人類、抗小鼠 IgG(Jackson ImmunoResearch)。為偵測 AP-結合物，根據製造商之說明使用如AttoPhos(Roche)之螢光 受質。在所有培養步驟之間，將微量滴定板之孔以PBST 洗滌3次且在最後與第二抗體一起培養之後洗滌5次。在 TECAN Spectrafluor板讀取器中量測榮光。 使用經生物素標記之骨硬化素之捕獲篩檢 使用此類ELISA以便在進行溶液淘選之後篩檢HuCAL GOLD® Fab。 將 Maxisorp(Nunc，Rochester, NY, USA)384孔板以 20 μΐ 於PBS(pH 7.4)中稀釋之5 pg/ml對Fd片段具有特異性之綿 羊抗人類 IgG(The Binding Site, Birmingham, UK)塗佈。 在室溫下以於TBS中之3% BS A、0.05%吐溫20阻斷2 h之 後，添加周質萃取物或經純化HuCAL GOLD® Fab且在室 溫下培育1 h。以PBST將培養板洗滌五次之後，將20 μΐ用 於特異性結合之經生物素標記之骨硬化素或用於非特異性 結合之經生物素標記之轉鐵蛋白添加至孔中。 隨後，使經生物素標記之抗原骨硬化素結合所捕獲之 HuCAL®-Fab片段。且洗滌之後，與結合鹼性磷酸酶之抗 生蛋白鏈菌素（Zymex)—起培育。為偵測AP-抗生蛋白鏈菌 素，根據製造商之說明使用如AttoPhos(Roche)之螢光受質 (Roche Diagnostics，Mannheim, Germany)。記錄 535 nm 下 之螢光發射，其中在43 0 nm下激發。 結果： 淘選之後，將富集之噬菌體集合自pMORPH®23庫載體 134810.doc -115· 200922621 (允許抗體在噬菌體表面上有效呈現）次選殖於介導可溶性 Fab周質表現之pMORPH®X9_Fab—MH表現載體中。選取單 純系且由該等單純系表現可溶性Fab。在一級篩檢中總共 分析約4600個純系，其係藉由以下步驟執行：藉由使細菌 溶解物之Fab直接與Maxisorp微量滴定板上所固定之人類 及小鼠骨硬化素結合或藉由將Fab經由抗Fd抗體捕獲於 maxisorp微量滴定板’繼而結合經生物素標記之人類骨硬 化素。在以鹼性磷酸酶標記之抗人類（Fab)，2抗體或使用抗 生蛋白鏈菌素鹼性磷酸酶標記之後以ELIS A進行债測。 對由在重組骨硬化素上之一級篩檢獲得之信號超過背景 5倍以上之命中物就與直接塗佈或溶液形式（使用經生物素 標記之骨硬化素）之人類HEK及大腸桿菌骨硬化素及小鼠 骨硬化素之結合作進一步分析。選擇識別所有骨硬化素衍 生物之命中物且對其進行測序。
HuCAL GOLD® Fab之表徵
使用Biacore之親和力測定 為進一步表徵抗骨硬化素抗體，測定其與人類、小鼠及 獼猴骨硬化素之親和力。將重組骨硬化素蛋白固^於⑽ Biacore晶片上且在移動相中施加不同濃度之Fab。為可靠 測f單價親和力’僅將在定性尺寸排阻層析中展示養。 之皁體刀率之Fab批料用於Biacore量測。 在Biacore中測定對重組人類、獼猴及小鼠骨硬化素之親 和力。對人類骨硬化素之親和力介於亞奈莫耳至超請 囊’對獼猴骨硬化素之親和力介於亞奈莫耳至接近5000 134810.doc -116- 200922621 nM且對小鼠骨硬化素之親和力介於亞奈莫耳至45〇〇 nM。 實例3 :使用BioVerisTM裝置進行抑制骨硬化素與經固定 BMP-2結合之抗人類骨硬化素Fab候選者之鑑別 將所有產生且純化之Fab在基於BioVeris之結合抑制效能 檢疋中測試其抑制骨硬化素與重組人類BMP-2結合之能 力。測試兩種不同嚴格度條件（緩衝系統中之〇.1%吐溫2〇 與1°/。吐溫20)。27種Fab中有9種能夠在嚴格緩衝條件下抑 制骨硬化素與經固定BMP-2之結合。 f
實例4 : MC3T3細胞中骨硬化素抑制BMp_2誘導之ALp產 生之逆轉 親本結合物之IgG轉化及igG之表徵 將21個候選者藉由分別次選殖KpM〇RpH$)—、“⑴表現 載體及PM〇RP(h_Ig載體系列之相應輕鏈構築—體中而轉 化為人類IgGl形式。藉由瞬時轉染HEK293或Ηκβιι細胞 執订表現且將全長免疫球蛋白自細胞培養物上清液純化。 藉由EUSA評定純化之後⑽與經固定之人類、小鼠及搁 猴骨硬化素結合之功能。 一級生物檢定中之IgG| ▲在ALP檢定巾將所有I純化之咖進行力價滴定及測 试。對於BMP-2骨硬化素抑制該檢定為可靠的，但所選候 選者不會在所有實驗中均展Μ硬化素抑制（M檢定之 間的雜變化、不同培養板之間的變化、進行重複試驗之 孔中之高度變化）。因此’僅可能對賊之活性進行分級。 實心藉由LCDR3及HCDR2盒之平行交換達成的所選抗 134810.doc 200922621 骨硬化素Fab之親和力成熟 在ALP檢定中測試IgG之結果僅可進行分級。由該分 級，就親和力成熟之高風險選擇4種Fab。所有候選者經選 擇以最佳化為L-CDR3及H-CDR2中之單一主候選者。 為增加四種所選抗體片段之親和力及生物活性，藉由盒 式誘變使用定向誘變（Virnekas等人，1994)來平行最佳化 LCDR3及HCDR2區域，由此構架區保持恆定。選殖成熟庫 之前，將所有親本Fab片段經由义五coRI限制位點自表 現載體pMORPH®x9_MH轉移至CysDisplay™成熟載體 pMORPH®25中。該載體提供N末端與半胱胺酸殘基融合之 噬菌體蛋白以及與Fd抗體鏈融合之C末端半胱胺酸pill且 因此允許各別Fab片段在噬菌體表面上經二硫化物連接之 呈現。 為產生HCDR2庫，將各親本Fab之HCDR2區域切除且替 換為590 bp填充片段。該DNA填充片段有利於自雙重消化 載體帶分離單一消化載體帶且降低成熟淘選期間高親和力 親本Fab之背景值。在下一步驟中，將填充片段自各親本 純系之Fab編碼質體切除且替換為高度多樣化之HCDR2成 熟盒。 平行地，將四個親本純系中之五者之LCDR3區域替換為 多樣化LCDR3成熟盒，中間不進行填充片段的選殖。 成熟庫尺寸介於lxlO7個純系與4χ108個純系之間，其中 選殖背景低於1%，且藉由測序達成之品質控制揭示各庫 之優良品質。僅親本純系MOR04520之LCDR3庫具有小尺 134810.doc -118- 200922621 寸（<ίο6)及許多錯誤純系且因此不包括在成熟淘選内。 對於各LCDR3及HCDR2成熟庫，製備抗體呈現噬菌體且 藉由點滴定測定噬菌體力價。 親和力成熟之淘選策略 對來自以下成熟庫之抗體呈現噬菌體進行獨立淘選及篩 檢： 主導（lead)l : MOR04518(L-CDR3成熟） 主導1 : MOR045 18(H-CDR2成熟） ( 主導 2 : MOR04520(H-CDR2成熟） 主導3 : MOR04532(L-CDR3成熟） 主導3 : MOR04532(H-CDR2成熟） 主導4 : MOR04799(L-CDR3成熟） 主導4 : MOR04799(H-CDR2成熟） 對各主導庫執行三種不同淘選。對於各淘選策略而言， 使用不同嚴格度條件。為增加淘選嚴格度及選擇改良之截 留率（off-rate)，執行廣泛洗務及與經純化親本Fab或與可 f K 溶性重組骨硬化素之競爭。成熟淘選之後，將富集之噬菌 粒集合次選殖於pMORPH®x9_MH表現載體中。選取約 2900個單純系且藉由以IPTG誘導表現Fab。
BioVeris™親和力分級及改良親和力之篩檢 為鑑別親和力改良之骨硬化素特異性Fab，將約2900個 單純系之細菌溶解物稀釋且檢驗Fab與固定於抗生蛋白鏈 菌素塗佈珠粒上之經生物素標記之人類骨硬化素的結合。 以BioVeris工作站分析該結合。產生最高信號之彼等純系 134810.doc • 119- 200922621 表明改良之親和力且因此選擇彼等純系以便藉由溶液平衡 滴定進一步分析。 出於該目的，選擇Π6個單純系且以Bi〇Veris經由4點溶 液平衡滴定（SET)測定初始親和力。該等數據中，選擇24 個展示最佳親和力之純系。將該等Fab以毫克規模純化。 使用8點SET量測及人類、小鼠及獼猴骨硬化素測定最 終親和力。 一級生物檢定中經最佳化之Fab
在細胞ALP檢定中測試經最佳化之Fab。其中大多數無 活性；且對於一些Fab觀察到骨硬化素抑制的可變逆轉。 因此’將選擇之純系轉化為人類/小鼠Ig(32a形式且在同一 檢疋中測試。但該等人類/小鼠IgG2a形式之純系可能不會 兀全逆轉骨硬化素抑制亦不能達成所需EC5()(< 1 〇 nM)標 準。最佳成熟候選者MOR05177(自親本MOR04518成熟之 Vl)展示在 50 nM Fab 或 140-467 nM 人類/小鼠 IgG2a下 ALP 信號達成75-85%恢復。 實例6:新穎一級生物檢定中自親本及經最佳化之Fab及 IgG鑑別抗骨硬化素抗艎 基於展示骨硬化素直接或間接影響Wnt信號傳輸之新出 版物（Wu等人，JBC 2005 ; He等人，JBC 2005 ; BeZ00yen 等人，ASBMR 2005 ; Winkler等人，JBC 2005)，開發出一 種新穎功能生物檢定。 該檢定係基於骨硬化素抑制HEK293細胞中Wntl介導之 STF活化的能力。 134810.doc -120- 200922621 在該檢定中，測試在初始篩檢中鑑別之所有Fab加上在 親和力成熟中鑑別之所有Fab。顯而易見，成熟Fab增加之 親和力反映wnt-1檢定中增加之效能及功效。 測試所有親本Fab鑑別出另外兩種抗體作為另一親和力 成熟之有前景之模板。圖1展示wnt-1檢定中鑑別之最有效 抗體之一 MOR05813—IgG2X之活性。 實例7:其他生物檢定中親本及親和力成熟Fab之表徵 礦化檢定中親本及親和力成熟Fab之活性 礦化檢定係基於MC3T3細胞形成礦化基質之能力，此指 示其進行成骨分化之能力。14日之後在測試之所有BMP-2 濃度下均量測到強礦化（每孔沈積之鈣>1 Kg(96孔形式））。 添加遞增濃度之骨硬化素誘導ΒΜΡ-2(2·1 nM)誘導之礦化 的劑量依賴性抑制（IC5Q值：120 nM)(數據未展示）。 圖2展示在MOR05813_Fab存在下礦化之一實例。該抗體 可使BMP-2誘導之礦化最大恢復至初始反應之80%，而用 作陰性對照之抗溶菌酶Fab無效。 親本及親和力成熟Fab在LRP6/骨硬化素ELISA中之活性 LRP6/骨硬化素ELISA係基於骨硬化素結合LRP6之能 力。為進一步表徵所產生之Fab，在該檢定中測試所選Fab 及IgG。在R&D之抗骨硬化素抗體（1000 ng/ml=約7 nM)存 在下，與對照相比骨硬化素（0.9 nM)與LRP6之結合被抑制 68%(數據未展示）。 在90 nM下，MOR05813_IgG2X抑制骨硬化素與LRP6之 結合高達90%，而用作陰性對照之抗溶菌酶IgG對骨硬化 134810.doc -121 - 200922621 素與LRP6之結合無效（圖3)。 磷酸-Smadl檢定中親本及親和力成熟Fab之活性 磷酸-Smadl檢定（Western)係基於BMP-6在15分鐘内誘導 MC3T3-E1細胞中 Smadl 磷酸化之能力。MOR053 18_IgG2X 抑制骨硬化素對BMP-6誘導之Smadl磷酸化之作用，其中 EC5〇值為115 nM，且其使Smadl磷酸化最大恢復至BMP-6 誘導之磷酸化的66%。陰性對照抗溶菌酶IgG(IgG C)無效 (圖 4)。 實例8 :新穎SOST相互作用搭配物LRP4對抗SOST抗體活 性的作用 除LRP4 siRNA e之外，在無SOST的情況下LRP4 mRNA 敲除不影響STF活性。然而，其確實將SOST抑制STF活性 之能力降低10%與30%之間。此對所有五個單獨（圖5A)或 以不同組合（數據未展示）測試之siRNA成立。在HEK及 c28a2 supertopflash檢定中，LRP4在過度表現之後，使 SOST IC5〇值分別減少5及16倍（圖5B及圖5C)。該作用在過 度表現之LRP4對DKK1 IC5Q值無效之意義上具特異性。敲 除LRP4(siRNA)降低SOST在Wnt-Ι誘導之STF中之抑制作 用，但其不降低DKK1之抑制作用（圖5D)。又，LRP4降低 抗SOST抗體之作用，其使MOR05813_IgG2a EC50值自17.2 nM增加至30 nM(圖5E)。該等數據表明LRP4為SOST作用 之促進者。 實例9 :新穎成熟 為基於由生物檢定獲得之結果增加兩種新近選擇之抗體 134810.doc 122- 200922621 片段之親和力及生物活性，藉由盒式誘變使用定向誘變平 行最佳化LCDR3及HCDR2區域（Virnekas等人，1994)，由 此構架區保持恆定。選殖成熟庫之前，將所有親本Fab片 段經由限制位點自表現載體pMORPH®X9_MH 轉移至CysDisplay™成熟載體PM0RPH®25中。該載體提供 N末端與半胱胺酸殘基融合之噬菌體蛋白pill及與Fd抗體 鏈融合之C末端半胱胺酸且因此允許各別Fab片段在噬菌體 表面上經二硫化物連接之呈現。 為產生HCDR2庫，將各親本Fab之HCDR2區域切除且替 換為590 bp填充片段。該DNA填充片段有利於自雙重消化 載體帶分離單一消化載體帶且降低成熟淘選期間高親和力 親本Fab之背景值。在下一步驟中，將填充片段自各親本 純系之Fab編碼質體切除且替換為高度多樣化之HCDR2成 熟盒。 平行地，將四個親本純系中之五者之LCDR3區域替換為 多樣化LCDR3成熟盒，中間不進行填充片段選殖。 成熟庫尺寸介於2χ107個純系與2χ108個純系之間，其中 選殖背景低於1%，且藉由測序達成之品質控制揭示各庫 之優良品質。對於各LCDR3及HCDR2成熟庫，製備抗體呈 現噬菌體且藉由點滴定測定噬菌體力價。 另外親和力成熟之淘選策略 對來自以下成熟庫之抗體呈現噬菌體進行獨立淘選及篩 檢. 主導1 : MOR04525(L-CDR3成熟） 134810.doc -123· 200922621 主導1 : MOR04525(H-CDR2成熟） 主導2 : MOR04529(L-CDR3成熟） 主導2 : MOR04529(H-CDR2成熟） 對於各主導或混合庫執行三種不同㈣，對於各淘 略而言，使用不同嚴格度條件。為增加淘選嚴格度及選擇 改良之截留率，在延長之培育及洗膝時間内執行與可溶性 重組骨硬化素蛋白之競爭。 阀選之後 吗租果合次選殖於 PM〇RPH⑧X9_MH表現㈣I選取約丨_個單純系且藉 由以IPTG誘導表現Fab。 兩種親本Fab之衍生物均滿足對人類骨硬化素<ι〇〇ρΜ之 親和力標準。兩種親本Fab之衍生物均滿^與獼猴骨硬化 素及與小鼠骨硬化素<500 pM之必須交又反應性。 厘0讀525產生更多對所有三個物種均具有較高親和力的 純系。
實例10:活體内研究中抗骨硬化素抗體之表徵 向八月齡雌性OF1/IC小鼠（n=16/組，Charles River， France)每週兩次靜脈内投與抗骨硬化素抗體m〇r〇58i3 (24·5 mg/kg，mIgG2a)或同型對照抗體（抗 _pc_mIgG2a)。對 照組每日接受皮下每公斤1〇〇叫pTH(i_34)或媒劑 (PBS+0.1% BSA)。對於所有動物治療均持續2 5週。在組 織形態學分析時處死一半動物（n=8/組）。在屍體解剖之前 第10曰及第3日使該等動物接受螢光染料標記以作骨形成 動力學之組織形態學評估。對於其餘動物n=8/組）繼續治療 1348I0.doc -124- 200922621 直至5週。 監測動物骨質量、密度及幾何尺寸之變化。活體内周邊 定量電腦斷層攝影術[PQCT]展示MOR05 i 77在老齡小鼠之 近端脛骨中具有強烈骨合成代謝作用，增加骨礦物含量 (圖6)及密度（圖7)。骨合成代謝作用存在於皮層（圖8)與松 質（圖9)骨腔室中。該等數據表明所觀察到的MQRG5813對 非成母細胞之Wnt信號傳輸報導體檢定中骨硬化素作用之 抑制效應體現為由於活體内骨硬化素抑制而誘導骨形成反 應。小氣骨合成代謝反應之程度與由高劑量hpTH(i34)誘 導之骨合成代謝相當。
MicroCT分析展示骨小樑體積增加（圖9)主要與跟骨合成 代謝一致之骨小樑結構變厚（圖1〇)相關。 此外，治療達5週之動物之骨礦物密度增加（圖u)e藉由 DEXA離體評估，附肢骨骼（脛骨、股骨）及主軸（腰椎）骨骼 中之骨礦物密度增加（圖12-14)。該作用與每日以1〇()pg/kg hPTH(l-34)治療之陽性對照組中所量測之作用相當。 基於組織形態學螢光染料標記之骨形成動力學分析展示 骨質量增加係歸因於附肢骨骼（圖15)及主軸骨骼（圖18)中 骨形成速率之顯著增長。該等作用與高劑量之ρτΗ(1_34) 之作用相當。骨形成速率增加與礦物沈積速率（圖16)與礦 化表面（圖1 7)二者相關。骨再吸收並未因該治療增加，如 由姓骨細胞表面量測所展示（圖19)。 實例11 :筛檢交又阻斷本發明之骨硬化素結合抗體之抗體 Biacore交又阻斷檢定 134810.doc •125· 200922621 以下般性描述判定抗體或其他結合劑是否交又阻斷或 能夠交又阻斷本發明之抗體的合適Biacore檢定。應瞭解該 檢定可用於本文所述之任何骨硬化素結合劑。 根據製造商之建議操作Biacore機（例如BIAcore 3000)。 骨硬化素可與（例如）CM5 8丨扣01^晶片經由常規使用之胺 偶合化學（例如EDC-NHS胺偶合）偶合以產生骨硬化素塗佈 表面。為獲得可量測水準之結合，通常可使2〇〇_8〇〇共振 單位之骨硬化素與晶片偶合（該量產生可量測之結合水準 且同時易於為所用測試試劑之濃度飽和）。 使骨硬化素與BIAcore晶片連接之替代性方法為藉由使 用經標記'’型式之骨硬化素，例如N末端或c末端His-標記 之骨硬化素。在該形式中，使抗His抗體與Biacore晶片偶 合’且隨後使His-標記之骨硬化素通過晶片表面且為抗His 抗體捕獲。 將欲評定彼此交叉阻斷之能力的兩種抗體以化學計量量 (例如莫耳比1:1)之結合位點在合適緩衝液中混合以產生測 試混合物。所用緩衝液通常為蛋白質化學中通常使用之緩 衝液’諸如 PBS(136 mM NaCl、2_7 mM KC1、10 mM Na^PO4、1.76 mM KH2P〇4，PH 7.4)。當基於結合位點計 算激度時，假定抗體之分子量為抗體之總分子量除以該抗 體上標乾（亦即骨硬化素）結合位點數目。 測試混合物中各抗體之濃度應足夠高以確保結合於 BIAcore晶片上之骨硬化素分子上對於該抗體之結合位點 飽和。混合物中之抗體為相同莫耳濃度（以結合計）且該濃 134810.doc -126- 200922621 度通常介於1·〇 mM與1.5 mM之間（以結合位點計）。 亦製備單獨含有獨立抗體之獨立溶液。用於該等獨立溶 液之緩衝液應為與測試混合物所用相同之緩衝液且為相同 濃度。 使測試混合物通過骨硬化素塗佈之BIAc〇re晶片且記錄 ° 此後藉由以（例如）酸（諸如30 mM HC!丨）處理晶片約1 刀#里來移除經結合之抗體。重要的為不損壞與晶片結合之 骨硬化素分子。 隨後使單獨第一抗體之溶液通過骨硬化素塗佈表面且記 錄結合。此後，處理晶片以在不損壞晶片結合之骨硬化素 的隋;兄下移除所有經結合之抗體（例如經由上述酸處理）。 隨後使單獨第二抗體之溶液通過骨硬化素塗佈表面且記 錄結合之量。 最大理論結合可定義為各抗體獨立地與骨硬化素結合之 總和。隨後將其與所量測抗體混合物之實際結合相比。若 實際結合低於理論結合，則兩種抗體彼此交叉阻斷。 基於ELISA之交又阻斷檢定 抗骨硬化素抗體或另一骨硬化素結合劑之交叉阻斷亦可 藉由使用ELISA檢定偵測。 ELISA檢定之一般原理涉及將抗骨硬化素抗體塗佈於 LISA板之孔上。隨後添加過量的溶液形式（亦即不與 ELISA板結合）之可能交又阻斷之第二抗骨硬化素抗體。隨 後將有限量之骨硬化素添加至孔中。 塗佈於孔上之抗體與溶液形式之抗體將競爭結合有限數 134810.doc -127- 200922621 目之骨硬化素分子。隨後洗滌培養板以移除未與所塗佈抗 體結合之骨硬化素且亦移除第二溶液相抗體以及第二溶液 相抗體與骨硬化素之間所形成的任何複合物。隨後使用適 當骨硬化素偵測試劑量測經結合之骨硬化素之量。能夠交 又阻斷經塗佈抗體之溶液形式之抗體應能夠使經塗佈抗體 可結合之骨硬化素分子數目相對於在不存在第二溶液相抗 體的情況下經塗佈抗體可結合之骨硬化素分子數目降低。 該檢定在下文中對於稱為Ab-X及Ab-Y之兩種抗體進一 步進行更詳細描述。在選擇Ab_x為經固定抗體的情況下， 將其塗佈於ELISA板之孔上，之後，將培養板以合適阻斷 溶液阻斷以最小化隨後添加之試劑的非特異性結合。隨後 將過量Ab-Y添加至ELIS A板中以使每孔Ab_Y骨硬化素結合 位點之莫耳數高於塗佈ELISA板期間每孔所用Ab_x骨硬化 素結合位點之莫耳數至少1 〇倍。隨後添加骨硬化素以使每 孔所添加骨硬化素之莫耳數低於用於塗佈各孔之Ab_x骨硬 化素結合位點之莫耳數至少25倍。培育合適時段之後，洗 滌ELISA板且添加骨硬化素偵測試劑以量測由經塗佈抗骨 硬化素抗體（在該情況下為Ab_X)特異性結合之骨硬化素之 量。該檢定之背景信號定義為在具有經塗佈抗體（在該情 況下為Ab-X)、第二溶液相抗體（在該情況下為八^丫）、單 獨骨硬化素緩衝液（亦即無骨硬化素）及骨硬化素偵測試劑 之孔中所獲得之信冑。該檢定之陽性對照信冑定義為在具 有經塗佈抗體（在該情況下為Ab_X)、單獨第二溶液相抗體 緩衝液（亦即無第二溶液相抗體）、骨硬化素及骨硬化素價 i348I0.doc -128- 200922621 測試劑之孔中所獲得之信號。ELISA檢定需要以一定方式 進行以便具有至少6倍於背景信號之陽性對照信號。
為避免來源於選擇何種抗體用作經塗佈抗體且何種抗體 用作第二（競爭）抗體之任何人為假像（例如Ab-X與Ab-Y之 間對骨硬化素顯著不同之親和力），交叉阻斷檢定需要以 兩種形式進行：1)形式1為Ab-X為塗佈於ELISA板上之抗 體且Ab-Y為溶液形式之競爭抗體，及2)形式2為Ab-Y為塗 佈於ELISA板上之抗體且Ab-X為溶液形式之競爭抗體。 實例12 :偵測MOR05813_IgG2X對LRP6之SOST結合之作 用的ELISA
LRP6/骨硬化素ELISA 將未經處理之96孔微量滴定板每孔以100 μΐ在PBS中稀 釋之 LRP6/Fc(l pg/ml, R&D Systems，目錄號 1505-LR)塗 佈。作為非特異性結合（NSB)之對照，少數孔每孔以1〇〇 μΐ PBS填充。將培養板以塑膠薄膜覆蓋且在室溫下培育隔 夜。塗佈之後，將培養板每孔以200 μΐ於PBS中之0.05%吐 溫20(Fluka，目錄號93773)洗滌3次且藉由每孔添加300 μΐ 於TBS中之SuperBlockP且斷緩衝液（Pierce，目錄號37535) 將孔在37。(：下阻斷1 h。培育之後，移除阻斷溶液且每孔添 加100 μΐ於PBS中之1% BSA中稀釋之骨硬化素（大腸桿菌來 源，Novartis ; 1-1000 ng/ml)。將培養板在室溫下培育2 h，隨後以每孔200 μΐ於PBS中之0.05%吐溫20洗滌3次。之 後，每孔添加100 μΐ於PBS中之1% BSA中稀釋之抗骨硬化 素抗體（1 pg/ml)且將培養板在室溫下培育2 h，隨後以每孔 134810.doc •129· 200922621 200 μΐ於PBS中之0.05%吐溫20洗滌3次。最後，在室溫下 每孔添加100 μΐ於PBS中之10/〇 BSA(Sigma目錄號：A-7888) 中稀釋之ALP結合之抗山羊IgG Ab(l:5000; Sigma目錄號A-7888)歷時1 h且隨後將培養板以每孔200 μΐ於PBS中之 0.05%吐溫20洗滌3次。為測定ALP，將每孔100 μΐ ALP受 質（Sigma，目錄號S0942)溶液（每5 ml二乙醇胺受質緩衝液 (lx)l錠；Pierce，目錄號34064)添加至培養板中歷時90 min且在405 nm下量測光學密度。 親本及親和力成熟Fab在LRP6/骨硬化素ELISA中之活性 LRP6/骨硬化素ELISA係基於骨硬化素結合LRP6之能 力。為進一步表徵所產生之Fab，在該檢定中測試所選Fab 及IgG。在R&D之抗骨硬化素抗體（1000 ng/ml=約7 nM)存 在下，與對照相比，骨硬化素（0.9 nM)與LRP6之結合被抑 制68%(數據未展示）。在90 nM下MOR〇5 813_IgG2X抑制骨 硬化素與LRP6之結合達90%，而用作陰性對照之抗溶菌酶 IgG對骨硬化素與LRP6之結合無效（圖20)。 實例13 :使用MOR05813共同治療 MOR05813 +唑來膦睃 將八月齡雌性OF 1/IC小鼠（n= 10/組，Charles River, France)切除卵巢以藉由剝奪雌激素誘導骨質流失或保持完 整。向動物每週兩次靜脈内投與抗骨硬化素抗體 MOR05 813(24 mg/kg，h/mIgG2a)或對照抗體（抗 PC-h/mIgG2a，完整及OVX對照組）。其他組接受單一施用單 獨唑來膦酸（100 Kg/kg)或與抗骨硬化素抗體MOR05813組 134810.doc -130· 200922621 合施用。抗體治療持續3·5週（施用7次）。 在印巢切除術之前藉由周邊定量電腦斷層攝影術（pQCT) 量測動物之脛骨質量及幾何尺寸。根據體重及脛骨總骨礦 物密度將動物均句地m治療期結束時評估骨礦物密 度、質量及幾何尺寸變化。 結果表示為平均值+/_SEM。使用RS1(系列1999，
Wmdows ’ Domain Manufacturing Corp·，USA)進行統計分 析。對數據進行單因子變異數分析（AN〇VA)。藉由Levene F-檢驗測試變異數相等性且使用B〇nferr〇ni調整之 檢驗測試各組之間的差異。測試治療組與對照抗體治療 OVX組之差異顯著性（ρ<.〇5*，ρ<；.〇ι**)。 老齡小鼠中卵巢切除術誘導之骨質流失可藉由抗體治療 阻斷（圖21)。當該抗體與單一靜脈内注射雙膦酸鹽唑來膦 酸組合使用時，如由總骨礦物含量（圖21 A)及密度（圖21 B)增加以及皮層厚度（圖21 c)及松質骨礦物密度（圖21 D) 增加所指示阻斷骨質流失且誘導骨增加。 MORO5813 +阿侖膦醮盥預治療 向 4.5 月齡雌性 0F1/IC 小鼠（n=1〇/組，Charles River， France)每週兩次靜脈内投與抗骨硬化素抗體m〇r〇5813(i〇 mg/kg，h/mIgG2a)或對照抗體（抗 _pc_mIgG2a，完
整及OVX 對照組）。其他組接受7週阿侖膦酸鹽預治療（4微克/公斤/ 曰；5日/週）隨後接受對照抗體或抗骨硬化素抗體 MOR05813。抗體治療持續3.5週（施用7次）。 在開始抗體治療之前藉由周邊定量電腦斷層攝影術 134810.doc * 131 - 200922621 (pQCT)量測動物之脛骨質量及幾何尺寸。根據體重及脛骨 總骨礦物密度將動物均勻分組。在治療階段期時評估骨礦 物密度、質量及幾何尺寸變化。 結果表示為平均值+/-SEM。使用RS1(系列1999， Windows 5 Domain Manufacturing Corp., USA)進行統計分 析。對數據進行單因子變異數分析（ANOVA)。藉由Levene F-檢驗測試變異數相等性且使用Bonferroni調整之Dunnett 檢驗測試各組之間的差異。測試阿侖膦酸鹽預治療組與未 接受預治療之組之差異顯著性（p<.〇5*，p<.01 **)。 以雙膦酸鹽阿侖膦酸鹽長期預治療對抗骨硬化素 MOR058 13之骨合成代謝作用無負面影響，如由總骨礦物 含量（圖22 A)及密度（圖22 B)增加以及皮層厚度（圖22 C)及 松質骨礦物密度（圖22 D)增加所反映。由於雙膦酸鹽之抗 再吸收特性持續至投藥之後，觀察到總骨礦物含量（圖22 A)及皮層厚度（圖22 C)增加。
MOR05813 + DKK1 或 hPTH 向六月齡雌性裸鼠（n = 8/組）每週兩次靜脈内投與媒劑、 抗骨硬化素抗體MOR05813(10、20及 40 mg/kg，IgG2)、抗 Dkkl 抗體（10 mg/kg，IgGl)、hPTH(l-34)(100 pg/kg)或其 組合。抗體治療持續4週（施用8次）。 在治療之前藉由周邊定量電腦斷層攝影術（pQCT)量測動 物之脛骨質量及幾何尺寸。根據體重及脛骨總骨礦物密度 將動物均勻分組。在治療期結束時評估骨礦物密度、質量 及幾何尺寸變化。 134810.doc -132- 200922621 結果表示為平均值+/_SEM。使用RS1 (系列MM，
Windows，Domain Manufacturing Corp.，USA)進行統計分 析。對數據進行單因子變異數分析（ANOVA)。藉由Levene F-檢驗測武變異數相等性且使用B〇nferr〇ni調整之Dunnett 檢驗測試各組之間的差異。測試各組與媒劑治療組之差異 顯著性（p<.05*，p<.01 **)。 骨合成代謝作用隨抗骨硬化素MOR058 1 3劑量增加（圖 23)。與抗Dkkl抗體共同治療使得總骨礦物含量（圖23 A)及 密度（圖23 B)及皮層厚度（圖23 C)增加改良且松質骨礦物 密度協同增加（圖23 D)。與hPTH(l-34)共同治療使得所有 量測參數協同增加（圖23 A-D)。 參考文獻
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Asn 15 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213〉智人 <400> 2
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 15 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 , <400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Asn 15 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213〉 智人 <400> 4
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 15 10 <210> 5 134810-序列表.doc 200922621 <211〉 10 <212> <213> PRT 智人 <400> 5
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 6 10 PRT 智人 <400> 6
Gly Phe Thr Phe Arg Ser ,His Trp Leu Ser 1 5 10 . <210〉 C <211> ' <212〉 <213> <400> 7 10 PRT 智人 7
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 8 10 PRT 智人 <400> 8
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 / 、 <210> <211> <212> <213> 9 10 PRT 智人 <400> 9
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser
1 5 10 <210> <211> <212> 10 10 PRT 134810·序列表.doc -2- 200922621 <213> 智人 <400> 10
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 11 10 PRT 智人 <400> 11
Gly Phe Thr Phe Arg Ser His Trp Leu Ser
1 5 10 <210> <211> <212> 12 20 PRT <213〉 智人 <400> 12
Trp Val Ser Phe lie Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 15 10 15
Ser Val Lys Gly 20 <210> <211> <212> <213> 13 20 PRT 智人 <400> 13
Trp Val Ser Asn lie Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15
Ser Val Lys Gly 20 <210> <211> <212> <213> 14 20 PRT 智人 <400> 14
Trp Val Ser Phe lie Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp 134810-序列表.doc 200922621 15 10 15
Ser Val Lys Gly 20 <210> <211> <212> <213> 15 20 PRT 智人 <400> 15
Trp Val Ser Asn lie Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15
Ser Val Lys Gly 20 f <210> ' <211> <212> <213> 16 19 PRT 智人 <400> 16
Trp Val Ser Val Thr Gly Val His Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15
Val Lys Gly <210> 17 <211> <212> <213> 19 PRT 智人 , <400> 17
Trp Val Ser Val lie Gly Asn Trp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15
Val Lys Gly <210> 18 <211> <212> <213> 19 PRT 智人 4- 134810-序列表.doc 200922621 <400> 18
Trp Val Ser Val Thr Thr His Gin Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15
Val Lys Gly <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> 智人 <400> 19
Trp Val Ser Ala Thr Asn Arg Tyr Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15
Val Lys Gly <210> 20 <211〉 20 <212> PRT <213> 智人 <400> 20
Trp Val Ser Asn lie Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 15 10 15
Ser Val Lys Gly 20 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> 智人 <400> 21
Trp Val Ser Val lie Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15
Val Lys Gly <210> 22 <211> 19 134810-序列表.doc 200922621 <212> PRT <213> 智人 <400> 22
Trp Val Ser Val 工le Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 15 10 15
Val Lys Gly <210> 23 <211> <212> <213> 15 PRT 智人 <400> 23
Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp Phe 1 5 10 15 f <210> <211> 24 8 <212> <213> PRT 智人 <400> 24
Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> <211> <212> <213> 25 15 PRT 智人 <400> 25
Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp Phe r l 5 10 15 <210> <211> 26 8 <212> <213> PRT 智人 <400> 26
Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 6- 134810-序列表.doc 200922621 V. <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 27 Asp Thr :Tyr Leu His 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 28 Asp Thr Tyr Leu His 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 29 Asp Thx Tyr Leu His 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 30 Asp Thr Tyr Leu His 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 31 Asp Thr Tyr Leu His 1 5 <210> 32 <211> 8 134810-序列表.doc 200922621 <212> PRT <213> 智人 <400> 32
Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> 智人 <400> 33
Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 34
Ser Gly Asp Asn lie Gly Ser Phe Tyr Val His 1 5 10 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> 智人 <400> 35
Trp Val Ser Asn 工le Asn Tyr Asp Gly Ser 1 5 10 Ser Val Lys Gly 20 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 36 Ser Gly Asp Asn lie Gly Ser Phe Tyr Val 1 5 10 His
Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp 15 134810-序列表.doc 200922621 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> 智人 <400> 37
Ser
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp lie Asn Asp Val 15 10 <210> 38 <211> 14 <212> PRT <213〉 智人 <400> 38
Ser
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp lie Asn Asp Val 15 10 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> 智人 <400> 39 Thr Gly 1 r Thr <210> 40 <211> 14 <212> PRT <213> 智人 <400> 40 Thr Gly Thr 1 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> 智人 <400> 41 Thr Gly Thr 1 <210> 42 <211> 14
Ser 10 10 10
Ser
Ser 134810-序列表.doc 200922621 <212> PRT <213> 智人 <400> 42
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp lie Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> <211> 43 14 <212> PRT <213〉 智人 <400> 43
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp lie Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> <211> f <212> ^ <213> 44 14 PRT 智人 <400> 44
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp lie Asn Asp Val Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 45 11 PRT 智人 <400> 45
Leu Val 工le Tyr Asp Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 / <210> \ · <211> <212> <213> 46 11 PRT 智人 <400> 46
Leu Met lie Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 47 11 PRT 智人 10· 134810-序列表.doc 200922621 f <400> 47 Leu Val lie Tyr 1 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 48 Leu Met lie Tyr 1 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 49 Leu Met .He Tyr
Ser
Ser ίο
Ser 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 50 Leu Met 1 :lie Tyr
Asp Val Asn Asn Arg Pro 5 10
Ser <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 51
Ser
Leu Met lie Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro 15 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 52 -11 - 134810-序列表.doc 200922621
Leu Met lie Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 53 Leu Met :lie Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 54 / Leu Met lie Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> 智人 <400> 55 Leu Met lie Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser 15 10 <210〉 <211〉 <212> <213> 5610ΪΙ /' k. <400> 56 Gly Ser Trp Ala Gly Ser Ser Gly Ser Tyr 1 5 10 <210> 57 <211〉 10 <212> PRT <213〉 智人 <400> 57 Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 134810-序列表.doc 12- 200922621 15 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 58
Ala Ser Trp Thr Gly Val Glu Pro Asp Tyr 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 59
Gin Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Glu 15 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 60
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 61
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 15 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> 智人 <400> 62
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 -13- 134810-序列表.doc 200922621 <210> 63 <211> <212> <213> 10 PRT 智人 <400> 63
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 64 10 PRT 智人 <400> 64
Ser Thr Tyr Asp Gly Pro Gly Leu Ser Glu 1 5 10 { <210> ' <211> <212> <213> 65 10 PRT 智人 <400> 65
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 66 10 PRT 智人 <400> 66
Ser Ser Tyr Gly Glu Ser Leu Thr Ser Tyr 1 ( 5 10 \ <210> <211> <212> <213> 67 124 PRT 智人 <400> 67
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 14- 134810-序列表.doc 200922621 20 25 30
Val Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Phe lie Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp 100 105 110
Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 117 <212> PRT <213> 智人 <400> 68
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 \
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Asn 工le Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 •15· 134810-序列表.doc 200922621
Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 124 <212> PRT <213> 智人 <400> 69
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Val Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Phe lie Ser Gly Asp Ser Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Thr Phe Met His Gly His Leu Gly Gly Gly Leu Ser Met Asp 100 105 110 i ;
Phe Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 117 <212> PRT <213> 智人 <400〉 70
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 16- 1348丨0·序列表.doc 200922621
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Asn lie Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 116 <212> PRT <213> 智人 <400> 71
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val Thr Gly Val His Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 17- 134810-序列表.doc 200922621
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 116 <212> PRT <213> 智人 <400> 72
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 /
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Gly Asn Trp Gly Asp Thr Tyr Tyr 7Vla Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Asp Thr Tyr Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 116 <212> PRT <213> 智人 <400> 73 -18· 134810-序列表.doc 200922621
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val Thr Thr His Gin Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 /.
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Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30
Trp Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
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Ser Val lie Thr Pro Tyr Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 -2!- 134810-序列表.doc 200922621
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Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Thr Tyr Asp Gly Pro 85 90 95
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atggcttggg gtgcagctgg tgcgccgcca ggcaagggcc gacagcgtga cagatgaaca ctgcacttcg ggcccatccg ctgggctgcc gctctgacca ctcagcagcg gtagatcaca gagtgcccac aaacccaagg gtgagccacg aatgccaaga ctcaccgttg aaaggcctcc tgtggacctt tcgagagcgg gcggcttcac tggaatgggt agggccggtt gcctgcgggc actactgggg tcttccccct tggtcaagga gcggcgtgca tggtgacagt agcccagcaa cgtgcccagc acaccctcat aagaccccga caaagccacg tgcaccagga cagcccccat gccattcctg cggagggctg cttcagaagc gtccaacatc caccatcagc cgaggacacc ccagggcacc ggcgccctgc ctacttcccc caccttccca gccctccagc caccaaggtg accacctgtg gatctcccgg ggtccagttc ggaggagcag ctggctgaac cgagaaaacc atggcagctg gtgcagcctg cactggctgt aactacgacg cgggacaaca gccgtgtact ctggtcaccg tccaggagca gaaccggtga gctgtcctac aacttcggca gacaagacag gcaggaccgt acccctgagg aactggtacg ttcaacagca ggcaaggagt atctccaaaa cccaaggtgt gcggcagcct cctgggtgcg gcagcagcac gcaagaacac actgcgccag tctcctcagc cctccgagag cggtgtcgtg agtcctcagg cccagaccta ttgagcgcaa cagtcttcct tcacgtgcgt tggacggcgt cgttccgtgt acaagtgcaa ccaaagggca ccaggcccag gagactgagc gcaggcccct ctactacgcc cctgtacctg ggacacctac ttccaccaag cacagcggcc gaactcaggc actctactcc cacctgcaac atgttgtgtc cttcccccca ggtggtggac ggaggtgcat ggtcagcgtc ggtctccaac gccccgagaa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 -81 - 134810-序列表.doc 200922621 ccacaggtgt acctgcctgg cagccggaga ctctacagca tccgtgatgc ggtaaatga acaccctgcc tcaaaggctt acaactacaa agctcaccgt atgaggctct cccatcccgg ctaccccagc gaccacacct ggacaagagc gcacaaccac gaggagatga gacatcgccg cccatgctgg aggtggcagc tacacgcaga ccaagaacca tggagtggga actccgacgg aggggaacgt agagcctctc ggtcagcctg gagcaatggg ctccttcttc cttctcatgc cctgtctccg 1140 1200 1260 1320 1380 1389 <210> 142 <211> 1386 <212> DNA <213> 智人 <400> 142 /. atggcttggg gtgcagctgg tgcgccgcca ggcaagggcc agcgtgaagg atgaacagcc cacttcgact ccatccgtct ggctgcctgg ctgaccagcg agcagcgtgg gatcacaagc tgcccaccgt cccaaggaca agccacgaag gccaagacaa accgttgtgc ggcctcccag caggtgtaca tgtggacctt tcgagagcgg gcggcttcac tggaatgggt gccggttcac tgcgggccga actggggcca tccccctggc tcaaggacta gcgtgcacac tgacagtgcc ccagcaacac gcccagcacc ccctcatgat accccgaggt agccacggga accaggactg cccccatcga ccctgccccc gccattcctg cggagggctg cttcagaagc gtccgtgatc catcagccgg ggacaccgcc gggcaccctg gccctgctcc cttccccgaa cttcccagct ctccagcaac caaggtggac acctgtggca ctcccggacc ccagttcaac ggagcagttc gctgaacggc gaaaaccatc atcccgggag atggcagctg gtgcagcctg cactggctgt accccctacg gacaacagca gtgtactact gtcaccgtct aggagcacct ccggtgacgg gtcctacagt ttcggcaccc aagacagttg ggaccgtcag cctgaggtca tggtacgtgg aacagcacgt aaggagtaca tccaaaacca gsgstgsccd cccaaagtgt gcggcagcct cctgggtgcg gcgacaccta agaacaccct gcgccaggga cctcagcttc ccgagagcac tgtcgtggaa cctcaggact agacctacac agcgcaaatg tcttcctctt cgtgcgtggt acggcgtgga tccgtgtggt agtgcaaggt aagggcagcc agaaccaggt ccaggcccag gagactgagc gcaggcccct ctacgccgac gtacctgcag cacctacctg caccaagggc agcggccctg ctcaggcgct ctactccctc ctgcaacgta ttgtgtcgag ccccccaaaa ggtggacgtg ggtgcataat cagcgtcctc ctccaacaaa ccgagaacca cagcctgacc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 82- 134810-序列表.doc 200922621 tgcctggtca ccggagaaca tacagcaagc gtgatgcatg aaatga aaggcttcta actacaagac tcaccgtgga aggctctgca ccccagcgac cacacctccc caagagcagg caaccactac atcgccgtgg atgctggact tggcagcagg acgcagaaga agtgggagag ccgacggctc ggaacgtctt gcctctccct caatgggcag cttcttcctc ctcatgctcc gtctccgggt 1200 1260 1320 1380 1386 <210> 143 <211> 1386 <212> DNA <213> 智人 <400> 143 atggcttggg tgtggacctt gccattcctg atggcagctg cccaaagtgt ccaggcccag 60 gtgcagctgg tcgagagcgg cggagggctg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc 120 tgcgccgcca gcggcttcac cttcagaagc cactggctgt cctgggtgcg gcaggcccct 180 ggcaagggcc tggaatgggt gtccgtgatc accccctacg gcgacaccta ctacgccgac 240 agcgtgaagg gccggttcac catcagccgg gacaacagca agaacaccct gtacctgcag 300 atgaacagcc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggga cacctacctg 360 cacttcgact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc 420 ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccagct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgacagtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 660 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 720 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 780 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 840 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 900 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 960 accgttgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1020 ggcctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1080 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1140 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1200
•83· 134810-序列表.doc 200922621 ccggagaaca tacagcaagc gtgatgcatg aaatga actacaagac tcaccgtgga aggctctgca cacacctccc caagagcagg caaccactac atgctggact tggcagcagg acgcagaaga ccgacggctc ggaacgtctt gcctctccct cttcttcctc ctcatgctcc gtctccgggt 1260 1320 1380 1386 <210> 144 <211> 393 <212> DNA <213> 智人 <400> 144 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag gccgatatcg aactgaccca gccgccttca gtgagcgttg caccaggtca gaccgcgcgt atctcgtgta gcggcgataa tattggttct ttttatgttc attggtacca gcagaaaccc gggcaggcgc cagttcttgt gatttatgat gataataatc gtccctcagg catcccggaa cgctttagcg gatccaacag cggcaacacc gcgaccctga ccattagcgg cactcaggcg gaagacgaag cggattatta ttgcggttct tgggctggtt cttctggttc ttatgtgttt ggcggccgca cgaagttaac cgttcttggc cag <210> 145 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 60 120 180 240 300 360 393 <400> 145 atgagtgtgc gacatcgccc agctgcaccg caccccggca agcaaccggt caggccgagg gtgtttggcg actctgttcc ataagtgact aaggcgggag tcactcaggt tgacccagcc gcaccagcag aggcccccaa tcagcggcag acgaggccga gcggaaccaa cgccctcctc tctacccggg tggagacaac cctggcgttg cgccagcgtg cgacgtgggc gctgatgatc caagagcggc ctactactgc gcttaccgtc tgaggagctt agccgtgaca cacaccctcc ctgctgctgt agcggcagcc gacatcaacg tacgacgtga aacaccgcca agcagctacg ctaggtcagc caagccaaca gtggcctgga aaacaaagca ggcttacagg ctggccagag acgtgagctg acaaccggcc gcctgaccat gcgagagcct ccaaggctgc aggccacact aggcagatag acaacaagta tacgcgttgc catcaccatc gtatcagcag cagcggcgtg cagcggcctc gaccagctac cccctcggtc ggtgtgtctc cagccccgtc cgcggccagc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 -84- 134810-序列表.doc 200922621 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 146 <211> 705 <212> DNA <213> 智人 <400> 146 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgagc tgacccagcc ccccagcgtg agcgtggccc ctggccagac cgcccggatc 120 agctgcagcg gcgacaacat cggcagcttc tacgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 180 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgac aacaaccggc ccagcggcat ccccgagcgg 240 ttcagcggca gcaacagcgg caacaccgcc accctgacca tcagcggcac ccaggccgag 300 gacgaggccg actactactg cgccagctgg accggcgtgg agcccgacta cgtgtttggc 360 ggcggaacaa agcttaccgt cctaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 420 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 480 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 540 gtggagacaa ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 600 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 660 gggagcaccg tggaaaagac agtggcccct acagaatgtt catag 705 <210> 147 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 <400> 147
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ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 148 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 <400> 148 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 149 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 <400> 149 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 134810-序列表.doc -86- 200922621 caggccgagg acgaggccga ctactactgc gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt ataagtgact tctacccggg agccgtgaca aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca <210> 150 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 <400> 150 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg r · 、 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc caccccggca aggcccccaa gctgatgatc agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc caggccgagg acgaggccga ctactactgc gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt ataagtgact tctacccggg agccgtgaca aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg / acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca V ' <210> 151 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 <400> 151 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 gtggccccta cagaatgttc atag 714 ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 gtggccccta cagaatgttc atag 714 ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 87- 134810-序列表.doc 200922621 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctacg gcgagagcct gaccagctac 360 gtgtttggcg gcggaaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 <210> 152 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 <400> 152
atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc 60 gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc 120 agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag 180 caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg 240 agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc 300 caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcacctacg acggccctgg cctgagcgag 360 gtgttcggcg gagggaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 420 actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 480 ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 540 aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 600 agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 660 acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag 714 0 12 3 1- 1 T~ 2 2 2 2 < < V <
3 4 A人 <400> 153 134810-序列表.doc 88 · 200922621 atgagtgtgc tcactcaggt gacatcgccc tgacccagcc agctgcaccg gcaccagcag caccccggca aggcccccaa agcaaccggt tcagcggcag caggccgagg acgaggccga gtgttcggcg gagggaccaa actctgttcc cgccctcctc ataagtgact tctacccggg aaggcgggag tggagacaac agctatctga gcctgacgcc acgcatgaag ggagcaccgt cctggcgttg ctgctgctgt cgccagcgtg agcggcagcc cgacgtgggc gacatcaacg gctgatgatc tacgacgtga caagagcggc aacaccgcca ctactactgc agcacctacg gcttaccgtc ctaggtcagc tgaggagctt caagccaaca agccgtgaca gtggcctgga cacaccctcc aaacaaagca tgagcagtgg aagtcccaca ggaaaagaca gtggccccta ggcttacagg tacgcgttgc ctggccagag catcaccatc acgtgagctg gtatcagcag acaaccggcc cagcggcgtg gcctgaccat cagcggcctc acggccctgg cctgagcgag ccaaggctgc cccctcggtc aggccacact ggtgtgtctc aggcagatag cagccccgtc acaacaagta cgcggccagc gaagctacag ctgccaggtc cagaatgttc atag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 714
<210> 154 <211> 714 <212> DNA <213> 智人 <400> 154 atgagtgtgc tcactcaggt cctggcgttg ctgctgctgt ggcttacagg tacgcgttgc gacatcgccc tgacccagcc cgccagcgtg agcggcagcc ctggccagag catcaccatc agctgcaccg gcaccagcag cgacgtgggc gacatcaacg acgtgagctg gtatcagcag caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtga acaaccggcc cagcggcgtg agcaaccggt tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctc caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcacctacg acggccctgg cctgagcgag gtgttcggcg gagggaccaa gcttaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc aaggcgggag tggagacaac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc agctatctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc acgcatgaag ggagcaccgt ggaaaagaca gtggccccta cagaatgttc atag <210> 155 134810-序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 714 -89· 200922621 <211> 213 <212> PRT <213> 智人 <400> 155
Met Gin Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Val Cys Leu Leu Val His Thr 15 10 15
Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gin Gly Trp Gin Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30
Ala Thr Glu lie lie Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45
Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60
Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80
Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 90 95
Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gin Cys Gly Pro Ala 100 105 110
Arg Leu Leu Pro Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 115 120 125
Gly Pro Asp Phe Arg Cys lie Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gin Arg Val 130 135 140
Gin Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg 145 150 155 160
Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gin 165 170 175
Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gin Lys Gly 180 185 190
Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gin Ala Glu 195 200 205 90- 134810-序列表.doc 200922621
Leu Glu Asn Ala Tyr 210 <210> 156 <211> 14 <212> PRT <213> 智人 <400> 156
Ala Arg Leu Leu Asn Ala lie Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg 15 10 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> 智人 <400> 157
Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His 15 10 15 <210> 158 <211> 13 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> 蛋白連接子序列 <400> 158
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 l〇 <210> 159 <211> 19 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>蛋白連接子序列 <400> 159
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15
Gly Gly Gly -91 - 134810-序列表.doc 200922621 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 160 taaattatca taaagtccta a <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 161 aggactttat gataatttat t f \ <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 162 atagtggtta aataactcca g <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 163 ggagttattt aaccactatt t <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 164 134810-序列表,doc 200922621 taaattctcg tgatgtgcca t
<210> <211> <212> <213> 165 21 DNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 165 ggcacatcac gagaatttat t
<210> <211> <212> <213> 166 21 DNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 166 tttcttatag cacagctggt t
<210> <211> <212> <213> 167 21 DNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 167 ccagctgtgc tataagaaat t
<210> <211> <212> <213> 168 21 DNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 168 tagacctttc catccacgct g <210> <211> <212> <213> 169 21 DNA 人工 <220> 134810-序列表.doc 21 200922621 <223> siRNA <400> 169 gcgtggatgg aaaggtctat t <210> 170 <211> 29 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> RT-PCT 引子 <400> 170 29 atgcagctcc cactggccct gtgtcttgt <210> 171 <211> 30 <212> DNA <213〉人工 f \ <220> <223> RT-PCR 引子 <400> 171 30 aatcaggccg agctggagaa cgcctactag
134810-序列表_廿〇〇 94·

Claims (1)

  1. 200922621 十、申請專利範圍·· 1. 種針對骨硬化素（sclerostin)多肽（SEQ ID NO: 155)中之 才不乾之分離抗體或包含該抗體之抗原結合部分的功能蛋 白’其特徵在於該抗體或功能蛋白與骨硬化素多肽特異 性結合且可增加哺乳動物之骨形成、骨礦物密度及骨礦 物含量。 2·如請求項丨之抗體或功能蛋白，其特徵在於該抗體或功 能蛋白與該骨硬化素多肽以小於10 nM、較佳小於丨nM 且更佳小於100 pM之KD結合。 3.如請求項丨之抗體或功能蛋白，其特徵在於該抗體或功 月b蛋白在基於細胞之Wnt信號傳輸檢定中可阻斷骨硬化 素之抑制作用。 如明求項3之抗體或功忐蛋白，其特徵在於該抗體或功 能蛋白在HEK293細胞株中在骨硬化素存在下如基於細 胞之Wnt信號傳輸檢定中所測量具有小於丨μΜ、較佳小 於100 ηΜ且更佳小於20 ηΜ之IC5Q值。 5. 2請求項i之抗體或功能蛋白，其特徵在於該抗體或功 能蛋白在基於細胞之礦化檢定中可阻斷骨硬化素之抑制 作用。 6·如請求項5之抗體或功能蛋白，其特徵在於該抗體或功 能蛋白在MC3T3細胞中在骨硬化素存在下如BMp2誘導 之礦化檢定中所測量具有小於i μΜ、較佳小於則nM且 更佳小於200 nM之IC5G值。 7.如請求们之抗體或功能蛋白，其在溶液抑制檢定中抑 134810.doc 200922621 制LRP6/骨硬化素相互作用。 8. 如請求項7之抗體或功能蛋白，其如LRP6/骨硬化素 ELIS A中所測量具有小於丨μΜ、較佳小於丨〇〇 nM、更佳 小於10 nM、更佳小於5 nM、更佳小於3 nM之IC5〇值。 9. 如請求項1之抗體或功能蛋白，其在基於細胞之功能檢 定中可阻斷骨硬化素對BMP6誘導之Smadl磷酸化之抑制 作用。 10. 如凊求項9之抗體或功能蛋白，其胞株中 在月硬化素存在下如BMP6 Smad 1磷酸化檢定中所測量 具有小於1 μΜ、較佳小於500 nM、較佳小於200 nM之 1。5〇 值。 1 h如印求項1之抗體或功能蛋白，其與SEQ ID NO: 155之胺 基酸112與126之間及/或胺基酸16〇與174之間的骨硬化素 區域結合，且較佳與把(^1〇]^〇:156與兕(511)1^0:157二 者結合。 12. 如請求項丨之抗體或功能蛋白’其包含至少一個互補決 定（CDR)序列與SEQ id N〇S:l-66中之至少一個CDR具有 至少 60、70、80、90或 95。/。一 致性。 13. 如請求項丨之抗體或功能蛋白，其包含至少一個重鏈區 C〇R3與—個選自由SEQ ID NO:25-33組成之群之C〇R3序 列具有至少60、70、80、90或95%—致性。 14. 如請求項1之抗體或功能蛋白，其包含VH多肽序列與 SEQ ID ΝΟ··69-77中之至少一者具有至少6〇 ' 7〇、8〇、 9〇、95或1〇〇。/。序列一致性。 134810.doc 200922621 1 5.如請求項1之抗體或功能蛋白，其包含Vl多肽序列與SEQ ID NO:80-88中之至少一者具有至少6〇、7〇、8〇、90、95 或1 00%序列一致性。 1 6·如請求項1之抗體或功能蛋白，其包含Vl多肽序列與SEq ID NO 80-88中之至少一者具有至少6〇、7〇、8〇、90、95 或100%序列一致性，及VH多肽序列與SEQ ID NO:69-77 中之至少一者具有至少60、70、80、90、95或100%序列 —致性〇 1 7.如請求項1之抗體或功能蛋白，其包含：一個重鏈可變 £ COR1包含一個選自由SEQ ID N0s:l-ll組成之群之胺 基酸序列；一個重鏈可變區COR2包含一個選自由SEQ ID NOs:12-22組成之群之胺基酸序列；一個重鏈可變區 COR3包含一個選自由SEQ ID NOs:23-33組成之群之胺基 酸序列；一個輕鏈可變區COR1包含一個選自由SEQ ID NOs:34-44組成之群之胺基酸序歹ij ; 一個輕鏈可變區 c〇R2包含一個選自由SEQ ID NOs:45-55組成之群之胺基 酸序列；及一個輕鏈可變區CDR3包含一個選自由SEQ ID NOs:5 6-66組成之群之胺基酸序列。 18·如請求項1之抗體或功能蛋白，其包含全長重鏈胺基酸 序列與SEQ ID NOs:lll-121中之至少一者具有至少6〇、 70、80、90、95 或 100% 序歹ij 一 致性。 19.如請求項1或18之抗體或功能蛋白，其包含全長輕鏈胺 基酸序列與SEQ ID NOs : 122-132中之至少一者具有至 少 6〇、70、80、90、95或 100%序列一致性。 134810.doc 200922621 20. —種抗體，其包含 (a) SEQ ID NO:113 之重鏈序列及 SEQ ID NO:124 之輕 鍵序列； (b) SEQ ID NO:114 之重鏈序列及 SEQ ID NO:125 之輕 鏈序列； (c) SEQ ID NO:115 之重鏈序列及 SEQ ID NO:126 之輕 鏈序列； (d) SEQ ID NO:116之重鏈序列及 SEQ ID NO:127之輕 鏈序列； (e) SEQ ID NO:117 之重鏈序列及 SEQ ID NO:128 之輕 鏈序列； (【)8£(^10>40:118之重鏈序列及8£(5 10 1^0:129之輕鏈 序列； (g) SEQ ID NO:119 之重鏈序列及 SEQ ID NO:130 之輕 鍵序列； (h) SEQ ID NO:120之重鏈序列及 SEQ ID NO:131 之輕 鏈序列；或 (i) SEQIDNO:121之重鏈序列及SEQIDNO:132之輕鏈 序列。 21. 如請求項1之抗體或功能蛋白，其包含vH及VL序列與至 少一種如請求項20之抗體之VH及VL相應序列具有至少 60 ' 70、80、90、95 或 100%序歹丨J 一致性。 22. 如請求項1之抗體或功能蛋白，其係由至少一種如請求 項20之抗體交又阻斷與骨硬化素結合。 134810.doc 200922621 23. 如請求項1之抗體或功能蛋白，其交又阻斷至少一種如 請求項20之抗體與骨硬化素結合或由至少一種如請求項 20之抗體交又阻斷與骨硬化素結合。 24. 如請求項22或23中任一項之抗體或功能蛋白，其中該交 叉阻斷或被交又阻斷之能力係在BIAc〇re檢定或£〇8八檢 定中侦測。 25. 如請求項丨之抗體或功能蛋白，其係用作藥劑。 26. 一種如請求項K25中任一項之抗體或功能蛋白之用途， 其係用於製備治療骨硬化素所介導或骨硬化素之含量增 加相關之病理學病症的藥劑，該病理學病症例如骨相關 疾病，諸如骨質疏鬆症。 27·如請求項26之用途，其中該骨相關疾病係選自包含以下 之群：原發性及繼發性骨質疏鬆症、骨質減少、骨軟 化、成骨不全(01)、無血管性壞死(骨壞死)、骨折及植 入物癒合(牙植入物及髖植入物)、其他病症所致之骨質 ;失’諸如與勝感染、癌症或關節炎相關之骨質流 失0 28. 種醫藥組合物，其包含如請求項 或功能蛋白。 -25中任一項之抗體 29. 如請求項28之醫藥組合物，其與一 受之滅形劑、稀釋劑或載劑級合。 或多種醫藥學上可接 其另外包含其他活性成 3 0·如請求項28或29之醫藥組合物， 份0 3 1. 一種分離之聚核苷酸序列 其蝙碼如請求項1-25中任一 134810.doc 200922621 項之抗體或功能蛋白 32· —種選殖或表現裁體， 核芽酸序列。 或多個如請求項31之聚 33.如請求項32之載體，其中該載體包含至少—個選自 一54組成之群之序列 選自： CDR區之片段。 王一個 34· —種宿主細胞，复句.一 或表現載體。 ^個如請求項32或33之料 35.:種，如請求項⑵中任—項之抗體或功能蛋白之方 L能蛋Γ料^求項34之宿主細胞及㈣該抗體或 36.如請求項丨之抗體或功能蛋白，其係用於治療或預防骨 ▲素所介導或骨硬化素含量増加相關之病理學病症。 37·如μ求項28或29之醫藥組合物’其係』於治療或預防骨 硬化素所介導或骨硬化素含量增加相關之病理學病症。
    38. -種診斷套組，其包含如請求項⑵中任一項之抗體或 功能蛋白。 39· :種鑑定表現骨硬化素之細胞或組織之方〉去，該方法包 ^吏該細胞或組織與如請求項1-25中任__項之抗體或功 此蛋白接觸’其中該抗體或功能蛋白另外包含可债測標 記0 40. 如吻求項39之方法，其中該標記為放射活性、螢光、磁 性、順磁性或化學發光標記。 41. 種如请求項1-25中任一項之抗體或功能蛋白及⑴唑來 134810.doc 200922621 膦酸（zoledronic acid)、（ii^DKK1 抗體、（⑴）阿侖膦酸 鹽（&1611心01^6)、（丨¥)抗1^11?4抗體、（\^)11?丁11及/或（¥丨）副 甲狀腺素釋放劑（鈣阻滯劑（calcilytics))之用途，其係用 於製備治療骨硬化素所介導或骨硬化素含量增加相關之 病理學病症的藥劑。 42. —種如請求項丨-25中任一項之抗體或功能蛋白之用途， 其係用於製備治療骨硬化素所介導或骨硬化素含量增加 相關之病理學病症的藥劑，其中該藥劑係與（丨）唑來膦 酸、（ii)抗DKK1抗體、（iii)阿侖膦酸鹽、（iv)抗LRP4抗 體、（v)hPTH及/或（vi)副甲狀腺素釋放劑（鈣阻滞劑）結合 使用。 43. —種⑴嗤來膦酸、（ii)抗DKK1抗體、（iii)阿侖膦酸鹽、 (iv)抗LRP4抗體、（v)hPTH及/或（vi)副曱狀腺素釋放劑 (約阻滯劑）之用途’其係用於製備治療骨硬化素所介導 或骨硬化素含量增加相關之病理學病症之藥劑，其中該 藥劑係與如請求項1-25中任一項之抗體或功能蛋白結合 使用。 44. 一種如請求項ι_25中任一項之抗體或功能蛋白之用途， 其係用於製備治療骨硬化素所介導或骨硬化素含量增加 相關之病理學病症的藥劑，其中該患者已預先投與⑴唑 來膦酸' (ii)抗DKK1抗體、（iii)阿侖膦酸鹽、（iv)抗LRP4 抗體、（v)hPTH及/或（Vi)副甲狀腺素釋放劑（鈣阻滯劑）。 45. —種⑴嗤來膦酸、（ii)抗DKK1抗體、（iii)阿侖膦酸鹽、 (iv)抗LRP4抗體、（v)hPTH及/或（Vi)副甲狀腺素釋放劑 134810.doc 200922621 (鈣阻滯劑）之用途，苴政m ^ ^ ± ”係用於製備治療骨硬化素所介導 或骨硬化素含量辨a + ea 3加相關之病理學病症之藥劑，其中該 患者已預先投與如請炎 月衣項1 -25中任一項之抗體或功能蛋 如吻求項41 45中任一項之用途其中該⑽丁^^為⑽丁吹卜 34) ° 47·如請求項41 45中任—項之用途’其中該骨相關疾病為以 下至少一者：原發性及繼發性骨質疏鬆症、骨質減少、 骨軟化、成骨不全（OI)、無血管性壞死（骨壞死）、骨折 及植入物癒合（牙植入物及髖植入物）、其他病症所致之 骨質流失’諸如與HIV感染、癌症或關節炎相關之骨質 流失 ° 134810.doc
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