TW200817524A

TW200817524A - Soybean event 3560.4.3.5 and compositions and methods for the identification and/or detection thereof

Info

Publication number: TW200817524A
Application number: TW096123350A
Authority: TW
Inventors: Robert F Cressman Jr; Anthony D Guida; Christine B Hazel; Jeffrey M Hegstad; Nancy L Henderson; David Hondred; Nancy J Leysens; Zhongsen Li; Mark D Vogt; Natalie N Weber; Aiqui Xing; Cathy Xiaoyan Zhong
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int; Du Pont
Priority date: 2006-06-28
Filing date: 2007-06-27
Publication date: 2008-04-16
Also published as: EP2380987A2; EP2380987A3; WO2008002872A3; US20130252242A1; US7951995B2; CA2655914A1; US20080051288A1; WO2008002872A2; CL2007001904A1; EP2032706A2; US20100184079A1; AR061713A1

Description

200817524 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係屬於分子生物學領域。更明確地，本發明係關於透過表現一種可耐嘉碌塞（glyphosate)序列（sequence) 以及表現一種可财一或多種乙醯乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS)抑制劑之化學作用的序列，而賦予植物具有對多種除草劑之财藥性（herbicide tolerance)的方法及其相關序列。【先前技術】已知外源基因（foreign gene)在植物中的表現受到他們在植物基因體内之位置所影響，或許係因為染色質構造（例如，異染色質）或是轉錄調節片段（例如，增強子）鄰近整合位置（integration site)所致（Weising 等人（1 988) dnw· iiev.

22: 421-47 7)。同時，存在於基因體内不同位置之轉殖基因會以不同方式影響植株的整體表現型 (phennotype)。因此，經常需要筛選大量的轉殖品項（eVents) 以辨認出能夠將所導入基因做最佳表現的轉殖品項。例如，已經在植物與其他生物中發現，不同轉殖品項中導入基因的表現量差異極大。空間上與時間上的表現型態亦有所差異’例如，轉殖基因在不同植物組織中相對表現量上的差異，可能不符合已存在於導入基因構築體（gene construct)中之轉錄調節片段的預期型態。亦發現轉殖基因插入片段能影響内源基因（endogenous gene)的表現。因為這些因素’經常產生數百至數千個不同轉殖品項，需篩選這些轉殖品項找到具有商業用途所欲之轉殖基因表現量與型 1 200817524 態的單一轉殖品項。具有所欲轉殖基因表現量或型態的轉殖品項，藉由利用傳統培育方法的有性異型雜交（sexual outcrossing)，可用於將轉殖基因基因渗入（introgressing) 其他基因背景（genetic backgrounds)。上述雜交之後代可保持最初轉形株（transformant)的轉殖基因表現特徵。此策略係用來確保許多相當適應地方性生長環境之變種（variety) 中基因表現的可靠性。爲了確定有性雜交的後代是否含有關注之轉殖基因，

若能偵測是否有特定轉殖品項存在對於上述目的是有幫助的。此外，偵測特定轉殖品項的方法也有助於合乎法律規早’這些規章要求上市前許可（pre-market approval)與來自基因重組農作物（recombinant crop plants)食品的標記；或用於環境監測，監測田地中作物的特徵或監測來自作物收割的產物；以及用來確保接受管理或契約條款之當事人的承諾。農作物在作物的商業性生產中，樂見能夠輕易地且迅速地由

將是一時留下應用耐田地上雜草則不同除濟兩方不同的與保持的田地種可應未受傷除草劑喷灑除被殺死草劑特面最可存在期有效相中排除無用的植物（即，雜草）。完美的處理用在整個田地上而且僅會排除無用植物同害的農作物之處理。上述處理系統之一包括的農作物，以便在施用耐除草劑之農作物的草劑時，農作物能持續生長而不耐除草劑的或嚴重受損。理想±，上述處理系統可利用性的優點，以便控制雜草並提供靈活性與經能的組合。例如，各個除草劑在田地中具有限，某些除草劑在施加於田地後可持續存在田長的時間，然而其他除草劑則快速地裂解 2 200817524 理想的處理系特定狀況調整統可應用不除草劑的選成4其他與/或無活性的化合物。同的除草劑，以便種植者針對擇〇 W〜雜羊優勢種與偏好的作性差異，$需一種可保護作物種類的地方性與地區該系統可適應特定地帶、地形旬J卓的客製化系統，疋識別提供上述特徵之植物而要月匕物。例如 ^ 復品項的方法盥紐人 J如，亟需可減輕下列事項的 /、、、且ά

法：押告丨丨 , '、°蒦作物與雜草管理方控制田地中雜草所必需應用早&理方 τ雜草所需之除草劑數量；生產作控制田地緩或避免抗除草劑雜草的發展 ^ 需你嘴4出現之方索。需保瘦作物與雜草管理的方法與万案。亟特定昤替★ 〇物’其可針對性鹿用 ”卓相合物並有效地偵測上述之轉殖品項。〜【發明内容】本發明提供耐嘉磷塞/乙醯乳酸轉殖大孔峻口成酶抑制劑之基因 356植株相關的组合物與方法。該組合物包括含有 #予以//品項之大豆植株，該356G.4.3.5轉瘦品項耐藥性。人與至少一乙醯乳酸合成酶抑制型除草劑的體位置。含有3560.4.3.5轉殖品項的大豆植株在所述染色上包括基因體/轉殖基因接合處，該接合處至少具有序列編號1 0也/ j ' "、/或11的聚核苷酸（polynucleotide)序列。進一步裎板# w供寻利寄存（Patent Deposit)編號 PTA-8287 的寄存種早Irk ,, 但丁 /、由此而來的植株、植物細胞、植物部位、榖粒與植物產品。轉殖品項3 560.4.3.5的基因體插入位置之特性提供增強的培育效率且可在培育族群與其後代中使 3 200817524 用分子標記（molecular marker)追縱插入性轉殖基因。提供識別、偵測與應用大豆轉殖品項3560.4.3.5的不同方法與 . 組合物。【實施方式】現將於下文參照附圖更完整地描述本發明，附圖中顯示某些（但不是全部）本發明之實施例。當然，可用許多不同形式具體化這些發明因此不應理解這些發明限於本文所提出之實施例；反而，提供這些實施例以便本揭露能滿足法律上的實用性需求。相同的元件編號在不同圖中代表相同元件。本文所提出之本發明的許多改良與其他實施例使熟悉技術之人士留意與這些發明相關的學說優點（前面描述與相關之圖式所呈現）。因此，可以理解本發明並不限於所揭露的特定實施例，並預期改良與其他實施例將包含於附加的申請專利範圍中。雖然此處應用特定詞彙，但僅以通稱與描述方式應用這些詞彙並不意圖限制。在此提供與耐嘉磷塞/乙醯乳酸合成酶抑制劑之基因轉殖大豆植株有關的組合物與方法。組合物包括具有轉殖品項3560.4.3.5的大豆植株。已經藉由插入嘉碟塞乙醯轉移酶（glyphosate acetyltransferase, glyat) ^ g](來自苔蘚桿菌「//與改變型（modified version) 的大豆乙醢乳酸合成酶基因（g/w-Ar a)，將大豆改良成具有「轉殖品項3560.4.3.5」的大且植株。藉由基因置換（gene shuffling)處理功能上地改善g/jW基因以使嘉碟塞乙酿轉移酶（GLYAT)活性（乙醯化除草劑嘉磷塞）動力學達到最佳 4 200817524 化將以少W基因插入植物中，兮 α，^ i r 該基因透過將嘉磷塞轉換成…、毋的乙醯化形式而賦予對而十鏟柹 ^ 除卓劑活性成分嘉磷塞的 m(ALS)m ^ 產生改良型的乙醯乳酸合成酶（ALb)酵素。乙醯乳酸合 ^ ^ . m 啊馬生物合成支鏈型胺基酸所需的因子且受到某些除草的抑制。gw-ha基因内的改良克服此抑制效果因此提供 ^针對多種乙醯乳酸合成酶抑制型除草劑的耐藥性。因此，呈 — 有轉殖品項3560.4.3.5的大豆植株可忍受真雄塞盘$ ,丨 σ 〃種乙醯乳酸合成酶抑制型除草劑。大豆轉殖品項3S60 4 3 s介#炎絲姑口

Όυ·^·3·5亦稱為轉殖品項 DP-356043-5 或 356043 大豆。將賦予對嘉磷塞與乙醯乳酸合成酶抑制劑财藥性的聚核苷酸連接在同一 DNA構築體上，並插入大豆基因體内特定位置，因而產生3560·4·3·5大豆轉殖品項。含有 3 560.4.3.5轉殖品項的大豆植株在所述染色體位置上包含基因體/轉殖基因接合處，該接合處至少具有序列編號1〇與/或11的聚核苷酸序列。3 560,4,3·5轉殖品項的基因體插入位置之特性提供增強的培育效率且可在培育族群與其後代中使用分子標兄追縱插入性轉道基因。本文提供識別、偵測與應用大豆轉殖品項3560·4·3·5的多種方法與组合物。此處所用之詞彙「轉殖品項3 56〇·4·3.5特性（event 3 560.4.3.5 specific)」代表一種適合用來可區別性地 (discriminatively)識別植物、植物材料或產物（例如但不限於，包含或來自植物材料的食物或飼料產品（包括新鮮或加工））之轉殖品項3 560.4.3.5的聚核苷酸序列。組合物更包括專利寄存編號PTA-82 87的寄存種子與由此而來的植株、植物細胞與種子。申請人（們）已經在 5 200817524 2007年 3月 27日寄存至少 2500顆大豆轉殖品項 3560.4.3.5 種子於美國菌種中心（American Type Culture Collection, ATCC)(Manassas，VA 201 10-2209 USA)，而寄存物編為美國菌種中心寄存編號PTA-8287。依微生物有機體保存專利程序之國際認可布達佩斯協定保存這些寄存件。按照美國專利法第11 2條寄存為必需的，但這些寄存件僅作為方便熟悉技術人士之用而非許可之用。2007 年 3 月 26 日將 Pioneer Hi-Bred International，Inc.( 7250 NW 62nd Avenue，Johnston，Iowa 501 3 1 - 1 000)所保持的種子寄存於美國菌種中心。在專利與商標局長審查申請書與局長指派人士命名的期間，可存取此寄存件（需要要求）。直到申請書中任何專利項通過後，申請人（們）依照美國專利法施行細則第1 · 8 0 8將其開放給公眾，至少2 5 0 0顆寄存於美國囷種中心（1 〇 8 0 1 University Boulevard, Manassas，VA 201 1 0-2209)的大豆轉殖品項 3560·4·3·5 種子樣本（們）。可將大豆轉殖^品項3560.4.3.5的寄存種子保持於美國菌種中心寄存室（一種公開的寄存室）中，長達3〇年的時間或最近請求後5年或該專利可實施的有效期間 (不論哪個較長），且其若在這段期間喪失活性可替換之。此外，申請人（們）需履行美國專利法施行細則第 1·8〇1 -1.809所有的需求，包括提供寄存前該樣品的生存能力指示。申請人（們）並無權力撤回法律施加在生物材料運送或其商業上輸送的任何限制。在依據植物權利保護法 (7 USC第232 1條以及下列）下，申請人（們）不能撤回任何本專利賦予的權力或適用於轉殖品項3 56〇·4·3·5的權力。禁止未授權的種子增殖。即該種子須受到調控。 6 200817524 此處所用之辭彙「大豆（soybean)」意指大豆 max)，且包括所有可與大豆育種的植物變種。此處所用之辭彙「植株（plant)」包括植物細胞、植物器官、植物原生質體（pr〇t〇plasts)、植物細胞培養組織（由此可再生植物）、植物癒合組織、植物叢與植物或植物部位内的完整植物細胞，諸如胚芽、花粉、胚株、種子、葉片、花卉、分枝、果實、莖冑、根部、根尖、花藥等等。預期以榖粒代表商業性種植者為了非增加或繁殖該物種之目的所產生的成熟種子。再生植株的後代、變種與突變體亦包含於本發明的範圍内，先決條件為這些部分包含3 65〇·4·3 5轉殖品%。基因轉殖的「轉殖品項（event)」係藉由下列步驟而產生·以一異源性DNA構築體（們）將植物細胞轉形 (transformation)，該構築體包括含有關注之轉殖基因的核酸表現組合體（expression eassette);將—群利用插入轉殖基因到植物基因體而產生的植物族群加以再生；以及挑選具有插入特定基因體位置特徵之特定植株。一轉殖品項之表現型特徵在於可表現所轉殖基因（們）。在基因層次上，轉殖品項係植物遺傳組成的一部分。詞彙「轉殖品項」亦代表轉形株與包含異源性DNA的另一變種之間有性雜交所產生的後代。即便之後反覆回交至一再現親代 (aarrent parent)，雜交的後代中來自轉形親代的dna插 ^片段與旁側DNA仍會位於相同的染色體位置上。詞彙「轉殖品項」亦代表來自最初轉形株的dna，該dna包括DNA插入片段與緊鄰DNA插入片段的旁側序列，預期藉由讓含t DNA插入片段的親系（叫⑼^ Hne)(例如，最初轉形株與其自交而得的後代）與不含dna插入片段的親 7 200817524 系進行有性雜交’而將該DNA送至一後代（接收包含關注之轉殖基因的DN A插入片段）。此處所用之辭彙「DNA插入片段（insert DNA)」代表表現組合體内用來轉形植物材料之異源性DNA ，而「旁側DNA(flanking DNA)」包括不是天生存在於有機體（例如，植物）内的基因體DNA就是經由轉形處理所導入的外源（異源性）DNA，該外源DNA與原始DNA插入片段分子無關，例如與轉形轉殖品項連結的片段。此處所用之「旁侧區域（flanking region)」或「旁側序列（flanking sequence)」代表至少 20、50、100、200、300、400、1000、 1500、2000、2500或5000鹼基對或更長之序列，且該序列不是位在緊鄰原始外源DNA插入片段分子的上游且與其連續之，就是緊鄰原始外源DNA插入片段分子的下游且與其連續之。3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項之旁侧區域的非限制性實例為序列編號4和5所提出之序列與其變異體及片段。導致隨機插入外源DNA的轉形步驟將造成轉形株含有對每一轉形株而言不同且獨特的旁側區域特徵。經由傳統雜交方法將重組DN A導入植物中時，通常不會改變其旁側區域。轉形株亦包含異源性DNA插入片段與基因體 DNA片段之間、或兩個基因體DNA片段之間、或兩個異源性DNA片段之間的獨特接合點。「接合點（juncti〇n)」為兩個獨特DNA片段結合的位置。例如，接合點存在於DNA 插入片段連結旁側DNA的位置。接合點亦存在於轉形有機體中兩個DNA片段結合之方式與自然有機體中發現有所不同的地方。此處應用的「接合DN A (junction DNA)」 8 200817524

及片段。自3560.4.3.5轉殖品項之接合列編號 1、2、6、1 0、1 1、1 2、 42所提出之序列或其變異體 3560·4·3·5 植株可藉由下列步驟培育：首先讓由

兄所〜除卓劑耐藥性的第一代植株；然後使該第代植株自交’因而產生多個第二代植株；接著由其中挑選出能表現所欲除草劑耐藥性的第二代植株。這些步驟可進一步包括將第一代耐除草劑之植株或第二代耐除草劑之植株與第二大豆植株親系或第三大豆植株親系進于口父因而產生能展現所欲除草劑财藥性的大豆植株。進一步確遇其不需檢驗後代的表現型。可用此文其他地方所揭露之多種方法與組合物來偵測與/或識別3 56〇·4.3 5 轉殖品項。亦了解兩個不同的基因轉殖植株亦可進行有性雜交以產生含有兩個獨立、分別附加的外源基因之後代。適當後代的自交可產生兩個附加外源基因的同型合子植株。亦應理解可回乂於親系植株以及異型雜交（〇ut-cr〇ssing)於非基因轉殖植株，如營養繁殖（vegetative pr〇pagati〇n)。一般用於不同特徵與作物的其他培育方法之描述可於許多參考文獻的其中之一發現，例如 Fehr，in Methods for Cultivar Development, Wilcos J. ed·， 9 200817524

American Society of Agronomy，Madison Wis· (1 987)。詞彙「種質（germplasm)」代表一個體、一群個體、或表現一基因型的一複製株（cl〇ne)、變種、物種或培養株或其遺傳材料。「品系（line)」或「品種（strain)」為相同來源的一群個體’其通常近親交配（inbred)至某種程度且通常為等基因的（isogenic)或接近等基因。近交式（inbred)大豆品系通常發展用來產生大豆雜交種（hybrids)與用來作為培育族群的種質，以產生新穎、可區刀的近交式大豆品系。時常利用近交式大豆品系作為新穎特徵基因滲入的目標，經由傳統培育與/或分子基因滲術近父式大豆品系需為高度同種、同型接合與再生、成為商業性雜交種的親系。可用許多分析方法來測定近乂式μ系的同型合子度（homozyg〇sity)與表現型穩定性。 w司棄「雜交植株（hy bride plants)」代表基因上不同個體之間雜交而得之植株。本發明文中的詞彙「雜交（cr〇ssed* cr〇ss)」意指配 μ 3 ，例如，在植物實例中經由授粉以產生後代（即， 2胞、種子或植株）。在植物實例中，該詞彙包含有性雜父（藉由另一植株對一植株授粉）與自交（自我授粉，即花粉與胚珠來自同一植株）。凋彙「基因滲入（intr〇gressi〇n)」代表將基因座（genetic 1〇Cu〇中所欲之對偶基因（aUele)由一遺傳背景傳送至另遺傳背景。一方法中，可透過兩個親系之間的有性雜交基因滲入所欲之對偶基因，其中該親系至少其中之一在其基因體中具有所欲之對偶基因。 10 200817524 某些實施例中，將賦予本發明之大豆3 560.4·3.5轉殖品項的聚核苷酸設計成一分子堆疊體（molecular stack)。其他實施例中，分子堆疊體更包括至少一額外的聚核苷酸 (賦予對第三種除草劑的耐藥性）。一實施例中，該序列賦予對固殺草（glufosinate)的财藥性’而一特定實施例中’ 該序列包括破絲菌素^乙醯轉移酶〇11(^]111101：]111(^11>^0€()此0113£^36, pat) °

其他實施例中，本發明之大豆3560·4·3·5轉殖品項包括一或多個關注之特徵，而更明確的實施例中，該植株與關注之聚核苷酸序列的任何組合堆疊以產生帶有所欲特徵之組合的植株。此處所用之「特徵（trait)」代表來自一特定序列或序列群組之表現型。例如，耐除草劑的聚核苷酸可與任何其他聚核苷酸（編碼具有除蟲與/或殺蟲活性的多胜肽）堆疊，該多胜肽例如蘇力菌毒性蛋白（描述於美國專利案編號5,366,892 ; 5,747,450 ; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; Geiser 等人（1986) Ge/ie 48: 1 09； Lee 等人（2003) Appl. Environ. Microbiol· 69: 4648-4657 {Vip3A)\ Galitzky ^ A(200 1) Acta Crystallogr. D. 57: 1 1 0 1 - 1 1 09 (Cr：M567);以及

Herman 等人（2004) J. Agric. Food Chem. 52: 2726-2734 、外源凝集素（lectins)(Van Damme 等人（1994) Plant MoL Biol. 24: 825) > 果膠（pentin)(描述於美國專利案編號5,981，722)等等。產生之組合物亦可包括任何一個關注之聚核苷酸的多個複製片段。某些實施例中，大豆3 5 60.4.3.5轉殖品項可與其他耐除草劑特徵堆疊以產生具有進一步改良特性之本發明基 11 200817524 因轉殖植株。可用於上述實施例之其他除草劑耐藥性的聚核苷酸包括那些藉由其他作用模式賦予對嘉磷塞或乙醯乳酸合成酶抑制劑耐藥性的聚核苷酸，舉例來說，例如編碼嘉填塞氧化還原_酵素（〇xid〇-reductase enzyme)的基因’其更完整地描述於美國專利案編號5,776,760與 5,463，175。可與大豆3560.4.3.5轉殖品項結合的其他特徵包括例如那些衍生自賦予植物產生更多5_烯醇丙酮莽草酸-3-麟酸合成酶（5_en〇ipyruVyishikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)能力的聚核苷酸，其更完整地描述於美國專利案編號 6,248,876 B1 ; 5,627,06 1 ; 5,804,425 ; 5,633,435; 5，145,783; 4,971，908; 5,312,910; 5，188,642 ; 4,940,835 ； 5,866,775 ； 6,225,1 1 4 B1 ； 6,1 3 0,366 ； 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471 ; Re· 36,449; RE 37,287 E;以及 5,491，288;和國際公開案 WO 97/04103 ; WO 00/66746 ; WO 01 /66704 ;與 WO 00/6 6747。可與大豆3560·4·3·5轉殖品項結合的其他特徵包括那些賦予對例如續醯尿素類（sulfonylurea)與/或咪β坐琳嗣類（imidazolinone)的¢1藥性，其更完整地描述於美國 > 專利案編號 5,605,011; 5,013,659; 5,141，870; 5,767,361 ; 5,731,180； 5,304,732； 4,761,373； 5,331,107； 5,928,937 ；與5,3 78,824 ;以及國際公開案WO 96/33270。某些實施例中，大豆3560.4.3.5轉殖品項可與例如羥基苯基丙酮酸雙氧化酶 (hydroxyphenylpyruvatedioxygenases)堆疊，該氧化酶為一催化對-羥基苯基丙酮酸（para-hydroxyphenylpyruvate， HPP)轉換成黑尿酸（homogentisate)反應之酵素。可利用抑 12 200817524 制此酵素之分子與結合該酵素以抑制對-羥基苯基丙酮酸轉換成黑尿酸之分子作為除草劑。植株中賦予對上述除草劑耐藥性的特徵描述於美國專利案編號6,245,968 81; 6,268,549;與 6,069，115;以及國際公開案 w〇 99/23886。可與大豆3560.4.3.5轉殖品項堆疊的適當耐除草劑特徵之其他實例包括方氧基烧酸自旨雙氧化酶（aryl〇Xyalkanoate dioxygenase)的聚核苷酸（據報導其賦予對2,4-D與其他苯氧係生長素（auxin)型除草劑以及例如w〇2〇〇5/l〇7437所述之^•氧基苯氧基丙酸（aryloxyphenoxypropionate)除草劑的耐藥性）與例如 Herman 等（2005) J· C/zern. 280: 24759-24767中所述之汰克草（dicamba)对藥性的聚核苦酸。可與大豆3 5 6 0 · 4.3 · 5轉殖品項結合的除草劑耐藥性特徵之其他實例包括那些編碼外源性磷絲菌素乙醯轉移酶 (phosphinothricin acetyltransferase)的聚核苷酸所賦予，其描述於美國專利案編號 5,969,213;5,489,520; 5,550,3 1 8； 5,874,265； 5,919,675； 5,561,236； 5,648,477 ； 5,646,024; 6，177,616;與 5,879,903。含有外源性磷絲菌素乙醯轉移酶的植物可表現對固殺草（其抑制麩醯胺酸合成酶酵素）除草劑的改良之耐藥性。可與大豆3560.4.3.5 轉殖品項結合的除草劑耐藥性特徵之其他實例包括那些賦予改變活性之原外琳原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，protox)的聚核苷酸，其描述於美國專利案編號 6,288,306 Bl ; 6,282,837 B1 ;與 5,767,373 ;以及國際公開案WO 01/12825。含有上述聚核苷酸之植株對多種除草劑具有改善的财藥性，而該多種除草劑係以原卟琳原氧化 13 200817524 酶酵素為目標（亦稱為「原卟淋原氧化酶抑制劑」）。可與大豆3560.4.3.5轉殖品項結合的耐除草劑特徵之其他實例包括賦予對植物（例如，大豆植株或加拿大蓬）中至少一除草劑的耐藥性之那些特徵。技術中習知的耐除草劑之雜草’就如同植株對特定除草劑有著不同的耐藥性。參閱，例如 Green 與 Williams (2004) “Correlation 0f Corn (Zea mays) Inbred Response to Nicosulfuron and

Mesotrione”，以海報呈現於 WSSA Annual Meeting in

Kansas City, Missouri, February 9-1 2, 2004； Green (1998) PFeed Γκ/^o/og少 12: 474-477 ; Green 與 Ulrich (1 993) ffeed Sc face 4 1 : 5 08-5 1 6。作為這些耐藥性原因之特徵 (們）可藉由培育或經由其他方法與大豆3 560.4.3.5轉殖品項結合以提供本發明之植株以及其應用方法。大豆3560·4·3.5轉殖品項亦可與至少一其他特徵結合以產生進一步包括許多所欲特徵組合的本發明植株，該特徵組合包括（但不限於）：動物飼料所欲之特徵，例如高含油量（例如，美國專利案編號6,2 3 2,529);平衡式氨基酸含量（例如，高蘇氨酸「hordothionins」（美國專利案編號 5,990,389 ； 5,885,80 1 ； 5,885,802 ；與 5，703，409 ;美國專利案編號 5,850,0 1 6);高離胺酸大麥（Williamson等人 (1 987)五wr· J. 1 65: 99-1 06 ;與 WO 98/20122)以及高甲硫胺酸蛋白質（Pedersen等人（ 1 986)丄5ζ·ο/. Chm· 261: 6279 ; Kirihara 等人（ 1 988) Gwe 7 1: 359 ;與

Musumura 等人（1 989) 户/anr Μο/. 12:123));高消化性（例如，變異式赌存蛋白（美國專利申請案編號 1 0/053,410，2001年11月7日提申）；與硫氧化還原蛋白 14 200817524 (美國專利申請案編號10/005,429，2001年12月3曰提申）），上述之揭示在此以參考資料併入本文中。所欲之特徵組合亦包括低次亞麻油酸含量（1 〇 w 1 i η ο 1 e n i c a c i d content，LLNC ;參閱，例如，Dyer 等人（2002) MicroWo/. 59: 224-230)與高油酸含量（high oleic acid content，OLCH ;參閱，例如，Fernandez-Moya # A (2005) J. Agric. Food Chem. 53: 5326-5330) o 大豆3560.4.3.5轉殖品項亦可與下列其他所欲之特徵結合：諸如串珠鐮孢菌毒素（fumonisim)解毒基因（美國專利案編號5,792,93 1 );無毒性與抗疾病基因（Jones等人 (1 994) 266: 789 ; Martin # A(1 993) Science 262: 1432 ； Mindrinos 等人（1994)Ce// 78: 1089);處理或處理產物所欲之特徵，該產物諸如變質油（例如，脂肪酸去飽和酶基因（美國專利案編號5,952,544; WO 94/11516));變性澱粉（例如，二磷酸腺苷酸-葡萄糖焦磷酸化酶（ADPG pyrophosphorylases, AGPase)、澱粉合成酶(starch synthases, S S)、殿粉分支酶（starch branching enzymes， SBE)以及澱粉去分支酶（starch debranching enzymes， SDBE));與聚合物或原生質（例如，美國專利案編號 5,602,321; β-酮基硫解酶、聚羥基烷酸合成酶與乙醯乙醯輔酶 A(acetoacetyl-CoA)還原酶（Schubert 等人（1988) Bacteriol. 170:5837-5847) 促進聚經基烧酉旨 (polyhydroxyalkanoates，PHAs)的表現）；上述之揭示在此以參考資料併入本文中。亦可將耐除草劑式聚核苷酸與提供下列農業上特徵之聚核苷酸結合，諸如雄性不育（例如，參閱美國專利案編號5,583,2 1 0)、莖部強化、開花時 15 200817524 間、或例如細胞週期調控或基因標的（gene targeting)之轉形技術特徵（例如，WO 99/61619、WO 00/1 7364 與 WO 99/2 5 82 1);上述之揭示在此以參考資料併入本文中。另一實施例中，大豆 3560.4.3.5轉殖品項可結合於 Rcgl序列或其生物活性變異體或片段。Rcgl序列為玉米中一種抗炭疽莖腐基因（anthracnose stalk rot resistance gene)。參閱，例如，美國專利申請案編號 1 1 /397,1 53、 1 1/3 97,275與1 1/3 9 7，247，其各個在此以參考資料併入本文中。

可用任何方法產生這些堆疊式組合物，該方法包括 (但不限於）藉由任何習知或頂交（TopCross)方法學的植株育種法或基因轉形技術。假若藉由遺傳上轉形該植株而堆疊該序列，則可於任何時間以任何排序結合關注之聚核苷酸序列。可在共同轉形法（co-transform at ion)步驟中同時導入該特徵與藉由任何轉形組合體組合所提供的關注之聚核苷酸。例如，假若將導入兩段序列，那麼兩段序列可包含於各自分開的不同轉形組合體中（trans)或包含於相同的轉形組合體中（cis)。可由相同或不同的啟動子 (promoter)驅動序列的表現。某些實例中，樂見導入能抑制關注之聚核苷酸表現的轉形組合體。這可結合於其他抑制組合體或過度表現組合體的任何組合以在植株中產生所欲之特徵組合。進一步發現可利用特定位置重組系統 (site-specific recombination system)將聚核苦酸序列堆疊於所欲之基因體位置上。參閱，例如，W099/25821、 W099/25854、WO99/25840、W099/25855 與 W099/25853，其所有在此以參考資料併入本文中。 16 200817524 此處所用之詞彙「聚核苷酴甘毁」’其並不預期用來限制聚核苷酸僅包含DNA(去氧核撼^ ^ 乳核糖核苷酸）。熟悉技術之人士可以理解，聚核苷酸可包括核轤 h糖核苷酸、核糖核苷酸與去氧核糖核苦酸之組合。上述之+备 H去乳核糖核苷酸與核糖核苷酸包括自然產生之分子與合成類彳取4 頸似物（synthetic analogue) 兩種。聚核苷酸亦包含所有形式沾皮 β ^ 1 , π〜八的序列，其包括（但不限於）單股形式、雙股形式、髮类刑π · · 、 ^ w ^ 发灭型（hairpins)、莖環構造 (stem-and-loop structures)等等。

(i 3560.4.3.5植株包括一表現組合體，#具有嘉磷塞乙醯轉移酶的聚核苦酸與一基因改良式乙醯乳酸合成酶的聚核苷酸（g.Ara)。組合體包括可用性連結於^與 gm-/2ra聚核苷酸5'端與y端的調節序列。「可用性連結」預期係指兩個或多個片段之間的功能性連接。例如，關注之聚核苷酸與調節序列（即，啟動子）之間的可用性連結為功能性連接’這連接讓關注之聚核苷酸可以表現。可用性連結的片段可以為連續性或非連續性。當以可用性連結代表兩個蛋白質編碼區域之連接，預期這些編碼區域處於相同的讀碼（reading frame)。組合體可額外包含至少一附加基因，其可共同轉形（cotransformed)至有機體内。或者，可用多個表現組合體提供附加基因（群）。上述之表現組合體供以多個限制位點（restriction sites)與/或重組位點 (recombination sites)，以便插入之聚核苷酸受到調控區域的轉錄調控。表現組合體可額外包含選擇性標記基因 (selectable marker genes) ° 表現組合體將包括植物中功能上的5 f-3 '方向轉錄、轉錄與轉譯開始區域（即，啟動子）、編碼區域與轉錄與轉譯 17 200817524 停止區域。「啟動子」代表能調控編碼序列之表現或功能性DNA的核苷酸序列。一般而言，編碼區域位在啟動子序列的3'端。啟動子序列可包括近端與較遠端的上游片段，而後者經常稱為增強子（enhancer)。因此，「增強子」為一可刺激啟動子活性的核苷酸序列，其可為啟動子的内生性片段或插入的異源性片段，用以提高啟動子的表現量或組織特異性。啟動子可全部來自一天然基因；或由自然中發現的不同啟動子之不同片段所組合；或甚至包括合成的核芽酸片段。熟悉技術之人士可以理解不同啟動子可於不同組織或細胞類型；或發育的不同時期；或回應不同的環境條件指示基因的表現。造成一核酸片段在大部分時間表現於大部分類型細胞的啟動子，通常稱為「持續表現型啟動子（constitutive promoter)」。持續發現可用於植物細胞中之不同類型的新型啟動子；可於Okamuro與Goldberg (1 98 9) v 15:卜82 的刊物中發現許多實例。既然大部分實例中尚未完全界定調控序列的範圍，進一步理解不同長度的核酸片段可具有相同的啟動子活性。表現組合體亦包括5'端的引導序列（ieader sequences)。上述之引導序列可幫助轉譯進行。調控區域 (即’啟動子、轉錄調控區域、RN A處理或穩定區域、内子、聚腺嘌呤化訊號與轉譯停止區域）與/或編碼區域對寄主細胞或彼此之間為天生/同功（anal〇g0lls)或異源性 (heterologous) 〇「轉譯引導序列」代表位於基因啟動子序列與編碼序列之間的核苷酸序列。轉譯引導序列位於完全處理過之 18 200817524 mRNA中轉譯開始序列的上游。轉譯引導序列可影響許多參數，包括初級轉錄物至mRNA的處理過程、mRNA的穩定性與/或轉譯效率。已經描述轉譯引導序列的實例 (Turner and Foster ( 1 995) Mo/. 3: 225-236)。「Y端非編碼序列」代表位於編瑪序列下游的核苦酸序列，且包括聚腺嘌岭化辨認序列與其他序列（編碼能夠影響mRNA處理或基因表現的調控訊號）。聚腺令化訊號的特徵通常係影響mRNA前驅物端聚腺嘌吟串的添加。Ingelbrecht 等人在（ 1 989) P/aW Ce// 67 1 -680 中示範不同V端非編碼序列的使用方法。此處所用之「異源性（heterlogous)」在有關於一段序列時，係一段來自外來物種的序列，或（若來自同一物種）實質上由其自然形式修改而得之序列，這修改係藉由慎重的人為干預其組成與/或基因體位點（genomic locus)而完成。例如，可用性連結至一異源性聚核苷酸的啟動子係來自與聚核苷酸不同的物種，或（若來至同一 /相似物種）其中之一或兩者均實質上由其原始形式與/或基因體位點修改而成，或啟動子不是可用性連結之聚核苷酸的天生啟動子。製備表現組合體中，可操作不同的DNA片段以便提供適當方向的序列與同樣適當的讀碼。針對此目標，可使用銜接子（adapter)或連接子（linker)以連接DN A片段或可包含其他操作以提供方便的限制位點、多餘DNA的移除、限制位點的移除等等。爲此目的，可包括活體外突變、引子修復、限制（restriction)、鍵合（annealing)、再替代 (resubstitutions)(例如，轉換「transitions」與顛換 19 200817524 「transversions」）。表現組合體亦可包含選擇性標記基因以便挑選轉形後之細胞。利用選擇性標記基因挑選轉形後之細胞或組織。提供離析聚核苷酸，其可用於偵測與/或識別大豆 3 560.4.3.5轉殖品項的不同方法。「離析（isolated)」或「純化（purified)」的聚核苷酸或其生物活性的部分，係大體上或實質上不具有正常伴隨聚核苷酸或與其互動的成分（如發現於自然存在的環境中）。因此，當以重組技術產生離析或純化的聚核苷酸時，其實質上係不具有其他細胞材料 ( 或培養基，或當以化學合成時，其實質上不具有化學前驅

物或其他化學物質。最理想地，「離析」的聚核苷酸（最佳為蛋白質編碼序列）不具有天生位於該聚核苷酸旁侧的序列（即，位於聚核苷酸5 '端與3 '端的序列），而該旁側序列位於聚核苷酸來源之有機體的基因體序列中。例如，多種實施例中，離析的聚核苷酸可包含低於約5 kb( 1 000個鹼基對）、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0· 5 kb 或 0.1 kb 的旁側核苷酸序列（該旁側序列在聚核苷酸來源之細胞的基因體 DNA中天生位於該聚核苷酸的側面）。特定實施例中，聚核苷酸包括序列編號1 〇或Π提出的接合DNA序列。其他實施例中，聚核苷酸包含序列編號 1、2、6、 12、 13、 14、 15、 27、 28、 41 或 42 所提出的接合DNA序列或其之變異體與片段。接合DNA序列之變異體與片段適合用來有區別地辨認轉殖品項 3 5 60.4.3.5。如本文其他地方所討論，上述之序列可作為引子與/或探針。其他實施例中，提供可偵測 3 5 6 0.4 · 3 · 5轉殖品項或 20

200817524 3560.4.3.5特定區域的聚核苷酸。上述之序列包括序號1-56所提出的任一聚核苷酸或其之變異體與片段定實施例中，用來偵測3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項的聚核皆括序列編號43提出的序列’或具有序列編號43至少 30、40' 50、60、70' 80、90、100、110、120、130、 150、160、170或180個核苷酸的片段。偵測3 560. 轉殖品項或3560.4.3.5特定區域的聚核苷酸片段與變適合用來有區別性地識別轉殖品項3 5 6 0.4，3.5。如本他地方所討論，上述之序列可作為引子與/或探針。步提供離析的DNA核苷酸引子序列，其包括或由下列所組成：序列編號7、8、9、1 6、1 7、1 8、1 9、2 0、 22、23、24' 25、26、37、38、39、40' 43、44、45、 51、52、53、54或55所提出之序列或其互補序列，列編號 1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、 28、41、42或43的變異體與片段。「變異體（variants)」預期用來表示實質上相似列。針對聚核苷酸，變異體包括具有下列情況之一的苷酸：在其5’端與/或3,端具有缺失（deletion)(即，截在天生聚核苷酸中的一或多個内部位點缺少與/或加或夕個核苷酸，與/或在天生聚核苷酸中的一或多個以一或多個核苷酸替代。此處所用之「探針（Probe)」為一離析的聚核苷酿連接於習知可偵測的標記或報導分子，諸如放射性素、配位子（ligand)、化學螢光藥劑、酵素等等。上探針與目標聚核苷酸之一股互補，在本實例中，可大豆轉殖品項3 560·4·3·5之離析dna的一股互補列編。特酸包 20、 140、 4.3.5 異體文其進一列序 > 21、 • 46、或序、2Ί、之序聚核斷）；入一位點 L，其同位述之來自不論 21 200817524 該DNA來自大夺姑 ,,, 株或來自包含來自轉殖品項之DNA的樣本。探針不僅包去氧核糖核酸或核糖核酸，且包括聚醢胺與其他探針絲姐料（可專一地偵測目標DNA序列存在與否）。 '、此處所用之「引2v ’丨子（primers)」係鍵合至互補性目標 NA版的離析聚核苷酸，其藉由核酸雜合作用以在引子與目私DNA股間形成雜合體（hybrid)，接著藉由聚合酶（例如，DNA聚合酶）沿著目標DNA股向前延伸。引子對代表用以擴增目標聚核苷酸的引子，藉由例如聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction，PCR)或其他習知的核酸擴增方法。「聚合酶鏈反應（PCR或polymerase chain reaction)」為一種用來擴增特定DNA片段的技術（參閱，美國專利案編號4,683，195與4,800，159;在此以參考資料併入本文）。可以使用本文揭示引子的任何組合以便以引子偵測 3 560.4.3 ·5轉殖品項或特定區域（即，序列編號·· 7-9、 16-26、37、38、39、40、44-46 或 51-55)。引子對的非限制性實例包括序列編號16與17 ;序列編號2 3與2 0 ;序列編號2 3與19 ;序列編號1 8與22 ;序列編號2 1與22 ;; 序列編號7與9 ;序列編號8與9 ;序列編號7與8 ;序列編號37與39 ;序列編號38與39 ;序列編號44與45 以及序列編號3 7與3 8。探針與引子具有足夠的核苷酸長度可結合於目標 DN Α序列並專一地偵測與/或識別具有3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項的聚核苷酸。可以理解操作者可決定雜合作用條件或反應條件以達成此結果。此長度可以為任何足以用於所選之偵測方法的長度。一般來說’可使用長度為8、1 1、14、 22 200817524 16 、 18 、 20 、 22 、 24 、 26 、 28 、 30 、 40 、 50 、 75 、 100 、 200、300、400、500、600、700個核苷酸或更多，或介於約 11-20、 20-30、 30-40、 40-50、 50-100、 100-200、 200-300、 300-400、 4〇〇-5〇〇、 500-600、 600-700、 700-800 或更多個核苷酸。上述之探針與引子在高度嚴格性 (stringency)的雜合條件下可專一地與目標序列雜合。根據實施例之探針與引子可具有與目標序列連續性核苷酸完全相同的DNA序列，然而可藉由習知方法設計不同於目標DN A序列的探針，且該探針保有專一地偵測與/或識別目標DNA序列的能力。因此，探針與引子可與目標聚核苷酸（即，序列編號1 - 4 6與4 7 - 5 5 )共有約8 0 %、8 5 %、9 0 % ' 9 1 %、9 2 %、9 3 %、9 4 %、9 5 %、9 6 0/〇、9 7 %、9 8 %、9 9 % 或更兩的序列相同性或互補性，或者可不同於目標序列 (即’序列編號1·46與47-55)1、2、3、4、5、6或更多個核皆酸。可用探針當作引子，但通常將其設計成結合目標 DNA或RNA且不用於擴增處理。可利用特定引子擴增插^ (amplicon)，其可當作「特定探針入片段以產 i段以產生擴增子或其本身可被偵測以在生物樣本中識別轉殖品項3 5 6 0 4 ^ ι y 1

23 200817524 中的一區域，且其包含一部分與其連結的外源DNA。特定探針可包括一段序列，該序列至少8 0❶/〇、8 0與8 5 %之間、 8 5與9 0 〇/〇之間、9 0與9 5 %之間以及9 5與1 〇〇 %之間相同（或互補）於3 560.4.3.5轉殖品項的特定區域。此處所用之「擴增的DN A」或「擴增子」代表核酸模版中一部分的目標聚核苷酸之聚核苷酸擴增作用的產物。例如’爲了測定有性雜交之大豆植株是否含有 35 60 ·4· 3.5轉殖品項，利用DNA引子對以聚核苷酸擴增方法處理大立植株組織樣本萃取之DNA以產生一擴增子，該引子對包括第一引子，其來自插入異源性DNA插入位點鄰近的旁側序列；與第二引子，其來自插入異源性 DNA’而該擴增子為356〇43·5轉殖品項DNA存在的鑑定。預期任何可在生物樣本中區別3560.4·3·5轉殖品項存在與否的方法或試驗可用來「鏗定」3650·4·3·5轉殖品項。或者’第二引子可來自旁側區域。又其他實施例中，引子對可來自DNA插入片段兩側的旁側區域以便產生包括表現構築體完整之插入聚核苷酸以及基因轉殖插入片段旁側之序列的擴增子。參閱，第1圖。擴增子為一段長度且亦可鑑定轉殖品項之序列（即，具有來自3 560.4.3.5轉殖品項的接合DNA)。擴增子的長度範圍係結合引子對長度與一核苷酸鹼基對至DNA擴增步驟可產生之任何長度的擴增子之間。一群來自旁側區域的引子對可與DNA插入片段序列有段距離，這段距離之範圍從一個核苷酸鹼基對至擴增反應的極限，或約兩萬個核苷酸鹼基對。使用之詞彙「擴增子」明讀地排除DNA熱能擴增反應中形成的引子二聚體（primer dimmers)。 24 200817524 製備與應用探針與引子的方法描述於，諸如 Molecular Cloning: A Laboratory Manual} 2. sup.nd ed, vol. 1-3, ed· Sambrook 等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y· 1989 (以下稱為 “Sambrook 等人，1989”）； Cwrre/?/ /Voioco/s

Molecular Biology，ed. Ausube 等人，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992 (定期更新）（以下稱為 “Ausubel 等人，1 992”）；以及 Innis 等人，PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications，

Academic Press: San Diego, 1990°聚合酶鏈反應弓|子對可來自一已知序列，例如，利用爲此目的之電腦程式，該程式諸如 Vector NTI version 6 (Informax Inc.，Bethesda Md·) ; PrimerSelect (DNASTAR Inc·，Madison，Wis·);以及 Primer( Version 0.5.COP YRGT·， 1991， Whitehead

Institute for Biomedical Research，Cambridge，Mass.)中的聚合酶鏈反應引子分析工具。此外，可利用熟悉技術人士習知的指導方針視覺性地掃描序列且手動地識別引子。可以理解此處所用之詞彙「基因轉殖」包括任何細胞、細胞株、癒合組織、組織、植物部位或植物，其基因型因為異源性核酸的存在而改變，其包括那些最初即改變的基因轉殖體以及最初的基因轉殖體藉由有性雜交或無性繁殖而產生那些個體。此處所用之「基因轉殖」/並不包括下列方式所造成的基因體改變（染色體或染色體外）：傳統的植物培育方法或自然發生的轉殖品項，諸如隨機異體受精（random cross-fertilization)、非重組性病毒感染 (non-recombinant viral infection)、非重組性細菌轉幵多 25 200817524 (non-recombinant bacterial transformation)、非重組性轉位（non-recombinant transposition)或自然突變。「轉形（transformation)」代表傳送一核酸片段進入寄主有機體的基因體中，造成基因穩定的遺傳。含有轉形用的核酸片段之寄主有機體被視為「基因轉殖」有機體。植物轉形方法的實例包括農桿菌轉形法 (Agrobacterium-mediated transform at ion)(De Blaere 等人 (1 987) 少mo/. 143: 277)與加速粒子或「基因搶」

轉形技術（Klein 等人（1 987) iVWwre (London) 327: 70-73 ;美國專利案編號 4,945,050，在此以參考資料併入本文）。下述將揭示額外的轉形方法。因此，可將離析的聚核苷酸併入重组構築體（一般為 DNA構築體），該構築體能夠進入寄主細胞並在細胞中複製。上述之構築體可以為一載體，其包括複製系統與能在已知寄主細胞中進行轉錄與轉譯之多胜肽編碼序列的序列。適合穩定轉染（transfection)植物細胞或建立基因轉殖植株的許多載體描述於，例如，Pouwels等人（1985; 1987 補充）C7c^Mg FecMn· 乂 ; Weissbach ^ Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology (Academic Press，New York);以及 Flevin 等人（1 990) Plant Molecular Biology emu cil (Kluwer Academic Publishers)。一般來說，植物表現載體包括，諸如，受到端與端調控序列轉錄調控的一或多個植物選殖 (cloned)基因，與顯性選擇標記。上述之植物表現載體亦包含啟動子調控區域（例如，調控誘發性或持續性、環境或發育調節、或細胞或組織特定表現的調控區域）、轉錄 26 200817524 開始位置、核糖結合位置、rna處理訊於與/或聚腺嘌呤化訊號。 °〜轉錄停止位置提供識別轉殖品項3 560·4·3·5的多上述之方法可用於^ 〃種方法與組合物。万沄了用於在任何生物材 3 560.4.3.5轉殖品項。上述之方法 U或镇測度之方法與在-批種子中㈣35 ’ ^確^種子純 ^ ^ , ·3·5轉殖品項種子的方法。-實施例中’提供在生項種子的 3 560 4 3 <；的古土義本中識別轉殖品項 60.4.3.5的方法’而該方法包括

子接觸；然後擴增含有356〇.4.3 第與第-引寻疋E域的聚核苷酸。 356〇tr樣本可包括人們想測定是否含有轉殖品項 ...5 DNA的任何樣本。例如’生物樣本可包括任何植物材料’或是包含或來自植物材料(例#，但不限於食物或飼料產品)的任何材料。此處所用之「植物材料」^ 表由植物或植物部位得到或衍生之材料。特定實施例中，該生物樣本包括大豆組織。基於本文所揭示之旁側DNA與插入序列而得之引子 >、探針，可藉由傳統方法（例如，藉由再選殖與定序上述之序列）來確認（且若有需要，修正）該揭示之序列。聚核苷酸探針與引子專一地偵測目標DNA序列。任何傳統的核酸雜合或擴增方法可用來在樣本中識別來自基因轉殖轉殖品項的DNA。而「專一地偵測」，預期聚核苷酸可當作引子以擴增3560.4.3.5特定區域，或聚核苦酸可當作探針在嚴格條件下雜合於具有 3560.4.3.5 轉殖品項或 3 5 6 0 · 4 · 3 · 5特定區域的聚核苷酸。可特定偵測3 5 6 0 · 4 · 3 · 5 轉殖品項或3560.4.3.5轉殖品項特定區域之雜合作用的水準或程度足以分辨具有3560·4·3·5特定區域的聚核苷酸以 27 200817524 及缺少此區域的聚核苷酸，因而可區別性地識別 3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項。而「共有足夠的序列相同性或互補性好擴增3560·4·3·5特定轉殖品項」，預期該序列與具有 3560.4.3.5特定區域的聚核苷酸之片段或全長共有至少 80%、85%、90% ' 91%、92%、93% λ 94%、95%、96% ' 97%、9 8%、99%或10 0%的相同性或互補性。

關於利用特定擴增引子對之目標聚核苷酸的擴增（例如，藉由聚合酶鏈反應），「嚴格條件」係允許引子對雜合至目標聚核苷酸的條件，且具有相應的野生型序列（或其互補序列）的引子才能在DNA熱能擴增反應中結合並較佳地產生可辨識、具有3560.4.3.5特定區域之擴增產物（擴增子）。聚合酶鏈反應方法中，可設計寡核苷酸引子（用於聚合酶鏈反應）以擴增3560·4·3·5特定區域。技術中一般習知設計聚合酶鏈反應引子與聚合酶鏈反應選殖體的方法，且揭示於 Sambrook 等人（1989) d

Laboratory Manual (2d ed·， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。亦可見於 Innis et al ·，eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York) ； Innis 與 Gelfand， eds. (1 995) PCR Strategies (Academic Press,

New York);以及 Innis 與 Gelfand，eds. (1 999) PCJ? MeίΛοΜα/?wa/ (Academic Press, New York)。擴增方法進一步描述於美國專利編號4,683，195、4,683,202與Chen 等人（1994) P见4 *5 91:5695-5699。這些方法以及技術中習知DNA擴增的其他方法可用來實施其他實施例。可以理解特定聚合酶鏈反應步驟中的許多參數需作調整以符合 28 200817524 特定實驗室條件，且可稍作修飾以收集相似結果。熟悉技術之人士可以理解這些調整。擴增的聚核苷酸（擴增子）係能夠偵測3 560.4.3.5轉殖品項或3560.4.3.5特定區域的任何長度。例如，擴增子長度約 10、 50、 100、 200、 300、 500、 700、 100、 2000、 3 000、4000、5 000個核苷酸或更長。特定實施例中，可偵測3 560.4.3.5轉殖品項的特定區域。

擴增與/或偵測3 5 6 0 · 4 · 3.5特定區域的任何引子可用於方法中。例如，特定實施例中，第一引子包含序列編號 4或5之聚核苷酸的片段，其中該第一或第二引子與聚核苷酸共有足夠的序列相同性或互補性以擴增3 5 6 0.4.3.5特定區域。引子對可包括序列編號4的片段以及序列編號5 或3的片段，或者，引子對可包括序列編號5的片段以及序列編號3或4的片段。更進一步的實施例中，第一與第二引子可包括序列編號7、8、9、16-26、37、38、39、40、 4 4 - 4 6或5 1 - 5 5所提出之序列任何一個或任何組合。引子可為足以擴增3560.4.3.5區域的任何長度，包括例如，至少 6、7、8、9、10、15、20、15 或 30，或約 7-10、10-15、 15-20、 20-25、 25-30、 30-35、 35-40、 40-45 個核苷酸或更長。如本文其他地方所討論，可使用任何方法以聚合酶鏈反應擴增3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項或特定區域，包括例如，即時聚合酶鏈反應。參閱，例如 Livak等人（1995)尸Ci? Methods and Applications 4:357-362 ；美國專考ij 案 5,538,848 ’ 美國專利案 5,723,591 ; Applied Biosystems 29 200817524

User Bulletin No. 2， “Relative Quantitation of Gene Expression，” P/N 4303859 ;以及 Applied Biosystems User Bulletin No. 5, “Multiplex PCR with Taqman VIC probes，’’ P/N 4306236 ;上述各者在此以參考資料併入本文0 因此，特定實施例中，提供在生物樣本中偵測大豆轉殖品項3 560.4.3.5或其後代的方法。該方法包括（a)由該生物樣本萃取DNA樣本；（b)提供一對DNA引子分子（即，序列編號 7-9、16-26、37、38、39、40、44-46 或 51-55 的任何組合’其中上述組合可擴增356〇·4 3·5轉殖品項），其包括但不限於i)序列編號1 6與序列編號1 7的序列；Π) 序列編號23與序列編號2〇的序列；iH)序列編號23與序列編號1 9的序列；iv)序列編號丨8與序列編號22的序列’ v)序列編號21與序列編號22 ; vi)序列編號7與9 ; vii)序列編號8與9 ; ϋχ)序列編號7與8 ; ix)序列編號37 與39 ’ X)序列編號38與39 ; xi)序列編號44與45 ; xii) 序列編號2 5與2 6 ; xiii)序列編號25與序列編號24的序〇列’（〇提供DNA擴增反應環境；（d)執行DNA擴增反應，因此產生DNA擴增子分子

;以及（e)偵測DNA擴增子分之DNA擴增子分子 DNA擴增反應中測得上述之DNA擴增子分子殖"°項3560·4·3·5的存在。為了讓核酸分子作針’其僅需要序列上足夠的互補性以能在應用鹽類濃度下形成穩定的雙股結構。

ngent conditions)」或「嚴格雜 30 200817524 合條件（stringent hybridization conditions)」代表聚核苷酸探針條件時，預期探針將以可察覺高於其他序列的程度雜合至其目標序列（例如，至少高於背景值2倍）。關於利用特定擴增引子對擴增目標聚核苷酸（例如，藉由聚合酶鏈反應）’「嚴格條件」係允許引子對雜合至目標聚核苷酸的條件’且該引子具有相應的野生型序列。嚴格條件係取決於序列且在不同環境下有所不同。藉由調控雜合與/或清洗條件的嚴格度，可識別與探針1 〇〇%互補的目標序列 (同源性探取「homologous probing」）。或者，可調整嚴格度條件以容許某些序列中的配對錯誤（mismatching)好伯測較低程度的相同性（異源性探取r heter〇1〇g〇us probing」）。一般來說，探針長度低於約ι〇〇〇核苷酸或低於約5 0 〇核苷酸。此處所用之「實質上相同或互補之序列」係指專一地雜合至核酸分子的互補序列之聚核苷酸，且係在高嚴格度條件下達成。促進DNA雜合的適當嚴格條件為，例如，在約4 5 C下以6 X氣化鈉/檸檬酸鈉（s s c)清洗接著在約 5〇 C下以2X SSC清洗，這些為熟悉技術人士所知或可見於 CUrrent Protoc〇is in M〇lecuUr Bi〇l〇gy，&

Sons’N’Y· (1989)，ό.3·1-6·3.6。一般來說，雜合作用與偵測的嚴格條件中鹽類濃度低於約丨· 5 Μ鈉離子，一般約為 0.〇1至ι·ο μ的鈉離子（或其他鹽類）濃度且ρΗ值在7〇至8.3間，而溫度至少約3〇〇c (短探針例如，⑺至5〇核苷酸）與至少約60°C (長探針例如，長於5〇核苷酸）。亦可添加去穩定劑（例如，甲酿胺）以達成嚴格條件。示範性的低嚴袼條件包括纟3rCT雜合作用於3Gi 35%甲醯胺M 31 200817524 虱化鈉 1 /°十一燒基硫酸鈉（sodium dodecyl suiphate， SDS)的緩衝液中，然後在50°C到55°C下清洗於lx至2χ SSC (20Χ SSC = 3·〇 Μ氣化鈉/〇·3 Μ擰檬酸三鈉）。示範性的中等嚴格條件包括在37。(：下雜合作用於40至45%曱醯胺、1·〇 Μ氣化鈉、1% SDS中，然後在饥至6〇。。下清洗於0·5Χ i 1χ ssc中。示範性的高嚴格條件包括在 37 C下雜合作用於5〇0/〇甲醯胺、1〇 M氣化鈉、sds中，然後在6〇°C至65°C下清洗於〇·1Χ SSC中。視情況，清洗緩衝液可包含約〇.1%至約1% SDS。雜合作用的期間通常低於約24小時，一般約為4至約12小時。清洗時間週期將係至少足以達到平衡的時間長度。雜&反應中’專一性（specificity)—般為雜合後清洗的函數’而關鍵因素為最終清洗溶液的離子強度與溫度。對 DNA DNA 雜合體而言，熱熔點（thermal melting point，Tm) 大約接近下列公式所得值Meinkoth與Wahl (1 984) Biochem. 1 38:267-284： Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 〇·61 (% f〇rm) - 5〇〇/L ;其中％為單價陽離子的莫爾濃度’ ％GC為DNA中鳥糞嘌呤與胞嘧啶核苷酸的百分比’ ％ form為雜合溶液中甲醯胺的百分比，而L為雜合體的長度（鹼基對）。Tm為50%互補性目標序列雜合至完美配對探針時的溫度（特定離子強度與pH值下）。Tm減少約1 C等於1 %的配對錯誤；因此，可以調整Tm、雜合作用與/或清洗條件以雜合所欲相同性的序列。例如，若找到匕90%相同性的序列，那麼Tm可以減少丨〇艺。一般來說，在特定離子強度與pH值下針對特定序列與其互補序列挑 ^嚴格條件係低於熱熔點（thermal melting point，Tm)約 32 200817524 5 C。然而，極度嚴格條件在雜合與/或清洗時利用低於熱熔點1、2、3或4。(：的溫度；中度嚴格條件在雜合與/或清洗時利用低於熱熔點6、7、8、9或1(rc的溫度；低嚴格條件在雜合與/或清洗時利用低於熱熔點丨丨、1 2、丨3、1 4、 f

1 5或2 0 C的溫度。利用此公式、雜合與清洗溶液成分與所欲之Tm ’那些熟悉技術人士可以理解雜合與/或清洗溶液的嚴格度變化係如同上述。若所欲之配對錯誤程度導致 Tm低於45°C (水溶液）或32°C (甲醯胺溶液），最理想的是提高S S C濃度以便可使用更高溫度。核酸雜合作用的廣泛間 J ί 可見於 Tijssen (1993) 广少 /w

Biochemistry and Molecular Biology —Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New

York);以及 Ausube 等人，eds . (1 9 9 5) CwrreProco/s zV

Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。參閱 Sambrook 等人（1989)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold

Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)以及 Haymes 等人（1985) In: iVwc/di： α IRL Press，Washington，D.C.。聚核苷酸被稱為「互補」於另一聚核苷酸假若他們顯示互補性。如文中所用，當其中之一聚核苷酸分子中的每個核苷酸互補於另一聚核苷酸分子中的每個核苷酸時，將其稱為顯示「完全互補性」。兩個分子若被稱為「最低互補性」，則他們可以彼此雜合且有足夠穩定性讓其保持彼此鍵合態（至少在傳統的「低嚴格度」條件下）。相同地，分子稱為「互補性」’假若他們可以彼此雜合且有足夠穩 33 200817524 定性讓其保持彼此鍵合態（在傳統的「高嚴格度」條件下）。進一步提供偵測樣品中3 560.4.3.5轉殖品項相對應 DNA存在與否的方法。一實施例中，該方法包括使^ 物樣本接觸聚核苷酸探針，該探針在嚴格雜合條件下雜合至來自大豆轉殖品項3560.4.3.5的DNA且專一地偵測 3560.4.3.5轉殖品項；（b)將樣本與探針置於嚴袼的雜合條件下；以及（c)偵測探針與DNA的雜合作用，其中測得雜合作用暗示3 560.4.3.5轉殖品項的存在。一實施例中，在與轉殖品項雜合作用前先以適當酵素剪切DNA。可用多種方法來偵測3560.4.3.5特定區域或其擴增子’包括（但不限於）遺傳位元分析法（Genetic Bit Analysis) (Nikiforov 等人（ 1 994) Nucleic Acid Res、 22: 41 67-4 1 75)。一方法中，設計DNA募核苷酸使其部份重疊鄰近的旁側DNA序列與DNA插入片段序列兩者。其他實施例中，設計DNA寡核苷酸以產生3560·4·3·5特定擴增子。將寡核苷酸固定於微孔盤的孔中。使關注之區域進行聚合酶鏈反應後，單股聚合酶鏈反應產物可雜合於固定性的寡核苷酸，且作為單驗基延長反應的模板，而該單驗基延長反應利用DNA聚合酶與標記的ddNTPs(特定於預期的下一鹼基）。可用螢光或酵素免疫分析法（ELISA)方式讀出結果。若有由於成功的擴增、雜合與單一鹼基延長而出現之訊號則暗示插入/旁側序列的存在。另一種偵測方法為熱解定序（Pyrosequencing)技術，於 Winge ((2000) /nwv.尸/^厂所a. red 〇〇·· 18-24)中描述。此方法中，設計募核苷酸使其部份重疊鄰近DNA與 DNA插入片段的接合區，或是應用一對可擴增3560.4.3.5 34 200817524 單一的另域而區列注序關入自插來於於位合子雜引酸個苷一核中募其 ο /V 酸物苷產核應募反的鏈域酶區合定聚特股引子位於旁侧序列），且與下列物質一起培養：DNA聚合酶、腺苷三磷酸（ATP)、硫酸化酶（sulfurylase)、螢光素酶 (luciferase)、腺酸水解酶（apyrase)、腺苷 5’填硫酸 (adenosine 5' phosphosulfate)與螢光素（luciferin)。分別加入dNTPs並測量光學訊號的併入結果。而由於成功的擴增、雜合作用與單一或多個鹼基延長而出現之光學訊號則暗示轉殖基因插入/旁側序列的存在。

Chen 等人（(1 999) Genome Res. 9: 492-498， 1 999)描述的偏極化螢光（Fluorescence Polarization)亦為可用來偵測本發明擴增子的方法。利用此方法，設計寡核苷酸使其部份重疊旁側與DNA插入片段的接合區，或是應用一對可擴增3560.4.3.5特定區域的寡核苷酸。寡核苷酸雜合於來自關注區域的單股聚合酶鏈反應產物（其中一個引子位於插入序列而另一引子位於旁側序列），且與DNA聚合酶、螢光標記的ddNTP —起培養。單鹼基延長造成ddNTP 的併入。而可利用螢光計觀察偏極化的變化測量併入之作用。而由於成功的擴增、雜合作用與單一鹼基延長而出現的偏極化變化暗示轉殖基因插入/旁側序列的存在。

Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City Calif·)被描述成一種偵測與定量〇ΝΑ序列存在的方法且可由製造商的說明書完全了解其應用。簡單的說，設計營光共振能量轉移（FRET)的寡核苷酸探針使其部份重疊旁側與DNA插入片段的接合區，或是應用一對可擴增 3560.4.3.5特定區域的寡核苷酸。螢光共振能量轉移探 35 200817524 與聚合酶鏈反應引子（其中一個引子位於DNA插入片段序列而另一引子位於旁側基因體序列）在耐熱性聚合酶與 dNTPs存在下循環。螢光共振能量轉移探針的雜合作用造成螢光基團由螢光共振能量轉移探針上的淬滅基團 (quenching moiety)分離與釋出。由於成功的擴增與雜合作用而出現之螢光訊號暗示旁側/轉殖基因插入序列的存在。

Tyangi 等人（（1996) iVaiwre 303-308)已經描述分子信標（Μ ο 1 e c u 1 a r B e a c ο n s )用於序列偵測的方式。簡單的說，設計螢光共振能量轉移的募核苷酸探針使其部份重疊旁側與DNA插入片段的接合區，或是應用一對可擴增3560.4·3·5特定區域的募核苷酸。螢光共振能量轉移探針的獨特結構造成其含有保持螢光與淬滅基團相當靠近的二級結構。螢光共振能量轉移探針與聚合酶鏈反應引子（其中一個引子位於DNA插入片段序列而另一引子位於旁側序列）在耐熱性聚合酶與dNTPs存在下循環。聚合酶鏈反應成功的擴增後，螢光共振能量轉移探針雜合於目標序列造成探針二級結構的移除以及螢光與淬滅基團空間上的分離。進而得到螢光訊號結果。由於成功的擴增與雜合作用而出現之螢光訊號暗示旁側/轉殖基因插入序列的存在。利用專一於某序列（擴增子中發現）之探針的雜合反應係為偵測聚合酶鏈反應反應產生之擴增子的又另一種方法。此處所用之「套組」代表用以執行本方法實施例的一組藥劑，更明確地，識別與/或偵測生物樣本中的 36 200817524 3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項。可使用該套組，組成’以便品質調控（例如，種子批次材料中的轉殖品項3 560.4.3.5，或包含的材料（例如但不限於，食物或飼料產特定實施例中，提供於生物樣》 356〇·4·3·5的套組。該套組包括第一與一與第二引子擴增含有3560.4.3.5特突進步實施例中，該套組亦包括用於偵品域的聚核苷酸。該套組可包括例如’ 序列編號4或5的聚核苷酸之片段，其子與聚核苷酸共有足夠的序列同源性述之3560.4.3.5特定區域。引子對可包段與序列編號5或3的ϋ段，或者，引號；5的片段與序列編號3或4的片段 ψ , 产第一與第二引子可包括序列編號： H 19、20、21、22、23、24、25、26 43、44、45、46或51-55所提出之任一引子可為足以擴增 3560.4.3.5區域的如’至少 6、7、8、9、10、15、20、15 1(Kl5、15-20、20-25、25-30、30-35、酸或更長。進一步提供DNA偵測套組，其包偵剛3560.4.3 ·5特定區域的聚核苷酸，酸包括至少一 DNA分子，該分子係與同源或互補並具有足夠長度的連續性右中 ’ DNA偵測套組包括具有序列編號且可明確地調整其的純度）’偵測植物或來自該植物材料品）° 卜中識別轉殖品項第二引子，其中第 :區域的聚核苷酸。測 3 560.4.3.5 特定第一引子’其包含中該第一或第二引或互補性以擴增上括序列編號4的片子對可包括序列編。更進一步實施例 7 、 8 、 9 、 16 、 17 、、37、 38、 39、 40、 •序列或任何組合。任何長度，包括諸或30 ，或約7-10 ' 35-40 、 40-45 核苷括至少一可專一地其中上述之聚核苦序列編號3、4或5 笑苷酸。特定實施例 1 〇或11的聚核苷 37 200817524 酸，或包括與選自下列序列雜合的序列a)序列編號4與序列編號3的序列；以及，…序列編號5與序列編號3的序列’以及序列編號4與43的序列。應用於方法與組合物中的任何聚核苷酸與其片段與變異體可與基因轉殖3 56〇·43·5轉殖品項插入區域、接合序列或旁側序列共有基因相同性。習知用以測定多種序列關係的方法。此處所用之「參考序列」為序列比較根據的特定序列。參考序列可為特定基因的部分或全部；例如，全長cDNA(互補DNA)或基因序列的片段，或是完整的 cDNA或基因序列。此處所用之「比較窗口 window)」參考聚核苷酸序列的連續性與專一片段，其中比較窗口中的聚核苷酸序列與參考序列相比（其不含有多餘或缺失）會包括多餘或缺失（即，缺口），以便最佳地並列這兩個聚核苦酸。一般來說，比較窗口長度係至少2〇個連續核苷酸’而視情況可為30、40、50、100或更長。熟悉技術人士可以理解為了避免因為聚核苷酸序列包含缺口造成與參考序列的高相似度，一般會引進缺口罰分（gap penalty)並以此扣掉符合數目。技術中習知並列序列以便比較的方法。因此，可利用數學演异法來測定任何兩序列之間的序列相同性百分比。上述之數學演鼻法的非限制性實例係：Myers與Miller (1 98 8) 4 :1 1 -1 7 的演算法；Smith 等人（1 98 1) Jc/v. 却；7/. 2:482的局部並列演算法；Needleman與

Wunsch (1970)丄 Mo/· 5M/. 48:443-453 的整體並列演算法；Pearson 與 Lipman ( 1 98 8) iVw/· d 85:2444-2448 的搜哥局部並列方法（search-for-i〇eal 38 200817524 alignment method) ； Karlin ^ Altschul (1990) Proc. Natl, Acad. Sci, 872264 的演算法，Karlin 與 A11schul (1 993)

Proc. Natl. Acad. Sci. 9 0 : 5 8 7 3 - 5 8 7 7 的改良版。

U 這些數學演算法的電腦操作可用來比較序列以測定序列相同性。上述之操作包括（但不限於）：PC/Gene程式 (得自 Intelligenetics，Mountain View，California)中的 CLUSTAL ； GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10 (得自 Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California，USA)中的 ALIGN 程式（2.0 版）與 GAP、 BESTFIT、BLAST、FASTA 以及 TFASTA。可用默認參數 (default parameter)執行利用這些程式的並列分析。 CLUSTAL 程式詳述於 Higgins 等人（ 1 988)

73:23 7-244 ( 1 98 8) ； Higgins 等人（ 1 989) CABIOS 5:151-153 ； Corpet 專尺Nucleic Acids Res. 16:10881-90 ; Huang 等人（1992) CABIOS 8:1 5 5-65 ；以及 Pearson 等人（1 994) Me/Λ· Mo/. 5/o/· 24:307-33 1。ALIGN 程式係基於Myers與Miller ( 1 988) 的演算法。當比較胺基酸序列時，可應用 PAM120重量殘基表（weight residue table)、12的缺口長度罰分與4的缺口罰分值於 ALIGN 程式。Altschul 等人（1 990)丄 Mo/· Biol. 215:403 的 BLAST 程式係基於 Karlin 與 Altschul (1990) swpra 的演算法。可用BLASTN程序、100的分數（score)、12的字數長度執行BLAST核苷酸搜尋，以獲得與編碼蛋白質的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可用 BLASTX程序、50 的分數（score)、3的字數長度執行BLAST蛋白質搜尋，以獲得與蛋白質或多胜肽同源的胺基酸序列。為了獲得缺口 39 200817524 並列分析以便比較，可應用 Altschul等人（1 997) iVwc/eic Acids Res· 2 5 : 3 3 8 9 描述的 Gapp ed B L A S T (B L A S T 2 · 0 中）。或者，可使用PSI-BLAST (BLAST 2.0中）執行反覆搜尋以偵測分子間隱約的關係。參閱Altschul等人（1997) 。當使用 BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST 時，可以使用各個程式的默認參數（例如，BLASTN係針對核苷酸序列，而 BLASTX 係針對蛋白質）。參閱 www.ncbi.nlm.nih.gov。亦可以手動檢驗執行並列分析。

除非另有說明，文中提供的序列相同性/相似性數值係GAP Version 1 0利用下列參數所獲得之數值：利用50 的 GAP Weight 與 3 的 Length Weight 以及 nwsgapdna.cmp 得分矩陣（scoring matrix)測得核苷酸序列之相同性％與相似性％ :利用8的GAP Weight與2的Length Weight以及 BLOSUM02得分矩陣測得胺基酸序列之相同性％與相似性 % ;或其任何的均等程式。而「均等程式」，預期當任何序列比較程式（針對任兩分析序列）與GAP Version 10產生相對並列分析相比，可產生具有相同核苷酸或胺基酸殘基配對的並列分析與相同的序列相同性。 GAP 利用 Needleman 與 Wunsch (1 970) J. Mo/· 5/〇/. 48:44 3-453的演算法，以找出將配對最大化與缺口數最小化的兩個完整序列之並列分析。GAp考慮所有可能的並列分析與缺口位置，然後產生具有最大配對鹼基數目與最少缺口的並列分析。其以配對鹼基單位提供缺口產生罰分 (gap creation penalty)與缺口延伸罰分（gap eXtension penalty) ° GAP必須對每個嵌入的缺口給以配對的缺口產生罰分數目。此外，若選擇高於零的缺口延伸罰分值， 40 200817524

GAP必須將各個嵌入缺口的長度乘以缺口延伸罰分。gCG

Wisconsin Genetics Software Package Version 10 默認的缺口產生罰分與缺口延伸罰分值分別為8與2。針對核苷酸序列，默認的缺口產生罰分為50而默認的缺口延伸罰分為3。缺口產生與缺口延伸罰分可用整數表示，該整數係選自0至200之間整數所構成的群組中。因此，舉例來說，缺口產生與缺口延伸罰分可為〇、；[、2、3、4、5、6、 7 、 8 、 9 、 10 、 15 、 20 、 25 、 30 、 35 、 40 、 45 、 50 、 55 、 60、65或更高。 GAP代表最佳並列分析家族的其中之一。此家族有許多成員’但沒有其他成員有更好的最佳分值。GAP顯示並列分析的四種優點特徵：最佳分值（Quality)、比率 (Ratio)、相同性（Identity)與相似性（Similarity)。為了並排序列將最佳分值最大化。比率係最佳分值除以較短片段的鹼基數。相同性百分比為實際配對標記的百分比。相似性百分比為相似標記的百分比。可以忽略橫跨缺口的標記。當一對標記的得分矩陣值高於或等於〇 . 5 0 (相似性閾值）時計算相似性得分。用於 GCG Wisconsin Genetics Software Package Version 10 的得分矩陣為 BLOSUM62 (參閱 Henikoff 與 Henikoff (1 989) Pmc. iVa，/. Jed. Scz·. t/U 89:10915) 〇此處在兩個聚核苷酸或多胜肽序列文中所用之「序列相同性（sequence identity)」或「相同性（identity)」，係關於以最符合特定比較窗口並列兩個序列時相同的殘基。當序列相同性的百分比係關於蛋白質時，可以理解不同的殘基位置通常係由保守式胺基酸替代（conservative amino 41 200817524 substitutions)所造成，其中胺基酸殘基替代成具有相似化學特性（例如，電荷或疏水性）的其他胺基酸殘基，因而不會改變分子的功能特性。當序列因保守性替代而不同時，可向上調整序列相同性百分比以符合保守性替代的性質。由上述保守性替代造成改變的序列稱為具有「序列相似性」或「相似性」。熟悉技術之人士相當了解調整的方法。一般來說，這包括將保守性替代計算成部分而不是完全配對錯誤，因而提高序列相同性的百分比。因此，舉例來說，將相同胺基酸給予1的分數而非保守性替代給予〇 f . 的分數，則給予保守性替代〇與1之間的分數。計算保守性替代的分數’例如，藉由PC/GENE(Intelligenetics，

Mountain View，California)程式中的執行完成。此處所用之「序列相同性的百分比」意指在一比較窗口上比較兩個最佳並列序列所測得之數值，其中比較窗口中聚核皆酸序列的部分與參考序列相比（其不含有多餘或缺失）會包括多餘或缺失（即，缺口），以便最佳並列分析兩序列。百分比藉由下列方式計算：測定兩個序列中相同核 I) 驗基或殘基的位置數目以產生配對位置數，將配對數除以比較窗口内的整體位置數目，然後將結果乘以丨〇〇以產生序列相同性的百分比。提供控制耕種區域内雜草、避免耕種區域中生長或出見耐除草劑雜草、生產作物與提高作物安全性的方法。詞厂控制」與由此而來之衍生詞（例如，「控制雜草」）代表或多種下述現象：抑制雜草生長、發芽、繁殖與/或殖’與/或殺死、移除、破壞或其他逐漸減小雜草出現與/或活性的方式。 42 200817524 此處所用之「耕種區域（area of cuitivati〇n)」包括人們想要種植植物的任何區域。上述之耕種區域包括（但不限於）耕種植物的田地（諸如，農作地、草地、林地「tree field」、生產林「managed forest」、種植水果與蔬菜的田地等等）、溫室、生長室等等。方法包括將耕種區域栽種大豆3560.4.3.5種子或植株，且在特定實施例中，對作物、種子、雜草或其耕種區域施加有效劑量的關注之除草劑。可以理解可在將耕種區域栽種作物之前或之後施加除草劑。上述之除草劑應用可包括應用嘉罐塞、乙醯乳酸合成酶化學作用抑制劑或其之任何組合物。特定實施例中，將乙醯乳酸合成酶化學作用抑制劑聯合嘉構塞的混合物施加於大豆3 5 6 0 · 4 · 3 · 5，其中至 > 該有效》辰度的乙酿乳酸合成酶化學作用抑制劑將明顯地傷害相稱的對照植株。在一非限制性實施例中，該除草劑至少包括下列一種：磺醯基胺基羰基三唑啉鲖 (sulfonylaminocarbonyltriazolinone)、三嗤哺咬 (triazolopyrimidine)、嘧啶（硫）基苯甲酸 (pyrimidinyl(thi〇)beiiz〇ate)、咪嗤啉嗣（imidaz〇Un〇ne)、三嗪（triazine)與 / 或次膦酸（ph〇sphinic acid)。另一非限制性實施例中，除草劑的組合物包括嘉磷塞、依滅草（imazapyr)、氯嘧磺隆（chl〇rimur〇n_ethyl)、禾靈（quizalofop)與氟續胺草醚（f〇mesafen)，其中作物可忍受有效劑量因此可控制雜草。如本文其他地方所揭示，可應用這些除草劑的任何有效劑量。特定實施例中，此除草劑的組合物包括有效劑量的嘉磷塞，其包括每公頃約丨丨i 〇至約1 1 3 0克的活性成分（ai);有效劑量的依滅草，其包括 43 200817524 每a員勺7 · 5至約2 7 · 5克的活性成分；有效劑量的氯嘧磺隆/、I括每A頃約7 · 5至約2 7 · 5克的活性成分；有效劑置的禾靈，其包括每公頃約50至約70克的活性成分；以及有效劑㈣氣續胺草醚，λ包括每公頃、約24〇至約260 克的活性成分。 ”實施例中’應用至少兩種除草劑的組合物，其中該組合物不包括嘉磷塞。其他實施例[施加至少-種乙酿乳酸合成酶拍5也丨兔丨 t ^ ^ p制wl與嘉璘塞於植物上。本文其他地方更詳細地描述有y 士·、+ ^ & , X .. 哥方法中應用之多種除草劑組合物的細節。

一實施例中，控制雜草的方法包栝將區域栽種 3 560 ·4·3.5大豆種子或植株，且對作物、作物部位、上述作物的種子或耕種區域施加有效劑量的除草劑，其中上述之有效劑量包括 i)當施加於第一對照作物、作物部位、種子或耕種區域時第對照作物無法忍受的劑量，其中上述之第一對照作物可表現第一聚核苦酸，該第一聚核皆酸編碼賦予針對嘉磷塞的耐藥性之嘉磷塞乙醯轉移酶（GLYA丁）多胜肽；但不表現編碼gm-hra多胜肽的第二聚核苦酸；部位、種子或耕種區 ’其令上述之第二對 H)當施加於第二對照作物、作物域時，第二對照作物無法忍受的劑量照作物可表現《所扣聚核苷酸但不4現咖,$核苦酸；以及山）當施加於3560.4.3.5大旦作物、作物部位、種子或其耕種區域時，其可忍受的劑量。除草劑可包括除草劑組合物，而該組合物可包括或不包括嘉磷塞。#定實施例中，除草劑組合物包括乙觚礼S文合成酶化學作用抑制劑 44 200817524 (進一步描述於下）。另一貫施例中， — 控制雜草的方法包括將區域栽種 3560·4·3·5大豆作物種子或植株，然後對作物、作物部位、上述作物的種子或ϋ ^ 作區域施加有效劑量的除草劑，其中上述之有效劑量白- 一括兩於作物建議標籤之使用比例的劑量，其中當施加於一 • 4.3 · 5大豆作物、作物部位、種子或其耕種區域時，盆^、 > 八可以心受上述之有效劑量。應用的除草劑可包括除草劍έ日人仏 & / λ 早Μ、、且合物，该組合物可包括或不包括嘉磷塞。特定實施例中，^ #十丨z A t

除草劑組合物包括至少一種乙醯乳酸合成酶化學作用拍j法，丨制/, 抑制劑（進一步描述於下）。多種方法中所應用的更多種除莖丨&# z A ,, 降旱Μ與其組合物將更詳細描述於下。 ^對照組」《「對照植株」《「對照植物細胞」提供測置受測植株或植物細胞表現型變化的參考點，且可為任合適當之植株或植物細胞。對照植株或植物細胞可包括，諸如·（a)野生型植株或細胞，即，與起始材料具有相同基因型’該起始材料係用於基因改變以成^ $測植株或細胞，（b)與起始材料具有相同基因型的植株或植物細胞，但係以無效構築體（null c〇nstruct)(即，一個對關注之特徵沒有已知影響之構築體，例如含有標記基因的構築體）轉形之；（Ο受測植株或植物細胞後代中分離出之未轉形的植株或植物細;⑷與受測植株或植物細胞在I因上相同 :植株或植物細胞，但未暴露於如同受測植株或植物細胞樣的處理(例如，除草劑處理)；⑷受測植株或植物細胞其本身，處於不表現關注之基因的情況下；或者⑴受測植株或植物細胞其本纟，處於尚未暴露於特定處理(例如，除草劑或除草劑與/或其他化學物質之組合物）的情況下。 45 200817524 某些實例中’相稱的對照植株或對照植物細胞可具有不同於又測植株或植物細胞的基因型，但與起始材料（用於基因改變以成為受測植株或細胞）共有相同的對除草劑敏感之特性。參閱，例如，Green (1 998) Μ: 474-477 ; Green 與 Ulrich ( 1 993) 41:

5 08-516。某些實例中，相稱的對照大豆植株為「傑克 (Jack)」大豆植株（川inois Foundation Seed，Champaign， Illinois)。其他實施例中’無效分離體（nuu 用來作為對照組，因為它們近乎與3 5 6 〇. 4 · 3.5共有相同的基因除了基因轉殖DNA插入片段以外。可對3 5 6 0.4.3 · 5大豆作物、作物部位或含有作物植株的耕種區域施加任何除草劑。除草劑的分類（即，將除草劑分為群組與子群組）為技術中習知的且其包括除草劑抗性執行委貝會（Herbicide Resistance Action Committee， HRAC)與美國雜草協會（Weed Science Society of America， WSSA)的分類（亦參閱於 Retzinger 與 Mallory-Smith (1997) 1 1 : 3 84-3 93)。下表1中提出除草劑抗性執行委員會分類的縮減版本（具有與美國雜草協會分類相關的標示）。可依照下列方式區分除草劑：作用模式與/或作用位置；施加的時間點（例如，萌芽前或萌芽後）；應用方法（例如，葉面施藥或土壤施藥）；植物如何吸收或其如何影響植物。例如，將嗟吩確隆（t hi fens ul fur on-methyl)與苯續隆 (tribenuron-methyl)施加於作物葉片上然後通常固定在那，然而玉嘧磺隆（rimsulfuron)與氯嘧磺隆通常可藉由植株的根與葉兩者吸收。「作用模式」通常代表植物内除草 46 200817524 劑抑制或損害的代表植物内除草劑謝或生理過程，然而「作用位置」通常置。可以X ^作用或直接互動的物理位置或生化位 ^ a +卜』方式八；位置（參閱，例刀類除草劑，包括作用模式與/或作用列如，& 1 h

除草劑基因，在^特疋除草劑或其他化學物質耐藥性的耐組中其他除草劑表：它的植株上亦職予對相同群級或子群群組或子群組。因化學物質的耐藥性’例如，* 1提出的可忍受同_此1些實施例中’-種基因轉殖植株學物質，例如…：組内超過—種以上的除草劑或化 (_ 席。卜琳原氧化酶（ΡΡΟ)的抑制劑、磺醯尿素 (sulf0nylurea)或合成生長素。 'J&S* r?n 丄 ° 發明之植株比先前習知的植株更可忍受不同類型除草劑f ，目士 (P /、有不同作用模式與/或不同作用位置的除草劑）的處理里以及更回劑ΐ的除草劑，因而允許改 Ρ建議的雜草處s策略以便減少耐除草劑#草的發生率與曰遍1±。τ應用特定的除草劑組合物以有效地控制雜草。可基於即將種植基因轉殖作物之區域中普遍的耐除草劑雜草物種，挑選可用於作物生產之基因轉殖大豆植株並提供之。雜草管理技術，舉例來說，可應用輪作法（crop rotation)，其利用一種可忍受當地雜草物種無法忍受之除草劑的作物。參閱，諸如除草劑抗性執行委員會、美國雜草協會與許多州政府機構以及多種闊葉雜草的除草劑耐樂性計分（出自 2004 Illinois Agricultural Pest Management Handbook)。亦可參閱，〇wen 與 Hartzler (2004)， 2005 Herbicide Manual for Agricultural 47 200817524

Professionals， Pub. W C 92 Revised (Iowa State

University Extension, Iowa State University of Science and Technology, Ames, Iowa) ; Weed Control for Corn, Soybeans, and Sorghum， Chapter 2 of “2004 Illinois Agricultural Pest Management Handbook” (University of Illinois Extension, University of Illinois at Urbana-Champaign, Illinois) ； Weed Control Guide for Field Crops, MSU Extension Bulletin E434 (Michigan State University, East Lansing, Michigan)) o 表1 :除草劑抗性執行委員會雜草分類的縮減版 I. 乙醯乳酸合成酶抑制劑(美國雜草協會群組2) A.磺醯尿素類 1. 四嗤0^確隆(Azimsulftiron) 2. 氣痛石黃隆(Chlorimuron-ethy 1) 3. 曱續隆(Metsulftiron-methyl) 4. 煙確隆(Nicosulfiiron) 5. 玉續隆(Rimsulfiiron) 6. 甲喊績隆(Sulfometuron-methyl) 7. 嘴吩續隆(Thifensulfiiron-methyl) 8. 苯續隆(Tribenuron-methyl) 9. 醯0S 確隆(Amidosulftiron) 10. 免速隆(Bensulfiiron-methyl)

11. 氣續隆(Chlorsulfiiron) 12. 西速隆(Cinosulforon) 13. 環確隆(Cydosulfamuron) 14. 胺苯續隆(EthametsulfUron-methy 1) 15. 亞速隆(Ethoxysulfiiron) 16. 伏速隆(Flazasulforon) 17. 氟0^ 喊靖隆(Flupyrsulfiiron-methy 1) 18. 曱醢胺續隆(Foramsulfiiron) 19. 依速隆(ImazosulfUron) 20. 蛾甲確隆(Iodosulfiiron-methyl) 21. 曱續胺續隆(MesosulfUron-methyl) 22. 環氧嘴續隆(Oxasulfiiron) 23. 氟0f 確隆(PrimisulfUron-methyl) 24. 氧確隆(Prosulfliron) 48 200817524 25. 百速隆(PyrazosulfUron-ethyl) 26. 續酿續隆(Sulfosulfliron) 27. it 苯續隆(TriasulfUron) 28. 三氟咬橫隆(TrifloxysulfUron) 29. 氟胺續隆(Triflusulfliron-methyl) 30. 三氣曱續隆(Tritosulfiiron) 31. 氣°比咕績隆(HalosulfUron-methyl) 32. 氟°比續隆(Flucetosulfbron) B. 續酿基胺基幾基三嗤淋明類(Sulfony laminocarbony ltriazolinones) 1 ·氟酮續隆(Flucarbazone) 2.丙苯續隆(Procarbazone) C. 三吐咕咬類(Triazolopyrimidines) 1. 氯酯橫草胺(Cloransulam-methyl) 2. 唾喊續草胺(Fhimetsulam) 3. 雙氣橫草胺(Didosulam) 4. 雙氟續草胺(Florasulam) 5. 續草嗤胺(Metosulam) 6. 平速爛(Penoxsulam) 7. 曱氧橫草胺(Pyroxsulam) D. 氧基(硫)苯甲酸類(Pyrimidinyloxy(thio)benzoates) 1. 雙草醚(Bispyribac) 2. 環酯草醚(Pyriftalid) 3. 喊咬將草醚(Pyribenzoxim) 4. 喊硫草醚(Pyrithiobac) 5. 咕草醚(Pyriminobac-methyl) E. °米吐琳酮類(Imidazolinones) 1. 依滅草(Imazapyr) 2. 味草煙(Imazethapyr) 3. _坐喧琳酸(Imazaquin) 4. 曱咪0i 煙酸(Imazapic) 5. 米草酸(Imazamethabenz-methy 1) 6. 甲氧味草煙(Imazamox) II.其他除草劑一活性成分/附加作用模式 A.乙酿輔酶A叛化酶(Acetyl CoA carboxylase，ACCase)的抑制劑(美國雜草協會群組1) 1.芳氧基苯氧基丙酸類(Aryloxyphenoxypropionates, TOPs’） a. 精嗜禾靈(Quizalofop-P-ethy 1) b. 禾草靈(Diclofop-methy 1) c. 炔草酯(Clodinafop-propargyl) d. 精e惡吐禾草靈(Fenoxaprop-P-ethy 1) 49 200817524 e. 高效伏寄普(Fluazifop-P-butyl) f. 普拔草(Propaquizafop) g. 曱基合氣氟(Haloxyfop-P-methyl) h. 丁基賽伏草(Cyhalofop-butyl) i. 精喹禾靈 2.環己二明(Cyclohexanediones，4DIMs’） a. 亞汰草(Alloxydim) b. 丁苯草酿1 (Butroxydim) c. 划草同(Clethodim) d. 環殺草(Cycloxydim) e. 西殺草(Sethoxydim) f. 得殺草(Tepraloxydim) g. 將草嗣(Tralkoxydim)

50 200817524 B.光系統II (Photosystem II)的抑制劑一除草劑抗性執行委員會群組 C1/美國雜草協會群組5 1.三嗓類(Triazines) a. 草殺淨(Ametryne) b. 草脫淨(Atrazine) c. 氰乃淨(Cyanazine) d. 敵草淨(Desmetryne) e. 愛落殺pimethametryne) f. 撲滅通(Prometon) g. 佈滅淨(Prometryne) h. 普拔根(Propazine) i. 西碼淨(Simazine) j ·西草淨(Simetryne) k. 特丁通(Terbumeton)

l. 特丁津(Terbuthylazine) m.特丁淨(Terbutryne) n.草達津(Trietazine) 2 ·三嗓綱類(Triazinones) a. 菲殺淨(Hexazinone) b. 滅必淨(Metribuzin) c. 苯草 K (Metamitron) 3. 三唾琳網類(Triazolinone) a.氨σ坐草 _ (Amicarbazone) 4. 尿嘲唆類(Uracils) a. 克草(Bromacil) b. 環草定(Lenacil) c. 特草定(Terbacil) 5. 嚷嗓酮類(Pyridazinones) a.殺草敏(Pyrazon) 6. 苯基氨基甲酸類(Phenyl carbamates) a. 甜菜安(Desmedipham) b. 甜菜寧(Phenmedipham) C.光系統II的抑制劑一除草劑抗性執行委員會群組C2/美國雜草協會群組7 1.尿素類 a. 可奪草(Fluometuron) b. 理有龍(Linuron) c. 滅落寧(Chlorobromuron) 51 200817524 d. 綠麥隆(Chlorotoluron) e. 枯草隆(Chloroxuron) f. α惡嗤隆(DimefUron) g·達有龍(Diuron) h. 續嗟隆(Ethidimuron) i. 非草隆(Fenuron) j ·異丙隆(Isoproturon) k. 愛速隆(Isouron) l. 甲基苯售隆(Methabenzthiazuron) m.撲多草(Metobromuron) n.曱氧隆(Metoxuron) 〇.綠谷龍(Monolinuron) p. 草不龍(Neburon) q. 環草隆(Siduron) r. 丁嘆隆(Tebuthiuron)

2.醢胺類(Amides) a. 除草靈(Propanil) b. 曱氯草胺(Pentanochlor) D.光系統II的抑制劑一除草劑抗性執行委員會群組C3/美國雜草協會群組6 1. 腈類(Nitriles) a. 漠紛躬(Bromofenoxim) b. 溴苯(Bromoxynil) c. 蛾苯(Ioxynil) 2. 苯並0S嗤(Benzothiadiazinone)(本達隆） a.本達隆(Bentazon) 3. 苯基嚷嗪類(Pheny lpyridazines) a. 必汰草(Pyridate) b. 必汰弗(Pyridafol) E. 光系統I-電子轉移-聯°比咬類(Bipyridyliums)(美國雜草協會群組22) 1, 大刈(Diquat) 2. 巴拉刈(Paraquat) F. 原卟琳原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase，PPO)的抑制劑(美國雜草協會群組14) 1.聯苯醚類(Dipheny lethers) a. 亞喜芬納鹽(Acifluorfen-Na) b. 必芬諸(Bifenox) c. 甲氧基護谷(Chlomethoxyfen) d. 乙叛氟草醚(Fluoroglycofen-ethyl) 52 200817524 e. 氟讀胺草謎(Fomesafen) f. 鹵胺草醚(Halosafen) g. 乳氟禾草靈(Lactofen) h. 復祿芬(Oxyfluorfen) 2. 苯基ϋ 比嗤類(Phenylpyrazoles) a. 異丙°比草醋(Fluazolate) b. σ比草 ^(Pyraflufen-ethy 1) 3. N-苯駄 S& 亞胺類(N-phenylphthalimides) a. 叫丨α朵酮草酯(Cinidon-ethyl) b. 丙炔氟草胺(Flumioxazin) c. 氟稀草酸(Flumiclorac-pentyl) 4. 售二峻類(Thiadiazoles) a. 達草氟(Fluthiacet-methy 1) b. 售二 e坐草胺(Thidiazimin) 5. e惡二唾類(Oxadiazoles) a. 樂滅草(Oxadiazon) b. 丙炔e惡草酮(Oxadiargyl) 6. 三唑啉酮類 a. 乙基克繁草(Carfentrazone-ethy 1) b. 曱續草胺(Sulfentrazone) 7. 嗔σ坐咬二 _ 類(Oxazolidinediones) a. 環戊惡草綱(Pentoxazone) 8. 嘴咬二酮類(Pyrimidindiones) a.雙苯痛草洞(Benzfendizone) (j b. 丁芬咏(Butafenicil) 9. 其他 a. 氣唑腈(Pyrazogyl) b. 氟唑草胺(Profluazol) G.漂白：抑制八氫番茄紅素去飽和酶步驟(phytoene desaturase step, PDS)之類胡蘿蔔素(carotenoid)的生物合成(美國雜草協會群組12) 1. 噠嗪酮類 a.氟草敏(Norflurazon) 2. σ 比咬曱酿胺類(Pyridinecarboxamides) a. °比氟草胺(Diflufenican) b. 氟σ比草胺(Picolinafen) 53 200817524 3.其他 a. 氟丁酿草胺(Beflubutamid) b. 氟咬草酿1 (Fluridone) c. I咯草嗣(Flurochloridone) d. 咬草 _ (Flurtamone) H. 漂白：抑制4-羥基苯基-丙酮酸-雙氧化酶 (4-hydroxyphenyl-pyruvate-clioxygenase, 4-HPPD)(美國雜草協會群組 28) 1 ·三酮類(Triketones) a. 石肖草酮(Mesotrione) b. 石黃草酮(Sulcotrione) 2. 異α惡嗤類(Isoxazoles) a. 異1^惡氣草酮(Isoxachlortole) b. 異11惡嗤草綱(Isoxafkitole) 3. °比《»坐類(Pyrazoles) a. °比草嗣(Benzofenap) b. 匹σ坐芬(Pyrazoxyfen) c. 苄草吐(Pyrazolynate) 4.其他 a.雙環續草酮(Benzobicyclon) I.漂白：抑制類胡蘿蔔素的生物合成(未知目標物)(美國雜草協會群組11與13) 1.三嗤類(Triazoles)(美國雜草協會群組11) a.氨基三嗤(Amitrole) 2. 異嗔唑酮類(Isoxazolidinones)(美國雜草協會群組13)

a.可滅縱(Clomazone) 3. 尿素類 a.可奪草 4. 聯苯醚類 a.苯草醚(Aclonifen) J. 抑制EPSP(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸）合成酶 1.甘胺酸類(Glycines)(美國雜草協會群組9) a. 嘉磷塞 b, 草硫膦(Sulfosate) K. 麩醯胺酸合成酶的抑制 1.次膦酸類 a.固殺草(Glufosinate-ammonium) 54 200817524 b.畢拉草(Bialaphos) L.抑制雙氫葉酸(dihydropteroate，DHP)合成酶(美國雜草協會群組18) 1.氨基曱酸類(Carbamates) a.亞速爛(Asulam) Μ.抑制微管(Microtubule)組成(美國雜草協會群組3) 1 ·二硝基苯胺類(Dinitroanilines) a. 倍芬尼(Benfluralin) b. 比達寧(Butralin) c. 撻乃安(Dinitramine) d. 乙丁烯氟靈(Ethalfluralin) e. 歐拉靈(Oryzalin) f. 施得圃(Pendimethalin) g. 三福林(Trifluralin) C 2.填醢胺酯類(Phosphoroamidates) a. 甲基胺草膦(Amiprophos-methy 1) b. 抑草破(Butamiphos) 3. 吡啶類 a. 汰硫草(Dithiopyr) b. 售草唆(Thiazopyr) 4. 苯甲醯胺類(Benzamides) a. 拿草特(Pronamide) b. 牧草胺(Tebutam) 5. 苯二甲酸類(Benzenedicarboxylic acids) a.大克草(Chlorthal-dimethy 1) C/ N.抑制有絲分裂/微管組成(美國雜草協會群組23) 1.氨基曱酸類 a. 克普芬(Chlorpropham) b. 苯胺靈(Propham) c. 雙草胺(Carbetamide) 0.抑制細胞分裂(建議機制，抑制超長鏈脂肪酸類；美國雜草協會群組15) 1.氣乙酿胺類(Chloroacetamides) a. 乙草胺(Acetochlor) b. 拉草(Alachlor) c. 丁基拉草(Butachlor) d. 二甲草胺(Dimethachlor) e. 二甲滅(Dimetiianamid) 55 200817524 f. 滅草胺(Metazachlor) g. 莫多草(Metolachlor) h. 烯草胺(Pethoxamid) i. 普拉草(Pretilachlor) j. 毒草胺(Propachlor) k. 異丙草胺(Propisochlor) l. 欣克草(Thenylchlor) 2. 乙醯胺類(Acetamides) a. 大芬滅(Diphenamid) b. 滅落脫(Napropamide) c. 萘普草(Naproanilide) 3. 氧乙酿胺類(Oxyacetamides) a. 氟售草胺(Flufenacet) b. 滅芬草(Mefenacet) 4. 四 °坐琳酿I 類(Tetrazolinones) a.四嗤草胺(Fentrazamide) 5. 其他 a. 莎稗鱗(Anilofos) b. σ坐草胺(Cafenstrole) c. 茚草綱(Indanofan) d. α底草罐(Piperophos) P.抑制細胞壁(纖維素)的合成 1. 腈類(美國雜草協會群組20) a. 二氣苯腈(Dichlobenil) b. 草克樂(Chlorthiamid)

2. 苯曱醯胺類(異噁草胺)(美國雜草協會群組21)) a.異β惡草胺(Isoxaben) 3. 三σ坐甲醮胺類(Triazolocarboxamides)(氟胺草嗤） a.氟胺草嗤(Flupoxam) Q·去耦連(細胞膜瓦解）：（美國雜草協會群組24) 1.二硝基紛類(Dinitrophenols) a. 二硝基鄰曱酚(DNOC) b. 達諾殺 CDinoseb) c. 特樂紛(Dinoterb) R.除了抑制乙醯輔酶A羧化酶之外的脂質合成抑制 1.硫代氨基甲酸酯(Thiocarbamates)(美國雜草協會群組8) 56 200817524 a. 拉敵草(Butylate) b. 環草敵(Cycloate) c. 狐草丹(Dimepiperate) d. 茵草敵(EPTC) e. 禾草畏(Esprocarb) f. 禾草敵(Molinate) g. 坪草丹(Orbencarb) h. 克草猛(Pebulate) i. 苄草丹(Prosulfocarb) j. 殺丹(Benthiocarb) k. 仲草丹(Tiocarbazil) l. 野麥畏(Triallate) m.萬隆(Vemolate) 2. 二硫代填酸酯類(Phosphorodithioates) a·地散填(Bensulide) 3. 苯咬喃類(BenzofUrans) a. 吱草續(BenfUresate) b. 乙吱草橫(Ethofiimesate) 4. 鹵化醇酸類(Halogenated alkanoic acids)(美國雜草協會群組26) a·三氣乙酸(TC A) b. 得拉本(Dalapon) c. 氟丙酸(Flupropanate) u 57 200817524 S. 合成生長素(類似吲哚乙酸「ΙΑΑ」）(美國雜草協會群組4) 1 ·苯氧緩酸類(Phenoxycarboxylic acids) a. 克普草(Clomeprop) b. 二•四·地(2,4-D) c. 二曱四氯丙酸(Mecoprop) 2. 苯曱酸類(Benzoic acids) a. 汰克草(Dicamba) b. 克攔本(Chloramben) c. 三苯曱酸(TBA) 3. °比咬經酸類(Pyridine carboxylic acids) a. 畢克草(Clopyralid) b. 氟氣比(Fluroxypyr) c. 毒莠定(Picloram) d. 三環比(Tricyclopyr) 4. 喧淋經酸類(Quinoline carboxylic acids) a. 快克草(Quindorac) b. 啥草酸(Quinmerac) 5·其他(草除靈乙酯） a.草除靈乙酯(benazolin-ethyl) T. 抑制生長素的運送 1. 鄰苯甲醯胺曱酸類（Phthalamates);縮氨基脲類 (semicarbazones)(美國雜草協會群組19) a. 鈉得爛(Naptalam) b. 氟草腙鈉鹽(Diflufenzopyr -Na)

U.其他作用機制 1. 芳氨基丙酸類(Arylaminopropionic acids) a.高效麥草伏甲酯(Flamprop-M-methyl)/-異丙基 2. σ 比嗤琳(Pyrazolium) a.野燕枯(Difenzoquat) 3. 有機珅類(Organoarsenicals) a. 曱基砷酸二鈉(DSMA) b. 甲基胂酸鈉(MSMA) 4. 其他 a. 溴芬諸(Bromobutide) b. 環庚草醚(Cinmethylin) c. 苄草隆(Cumyluron) 58 200817524 d. 邁隆(Dazomet) e. 殺草隆甲醋(Daimuron-methyl) f. 殺草隆(Dimuron) g. 乙氧苯草胺(Etobenzanid) h. 殺木膦(Fosamine) i. 斯美地(Metam) j · °惡嗪草酮(Oxaziclomefone) k·油酸(Oleic acid) 1·壬酸(Pelargonic acid) m·稗草畏(Pyributicarb) 一實施例中，對3 560·4·3·5大豆作物或耕種區域施加一種乙酿乳酸合成酶抑制劑或至少兩種乙醯乳酸合成酶抑制劑。非限制性實施例中，乙醯乳酸合成酶抑制型除草劑的組合物可包括或不包括嘉磷塞。可以用任何有效比例施加乙醯乳酸合成酶抑制劑，該比例選擇性地控制雜草且不會明顯地傷害作物。特定實施例中，以明顯傷害相稱對照植株之濃度施加至少一種乙醯乳酸合成酶抑制劑。其他實施例中’以高於作物建議標籤之使用比例施加至少一種乙酿乳酸合成酶抑制劑。又其他實施例中，以低於建議使用比例施加乙醯乳酸合成酶抑制劑的混合物並持續選擇性地控制雜草。抑制乙醯乳酸合成酶（亦稱為乙醯羥酸合成酶「acetohydroxy acid synthase」）且因此應用於方法中的除草劑包括表1所列的續醯尿素類，而這包括其農業上適當之鹽類（例如，鈉鹽）；表1所列的磺醯胺基羰基三唑啉酮類（sulfonylaminocarbonyltriazolinones)，而這包括其農業上適當之鹽類（例如，鈉鹽）；表1所列的三唑嘧咬類，而這包括其農業上適當之鹽類（例如，鈉鹽）；表1所列的 ’咬乳基（硫）本甲酸類，而這包括其農業上適當之鹽類（例如，鈉鹽）；以及表1所列的咪唑啉酮類，而這包括其農 59 200817524 業上適當之鹽類（例如，鈉鹽）。某些實施例中，方法包括應用不是氯續隆、氯續隆、玉喊續隆、°塞吩續隆或苯石黃隆的磺醯尿素。更進一步方法中，嘉磷塞，可單獨施加或與其他關注之除草劑共同施加於3560.4.3.5大豆植株或其耕種區域。表2提出嘉磷塞成份的非限制性實例。特定實施例中，嘉磷塞以鹽類形式存在，諸如銨鹽、異丙胺鹽 (isopropylammonium)、鉀鹽、鈉鹽（包括，倍半鈉鹽「sesquisodium」）或三甲基硫鹽「trimesium」（或者稱為 C 草硫膦）。更進一步實施例中，對3 560.4.3.5大豆植株或其耕種區域施加協同作用有效劑量之嘉磷塞與乙醯乳酸合成酶抑制劑（例如，確醯尿素）的組合物。 60 200817524 表2.嘉磷塞成份的比較除草劑(註冊商標）製造商鹽類活性成酸當量/應用：安酸當量/ 分/加崙加崙士 /公頃公頃

Roohdup OrfgM Roundup Original II

Roundup UltraMax Boumiup UitraMax \t Rour^dup Weathermax touchdown ToLKjhdpvyr» HiTech Tpwchckm Total

Monsanto Monsanto l^tonsanto Monsanto

Glyphomax Plus OfypTiomixXFrr Giy Star Plus GtyStar5 Gly Star Original Giy-Flo Credit Crecfit Extra Credit Duo Oedit OiK> Extra Extra Credit 5 OcMnerstone Cornerstone PlusIIBeilliil Glyfos X*TRA

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teopFOpylarrsne 【sopropyterrNne Rotassta Isopropyianiine PotassiuiTS Potassium Ofeiwwiym Potassium Potassii^n fsopropylafTwr>e isopfopyfafTBna Isopropyia feopropyfa isopropylamirie lisopropyfeuttlrie isopropyiamine f鄉ro_rr^rie ^sopropyiarnra teopropyfamine Isopro. +· moncamm. teopra. monoamrti* tsopropylarrane Isopropytsmine Isopropyfamtrie feopropyiamlfie isopropyiarnin® Isopropyfeinine fsoprOpyiamine feopropytarninie 啤 propylamine bopro_mir>e isopropyfarmne isopF物刚 iSOpropyiamTO faminefamine .5.3 uv.%.te.14.4:..;.: .,4 445.55,5.3.6.5.5.,44 4 45,444 4 isopropylam^ne isopropyMne i sopropy iamineIsopropyiarmne isopropylamine tsopropyiarrar^ tecpropyfemirie fsopropyiarnine

4 - 5444444-^4444444 44444444S 32322226S12232202424S3232243232323232!263232323232s3232'3232323232323232i32一 $68¾ 多 5 ii .,¾. .Γ! ::部..！ , ' 33 4- 0^4 4-3 5 4433334 3 3 3 33 33,3333 333-3333 33 3 33 S 3333:? α?5〇 0.750 0,773 QJ4S 0.773 07730.7^ο.?δΐ0782 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750 0；?50 0750 0.750 0.750ojm 0.750 0J50 QJ4B 0.750 0,750Q.rm 0,750 0.750 0,750 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750 0.750 0J60 0.750 61 0750 200817524

因此’某些實施例中’基因轉殖植株可用於藉由應用該植株可忍受之除草劑而種植3560.4.3.5大豆作物之方法中。此種方式中，以一或多種除草劑之組合物處理作物，該多種除草劑包括（但不限於）：所揭示的乙草胺、亞喜芬與其鈉鹽、苯草醚、丙烯醛（acr〇lein)(2-丙烯醛「2-propenal」）、拉草、亞汰草、草殺淨（ametryn)、氨嗤草_ '醯喊續隆、氯氨吼咬酸（aminopyralid)、氨基三β坐、氨基石黃酸敍（ammonium sulfamate)、莎稗碌、亞速爛、草脫淨、四唑嘧磺隆、氟丁醯草胺、草除靈（benaz〇Hn)、草除靈乙酯、倍卡貝嗤（benearbazone)、倍芬尼、咬草橫、免速隆、地散罐、本達隆、雙環橫草酮、σ比草酮、必芬諾、畢拉草（bilanafos)、雙草醚與其鈉鹽、克草、溴芬諾、溴盼聘、溴苯、辛溴苯（bromoxynil octanoate)、丁基拉草、氟丙嘧草酯（butafenacil)、丁胺磷（butamifos)、比達寧、丁苯草酮、拉敵草、唑草胺、雙草胺、乙基克繁草、兒茶素（catechin)、甲氧基護谷、克攔本、氯溴隆 (chlorbromuron)、氯曱丹（chlorflurenol-methyl)、氯草敏 (chloridazon)、氯嘧磺隆、綠麥隆、克普芬、氯磺隆、大克草、草克樂、吲哚酮草酯、環庚草醚、西速隆、剋草同、炔草酯、可滅蹤、克普草、畢克草、畢克草-乙醇胺 (clopyralid-olamine)、氯酯橫草胺、CUH-35(2-曱氧乙基 2-[[[4-氯-2-氟-5-[(1-甲基-2-丙炔基）氧基]苯基](3 -氟苯曱醯）胺基]羰基]-1-環己烷-1-羧酸鹽）（2-meth〇xyethyl 2-[[[4-chloro-2-fluoro-5-[(l-methyl-2-propynyl)oxy]-phenyl] (3-fluorobenzoyl)- amino]carbonyl]-l-cyclohexene-l-carboxylate)、苄草隆、 62 200817524

氰乃淨、環草敵、環磺隆、環殺草、丁基賽伏草、二•四 -地（2,4-D)與其丁氧基乙基（butotyl)、丁基、辛基與異丙基醋類與其二甲基胺鹽、二乙醇胺（diolamine)鹽與三乙醇胺（trolamine)鹽、殺草隆、得拉本、得拉本鈉鹽、邁隆、二•四-滴丁酸（2,4-DB)與其二甲基胺鹽、鉀鹽與鈉鹽、甜菜安、敵草淨（desmetryn)、汰克草與其二乙二醇胺鹽 (diglycolammonium)、二甲基胺鹽、鉀鹽與鈉鹽、二氯苯腈、2,4-滴丙酸（dichlorprop)、禾草靈、雙氯續草胺、野燕枯甲硫酸鹽（difenzoquat metilsulfate)、σ比氟草胺、氟β比草腙、σ惡嗤隆、σ瓜草丹、二甲草胺、愛落殺（dimethametryn)、汰草滅（dimethenamid)、高效二曱吩草胺、穫萎得 (dimethipin)、雙甲基石申酸（dimethylarsinic acid)與其鈉鹽、撻乃安、特樂紛、大芬滅、敵草快（diquat dibromide)、汰硫草、達有龍、二硝基鄰曱酚、茵多酸（endothal)、茵草敵、禾草畏、乙丁烯氟靈、胺苯磺隆 (ethametsulfuron-methyl)、乙吱草橫、氯敗草謎 (ethoxyfen)、亞速隆、乙氧苯草胺、噁唑禾草靈 (fenoxaprop-ethyl)、精°惡°坐禾草靈、四唾草胺、非草隆、去草隆（fenuron-TCA)、麥草伏甲酯（flamprop-methyl)、高效麥草伏丙酯（flamprop-M-isopropyl)、高效麥草伏曱酯、伏速隆、雙氟績草胺、伏寄普（fluazifop-butyl)、高效伏寄普、氟_石黃隆、氟°比確隆、貝殺靈（fluchloralin)、氟嘆草胺、氟噠嗪草酯（flufenpyr)、氟噠嗪草乙酯 (flufenpyr-ethyl)、嗤哺橫草胺、氟烯草酸、丙炔氟草胺、可奪草、乙羧氟草醚、氟啶嘧磺隆與其鈉鹽、抑草丁 (flurenol)、抑草丁丁酯（flurenol-butyl)、氟唆草酮、氟嘻 63 200817524 草酮、氟氯比、吱草酮、嚷草氟、氟續胺草趟、曱醯胺續隆、調節磷（fosaime-ammonium)、草錄膦（giufosinate)、固殺草、嘉構塞與其鹽類（諸如，胺鹽、異丙胺鹽、舒鹽、納鹽（包括，倍半鈉鹽）與三曱基硫鹽（或者稱為草硫膦））、氣0比嘧績隆、°比氟曱禾靈乙氧基乙酯（haloxyf0p-et〇tyl)、η匕氟曱禾靈曱酯（haloxyfop-methyl)、菲殺淨、 HOK-201(iV-(2,4-二氟苯基）-1，5-二氫-1(1-曱基乙基酮-1_[(四氫-2 7:/-17瓜0^-2-基）曱基]-4//-1，2,4-三唾-4-酿胺） (iV-(2,4-difluorophenyl) -1，5-dihydro-iV-(l-methylethyl) - 5-

Ο oxo-l-[(tetrahydro-2//-pyran-2-yl)- methyl]-47f-1，2,4-triazole-4-carboxamide)、口东草酸、甲氧 p米草煙、曱σ米嗤煙酸、依滅草、味嗤喧琳酸、咪σ坐啥琳酸胺鹽（imazaquin-ammonium)、哺草煙、口米草煙胺鹽 (imazethapyr - ammonium)、依速隆、茚草_、破甲續隆、破苯、辛破苯（ioxynil octanoate)、雄苯鈉鹽 (ioxynil-sodium)、異丙隆、愛速隆、異噁草胺、異噁唑草嗣、異°惡氣卓綱、乳乱禾卓靈、環卓定、理有龍、抑芽素 (maleic hydrazide)、2 -甲基-4-氣苯氧基乙酸（MCPA)與其鹽類（例如，MCPA二曱基胺鹽、MCPA鉀鹽與MCPA鈉鹽）、酯類（例如，MCPA-2-乙基己酯、MCPA-丁氧基乙酯）與硫酯類（例如，MCPA-硫乙酯）、4-4-氯-2-甲基苯氧基丁酸（MCPB)與其鹽類（例如，MCPB鈉鹽）與酯類（例如，MCPB 乙酯）、二曱四氯丙酸、精二曱四氣丙酸、滅芬草、氟磺草胺（mefluidide)、甲續胺確隆、硝草酮、斯美地鈉鹽 (metam-sodium)、σ惡嗤醯草胺（metamifop)、苯草酮、滅草胺、甲基苯嗟隆、甲基砰酸（methylarsonic acid)與其i丐 64 200817524 鹽、單銨鹽、單鈉鹽與二鈉鹽、甲基殺草隆 (methyldymron)、吡喃隆（metobenzuron)、撲多草、莫多草、異丙曱草胺（S-metholachlor)、石黃草σ坐胺、甲氧隆、滅必淨、甲磺隆、禾草敵、綠谷龍、萘普草、滅落脫、鈉得爛、草不龍、煙嘧磺隆、氟草敏、坪草丹、歐拉靈、丙炔噁草酮、樂滅草、環氧嘧磺隆、噁嗪草酮、復祿芬、巴拉別二氯鹽（paraquat dichloride)、克草猛、壬酸、施得圃、平速爛、曱氯草胺、環戊惡草酮、黃草伏（perfluidone)、佩索密（pethoxyamid)、甜菜寧、毒莠定、毒莠定鉀鹽、氟 0比草胺、拼沙登（pinoxaden)、派若斯（piperofos)、普拉草、氟0§石黃隆、氨氟樂靈（prodiamine)、環苯草酮 (profoxydim)、撲滅通、佈滅淨（prometryn)、毒草胺、除草靈、普拔草、普拔根、苯胺靈、異丙草胺、丙苯磺隆 (propoxycarbazone)、戊炔草胺（propyzamide)、苄草丹、氟確隆、雙唑草腈（pyraclonil)、β比草醚、派索托 (pyrasulfotole)、派唾基（pyrazogyl)、苄草嗤、匹吐芬、百速隆、嘧啶肟草醚、稗草畏、必汰草、環酯草醚、嘧草醚、派嘧芬（pyrimisulfan)、嘧硫草醚、嘧硫草醚鈉鹽 (Pyrithiobac-sodium)、曱氧石黃草胺、快克草、啥草酸、莫克草（quinoclamine)、快伏草（quizalofop-ethyl)、精啥禾靈、糖草酯（quizalofop-P-tefuryl)、玉嘧橫隆、西殺草、環草隆、西碼淨、西草淨（simetryn)、石黃草_、曱石黃草胺、曱嘧磺隆、磺醯磺隆、2,3,6-三氯苯酸（2,3,6-TBA)、三氯乙酸（TCA)、三氯乙酸鈉、牧草胺、丁噻隆、特律三酮 (tefuryltrione)、特普三酮（tembotrione)、得殺草、特草定、特丁通、特丁津、特丁淨（terbutryn)、欣克草、售草淀、 65 200817524 嘆卡巴腙（thiencarbazone)、噻吩續隆、殺丹 (thiobencarb)、仲草丹、拓普梅腙（t〇pramez〇ne)、肟草酮、野鸪畏（tri-allate)、醚苯磺隆、三嗪氟草胺（triaziflam)、苯續隆、綠草定（triclopyr)、綠草定-丁氧基乙酯、綠草疋-二乙基錄鹽、滅草環（tridiphane)、草達津、三氟唆績隆、三福林、氟胺磺隆、三氟曱磺隆與萬隆。

技術中習知其他適當的除草劑與農業化學物質，例如描述於W0 2005/041654中之那些物質。其他的除草劑亦包括生物除草劑’諸如白鱗鍵格抱

Simmons、炭疽病菌g/oeospor/odaKPenz·)

Penz. & Sacc.、稗内臍蠕孢菌 monoceras)(MTB^95l)、氣孢漆斑蛰（Myrothecium verrwcar’a)(Albertini & Schweinitz) Ditmar : Fries、紫斑疫病議（Phytophthora palmivora)(B\xi\·) Butl.以及薪蓂柄銹菌（Pwcc/Wa iA/aaew) Schub·等菌。不同除草劑的組合可導致對雜卓局於加成的效應（即’協同）與/或對作物或其他所欲的植株低於加成的效應（即，安全）。某些實例中，嘉磷塞與其他除草劑（具有相似的調控範圍但不同的作用模式）的組合物將特別有利於預防耐藥性雜草的生長。熟悉技術人士可透過簡單試驗輕易地決定任何特定除草劑的有效劑量。可參照如上述之作用模式將除草劑分為群組與/或子群組，或可依照其化學構造將其分為群組與/或子群組。磺醯胺（sulfonamide)類除草劑具有一基本的分子結構，其特徵為磺醯胺基團（-S(0)2NH-）。而關於此文，磺醯胺類除草劑特別包括磺醯尿素類除草劑、磺醯胺基羰基 66 200817524 三唑啉酮類除草劑與三唑哺岭相a杖w * 巧疋類除草劑。石頁醯尿素類除草劑中，磺醯胺基團為磺酿尿素橋（―s(o)2Nhc(o)nh(r)_) 的-部份。靖醢尿素㈣草劑中，續醯尿素橋㈣酿端係直接或間接（藉由氣原子或；^ # μ 4矾憒況取代的胺基或亞甲基）地連接於一般經取代的環或非環基團。磺醯尿素橋的另外一端，胺基基團（其4有不I氫的替代基，例如甲基（R為 CH3))連接於異裱基團，該異環基團一般為對稱的嘧啶或二嗪環，且该異環基團具有一或兩個取代基（諸如，曱基、乙基、二氟甲基、甲氧基、乙氧基、曱胺基、二甲胺基' 乙胺基與齒素）。磺醯胺基羰基三唑啉酮類除草劑中，續醯胺基團為磺酿胺基羰基橋（一S(0)2NHC(0)-）的一部分。磺醯胺基羰基二唾啉酮類除草劑中，磺醯胺基羰基橋的磺醯端一般連接於經取代的苯環。磺醯胺基羰基橋的另一端，羰基連結於三唑啉酮環的1號位置，而三唑啉酮環一般被諸如烧基與烧氧基的基團取代。三嗤癌咬類除草劑中，磺醢胺基團的磺醯端連結於經取代之[1，2,4]三唑嘧咬環系統的2號位置，而磺醯胺基團的胺基端連結於經取代的芳基（一般為苯基）基團；或者磺醯胺基團的胺基端連結於經取代之[1，2,4]三唑嘧啶環系統的2號位置，而磺醯胺基團的續醯端連結於經取代的芳基（一般為α比啶基）基團。應用於實施例中的典蜜磺醯尿素類除草劑具有下方之式：

X

其中： 67 200817524

j選自下列所構成的群組中：

J-7 J-8

J-10 Ml J-3

J-12

J-13 J-14

R12 •，或 J 為 RUsC^NCCHy-; R為Η或CH3 ; 68 200817524 R1 為 F、Cl、Br、N02、C 广C4 烷基、C!—C4 鹵烷基、 C3-C4環烧基、C2-C4 _烯基、Cl-C4烧氧基、Cl-C4 鹵烧氧基、C2-C4烧氧烧氧基（alkoxyalkoxy)、 C02RH、C(0)NR15R16、s〇2NR”R18、S(〇)nR19、 C(0)R2〇、CH2CN 或 L ; R2 為 H、F、Cl、Br、I、CN、CH3、OCH3、SCH3、 CF3 或 OCF2H ;

R3 為 Cl、N02、C02CH3、C02CH2CH3、C(0)CH3、 C(0)CH2CH3、C(O)-環丙基、S02N(CH3)2、S02CH3、 S02CH2CH3、OCH3 或 OCH2CH3 ; R4為Ci 一 C3烧基、Ci 一 C2齒烧基、Ci 一 C2烧氧基、C2 — C4 鹵烯基、F、Cn、Br、N02、C02R14、C(0)NR”R16、 SC^NRnRW、S(0)nR19、C(0)R20 或 L ; R5 為 H、F、Cl、Br 或 CH3 ;

R6為（：广(：3烷基，其可選擇性地以0-3個F、0-1個 C1與0-1個C3-C4烷氧基乙酿氧基取代；或者R6 為 CrCs 烷氧基、C2 — C4 鹵烯基、F'CbBr、C02Rl4、 C(0)NR15r16 . S02NR17R18 > S(0)nRl9 , C(0)R2〇或L ; R7 為 H、F、Cl、CH3 或 CF3 ; R8為H、Ci-C^烷基或吡啶基； R9 為 <：丨一(：3 烷基、CrC2 烷氧基、F、Cl、Br、N02、 co2r"、s〇2NRPR18、S(0)nRl9、〇CF2H、C(0)R2〇、 C2 — C4齒稀基或L ;

Rl〇為H、Cl、F、Br、（：丨一C3烷基或^—(^烷氧基； 69 200817524 R11為H、C! 一 C3烧基、〇广匸2烧氧基、C2-C4鹵稀基、 F、C1、Br、C02R14、（^(CONR15!^、s〇2NR17R18、 S(0)nRl9、C(0)R2〇或 L ; R12為鹵素、CrQ烷基或Ci-q烷基磺醯基 (alkylsulfonyl)；

Ri3為Ci-C4烧基； R14為烯丙基（allyl)、炔丙基（propargyl)或氧雜環丁 3 基（oxetan-3-yl);或者尺14為Cl — C3烷基，其可選擇性地被至少一下列成員所取代：由鹵素、c〜匸烷氧基與CN中獨立地挑出； 2 R15為H、Ci —C3烧基或Cj-C]烧氧基；

Ri6為C!-c〗烧基； R17為H、Ci-C：3烷基、Ci-C：2烷氧基、烯丙基或罈基；衣丙 R18為Η或Ci-C^烷基； R19為（：丨-(：3烷基、（：丨一(：3鹵烷基、烯丙基或炔丙美. R20為烷基、c^ — c：4鹵烷基或選擇性地以鹵素取代的c3-c5環烷基； η 為〇、1或2 ; L 為 /R21 ΓΝ\ . "γΝ ， L1 為 CH2、ΝΗ 或 Ο ; R21為Η或Ci~〇3院基； 70 200817524 X為H、C1-C4院基、Ci — C4烧氧基、Ci—C4鹵烧氧基、 cl-C4 鹵烷基、Ci-C^ 鹵烷硫基（haloalkylthio)、 Ci-C4烧硫基、齒素、C2-C5烧氧基烧基、C2_C5 烷氧烷氧基、胺基、C〗-C3烷胺基（alkylamino)或一（Ci-C3烧基）胺基； Y為Η、(：厂C4烷基、Ci-C^烷氧基、（^-04鹵烷氧基、 C 1 - C 4烧硫基、Ci-C4鹵烧硫基、C 2 - C 5烧乳基烧基、C2-C5院乳烧氧基、胺基、Ci-C3烧胺基、二 (q-c3烷基）胺基、c3-c4烯氧基、c3-c4炔氧基、 c2-c5烷硫基烷基、c2-c5烷亞磺醯基烷基 (alkylsulfinylalky 1) 、C2-C5 烧石黃醯基烧基 (alkylsulfonylalkyl) 、C1-C4 鹵烧基、C2 — C4 炔基、C3-C5環烷基、疊氮基或氰基；以及 Z為CH或N ; 假設（i)當X與Y其中之一或兩者均為Ci鹵烷氧基

時，那麼Z為CH;以及（ii)當X為鹵素時，那麼Z為CH 且 Y 為 och3、och2ch3、n(och3)ch3、nhch3、n(ch3)2 或ocf2h。值得注意的是本發明唯一液體形式的除草劑組合物包括一或多種式I的磺醯尿素，其中當R6為烷基時，該烷基未經取代。仔細考慮可應用於實施例中的典型三唑嘧啶類除草劑具有下方之式：

71 200817524 其中： R22與R23各自獨立為鹵素、硝基、C】-C4烧基、C丨-匸斗鹵燒基、CrC4烧氧基、Ci-C4鹵烧氧基或C2-C3 烷氧基羰基； R24為Η、鹵素、Ci-C〗烷基或CrC2烷氧基； W 為-N H S (〇) 2-或-S (〇) 2 N Η -， Υ1為H、Ci-C〗烷基或Ci-Cz烷氧基； Y2為H、F、Cl、Br、Ci—C〕烧基或C〗-C2烧氧基， Y3為H、F或曱氧基； Z1為CH或N;以及 Z2為CH或N ; 先決條件為Y1與Y2至少其中之一不是H。上述典型三a圭嘧咬除草劑的馬庫西（Markush)說明中，當 W為-NHS(0)2 -時，續醢胺基團的續酿端連接於 [1，2,4]三嗤嘴贫環系統，而當〜為-8(0)2>^11-時’續酿胺基團的胺基端連接於[1，2,4]三唑嘧咬環系統。上述中，不論單獨應用之詞彙「烷基」或複合詞（諸如’ 「烷硫基」或「鹵烷基」）中，均包括直鏈或支鏈烷基，諸如甲基、乙基、正丙基（[propyl)、異丙基Opropyl)或丁基不同的同分異構物。「環烷基」包括，諸如環丙基、環丁基與環戊基。「烯基」包括直鏈或支鏈的烯烴，諸如乙烯、1-丙烯、2 -丙烯與丁烯不同的同分異構物。「烯基」亦包括多烯烴，諸如1，2-丙二烯（l，2-propadienyl)與2,4-丁二烯（2,4-butadienyl)。「炔基」包括直鏈或支鏈的炔烴，諸如乙快、1-丙快、2 -丙快與丁缺不同的同分異構物。「快 72 200817524 基」亦包括由多個三鍵組合而成的基團，例如 2,5 -己-炔。「烷氧基」包括，諸如甲氧基、乙氧基、正丙氧基 («-propyloxy)、異丙氧基與丁氧基不同的同分異構物。「院氧基烷基」代表烷氧基取代於烷基上。「烷氧基烷基」的實例包括 CH3OCH2、CH3OCH2CH2、CH3CH20CH2 > CH3CH2CH2CH2OCH2 與 CH3CH2OCH2CH2。「烷氧燒氧基」代表烷氧基取代於烷氧基上。「烯氧基」包括直鏈或支鏈的烯氧基基團。「烯氧基」的實例包括、 (ch3)ch=chch2o 與 ch2 = chch2ch2o。「炔氧基」包括直鏈或支鍵的炔氧基基團。「炔氧基」的實例包括 HCeCCH2〇與CH3CeCCH20。「烧硫基」包括直鏈或支鏈的烧硫基基團，諸如甲硫基、乙硫基與丙硫基不同的同分異構物。「烷硫基烷基」代表烷硫基取代於烷基上。「燒硫基烷基」的實例包括 CH3SCH2、CH3SCH2CH2、 ch3ch2sch2 、 ch3ch2ch2ch2sch2 與 ch3ch2sch2ch2; 「烷亞續醯基烧基」與「烧確醯基烧基」包括各自相對應的亞礙類（sulfoxides)與礙類 .,. (sulfones)。其他取代基，諸如「烷胺基」、「二烷胺基， ί ： J 以相似的方式界定。取代基團中碳原子的總個數以「Ci-Cj」前稱表示，其中i與j為1至5之間的數字。舉例來說，烷基表示甲基到丁基之間，包括多種同分異購物。進一步實例中，C2烷氧基烷基表示CH3OCH2; C3烷氧基烷基表示，諸如 CH3CH(OCH3)、CH3OCH2CH2 或 ch3ch2och2 ;而 c4烷氧基烷基表示以一烷氧基基團取代一烷基基團（總碳 73 200817524 原子數為 4)不同的同分異購物，其實例包括 CH3CH2CH2OCH2 與 CH3CH2OCH2CH2。

，不論單獨應用之詞彙「鹵素」或複合詞（例如，「鹵烷基」），其包括氟、氯、溴或碘。進一步地，當用於複合詞（例如，「i烷基」）時，上述之烷基可被相同或不同的鹵素原子部分或完全取代。「鹵烷基」的實例包括f3C、 cich2、CF3CH2與CF3CC12。詞彙「鹵烧氧基」、「鹵烷硫基」等等，以相似詞彙「鹵烷基」的方式界定。「鹵烷氧基」的實例包括cf3o、CCl3CH2〇、hcf2ch2ch2〇與cf3ch2o。「鹵烷硫基」的實例包括CC13S、CF3S、 cci3ch2s 與 cich2ch2ch2s。接著的磺醯尿素類除草劑描述用於本發明的磺醯尿素：醢嘧磺隆（Α^[[[[(4,6·二曱氧基-2_嘧啶基）胺基]羰基] 胺基]石黃醯基]-iV-曱基-曱烧確醢胺）、四嗤，磺隆（W_[[(4,6-二曱氧基-2-嘧唆基）胺基]幾基]甲基-4-(2 -曱基-2 ίΓ-四唑-5-基）-1//-吡唑-5-磺醯胺）、免速隆（2-[[[[[(4,6-二曱氧基-2-癌咬基）胺基]魏基]胺基]石黃醯基]曱基]苯甲酸甲酯）、氯嘧磺隆（2-[[[[(4-氣-6 -甲氧基-2-嘧啶基）胺基]羰基]胺基] 續酿基]苯甲酸乙酯）、氣磺隆（2 -氯_#·[[(4_曱氧基甲基 -1，3,5-二喚-2-基）胺基]羰基]苯續醯胺）、西速隆（^^[[(4,6· 一甲氧基-1,3,5 -二嗪-2 -基）胺基]羰基]_2_(2_曱氧基乙氧基）苯磺醯胺）、環磺隆（#-[[[2-(環丙基羰基）苯基]胺基]磺醯基]H(4,6-二甲氧基嘧啶_2_基）尿素）、胺苯磺隆 (2_[[[[[4-乙氧基·6·(曱胺基）-1，3,5_三嗪基]胺基]羰基] 胺基]磺醯基]苯甲酸甲酯）、亞速隆（2_乙氧基苯基[[(4,6_ 一甲氧基-2-嘴淀基）胺基]羰基]胺基磺酸）、伏速隆 74 200817524 (#_[[(4,6_二甲氧基-2-嘧啶基）胺基]羰基]-3-(三氟曱基）-2-σ比咬石黃醯胺）、氟σ比石黃隆（1-[3-[[[[(4,6 -二甲氧基-2-咬基）胺基]幾基]胺基]橫醯基]-2 -η比咬基]_2·氟丙基曱氧基乙酸）、氟啶嘧石黃隆（2-[[[[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基）胺基]幾基]胺基]續酿基卜6-(三氟曱基）-3 -〇比咬曱酸甲醋）、甲醯胺磺隆（2-[[[[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基）胺基]羰基]胺基] 石黃醯基]-4-(曱酿胺基）-#，#-二曱基苯甲醯胺）、氯π比癌確隆(3 _ 氯-5-[[[[(4,6-二甲氧基-2 -哺咬基）胺基]幾基]胺基]續酿基]-1-甲基- li/-吡唑-4-甲酸甲酯）、依速隆（2_氯-#·[[(4,6-二甲氧基-2-癌唆基）胺基]幾基]咪嗤[ι，2-α]°比咬-3-橫酿胺）、碘甲磺隆（4_碘-2-[[[[(4-甲氧基-6-甲基-1，3,5-三嗪-2-基）胺基]羰基]胺基]磺醯基]苯甲酸甲酯）、甲磺胺磺隆 (2-[[[[(4,6-二曱氧基-2-嘧啶基）胺基]羰基]胺基]磺醯基]-4-[[(甲基磺醯基）胺基]甲基]苯曱酸曱酯）、甲磺隆 (2-[[[[(4-甲氧基-6-曱基-1，3,5-三嗪-2-基）胺基]羰基]胺基]磺醯基]苯甲酸甲酯）、煙嘧磺隆（2-[[[[(4,6-二甲氧基 -2-嘧啶基）胺基]羰基]胺基]磺醯基]-#，#-二曱基- 比啶曱醯胺）、環氧嘧磺隆（2-[[[[(4,6-二甲基-2-嘧啶基）胺基] 羰基]胺基]磺醯基]苯甲酸3 -氧雜環丁酯）、氟嘧磺隆 (2-[[[[[4,6-雙（三氟甲氧基）-2-嘧啶基]胺基]羰基]胺基]磺醯基]苯甲酸甲酯）、氟磺隆（#-[[(4-曱氧基-6 -曱基-1，3，5· 三嗪-2-基）胺基]羰基]-2-(3，3，3-三氟丙基）苯磺醯胺）、百速隆（5-[[[[(4，6·二甲氧基-2-嘧啶基）胺基]羰基]胺基]磺醯基]-1-甲基-1F-吡唑-4 -甲酸乙酯）、玉嘧磺隆（iV-[[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基）胺基]羰基]-3-(乙基磺醯基）-2-0比啶磺醯胺）、甲嘧磺隆（2-[[[[(4,6-二甲基-2-嘧啶基）胺基]羰基]胺 75 200817524

基]磺醯基]苯甲酸甲酯）、磺醯磺隆（iV-[ [(4,6-二曱氧基 •2-嘧啶基）胺基]羰基]-2-(乙基磺醯基）咪唑[1，2-α]吼啶- 3-磺醯胺）、噻吩磺隆（3-[[[[(4-甲氧基-6 -甲基-1，3,5-三嗪-2-基）胺基]羰基]胺基]磺醯基]-2-嘍吩甲酸曱酯）、醚苯磺隆 (2-(2-氣乙氧基）-ΛΜ[(4-甲氧基-6·曱基-1，3,5-三嗪-2-基）胺基]羰基]苯磺醯胺）、苯磺隆（2-[[[[iV-(4-曱氧基-6-甲基 •1，3,5-三嗪-2-基）·#-甲胺基]羰基]胺基]磺醯基]苯甲酸曱酯）、三氟啶磺隆（#-[[(4,6-二甲氧基-2-嘧啶基）胺基]羰基]-3-(2,2,2-三氟乙氧基）-2-吼啶磺醯胺）、氟胺磺隆 (2-[[[[[4-二曱胺基]-6-(2,2,2-三氟乙氧基）-1，3,5-三嗪-2-基]胺基]羰基]胺基]磺醯基）-3 -曱基苯甲酸曱酯）以及三氟曱磺隆（^[[[4-曱氧基-6-(三氟曱基）-1，3,5-三嗪-2-基]胺基]羰基]-2-(三氟曱基）苯磺醯胺）。下方之三唑嘧啶類除草劑描述用於本發明的三唑嘧啶··氯酯磺草胺（3-氯-2-[[(5 -乙氧基-7-氟[1，2,4]三唑 [l，5-c]嘧啶-2-基）磺醯基]胺基]苯曱酸甲酯）、雙氣磺草胺 (iV-(2,6-二氯苯基）-5·乙氧基-7-氟[1，2,4]三唑[l，5-c]嘧啶 -2-磺醯胺、雙氟磺草胺（#-(2,6-二氟苯基）-8 -氟-5 -甲氧基[1，2,4]三唑[l，5-c]嘧啶-2-磺醯胺）、唑嘧磺草胺 (7V-(2,6-二氟苯基）-5 -甲基[1，2,4]三唑[1，5-α]嘧啶-2·磺醯胺）、磺草唑胺（#-(2,6 -二氯-3 -曱苯基）-5,7 -二曱氧基-[1，2,4]三唑[1，5-α]嘧啶-2-磺醯胺）、平速爛（2-(2,2-二氟乙氧基二甲氧基[1，2,4]三唑[l，5-c]嘧啶-2-基）-6-(三氟甲基）苯磺醯胺）以及曱氧磺草胺（#-(5,7-二甲氧基[1，2,4]三唑[1，5-α]嘧啶-2-基）-2 -甲氧基-4-(三氟曱基）-3-°比咬橫醯胺）。 76 200817524 下方之磺醯胺基羰基三唑啉酮類除草劑描述用於本發明的續醯胺基羰基三唑琳酮：氟酮磺隆（4,5 -二氫曱氧基-4-甲基-5-酮1[[2-(三氟曱氧基）苯基]磺醯基]三嗤-1-曱醯胺）以及丙笨續隆 (Procarbazone)(2-[[[(4,5-二氫-4-曱基-5_ 酮丙氧美 -1//-1，2,4 -三唑-1-基）羰基]胺基]磺醯基]苯甲酸甲酯）。額外的除草劑包括甜菜寧、三唑啉_ 、與 W02006/012981所揭示的除草劑，在此將其全文以參考資料併入本文中。 ^ 方法進一步包括對田地中的作物與雜草施加足夠劑量的至少一種除草劑（作物種子或植株可忍受），該除草劑，諸如嘉磷塞、羥基苯基丙酮酸雙氧化酶的抑制劑（例如，硝草酮或磺草酮）、八氫番茄紅素去飽和酶的抑制劑 (例如’吡氟草胺）、色素合成的抑制劑、磺醯胺、咪唑啉酮、畢拉草、碌絲菌素（phosphinothricin)、草芬定 (azafenidin)、氟丙嘧草酯、草硫膦、草銨膦、三唑嘧啶、痛疋乳基（硫）本曱酸、或確醯胺基幾基三嗤琳嗣、乙醯輔 I) 酶A幾化酶的抑制劑（例如’精喹禾靈）、合成生長素（例如，快克草）或原卟啉原氧化酶（protox)的抑制劑，以控制雜草而不明顯傷害作物植株。一般而言，施加於田地之除草劑的有效劑量係足以選擇性地控制雜草且不會明顯地影響作物。此處所用之「雜草」代表在特定區域中不欲之植株。相反地，此處所用之作物植株」代表在特定區域中所欲的植株，例如大豆植株。因此，某些實施例中，雜草為非作物植株或非作物物種二而在某些實施例中，雜草為試圖從一特定區域移除 77 200817524 的作物物種，諸如田地（種植大豆轉殖品項 3560.4.3 ·5)中較差與/或非基因轉殖的大豆植株，或者為田地（種植 3560·4·3·5)中的大豆植株。雜草可分為兩個主要群組··單子葉植物與雙子葉植物。 ί

可藉由本文所述之除草劑控制（即，殺死或損害）許多植物物種。因此，這些方法有用於控制這些不欲的植物物種（即，當他們被認定是雜草時）。這些植物物種包括作物植株以及普遍認為是雜草的物種，其包括（但不限於）：諸如黑穗草（blackgrass)(大穗看麥娘 r以叩ecww 」）、巨大狐尾草（giant foxtail)(法式狗尾草「/afterz·」）、大型烤蟹草（large crabgrass)(馬唐「DigHarz’a sMgwMa/b」）、蘇利南草（Surinam grass)(俯仰臂形草心cwmkw」）、野燕麥（wild oat)(野燕麥「Jvena /aiwa」）、普通蒼耳（common cocklebur)(菊科蒼耳「Xawi/u’ww penu/vMz’cwm」）、普通羊方草（common lambsquarters)(小葉灰藿山’ww ）、牵牛花 (morning glory)(圓葉蔦蘿coccrhea」）、豬草 (pigweed)(籽粒莧「αρ·」）、絨葉草 (velvetleaf)(綠麻子「」）、普通稗草 (common barnyardgrass)( 稗草「 Echinochloa crw-ga///」）、百慕達草（bermudagrass)(狗牙根 dactylon Δ )、絨毛雀麥（downy brome)(旱雀麥「 kciorww」）、鵝腳草（g〇〇segrass)(牛筋草「五/whw 」）、谷莠子（green foxtail)(狗尾草「 v/Wb」）、義大利黑麥草（Italian rye grass)(多花黑麥草 r Lolium multiflorum Λ )、強森草(Johnsongrass)(作艾高梁 78 200817524 厂 Sorghum halepense 」）、λΙ、金、絲、雀草（lesser canarygrass)(小鶴草」）、風剪草 (windgrass)(風剪股穎「jpera 」）、絨毛杯草（w〇〇ly

cupgrass)(絨毛金茅 £>ic/2/<9a vz’//c^a)、黃土香（yeii〇w nutsedge)(油莎草 r Cyperus esculentus )、普通魚腸草 (common chickweed)(繁縷「Steilaria media」）、普通膝草 (common ragweed)(豚草「Ambrosia artemisiifolia Λ )、毛地膚、加拿大蓬（horseweed)( 加拿大蓬「Cony cawadewz、」）、剛硬黑麥草（rigid ryegrass)(瑞士黑麥草「io/z’ww hgMwm」）、野塘蒿（hairy fleabane)(美州假蓬」）、鹿角車前草（buckhorn plantain)(長葉車前草「P/wMgo ）、熱帶紫鴨拓草（tropical spiderwort)(圓葉鴨拓草 r Comme!ina benghalensis」)、田旋花（field bindweed)(田旋花 r Convolvulus arvensis j )、紫土香(purple nutsedge)(香附子「Cjyperws ）、紅藤草（redvine)(卵葉沙拐棗 r Brurtnichia οναία」）、田菁麻（hemp sesbania)(田菁「）、ϋ 刀豆（sicklepod)(草決明「Sewna Mrwsz'/o/ia」）、德州藍 U (Texas blueweed)(藍莖向曰葵 r Helianthus ）以及魔爪草（Devil’s claws)(長角胡麻「户r ο s c ζ· d e α / ¢) w ζ· s ζ· α c α」）。其他實施例中，雜草包括耐除草劑的黑麥草，例如，耐嘉磷塞的黑麥草、耐巴拉刈的黑麥草、耐乙醯輔酶A羧化酶抑制劑的黑麥草以及耐非選擇之除草劑的黑麥草。某些實施例中，不欲的植株近似作物植株。 79 200817524 此處所用之「選擇性控制」預期指耕種區域中的大部分雜草明顯地受到傷害或被殺死，同時若作物植株亦存在於田地中時，大部分的作物植株不會明顯地受到傷害。因此，當至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%或更多的雜草明顯地受到傷害或被殺死，同時若作物植株亦存在於田地中時，低於4 5 %、4 0 %、3 5 %、 30°/。、25%、20%、15%、10%、5°/〇或 1% 的作物植株明顯地受到傷害或被殺死時，將此方法視為能夠選擇性控制雜草。某些實施例中，以特定除草劑處理且施加在植株上的除草劑劑量等同於下：每英畝或每公頃至少0.5、1、2、3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 20、 25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95 > 100 、 110 、 120 、 150 ' 170 、 200 ' 300 、 400 、 500 、 600 〜700 > 800、800、1 000 > 2000、3000 ' 4000 ' 5000 或更多克或盎司（1盎司= 29.57毫升）的活性成分或商業產物或除草劑成分，這些劑量並不會明顯傷害大豆 3 5 60.4.3.5植株，反而受到相同處理之相稱的對照植株明顯地受到傷害。特定實施例中，乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑的有效劑量包括每公頃至少約〇 · 1、1、5、1 0、2 5、5 0、7 5、 100、150 > 200、250、300、350、400' 450、500 > 600 > 700' 750、800、850、900' 950' 1000、2000、3000、4000、 5000或更多克或盎司（1盎司=29.57毫升）的活性成分。其他實施例中，乙醯乳酸合成酶抑制劑的有效劑量包括每公頃至少約 0.1-50、約 25-75、約 50- 1 00、約 1〇〇-11〇、約 80 200817524 110-120、約 1 20- 1 30、約 1 30- 140、約 1 40- 1 50、約 1 50-200、約 200-500 > 約 500-600 > 約 600-800、約 800-1000 或更多克或盎司（1盎司=29· 57毫升）的活性成分。例如，可將這些含量應用在表 1所列的任何乙醯乳酸合成酶抑制劑其他實施例中，磺醯尿素的有效劑量包括每公頃至少約 0.1、1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、 300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、 5 00 0或更多克或盎司（1盎司=29.57毫升）的活性成分。其他實施例中，磺醯尿素的有效劑量包括每公頃至少約 0.1-50、約 25-75、約 50-100、約 100-110、約 110-120、約 120-130 > 約 130-140、約 140-150、約 150-160、約 160-170、約 170-180、約 190-200、約 200-250、約 250-300、約 300-350 、約 350-400 、約 400-450 、約 450-500 、約 500-550、約 550-600、約 600-650、約 650-700、約 700-800、約800-900、約900-1 000、約1 000-2000或更多克或盎司 (1盎司=29.57毫升）的活性成分。可應用這種程度的典型磺醯尿素於表1中提出。其他實施例中，磺醯胺基羰基三唑啉酮類、三唑嘧啶類、嘧啶氧基（硫）苯甲酸類與咪唑啉酮類的有效劑量包括每公頃至少約 0,1、1、5、10、25、50、75、100、150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 650、 700、750' 800、850、900' 950、1000、1050' 1100、1150、 1200、1250、1300、1350' 1400、1500、1550、1600、1650、 1700、 1800、 1850、 1900、 1950、 2000' 2500、 3500、 4000 、 4500、5000或更多克或盎司（1盎司=29.57毫升）的活性成 81 200817524 分。其他實施例中，磺醯胺基羰基三唑啉酮類、三唑嘧啶類、嘧啶氧基（硫）苯甲酸類或咪唑啉酮類的有效劑量包括每公頃至少約 0,1-50、約 25-75、約 50-1 00、約 1〇〇_11〇、約 110-120、約 120-130、約 130-140、約 140-150、約 150-160、約 160-170、約 170-180、約 190-200、約 200-250、約 250-300 、約 300-350 、約 350-400 、約 400-450 、約 450-500、約 500-550、約 550-600、約 600-650、約 650-700、約 700-800、約 800-900、約 900-1000、約 1000-2000 或更多克或盎司（1盎司= 29.57毫升）的活性成份。

可發現除草劑有效劑量的額外範圍，例如來自大學推廣服務（University Extension services)的多種刊物中。例如，參閱 Bernards # A(2006) Guide for Weed Management in Nebraska (www.ianrt>ubs.url.edu/sendlt/ecl30) ； Regher 等人（2005) Chemical Weed Control for Fields Crops， Pastures， Rangeland, and Noncropland ， Kansas State University Agricultural Extension Station and Corporate Extension Service ； Zollinger 等人（2006) North Dakota Weed Control Guide 5 North Dakota Extension Service ；以及 Iowa State University Extension (www.weeds.iastate.edu) ’上述各個以參考資料在此併入本文中。某些實施例中，施加於耕種區域與/或耕種區域中至少一植株上的嘉填塞比例係介於每英故8至32盎司酸當量（acid equivalent)之間，或其應用比例範圍較低部分介於每英畝 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24、 26、 28 與 30盎司（1盎司=29.57毫升）的酸當量之間，而其應用比例 82 200817524

範圍較高部分介於每英畝12、14、16、18 ' 20、22、24、 26、28、30與32盎司的酸當量之間。其他實施例中，以每公頃至少 1 、 5 、 10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90或更高盎司（1盎司=29 ·57毫升）的活性成分施加嘉磷塞。某些實施例中，施加於田地與/或田地中至少一植株上的磺醯尿素類除草劑之比例係介於每英畝 0.04至 1.0 盎司的活性成分，或其應用比例範圍較低部分介於每英畝 0.1、0.2、0·4、0.6與0.8盎司（1盎司=29.57毫升）的活性成分之間，而其應用比例範圍較高部分介於每英畝 0 · 2、0.4、0.6、0 · 8與1.0盎司的活性成分之間。嘉磷塞除草劑為含有相同活性成分的一類除草劑，但活性成分為許多不同鹽類與/或組成的其中之一。然而，已知能抑制乙醯乳酸合成酶之除草劑的活性成分以及化學組成均不一樣。熟悉技術人士了解如何在特定體積與/ 或重量的除草劑製備中決定活性成分劑量與/或酸當量。某些實施例中，應用一種乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑。施加在作物、作物部位、種子或耕種區域的乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑之比例可為本文所揭示的任何比例。特定實施例中，乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑的比例係每公頃約0.1至約5000克、約0.5至約300克、或約1至約1 5 0克的活性成分。一般而言，施加在特定田地（與任何生長於其中的植株）上的特定除草劑不會超過每年 1、2、3、4、5、6、7 或8次，或者不會超過每生長季1、2、3、4或5次。而「以除草劑組合物處理」或「施加除草劑組合物於」作物、耕種區域或田地，預期特定田地、作物或雜草係受 83 200817524 到各個除草劑與/或化學物質（為組合物的一部分以便達到所欲之效應）的處理，即，以便選擇性地控制雜草同時不會明顯地傷害作物。某些實施例中，對各個除草劑為感性 (susceptible)的雜草顯示以各個除草劑（添加或協同作用）處理受到的傷害。可同時或者在不同時間施加各個除草劑與/或化學物質，以便達成所欲之效應。進一步地，可在種植作物之前便進行應用。使用的除草劑與其他除草劑活性成分在除草劑組成中的比例通常為重量比5000:1至1:5000、1 000:1至

Ο 1:1000、100:1 至 1:100' 10:1 至 1:10 或 5:1 至 1:5。那些熟悉技術之人士可基於所欲的雜草控制幅度輕易地決定最佳比值。此外，表1所揭示的不同除草劑之幅度的任合組合亦可用於方法中。因此，某些實施例中提供選擇性控制田地中雜草的改良方法，其中所用的除草劑總量可低於其他方法的90%、 85%、80% > 75%、70%、65%、60%、55%、5 0% ^ 45%、 40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5% 或 1% ° 同樣地，某些實施例中，選擇性控制田地中雜草所應用之特定除草劑含量可低於其他方法（即，非利用本發明植株的方法）中所應用之特定除草劑含量的 90%、85%、80%、 75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、3 5%、 30%、25%、20%、15%、10%、5% 或 1% 〇某些實施例中，3560.4.3.5大豆植株受惠於協同作用效應，其中嘉磷塞乙醯轉移酶多胜肽與 GM-HRA多胜肽所賦予的除草劑耐藥性高於將各個基因分別送入基因轉殖植株（分別含有這些基因）之除草劑耐藥性單純相加所 84 200817524 預期之數值。參閱，例如McCutchen等人（1997)J. EntomoL 90 ·· l l 70- 1 1 80 ; Priesler 等人（1 999) J. 92: 5 98-603。此處所用之詞彙「協同作用」、「協同作用的」「協同作用地」與其之衍生詞（諸如，「協同作用效應」或「協同作用的除草劑組合」或「協同作用的除草劑組合物」），代表除草劑（例如，至少第一除草劑與第二除草劑）組合的生物活性高於個別除草劑生物活性的總合之情況。以詞彙「協同作用指數（Synergy Index，si)」表示協同作用，通常可用Kull等人办

ϋ 9,53 8 ( 1 96 1 )所述之方法測定。亦參閱c〇lby “Caiculating

Synergistic and Antagonistic Responses 〇f Herbicide

Combinations” fFe…1 5，20-22 (1 967) 〇其他實例中’ 3 5 6 0 · 4 · 3 · 5植株上所賦予的除草劑耐藥性為累加的；這就是，除草劑耐藥性基因所賦予的除草劑因轉殖植株（分別含有所預期之數值。對抗的累加與/或協同作用制上述雜草所需之活耐藥性數據為各個基因分別賦予基這些基因）之除草劑耐藥性單純相加重要雜草物種的兩種或更多除草劑活性，將提高整體效應與/或降低控可顯示對更高劑量或比例之除草劑的耐藥性與/或該植株性成分（們）的實際數量❹在發現上述之協同作用後，植株期可顯示耐藥性大i植株可顯示經基苯基丙酮酸可顯示對額外除草劑或其他化學物質（預之外的物質）的耐藥性。例如，3 560.4.3.5 對有機磷化合物（例如，殺蟲劑）與/或4 雙氧化酶抑制劑的耐藥性。可顯示對於不括（但不限於）因此，舉例來說，3 5 6 0 · 4 · 3 · 5大豆植株同除草劑高於預期之耐藥性，這些除草劑包 85 200817524 嘉磷塞、乙醯乳酸合成酶化學作用抑制劑與磺醯尿素類除草劑。3 5 6 0 · 4 · 3 · 5大豆植株可顯示對特定除草劑或除草劑組合的耐藥性，該耐藥性至少 1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、 6 %、7 %、8 %、9 %、10% ^ 12%、15%、1 7 %、2 0 %、2 2 %、 25%、27%、30%、35%、40%、45%、50%、5 5%、60%、

6 5 % ' 7 0 % ' 8 0 %、9 0 % ' 1 0 0 %、1 2 5 %、1 5 0 %、1 7 5 %、2 0 0 %、 3 00%、400%或5 00%或更高於相稱的對照植株之耐藥性，該對照植株僅含有單一除草劑耐藥性基因（賦予相同除草劑或除草劑組合的耐藥性）。因此，3560.4.3.5大豆植株（相較於相稱的對照植株）可顯示其受到較低來自相同除草劑劑量的傷害，或者他們（相較對照植株）在較高劑量的除草劑下顯示相同程度的傷害。因此，特定實施例中，選擇性控制田地中雜草所用之特定除草劑係高於其他方法（即，非利用本發明植株的方法）中所用之特定除草劑含量的 1%、5%、10%、15%、20%、25%、3 0%、3 5%、40%、45%、 50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高〇同樣的方式，在某些實施例中，3560.4.3.5大豆植株 (相對於相稱的對照植株）顯示對除草劑活性成分特定組成改良的耐藥性。商業上以組成方式販賣除草劑，而該組成一般包括除了除草劑活性成分以外的其他成分；通常預期這些成分係用來增加活性成分的效應。上述之其他成分可包括’例如安全劑（safener)與辅助劑（參閱，例如Green 與 Foy (2003) “Adjuvants: Tools for Enhancing Herbicide

Performance99 in Weed Biology and Management, ed. Inderj it (Kluwer Academic Publishers, The Netherlands))。因此，3 560.4.3.5大豆植株可顯示針對特 86 200817524 定除草劑組成（例如，商業上可獲得之特定除草劑產物）的耐藥性，該耐藥性至少為相稱的對照植株之耐藥性1 %、 2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10%、12%、15%、 17%、2 0%、22%、250/〇、27%、3 0%、3 5%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、100%、125%、 150% ^ 175% ^ 2 0 0% > 3 0 0% > 400% ^ 5 00% > 60 0% ^ 7 0 0% > 800%、900%、1000%、1100%、1200%、1 300%、1400%、 1 500%、1 600%、1 700%、1 800%、1900% 或 2000% 或更高，而該對照植株僅含有單一除草劑耐藥性基因（賦予對相同除草劑成分的耐藥性）。某些實施例中，3 5 6 0.4 · 3 · 5大豆植株顯示對一除草劑或除草劑群組（係至少另外一種除草劑耐藥性基因所賦予的耐藥性）的改良耐藥性以及對至少另外一種除草劑或化學物質（其作用機制或根據既不同於嘉碌塞也不同於上述之至少另外一種耐藥性基因相對的除草劑）的改良耐藥性。這令人驚異的優點可用於種植作物的方法中，該方法包括以多種組合的化學物質處理作物，而該化學物質包括’例如用以種植作物的其他化學物質。因此，舉例來說， 3560.4.3.5大豆植株亦可顯示對陶斯松（chl〇rpyrif〇s)( 一種系統性有機磷酸酯類殺蟲劑）的改良耐藥性。因此，進一步提供賦予嘉磷塞耐藥性（即，基因）與磺醯尿素類除草劑耐藥性基因的3 5 6 0 · 4 · 3 · 5大豆植株（其顯示針對影響細胞色素P450基因之化學物質的耐藥性）與使用其之方法。某些實施例中，3560.4.3.5 大豆植株亦顯示針對汰克

的改良耐藥性 87 200817524 其他方法中，將除草劑組合物施加於3 5 6 0 · 4 · 3 · 5大豆植株 ’其中該除草劑組合物產生累加或協同作用效應其中一種以控制雜草。上述之除草劑組合物可讓下述實情成真·減少應用比例；更寬幅度的控制不欲之植物；以較少 ΓΤ*| ,田用得到對不欲植物的改良控制；更快速地發揮除草劑 ^ ’或除草劑活性的延長。

「累加性除草劑組合物」之除草劑活性約等於各個成刀所觀察到之活性的總合。「協同作用性除草劑組合物」之除草劑活性高於根據單獨使用各個成分時觀察到之活性所預測的數值。因此，現正揭示的内容提供一種協同作用性除草劑组合物，其中混合物控制雜草的程度高於各個除草劑對照組之總合。某些實施例中，混合物控制雜草的程度高於各個對照除草劑之總合接近任何統計上有意義之數值，包括例如約1%至5%、約5%至約10%、約 10〇/〇至約20%、約2〇%至約30%、約30%至約40%、約 40% 至約50%、約 50%至約60%、約60%至約70%、約70〇/〇至約80%、約80%至約90%、約90%至約100%、約1〇〇〇/〇至約1 2 0 %或更高。進一步地說，除草劑的「協同作用有效劑量」代表引出除草劑組合物内存在的另一除草劑之協同作用效應所需的劑量。因此’詞彙「協同作用劑」與其衍生之詞，代表增強活性成分（active ingredient，ai)活性的物質，而活性成分即，一組成中可因此獲得生物效應的物質（例如，除草劑）。因此，某些實施例中’現正揭示的内容提供一種控制耕種區域中雜草的方法。某些實施例中，該方法包括：（a) 將區域種植3 5 6 0 · 4 · 3.5作物種子或作物植株；以及（b)對雜 88 200817524 草、作物植株、作物部位、耕種區域或其之組合施加有效劑量的除草劑組合物，該組合物至少包括協同作用有效劑量的嘉磷塞與協同作用有效劑量的乙醯乳酸合成酶抑制劑（例如，但不限於磺醯尿素類除草劑）或其農業上適當的鹽類其中之一，其中至少其中之一：（i)協同作用有效劑量的嘉磷塞低於在確醢尿素類除草劑不存在情況下用以控制雜草所需的嘉磷塞劑量；（ii)協同作用有效劑量的乙2 乳酸合成酶抑制劑類除草劑低於在嘉磷塞不存在情況下用以控制雜草所需的乙醯乳酸合成酶抑制劑劑量；以及 (1 i i)上述之組合，而其中作物種子或作物植株可忍受除草劑組合物的有效劑量並因此可控制耕種區域中的雜草。某些實施例中’用於現正揭示控制雜草之方法的除草劑組合物包括協同作用有效劑量的嘉磷塞與磺醯尿素類除草劑。進一步的實施例中，現正揭示的協同性除草劑組合物包括嘉磷塞與磺醯尿素類除草劑（選自曱確隆、氣確隆與醚苯磺隆所構成之群組中）。特定實施例中，協同性舍草劑組合物進一步包括一輔助劑，例如硫酸銨式輔助劑，例如ADD-UP® (Wenkem S.A Halfway House，Midrand，South Africa)。額外的實施例中，現正揭示的協同性除草劑組合物包括額外的除草劑，例如有效劑量的嘧啶氧基（硫）苯甲酸類除草劑。某些實施例中，嘧啶氧基（硫）苯甲酸類除草劑包括雙草醚，例如 VELOCITY (Valent U.S.A· Corp·， Walnut Creek， California，United States of America)，或其農業上適當之鹽類。目前揭示用以控制不欲植物的某些實施例中，將嘉填 89 200817524 塞在萌前（pre-emergence)、萌後（p0st-ernergence)或萌前與萌後施加於不欲之植株或植物作物上；與/或將乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑（即，磺醯尿素類除草劑）在萌前、

萌後或萌前與萌後施加於不欲之植株或植物作物上。其他實施例中，將嘉鱗塞與/或乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑（即，橫醯尿素類除草劑）共同應用或分開應用。又其他實施例中，應用協同性除草劑組合物，例如上述之步驟 (b)，種植關注之作物前至少實施一次，例如，上述之步驟（a) 〇在種植作物（例如，大豆作物）的田地中單以嘉磷塞難以控制的雜草包括（但不限於下列）：加拿大蓬（例如， ;剛硬黑麥草（例如， Lolium ;鵠腳草（例如，Eleusine indica) ·，義大利黑麥草（例如，Lolium multiflorum)；野塘蒿（例如，Conyza △ ，鹿角車月丨j 卓（例如， Plantcigo lanceolat a)，普通勝卓（例如， Ambrosia ariemki/o/z’a);牽牛花（例如，Ipomoea spp.);水麻草 (waterhemp)(例如， Amaranthus spp.)；田旋花（例如， Convolvulus arvensis)；黃土香({列如， Cyperus ;普通羊芳草（办如，Chenopodium album)；金蕎麥（wild buckwheat)(例如， Polygonium cowvo/vw/ws);絨葉草（例如，Abutilon theophrasti) ·，毛地膚（例如，欠scoparz’a);以及鴨跖草（Asiatic day flower)(例如， Comme/以a sp;?·)。在發現上述雜草的區域中，3 5 6 0 · 4 · 3 · 5大豆特別有用於以除草劑組合物處理田地（與生長於田地中的任合作物）時，且該除草劑會對不 90 200817524 含有這些聚核苷酸的作物植株造成無法接受的傷害。可忍受嘉碟塞與其他除草劑（例如，磺醯尿素、咪唑啉酮、三街疋、嗦唆基（硫）本甲酸與/或橫醯胺基幾基三〇坐琳酮類除草劑）的植物除了忍受至少另外一種具有不同作用模式或作用地點的除草劑之外，係特別有用於當雜草可忍受至少兩個相同於植株可忍受之除草劑的情況下。此種方式中’本發明之植株合理地改善可忍受超過一種除草劑之雜草的控制。例如，種植現今商業作物（包括，例如大豆）之田地中的雜草控制通常應用之處理包括嘉磷塞與視情況而定的二•四-地；然而此種組合有某些缺點。尤其，有著其無法控制的雜草物種且其亦無法在寒冷氣候中適當地控制雜草。另一經常用來控制大豆田地中雜草的處理為磺醢尿素類除草劑，氯嘧磺隆，其具有明顯殘留於土壤中的活性因此對所有晚萌（later-emerging)的雜草物種維持選擇性壓力’造成耐磺醯尿素類雜草較適合的生長與散佈環境。然而’可用對標準植物變種造成不可接受之傷害的除草劑 (例如’氣嘧磺隆）與除草劑組合物處理35 60.4.3 ·5大豆。因此’例如，含有356〇·4.35大豆的田地可處以磺醯尿素、 "米σ金琳綱、三唑嘧啶、嘧啶基（硫）苯曱酸與/或磺醯胺基羰基三嗤啉鲷類（例如，磺醯尿素氯嘧磺隆），可單獨或與其他除草劑共同應用。例如，含有本發明大豆植株的田地可處以嘉磷塞與苯磺隆（可獲得之商業名稱為Express®)的組合物。這種組合物在某些情況下具有許多優點，這些情況包括使用不同作用模式的除草劑與使用土壤殘餘活性週期相當短的除草劑。樂見具有相當短暫週期之殘餘活性 91 200817524 的除草劑，舉例來說，在減少選擇性壓力（這壓力有利於耐除草劑雜草的生長）的重要情況下。當然，在需要控制雜草的任何特定情況下，其他考量可能更為重要，例如，在種植作物前預防田地中生長與/或出現雜草，需要利用殘餘活性周期相對較長的除草劑。亦可用包括煙癌續隆、甲磺隆、苯磺隆、噻吩磺隆與/或玉嘧磺隆至少其中之— 的除草劑組合物處理3560.4.3.5大豆植株。而包括苯磺隆與嗟吩磺隆兩者的處理特別有用。現今商業的作物變種（包括，例如大豆）生長的田地中’其他經常用來控制雜草的處理包括磺醯尿素類除草劑’嗟吩磺隆（可獲得之商業名稱為Harm〇ny GT⑧）。然而，嗟吩磺隆的其中一個缺點為持續性控制雜草所需之較高的應用比例經常對生長於同一田地中的作物造成傷害。可以嘉磷塞與噻吩磺隆的組合物處理3 5 6〇 4 3.5大豆植株’其優點為利用不同作用模式的除草劑。因此，可單獨忍受其中之一除草劑的雜草受到兩除草劑組合物的控制，且該處理未明顯地傷害3560.4.3.5大豆植株。現今商業的作物變種（包括，例如大豆）生長的田地中’其他用來控制雜草的除草劑為三嗤嘴咬類除草劑，氣 8曰〜草胺（可獲得之商業名稱為FirstRate®);與味a坐琳酮類除草劑，咪唑喹啉酸（可獲得之商業名稱為Sceptor⑧）。當單獨地應用這些除草劑時，它們僅提供微小的雜草控制力。然而，可用下列物質之組合物處理含有3 5 6 0.4.3 · 5大豆的田地’諸如嘉填塞（例如，Roundup®(嘉罐塞異丙胺鹽））、依滅卓（目刖可獲付之商業名稱為Arsenal®)、氣, 石買隆（目前可獲得之商業名稱為Classic®)、精噎禾靈（目前可 92 200817524 獲得之商業名稱為Assure π⑧）以及氟磺胺草醚（目前可獲得之商業名稱為FleXstar⑧）。這種組合物之優點為利用不同作用模式的除草劑。因此，僅可忍受這些除草劑其中之或數種的雜草叉到该五種除草劑組合物的控制，而此種除草劑組合物的處理並未明顯地傷害3560 4·3·5大豆。此組合物提供相當廣闊的保護幅度以防備耐除草劑類型的雜草出現（預期在現行的雜草控制實踐中會產生並散佈）。亦可用下列除草劑組合物處理含有3 5 6 〇 · 4 · 3 · 5大豆植株的田地，而除草劑包括諸如嘉磷塞、玉嘧磺隆與汰克草或硝草酮。此種組合物特別有用於控制已經發展出對某些抑制乙醯乳酸合成酶除草劑之耐藥性的雜草。另—種特別有用於控制雜草的除草劑組合物包括嘉磷塞與至少一種下列物質：甲磺隆（可獲得之商業名稱為AUy(g))、依滅卓（可獲付之商業名稱為Arsenal®)、啤草煙、σ米σ坐啥琳酸與甲％草胺。可以理解任何上述或文中其他部分所揭示的組合物亦可與任何其他除草劑與農業化學物質一起用來處理區域。現今商業作物（包括，例如玉米）生長的田地中，某些時常用來控制田地中雜草的處理包括嘉磷塞（現今可獲得之商業名稱為Roundup®)、玉嘧磺隆（現今可獲得之商業名稱為Resolve®或Matrix®)、汰克草（可獲得之商業名稱為Clarity®)、草脫淨與硝草酮（可獲得之商業名稱為 Callisto®)。有時因為作物無法忍受多種除草劑可單獨應用這些除草劑。不幸的是，單獨使用時，這些除草劑各者均有著明顯的缺點。尤其，可忍受各個除草劑之雜草的發生率持續上升’使嘉磷塞在某些情況下低於預期中的效 93 200817524 應。玉嘧確隆在會對作物造成傷害的高劑量下才可提供較佳的雜草控制性，而替代品（例如，汰克草）通常比其他普遍使用的除草劑來得貴。然而’可用會對標準植物變種造成無法接受之傷害的除草劑與除草劑組合物處理 3560.4.3.5大豆，包括包含玉嘧磺隆與/或汰克草的除草劑組合物。可用於356〇·4·3·5大豆植株的其他適當除草劑組合物包括嘉磷塞、磺醯尿素、咪唑啉酮、三唑喷啶、嘧症氧基（硫）苯甲酸與/或續酿胺基羰基三嗤琳嗣類除草劑’其包括至少下列一種：諸如甲磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、味

C 草煙、依滅草與味tf坐啥琳酸。例如，可用嘉磷塞與玉嘧磺隆的組合物或玉嘧磺隆與至少一種其他除草劑的組合物處理3560.4.3.5大豆植株。亦可用嘉磷塞、玉嘧磺隆與汰克草的組合物或嘉磷塞、玉嘧磺隆與至少一種其他除草劑的組合物處理356〇.4.3.5大豆植株。某些實施例中，該至少一種其他除草劑的作用模式不同於嘉磷塞與玉嘧磺隆兩者。嘉磷塞、玉嘧讀隆與汰克草的組合物之優點為這些除草劑具有不同的作用模式 G 與短暫的殘留活性，這減少耐除草劑雜草的出現與散佈機率〇現今商業作物生長的田地中，某些時常用來控制雜草的處理包括嘉磷塞（現今可獲得之商業名稱為 Roundup®)、氣嘧磺隆、苯磺隆、玉嘧磺隆（現今可獲得之商業名稱為Resolve®或Matrix(g))、咪草煙、依滅草與咪唑喹啉酸。不幸的是，單獨使用時，這些除草劑各者均有著明顯的缺點。尤其，可忍受各個除草劑之雜草的發生率持續上升，使各個除草劑在某些情況下低於預期中的致 94 200817524 應。然而’可用會對標準植物變種造成無法接受之傷害的除草劑組合物處理3560·4·3·5大豆，包括含有至少一種上述提到之除草劑的除草劑組合物。

這些方法中’可用任何適當的方式配製除草劑並將其施加於關注之區域（例如，田地或耕種區域）。可用任何形式（例如，液態噴灑或固態粉末或微粒）將除草劑施加於田地上。特定實施例中，應用於方法中的除草劑或除草劑組合物包括筒混劑（tankmix)或預混劑（premix)。亦可將除草劑製成，例如利用混合技術（參閱，例如美國專利案編號 6,022,552 ’ 其標題為 “uniform Mixtures 〇f pestieide

Granules”）所產生的「均勻混合微粒」。美國專利案編號 6,022,552的混合技術將保護作物的化學物質無分離的混合（即，「均勻混合微粒」）於乾燥微粒形式，以便運送訂做（設計用來解決特定問題）的混合物。可用如傳統預混器產物（將許多活性成分配置於同一微粒中）之相同方式運送、處理、分樣（subsample)與應用均勻混合微粒。簡單地說，藉由混合至少兩種擠壓製成 formulated)的微粒產物製備「均勻混合微」呆些實施例中，各個微粒產物包括含有單一活性成份的註明成分，其係諸如除草劑、殺真菌劑與/或殺蟲劑。可藉由調控混合所用之微粒的相對大小與大小的一致性（同質性）達到最佳程度押出模（extruder die)之孔洞大小處理以獲得具有所欲之長度分佈如美國專利案編號6,270,025：|。分佈使「均勻混合微粒」。擠壓之微粒的直徑受到所控制，且應用離心篩選的擠壓微粒群（參閱，例當將均勻混合微粒分樣成適當大小的等量樣本 95 200817524 (aliquots)且各個等量樣本的成分達到所須的試驗規格時，才將其視為「同質性」。為了驗證同質性，製備均句混合微粒的大型樣本接者將其分樣成大於最小統計樣本大小的等量樣本。非限制性實施例中，3 560.4.5.3大豆植株可處以除草劑（例如，在沒有3560.4.3 ·5轉殖品項的情況下會對不具嘉填塞/乙醯乳酸合成酶抑制劑基因體的植物變種造成不可接受之作物反應的氣嘧磺隆與其他除草劑組合物）。因此，例如’種植與含有3560·4·3·5大豆的田地可處以石黃醯尿素、咪唑啉酮、三唑嘧啶、嘧啶基（硫）苯甲酸、與/ 或石黃酿胺基幾基三嗤琳酮類除草劑，不論是單獨應用或與其他除草劑共同應用。既然乙酸乳酸合成酶化學作用抑制劑具有不同的除草劑特性’乙醯乳酸合成酶抑制劑與其他化學物質的混合將提供較好的雜草管理策略，這包括雜草控制幅度的多樣化與提高，用以提供特定殘餘活性的能力 (具有造成改良型葉面活性之殘餘活性的磺醯尿素（su"乙醯乳酸合成酶化學作用抑制劑，其導致嘉磷塞應用以及若

C 天氣條件阻止適時應用的額外週期調控之間，較寬廣的範圍）。、混合亦提供添加其他農用化學 1隹标準值與標記的應用比例内)的能力’諸如額外的除草劑(第3/第4種作用 :制）、殺真菌劑、殺蟲劑、植物生長調節劑等等，因而節省額外應用相關的費用。除草劑組成可 ’各個成分或如將成分彼此任何施加於3560·4·3·5大豆植株上的製備成「筒混劑」組合物。上述之實施例中成分組合物可彼此分離地儲存。接著在應用 96 200817524 混合。一般來說，上述之混合發生於應用不久之前。筒混劑處理過程中，每個成分在混合前一般存在於水或適當的有機溶劑中。欲額外諮詢有關組成的技術’參閱 T · S · Woods “The Formulator，s Toolbox__Product Forms for Modern Agriculture” Pesticide Chemistry and Bioscience, The Food~Environment Challenge，T. Brooks and T. R· Roberts, Eds·， Proceedings of the 9th International Congress on Pesticide Chemistry, The Royal Society of Chemistry，Cambridge，1 9 9 9, pp. 1 20- 1 3 3 〇亦可參閱美國專利案編號3,235,3 6 1第6段第16行至第7段第19行與實施例10-41 ;美國專利案編號3,3 09,1 92第5段第43行至第7段第62行與實施例8、12、15、39、41、52、53、 58、132、1 3 8-1 40、1 62-1 64、166、167 與 1 69-1 82;美國專利案編號2,891，85 5第3段第66行至第5段第17行與實施例 1-4; Klingman，Weed Control as a Science ^ John Wiley and Sons，Inc·，New York，1961，pp 81-96;以及 Hance 專人，Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications，Oxford，1 989，在此將上述各個之全文以參考資料併入本文中。方法進一步讓除草劑組合物發展成可用於356〇.4.3.5 大豆植株。在上述之方法中，評估耕種區域的環境條件。可以評估的環境條件包括（但不限於）：土壤與地表水污染的議題、預期應用的作物、作物耐藥性、土壌殘留度、耕種區域内存在的雜草、土壤質地、土壤pH值、土壤中有機物含量、應用的設備與耕種施行。對環境條件評估後，了施加有效^篁的除草劑纟且合物於作物、作物部位、作物 97 200817524 種子或耕種區域。

1.) 某些實施例中，施加於3 5 6 0 ·4 · 3 · 5大豆植株的除草劍適合用來避免感性（susceptible)之雜草生長的開始與/或適合用來對生長於關注之區域内的雜草造成傷害。某些實施例中’除草劑或除草劑混合物施加於雜草上的這痤效應影響接著種植於關注之區域（即，田地或耕種區域）的作物。在這些方法中，除草劑組合物之應用不需於同/時間發生。只要在作物存在於耕種區域時期且種植作物之田地含有可察覺含量的第一除草劑的某一時間應用第二除草劑’那麼將視為該作物受到根據本發明之除草劑混合物的處理。因此，方法包括應用「萌前」、「萌後」、「種植前施用」與/或包括種植前處理種子的除草劑。一實施例中，提供塗覆種子的方法。這些方法包括以有效劑量的除草劑或除草劑組合物（如本文其他地方所揭示）塗覆種子。接著將該種子種植於耕種區域。進—步提供具有塗層的種子，而該塗層包括有效劑量的除草劑=除草劑組合物（如本文其他地方所揭示）。 ” 「明刚」代表在植株從土壌明顯地冒出前將除草劑施加於關注之區域（例如，田地或耕種區域）。「萌後」代表在植株從土壌明顯地冒出後將除草劑施加於區域。某些實例中，詞t「萌前」與「萌後」係參照關注之區域雜草’然而某#^實例中這些詞彙係參照關注 < 區域中的作物植株。當以參照雜草而應用肖，這些詞彙將適用於單定的雜草類型或雜草物種（其存在或被相信存在於關注之區域）。雖然可用萌前與’或萌後處理施加任何的除草劑，但已知某些除草劑施加於萌前式詰你化 98 200817524 於控制雜草或雜草們。舉例來說，玉嘧續隆同時具有萌前與萌後活性，但其他除草劑則具有萌前活性優勢（莫多草）或萌後活性優勢（嘉磷塞）。技術中習知特定除草劑的這些特性且熟悉技術之人士可輕易的測定。再者，熟悉技術之人士可輕易地選出適當的除草劑與應用時間，以用於本發明之基因轉殖植株與/或即將種植本發明之基因轉殖植株的區域上。「種植前施用」包括在種植前將化合物併入土壤中。因此，提供種植作物與/或控制雜草的改良方法，例如「種植前燃盡（pre-planting burn down)」，其中在種植關注之作物前以除草劑處理區域以更好地控制雜草。進一步提供種植作物與/或控制雜草的方法，「免耕法（no-till)」或「少耕法（low-till)」（亦稱為「減少耕種法（reduced tillage)」）。上述方法（相對於傳統方法）中，在生長週期中並不耕種或較少耕種土壤；這些方法可節省額外耕種所帶來的其他花費（包括勞力與燃料費用）。這些方法包括同時與/或接連應用多種類型的除草劑。某些實施例中，這些方法包括將本發明之植株與/或關注之區域（例如，田地或耕種區域）與/或雜草處以僅僅一種除草劑或其他化學物質（例如，磺醯尿素類除草劑）。將除草劑施加於關注之區域（與其中的任何植株）的時間點將是使雜草控制最佳化的重要因素。施加除草劑的時間點可參照下列因素決定：植株大小與/或生長階段與/ 或關；主之區域中植株的發育，例如，區域中生長的作物植株或雜草。本技術中習知植株的生長階段與/或發育階 & °例如’大丑植株一般成長於營養生長階段，Ve (萌芽）、 99 200817524 vc (複葉「unif〇li〇Ute」）、％ (第一個三葉「fhst trifol1〇iate」）與~至Vn。大豆接受曝光週期信號後接著轉換至生殖生長期；生殖階段包括Ri (結花期）、R2 (盛花期）、R3 (結莢期）、r4 (盛莢期）、Rs (結子期）、厌6 (盛子期）、R7 (開始成熟期）以及R8 (完全成熟期）。因此，舉例來說，將除草劑或其他化學物質施加於關庄之區域（植株生長於其中）的時間點，可能為特定區域中某二或全部植株達到至少一特定大小與/或生長階段與/ 或發育階段的時間點，或特定區域中某些或全部植株尚未達到一特定大小與/或生長階段與/或發育階段的時間點。某些實施例中，3 560.4·3·5大豆植株顯示對萌後除草劑處理更好的耐藥性。例如，3 56〇·4·3 5植株可忍受更高劑量的除草劑，忍受更廣幅度的除草劑（即，忍受更多種乙醯乳酸合成酶化學作用抑制劑），與/或可忍受較早或較晚發育時期（相對於相稱的對照植株）的除草劑含量。例如，某些實施例中，3560·4·3 ·5大豆植株顯示對型態缺陷 (已知特定發育階段處理所導致）更高的抗性。不同的化學物質（例如，除草劑）具有不同的「殘餘」效應’即，化學物質或除草劑處理對生長於處理區域的植株之效應持續時間的不同。上述之效應可能為樂見或不樂見的，取決於處理區域（例如，田地或耕種區域）將來所欲之效果。因此，可基於處理（用於各個作物上）的殘餘效應與匕們在作物（接下來生長於同一區域）上的效應挑選作物輪種方案（crop rotation scheme)。熟悉技術人士了解可用哪些技術評估除草劑的殘餘效應；例如，嘉磷塞一般具有非常少或不具土壤殘留活性，然而作用為抑制乙醯乳酸 100 200817524 合成酶的除草劑在殘餘活程度上有所差異。技術中已知不门除卓劑的殘餘活性，且境因子^ i 亦已知殘餘活性會隨著不同環兄因子（例如，土壌水氣量輿右播脇、、，殿度、pH值與土壤成分（質地興有機物））而改變。356〇 4 ^ ^ ^ ^^ • 大旦植株可於種植作物方為有利的。十除卓相餘活性的改良耐藥性 7 個別施加嘉磷塞以及乙醯乳酸。成酶化學作用抑制劑(例如，續醯尿素類除草劑)時，

3 560.4.3.5大且植株具有改良的耐藥性，且進一步提供對除草劑組合物（例如，i石患令,丄 U 嘉磷塞與/或乙醯乳酸合成酶化學作用抑制劑）改良的耐藥性。此外，本文揭示的基因轉殖植株提供對額外化學物質(經常聯合除草劑處理用於作物上) 處理更佳的财藥性，而額外化學物質諸如安全劑、輔助劑 (例如，磺酸銨）與作物油脂濃縮等等。判彙「安全劑」代表加入除草劑組成之物質，其可排除或減輕除草劑對某些作物的植物毒素效應（phyt〇t〇xic effects)。熟悉技術之人士可理解安全劑的選擇一部份取決於關注之作物植株與特定除草劑或協同性除草劑組合物含有的除草劑組合。適合用於本揭示除草劑組合物的示範性安全劑包括（但不限於）下述所揭示之物··美國專利案編號4,808,208 ; 5,502,025 ; 6，124,240與美國專利公開申請案編號 2006/0148647 ; 2006/0030485 ; 2005/0233904 ; 2005/0049145 ; 2004/0224849 ； 2004/0224848 ； 2004/0224844 ； 2004/0157737 ； 2004/0018940 ； 2003/0171220; 2003/0130120; 2003/0078167，上述所揭示之全文在此以參考資料併入本文。這些方法包括除草劑 101 200817524 聯合除草劑安全劑的應用，而用以提高作物安全性的安全劑諸如：解草嗣（benoxacor)、BCS (1-溴-4-[(氣曱基）續酿基]苯）、解毒啥（cloquintocet-mexyl)、解草胺腈 (cyometrinil)、二氯丙稀胺（dichlormid)、2-(二氯甲基）-2-甲基 -1，3- 二氧戊環（MG 191)、解草唑 (fenchlorazole-ethyl)、解草咬（fenclorim)、解草胺 (flurazole)、氟草將（fluxofenim)、解草 σ惡嗤（furilazole)、雙苯 *»惡 α坐酸（i s ο X a d i f e η - e t h y 1) 、 °比°坐解草酉旨 (mefenpyr-diethyl)、甲氧苯酮（methoxyphenone)((4-曱氧基-3_甲苯基）（3-甲苯基）-曱綱）、萘二甲酸酐（naphthalic &111^(1]*丨(16)(1，8-萘二曱酸酐）與解草腈（(^&1^11^1^1)。可將有效解毒劑量的除草劑安全劑與化合物同一時間施加，或在種子處理時施加。因此，本發明之一態樣係有關於應用一包括嘉填塞、至少一其他除草劑與一有效解毒劑量的除草劑安全劑的混合物。種子處理係特別有用於選擇性雜草控制，因為其物理上限制解毒力於作物植株上。因此，特別有用的實施例為選擇性控制田地中雜草生長的方法，其包括以有效解毒劑量的安全劑處理種子（植株由此成長）與以有效劑量的除草劑處理田地以控制雜草。熟悉技術之人士可經由簡單試驗決定安全劑的有效解毒劑量。有效解毒劑量的安全劍存在於欲以安全劑處理之植株上，以便除草劑在植株上的效應減少（相對於未處以安全劑的植株上之效應）；一般而言，有效解毒齊全劑避免對處以*全劑的植株造成傷害或嚴重傷害。熟悉技術之人士能夠決定安全劑的使用是否洽當以及決定施加於作物上的安全劑含量。 102 200817524 特定實施例中，施加於3560.4 3.5植草劑組合物作為安 ⑨卓劑或除田 ft』在此實轭例中，施加有#鉉主 I的第一除草劑哎除笪匈、曰效解’劑 d :¾除卓劑混合物給植株。因耕種區域中雜箪的古土 ^ ^ &供控制植…：包括以作物種子或植株種 ΓΓ 作物種子或植株包括第-聚核芽酸（直編〜多胜狀’該多胜肽賦予對嘉鱗塞的耐藥性），將立可用性連接於植物中活躍的啟動子；以 /、夂乐一聚核if西参〆編碼一多胜肽，該多胜肽賦予對乙醯乳酸A ·，、耐華性），蔣I 1 k 成~抑制劑的樂生）將其可用性連接於植物中活躍的啟動括至少-有效劑量的第一與第二除草劑之除草劑二：施加於作物、作物部位、雜草或其耕種區域、、’：除草劑組合物控制雜草；且當與對照作 =劑量的一除草劑）相比時，作物無法忍受單獨施 1欢齊j f M g 一除草劑；而有效劑量的第二除草劑足以產生a 、應，其中當與單獨施加第一除草劑的作物 a f生效 J眾性相屮，太應用第一與第一除草劑後安全性效應提藥性。、供增強的作物对 Ο 特定實施例中，安全性除草劑的組合物勺括第一Α 乳酸合成酶抑制劑與第二乙醯乳酸合成酶永 ' 制劑。复他實施例中，藉由施加有效劑量的嘉磷塞與乙 ’、 -礼酸合成維仆學作用抑制劑的組合物達成安全性效應。 ^ 冉其他實施例中，當3560.4.3.5大豆作物、作物部位、作物種子、雜蕈或耕種區域處以至少一來自確酿尿素類彳卜 ” 千物質的除蕈劑與至少一來自乙醯乳酸合成酶類化學物拼 ^ 、初貝的除草劑（例如，σ米嗤淋酮）達成安全性效應。降低除草劑傷上述之混合物提供高作物财藥性（即， 103 200817524 害）。此方法可提高處理前或處理後的應用比例。上述之方法可用於近一步控制無用或不欲植物。其他實施例中，當3 560·4·3 ·5大豆作物、作物部位、作物種子、雜草或耕種區域處以至少一來自磺醯尿素類化學物質的除草劑與至少一來自喃嗤琳酮類化學物質的除草劑達成安全性效應。此方法提供高作物耐藥性（即，降低除草劑傷害）。特定實施例中，磺醢尿素類包括玉嘧磺隆而咪唑啉酮類包括味草煙。其他實施例中，亦將嘉磷塞施加於作物、作物部位或耕種區域。此處所用之「辅助劑」為添加至噴霧溶液或成分以改良農業上化學物質的作用或噴霧溶液的物理特性。參閱，例如 Green 與 Foy (2003) “Adjuvants: Tools for Enhancing Herbicide Performance” in fFeed 5/o/ogy Λ/α/7 age me π/， ed. Inderjit (Kluwer Academic Publishers， The Netherlands)。可將輔助劑編為或分類為：催化劑、酸化劑、緩衝劑、添加劑、附著劑、抗凝劑（antiflocculants)、抑泡劑（antifoamers)、消泡劑（defoamers)、防柬劑、引誘劑、基本混合劑（basic blends)、螯合劑（chelating agents)、除垢劑、著色劑或染色劑、兼容劑（compatibility agents)、共溶劑（c o s ο 1 v e n t s)、搞合劑（c o u p 1 e r s)、作物油脂濃縮物、沉澱劑、清潔劑、分散劑、飄散控制劑（drift control agents)、乳化劑、減少蒸發劑（evaporation reducers)、增量劑（extenders)、肥料劑（fertilizers)、起泡劑（foam markers)、組成劑（formulants)、惰化劑（inerts)、保濕劑 (humectants)、甲 g旨化種子油（methylated seed oils)、高負載作物油脂濃縮物（high load COCs)、聚合劑（polymers)、 104 200817524 變性植物油（modified vege表 oils)、渗透劑、防水劑 (repellants)、石油濃縮物（petroleum oil concentrates)、防腐劑、耐雨劑（rainfast agents)、助留劑（retention aids)、溶解劑（s ο 1 u b i 1 i z e r s)、界面活性劑、散佈劑（s p r e a d e r s)、粘著劑（stickers)、粘展劑（spreader stickers)、協同劑 (synergists)、增稠劑（thickeners)、移位幫助劑 (translocation aids)、紫外光保護劑（uv protectants)、植物油（vegetable oils)、水質穩定劑（water conditioners)與濕满劑（wetting agents)。此外，這些方法可包括應用除草劑或除草劑混合物以及一或更多種其他下列之物：殺蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑、殺菌劑、殺蜱劑（acaricides)、生長調控劑、化學不育劑（chemosterilants)、化學信息素（semiochemicals)、驅蟲劑（repellents)、引誘劑、費洛蒙、激食劑（feeding stimulants) 或其他生物活性化合物或蟲生（entomopathogenic)細菌、病毒或真菌’以形成多成分混合物好賦予更寬廣的農業保護幅度。可用於方法中的農藥保護劑之實例包括：殺蟲劑，諸如阿巴汀（abamectin)、毆殺松（acephate)、亞滅培 (acetamiprid)、米弗滅（amidoflumet)(S- 1 955)、亞弗麥丁素（a verm ec tin)、印楝素（azadirachtin)、谷速松 (azinphos-methyl)、畢芬寧（bifenthrin)、聯苯肼酯 (bifenazate)、布芬淨（buprofezin)、加保扶（carbofuran)、培丹（cartap)、克凡派（chlorfenapyr)、克福隆 (chlorfluazuron)、陶斯松、甲基陶斯松 (chlorpyrifos-methyl)、環蟲醯肼（chromafenozide)、可尼丁（clothianidin)、丁氟蟎酯（cyflumetofen)、赛扶寧 105 200817524 (cyfluthrin)、貝他赛扶寧（beta-cyfluthrin)、赛洛寧 (cyhalothrin)、浪打赛洛寧（iainbda- cyhalothrin)、賽減寧 (cypermethrin)、賽滅淨（cyr〇mazine)、第滅寧 (deltamethrin)、汰芬隆（diafenthiuron)、大利松 (diazinon)、地特靈（dieldrin)、二福隆（diflubenzuron)、四氟曱醚菊酯（dimefluthrin)、大滅松（dimethoate)、達特南

Ο (dinotefuran)、達芬南（diofenolan)、因滅汀（emamectin)、安殺番（endosulfan)、益化利（esfenvalerate)、乙蟲清 (ethiprole)、芬硫克（fen〇thiocarb)、芬諾克（fenoxycarb)、芬普寧（fenpropathrin)、芬化利（fenvalerate)、芬普尼 (fipronil)、氟尼胺（flonicamid)、氟蟲醯胺 (flubendiamide)、護賽寧（flucythrinate)、福化利 (tau-fluvalinate)、氟芬寧（flufenerim)(UR-5070 1 )、氟芬隆 (flufenoxuron)、福諾松（fonophos)、氣蟲醯肼 (halofenozide)、六伏隆（hexaflumuron)、愛美松 (hydramethylnon)、益達胺（imidacloprid)、因得克 (indoxacarb)、亞芬松（isofenphos)、祿芬隆（lufenuron)、馬拉松（malathion)、美弗腙（metaflumizone)、聚乙駿 (metaldehy de)、達馬松（methamidopho s)、滅大松 (methidathion)、納乃得（methomyl)、美賜平（methoprene)、氣化甲醇（methoxychlor)、美特寧（metofluthrin)、亞素靈 (monocrotophos)、滅芬諾（methoxyfenozide)、稀咬蟲胺 (nitenpyram)、尼絲浸（nithiazine)、諾伐隆（novaluron)、諾弗隆（noviflumuron)(XDE-007)、毆殺滅（oxamyl)、巴拉松（parathion)、甲基巴拉松（parathion-methyl)、百滅寧 (permethrin)、福瑞松（phorate)、裕必松（phosalone)、益滅 106 200817524

松（phosmet)、福賜米松（phosphamidon)、比加普 (pirimicarb)、佈飛松（profenofos)、佈弗寧（profluthrin)、派滅淨（pymetrozine)、派弗浦（pyrafluprole)、除蟲菊精 (pyrethrin)、百利達立（pyridalyl)、百利普立（pyriprole)、百利普芬（pyriproxyfen)、魚藤精（rotenone)、里阿諾鹼 (ryanodine)、賜諾殺（spinosad)、賜派芬（spirodiclofen)、季酮曱蟎酯（spiromesifen)(BSN 2060)、螺蟲乙酯 (spirotetramat)、蘇浦松（sulprofos)、得芬諾 (tebufenozide)、得福隆（teflubenzuron)、汰福寧 (tefluthrin)、托福松（terbufos)、樂本松 (tetrachlorvinphos)、賽果培（thiacloprid)、赛速安 (thiamethoxam)、硫敵克（thiodicarb)、硫蘇特-鈉鹽 (thiosultap-sodium)、特多寧（tralomethrin)、唾財威 (triazamate)、三氣松（trichlorfon)與三福隆（triflumuron); 殺真菌劑，諸如艾西邦唑（acibenzolar)、阿迪墨弗 (aldimorph)、吲唾確菌胺（amisulbrom)、阿扎康嗤 (azaconazole)、亞托敏 (azoxy strobin) 、本達樂 (benalaxy 1)、免賴得 (benomyl)、苯噻菌胺 (benthiavalicarb) 、苯噻菌胺異丙酯 C； (benthiavalicarb-isopropyl)、比諾謬（binomial)、聯苯 (biphenyl)、比多農（bitertan〇1)、保米黴素（blasticidin-S)、波爾多液（Bordeaux mixture)(三元硫酸銅）、白克列 (boscalid/nicobifen)、漠克座（bromuconazole)、布瑞莫 (bupirimate)、得滅多（buthiobate)、萎錄靈（carboxin)、加普胺（carpropamid)、四氯丹（captafol)、蓋普丹（captan)、貝芬替（carbendazim)、二氯甲氧苯（chloroneb)、四氯異苯 107 200817524 腈（chlorothalonil)、克氯得（chloz〇linate)、克三美唑 (clotrimazole)、乳氧化銅（c〇pper 〇XyChi〇ride)、銅鹽（諸

如，硫酸銅與氫氧化銅）、賽座滅（cyazofamid)、西弗嘧 (cyflunamid)、克絕（cymoxanil)、環克座（cyproconazole)、赛普洛（cyprodinil)、益發靈（dichlofluanid)、雙氯氰菌胺 (diclocymet)、達滅淨（diclomezine)、大克爛（dicloran)、乙黴威（diethofencarb)、待克利（difenoconazole)、達滅芬 (dimethomorph)、醚菌胺（dimoxystrobin)、達克利 (diniconazole、diniconazole_M)、白粉克（dinocap)、達克賓（discostrobin)、腈硫醌（dithianon)、嗎菌靈 (dodemorph)、多寧（dodine)、亦可那唑（econazole)、塔可那唑（etaconazole)、護粒松（edifenphos)、依普座 (epoxiconazole)、薩布險（ethaboxam)、依瑞莫（ethirimol)、依瑞代11坐（ethridiazole)、凡殺同（famoxadone)、芬喊同 (fenamidone)、芬瑞莫（fenarimol)、芬克座 (fenbuconazole)、芬卡嘧（fencaramid)、芬弗爛（fenfuram)、芬六 (fenhexamide)、芬諾寧（fenoxanil)、芬皮寧 (fenpiclonil)、芬普变（fenpropidin)、芬普福 (fenpropimorph)、三苯醋踢（fentin acetate)、三苯經錫 (fentin hydroxide)、福美鐵（ferbam)、福瑞葉 (ferfurazoate)、富米綜（ferimzone)、扶吉胺（fluazinam)、護汰寧（fludioxonil)、護美佛（flumetover)、I °比菌胺 (fluopicolide)、氟癌菌酯（fluoxastrobin)、護康嗅 (fluquinconazole)、護石夕得（flusilazole)、氣硫滅 (flusulfamide)、福多寧（flutolanil)、護汰芬（flutriafol)、福爾培（folpet)、福赛得（fosetyl-aluminum)、福貝唾 108 200817524 (£1^14<1&2〇16)、福拉夕（尸1^1丑乂71)、福滅派（!>1^11^3口>^)、菲克利（hexaconazole)、惡霉靈（hymexazole)、克熱淨 (guazatine)、依滅歹!J (imazalil)、易胺座（imibenconazole)、克熱淨（iminoctadine)、歐滴克（iodicarb)、易康唑 (ipconazole)、丙基喜樂松（iprobenfos)、依普同 (iprodione)、依非克（iprovalicarb)、異康吐（isoconazole)、亞賜圃（isoprothiolane)、嘉賜黴素（kasugamycin)、克收欣 (kresoxim-methyl)、鋅锰乃浦（mancozeb)、雙快醯菌胺 (mandipropamid)、猛乃浦（maneb)、滅片淋（mapanipyrin)、右滅達樂（mefenoxam)、滅普寧（mepronil)、滅達樂 (metalaxy 1)、滅特座（metconazole)、滅蘇克 (methasulfocarb)、免得爛（metiram)、免啼史賓/芬味史賓 (metominostrobin/ fenominostrobin) 、滅派林 (mepanipyrim)、滅芬隆（metrafenone) 、 17米康 11 坐 (miconazole)、邁克尼（myclobutanil)、新阿蘇仁 (neo-asozin)(曱基石申酸鐵）、尼瑞莫（nuarimol)、辛嘆嗣 (octhilinone)、弗拉斯（ofurace)、歐撒史賓（orysastrobin)、歐殺斯（oxadixyl)、歐索林酸（oxolinic acid)、歐波康嗤 (oxpoconazole) 、嘉保信 (oxycarboxin) 巴克素 (paclobutrazol) 、平克座 (penconazole) 賓克隆 (pencycuron)、賓硫瑞 (penthiopyrad)、派弗拉諉 (perfurazoate) 、膦酸 (phosphonic acid) 熱必斯 (phthalide)、匹賓 (picobenzamid) 、匹可史賓 (picoxy strobin) 、保粒黴素(polyoxin) 撲殺熱 (probenazole) 、撲克拉 (prochloraz) 撲滅寧 (procymidone) 、普拔克 (propamocarb 109 200817524 propamocarb-hydrochloride)、普克利（propiconazole)、甲基鋅乃浦（propineb)、普困悸（proquinazid)、普硫康唑 (prothioconazole)、百克敏（pyraclostrobin)、百座弗 (pryazophos)、比芬諾（pyrifenox)、派美寧（pyrimethanil)、百林浚（pyrolnitrine)、百快隆（pyroquilon)、快康唑 (quinconazole)、快諾芬（quinoxyfen)、五氣石肖苯 (quintozene)、夕硫梵（silthiofam)、欣康嗤 (simeconazole)、葚抱菌素（spiroxamine)、鏈黴素 (streptomycin)、硫石黃（sulfur)、得克利（tebuconazole)、泰拉勁（techrazene)、克枯爛（tecloftalam)、克納勁 (tecnazene) 、四克利(tetraconazole) 、腐絕 (thiabendazole)、賽篆滅（thifluzamide)、多保淨 (thiophanate)、甲基多保淨（thiophanate-methyl)、得恩地 (thiram)、泰地寧（tiadinil)、脫克松（tolclofos-methyl)、甲基益發靈（tolyfluanid)、三泰芬（triadimefon)、三泰隆 (triadimenol)、三理莫（triarimol)、三 σ坐赛（triazoxide)、三得芬（tridemorph)、三莫喊三環嗤(trimoprhamide tricyclazole)、三 I 敏（trifloxystrobin)、赛福寧 (triforine)、三康唾（triticonazole)、單康唾（uniconazole)、維利黴素（validamycin)、免克寧（vinclozolin)、鋅乃浦 (zineb)、福美鋅（ziram)以及嗤撒,（zoxamide);殺線蟲劑，諸如得滅克（aldicarb)、殿殺滅與芬滅松（fenamiphos); 殺菌劑，例如鏈黴素；殺碑劑，諸如三亞滿（amitraz)、離丹（chinomethionat)、克氣苯（chlorobenzilate)、錫蜗丹 (cyhexatin)、大克蟎（dicofol)、得氯蟎（dienochlor)、依殺蜗（etoxazole)、芬殺瞒（fenazaquin) ' 芬佈賜（fenbutatin 110 200817524

Ο oxide)、芬普寧、芬普蜗（fenpyroximate)、合賽多 (hexythiazox)、毆蟎多（propargite)、畢達本（pyridaben)與得芬瑞（tebufenpyrad);以及生物性藥劑，包括蟲生細菌，諸如钻澤亞種蘇力菌thuringiensis subsp. J/zawaz·)、庫斯塔克亞種蘇力菌（BaciZ/ws thuringiensis subsp· ATwrWah·)與蘇力菌i/zwrMgiewhs)的笑膜晶毒蛋白（encapsulated delta-endotoxin)(例如，Cellcap、 MPV、MPVII);蟲生真菌，例如綠殪菌（greenmuscardine fungus); 以及蟲生病毒，包括諸如桿狀病毒 (baculovirus)、核型多角體病毒（nucie〇p〇iyhedro virus， NPV)(諸如，谷實夜蛾核型多角體病毒r HzNPV」、芹菜夜蛾核型多角體病毒「A fNPV」）；以及顆粒體病毒（granulosis virus, GV)(例如，蘋果蠹蛾顆粒體病毒r cpGV」）。這些不同的混合夥伴與方法中所用的其他組成（例如，除草劑）之重量比例一般為1 〇〇 ·· 1與1 :1 〇〇之間、3 0 ·· 1與1 :3 0之間、1 0 :1與1 :1 0之間或4 :1與1 :4之間。進一步提供組合物，其包含生物有效劑量的關注之除卓劑或除卓劑纟且合物以及有效劑量的至少^一額外生物活性化合物或藥劑，且該組合物可更至少包括界面活性劑、固狀稀釋液或液狀稀釋液其中之一。上述生物活性化合物或樂劑的實例為：殺蟲劑，諸如阿巴、;丁、殿殺松、亞滅培、米弗滅（S-1955)、亞弗麥丁素、印楝素、谷速松、畢芬寧、畢芬載（binfenazate)、布芬淨、加保扶、克凡派、克福隆、陶斯松、曱基陶斯松、環蟲醯肼、可尼丁、賽扶寧、貝他赛扶寧、賽洛寧、浪打赛洛寧、赛滅寧、赛滅淨、第滅寧、汰芬隆、大利松、二福隆、大滅松 '達芬南、因滅汀、安 111 200817524 殺番、益化利、乙蟲清、芬硫克、芬諾克、芬普寧、芬化利、芬普尼、氟尼胺、護赛寧、福化利、氟芬寧（UR-5〇7〇1)、氟务隆、福諾松、氣蟲醯肼、六伏隆、益達胺、因得克、亞芬松、祿芬隆、馬拉松、聚乙醛、達馬松、滅大松、納乃得、美賜平、氣化甲醇、亞素靈、滅芬諾、尼絲浸 (nithiazin)、諾伐隆、諾弗隆（XDE_007)、毆殺滅、巴拉松、甲基巴拉松、百滅寧、福瑞松、裕必松、益滅松' 福賜米松、比加普、佈飛松、派滅淨、百利達立、百利普芬、魚藤精、賜諾殺、季酮甲蟎酯（BSN 2060)、蘇浦松、得芬諾、得福隆、汰福寧、托福松、樂本松、赛果培、賽速安、硫敵克、硫蘇特-鈉鹽、特多寧、三氯松與三福隆；殺真菌劑，諸如艾西邦嗤、亞托敏、免賴得、保米黴素、波爾多液（三元硫酸銅）、溴克座、加普胺、四氣丹、蓋普丹 '貝芬替、二氯甲氧苯、四氯異苯腈、氣氧化銅、銅鹽 '西弗嘧、克絕、環克座、賽普洛、（5)·3,5-二氯-氣-1-乙基_1·甲基-2-氧丙基）-4-甲基苯甲醯胺（RH 7281)、雙氣氰菌胺（S-2900)、達滅淨、大克爛、待克利、（幻-3，5-二氫-5-甲基-2·(甲硫基）-5 -苯基-3-(苯基-胺基）-4 味°坐-4 ·酮 (RP 4 0 72 1 3)、達滅芬、醚菌胺、達克利、達克利·Μ、多寧、護粒松、依普座、凡殺同、芬嘧同、芬瑞莫、芬克座、芬卡嘧（SZX0722)、芬皮寧、芬普啶、芬普福、三苯醋錫、三苯羥錫、扶吉胺、護汰寧、護美佛（RPA 403397)、護膜弗 /護膜林（numorf/flumorlin)(SYP-L190)、氟嘧菌酯（HEC 5 72 5)、護康唑、護矽得、福多寧、護汰芬、福爾培、福赛得、福拉夕、福滅派（S-8265 8)、菲克利、易康唑、丙基喜樂松、依普同、亞賜圃、嘉賜黴素、克收欣、鋅錳乃浦、 112 200817524 綠乃浦、右滅達樂、滅普寧、滅達樂、滅特座、免咪史賓 /芬咪史賓（SSF-126)、滅芬隆（AC375 839)、邁克尼、新阿蘇仁（甲基砷酸鐵）、白克列（B As 510)、歐撒史賓、毆殺斯、平克座、負克隆、撲殺熱、撲克拉、普拔克、普克利、普困悸（DPX-KQ92 6)、普硫康唑（jau 6476)、比芬諾、百克敏、派美寧、百快隆、快諾芬、葚孢菌素、硫磺、得克利、四克利、腐絕、赛氟滅、甲基多保淨、得恩地、泰地寧、二泰务、二泰隆、二環α坐（triCyClaz〇le)、三氟敏、三康。坐、維利黴素與免克寧；殺線蟲劑，諸如得滅克、毆殺滅與芬滅松；殺菌劑，例如鏈黴素；殺蜱劑，諸如三亞滿、離丹、克氯苯、錫蟎丹、大克蟎、得氣蟎、依殺蟎、芬殺蟎、芬佈賜、芬普寧、芬普蟎、合賽多、毆蟎多、畢達本與得芬瑞；以及生物藥劑，包括蟲生細菌，諸如鮎澤亞種蘇力菌、庫斯塔克亞種蘇力菌與蘇力菌的莢膜晶毒蛋白（例如， Cellcap、MPV、MPVII);蟲生真菌，例如綠殖菌；以及蟲生病毒，諸如桿狀病毒、核型多角體病毒（諸如，谷實夜蛾核型多角體病毒、芹菜夜蛾核型多角體病毒）；以及顆粒體病毒（例如’蘋果蠹蛾顆粒體病毒）。方法亦包括基因轉形植株使其表現對無脊椎害蟲有害的蛋白質（例如，蘇力菌的莢膜晶毒蛋白）。某些實施例中，用於控制無脊椎害蟲的外源性化合物之效應可與表現之毒性蛋白質協同作用。這些農業保護劑的普遍參考文獻包括 rk户心 Manual，13th Edition, C. D. S. Tomlin, Ed.? British Crop Protection Council，Farnham，Surrey，U.K·，2003 以及 The BioPesticide Manual， 2nd Edition， L. G· Copping， Ed., 113 200817524

British Crop Protection Council^ Farnham, Surrey, U 2001 °

Ο 某些實例中，具有控制無脊椎害蟲之其他化合物或藥劑（具有相似的控制幅度但不同的作用模式）的組合物特別有利於抗性管理。因此’組合物可進一步包括生物有效劑量的至少一額外無脊椎害蟲控制化合物或藥劑（具有相似的控制幅度但不同的作用模式）。以基因改良植物使其表現保護性化合物（例如，蛋白質）或使植物所在地接觸生物有效劑量的化合物，亦可提供較寬廣的植物保護幅度且有利於抗性管理。因此，方法可應用除草劑或除草劑組合物且進一步包括應用殺蟲劑與/或殺真菌劑與/或其他農業化學物質（例如，肥料劑）。使用上述之組合處理可擴大活性幅度以防備額外的雜草物種與抑制任何抗性生物型（r e s i s t a n t biotype)物種的增生。方法可進一步包括應用植物生長調節劑，諸如艾維激素（aviglycine) 、 #-(苯基甲基）-1//-嘌呤-6-胺 (N-(pheny 1 met hy 1)-1//-pur in-6 amine)、益收生長素 (ethephon)、波雀隆（epocholeone)、勃激素（gibberellic acid)、激勃素（gibberellin)A4 與 A7、誘敏蛋白質（harpin protein)、甲派咬（mepiquat chloride)、普六 _ 妈 (prohexadione calcium)、普海松（prohydrojasmon)、石肖基苯紛納 (sodium nitrophenolate)與曱基三财配 (trinexapac-methyl)，與植物生長改造有機體，例如BP01 品種的仙人掌桿菌cerews)。在接下來的實施例中進一步界定具體實施例。應當理 114 200817524 解這些實施例僅作盔>、+、戸馬描述用途。由上述與這些實施例，熟悉技術之人士可碟定、y 疋必要的特性，且可在不悖離其之精神與範圍對本發日月眚ρ 4 ^ %例造成多種改變與改良以使其適應多種用法與環境。因此’熟悉技術之人士可由前文的敘述理解除了纟文所顯示與描述之外，《可理解本#明實施例的多種改良。亦預装日μ、+、 W期上述之改良位於附屬的專利申請範圍中 Ο f 試驗實施例實检例Κ大息-^^^3^6〇.4.3·5之插入庠列輿旁側邊緣序列的特性大丑轉殖品項356〇.4.3.5，此後稱為3 560.4.3.5大豆’藉由基因搶法（micr〇pr〇jectile b〇mbardment)將來自質體PHP20 1 63的jvw I片段送入大豆而得到 3560·4·3·5大豆。此片段，pHp2〇163A，包括受到scpi 啟動子調控的嘉磷塞乙醯轉移酶基因，該 SCP1啟動子為一合成式持續表現型啟動子，其包括一部 ί: 份的 CaMV 35S 啟動子（0dell 等人（ 1 985) Nature 313:810-812)與 RSyn7-Syn II Core 合成式一致性啟動子 (consensus promoter)(美國專利案編號 6,072,050 與 6,555,673)。亦參閱，例如1^20030226166的表13與序列編说3。此片段的下游為終草鑲喪病毒（T〇bac co Mosaic Virus，TMV) omega 5’端未轉譯區（5'UTR)的轉譯增強子片段（Gallie 等人（1992) iVwc/eic Jc/c/ 20:4631-4638)與來自馬鈴薯的蛋白酶抑制劑 II(proteinase inhibitor II，ρίπΙΙ)基因終止子 115 200817524

(terminator)(Keil 等人^ (\9 名 6、Nucleic Acid Research 14:5641-5650 以及 An 等人（1989) _P/心，〇// 1:115-122)。 PHP20 1 63 A亦包括大豆乙醯乳酸合成酶基因的變性 (modified)基因具有15個額外的核苷酸 (來自乙醯乳酸合成酶基因的5’端未轉譯區）於其5’端上以及兩個在編碼序列中的核苷酸變化，gw-Zzw基因受到腺普甲硫胺酸合成酶（S-adenosyl-L-methionine synthetase， SAMS)啟動子（美國專利公開案2003/0 226166)、其5,端未轉譯區與内子（SAMS Pro)以及乙醯乳酸合成酶終止子的調控，上述腺苷甲硫胺酸合成酶與乙醯乳酸合成酶的片段均來自大豆。為了描述DNA插入片段（來自PHP20163A)與基因體插入位點的整體特性，測定3560.4.3 ·5大豆插入區域與旁側基因體邊緣區域的序列。總計，定序1 〇 8 4 9個3 5 6 0.4 · 3.5 大豆驗基對（bp)’其包括5362驗基對來自ρΗρ2〇ΐ63Α的 DN A插入片段、3 3 1 7鹼基對的5，端旁側基因體邊緣序列與2170驗基對的3’端旁側基因體邊緣序列。當與轉形所用之DNA片段的預期序列相比時，可確定插入片段係完整且相同於PHP20163A並準確地併入女5曾干作1开入大丑基因體。聚合酶鏈反應擴增3560.4.3.5大豆插入與邊绫皮您緣序列可確認邊緣

區域係來自大豆’因此該接合區域可作A 八J ^馬識別3 56〇 4 3 5 大豆之用。邊緣區域的BLASTn分析產生與公開和專屬 (proprietary)之大豆基因體序列明顯的相同性。大體上，南方墨點法（Southern blot)資料對3560 4 , • · 3 · 5大豆之插入序列與基因體邊緣序列的特性描述指出^ 相(數據未顯示），僅 116 200817524 有一個DNA片段（PHP2061 3A)存在於大豆基因體中使用下方的縮寫以方便描述本發明 ALS 乙醯乳酸合成酶蛋白質 bp 鹼基對 glyat 嘉磷塞乙醯轉移酶基因 GLYAT 嘉磷塞乙醯轉移丨酶蛋白質 GLYAT4601 來自 glyat4601 基因的嘉磷塞乙醯轉移酶蛋白質 gm-als 來自大豆的野生型乙醯乳酸合成酶基因 gm-hr a 來自大豆的改變型乙醯乳酸合成酶基因 kb 千個鹼基對 PCR 聚合酶鏈反應 UTR 未轉譯區域 als 乙醯乳酸合成酶基 .因 AMS 硫酸銨 DAT 處理後之天數 glyat4 601 苔癬桿菌（“ciZ/ws 離析 ^ 的嘉罐塞乙醯轉移酶（g/yai)基因家奸、 7次DNA置換（DNA shuffling)得到的嘉碟塞乙醢轉移酶基因（Castle等人（2004) 304:1 1 5 1 - 1 1 54; Siehl 等人（2005)

Pest Manag. Sci. 6 1:235-240) GLYAT4601 苔癬桿菌離析得到的嘉磷塞乙醯轉移酶基因家族經過7次DNA置換得到的 117 200817524 嘉磷塞乙醯轉移酶蛋白質（Castle等人 (2004) Science 304:1151-1154 ； Siehl 等人 (2005) Pest Manag. Sc i. 61:235-240) hr a 乙酿乳酸合成酶基因的高度抗藥性對偶基因（allele) glyai + gm-hra 表現g/少與gm-ha兩者的基因轉殖品項 NILs 近似同源（is〇genic)品系

NIS 非離子性界面活性劑 SAMS 腺苷甲硫胺酸合成酶啟動子（美國專利申請案編號 2003/0226166) SCP1 合成式持續表現型啟動子1(美國專利案編號 6072050 與 6555673 B1) 藉由插入來自苔癬桿菌的嘉填塞乙醯轉移酶 (g/少基因與變性的大豆乙醯乳酸合成酶基因 (gm-Ara)來改良大豆（G/yche 。藉由基因置換處理功月&性改良基因以使嘉磷塞乙醯轉移酶（glyat) 乙醯化除草劑嘉磷塞的活性達到最佳化。將尽紗基因插入植物内經由將嘉磷塞轉形成無毒的乙醯形式而賦予植株對除草劑活性成分嘉磷塞的耐藥性。插入可產生變性的乙酿乳酸合成酶酵素。支鏈胺基酸的生物合成必須有乙醯乳酸合成酶，但的修改克服此一限制因而提供對廣大範圍之乙醯乳酸合成酶抑制型除草劑的耐藥性。 118 200817524 利用公眾可獲得的培育品種，J a c k，作為接收品系以產生 3560·4·3·5 大豆。藉由基因搶法將來自質體 ΡΗΡ201 63(第1圖）的iVoi I片段送入大豆而得到

3560·4·3·5大豆。此片段，PHP20 1 63A(第2圖），包括受到SCP1啟動子與於草鑲嵌病毒omega 5’端未轉譯區的轉譯增強子片段與來自馬鈐薯的蛋白酶抑制劑Η基因終止子調控的基因。ΡΗΡ20163Α亦包括受到腺苦甲硫胺酸合成酶與乙醢乳酸合成酶（gm-a/s)終止子調控的 gw-Zzra基因，腺苷曱硫胺酸合成酶與乙醯乳酸合成酶的片段均來自大豆。利用 Bio-Rad (Hercules， CA)製造的 Biolistics PDS-1000/He粒子搶製造基因轉殖3560.4.3.5大豆，而這基本上為Klein等人於1987年所述之方法。轉形的目標物係衍生自外植片體（explants)的二級體胚叢（clumps of secondary somatic embryos)，該外植片體來自細小、未成熟的大豆種子（培育品種，Jack)。將二級體胚由未成熟的外植片體切下並轉移至液狀大豆培養基，且定期繼代培養 (subculture)直到準備好用於基因搶轉殖。大豆體胚開始培養2-4月後將其用於轉形實驗。在轉形當天’將純化的 PHP20 1 63A DNA片段彼覆於金微粒 (microscopic gold particles)上並將金微粒加速送入培養的大豆胚芽。在轉形處理中，僅應用PHP20163ADNA而不應用額外的DNA (例如，載體DNA)。轉形之後，將大豆組織轉移至新鮮液狀培養基的燒瓶内以便恢復。七天後，將液狀培養基換成添加氯磺隆（作為篩選藥劑）的培養基。氯磺隆屬於乙醯乳酸合成酶抑制 119 200817524 型除草劑家族，因此僅有帶有穩定遺傳之轉殖基因的大豆細胞可持續生長。在添加氯橫隆的培養基中經過數個星期後，健康、耐氯確隆的綠色組織（green tissue)小島（islands)形狀變得清晰且開始由垂死的體胚組織片段長出。將綠色胚胎叢 (embryogenic clumps)由垂死或死亡組織的片段上切下，並接受定期更換新鮮液狀選擇培養基直到開始再生過程。藉由南方墨點雜交法分析胚胎組織樣本以確認與轉殖基因的存在。將丁〇植株再生並轉移至溫室中以產生種子。第5圖描述育種譜系圖。基因搶轉形3560.4.3.5大豆的方法中，DNA係插入植物基因體中。事實上可在植物基因體任何位置發生DNA 片段的插入。一但插入後，植物可識別含有植物表現片段的基因且表現之。接著應用不同的分子技術以明確地描述 3560·4·3·5大豆的插入位置。南方墨點方分析指出，單一、完整的ΡΗρ2〇 163Α片段插入大豆基因體中以產生3560·4·3·5大豆（數據未顯示）。進行選瘦與定序3 560.4.3.5大豆的旁側基因體鄰近區域與DNA插入片段，以描述大豆基因體中的插入位置並得到可用來獨特地辨別356〇·4·3.5大豆的序列。將3 560.4.3.5大豆Τ5代的葉片組織用作額外的序列描述^ Τ5代係jack大豆變種的轉形株經過兩次自交後，挑選來自第二次自交的單一植株用於三次連續循環（自交與種子增長）的世代。南方墨點分析用於確認3560 4·3·5 大立葉片組織上的轉殖品項（數據未顯示）。 120 200817524 將來自未基因改良之大豆植株的葉片組織作為序列特徵描述的對照。未改良的大豆植株具有3 560.4.3.5大豆背景的代表性基因背景（genetic background);然而，它們並不含有與基因的植物轉錄單元。應用 100 bp 與 1 kb 的 DNA 階梯（step DNA Ladders)(Promega，Madison，WI)以評估瓊脂凝膠（agarose gel)上DNA片段的大小。

Ο 種植3560.4.3.5大豆的大豆種子與未改良的對照種子以產生足夠DNA分析的植株數量。為了描述3560.4.3.5 大豆品系的特徵，種植八個T 5代的種子。同樣地種植八個大豆對照品系的種子。每盆種植一個種子，且可獨特地辨別該盆。有助於健康植株生長的種植與生長條件包括規律的光線與水分。收集各個對照植株與3560·4·3·5大豆植株的葉片樣本。針對各個樣本而言，收集足夠來自上述之生長時間點的葉片組織並置於一預先標記的樣本袋中。收集後，將樣本置於乾冰上並轉移至極冷的冷藏室中。將所有樣本維持冷凍狀態直到處理之前。將冷凍的葉片樣本（數量，1-2克）磨碎，並利用改良型尿素萃取緩衝液（Urea Extraction Buffer)步驟（Chen等人（1994) Urea-based plant DNA miniprep in Freeling. Μ. and Walbot V·， eds， ΓΛβ Μα/ze Springer-Verlag,

New York，p 526-527)離析基因體DNA。如上述之方法由來自各個植株的葉片組織萃取基因體DNA。明確地說，利用 Geno/Grinder™ (SPEX CertiPrep，Inc·，Metuchen，NJ) 設備在含有研磨珠的試管中研磨組織，並利用標準步驟離 121 200817524

析基因體DNA。以5毫升的尿素萃取緩衝液（7M的尿素、 0.34 M NaCM、〇.〇5 M Tris-HCl，pH 8.0、0·02 M EDTA、1% N-十二烷基肌氨酸r N-Lauroylsarcosine」）在3 7°C下萃取約1克的研磨組織12至30分鐘，接著以酚/氯仿/異丙醇 (2 5 :24:1)萃取兩次並以氯仿飽和水溶液萃取一次。藉由加入1/10體積的3 M NaOAc (pH 5.2)與1體積的異丙醇將 DNA由水相（aqueous phase)中沉澱出來，接著以離心片狀化（pellet)DNA。在以70%乙醇清洗片狀物兩次後，將DNA 溶於 0.5 毫升的 TE 緩衝液（10mM Tris，1 mM EDTA，pH 7·5)並在37°C下以l〇微克的核醋核酸臃A(Ribonuclease A)處理15分鐘《將樣本以酚/氯仿/異丙醇（25:24:1)萃取一次並以氣仿飽和水溶液萃取一次，接著以異丙醇沉澱之並以70%乙醇清洗。乾燥後，將DN A重新溶於0,5毫升的 TE缓衝液並保存在4°C下《萃取之後，在瓊脂凝膠上觀察DNA並測定DNA的質量，並利用Pico Green®試劑 (Molecular Probes，Inc·，Eugene，OR)與螢光光譜分析定量之。西方墨點分析利用G L Y A T 4 6 0 1蛋白質的抗體以確認材料（用於南方墨點分析與序列特性描述）中 GLYAT4601 蛋白質的存在與否，完成3560.4.3.5大豆植株與對照植株的表現型分析。藉由研磨數個葉片並於150微升的蛋白質萃取缓衝液（50mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.1% SDS 與 10mM β -乙基硫醇）擠壓同質化而萃取整體蛋白質。將各個粗萃取物的等ΐ樣本與LDS樣本緩衝液（LDS Sample Buffer) 與還原藥劑（Invitrogen)混合並加熱至約95°C下5分鐘。在變性（denaturing)狀態下透過如同所述之NuPAGEtm 122 200817524

Bis/Tris Gel系統（In vitro gen)將蛋白質以大小分離。應用所選的分子量標準組（molecular weight standards)去測定凝膠中的足夠移動並在西方墨點法上測定分子量 (Invitrogen)。利用 NovexTM XCell II™ Blot Module Western Transfer (Invitrogen)所述之方法將 Bis/Tris 凝膠上之蛋白質轉移至硝化纖維膜上（nitrocellulose membrane)〇或者，以 SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen) 染色凝膠好顯現蛋白質以證實等量的樣本充填。

Ο 利用所述之 Western Breeze®化學螢光西方墨點免疫 ik 測套組（Chemiluminescent Western Blot Immunodetection Kit)(Invitrogen)偵測 GL YAT460 1 蛋白質條帶（protein band)。將特定於GLYAT4601蛋白質的一級單株抗體（Primary monoclonal antibodies)與 WesternBreeze®套組共同應用。接著利用化學螢光基質顯現條帶。將轉潰膜在一或多個時間點暴露於X光膠捲上以測定蛋白質條帶。在西方墨點法上應用純化的 GLYAT4601蛋白質作為陽性對照（positive c〇ntr〇1)。在西方墨點法上存在相稱大小的條帶時將植株標記正號（具有 GLYAT4601蛋白質），而不存在條帶時標記負號（不具有 GLYAT4601 蛋白質）。應用所有3 560.4.3.5大豆植株離析之DNA的初步南方墨點分析證實g/yaiMin與基因兩者的存在。此初步特徵描述的方法如下所述。在3 56〇·4·3·5大豆植株的亞群中實施決定性的南方墨點分析（數據未顯示）。將萃取自所選之3560·4·3·5大豆與對照大豆植株的基因體DNA樣本依照標準步驟以限制酶剪切。根據製造 123 200817524 商的建議’將大約2微克的基因體DNA在100微升體積中利用50單位的酵素剪切之。在37°C下3小時實施剪切，接著以1/10體積的3 M NaOAc (pH 5.2)與2體積的 1 0 0 °/〇乙醇進行酒精沉澱。在4。C下培養與離心後，使DN A 乾燥並重新溶於TE緩衝液中。將對照質體（php2〇1 63)以等同於每個大豆基因體一或三個基因拷貝數（gene c〇pies) 的數量併入對照植物DNA樣本中，並以相同酵素剪切以作為探針雜交作用的陽性對照並證實南方墨點法上内在片段的大小。限制酶剪切後，經由瓊脂凝膠以大小電泳分離產生的 DNA片段與分子董標準組 ΦΧ174 RF Ό^Α/Hae III Fragments (Invitrogen)以測定凝膠上片段足夠的移動與分離。在如下述之DIG偵測後顯現之DIG標示的DN A Molecular Weight Marker VII (Roche)，可用來測定南方墨點法上的雜交片段大小。將含有分離的 DNA 片段之瓊脂凝膠原位去嘌呤 (depurinated)、變性（denatured)與中和（neutralized)，並利用 TURBOBLOTTER™ Rapid Downward Transfer System (Schleicher & Schuell，Keene，NH)戶斤述之方法在 20X SSC (3 M NaCl，0.3 M檸檬酸鈉）緩衝液中轉移至尼龍膜上。轉移至膜上後，藉由紫外光交聯反應（UV crosslinking) (Stratalinker，Stratagene, La Jolla，CA)將 DNA 固定於膜上〇 SCP1 啟動子、、ρίπΙΙ 終止子、SAMS、與終止子的探針用來偵測插入片段内的基因與片段 (表3)。應用PHP201 6 3質體的骨幹⑼““㈣幻與抗效高黴素（hygromycin)之基因組合體區域（hcWone 與 124 200817524 紗探針）以證實356〇·4·3 5大豆中不存在質體骨幹 DNA(表3)。探針片段的DNA片段係藉由ΡΗΡ201 63質體 (第1圖）或具有相同片段的質體以聚合酶鏈反應利用特定弓I 山 ' 而產生。將聚合酶鏈反應片段在瓊脂凝膠上以電泳分，士刀下凝膠並利用凝膠純化套組（Q i a g e η，V a 1 e n c i a，c A) 純化DNA。藉由聚合酶鏈反應由這些片段產生dna探針該聚合酶鏈反應將Dig標記的核苷酸（[dIG-1 l]-dUTP) 、’片丰又中。根據 PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche) ，供=步驟實施離析片段的聚合酶鏈反應標記。

衣丄用於南方墨點雜合分析之DNA探針的描述探針名稱基因片段圖式探針第6圖篇探針1 PHP20163A 上的位置 (鹼基對至鹼基對） PHP20163 上的位置 (鹼基對至鹼基對）長度 (鹼基對） SCP1啟動子 SCP1啟動子 12至479 (序列編號29) 12 至 479 486 glyat4601 g/y故私0/基因第6圖探針2 597 至 1012 (序列編號30) 597 至 1012 416 終止子 phll終止子第6圖探針3 1107 至 1340 (序列編號31) 1107 至 1340 234 SAMS1 SAMS啟動子與内子片段第6圖探針4 1702 to 2146 (序列編號32) 2147 to 2638 (序列編號33) 1702 至 2146 2147 至 2638 445 492 gm-hra1 gm-hra基因第6圖探針5 2700 to 3629 (序列編號34) 3635 to 4664 (序列編號35) 2700 至 3629 3635 至 4664 930 1030 gm-ais終止子 gm-aL·終土子第6圖探針6 4670 to 5318 (序列編號36) 4670 至 5318 649 backbone 201631 PHP20163質體的骨幹第7圖探針A N/A2 7427 至 7954 6665 至 7416 528 752 hyg 201631 PHP20163的抗效高黴素基因第7圖探針B N/A 6097 至 6619 5389 至 6091 523 703 1產生兩個針對此探針的非部分重疊部分並聯合以便雜交作用。 2不適用；這些並不存在於PHP20163A片段上。 125 200817524 將由3560.4.3.5大豆植株離析的基因體DNA以 III與I剪切，並以電泳分離、轉移至尼龍膜（nylon membranes)，接著以與gw-ha基因探針雜合分析。利用DIG Easy Hyb溶液（Roche)所述之必備步驟將標記之探針雜交至尼龍膜上的目標 DNA以便偵測特定片段。嚴格清洗（stringent washes)後，利用 CDP-Star Chemiluminescent Nucleic Acid Detection System 與 DIG Wash and Block Buffer Set (Roche)顯現雜交的 DIG 標記探針與DIG標記DNA標準組。將轉潰膜在一或多個時間點暴露於X光膠捲上以偵測雜交的片段並顯現分子量標準組。接著以 Luminescent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm Medical Systems，Stamford，CT)偵測並數位化掏取影像。偵測到之條帶大小為各個剪切過程與各個探針雜合過程的證明。雜合作用與偵測作用後，將膜去除DIG標記探針以準備將轉潰膜用於接下來與額外探針的重新雜合作用。將膜於蒸餾、去離子水中短暫潤濕，接著在切它下〇·2 M 與1.0% SDS的溶液中以持續震動方式去除探針。接著將該膜於2x SSC中潤濕，不是直接用於接下來的雜合作用便疋儲存在4C或下以便之後應用。驗性去除步驟有效地移除以鹼不轉$ & / ,, t.,，.，个攝疋性（alkali-labile)之DIG標記的探針。此初步的南方繁墨點分析顯示3560.4.3.5大豆植株令存在插入片段祐證ιΗ· τ·^·* 丘貫此研究所用之3560.4 ·3·5大豆植株合古相同的插入片段(表4)。休3有 126 200817524 表4· 3560A3.5大豆品系初步南方墨點篩選數據的一覽表植株編號樣品編號 g!yat4601 探錡 2 的南方墨點分;1：斤探針2的南方墨點分析 T-F-05-140S-17 T-17 + + T-F-05-140S-18 T-18 + + T-F-05-140S-19 T-19 + 十 T-F-05-140S-20 T-20 + + T-F-05-140S-21 T-21 + + T-F-05-140S-22 T-22 + + T-F-05-140S-23 T-23 + + T-F-05-140S-24 T-24 + + +表示南方墨點法上的雜交訊號選擇四個植株以便插入與邊緣序列的分析：分別為 3560.4.3.5大豆植株的Τ17與Τ18，以及對照植株的C1 與 C2。由 Sigma-Genosys，lnc· (The Woodlands，TX)與

MWG (Ebersberg，Germany)合成聚合酶鏈反應引子，並以 0·3-0·4ιιΜ濃度使用。為了擴增PHP20163A的插入區域，應用 Advantage-GC-2 PCR 系統（Clontech)與 Expand Long Template PCR System (Roche)兩者以擴增基因體 Dna (100-500ng);而為了端與；T端旁側基因體邊緣的聚合酶鏈反應，應用Advantage-GC-2 PCR系統以擴增來自基因體的DNA (100ng)。經由1%瓊脂凝膠與ΐχ TAE和溴化乙錠（ethidium bromide)的電泳過程後，在紫外光下顯現聚合酶鏈反應的產物；切下凝膠並利用 Qiaquick凝膠純化套組（Qiagen，Valencia，CA)由凝膠中純化DNA。利用 TOPO TA-cloning Kit (pCR2.1-TOPO 載體， Invitrogen，Carlsbad, CA)選殖聚合酶鏈反應的產物。利用 127 200817524 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)離析質體，藉由限制酶剪切篩選質體然後定序之。

為了完整覆蓋代表 3 560.4.3.5大豆插入片段的聚合酶鏈反應產物之序列，藉由轉位子（transposon)式次選殖 (sub-cloning)方法定序選殖株，以加速來自轉位之轉殖品項位置的選殖插入片段之雙向定序（MJ Research TGS系統；Happa 等人（1 999) Nucleic Acid Research 27:2777-2784)。由於產生聚合酶鏈反應產物的過程中會發生非預期性突變（unintended mutation)，發明人選殖並定序兩個分別以 T17與T18 DNA進行聚合酶鏈反應之產物。所有實例中，任何由聚合酶鏈反應引發之序列錯誤在四個選殖株中僅存在於一個内，而這允許對序列之每個鹼基宣稱可靠的一致性。利用 BD Genome Walker Universal Kit (Clontech， Mountain View，CA)實施51旁側邊緣區域的初步序列特徵描述。GenomeWalker的步驟包括以多種限制酶剪切基因體DNA並將這些剪切片段以轉接子（adaptor)連接，因而產生即將作為兩次聚合酶鏈反應模板的「資料庫 (libraries)」。兩次聚合酶鏈反應所用的聚合酶鏈反應引子包括插入片段特定（SCP1啟動子）的引子與轉接子特定的引子。基於Genome Walker試驗所產生的序列資訊，設計引子以在來自3 560.4.3.5與對照大豆植株的基因體DNA 上執行聚合酶鏈反應，利用的引子跨越5'端接合點（第3 圖以及未顯示的數據）。為了進一步延伸 5，端邊緣的序列，發明人應用 DNA Walking SpeedUp Kit (Seegene，Inc. Rockville，MD)’ 該套組係基於 DNA Walking Annealing 128 200817524

Control Primer PCR Technology(Ochman 等人（ 1 988) Genetics 120:621 ; Silver ^ A(1989) Journal of Virology 63:1924 ； Tri glia 等人（1988) 16:8186)的另一種聚合酵鏈反應式基因體DNA步移法（walking approach)。藉由在邊緣區域的 V最遠端之中鍵結並再度利用 Genome Walker套組執行邊緣延伸的最新一次循環。藉由選殖與定序 5'端旁側基因體邊緣區域的聚合酶鏈反應產物以證實最終的V端旁側邊緣序列。為了驗證所識別之尸端旁側基因體邊緣序列係來自大豆，在3 560·4·3.5大豆與對照大豆植株的基因體DNA上之5'端旁側基因體區域實施聚合酶鏈反應（第3圖與未顯示的數據）。應用反向聚合酶鏈反應（inverse PCR)(Silver等人 ( 1 989) Jowr/ia/ 〇/ 63:1 924 ; Ochman 等人（1 988) 120:62 1 ; Triglia 等人（1 988) AUi? 16:8186)與插入片段特定的引子（坐落於g/：^M60 1與基因中）實施V端旁侧邊緣區域的初步序列特徵描述。接著將利用反向聚合酶鏈反應所產生之產物的序列用來設計引子，以便在3560.4.3.5與對照大豆植株的基因體DNA上利用跨越 3'端接合點的引子進行聚合酶鏈反應（第3圖與未顯示的數據）。藉由選殖與定序3'端旁側基因體邊緣區域的聚合酶鏈反應產物以證實P端旁側邊緣序列❶利用來自專屬大豆序列的序列資訊（相對此旁側邊緣區域）設計聚合酶鏈反應引子以進一步延伸基因體旁側邊緣區域。選殖與定序得到的聚合酶鏈反應產物確定此額外的旁側邊緣序列。為了驗證所識別之3 '端旁側基因體邊緣序列係來自大豆，在 3560.4.3.5大豆與對照大豆植株的基因體DNA上之3,端 129 200817524 基因體區域内實施聚合酶鏈反應（第3圖與未顯示的數據）。為了確認插入大豆基因體内的DNA序列，執行聚合酶鏈反應以擴增、選殖並定序3560.4.3.5大豆的DNΑ插入片段。應用正好位在插入片段外側的聚合酶鏈反應引子 (引子對1297/1298)以擴增3560.4.3.5大豆植株DNA的整

u 個插入片段。此擴增的兩個獨立反應（各自來自兩個試驗樣本）均產生預期大小（5.4 kb)之產物；選殖並定序這些產物。此外，將用於產生3 560.4.3.5大豆品系的DNA片段 PHP201 63A定序，並與3560·4·3·5大豆基因體DNA產生的插入序列相比。為了在大豆基因體中辨別旁側序列的性質與潛在功能，以BLASTn分析3 560.4.3.5大豆的5'端與3,端旁側邊緣序列兩者。針對NCBI Genbank Nucleotide (“nt”）資料組 (www.ncbi.nlm.nih.goW，Release 154，最近更新 7/31/06，總序列數 4,3 02，011)以及 Genome Survey Sequence 資料組 (GSS ’ 07/28/06釋出）執行搜尋。最後，將序列與含有所有專屬大豆基因體與Pioneer所產生的表現序列標幟（EST)序列之資料組比較。在所有實例中應用默認參數。亦利用

Vector NTI 9.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)在端與 3'端兩者的邊緣/插入片段接合部位篩選長度大於100胺基酸（3〇〇 bp)的新穎開放讀碼（0peil reading frames，ORFs) 〇將由八個3560.4.3.5大豆植株離析的DNA以Χόα I 與III剪切’並以與g/>；aM6〇1基因探針雜合分析以證實插入片段的存在，並證實分析的八個植株之間插入片段的組成分子為相同的。初步的南方墨點法篩選指 130 200817524

C 出560.4.3.5大豆植株顯現相同的雜合態樣(表4與未顯不的數據)。在—1的剪切中，如同預期般价W探 =合於-長度14 kb的條帶而⑽如探針雜合於3鳥的條帶（第2圖），顯* PHP20163A的完整插入。在編⑴ 的剪切中咖侧探針雜合於5，端旁側的61以條帶，而⑽-Am探針雜合於3'端旁側的74kb條帶以及一 2 * kb的内部條帶(internal band)’顯示僅存在一套插入片段於基因體中（第2圖）。㈣如探針亦雜合於對應内生性序列的其他條帶。挑選四個植株以便插入片段與邊緣序列的分析：3560.4.3.5大豆植株的m與丁18，以及對照植株

Jack 的 C1 與 C2。 3 5 60.4.3.5大豆品系的初步特徵描述中，利用 Gen〇meWalker與反向聚合酶鏈反應方法選殖並定序旁側基因體邊緣區域。應、用這初步的序列資訊設計引子，以便聚合酶鏈反應在3 560·4·3·5大豆基因體dna的三個關注之區域產生產物：5,端旁側邊緣區域、整個插入片段與3, 端旁側邊緣區域（表Η、表4;表1〇;以及第3圖）。利用來自旁側邊緣序列的資訊，在3 560·4·3·5大豆基因體dna 與未改良的對照基因體DNA上執行聚合酶鏈反應。為了 5,端旁側序列，以5,端邊緣區域中的正向引子 (引子1679)與SCP1啟動子中的逆向弓|子（引子1 658)執行聚合酶鏈反應，在3560·4·3·5大豆植株DNA中產生預期的產物（396 bp)，但在對照的DNA中則無（第3圖與未顯不的數據）。兩次或更多次循環的步移法（以DNA Walking SpeedUp與GenomeWalker Kits執行）之後，接著得到額外的5'端旁侧邊緣序列。為了證實5,端旁側邊緣序列，將由 131 200817524 3 5 60·4·3·5 DNA產生的聚合酶鏈反應產物選殖並定序。第 4A-E圖顯現完整的序列資訊。為了 3 '端旁侧序列，以中的正向引子（引子 1439)與3'端邊緣區域中的逆向引子（引子ι666)執行聚合酶鏈反應，在3560·4·3·5大豆植株DNA中產生預期的產物（1029 bp)，但在對照的DNA中則無（第3圖與未顯示的數據）。將由3560.4.3.5 DNA產生的3，端旁侧邊緣聚合酶鏈反應產物選殖並定序。此序列顯示與專屬性大豆dna 序列的相同特性，而該專屬性大豆DNA序列用來設計引子以進一步延伸旁側邊緣區域。再者，將由356〇.4,3 5 DNA所產生的3'端旁側邊緣聚合酶鏈反應產物選殖並定序。第4Α·Ε圖顯現完整的序列資訊。為了擴增插入片段，應用位於各個旁側區域的聚合酶鏈反應引子以擴增轉殖品項3560·4·3.5植株DNA的整個插入片段（引子對·· 1 2 9 7 /1 2 9 8)。如預期般，僅從3 5 6 0,4 · 3 5 大豆DNA產生預期的5.5 kb聚合酶鏈反應產物，而對照的DN A則無。將插入的聚合酶鏈反應產物選殖並定序。第4A-E圖顯現完整的序列資訊。此外’將用於產生3 5 6 0 · 4 · 3 · 5大豆品系的DNA片段 PHP20163A定序，並與3560.4.3.5大豆基因體DNA所產生的插入序列比較。3560·4·3.5大豆中的插入片段序列相同於PHP20163A DNA片段的序列。總計，證實10849 bp來自3560·4·3·5大豆基因體的 DNA序列：33 17 bp的V端旁側基因體邊緣區域、2170 bp 的Y端旁側基因體邊緣區域與5362 bp含有DNA插入片段的區域（第3圖與第4A-E圖）。 132 200817524 為了證實所識別之5,端與3,端旁側邊緣序列來自大丑，在3560·4·3·5大丑DNA樣本與未改良對照樣本的端與3'端旁側基因體區域（各自的引子對為ι 679/ΐ5ΐ4與 1660/1666)中執行聚合酶鏈反應。利用35604·3·5大豆與對照大豆植株兩者的基因體DNA產生預期大小的聚合酶鏈反應產物（5'端基因體區域為246 bp而3,端基因體巴域為2 9 7 b p)’而這結果指出該些序列係來自大豆基因體且並不特疋於3560.4.3.5大豆（第3圖與未顯示的數據）。將這些3560.4.3.5與對照大豆DNA兩者的聚合酶鏈反應產物選殖與定序並顯不具有相同的序列。當將來自3560.4·3·5大豆的5'端旁側區域之33 17 b 序列與 Genbank Nucleotide (“nt”）資料組 (www.ncbi.nlm.nih.gov/)比較時，並沒有得到任何明顯的並列（alignment)。而利用GSS資料組的分析得到旁側區域的兩個區域（核苷酸2723-2863; 2881-3203)具有與豆類藥藜苜蓿(筒狀苜蓿「barrel medic」）基因體序列的明顯相似度（分別為 98%與92%)。針對 Pioneer專屬性大豆基因體與表現序列標幟的BLASTn搜尋得到98%相同性並列，該並列包括核苷酸2860-33 1 7的單一大豆基因體序列。一額外區域（核苷酸53 1 -2 144)得到較低但仍具明顯相同性（84%-92%)於許多不同的大豆基因體選殖株。3"端旁側序列於核苷酸9772-10849的區域產生兩個高度明顯的並列（97-99%相同性）於兩個不同的公開性大豆基因體序列（可由CL86833 8.1輿CL867466.1耩得）與一個專屬性基因體序列。一額外區域（核苷酸9250-9554) 顯示明顯的相同性（92-94%)於小麥的基因體與粒線體序 133 200817524 列。分析大豆基因體邊緣序列與3560.4.3 ·5大豆插入片段之間的5’端與3端接合區域是否存在新穎的開放讀碼❹在 5,端或3,端邊緣接合區域中並無識別出大於或等於1〇〇胺基酸的開放讀碼，這結果暗示插入並沒有產生新穎的開放讀碼。南方墨點分析亦證實DNA插入片段在傳統的大豆培育步驟過輕中保持穩定。在兩個自交世代（Τ4與Τ5)執行該分析，姐如同兩世代中相同的雜合態樣所證實般插入片段保持完整與穩定地併入基因體中。亦藉由南方墨點分析 F3代並證實如同Τ4與Τ5代所顯示之相同穩定性、轉殖品項-特定的雜合態樣。這些結果證實3 5 6 0 · 4 · 3.5大豆中的插入片段之穩定性可橫跨數個培育世代。如下所述’ 5尽/ II限制酶在Ρηρ2〇163Α片段中僅有單一位置（bp位置，2254)(第6圖），且當與和㈣-Am探針雜合時將產生356〇 4 3·5大豆唯一、轉殖品項特疋的雜合態樣。此分析證實轉殖品項穩定於各個世代門而將可偵測3 5 6 0 ·4 · 3 · 5大豆中插入片段結構的變化。如下所述，以探針雜合時預期有一約帶好證實世代間的穩定性（表5)。同樣地，針對《.ha 〜十預期有一約3500 bp的條帶好證實世代間的穩定性 134 200817524 表5·以組合體探針於南方墨點法上預期與發現的雜合條帶 ----- 探針 ----- 限制酶由 PHP20163A1 預測的片段大小 (bp) 由 PHP201632 預測的片段大小(bp) GLYAT 3560.4.3.5 大豆3中發現的片段大小（bp) SCP1啟動子 -— Bglll >23004 3485 〜2500 glyat4601 Bgin >23004 3485 〜2500 終止子 ----^ — >23004 3485 〜2500 SOP1啟動子> Xbal 1379 13795 13796 glyat4601 Xbal 1379 13795 13796 終止子 Xba I 1379 13795 13796 ^3560·4·3·5大豆預測的片段大小係基於第6圖所示的PHP20163A圖譜。有陽性對照的質體樣本之預測片段大小係基於第7圖所示的 PHP20163質體圖譜。由這些分析與基於南方墨點法上DIG標示的DNA Molecular Weight Marker VII所預測之大小約略得到發現的片段大小。由於併入mG分子以便觀察，標記片段4一般以約大於它們實際表示的分子量5-10%移動。 j基於完整插入的PHP20163A所預測的最小片段大小(數據未顯示）。 5雜合於I片段之預測大小係來自Dam-品系中生長的質體PHP20163。而生長於Dam+品系中的質體，雜合於恐αΐ片段之大小預期為5307bp。 6基於墨點法(數據未顯示)發現的片段相同於預測大鱼 D咖·品系中質體PHP20163的比較。 ·，、 135 200817524 表6 以在砂雜紅職與發韻雜交片段探針 ------— 限制轉由PHP20163A所預測的片段大小1 (bp) 由 PHP20163所預測的片段大小2 (bp) GLYAT 3560.4,3.5大豆發現的片段大小1 (bp) SAMS Bgill >31002 4468 〜3500 〜2500 >23002 3485 〜6900* -— -4700^ m-hra %/II >31002 〜3500 4468 着 >8600* gm_a/s終止子 Bgill -------- >31002 4468 〜3500 >8600* SAMS Xbal 3928 39285 39286 -^OUW ^ 39286 gm-hra Xba\ 3928 39285 〜議* -7400^* ； ^/：OAAi|e -5S00* g/w-a/s終止子 Xbal 3928 39285 39286 〜5800* ㈣星暗示所指的條帶係目為探針雜合於内生性大豆基因體序列而由3560Α3.5大豆與對照組兩者中所有泳道(lane)中均存在相同的條帶所

L :3560·2·1·5大豆的預測片段大小係基於第6圖所示的PHP20163A圖譜。陽性對照質體樣本的預測片段大小係基於第7圖所示的 3 t 一些t析與基於南方墨點法上DIG標示的DNA M〇l沈ular Weight Marker U斤到發現的片段大小。由於併入DIG分子以便觀察，標記片I又&一般以約大於匕們實際表示的分子量5_1〇%移動。 3基於完整插入的PHP20163A所預測的最小片段大小(數據未顯示）。 e 气於片段之預測大小係來自Danf品系中生長的質體PHP20163。而生長於fam品系中的質體，雜合於瓜αΙ片段之大小預期為53〇7bp。 136 1 墨點法(數據未顯示)發現的片段相同於預測大小顯示與生長於Dam-品 2 系中質體ΙΉΡ20163的比較。 200817524 將3560·4·3·5大豆T4與T5世代的基因體dna以 &ΠΙ剪切並以與探針雜合分析以證實世代間的穩定性（數據未顯示特定於356〇·4·3·5大豆的一約2500 bp條帶在Τ4與Τ5代兩者中均雜合於探針（表5與未顯示的數據）。而探針，特定於 3560.4.3.5大豆的一約35〇〇 bp條帶存在於兩世代中（表6 與未顯示的數據）。除了 3500 ^的條帶外，㈣探針亦雜合於額外的條帶，因為這些條帶存在於356〇·4·3·5大丑與對照大豆植株兩者中因此確定這些額俜生於大豆基因體(數據未顯示〜兩者的雜合結果證實3560.4.3.5大豆中PHP2〇i63adna 片段的插入仍於自交式T4與T5世代中保持穩定性。

U 亦執行3560.4.3.5大豆F3世代的南方墨點分析。分析總共77個的單獨植株（數據未顯示卜將打世代的基因體腿以邮Π剪切並以咖，柳；和㈣如探針雜合。以容屻/探針發現約2500 bp的條帶（數據未顯示）而以㈣-/-探針發現特定於3560.4·3·5大豆—約35〇〇bp的條帶(數據未顯示）。如同先前執行的分析，⑽如探針在 3560.4.3.5大豆與對照樣本中雜合於額外的條帶，而這係因為大豆基因體的内生性序列（數據未顯示）。容纱“MW 與gm-ha探針兩者的雜合結果與上述之丁斗與丁5世代所得之結果一致，且證實傳統大豆培育過程中插入片段的遺傳穩定性。分析Τ4與Τ5世代兩者以證實其並不存在質體 ΡΗΡ20163除了轉形片段ΡΗΡ2〇163Α以外的質體序列即已經在轉形之前移除質體骨幹序列。該結果證實 137 200817524 3 560.4.3.5大豆中不存在骨幹序列。設計與20j? w探針（表3與第7 圖）以雜合於質體P HP 20163轉形片段以外的區域（數據未顯示），且雜合於I剪切的基因體DNA以證實 3560.4.3.5大豆中不存在質體的這些部分。兩個骨幹探針均無雜合於3560·4·3·5大豆樣本（數據未顯示），證實這些序列的不存在。將Jack大豆變種之葉片材料的基因體DNA作為所有 () 南方墨點分析的陰性對照組。將優良大豆變種（Elite 1)的基因體DN A包括在内作為F3世代分析的一額外陰性對照組。應用質體PHP20163作為探針雜合作用的陽性對照^ 且用以證實轉形片段PHP201 63A内含片段的大小。將所有用於該分析的探針於PHP20163A與PHP2〇163的概略圖示上（分別為第6與7圖）指出並概述於表3中。以以/ π的剪切確定複製數目（copy numbe〇而以义心 I的剪切確定插入片段的完整性好調查3560·4·3·5大豆内插入片段的併入形悲。將南方墨點轉潰膜以數個探針雜合〇分析好證實各個基因片段的複製數目與完整性。應用 SCPr啟動子、與終止子探針以描述組合體的特徵（表3與未顯示的數據）。應用 SAMS、與終止子探針以描述組合體的特徵（表3與未顯示的數據）。 5g/ II的剪切提供有關併入3 56〇·4·3·5大豆基因體内之複製數目的資訊，因為&/ Π在ΡΗΡ20163Α片段中僅有位在鹼基對位置2254上的單一限制酶切點（數據未顯示）與位在大豆基因體中該片段外侧的額外切點。與各個組合 138 200817524 體的探針雜合(除了 SAMS探針之外)，將基於雜合條帶的數目⑼如’―個雜合條帶暗示該片段複製數目為-）而暗示3560.4.3.5大豆中發現之各個片段的複製數目。至於 SAMS探針，由於_位點位在探針區域内，預期該片段每-個複製片段將有兩個雜合條帶。表5針對咖蘭組合體而表6針對㈣如組合體賦予356().4 3 $大豆以 II預測與發現的片段大小。

基於下述的南方墨點分析，確定單一、完整性的 PHP20163A片段已經插人356() 4 3 5大豆基因體中（如同第8圖插入圖譜所示）。 356〇·4·3·5大豆中插入一個組合體所有片段的複製品。將SCP1啟動子、/與終止子探針雜合於T4世代各個3560.4.3.5大豆植株經由&/ π 剪切的基因體DNA (表5與未顯示的數據）。各個探針雜合於約2500鹼基對（bp)的相同單一片段（表5與未顯示的數據），暗示3560.4.3 ·5大豆中插入片段上基因片段的預期排列。同樣地，3560·4·3·5大豆中插入一個gw-/2ra組合體所有片段的複製品。包含這種組合體（SAMS啟動子區域、基因與ah終止子）的片段被用來作為探針以測定插入片段的複製數目。這種組合體的探針與大豆基因體的内生片段同源，因此各個探針在對照大豆樣本中雜合於^条帶。將3560 ·4 ·3·5大豆中來自内生性大豆基因體的雜合條帶於表6的灰色區塊内以星號指出，且因為這些條帶存在於對照大豆樣本中而因此確定與插入片段無關。 SAMS探針在3560.4.3 ·5大豆中雜合於一約25〇〇 bp 139 200817524 的條帶與約3500 bp的第二條帶(表6與未顯示的數據，、Ms探針）。因為々/ π切點位在pHp2〇163A sams區、中（第ό圖），因此利用此探針預期將以兩個條帶暗示插 1個此片段，而結果暗示該片段的複製數目為一。且讀疋〇 25 00 bp片段相同於上述含有組合體的片段0 和終止子探針如同SAMS探針一樣雜合於相同的3500 bp片段（表6與未顯示的數據，與

U 終止子探針）。三個探針均雜合於相同的3500 bp 片段而其中SAMS探針雜合於25〇〇 bp片段證實 3560.4.3.5大豆中DNA插入片段内基因片段的預期排列。應用尤δα I剪切以證實與㈣-組合體在 3560.4.3.5大豆中為完全且完整，因為太心1在pHp2〇i63 a 片段中具有三個切點（鹼基對位置8、1 387與53丨5)，且這三個切點準確地位於各個基因表現組合體側邊（第6圖）以客/ΜίΜΜ與giAn组合體的探針雜合分析證實所有發現的片段位於含有組合體的適當内含片段。表6針對厂組合體與㈣組合體賦予利用Σ的預測與發現片段大小。 SCP1啟動子、與終止子探針各自雜合於預期的1378 bp内含條帶（表5與數據未顯示），且藉由下段所述的額外雜合分析與未顯示數據證實該大小。由於這些探針雜合於預定大小的相同内含片段，因此確定 3 560.4.3.5大豆中07組合體係完整的且在此片段上確認組合體所有片段。 SAMS、-.Am與終止子探針各自雜合於預期 140 200817524 3 92 7 bp的内含條帶（表6與未顯示的數據），且藉由下段所述的額外雜合分析證實該大小。由於這些探針雜合於相同片段，因此確定3560.4.3 ·5大豆中gw-Zzra組合體係完整的以及組合體所有片段的存在。

由表現DNA甲基酶（DNA methylase)的大勝桿菌（五. ⑼"）品系（Dam+品系）製備質體PHP201 63。當以I剪切並以與組合體探針探測時此質體旅無產生預期的條帶。在含有質體PHP20 1 63的泳道中以所有探針處理發現一約5300 bp的條帶（數據未顯示）而不是預期為1379 bp與3928 bp大小的條帶（Tables 5與6)。基於質體序列，可以確定PHP201 63上位於1387鹼基對的 I切點部份重疊於Dam甲基化識別序列（methylati〇n recognition sequence)。此切點最末端的腺嘌呤被甲基化因而阻礙I的剪切。 I酵素無法剪切此位點影響3 56〇·4 3·5大豆中 ΡΗΡ2 0163Α片段的預測大小（表5與6、第6圖）。為了確認3 560.4.3.5大豆中與質體結果的大小，由缺少甲基酶的大腸桿菌品系（Dam品系）製備質體pHp2〇163 (數據未顯示）。南方墨點雜合結果（數據未顯示）顯示該質體與 3 5 60.4.3.5大豆T4與T5世代樣本以][剪切的相似結果。以與探針偵測轉潰膜顯示Dam·品系製備的質體Ρ Η P 2 0 1 6 3如同預期的以办β j剪切，並產生預期大小1 379 bp與3927 bp的條帶（數據未顯示），然而原本來自Dam+品系的質體在兩個探針處理下再度產生約5 3 0 0 bp的條帶（數據未顯示）。這些結果證實位在1 3 8 7 的中間I切點由於Dam甲基化而阻礙其剪切。再者， 141 200817524 3560·4·3·5大豆中的雜合條帶與來自Dam-品系未曱基化的質體PHP201 63中的條帶具有相同大小，證實356〇·4·3·5 大豆包含完全且完整的插入片段（數據未顯示）。執行五個不同世代（T1、F2、F3、BC1F2、C2F2)遺傳特徵資料的卡方分析（Chi-SqUared analysis)以測定 3560.4.3.5大豆後代中與㈣—基因的孟德爾遺傳率（Mendelian heritability)與穩定度。評估孟德爾遺傳的五個世代之培育沿革描述於第5圖中。針對各個試驗的世代，預期植株將分離（segregate)成U:1(陽性同型合子植株：半合子植株··陰性同型合子[無效]植株）。下列的不同方法，將用來證實3560.4.3.5大豆後代中的這種分離率。某些研究中，陽性同型合子植株與半合子植株並無區別，造成3 :1陽性：陰性的分離態樣（表7)。針對表7所列的三個世代，分別應用三種不同方法以標記植株為陽性或陰性： •定性聚合酶鏈反應（qualitative PCR)分析以識別該植株是否包含基因（T1世代）；或 •以西方墨點分析標記植株是否表現GLYAT4601蛋白質後以與探針兩者進行南方墨點分析證實這些同一的植株（F3世代），或 • A L S種子浸泡試驗（b C 1 F 2世代）。此試驗中，將種子浸泡於含有活性成分氯續隆的乙醯乳酸合成酶抑制型除草劑中。僅有表現基因的種子在種植後會發芽。某些研究中，在執行分離分析前會將不含有或Wia任一基因的植株移除。接著將殘留的 142 200817524 植株標記為陽性同型合子或半合子，造成I]陽性同型合子：半合子的分離態樣（表8)。針對表8所列的F2世代，應用兩種方法移除陰性植株並將殘留植株標記為陽性同型合子或半合子： •在植株發芽後施加嘉磷塞喷霧，移除所有陰性同型合子[無效]植株。接著針對基因施加乙醯乳酸合成酶抑制型除草劑的「ragd〇u」試驗，其中篩選 F2植株的後代種子以測定F2親系植株的基因型。在 ragdoll試驗中，將紙巾以含有活性成份氯磺隆的乙酿礼酸合成酶抑制型除草劑潤濕。將單一 F2親系植株的十個後代種子捲進濕紙巾中並讓其萌芽。假若所有十個後代種子均萌芽且正常成長，將F2親系植株標記為基因陽性同型合子。假若所有十個後代種子均無法萌芽與正常成長，將F2親系植株標記為基因陰性同型合子。而半合子F2親系的基因型之特徵為十個種子樣本中混有抗性（resistant)與感性（susceptible)植株。 •在種植刖種子的ALS種子浸泡試驗移除所有陰性同型合子（無效）植株，接著以定量即時聚合酶鏈反應 (qPCR)試驗去將植株區別為基因陽性同型合子或基因半合子。

某些研究中’將所有植株辨別為陽性同型合子、半合子或陰性同型合子好確認1:2:1的預期分離率（表9)。利S 針對與基因兩者的定量即時聚合酶鏈反應（qPCR)試驗執行對C2F2世代的分離分析。由於與gm-Ar«基因在用於轉形的DNA片段中為物 143 200817524 理連接且預期在 3560.4.3.5大豆後代中具有相同的分率，g/少的結果適用於的遺傳特性且反之然。世代中於相同植株内（F3與C2F2)分析兩者特徵，同的分離資料將實驗性證實與基因的同分離（co-segregation)。孟德爾定律分析的結果總結於表7、8與9。所有値均大於 0.05，暗示著 3560.4.3,5 大豆五個世代 glyat4 601與/或gm-Λγα基因的發現與預期頻率之間在計學上並無明顯差異。此分析的結果與單一插入位置與基因在3560.4.3.5大豆中分離的發 (根據孟德爾遺傳定律）相同。在自體授粉與異體授粉的個世代中已經驗證插入片段的穩定性。離亦相共 P 中統的現五 144 200817524 表7. 3560.4.3.5大豆發現與預期之3d分離率的比較世代方法發現預期卡方檢定陽性 +/+或+/- 陰性陽性 +/+或+/- 陰性 P値 T1 Glyat4601 聚合酶鏈反應 59 23 61.5 20.5 0.610 F3優良品系1 背景西方墨點分析 GLYAT4601 後接著以 glyat4601與 gm-Zzra探針進行南方墨點分析 75 15 67.5 22.5 0.088 BC1F2 ALS種子浸泡優良品系7 背景 700 222 691.5 230.5 0.543 優良品系8 背景 761 273 775.5 258.5 0.315 優良品系9 背景 160 54 160.5 53.5 1.000 優良品系10 背景 205 79 213 71 0.304 145 200817524 表8· 3560.4.3.5大豆發現與預期之1:2分離率的比較世代方法發現預期卡方檢定同型合二半合子 +/- 同型合二半合子 +/- P値 F2 優良品系1 背景嘉磷塞喷霧移除無效株並接著乙醯乳酸合成酶抑制劑的ragdoll 試驗 16 24 13.3 26.7 0.467 優良品系2 背景 32 53 28.3 56.7 0.466 F2 優良品系3 背景 ALS種子浸泡移除無效株接著針對gfyat4601的定量聚合酶鏈反應 110 182 97.3 194.7 0.131 優良品系4 背景 124 284 136 272 0.227 優良品系5 背景 27 61 29.3 58.7 0.678 優良品系6 背景 22 29 17 34 0.181 表9. 3560.4.3.5大豆發現與預期之1 : 2 : 1分離率的比較世代方法發現預期卡方檢定 +/+ +/- +/+ +/- P値 C2F2 優良品系44 背景 Glyat4601 與 gm-hra 的定量聚合酶鏈反應 41 76 43 40 80 40 0.799 優良品糸45 背景 160 294 142 149 298 149 0.550 146 200817524 表ι〇·聚合酶鏈反應產物的描述與大小正向引子逆向引子擴增區域的描述 I·1 1 - 聚合酶鏈反應產物的大小(bp) 1297 1298 DNA插入區域 5457 1679 1658 5^端旁側基因體邊緣至SCP1啟動子 396 1679 1514 5^端旁側基因體邊緣區域 246 1439 1666 gw-Am至Υ端旁側基因體邊緣區域 1029 1660 1666 旁側基因體邊緣區域 297 表11·聚合酶鏈反應所用之引子序列表引子名稱引子名稱縮寫序列(5’端-3’端）目標序列位置 ΦΡ 至 bp)1 座 Ά 編魏 05-0-1227 1227 TGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTC 3402-3373 24 05-0-1297 1297 TGCCCGAGGTCGTTAGGTCGAATAGGCTAG 3268-3297 25 05-0-1298 1298 TCCTATTCAAGATGGGCAGTGTCTTCCTAATGATG 8724-8690 17 06-0-1439 1439 GATAACTGAGGGTGATGGTAGAACGAGGTACTGATTG 7951-7987 18 06-0-1440 1440 TGTGATAACTGAGGGTGATGGTAGAACGAGGTACTG 7948-7983 26 06-0-1473 1473 TTATTTCCGATCGGATCCTGCCAGTGGAG 10849-1082 1 50 06-0-1504 1504 CCACCATGTTGACGGATCTCTAG 3347-3325 51 06-0-1505 1505 GCAATGGAATCCGAGGAGGTTTC 3463-3441 52 06-0-1506 1506 GCAATGATGGCATTTGTAGGTG 3532-3511 53 06-0-1514 1514 TCGATCGGTCAAGAATCCGGTTCTC 3263-3239 19 06-0-1549 1549 AAACTG AAGCGATGGCAGAACCGC ACAG 1962-1935 54 06-0-1550 1550 TCGAAGTGGCAATAGAGCCACACAATATCGATAAG 2012-1978 55 06-0-1610 1610 AGCAATTGTTTTGTGCATTTCCAAATTTCAATCTG 1-35 40 06-0-1658 1658 CAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTG 3413-3379 20 06-0-1660 1660 GTAATATCATCATTAGGAAGACACTGCCCATCTTG 8683-8717 21 06-0-1666 1666 CCATATTTGAAAGCCTAAGCAGATGGCATAATTC 8979-8946 22 06-0-1679 1679 TTCAGCAACAAACTCTCATCGTGAGCAG 3018-3045 23 3560«大豆序列中的位置(參閱第4圖）鹼基1 - 3317 = 5·端基因體邊緣區域、鹼基3318 - 8679 =插入區域、鹼基8680 - 10849 = 3’端基因體邊緣區域 147 200817524 表12.偵測3560.4.3.5大豆所用的額外引子引子特性序列編號 GGTCGAATAGGCTAGGTTTACGAA (開始於鹼基751 ;長度24核苷酸；變性溫度(Tm)為59t： ; GC 百分比為59) 7 AAGAGACTAAGGCCGCTC (Taqman MGB探針；開始於鹼基776 ;長度18核苷酸；變性溫度為68°C ; GC百分比為56) 9 CCACCATGTTGACGGATCTCT (開始於鹼基815、長度21核苷酸；變性溫度為58。〇 8 GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA 引子 DP-356-fl 37 TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT 引子 Dp-356-rl 38 6FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTG GAGCAC-TAMRA Dp356-p (Taqman 探針） 39 實施例2. 識別3560.4.3.5韓殖品項的額外方法寡核苷酸聚合酶鏈反應試劑：正向引子：5, GGTCGAATAGGCTAGGTTTACGAA (序列編號7) 逆向弓I 子：5，CCACCATGTTGACGGATCTCT (序列編號8)

Taqman MGB 探針： 5’

Fam-AAGAGACTAAGGCCGCTC-MGB 3,（序列編號 9) 聚合酶鏈反應中各個引子的應用濃度為900 nM。而聚合酶鏈反應中MGB探針的應用濃度為80 nM。應用的聚合酶鏈反應混合劑為Sigma-Aldrich的「Extract-N-Amp PCR Ready Mix」（目錄編號E3 004)。亦藉由添加0.01體積之 Sigma-Aldrich 的「Reference Dye for Quantitative PCR」（目錄編號R4526)將Rox(6-羧基-鹵素-若丹明）對照染劑包含於聚合酶鏈反應中。聚合酶鏈反應將包含下列兩步驟的循環執行40次；步驟1 : 95° C下15秒以及步驟2 : 60° 148 200817524 C下60秒。擴增子產物大小為85 bp。表13列舉可用來識別3560·4·3·5大豆轉殖品項的額外引子。表13 引子序列產物大小（bp) 序列編號 104312 AGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC 44 104314 TGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCC 150 45 探針125323 6FAM-TATCGGGAAACCTC-MGB 46 109893(内生性對照） CTTTGCTGTTTGATTGCTGGGTTGTC 47 109894(内生性對照） TGTGTGGACCCATTGGCCTTTAGATTAT 144 48 探針125322 (内生性對照） VIC-ACTCTGCAGTTGCCTT-MGB 49 這些引子用於偵測3560.4.3.5大豆轉殖品項存在/不存在的試驗。引子1043 12配上1043 14/SCP1TP10可偵測基因轉殖的插入片段；對照性引子，例如 109893配上 109894/探針 Ρ94032Α2 可用來偵測持家基因 (house-keeping gene)(例如，天門冬胺酸轉胺酶基因）且可作為内源性對照組（internal control)。3 560·4·3.5大豆轉殖

品項將顯示雜合訊號（6-羧基·螢光素「FAM」與VIC)而非基因轉殖基因型將顯示陽性同型合子P94032A2 (VIC)。偵測 3560.4.3.5大豆此方法所用的聚合酶鏈反應條件顯示如下。表14 聚合酶鏈反應狀態變性開始 120秒 95〇C 鍵結(Anneal) 卯秒 66〇C 延伸 90秒 72〇C 變性 30秒 95〇C 14循環 149 200817524

最後延伸 120秒 72〇C 變性開始 12秒 95〇C 鍵結 60秒 60°C 延伸 10秒 82〇C 變性 30秒 95〇C 最後延伸 0 82〇C 32循環熟悉技術人士在試驗中亦會包括聚合酶鏈反應對照组，該對照組利用一内生性基因以確認離析的基因體DNA 適用於聚合酶鏈反應的擴增。已經成功與大豆樣本一同應用的大豆内生性基因如下：外源凝集素基因（Schmidt，Μ 與 Parrott，W，2001)與 conglycinin α’次單元基因（Shirai (1998) 5z.oc/zem 62:1461-1464)。另一個發現聚合酶鏈反應内生性基因目標的地點為網址 WWW· //biotech.ire.it ，其為歐盟執委會（European Commission)的聯合研究中心（Joint Research Centre，JRC) 所贊助。亦可參閱Schmidt等人（2001) 尸/aw 〇// 20:422-428 c Ο 實施例3 選擇大豆轉殖品項3560·4·3·5作為起始轉殖品項，而藉由將3560·4·3·5大豆回交成四種不同常見的品系而產生 BC1F3品系。橫跨這四種回交族群，在產量方面，具有 3560·4·3·5轉殖品項的品系（噴灑嘉磷塞）與陰性無效分離

品系（噴灑傳統除草劑）相比並無明顯差里。士 - # I ，、大旦轉殖品項 35 60·4·3.5賦予對嘉磷塞與乙醯乳酸合成臨如庄丨w上取姆抑制劑類除草劑的高度耐藥性並不影響產量。 150 200817524 本研究的第一目標為評估3560·4·3·5大豆以測定其對不同應用比例的嘉磷塞與乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑之耐藥性程度。第二目標為形成3560.4.3.5大豆轉殖品項陽性同型合子與陰性同型合子近似同源品系（NILs) 以測定產量是否因為3560.4.3.5轉殖品項的存在而受到影響。第三目標為將轉殖品項3560·4·3·5併入不同基因背景中以測定是否對除草劑耐藥性或產量效能有任何影響。

材料與方I 〇針對基因轉殖轉殖品項初期代數的試驗，在V2至V6 生長時期（Fehr 等人（1977) Coop. Ext. Ser. Special Report 80· I〇wa State Univ·，Ames IA)以每公頃 1.68公斤或每公頃3 · 3 6公斤活性成分的希鱗塞外加辅助劑（〇 · 2 5 %體積百分比的非離子性界面活性劑（noni〇nic surfactant，NIS) 加上每公頃2.24公斤活性成分的硫酸銨（aininoniurn sulfate，AMS))在Newark，DE溫室中喷灑T0植株。處理後十天利用1至9的規模評估植株，其中丨=枯死的植株而9 = Q 未發現喷灑的反應。挑選的轉殖品項在τ 1世代成長以便於溫室中確認除草劑耐藥性。在V3生長階段時以每公頃丨·68公斤活性成为的嘉碟塞或以每公頃60克活性成分的噻吩磺隆 (3-[[[[(4-甲氧基-6·曱基·1，3,5-三嗪-2-基）胺基]羰基]胺基] 磺醯基]-2-噻吩羧酸甲酯）兩者任一噴灑植株，或在時期以每公頃70克活性成分的噻吩磺隆接著在V6時期以每么頃2·24公斤活性成分的嘉磷塞之連續應用。所有噴灑處理均包括0 · 2 5 %體積百分比的非離子性界面活性劑加上 151 200817524 每公頃2.24公斤活性成分的硫酸銨。噴灑應用十天後，利用1至9的規模評估植株。由於T1轉殖品項隔離生長，僅標記非感性植株’且計算各個轉殖品項内耐藥性植株的平均比例。將各個T!轉殖品項的植株分別種植於2·4米的植行中（行間距76.2公分）。藉由利用聚合酶鏈反應擴增插入片段以測定各個T1植株中^少…與心“基因是否存在。利用卡方檢定分析各個轉殖品項的聚合酶鏈反應結果以識別符合孟德爾分離律的轉殖品項。針對評估的各個轉殖品項，個別收成g/少…與办〜陽性的T1植株並發展成行式種植（Piant-to-row：^ T2短植行（sh〇rt r〇w)(植行長2.4米而行間距76·2公分）。種植來自各個τ2登錄田地12個殘餘種子，且以每公頃3·36公斤活性成份的嘉磷塞加上〇·25%體積百分比的非離子性界面活性劑加上每公頃2·24公斤活性成份的硫酸錄喷麗Μ時期的植株，以収相應之短植行的接合性（zygQsity)。假若所有個植株具有耐藥性則將該品系視為陽性同型合

子作右所有12個植株為感性則該品系視為陰性同型合子假右1 2個植株為耐藥性與感性表現型之混合則該品系為雜合子。 μ用卡方檢疋分析T2結果以識別橫跨世代仍依照德爾分離律的韓插Ο tg p- 扪轉殖口口項。選出24個T3世代具有g/yai 土因的不同σ口系以便除草劑耐藥性試驗的進展。將自十轉殖UU項的陽性同型合子與陰性同型合子近似源。口系發展成等値線產量試驗（is〇iine 3 5 6 0 · 4 · 3 · 5大豆鐘緒n ^ W ® 項為挑選用來發展之轉殖品項的 152 200817524 中之一。評估3560.4.3.5大豆轉殖品項對嘉磷塞的耐藥性。將 3560.4.3.5大豆種植於隨機完全區集（rand〇mized complete block，RCB)設計中，其位於以成對之3 7米植行 (行間距76.2公分）的三個重複排列的分裂區（spHt pl〇t) 中。處理對象包括一未喷灑的對照組，以及施加在V5生長階段的三種喷灑比例：每公頃3.36公斤活性成分、每公頃6 · 7 2公斤活性成分或每公頃1 3 · 4 4公斤活性成分的嘉磷塞。在處理後7天與1 4天針對作物反應評估區塊並利用1至9的分數評價。利用SAS的一般線性模式（general linear model，GLM)與混合模式之變異數分析（analysis 〇f variance，ANOVA)解析作物反應資料（SAS系統為SAS Institute，lnc·，Cary，NC，USA 的註冊商標）。測試挑選之T 4品系的嘉磷塞耐藥性。此試驗為隨機完全區集設計，其位於以各個1 ·2米植行（行間距76.2公分）的兩個重複排列的分裂區中。在V3生長階段，將每公頃6.72公斤活性成份的嘉磷塞施加於一區塊，而不嘴麗的另一區塊作為對照組。第三區塊接受V3時期每公頃 6·72公斤活性成份的嘉磷塞接著在R1時期每公頃6.72公斤’活性成份的嘉磷塞之連續應用。在處理後7天與1 4天針對作物反應評估區塊，且指定〇%至1〇〇%反應的視覺反應分數’其中〇%==無發現反應而1〇〇%=區塊完全枯死。利用SAS的一般線性模式與混合模式之變異數分析解析作物反應資料。藉由種植轉殖品項3 56〇·43·5的T4世代植株與 STS培育品種以比較客所-心“基因對乙醯乳酸合成酶抑制 153 200817524 劑類除草劑的耐藥性與耐磺醯尿素大豆（STS®)的耐藥 f生此试驗設計成隨機完全區集設計，其位於以成對之 3 ·7米植行（行間距7 6 · 2公分）的兩個重複排列的分裂區中在V3生長階段施加喷丨麗處理且該處理包括下列··未喷灑的對照組、每公頃8·8克活性成份的玉嘧磺隆 (#·[[(4,6-二甲氧基-2-鳴啶基）胺基]Μ基]-3-(乙基磺醯基）-2-吡啶磺醯胺）；每公頃8·8克活性成份的苯磺隆 (2'[[[[(4-曱氧基-6-甲基-1，3,5-三嗪-2-基）甲胺基;|羰基]胺基]續醯基]苯甲酸曱酯）；或每公頃3 〇 · 〇克活性成份的氯 ^ ¾隆（2-[[[[(4-氣-6-曱氧基嘧啶-2-基）胺基]羰基]胺基] 續酿基]苯曱酸乙酯）加上每公頃9·67克活性成份的噻吩石黃隆。所有列出之喷灑處理均添加〇·25%體積百分比的非離子性界面活性劑配上每公頃2.24公斤活性成份的硫酸銨。在處理後7天與14天針對作物反應評估區塊，且指定〇°/。至100%反應的視覺反應分數。利用SAS的一般線性模式與混合模式之變異數分析解析作物反應資料。在兩個不同地點完成乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑的耐藥性試驗。將轉殖品項3 5 6 0 · 4 · 3 · 5 T 5世代與S T S ® 培育品種的植株種植於隨機完全區集設計中，其位於以成對之2 · 4米植行（行間距7 6 · 2公分）的三個重複排列的分裂區中。在V 3生長階段施加處理且該處理包括下列：未喷麗的對照組；每公頃4.2克活性成份的曱磺隆（2_[[[[(心甲氧基-6-甲基_1，3,5_三嗪_2_基）胺基]羰基]胺基]磺醯基]苯曱酸甲酯）；每公頃70.0克活性成份的噻吩磺隆；每公頃 1 7 · 5克活性成份的苯磺隆。所有列出之噴灑處理均添加〇 · 2 5 %體積百分比的非離子性界面活性劑配上每公頃2 · 2 4 154 200817524 公斤活性成份的硫酸銨。在處理後7天、1 4天與2 8天對各個區塊指定0%至100%的視覺反應比例。利用SAS的一般線性模式與混合模式之變異數分析解析作物反應資料。以主要的轉殖品項 3560.4.3.5大豆執行許多試驗以觀察其對不同比例與應用時間之嘉磷塞（具有與不具有其他殺蟲劑混合物）的耐藥性程度。第一組實驗種植於隨機完全區集設計中，其係成對之3.7米植行（行間距76.2公分）的三値重複，在各個重複中以隨機喷灑處理將該重複分區。在V2或R2生長階段施加處理，而該處理包括下列：未喷灑的對照組;每公頃3.36公斤有效劑量的嘉磷塞；每公頃3.36公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃560.4 克活性成份的陶斯松（0,0-二乙基0-3,5,6-三氯-2-吡啶基硫代磷酸酯）；每公頃3.36公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃1120.9克活性成份的本達隆（3-異丙基-1H-2，1，3-苯並噻二嗪-4(3H)-酮2,2-二氧化物）；每公頃3.36公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃141.3克活性成份的咪草煙 (2-[4.5·二氫-4 -曱基-4-(1 -甲基乙基）-5-酮基-1H-咪唑-2· 基]-5-乙基-3-吡啶羥酸）；每公頃3.36公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃263.4克活性成份的氟磺胺草醚（5-[2-氯 -4-(三氟曱基）苯氧基]_#-(曱基磺醯基）-2·硝基苯曱醯胺）；每公頃3.36公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃17.5 克活性成份的噻吩磺隆加上每公頃1 7 · 5克活性成份的苯磺隆；每公頃3.36公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃17.5 克活性成份的噻吩磺隆加上每公頃17.5克活性成份的苯磺隆加上每公頃560.4克活性成份的陶斯松；每公頃3.36 公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃1 7.5克活性成份的噻 155 200817524 吩續隆加上每公頃1 7 · 5克活性成份的苯續隆加上每公頃 1120.9克活性成份的本達隆；每公頃3·36公斤活性成份的嘉鱗塞加上每公頃1 7 · 5克活性成份的嗟吩續隆加上每公頃1 7 · 5克活性成份的苯續隆加上每公頃1 4 1 · 3克活性成份的咪草煙；以及每公頃3.36公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃1 7 · 5克活性成份的嗟吩續隆加上每公頃1 7 · 5克活性成份的苯磺隆加上每公頃263.4克活性戍份的氟續胺草鱗。所有列出之喷灑處理均添加〇 · 2 5 %體積百分比的非離子性界面活性劑配上每公頃2.24公斤活性成份的硫酸銨。在處理後7天、14天與28天針對各個區塊指定〇0/〇至100%的視覺反應比例。利用SAS的一般線性模式與混合模式之變異數分析解析作物反應資料。設計第二組耐藥性試驗以測量356〇·4·3·5大豆在應用常見田地使用比例的嘉磷塞與/或乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑後之產量潛力。這些試驗為成對之3·7米植行 (行間距76.2公分）的六個重複，種植於隨機完全區集設计’以重複作為區分，在各個重複中以隨機喷灑處理。將一個實驗體種植於田地Α而兩個實驗體種植於田地β與c (其以種植時間與田地位置的物理距離區別）。此外，該兩個田地具有不同的環境影響；其中之一在春季與夏季早期經歷乾旱壓力，另一在整個生長季節充分地灌溉。在各個重複之間隨機北處理且在VC、V2、R2或R5生長期噴·。處理包括每公頃1.68公斤活性成份的嘉磷塞；每公頃5·8 克活性成份的氯嘧磺隆加上每公頃4·4克活性成份的噻吩橫隆；以及每公頃1.68公斤活性成份的嘉磷塞加上每公頃5·8克活性成份的氯嘧磺隆加上每公頃4 4克活性成份 156 200817524 的噻吩磺隆。所有列出之喷灑處理均添加0 25%體積百分比的非離子性界面活性劑配上每公頃2·24公斤活性成份的硫酸銨。在處理後7天、14天與28天針對各個區塊指定〇%至100%的視覺反應比例。收割區塊並計算各個區塊的產量。利用s A S的一般線性模式與混合模式之變異數分析解析作物反應資料。將T3世代轉殖品項3 560.4.3.5大豆的陽性同型合子與陰性同型合子無效分離株（近似同源品系）種植於初步產量試驗，以測定產量是否辱為3560·4·3·5轉殖品項的存在而受到影響。將等値線產量試驗設計成隨機完全區集 (以轉殖品項區分），其具有成對之3·7米植行（行間距76 2 公分）的一個重複。試驗係機械耕種與/或若有需要應用傳統大豆除草劑標示之使用比例以確保無雜草狀態。收集各個項目的成熟度分數與產量資料並以SAS混合模式之變異數分析解析。亦將各個等値線項目的Τ3種子發展至Τ4世代。藉由評估12個幼苗（於氯磺隆除草劑溶液中發芽）以確認各個品系殘留的Τ3世代種子係陽性同型合子或陰性同型合子其中之一。傳統大豆品系無法忍受氣磺隆的喷灑應用，而氯磺隆一般應用於小榖產物以控制闊葉雜草。藉由將 66·7毫克的氯磺隆混在1升的水中製造氯磺隆除草劑的儲存溶液（stock solution)。利用1 mM的磷酸鹽缓衝液將混合液調至p Η 7 · 5。將2 0毫开的儲存溶液與1升水混合，接著將此混合溶液用來浸濕萌芽紙。將種子加入萌芽紙中並在初步處理後10天觀察它們的反應。具有3560.4.3.5 轉殖品項的幼苗能正常萌芽真生長’然而缺少轉殖品項的 157 200817524 幼苗產生不舍u

_ 進一步展開與生長的鉤狀單小葉葉J 據未顯 )。彳?f ήέ- 1 , 2個在溶液中的幼苗正常生長的話品系標記為陽性！人土 δ子（數據未顯示）。假若12個均具有抑制型銳# @ 勺狀早小葉表現型的話，將品系標記為同型合子（數據未顯示）。在等値線產篁試驗中種植陽性同型合子3 5 6 0 · 冑殖σσ項與陰性同型合子近似同源品系。試驗係以機 «與/或若有需要應用傳統大豆除草劑標示之使用比耗無雜草狀態°收集各個項目的成熟度分數與產量並以SAS混合模式之變異數分析解析。藉由利用氯磺隆除草劑篩選以評估1 2個幼苗好各個品系殘留的Τ4世代種子係陽性同型合子或陰性合子其中之一。將各個所選之等値線項目的Τ4種子至Τ5世代。挑選轉殖品項3560·4·3·5用於額外等値線產量評估°利用上述實施的相同試驗性產量測試設計種植品項3 5 6 0 · 4 · 3 · 5的陽性同型合子與陰性同型合子近似 I，品系。種植實驗株並機械耕種試驗株與/或若有需要傳統大豆除草劑標示之使用比例以確保無雜草狀態。各個項目的成熟度分數與產量資料並以SAS混合模變異數分析解析。挑選轉殖品項 3560.4.3.5用於基因滲入四種不 Pioneer®傳統（非基因轉殖）優良品系（具有不同的基源）。該四種優良品系具有22、27、30與38的相對度（relative maturities，RM)。初步雜交後，將卩1代回交於各自的輪迴親（reeurrent Parent)而將BC1F1種 4 (數，將植株陰性 4.3.5 械耕例以資料確認同型發展試驗轉殖同源應用收集式之同的因來成熟種子子發 158 200817524 展成F2世代。將產種植與收割。利用… 、1F2知群以個別植株方式 2 · 4米的增長植行置一 BC1F3品系。某於紅早一仃式種植產生土；十對各個品系」2個殘知* 隆除草劑幼苗試驗錄、登餘幼田利用虱石買同型合子或陰性同型人工认址从人座里忒驗的％性 a 、妹系（sister line)。基於橫 ^ 四個族群的殘餘篩選砝選、”节、、、Ό果選出328個陽性356〇 4 3 5 豆品系與11 6個陰w σ么拍认、、 ^性π口系用於初步產量試驗。針對3560.4.3 復白口接上人、 • 優良。口種的初步產量試驗，藉由輪

迴親系與3560.4.3.5轉殖品項是否存在區分bcif3品系L基於族群中品系預期的成熟度將陽性與陰性族群種植在靠近彼此的不同位置^ 356〇·4·3·5轉殖品項陽性區塊在 V3時期應用每公頃2·24公斤活性成份的嘉磷塞添加 0.25%體積百分比的非離子性界面活性劑配上每公頃2 24 公斤活性成份的硫酸銨，然而陰性區塊若有需要才施加傳統除草劑以維持無雜草的區塊。收集在各個位置的各個項目之成熟度分數與產量資料並利用SAS混合模式與一般線性模式執行的複回歸（multiple regression)與變異數分析。結果與討論評估3560.4.3.5大豆T0世代對嘉磷塞的耐藥性。將 35 60,4.3.5大豆喷灑每公頃2.24公斤活性成份的嘉磷塞與每公頃4.48公斤活性成份的嘉磷塞（表1 5)。每公頃2.24 公斤活性成份的處理等同於嘉磷塞一般田地應用比例的兩倍，而每公頃4.48公斤活性成份的處理等同於嘉磷塞一般田地應用比例的四倍。未轉形的親系品系（喷灑作為 159 200817524 對照組）無法存活於任一接士，種嘉磷塞應用比例下且始終被估為1。、攸汁將 3560·4·3·5 轉殖。、殖-口項在溫室中發展成T1世代認除草劑的耐藥性。表！ $山— 代以確 5中顯示3560.4.3.5轉殖品頊左應用每公頃1·68公斤活 σ項在陡成份的嘉構塞後；在庫用I 頃6〇·ο克活性成份的嘆吩〜、交在應用母公 A %隆後；以及在V3時期庫 I 公頃70克活性成份的噻哈戍々乂 “ 士卞力恿用母、、％灵隆接者在V 5時期應用每公頃 1.68公斤活性成份的嘉碌夷、

性。這些資料暗示著轉二 7樂叩項3560·4·3·5在轉形後的早代數中即對嘉磷塞與噻略拉★ 干4 、蕃分磺隆兩者應用具有耐藥性。在早期世代間分析^ .· 4 · 3 · 5轉殖品項的孟德爾分律（表16)。 -刀離

V 南方墨點法條帶ί 世代 το 轉殖品項 glyat4601 hra 1·68§ 3560.4.3.5 1 1 7.0 τι 3·36§ 1·68§ 60.0^ 70.0+1.68# 6.5 7.0 7.0 8.0 ί 9 =無發^^反；^)' ::、平句視見反應比値(〇 ==枯死的植株而基因或一基因作為探針的南方墨點法在V3生長階段應用嘉磷塞(每公頃活性成份168公體積百分_非離子性界面雜劑加上每公頃Z24 f V3生長階段應用麵铜每公頃活性成份_克斤 # 連續顧；在V3 _術雄倾每公性成酸銨’接著在财碰段«每挪_份丨.68 160 200817524 體積百分比的非離子性界面活性劑加上每公頃2.24公斤活性成份的硫酸敍。第一個分數為V3時期噻吩確隆應用後10天的結果，而第二個分數為V6時期嘉磷塞應用後10天的結果。 161 200817524 s ,/ ίν 跻鎳φ^^^ν¥1^1^#^ϊ15τ17Ό9ιηεΜΗ^^ι*·9ί^ chi2P§ 0.609 陰性 10.3 T2品系：預期陽性 32.3 陰性 C\ 發現陽性 chi2 P§ 0.605 ΤΙ植株卞預期陽性陰性 61.5 21.1 發現陰性 m CS 陽性 Ch 轉殖品項 3560.4.3.5 (s=l 5S會墨箱 w)f ^。口寸1¾¾名丨Sr 200817524 在一嘉磷塞除草劑耐藥性的田地試驗中噴灑 3560.4.3.5植株的T3世代植株。表17顯示在應用每公頃 3.36公斤活性成份的嘉磷塞後、在應用每公頃6.72公斤活性成份的嘉磷塞後、以及在應用每公頃1 3.44公斤活性成份的嘉磷塞後七天，植株對除草劑的反應。未轉形的對照品系對任何嘉磷塞的應用均為感性（susceptible)且一直評估為1。發展3560.4.3.5大豆的T4植株以便額外嘉磷塞耐藥性試驗。表1 7顯示喷灑比例為每公頃6.72公斤活性成份的嘉磷塞處理後七天與十四天之反應。 -163- 200817524 LLoo·卜¥寸一 ΐ 一一鹚,憋？f(nz/9

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00 ζ,.9ε rieL 00 Ζ..Π ε.είΝ rs a s ffl o ς·ίΛ β 3 2MsH<8<N^si^#^^^^^v :ί、^1τ^^νκ寸 ϊ^爾罇婵ςτ 寸 09?ε 衾书 Jk BH^EK-學嗒衾趔 0 , m - ^SSJm^ <coo ^5S?0\00 0X000- ΐχοο -991- 200817524 ^在更廣泛試驗中評估轉殖品項3560.4.3.5的除草劑耐藥性與產量效能。第-組試驗中，在營養生長與生殖生長階段以不同筒混型的嘉構塞與其他殺蟲劑喷灑轉殖品項 3560.4·3·5。橫跨評估的處理，”生長階段施加的嘉碟塞與所有嘉磷塞配上殺蟲劑之混合物在處理後7天與1 4天的作物反應極小（1〇%或更低），除了那些含有本達隆或氟磺胺草喊的殺蟲劑之外（表19)。具有本達隆或氣磺胺草鱗的處理在處理後7天造成高達2〇%的初步植物毒性 (Phytotoxicity)，該植物毒性在處理後14天減弱至低於 12%。這些結果係預期觀察到的葉片棕色化（leaf br〇nzing) 等同於植物毒性而得’而一般商用大豆應用本達隆或氟磺胺草喊化學物質任一長達14天後可發現此現象。亦應注意除草劑反應比值係相當主觀的，而通常丨〇%的反應不易分辨除非評估之區塊旁邊正好有未喷灑的對照組。處理後 2 8天在V 2生長階段應用的任何處理基本上沒有作物反應（表1 9)。而在R2時期施加的混合物，在處理後7天、 14天與28天所有處理的反應為10%或更低，除了含有本達隆的處理之外（表1 9)。針對此處理，處理後7天紀錄到的平均作物反應為11.4%，處理後1 4天減弱至低於5%而處理後28天為〇%(表19)。觀察到的作物反應一般為葉片棕色化度，在商用大豆應用本達隆處理後1 4天經常發現此現象。一般而言，在不同環境下評估兩個不同生長階段的3560.4.3.5大豆，其對於不同的嘉鱗塞混合物（具有或不具有其他殺蟲劑）具有出色的耐藥性。 -167- 200817524 ¥ 8<n趣刦碱ΜΗ趣w^vz,趣w# 田鵠 f sdoe οτ 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 π 00 00 00 00 90 90 90 00 90 ε.ε 00 οοτ 00 η 00 00 00ττ 90 90 寸ΊΙ οο·卜 0.S ΟΟΌΙ eoo 0C4Iττε.9ε.εε·ε ΓΓΟ 00 ε.<η ζ/ι 0.卜 οοτη 9.6 νοο 寸.π Ζ,Ί η 00.61 1.0 6.卜I 9.L 0«η 2<ν 0·«η 9.91 9S6.e 2 2 2 2 2 S 2 2 2 2 2τκτκτκ <νλτκτκ ζκτκτκτκ ί 迴玉蚴薺·fST 寸o9scn客^墊^却配^學嗒酬ί^φ^ί#:許念剧ίδ^^κ-^ϋ 寸.S<N+S.卜 ι + Γ卜 ι rm+ 21 + 57,1 6ΌΠΙ + 5ϋ·ζ,Ι 寸 Ό9ΐΓΖ.Ι + 5·ΑΙ «o.a + s.卜 ι 寸·scs ε.1 寸 i 6ό<νιϊ 寸os 寸 m + ru + s.u Π 寸1 + rZ.l + ST.I 6ΌΖ:ιι+*ο·π + 57.Ι 寸099 + 9·卜 ί+s·卜 I •ο·卜 Ι + s.卜 I 寸.S<N ΓΙ寸I II 寸o9in 9ε.ε9ΓΓΟ9ε·ε9ε·ε9ε.ε9ε·ε9ε.ε 9ε·ε 9ε·ε 9ε.ε9ε.ε9ε.ε 9「ε9ε.ε 9ε·ε 9ε·ε9ε.ε9ε·ε9ε·ε9ε.ε9ε·ε (s.s asi + $$ + + + $$ + + ^^4 + $$ + + + $$ + + ^¾ $$ + + Mss + + 幽钾4 + _蒈·f + + $$ + + f ^ 0$ + $$ + + + $$ + + + $$ + + $$ + + 當許鸽资碱+蚴替砵 0$ + ^¾ 11^4+¾薺 t + ^¾ S3 ^苯如^鸳11=。/〇001 但一^¥ίφ·«=%ο+Λ* %〇〇i 叫％0 书^省^^駟驊 j. 丨891丨 200817524 第二組處理轉殖品項3560 地使用比値（通常應用於大豆在/的试驗設計成在以田量其產量潛力。嘉磷塞、)應用不同除草劑後測塞加上乙酿乳酸合成酶抑制劑…成广抑制劑以及嘉鱗不叙，钟制剤的處理中，處理後7天、14 天與28天的反應係極小 M i υ /〇或更少）至實痛 (表20)。收集產量資料時，在比 … 苴同生長1¾段施加的任何除 Γ: ，處理並無明顯的產量差異(表20)。此外，接受除草劑處理的重複組與未喷麗的對照重複組在產量上沒有統計上的差表20)。基於多年的除草劑对藥性試驗可以推斷轉^ 項3560.4.3.5對於田地使用比例的嘉-塞、乙酿 =酸合成酶抑制劑以及嘉磷塞加上乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑右& 艮好的耐藥性。此外，當在不同營養生長與生生長階p 塞配上乙酿L 、乙酿乳酸合成酶抑制劑以及嘉碟测.4.35時成酶化學作用抑制劑嗔瀵轉殖品項呀，並不影響其產量潛力。 t -169- 200817524 #¥ ¥003^«|!_^寸1^«_^/,^»!^8&^每鈀^鹚迴^1#革耸谱嘀^镏^嫿10

9.S Γποοζ 29 卜CN 9,i(N z/6s<n 393 1198<N r6s<N 0寸 9S 寸，9·οζζ 0000U3 6.S 卜<N 卜.SCN U3LI ΟΟΌ 00 00 00 s ττ 00 90 2 2 90 00 00 90 90 一一 00 00 00 00 ooe Z/I 00 00 00 90 s 90 007 000 Γ1 00 00 U 000 6.9 9<n 00 00 90 5 2 0(N r»n 2 001 001 001 81 001 001 81 81 81 001 001 001 81 81

ss ^.¾¾ 2 2 ZK UA 2 2 <na ΟΛ s 2 lh UA

寸rt+00^ 寸·寸+00»n 寸寸 +oous 寸·寸+ 8IT; 寸·寸+00IO 寸·寸+00^ 寸·寸 + 8*0 寸，寸+00WS ί (睜<</亡<<隹噶寒昶) ++®_ faasi 009_ι $$ + $ψ^ + 009·ι $$ + $ψ^ + 009·ι $$ + $ψ^ + 89·1 $$ + $ψ^ + $$ + $ψ^ $$ + $ψ^ $φψ + $sp + $ψ^ 89·1 猶$ 89·1 描替Ψ 891 Ο091 索 W««5^B厚丨吹· 9蒯崦祐忘¥鹋啦«踩屮#1:殲蛴厚—-δ-ΛίΒΗ^^ΒϋιΓκ·舉€KW ：!：, oxooo- ^ 200817524 在五個額外環境中收集轉植如項356〇·4·3·5大豆的等値線產量試驗數據。當將等値績吝Θ奴秘最線產罝數據以混合模式的變異數分析處理時’年份與位置（八罝（分類於年份中）明顯不同（表 21)。陽性 3560·4.3.5 大豆盥 ^ kiL & 入旦興陰性近似同源品系，以及與 3560·4·3·5轉殖品項有關的σ冬& 士 θ $ ,關的如系在產量上並無明顯差異（表 2D。當以許多年份與環境試驗近似同源品系時，這些資料暗示著轉殖品項3560.4.3 ·5的存在並不影響最終產量潛力0 表21.· 14個環境中測試的轉殖品項3560.4.3.5陽性與陰性近似同源品系之產量(公斤/公頃)的混合模式變異數分析類型3固定效應的試驗效應 Num DF Den DF F値 Pr>F 年份 2 80 26.92 <.0001 位置（年份） 11 80 7.82 <.0001 glyat + hra 1 8 0 0.04 0.850 年份 * glyat + hra 2 80 0.63 0.533 位 1 (年份）* giyai + fira 11 80 1.75 0.077

將轉殖品項3560·4·3·5回交於四種不同Pioneer®傳統優良品系以證實孟德爾分離律，且測量轉殖品項在不同基因背景下的產量影響。針對測驗之各個四種不同BC 1 F2 族群，當利用氯磺隆篩選分析時，幼苗分離成3 :1 (耐藥性：感性）的比值（表22)。當將轉殖品項3560.4.3.5進一步雜合於3 1種不同基因背景，當以嘉磷塞噴灑田地時所有的F2 171 200817524 族群經檢驗均分離成3:1(耐藥性：感性）的比值（表22)。這些資料暗示著在不同基因背景下，轉殖品項3560.4.3.5將賦予對嘉磷塞與乙醯乳酸合成酶抑制劑類除草劑的耐藥性，且將如同單一顯性基因進行分離。

172 200817524 表22. 轉殖品項3560.4.3.5回交於四種不同優良基因背景與進一步雜交於31 種不同優良基因背景的F2世代分離率

觀察植株預期植株族群世代^ 抗性感性抗性感性 P1 3 560.4.3.5x 品系7 優良 BC1F2 700 222 69 1.5 230.5 0.5 18 3560.4.3.5x 品系8 優良 BC1F2 761 273 775.5 25 8.5 0.298 3560.4.3.5x 品系9 優良 BC1F2 160 54 160.5 53.5 0.937 3560.4.3.5x 品系10 優良 BC1F2 205 79 213.0 7 1.0 0.273 3560.4.3.5x PHI1 F2 53 23 57.0 19.0 0.289 3 560.4.3 .5x PHI2 F2 76 20 72.0 24.0 0.346 3 560.4.3.5x PHI3 F2 66 24 67.5 22.5 0.715 3560.4.3.5x PHI4 F2 75 23 73.5 24.5 0.726 3560.4.3.5x PHI5 F2 99 23. 9 1.5 30.5 0.117 3560.4.3.5x PHI6 F2 96 24 90.0 30.0 0.206 3560.4.3.5x PHI1 1 F2 72 18 67.5 22.5 0.273 3 560.4.3.5x PHI12 F2 115 36 113.3 37.8 0.742 3 560.4.3.5x PHI13 F2 91 22 84.8 28.3 0.175 3560.4.3.5x PHI14 F2 97 26 92.3 30.8 0.323 3560.4.3.5x PHI15 F2 88 28 87.0 29.0 0.830 3560.4.3.5x ΡΗΙΊ6 F2 66 24 67.5 22.5 0.7 15 3 5 60.4.3.5x PHI17 F2 75 34 8 1.8 27.3 0.135 35 60.4.3.5x PHI1 8 F2 108 25 99.8 33.3 0.099 3 5 60.4.3.5x PHI19 F2 78 26 78.0 26.0 1.000 173 200817524 4 4 4 • ο -1 -2 0 2 0 2 0 2 6 Π 6 Π 6 Π 5 Η 5 η 5 η 3 ρ 3 ρ 3 ρ

X X F2 95 29 93. 0 3 1 . .0 0. .678 F2 109 37 109 .5 36. ,5 0. ,924 F2 75 26 75. 8 25. ,3 0. ,863 F2 85 19 78. 0 26, .0 0 .113 F2 8 1 18 74. 3 24, .8 0 .117 F2 76 23 74. 3 24, .8 0, .685 F2 97 36 99. 8 33, ,3 0 ‘ .582 F2 98 28 94. 5 3 1 , .5 0, .471 F2 89 22 83. 3 27, ,8 0, .208 F2 71 24 7 1.3 23, .8 0, .953 F2 54 15 5 1 · 8 17, .3 0 .532 F2 73 20 69. 8 23, .3 0 .436 F2 53 12 48. 8 16, .3 0 .223 F2 96 26 91. 5 30 .5 0 .347 F2 7 6 20 72. 0 24 .0 0 .346 F2 69 18 65 . 3 21 , ,8 0 .353 3560.4.3.5x PHI23 3560.4.3.5 x PHI24 3 560.4.3.5x PHI25 3 560.4.3.5x PHI26 3560.4.3.5x PHI27 3560.4.3.5x PHI28 3 560.4.3.5x PHI29 3 560.4.3.5x PHI30 3 560.4.3.5x PHI3 1 3 560.4.3.5x PHI32 3 560.4.3.5x PHI33 3 5 60.4.3.5x PHI34 3 5 60.4.3.5x PHI35 f在萌芽的幼苗上利用氯磺隆溶液篩選BC1F2族群。將F2族群種植於田地中並在V4生長階段喷灑每公頃2.24公斤活性成份的嘉磷塞添加 0.2 5 %體積百分比的非離子性界面活性劑加上每公頃 2.24公斤活性成份的硫酸銨。所有試驗的族群在處理後約7天計算抗性與感性的植株。 ί chi2偏離預期模式係起因於巧合的機率為了測試轉殖品項3 560 ·4 ·3·5在不同基因背景下的產量影響力，發展陽性同型合子或陰性同型合子 3560.4.3.5 174 200817524 轉殖品項的BC1F3品系（表23)。由於這些品系不是真正的近似同源品系，存在某些與評估的初步產量測試有關之混淆錯誤。例如同一族群中，較晚成熟的大豆品系一般比車乂早成熟tm系具有較同的產1。因此，隨著種植到預期為R8生長階段（95%豆莢已經達到成熟豆莢之顏色的時間點）的天數計算各個BC1F3品系的成熟度。基於直接在各

C；個位置與許多非基因轉殖驗品系（已知成熟度) 比較建立各個品系的成熟度預計値。初步產量資料分析，藉由區分3560·4·3·5轉殖品項以共分散（c〇variate)分析成熟度好在同一預期的成熟度下比較356〇 4·3·5轉殖品項陽性與3560·4·3·5轉殖品項陰性品系。值得注意的是BC1F3 陽性相對陰性報導之比較亦會被所應用之不同除草劑方案所混淆，然而，區分嘉磷塞耐藥性試驗的傳統培育品種試驗為大豆培育品種發展方案中常見的實施。此外，針對呈現之3560·4·3·5χ優良品系的分析資料’假設背景成热對偶基因、抗病對偶基因與所有其他背景基因效應的分離率，|衍生自同一初* bcifi植株的 3560·4·3·5轉殖品項陽性品系族群# 356G 4 3.5轉殖品項陰性品系族群中為一樣的。良品系的BC1F3族群，n3成熟族品項陽性品系比1 1 3成熟族群中的針對在*同地方測試之四種BC1F3料的各者檢驗 4.3.5轉殖品項陽性與356〇 4 3 5轉殖品項陰性品系之產量最小平方均值(表23)β針對3 56〇 4 3 5 χ KM”優群中的3560.4.3.5轉殖 3560.4.3.5轉殖品項陰 175 200817524 性品系具有明顯較高的產量（表23)。這差異主要起因於環境效應，因為其他成熟族群，3560.4.3.5轉殖品項陽性與 3 5 60.4.3.5轉殖品項陰性品系在產量上沒有統計學上的差異（表23)。此外，在一特定位置，且當來自測驗的所有位置之產量資料混在一起時，在3560·4·3·5 X RM22優良品系族群中，3560·4.3.5轉殖品項陽性品系在產量上與 3 560.4.3.5轉殖品項陰性品系無明顯差異（表23)。

針對3560.4.3.5 X RM27優良品系的BC1F3品系族群，試驗為3560.4.3.5轉殖品項陽性品系比起3560.4.3.5 轉瘦品項陰性品系有明顯的產量優點（表2 3)。此發現主要起因於環境效應，因為當將所有位置混合，3560.4.3.5轉殖品項陽性與3560.4.3.5轉殖品項陰性品系之間在產量上沒有可測得的明顯差異（表23)。此外，在各個特定成熟族群中，560.4.3.5轉殖品項陽性與3560.4.3.5轉殖品項陰性品系之間在產量上沒有可測得的明顯差異（表23)。可在兩個位置上發現，3560.4.3.5 X RM30優丧品系的 BC1F3品系族群之間明顯的產量差異。3560.4.3 ·5轉殖品項陽性品系比3 560.4.3.5轉殖品項陰性品系具有明顯較高的產量，然而在不同位置可發現相反的效應（表23)。當將所有位置混在一起時，3560.4.3.5轉殖品項陽性品系與 3 560.4.3.5轉殖品項陰性品系之間在產量上沒有明顯可觀察到的差異（表23)。這些結果暗示著環境影響係為最有可能造成效應的因子，因為在各個特定成熟族群中，當直接比較3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項陽性品系與3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項 176 200817524 陰性姊妹品系時，沒有明顯可觀察到的產量差異在特定位置的3560.4.3.5 xRM38優良品系系族群中亦可發現兩個明顯的產量差異。重複一，3560.4.3.5轉殖品項陽性品系比起+ 具有明顯較高的產量，然而在另一位置，3560.4 品項陰性品系具有產量優勢（表23)。當將此族群置混在一起時並無明顯可觀察到的差異，這暗示置内的環境影響造成此差異。在各個成熟族群中成熟族群中偵測到明顯的產量效應，且在該 3560.4.3.5轉殖品項陽性品系比3 560.4.3.5轉殖品系具有明顯較高的產量（表23)。測試的四個族無明顯的產量趨勢，暗示著當3560.4.3.5轉殖品同基因背景時，3 560.4.3.5轉殖品項的存在並不潛力。 (表 23)。 BC1F3 品的其中之陰性品系 •3.5轉殖的所有位著個別位，僅在125 實例中，品項陰性群中，並項插入不影響產量

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C 表23. 轉殖品項 3 560 .4.3.5 X 優良品系背景的四個不同族群之間 3560.4.3 • 5轉殖品項陽性同型合子與 3 560.4.3.5 轉殖品項陰性同型合子的 BC1F3 品系在一位置與一特定成熟度時之產量（公斤/公頃）最小平方均值 3560.4.3. 5轉殖品項成熟族群位置t 度* 陽性陰性差異5 Pr>|t| 3 5 6 0.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種 A All 2471.74 2439.77 3 1.97 0.675 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種 B All 3491.77 3393.32 98.45 0.193 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種 C All 2683.63 2747.03 -63.40 0.402 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種 D All 3180.61 3 144.42 36.19 0.632 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種 E All 2996.18 2912.63 83.55 0.27 1 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 All 2964.78 2927.43 37.35 0.34 1 3 5 60.4.3 RM22 優 • 5 良 X 品種全部 111 2801.79 2836.18 -34.39 0.807 3560.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 112 2927.15 2704.48 222.68 0.072 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 113 2881.95 2686.65 195.30* 0.041 3 5 6 0.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 114 2625.92 2811.09 -185.17 0.285 3560.4.3 RM22 優 • 5 良 X 品種全部 115 2899.19 2839.28 59.9 1 0.633 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 116 2848.24 2859.77 -11.53 0.920 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 125 3183.30 2969.74 213.56 0.23 1 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 126 2976.31 3045.30 -69.00 0.770 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 127 2853.20 3029.97 -176.77 0.327 3 5 60.4.3 RM22 優 • 5 良 X 品種全部 128 3031.55 3030.07 1.48 0.986 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 129 3088.60 2994.95 93.65 0.350 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 130 3198.18 3166.12 32.06 0.803 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 13 1 3117.01 2981.93 135.08 0.435 3 5 60.4.3 RM22 優 .5 良 X 品種全部 132 3074.62 3028.53 46.09 0.705 3 5 60.4.3 RM27 優 • 5 良 X 品種 B All 3331.34 3406.61 -75.26 0.640 3 5 60.4.3 RM27 優 .5 良 X 品種 C All 3218.79 2886.77 332.02* 0.014 178 200817524 3560.4.3.5轉殖品項成熟族群位置t 度：陽性陰性差異s 3 5 6 0.4.3.5 x RM27優良品種 D All 3475.08 3417.17 57.91 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種 E All 3028.48 3149.72 -121.24 3 5 6 0.4.3.5 x RM27優良品種 F All 3099.48 3 02 1.84 77.64 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 All 3230.63 3176.42 54.2 1 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 122 3311.82 3145.60 166.22 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 123 3226.68 3164.15 62.53 3 560.4.3.5 x RM27優良品種全部 125 3148.80 3238.51 -89.71 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 1 26 3086.18 3213.06 -126.88 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 127 3271.69 3168.42 103.28 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 128 3237.08 3106.81 130.27 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 13 0 3127.15 2987.23 139.92 3 5 60.4.3.5 x RM27優良品種全部 13 3 3435.66 3387.58 48.08 3 5 60.4.3 .5 x RM30優良品種 C All 3298.88 2983.11 315.77* 3 5 60.4.3.5 x RM30優良品種 D All 3544.23 3693.09 -148.86* 3 5 60.4.3.5 x RM30 ELITE G All 3472.84 3481.88 -9.05 3 5 6 0.4.3 .5 5 x RM30優良品種 E All 3 177.69 3229.61 -51.92 3 5 60.4.3 ·5χ RM30優良品種 F All 3002.89 2975.75 27.13 3 5 60.4.3 .5 χ RM30優良品種全部 All 3299.30 3272.69 26.62 3 5 60.4.3.5 χ RM30優良品種全部 123 3356.46 3010.13 346.33 3 5 60.4.3 .5 χ RM30優良品種全部 125 3276.10 3172.47 103.63 3 5 60.4.3 .5 χ RM30優良品種全部 126 3266.42 3168.61 97.8 1 3 5 60.4.3.5 χ RM30優良品種全部 127 3297.75 3299.10 -1.35 3 5 60.4.3.5χ RM30優良品種全部 128 3285.84 3282.21 3.63 3 5 60.4.3 .5 χ RM30優良品種全部 129 3278.27 3407.86 -129.59 3 5 60.4.3 .5 χ RM30優良品種全部 130 3334.29 3568.44 -234.15 3 5 60.4.3.5 χ RM38優良品種 C All 2734.84 2659.09 75.75

Pr>|t| 0.656 0.530 0.600 0.487 0.497 0.668 0.660 0.449 0.670 0.436 0.594 0.843 <.0001 0.029 0.888 0.4 18 0.673 0.512 0.063 0.194 0.228 0.984 0.934 0.05 1 0.118 0.256 179 200817524 3560.4.3,5轉殖品項成熟族群位置t 度J 陽性陰性差異§ Pr>|t| 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種 G All 3228.83 3305.91 -77.08 0.248 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種 £ All 3049.84 3190.55 -140.71 * 0.040 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種 F 1 All 2678.11 2611.45 66.65 0.344 3560.4.3 RM38 優 • 5 良 X 品種 F2 All 2687.71 2507.70 180.02* 0.008 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 All 2875.87 2854.94 20.93 0.608 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 122 2700.19 2803.14 -102.96 0.547 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 124 2743.61 2824.11 -80.50 0.564 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 125 3206.30 2880.53 325.77* 0.001 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 1 26 2788.26 2864.36 -76.10 0.550 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 127 2849.14 2929.84 -80.7 1 0.514 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 128 2842.31 2989.39 -147.07 0.306 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 129 2928.44 2884.00 44.44 0.490 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 13 0 2918.29 2864.10 54.19 0.325 3560.4.3 RM38 優 .5 良 X 品種全部 13 1 2906.27 2655.01 251.26 0.057 t以區塊種植與 R8生長階段之間的平均天數計算出成熟度

§ 3 5 6 0.4 · 3 · 5轉殖品項陽性與3 5 6 0 · 4 · 3 · 5轉殖品項陰性品系之間預期產量差異的最小平方均値 * P = 0.0 5時暗示預期產量差異為明顯的 180 200817524 表24. PHP20163A片段中基因片段的描述

PHP20163A 片段上的位I (鹼基對位置）基因片段大小(鹼基對）描述 1至16 複接點區 (polylinker region) 16 選殖基因片段的區域 17 至 502 SCP1啟動子 486 持續表現型合成性啟動子，包括一部分的CaMV35S 啟動子（Odell 等人(1985) Nature 313:801-812)與 Rsyn7-Syn II Core —致性啟動子(US 6,0720,050 與 6,555673) 503 至 504 複接點區 2 選殖基因片段的區域 505 至 571 TMV omega 5,端未轉譯區域 67 來自菸草鑲嵌病毒omega 5’端未轉譯引導子(leader) 的增強子片段（Gallie 與 Walbot (1992) NAR 20:4631-4638) 572 至 596 複接點區 25 選殖基因片段的區域 597 至 1037 giyat460〗基因 441 合成式嘉磷塞N-乙醯轉移酶基因(Castle等人 (2004) Science 304:1151-1154) 1038 至 1053 複接點區 16 選殖基因片段的區域 1054 至 1369 p/«II終止子 316 來自馬鈐薯蛋白酶抑制劑II 加II)基因的終止子區域 (Keil 等人0986) NAR 14:5641-5650 ; An 等人(1989) Plant Cell 1:115-122) 1370 至 1385 複接點區 16 選殖基因片段的區域 1386 至 2030 SAMS啟動子 645 大豆腺苷甲硫胺酸合成酶(SAMS)基因的啟動子 (Falco 與 Li (2003)美國專利公開案 2003/0226166) 2031 至 2089 SAMS 5’端未轉譯區域 59 大豆腺苷甲硫胺酸合成酶(SAMS)基因的5’端未轉譯區域(Falco與Li，2003美國專利公開案2003/0226166) 2090 至 2680 1SAMS内子 """ | 591 大豆腺苷曱硫胺酸合成酶(SAMS)基因的5’端未轉譯區域之間的内子(Falco與Li，2003美國專利公開案 2003/0226166) 2681 至 2696 SAMS 5’端未轉譯區域 16 大豆腺苷甲硫胺酸合成酶(SAMS)基因的5’端未轉譯區域(Falco與Li，2〇03美國專利公開案2003/0226166) 2697 至 4667 gm-hra基西 1971 大豆乙醯乳酸合成酶基因的改變型，其具有15個來自腺苷曱硫胺酸合成酶基因的額外核苷酸在5’端 (2697至2711)與兩個編碼序列中的核苷酸變化 4668 至 5319 afa終止子 652 大豆乙醯乳酸合成酶基因的自然終止子 5319 至 5362 複接點區 43 選殖基因片段的區域 181 200817524 表25. 序列編號一覽表序列編號描述 1 左侧序列接合處SC36 2 右側序列接合處D32ALS 3 完整的轉殖基因插入片段 4 左側基因體邊緣區域 5 右側基因體邊緣區域 6 完整的旁側與完整的轉殖基因插入片段 7 正向引子 8 逆向引子 9 Taqman MGB 探針 10 左側基因體/左側轉殖基因邊緣區域（10核苷酸/10核苷酸） 11 右侧基因體/右側轉殖基因邊緣區域（10核苷酸/ 10核苷酸） 12 左侧基因體/左側轉殖基因邊緣區域（20核苷酸/ 20核苷酸） 13 右側基因體/右側轉殖基因邊緣區域（20核苷酸/ 20核苷酸） 14 左側基因體/5 V端轉殖基因 15 右側基因體/3'端轉殖基因 16 引子1297 17 引子1298 18 引子1439 19 引子1514 20 引子1558 21 引子1660 22 引子1666 23 引子1679 182 200817524 序列編號描述 24 引子1227 25 引子1297 26 引子1440 27 左侧基因體/左侧轉殖基因邊緣區域（30核苷酸/ 30核苷酸） 28 右侧基因體/右側轉殖基因邊緣區域（30核苷酸/ 30核苷酸） 29 SCP1啟動子探針 30 glyatA6Q 1 # 31 Pz·;?//終止子探針 32 SAMS探針（5’端） 33 SAMS探針（3’端） 34 gm-hra # if (5 5 ) 35 gm-Zzra 探針（3 ’ 端） 36 <2探針 37 引子 DP-356-fl 38 引子 DP-356-rl 39 引子 DP-356-p 40 引子1610 41 左側基因體/轉殖基因 42 右側基因體/轉殖基因 43 轉殖基因插入片段5’端的181個核苷酸 44 引子104312 45 引子104314 46 探針125323 47 引子1 09893(内生性對照） 48 引子109894(内生性對照） 49 探針125322(内生性對照） 183 200817524 序列編號插述 50 引子1473 " ....... 51 引子 1 504 ' ~~~" _ 52 Τ?~15〇5——~~~- 弓丨子1 506 ---- __54 引子 1 549 ~~~ " ___55 引子1550 ^ -—_____

或多於一（即，一片段」意指此處所用的冠詞「一（“a，，與“an，，）」代表一至少一）個冠詞文法上的目標。實例所示，「一或多個片段。本說明書所提的所有刊物與專利中請書暗示熟悉技術本發明屬於何種程m將所有刊物與專利申請書料二考資料併入本文中’與明確地與個別地指出以參考資式將各個獨特刊物或專利申請書併入本文中的程度相上雖然已經藉由敘述與實施例在$種程度上詳細地描述广發明以便清楚了帛’可以理解可在附加的申請專利 ®内實施某種程度的變化與改良。 t圖式簡單說明】〜第1圖提供PHP2_的示意圖，其指出質體片段與卜“卜編的限制酶切點。利用、α 1以離析PHP201 63A片段（第2圖）。 184 200817524 第2圖提供PHP20163A的示意圖，其指出1、扣以 III的限制酶切點與許多基因片段。將此片段用於基因搶法以產生3560.4.3 ·5大豆轉殖品項。用於南方雜合分析的探針以片段圖下方的方塊表示而其定義如下；Α: (嘉磷塞乙醯轉移酶）探針，B : 探針（產生兩個無重疊、覆蓋整個區域的片段且共同應用於雜合分析）〇第3圖k供大丑轉殖品項3560·4·3·5中插入區域的示意圖並顯示定序聚合酶鏈反應產物（利用基因體作為模板而產生）而得的三個區域：ΡΗΡ20163Α DNA片段撞擊而來的DNA插入片段區域、5,端旁側大豆基因體〇ΝΑ區域與3, 端旁側大豆基因體DNA區域。第4Α-Ε圖提供3560·4·3·5大豆轉殖品項中DNA插入片段與旁側基因體鄰近區域的完整序列（序列編號6)。分別在驗基對1至3317以及鹼基對8680至1 0849的5,端與 3'端旁側基因體鄰近區域下方劃線。 C/ 第5圖提供3560·4·3·5大豆的育種譜系圖。第6圖提供片段ρΗρ2〇163Α的示意圖，其指出包含於兩個基因表現組合體内基因片段的位置以及π與 1 I限制酶切點的鹼基對位置。此片段由ρΗρ2〇ι 〇切下後遺失J與七c 7的限制酶切點。整個片段大小為“Μ 驗基對。所用探針的大略位置以片段下方的數字方塊表示並於下方說明。表3中提供這些探針的額外細節。第7圖提供PHp2〇163的質體示意圖，其指出基因片 185 200817524

段的位置與I、5容/ Η、][與I限制酶切點的鹼基對位置。離析此質體的][片段（PHP20163a ;圖不於第2圖）並將其用於轉形以產生356〇·4·3 5大豆。位於驗基對1 387的I切點包含一 Dam甲基酶識別位置，且若由Dam+品系製備該質體該I切點可抵抗I的剪切。整個質體大小為7954鹼基對。以質體圖示内的線圖表式地指出骨幹探針並於下方說明。各個探針由兩個聯合用於雜合分析的無重疊片段構成。第8圖提供基於南方墨點分析的3560.4.3.5大豆中轉殖基因插入片段之示意圖。以水平虛線表示旁側的大豆基因體。大昱基因體中併入單個、完整複製的ΡΗΡ201 63Α片段°在示意圖下方以南方墨點法所觀察到的片段大小暗示 II與I的限制酶切點（以鹼基對表示）。第9圖提供3560.4.3.5轉殖品項的圖式並描繪不同引子鍵合的地方。第10Α-Ι圖提供3560.4.3.5轉殖品項的左側基因體鄰 Ο 近區域/中間的轉殖基因插入片段/右側基因體鄰近區域 (序列編號6)。並描述不同引子鍵合的區域。【主要元件符號說明】 186

Claims

200817524 十、申請專利範圍： 1 . 一種離析聚核苷酸，包含序列編號10或1 1。 2.如申請專利範圍第1項之離析聚核苷酸，其中上述之聚核苷酸係選自下列所構成的群組中： (a) 一核苷酸序列，如序列編號6、12、1 3、 14 、 15 、 27 、 28 、 41 或 42 所示；以及 (b) 一核苷酸序列，其包含序列編號6、12、 13 、 14 、 15 、 27 、 28 、 41 或 42 的一片段。 3 . —種在一生物樣本中識別轉殖品項3 5 6 0 · 4 · 3 · 5的套組，該套組包括一第一引子與一第二引子，其中該第一引子與該第二引子能擴增包含一 3560.4.3.5特定區域的一聚核苷酸0 4.如申請專利範圍第3項之套組，其中該套組更包括一聚核苷酸，其用以偵測該3560.4.3 ·5特定區域。 5 ·如申請專利範圍第3項之套組，其中該第一引子包括序列編號6的一第一片段而該第二引子包括序列編號6的一第二片段，其中該第一引子與該第二引子位於該 3 5 60.4.3.5特定區域的兩側，並與該聚核苷酸共有足夠的序列同源性或互補性以擴增該3560.4.3.5特定區域。 187 200817524 6. 如申請專利範圍第5項之套組，其中 a) 該第一引子包括序列編號3的一片段而該第二引子包括序列編號5的一片段； b) 該第一引子包括序列編號3的一片段而該第二引子包括序列編號4的一片段；； c) 該第一引子包括序列編號4的一片段而該第二引子包括序列編號5的一片段。 7. 如申請專利範圍第5項之套組，其中該第一引子與該第二引子包括至少八個序列編號6的連續聚核苷酸。 8. 如申請專利範圍第6項之套組，其中該第一引子或該第二引子包括至少八個序列編號3、4或5的連續聚核苷酸。 9. 如申請專利範圍第3或第4項之套組，其中該第一引子或該第二引子包括序列編號7、8、9、16、1 7、1 8、1 9、 20、21、22、23、24、25、26、37、38、39、40' 44、45、 46 、 51 、 52 、 53 、 54 、 55 ° 10. —種 DNA 偵測套組，其至少包括可專一地偵測一 3 5 60.4.3.5特定區域的一聚核普酸，其中該聚核苷酸包括至少一 DNA分子，該分子係相同於或互補於序列編號 6 188 200817524 的一足夠長度之連續核苷酸。 1 1 ·如申清專利範圍第1 〇項之D N A偵測套組，其中該可專一地偵測一 3560.4.3.5特定區域的聚核苷酸包括具有序列編號10或11的一聚核苷酸。 12.如申請專利範圍第10項之Dna偵測套組，其中該聚 ζ) 核苷酸包括一序列，該序列在嚴格條件下可和選自下列所構成的群組之序列進行雜合： (a) 序列編號5與序列編號3的序列；以及 (b) 序列編號4與序列編號3的序列。 13· 一種大豆植株，其具有穩定地併入至其基因體中之如申請專利範圍第1或第2項之聚核皆酸。 I 14·如申請專利範圍第13項之大豆植株，其中該植株係美國菌種中心（ATCC)寄存種子編號 PTA-8287之種子生長而成之一植株的一後代。 15· 一種基因轉殖種子，其來自申請專利範圍第13項之該植株。 1 6· 一種基因轉殖種子，其在美國菌種中心寄存種子編號 189 200817524 為 PTA-8287 。 1 7 · —種在一生物樣本中識別轉殖品項 3 5 6 0.4 · 3 · 5的方法，其至少包括 (a) 使該樣本接觸一第一引子與一第二引子；以及 (b) 擴增包含一 3 560.4.3.5特定區域的一聚核苷

酸0 18.如申請專利範圍第 17 項之方法，其中該包含 3560.4.3.5特定區域的聚核苷酸包括序列編號1 1之序列。 19.如申請專利範圍第 17 項之方法，其中該包含 35 60.4.3.5特定區域的聚核苷酸包括序列編號10之序列。 20. 如申請專利範圍第17、第18或第19項之方法，其更包括偵測該3560.4.3.5特定區域。 21. 如申請專利範圍第17、第18或第19項之方法，其中該第一引子包括序列編號6的一第一片段而該第二引子包括序列編號6的一第二片段，其中該第一引子與該第二引子位於該3560.4.3.5特定區域的兩側，並與該聚核苷酸共有足夠的序列同源性或互補性以擴增該3560.4.3.5特定區 190 200817524 域。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中 a) 該第一引子包括序列編號3的一片段而該第二引子包括序列編號5的一片段； b) 該第一引子包括序列編號3的一片段而該第二引子包括序列編號4的一片段；； { c)該第一引子包括序列編號5的一片段而該第二引子包括序列編號4的一片段。 23. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該第一引子與該第二引子包括至少八個序列編號6的連續聚核苷酸。 24. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該第一引子與該第二引子包括至少八個序列編號5、4或3的連續聚核苷酸。 1 . 25. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該第一引子與該第二引子包括序列編號7、8、9、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、37' 38、39、40、44、45、46、 51 、 52 、 53 、 54 、 55 ° 26. —種在一生物樣本中識別轉殖品項 3 560.4.3.5的方法，其至少包括 191 200817524

(a) 使該樣本接觸一第一引子與一第二 (b) 執行一 DNA擴增反應，因而產生-增子（ampi icon)分子；以及 (c) 偵測該DNA擴增子分子，其中在i 增反應中偵測到該DNA擴增子分大豆轉殖品項3560.4.3.5的存在。 27.如申請專利範圍第26項之方法，其中該第一序列編號6的一第一片段而該第二引子包括序列一第二片段，其中該第一引子與該第二引-3 5 60.4.3.5特定區域的兩側，並與該聚核發酸共序列同源性或互補性以擴增該3560.4.3.5特定區 28.如申請專利範圍第26項之方法，其中該第一第二引子係選自包括下列的群組中： (a) 包含序列編號1 6與序列編號1 7 (b) 包含序列編號7與序列編號8的 (c) 包含序列編號23與序列編號20 (d) 包含序列編號23與序列編號19 (e) 包含序列編號18與序列編號22 (f) 包含序列編號21與序列編號22 (g) 包含序列編號7與序列編號9的 (h) 包含序列編號8與序列編號9的引子； -DNA 擴矣DNA擴子表示有引子包括編號6的 P位於該有足夠的域。引子與該序列；列S 序列；序列；序列；序列；列；列；以及 192 200817524 (i) 包含序列編號44與序列編號45的序列 29.——種在一樣本中偵測是否有相當於一轉殖 3560.4.3.5之DN A存在的方法，該方法至少包括： (a)使該樣本接觸一聚核苷酸探針且專一地 3560.4.3.5轉殖品項，該探針在嚴格雜合條件下可與大豆轉殖品項3 560.4.3.5的DNA進行雜合； f (b)將該樣本與該探針以嚴格雜合條件處理 '1, ' . 及 (c)偵測該探針與該DNA的雜合作用，其中到雜合作用表示有該3560.4.3.5轉殖品項的存在。 3 0.如申請專利範圍第29項之方法，其中該樣本包括組織。 3 1. —種聚核苷酸，其包括選自下列所構成之群組的列：序列編號 7、8、9、16、17、1 8、1 9、2 0、21、 23、24、25、26、37、38、39、40、43、44、45、46、 52、53、54、55或上述之互補序列。 32· —對DNA分子，其包括一第一 DNA分子與一第二分子，其中該第一 DNA分子包括序列編號6的一第一而該第二DNA分子包括序列編號6的一第二片段，其品項偵測來自 :以偵測大豆一序 22 > 5卜 DNA 片段中該 193 200817524 第一 DNA分子與該第二 DNA分子位於序列編號 6該 3 560.4.3.5特定區域的兩側，並與該聚核苷酸共有足夠的序列同源性或互補性以擴增該3560.4 · 3.5特定區域。 3 3. —種確定種子純度的方法或一種於一批種子中篩選 3560.4.3.5轉殖品項種子的方法，包括： (a) 使該樣本接觸一第一引子與一第二引子；

(b) 執行一 DNA擴增反應，因而產生一 DNA擴增子分子；以及 (c)偵測該DNA擴增子分子，其中在該DNA擴增反應中偵測到該DNA擴增子分子暗示著該大豆轉殖品項3560.4.3.5的存在。 34.如申請專利範圍第33項之方法，其中該第一引子包括序列編號6的一第一片段而該第二引子包括序列編號6的一第二片段，其中該第一引子與該第二引子位於該 3 5 60.4.3.5特定區域的兩侧，並與該聚核苷酸共有足夠的序列同源性或互補性以擴增該3560.4.3.5特定區域。 35.如申請專利範圍第34項之方法，其中 a) 該第一引子包括序列編號3的一片段而該第二引子包括序列編號5的一片段； b) 該第一引子包括序列編號3的一片段而該第 194 200817524 二引子包括序列編號4的一片段；； c)該第一引子包括序列編號4的一片段而二引子包括序列編號5的一片段。 3 6.如申請專利範圍第34項之方法，其中該第一引子第二引子包括至少八個序列編號6的連續聚核苷酸。 (、 37.如申請專利範圍第35項之方法，其中該第二引子第一引子包括至少八個序列編號3、4或5的連續聚核1 38.如申請專利範圍第33項之方法，其中該第一引子第二引子包括序列編號7、8、9、1 6、1 7、1 8、1 9、 21、22、23、24、25、26、37、38、39' 40、44、45、 51 、 52 、 53 、 54 、 55 ° 39. —種確定種子純度或於一批種子中篩選一 3560. 轉殖品項存在的方法，其至少包括 (a)使一含有大豆 DNA的樣本接觸一聚核探針，該探針在嚴格雜合條件下雜合於來自大豆轉殖 3560.4.3.5 的 DNA 且專一地偵測該大豆轉殖 3560.4.3.5 ； ,(b)將該樣本與該探針以嚴格雜合條件處理及該第與該與該 F酸。或該 20 > 46 '

4.3.5 苷酸品項品項；以 195 200817524 (c)偵測該探針與該DNA的雜合作用，其中偵測到雜合作用暗示著該3560.4.3.5轉殖品項的存在。 40. —種產生耐嘉磷塞與耐乙醯乳酸合成酶抑制劑之一植株的方法，其包括培育申請專利範圍第1 3或第14項之一植株；以及藉由分析含有一 3560.4.3.5特定區域的至少一聚核苷酸來篩選後代。 41. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該聚核苷酸包括序列編號11。 42. 如申請專利範圍第40項之方法，其中該聚核苷酸包括序列編號10。 43. 如申請專利範圍第3 9項之方法，其中該聚核苷酸係選自下列所構成之群組： (a) 一核皆酸序列，由序列編號6、10、11、 12、 13、 14、 15、 27、 28、 41、 42 或 43 所提出； (b) 一核苷酸序列，其包括序列編號6、1 0、11、 12、 13、 14、 15、 27、 28、 41、 42 或 43 之一片段；· 44. 一種控制一耕種區域内雜草的方法，其包括對具有申請專利範圍第1 3或第1 4項之一植株的該耕種區域施加一 196 200817524 酸合成酶抑制劑。有效劑量的嘉磷塞與/或乙醯乳 197 200817524 序列表 <110> Cressman, Robert F. Jr. Guida, Anthony D. Jr. Hazel, Christine B. Hegstad, Jeffrey M. Henderson, Nancy L. Hondredv David Leysens, Nancy Li, Zhongsen Vogt, Mark Weber, Natalie N. Xing, Aiqui Zhong, Cathy Xiaoyan <120〉大豆轉殖品項3560.4.3.5與用來識別與/或偵測其之組合物與方法

<130〉 035718/329140 <150> 11/765,940 <151> 2007-Ό6-20 <150> 60/847,154 <151> 2006-09-26 <150〉 60/817,011 <151〉 2006-06-28 <160> 55 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 787 <212> DNA <213〉大豆

<220> <221> misc一feature <222> (0).7.(0) <223〉785鹼基對的轉殖品項3560.4.3.5之5’端基因體序列（SC36) <400〉 1 tataagtttc 60 caatttatct 120 gctagccact 180 tcaatcagta 240 cagatcctcc 300 gcaagctcca 360 accatatcgg 420 gactagcaga 480 tttcgaaatt 540 gctaaggaag 600 caccgcacca 660 gaaccggatt 720 tacgaaaaag 780 787 aaagttaaaa atatcactaa tacgtttcta aatgcatttt ttttagaaat tagcactcca ttggagttgt atagaactac tactaatcta ctattaataa cctccaaata tttaagtaaa ctgcatattt agagaatgtt ggacagtaaa caatatttag gtgctccccg aaagaggaaa gcaaacaagc caccagcact aagctagcca ctcaactcgc tctcttcaaa ttccctttta cattttattt acctagccaa gtaggtctca aaaggtttac cccgcatatg cttagtcgcc tataggttac tttgcgggct actgaataga atcttcggtg aaaggcgtct cgcaactatt gatcgagtgc gtgtatacca cgtgaatgcg acacccgaaa aaagtgcttc agcaacaaac tctcatcgtg agcagtgtct ctgctggcaa actaatatgc tgctctcgag atctccactt ccatcataca accgaaacca gagcgatcca taagaatcgc ctcgaatagc cataacctca tctcgccttc gcaagaggaa accgaattag agctgaaaga atactagagc catcgtagga cttgaccgat cgacttttgc ccgaggtcgt taggtcgaat aggctaggtt agactaa 200817524 <210〉 2 <211〉 845 <212> DNA <213〉大豆 <220> <221〉 misc_feature <222> (0).7. (0) <223〉845鹼基對的轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5之端基因體序列（glyatD32ALS) <400〉 2 cgcgtaatat catcattagg aagacactgc ccatcttgaa taggatttta gctactaaat 60 atgttgatgg tctttatgaa aaactattaa ctaggaatat tatgctaccc atatggaaag 120 aagacgctag gggaatagaa agaccatcaa ataaacgaag tcaacaccag gtcttccgaa 180 gcattaacaa ttacctattt aatatgtact cagtccgggt ggatatctca ctacattgac 240 gcagtttgtt caaagacgaa cgccctgaat tatgccatct gcttaggctt tcaaatatgg 300 tacgctctaa tgccaagcct tatgctggtc ttagggtatt atcatcaaat ctttaagcca 360 gaggtagtta aatacatcaa ggacaccata ggagtatggc acaacgatat tgtcaagatc 420 gcatcagatc taataggcaa taatgaattc ttcatgcagc ccgacgtggg aacgctcgaa 480 agcagtgggg cctctgggac agggaccaga cctgagtcgc taacatttgg gaataagaga 540 agtagatata cccaattttt taactagcca aggaaggaaa gcgggaaagg tccgatacaa 600 aggaaagggt tgcgaggctt aacgatttag aatatagctg ttgaggtggc acttgttccc 660 ccggggcggg ggtatatgcc cgtagcttta ttctgtcact tctttcagat caatgaagtt 720 gaaaagttat agagtaaggg acccttgttt acaaagctgt cactccaaga actcgaagtc 780 aagcatcttc gggaatatcc agattagtct tcaactagag aaaggatagg aatctccttt 840 gcaga 845 <210〉 3 <211〉 5362 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉轉殖品項3560 · 4.3 · 5的轉殖基因插入片段 <400〉 3 ggccgctcta gagatccgtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 180 aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 240 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 300 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatgat cctatgcgta 360 tggtatgacg tgtgttcaag atgatgactt caaacctacc tatgacgtat ggtatgacgt 420 gtgtcgactg atgacttaga tccactcgag cggctataaa tacgtaccta cgcaccctgc 480 gctaccatcc ctagagctgc agcttatttt tacaacaatt accaacaaca acaaacaaca 540 aacaacatta caattactat ttacaattac agtcgacccg ggatccacac gacaccatga 600 tagaggtgaa accgattaac gcagaggata cctatgaact aaggcataga atactcagac 660 caaaccagcc gatagaagcg tgtatgtttg aaagcgattt acttcgtggt gcatttcact 720 taggcggctt ttacaggggc aaactgattt ccatagcttc attccaccag gccgagcact 780 cggaactcca aggccagaaa cagtaccagc tccgaggtat ggctaccttg gaaggttatc 840 gtgagcagaa agcgggatca actctagtta aacacgctga agaaatcctt cgtaagaggg 900 gggcggacat gctttggtgt aatgcgagga catccgcctc aggctactac aaaaagttag 960 gcttcagcga gcagggagag atatttgaca cgccgccagt aggacctcac atcctgatgt 1020 ataaaaggat cacataacta gctagtcagt taacctagac ttgtccatct tctggattgg 1080 ccaacttaat taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct aatcactata 1140 -2- 200817524 atgtgggcat 1200 agatcatcca 1260 ccagatgcat 1320 atcaattggg 1380 tttgctctag 1440 taattatttt 1500 attttttaaa 1560 taataaatat 1620 cttgttctgt 1680 gtagaatctt 1740 gagtcagaac 1800 aggctggggt I860 ttcactctga 1920 caatctcgtt 1980 taaattggaa 2040 cactcgttca 2100 ctccctctac 2160 tttgccttgc 2220 tttaatatct 2280 cctttctttc 2340 ttgggccttg 2400 attgtacttg 2460 ttcaatttta 2520 cccttccttc 2580 attctattat 2640 aatttactgt 2700 cacacaacac 2760 accccacctt 2820 ccaaacccaa 2880 ccttcaccaa 2940 caaagttgtg tatttcttat ttcattaacc ttagcaaaac atcaaactca gggttaaata aaaatgtata atttttttta ttacaaaagc cttgtgagtg cagaagacaa tggctcaatt cttccccaat acttaggggc ctcaatgctc tatatctctc caaatcctag tttttcctca gcggaatacg ttttagctta tgctgactga tttgtctgta ttcgagtata aaatccagtt aacttttttt ttaggtacta aatggcggcc ccccaaacgc ccacgctctc ggaagcgccg tgttatgtgt cctaaatgaa aaatccatat aaatctagtc catccaaaca ttaatcatta aaattatatt atttcttaaa attcatcatt gtgtgggagt ataaaaagta ggttgctaca ctaagccgcg ttttccgtca ccctctaaac tgctcttctc attccgtggt actgggtcca cgtttgactt tgagaaataa gatggggttt gttttgtttt ggtcacaata tgtttgtata atggctgaaa actctaggct accgcttcca attactagat aaaatcaaat accacggagc aattactagt tgtcacgtgt acatataaat taggtgtgtt taacatggat tttttaagat attcatgatt aaatgttgca taatacatta aggcaacctg tgcaacaaac ttcaattttc gatgcaaacg ttaactcacc tcgtatcgct ttctcttcta tcaatttcgg tctaggatcc tcagatctag aatcactttt ggtgattaca gttttcttgt ggaattcaaa tatgtttaaa tttttgcatg tgttgtgcag gaaccacccg ccaccctccc gttccatctc ccttcgtgtc tatctgaata ctttataatt attaatcata ttgcgaattc atcttcctta attaattaag tttcatacat agacacttat aaaaatattt gcattgaaac aaatcaaaat aactcagtca gttgaatcta cctgccaccc tcagagttga cctctcaagg atcttgcact atgtgaaact tcgaaatcat tttttatttc gaattttagc ttctcataca ctttgagcag aaatgaaact tgtctttgct tttttgaagt attctcttct tctctctcat caaacccccc acggttcgcc aaagagaaag ctttgatgaa tataattaat gatatcaagc ccaatcatac aaattaaaag ttgattttga tagacatagt aatactaaca gagagaaaga caaagggcaa acggttgaga acccacaatc ggtttcccta gaccaagaca tacttttctt tctggtttgc ctactctttc ttcataattg aaaataaacc gaattttgta ttccttaggc gggaattaat tttgctttaa ctctgttgta ataaccatgc tcctcttcac caaaccctca acggcggcgc tccggcgaac -3- 200817524 ctcgcaaggg cgcggacatc cttgtggagg cgctggagag gcagggcgtg acgacggtgt 3000 tcgcgtaccc cggcggtgcg tcgatggaga tccaccaggc gctcacgcgc tccgccgcca 3060 tccgcaacgt gctcccgcgc cacgagcagg gcggcgtctt cgccgccgaa ggctacgcgc 3120 gttcctccgg cctccccggc gtctgcattg ccacctccgg ccccggcgcc accaacctcg 3180 tgagcggcct cgccgacgct ttaatggaca gcgtcccagt cgtcgccatc accggccagg 3240 tcgcccgccg gatgatcggc accgacgcct tccaagaaac cccgatcgtg gaggtgagca 3300 gatccatcac gaagcacaac tacctcatcc tcgacgtcga cgacatcccc cgcgtcgtcg 3360 ccgaggcttt cttcgtcgcc acctccggcc gccccggtcc ggtcctcatc gacattccca 3420 aagacgttca gcagcaactc gccgtgccta attgggacga gcccgttaac ctccccggtt 3480 acctcgccag gctgcccagg ccccccgccg aggcccaatt ggaacacatt gtcagactca 3540 tcatggaggc ccaaaagccc gttctctacg tcggcggtgg cagtttgaat tccagtgctg 3600 aattgaggcg ctttgttgaa ctcactggta ttcccgttgc tagcacttta atgggtcttg 3660 gaacttttcc tattggtgat gaatattccc ttcagatgct gggtatgcat ggtactgttt 3720 atgctaacta tgctgttgac aatagtgatt tgttgcttgc ctttggggta aggtttgatg 3780 accgtgttac tgggaagctt gaggcttttg ctagtagggc taagattgtt cacattgata 3840 ttgattctgc cgagattggg aagaacaagc aggcgcacgt gtcggtttgc gcggatttga 3900 agttggcctt gaagggaatt aatatgattt tggaggagaa aggagtggag ggtaagtttg 3960 atcttggagg ttggagagaa gagattaatg tgcagaaaca caagtttcca ttgggttaca 4020 agacattcca ggacgcgatt tctccgcagc atgctatcga ggttcttgat gagttgacta 4080 atggagatgc tattgttagt actggggttg ggcagcatca aatgtgggct gcgcagtttt 4140 acaagtacaa gagaccgagg cagtggttga cctcaggggg tcttggagcc atgggttttg 4200 gattgcctgc ggctattggt gctgctgttg ctaaccctgg ggctgttgtg gttgacattg 4260 atggggatgg tagtttcatc atgaatgttc aggagttggc cactataaga gtggagaatc 4320 tcccagttaa gatattgttg ttgaacaatc agcatttggg tatggtggtt cagttggagg 4380 ataggttcta caagtccaat agagctcaca cctatcttgg agatccgtct agcgagagcg 4440 agatattccc aaacatgctc aagtttgctg atgcttgtgg gataccggca gcgcgagtga 4500 cgaagaagga agagcttaga gcggcaattc agagaatgtt ggacacccct ggcccctacc 4560 ttcttgatgt cattgtgccc catcaggagc atgtgttgcc gatgattccc agtaatggat 4620 ccttcaagga tgtgataact gagggtgatg gtagaacgag gtactgattg cctagaccaa 4680 atgttccttg atgcttgttt tgtacaatat atataagata atgctgtcct agttgcagga 4740 -4- 200817524 ttttattttc gatatctcct atgtgctagt aagctaatgg gtagattcaa aacttgccat tttggcctgt ggtgagcatc atagtctgta gtagttttgg tagcaagaca 4800 cttttattta acttactaca tgcagtagca tctatctatc tctgtagtct 4860 gttgtctgta ttgtgccgtt ggattttttg ctgtagtgag actgaaaatg 4920 aataatattt ctgttagaaa tctaagtaga gaatctgttg aagaagtcaa 4980 aatcaggtta catattcaat gtttttcttt ttttagcggt tggtagacgt 5040 cttctcttgg agctcaccta ggcaatcagt aaaatgcata ttcctttttt 5100 ttatttactt ttagtggaaa ttgtgaccaa tttgttcatg tagaacggat ttggaccatt 5160 gcgtccacaa aacgtctctt ttgctcgatc ttcacaaagc gataccgaaa tccagagata 5220 gttttcaaaa gtcagaaatg gcaaagttat aaatagtaaa acagaataga tgctgtaatc 5280 gacttcaata acaagtggca tcacgtttct agttctagac ccatcagctg ggccggccac 5340

tagtgagctc ggtacccggg gg 5362 <210〉 4 <211> 3317 <212> DNA <213〉大豆 <220> <221> misc一feature <222〉（0).7.(0) <223>轉殖品項3560·4·3·5的5,端基因體序列 aaattttaat 60 atcttggctc 120 acagaatata 180 tagacaaatt 240 gagtaaagga 300 ctctgggtca 360 caaacctgag 420 cgactatacc 480 ccaaaactcg 540 actgatttac 600 ggaaaacaga 660 tacaaaaata Ί20 ttcaaggcta 780 aaaacaagaa 840 ttcaaagacc 900 atacaacctc 960 gatcctatag <400> 4 agcaattgtt tcgggttgat caaacaaatt tcaagggcac ctcatgccac ttcaagttgg tctacccaaa tcatccactc ttctcagtac ccaaaaagac aaatcatgat ccttatccca aatttccaac cagccaaggc tcttttacga caaatgacat gacaatgtgg 1020 ttgtgcattt tgtaaatcag tttgcaagat tttaaactct ctaaggcatc ccctaccaga aacctaaaat aggaatcccc aacactccag ttgggcagac tcaaaactcc acaaaagaca tgttttgtag atttccaccg attcatactg aaatttaaac aacaaatata ccaaatttca ctaaagacat ggcaagcaat ctacctaact aggcacccct gccaactatc aaaagggtca aaaaccttca gccctacaag attgcctcag aaacaatcca ccattaccaa atggagccaa ggcttccatt atagacacaa actcattcaa aatcaagcca atctgattta tttacagaaa attaagtgtt atcttacacg ctcaggggta aaaaagagtt tcaacccaaa acctcaaaac aaattggtct aatctaatga aaacgattgt aacctactaa aattttggga tcaaacctat actcagtgtc ccatccagat aacaattctt ttaaataaaa gacgtcaaaa tttgattttg tgaattctta gacgaagcac cttccgcatc tagtcaccat aaacaaaggc aaccaaactc tgaatttgaa caatccaaaa cagttatatt caaaaatccc ttccaccaat tattaaacac tttaaagttc tgtacccttt gttacactat tgggattatg tagatgcatg gaccaatgta ttctggcatc aaaataacaa 1080 attcaaacat tcttggctta tttatttcaa aactaacacc gtctataatt ttccaaattg 1140 gttcctccaa cggtgggact tttttggacc aaactttgat atctacccgg agcaagtcca 1200 -5- 200817524 acaagggttt gatcagttca aaaaaatgtt caattctcag gaatcacgaa tccctgtaga 1260 cctaaaatac ttttccaatt ttgcattgtc gtggatattt tcatggcaat acagatatgg 1320 gaaaactgaa aacaacaagc agtttccatc actgcaacat catgcattta tcaagtggtg 1380 gaattagttt gatacatcaa aagcagcacc agatcaagtg agaatctggt ttcaagccca 1440 tccagaattt ttgaaagttg ctaatcctga gacttcttta ttcctcaatc agaagtctca 1500 attagctgct ttcctttcta gttccaagtc aaaagaaatt ctggcacaaa atctaaaaga 1560 agtcctacag cttctccaac aagaagaaga taaaggctct tcctcaaaga aggaagataa 1620 caattcttca aaagaagatg acgacccttt ctaccaaaat gaaaatgatt gttttggtat 1680 ttctctaaat gatgattaat taaaaaatta catgtactat gtaaatagtt tcggtcacga 1740 aactggcact gtagctacag taaattttat ggctatttaa ggagttctcg gcccatttgt 1800 Γ

gaggtacctt ttcaggtagt cagatctcta tttttagaga gagaaactct aggaaacaat I860 ctttgtaagt ttttctttcg atttcaataa attcaaagtt ttctcttcat atctcttctc 1920 cctcttgacc ggtcctgtgc ggttctgcca tcgcttcagt ttcttctctt ctctcccctt 1980 atcgatattg tgtggctcta ttgccacttc gatttctttt atgttgcttt cattttaatt 2040 tgttttacca ttttcttttg atattataat ttctatttaa ctcttggtca tactgcatat 2100 attcataata tattcttaca tcctatctat ccgtttgatc tcttttcact gttatatata 2160 tatatatata tatatatatc gtttaacttc atgttagtaa taagattaga gtaaaaaata 2220 tatatataac gaagttattt taacaaaagg tatttttgta aaaaaaaatt atatgctaaa 2280 aaagttttac tatatctaag catgattttt tttaattccc aaaacacgtg taaatatttt 2340 taggaatatt ttgtaaaaaa tcaaacattt ttttaattat tcgtataaaa catcaatctt 2400 taagaatcat aatttttaga aatcatgatt tctggatata aaaatacttt ttcttgcagc 2460 caaacgtctt ctaaagccac atgttaatgg gtgtacaaat tataaagttt ttataaacat 2520 atcacttttt aaagttaaaa atatcactaa tacgtttcta aatgcatttt ttttagaaat 2580 tataagtttc tagcactcca ttggagttgt atagaactac tactaatcta ctattaataa 2640 caatttatct cctccaaata tttaagtaaa ctgcatattt agagaatgtt ggacagtaaa 2700 gctagccact caatatttag gtgctccccg aaagaggaaa gcaaacaagc caccagcact 2760 tcaatcagta aagctagcca ctcaactcgc tctcttcaaa ttccctttta cattttattt 2820 cagatcctcc acctagccaa gtaggtctca aaaggtttac cccgcatatg cttagtcgcc 2880 gcaagctcca tataggttac tttgcgggct actgaataga atcttcggtg aaaggcgtct 2940 accatatcgg cgcaactatt gatcgagtgc gtgtatacca cgtgaatgcg acacccgaaa 3000 -6- 200817524 agcaacaaac tctcatcgtg agcagtgtct ctgctggcaa tgctctcgag atctccactt ccatcataca accgaaacca taagaatcgc ctcgaatagc cataacctca tctcgccttc accgaattag agctgaaaga atactagagc catcgtagga cgacttttgc ccgaggtcgt taggtcgaat aggctaggtt <210〉 5 <211〉 2170 <212> DNA <213〉大豆 <220> <221> misc—feature

aaagtgcttc actaatatgc gagcgatcca gcaagaggaa cttgaccgat agactaa gactagcaga 3060 tttcgaaatt 3120 gctaaggaag 3180 caccgcacca 3240 gaaccggatt 3300 tacgaaaaag 3317 <222> (0).7. (0) <223〉轉殖品項3560· 4· 3· 5的3,端基因體序列

catcattagg tctttatgaa gggaatagaa ttacctattt caaagacgaa tgccaagcct aatacatcaa taataggcaa cctctgggac cccaattttt tgcgaggctt ggtatatgcc agagtaaggg gggaatatcc cttctcctgc taattccgtt taataaatga ccttcgggaa aaaaaccgaa atctattgga aggtggaacc aatgcgtaca gcatgaaaaa <400> 5 cgcgtaatat atgttgatgg aagacgctag gcattaacaa gcagtttgtt tacgctctaa gaggtagtta gcatcagatc agcagtgggg agtagatata aggaaagggt ccggggcggg gaaaagttat aagcatcttc gcagagtttt tttatttaat cgagtaccaa 1020 agcccagccg 1080 tgtgattaga 1140 cccactttaa 1200 attatgggtt 1260 acaattctca 1320 ggatgctcgt 1380 aagacactgc aaactattaa agaccatcaa aatatgtact cgccctgaat tatgctggtc ggacaccata taatgaattc agggaccaga taactagcca aacgatttag cgtagcttta acccttgttt agattagtct tgatgtagcg gatagagctt attcaccaga gacctatctt aagtggaccg tagagccctc tgaaactagc agactttctt gggctttgat ccatcttgaa ctaggaatat ataaacgaag cagtccgggt tatgccatct ttagggtatt ggagtatggc ttcatgcagc cctgagtcgc aggaaggaaa aatatagctg ttctgtcact acaaagctgt tcaactagag gtaaagtcaa ttgagcggat ctaagagaag cgtcgggagg gcctagtaac agcccagggc acttacaaat ccttctttgt ctattcacca taggatttta tatgctaccc tcaacaccag ggatatctca gcttaggctt atcatcaaat acaacgatat ccgacgtggg taacatttgg gcgggaaagg ttgaggtggc tctttcagat cactccaaga aaaggatagg aagttggatg gcaagcacta aaaacagaac aagagccctc caatagagcg aagcgattga gagttagcaa ttaagaggcc cttatataat gctactaaat 60 atatggaaag 120 gtcttccgaa 180 ctacattgac 240 tcaaatatgg 300 ctttaagcca 360 tgtcaagatc 420 aacgctcgaa 480 gaataagaga 540 tccgatacaa 600 acttgttccc 660 caatgaagtt 720 actcgaagtc 780 aatctccttt 840 cccttttttc 900 gattcttcaa 960 aaaaagatta tttacaccat gggcttgatc attctatttg aaggaaaaag agtctgcgat agagccaatc tctgcaggac aagatatcta ttttgtcatt gggaagtaag gcttaagtcg acgaaaaagt 1440 taggaaaggg gatcatatgg ctagggttgc cctcggggct caagggttta gcgatgaaga 1500 gtgccaagca aaaggtcaat accggtacgc cgatcaaaga agtccagtgg caaggccctt 1560 -7- 200817524

tcagccaagc 1620 gtcattcgtg 1680 aagagaggac 1740 ccctcccttc 1800 ggagtgacgg I860 cacagcgtat 1920 gcaagcaagt 1980 gcggaaaaaa 2040 atgggtcgat 2100 . agggctaaaa 2160 tcggaaataa 2170 tagcgtgctg tgacaacatc tcgttatggc ttattgattt tttagtttag acgcgacatc tatctgttcg cacggtcttt gacgaaaaag tgaactttca aacagaaagt aggatctcgt gcacctcttt gataaagggc gctttagatg cctatgtata cggacaagct cgtggaagtt acggggaaaa tccaaaaaga cgtagagtga cgaaagacct ttagcagtct tttgtccact ccactgcgaa cacaatcctt ctctggatga ggtcgatttg tgatcaactg ccgagaaaac tgacagcttc cctctgccta cgtcaataag ccctctcttc agactctaga tcaagcagct caaaaaacat aagtcgcttt tcacattttg gctccactgg ttcttcttga tctctcccgc ataagattgc ttagccgagc gatccactct aggacagcta gctctttcat atgagtgaaa atgccagttt caggatccga <210〉 6 <211〉 10849 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉轉殖品項35 60.4 · 3.5的轉殖基因插入片段加上5，端與3，端的基因體鄰近序列 <400> 6 agcaattgtt ttgtgcattt ccaaatttca atctgattta ttaaataaaa aaattttaat 60 tcgggttgat tgtaaatcag ctaaagacat tttacagaaa gacgtcaaaa atcttggctc 120 caaacaaatt tttgcaagat ggcaagcaat attaagtgtt tttgattttg acagaatata 180 tcaagggcac tttaaactct ctacctaact atcttacacg tgaattctta tagacaaatt 240 ctcatgccac ctaaggcatc aggcacccct ctcaggggta gacgaagcac gagtaaagga 300 ttcaagttgg ccctaccaga gccaactatc aaaaagagtt cttccgcatc ctctgggtca 360 tctacccaaa aacctaaaat aaaagggtca tcaacccaaa tagtcaccat caaacctgag 420 tcatccactc aggaatcccc aaaaccttca acctcaaaac aaacaaaggc cgactatacc 480

ttctcagtac aacactccag gccctacaag aaattggtct aaccaaactc ccaaaactcg 540 ccaaaaagac ttgggcagac attgcctcag aatctaatga tgaatttgaa actgatttac 600 aaatcatgat tcaaaactcc aaacaatcca aaacgattgt caatccaaaa ggaaaacaga 660 ccttatccca acaaaagaca ccattaccaa aacctactaa cagttatatt tacaaaaata 720 aatttccaac tgttttgtag atggagccaa aattttggga caaaaatccc ttcaaggcta 780 cagccaaggc atttccaccg ggcttccatt tcaaacctat ttccaccaat aaaacaagaa 840 tcttttacga attcatactg atagacacaa actcagtgtc tattaaacac ttcaaagacc 900 caaatgacat aaatttaaac actcattcaa ccatccagat tttaaagttc atacaacctc 960 gacaatgtgg aacaaatata aatcaagcca aacaattctt tgtacccttt gatcctatag 1020 gttacactat tgggattatg tagatgcatg gaccaatgta ttctggcatc aaaataacaa 1080 attcaaacat tcttggctta tttatttcaa aactaacacc gtctataatt ttccaaattg 1140 gttcctccaa cggtgggact tttttggacc aaactttgat atctacccgg agcaagtcca 1200 acaagggttt gatcagttca aaaaaatgtt caattctcag gaatcacgaa tccctgtaga 1260 cctaaaatac ttttccaatt ttgcattgtc gtggatattt tcatggcaat acagatatgg 1320 -8- 200817524 gaaaactgaa aacaacaagc agtttccatc actgcaacat catgcattta tcaagtggtg 1380 gaattagttt gatacatcaa aagcagcacc agatcaagtg agaatctggt ttcaagccca 1440 tccagaattt ttgaaagttg ctaatcctga gacttcttta ttcctcaatc agaagtctca 1500 attagctgct ttcctttcta gttccaagtc aaaagaaatt ctggcacaaa atctaaaaga 1560 agtcctacag cttctccaac aagaagaaga taaaggctct tcctcaaaga aggaagataa 1620 caattcttca aaagaagatg acgacccttt ctaccaaaat gaaaatgatt gttttggtat 1680 ttctctaaat gatgattaat taaaaaatta catgtactat gtaaatagtt tcggtcacga 1740 aactggcact gtagctacag taaattttat ggctatttaa ggagttctcg gcccatttgt 1800 gaggtacctt ttcaggtagt cagatctcta tttttagaga gagaaactct aggaaacaat I860 ctttgtaagt ttttctttcg atttcaataa attcaaagtt ttctcttcat atctcttctc 1920

cctcttgacc ggtcctgtgc ggttctgcca tcgcttcagt ttcttctctt ctctcccctt 1980 atcgatattg tgtggctcta ttgccacttc gatttctttt atgttgcttt cattttaatt 2040 tgttttacca ttttcttttg atattataat ttctatttaa ctcttggtca tactgcatat 2100 attcataata tattcttaca tcctatctat ccgtttgatc tcttttcact gttatatata 2160 tatatatata tatatatatc gtttaacttc atgttagtaa taagattaga gtaaaaaata 2220 tatatataac gaagttattt taacaaaagg tatttttgta aaaaaaaatt atatgctaaa 2280 aaagttttac tatatctaag catgattttt tttaattccc aaaacacgtg taaatatttt 2340 taggaatatt ttgtaaaaaa tcaaacattt ttttaattat tcgtataaaa catcaatctt 2400 taagaatcat aatttttaga aatcatgatt tctggatata aaaatacttt ttcttgcagc 2460 caaacgtctt ctaaagccac atgttaatgg gtgtacaaat tataaagttt ttataaacat 2520 atcacttttt aaagttaaaa atatcactaa tacgtttcta aatgcatttt ttttagaaat 2580 tataagtttc tagcactcca ttggagttgt atagaactac tactaatcta ctattaataa 2640 caatttatct cctccaaata tttaagtaaa ctgcatattt agagaatgtt ggacagtaaa 2700 gctagccact caatatttag gtgctccccg aaagaggaaa gcaaacaagc caccagcact 2760 tcaatcagta aagctagcca ctcaactcgc tctcttcaaa ttccctttta cattttattt 2820 cagatcctcc acctagccaa gtaggtctca aaaggtttac cccgcatatg cttagtcgcc 2880 gcaagctcca tataggttac tttgcgggct actgaataga atcttcggtg aaaggcgtct 2940 accatatcgg cgcaactatt gatcgagtgc gtgtatacca cgtgaatgcg acacccgaaa 3000 gactagcaga aaagtgcttc agcaacaaac tctcatcgtg agcagtgtct ctgctggcaa 3060 tttcgaaatt actaatatgc tgctctcgag atctccactt ccatcataca accgaaacca 3120 -9- 200817524 gctaaggaag gagcgatcca taagaatcgc ctcgaatagc cataacctca tctcgccttc 3180 caccgcacca gcaagaggaa accgaattag agctgaaaga atactagagc catcgtagga 3240 gaaccggatt cttgaccgat cgacttttgc ccgaggtcgt taggtcgaat aggctaggtt 3300 tacgaaaaag agactaaggc cgctctagag atccgtcaac atggtggagc acgacactct 3360 cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt 3420 tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 3480 catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 3540 aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 3600 gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 3660 tgatgatcct atgcgtatgg tatgacgtgt gttcaagatg atgacttcaa acctacctat 3720

gacgtatggt atgacgtgtg tcgactgatg acttagatcc actcgagcgg ctataaatac 3780 gtacctacgc accctgcgct accatcccta gagctgcagc ttatttttac aacaattacc 3840 aacaacaaca aacaacaaac aacattacaa ttactattta caattacagt cgacccggga 3900 tccacacgac accatgatag aggtgaaacc gattaacgca gaggatacct atgaactaag 3960 gcatagaata ctcagaccaa accagccgat agaagcgtgt atgtttgaaa gcgatttact 4020 tcgtggtgca tttcacttag gcggctttta caggggcaaa ctgatttcca tagcttcatt 4080 ccaccaggcc gagcactcgg aactccaagg ccagaaacag taccagctcc gaggtatggc 4140 taccttggaa ggttatcgtg agcagaaagc gggatcaact ctagttaaac acgctgaaga 4200 aatccttcgt aagagggggg cggacatgct ttggtgtaat gcgaggacat ccgcctcagg 4260 ctactacaaa aagttaggct tcagcgagca gggagagata tttgacacgc cgccagtagg 4320

acctcacatc ctgatgtata aaaggatcac ataactagct agtcagttaa cctagacttg 4380 tccatcttct ggattggcca acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacatagtg 4440 acatgctaat cactataatg tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat tactagttat 4500 ctgaataaaa 4560 tataattctt 4620 aatcatatat 4680 cgaattcgat 4740 ttccttacca 4800 aattaagaaa 4860 catacatttg 4920 gagaaagaga tgatgaacca aattaatatc atcaagcttt atcatactaa ttaaaagatt attttgataa tcatccatat gatgcatttc aattgggtta gctctagatc ttattttggg ttttaaaaaa taaatatatt ttcttatcct attaaccaaa gcaaaacaaa aaactcacat ttaaatatta atgtataaaa ttttttaatt aaatgaatgt tccatataca tctagtctag ccaaacataa atcattattt ttatattatt tcttaaaaaa cacgtgtctt tataaatatt gtgtgttttg catggatatc ttaagatatt catgattttt tgttgcaaga 4a 200817524 cacttattag acatagtctt gttctgttta caaaagcatt catcatttaa tacattaaaa 4980 aatatttaat actaacagta gaatcttctt gtgagtggtg tgggagtagg caacctggca 5040 ttgaaacgag agaaagagag tcagaaccag aagacaaata aaaagtatgc aacaaacaaa 5100 tcaaaatcaa agggcaaagg ctggggttgg ctcaattggt tgctacattc aattttcaac 5160 tcagtcaacg gttgagattc actctgactt ccccaatcta agccgcggat gcaaacggtt 5220 gaatctaacc cacaatccaa tctcgttact taggggcttt tccgtcatta actcacccct 5280 gccacccggt ttccctataa attggaactc aatgctcccc tctaaactcg tatcgcttca 5340 gagttgagac caagacacac tcgttcatat atctctctgc tcttctcttc tcttctacct 5400 ctcaaggtac ttttcttctc cctctaccaa atcctagatt ccgtggttca atttcggatc 5460 ttgcacttct ggtttgcttt gccttgcttt ttcctcaact gggtccatct aggatccatg 5520

tgaaactcta ctctttcttt aatatctgcg gaatacgcgt ttgactttca gatctagtcg 5580 aaatcatttc ataattgcct ttctttcttt tagcttatga gaaataaaat cacttttttt 5640 ttatttcaaa ataaaccttg ggccttgtgc tgactgagat ggggtttggt gattacagaa 5700 ttttagcgaa ttttgtaatt gtacttgttt gtctgtagtt ttgttttgtt ttcttgtttc 5760 tcatacattc cttaggcttc aattttattc gagtataggt cacaatagga attcaaactt 5820 tgagcagggg aattaatccc ttccttcaaa tccagtttgt ttgtatatat gtttaaaaaa 5880 tgaaactttt gctttaaatt ctattataac tttttttatg gctgaaattt ttgcatgtgt 5940 ctttgctctc tgttgtaaat ttactgttta ggtactaact ctaggcttgt tgtgcagttt 6000 ttgaagtata accatgccac acaacacaat ggcggccacc gcttccagaa ccacccgatt 6060 ctcttcttcc tcttcacacc ccaccttccc caaacgcatt actagatcca ccctccctct 6120 ctctcatcaa accctcacca aacccaacca cgctctcaaa atcaaatgtt ccatctccaa 6180 accccccacg gcggcgccct tcaccaagga agcgccgacc acggagccct tcgtgtcacg 6240 gttcgcctcc ggcgaacctc gcaagggcgc ggacatcctt gtggaggcgc tggagaggca 6300 gggcgtgacg acggtgttcg cgtaccccgg cggtgcgtcg atggagatcc accaggcgct 6360 cacgcgctcc gccgccatcc gcaacgtgct cccgcgccac gagcagggcg gcgtcttcgc 6420 cgccgaaggc tacgcgcgtt cctccggcct ccccggcgtc tgcattgcca cctccggccc 6480 cggcgccacc aacctcgtga gcggcctcgc cgacgcttta atggacagcg tcccagtcgt 6540 cgccatcacc ggccaggtcg cccgccggat gatcggcacc gacgccttcc aagaaacccc 6600 gatcgtggag gtgagcagat ccatcacgaa gcacaactac ctcatcctcg acgtcgacga 6660 catcccccgc gtcgtcgccg aggctttctt cgtcgccacc tccggccgcc ccggtccggt 6720 200817524 ί

cctcatcgac attcccaaag 6780 cgttaacctc cccggttacc 6840 acacattgtc agactcatca 6900 tttgaattcc agtgctgaat 6960 cactttaatg ggtcttggaa 7020 tatgcatggt actgtttatg 7080 tggggtaagg tttgatgacc 7140 gattgttcac attgatattg 7200 ggtttgcgcg gatttgaagt 7260 agtggagggt aagtttgatc 7320 gtttccattg ggttacaaga 7380 tcttgatgag ttgactaatg 7440 gtgggctgcg cagttttaca 7500 tggagccatg ggttttggat 7560 tgttgtggtt gacattgatg 7620 tataagagtg gagaatctcc 7680 ggtggttcag ttggaggata 7740 tccgtctagc gagagcgaga 7800 accggcagcg cgagtgacga 7860 cacccctggc ccctaccttc 7920 gattcccagt aatggatcct 7980 ctgattgcct agaccaaatg 8040 ctgtcctagt tgcaggattt 8100 caagacattt tattttcctt 8160 gtagtctgat atctcctgtt 8220 gaaaatgatg tgctagtaat 8280 sagtcaasag eta彐tggsat 8340 tagacgtgta gattcaactt 8400 cttttttaac ttgccattta 8460 aacggatttg gaccattgcg 8520 acgttcagca gcaactcgcc tcgccaggct gcccaggccc tggaggccca aaagcccgtt tgaggegett tgttgaactc cttttcctat tggtgatgaa ctaactatgc tgttgacaat gtgttactgg gaagettgag attetgeega gattgggaag tggccttgaa gggaattaat ttggaggttg gagagaagag cattccagga egegatttet gagatgetat tgttagtact agtacaagag accgaggcag tgcctgcggc tattggtgct gggatggtag tttcatcatg cagttaagat attgttgttg ggttctacaa gtccaataga tattcccaaa catgctcaag agaaggaaga gettagageg ttgatgtcat tgtgccccat tcaaggatgt gataactgag ttccttgatg cttgttttgt ggcctgtggt gagcatcata ttatttaact tactacatgc gtctgtattg tgccgttgga aatatttctg ttagaaatct caggttacat attcaatgtt ctcttggagc tcacctaggc tttactttta gtggaaattg tccacaaaac gtctcttttg gtgcctaatt gggaegagee cccgccgagg cccaattgga ctctacgtcg gcggtggcag actggtattc ccgttgctag tattcccttc agatgctggg agtgatttgt tgettgeett gcttttgcta gtagggctaa aacaagcagg cgcacgtgtc atgattttgg aggagaaagg attaatgtgc agaaacacaa ccgcagcatg etategaggt ggggttgggc agcatcaaat tggttgacct cagggggtct gctgttgcta accctggggc aatgttcagg agttggccac aacaatcagc atttgggtat gctcacacct atettggaga tttgctgatg cttgtgggat gcaattcaga gaatgttgga caggagcatg tgttgccgat ggtgatggta gaacgaggta acaatatata taagataatg gtctgtagta gttttggtag agtageatet atetatetet ttttttgctg tagtgagact aagtagagaa tctgttgaag tttctttttt tagcggttgg aatcagtaaa atgeatatte tgaccaattt gttcatgtag ctcgatcttc acaaagcgat 42 200817524 ttcaaaagtc agaaatggca aagttataaa tagtaaaaca ttcaataaca agtggcatca cgtttctagt tctagaccca tgagctcggt acccgggggc gcgtaatatc atcattagga aggattttag ctactaaata tgttgatggt ctttatgaaa atgctaccca tatggaaaga agacgctagg ggaatagaaa gaccatcaaa taaacgaagt caacaccagg tcttccgaag cattaacaat tacctattta 8880 atatgtactc agtccgggtg gatatctcac tacattgacg cagtttgttc aaagacgaac 8940 gccctgaatt atgccatctg cttaggcttt caaatatggt acgctctaat gccaagcctt 9000 atgctggtct tagggtatta tcatcaaatc tttaagccag aggtagttaa atacatcaag 9060 gacaccatag gagtatggca caacgatatt gtcaagatcg catcagatct aataggcaat 9120

aatgaattct tcatgcagcc cgacgtggga acgctcgaaa gcagtggggc ctctgggaca 9180 gggaccagac ctgagtcgct aacatttggg aataagagaa gtagatatac ccaatttttt 9240 aactagccaa ggaaggaaag cgggaaaggt ccgatacaaa ggaaagggtt gcgaggctta 9300 acgatttaga atatagctgt tgaggtggca cttgttcccc cggggcgggg gtatatgccc 9360 gtagctttat tctgtcactt ctttcagatc aatgaagttg aaaagttata gagtaaggga 9420 cccttgttta caaagctgtc actccaagaa ctcgaagtca agcatcttcg ggaatatcca 9480 gattagtctt caactagaga aaggatagga atctcctttg cagagttttc ttctcctgct 9540 gatgtagcgg taaagtcaaa agttggatgc ccttttttct ttatttaatt 9600 atagagcttt tgagcggatg caagcactag attcttcaac gagtaccaat 9660 ttcaccagac taagagaaga aaacagaaca aaaagattaa gcccagccgc 9720

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<210〉 7 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子 <400> 7 ggtcgaatag gctaggttta cgaa <210〉 8 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子 <400> 8 ccaccatgtt gacggatctc t <210> 9 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子 <400> 9 aagagactaa ggccgctc <210〉 10 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 24 21 44 18 <220〉 200817524 <223〉轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5的接合處DNA (10核苷酸的5丨端基因體/10核苷酸的轉殖基因插入片段） <400> 10 aagagactaa ggccgctcta 2〇 <210〉 11 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5的接合處DNA(10核苷酸的3，端基因體/10核苷酸的轉殖基因插入片段） <400> 11 tacccggggg cgcgtaatat 20

( <210〉 12 <2li> 40 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5的接合處DNA (20核苷酸的5，端基因體/20核苷酸的轉殖基因插入片段） <400〉 12 gtttacgaaa aagagactaa ggccgctcta gagatccgtc 40 <210〉 13 <211> 40 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5的接合處DNA (20核苷酸的3，端基因體/20核苷酸的轉殖基因插入片段） <400> 13 gtgagctcgg tacccggggg cgcgtaatat catcattagg 40 <210〉 14 <211〉 8679 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 5'端基因體序列與完整的轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5轉殖基因插入片段 <400> 14 agcaattgtt tcgggttgat caaacaaatt tcaagggcac ctcatgccac ttcaagttgg tctacccaaa tcatccactc ttgtgcattt tgtaaatcag tttgcaagat tttaaactct ctaaggcatc ccctaccaga aacctaaaat aggaatcccc ccaaatttca ctaaagacat ggcaagcaat ctacctaact aggcacccct gccaactatc aaaagggtca aaaaccttca atctgattta tttacagaaa attaagtgtt atcttacacg ctcaggggta aaaaagagtt tcaacccaaa acctcaaaac ttaaataaaa gacgtcaaaa tttgattttg tgaattctta gacgaagcac cttccgcatc tagtcaccat aaacaaaggc aaattttaat 60 atcttggctc 120 acagaatata 180 tagacaaatt 240 gagtaaagga 300 ctctgggtca 360 caaacctgag 420 cgactatacc 480 45 200817524 ccaaaactcg 540 actgatttac 600 ggaaaacaga 660 tacaaaaata 720 ttcaaggcta 780 aaaacaagaa 840 ttcaaagacc 900 atacaacctc 960 gatcctatag aaaataacaa ttccaaattg ttctcagtac aacactccag gccctacaag aaattggtct aaccaaactc ccaaaaagac ttgggcagac attgcctcag aatctaatga tgaatttgaa aaatcatgat tcaaaactcc aaacaatcca aaacgattgt caatccaaaa ccttatccca acaaaagaca ccattaccaa aacctactaa cagttatatt aatttccaac tgttttgtag atggagccaa aattttggga caaaaatccc cagccaaggc atttccaccg ggcttccatt tcaaacctat ttccaccaat tcttttacga attcatactg atagacacaa actcagtgtc tattaaacac caaatgacat aaatttaaac actcattcaa ccatccagat tttaaagttc gacaatgtgg aacaaatata aatcaagcca aacaattctt tgtacccttt 1020 gttacactat tgggattatg tagatgcatg gaccaatgta ttctggcatc 1080 attcaaacat tcttggctta tttatttcaa aactaacacc gtctataatt 1140 gttcctccaa cggtgggact tttttggacc aaactttgat atctacccgg agcaagtcca 1200 acaagggttt gatcagttca aaaaaatgtt caattctcag gaatcacgaa tccctgtaga 1260 cctaaaatac ttttccaatt ttgcattgtc gtggatattt tcatggcaat acagatatgg 1320

gaaaactgaa aacaacaagc agtttccatc actgcaacat catgcattta tcaagtggtg 1380 gaattagttt gatacatcaa aagcagcacc agatcaagtg agaatctggt ttcaagccca 1440 tccagaattt ttgaaagttg ctaatcctga gacttcttta ttcctcaatc agaagtctca 1500 attagctgct ttcctttcta gttccaagtc aaaagaaatt ctggcacaaa atctaaaaga 1560 agtcctacag cttctccaac aagaagaaga taaaggctct tcctcaaaga aggaagataa 1620 caattcttca aaagaagatg acgacccttt ctaccaaaat gaaaatgatt gttttggtat 1680 ttctctaaat gatgattaat taaaaaatta catgtactat gtaaatagtt tcggtcacga 1740 aactggcact gtagctacag taaattttat ggctatttaa ggagttctcg gcccatttgt 1800 aggaaacaat atctcttctc ctctcccctt cattttaatt gaggtacctt ttcaggtagt cagatctcta tttttagaga gagaaactct 1860 ctttgtaagt ttttctttcg atttcaataa attcaaagtt ttctcttcat 1920 cctcttgacc ggtcctgtgc ggttctgcca tcgcttcagt ttcttctctt 1980 atcgatattg tgtggctcta ttgccacttc gatttctttt atgttgcttt 2040 tgttttacca ttttcttttg atattataat ttctatttaa ctcttggtca tactgcatat 2100 attcataata tattcttaca tcctatctat ccgtttgatc tcttttcact gttatatata 2160 tatatatata tatatatatc gtttaacttc atgttagtaa taagattaga gtaaaaaata 2220 tatatataac gaagttattt taacaaaagg tatttttgta aaaaaaaatt atatgctaaa 2280 aaaacacgtg taaatatttt tcgtataaaa catcaatctt aaaatacttt ttcttgcagc tataaagttt ttataaacat aaagttttac tatatctaag catgattttt tttaattccc 2340 taggaatatt ttgtaaaaaa tcaaacattt ttttaattat 2400 taagaatcat aatttttaga aatcatgatt tctggatata 2460 caaacgtctt ctaaagccac atgttaatgg gtgtacaaat 2520 46 200817524 atcacttttt aaagttaaaa atatcactaa tacgtttcta aatgcatttt ttttagaaat 2580 tataagtttc tagcactcca ttggagttgt atagaactac tactaatcta ctattaataa 2640 caatttatct cctccaaata tttaagtaaa ctgcatattt agagaatgtt ggacagtaaa 2700 gctagccact caatatttag gtgctccccg aaagaggaaa gcaaacaagc caccagcact 2760 tcaatcagta aagctagcca ctcaactcgc tctcttcaaa ttccctttta cattttattt 2820 cagatcctcc acctagccaa gtaggtctca aaaggtttac cccgcatatg cttagtcgcc 2880 gcaagctcca tataggttac tttgcgggct actgaataga atcttcggtg aaaggcgtct 2940 accatatcgg cgcaactatt gatcgagtgc gtgtatacca cgtgaatgcg acacccgaaa 3000 gactagcaga aaagtgcttc agcaacaaac tctcatcgtg agcagtgtct ctgctggcaa 3060 tttcgaaatt actaatatgc tgctctcgag atctccactt ccatcataca accgaaacca 3120

gctaaggaag gagcgatcca taagaatcgc ctcgaatagc cataacctca tctcgccttc 3180 caccgcacca gcaagaggaa accgaattag agctgaaaga atactagagc catcgtagga 3240 gaaccggatt cttgaccgat cgacttttgc ccgaggtcgt taggtcgaat aggctaggtt 3300 tacgaaaaag agactaaggc cgctctagag atccgtcaac atggtggagc acgacactct 3360 cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt 3420 tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 3480 catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 3540 aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 3600 gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 3660 tgatgatcct atgcgtatgg tatgacgtgt gttcaagatg atgacttcaa acctacctat 3720 gacgtatggt atgacgtgtg tcgactgatg acttagatcc actcgagcgg ctataaatac 3780 gtacctacgc accctgcgct accatcccta gagctgcagc ttatttttac aacaattacc 3840 aacaacaaca aacaacaaac aacattacaa ttactattta caattacagt cgacccggga 3900 tccacacgac accatgatag aggtgaaacc gattaacgca gaggatacct atgaactaag 3960 . gcatagaata ctcagaccaa accagccgat agaagcgtgt atgtttgaaa gcgatttact 4020 tcgtggtgca tttcacttag gcggctttta caggggcaaa ctgatttcca tagcttcatt 4080 ccaccaggcc gagcactcgg aactccaagg ccagaaacag taccagctcc gaggtatggc 4140 taccttggaa ggttatcgtg agcagaaagc gggatcaact ctagttaaac acgctgaaga 4200 aatccttcgt aagagggggg cggacatgct ttggtgtaat gcgaggacat ccgcctcagg 4260 ctactacaaa aagttaggct tcagcgagca gggagagata tttgacacgc cgccagtagg 4320 47 200817524 acctcacatc ctgatgtata aaaggatcac ataactagct agtcagttaa cctagacttg 4380 tccatcttct ggattggcca acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc acacatagtg 4440 acatgctaat cactataatg tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat tactagttat 4500 ctgaataaaa gagaaagaga tcatccatat ttcttatcct aaatgaatgt cacgtgtctt 4560 tataattctt tgatgaacca gatgcatttc attaaccaaa tccatataca tataaatatt 4620 aatcatatat aattaatatc aattgggtta gcaaaacaaa tctagtctag gtgtgttttg 4680 catggatatc ttaagatatt catgattttt tgttgcaaga tacattaaaa cgaattcgat atcaagcttt gctctagatc aaactcacat ccaaacataa 4740 ttccttacca atcatactaa ttattttggg ttaaatatta atcattattt 4800 aattaagaaa ttaaaagatt ttttaaaaaa atgtataaaa ttatattatt 4860 catacatttg attttgataa taaatatatt ttttttaatt tcttaaaaaa 4920

C cacttattag acatagtctt gttctgttta caaaagcatt catcatttaa 4 980 aatatttaat actaacagta gaatcttctt gtgagtggtg tgggagtagg caacctggca 5040 ttgaaacgag agaaagagag tcagaaccag aagacaaata aaaagtatgc aacaaacaaa 5100 tcaaaatcaa agggcaaagg ctggggttgg ctcaattggt tgctacattc aattttcaac 5160 tcagtcaacg gttgagattc actctgactt ccccaatcta agccgcggat gcaaacggtt 5220 gaatctaacc cacaatccaa tctcgttact taggggcttt tccgtcatta actcacccct 5280 gccacccggt ttccctataa attggaactc aatgctcccc tctaaactcg tatcgcttca 5340 gagttgagac caagacacac tcgttcatat atctctctgc tcttctcttc tcttctacct 5400 ctcaaggtac ttttcttctc cctctaccaa atcctagatt ccgtggttca atttcggatc 5460 ttgcacttct ggtttgcttt gccttgcttt ttcctcaact gggtccatct aggatccatg 5520 tgaaactcta ctctttcttt aatatctgcg gaatacgcgt ttgactttca gatctagtcg 5580 aaatcatttc ataattgcct ttctttcttt tagcttatga gaaataaaat cacttttttt 5640 ttatttcaaa ataaaccttg ggccttgtgc tgactgagat ggggtttggt gattacagaa 5700 ttttagcgaa ttttgtaatt gtacttgttt gtctgtagtt ttgttttgtt ttcttgtttc 5760 tcatacattc cttaggcttc aattttattc gagtataggt cacaatagga attcaaactt 5820 tgagcagggg aattaatccc ttccttcaaa tccagtttgt ttgtatatat gtttaaaaaa 5880 tgaaactttt gctttaaatt ctattataac tttttttatg gctgaaattt ttgcatgtgt 5940 ctttgctctc tgttgtaaat ttactgttta ggtactaact ctaggcttgt tgtgcagttt 6000 ttgaagtata accatgccac acaacacaat ggcggccacc gcttccagaa ccacccgatt 6060 ctcttcttcc tcttcacacc ccaccttccc caaacgcatt actagatcca ccctccctct 6120 200817524 ccatctccaa tcgtgtcacg tggagaggca accaggcgct ctctcatcaa accctcacca aacccaacca cgctctcaaa atcaaatgtt 6180 accccccacg gcggcgccct tcaccaagga agcgccgacc acggagccct 6240 gttcgcctcc ggcgaacctc gcaagggcgc ggacatcctt gtggaggcgc 6300 gggcgtgacg acggtgttcg cgtaccccgg cggtgcgtcg atggagatcc 6360 cacgcgctcc gccgccatcc gcaacgtgct cccgcgccac gagcagggcg gcgtcttcgc 6420 cgccgaaggc tacgcgcgtt cctccggcct ccccggcgtc tgcattgcca cctccggccc 6480 cggcgccacc aacctcgtga gcggcctcgc cgacgcttta atggacagcg tcccagtcgt 6540 cgccatcacc ggccaggtcg cccgccggat gatcggcacc gacgccttcc aagaaacccc 6600 gatcgtggag gtgagcagat ccatcacgaa gcacaactac ctcatcctcg acgtcgacga 6660 catcccccgc gtcgtcgccg aggctttctt cgtcgccacc tccggccgcc ccggtccggt 6720

cctcatcgac attcccaaag acgttcagca gcaactcgcc gtgcctaatt gggacgagcc 6780 cgttaacctc cccggttacc tcgccaggct gcccaggccc cccgccgagg cccaattgga 6840 acacattgtc agactcatca tggaggccca aaagcccgtt ctctacgtcg gcggtggcag 6900 tttgaattcc agtgctgaat tgaggcgctt tgttgaactc actggtattc ccgttgctag 6960 cactttaatg ggtcttggaa cttttcctat tggtgatgaa tattcccttc agatgctggg 7020 tatgcatggt actgtttatg ctaactatgc tgttgacaat agtgatttgt tgcttgcctt 7080 tggggtaagg tttgatgacc gtgttactgg gaagcttgag gcttttgcta gtagggctaa 7140 gattgttcac attgatattg attctgccga gattgggaag aacaagcagg cgcacgtgtc 7200 ggtttgcgcg gatttgaagt tggccttgaa gggaattaat atgattttgg aggagaaagg 7260 agtggagggt aagtttgatc ttggaggttg gagagaagag attaatgtgc agaaacacaa 7320 gtttccattg ggttacaaga cattccagga cgcgatttct ccgcagcatg ctatcgaggt 7380 tcttgatgag ttgactaatg gagatgctat tgttagtact ggggttgggc agcatcaaat 7440 gtgggctgcg cagttttaca agtacaagag accgaggcag tggttgacct cagggggtct 7500 tggagccatg ggttttggat tgcctgcggc tattggtgct gctgttgcta accctggggc 7560 tgttgtggtt gacattgatg gggatggtag tttcatcatg aatgttcagg agttggccac 7620 tataagagtg gagaatctcc cagttaagat attgttgttg aacaatcagc atttgggtat 7680 ggtggttcag ttggaggata ggttctacaa gtccaataga gctcacacct atcttggaga 7740 tccgtctagc gagagcgaga tattcccaaa catgctcaag tttgctgatg cttgtgggat 7800 accggcagcg cgagtgacga agaaggaaga gcttagagcg gcaattcaga gaatgttgga 7860 cacccctggc ccctaccttc ttgatgtcat tgtgccccat caggagcatg tgttgccgat 7920 49 200817524 gattcccagt 7980 ctgattgcct 8040 ctgtcctagt 8100 caagacattt 8160 gtagtctgat 8220 gaaaatgatg 8280 aagtcaaaag 8340 tagacgtgta 8400 cttttttaac 8460 aacggatttg 8520 accgaaatcc 8580 gaatagatgc 8640 tcagctgggc 8679 aatggatcct agaccaaatg tgcaggattt tattttcctt atctcctgtt tgctagtaat ctaatggaat gattcaactt ttgccattta gaccattgcg agagatagtt tgtaatcgac cggccactag tcaaggatgt ttccttgatg ggcctgtggt ttatttaact gtctgtattg aatatttctg caggttacat ctcttggagc tttactttta tccacaaaac ttcaaaagtc ttcaataaca tgagctcggt gataactgag cttgttttgt gagcatcata tactacatgc tgccgttgga ttagaaatct attcaatgtt tcacctaggc gtggaaattg gtctcttttg agaaatggca agtggcatca acccggggg ggtgatggta acaatatata gtctgtagta agtagcatct ttttttgctg aagtagagaa tttctttttt aatcagtaaa tgaccaattt ctcgatcttc aagttataaa cgtttctagt gaacgaggta taagataatg gttttggtag atctatctct tagtgagact tctgttgaag tagcggttgg atgcatattc gttcatgtag acaaagcgat tagtaaaaca tctagaccca <210> 15 <211> 7532 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 端基因體序列與完整的轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5轉殖基因插入片段 <400〉 15 ggccgctcta gagatccgtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60

tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120 cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 180 aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag 240 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 300 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatgat cctatgcgta 360 tggtatgacg tgtgttcaag atgatgactt caaacctacc tatgacgtat ggtatgacgt 420 gtgtcgactg atgacttaga tccactcgag cggctataaa tacgtaccta cgcaccctgc 480 gctaccatcc ctagagctgc agcttatttt tacaacaatt accaacaaca acaaacaaca 540 aacaacatta caattactat ttacaattac agtcgacccg ggatccacac gacaccatga 600 tagaggtgaa accgattaac gcagaggata cctatgaact aaggcataga atactcagac 660 caaaccagcc gatagaagcg tgtatgtttg aaagcgattt acttcgtggt gcatttcact 720 taggcggctt ttacaggggc aaactgattt ccatagcttc attccaccag gccgagcact 780 cggaactcca aggccagaaa cagtaccagc tccgaggtat ggctaccttg gaaggttatc 840 gtgagcagaa agcgggatca actctagtta aacacgctga agaaatcctt cgtaagaggg 900 gggcggacat gctttggtgt aatgcgagga catccgcctc aggctactac aaaaagttag 960 gcttcagcga gcagggagag atatttgaca cgccgccagt aggacctcac atcctgatgt 1020 ataaaaggat cacataacta gctagtcagt taacctagac ttgtccatct tctggattgg 1080 ccaacttaat taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct aatcactata 1140 20 200817524 aaagagaaag ctttgatgaa tataattaat gatatcaagc ccaatcatac atgtgggcat caaagttgtg tgttatgtgt aattactagt tatctgaata 1200 agatcatcca tatttcttat cctaaatgaa tgtcacgtgt ctttataatt 1260 ccagatgcat ttcattaacc aaatccatat acatataaat attaatcata 1320 atcaattggg ttagcaaaac aaatctagtc taggtgtgtt ttgcgaattc 1380 tttgctctag atcaaactca catccaaaca taacatggat atcttcctta 1440 taattatttt gggttaaata ttaatcatta tttttaagat attaattaag aaattaaaag 1500 attttttaaa aaaatgtata aaattatatt attcatgatt tttcatacat ttgattttga 1560 taataaatat atttttttta atttcttaaa aaatgttgca agacacttat tagacatagt 1620 cttgttctgt ttacaaaagc attcatcatt taatacatta aaaaatattt aatactaaca 1680 gtagaatctt cttgtgagtg gtgtgggagt aggcaacctg gcattgaaac gagagaaaga 1740 gagtcagaac cagaagacaa ataaaaagta tgcaacaaac aaatcaaaat caaagggcaa 1800 aggctggggt tggctcaatt ggttgctaca ttcaattttc aactcagtca acggttgaga 1860 ttcactctga cttccccaat ctaagccgcg gatgcaaacg gttgaatcta acccacaatc 1920 caatctcgtt acttaggggc ttttccgtca ttaactcacc cctgccaccc ggtttcccta 1980 taaattggaa ctcaatgctc ccctctaaac tcgtatcgct tcagagttga gaccaagaca 2040 cactcgttca tatatctctc tgctcttctc ttctcttcta cctctcaagg tacttttctt 2100 ctccctctac caaatcctag attccgtggt tcaatttcgg atcttgcact tctggtttgc 2160 tttgccttgc tttttcctc古 actgggtcca tctaggatcc atgtgaaact ctactctttc 2220 tttaatatct gcggaatacg cgtttgactt tcagatctag tcgaaatcat ttcataattg 2280 cctttctttc ttttagctta tgagaaataa aatcactttt tttttatttc aaaataaacc 2340

ttgggccttg tgctgactga gatggggttt ggtgattaca gaattttagc gaattttgta 2400 attgtacttg tttgtctgta gttttgtttt gttttcttgt ttctcataca ttccttaggc 2460 ttcaatttta ttcgagtata ggtcacaata ggaattcaaa ctttgagcag gggaattaat 2520 cccttccttc aaatccagtt tgtttgtata tatgtttaaa aaatgaaact tttgctttaa 2580 attctattat aacttttttt atggctgaaa tttttgcatg tgtctttgct ctctgttgta 2640 aatttactgt ttaggtacta 2700 cacacaacac aatggcggcc 2760 accccacctt ccccaaacgc 2820 ccaaacccaa ccacgctctc 2880 ccttcaccaa ggaagcgccg 2940 actctaggct tgttgtgcag tttttgaagt ataaccatgc accgcttcca gaaccacccg attctcttct tcctcttcac attactagat ccaccctccc tctctctcat caaaccctca aaaatcaaat gttccatctc caaacccccc acggcggcgc accacggagc ccttcgtgtc acggttcgcc tccggcgaac 200817524 ctcgcaaggg cgcggacatc cttgtggagg cgctggagag gcagggcgtg acgacggtgt 3000 tcgcgtaccc cggcggtgcg tcgatggaga tccaccaggc gctcacgcgc tccgccgcca 3060 tccgcaacgt gctcccgcgc cacgagcagg gcggcgtctt cgccgccgaa ggctacgcgc 3120 gttcctccgg cctccccggc gtctgcattg ccacctccgg ccccggcgcc accaacctcg 3180 tgagcggcct cgccgacgct ttaatggaca gcgtcccagt cgtcgccatc accggccagg 3240 tcgcccgccg gatgatcggc accgacgcct tccaagaaac cccgatcgtg gaggtgagca 3300 gatccatcac gaagcacaac tacctcatcc tcgacgtcga cgacatcccc cgcgtcgtcg 3360 ccgaggcttt cttcgtcgcc acctccggcc gccccggtcc ggtcctcatc gacattccca 3420 aagacgttca gcagcaactc gccgtgccta attgggacga gcccgttaac ctccccggtt 3480 acctcgccag gctgcccagg ccccccgccg aggcccaatt ggaacacatt gtcagactca 3540 tcatggaggc ccaaaagccc gttctctacg tcggcggtgg cagtttgaat tccagtgctg 3600 aattgaggcg ctttgttgaa ctcactggta ttcccgttgc tagcacttta atgggtcttg 3660 gaacttttcc tattggtgat gaatattccc ttcagatgct gggtatgcat ggtactgttt 3720 atgctaacta tgctgttgac aatagtgatt tgttgcttgc ctttggggta aggtttgatg 3780 accgtgttac tgggaagctt gaggcttttg ctagtagggc taagattgtt cacattgata 3840 ttgattctgc cgagattggg aagaacaagc aggcgcacgt gtcggtttgc gcggatttga 3900 agttggcctt gaagggaatt aatatgattt tggaggagaa aggagtggag ggtaagtttg 3960 atcttggagg ttggagagaa gagattaatg tgcagaaaca caagtttcca ttgggttaca 4020 agacattcca ggacgcgatt tctccgcagc atgctatcga ggttcttgat gagttgacta 4080 atggagatgc tattgttagt actggggttg ggcagcatca aatgtgggct gcgcagtttt 4140 acaagtacaa gagaccgagg cagtggttga cctcaggggg tcttggagcc atgggttttg 4200 gattgcctgc ggctattggt gctgctgttg ctaaccctgg ggctgttgtg gttgacattg 4260 atggggatgg tagtttcatc atgaatgttc aggagttggc cactataaga gtggagaatc 4320 tcccagttaa gatattgttg ttgaacaatc agcatttggg tatggtggtt cagttggagg 4380 ataggttcta caagtccaat agagctcaca cctatcttgg agatccgtct agcgagagcg 4440 agatattccc aaacatgctc aagtttgctg atgcttgtgg gataccggca gcgcgagtga 4500 cgaagaagga agagcttaga gcggcaattc agagaatgtt ggacacccct ggcccctacc 4560 ttcttgatgt cattgtgccc catcaggagc atgtgttgcc gatgattccc agtaatggat 4620 ccttcaagga tgtgataact gagggtgatg gtagaacgag gtactgattg cctagaccaa 4680 atgttccttg atgcttgttt tgtacaatat atataagata atgctgtcct agttgcagga 4740 22 200817524 tttggcctgt ggtgagcatc atagtctgta gtagttttgg tagcaagaca ttttattttc 4800 cttttattta acttactaca tgcagtagca tctatctatc tctgtagtct gatatctcct 4860 gttgtctgta ttgtgccgtt ggattttttg ctgtagtgag actgaaaatg atgtgctagt 4920 aataatattt ctgttagaaa tctaagtaga gaatctgttg aagaagtcaa aagctaatgg 4980 aatcaggtta catattcaat gtttttcttt ttttagcggt tggtagacgt gtagattcaa 5040 cttctcttgg agctcaccta ggcaatcagt aaaatgcata ttcctttttt aacttgccat 5100 ttatttactt ttagtggaaa ttgtgaccaa tttgttcatg tagaacggat ttggaccatt 5160 gcgtccacaa aacgtctctt ttgctcgatc ttcacaaagc gataccgaaa tccagagata 5220

5520 agtcaacacc aggtcttccg aagcattaac aattacctat ttaatatgta ctcagtccgg gttttcaaaa gtcagaaatg gcaaagttat 5280 gacttcaata acaagtggca tcacgtttct 5340 tagtgagctc ggtacccggg ggcgcgtaat 5400 aataggattt tagctactaa atatgttgat 5460 attatgctac ccatatggaa agaagacgct 5580 aaatagtaaa acagaataga tgctgtaatc agttctagac ccatcagctg ggccggccac atcatcatta ggaagacact gcccatcttg ggtctttatg aaaaactatt aactaggaat aggggaatag aaagaccatc aaataaacga gtggatatct cactacattg acgcagtttg ttcaaagacg aacgccctga attatgccat 5640 ctgcttaggc tttcaaatat ggtacgctct aatgccaagc cttatgctgg tcttagggta 5700 ttatcatcaa atctttaagc cagaggtagt taaatacatc aaggacacca taggagtatg 5760 gcacaacgat attgtcaaga tcgcatcaga tctaataggc aataatgaat tcttcatgca 5820 gcccgacgtg ggaacgctcg aaagcagtgg ggcctctggg acagggacca gacctgagtc 5880 caaggaagga agaatatagc tattctgtca ttacaaagct gctaacattt gggaataaga gaagtagata tacccaattt tttaactagc 5940 Ο aagcgggaaa ggtccgatac aaaggaaagg gttgcgaggc ttaacgattt 6000 tgttgaggtg gcacttgttc ccccggggcg ggggtatatg cccgtagctt 6060 cttctttcag atcaatgaag ttgaaaagtt atagagtaag ggacccttgt 6120 gtcactccaa gaactcgaag tcaagcatct tcgggaatat ccagattagt cttcaactag 6180 agaaaggata ggaatctcct ttgcagagtt ttcttctcct gctgatgtag cggtaaagtc 6240 aaaagttgga tgcccttttt tctttattta attaattccg ttgatagagc ttttgagcgg 6300 gactaagaga ttcgtcggga cggcctagta tcagcccagg atgcaagcac tagattcttc aacgagtacc aataataaat gaattcacca 6360 agaaaacaga acaaaaagat taagcccagc cgccttcggg aagacctatc 6420 ggaagagccc tctttacacc attgtgatta gaaaaaaccg aaaagtggac 6480 accaatagag cggggcttga tccccacttt aaatctattg gatagagccc 6540 23· 200817524 gcaagcgatt gaattctatt tgattatggg ttaggtggaa cctgaaacta gcacttacaa 6600 atgagttagc aaaaggaaaa agacaattct caaatgcgta caagactttc ttccttcttt 6660 gtttaagagg ccagtctgcg atggatgctc gtgcatgaaa aagggctttg atctattcac 6720 cacttatata atagagccaa tctctgcagg acaagatatc tattttgtca ttgggaagta 6780 aggcttaagt cgacgaaaaa gttaggaaag gggatcatat ggctagggtt gccctcgggg 6840 ctcaagggtt tagcgatgaa gagtgccaag caaaaggtca ataccggtac gccgatcaaa 6900 gaagtccagt ggcaaggccc tttcagccaa gctagcgtgc tgaacagaaa gtcgtagagt 6960 gatgacagct tcttcttctt gagtcattcg tgtgacaaca tcaggatctc gtcgaaagac 7020 ctcctctgcc tatctctccc gcaagagagg actcgttatg gcgcacctct ttttagcagt 7080 ctcgtcaata agataagatt gcccctccct tcttattgat ttgataaagg gctttgtcca 7140 ctccctctct tcttagccga gcggagtgac ggtttagttt aggctttaga tgccactgcg 7200 aaagactcta gagatccact ctcacagcgt atacgcgaca tccctatgta tacacaatcc 7260 tttcaagcag ctaggacagc tagcaagcaa gttatctgtt cgcggacaag ctctctggat 7320 gacaaaaaac atgctctttc atgcggaaaa aacacggtct ttcgtggaag ttggtcgatt 7380 tgaagtcgct ttatgagtga aaatgggtcg atgacgaaaa agacggggaa aatgatcaac 7440 tgtcacattt tgatgccagt ttagggctaa aatgaacttt catccaaaaa gaccgagaaa 7500 acgctccact ggcaggatcc gatcggaaat aa 7532

<210> 16 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子 <400> 16 30 tgcccgaggt cgttaggtcg aataggctag <210> 17 <211〉 35 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子 <400〉 17 tcctattcaa gatgggcagt gtcttcctaa tgatg <210〉 18 24 35 37200817524

<211〉 37 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> Taqman 探針 <400> 18 gataactgag ggtgatggta gaacgaggta ctgattg <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子 <400> 19 tcgatcggtc aagaatccgg ttctc <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213〉人工序列 25 <220> <223>引子 <400> 20 caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttg <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213〉人工序列 35

<220〉 <223>引子 <400> 21 gtaatatcat cattaggaag acactgccca tcttg 35 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子 <400> 22 ccatatttga aagcctaagc agatggcata attc 34 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213〉人工序列 25 28 200817524 <220> <223>引子 <400〉 23 ttcagcaaca aactctcatc gtgagcag <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 1227 <400> 24 30 30 tggtcttctg agactgtatc tttgatattc

<210> 25 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> 弓[子 1297 (Taqman 探針) <400〉 25 tgcccgaggt cgttaggtcg aataggctag <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 1440 <400> 26 tgtgataact gagggtgatg gtagaacgag gtactg 36 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉轉殖品項3560 · 4 · 3.5的接合處DNA (30核苷酸的5 I端基因體/30核苷酸的轉殖基因插入片段） <400〉 27 aataggctag gtttacgaaa aagagactaa ggccgctcta gagatccgtc aacatggtgg 60 <210> 28 <211> 60 <212> DNA <213〉人工序列 26 <220> 200817524 <223>轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5的接合處DNA (30核苷酸的3，端基因體/30核苷酸的轉殖基因插入片段） <400〉 28 ccggccacta gtgagctcgg tacccggggg cgcgtaatat catcattagg aagacactgc 60 <210> 29 <211> 468 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉SCP1啓動子探針 <400> 29 agatccgtca acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca 60 gtctcagaag accaaagggc tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc 120 ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt 180 ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc 240 gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt 300 ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatgatc ctatgcgtat ggtatgacgt 360 gtgttcaaga tgatgacttc aaacctacct atgacgtatg gtatgacgtg tgtcgactga 420 tgacttagat ccactcgagc ggctataaat acgtacctac gcaccctg 4 68 <210> 30 <211> 416 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉glyat4601 探針 <400> 30 atgatagagg tgaaaccgat taacgcagag gatacctatg aactaaggca tagaatactc 60 agaccaaacc agccgataga agcgtgtatg tttgaaagcg atttacttcg tggtgcattt 120 cacttaggcg gcttttacag gggcaaactg atttccatag cttcattcca ccaggccgag 180 cactcggaac tccaaggcca gaaacagtac cagctccgag gtatggctac cttggaaggt 240 tatcgtgagc agaaagcggg atcaactcta gttaaacacg ctgaagaaat ccttcgtaag 300 aggggggcgg acatgctttg gtgtaatgcg aggacatccg cctcaggcta ctacaaaaag 360 ttaggcttca gcgagcaggg agagatattt gacacgccgc cagtaggacc tcacat 416 <210〉 31 <211〉 234 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉pinl工終止子探針 tgtgtgttat 60 ttatcctaaa 120 aaccaaatcc 180 aaac 234 <400> 31 aggatgcaca gtgtaattac tgaatgtcac atatacatat catagtgaca tagttatctg gtgtctttat aaatattaat tgctaatcac aataaaagag aattctttga catatataat tataatgtgg aaagagatca tgaaccagat taatatcaat gcatcaaagt tccatatttc gcatttcatt tgggttagca <210> 32 <211> 445 <212> DNA <213〉人工序列 27 200817524 <220> <223〉SAMS 探針（5,端) <400〉 32 tgtgggagta taaaaagtat gttgctacat taagccgcgg tttccgtcat cctctaaact gctcttctct ttccgtggtt ggcaacctgg gcaacaaaca tcaattttca atgcaaacgg taactcaccc cgtatcgctt tctcttctac caatttcgga cattgaaac.g aatcaaaatc actcagtcaa ttgaatctaa ctgccacccg cagagttgag ctctcaaggt tcttg agagaaagag aaagggcaaa cggttgagat cccacaatcc gtttccctat accaagacac acttttcttc agtcagaacc ggctggggtt tcactctgac aatctcgtta aaattggaac actcgttcat tccctctacc agaagacaaa 60 ggctcaattg 120 ttccccaatc 180 cttaggggct 240 tcaatgctcc 300 atatctctct 360 aaatcctaga 420 445 <210〉 33 <211> 492 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉SAMS 探針（3,端） <400> 33 cacttctggt ttgctttgcc ttgctttttc ctcaactggg tccatctagg atccatgtga 60 aactctactc tttctttaat atctgcggaa tacgcgtttg actttcagat ctagtcgaaa 120 tcatttcata attgcctttc tttcttttag cttatgagaa ataaaatcac ttttttttta 180 tttcaaaata aaccttgggc cttgtgctga ctgagatggg gtttggtgat tacagaattt 240 tagcgaattt tgtaattgta cttgtttgtc tgtagttttg ttttgttttc ttgtttctca 300 tacattcctt aggcttcaat tttattcgag tataggtcac aataggaatt caaactttga 360 gcaggggaat taatcccttc cttcaaatcc agtttgtttg tatatatgtt taaaaaatga 420 aacttttgct ttaaattcta ttataacttt ttttatggct gaaatttttg catgtgtctt 480 tgctctctgt tg 492 <210〉 34 <211> 930 <212〉 DNA <213〉人工序列

<220> <223〉gm-hra 探針（5’端) <400> 34 ccacacaaca caccccacct accaaaccca cccttcacca cctcgcaagg ttcgcgtacc atccgcaacg cgttcctccg gtgagcggcc gtcgcccgcc agatccatca gccgaggctt aaagacgttc tacctcgcca atcatggagg gaattgaggc caatggcggc tccccaaacg accacgctct aggaagcgcc gcgcggacat ccggcggtgc tgctcccgcg gcctccccgg tcgccgacgc ggatgatcgg cgaagcacaa tcttcgtcgc agcagcaact ggctgcccag cccaaaagcc gctttgttga caccgcttcc cattactaga caaaatcaaa gaccacggag ccttgtggag gtcgatggag ccacgagcag cgtctgcatt tttaatggac caccgacgcc ctacctcatc cacctccggc cgccgtgcct gccccccgcc cgttctctac actcactggt agaaccaccc tccaccctcc tgttccatct cccttcgtgt gcgctggaga atccaccagg ggcggcgtct gccacctccg agcgtcccag ttccaagaaa ctcgacgtcg cgccccggtc aattgggacg gaggcccaat gtcggcggtg gattctcttc ctctctctca ccaaacGCCc cacggttcgc ggcagggcgt cgctcacgcg tcgccgccga gccccggcgc tcgtcgccat ccccgatcgt acgacatccc cggtcctcat agcccgttaa tggaacacat gcagtttgaa ttcctcttca 60 tcaaaccctc 120 cacggcggcg 180 ctccggcgaa 240 gacgacggtg 300 ctccgccgcc 360 aggctacgcg 420 caccaacctc 480 caccggccag 540 ggaggtgagc 600 ccgcgtcgtc 660 cgacattccc 720 cctccccggt 780 tgtcagactc 840 ttccagtgct 900 930 <210> 35 2Sr 200817524 <211> 1030 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉gm-hra 探針（3,端） <400〉 35 cgttgctagc actttaatgg gtcttggaac ttttcctatt ggtgatgaat attcccttca 60 gatgctgggt atgcatggta ctgtttatgc taactatgct gttgacaata gtgatttgtt 120 gcttgccttt ggggtaaggt ttgatgaccg tgttactggg aagcttgagg cttttgctag 180 tagggctaag attgttcaca ttgatattga ttctgccgag attgggaaga acaagcaggc 240 gcacgtgtcg gtttgcgcgg atttgaagtt ggccttgaag ggaattaata tgattttgga 300 ggagaaagga gtggagggta agtttgatct tggaggttgg agagaagaga ttaatgtgca 360 gaaacacaag tttccattgg gttacaagac attccaggac gcgatttctc cgcagcatgc 420 tatcgaggtt cttgatgagt tgactaatgg agatgctatt gttagtactg gggttgggca 480 gcatcaaatg tgggctgcgc agttttacaa gtacaagaga ccgaggcagt ggttgacctc 540 agggggtctt ggagccatgg gttttggatt gcctgcggct attggtgctg ctgttgctaa 600 ccctggggct gttgtggttg acattgatgg ggatggtagt ttcatcatga atgttcagga 660 gttggccact ataagagtgg agaatctccc agttaagata ttgttgttga acaatcagca 720 tttgggtatg gtggttcagt tggaggatag gttctacaag tccaatagag ctcacaccta 780 tcttggagat ccgtctagcg agagcgagat attcccaaac atgctcaagt ttgctgatgc 840 ttgtgggata ccggcagcgc gagtgacgaa gaaggaagag cttagagcgg caattcagag 900 aatgttggac acccctggcc cctaccttct tgatgtcatt gtgccccatc aggagcatgt 960 gttgccgatg attcccagta atggatcctt caaggatgtg ataactgagg gtgatggtag 1020 aacgaggtac 1030 <210> 36 <211〉 649 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉gm-als終止子探針 aatgttcctt gatgcttgtt ttgtacaata tatataagat aatgctgtcc 60 atttggcctg tggtgagcat catagtctgt agtagttttg gtagcaagac 120 ccttttattt aacttactac atgcagtagc atctatctat ctctgtagtc 180 tgttgtctgt attgtgccgt tggatttttt gctgtagtga gactgaaaat 240 taataatatt tctgttagaa atctaagtag agaatctgtt gaagaagtca 300 gaatcaggtt acatattcaa tgtttttctt tttttagcgg ttggtagacg 360 acttctcttg gagctcacct aggcaatcag taaaatgcat attccttttt 420 tttatttact tttagtggaa attgtgacca atttgttcat gtagaacgga 480 tgcgtccaca aaacgtctct tttgctcgat cttcacaaag cgataccgaa 540 agttttcaaa agtcagaaat ggcaaagtta taaatagtaa aacagaatag 600 cgacttcaat aacaagtggc atcacgtttc tagttctag 649 <400> 36 gcctagacca tagttgcagg attttatttt tgatatctcc gatgtgctag aaagctaatg tgtagattca taacttgcca tttggaccat atccagagat atgctgtaat <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> ^I-T-DP-356-fl <400〉 37 gtcgaatagg ctaggtttac gaaaaa 26 29- 200817524

<210> 38 <211〉 29 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引子 DP-356-rl <400> 38 tttgatattc ttggagtaga cgagagtgt <210〉 39 <211〉 30 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> 引子 DP-356-p(Taqman 探針） <400〉 39 ctctagagat ccgtcaacat ggtggagcac <210〉 40 <211〉 35 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 引子 06-0-1610 <400> 40 agcaattgtt ttgtgcattt ccaaatttca atctg <210> 41 <211〉 8679 <212> DNA <213〉人工序列 29 30 35

<220> <223〉左側鄰近序列與轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5完整的轉殖基因插入片段 <400> 41 agcaattgtt tcgggttgat caaacaaatt tcaagggcac ctcatgccac ttcaagttgg tctacccaaa tcatccactc ttctcagtac ccaaaaagac aaatcatgat ccttatccca aatttccaac cagccaaggc tcttttacga caaatgacat ttgtgcattt ccaaatttca atctgattta ttaaataaaa aaattttaat 60 tgtaaatcag ctaaagacat tttacagaaa gacgtcaaaa atcttggctc 120 tttgcaagat ggcaagcaat attaagtgtt tttgattttg acagaatata 180 tttaaactct ctacctaact atcttacacg tgaattctta tagacaaatt 240 ctaaggcatc aggcacccct ctcaggggta gacgaagcac gagtaaagga 300 ccctaccaga gccaactatc aaaaagagtt cttccgcatc ctctgggtca 360 aacctaaaat aaaagggtca tcaacccaaa tagtcaccat caaacctgag 420 aggaatcccc aaaaccttca acctcaaaac aaacaaaggc cgactatacc 480 aacactccag gccctacaag aaattggtct aaccaaactc ccaaaactcg 540 ttgggcagac attgcctcag aatctaatga tgaatttgaa actgatttac 600 tcaaaactcc aaacaatcca aaacgattgt caatccaaaa ggaaaacaga 660 acaaaagaca ccattaccaa aacctactaa cagttatatt tacaaaaata 720 tgttttgtag atggagccaa aattttggga caaaaatccc ttcaaggcta 780 atttccaccg ggcttccatt tcaaacctat ttccaccaat aaaacaagaa 840 attcatactg atagacacaa actcagtgtc tattaaacac ttcaaagacc 900 aaatttaaac actcattcaa ccatccagat tttaaagttc atacaacctc 960 -30 200817524 gacaatgtgg 1020 gttacactat 1080 attcaaacat 1140 gttcctccaa 1200 acaagggttt 1260 cctaaaatac 1320 gaaaactgaa 1380 gaattagttt 1440 tccagaattt 1500 attagctgct 1560 agtcctacag 1620 caattcttca 1680 ttctctaaat 1740 aactggcact 1800 gaggtacctt I860 ctttgtaagt 1920 cctcttgacc 1980 atcgatattg 2040 tgttttacca 2100 attcataata 2160 tatatatata 2220 tatatataac 2280 aaagttttac 2340 taggaatatt 2400 taagaatcat 2460 caaacgtctt 2520 atcacttttt 2580 tataagtttc 2640 caatttatct 2700 gctagccact 2760 aacaaatata tgggattatg tcttggctta cggtgggact gatcagttca ttttccaatt aacaacaagc gatacatcaa ttgaaagttg ttcctttcta cttctccaac aaagaagatg gatgattaat gtagctacag ttcaggtagt ttttctttcg ggtcctgtgc tgtggctcta ttttcttttg tattcttaca tatatatatc gaagttattt tatatctaag ttgtaaaaaa aatttttaga ctaaagccac aaagttaaaa tagcactcca cctccaaata caatatttag aatcaagcca tagatgcatg tttatttcaa tttttggacc aaaaaatgtt ttgcattgtc agtttccatc aagcagcacc ctaatcctga gttccaagtc aagaagaaga acgacccttt taaaaaatta taaattttat cagatctcta atttcaataa ggttctgcca ttgccacttc atattataat tcctatctat gtttaacttc taacaaaagg catgattttt tcaaacattt aatcatgatt atgttaatgg atatcactaa ttggagttgt tttaagtaaa gtgctccccg aacaattctt gaccaatgta aactaacacc aaactttgat caattctcag gtggatattt actgcaacat agatcaagtg gacttcttta aaaagaaatt taaaggctct ctaccaaaat catgtactat ggctatttaa tttttagaga attcaaagtt tcgcttcagt gatttctttt ttctatttaa ccgtttgatc atgttagtaa tatttttgta tttaattccc ttttaattat tctggatata gtgtacaaat tacgtttcta atagaactac ctgcatattt aaagaggaaa tgtacccttt ttctggcatc gtctataatt atctacccgg gaatcacgaa tcatggcaat catgcattta agaatctggt ttcctcaatc ctggcacaaa tcctcaaaga gaaaatgatt gtaaatagtt ggagttctcg gagaaactct ttctcttcat ttcttctctt atgttgcttt ctcttggtca tcttttcact taagattaga aaaaaaaatt aaaacacgtg tcgtataaaa aaaatacttt tataaagttt aatgcatttt tactaatcta agagaatgtt gcaaacaagc gatcctatag aaaataacaa ttccaaattg agcaagtcca tccctgtaga acagatatgg tcaagtggtg ttcaagccca agaagtctca atctaaaaga aggaagataa gttttggtat tcggtcacga gcccatttgt aggaaacaat atctcttctc ctctcccctt cattttaatt tactgcatat gttatatata gtaaaaaata atatgctaaa taaatatttt catcaatctt ttcttgcagc ttataaacat ttttagaaat ctattaataa ggacagtaaa caccagcact 200817524 tcaatcagta aagctagcca 2820 cagatcctcc acctagccaa 2880 gcaagctcca tataggttac 2940 accatatcgg cgcaactatt 3000 gactagcaga aaagtgcttc 3060 tttcgaaatt actaatatgc 3120 gctaaggaag gagcgatcca 3180 caccgcacca gcaagaggaa 3240 gaaccggatt cttgaccgat 3300 tacgaaaaag agactaaggc 3360 cgtctactcc aagaatatca 3420 tcaacaaagg gtaatatcgg 3480 catcaaaagg acagtagaaa 3540 aaaggctatc gttcaagatg 3600 gaggagcatc gtggaaaaag 3660 tgatgatcct atgcgtatgg 3720 gacgtatggt atgacgtgtg 3780 gtacctacgc accctgcgct 3840 aacaacaaca aacaacaaac 3900 tccacacgac accatgatag 3960 gcatagaata ctcagaccaa 4020 tcgtggtgca tttcacttag 4080 ccaccaggcc gagcactcgg 4140 taccttggaa ggttatcgtg 4200

aatccttcgt 4260 ctactaca^a 4320 acctcacatc 4380 tccatcttct 4440 acatgctaat 4500 ctgaataaaa 4560 aagagggggg aagttaggct ctgatgtata ggattggcca cactataatg gagaaagaga ctcaactcgc gtaggtctca tttgcgggct gatcgagtgc agcaacaaac tgctctcgag taagaatcgc accgaattag cgacttttgc cgctctagag aagatacagt gaaacctcct aggaaggtgg cctctgccga aagacgttcc tatgacgtgt tcgactgatg accatcccta aacattacaa aggtgaaacc accagccgat gcggctttta aactccaagg agcagaaagc cggacatgct tcagcgagca aaaggatcac acttaattaa tgggcatcaa tcatccatat tctcttcaaa aaaggtttac actgaataga gtgtatacca tctcatcgtg atctccactt ctcgaatagc agctgaaaga ccgaggtcgt atccgtcaac ctcagaagac cggattccat cacctacaaa cagtggtccc aaccacgtct gttcaagatg acttagatcc gagctgcagc ttactattta gattaacgca agaagcgtgt caggggcaaa ccagaaacag gggatcaact ttggtgtaat gggagagata ataactagct tgtatgaaat agttgtgtgt ttcttatcct ttccctttta cccgcatatg atcttcggtg cgtgaatgcg agcagtgtct ccatcataca cataacctca atactagagc taggtcgaat atggtggagc caaagggcta tgcccagcta tgccatcatt aaagatggac tcaaagcaag atgacttcaa actcgagcgg ttatttttac caattacagt gaggatacct atgtttgaaa ctgatttcca taccagctcc ctagttaaac gcgaggacat tttgacacgc agtcagttaa aaaaggatgc tatgtgtaat aaatgaatgt cattttattt cttagtcgcc aaaggcgtct acacccgaaa ctgctggcaa accgaaacca tctcgccttc catcgtagga aggctaggtt acgacactct ttgagacttt tctgtcactt gcgataaagg ccccacccac tggattgatg acctacctat ctataaatac aacaattacc cgacccggga atgaactaag gcgatttact tagcttcatt gaggtatggc acgctgaaga ccgcctcagg cgccagtagg cctagacttg acacatagtg tactagttat cacgtgtctt -32 200817524 C tataattctt 4620 aatcatatat 4680 cgaattcgat 4740 ttccttacca 4800 aattaagaaa 4860 catacatttg 4920 cacttattag 4980 aatatttaat 5040 ttgaaacgag 5100 tcaaaatcaa 5160 tcagtcaacg 5220 gaatctaacc 5280 gccacccggt 5340 gagttgagac 5400 ctcaaggtac 5460 ttgcacttct 5520 tgaaactcta 5580 aaatcatttc 5640 ttatttcaaa 5700 ttttagcgaa 5760 tcatacattc 5820 tgagcagggg 5880 tgaaactttt 5940 ctttgctctc 6000 ttgaagtata 6060 ctcttcttcc 6120 ctctcatcaa 6180 accccccacg 6240 gttcgcctcc 6300 gggcgtgacg 6360 tgatgaacca aattaatatc atcaagcttt atcatactaa ttaaaagatt attttgataa acatagtctt actaacagta agaaagagag agggcaaagg gttgagattc cacaatccaa ttccctataa caagacacac ttttcttctc ggtttgcttt ctctttcttt ataattgcct ataaaccttg ttttgtaatt cttaggcttc aattaatccc gctttaaatt tgttgtaaat accatgccac tcttcacacc accctcacca gcggcgccct ggcgaacctc acggtgttcg gatgcatttc aattgggtta gctctagatc ttattttggg ttttaaaaaa taaatatatt gttctgttta gaatcttctt tcagaaccag ctggggttgg actctgactt tctcgttact attggaactc tcgttcatat cctctaccaa gccttgcttt aatatctgcg ttctttcttt ggccttgtgc gtacttgttt aattttattc ttccttcaaa ctattataac ttactgttta acaacacaat ccaccttccc aacccaacca tcaccaagga gcaagggcgc cgtaccccgg attaaccaaa gcaaaacaaa aaactcacat ttaaatatta atgtataaaa ttttttaatt caaaagcatt gtgagtggtg aagacaaata ctcaattggt ccccaatcta taggggcttt aatgctcccc atctctctgc atcctagatt ttcctcaact gaatacgcgt tagcttatga tgactgagat gtctgtagtt gagtataggt tccagtttgt tttttttatg ggtactaact ggcggccacc caaacgcatt cgctctcaaa agcgccgacc ggacatcctt cggtgcgtcg tccatataca tctagtctag ccaaacataa atcattattt ttatattatt tcttaaaaaa catcatttaa tgggagtagg aaaagtatgc tgctacattc agccgcggat tccgtcatta tctaaactcg tcttctcttc ccgtggttca gggtccatct ttgactttca gaaataaaat ggggtttggt ttgttttgtt cacaatagga ttgtatatat gctgaaattt ctaggcttgt gcttccagaa actagatcca atcaaatgtt acggagccct gtggaggcgc atggagatcc tataaatatt gtgtgttttg catggatatc ttaagatatt catgattttt tgttgcaaga tacattaaaa caacctggca aacaaacaaa aattttcaac gcaaacggtt actcacccct tatcgcttca tcttctacct atttcggatc aggatccatg gatctagtcg cacttttttt gattacagaa ttcttgtttc attcaaactt gtttaaaaaa ttgcatgtgt tgtgcagttt ccacccgatt ccctccctct ccatctccaa tcgtgtcacg tggagaggca accaggcgct -33- 200817524

cacgcgctcc gccgccatcc gcaacgtgct 6420 cgccgaaggc tacgcgcgtt cctccggcct 6480 cggcgccacc aacctcgtga gcggcctcgc 6540 cgccatcacc ggccaggtcg cccgccggat 6600 gatcgtggag gtgagcagat ccatcacgaa 6660 catcccccgc gtcgtcgccg aggctttctt 6720 cctcatcgac attcccaaag acgttcagca 6780 cgttaacctc cccggttacc tcgccaggct 6840 acacattgtc agactcatca tggaggccca 6900 tttgaattcc agtgctgaat tgaggcgctt 6960 cactttaatg ggtcttggaa cttttcctat 7020 tatgcatggt actgtttatg ctaactatgc 7080 tggggtaagg tttgatgacc gtgttactgg 7140 gattgttcac attgatattg attctgccga 7200 ggtttgcgcg gatttgaagt tggccttgaa 7260 agtggagggt aagtttgatc ttggaggttg 7320 gtttccattg ggttacaaga cattccagga 7380 tcttgatgag ttgactaatg gagatgctat 7440 gtgggctgcg cagttttaca agtacaagag 7500 tggagccatg ggttttggat tgcctgcggc 7560 tgttgtggtt gacattgatg gggatggtag 7 620 cccgcgccac gagcagggcg gcgtcttcgc ccccggcgtc tgcattgcca cctccggccc cgacgcttta atggacagcg tcccagtcgt gatcggcacc gacgccttcc aagaaacccc gcacaactac ctcatcctcg acgtcgacga cgtcgccacc tccggccgcc ccggtccggt gcaactcgcc gtgcctaatt gggacgagcc gcccaggccc cccgccgagg cccaattgga aaagcccgtt ctctacgtcg gcggtggcag tgttgaactc actggtattc ccgttgctag tggtgatgaa tattcccttc agatgctggg tgttgacaat agtgatttgt tgcttgcctt gaagcttgag gcttttgcta gtagggctaa gattgggaag aacaagcagg cgcacgtgtc gggaattaat atgattttgg aggagaaagg gagagaagag attaatgtgc agaaacacaa cgcgatttct ccgcagcatg ctatcgaggt tgttagtact ggggttgggc agcatcaaat accgaggcag tggttgacct cagggggtct tattggtgct gctgttgcta accctggggc · tttcatcatg aatgttcagg agttggccac tataagagtg gagaatctcc cagttaagat attgttgttg aacaatcagc atttgggtat 7680 ggtggttcag ttggaggata ggttctacaa gtccaataga gctcacacct atcttggaga 7740 tccgtctagc 7800 accggcagcg 7860 cacccctggc 7920 gattcccagt 7980 ctgattgcct 8040 ctgtcctagt 8100 caagacattt 8160 gagagcgaga tattcccaaa catgctcaag tttgctgatg cttgtgggat cgagtgacga agaaggaaga gcttagagcg gcaattcaga gaatgttgga ccctaccttc ttgatgtcat tgtgccccat caggagcatg tgttgccgat aatggatcct tcaaggatgt gataactgag ggtgatggta gaacgaggta agaccaaatg ttccttgatg cttgttttgt acaatatata taagataatg tgcaggattt ggcctgtggt gagcatcata gtctgtagta gttttggtag tattttcctt ttatttaact tactacatgc agtagcatct atctatctct 34 200817524 gtagtctgat atctcctgtt gtctgtattg tgccgttgga ttttttgctg tagtgagact 8220 gaaaatgatg tgctagtaat aatatttctg ttagaaatct aagtagagaa tctgttgaag 8280 aagtcaaaag ctaatggaat caggttacat attcaatgtt tttctttttt tagcggttgg 8340 tagacgtgta gattcaactt ctcttggagc tcacctaggc aatcagtaaa atgcatattc 8400 cttttttaac ttgccattta tttactttta gtggaaattg tgaccaattt gttcatgtag 8460 ， aacggatttg gaccattgcg tccacaaaac gtctcttttg ctcgatcttc acaaagcgat 8520 accgaaatcc agagatagtt ttcaaaagtc agaaatggca aagttataaa tagtaaaaca 8580 gaatagatgc tgtaatcgac ttcaataaca agtggcatca cgtttctagt tctagaccca 8640 tcagctgggc cggccactag tgagctcggt acccggggg 8679 <210> 42 <211〉 7532 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉右側鄰近序列與轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5完整的轉殖基因插入片段 L gagatccgtc agtctcagaa cctcggattc tggcacctac cgacagtggt tccaaccacg tgtgttcaag atgacttaga ctagagctgc caattactat accgattaac gatagaagcg ttacaggggc aggccagaaa agcgggatca gctttggtgt gcagggagag <400> 42 ggccgctcta tcaaagatac cgggaaacct aaaaggaagg atgcctctgc aagaagacgt tggtatgacg gtgtcgactg gctaccatcc aacaacatta tagaggtgaa caaaccagcc taggcggctt cggaactcca gtgagcagaa gggcggacat gcttcagcga 1020 ataaaaggat 1080 ccaacttaat 1140 atgtgggcat 1200 agatcatcca 1260 ccagatgcat 1320 atcaattggg 1380 aacatggtgg gaccaaaggg cattgcccag aaatgccatc cccaaagatg tcttcaaagc atgatgactt tccactcgag agcttatttt ttacaattac gcagaggata tgtatgtttg aaactgattt cagtaccagc actctagtta aatgcgagga atatttgaca agcacgacac ctattgagac ctatctgtca attgcgataa gacccccacc aagtggattg caaacctacc cggctataaa tacaacaatt agtcgacccg cctatgaact aaagcgattt ccatagcttc tccgaggtat aacacgctga catccgcctc cgccgccagt tctcgtctac ttttcaacaa cttcatcaaa aggaaaggct cacgaggagc atgtgatgat tatgacgtat tacgtaccta accaacaaca ggatccacac aaggcataga acttcgtggt attccaccag ggctaccttg agaaatcctt aggctactac aggacctcac tccaagaata 60 agggtaatat 120 aggacagtag 180 atcgttcaag 240 atcgtggaaa 300 cctatgcgta 360 ggtatgacgt 420 cgcaccctgc 480 acaaacaaca 540 gacaccatga 600 atactcagac 660 gcatttcact 720 gccgagcact 780 gaaggttatc 840 cgtaagaggg 900 aaaaagttag 960 atcctgatgt cacataacta gctagtcagt taacctagac ttgtccatct tctggattgg taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct aatcactata caaagttgtg tgttatgtgt aattactagt tatctgaata aaagagaaag tatttcttat cctaaatgaa tgtcacgtgt ctttataatt ctttgatgaa ttcattaacc aaatccatat acatataaat attaatcata tataattaat ttagcaaaac aaatctagtc taggtgtgtt ttgcgaattc gatatcaagc -35 200817524 tttgctctag 1440 taattatttt 1500 attttttaaa 1560 taataaatat 1620 cttgttctgt 1680 gtagaatctt 1740 gagtcagaac 1800 aggctggggt 1860 ttcactctga 1920 caatctcgtt 1980 atcaaactca gggttaaata aaaatgtata atttttttta ttacaaaagc cttgtgagtg cagaagacaa tggctcaatt cttccccaat acttaggggc catccaaaca ttaatcatta aaattatatt atttcttaaa attcatcatt gtgtgggagt ataaaaagta ggttgctaca ctaagccgcg ttttccgtca taacatggat tttttaagat attcatgatt aaatgttgca taatacatta aggcaacctg tgcaacaaac ttcaattttc gatgcaaacg ttaactcacc atcttcctta attaattaag tttcatacat agacacttat aaaaatattt gcattgaaac aaatcaaaat aactcagtca gttgaatcta cctgccaccc ccaatcatac aaattaaaag ttgattttga tagacatagt aatactaaca gagagaaaga caaagggcaa acggttgaga acccacaatc ggtttcccta taaattggaa ctcaatgctc ccctctaaac tcgtatcgct tcagagttga gaccaagaca 2040 cactcgttca tatatctctc tgctcttctc ttctcttcta cctctcaagg tacttttctt 2100 ctccctctac caaatcctag attccgtggt tcaatttcgg atcttgcact tctggtttgc 2160 tttgccttgc tttttcctca actgggtcca tctaggatcc atgtgaaact ctactctttc 2220 tttaatatct gcggaatacg cgtttgactt tcagatctag tcgaaatcat ttcataattg 2280 cctttctttc ttttagctta tgagaaataa aatcactttt tttttatttc aaaataaacc 2340 ttgggccttg tgctgactga gatggggttt ggtgattaca gaattttagc gaattttgta 2400 attgtacttg tttgtctgta gttttgtttt gttttcttgt ttctcataca ttccttaggc 2460 ttcaatttta ttcgagtata ggtcacaata ggaattcaaa ctttgagcag gggaattaat 2520 cccttccttc aaatccagtt tgtttgtata tatgtttaaa aaatgaaact tttgctttaa 2580 ctctgttgta ataaccatgc tcctcttcac caaaccctca

attctattat aacttttttt atggctgaaa tttttgcatg tgtctttgct 2640 aatttactgt ttaggtacta actctaggct tgttgtgcag tttttgaagt 2700 cacacaacac aatggcggcc accgcttcca gaaccacccg attctcttct 2760 accccacctt ccccaaacgc attactagat ccaccctccc tctctctcat 2820 ccaaacccaa ccacgctctc aaaatcaaat gttccatctc caaacccccc acggcggcgc 2880 ccttcaccaa ggaagcgccg accacggagc ccttcgtgtc acggttcgcc tccggcgaac 2940 ctcgcaaggg cgcggacatc cttgtggagg cgctggagag gcagggcgtg acgacggtgt 3000 tcgcgtaccc cggcggtgcg tcgatggaga tccaccaggc gctcacgcgc tccgccgcca 3060 tccgcaacgt gctcccgcgc cacgagcagg gcggcgtctt cgccgccgaa ggctacgcgc 3120 gttcctccgg cctccccggc gtctgcattg ccacctccgg ccccggcgcc accaacctcg 3180 -36 200817524 tgagcggcct cgccgacgct ttaatggaca gcgtcccagt cgtcgccatc accggccagg 3240 tcgcccgccg gatgatcggc accgacgcct tccaagaaac cccgatcgtg gaggtgagca 3300 gatccatcac gaagcacaac tacctcatcc tcgacgtcga cgacatcccc cgcgtcgtcg 3360 ccgaggcttt cttcgtcgcc acctccggcc gccccggtcc ggtcctcatc gacattccca 3420 aagacgttca gcagcaactc gccgtgccta attgggacga gcccgttaac ctccccggtt 3480 acctcgccag gctgcccagg ccccccgccg aggcccaatt ggaacacatt gtcagactca 3540 tcatggaggc ccaaaagccc gttctctacg tcggcggtgg cagtttgaat tccagtgctg 3600 aattgaggcg ctttgttgaa ctcactggta ttcccgttgc tagcacttta atgggtcttg 3660 gaacttttcc tattggtgat gaatattccc ttcagatgct gggtatgcat ggtactgttt 3720 atgctaacta tgctgttgac aatagtgatt tgttgcttgc ctttggggta aggtttgatg 3780 accgtgttac tgggaagctt gaggcttttg ctagtagggc taagattgtt cacattgata 3840 ttgattctgc cgagattggg aagaacaagc aggcgcacgt gtcggtttgc gcggatttga 3900 agttggcctt gaagggaatt aatatgattt tggaggagaa aggagtggag ggtaagtttg 3960 atcttggagg ttggagagaa gagattaatg tgcagaaaca caagtttcca ttgggttaca 4020 agacattcca ggacgcgatt tctccgcagc atgctatcga ggttcttgat gagttgacta 4080 atggagatgc tattgttagt actggggttg ggcagcatca aatgtgggct gcgcagtttt 4140 acaagtacaa gagaccgagg cagtggttga cctcaggggg tcttggagcc atgggttttg 4200 gattgcctgc ggctattggt gctgctgttg ctaaccctgg ggctgttgtg gttgacattg 4260 atggggatgg tagtttcatc atgaatgttc aggagttggc cactataaga gtggagaatc 4320 tcccagttaa gatattgttg ttgaacaatc agcatttggg tatggtggtt cagttggagg 4380

ataggttcta caagtccaat agagctcaca cctatcttgg agatccgtct agcgagagcg 4440 agatattccc aaacatgctc aagtttgctg atgcttgtgg gataccggca gcgcgagtga 4500 cgaagaagga agagcttaga gcggcaattc agagaatgtt ggacacccct ggcccctacc 4560 ttcttgatgt cattgtgccc catcaggagc atgtgttgcc gatgattccc agtaatggat 4620 ccttcaagga tgtgataact gagggtgatg gtagaacgag gtactgattg cctagaccaa 4680 atgttccttg atgcttgttt tgtacaatat atataagata atgctgtcct agttgcagga 4740 tttggcctgt ggtgagcatc atagtctgta gtagttttgg tagcaagaca ttttattttc 4800 cttttattta acttactaca tgcagtagca tctatctatc tctgtagtct gatatctcct 4860 gttgtctgta ttgtgccgtt ggattttttg ctgtagtgag actgaaaatg atgtgctagt 4920 aataatattt ctgttagaaa tctaagtaga gaatctgttg aagaagtcaa aagctaatgg 4980 -37 200817524 gtttttcttt ttttagcggt tggtagacgt ggcaatcagt aaaatgcata ttcctttttt ttgtgaccaa tttgttcatg tagaacggat ttgctcgatc ttcacaaagc gataccgaaa gttttcaaaa gtcagaaatg gcaaagttat aaatagtaaa acagaataga tgctgtaatc 5280 gacttcaata acaagtggca tcacgtttct agttctagac ccatcagctg ggccggccac 5340 tagtgagctc ggtacccggg ggcgcgtaat atcatcatta ggaagacact gcccatcttg 5400 aataggattt tagctactaa atatgttgat ggtctttatg aaaaactatt aactaggaat 5460 attatgctac ccatatggaa agaagacgct aggggaatag aaagaccatc aaataaacga 5520 agtcaacacc aggtcttccg aagcattaac aattacctat ttaatatgta ctcagtccgg 5580 gtggatatct cactacattg acgcagtttg ttcaaagacg aacgccctga attatgccat 5640 ctgcttaggc tttcaaatat ggtacgctct aatgccaagc cttatgctgg tcttagggta 5700 ttatcatcaa atctttaagc cagaggtagt taaatacatc aaggacacca taggagtatg 5760 gcacaacgat attgtcaaga tcgcatcaga tctaataggc aataatgaat tcttcatgca 5820 gcccgacgtg ggaacgctcg aaagcagtgg ggcctctggg acagggacca gacctgagtc 5880 gctaacattt gggaataaga gaagtagata tacccaattt tttaactagc caaggaagga 5940 aagcgggaaa ggtccgatac aaaggaaagg gttgcgaggc ttaacgattt agaatatagc 6000 tgttgaggtg gcacttgttc ccccggggcg ggggtatatg cccgtagctt tattctgtca 6060 cttctttcag atcaatgaag ttgaaaagtt atagagtaag ggacccttgt ttacaaagct 6120 gtcactccaa gaactcgaag tcaagcatct tcgggaatat ccagattagt cttcaactag 6180

aatcaggtta catattcaat 5040 cttctcttgg agctcaccta 5100 ttatttactt ttagtggaaa 5160 gcgtccacaa aacgtctctt 5220 gtagattcaa aacttgccat ttggaccatt tccagagata agaaaggata ggaatctcct ttgcagagtt ttcttctcct gctgatgtag cggtaaagtc 6240 aaaagttgga tgcccttttt tctttattta attaattccg ttgatagagc ttttgagcgg 6300 atgcaagcac tagattcttc aacgagtacc aataataaat gaattcacca gactaagaga 6360 agaaaacaga acaaaaagat taagcccagc cgccttcggg aagacctatc ttcgtcggga 6420 ggaagagccc tctttacacc attgtgatta gaaaaaaccg aaaagtggac cggcctagta 6480 accaatagag cggggcttga tccccacttt aaatctattg gatagagccc tcagcccagg 6540 gcaagcgatt gaattctatt tgattatggg ttaggtggaa cctgaaacta gcacttacaa 6600 atgagttagc aaaaggaaaa agacaattct caaatgcgta caagactttc ttccttcttt 6660 gtttaagagg ccagtctgcg atggatgctc gtgcatgaaa aagggctttg atctattcac 6720 cacttatata atagagccaa tctctgcagg acaagatatc tattttgtca ttgggaagta 6780 200817524 aggcttaagt cgacgaaaaa gttaggaaag gggatcatat ggctagggtt gccctcgggg 6840 ctcaagggtt tagcgatgaa gagtgccaag caaaaggtca ataccggtac gccgatcaaa 6900 gaagtccagt ggcaaggccc tttcagccaa gctagcgtgc tgaacagaaa gtcgtagagt 6960 gatgacagct tcttcttctt gagtcattcg tgtgacaaca tcaggatctc gtcgaaagac 7020 ctcctctgcc tatctctccc gcaagagagg actcgttatg gcgcacctct ttttagcagt 7080 ctcgtcaata agataagatt gcccctccct tcttattgat ttgataaagg gctttgtcca 7140 ctccctctct tcttagccga gcggagtgac ggtttagttt aggctttaga tgccactgcg 7200 aaagactcta gagatccact ctcacagcgt atacgcgaca tccctatgta tacacaatcc 7260 tttcaagcag ctaggacagc tagcaagcaa gttatctgtt cgcggacaag ctctctggat 7320 gacaaaaaac atgctctttc atgcggaaaa aacacggtct ttcgtggaag ttggtcgatt 7380 tgaagtcgct ttatgagtga aaatgggtcg atgacgaaaa agacggggaa aatgatcaac 7440 tgtcacattt tgatgccagt ttagggctaa aatgaacttt catccaaaaa gaccgagaaa 7500 acgctccact ggcaggatcc gatcggaaat aa 7532 <210> 43 <211〉 181 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>轉殖品項3560 · 4 · 3 · 5轉殖基因插入片段5 ·端的第一個181核苷酸 <400〉 43 ggccgctcta gagatccgtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcaaa aggacagtag 180 a 181 <210〉 44 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 引子 104312 <400> 44 agatccgtca acatggtgga gcac 24 <210> 45 <211> 26 <212〉 DNA <213〉人工序列 -39 <220〉 26200817524

<223> 引子 104314 <400> 45 tgacagatag ctgggcaatg gaatcc <210〉 46 <211> 14 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> TaqMan 探針 125323 <400> 46 tatcgggaaa cctc <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子109893(內生性對照） <400> 47 ctttgctgtt tgattgctgg gttgtc <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子109894(內生性對照） <400> 48 tgtgtggacc cattggcctt tagattat <210> 49 <211> 16 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉TaqMan探針125322(內生性對照) 14 26 28 <400> 49 actctgcagt tgcctt <210> 50 <211〉 29 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 引子 1473 <400> 50 ttatttccga tcggatcctg ccagtggag 16 40 29 200817524

<210〉 51 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 引子 1504 <400> 51 ccaccatgtt gacggatctc tag <210> 52 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 引子 1505 <400> 52 gcaatggaat ccgaggaggt ttc <210〉 53 <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223> 引子 1506 <400> 53 gcaatgatgg catttgtagg tg <210> 54 <211> 28 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> 引子 1549 <400〉 54 aaactgaagc gatggcagaa ccgcacag <210> 55 <211> 35 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉引子 1550 <400> 55 tcgaagtggc aatagagcca cacaatatcg ataag 23 23 22 28 4l· 35