SK285810B6 - Kompozícia obsahujúca živinu a rastlinu a jej použitie - Google Patents

Abstract

Opisuje sa kompozícia obsahujúca živinu a rastlinu, pričom živinou je kyselina folová a rastlina zahŕňa rastlinný extrakt z rodu Echinacea a ďalej z rodu Commiphora. Pomer Commiphora myrrha k Echinacea purpurea je v rozmedzí od 1 : 2 do 1 : 4.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný patent sa týka ľudskej vírusovej imunodeficiencie a obzvlášť liečby a prevencie ľudskej vírusovej imunodeficiencie a iných mikrobiálnych infekcií.

Doterajší stav techniky

Je známe, že v súčasnosti je vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV) infikovaných okolo 22 miliónov ľudí na celom svete. Najväčší pomer nových prípadov HIV je zaznamenaný v Afrike a v Karibiku. Typická progresia HIV infekcie je rozdelená do rozličných štádií: 1. vírusové nakazenie, 2. akútny retrovírusový syndróm, 3. sérokonverzia, 4. klinické latentné obdobie s alebo bez trvalej celkovej lymfadenopatie (PGL), 5. včasná symptomatická HIV infekcia, predtým známa ako komplex prejavov AIDS alebo ARC a nedávno tiež nazývaná ako „B symptómy“ podľa CDC klasifikácie z roku 1993, 6. syndróm získanej straty imunity (AIDS) (indikačnou podmienkou AIDS podľa CDC kritérií z roku 1987 a revidovaných CDC kritérií z roku 1993 je množstvo CD4 buniek <200/mm³), 7. rozvinutá HIV infekcia charakterizovaná množstvom CD4 buniek <50/mm³. CD4 bunky sú cieľové lymfocyty pre HIV. V roku 1993 CDC zmenila definíciu AIDS, ktorá zahŕňa všetkých pacientov s množstvom CD4 buniek <200/mm³. Táto definícia zahŕňa pacientov v 4 - 7 štádiu bez ohľadu na symptómy.

Počiatočný akútny retrovírusový syndróm je sprevádzaný prudkým znížením množstva CD4 buniek, vysokou kultivačnou plazmovou virémiou a vysokou koncentráciou HIV RNA v plazme. Klinické vyliečenie nastane a vysoká hladina HIV RNA plazmovej virémie je redukovaná rozvinutím odozvy cytotoxických T lymfocytov (CTL). Množstvo CD4 buniek sa postupne znižuje počas niekoľkých rokov a 1,5 - 2 roky pred zistením diagnózy AIDS toto množstvo prudko klesne. Koncentrácia HIV RNA v plazme je relatívne stabilná, pokiaľ je HIV v latentnej forme a množstvo CD4 buniek je <200/mm³. Klinický priebeh je charakterizovaný infekciou, vybranými tumormi, chradnutím a neurologickými komplikáciami. Vo všeobecnosti, u približne 10 % pacientov sa rozvinie diagnosticky definovaný AIDS predtým, ako sa množstvo CD4 buniek zníži na 200 mm³. Ak množstvo CD4 buniek je pod 200/mm³, do 12 až 18 mesiacov sa objavia komplikácie. Pri absencii terapie zameranej proti HIV alebo PCP profylaxii, priemerný čas od vírusového nakazenia až do diagnostikovania AIDS je asi 10 rokov a prežitie po komplikáciách spojených s AIDS bolo predtým 1 rok.

Celé poradie udalosti trvá u priemerného pacienta, pri absencii liečby zameranej proti HIV, približne 10 rokov od sérokonverzie k smrti. Priemerný čas od HIV sérokonverzie do AIDS bol určený na 7 rokov pre príjemcov transfúzií, 10 rokov pre hemofilikov, 10 rokov pre užívateľov drog a 8 až 12 rokov pre homosexuálov. Podobná rýchlosť progresie závisí od pohlavia, rasy a príslušnosti ku rizikovým kategóriám, ak sa prispôsobili kvalite starostlivosti. Pre 16-24 ročných pacientov so sérokonverziou bol priemerný čas 15 rokov, pre pacientov nad 35 rokov so sérokonverziou to bolo 6 rokov.

HIV infekcia môže byť získaná počas pohlavného styku, pri transfúzii kontaminovanej krvi, pri drogových návykoch s infikovanými ihlami alebo perinatálnym prenosom. Symptomatická primárna HIV infekcia tiež označovaná ako akútny retrovírusový syndróm bola opísaná v predchádzajúcich rizikových kategóriách s frekvenciou 50 až 90 %. Tento syndróm bol opísaný u siedmich z ôsmich zdravotníckych pracovníkov, ktorí boli HIV infikovaní dôsledkom pracovnej expozície. Čas od expozície až do začiatku symptómov je obyčajne 2-4 týždne, ale inkubačný čas môže byť dlhší ako 6 týždňov. Typickými symptómami sú: horúčka, adenopatia, faringitída, vyrážky zahrnujúce makulopapulámy erytém s 5 - 10 mm íéziami na tvári alebo trupe niekedy na končatinách vrátane dlaní a chodidiel alebo mukokutánna ulcerácia na ústach, pažeráku alebo genitáliách, ďalej bolesti svalov alebo kĺbov, hnačky, bolesti hlavy, hepatosplenomegalia, afty, nauzea a vracanie. Neurologické symptómy môžu zahrnovať: meningoencefalitídu, periférnu neuropatiu, ochrnutie tváre, Guillain-Berré syndróm, brachiálnu neuritídu, radikulopatiu, kognitivne poruchy a psychózy. Akútne ochorenie je všeobecne sprevádzané vysokou hladinou HIV virémie s p24 antigenémiou, plazmovou virémiou a vysokým titrom HIV v periférnych krvných jednojadrových bunkách.

Prvá je odpoveď cytotoxických T lymfocytov (CTL) a obyčajne predchádza preukázateľnej humorálnej odpovedi počas niekoľkých týždňov. CTL odpoveď je sprevádzaná 3 - 5 log znížením koncentrácie HIV v periférnej krvi. Vysoká hladina virémie počas akútnej fázy ochorenia môže byť asociovaná s disemináciou vírusu do CNS a lymfatického tkaniva. Lymfatické tkanivo slúži ako majoritný rezervoár pre samotný vírus a jeho replikáciu. Infekcia nelymfoidných orgánov s vysokou hladinou HIV sa môže objaviť v neskorších fázach HIV.

Prítomnosť symptómov skôr ako asymptomatická sérokonverzia predlžuje ochorenie viac ako o 14 dní a zdá sa, že urýchľuje progresiu k AIDS. Sérokonverzia s pozitívnou HIV sérológiou sa vo všeobecnosti uskutočni počas 6-12 týždňov nakazením tak ako pri transfúzii alebo poranení ihlou u zdravotníckych pracovníkov. Priemerný interval je 63 dní. CTL odpoveď je spojená s prudkou redukciou kvantity vírusového zaťaženia v krvi, klinickým uzdravením z akútneho retrovírusového syndrómu a návratom množstva CD4 buniek do vyšších hladín, ktoré sú často v normálnom stupni podľa viacerých laboratórií.

HIV pacient sa stane klinicky asymptomatický a vo všeobecnosti nemá fyzický nález okrem trvalej celkovej lymfadenopatie (PGL), ktorá zahrnuje zväčšenie lymfatických uzlín. Štúdie lymfatických uzlín majú vysokú koncentráciu HIV ako extracelulárneho vírusu zachyteného na folikulárnych dendritických bunkách spracovaných bez strednej proliferatívnej časti lymfoidného folikulu a ako intracelulámeho vírusu prevládajúceho v latentnej forme. Lymfatické tkanivo slúži ako majoritný rezervoár pre HIV, folikuláme dendritické bunky, ktoré filtrujú a zachytávajú voľný vírus a infikované CD4 bunky a teda množstvo vírusu v periférnej krvi jednojadrových buniek je relatívne nízke. S progresiou ochorenia je rozrušená konfigurácia lymfatických uzlín vplyvom HIV.

Virologické štúdie u pacientov s asymptomatickou HIV infekciou ukazujú vysoký stupeň HIV replikácie s produkciou priemerne 10⁹ viriónov denne. Replikácia vírusu je sprevádzaná mohutnou deštrukciou a produkciou CD4 buniek 10⁹ denne. Nadbytok CD4 buniek predstavuje 6 - 7 % z celkového množstva CD4 buniek. Tento nadbytok sa vytvorí každých 15 dní. Ochorenie AIDS bolo považované ako následok nepretržitej, vysokostupňovej replikácie HIV-1 vedúcej ku vírusovej a imunosprostredkujúcej terminácii na CD4 lymfocytoch.

Pokročilá HIV infekcia sa vyskytuje u pacientov s množstvom CD4 buniek <507mm³. Takýto pacienti majú limitovanú pravdepodobnú dĺžku života s pravdepodobnosťou prežitia 12-18 mesiacov. Prakticky všetci pacienti,

SK 285810 Β6 ktorí zomreli na komplikácie súvisiace s HIV, sú podľa počtu CD4 buniek v tejto skupine.

The Food & Drug Administration (FDA) schválila množstvo inhibítorov reverzných transkriptáz (RT). RT enzýmy konvertujú vírusovú RNA do DNA. RT enzýmy môžu stratiť túto svoju schopnosť a inhibítor RT AZT, ktorý je predávaný pod značkou Retrovir a zidovudín od Glaxo Weílcome, bol schválený FDA v 1987. RT inhibítor ddl, ktorý je predávaný pod značkou Videx a didanozín od Bristol-Myers Squibb, bol schválený FDA v 1991. RT inhibítor ddC, ktorý je predávaný pod značkou HIVID a dideoxycytidin od Hoffman-LaRoche, bol schválený FDA v 1992. RT inhibítor d4T, ktorý je predávaný pod značkou Zerit a stavudín od Bristol-Myers Squibb, bol schválený FDA v 1994. RT inhibítor 3TC, ktorý je predávaný pod značkou Epivir a lamivundín od Glaxo Wcllcome, bol schválený FDA v 1995. RT inhibítor Nevirapin, ktorý je predávaný pod značkou Viramune od Boehringer Ingelheim, bol schválený FDA v 1996.

The Food & Drug Administration (FDA) v súčasnosti schválila tri inhibítory proteázy na liečbu infekcie spôsobenej vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV). Saquinavir predávaný pod značkou Invirase od Hoffman-LaRoche Laboratories, bol prvou proteázou inhibujúcou činidlo (vírus) a bol schválený FDA. Ritonavir, iný inhibítor proteázy, ktorý je predávaný pod značkou Norvir od Abbott Laboratories odporučený FDA a schválený v marci 1996, ako aj Indinavir predávaný pod značkou Crixivan od Merck & Co.

Inhibítory proteázy majú odlišný mechanizmus účinku ako predchádzajúce schválené anti-HIV liečivá, tak ako nukleozidové analógy AZT a 3TC predávané pod značkou zidovudín a lamivundín od Glaxo Wellcome, ddl a d4T predávané pod značkou didanozín a stavudín od Bristol-Myers Squibb a ddC predávané pod značkou dideoxycytidín od Roche Laboratories. Inhibítory proteázy zablokujú enzýmy, ktoré HIV potrebuje na dokončenie svojho replikačného cyklu a na sformovanie nových životaschopných vírusov. Bez enzýmu proteázy vírusové štrukturálne proteiny nemôžu byť správne vytvorené a tak sa vytvorí chybný neinfekčný vírus. Nukleozidové analógy blokujú iný enzým - reverznú transkriptázu. Jej účinok je v blokovaní prepisu vírusovej RNA do vírusovej DNA, ktorá môže byť začlenená do DNA ľudských buniek. Kombinácia jedného alebo viacerých inhibítorov reverznej transkriptázy s inhibitorom proteázy, niekedy označovaná ako „koktail“, je nevyhnutná na napadnutie HIV replikácie v dvoch bodoch replikačného cyklu. Klinický pokus kombinácie saquinaviru s AZT, ddC alebo oboch demonštruje väčšie zníženie počtu HIV častíc v krvi, niekedy tiež označované ako vírusové zaťaženie a väčšie zvýšenie CD4 buniek (T lymfocytov), ktoré bolo predtým pozorované s inhibítormi reverznej transkriptázy. Niekedy je „koktail“ toxický a neúčinný pre niektorých pacientov. Klinická prospešnosť alebo redukcia rýchlosti progresie ochorenia nebola úplne preukázaná pre kombináciu (koktail) inhibítorov RT a inhibítorov proteázy. Lekári však začali radšej brať do úvahy HIV ako chronické zdĺhavo liečiteľné ochorenie, než by prijali rozsudok smrti.

Saquinavir ako inhibítor proteázy bol schválený FDA na použitie v kombinácii s inhibítormi reverznej transkriptázy u pacientov s rozvinutým AIDS. Proteázový inhibítor saquinavir môže byť tolerovaný niektorými pacientmi bez hematologických alebo neurologických toxicít, ktoré sú bežné s nukleuzidovymi analógmi. Iné predpisované lieky zahrnujúce rifampín, rifabutín, fenobarbital, dilantín a dexametazón môžu výrazne znižovať hladinu proteázového inhibítora saquinaviru v plazme a pacienti sa tak môžu vyhnúť užívaniu saquinaviru. Taktiež bola opísaná vírusová rezistencia na proteázový inhibítor saquinavir, ako aj na iné anti-HIV liečivá.

Ritonavir a indinavir ako inhibítory proteáz sa zdajú byť viac účinnejšie proti HIV ako bežná formulácia saquinaviru. Proteázový inhibítor ritonavir si vyžaduje chladenie. Proteázový inhibítor ritonavir sa bežne používa v kombinácii s nukleozidovými analógmi (lieky ako AZT) alebo ako monoterapia. V skorších štúdiách sa liečilo 32 pacientov s ritonavirom plus AZT plus ddC. Po 20 týždňoch sa stredné množstvo (medián) CD4 buniek zvýšilo z 83 buniek/mm³ na základnú líniu 106 buniek/mm³. Vírusové zaťaženie (meranie počtu vírusových kópií v krvi) sa znížilo takmer o 100-násobok. Ritonavir je dávkovaný v 600 mg orálne dvakrát za deň, pričom je požadované požitie 12 kapsúl každý deň. Liečivo je prístupné v 100 mg kapsulách. Vedľajšie účinky sú dosť bežné, zahrnujú gastrointestinálne symptómy s nauzeou, zvracanie a hnačky. Iné vedľajšie účinky zahrnujú zníženú citlivosť napr. pri bodnutiach, osobitne v okolí úst a zápal pečene porovnateľný s istým druhom hepatitídy.

Indinavir ako proteázový inhibítor bol FDA prijatý urýchlene a súhlas na predaj bol založený na štúdiách demonštrujúcich priemerné zrýchlenie počtu CD4 buniek asi na 100 buniek/mm³ a pokles vírusového zaťaženia takmer o 100-násobok pri kombinácii AZT plus 3TC plus indinavir. Indonavir je dávkovaný v 800 mg orálne trikrát za deň (2 kapsuly trikrát denne). V porovnaní s ritonavirom, indinavir sa užíva na prázdny žalúdok, aby sa lepšie absorboval. Indinavir ma menší gastrointestinálny vedľajší účinok ako ritonavir a zdá sa byť celkovo lepšie tolerovaný niektorými pacientmi. Hlavný vedľajší účinok indinaviru ako proteázového inhibítora je tvorba obličkových kameňov. Liečivo je čiastočne vylučované močom a ak nie je udržiavaná adekvátna hydratácia, môžu sa tvoriť kryštáliky, ktoré tvoria kamene. Proteázový inhibítor indinavir môže tiež pôsobiť na pečeň, ovplyvňuje hladinu bilirubínu v krvi, t. j. žlčové pigmenty sa tvoria v narušených červených krvinkách. Proteázový inhibítor indinavir môže tiež zapríčiniť interakcie lieku.

Analýza rezistencie na proteázové inhibítory nebola úplne zistená. Saquinavir a ritonavir ako proteázové inhibítory môžu bežne stáť pacientov približne 600 U. S. S za mesiac. Proteázový inhibítor indinavir má hodnotu asi 30 % z tejto sumy. Kombinácia troch liečiv AZT plus 3TC plus ritonavir môže stáť pacienta cca 1000 U. S. $ za mesiac. Kombinácia (koktaily) RT inhibítorov a proteázových inhibítorov môže stáť viac ako 25 000 U. S. $ za rok. Hoci proteázové inhibítory môžu byť nápomocné, lekárska komunita a ani spoločnosť v súčasnosti nevedia riešiť finančné problémy pacientov spojené s vysokou cenou liečiv.

Vírus herpes simplex (HSV) bežne označovaný ako „herpesový vírus“ alebo „herpes“ je infekčné ochorenie, ktoré dosahuje kritický počet u obyvateľstva s odhadom počtu infikovaných ľudí na 70 % - 80 % v populácii zaznamenaných Americkou spoločnosťou pre zdravie a spoločnosť (ASHA) a s ročným nárastom o 500 000 ľudí. Sú dva bežné typy herpesového vírusu: herpes simplex vírus 1 (HSV 1) a herpes simplex vírus 2 (HSV 2). Herpes vstupuje do ľudského tela cez miniatúrne trhliny v epidermálnom tkanive, obyčajne kontaktom s infikovaným hostiteľom a infekcia je rozpoznateľná výsevom jednej alebo viacerých vezikúl, zvyčajne v skupine, pokračujúca inkubačným časom v priemere 4 dni. Typický priebeh prepuknutia infekcie je iniciovaný príznakovým štádiom, postupným výsevom vezikúl, pokračujúci ulceráciou, splynutím, vstrebaním a latentnou periódou. Prepuknutie trvá niekoľko týždňov a v priemere trvá dva-tri týždne. U niektorých imúnne oslabených jedincov prepuknutie môže trvať mesiac. Vezikuly sa môžu objaviť kdekoľvek na koži alebo sliznici, typickým miestom výskytu sú pery, žľazy, ústna sliznica, spojovka a rohovka, genitálie, análna sliznica a perianálne tkanivo.

Symptómy herpesu zahrnujú: ingvinálny opuch, bolesť, horúčku, nevoľnosť, bolesti svalov a opuch žliaz. Niektorí jedinci, ktorí majú oslabený trojklanný nerv oparom, majú bolesti tvárovej časti obzvlášť pri prehltaní a jedení a majú aj tvárové opuchy. Jedinci so zasiahnutým krížovým nervom majú silné bolesti hornej časti dolnej končatiny, opuchy a veľké problémy s chodením.

Infekcia vírusom jednoduchého oparu (HSV) je opakujúca sa. Vírus prebýva v nervových gangliách. Opakovanie infekcie spôsobuje určité, v súčasnosti ešte neznáme, podráždenie. Opakujúce sa herpetické infekcie môžu byť vyvolané takmer hocičím, vrátane: vystavenia sa vplyvu slnečného žiarenia, potravinovými defícienciami, stresom, menštruáciou, imunosupresiou, istým druhom potravy, liečivami, horúčkovitými ochoreniami atď. Nedávno bol herpesový vírus izolovaný zo srdcového tkaniva.

Infekcie HSV 1 a HSV 2 predstavujú veľmi vážne ohrozenia zdravia, často vedú: k slepote, zvýšenému riziku rakoviny krku, aseptickej meningitíde a eneefalitíde, smrti novorodencov, virémie atď. HSV je zodpovedný aj za vážne psychické a emocionálne ťažkosti podobne ako značné ekonomické straty národov a sveta.

Navrhli sa rozličné liečby herpesu, ktoré zahrnujú lokálnu aplikáciu prostriedkov ako povodon-iodín, idoxuridín, trifluorotymidín alebo acyklivir. Takéto liečby sa stretli s rozličným stupňom úspechu. Mnohé prioritné liečby doslova sklamali. Acyklivir užívaný orálne pri systematickom liečení HSV je sčasti účinný. Ale acyklovir je úspešný len v prerušení replikácie vírusu. Nie je úspešný v liečbe prepuknutia infekcie a to ani systematicky ani lokálne. Zaznamenali sa rezistentné kmene vírusu na acyklivir. Jedinci s AIDS sú vážne imúnne oslabení a trpia špeciálne oslabujúcimi vypuknutiami HSV. Navyše pacienti s AIDS môžu nosiť rezistentné kmene HSV na acyklivir a tým sa stane acyklovir u nich neúčinným.

Wainberg a kol. (Árch. AIDS Res., 1 (1), 1987, str. 57 až 58) zistili, že benzalkónium chlorid znižuje aktivitu HIV-1 reverznej transkriptázy po jeho pôsobení na vírus.

US 4 797 420 opisuje dezinfekčnú čistiacu formuláciu pre pevné povrchy. Formulácia obsahuje alkyldimetylbenzylamóniumchlorid a je účinná najmä proti vírusom herpes simplex.

Preto je žiaduce vyvinúť bezpečnú a úspešnú liečbu pomáhajúcu liečiť a predchádzať takým vážnym problémom ako sú HIV a iné infekčné ochorenia.

Podstata vynálezu

Vylepšená medicinálna liečba a poskytované liečivo, ktoré je systematicky používané, inhibuje prichytenie vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV) na cieľové bunky a tak predchádza šíreniu HIV. Výhodné využitie novej medicinálnej liečby a liečiva môže byť prospešné v prevencii pohlavného šírenia HIV a iných vírusov. Vylepšená medicinálna liečba a liečivo sú hlavne bezpečné, menej finančne náročné a účinné.

Vylepšené liečivo, tiež označované ako Viracea 2 HIV-4, obsahuje novú liečebnú kompozíciu, formuláciu, antimikrobiálnu zlúčeninu a roztok. Nové antimikrobiálne liečivo a mikrobicidálne liečivo sú úspešné v systematickej liečbe primárneho HIV a môžu byť použité v liečbe iných mikrobiálnych infekcií, ale neobmedzuje sa len na ne: vírus varicella zoster (herpes zoster, pásový opar) a cytomegalovírus. Za niektorých okolností môže byť žiaduce použiť nové liečivo aj lokálne.

Nové liečivo a antimikrobiálna zlúčenina sú čiastočne užitočné pri výraznom inhibovaní infekcie HIV, môžu byť tiež užitočné v liečbe iných mikrobiálnych ochorení (ochorenia spôsobené mikroorganizmami) ako napr.: vírus Epstein Barr, papilámy vírus, stafylokokus, streptokokus, mykobaktéria, chrípka, parachrípka, adenovírus, eneefalitída, meningitída, arbovírus, arenavirus, anaeróbne bacily, pikomavírus, koronavírus a syncytialvirus, a tiež aj herpes simplex vírus, varicella zoster vírus a cytomegalovírus.

Takáto liečba a liečivo sú čiastočne užitočné pri inhibovaní HIV a iných infekčných ochorení u ľudí (homo sapiens), tiež môžu byť použité pri veterinárne schválenej liečbe vírusových a bakteriálnych infekcií a infekčných ochorení zvierat ako napr.: psov, mačiek, vtákov, koní, dobytka, oviec, ošípaných a iných chovných zvierat, taktiež aj hlodavcov a iných zvierat chovaných v ZOO.

Zlepšené lekárske ošetrenie a samotné liečivo predkladané v tomto vynáleze poskytujú výhodné, neočakávané, prekvapujúce dobré výsledky. Jednoduché použitie mikrobicídncho roztoku môže poskytovať okamžitú absorpciu pri parenterálnej aplikácii. Po aplikácii sa môže objaviť mierny bodavý účinok. Počas niekoľkých minút po aplikácii môže byť zažitá nepríjemná chuť v ústach. Počiatočné testovanie in vitro novej medicinálnej liečby a liečiva ukazuje extrémne prekvapivý inhibičný účinok na vírus HIV. Nové liečivo je vhodne vyrobené z ľahko dostupných chemikálií alebo produktov a poskytuje bezpečné a ekonomické spracovanie.

Výhodou tohto nového liečiva (medicinálna kompozícia) je, že obsahuje mikrobiálne inhibítory, ktoré inhibujú, potláčajú a zastavujú mikrobiálnu infekciu pri ochoreniach spôsobených mikroorganizmami. Mikrobiálne inhibítory sa skladajú z antimikrobiálnych inhibítorov, rastlinných extraktov alebo fytochemikálií, pochádzajúcich prinajmenšom z jednej alebo viacerých uvádzaných špeciálnych rastlín. Mikrobiálne inhibítory môžu obsahovať vírusové inhibítory, ktoré inhibujú vírusové ochorenia ako: HIV, herpes simplex vírus 1 (HSV 1), herpes simplex vírus 2 (HSV 2), vírus varicella zoster (herpes zoster), cytomegalovírus, vírus Epstein Barr, papilámy vírus, vírus chrípky, vírus parachrípky, adenovírus, vírus eneefalitídy, vírus meníngitidy, arbovírus, arenavirus, pikomavírus, koronavírus a syncytialvirus. Mikrobiálne inhibítory môžu tiež obsahovať bakteriálne inhibítory, ktoré inhibujú bakteriálne ochorenia ako: stafylokokóza, streptokokóza, mykobakterióza, bakteriálna eneefalitída, bakteriálna meningitída a anaeróbna bacilóza. Za určitých okolností môžu mikrobiálne inhibítory obsahovať aj plesňové inhibítory.

Lepšie výsledky môžu byť dosiahnuté, ak Echinacea a Commophora (tiež označovaná ako Commiphora) alebo iné rastliny sú použité v liečive v ich surovom, nespracovanom, prírodnom stave. Pre rovnako dobré výsledky liečivo môže obsahovať: arabinózu, betaín, celulózu, meď, fruktózu, mastné kyseliny, galaktózu, glukózu, železo, draslík, proteín, živicu, sacharózu a xylózu.

Zlepšenie medicinálnej liečby zahrnuje nový spôsob a postupy na použitie v liečbe infekčných ochorení. V niektorých infekčných ochoreniach mikrobiálne inhibítory môžu byť aplikované a udržiavané na infikovanej ploche (oblasť alebo povrch) až dovtedy, kým vonkajšie symptómy a somatické prejavy infekcie nezmiznú. Liečivo sa môže podávať injekčnou striekačkou, podjazykovo intramurálne, sprejovo, v tabletách, výterom, odsatím, nanášaním štetcom, liatím, dispenzáciou, pokrývaním alebo navrstvením liečiva na mikroorganizmami infikovanú plochu, tak ako aj na: lymfatické uzliny, lymfatický systém, T-bunky, ústnu sliznicu, nosnú sliznicu, vaginálne tkanivo, labiálne tkanivo, rektálne tkanivo, análne tkanivo, perianálne tkanivo, pery, kožné tkanivo, očné tkanivo, očnú spojovku a očné viečka.

Prednostnejšie sa mikrobiálne inhibítory alebo antimikrobiálne zlúčeniny aplikujú systematicky injekčnou striekačkou rektálne alebo vaginálne zabezpečujúc tak liečbu ako aj prevenciu pred pohlavným nakazením sa HIV. Mikrobiálne inhibítory alebo antimikrobiálne zlúčeniny sa môžu aplikovať predchádzajúcim spôsobom 4 až 20-krát za deň počas 4 až 18 za sebou nasledujúcich dní, čím dôkladne znižujú vírusové zaťaženie pacientov infikovaných s HIV, t. j. znižujú množstvo HIV a vírusu AIDS v tele.

Zlepšené liečivo, medicinálna kompozícia alebo mikrobiálna zlúčenina sú fytochemickým kocentrátom, ktorý je zložený a súčasne alebo zhodne aplikovaný s povrchovo aktívnym činidlom, živinou a nosičom, rozpúšťadlom alebo riedidlom a tvorí tak mikrobicídny liečebný roztok. Živina slúži ako katalyzátor, aktivátor, fytochemický iniciátor, výživový doplnok a pomocný nosič. Živina môže obsahovať jeden alebo viacero vitamínov rozpustných vo vode, vitamínov rozpustných v tukoch, vitamín A, vitamíny B komplexu, vitamín D, vitamín E, vitamín K, vitamín BI, vitamín B2, vitamín B5, vitamín B6, vitamín B12, vitamín B15 a prednostne folacín alebo kyselinu folovú (kyselinu listovú).

Zaujímavý mikrobicídny roztok obsahuje antimikrobiálny detergentný surfaktant s rastlinnými extraktmi. Surfaktanty (povrchovo aktívne látky) sú prednostne katiónové surfaktanty, ktoré môžu obsahovať samotný alebo niekoľkonásobný kvartémy amónium chlorid majúci 6-18 uhlíkov, ako je alkylbenzyldimetylamónium chlorid, zmesi týchto zlúčenín: alkylbenzyldimetylamónium chlorid, alkyldimetyl/etylbenzylamónium chlorid, diizobutylfenoxyetoxyetyldimetylbenzylamónium chlorid, N-(C₁₂C|₄C_]6)dimetylbenzylamónium chlorid, benzalkónium chlorid, oktyldecyldimetylamónium chlorid, didecyldimetylamónium chlorid, dioktyldimetylamónium chlorid, dialkyldimetylamónium chlorid, dialkylmctylbenzylamóniumchlorid, oktyldecyldimetylamónium chlorid, dimetylbenzylamónium chlorid, lauryldimetylbenzylamónium chlorid, o-benzyl-p-chlorofenol, dideryldimetylamónium chlorid, doktyldimetylamónium chlorid, alkyl (C_l4C]₂C₁₆)dimetylbenzylamónium chlorid a prednostne obsahujú alkylbenzyldimetylamónium chlorid, obzvlášť benzalkónium chlorid. Stupeň aktivity katiónových surfaktantov môže byť 5 % - 90 %, ale pre najlepšie výsledky je to 8 % - 20 %. Kvartéme amónne soli sú komerčne dostupné. Za určitých podmienok môžu byť potrebné iné surfaktanty, ale neobmedzujú sa len na ne: DMSO, surfaktanty kyseliny glykolovej, enzýmové surfaktanty, amfolytické surfaktanty, cviteriónové surfaktanty a neiónové surfaktanty. Surfaktanty môžu obsahovať detergenty, zvlhčujúce činidlá, emulzifikátory, odpeňovače a/alebo prostriedok redukujúci povrchové napätie. Nosiče sú potrebné na zmiešanie zložiek, na udržiavanie zložiek v roztoku a poskytujú jednoduché metódy aplikácie na zasiahnuté plochy, buď vo forme spreju, rozprašovača, alebo aplikátora. Pre lepšie výsledky je uprednostňovaný vodný roztok, prednostne sterilný vodný nosič a rozpúšťadlo, ale za určitých podmienok môžu byť použité aj iné kvapalné alebo pevné nosiče, ako sú: glycerín, minerálny olej, oxid kremičitý, bavlníkový olej, kokosový olej, rastlinný olej, olej z rastlinných semien, rybí olej alebo olej z iných zvierat, alkohol, mastenec, kukuričná múka, včelí vosk, karnaubský vosk, betakarotén, cesnakový olej, gáfrový olej, rozpustné vitamíny, rozpustné minerály, repkový olej, orechový olej, olivový olej, lipozómy, kyselina askorbová, prvosienkový olej, pyknogenol, hroznový olej, lanolín, etocín, kolagén, aloe vera, včelí peľ, royal želé, chondroitin sulfát A, morské rastliny, EDTA, mastné kyseliny, byliny, lecitín, bioflavinoidy, obilné oleje alebo prášky, riasy, čaje, octy, acidofílus, bunkové soli, kyselinu askorbovú, hydra 5, glandulíny, aminokyseliny, psylium, rastlinné deriváty a iné sterilné nosiče.

Rastlinné extrakty antimikrobiálnych izolátov alebo fytochemikálií obsiahnuté v tomto novom liečive a liečbe zahrnujú: myrhové živice, sekviterpény, kurzenón, dihydro fuanodién-6-ón, 2-metoxylferándién, kyselinu octovú, a-a-myrón, arabinózu, α-bisabolén, gama-bisabolén, kadinén, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferín, kyselinu o-komiforovú, kyselinu β-komiforovú, kyselinu gamakomiforovú, kyselinu komiforínovú, m-krezol, kumik alkohol, kumínaldehyd, dipentén, elemol, 3-epi-alfa-amyrín, eugenol, furanodién, furanodienón, galaktózu, kaučuk, heerabolén, alfaheerabomyrhol, beta-heerabomyrhol, heeraborezén, limonén, 4-0-metylglukurónovú kyselinu, n-nonacezán, beta-sitosterol, xylózu, karopylény, linderstyrény, arabinózu, betaín, echinacén, echinacín B, echinakozid, echinolón, enzýmy, fruktózu, mastné kyseliny, galaktózu, glukózu, kyselinu glukurónovú, inulin, inuloid, pentadekadién, polyacetylénové zlúčeniny; polysacharidy tak ako napr. arabinogalaktán, živica, ramnóza, sacharóza, taníny, vitamíny A, C a E, alkylamidy, apigenín, arabinogalaktóza, kyselina askorbová, behénová kyselina-etylová kyselina, betaín, borneol, bomylacetát, kyselina kávová, 2-O-kávoyl-3-(5-alfa-karboxybeta)-3,4-dihydroxyfenyl, 2-O-kávoyl-3-O-kumaroyltartarová kyselina, 6-O-kávoylechinakozid, 2-0-kávoyl-3-O-feruloyltartarová kyselina, 2-0-kávoyltartarová kyselina, vápnik, uhličitan, betakarotén, karofylén, karofylén-epoxid, kyselina chlorogénová, cichorová kyselina, metylester cichorovej kyseliny, kyanadín-3-0-P-d-glykopyranozid), kynadín-3-(6-0-malonyl β-d-glykopyranozid), cynarín, deka (2e,4e,6e)izobutylamid triénovej kyseliny, desramnozylverbaskozid, 3,5-dikávoylchinónová kyselina, 4,5-0-dikávoylchinínová kyselina, 2,3-0-diferuloltartarová kyselina, izobutylamid dodeka-(2e,4e)-diénovej kyseliny, dodeca-2,4-dién-l-yl izovalerát, izobutylamid dodeka-(2e,6z,8e,10e)-tetraénovej kyseliny, beta-famezén, 2-0-feruloytartarová kyselina, germakrén, heptadeka-(8z,l lz)-dién-2-ón, heteroxylán, humulén 8-12, (e)-10-hydroxy-4, 10-dimetyl-4,l l-dodekadién-2-ón, 13-hydroxyoktadeka-(9z,lle,15z)-triénová kyselina, inulin, izochlorogénová kyselina, izoramnetín-3-rutinozid, izotusilagín, kaempferol, kaempferol-3-glukozid, kaempferol-3-nutinozid, limonén, luteolín, luteolin-7-glukozid, 2-metyltetradeka-5,12-dién,

2-metyltetradeka-6,12-diencén, metyl-p-hydroxycinamát, mareín, niacín, palmitová kyselina, pentadeka-(8z,llz)-dién-2-ón, pentadeka-(8z,13z)-dién-l l-lyn-2-ón, pentadeka-8en-2ón, pentadeka-(8z)-én-2-ón, pentadeka-(8z)-én-1 l,13-dién-2-ón, 1-pentadecén, penta-(l,8z)-dién, fosfor, a-pinén, β-pinén, polyacetylény, pontika epoxid, chercetagetin-7-glukozid, chcrcetín, chercetín-3-galaktozid, chercetín-3-glukozid, chercetín-3-robinozid, chercetín-3-xylozid, chercetín-3-xylozylgaktozid, ramnoarabinogalaktán, riboflavín, rutín, rutozid, β-sitosterol, sitosterol-3^-0-glukozid, sodík, stigmasterol, sulfát, tartarová kyselina, tetradeka-(8z)-én-l 1,13-dién-2-ón, tiamín, n-triacontanol, trideka-l-én-3,5,7,9,10-pentaín, tusilagín, vanilin, verbaskozid. Pre lepšie výsledky fytochemické koncentráty zahrnujú okrem fytochemikálií aj arabinózu, betaín, celulózu, fruktózu, mastné kyseliny, galaktózu, glukózu, sacharózu a xylózu.

Rastlinné extrakty, antimikrobiálne izoláty a fytochemikálie môžu byť oddelené, extrahované a izolovane z rastlín ako napr.: Pimpinella anisum (anýz), Myroxylon sp., Arctostaphylos sp. (medvedica), Carum sp. (rasca), Capsicum sp. (paprika), Eugénia mytacea, Coriandrum sp. (koriander), Imda sp. (oman), Allium sp. (cesnak), Gentiana sp. (horec), Juniperus sp. (borievka), Calendula sp., Origanum sp. (pamajorán), Mentha labiate (mäta), Commiphora sp. (myrhovnik), Plantago sp. (skorocel), Rosmarinus sp., Ruta sp., čeľaď Lamiaceae (hluchavkovité), Meliosa, Baptisa, Artemisia sp. (palina), Šalvia sp. (šalvia), Mentha sp. (mäta), Parthenium integrifolium, Eucafyptus sp., čeľaď Asteriacea a prednostnejšie sú to: rastliny rodu Echinacea sp. z čeľade Asteriacea konkrétne Echinacea purpurea, Echinacea angustifolium, (Echinacea pallidae), Echinacea vegelalis, Echinacea atribactilus a Echinacea pallidum a kultivary, a taktiež sú to rastliny rodu Commophora sp. (myrhovnik) konkrétne Commophora myrrha, Commophora molmol, Commophora erythraea a ich kultivary. Pre lepšie výsledky fytochemikálie a antimikrobiálne izoláty sú extraktmi z Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia a Commophora myrrha.

Technológia vynálezu, liečba a liečivo poskytujú veľmi atraktívne, neočakávané, prekvapujúco dobré a dôsledné výsledky. Testy ukazujú, že mikrobicídny roztok (liečivo) a lekárske ošetrenie sú nesmieme potrebné na: kontrolu infekcie HIV, inhibíciu prichytenia HIV na cieľové bunky, akt preventívnej mikrobicidity, predĺženie latentnej periódy HIV, inhibíciu HIV a iných vírusov, a stávajú sa tak vo všeobecnosti pre pacientov a pre životné prostredie bezpečnými.

Detailnejšie vysvetlenie vynálezu poskytuje nasledujúci opis a patentové nároky.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Mikrobicídy a liečba poskytujú inhibíciu vírusu ľudskej imunodeficiencie, tiež označovaného ako ľudský imunodeficientný vírus alebo HIV. HIV mikrobicíd a liečba úplne inhibuje HIV ako aj iné infekčné mikrobiálne ochorenia a sú bezpečné a netoxické pre ľudí, zvieratá a pre životné prostredie.

HIV mikrobicíd a liečivo môžu obsahovať surfaktant a bylinkovú rastlinnú drogu poskytujúcu rastlinný extrakt, fytochemikáliu, antimikrobiálny izolát, antivirusový izolát, mikrobiálny inhibítor a vírusový inhibítor. Uprednostnená mikrobicídna kompozícia môže obsahovať: surfaktant, vodné riedidlá a živiny a bylinkové rastlinné drogy získané z rodu Echinacea (E) z čeľade Asteracea a konkrétnych druhov: E. purpurea, E. angustifolia, E. pallidea, E. vegetalis, E. atribactilus a ich kultivary a taktiež tieto bylinkové rastlinné drogy získané z rodu Commiphora,, druhy: Commiphora myrrha, Commiphora molmol, Commiphora erythraea a ich kultivary. Bylinkové rastlinné drogy sú extrakty a izoláty obsiahnuté vo fytochemikáliách nájdených v Commiphora sp. a fytochemikáliách nájdených v Echinacea sp. a extrahované z Commiphora myrrha, Echinacea purpurea, Echinacea pallide a Echinacea angustifolia. Medicinálna liečba a mikrobicíd (liečivo) kvôli lepším výsledkom obsahujú: katiónový surfaktant, fytochemikálie z Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia a Commiphora myrrha a sterilné vodné riedidlá a kyselinu listovú. Pomer Commiphora myrrha ku Echinacea purpurea a Echinacea angustifolia je v intervale od 1 : 2 do 1 : 4.

Surfaktant poskytuje istú excíziu bunkovej povrchovej hladiny so širokým spektrom antimokrobiálneho účinku.

Surfaktant tohto pôvodu môže obsahovať kvartéme amónne soli zložené zo 6 až 18 atómov uhlíka. Presnejšie surfaktant s kvartémou amónnou soľou je zmes alkyl dimetylbenzylamónium chloridov, ktorými môžu byť: benzalkónium halogenid, benzalkónium bromid, benzalkónium chlorid a najvhodnejší je benzalkónium chlorid. Pri liečbe HIV sa môže použiť 100 % aktívny vodný roztok, ale môže byť použitý aj v zriedenej forme. Roztok sa môže skladať z hmotnostné rôznych koncentrácií surfaktantov, tak ako 0,0005 % až 0,8 %, prednostne 0,02 % až 0,3 % a najvýhodnejšie 0,02 % až 0,26 %.

Fytochemikálie z rastliny Echinacea majú dobrú účinnosť proti baktériám, vírusom a niektorým plesniam. Exaktný mechanizmus je neznámy. Mikrobicídy tohto vynálezu boli testované lokálne na Hl a HSV 1 a 2 a boli účinné pri liečbe vzplanutia infekcie jednoduchého oparu (herpes simplex). Pri testovaní in vitro majú inhibičnú aktivitu proti HIV-1 a HSV 1 a 2.

Koncentrát fytochemickej kompozície obsahuje nasledujúce izolované zložky, rastlinné extrakty, mikrobiálne inhibítory a intimikrobiálne izoláty: polysacharidy, echinacén, echinaceín, echinakozid (ester kyseliny kávovej), echinolón, echinadiol, enzýmy, glukurónovú kyselinu, inuloid, pentadekadién, polyacetylénové zlúčeniny, arabinogalaktán, ramnózu, PS I (4-0-metylglukorono-arabinoxylán, Mr 35 kD) a PS II (kyselinu ramnoarabinogalaktánovú, Mr 450 kD), cynarín (l,5-di-0-kávoylchínová kyselina), chikorovú kyselinu (2,3-0-di-kávoyltartarová kyselina) a deriváty, alkylamidy, keto-alkíny a keto-alkény, chinóny; oleje zahrnujúce: bomeol, bomylacetát, pentadeka-8(z)-én-2ón, germakrén D, karyofylén, karyofylén epoxid, antokyanínové pyrolizidínové alkaloidy, lipofilné amidy, izobutylamidy, polyacetylény, myrhovú živicu, kurzerenón (furanoeudesmánového typu), dihydro fuanodién-6-ón, 2-metoxyfuranodién (furanoeleménového typu), lyndestyrén (furanogermakránového typu), alkylamidy, apigenín, arabinogalaktán, kyselinu askorbovú, behénovú kyselinu-etylovú kyselinu, betaín, bomeol, bomylacetát, kyselinu kávovú, 2-0-kávoyl-3-(5-a-karboxybeta)-3,4-dihydroxyfenyl, 2-0-kávoyl-3-0-kumaroyltartarovú kyselinu, 6-0-kávoylechinakozid, 2-0-kávoyl-3-0-feruloyltartarovú kyselinu, 2-0-kávoyltartarovú kyselinu, beta karotén, karofylén, karofylénepoxid, chlorogénovú kyselinu, cichorovú kyselinu, metyl ester cichorovej kyseliny, kyanadin-3-0-(beta-d-glykopyranozid), kynadín-3-(6-0-malonyl beta-d-glykopyranozid), kynarin, deka (2e,4e,6e)izobutylamid triénovej kyseliny, desramnozylverbascozid, 3,5-dikávoylchínovú kyselinu, 4-5-0-dikávoylchínovú kyselinu, 2,3-0-diferuloltartarovú kyselinu, izobutylamid dodeka-(2e,4e)-diénovej kyseliny, dodeka-2,4-dién-l-yl izovalerát, izobutylamid dodeka-(2e,6z,8e,10e)-tetraénovej kyseliny, beta-famezén, 2-0-feruloytartarovú kyselinu, germakrén, heptadeka-(8z,l lz)-dién-2-ón, heteroxylán, humulén 8-12, (e)-10-hydroxy-4,10-dimetyl-4,l l-dodekadién-2-ón, 13-hydroxyoktadeka-(9z,l le,15z)-triénovú kyselinu, inulín, izochlorogénovú kyselinu, izoramnetín-3-rutinozid, izotusilagín, kaempferol-3-glukozid, kaempferol-3-nutinozid, limonén, luteolín, luteolin-7-glukozid, 2-metyltetradeka-5,12-dién, 2-metyltetradeka-6,12-diencén, metyl-p-hydroxycinamát, marcín, niacin, kyselinu palmitovú, pentadeka-(8z,l lz)-dién-2-ón, pentadeka-(8z,13z)-dién-l l-lyn-2-ón, pentadeka-8en-2-ón, pentadeka-(8z)en-2-ón, pentadeka-(8z)-én-l 1,13-dién-2-ón, I-pentadecén, penta-( 1,8z)-dién, fosfor, alfa pinén, beta pinén, polyacetylény, pontika epoxid, chercetagetín-7-glukozid, chercetín, chercetín-3-galaktozid, chercetín-3-glukozid, chercetín-3-robinozid, chercetín-3-xylozid, chercetín-3-xylozylgalaktozid, ramnoarabinogalaktán, riboflavín,

SK 285810 Β6 rutín, rutozid, betasitosterol, sitosterol-3-beta-o-glukozid, stigmasterol, tartarovú kyselinu, tetradeka-(8z)-én-l 1,13-dién-2-ón, tiamín, n-triakontanol, trideka-l-én-3,5,7,9,10-pentaín, tusilagín, vanilín, verbaskozid, sekviterpény, kyselinu octovú, alfa-amyrón, arabinózu, alfa-bisabolén, gama-bisabolén, kadinén, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferín, alfa-komiforovú kyselinu, beta-komiforovú kyselinu, gama-komiforovú kyselinu, komiforínovú kyselinu, m-krezol, kumik alkohol, kumínaldehyd, dipentén, 3-epi-alfa-amyrín, eugenol, furanodién, furanodienón, galaktózu, rastlinnú gumu, heerabolén, alfa-heerabomyrhol, beta-heerabomyrhol, heeraborezén, limonén, 4-0-metyl-glukurónovú kyselinu, n-nonacezán, beta-sitosterol, xylózu, karapylén, myrhovú živicu, kurzenón, dihydro fuanodién-6-ón a 2-metoxyfurándién.

Antimikrobiálne izoláty fytochemického koncentrátu obsahujú hmotnostné (z celkovej hmotnosti medicinálnej kompozície): 0,3 až 9 % hmotn. echinokozidu, 0,1 až 7 % hmotn. PS I (4-0-metylglukorónarabinoxylán, Mr 35 kD) a PS II (kyseliny ramnoarabinogalaktánovej, Mr 450 kD); 0,1 až 10 % hmotn. cynarínu (l,5-di-0-kávoylchínová kyselina) a chikorovej kyseliny (2,3-0-dikávoyltartarová kyselina) a ich deriváty; 0,2 až 4 % echinolónu; 0,2 až 8 % echinacínu B, 0,1 až 6 % echinaceínu, 0,2 až 7 % antokyanínov obsahujúcich kyanidin 3-0-p-D-glukopyranozid a 3-0(6-0-malonyl-P-D-glukopyranozid; 0,01 až 0,06 % pyrolizidínových alkaloidov obsahujúcich tusilagín a izotusilagín; 0,003 až 0,009 % izomerických dodeka izobutylamidov a 2e, 4e, 8z, 10e/z tetraénovej kyseliny; 0,01 až 2 % karyopylénov ako Commophora myrrhové fytochemikálie obahujúce: myrhovú živicu, kurzeón, dihydro-fuanodién-6-ón, 2-metoxyfurándién, lynderstyrénové sekviterpény, kyselinu octovú, alfa-amyrón, arabinózu, alfa-bisabolén, gamabisabolén, kadinén, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferín, alfa-komiforovú kyselinu, beta-komiforovú kyselinu, gama-komiforovú kyselinu, komiforovú kyselinu, m-krezol, kumik alkohol, kumínaldehyd, dipentén, elemol,

3-epi-alfa-amyrín, eugenol, furanodién, furanodienón, galaktóza, rastlinná guma, heerabolén, alfa-heerabomyrhol, beta-heerabomyrhol, heeraborezén, limonén, 4-0-metylglukorónovú kyselinu, n-nonacezán, beta-sitosterol, xylózu, caropylén a lynderstyrén.

Fytochemický koncentrát môže obsahovať hmotnostné: 2 % až 90 % medicinálnej kompozície a roztoku a prednostne obsahuje nie menej než 15 % kompozície a roztoku a kvôli lepším výsledkom obsahuje 40 % až 60 % medicinálnej kompozície a roztoku.

Riedidlo rozpúšťa surfaktant a fytochemické koncentráty a môže fungovať ako nosič v spreji, v skúmavkách a v kvapkových fľašiach. Preferované riedidlo je vodné riedidlo a najvýhodnejšie je sterilné vodné riedilo. Pomer vody vo vodnom roztoku ku surfaktantu môže byť od 30 000 : 1 až 250 : 1 a prednostne od 5000 : 1 až 750 1. Pomer vody ku kombinovaným koncentrátom benzalkónium chloridu a fytochemikálií môže spĺňať interval od 2 : 1 až 100 : 1 a prednostne od 4 : 1 až 40 : 1 a kvôli lepším výsledkom je to interval od 6 : 1 až 20 : 1.

Pre najlepšie výsledky vylepšená mikrobicidálna liečba a liečivo (mikrobicid) proti herpesu hmotnostné obsahuje: 0,02 % až 0,3 % surfaktantu a aby sa vyhlo toxicite, je preferované množstvo menej ako 0,26 %, 40 % až 60 % fytochemikálií z Echinacea a Commophora, 0,01 % až 25 % najvýhodnejšie však 2 % až 12 % živín, 20 % až 60 % najvýhodnejšie však 29,74 % až 59,8 % sterilnej vody. Liečivo (mikrobicid) požadovane obsahuje vitamínové živiny, ktoré slúžia ako nutričné nosiče a poskytujú synergický efekt, ak sú kombinované s Commophora myrrha, Echinacea purpu rea a Echinacea angustofolia. Živina môže obsahovať 1 alebo viac z nasledujúcich vitamínov: vitamín A, vitamíny B komplexu, vitamín D, vitamín E, vitamín K, vitamíny rozpustné vo vode, vitamíny rozpustné v tukoch, vitamín Bl, vitamín B2, vitamín B5, vitamín B6, vitamín B12, vitamín B15 a prednostne folacin alebo kyselinu folovú (kyselina listová).

Sice preferovaným riedidlom je voda a vodný nosič, za istých okolností môžu byť použité aj iné nosiče vďaka ich väčšej rozpustnosti a účinnosti v usporiadaní na poháňanie koncentrát cez striekačku alebo sprej. Taktiež za istých okolností môže byť žiaduce zahrnúť prostriedok kontrolujúci viskozitu.

Medicinálny roztok (liečivo) môže byť aplikovaný systematicky, vaginálne alebo rektálne ako mikrobicidiálny prostriedok proti HIV. Liečivo môže byť aplikované injekčné, sprejom, rozprašovačom alebo pomocou iných metód. Aplikácia alebo nanesenie roztoku (liečiva) musí pretrvávať aj počas súlože. Aniónové mydlá, aniónové detergenty a špeciálne proteínový obsah mydiel môžu spôsobiť kontraindikáciu. Plocha na aplikáciu by mala byť umytá, vyčistená a vysušená pred aplikovaním liečiva. Liečivo, ktoré má pôsobiť ako antivirusové na ošetrenie HIV, môže byť aplikované injekčným dávkovaním liečiva do rekta alebo vagíny, alebo inými metódami.

Benzalkónium chlorid

Preferovaný surfaktant je benzalkónium chlorid. Benzalkónium chlorid vo vodnom roztoku je komerčne prístupný pod obchodnou značkou Zephiran® distribuovaný firmou Sanoft Winthrop Pharmaceuticals (vyvinutý Winthrop laboratóriami). Benzalkónium chlorid je rýchle pôsobiaci anti-infekčný surfaktant so stredne dlho trvajúcim účinkom. Surfaktant je aktívny proti baktériám a určitým vírusom, hubám a protozoám. Bakteriálne spóry sú považované za rezistentné. Roztoky benzalkónia chloridu sú bakteriostatické alebo bakteriocídne vzhľadom na ich koncentráciu. Mechanizmus bakteriálneho účinku benzalkónium chloridu je neznámy ale pravdepodobne pôsobí na enzýmovú inaktiváciu. Aktivita benzalkónium chloridu sa všeobecne zvyšuje so zvyšujúcou teplotou a pH. Gram-pozitívne baktérie sú citlivejšie na benzalkónium chlorid než gram-negatívne baktérie.

Prekvapujúco benzalkónium chlorid je inaktivovaný mydlami, aniónovými detergentmi, sérom a inými proteínmi. Vďaka uvedeným nedostatkom záujem laboratórií o benzalkónium chlorid poklesol. Keď bol benzalkónium chlorid použitý samostatne a testový in vivo, bol neúčinný proti vypuknutiu infekcie herpes simplex. Keď bol testovaný in vitro na HIV a HSV1 & 2, preukázal nežiaduco vysokú hladinu toxicity na bunky a dokonca pri vysokých zriedeniach, ktoré sú medicinálne neprijateľné. Chemický vzorec benzalkónium chloridu je uvedený. Môžu byť použité aj iné typy benzalkónium chloridu.

Benzalkónium chlorid

T ₊í^Ha CHsíCH^á^N-CHg

CH₃

Surová, neupravená, nespracovaná neizolovaná Echinacea je vo všeobecnosti vnútorne nepoužiteľná na liečbu

HIV a herpesu, ale keď je primerane filtrovaná, vnútorné podanie je možné. Zdá sa, že len niektoré, nie všetky izolované zložky a rastlinné extrakty Echinacea a Commiphora poskytujú fytochemikálie, antimikrobiálne izoláty, rastlinné

SK 285810 Β6 extrakty a mikrobiálne inhibítory, ktoré prejavujú antimikrobiálnu účinnosť a sú efektívne v liečbe HIV, herpes vírusu a iných infekčných ochorení.

Fotochemická kompozícia koncentrátu obsahuje nasledujúce izolované zložky, rastlinné extrakty, mikrobiálne inhibítory a antimikrobiálne izoláty: polysacharidy, echinacén, echinacein, echinakozid (ester kyseliny kávovej), echinolón, echinadiol, enzýmy, kyselinu glukurónovú, inuloid, pentadekadién, polyacetylénové zlúčeniny, arabinogaJaktán, ramnózu, PS I (4-0-metylglukorono-arabinoxylán, Mr 35 kD) a PS II (kyselina ramnoarabinogalaktánová, Mr 450 kD), cynarín (1,5-di-O-kávoylchínová kyselina), kyselinu (2,3-0-di-kávoyl-tartarová kyselina) a ich deriváty, alkyamidy, keto-alkíny a keto-alkény, chinóny, oleje zahrnujúce: bomeol, bomyl acetát, pentadeka-8(z)-én-2-ón, germakrén D, karyofylén, karyofylén epoxid, antocyaninové pyrolizidínové alkaloidy, lipofilné amidy, izobutylamidy, polyacetylény, myrha živicu, kurzerenón (furanoeudezmanového typu); dihydro fuanodién-6-ón, 2-metoxyfuranodién (furanoeleménového typu), eiamol, lyndestrén (furanogermakránového typu), alkylamidy, apigenin, arabinogalaktán, kyselinu askorbovú, kyselín behénovú, kyselinu etylovú, betaín, borneol, bomyl-acetát, kyselinu kávovú, 2-0-kávoyl-3-(5-alfa karboxybeta)3,4-dihydroxyfenyl, 2-0-kávoyl-3-0 kumaroyltartaiovú kyselinu, 6-0-kávoylechinakozid, 2-0-kávoyl-3-0-feruloyltartarovú kyselinu, 2-0-kávoyltartarovú kyselinu, beta karotén, karofylén, karofylénepoxid, chlorogénovú kyselinu, cichorovú kyselinu, metyl ester cichorovej kyseliny, cyanadin-3-0-(beta-d-glykopyranozid), cynadín-3-(6-0-malonyl beta-d-glycopyranozid), cynarín, deka (2e,4e,6e) izobutylamid triénovej kyseliny, des-ramnozylverbaskozid, 3,5-dikávoylchínovú kyselinu,

4-5-0-dikávoylchínovú kyselinu, 2,3-0-diferuloltartarovú kyselinu, izobutylamid dodeka-(2e,4e) diénovej kyseliny, dodeka-2,4-dién-l-yl-izovalerát, izobutylamid dodeka-(2e,6z,8e,10e)-tetraénovej kyseliny, epishobunol, betafamezén, 2-0-fcruloytartarovú kyselinu, germakrén, heptadeka-(8z,l 1 z)-dién-2-ón, heteroxylán, humulén 8-12, (e)-10-hydroxy-4,10-dimetyl 4,11-dodekadién-2-ón, 13-hydroxyoktadeka-(9z,l 1 e, 15z)triénovú kyselinu, izochlorogénovú kyselinu, izoramnetín-3-rutinozid, izotusilagín, kaempferol, kaempferol-3-glukozid, kaempferol-3-nutinozid, limonén, luteolin, luteolín-7-glukozid, 2-metyltetradeka-5,12-dién, 2-metyltetradeka-6,12-diencén, metyl-p-hydroxycinamát, marcín, niacín, kyselinu palmitovú, pentadeka-(8z, 11 z)-dién-2-ón, pentadeka-(8z,13z)-dién-l l-lyn-2-ón, petadeka-8en-2-ón, pentadeka-(8z)-én-2-ón, petadeka-(8z)-én-1 l,13-dién-2-ón, 1-pcntadecén, penta-(l,8z)-dién, fosfor, alfa pinén, beta pinén, polyacetylény, pontika epoxid, chercetagetin-7-glukozid, chercetín, chercetín-3-galaktozid, chercetín-3-glukozid, chercetín-3-robinozid, chercetín-3-xylozid, chercetín-3-xylozylgalaktozid, ramnoarabinogalaktán, riboflavin, rutín, rutozid, selén, oxid kremičitý, beta-sitosterol, sitosterol-3-beta-o-glukozid, sodík, stigmasterol, sulfát, kyselinu tartarovú, tetradeka-(8z)-én-ll,13-dién-2-ón, tiamín, n-triakontal, trideka-l-én-3,5,7,9,10-pentaín, tusilagín, vanilín, verbaskozid, sekviterpén, kyselinu octovú, alfa-amyrón, arabinózu, alfa-bisabolén, gama-bisabolén, kadinén, kampcstcrol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferín, alfa-komiforovú kyselinu, beta-komiforovú kyselinu, gama-komiforovú kyselinu, komiforinovú kyselinu, m-krezol, kurník alkohol, kumínaldehyd, dipentén, eiemol, 3-epi-alfa-amyrín, eugenol, furanodién, furanodienón, galaktózu, rastlinnú gumu, heerabolén, alfa-heerabomyrhoí, beta-sitosterol, xylóza, karopylény, lynderstyrén, karopylény, myrhovú živicu, kurzenón, dihydro furanodín-6-ón, 2-metoxyfurandién a lynderstyrén.

Chemické vzorce niektorých rastlinných extraktov Echinacea sú znázornené:

Echinakozid

*cco<

kyselina cichorová

Echinacein

Echinolón

Chemické vzorce niektorých rastlinných extraktov z

Commiphora myrrha sú znázornené:

Kurzerenón (Furanoeudezmánového typu)

4,5-dihydrofumodlén-8-ón (Furanoeleménový typ)

2-mctoxyhuranodlén (Furanoeleménový typ)

Lindestrén (Furanogermakrénový typ)

SK 285810 Β6

Elemol

Myrha je tiež niekedy označovaná ako myrrh, mirre, myrrhis, gummi myrrha, myrrha vera, gum myrrh, Commiphora resin, gruggal gum, gruggal resin, Heerabol myrrh, myrrhc, Manniliche myrrhe, Opopanax a Hirabol myrrh. Myrha môže obsahovať živicu získanú z rezov do kôry stromov druhu Commiphora myrrha a iného myrhového stromu. Myrha môže tiež obsahovať utišujúci extrakt z Balsamodendron myrrha a z iných arabských druhov stromu. Myrha môže byť tiež extrahovaná z Osmorhiza alebo Washigtonia, ktroré sa tiež označujú ako „sweet cicely“. Myrhový strom sa vyskytuje v Erytrey, Abysínii, Somálsku, Jemene, Sudáne atď.

Myrhu produkujúce Commiphorové druhy sú kríky alebo malé stromy s veľkými, ostrými tŕňmi na kmeni. Neprirodzené listy sú pozmenené a malé kvety sú umiestnené v terminálnom usporiadaní. Pri poranení vyteká živica, ktorá poskytuje liečivo myrhu.

Myrha je na vzduchu vysušená rastlinná guma, ktorá je vylučovaná z kôre druhov Commiphora. Materiál obsahuje nepravidelné okrúhle zrná alebo hrčky rôznej veľkosti s dierami a rozpätie farieb je od tmavohnedej až takmer čiernej do svetlo alebo tmavooranžovo-hnedej, niektoré časti môžu byť žlté alebo svetložlté. Povrch je väčšinou pokrytý šedivým až žltkasto šedivým práškom, prelom je konchoidálny a poskytuje tenké, priesvitné fragmenty.

Myrha môže byť príkrej, aromatickej, sladkej vône a horkej chuti, môže byť dráždivá a lepkavej žuvačkovej konzistencie. Commiphora molmol a iné Commiphora sp. v takom rozsahu ako chemická kompozícia sú porovnateľné s myrhou DAB 10. V literatúre sa nachádzajú značné nejasnosti, ktoré sa týkajú zdrojov myrhy a totožnosti druhov Commiphora. Bežná myrha pravdepodobne pochádza z Commiphora myrrha. Zdrojom somálskej myrhy je Commiphora molmol. Ale systematický (taxonomický) vzťah medzi Commiphora molmol a Commiphora myrrha nie je jasný. Zdrojom abysinianskej myrhy je Commiphora madagascariensis alebo Commiphora abyssinica. Opopanax, ktorý je tiež označovaný ako bisabol myrrh alebo parfumované bdellium pochádza pôvodne z Commiphora erythraea (Ehrenb) alebo Opopanax.

Zloženie myrhy je veľmi komplexné a len čiastočne známe, 40 až 60 % myrhy je rozpustných v etanole a obsahuje živicu a esenciálny olej. Myrha obsahuje najviac seskviterpény. Hlavné zložky seskviterpénov sú: furanoseskviterpény germakran elemánového, eudezmánového, guaianovéhu typu. Seskvitcrpény sú uhľovodíky a to β a ô-elemén, β-burbonén, β-karyofylén, humulén a seskvíterpénové alkoholy ako elemol. Niektoré furanoseskviterpény sú charakteristické liečivo myrha. Myrhová rastlinná guma zahrnuje 20 % proteínov a 65 % sacharidov, ktorými sú galaktóza, 4-0-metylglukurónová kyselina a arabinóza. Commiphora myrhafytochemikálie obsahujú alfa-amyrón, arabinózu, alfa-bisabolén, gama-bisabolén, kadinén, kampesterol, cholesterol, cinamaldehyd, komiferín, alfa-komifórovú kyselinu, beta-komifórovú kyselinu, gama-komifórovú kyselinu, komiforínovú kyselinu, m-krezol, kumik alkohol, kuminaldehyd, dipentén, elemol, 3-cpi-alfa-amyrín, eugenol, furanodién, furanodienón, galaktózu, rastlinnú gumu, herabolén, alfa-herabomyrhol, beta-herabomyrhol, heraborezén, limonén, 4-0-metyl-glukorónovú kyselinu, n-non acezán, beta-sitosterol, xylózu, karopylény, myrhovú živicu, kurzenón, dihydro fuanodien-6-ón, 2-metoxyfurandién a lynderstyrén.

Tinktúra myrhy môže mať protizápalový účinok. Makro a mikroskopicky sa myrha môže zdať ako hnedožltý prášok charakterizovaný žltými sférickými zmámi rôznej veľkosti spolu s jemne granulovaným materiálom, ktorý napučiava vo vode. V chloralhydrátových podložkách je len málo fragmentov tkaniva z rastlinného zdroja: červeno-hnedé fragmenty korku, jednotlivé a skupinové polyedrické až obdĺžnikové bunky s väčšou hrúbkou a lignifikovanými stenami a fragmenty tenkých parcnchýmových a sklerenchýmových vlákien a 10 až 25 pm prismatické až polyedrické kryštály šťaveľanu vápenatého.

Myrha môže byť skladovaná pred svetlom a vlhkosťou v dobre uzavretých kontajneroch spolu s vysušovacou látkou, aj keď sacharidová časť liečiva absorbuje vodu. Prednostne myrha môže byť skladovaná v práškovej forme.

Kyselina folová (kyselina listová)

Preferovanou živinou je kyselina folová. Kyselina folová je tiež označovaná ako folacín, pteroyglutámová kyselina, foldín, folaemín, foliamín, folicel, folipak, foletes, folzan, folvite, inkafolik, milafol alebo cytofol. Kyselina folová je žltý, kryštalický, vo vode rozpustný vitamín B komplexovej skupiny nevyhnutný na bunkový rast a reprodukciu. Kyselina folová funguje ako koenzým s vitamínom B12 a vitamínom C v odbúravaní a využití proteínov a v tvorbe nukleových kyselín a hému a hemoglobínu. Kyselina folová zvyšuje chuť do jedla a stimuluje tvorbu chlóralhydrátovej kyseliny v tráviacom trakte. Kyselina folová je skladovaná v pečeni a môže byť syntetizovaná bakteriálnou flórou gastrointestinálneho traktu. Nedostatok kyseliny folovej sa prejaví v slabom raste, padaním vlasov, glositídou, stomatitídou, gastrointestinálnymi léziami a hnačkami a môže viesť až ku megaloblastickej anémii. Deficiencia kyseliny folovej môže byť zapríčinená neadekvátnou diétou, nedostatkom vitamínu, zlou absorpciou alebo metabolickými abnormalitami. Potreba kyseliny folovej je zvýšená v tehotenstve, v detstve alebo v prítomnosti stresov. Kyselina folová je nestabilná na svetle a teple a k veľkým stratám dochádza, ak je uskladnená na dlhý čas. Kyselina folová je netoxická a účinná v ošetrení špecifických deficitných stavoch. Chemický vzorec kyseliny folovej je uvedený:

COOH

Kyselina folová (pteroylglutámová kyselina) Štruktúra kyseliny folovej je prezentovaná nižšie:

2.am:oo-4*Sydroxy^*ney^,P^ur'^t,í(1 p-afrinobenzooví kyselina glulimovi kyseline

OH ! s L. ' ^H w-C, A

K N

J H H

C-N'-C-CH.-CH.-COOH I COOH pieroort kyselín*

Molekula kyselina folovej obsahuje kyselinu glutámovú, p-aminobenzoovú kyselinu a pterín. Kombinácia pterínu a p-aminobenzoovej kyseliny dáva pteroovú kyselinu.

Uvedená štruktúra znázorňuje pteroylglutámová kyselinu z

SK 285810 Β6 pečene. Kyselina folová produkovaná baktériami obsahuje tri glutámové kyselinové zvyšky kombinované v γ-glutamylovej väzbe. Rôzne živočíšne tkanivá obsahujú pteroylheptaglutámovú kyselinu, zvyšky glutámovej kyseliny viazané γ-glutamylovou väzbou. Syntetické pteroylpolyglutámové kyseliny, v ktorej molekuly glutámovej kyseliny sú viazané v «-glutamylových väzbách, sú účinné v bakteriálnych rastových testoch, ptcroyl-y-glutámové kyseliny sú účinné aj v bakteriálnom raste aj v liečbe makrocytovej anémie u človeka. Enzým v živočíšnych tkanivách hydrolyzuje prírodné pteroylpolglutamátové zlúčeniny na pteroylmonglutámovú kyselinu a voľnú glutámovú kyselinu.

Ďalší štruktúrny vzorec pteroylglutámovej kyseliny (PteGlu!) je znázornený:

Pteroyl MonohepľagluUmái

Po/iciM	Radikál	Obdoba
N'	CII*	CHjl-bPteOlu	Metylteti'AhydrofolÁi
	-C HO	5. CHOHíPtcOlu	Folinovi kyselina (Citravonim ľacior)
N'	-CHO	10. CHOH4PleGlu	10. FormylkvaJ-kydrofolil
N '	•CH·	5,10. CHKPteOlu	5,l<J.Metenyltcirnhydrofolál
	-CHr	5,10. CHjHjPleGlu	3.10 Mctylémcirahydrofoiát
	•CHNH	CHNHKíhcGlu	ForTníniinCrtctrahydrofolAl
N10	CHiOll	CHrOHHíPteClu	Hydnjxynwlyíielr.thydrofclál

Štruktúry a nomenklatúra pteroylgutámovej kyseliny (kyselina folová)

Hlavné časti molekuly kyseliny folovej zahrnujú pteridínový kruh viazaný metylénovým mostíkom na paraaminobenzoovú kyselinu, ktorá je spojená amidovou väzbou na glutámovú kyselinu. Aj keď pteroylglutámová kyselina je bežná farmaceutická forma kyseliny folovej, nie je ani hlavná folátová obdoba v potrave ani účinný koenzým na intracelulámy metabolizmus. Nasledujúcou absorpciou PteGlui je rapídne redukovaná v 5, 6, 7 a 8 polohe na tetrahydrofolovú kyselinu (H₄PteGlu₁), ktorá potom pôsobí ako akceptor počtu jednouhlíkových jednotiek. Tieto sú pripojené v 5 alebo 10 polohe pteridínového kruhu alebo mostíku týchto atómov na tvorbu nového päťčlenného kruhu.

Vitamín B₁₂ a folová kyselina sú esenciálne pre človeka. Nedostatok niektorého z týchto vitamínov sa prejaví v neúčinnosti syntézy DNA v bunke, ktorá sa pripravuje na chromozomálnu replikáciu a delenie. Pretože tkanivá s zväčšujúcim nadbytkom buniek poukazujú na výrazné zmeny, hematopoézny systém je špeciálne citlivý na nedostatok týchto vitamínov. Klinickým prejavom tejto už spomínanej nedostatočnosti je morfoblastická anémia, v ktorej porucha syntézy DNA spôsobuje charakteristické morfologické abnormality prekurzorov buniek v kostnej dreni. Produkujú sa abnormálne makrocytové krvné bunky a pacient sa stáva silne anemický.

Metyl kobalamin podporuje metionín syntetázovú reakciu, ktorá je nevyhnutná pre normálny metabolizmus folátu. Metylové skupiny kontribuované metyltetrahydrofolátom (CHiHjPteGluiJ sú použité na tvorbu metylkobalamínu, ktorý potom pôsobí ako donor metylovej skupiny na konverziu homocysteinu na metionín. Táto folát-kobalamínová interakcia je dôležitá na normálnu syntézu purínov a pyrimidínov a teda na DNA. Metionín syntetázová reakcia je zodpovedná za kontrolu recyklácie folátových kofaktorov, na podporu vnútrobunkovej koncentrácie folylpolyglutamátov prostredníctvom syntézy metionínu a jeho produktu S-adenozylmetioninu, na podporu metylačných reakcií. Pre tože metyltetrahydrofolát je hlavná obdoba folátu privádzaná do buniek, prenos metylovej skupiny na kobalamin je nevyhnutný na adekvátne dodávanie tetrahydrofolátu (H₄PteGIU|), substrátu na množstvo metabolických krokov. Tetrahydrofolát je prekurzor na tvorbu intracelulámych folylpolyglutamátov a tiež pôsobí ako akceptor jednouhlíkovej jednotky v konverzii serínu na glycin, ktorej výsledkom je formulácia 5,10 metyléntetrahydrofolát (5,1O-CH₂H1₄PteGlu). Novší derivát dodáva metylénovú skupinu na deoxyuridylát na syntézu tymidylátu, čo je veľmi dôležitá reakcia v syntéze DNA. V procese 5,10-CH₂H₄PteGI je konvertovaný na dihydrofolát (H₂PteGlu). Cyklus je potom doplnený redukciou H₂PteGlu na H₄PteGlu dihydrofolátovou reduktázou, krokom, ktorý je blokovaný folátovým antagonistom ako je metotrexát. Iné cesty tiež vedú ku syntéze 5,10 metyléntetrahydrofolátu.

Tabuľka A: Biosyntéza kyseliny folovej (kyseliny listovej) Biosyntéza kyseliny folovej je znázornená. Symbol ppp predstavuje trifosfát.

RtbónPPP OTP<1>

i

CHj—Oi—CH —CHjO (Tí* ^Λ OH

OH <?H ýH

H ^H

Dihydroneopt«tin

dihydropteroovA kychtu (v(l) xnl jlulímovi KysUnw

H ? H Í^OOH

1,-N C-H-CH

I CH. I CH.

I

COOH

OthydrafôlovA kyselín.

Folát môže byť prenášaný do tkaniva ako CH₃H₄PteG₁. Pečeň aktívne redukuje a metyluje PteGlu, (a H₂ alebo H₄PteGlUj) a potom transportuje CH₃H₄PteGIU| do žlče na reabsorpciu črevom a následné dodanie do tkanív. CH₃H₄PteGlu pôsobí ako metylový donor na tvorbu metylkobalamínu a ako zdroj H₄PteGlu a iných folátový obdôb. Folát je uskladňovaný vnútri buniek ako polyglutamáty.

Surfaktanty

Zatiaľ čo benzalkónium chlorid je preferovaný surfaktant, v niektorých prípadoch môže byť požadované použitie iných kvartémych amóniových surfaktantov alebo iných surfaktantov.

Kvartéma amóniová zlúčenina môže byť dikokodimónium chlorid, ktorý je tiež známy ako dikoko alkyldimetyl

SK 285810 Β6 chlorid alebo dikoko dimetylamónium chlorid, alebo Di-C8-18-alkyldimetyl chlorid. Môže byť použitý v kombinácii s izopropanolom ako je 20 - 30 % izopropanol. Preferovaný zdroj kvartémej amóniovej zlúčeniny obsahuje: 70 až 80 % kvartémej amóniovej zlúčeniny a menej než 0,03 % metyl chloridu a má špecifickú tiaž okolo 0,87 pri 115 stupňoch F, tlak pary 33 mm/Hg pri 68 stupňoch F, začiatočnú teplotu varu 180 stupňov F pri 760 mm/Hg a prchavosť 20 až 30 % a je produkovaný pod obchodným názvom CarSpray 300 firmy Witco Corporation, Dublin, Ohio, USA. Kvartéma zlúčenina má dezinfekčné kvality a slúži ako fungicíd na liečenie plesní a kvasinkových infekcií.

Iné kvartéme amóniové zlúčeniny, ktoré sa môžu použiť, sú vedené pod obchodnými názvami Jet Quat 2C-75 firmy Jetco Chemicals, Inc., Corsicana, Texas, USA alebo Carspray 400 a Camauba Spray 200 od firmy Witco Corporation, Dublin, Ohio, USA. Zlúčeniny obsahujúce 9 % denaturovaný etylalkohol sa predávajú pod obchodným názvom BTC 2125M od firmy Stephan Company, Northfíeld, Illinois, USA alebo MAQUAT produkty obsahujúce n-alkyl dimetyl benzyl amónium chlorid produkovaný Mason Chemical Company, Arlington Heights, Illinois, USA. LC-12S (67 % Cl2,25 % C14, 7 % C16,1 % Cl 8), MC 1416 (5 % C12,60 % C14, 30 % C16, 5 % Cl 8), MC1412 (40 % C12, 50 % C14, 10 % C16), SC-18 stearylová pasta alebo vločka (5 % C16, 95 % C18), TC-76 alebo MQ-2525 (5 % C12,60 % Cl4 %, 30 % Cl6 a 5 % Cl 8) a MC6025 - 50 % (25 % C12, 60 % C14 a 15 % C16). Jet Quat 2C-75 obsahuje: 50 až 75 % dikoko dimetyl kvartémy amónium chlorid, 20 - 50 % izopropyl alkohol, má špecifickú tiaž 0,88 a teplotu varu 180 stupňov F. CarSpray 400 obsahuje: 55 až 65 % kvartémych amóniových zlúčenín, 20 až 30 % amínov, C14 - 18 & C16 - 18 nesaturované, alkyl, etoxylový 10 až 20 % izopropanol a menej než 0,03 % metyl chloridu a má špecifickú tiaž približne 0,88 pri 75 stupňoch F a tlak pary 33 mm/Hg pri 68 stupňoch F a začiatočnú teplotu varu 180 stupňov F pri 760 mm/Hg a prchavosť 10 - 20 %. Carnauba Spray 200 obsahuje: 50 až 60 % kvartémych amóniových zlúčenín, 10 až 20 % izopropanolu, 15 až 25 % vody, 1 až 10 % alkoylatovaného kamaubského vosku a menej než 0,03 % metyl chloridu, a má špecifickú tiaž asi 0,90 pri 80 stupňoch F, tlak pary 33 mm/Hg pri 68 stupňoch F, začiatočnú teplotu varu 180 stupňov F pri 760 mm/Hg a prchavosť 20 až 40 %.

Neiónové surfaktanty sú povrchovo aktívne zlúčeniny, ktoré neionizujú vo vodnom roztoku. Castokrát majú hydrofilné chakteristické vlastnosti vďaka prítomnosti okysličeného reťazca (poly-oxyetylénový reťazec), lyofilná časť molekuly je odvodená z mastných kyselín, fenolov, alkoholov, amidov alebo amínov. Zlúčeniny sú poly-(etylénoxid) kondenzáty alkalických fenolov, kondenzačné produkty tvorené z jedného mólu nonyl fenolu a z desiatich molov etylénoxidu a kondenzačné produkty alifatických alkoholov a etylénoxidu, kondenzačné produkty tvorené z jedného mólu tridekanolu a z dvanástich molov etylénoxidu. Neiónové surfaktanty môžu obsahovať fenol ctoxyláty obsahujúce kondenzovaný produkt etylénoxidu a alkyl fenolu alebo alifatického alkoholu. Neiónové surfaktanty prednostne obsahujú nonofenolový etoxylát ako je T-DET, a/alebo oktafenolový etoxylát. Neiónové surfaktanty sú reakčné produkty etylén oxidu a nonolfenolu a/alebo oktafenolu. Pomer fenolu ku etylén oxidu môže byť z intervalu 2 : 20 až 4 : 16 a prednostne je asi 8 : 12.

Neiónové syntetické surfaktanty môžu obsahovať neiónové detergenty. Neiónové syntetické surfaktanty tiež môžu byť tvorené kondenzáciou etylén oxidu s hydrofóbnou bázou tvorenou kondenzáciou propylén oxidu s propylén glykoiom. Hydrofóbna časť molekuly, ktorá preukazuje nerozpustnosť vo vode, má molekulovú váhu asi 1200 až 2500. Prídavok polyoxyetylénových radikálov ku tejto hydrofóbnej časti vedie ku zvýšeniu rozpustnosti molekuly ako celku vo vode a kvapalný charakter produktu je ponechaný na úrovni, kde polyoxyetylénový obsah je asi 50 % z celkovej váhy kondenzačného produktu. Druhé neiónové syntetické surfaktanty môžu zahrnovať: polyetylén oxid, ktorý kondenzuje alkylfenoly, kondenzačné produkty alkylfenolov alebo dialkylfenolov, kde alkylová skupina obsahuje asi 6 až 12 uhlíkových atómov v rozvetvenom alebo v nerozvetvenom reťazci s etylén oxidom. Etylén oxid môže byť prítomný v množstvách rovnajúcich sa 8 až 25 molov etylén oxidu na jeden mól alkylfenolu. Alkylový substituent v takýchto zlúčeninách môže byť odvodený z polymerizovaného propylénu, diizobutylénu, n-okténu alebo n-nonénu.

Neiónové surfaktanty sú produkované z kondenzácie etylén oxidu s reakčným produktom propylén oxidu a etyléndiamínu a zlúčenín obsahujúcich asi 40 % hmotn. až asi 80 % hmotn. polyoxyetylénu, ktoré majú molekulovú váhu asi 5000 až asi 11 000 a vznikli z reakcie etylén oxidových skupín s hydrofóbnou fázou obsahujúcou reakčný produkt etyléndiaminu a nadbytok propylénoxidu. Báza má molekulovú hmotnosť asi 2500 až 3000.

Iné neiónové surfaktanty zahrnujú kondenzačný produkt alifatických alkoholov, ktoré majú 8 až 18 uhlíkových atómov v rozvetvenom alebo nerozvetvenom reťazci s etylénoxidom a kokosovým alkoholom. V kondenzácii pripadá 10 až 30 molov etylénoxidu na jeden mól kokosového alkoholu a frakcia kokosového alkoholu má 10 až 14 uhlíkových atómov.

Ďalšie neiónové surfaktanty zahrnujú dlhý reťazec terciámych amín oxidov zodpovedajúcich nasledujúcemu všeobecnému vzorcu:

R|R₃R₂N -* O, kde R[ je alkylový radikál z asi 8 až 18 uhlíkovými atómami a R₂ a R₃ sú každé metylové alebo etylové radikály. Šípka vo vzorci je konvenčná dohoda, ktorou je označovaná semi-poláma väzba. Príklady amínových oxidov vhodných na použitie zahrnujú: dimetyldodecylamín oxid, dimetyloktylamín oxid, dimetyldecylamín oxid, dimetyltetradecylamín oxid a dimetylhexadccylamín oxid.

Iné neiónové surfaktanty môžu zahrnovať: dlhý reťazec terciámych fosfín oxidov zodpovedajúcich nasledujúcemu všeobecnému vzorcu:

RR’RT-> O, kde R je alkyl, alkenyl alebo monohydroxyalkylový radikál z 10 až 18 atómami uhlíka v reťazci a R' a R sú každý alkyl alebo monohydroxyalkylové skupiny obsahujúce 1 až 3 uhlíkové atómy. Šípka vo vzorci predstavuje semi-polámu väzbu. Príklady vhodných fosfínových oxidov sú: dimetyldodecylfosfm oxid, dimetyltetradecylfosfm oxid, etylmetyltetradecylfosfín oxid, cetyldimetylfosfín oxid, dimetylstearylfosfin oxid, cetyletylpropylfosfm oxid, dietyldodecylfosfin oxid, dietyltetradecylfosfín oxid, dipropyldodecylfosfln oxid, bis-(2-hydroxymetyl)dodecylfosfín oxid, bis-(2-hydroxyetyljdodecylfosfin oxid, (2-hydroxypropyl)metyltctradecylfosfín oxid, dimetyloleylfosfín oxid a dimetyl-(2-hydroxydodecyljfosfín oxid.

V iných prípadoch môžu byť použité iné surfaktanty ako: kationový surfaktant, amfolytový surfaktant alebo cviteriónový surfaktant.

Katiónové surfaktanty môžu zahrnovať katiónové detergenty. Katiónové surfaktanty obsahujú zlúčeniny, ktoré ionizujú vo vodnom médiu na katióny obsahujúce lyofilickú skupinu. Typické príklady týchto zlúčenín sú kvartéme

SK 285810 Bó amóniovc soli, ktoré obsahujú alkylovú skupinu z asi 12 až asi 18 uhlíkovými atómami, ako je lauryl benzyl dimetyl amónium chlorid.

Amfolytické surfaktanty sú zlúčeniny majúce aj aniónové aj katiónové skupiny v tej istej molekule. Príklady týchto zlúčenín sú deriváty alifatických amínov, ktoré majú reťazec z 8 až 18 uhlíkových atómov a skupiny rozpustné v aniónovej vode, ako sú: karboxysulfo, sulfo alebo sulfato. Príklady amfolyckých detergentov sú: 3-dodecylaminopropán sulfonát sodný, sódium-N-metyltaurát a podobné substancie, ako sú vyššie alkyl disubstituované aminokyseliny, betaíny, tctiny, sulfátovaný reťazec olefínových amínov a sulfátované imidazolínové deriváty.

Cviteriónové surfaktanty zahrnujú syntetické detergenty. Cviteriónové surfaktanty sú vo všeobecnosti deriváty alifatických kvartémych amóniových zlúčenín, v ktorých alifatický radikál môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený reťazec, kde jeden z alifatických substituentov obsahuje 8 až 18 atómov uhlíka a jeden obsahuje v aniónovej vode rozpustnú skupinu, ako je karboxy, sulfo, sulfáto. Príklady zlúčenín podľa uvedenej definície sú 3-(N,N-dimetyl-N-hexadecyl amónio)-propán-l-sulfonát a 3-(N,N-dimetyl-N-hexadecyl amónio)-2-hydroxy propán-l-sulfonát.

Klinická farmakológia

Zmiešaním a kombinovaním fytochemikálií z Echinacea a Commiphora (antimikrobiálne izoláty, rastlinné extrakty a mikrobiálne inhibítory) a následným aplikovaním so surfaktantom (prednostne benzalkónium chlorid) a živinovým nosičom (prednostne kyselina folová) a sterilným vodným nosičom sa získali neočakávané a prekvapujúce výsledky v liečení HIV a iných infekčných ochorení a taktiež sa dosiahlo zvýšenie účinnosti liečiva (mikrocibid). Pri testovaní in vitro jedinečná zlúčenina preukazuje neočakávanú a prekvapujúco dobrú antivírusovú aktivitu proti HIV, ktorá zahrnuje inhibíciu pripojenia HIV na cieľové bunky. Pri lokálnom testovaní synergického liečiva in vivo sa okamžite zastavila infekcia herpes simplex. Ak bolo synergické liečivo testované in vitro, benzalkónium chloridový surfaktant bol menej toxický a spadal do intervalu bezpečného použitia a taktiež bola zaznamená vyššia úroveň inhíbičnej aktivity proti HIV a HSV 1 & 2. Synergizmus interakcie a zmiešanie fytochemikálií z Echinacea a Commiphora, kyseliny folovej a surfaktantu bolo demonštrované a pozorované z hľadiska rýchlej rozpustnosti zložiek, ktoré boli zmiešané a bola pozorovaná nepatrná adhezívna kvalita roztoku. Chemické vlastnosti fytochemikálií z Echinacea a Commiphora, surfaktantu-živinového nosiča (živina) a vodného nosiča zvyšujú stabilizáciu a zvyšujú reaktivitu, ktorá sa využíva v liečení infekčných ochorení.

Liečivo môže byť použité v rôznych zriedeniach na orálnu a nasálnu mukózu, na vaginálne tkanivo, na labiálne tkanivo, na análne a peri-análne tkanivo, penisové tkanivo, spojivové tkanivo, otvorené podkožné tkanivo a vo vyšších zriedeniach na očné infekcie a prednostne na rektálne alebo vaginálne podanie. Zmenou koncentrácie liečivo môže byť podávané aj mimočrevne. Liečivo môže byť kontraindikované vo vaginálnych a análnych cestách v baliacom poťahu, v ušnom kanáli v uzavretom obale, ale takéto použitie môže vyvolať dráždenie alebo chemické poleptanie. Liečivo je teda nevhodné na použitie v liečení anaeróbnych hubových infekcii, aj keď určité huby môžu byť rezistentné.

Príklady 1 až 7. In vivo testovanie

V začiatočnej lokálnej aplikácii in vivo štúdie boli vykonávané na zhodnotenie účinnosti lekárskeho ošetrenia a liečiva podľa vynálezu na niekoľkých ľudských subjektoch, ktoré boli pozitívne na HSV 1 alebo 2. Subjekty boli liečené lokálne liečivom obsahujúcim benzalkónium chloridový surfaktant vo vodnom roztoku (v pomere 1 : 750) v kombinácii s bylinnou rastlinnou drogou z Echinacea purpurea v práškovej forme, ktorá obsahuje už uvedené fytochemikálie. Kompozícia bola aplikovaná dvojkrokovým postupom. V prvom kroku sa zvlhčila postihnutá plocha alebo vezikula s benzalkónium chloridovým surfaktantom vo vodnom roztoku sprejom alebo použitím rozprašovača. V druhom kroku sa aplikoval náter práškových fytochemikálií na vlhkú plochu postrekom prášku na infikovanú plochu. Dôležité je v tomto liečení, aby sa dosiahlo kompletné pokrytie postihnutého miesta v priebehu vypuknutia. Teda plocha vypuknutia by mala byť udržiavaná pokrytá kompozíciou a ak je to potrebné, treba znova aplikovať kompozíciu.

Sedem subjektov tvorilo šesť žien a jeden muž. V začiatkoch tejto štúdie mal muž 38 rokov a ženské subjekty mali 8, 27, 30, 32, 38 a 39 rokov. V priebehu približne šiestich týždňov trpeli dvanástimi vypuknutiami infekcie. Deväť z vypuknutí boli HSV 2, genitálny herpes a tri boli HSV 1, opar na perách. Osemročný a 27-ročný ženský subjekt trpel na HSV 1 (opar na perách), 30-ročný, 38-ročný a 39 ročný ženský subjekt trpel na HSV 2 (genitálny herpes). 38 ročný subjekt trpel tiež na HSV 1 (opar na perách). Muž trpí na HSV 2 (genitálny herpes). Všetky testované subjekty mali dobre vedené záznamy o ochorení a taktiež priebeh ochorenia bol štandardný. Aby sa získali objektívne údaje, testované osoby nevedeli nič o testovanom liečení ani o účinku liečiva. Pri opakovanom testovaní subjekty boli upozornené, že medzi vzorkami môže byť aj placebo.

V siedmich prípadoch mikrobiálna zlúčenina (liečivo) bola aplikovaná priamo na tkanivo v začiatočnom štádiu. V šiestich prípadoch mikrobiálna zlúčenina bola aplikovaná priamo na erupčné vezikuly (pľuzgieriky). Antimikrobiálna zlúčenina bola nevyhnutne znova aplikovaná, aby sa získal náter.

Pozorovania: Výsledky testovania siedmich subjektov na liečivo boli neočakávane prekvapujúco dobré a veľmi dôsledné. V každom prípade subjekt uvádza, že hneď po aplikácii kompozície (liečiva) na postihnutú plochu, bolesť úplne zmizla v priebehu 10 až 20 minút, pričom v minulosti nič neuvoľnilo bolesť takýmto spôsobom. V siedmich prípadoch, v ktorých bola použitá zlúčenina (liečivo) v začiatočnom štádiu, subjekty uvádzajú, že bolesť bola zastavená, všetky symptómy vedúce ku stupňovaniu vzplanutia boli úplne zastavené a vzplanutie znova nenastalo. Všetky vonkajšie symptómy a fyzické prejavy herpesu zmizli v priebehu niekoľkých hodín po aplikácii liečiva. V piatich prípadoch, kde zlúčenina (liečivo) bola aplikovaná na eruptované pľuzgiere, subjekty uvádzajú, že bolesť sa zastavila v priebehu minút a pálenie, svrbenie a dráždenie zmizlo v priebehu dvoch až štyroch hodín a pľuzgieriky boli vysušené v priebehu 21 hodín. Vo všetkých prípadoch ďalšie symptómy ako horúčka, malátnosť, opuch, mokvanie pier a bolestivá urinácia boli zastavené po aplikácii liečiva.

Keď subjektom bola daná dávka kompozície (liečiva) na testovanie budúceho vypuknutia, zistilo sa, že ak pri začiatočných príznakoch vzplanutia, ktoré signalizuje začiatočné štádium vzplanutia, bola aplikovaná zlúčenina (liečivo) podľa inštrukcií, vzplanutie bolo úplne zastavené a odstránené. Ďalej sa zistilo, že subjekty, ktoré mali skúsenosť s vzplanutiami niekoľkokrát ročne, mali nevšedne dlhú latentnú periódu. U subjektu, ktorý mal niekoľko vzplanutí mesačne v priebehu štyroch rokov po aplikácii tejto zlúčeniny (liečiva), sa vzplanutie neprejavilo v priebehu jedného roka.

SK 285810 Β6

Dodatočné pozorovania: Jeden mužský subjekt uvádza, že po začiatočnej aplikácii počas začiatočnej fázy vzplanutia zabudol na opätovné použitie kompozície (liečiva) na 30 hodín. Následne na to sa objavilo niekoľko pľuzgierov a začali sa spájať. Subjekt pokračoval v užívaní kompozície (liečiva) a potom už udržiaval plochu dobre pokrytú kompozíciou. Následne na to vzplanutie zmizlo do 21 hodín takým istým spôsobom, ako je opisovaný u iných ľudských subjektov.

Iné pozorovania poukazujú na to, že kompozícia (liečivo) môže byť oslabená alebo menej účinná v prítomnosti iných proteínov alebo mydiel. U jedného ženského subjektu, ktorý bol príliš horlivý v čistení postihnutého miesta pred aplikáciou kompozície (liečiva), sa stalo, že po troch úspešných liečeniach vzplanutia sa v tomto prípade dostavilo nie bežné štípanie a nedošlo k úľave od symptómov po aplikácii kompozície (liečiva). Tento stav trval 24 hodín a vzplanutie sa stupňovalo až došlo k úplnému vzplanutiu so všetkými symptómami ochorenia. Potom dostala inštrukcie na dôsledné vypláchnutie mydlových zvyškov z plochy a kompozícia sa znova aplikovala na suchú plochu. Následne potom uvádza, že vzplanutie bolo úplne odstránené ako to bolo v predchádzajúcich prípadoch pri aplikácii kompozície.

Príklady 8 až 13 Dermatologické a veterinárne testovanie.

Testovanie na živočíchoch sa uskutočnilo na určenenie nejakých možných dermatologických alergických reakcií vyvolaných kompozíciou (liečivom). Bolo použitých šesť živočíšnych subjektov. Tieto subjekty zahrnujú 3 samice zajacov (druh neznámy), 2 psy (jedna dvojročná suka a jeden deväťročný pes), jedného trojročného kocúra. V týchto testoch bola použitá uvedená kompozícia, ktorá bola aplikovaná predtým určeným spôsobom na vnútro vonkajšieho ucha každého zvieraťa. Vo všetkých prípadoch bola plocha pokrytá zlúčeninou počas 24 hodín, tento čas bol použitý aj u ľudských subjektov. Testovanie uskutočnené na šiestich živočíšnych subjektoch poukazuje na to, že nedošlo k žiadnym príznakom dermatologického dráždenia alebo alergickej reakcie.

Príklad 14

Uvedená medicinálna zlúčenina obsahujúca vírusové inhibítory bola testovaná na papilloma víruse, ktorý spôsobuje bradavice na nose dvojročného čistokrvného koňa. Papilloma vírusové bradavice sa komplikovane liečia. Bradavica meria 25 mm v priemere. Antimikrobiálna zlúčenina (liečivo) bola aplikovaná dvakrát denne. Bradavica bola potom meraná po každej aplikácii.

Výsledky: Absolútne neočakávane sa bradavica zmenšila približne o 3 mm za deň po aplikácii liečiva a na piaty deň úplne zmizla. Bolo pozorované, žc degradácia sa začala pri prvých povrchových vrstvách obnažujúc veľké erytematózne pľuzgiere. Je zaujímavé, že bradavice sa nezmenšili vo veľkosti odlupovaním alebo oškrabovaním, ale boli zmenšené v bode pripojenia na epidermis a zmizli bez následkov zjazvenia.

Vo vývoji, dlhodobé in vivo štúdie tohto vynálezu, ktoré začali s prvými siedmimi subjektmi v apríli 1989 a pretrvávajú už sedem rokov, bolo liečených 100 infekčných vzplanutí liečivom v rozdielnych koncentráciách. Vo všetkých prípadoch sa dosiahli prekvapujúco dobié výsledky a to: 1. Bolesť zmizla v minútach. 2. Nenastalo žiadne vzplanutie, keď kompozícia bola aplikovaná v začiatočnom štádiu. 3. Vzplanutie zmizlo do 21 hodin po aplikovaní v štádiu pľuzgierov.

In vitro testovanie

Laboratórne testovanie prebiehalo pri University Of Chicago, Clinical Microbiology Laboratories (Klinických mikrobiologických laboratóriách) na určenie inhibítora aktivity (in vitro) medicinálnej liečby a kompozície (liečivo). Laboratórne testovanie bolo vykonávané riaditeľom, PhD a profesorom patológie. In vitro testovanie medicinálnej kompozície označovanej ako „liečivo“ dáva prekvapujúco dobré výsledky. Určilo sa, že medicinálna liečba a kompozícia má neočakávane prekvapujúco dobré výsledky ako inhibítor aktivity HSV 1 a HSV 2. Patológom bolo potvrdené, že „stovky“ testovaných iných zlúčenín nedosahovali také dobré výsledky ako tieto.

Nasledujúce uskutočnené testy liečiva sa vykonávali a výsledky boli získané v Univerzite v Chicago. Na jasnú interpretáciu určitých vedeckých údajov a výsledkov testovania boli použité nasledujúce definície:

„MEM“ zodpovedá minimálnemu esenciálnemu médiu. Toto médium je kultivačné médium použité v laboratóriách na nárast buniek, na ktorých prebiehali testy.

„Fibroblast“ je mezenchým ľudskej bunky (bunky spojivového tkaniva, krvi, kosti, lymfatické bunky, chrupavkové bunky).

„IC₅o“ zodpovedá inhibičnému koncentrátu. Na toto testovanie bol vybraný ako konečný bod 50 %. Číslo označuje najväčšie zriedenie pod 50 %, čo sa považuje za definíciu konečného bodu.

Ak plocha pod zriedením je prázdna, naznačuje to, že pri tomto zriedení môže byť zaznamenaná toxicita a test sa nedal vyhodnotiť alebo údaje sú nevhodné na interpretáciu. Ak plocha pod zriedením je označená spojovníkom (-) naznačuje to, že je tam prítomný plak a inhibícia herpes (HSV) je výborná.

Príklady 15 až 17

V týchto in vitro testoch boli použité nasledujúce liečivá:

Referenčné liečivo # 1. Benzalkónium chloridový surfaktant vo vodnom roztoku v pomere 1 : 750. Surfaktant je vodný roztok, ktorý bol filtrovaný pred použitím a zriedený v rovnakom objeme 2X MEM na zriedenie 1 : 1 500 v IX MEM.

Referenčné liečivo # 2. Echinacea-prálkavá fytochemikália vo vodnom roztoku. Tento prípravok bol extrahovaný teplou infúziou v sterilnej vode. Extrahované fytochemikálie boli pred použitím centrifugované a filtrované. Filtrované fytochemikálie sa zriedili v rovnakom objeme 2X MEM na získanie čistého prípravku v IX MEM.

Referenčné liečivo # 3 Echinacea-ptásková fytochemikália bola extrahovaná a kombinovaná s benzalkónium chloridovým surfaktantom studeným infúznym procesom. Kombinovaný prípravok bol pred použitím centrifugovaný a filtrovaný a zriedený v rovnakom objeme 2X MEM na získanie čistého prípravku v IX MEM.

L Tri 24 časťové platne boli naočkované fibroblastami. Tri rozdielne extrakty (na porovnanie) v piatich koncentráciách kompozície sa použili na uskutočnenie antivírusovej aktivity v koncentráciách: čistý, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 a 1 : 16 v IX MEM. Na každej platni boli prítomné štyri kontrolné časti, ktoré obsahujú MEM bez liečiva.

2. Rastové médium sa odstránilo z častí a 200 pl HSV-1 bolo pridaných ku každej časti vyššej polovici každej platne. HSV-1 bolo zriedené 1 : 5000 (2,0 μί, kmeňa HSV-1 v 10 ml MEM). Vírusový titer bol 6 x 10⁵ na 1 ml.

3. Platne boli očkované pri 37 °C počas dvoch hodín.

4. Inokulum sa odstránilo a jeden mililiter MEM obsahujúci liečivo # 1 - 3 bol pridaný do štyroch časti. Koncentrácia liečiva v porovnaní s MEM je uvedená.

Tabuľka 1

Koncentrácia	nezriedená	1 :2	1 :4	1 : 8	1 : 16
Liečivo (pl)	4000	2000	1000	500	250
MEM (pl)	-	2000	3000	3500	3750

5. Výsledky: HSV-1, kvapalinový poťah, liečivo pridané hneď po vírusovej absorpcii.

Platňa 1, Liečivo # 1 kontaminované baktériami. Žiadny nárast, asi poškodené tkanivo.

Platňa 2, Liečivo # 2 kontaminované baktériami. Žiadny nárast asi poškodené tkanivo.

Platňa 3, Liečivo # 3. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2 a3.

Tabuľka 2 - Liečivo # 3 HSV 1. Testovacie výsledky

koncentrácia	nezriedené	1 :2	1 :4	1 : 8	1 : 16
plak 54	toxický	tox.	-	6*	12**
plak 42	toxický	tox.	-	4*	16**
plak 48				5	14	IC5O>1 : 16

Tabuľka 3- Liečivo # 3 HSV 2. Testovacie výsledky

Koncentrácia	nezri edeny	1 :2	1 :4	1 : 8	1:16
plak 46	toxický	tox.	-	22*	32**
plak 49	toxický	tox.	-	21*	28**
priemer 48					22	30ICj)=l:8

* slabá toxicita ** veľmi malý plak

Komentár: Testovanie s liečivom # 3 poskytuje výborne výsledky. Bunky vyzerajú byť čisté bez kontaminácie. Pri nižších zriedeniach môže byť prípravok toxický pre určité bunky. Tento prípravok bol neočakávané dobrý v inhibičnej aktivite.

Príklady 18-20

Tri 24 časťové platne boli naočkované fibroblastami a nasledujúcimi liečivami.

Referenčné testované liečivo # JA = Benzalkónium chloridového surfaktantu vo vodnom roztoku. Benzalkónium chloridový surfaktant bol pripravený riedením vo vode v pomere 1 : 375 (32 pl v 12,0 ml sterilnej vody). Tento roztok sa prefiltroval pred použitím a bol zriedený v rovnakom objeme 2X MEM za vzniku 1 : 750 zriedenia v IX MEM. Zriedenie bolo vykonané na získanie tohto pomeru.

Referenčné testované liečivo # 2A = Echinacea purpurea - fytochemikália v práškovej forme vo vodnom roztoku. Tento prípravok bol 50 mg/ml roztok (300 mg v 6,0 ml vody) prášku z Echinacea purpurea v sterilnej vode. Zmes bola vortexovaná a chladená počas štyroch hodín. Echinacea - práškový prípravok bol centrifugovaný pri 3500 rpm počas 15 minút pri 10 °C a filtrovaný pred použitím a potom zriedený v rovnakom objeme 2X MEM na získanie čistého prípravku IX MEM.

Referenčné testované liečivo # 3A = Prášková Echinacea purpurea (fytochemikália) rozpustená v benzalkónium chloridovom surfaktante. Tento prípravok bol 50 mg/ml roztok (300 mg v 6,0 ml benzalkónium chloridu, 1 : 375). Zmes bola vortexovaná a chladená počas štyroch hodín. Zmes fytochemikálie a surfaktantu bola centri fugovaná pri 3500 rpm počas 15 minút pri 10 °C a filtrovaná pred použitím a potom zriedená v rovnakom objeme 2X MEM na získanie čistého prípravku v IX MEM.

1. Použili sa tri platne na chránenie troch liečivých prípravkov. Koncentrácia potrebná na udržiavanie aktivity bola 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 a 1 : 16 v IX MEM. Boli tu prítomné štyri kontrolné časti na každej platni, ktoré obsahovali MEM bez liečiva.

2. Rastové médiá boli odstránené z častí a 200 pl HSV-1 bolo pridaných ku každej časti vyššej polovice každej platne. HSV-1 bol zriedený 1 : 5000 (2,0 pl kmeňa HSV-1 v 10 ml MEM). Vírusový titer bol 3 x 10⁶ na mililiter.

3. Platne boli inkubované pri 37 °C počas štyroch hodín.

4. Inokulum bolo odstránené a jeden ml MEM obsahujúci liečivo #1A - 3A bol pridaný ku štyrom častiam.

Tabuľka 4

Koncentrácia	nezriedené	1 :2	1 :4	1:8	1 : 16
Liečivo (pl)	4000	2000	1000	500	250
MEM (pl)	-	2000	3000	3500	3750

5. Výsledky. HSV-1, kvapalný poťah, kompozícia pridaná ihneď po vírusovej absorpcii.

Tabuľka 5 - liečivo # 1A - HSV 1 testové výsledky

Koncentrácia	1 :2	1 :4	1 : 8	I : 16	1 : 32
plak 70	tox.	tox.	tox.	tox.	tox.
plak 68
plak 58
plak 74
Priemer 70

Komentár: Tieto časti majú čistý precipitát buniek. Benzalkónium chlorid je pravdepodobne precipitovaný proteínom v médiu.

Tabuľka 6 - Liečivo # 2A - HSV L Testové výsledky

kone.		1 :2	1 :4	1 :8	1 : 16	1 : 32
plak 72	-	-	-		9*	12*
plak 74	-	-	-		7	8
plak 79	-	-	-		4	12
plak 71	-	-	-		7	11
Priemer 70			ICso>l : 32

Komentár: Aj keď tu bol prítomný nejaký plak, tak bol veľmi malý.

Tabuľka 7 - Liečivo #3 A - HSV L Testové výsledky

Koncentrácia		1:2	1 :4	1 : 8	1 : 16	1 : 32
plak 72	-	-	-		9*	12*
plak 74	-	-	-		7	8
plak 79	-	-	-		4	12
plak 71	-	-	-		7	11
Priemer 70			IC50> 1 : 32

Komentár: Aj keď tu bola prítomná určitá toxicita, toto liečivo malo veľmi prekvapujúce výsledky v inhibovaní vírusu. Neobjavil sa žiaden plak.

Príklady 21 -24

Štyri 24 časťové platne boli očkované fibroblastami.

Referenčné testované liečivo tt 1B = Benzalkónium chloridového surfaktantu vo vodnom roztoku. Benzalkónium chlorid bol pripravený zriedením 1 : 1000 vo vode (10 pl v 10,0 ml sterilnej vody). Roztok bol filtrovaný pred použitím a zriedený v rovnakom objeme 2X MEM na získanie zriedenia 1 : 2000 v IX MEM. (500 pl liečiva plus

2X MEM).

SK 285810 Β6

Referenčné testované liečivo # 2B = Prášok z Echinacea purpurea fytochemikálie vo vodnom roztoku. Tento prípravok bol 50 mg/ml roztok (250 mg v 5,0 ml vody) prášku z Echinacea purpurea v sterilnej vode. Zmes bola vortexovaná a chladená počas štyroch hodín. Tento práškový prípravok z Echinacea bol centrifugovaný pri 3500 rpm počas 15 minút pri 10 °C a filtrovaný pred použitím a zriedený v rovnakom objeme 2X MEM na získanie čistého prípravku v IX MEM. (500 μΐ liečiva plus 500 μΐ 2X MEM).

Referenčné testované liečivo # 3B - Prášok z Echinacea purpurea fytochemikálie rozpustený v benzalkónium chloridovom surfaktante. Tento prípravok bol 50 mg/ml roztok (250 mg v 5,0 ml benzalkónium chlorid, 1 : 1000). Zmes bola vortexovaná a chladená počas štyroch hodín. Fytochemikálie z Echinacea a surfaktanty boli centrifugované pri 3500 rpm počas 15 minút pri 10 °C a filtrované pred použitím a potom zriedené v rovnakom objeme 2X MEM na získanie prípravku v IX MEM (500 μΐ liečiva plus 500 μΐ 2X MEM).

Referenčné testované liečivo # 4B = Prášok z Echinacea purpurea (fytochemikálie) vo vodnom roztoku bol zmiešaný s benzalkónium chloridovým surfaktantom v pomere 1 : 1000. Tento prípravok bol 50 mg/ml roztok (250 mg v 5,0 ml vody) prášku z Echinaceapurpurea v sterilnej vode. Zmes bola vortexovaná a chladená počas štyroch hodín. Vodné fytochemikálie boli centrifugované pri 3500 rpm počas 15 minút pri 10 °C a filtrované pred použitím. Tento prípravok bol zriedený v rovnakom objeme benzalkónium chloridu v pomere 1 : 1000 na získanie Echinacea-benzalkónium chloridovej zmesi. Táto zmes bola zriedená v rovnakom objeme 2X MEM na získanie zriedenia 1 : 4 prípravku v IX MEM (500 μΐ liečiva 1 a 250 μΐ liečiva 2 plus 500 μΐ 2X MEM).

1. Štyri platne sa použili na udržiavanie liečivého prípravku. Koncentrácie potrebné na udržiavanie antivírusovej aktivity boli 1 : 20, I : 40, 1 : 80, 1 : 160 a 1 : 320 v IX MEM. Štyri kontrolné časti na každej platni obsahovali MEM bez liečiva.

2. Rastové médium sa odstránilo z častí a 200 μΐ HSV-1 bolo pridaných ku každej časti vyšších dvoch radov každej platni. HSV-1 bolo zriedené 1 : 5000 (2,0 μΐ zásoby HSV-1 v 10 ml MEM). Vírusový titer bol 3 x 10⁶ na mililiter. Tiež 200 μΐ HSV-2 bolo pridaných ku každej časti nižšej polovice každej platne. HSV-2 bolo zriedené 1 : 2000 (5,0 μΐ zásoby HSV-2 v 10 ml MEM). Vírusový titer bol 6 x 10⁵ na mililiter.

3. Platne boli očkované pri 37 °C počas štyroch dní.

4. Inokulum bolo odstránené a jeden ml MEM obsahujúci liečivá 1 - 4 bol pridaný ku štyrom častiam.

Tabuľka 8

Koncentrát	1 : 20	1 : 40	1 : 80	1 : 160	1 :320
Liečivo (μΐ)	400	200	100	50	25
MEM (μΐ)	3600	3800	3900	3950	3975

5. Výsledky: HSV-1, kvapalný poťah, liečivo pridané ihneď po vírusovej absorpcii.

Tabuľka 9- Liečivo # 1B - HSV 1 testové výsledky

Koncentrácia	1 : 20	1 :40	1 : 80	1 : 160	1 : 320
plak 37	toxický	toxický	toxický	toxický	15?*
plak 45					18?*
Priemer 41				IC50

Komentár: Mierna toxicita, test bol ťažko vyhodnotiteľný HSV-2, kvapalný poťah, liečivá boli pridané ihneď po vírusovej absorpcii.

Tabuľka 10 - Liečivo # IB - HSV 2 testové výsledky

Koncentrácia	1 :20	1 :40	1:80	1 :160	1 :320
plak 38	toxický	toxický	toxický	toxický	21
plak 42					17
Priemer 40					19	IC»> 1:320

Komentár: Test bol tiež toxický na dobré vyhodnotenie.

Tabuľka 11 - Liečivo # 2B - HSV 1 testové výsledky

Koncentrácia	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
plak 39	2*	8*	23*	24	44
plak 40	3	18	11	28	38
Priemer 40	3	13	17	26		ICs>>1:80

Komentár: Malé plaky

Tabuľka 12 - Liečivo # 2B - HSV 2 testové výsledky

Koncentrácia	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
plak 48	21	33
plak 52	22	38
priemer 50	21,5	35,5				1C»>1:20

Tabuľka 13 - Liečivo # 3B - HSV 2 testové výsledky

Koncentrácia	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
plak 44	1*	17	31	37
plak 46	-	16	28	27
priemer	45	-	17	30 32		IC50> 1:40

Komentár: Aj keď tu bola prítomná určitá toxicita, liečivo bolo dobré a nebol prítomný žiadny plak.

Tabuľka 14 - Liečivo # 3B - HSV 2 testové výsledky

Koncentrácia	1:20	1:40	1:80	1: 160	1:320
niekoľko buniek	11*	27	30	35
plak 44	10	32
priemer 44	11	295				K5o>1:4O

Komentár: Ťažký test na dobrý odpočet. Ale liek bol výborný inhibítor účinnosti.

Tabuľka 15 - Liečivo #4B - HSV 1 testové výsledky

koncentrácia	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640
plak 47	toxický	toxický	toxický	33
plak 48			28
priemer 48			30			KD»>l:640

Komentár: Toxicita pravdepodobne spôsobená benzalkónium chloridom. Liečivo pri 1 : 320 zriedení má veľmi silnú ihibičnú aktivitu.

Na in vitro testy v príkladoch 21 - 24 sa využívajú surové materiály, ktoré neboli čistené. Testy demonštrujú prekvapujúco dobrú vírusovú inhibičnú aktivitu a pravdepodobný synergizmus medzi zložkami.

V predchádzajúcich in vitro testoch, kde referenčné liečivá #3, 3A a 3B boli fytochemikálie z Echinacea purpurea extrahované a kombinované s benzalkónium chloridovým surfaktantom, demonštrovali vyššiu antivírusovú aktivitu a taktiež synergizmus medzi zložkami: Echinacea purpurea a benzalkónium chlorid. Toto je možné vysvetliť zdieľanou stabilitou a zvýšenou reaktivitou medzi dvoma zložkami. Benzalkónium chlorid v synergickej zmesi prejavuje nižší stupeň toxicity a synergická kombinácia prejavuje vyšší stupeň antivírusovej aktivity, najmä s HSV-2.

SK 285810 Β6

HIV testy

Viracea-2 bola testovaná na zhodnotenie anti-HIV účinnosti v akútnom infekčnom modeli testovania. Prídavné testovanie bolo uskutočnené na určenie intervalu a mechanizmu účinku zlúčeniny.

Viracea-2 bola dodávaná ako roztok. Formulácia zahrnuje filtráciu roztoku a centrifugáciu. Vysoká testová koncentrácia použitá v každom teste sa pohybovala v zriedení : 5 až 1 : 100 v tkanivovom kultivačnom médiu. Zlúčenina bola uskladnená pri 70 °C pred použitím.

Propagácia a stanovenie množstva bunkových línii a vírusových kmeňov

Bunky použité v zlúčenine podrobenej testovaniu boli označené ako CEM-SS bunková línia. Tieto bunky sú vysoko citlivé na infikovanie HIV, rapídne tvoria mulijadrové syncytia a sú eventuálne usmrtené HIV. Tieto bunky sú ľahko získané (2 - 7 x 10³ buniek na 1 ml) v RPMI 1640 tkanivovom kultivačnom médiu doplnenom 10 % fetálnym pečeňovým sérom, glutamínom a antibiotikami. Bunky sú pasážované dvakrát týždenne pri zriedení 1 : 20. Pasážové číslo je zisťované každý týždeň a bunky sú odstránené po 20 týždňoch pasážovania a čerstvé CEM-SS bunky sú rozmrazené a ďalej využité v testovaní. Zásoby CEM-SS buniek boli zmrazené v kvapalnom dusíku v 1 ml NUNC skúmavkách v 90 % fetálnom teľacom sére a v 10 % dimetyl sulfoxide (DMSO). Nasledujúce rozmrazené CEM-SS bunky sú pripravené na použitie v primárnom testovaní po týždňoch kultivácie. Posledná bunková línia je nahradená novými CEM-SS bunkami, ktoré sú testované v testovacom protokole, ktorý využíva zásobu infekčného vírusu a AZT. Ak infekčnosť vírusu je výrazne rozdielna na nových bunkách alebo ak AZT prejavuje nižšiu aktivitu, nezje očakávaná, nové bunky budú zahrnuté do udržiavacieho programu. Mykoplazmové testovanie je vykonávané na všetkých bunkových líniách (pozri nižšie).

Zásoby vírusu sú pripravené a titrované v CEM-SS bunkách, ktoré sú umiestnené v 5 ml vzorkách a mrazené pri -135 °C. Po rozmrazení nepoužitý vírus je odložený, aby sa vyhlo zmenám v infekčnom titry. Optimalizačné testy majú dokumentovať jednu dlhú redukciu vo vírusovom titre v prvom zmrazenie - rozmrazenie cykle a optimalizovať redukciu titra v týchto cykloch. Vírusové zásoby sú pripravené akútnou infekciou 5 x 10⁵ CEM-SS buniek s HIV v objeme 200 μΐ pri mnohonásobnej infekcii určenej na kompletné zabitie na siedmy deň po infekcii (približne 0,05 na I11_B izolátu HľV-1 a 0,01 na RF izolátu HIV-1). Bunky sú vystavené infekcii len počas jednej hodiny a pri 37 °C a potom sú bunky transportované do T25 banky a objem je zvýšený na 2 ml. Jeden deň po infekcii objem bol prenesený do 5 ml a na druhý deň sa objem zvýšil na 10 ml. Začiatkom štvrtého dňa sa bunky peletizovali. Supematant bol odložený a bunky sa resuspendovali v čerstvom 10 ml podiele tkanivového kultivačného médiá. Predtým ako sa začal rast buniek na dlhší čas, sa vykonala úplná zmena média. Vírusové inokulum použité v primárnom testovaní na odstránenie relatívne nevyčerpaných živín sa použilo na infikované bunky. Sfarbujúca reakcia s XXT si vyžaduje, aby koncentrácia glukózy bola na vysokej hladine. Ak hladina glukózy klesne počas bunkového rastu, nenastane metabolická konverzia tetrazoliového farbiva na formazánový produkt.

Bezbunkové supematanty z akútne infikovaných buniek sú odoberané na štvrtý, na piaty, na šiesty, na siedmy deň. Podiel supematantu je odobraný oddelene každý deň na použitie v určovaní titra. Určenia titra zahrnujú testovanie aktivity reverznej transkriptázy, určenie konečného bodu titrácie alebo plakové testovanie (CEM-SS) kvantity in fekčných častíc a kvantifikáciu kinetiky usmrtenia bunky. Určila sa hladina píkov infekčného vírusu tvoreného v akútne infikovaných kultúrach ako životaschopnosť buniek na 50 %. Aj keď primáme udržiavajúce testovanie kvantifikuje ochranný účinok zlúčeniny jej schopnosťou inhibovať cytopatické efekty vyvolané HIV, množstvo vírusu potrebného na zabitie CEM-SS buniek po šiestom dni je bežne využívané na určenie množstva vírusu potrebného na dobrý primárny udržiavací test. Každá denná zásoba je titrovaná v primárnom XTT testovaní dvojnásobne zriedeným roztokom vírusu začínajúc pri vysokej testovacej koncentrácii 50 μΐ vírusu na jamku. Farbiaca metóda využíva tetrazóliové farbivo XTT a je použitá na určenie množstva vírusu potrebného na zabitie všetkých CEM-SS buniek v každej jamke a toto minimálne množstvo vírusu je potrebné na vykonanie primárneho testovania. Identické metódy sa použili na prípravu všetkých vírusových izolátov požívaných v laboratóriu, sem patria laboratórne odvodené kmene HIV-1, HIV-2 a STV. Použité klinické izoláty sú pasažované v čerstvých ľudských bunkách a metódy na rast týchto buniek a produkciu vírusových zásob sú opísané.

Mikrotitrový antivírusový XTT test

Príprava bunky

CEM-SS bunky alebo iné založené ľudské bunkové línie použité v týchto experimentoch boli pasažované v ΤΙ 50 banke. Deň pred testom boli bunky rozštiepené 1 : 2 na zaistenie toho, aby boli v exponenciálnej fáze v čase infekcie. V deň testu bunky boli premyté dvakrát tkanivovým kultivačným médiom a resuspendované v čerstvom tkanivovom kultivačnom médiu. Farbenie a počítanie buniek bolo vykonávané použitím hemacytometra a vylúhovaním v trypan- modrom farbive. Životaschopnosť bunky bola vyššia než 95 % pre bunky použité v tomto teste. Bunky boli peletizované a resuspendované na 2,5 x 10⁴ buniek na jeden mililiter tkanivového kultivačného média. Bunky boli pridané do platni, ktoré obsahovali liečivo v objeme 50 μ1.

Príprava vírusu

Pretitrovaný podiel vírusu bol odstránený z mrazu (-80 °C) a rozmrazený na izbovú teplotu v biologicky čistej komore. Vírus bol resuspendovaný a zriedený v tkanivovom kultivačnom médiu tak, aby množstvo vírusu pridané do každej jamky malo objem 50 μΐ. Toto množstvo je určené na kompletné usmrtenie po šiestich dňoch po infikovaní. Vo všeobecnosti vírusové zásoby produkované s IIIB izolátoru HIV vyžadujú prídavok 5 μΐ vírusu na jamku. Zásoby RF vírusu boli päť až desaťnásobne silnejšie ako požadovaných 0,5 - 1 μΐ na jamku, TCID₅o vypočítaný titráciou na koncový bod v CEM-SS bunkách poukazuje na to, že mnohonásobnosť infekcie v tomto testovaní je z intervalu 0,0005 - 2,5.

Formát platne

Formát testovacej platne bol štandardný a obsahuje kontrolné jamky pre bunky (len bunky), jamky na kontrolu vírusu (bunky plus vírus), jamky na kontrolu toxicity liečiva (bunky plus liečivo), jamky na kolorimetrickú kontrolu liečiva (len liečivo) a potom experimentálne jamky (liečivo plus bunky plus vírus).

Príklady 25 - 48

XXT farbenie testovacích platní

Po šiestich dňoch inkubácie pri 37 °C v 5 % CO₂ inkubátore testovacie platne sa analyzovali farbením s tetrazoliovým farbivom XTT. XTT-tetrazólium je metabolizované mitochondiálnymi enzýmami metabolických aktívnych bu16 niek na formazanový produkt, ktorý umožňuje rýchlu kvantitatívnu analýzu inhibície zabíjania vyvolaného HIV anti-HIV testovanými substanciami. Na šiesty deň po infekcii platne sa odstránili z inkubátora a boli pozorované použitím kruhového dna mikrotitrových platní, ktoré umožňujú rýchlu makroskopickú analýzu aktivity testovanej zlúčeniny vyhodnotením peletovej veľkosti. Výsledky makroskopických pozorovaní boli potvrdené a spresnené ďalšou mikroskopickou analýzou. XTT roztok sa pripravil len ako zásobný a to 1 mg/ml v PBS. Fenazín metosulfátový (PMS) roztok sa pripravil 15 mg/ml v PBS a bol uskladnený v tme pri -20 °C, XTT/PMS bol pripravený tesne pred použitím

Tabuľka 17

In vitro antivírusové výsledky XTT testu pre Viracea 2 riedením PMS 1 : 100 ku PBS a pridaním 40 μί na mililiter XTT roztoku. 50 mikrolítrov XTT/PMS bolo pridaných ku každej jamke platne a platňa bola reinkubovaná počas štyroch hodín pri 37 °C. Platňa sa zapečatila v mieste vrchnáka a zatmelená bola ponechaná nejaký čas na zmiešanie roztoku formazanového produktu. Platňa bola vyhodnotená spektrofotometricky pri 450 nm s „Molekular Devices Vmas“ platňový čítač. Použitím % „CPE redukcie“, % „bunkovej životaschopnosti“ sa vypočítali IC₂5,5o&95 a iné indexy.

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
0,169	0,163	Prostredie reagentu 0,164 0,166	0,160	0,170	0,074	0,072	syntetické prostredie 0,067 0,067	0,067	0,068
Tox	cc/vc	Experimentálna vysoká kone.	Tox	Tox	Experimentálna nízka kone.	cc/vc	Tox
1,468	1,421	0,461	0,257	1,170	1,467	1,501	0,207	0,222	0,214	1,506	1,503
1,321	1,397	1,316	0,209	0,191	1,340	1,494	0,200	0,202	0,204	1,446,	1,487
0,906	1,345	0,249	0,764	0,836	0,953	1,485	0,227	0,179	0,179	1,453	1,500
0,219	0,256	1,190	0,207	0,210	0,234	1,491	0,204	0,190	0,228	0,192	1,506
0,168	0,190	0,161	0,161	0,148	0,157	1,503	0,237	0,195	0,202	0,186	1,501
0,242	0,223	0,238	0,239	0,230	0,242	1,495	0,201	0,204	0,227	0,189	1,503
Kolorimetrické prostredie - vysoké koncentrácie	Kolorimetrické prostredie - nízke koncentrácie
0,258	0,172	0,159	0,165	0,163	0,165	0,165	0,166	0,166	0,171	0,159	0,169

Tabuľka 18

Viracea 2

STRŇ RF

Reagent	0,165	Liečivo Viracea 2 2	25%	50%	95%
Vírusová kontrola	0,041	TC	1 :450	: 250	1 : 100
Bunková kontrola	1,263	IC	1 : 900
Rozdiel	1,222	Antivírusový index (Al)	2,02

Tabuľka 19

Viracea 2

	Liečivo Viracea 2	Antivírusové testové hodnoty	Cytotoxicitové testové hodnoty
	Vrstva na platni	Kone. (um)	Stredné O. D.	% červeň v vírusovom CPE	Stredné O.D.	% bunková životnosť	Kolorimetrická kontrola
	Low B	0,00003	0,004	0%	1,335	100%	0,004
Založené na hodnotách	C	0,0001	0,002	0%	1,331	100%	-,006
z kolón	D	0,00032	-,017	0%	1,321	100%	0,006
7z 12	E	0,001	0,000	0%	1,332	100%	0,001
(pravá strana platne)	F	0,0032	0,004	0%	1,336	100%	0,001
	G	0,01	0,005	0%	1,334	100%	0,000
	B	0,032	0,090	7%	1,302	100%	0,000
Založené na hodnotách	C	0,1	0,368	30%	1,167	92%	-,002
z kolón	D	0,32	0,410	34%	1,764	61%	0,00
1 z6	E	1	0,002	0%	1,067	5 %	-,006
(ľavá strana platne)	F	3,2	-,056	0%	-,010	0%	0,007
	nízky G	10	-,063	0%	-,016	0%	0,093

Príklady 49 - 54

Testovanie aktivity reverznej transkriptázy

Použil sa mikrotiter základnej reakcie reverznej transkriptázy (RT). Tritiated tymidin trifosfát (NEN) (TTP) bol resuspendovaný v destilovanej vode H₂O pri 5Ci/ml. Poly rA a oligo dT boli pripravené ako zásobné roztoky, ktoré sa udržiavali pri -20 °C. RT reakčný pufor sa pripravil čerstvý na každý deň a obsahoval 125 μί IM EGTA, 125 pl dH₂O,

125 μί Triton X-100, 50 μί IM Tris (pH 7,4), 50 μί IM DTT a 40 μΐ IM MgCl₂· Tieto tri roztoky boli spoločne zmiešané v pomere jedna časť TTP, 2,5 časti poly rA : oligo dT, 2,5 časti reakčného pufra a štyri časti destilovanej vody. Desať mikrolítrov reakčnej zmesi sa nanieslo do mikrotitrovej platne s okrúhlym dnom a pridalo sa 15 μί supernatantu obsahujúceho vírus. Platňa bola inkubovaná pri 37 °C a počas 60 minút. Reakčný objem bol prenesený na

SK 285810 Β6 filtračnú maticu a tá bola premytá šesťkrát počas piatich minút v 5 % pufry fosforečnanu sodného, dvakrát počas jednej minúty v destilovanej vode, dvakrát počas jednej minúty v 70 % etanole a potom vysušená. Vysušená filtrač ná matica bola umiestnená v plastickom vrecúšku. Scintilačná tekutina bola pridaná do vrecúška a ten bol tepelne zapečatený. Vytvorená rádioaktivita bola kvantifikovaná použitím scintilačného počítača značky Wallac Microbeta.

Tabuľka 20

Viracea-2: PBMC7ROJO

Aktivita reverznej transkriptázy
Kone.	1 :0	1 : 100,000	1 : 32,000	1 : 10,000	1 :3200	1 : 1000	1 :320	1 : 100	1 : 32	1 : 10
Vzorka 1	28139	31734	36488	34880	31240	2287	7436	463	96	38
Vzorka 2	24587	27559	33120	23103	33408	20550	9478	265	103	81
Vzorka 3	32527	24114	23828	28137	23174	25825	11132	309	77	55
Vzorka 4	28418	27802	31145	26677	29274	16221	9349	346	92	58
%VC	100,0	97,8	109,6	100,9	103,0	57,1	32,9	1,2	0,3	0,2

Tabuľka 21

Viracea-2: PBMC/ROJO

Hodnoty toxicity
Kone.	1 :0	1 : 100,000	1 :32,000	1 : 10,000	1 :3200	1 :1000	ΓΤ.-320	1 : 100	1 : 32	1 : 10
Vzorka 1	2,029	1,547	1,460	1,488	1,345	1,354	0,860	0,546	0,429	0,611
Vzorka 2	2,120	1,503	1,548	1,622	1,902	1,489	0,971	0,529	0,434	0,627
Vzorka 3	1,879	1,364	1,463	1,720	1,649	1,223	0,772	0,451	0,433	0,633
Vzorka 4	2,009	1,471	1,490	1,610	1,632	1,355	0,868	0,509	0,432	0,624
%VC	100,0	73,2	74,2	80,1	81,2	67,5	43,2	25,3	21,5	31,0

Elisa

Elisové kity boli zakúpené od firmy Coulter. Test bol realizovaný podľa priloženého návodu. Pred clisou bola testovaná aktivita reverznej transkriptázy a hodnoty boli použité na zavedenie rádioaktivity v RT testovaní, na určenie zriedenia vzoriek, ktoré je potrebné pre elisu. Kontrolné krivky boli generované v každom teste na správne určenie množstva kapsidového proteínu v každej vzorke. Údaje sa získali spektrofotometrickou analýzou pri 450 nm použitím platňového čítača značky Molecular Devices Vmax. P24 koncentrácie boli vypočítané z hodnôt optickej hustoty získaných z Molecular Devices a pomocou softvéru Soft Max.

Infekčné častice

Infekčné vírusové častice boli kvantifikované použitím CEM-SS testovania plaku a kvantitatívnym testovaním infekčnosti na HIV-1 a HIV-2. Mikrotiter s 96 jamkami s plochým dnom bol pokrytý 50 μ! poly-L-lizínu pri 50 pg/m) počas dvoch hodín pri 37 °C. Jamky boli potom premyté s PBS a 2,5 x 10⁵ CEM-SS buniek bolo uložených do mikrotitrovej jamky kde sa zafixovali na dno platne. Pridal sa dostatok buniek na tvorbu monovrstvy CEM-SS buniek v každej jamke. Supematant obsahujúci vírus bol pridaný ku každej jamke XTT fázy zahrnujúcej vírus, bunku a sériový zriedený roztok testovacej substancie. Počet syncytia bol kvantifikovaný v 96 jamkovej mikrotitrovej platni s plochým dnom inverzným mikroskopom značky Olympus CK2 po štyroch dňoch infekcie. Každý syncytium pochádza z jednotlivých infekčných HIV viriónov.

Anti-HIV aktivita v čerstvých ľudských bunkách: Testovanie T-lymfocytov v ľudských bunkách.

Ľudské periférne krvné lymfocyty (PBL) boli izolované z krvi dobrovoľných darcov séronegatívnych na HIV a HBV. Leukoforezovaná krv je zriedená pufrovaným fyziologickým roztokom (Dulbecco'fosfátovaným) 1:1, vrstvená cez 14 ml Ficoll-Hypaque s hustotným gradientom v 50 ml eentrifugačnej skúmavke. Skúmavky boli potom centrifugované počas 30 minút pri 600 X.g. Pásový PBLs bol opatrne odobratý z výsledného rozhrania a následne premytý 2X PBS centrifiigáciou pri nízkych otáčkach. Po koneč nom premytí sa bunky spočítali vylúčením trypanovcj modrej a resuspendovali sa v 1 x 10⁷/ml v RPM1 1640 s 15 % fetálnym pečeňovým sérom (FBS), 2 mM L-glutamínu, 4 pg/ml PHA-P a inkubovali počas 48 - 72 hodín pri 37 °C. Po inkubácii PBLs bol centrifugovaný a prechovávaný v RPM1 1640 s 15 % FBS, 2mM L-glutamínom, 100 U/ml penicilínom, 100 qg/ml streptomycínom, 10 pg/ml gentamicínom a 20 U/ml rekombinantným ľudským IL-2. PBLs bolo získané v tomto médiu pri koncentrácii 1 - 2 x 10⁶ ml s dvojtýždňovými výmenami média až do použitia v testovaní.

Na PBL testovanie, PHA-P stimulované bunky z aspoň dvoch donorov boli združené usporiadané v čerstvom médiu v 2 x 10⁶/ml a umiestnené vnútri jamiek 96 jamkovej mikroplatne s okrúhlym dnom v 50 μΐ/jamku. Zriedené testovacie liečivo bolo pripravené v 2X koncentrácii v mikrotitrových skúmavkách a 100 μΐ každej koncentrácie je nanesených v jamkách v štandardnom formáte. 50 μΐ predurčeného roztoku vírusového kmeňa bolo nanesených do každej testovacej jamky. Jamky s bunkami a samotným vírusom boli použité na vírusovú kontrolu. Oddelené platne boli identicky nastavené bez vírusu na cytotoxické štúdie liečiva použitím XTT testovacieho systému.

V štandardnom PBL teste (MOI : 0,2) bol test ukončený na siedmy deň a nasledovalo zachytávanie vzoriek bez bunkového supernatantu na testovanie aktivity reverznej transkriptázy. V nižšom MOI PBL testovaní (MOI : 0,02) supernatantové vzorky boli zbierané na šiesty deň, na 11. deň a na 14. deň po infikovaní a testované na RI aktivitu. Tritiated tymidín trifosfát (NEN) (TTP) bol resuspendovaný v destilovanej H₂O pri 5Ci/ml. Poly rA a oligo dT boli pripravené ako zásobný roztok, ktorý bol držaný pri -20 °C. RT reakčný pufor bol pripravený čerstvý každý deň a obsahoval 125 μΐ IM EGTA, 125 μΙ dH₂O, 110 μΐ 10 % SDS, 50 μΐ IM Tris (pH 7,4), 50 μΐ lMDTTa40pl IM MgCl₂. Tieto tri roztoky boli zmiešané spoločne v pomere 2 časti TTP, 1 časť poly rA : oligo dT, 1 časť reakčného pufra. Desať mikrolitrov reakčnej zmesi bolo uložených do mikrotitrovej platne s okrúhlym dnom a 15 μΐ vírus obsahujúceho supernatantu bolo pridaných a zmiešaných. Platne boli inkubované pri 37 °C počas 60 minút vo vodnom kúpeli s tu hým nosičom na prevenciu ponorenia platne. Reakčný objem bol nanesený na miesta DE81 papiera, premytý päť-krát počas 5 minút v 5 % pufre fosforečnanu sodného, 2-krát počas 1 minúty v destilovanej vode, 2 krát počas 1 minúty v 70 % etanolu a potom bol vysušený. Opti-fluór O bol pridaný ku každej vzorke a získaná rádioaktivita bola meraná použitím scintilačného počítača firmy Wallac 1450 Microbetapius.

Triated tymidínová inkorporácia bola meraná v paralelných kultivaroch na siedmy deň. Každá jamka bola vyplnená 1 pCi tritiated tymidínu a bunky boli zbierané o 18 hodín neskôr so zberačom typu Skatron celí harvester do filtračného papiera so skleneným vláknom. Filtre boli vysušené umiestnené v scintilačnej nádobke s 1 ml scintilačného koktailu a vzniknutá rádioaktivita bola meraná scintilačným počítačom značky Packard Tri-Carbh 1900 TR.

Príklady 55-78

Testovanie anti-HIV aktivity v čerstvých ľudských bunkách: Testovanie monocytov v čerstvých ľudských bunkách.

Na izoláciu adherentných buniek 3x10⁶ non-PHA stimulované periferálne krvné bunky boli resuspendované v Hankovom pufrovacom fyziologickom roztoku s vápnikom a horčíkom obohateným 10 % ľudského AB séra. Bunky boli umiestnené na 24 jamkovú mikrotitrovú platňu pri 37 °C počas dvoch hodín. Neadherentné bunky boli odstránené prudkým premytím opakovaným šesťkrát. Adherentné bunky boli kultivované na siedmy deň v RPMI 1640 tkanivovom kultivačnom médiu s 15 % fetálneho pečeňového séra. Kultúry boli opatrne monitorované na nárast v priebehu tejto inkubačnej periódy. Infekcia buniek bola vykonaná monocytotropickým HIV-1 kmeňom BaL alebo ADA a odlišným párom AZT-citlivých a AZT-rezistentných vírusových izolátov. Každý z týchto vírusových izolátov bol získaný z NLAID AIDS „Research an Reference Reagent Program“.

Vyšší titer zásoby z každých týchto vírusov bol zbieraný z infikovaných kultúr periferálnych krvných adherentných buniek a zmrazený v 1,0 ml podiele pri -80 °C. Monocyt-makrofágové monovrstvy boli infikované pri MOI 0,1. Zlúčeniny vyhodnotené v monovrstvách boli infikované pri MOI 0,1. Zlúčeniny vyhodnotené v monocyt-makrofágovom teste boli pridané ku monovrstvám krátko pred infekciou v usporiadaní na maximalizáciu potenciálu na identifikovanie aktívnych zlúčenín.

Po dvoch dňoch po infekcii médium bolo dekantované a kultúry premyté dvakrát úplným médiom v usporiadaní na odstránenie nadbytku vírusu. Ku médiu, ktoré obsahuje primeranú koncentráciu liečiv, sa pridá čerstvé médium samotné a inkubácia pokračuje ďalších päť dní. Testovanie na životaschopnosť bolo vykonané pomocou XXT-tetrazólium alebo trypánovej modrej a elisa testovanie sa vykonalo na tvorbu p24 dreňového antigénu a bolo robené na siedmy deň po infekcii. Elizové kity boli kupované od firmy Coulter. Kontrolné krivky boli generované v každom teste na určenie množstva kapsidového proteínu v každej vzorke. Údaje boli získané spektrofotometrickou analýzou pri 450 nm použitím platňového čitača značky Molckular Devices Vmax. P24 koncentrácie boli počítané z hodnôt optickej hustoty použitím Molecular Device a pomocou softvéru Soft Max.

Tabuľka 22

Makrofágový test pre Viracea 2 pg/ml P-24 aktivita

AZT kontrola	Viracea #2
μΜ	vs. ADA	Zriedenie	vs. ADA
4	8,65	8,65	17,45	1	100	42,19	22,95	34,49
1,28	9,20	6,45	25,15	1	312	4,25	15,25	41,09
0,410	13,60	10,00	16,35	1	976	14,70	17,45	39,44
0,131	53,74	13,60	62,54	1	3051	63,64	26,25	48,79
0,042	82,89	72,44	96,63	1	9536	48,79	570,60	180,80
0,013	175,80	168,70	316,00	1	29802	278,60	243,50	450,80
0,004	914,90	891,20	499,20	1	93132	305,60	599,80	435,90
0,0014	821,90	594,80	983,10	1	291038	548,10	947,90	913,20
0,0004	1097,00	1160,00	1098,00	1	909494	814,80	790,60	820,80

Tabuľka 23

Makrofágový test pre Viracea 2 Štúdium absorbancie toxicity

AZT kontrola	Zriedenie	Viracea #1	vs. ADA
μΜ	vs. ADA
4	1,140	0,981	1,427	1 : 100	1,271	1,244	1,289
1,28	1,692	1,318	0,985	1 : 312	1,081	1,154	1,393
0,410	1,505	1,258	1,522	1 : 976	1,073	1,183	1,536
0,131	1,427	1,347	1,043	1,3051	1,482	1,032	1,518
0,042	1,534	1,725	1,720	1 :9536	1,031	1,330	1,053
0,013	1,818	1,526	1,363	1 : 29802	1,344	1,449	1,497
0,004	1,578	1,112	1,034	1 :93132	1,024	1,554	1,446
0,0014	1,386	1,350	1,133	1 :291038	1,692	1,112	1,411
0,0004	1,451	1,081	1,342	1 : 909494	1,182	1,163	1,373

SK 285810 Β6

Tabuľka 24

Anti-HIV makrofágový test (P24) pre Viracea #2 - 4

P24 Aktivita
Zriedenie	0	1 :909494	1 :291038	1 :93132	1 :29802	1 :9536	1 :305i	1 : 976	1 : 312	1 : 100
Vzorka 1	1366,8	1347	524,1	634,4	457,5	349,9	193,5	138	120,9	46,96
Vzorka 2	1366,8	1151	693,8	782,2	321,5	228	271,4	190,2	4,718	96,46
Vzorka 3	1366,8	1000	877,9	642,9	507	382,2	136,1 '	202,1	171,7	92,5
Priemer	1366,8	1166,0	695,6	686,5	428,7	320,0	200,3	176,8	99,1	78,5
% VC	100,0	85,3	51,1	50,2	31,4	23,4	14,7	12,9	7,3	5,8

Tabuľka 25

Viracea #2 - 4

XTT Hodnoty toxicity (absorbancia)
Zriedenie	0	1 :909494	1 :291038	1 :93132	1 : 29802	1 :9536	1 : 3051	1 : 976	I : 312	1 : 100
Vzorka 1	3,293	3,85	3,606	3,787	3,693	3,657	2,927	3,134	3,131	3,393
Vzorka 2	3,293	3,005	3,662	3,542	3,685	3,828	3,408	2,833	3,074	3,263
Vzorka 3	3,293	3,457	3,648	2,59	2,808	2,558	2,735	2,932	2,892	3,345
Priemer	3,293	3,437	3,639	3,306	3,395	3,348	3,023	2,966	3,032	3,334
%CC	100,0	104,4	110,5	100,4	103,1	101,7	91,8	90,1	92,1	101,2

Tabuľka 26

Anti-HIV makrofágový test (P24) pre Viracea #2-5

P24 Aktivita
Zriedenie	0	1 : 909494	1 : 291038	1 :93132	1 :29802	1 :9536	1 :305 i	1 : 976	1 :312	1 :100
Vzorka 1	1298,2	1350	793,9	1001	515,9	274	196,3	65,8	16,28	3,904
Vzorka 2	1298,2	1350	858,6	851	780,4	393,3	102,9	110,2	38,79	16,28
Vzorka 3	1298,2	1454	1262	801,2	837,8	396,1	222,2	113,1	42,73	15,72
Priemer	1298,2	1384,7	971,5	884,4	711,4	354,5	173,8	96,4	32,6	12,0
%VC	100,0	106,7	74,8	68,1	54,8	27,3	13,4	7,4	2,5	0,9

Tabuľka 27

Viracea #2 - 5_________________________________________________________________

XTT Hodnoty toxicity (absorbancia)

Zriedenie	0	1 : 909494	1 : 291038	1 :93132	1 :29802	1 : 9536	1 :3051	1 : 976	1 :312	1 : 100
Vzorka 1	3,139	3,459	3,568	3,567	3,634	3,562	3,134	3,311	3,171	2,974
Vzorka 2	3,139	3,018	3,295	3,505	3,533	3,359	2,833	3,313	3,133	2,909
Vzorka 3	3,139	3,21	3,261	3,263	3,297	3,051	2,932	2,829	3,151	3,35
Priemer	3,139	3,228	3,375	3,445	3,488	3,312	2,966	3,151	3,152	3,078
%CC	100,0	102,9	107,5	109,7	111,1	105,5	91,8	100,4	100,4	98,0

Tabuľka 28

In vitro anti-HTV makrofágový test pre Viracea 2

P24 (pg/mL)
Zriedenie	0	1 :909494	1 :291038	1 :93132	1 :29802	1 ;9536	1 :305i	1 : 976	1 : 312	1 : 100
Vzorka 1	1045,9	820,80	913,20	435,90	450,80	180,80	48,78	39,44	41,09	34,49
Vzorka 2	1046,8	790,60	947,90	599,80	243,50	570,60	26,25	17,45	15,25	22,95
Vzorka 3	1045,8	814,80	548,10	305,60	276,60	48,79	63,64	14,70	4,25	42,19
Priemer	1045,8	808,7	803,1	447,1	324,3	266,7	46,2	23,9	20,2	33,2
% VC	100,0	77,3	76,8	42,8	31,0	26,6	4,4	2,3	1,9	3,2
Tabuľka 29
Viracea 2
XXT Hodnota toxicity (Absorbancia)
Zriedenie	0	1 :909494	1 :291038	1 :93132	1 :29802	1 :9535	1 :305 i	1 : 976	1 :312	1 : 100
Vzorka 1	1,439	1,373	1,411	1,446	1,497	1,053	1,518	1,536	1,393	1,289
Vzorka 2	1,439	1,163	1,112	1,554	1,494	1,330	1,032	1,183	1,154	1,244
Vzorka 3	1,439	1,182	1,692	1,024	1,334	1,031	1,482	1,073	1,081	1,271
Priemer	1,439	1,239	1,405	1,341	1,442	1,138	1,344	1,264	1,209	1,268
%CC	100,0	86,1	97,6	93,2	100,2	78,1	93,4	87,8	84,0	88,1

Príklady 79 - 90

Testovanie väzbovej a fúznej inhibície.

Tieto testy využívajú HeLa-CD4-LTR-P-galaktozidázové bunky, ktoré obsahujú tat proteín vyvolávajúci transaktiváciu β-galaktozidázového génu budeného HIV-1 terminálnym opakovacím (LTR) promótorom. Testovanie bolo použité na kvantifikáciu obidvoch viažucich sa infekčných virónov na bunky a fúzie bunka-bunka javov. Infíko20

SK 285810 Β6 vané bunky zo syncytia sú ľahko mikroskopicky zrátateľné po inkubácii s X-gai. HIV väzbové inhibičné testovanie zahrnuje vloženie 1 x 10⁴HeLa-CD4-LTR-P-galaktozidových buniek do 200 μΙ β96 jamkovej mikrotitrovej platne s plochým dnom. Bunky boli inkubované cez noc, médium bolo odstránené a vymenené za 100 μΐ ISIS 5320 rôznej koncentrácie alebo kontrolnú zlúčeninu. O jednu hodinu neskôr 100 μΐ média obsahujúceho vírus bolo pridaných do každej jamky. Bunky boli inkubované ďalšiu hodinu a monovrstva bola premytá na odstránenie neviazaného vírusu a extracelulámej zlúčeniny. Po 48 hodinách bunky boli fixované a farbené s X-gal. Modré mnohojadrové bunky sa potom spočítali pod inverzným mikroskopom. Testovanie inbihície bunka-bunka fúzie bolo vykonávané v 96 jamkovej mikrotitrovej platni s plochým dnom. He-La-CD4-LTR-p-galaktozidázové bunky (5 x 10³) boli pridané ku každej jamke a inkubované s testovanou zlúčeninou počas 1 hodiny pred pridaním 5 x 10³ HL2/3 buniek (28). Bunky boli inkubované ďalších 48 hodín a fixované a farbené s X-gal. Modré syncytia boli počítané mikroskopicky. Farbenie bunky bolo vykonávané fixovaním buniek roztokom 1 % formaldehydu a 0,2 % glutaraldehydom a samotné farbenie fixovaných buniek bolo vykonávané 4 μΜ ferokyanidom draselným, 4 μΜ ferikyanidom draselným, 2 μΜ MgCl₂ a 0,4 % X-gal v PBS. Trans aktivácia β-galaktozidázovej expresivity bola tiež monitorovaná elisou. Bunkové extrakty boli pripravené mrazením-rozmrazením a testovanie na β-galaktozidázovú aktivitu prebehlo podľa návodu na použitie. Výsledky elisy boli kvantifikované spcktrofotochemicky pri 405 nm použitím platňového čítača značky Molecular Devices Vmax.

Tabuľka 30

Beta-gal fúzne testy : Viracea #2/SKl

Počet modrých buniek na jamku
zriedenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Vzorka 1	49,0	26,0	16,0	17,0	10,0	2,0	1,0
Vzorka 2	32,0	18,0	16,0	11,0	3,0	2,0	0,0
Vzorka 3	59,0	19,0	20,0	14,0	5,0	3,0	1,0
Stredne	46,7	21,0	17,3	14,0	6,0	2,3	0,7
% VC	100,0	45,0	37,1	30,0	12,8	5,0	1,4
STDDEV	29,3	9,3	4,9	6,4	7,7	1,2	1,2

Tabuľka 31

Beta-gal fúzne testy: Viracea #2/SK2

Percento toxicity
zriedenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
vzorka 1	1,441	1,59	1,965	1,972	1,799	1,932	0,829
vzorka 2	1,5	1,543	1,83	1,835	1,897	1,386	0,882
vzorka 3	1,425	1,536	1,839	1,867	2,036	1,615	0,758
stredné	1,455	1,558	1,875	1,891	1,911	1,644	0,823
% životnosť	100,0	106,9	129,0	130,0	131,3	113,0	56,6

Tabuľka 32

Beta-gal fúzne testy: Viracea #2

Počet modrých buniek na jamku
Kone.	0	1 -.3200	1:1000	1:320	1.100	1:32	1 .10
Vzorka 1	38,0	64,0	50,0	56,0	40,0	50,0	0,0
Vzorka 2	48,0	56,0	77,0	54,0	53,0	54,0	0,0
Vzorka 3	32,0	44,0	46,0	42,0	48,0	47,0	0,0
Stredné	39,3	54,7	57,7	50,7	47,0	50,3	0,0
%VC	100,0	139,0	146,6	128,8	119,5	128,0	0,0
STDDEV	20,5	25,6	42,9	19,3	16,7	8,9	0,0

Tabuľka 33

Viracea #2

Percento toxicity
Kone.	0	1:3200	1:1000	1 :320	1 :100	1:32	1:10
Vzorka 1	1,425	1,998	1,87	1,85	1,592	0,956	0,174
Vzorka 2	1,5	1,911	1,959	1,904	1,645	0,988	0,174
Vzorka 3	1,441	1,976	1,902	1,939	1,623	0,965	0,182
Stredné	1,456	1,962	1,914	1,898	1,620	0,970	0,177
% životnosti	100,0	134,8	131,5	130,4	111,3	56,6	12,1

Lokálne mikrobicídne testy

MEI180 cervikálne epitelové bunky boli uložené vnútri jamiek 96 jamkovej mikrotitrovej platne s plochým dnom v hustote 5 x 10 buniek na jamku a inkubované cez noc. Chronicky infikované H9 bunky boli ošetrované s 200 pg-'ml mitomicynom C v úplnom médiu počas jednej hodiny, potom nasledovalo premytie a resuspendovanie 4 x 10⁵ na ml. Koncentrácia mitomycínu C použitá na zabitie infikovaných buniek v intervale 48 hodín ošetrovania musí umožňovať dostatočný čas na transformáciu bunka-bunka vírusu na ME-180 bunky tak, aby vírusový koncový bod kvantifikácie nezahrnoval príspevok z chronicky infikovaných buniek. Antivírusové zlúčeniny a chronicky infikované bunky (2 x 10⁴) boli pridané ku každej jamke obsahujúcej ME 180 bunky a inkubované počas šiestich hodín. Nasledujúca kultivačná monovrstva bola premytá a potom sa pridalo čerstvé médium. Médium bolo odstránené a čerstvé médium sa pridalo po 24 a 80 hodinách po infekcii na odstránenie mŕtvych lymfocytov. Na šiesty deň po infekcii supematantné vzorky boli odstránené a analyzované na obsah vírusu pomocou p24 elisy.

Testovanie CD4 expresivity

Kvantifikácia účinku Viracea na expresiu CD4 bola vykonávaná použitím štandardných prietokových cytometrických techník. Bunky boli spracované s Viracea počas jednej hodiny pri 37 °C v tkanivovom kultivačnom médiu. 10 CEM-SS buniek bolo inkubovaných, ale bez zlúčeniny počas 60 minút pri izbovej teplote. Anti-CD4 monoklonálne protilátky (20 μΐ, 3 pg/ml) (Becton-Dickinson, San Jose, CA) boli pridané a bunky boli inkubované pri 4 °C počas 40 minút. Bunky boli potom premyté dvakrát s PBS, resuspendované v 1 °C paraformaldehyde a analyzované použitím prietokového cytometra Becton-Dickinson FAC-Sort.

Makromolekuláma syntéza

CEM-SS bunky boli kultivované v prítomnosti alebo bez prítomnosti zlúčeniny 24 hodín pri 37 °C v zvlhčenom CO₂ inkubátore. Po 24 hodinách, 1 pCi (metyl-³H)-tymidín, (5-³H)-uridín alebo (3,4,5-³H)-leucín boli pridané ku kultúre a inkubácia pokračovala ďalších 8 hodín. Bunky boli prenesené na filtračný papier so skleneným vláknom a ten bol umiestnený do scintilačného flakónu a vzniknutá rádioaktivita bola kvantifikovaná scintilačným počítačom značky Packar Tri-Carb.

Výsledky HIV testu

Viracea-2 bola určená testovaním mikrotitra anti-HIV na kvantifikovanie schopnosti testovanej zlúčeniny inhibovať HIV replikáciu a HIV vyvolanú bunkovú deštrukciu. Zlúčenina bola určená ako aktívna proti RF kmeňu HIV-1 v CEM-SS bunkách. Viracea-2 prejavuje IC₂₅ pri 1 : 900 zriedení a nedosahuje 50 % inhibičnú hodnotu. Viracea-2 prejavuje toxicitu (TC₃o) na CEM-SS bunky pri zriedení približne 1 : 20 a 1 : 250. Pozitívna kontrolná zlúčenina, ddC, prejavuje očakávanú úroveň aktivity proti RF vírusu.

SK 285810 Β6

Viracea-2 bola testovaná na aktivitu v ľudských PBMCs infikovaných klinickým HIV izolátom ROJO. Tieto nízko pasážované izoláty sú definované ako liečivo citlivé (AZT, ddC, nevirapin) na syncytium indukovaný vírusový izolát. Viracea-2 inhibuje replikáciu tohto izolátu pri netoxických koncentráciách. Ďalej vyhodnotenie zlúčeniny v PMBCs infikovaných s ROJO bolo vykonávané použitím IL2 stimulácie PBMCs skôr než PHA blastogenézou. Znova neúčinnosť bola určovaná pod koncentráciami, ktoré inhibujú rast PBMCs. AZT prejavuje očakávanú úroveň aktivity v týchto testoch.

Viracea-2 bola hodnotená v ľudských monocyt-makrofágoch infikovaných s nízko pasážovaným klinickým izolátom ADA. V týchto testoch zlúčenina prejavuje vysokú úroveň aktivity. 50 % účinnej koncentrácie Viracea-2 bolo 1 : 10000. Toxicita bola určená na monocyt-makrofágových monovrstvách morfologickou skúškou alebo XTT-tetrazoliovým farbením. AZT prejavuje očakávanú úroveň aktivity v týchto testoch.

Viracea-2 inhibuje pripojenie infekčného vírusu na CD4 expresívne HeLa-CD4-LTR-P-galaktozidázové bunky. Inhibícia viazania vírusu na cieľové bunky bola určená pri zriedení približne 1 : 1000 na 1 : 3200 pri tejto zlúčenine. Zlúčenina nemá antivírusový efekt na fúziu HL2/3 buniek s HeLa-CD4-LTR-p-galaktozidázovými bunkami. V testovaní fúzie, kde bola zlúčenina prítomná počas celého trvania testu, bola pri zlúčenine zaznamená toxicita a vo väzbovom teste, kde bola zlúčenina prítomná iba 2 hodiny, bola tiež zaznamenaná toxicita tejto zlúčeniny. Farbivo Chicago Sky Blue, sulfónované, prejavuje očakávanú hladinu aktivity v každom z týchto testov.

Viracea-2 predchádza prenosu vírusu z chronicky infikovaných lymfocytov na ME 180 cervikálne epitelové bunkové línie pri zriedení približne 1 : 500 (IC₃₀)· Toxicita nebola zaznamenaná v tomto teste na ΜΕ 180 bunkách. V tomto teste bolo liečivo prítomné v priebehu infekcie len 4 hodiny. Dextrán sulfát (pozitívna kontrola, sulfónované polysacharidy) a dextrán (negatívna kontrola) prejavujú očakávanú úroveň aktivity v týchto testoch.

Viracea-2 nemá účinok na expresivitu CD4 na bunkový povrch.

Inhibícia inkorporácie tymidínu (DNA), uridínu (RNA) alebo leucínu (proteín) vo vysoko molekulových makromolekulách bola pozorovaná pri zriedení väčšom než 1 : 320. Inhibícia makromolekulovej syntézy upravuje toxicitu zlúčeniny v CEM-SS bunkách.

Zhrnutie výsledkom HIV' testu

Viracea-2 inhibuje HIV infekciu v bežných T-bunkách s obmedzeným terapeutickým indexom. Viracea-2 inhibuje HIV replikáciu v monocytmakrofágoch. Viracea-2 inhibuje pripojenie vírusu na cieľové bunky, ale nepredchádza fúzii infikovaných a neinfikovaných buniek. Viracea-2 inhibuje prenos vírusu v lokálnom mikrobicídnom testovaní a môže byť použitá na prevenciu sexuálneho prenosu HIV. Viracca-2 nemá žiadny účinok na bunkový povrch CD4 expresie.

Prevencia a liečba

Antimikrobiálne zlúčeniny poskytujú antimikrobicíd a liečivo, ktoré môže (I) predchádzať sexuálnemu prenosu HIV; (2) kontrolovať vírusové zaťaženie HIV a iných vírusov; (3) eradikovať HIV; (4) predĺžiť latentnú periódu autoimunodeficicnčného syndrómu (AIDS) u pacientov, ktorí sú nakazení HIV; (5) znížiť bolesť a utrpenie HIV pacientov; (6) znížiť infekčné šírenie HIV; (7) poskytovať lepšie ošetrenie pacientov s HIV. Medicinálne ošetrenie môže tiež odstrániť fyzické symptómy infekčného vzplanutia HIV, herpes simplex vírus 1 alebo 2 (HSV 1 alebo HSV 2) alebo iných infekčných mikrobiálnych ochorení. Toto môže byť dosiahnuté systematickým aplikovaním opisovanej antimikrobiálnej zlúčeniny (liečiva) injekčné do rekta, rektálneho tkaniva, análu, análneho tkaniva alebo vagíny, vaginálneho tkaniva pacienta infikovaného HIV alebo inými infekčnými mikrobiálnymi ochoreniami 8 až 12-krát za deň, prednostne 10-krát za deň v intervaloch každé dve hodiny počas 10 až 18 dní, prednostne 14 spojitých dní (dva týždne) na dosiahnutie lepších výsledkov. Dávkovanie koncentrácie a množstva antimikrobiálnej zlúčeniny (liečiva) môže byť rôzne v závislosti od ťažkosti a rozsahu ochorenia, ako aj od pohlavia, váhy, rasy a zdravotného stavu pacienta. Infikované plochy sú omyté a vysušené na odstránenie zvyškov na infikovanej ploche predtým, ako je aplikovaná antimikrobiálna zlúčenina (liečivo). Na ošetrenie herpes simplex vírusu 1 alebo 2 jc antimikrobiálna zlúčenina (liečivo) aplikovaná na infikovanú plochu na 19 až 24 hodín. Erupcia pľuzgierov herpesového vírusu je odstránená v 19 až 24 hodinách a herpesové lézie sú následne liečené.

Množstvo rôznych výhod medicinálnej liečby a liečiva (kompozície) podľa vynálezu sú:

1. Vynikajúce ošetrenie a prevencia HIV a iných infekčných ochorení.

2. Výborné výsledky v odstraňovaní bolesti HIV, herpes simplex vírusových infekcií a iných mikrobiálnych infekcií bez toxicity.

3. Odstránenie vzplanutia HIV, herpes simplex vírusových a iných mikrobiálnych ochorení.

4. Chráni životy novorodencov, detí, dospelých a živočíchov.

5. Znižuje svetové ekonomické straty spôsobené HIV, herpes a inými mikrobiálnymi ochoreniami.

6. Odstraňuje rôzne emocionálne a mentálne duševné strádanie pacientov s HIV, herpes.

7. Používa vhodné materiály (ingrediencie).

8. Hospodárny.

9. Bezpečný.

10. Ľahký na použitie.

11. Spoľahlivý.

12. Účinný.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozícia obsahujúca živinu a rastlinu, vyznačujúca sa tým, že živinou je kyselina folová a rastlina zahŕňa rastlinný extrakt z rodu Echinacea a Echinacea zahŕňa Echinacea purpurea.
2. 2. Kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že kompozícia ďalej zahŕňa druhú rastlinu zahŕňajúcu rastlinný extrakt z rodu Commiphora.
3. 3. Kompozícia podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že Commiphora zahŕňa druhy pozostávajúce z Commiphora myrrha, Commiphora molmol alebo Commiphora erythraea.
4. 4. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 2 alebo 3, vyznačujúca sa tým, žc Commiphora zahŕňa Commiphora myrrha.
5. 5. Kompozícia podľa niektorého z nárokov 3 alebo 4, vyznačujúca sa tým, že pomer Commiphora myrrha ku Echinacea purpurea je v rozmedzí od 1 : 2 do 1 : 4.
6. 6. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 5, vyznačujúca sa tým, že obsahuje antimikrobiálne izoláty vybrané zo skupiny pozostávajúcej zo sek

   SK 285810 Β6 viterpénov, kyseliny octovej, alfa-amyrónu, arabinózy, alfa-bisabolénu, gama-bisabolénu, kadinénu, kampesterolu, cholesterolu, cinamaldehydu, komiferinu, alfa-komiforovej kyseliny, beta-komiforovej kyseliny, gamakomiforovej kyseliny, komiforínovej kyseliny, m-kiezolu, kurník alkoholu, kumínaldehydu, dipenténu, elemolu, 3-epi-alfa-amyrínu, eugcnolu, furanodiénu, furanodienónu, galaktózy, gumy, heerabolénu, alfa-heerabomyrholu, beta-heerabomyrholu, heeraborezénu, limonénu, 4-0-metyl-glukurónovej kyseliny, n-nonacezánu, beta-sitosterolu, xylózy, myrhovej živice, kurzenónu, dihydrofuanodién-6-ónu, 2-metoxyfurándiénu, lynderstyrénu, echinacénu, echinacénu B, echinaceínu, echinakozidu, pesteru kyseliny kávovej, echinolónu, enzýmov, glukurónovej kyseliny, inulínu, inuloidu, pentadekadiénu, polyacetylénových zlúčenín, polysacharidov, arabinogalaktánu, ramnózy, tanínov, PS I, t. j. 4-0-metylglukoronoarabinoxylánu s Mr 35 kD, PS II, t. j. kyseliny ramnoarbinogalaktánovej s Mt 450 kD, cynarinu, l,5-di-0-kávoylchĺnovej kyseliny, chikorovej kyseliny, 2,3-di-kávoyltartarovej kyseliny, bomeolu, bomyl acetátu, pentadeka-8(z)én-zónu; germakrénu D, karyofylénu, karyofylén epoxidu, antokyanínu, pyrolizidín alkaloidu, lipofilného amidu, izobutylamidu, polyacetylénu, antokyanínu, 3-0-B-D-glukopyranozidu, 3-0-(6-0-mabonyl)-B-D-glukopyranozidu, tusilagínu, izotusilagínu, izomérového dodekaizobutylamidu, tetraénovej kyseliny, alkylamidov, apigenínu, arabinogalaktánu, kyseliny askorbovej, kyseliny behénovej-kyseliny etylovej, betaínu, bomeolu, bomyl acctátu, kyseliny kávovej, 2-0-kávoyl-3-(5-alfa-karboxybeta)-3,4-dihydroxyfenylu, 2-0-kávoyl-3-0-kumaroyltartarovej kyseliny, 6-0-kávoylechinakozidu, 2-0-kávoyl-3-0-feruloyltartarovej kyseliny, 2-O-kávoyltartarovej kyseliny, betakaroténu, karofylénu, karofylén epoxidu, chlorogénovej kyseliny, cichorovej kyseliny, metylesteru cichorovej kyseliny, kyanadín-3-0-(beta-d-glykopyranozidu), kynadín-3-(6-0-malonyl-beta-d-glykopyranozidu), kynarinu, izobutylamidu deka-(2e,4e,6e)-triénovej kyseliny, des-ramnozylverbaskozidu, 3,5-dikávoylchinovej kyseliny, 4-5-0-dikávoylchínovej kyseliny, 2,3-0-diferuloltartarovej kyseliny, izobutylamidu dodeka-(2e,4e)-diénovej kyseliny, dodeka-2,4-dién-l-yl izovalerátu, izobutylamidu dodeka-(2e,6z,8e,10e)-tetraénovej kyseliny, beta-famezénu, 2-0-feruloytartarovej kyseliny, germakrénu, heptadeka-(8z,l lz)-dién-2-ónu, heteroxylánu, humulén 8 až 12, (e)-I0-hydroxy-4,10-dimetyl-4,ll-dodekadién-2-ónu, 13-hydroxyoktadeka-(9z,l le,15z)triénovej kyseliny, izochlorogénovej kyseliny, izoramnetín-3-rutinozidu, izotusilagínu, kaempferolu, kaempferol-3-glukozidu, kaempferol-3-nutinozidu, limonénu, luteolínu, luteolín-7-glukozidu, 2-metyltetradeka-5,12-diénu, 2-metyltetradeka-6,12-diencénu, metyl-p-hydroxycinamátu, mareínu, niacínu, kyseliny palmitovej, pentadeka-(8z, 11 z)-dién-2-ónu, pentadeka-(8z,13z)-dién-ll-lyn-2-ónu, pentadeka-8-én-2-ónu, pentadeka-(8z)-én-2-ónu, pentadeka-(8z)-én-ll,13-dién-2-ónu, 1-pentadecénu, penta-(l,8z)-diénu, fosforu, alfa-pinénu, beta-pinénu, polyacetylénov, pontika epoxidu, chercetagetín-7-glukozidu, chercetínu, chercetín-3-galaktozidu, chercetín-3-glukozidu, chcrcetín-3-robinozidu, chercetín, chercetín-3-xylozidu, chercetín-3-xylozylgalaktozidu, ramnoarabinogalaktánu, riboflavinu, rutinu, rutozidu, beta-sitosterolu, sitosterol-3-beta-o-glukozidu, stigmasterolu, kyseliny tartarovej, tetradeka-(8z)-én-i l,13-dién-2-ónu, tiamínu, n-triakontanolu, trideka-l-én-3,5,7,9,10-pentaínu, tusilagínu, vanilínu, verbaskozidu a karofylénov.
7. 7. Kompozícia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že antimikrobiálne izoláty zahŕňajú myrhovú živicu.
8. 8. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že suchá hmotnosť kompozície obsahuje od 0,01 % do 12 % kyseliny folovej a od 2 % do 90 % Echinacea purpurea a Commiphora myrrha.
9. 9. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje riedidlo a surfaktant.
10. 10. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov na použitie ako liečivo.
11. 11. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 9 na výrobu liečiva na liečenie ochorenia spôsobeného vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV), vírusom herpes simplex 1, vírusom herpes simplex 2, vírusom varicela zoster (pásový opar), cytomegalovírusom, Epstein Barrovým vírusom, papilloma vírusom, vírusom chrípky, vírusom parachrípky, adenovírusom, arbovírusom, arenavírusom, pikomavírusom, koronavírusom, syncyntial vírusom, stafylokokom, streptokokom, mykobaktériou, anaeróbnymi bacilmi, bakteriálnej eneefalitídy, bakteriálnej meningitídy, vírusovej eneefalitídy alebo vírusovej meningitídy.