PL196036B1 - Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu chorób lub zapobieganiu ich przekazywania drogą płciową, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu przekazywania drogąpłciową wirusa nabytego niedoboru odporności immunologicznej lub innych chorób zakaźnych oraz zastosowanie tych kompozycji - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu chorób lub zapobieganiu ich przekazywania dro- ga plciowa, znamienna tym, ze zawiera rosline z gatunku Echinacea purpurea, rosline wybrana z grupy obejmu- jacej Commiphora myrrha, Commiphora molmol i Commiphora Erythraea oraz dodatek w postaci kwasu foliowego. 3. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu przekazywania droga plciowa wirusa nabytego niedoboru odpornosci lub innych chorób zakaznych, znamienna tym, ze zawierajaca wagowo: od okolo 2% do okolo 90% stezonych fitochemikaliów z Commiphora myrrha, Echinacea purpurea i Echinacea augustifolia; od okolo 0,005% do okolo 0,8% powierzchniowo czynnej czwartorzedowej soli amoniowej bedacej chlorkiem benzalkonium jalowa wode bedaca rozcienczalnikiem i nosnikiem dla wspomnianych stezonych fitochemikaliów, a ogólna proporcja jalowej wody do wspomnianych stezonych fitochemikaliów i powierzchniowo czynnych czwartorzedowych soli amoniowych miesci sie w zakresie od okolo 2:1 do okolo 100:1. 6. Zastosowanie kompozycji okreslonej w zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku do leczenia chorób wybranych z grupy obejmujacej: choroby wywolywane przez wirus nabytego niedoboru odpornosci (HIV), wirus opryszczki typu 1, opryszczki typ 2, wirus ospy wietrznej (herpes zoster), wirus cytomegalii, wirus Epsteina-Barra, wirus brodawcza- ka, wirusowa grype, wirusowa grype rzekoma, choroby wywolywane przez adenowirus, wirus zapalenia mózgu, wirus zapalenia opon, arbowirus, arenawirus, pikornawirusy, koronawirus, wirusy syncytialne, zapalenie tkanki lacznej, choroby wywolywane przez gronkowce, paciorkowce, mykobakterie, bakteryjne zapalenie mózgu, bakte- ryjne zapalenie opon lub choroby wywolywane przez beztlenowe laseczki. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotowy wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej do zastosowania w leczeniu chorób lub w zapobieganiu ich przekazywania drogą płciową, kompozycji farmaceutycznej do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu przekazywania drogą płciową wirusa nabytego niedoboru odporności immunologicznej lub innych chorób zakaźnych oraz zastosowanie tych kompozycji do leczenia wybranych chorób wirusowych i bakteryjnych.

Ostatnie doniesienia informowały, że obecnie na całym świecie jest około 22 milionów ludzi zarażonych ludzkim wirusem nabytego niedoboru odporności (HIV). Największa ilość nowych przypadków HIV pochodzi z Afryki i wysp karaibskich. Typowy przebieg infekcji HIV dzieli się na różne stadia: 1) przekazanie wirusa; 2) objawy ostrego zakażenia retrowirusem; 3) serokonwersja; 4) kliniczny okres utajenia z lub bez uporczywego, ogólnego powiększenia węzłów chłonnych (PGL); 5) wczesne objawy zarażenia HIV wcześniej znane jako zespół stowarzyszony z AIDS lub ARC a współcześnie określany, zgodnie z klasyfikacją CDC z 1993 roku, jako „syndrom B”; 6) zespół niedoboru odporności (AIDS) (wskaźnik objawów AIDS zgodny z kryteriami CDC z 1987 roku zrewidowany o kryteria CDC z 1993 roku obejmujące ilość komórek CD4 <200/mm³); i 7) zaawansowaną infekcję HIV charakteryzowaną przez ilość komórek CD4 <50/mm³. CD4 są limfocytami atakowanymi przez HIV. W roku 1993 CDC zmieniło definicję AIDS, tak by objąć wszystkich pacjentów z ilością CD4 <200/mm³; definicja ta obejmuje pacjentów w stadiach 4-7 z uwagi na występujące objawy.

Początkowemu ostremu zespołowi infekcji retrowirusem towarzyszy gwałtowny spadek liczby komórek CD4, wysoka wiremia osocza krwi i wysokie stężenie HIV RNA w surowicy. Kliniczna poprawa i ograniczenie wysokiego poziomu wiremii z HIV RNA w osoczu krwi uzyskuje się przy rozwoju cytotoksycznej odpowiedzi limfocytów T (CPL). W ciągu kilku lat stopniowo zmniejsza się liczba komórek CD4, a następnie w ciągu 1,5-2 lat poprzedzających zdiagnozowanie AIDS spadek ten ulega przyśpieszeniu. Stężenie HIV RNA w surowicy jest względnie stałe, aż do późnego stadium HIV gdy liczba CD4 wynosi <200/mm³ a objawy kliniczne scharakteryzowane przez infekcje, wybrane nowotwory wyniszczenie i komplikacje neurologiczne. Ogólnie, około 10% pacjentów rozwija stan diagnozowany jako AIDS zanim liczba komórek CD4 spadnie do 200/mm³. Średni czas wystąpienia komplikacji określanych jako AIDS, po osiągnięciu liczby komórek CD4 200/mm³, wynosi 12-18 miesięcy. Przy braku leczenia skierowanego przeciw HIV lub profilaktyki PCP średni czas od przeniesienia wirusa do diagnozy określającej AIDS wynosi około 10 lat, a czas przeżycia po wystąpieniu komplikacji określających AIDS wynosił uprzednio około jeden rok.

U przeciętnego pacjenta pełna sekwencja zdarzeń, przy braku leczenia skierowanego przeciw HIV, trwa w przybliżeniu 10 lat począwszy od serokonwersji po śmierć. Dla HIV średni czas od serokonwersji do AIDS wynosi 7 lat dla biorców transfuzji, 10 lat dla osób chorych na hemofilię, 10 lat dla osób używających narkotyki i 8-12 lat dla homoseksualistów. Szybkość rozwoju choroby wydaje się być podobny dla różnych płci, ras i osób z różnych kategorii ryzyka, jeśli brać pod uwagę jakość opieki. Dla pacjentów mających 16-24 lat w momencie serokonwersji średni czas wynosił 15 lat, dla tych, którzy w momencie serokonwersji mieli 35 lat wynosi on 6 lat.

Infekcja HIV może nastąpić drogą płciową, przez wstrzyknięcie narkotyków zanieczyszczonych zakażoną krwią, przez podanie narkotyków zanieczyszczoną igłą lub zakażenie okołoporodowe. Objawowa pierwotna infekcja HIV opisywana również jako ostry zespół retrowirusowy, opisywana była u osób należących do poprzednio podanych kategorii ryzyka, z częstością 50-90%. Zespół ten odnotowany był również w przypadku siedmiu z ośmiu pracowników opieki zdrowotnej, u których przeniesienie HIV nastąpiło w związku z wykonywanym zawodem. Czas od ekspozycji do ujawnienia się objawów wynosi zazwyczaj 2-4 tygodni, lecz inkubacja może trwać aż do sześciu tygodni. Typowymi objawami są: gorączka, adenopatia, zapalenie gardła, wysypkę obejmującą rumieniowe grudkowoplamkowe zmiany skóry z 5-10 mm uszkodzeniami na twarzy i tułowiu, czasem kończyny dolne włącznie z dłońmi i podeszwami lub owrzodzenie śluzówkowo-skórne na ustach, przełyku lub genitaliach lub bóle stawów, biegunka, ból głowy, powiększenie wątroby i śledziony, pleśniawka, mdłości i wymioty. Objawy neurologiczne mogą obejmować: zapalenie opon i mózgu, neuropatię obwodową, porażenie twarzy, zespół Guillain-Barre, zapalenie nerwu barkowego, upośledzenie umysłowe i psychozy. Ostrej postaci choroby zazwyczaj towarzyszy wysoka wiremia HIV z antygenem p24, wiremia osocza krwi i wysokie miano HIV w jednojądrowych komórkach krwi obwodowej.

Odpowiedź cytotoksyczna limfocytów T (CTL) występuje jako pierwsza zazwyczaj o kilka tygodni poprzedzając wykrywalną odpowiedź humoralną. Odpowiedź CTL zazwyczaj stowarzyszona jest

PL 196 036 B1 z 3-5 log zmniejszeniem stężenia HIV w krwi obwodowej. Wysoki poziom wiremi w czasie tej ostrej fazy choroby może być związany z wysianiem się wirusa do CNS i tkanki limfatycznej. Tkanka limfatyczna stanowi główny zbiornik HIV i miejsce jego replikacji. Infekcja organów nielimfatycznych przez dużą ilość HIV występuje w późnych stadiach HIV.

Występowanie objawów bardziej niż bezobjawowa serokonwersja jak również przedłużenie choroby na okres dłuższy niż 14 dni wydaje się korelować z gwałtowniejszym rozwojem AIDS. Serokonwersja z HIV pozytywnym odczynem surowicy zazwyczaj ma miejsce w 6-12 tygodni po przeniesieniu wirusa w wyniku transfuzji lub urazu pracownika opieki zdrowotnej w wyniku kontaktu z igłą. Średnio, okres bezobjawowy trwa 63 dni. Odpowiedź CTL występuje wraz z ograniczeniem ilości wirusa we krwi, poprawy stanu zdrowia względem ostrego zespołu retrowirusowego i przywrócenia wysokiej ilości komórek CD4, który zdaniem większości laboratoriów wraca do poziomu normalnego.

Pacjenci z HIV stają się pozbawionymi objawów klinicznych i ogólnie nie wykazują zaburzeń fizycznych z wyjątkiem przewlekłej ogólnej limfopatii (PGL) charakteryzującym się powiększonymi węzłami chłonnymi. Badania węzłów chłonnych ujawniły wysokie stężenie HIV w postaci zewnątrzkomórkowych wirusów wychwyconych na pęcherzykowych komórkach dendrytycznych w obrębie ośrodków rozwoju i jako wewnątrzkomórkowe wirusy, głównie w postaci latentnej. Tkanka limfatyczna stanowi główny zbiornik HIV, pęcherzykowe komórki dendrytyczne filtrują i wychwytują wolne wirusy i zainfekowane komórki CD4, w efekcie względnie niski jest wybuch wirusa w jednojądrowych komórkach z krwi obwodowej. W postępującej postaci choroby, HIV niszczy strukturę przestrzenną węzła limfatycznego.

Badania wirologiczne pacjentów z bezobjawową infekcją HIV ujawniły wysoki poziom replikacji HIV skutkiem czego dziennie wytwarzanych jest około 10⁹ wirionów. Replikacji wirusa towarzyszy rozległa destrukcja i produkcja 10⁹ komórek CD4 dziennie. Wymiana komórek CD4 odpowiada 6-7% wszystkich komórek CD4 tak, że pełna wymiana komórek następuje co 15 dni. AIDS był rozważany jako konsekwencja ciągłej wysokowydajnej replikacji HIV-1 prowadzącej do zależnego od wirusa zachodzącego za pośrednictwem układu immunologicznego zaniku limfocytów CD4.

₃

Zaawansowana infekcja HIV występuje u pacjentów z liczbą komórek CD4 <50/mm³. U pacjentów tych skróceniu ulega oczekiwany okres przeżycia ze średnią przeżywalnością 12-18 miesięcy. Zazwyczaj wszyscy pacjenci umierający w wyniku komplikacji związanych z HIV charakteryzują się taką liczbą komórek CD4.

Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zaakceptowała liczne inhibitory odwrotnej transkryptazy (RT). Odwrotna transkryptaza przepisuje wirusowy RNA na DNA. Inhibitor RT może zaburzyć ten proces. AZT będący inhibitorem RT, który jest sprzedawany przez Glaxo Wellcome pod firmowymi nazwami Retrovir i zydowudyna, został zaakceptowany przez FDA w 1987 roku. Będący inhibitorem RT, ddl sprzedawany przez Bristol-Myers Squibb pod handlowymi nazwami Videx i didanozyna został dopuszczony przez FDA, w roku 1991. Będąca inhibitorem RT ddC sprzedawana przez HoffmanLaRoche pod handlową nazwą HIVID i dideoksycytydyna została dopuszczona przez FDA w roku 1992.

Inhibitor RT, d4T sprzedawany przez Bristol-Myers Squib pod handlową nazwą Zerit i stawudyna został dopuszczony przez FDA w roku 1994. Inhibitor RT, 3TC sprzedawany przez Glaxo Wellcome pod handlową nazwą Epivir i lamiwudyna został w 1995 roku dopuszczony przez FDA. Inhibitor TR, Navirapin sprzedawany przez Boehringer Ingelheim pod handlową nazwą Viramune został dopuszczony przez FDA w roku 1996.

Obecnie Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) dopuściła do leczenia u człowieka infekcji wirusem braku odporności immunologicznej (HIV) trzy inhibitory proteaz. Pierwszy dopuszczony przez FDA czynnik hamujący proteazy jest sakwinawir (saquinavir), sprzedawany przez Hoffman-LaRoche Laboratories pod handlową nazwą Invirase. Ritonawir, kolejny inhibitor proteazy, który jest sprzedawany przez Abbott Laboratories pod handlową nazwą Norvir uzyskał akceptację FDA w marcu 1996 roku, podobnie jak Indinawir sprzedawany przez Merck & Co. pod handlową nazwą Crixivan.

Mechanizm działania inhibitorów proteaz jest całkiem inny niż wcześniej dopuszczonych leków przeciw-HIV, takich jak analogi nukleotydów AZT i 3TC sprzedawane przez Glaxo Wellcome pod handlową nazwą zydowudyna i lamiwudyna czy ddl i d4T sprzedawane przez Bristol-Myers Squibb pod handlową nazwą didanozyna i stawudyna i ddC sprzedawana przez Roche Laboratories pod handlową nazwą dideoksycytydyna. Inhibitory proteaz blokują enzymy, których HIV wymaga do przeprowadzenia pełnego cyklu replikacji i wytworzenia nowych żywotnych wirusów. Bez protez, strukturalne białka wirusa nie mogłyby być utworzone w odpowiedni sposób i powstawałby nieprawidłowy nieinfektywny wirus. Analogi nukleozydów blokują inny enzym, odwrotną transkryptazę. Działanie to może

PL 196 036 B1 zapobiec syntezie na matrycy RNA wirusowego DNA, który następnie może być wbudowywany do DNA komórek człowieka. Obserwowano, że kombinacja jednego lub większej liczby inhibitorów odwrotnej transkryptazy z inhibitorem proteazy czasem nazywana „koktajlem”, rozszerza zakres ataku na replikację HIV do dwóch punktów cyklu replikacji. Testy kliniczne łączące sakwinawir z AZT, ddC lub oboma wykazało większe zmniejszenie liczby cząsteczek HIV we krwi, czasem nazywanych wirusowymi wybuchami, i większy wzrost liczby komórek CD4 (limfocyty T)niż wcześniej obserwowany, gdy stosowano jedynie inhibitory odwrotnej transkryptazy. Czasem koktaile bywają toksyczne i nieskuteczne w przypadku niektórych pacjentów. Jednakże korzyści kliniczne w kategoriach dłuższego przeżycia lub ograniczenia postępu choroby nie został do tej pory w pełni udokumentowany dla kombinacji (koktailu) inhibitorów RT i inhibitorów proteazy. Jednak lekarze zaczęli traktować HIV jako chorobę przewlekłą wymagającą opieki nie zaś jako wyrok śmierci.

Inhibitor protezy - sakwinawir został dopuszczony przez FDA do stosowania w kombinacji z inhibitorami odwrotnej transkryptazy u pacjentów z zaawansowanym AIDS.

Inhibitor proteazy - sakwinawir może być tolerowany przez niektórych pacjentów nie wykazując hematologicznej lub neurologicznej toksyczności w połączeniu z analogami nukleozydowymi. Pewne leki, włącznie z rifampiną, rifabutyną, fenobarbitalem, dilantyną i deksametazonem mogą znacząco zmniejszać poziom inhibitora proteazy - sakwinawiru w osoczu krwi i powinny być unikane przez pacjentów biorących sakwinawir.

Obserwowano oporność wirusową na inhibitor proteazy - sakwinawir, jak również na inne leki anty-HIV.

Inhibitory proteazy ritonawir i indinawir wydają się być bardziej skutecznymi względem HIV niż obecnie stosowana postać sakwinawiru. Inhibitor proteazy ritonawir wymaga zamrożenia. Obecnie inhibitor proteazy - ritonawir jest stosowany w połączeniu z analogami nukleozydowymi (leki takie jak AZT) lub jako pojedynczy lek. W początkowych badaniach 32 pacjentów poddano działaniu ritanowiru z AZT i ddC. Po 20 tygodniach średnia ilość komórek CD4 wzrosła z początkowego poziomu 83 komórek/mm³ do 106 komórek/mm³. Poziom wirusów we krwi spadł prawie 100-krotnie. Ritonawir jest podawany doustnie dwa razy dziennie po 600 mg co wymaga wzięcia każdego dnia dwunastu kapsułek. Lek jest dostępny w 100 mg kapsułkach. Efekty uboczne są całkiem pospolite, obejmują: objawy żołądkowo-jelitowe z nudnościami, wymiotami i biegunką. Inne efekty uboczne obejmują cierpnięcie i mrowienie, szczególnie wokół ust i zapalenie wątroby przyjmujące postać żółtaczki.

Inhibitor proteazy - indinaqir został dopuszczony przez FDA w trybie przyśpieszonym w oparciu o badania, które wykazały, że liczba CD4 wzrosła do ponad 100 komórek/mm³ i prawie 100 krotnie spadł poziom wirusa gdy stosowano AZT z 3TC i indinawirem. Indinawir jest podawany w ilości 800mg doustnie trzy razy dziennie (2 kapsułki 3 razy dziennie). W przeciwieństwie do ritonawiru, indinawir może być podawany na czczo celem zwiększenia jego wchłaniania. Indinawir powoduje mniej jelitowo-żołądkowych efektów ubocznych niż ritonawir i wydaje się być ogólnie lepiej tolerowanym przez niektórych pacjentów. Głównym efektem ubocznym wywoływanym przez inhibitor proteaz - indinawir jest powstawanie kamieni nerkowych. Lek jest częściowo wydalany w moczu i może krystalizować tworząc kamienie, jeśli nie będzie się podawać dostatecznej ilości wody. Inhibitor proteaz - indinawir może również uszkadzać wątrobę powodując wzrost ilości bilirubin we krwi np. barwnika żółciowego powstającego z rozpadających się czerwonych komórek krwi. Inhibitor proteazy - indinawir może również powodować interakcje między lekami.

Analiza oporności na inhibitory proteaz nie została w pełni przeprowadzona. Inhibitory proteaz sakwinawir i ritonawir mogą obecnie kosztować pacjenta miesięcznie około 600 $ amerykańskich. Cena inhibitora proteaz - indinawiru kształtuje się około 30% poniżej tego poziomu. Kombinacja trzech leków, AZT, 3TC oraz inhibitora proteaz ritonawiru mogą miesięcznie kosztować pacjenta ponad 1000$ amerykańskich. Kombinacje (koktaile) inhibitorów RT i inhibitorów proteaz mogą kosztować w ciągu roku do 25 000 $ amerykańskich. Choć inhibitory proteaz mogą być pomocne, to społeczność lekarska i stowarzyszenia do tej pory nie rozwiązały problemu wynikającego z kosztów ponoszonych przez pacjenta na te drogie lekarstwa.

Wirus herpes simplex (HSV) pospolicie określany jako „wirus opryszczki” lub „herpes” jest chorobą infekcyjną, która w skali narodowej osiągnęła poziom kryzysowy szacowany zgodnie z doniesieniami Amerykańskiego Stowarzyszenia Zdrowia Społecznego (American Societal Health Association ASHA) na 70-80% amerykańskiej populacji i zwiększający się rocznie o 500 000 przypadków. Istnieją dwa pospolite rodzaje wirusa opryszczki: wirus herpes simplex typu 1(HSV 1) i wirus herpes simplex typu 2 (HSV 2).

PL 196 036 B1

Herpes wnika do ciała człowieka przez mikroskopijne pęknięcia nabłonka, zazwyczaj w wyniku kontaktu z zarażonym gospodarzem i objawia się wypryskiem złożonym z jednego lub większej liczby pęcherzyków, zazwyczaj zgrupowanych, przy czym czas inkubacji trwa około czterech dni. Zazwyczaj infekcja rozpoczyna się stadium zwiastującym (prodromalnym); przechodzącym w wyprysk pęcherzykowy po którym następuje owrzodzenie; zlewanie się; wchłonięcie i okres latencji. Wybuch choroby może trwać kilka tygodni, a średnio dwa do trzech tygodni. U niektórych osób z upośledzonym systemem odpornościowym, wybuch choroby może utrzymywać się przez miesiąc. Pęcherzyki mogą pojawić się gdziekolwiek na skórze lub błonach śluzowych, zazwyczaj pojawiają się na wargach jako opryszczka, na gruczołach, śluzowce jamy gębowej, spojówce i rogówce, narządach rozrodczych, śluzówce odbytu i tkance przyodbytowej.

Objawy opryszczki obejmują: obrzęki pachwiny, ból, gorączkę, złe samopoczucie, ból głowy, tępe długotrwałe bóle mięśni i obrzmienie gruczołów. Niektóre osoby z nerwem trójdzielnym porażonym przez wirusa opryszczki typowego dla jamy ustnej odczuwają rozdzierający ból twarzy, trudności z przełykaniem, jedzeniem i opuchliznę twarzy. Osoby z porażonym nerwem krzyżowym odczuwają przewlekły ból górnej części nogi, opuchliznę i trudności w chodzeniu.

Infekcja wirusem herpes simplex (HSV) ulega zaostrzeniu, zasiedla zwoje nerwowe, a dalej następuje nawrót wywołany przez nieznany do tej pory czynnikiem. Nawrót infekcji opryszczki może być wywołany prawie wszystkim, włącznie z nadmiernym wystawieniem się na światło słoneczne; niedostatkami pokarmu; stresem, menstruacją, immunosupresją, szczególnym pokarmem, lekami, przeziębieniami itp. Obecnie wirus opryszczki został wyizolowany z tkanki serca.

Infekcje HSV 1 i HSV 2 stanowią bardzo poważne zagrożenie dla zdrowia często powodując: ślepotę; zwiększając ryzyko nowotworów szyi, jałowe zapalenie opon i zapalenie mózgu; śmiertelność około urodzeniową, wiremie i tym podobne. Niszczące efekty tej choroby wykraczają poza zakres medycznej definicji cierpienia człowieka. HSV jest odpowiedzialny za szereg zaburzeń psychologicznych i emocjonalnych jak również poważnych strat ekonomicznych ponoszonych przez naród i świat.

Proponowano szereg sposobów leczenia opryszczki, obejmujących miejscowe podawanie takich substancji jak jodopowidon, idoksyurydyna, trójfluorotymidyna lub acyklowir. Takie sposoby leczenia odnoszą różny pozytywny skutek. Większość dotychczasowych sposobów leczenia było niezadawalające. Acyklowir podawany doustnie, w systematycznym leczeniu HSV jest w pewnym stopniu skuteczny. Jakkolwiek acyklowir jest skuteczny jedynie w zaburzaniu replikacji wirusa. Nie jest skuteczny, zarówno stosowany systematycznie jak i miejscowo, w leczeniu wybuchów choroby. Donoszono o szczepach opornych na acyklowir. Osoby z nabytym zespołem utraty oporności immunologicznej (AIDS) mają poważnie zaburzoną odporność i podlegają szczególnie wyniszczającym atakom HSV. Dodatkowo, osoby z AIDS mogą przenosić szczepy HSV oporne na acyklowir, co może czynić acyklowir, w przypadku tych osób, nieskutecznym.

Tak więc, pożądanym jest opracowanie bezpiecznego i skutecznego sposobu leczenia i zapobiegania bardzo poważnym problemom związanym z HIV i innymi chorobami zakaźnymi.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu chorób lub zapobieganiu ich przekazywania drogą płciową, zawierająca roślinę z gatunku Echinacea purpurea, roślinę wybraną z grupy obejmującej Commiphora myrrha, Commiphora molmol i Commiphora erythraea oraz dodatek w postaci kwasu foliowego.

Korzystnie, rośliną jest Commiphora myrrha.

Przedmiotem wynalazku jest także, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu przekazywania drogą płciową wirusa nabytego niedoboru odporności lub innych chorób zakaźnych.

Istotą wynalazku jest to, że kompozycja zawiera wagowo:

od około 2% do około 90% stężonych fitochemikaliów z Commiphora myrrha, Echinacea purpureai Echinacea augustifolia;

od około 0,005% do około 0,8% powierzchniowo czynnej czwartorzędowej soli amonowej będącej chlorkiem benzalkonium jałową wodę będącą rozcieńczalnikiem i nośnikiem dla wspomnianych stężonych fitochemikaliów, a ogólna proporcja jałowej wody do wspomnianych stężonych fitochemikaliów i powierzchniowo czynnych czwartorzędowych soli amonowych mieści się w zakresie od około 2:1 do około 100:1.

Korzystnie, kompozycja zawiera od około 40% do około 60% wagowych Echinacea purpurea, Echinacea augustifolia i Commiphora myrrha,

PL 196 036 B1 od około 20% do około 60% wag. jałowej wody, od około 0,02% do około 0,30% wag. powierzchniowo czynnej soli amoniowej będącej chlorkiem benzalkonium, oraz dodatkowo od około 2% do około 12% wag. kwasu foliowego,

Korzystnie, proporcje Commiphora myrrha do Echinacea purpurea i Echinacea augustifolia mieszczą się w granicach od około 1:2 do około 1:4.

Przedmiotem wynalazku jest także, zastosowanie kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej: choroby wywoływane przez wirus nabytego niedoboru odporności (HIV), wirus opryszczki typu 1, opryszczki typ 2, wirus ospy wietrznej (herpes zoster), wirus cytomegalii, wirus Epstein-Barra, wirus brodawczaka, wirusową grypę, wirusową grypę rzekomą, choroby wywoływane przez adenowirus, wirus zapalenia mózgu, wirus zapalenia opon, arbowirus, arenawirus, pikornawirusy, koronawirus, wirusy syncytialne, zapalenie tkanki łącznej, choroby wywoływane przez gronkowce, paciorkowce, mykobakterie, bakteryjne zapalenie mózgu, bakteryjne zapalenie opon lub choroby wywoływane przez beztlenowe laseczki.

Przedmiotowy wynalazek umożliwia udoskonalony sposób leczenia, zapewniając lek, który gdy podawane systematycznie hamuje przyłączanie się wirusa ludzkiego nabytego niedoboru odporności (HIV) do komórek docelowych i zapobiega rozprzestrzenianiu się HIV. Korzystnie, zastosowanie nowego leku może być pomocne dla zapobiegania przenoszenia wirusa HIV i innych wirusów drogą płciową. Znaczącym jest, że udoskonalone leczenie i lekarstwo są bezpieczne tańsze i skuteczne.

Udoskonalony lek, określany również jako Viracea 2 HIV-4, obejmuje nową kompozycję leczniczą, preparat, składnik przeciwko drobnoustrojom i roztwór. Nowy lek przeciwdrobnoustrojowy jest skuteczny w leczeniu w pierwszej kolejności ogólnoustrojowego HIV, i może być użyteczne w leczeniu innych infekcji wywołanych przez drobnoustroje, obejmujących, ale nie ograniczonych do: wirusa ospy wietrznej i wirusa cytomegalii. W pewnych sytuacjach pożądanym może być miejscowe zastosowanie nowego leku.

Choć nowy lek i skierowane przeciw drobnoustrojom składniki są szczególnie użyteczne dla znaczącego zahamowania infekcji wywołanej ludzkim wirusem zespołu nabytego niedoboru odporności (HIV) może być użyteczny w leczeniu innych chorób wywołanych przez drobnoustroje takich jak: wirus Epsteina-Barra, wirus brodawczaka, gronkowce, paciorkowce, mykobakterie, grypa, grypa rzekoma, adenowirusy, zapalenie mózgu, zapalenie opon, arbowirus, arenawirus, pałeczki beztlenowców, pikornawirus, koronawirus i wirusy syncytialne jak również wirus opryszczki, ospy wietrznej i wirusa cytomegalii.

Choć lek jest szczególnie użyteczny dla hamowania HIV i innych chorób infekcyjnych u osób (ludzi) (homo sapiens), mogą być one użyteczne dla celów weterynaryjnych dla leczenia infekcji bakteryjnych i chorób wirusowych zwierząt takich jak: psy, koty, ptaki, konie, krowy, owce, świnie (lochy i knury) i innych zwierząt hodowlanych jak również gryzoni i innych zwierząt, które można zobaczyć wzoo.

Korzystnie, zastosowanie udoskonalonego leku według niniejszego wynalazku daje zaskakująco dobre wyniki. Ten łatwy w użyciu roztwór o działaniu przeciwdrobnoustrojowym może, przy podaniu pozajelitowym, zapewniać natychmiastowe wchłanianie. W zależności od sposobu podania może wystąpić efekt nieznacznego mrowienia. W ciągu minut po podaniu oczekiwać można pojawienia się w ustach lekkiego smaku leku. Początkowo, w badaniach in vitro i nowy lek ujawnił zaskakująco bardzo silny efekt hamowania wirusa HIV. Co pożądane, nowe lekarstwo sporządzane jest z gotowych dostępnych, w sklepach odczynników chemicznych lub produktów i umożliwia bezpieczny, wygodny i ekonomiczny sposób leczenia.

Co pożądane, nowy lek (kompozycja medyczna) obejmuje inhibitory drobnoustrojów, które hamują, ograniczają lub zatrzymują infekcje spowodowane przez drobnoustroje chorobotwórcze. Inhibitory drobnoustrojów obejmują wyciągi, ekstrakty z roślin lub fitochemikalia wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe, pochodzące z części jednej lub większej ilości specjalnych wymienionych niżej roślin. Inhibitory drobnoustrojów mogą obejmować inhibitory wirusów dla hamowania chorób wirusowych takich jak: HIV, wirus herpes simplex typ 1 (HSV 1), wirus herpes simplex typ 2 (HSV 2), wirus ospy wietrznej (herpes zoster), wirus cytomegalii, wirus Epsteina-Barra, wirus brodawczaka, wirus grypy, wirus grypy rzekomej, adenowirus, wirus wirusowego zapalenia mózgu, wirus wirusowego zapalenia opon, arbowirus, arenawirus, pikornawirus, koronawirus i wirusy syncytialne. Inhibitory drobnoustrojów mogą również zawierać inhibitory bakterii, hamujące choroby bakteryjne takie jak: gronkowce, paciorkowce, mykobakterie, bakteryjne zapalenie mózgu, bakteryjne zapalenie opon, i pałeczki beztlenowców. W pewnych warunkach inhibitory drobnoustrojów mogą zawierać inhibitory grzybów.

PL 196 036 B1

Lepsze wyniki mogą być uzyskane jeśli w lekarstwie zastosuje się rośliny z rodzaju Echinacea i Commophora (nazywane również Commiphora) lub inne rośliny w postaci surowej, nie poddanej obróbce i niepocięte. Dla jeszcze lepszych wyników z leku mogą być wyłączone: arabinoza, betaina, celuloza, miedź, fruktoza, kwasy tłuszczowe, glukoza, żelazo, potas, białko, żywica, sacharoza i ksyloza.

Dla pewnych chorób zakaźnych inhibitory drobnoustrojów mogą być podawane i utrzymywane na zakażonej drobnoustrojami powierzchni (obszarze lub powierzchnia, aż do zaniku zewnętrznych objawów i fizycznych znamion występujących lub rozwiniętych na zarażonej powierzchni. Lek może być podany przy pomocy zastrzyku, podjęzykowo do śluzówki, w rozpylaczu, przez wtarcie płynu, napylenie, pędzlowanie, nanoszenie gąbką szczotkowanie, nalewając, nanosząc, nakrywając lub pokrywając grubą warstwą leku zarażone drobnoustrojami powierzchnie takie jak: węzły limfatyczne, układ limfatyczny, komórki T, śluzówkę jamy ustnej, śluzówkę nosa, tkankę pochwy, tkankę warg sromowych, tkankę odbytnicy, tkankę odbytu, tkankę okołoodbytową, wargi, rogówkę, tkankę oka, spojówka i powieki.

Korzystnie, jeśli inhibitor drobnoustrojów lub składnik zwalczający drobnoustroje jest podawany ogólnoustrojowo, strzykawką doodbytowo lub dopochwowo celem leczenia lub zapobiegania przekazywania HIV drogą płciową. Inhibitor drobnoustrojów lub składnik o działaniu przeciwdrobnoustrojowym może być podawany w wyżej podany sposób 4-20 razy dziennie przez 4-18 kolejnych dni dla znaczącego obniżenia poziomu wirusa u pacjentów zarażonych HIV np. aby w ciele zmniejszyć ilość HIV i wirusa AIDS.

Korzystnie, jeśli udoskonalony lek, kompozycja medyczna lub składnik o działaniu względem drobnoustrojów jest stężonym odczynnikiem litochemicznym, który połączono i podawano równocześnie z substancją powierzchniowo czynną, składnikiem odżywczym, nośnikiem, rozpuszczalnikiem lub rozcieńczalnikiem dla uzyskania roztworu leczniczego o działaniu drobnoustrojobójczym. Składnik odżywczy służy jako katalizator, aktywator, inicjator fitochemiczny, dodatek odżywczy i nośnik pomocniczy. Składnik odżywczy może zawierać jeden lub więcej następujących składników: witaminę rozpuszczalną w wodzie, witaminę rozpuszczalną w tłuszczach, witaminę A, witaminę B kompleks, witaminę D, witaminę E, witaminę K, witaminę B1, witaminę B2, witaminę B5, witaminę B6, witaminę B12, witaminę B15 i korzystnie foliacyn lub kwas foliowy.

Interesujący roztwór o działaniu przeciwdrobnoustrojowym może zawierać powierzchniowo czynny detergent o działaniu przeciwdrobnoustrojowym i wyciągi roślinne. Korzystnie, substancja powierzchniowo czynna stanowi kationową substancję powierzchniowo czynną, która zawiera jeden lub dowolną ilość czwartorzędowych chlorków amoniowych zawierających 6-18 atomów węgla, takich jak chlorek alkilobenzylodimetyloamoniowy, mieszaniny chlorku alkilobenzylodimetyloamoniowego, chlorku alkilodimetylo/etylobenzyloamoniowego, chlorku n-alkilodimetylobenzyloamoniowego, chlorku diizobutylofenoksyetoksyetylodimetylobenzyloamoniowego, chlorku N-(C12C14C16)dimetylobenzyloamoniowego, chlorku benzalkonium, chlorku oktylodecylodimetyloamoniowego, chlorku didecylodimetyloamoniowego, chlorku dioktylodimetyloamoniowego, chlorku dialkilodimetyloamoniowego, chlorku dialkilometylobenzyloamoniowego, chlorku oktylodecylodimetyloamoniowego, chlorku dimetylobenzyloamoniowego, chlorku laurylodimetylobenzyloamoniowego, o-benzylo-p-chlorofenolu, chlorku diderylodimetyloamoniowego, chlorku doktylodimetyloamoniowego, chlorku alkilo(C14C12C16)dimetylobenzyloamoniowego i korzystnie zawiera alkilobenzylodimetyloamoniowego, najkorzystniej chlorku benzalkonium. Zakres aktywności kationowej substancji powierzchniowo czynnej może wynosić od 5% do 90%, lecz najlepiej 8% do 20%. Czwartorzędowe sole amoniowe są komercyjnie dostępne w postaci gotowej do użycia. Z pewnych względów może być użyteczne użycie innych substancji powierzchniowo czynnych, takich jak, lecz nie tylko takich jak: DMSO, powierzchniowo czynne kwasy glikolowe, powierzchniowo czynne enzymy, powierzchniowo czynne amfolity, powierzchniowo czynne jonity obojnacze i nie jonowe substancje powierzchniowo czynne. Substancje powierzchniowo czynne mogą zawierać detergenty, czynniki zwilżające, emulgatory, odpieniacze i/lub uzupełnienia obniżające napięcie powierzchniowe.

Nośniki są użyteczne do mieszania składników, utrzymywania składników w roztworze i zapewnienia łatwego sposobu podawania na chorą powierzchnię bądź to przez rozpylacz, nakraplacz lub aplikator. Choć dla osiągnięcia najlepszych wyników jako nośnik i rozpuszczalnik preferowany jest roztwór wodny, korzystnie jałowy roztwór wodny, to w pewnych sytuacjach pożądanym może być inna ciecz lub nośnik stały taki jak: gliceryna, olej mineralny, krzemionka, olej z nasion bawełny, olej kokosowy, olej roślinny, olej z nasion, olej rybi lub olej zwierzęcy, alkohol, talk, mąka kukurydziana, wosk pszczeli, wosk carnauba, beta karoten, olej czosnkowy, olej kamforowy, rozpuszczalne witaminy, rozpuszczalne minerały, olej rzepakowy, oleje orzechowe, oliwa z oliwek, liposomy, kwas askorbinowy,

PL 196 036 B1 olej pierwiosnkowy, preparat z kory sosny morskiej (pycnogenol), olej z pestek winogron, lanolina, Ethocyn, kolagen, aloes, pyłek pszczeli, mleczko pszczele, siarczan chondroityny A, glony, EDTA, kwasy tłuszczowe, zioła, lecytyna, bioflawinoidy, oleje zbożowe lub puder, glony, herbaty, octy, bakterie Acidophilus, sole komórkowe, kwas askorbinowy, hydra 5, aminokwasy gruczołowe, psyllium, pochodne roślinne lub inne jałowe nośniki.

Ekstrakty roślinne, izolaty wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojom lub fitochemikalia zawarte w nowym leku mogą obejmować mirrę, półtoraterpeny, kurzerenon, dihydro fuanodien-6-on, 2-metoksylofuranodien, kwas octowy, alfa-amyrinę, arabinozę, alfa-bisabolen, gamma-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, aldehyd cynamonowy, kommiferynę, kwas alfa-kommiforowy, kwas beta-komiforowy, kwas gamma-komiforowy, kwas komiforynowy, m-krezol, alkohol kuminowy, aldehyd kuminowy, dipenten, elemol, 3-epi-alfa-amyrinę, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktozę, żywicę, heerabolen, alfa-herabormirol, beta-herabormirol, heraboresen, limonen, kwas 4-0-metylo-glukuronowy, n-nonacesan, beta-sitosterol, ksylozę, kariofyleny, lindestren, betainę, echinacen, echinacynę B, echinakozyd, echinolon, enzymy, fruktozę, kwasy tłuszczowe, galaktozę, glukozę, kwas glukuronowy, inulinę, inuloid, pentadekadien, związki poliacetylenowe, polisacharydy takie jak arabinogalaktan, białka, żywicę, ramnozę, sacharozę, garbniki, witaminy A, C i E, alkiloamidy, apigeninę, kwas behenoetylowy, betainę, borneol, octan bornylu, kwas kofeinowy, 2-0-kawolilo-3-(5-alfakarboksybeta)-3,4-dihydroksyfenyl, kwas 2-0-kawolilo-3-0 kumarowinowy, 6-0-kawoliloechinakozyd, kwas 2-0-kawolilo-3-0-ferulylowinowy, kwas 2-0-kawololowinowy, beta karoten, kariofylen, epoksykariofylen, kwas chlorogenowy, kwas hikorowy, ester metylowy kwasu hikorowego, cyjanidyno-3-0-(beta-d-glikopiranozyd), cyjanidyno-3-(6-0-malonylobeta-d-glikopiranozyd), cynarin, amid izobutylowy kwasu deka-(2e,4e,6e)-trienowego, des-ramnosylwerbaskozyd (des-rhamnosylverbascoside), kwas 3,5-dikawolilochinowy, kwas 4-5-0-dikawolilochinowy, kwas 2, 3-0-dikawolilowinowy, amid izobutylowy kwasu dodeka-(2e,4e)-dienowego, dodeka-2,4-dien-1-ylo-izowalerianian, amid izobutylowy kwasu dodeka(2e,6z,8e,10e)-tetraenolowego,, beta farnezen, kwas 2-0-ferulowinowy, germakren, heptadeka-(8z,11z)-dien-2-one, heteroksylan, humulen 8-12, (e)-10-hydroksy-4,10-dimetylo-4,11-dodekadien-2-one, kwas 13-hydroksyoktadeka(9z,11e,15z)-trienowy, inulinę, kwas izochlorogenowy, izoramnetyno-3-rutynozyd, izotusilaginę, kempferol, kempferolo-3-glukozyd, kempferolo-3-nutinozyd, limonen, luteolinę, luteolino-7-glukozyd, 2-metylotetradeka-5,12-dien, 2-metylotetradeka-6,12-dien, metylo-p-hydroksycynamonian, marcinę, niacynę, kwas palmitynowy, pentadeka-(8z,11z)-dien-2-on, pentadeka-(8z,13z)-dien-11-lyn-2-on, pentadeka-8-en-2-on, pentadeka-(8z)-en-2-on, pentadeka-(8z)-en-11,13 dien-2-on, 1-pentadekan, pentadeka-(1,8z)-dien, alfa pinen, beta pinen, poliacetyleny, epoksyd pontyjski, kwarcetagetyn-7-glukozyd, kwarcetynę, kwarcetyno-3-galaktozyd, kwarcetyno-3-glukozyd, kwarcetyno-3-robinozyd, kwarcetyno-3-ksylozyd, kwarcetyno-3-ksylozylogalaktozyd, ramnoarabinogalaktan, ryboflawinę, rutynę, rutozyd, beta-sitosterol, sitosterolo-3-beta-o-glukozyd, stigmasterol, kwas winowy, tertadeka-(8z)-n-11,13-dien-2-on, tiaminę, n-triakontanol, trideka-1-n-3,5,7,9,10-pentainę, tusilaginę, wanilinę, werbaskozyd. Dla lepszych wyników fitochemiczne koncentraty zawierające powyższe fitochemikalia pozbawiono arabinozy, betainy, celulozy, fruktozy, kwasów tłuszczowych, galaktozy, glukozy, sacharozy i ksylozy.

Wyciągi roślinne, izolaty o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, fitochemikalia mogą być rozdzielone, wyekstrahowane i wyizolowane z fragmentów roślin takich jak biedrzeniec anyż (Pimpinella anisum), drzewo balsamowe (Myroxylon), mącznica lekarska (Arctostaphylos), kminek zwyczajny (Carum), papryka roczna (Capsicum), goździkowiec (Eugenia Myrtaceae), kolendra (Coriandrum), oman (Inula), czosnek (Allium), goryczka (Gentiana), jałowiec (Juniperus), nagietek (Calendula), oregano (Origanum), mięta (Mentha labiate), balsamowiec (Commiphora) babka (Plantago), rozmaryn (Rosmarinus), ruta (Ruta), roślin z rodziny jasnotowatych (Lamiaceae), melisa (Melisa), baptysja (Baptisia), bylica (Artemisia), szałwia (Sage), gwajula (Parthenium integrifolium), eukaliptus (Eucalyptus), roślin z rodziny astrowatych (Asteraceae) i korzystnie: (1) z rodzaju Echinacea z rodziny Asteraceae konkretnie, Echinacea purpurea, Echinacea angustofolium (Echinacea pallidae), Echinacea vegetalis, Echinacea atribactilus i Echinacea pallidum i ich kultywary, jak również z rodzaju Commophora, konkretnie Commophora myrrha, Commophora molmol, Commophora erythraea i ich kultywary. Dla najlepszych wyników fitochemikalia i izolaty o działaniu przeciwdrobnoustrojowym ekstrahowano z Echinacea purpurea, Echinacea angustifolium i Commophora myrrha.

Rezultaty wynikające z wynalazku są bardzo atrakcyjne, nieoczekiwane, jak również zaskakująco dobre i spójne. Badania wykazały, że roztwór o działaniu przeciwko drobnoustrojom (lek) jest wyjątkowo użyteczne dla: kontrolowania infekcji HIV, hamowania absorbcji wirusa HIV na komórkach

PL 196 036 B1 docelowych, działa jako profilaktyczny środek przeciwko drobnoustrojom, wydłuża okres latencji HIV i innych chorób i w bardzo dużym stopniu hamuje aktywność HIV i innych wirusów będąc równocześnie ogólnie bezpiecznym dla pacjenta i środowiska.

Bardziej szczegółowe wyjaśnienie wynalazku podano w poniższym opisie i dołączonych zastrzeżeniach.

Kompozycja według wynalazku są dostarczone dla hamowania aktywności ludzkiego wirusa nabytego niedoboru odporności HIV. Pożądane aby skierowany przeciw HIV środek przeciwdrobnoustrojowy całkowicie hamował aktywność HIV jak również inne choroby wywołane przez drobnoustroje i był bezpieczny i nie toksyczny dla ludzi zwierząt i środowiska.

Kompozycja według wynalazku, skierowana przeciw HIV może zawierać substancję powierzchniowo czynną i rośliny zielne w postaci ekstraktów roślinnych, fitochemikaliów, izolatów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, izolatów przeciw wirusowych, inhibitorów drobnoustrojów i inhibitorów wirusów. Korzystnie kompozycja przeciwdrobnoustrojowa może zawierać: substancję powierzchniowo czynną; wodny rozcieńczalnik; składnik odżywczy i rośliny zielne z rodzaju Echinacea (E) z rodziny Asteracea z gatunków purpurea, angustifolia, pallidae, vegetalis, atribactilus i ich kultywary jak również rośliny zielne z rodzaju Commiphora z gatunków: Commiphora myrrha, Commiphora molmol, Commiphora erythraea i ich kultywarów. Korzystnie rośliny zielne są w postaci ekstraktów i izolatów zawierających fitochemikalia z Commiphora i fitochemikalia z Echinacea co stwierdzono dla ekstraktów z Commiphora myrrha, Echinacea purpurea, Echinacea pallidae i Echinacea angustifolia. Dla najlepszych wyników, kompozycja według wynalazku (lek) zawiera: kationową substancję powierzchniowo czynną, fitochemikalia z Echinacea purpurea, Echinacea angustifolia i Commiphora myrrha, jałowy rozpuszczalnik wodny i folacin. Korzystnie, proporcje Commiphora myrrha do Echinacea purpurea i Echinacea augustofolia mieszczą się w zakresie 1:2 do 1:4.

Substancje powierzchniowo czynne oczyszczają powierzchnię komórki wykazując szeroki zakres działań przeciwdrobnoustrojowych. Substancjami o takim charakterze mogą być czwartorzędowe sole amoniowe zawierające 6-18 atomów węgla. Korzystnie, czwartorzędowa sól amoniowa będąca substancją powierzchniowo czynną jest mieszaniną chlorków alkilodimetylobenzyloamonowych, którymi mogą być: halogenek benzalkonium, bromek benzalkonium, chlorek benzaltonium i najkorzystniej chlorek benzalkonium. Lek przeciwko HIV może zawierać 100% aktywnego roztworu wodnego, lecz również może być stosowane w postaci koncentratu. Roztwór może zawierać wagowo różne stężenia substancji powierzchniowo czynnych np. od 0,005% do 0,8%, korzystnie 0,02% do 0,30%, najkorzystniej 0,02% do 0,26%.

Występujące w materiale biologicznym z Echinacea fitochemikalia wykazują zaskakującą aktywność przeciw bakteriom, wirusom i niektórym grzybom. Szczegółowy mechanizm nie jest znany. Gdy będący przedmiotem wynalazku środek przeciwdrobnoustrojowy stosowano miejscowo na HIV i HSV 1i 2 był on skuteczny w leczeniu wybuchów infekcji opryszczki. Gdy badano in vitro wykazywał aktywność hamującą względem HIV-1 i HSV 1i 2.

Skoncentrowana kompozycja fitochemiczna zawiera następujące wyizolowane składniki, ekstrakty botaniczne, inhibitory drobnoustrojów i izolaty o działaniu przeciwdrobnoustrojowym: polisacharydy, echinacen, echinaceinę, echinakozyd (ester kwasu kofeinowego), echinolon, echinadiol, enzymy, kwas glukuronowy, inuloid, pentadekadien, związki poliacetylenowe, arabinogalaktan, ramnozę, PS I (4-0-metyloglukuroarabinoksylan, Mr = 35 ) i PS II (kwas ramnoarabinogalaktanowy Mr = 450), cynarynę (kwas 1,5-di-O-kawoilochinowy), kwas hikorowy (kwas 2,3-O-di-kawoilowinowy) i ich pochodne, amidy alkilowe, keto-alkiny i -alkeny; chinony; oleje w tym: borneol, octan bornylu; pentadeka-8(z)-nen-2-on, germakren D; kariofylen; epoksyd kariofylenowy; antocyjaninowe alkloidy pirolizydyny; amidy lipofilowe, amidy izobutylowe; poliacetyleny; mirrę; kurzerenon (typu furahoudesmanu); dihydrofuranodien-6-on; 2-metoksyfuranodien (typu furanoelemenu); elamol; landestyren (typu furanogermakrenu); apigeninę,, kwas askorbinowy, kwas behenoetylowy, betainę, kwas kofeinowy, 2-0-kawoilo-3-(5-alfakarboksybeta)-3,4-dihydroksyfenyl, kwas 2-0-kawoilo-3-0-kumaroilowinowy, 6-0-kawoiloechinakozyd, kwas 2-0-kawoilo-3-0-feruloilowinowy, kwas 2-0-kawoilowinowy, beta karoten, kwas chlorogenowy, ester metylowy kwasu hikorowego, cyjanidyno-3-O-(beta-d-glikopiranozyd), cyjanidyno-3-(6-0-malonylo-beta-d-glikopiranozyd), cynarynę, amid izobutylowy kwasu deka (2e,4e,6e)trienowego, desramnosylwerbaskozyd, kwas 3,5-dikawoilochinowy, kwas 4-5-0-dikawoilochinowy, kwas 2,3-0-diferulowinowy, amid izobutylowy kwasu dodeka-(2e,4e)-dienowego, izowalerianian dodeka-2,4-dien-1-ylu, amid izobutylowy kwasu dodeka-(2e,6z,8e,10e)-tetraenowego, beta-farnezewn, kwas 2-0-ferulowinowy,

PL 196 036 B1 germakren, heptadeka-(8z,11z)-dien-2-on, heteroksylan, humulen 8-12, (e)-10-hydroksy-4,10-dimetylo-4,11-dodekadien-2-on, kwas 13-hydroksyoktadeka(9z,11e,15z)-trienowy, inulinę, kwas izochorogenowy, izoramnetyno-3-rutynozyd, izotusilaginę, kempferol, kempferolo-3-glukozyd, kempferolo-3-nutinozyd, limonen, luteolinę, luteolino-7-glukozyd, 2-metylotetradeka-5,12-dien, 2-metylotetradeka-6,12-dien, metylo-p-hydroksycynamonian, marcinę, niacynę, kwas palmitynowy, pentadeka-(8z,11z)-dien-2-on, pentadeka-(8z,13z)-dien-11-lyn-2-on, pentadekan-8-en-2-on, pentadekan-(8z)-en-2-on, pentadekan-(8z)-en-11,13-dien-2-on, 1-pentadekan, pentadeka-(1,8z)-dien, alfa pinen, beta pinen, epoksyd pontyjski, kwarcetagetyn-7-glukozyd, kwarcetynę, kwarcetyno-3-galaktozyd, kwarcetyno-3-glukozyd, kwarcetyno-3-robinozyd, kwarcetyno-3-ksylozyd, kwarcetyno-3-ksylozylogalaktozyd, ramnoarabinogalaktan, ryboflawinę, rutynę, rutozyd, beta-sitosterol, sitosterolo-3-beta-o-glukozyd, stigmasterol, kwas winowy, tertadeka-(8z)-n-11,13-dien-2-on, tiaminę, n-triakontanol, trideka-1-n-3,5,7,9,10-pentainę, tusilaginę, wanilinę, werbaskozyd, półtoraterpeny, kwas octowy, alfa-amyrinę, arabinozę, alfa-bisabolen, gamma-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, aldehyd cynamonowy, kommiferynę, kwas alfa-kommiforowy, kwas beta-komiforowy, kwas gamma-komiforowy, kwas komiforynowy, m-krezol, alkohol kuminowy, aldehyd kuminowy, dipenten, 3-epi-alfa-amyrinę, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktozę, żywicę, heerabolen, alfa-herabormirol, beta-herabormirol, heraboresen, limonen, kwas 4-0-metylo-glukuronowy, n-nonacesan, beta-sitosterol, ksylozę, kariofyleny, kurzerenon, dihydro-furanodien-6-on oraz 2-metoksy-furanodienon.

Dla najlepszych wyników izolaty o działaniu przeciwdrobnoustrojowym otrzymane z koncentratu fitochemicznego powinny zawierać wagowo (względem całkowitej masy kompozycji według wynalazku): 0,3-9% echinakozydu, 0,1-7% PS I (4-0-metyloglukuronoarabinoksylanu, Mr = 35) i PS II (kwas ramnoarabinogalaktanowy Mr = 450); 0,1-10% cynaryny (kwas 1,5-di-O-kawoilochinowy) i kwasu hikorowego (kwas 12,3-0-di-kawoilowinowy) i ich pochodnych; 0,2-4% echinolonu; 0,2-8% echinacyny B; 0,1-6% echinaceiny; 0,2-7% antocyjanin w tym cyjanidyno-3-0-e-D-glukopiranozydu i 3-0-(6-0-malonylo-e-D-glukopiranozydu); 0,01-0,06% alkaloidów pirolizydyny w tym tusilaginę i izotusilaginę; 0,003-0,009% izomerycznego amidu dodekaizobutylowego i kwasu 2E,4E,8Z,10E/Z-tetraenowego; 0,01-2% kariofylenów jak również fitochemikalia z Commophora myrrha w tym: mirrę; kurzerenon; dihydro furanodien-6-on; 2-metoksyfuranodien; lindestren; półtoraterpeny, kwas octowy, alfa-amirynę, arabinozę, alfa bisabolen, gamma-bisabolen, kadinen, kampestrol, cholesterol, aldehyd cynamonowy, kommiferynę, kwas alfa-komiforowy, kwas beta-komiforowy, kwas gamma-komiforowy, kwas komiforynowy, m-krezol, alkohol kuminowy, aldehyd kuminowy, dipenten, elemol, 3-epi-alfa-amyrinę, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktozę, żywicę naturalną, heerebolen, alfa-herebomyrol, beta-herebomyrol, heereborezen, limonen, kwas 4-0-metylo-glukuronowy, n-nonacesan, beta-sitosterol, ksylozę, kariofyleny i lindestren.

Koncentrat fitochemiczny może zawierać wagowo: 2%-90% kompozycji leczniczej i roztwór, akorzystnie zawiera nie mniej niż 15% kompozycji leczniczej i roztworu, a dla najlepszych wyników 40%-60% kompozycji leczniczej i roztworu.

Rozcieńczalnik rozcieńcza chlorek benzalkonium (substancja powierzchniowo czynna) i koncentrat fitochemiczny i może działać jako nośnik w rozpylaczach, tubkach i wkraplaczach. Korzystnie, rozcieńczalnik jest rozcieńczalnikiem wodnym, najkorzystniej jałowym rozpuszczalnikiem wodnym. Proporcje wody w wodnym roztworze chlorku benzalkonium mogą mieścić się w zakresie od 30000:1 do 250:1, korzystniej 5000:1 do 750:1. Proporcje wody do połączonych koncentratów chlorku benzalkonium i fitochemikaliów może mieścić się w zakresie 2:1 do 100:1 z korzystnym zakresem 4:1 do 40:1, a dla najlepszych wyników powinien zawierać proporcje 6:1 do 20:1.

Dla najlepszych wyników kompozycja przeciwdrobnoustrojowa według wynalazku zawiera wagowo: 0,02% do 0,3% chlorku benzalkonium, a aby uniknąć toksyczności korzystnie mniej niż 0,26%;40% do 60% fitochemikaliów z Echinacea i Commophora; 0,01% do 25%, najkorzystniej 2% do 12% składnika odżywczego i 20% do 60%, najkorzystniej 29,74% do 59,8% jałowej wody. Korzystnie, kompozycja według wynalazku o działaniu przeciwdrobnoustrojowym zawiera witaminowy składnik odżywczy służący jako odżywczy nośnik i umożliwiający efekt synergiczny po połączeniu z Commophora myrrha, Echinecea purpurea i Echinacea augustofolia. Składnik odżywczy może zawierać jedną lub więcej następujących witamin: witamina A, witamina B kompleks, witamina D, witamina E, witamina K i rozpuszczalne w wodzie witaminy, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach, witamina B1, witamina B2, witamina B5, witamina B6, witamina B12, witamina B15 i korzystnie foliacyn lub kwas foliowy.

Podczas gdy woda jest korzystnym rozcieńczalnikiem i nośnikiem wodnym, w pewnych warunkach może być pożądanym zastosowanie innych nośników celem przemieszczania koncentratu

PL 196 036 B1 w strzykawce lub rozpylaczu lub dla zwiększenia rozpuszczalności. W pewnych sytuacjach pożądanym może być również uwzględnienie środka regulującego lepkość. Co więcej, choć stwierdzono, że trwałość kompozycji według wynalazku wynosi dwa lata to może być niezbędnym dodanie odpowiednich konserwantów.

Dla korzystnego użycia jako środka zapobiegawczego działającego zapobiegawczo przeciw HIV, roztwór leczniczy (lek) powinien być podawany ogólnoukładowo - dopochwowo lub dojelitowo. Sposobem podawania leku może być: wstrzykiwanie, rozpylanie, wklepywanie, nakraplanie lub inne sposoby. Podawanie lub pokrywanie roztworem (lekiem) powinno być utrzymywane w czasie stosunku. Mydła anionowe, detergenty anionowe a zwłaszcza mydła ze składnikami białkowymi są przeciwwskazane. Korzystnie, przed podaniem leku, miejsce podania powinno być wymyte, oczyszczone i wysuszone. Dla stosowania jako preparat antywirusowy skierowany przeciw HIV lek może być naniesiony strzykawką dozującą lek do odbytu lub pochwy lub innym sposobem.

Korzystną substancją powierzchniowo czynną jest chlorek benzalkonium. Chlorek benzalkonium jest roztworem wodnym dostępnym handlowo, rozprowadzanym przez Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (dawniej Winthrop Labs) pod handlową nazwą i znakiem towarowym Zephiran®. Chlorek benzalkonium jest szybko działającą substancją powierzchniowo czynną o działaniu przeciw infekcyjnym o umiarkowanie długim czasie działania. Substancja powierzchniowo czynna działa przeciw bakteriom, niektórym wirusom, grzybom i pierwotniakom. Stwierdzono, że zarodniki bakterii są oporne. Roztwory chlorku benzalkonium, w zależności od stężenia, są bakteriostatykami lub środkami bakteriobójczymi. Dokładny mechanizm działania chlorku benzalkonium na bakterie jest nieznany, lecz wydaje się dotyczyć dezaktywacji enzymów. Ogólnie, aktywność chlorku benzalkonium wzrasta wraz ze wzrostem temperatury i pH. Bakterie gram pozytywne są bardziej wrażliwe na chlorek benzalkonium niż bakterie gram ujemne.

Niestety, chlorek benzalkonium jest dezaktywowany przez mydła, detergenty anionowe, surowicę i określone białka. Z tych powodów chlorek benzalkonium, w niektórych laboratoriach popadł w niełaskę. Chlorek benzalkonium stosowany samodzielnie, miejscowo, okazał się in vivo nieaktywny wobec wybuchu infekcji wirusem opryszczki. Gdy chlorek benzalkonium testowano in vivo przeciw HSV 1 i 2 ujawnił on względem komórek niepożądany, wysoki poziom toksyczności, nawet gdy był stosowany w wysokim rozcieńczeniu, co jest nie do zaakceptowania z medycznego punktu widzenia. Wzór chemiczny chlorku benzalkonium przedstawiono poniżej. Użyte mogą być również inne rodzaje chlorku benzalkonium.

Chlorek benzalkonium cr ch₃

I ₊l ch₃(ch₂)₁₄ch₂—n—ch₂

ch₃

Fitochemikalia

Podczas gdy surowy, nieprzetworzona, nie poddana obróbce, nie izolowana Echinacea jest ogólnie niepożądana przy w śródściennym leczeniu HIV i opryszczki, po odpowiednim przefiltrowaniu, podanie śródścienne może być możliwe. Co znaczące, wydaje się, że pewne, lecz nie wszystkie izolowane składniki i ekstrakty roślinne z Echinacea i Commiphora (jak opisano powyżej) dostarczają składników bakteriobójczych, izolatów o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, ekstraktów roślinnych i inhibitorów drobnoustrojów, które posiadają lub wykazują aktywność przeciwdrobnoustrojową, która wydaje się być skuteczna w leczeniu HIV, wirusa opryszczki i innych chorób zakaźnych.

Poprzednio stwierdzono, że stężona kompozycja fotochemiczna może zawierać następujące wyizolowane składniki, ekstrakty roślinne, inhibitory drobnoustrojów, oraz izolaty o działaniu przeciwdrobnoustrojowym: polisacharydy, echinacen, echinaceinę, echinakozyd (ester kwasu kawowego), echinolon, echinadiol, enzymy, kwas glukuronowy, inuloid, pentadekadien, związki poliacetylenowe, arabinogalaktan, ramnozę, PS I (4-0-metyloglukuroarabinoksylan, Mr = 35 ) i PS II (kwas ramnoarabinogalaktanowy Mr = 450), cynarynę (kwas 1,5-di-O-kawoilochinowy), kwas hikorowy (kwas 2,3-O-di-kawoilowinowy) i ich pochodne, amidy alkilowe, keto-alkiny i -alkeny; chinony; oleje w tym: borneol, octan bornylu; pentadekan-8(z)-en-2-on, germakren D; kariofylen; epoksyd kariofylenowy; antocyjaninowe

PL 196 036 B1 alkloidy pirolizydyny; amidy lipofilowe, amidy izobutylowe; poliacetyleny; mirrę; kurzerenon (typu furahoudesmanu); dihydrofuranodien-6-on; 2-metoksyfuranodien (typu furanoelemenu); elamol; lindestren (typu furanogermakrenu); apigeninę, kwas askorbinowy, kwas behenoetylowy, betainę, kwas kawowy, 2-O-kawoilo-3-(5-alfakarboksybeta)-3,4-dihydroksyfenyl, kwas 2-O-kawoilo-3-0-kumaroilowinowy, 6-O-kawoiloechinakozyd, kwas 2-O-kawoilo-3-O-feruloilowinowy, kwas 2-O-kawoilowinowy, beta karoten, kwas chlorogenowy, ester metylowy kwasu hikorowego, cyjanidyno-3-O-(beta-d-glikopiranozyd), cyjanidyno-3-(6-O-malonylo-beta-d-glikopiranozyd), cynarynę, amid izobutylowy kwasu deka (2e,4e,6e)trienowego, des-ramnosylwerbaskozyd, kwas 3,5-dikawoilochinowy, kwas 4-5-O-dikawoilochinowy, kwas 2,3-O-diferulowinowy, amid izobutylowy kwasu dodeka-(2e,4e)-dienowego, izowalerianian dodeka-2,4-dien-1-ylu, amid izobutylowy kwasu dodeka-(2e,6z,8e,10e)tetraenowego, beta-farnezen, kwas 2-O-ferulowinowy, germakren, heptadeka-(8z,11z)-dien-2-on, heteroksylan, humulen 8-12, (e)-10-hydroksy-4,10-dimetylo-4,11-dodekadien-2-on, kwas 13-hydroksyoktadeka(9z,11e,15z)-trienowy, inulinę, kwas izochlorogenowy, izoramnetyno-3-rutynozyd, izotusilaginę, kempferol, kempferolo-3-glukozyd, kempferolo-3-nutinozyd, limonen, luteolinę, luteolino-7-glukozyd, 2-metylotetradeka-5,12-dien, 2-metylo-tetradeka-6,12-dien, metylo-p-hydroksycynamonian, marcinę, niacynę, kwas palmitynowy, pentadeka-(8z,11z)-dien-2-on, pentadeka-(8z,13z)-dien-11-lyn-2-on, pentadekan-8-en-2-on, pentadekan-(8z)-en-2-on, pentadekan-(8z)-en-11,13-dien-2-on, 1-pentadekan, pentadeka-(1,8z)-dien, alfa pinen, beta pinen, epoksyd pontyjski, kwarcetagetyno-7-glukozyd, kwarcetynę, kwarcetyno-3-galaktozyd, kwarcetyno-3-glukozyd, kwarcetyno-3-robinozyd, kwarcetyno-3-ksylozyd, kwarcetyno-3-ksylozylogalaktozyd, ramno-arabinogalaktan, ryboflawinę, rutynę, rutozyd, beta-sitosterol, sitosterolo-3-beta-o-glukozyd, stigmasterol, kwas winowy, tertadeka-(8z)-n-11,13-dien-2-on, tiaminę, n-triakontanol, trideka-1-n-3,5,7,9,10-pentainę, tusilaginę, wanilinę, werbaskozyd, półtoraterpeny, kwas octowy, alfa-amyrinę, arabinozę, alfa-bisabolen, gamma-bisabolen, kadinen, kampesterol, cholesterol, aldehyd cynamonowy, kommiferynę, kwas alfa-kommiforowy, kwas beta-komiforowy, kwas gamma-komiforowy, kwas komiforynowy, m-krezol, alkohol kuminowy, aldehyd kuminowy, dipenten, 3-epi-alfa-amyrinę, eugenol, furanodien, furanodienon, galaktozę, żywicę, heerabolen, alfa-herabormirol, beta-herabormirol, heraboresen, limonen, kwas 4-0-metylo-glukuronowy, n-nonacesan, beta-sitosterol, ksylozę, kariofyleny, dihydro-furanodien-6-on oraz 2-metoksy-furanodienon oraz lindestren.

Wzory chemiczne niektórych wyciągów roślinnych z Echinacea pokazano poniżej.

PL 196 036 B1

Wzory chemiczne niektórych wyciągów roślinnych z Commiphora myrrha pokazano poniżej.

kurzerenon (typu furaheudesmenu)

u dihydro-furanodien-6-on 2-metoksyfuranodien (typu furanoelemenu)

elemol

Lindestren (typu furanogermakrenu)

Mirra jest też czasem określana jako żywica z balsamowa, żywica Commiphora, mirra vera żywicą gruggal, mirrą heerabol, mirrą Manniliche, Opopanax czy mirrą Hirabol, (ang. myrrh, mirre, gummi myrrha, myrrha vera, gum myrrh, Commiphora resin, gruggal gum, gruggal resin, Heerabol myrrh, merrhe, Manniliche merrhe, Opopanax i Hirabol myrrh). Mirra może zawierać żywicę naturalną otrzymaną po nacięciu wykonanym na korze drzewa z gatunku Commiphora myrrha tzw. drzewa mirrowego. Mirra może również zawierać sok balsamiczny z Balsamodendron myrra tzw. balsamowcu mirra będącego kolczastym krzewem. Mirra może być również wyekstrahowana z Osmorhiza lub Washingtonia, która jest również czasem nazywana mirnikiem wonnym. Drzewa mirrowe w naturze występują w Erytrei, Abisyni, Somali, Jemenu, Sudanu i innych.

Wytwarzające mirrę gatunki Commiphora są krzewami lub małymi drzewami posiadającymi na pniach ostro zakończone kolce. Niesymetryczne trójkątne liście są ułożone naprzemiennie, a małe kwiaty są zebrane na szczytach pędów w wiechetki. Zniszczenie przewodów żywicy owocuje uzyskaniem leczniczej mirry.

Mirra jest wysychającą na powietrzu oleistą żywicą naturalną, która sączy się z kory gatunków Commiphora. Materiał składa się z nieregularnych, okrągłych ziaren lub bryłek różnej wielkości z dziurami i o barwie od ciemno brązowej i niemal czarnej do jasno lub ciemno pomarańczowo-brązowej; niektóre części mogą być żółte lub bezbarwne do blado żółtych. Powierzchnię w większości pokrywa szary do żółtawo-szarego proszek, przełam jest muszlowy i daje cienkie, przezroczyste fragmenty. Mirra może mieć słodki zapach o cierpkim i aromatycznym akcencie. Mirra może mieć gorzki i aromatyczny smak. Mirra może być zjadliwie gorzka i klei się do zębów gdy jest żuta.

Skład chemiczny żywicy otrzymywanej z Commophora molmol i innych gatunków Commiphora jest porównywalny z mirrą DAB 10. W literaturze istnieje dyskutowana niezgodność dotycząca źródła mirry i identyfikacji powiązanych z nią gatunków Commiphora. Popularna mirra (lub hirabol) wydaje się pochodzić z Commiphora myrrha. Mirra somalijska pochodzi z Commiphora molmol. Jakkolwiek nie jest jasna systematyczne (taksonomiczne) zależności pomiędzy Commiphora myrrha i Commiphora molmol. Źródłem mirry abisyńskiej jest Commiphora madagascariensis lub Commiphora abyssinica. Opopanax, określany również jako mirra bisabolowa lub perfumowane bdellium przypuszczalnie pochodzi z Commiphora erythraea (Ehrenb) lub Opopanax.

Skład mirry jest bardzo złożony i tylko częściowo znany. 40-60% rozpuszcza się w etanolu i zawiera żywicę i esencję olejową. Mirra zbudowana jest niemal wyłącznie z półtoraterpenów. Zasadniczym składnikiem półtoraterpenów są: furanopółtoraterpenów takie jak germakranowy eleman germakranowy, eudesmen i rodzaje guaiany. Dodatkowo występują węglowodory półtoraterpenowe np. β i δ-elemen, β-burbonen, β-kariofylen, humulen i alkohole półtoraterpenowe np. elemol. Przypuszczalnie

PL 196 036 B1 niektóre furanopółtoraterpeny są charakterystyczne dla mirry farmaceutycznej. Surowa żywica mirrowa lub surowy klej roślinny zawiera 20% białek i 65% węglowodanów zbudowanych z galaktozy, kwasu 4-O-metyloglukuronowego i arabinozy. Fitochemikalia z Commophora myrra obejmują: kwas octowy, alfa-amyrinę, arabinozę, alfa-bisabolen, gamma-bisabolen, kadynen, kampestrol, cholesterol, aldehyd cynamonowy, kommiferynę, kwas alfa kommiforowy, kwas beta komiforowy, kwas gamma komiforowy, kwas komiforynowy, m-krezol, alkohol kuminowy, aldehyd kuminowy, dipenten, elemol, 3-epi-alfa-amyrinę, eugenol, furanodien, galaktozę, żywicę, heerebolen, alfa-hereebomyrol, beta-heerebomyrol, hereboresen, limonen, kwas 4-O-metylo-glukoronowy, n-nonekasen, beta-sitesterol, ksylozę, kariofyleny, mirrę, kurzerenon, dihydro furanodien-6-on, 2-metoksyfurandien i lindestren.

Nalewka na mirrze może posiadać działanie przeciwzapalne. Makro i mikroskopowo, mirra może występować jako brązowo-żółty proszek charakteryzujący się żółtawymi odpryskami lub kulistymi ziarnami o rozmaitej wielkości jak również drobnoziarnistym materiałem, który pęcznieje w wodzie. W chloro-hydratowym preparacie mikroskopowym widać jedynie kilka fragmentów tkanki pochodzącej ze źródeł roślinnych: brązowo czerwone fragmenty kory, pojedyncze lub grupy wielobocznych lub obłych komórek kamiennych, częściowo znacznie wycienionych, ospowatych i zlignifikowanych ścian i brązowawej zawartości, fragmenty cienkościennych włókien parenchymy i sklerenchymy i 10-25 μm nieregularne pryzmatyczne oraz wieloboczne kryształy tlenku wapnia.

Mirra powinna być chroniona przed światłem i wilgocią w dobrze zamykanych pojemnikach. Najlepiej osuszonych bowiem węglowodany będące częścią leku łatwo absorbują wodę. Korzystne jest aby mirra nie była przechowywana w postaci proszku.

Kwas foliowy

Korzystnym składnikiem odżywczym, dającym najlepsze wyniki jest kwas foliowy. Kwas foliowy określany również jako folacin, kwas pteroglutamowy, foldine, folaemin, foliamin, folicet, folipac, follettes, folsan, folvite, incafolic, milafol lub cytafoljest żółtą, krystaliczną rozpuszczalną w wodzie witaminą z grupy B kompleks mającą zasadnicze znaczenie dla wzrostu i rozmnażania się komórki. Kwas foliowy działa jako koenzym z witaminą B12 i witaminą C w degradacji i wykorzystywaniu białek i w syntezie kwasu nukleinowego, hemu i hemoglobiny. Kwas foliowy zwiększa również apetyt i pobudza wytwarzanie przez układ pokarmowy kwasu solnego. Kwas foliowy jest przechowywany w wątrobie i może być syntetyzowany przez florę bakteryjną przewodu pokarmowego. Efektem braku kwasu foliowego jest słaby wzrost, siwienie włosów, zapalenie języka, zapalenie jamy ustnej, uszkodzenia żołądkowo jelitowe i biegunka, jak również może prowadzić do anemii megaloblastycznej. Niedobór może być spowodowany zbyt małą ilościądostarczanych witamin w diecie, złe wchłanianie pokarmu lub wady metaboliczne. Zapotrzebowanie na kwas foliowy wzrasta w ciąży, dzieciństwie i w stresie. Kwas foliowy jest wrażliwy zarówno na światło jak i ogrzewanie i znaczna utrata witaminy następuje, gdy jest przechowywana przez dłuższy czas. Kwas foliowy jest nietoksyczny i efektywny w leczeniu konkretnych niedoborów. Wzór chemiczny kwasufoliowego przedstawiono poniżej.

I

COOH

Kwas foliowy (kwas pteroiloglutaminowy).

PL 196 036 B1

Strukturę kwasu foliowego przedstawiono poniżej

Kwas pteroiloglutaminowy (kwas foliowy).

Cząsteczki kwasu foliowego zawierają kwas glutaminowy, kwas p-aminobenzenowy i pterynę; a pterynę połączoną z kwasem p-aminobenzenowym nazywamy kwasem pterynowym. Przedstawiona struktura obrazuje kwas pteroglutaminowy z wątroby. Kwas foliowy wytwarzany przez bakterie zawiera trzy reszty kwasu glutaminowego połączone wiązaniem γ-glutamylowym. Wiele tkanek zwierzęcych zawiera kwas pteryloheptaglutaminowy, tu również reszty kwasu glutaminowego połączone są wiązaniem γ-glutamylowym. Syntetyczny kwas pterylopoliglutaminowy, w którym cząsteczki kwasu połączone są wiązaniem a-glutamylowym jest aktywny w oznaczeniu opartym na analizie wzrostu bakterii; kwas pteroilo-γ-glutaminowy jest skuteczny zarówno względem bakterii i w leczeniu u człowieka anemii makrocytowej. Enzymy występujące naturalnie w tkankach zwierzęcych hydrolizują naturalnie występujący pteroiloglutaminian do kwasu pteroilomonoglutaminowego i wolnego kwasu glutaminowego.

Kolejny wzór kwasu pteroiloglutaminowego (PtGlu1) przedstawiono poniżej.

Pozycja	Rodnik	Kongener
N5	-CH3	CH3H4PteGlu	metylotetrahydrofolian
N5	-CHO	5-CHOH4PteGl	kwas foliowy
N10	-CHO	10-CHOH4PteGlu	10-formylotetrahydrofolian
N5-10	-CH-	5,10-CHH4PteGlu	5,10-metenylotetrahydrofolian
N5-10	-CH2-	5,10-CH2H4PteGlu	5,10-metylenotetrahydrofolian
N5	-CHNH	CHNHH4PteGlu	forminotetrahydroksyfolian
N10	-CH2-OH	CH2OHH4PteGlu	forminotetra hydroksyfolian

Struktura i nazewnictwo kwasu pteroiloglutaminowego (kwasu foliowego).

Główną część kwasu foliowego obejmuje pierścień pterydynowy połączoną mostkiem metylenowym z kwasem paraaminobenzoesowym, który jest połączony przez wiązanie amidowe z kwasem glutaminowym. Podczas gdy kwas pteroiloglutaminowy jest pospolitą farmaceutyczną postacią kwasu foliowego to nie jest on nigdy głównym folianem występującym w żywności, ani aktywnym koenzymem dla

PL 196 036 B1 metabolizmu wewnątrzkomórkowego. Po absorbcji PtrGlu jest gwałtownie redukowany w pozycjach 5, 6, 7 i 8 do kwasu tetrahydrofoliowego (H4PteGlu), który następnie może działać jako akceptor wielu jednostek jedno-węglowych. Miejsca przyłączania występują w pozycji 5 lub 10 pierścienia pterydynowego lub mostkują te atomy tworząc nowy pięcioelementowy pierścień.

Witamina B12 i kwas foliowy są niezbędne w diecie człowieka. Brak każdej z tych witamin prowadzi w każdej komórce do nieprawidłowej syntezy DNA w każdej komórce rozpoczynającej replikację i podział chromosomu. Ponieważ tkanki z szybszą wymianą komórek wykazują bardziej dramatyczne zmiany to układ hemopoetyczny jest szczególnie wrażliwy na brak tych witamin. Klinicznie, wczesnym sygnałem braków jest anemia megablastyczna, w której przegrupowanie syntezy DNA prowadzi do charakterystycznych nienormalności morfologicznych u występujących w szpiku kostnym komórek prekursorowych. Efektem są powstające nienormalne olbrzymie krwinki czerwone, a pacjent zapada na ostrą anemię.

Metylkobalamina wspomaga reakcję katalizowaną przez syntetazę metioninową, będącą zasadniczym elementem normalnego metabolizmu folianów. Grupa metylowa dostarczana przez metylotetrahydroksyfolian (CH3H4PteGlu) jest używana do wytwarzania metylkobalaminy, która z kolei działa jako donor grupy metylowej przy przekształcaniu homocysteiny w metioninę. Oddziaływanie folian-kobalamina jest kluczowe dla normalnej syntezy puryn i pirymidyn, a co za tym idzie DNA. Reakcja katalizowana przez syntetazę metioninową jest w znacznym stopniu odpowiedzialna za kontrolowanie reutylizacji kofaktorów folianowych; utrzymywania wewnątrzkomórkowego stężenia folilopoliglutaminianów, a przez to syntezy metioniny i jej produktu, S-adenozynometioniny, utrzymaniu szeregu reakcji metylacji. Ponieważ metylotetrahydroksyfolian jest zasadniczą postacią folianu dostarczanego komórkom, przenoszenie grupy metylowej na kobalaminę jest zasadnicze dla prawidłowego uzupełniania tetrahydrofolianów (H2PteGlu1), substratu dla szeregu przekształceń metabolicznych. Tetrahydrofolian jest prekursorem w syntezie wewnątrzkomórkowych folilopoliglutaminianów; działa również jako akceptor jednostek jednowęglowych w przekształcaniu seryny w glicynę, w wyniku czego powstaje 5,10-metylenotetrahydrofolian (5,10-CH2H4PteGlu). Druga pochodna dostarcza grupę metylenową do deoksyurydynianu co umożliwia syntezy tymidynianu, która to reakcja jest wybitnie istotną dla syntezy DNA. W procesie, 5,10-CH2H4PteGlu jest przekształcana do dihydrofolianu (H2PteGlu). Cykl jest następnie zamknięty przez redukcję H2PteGlu do H4PteGlu katalizowaną przez reduktazę dihydrofolianową, etap ten jest blokowany przez antagonistów folianu takich jak metotreksat. Inne szlaki metaboliczne również prowadzą do syntezy 5,10-metylenotetrahydrofolianu.

PL 196 036 B1

T a b el a A Biosynteza kwasu foliowego.

Poniżej przedstawiono biosyntezę kwasu foliowego. Symbol ppp oznacza trifosforan.

Folian może być transportowany do tkanki jako CH3H4PteG1. Wątroba aktywnie redukuje i metyluje PteGlu1 (i H2 lub H4PteGlu1), a następnie transportuje CH3H4PteGlu1 do żółci dla resorbcji przez jelita i następnie przeniesienie do tkanek, CH3H4PteGlu działa jako donor grup metylowych dla tworzenia metylkobalaminy i jak opisano to uprzednio jako źródło H4PteGlu i innych postaci folianów. Foliany są przechowywane w komórce jako poliglutaminiany.

Substancje powierzchniowo czynne.

Choć chlorek benzalkonium jest korzystną substancją powierzchniowo czynną dla osiągnięcia najlepszych wyników, w pewnych sytuacjach może być pożądanym użycie innych czwartorzędowych amoniowych substancji powierzchniowo czynnych lub innych substancji powierzchniowo czynnych.

Czwartorzędowym związkiem amoniowym może być chlorek dikokodymonium, określany również jako chlorki dikoko dimetylalkilowe, chlorek dikoko dimetylo amoniowy lub chlorek di-C8-18-alkilodimetylu. Może być on użyty w połączeniu z izopropanolem, na przykład z 20-30% izopropanolem.

Korzystne źródło związku czwartorzędowego zawiera: 70-80% czwartorzędowego amonowego składnika i mniej niż 0,03% chlorku metylu o ciężarze właściwym 0,87 przy około 46,1°C (115°F) i prężności par

PL 196 036 B1

4,4 kPa (33 mm/Hg) przy 20°C (68°F) i początkowej temperaturze wrzenia przy około 65,6°C (180°F) przy 101,3 kPa (760 mm/Hg) i lotności 20-30%; i jest wytwarzany przez Witco Corporation, Dublin, Ohio, USA pod handlową nazwą CarSpray300. Związki czwartorzędowe mogą dostarczać właściwości dezynfekcyjnych i służyć jako środki grzybobójcze dla leczenia infekcji wywoływanych przez grzyby i drożdże.

Użyteczne mogą być inne czwartorzędowe związki amonowe mogą być użyteczne, w postaci w jakiej są produkowane przez Jetco Chemicals, Inc. z Corsicana, Texas, USA pod handlową nazwą Jet Quat 2C-75 lub produkowany przez Witco Corporation, Dublin, Ohio, USA pod handlową nazwą Carspray 400 i Carnauba Spray 200 lub zawierających 9% denaturat (alkohol etylowy), taki jak wytwarzany przez Stephen Company, Northfield, Illinois, USA pod handlową nazwą BTC 2125M lub następujące produkty MAQUAT zawierające n-alkilowy chlorek dimetylobenzyloamoniowy wytwarzane przez Masao Chemical Company, Arlington Heights, Ilinois, USA: LC-12S (67% C12, 25% C14, 7% C16, 1% C18), MC 1416 (5% C12, 60% C14, 30% C16, 5% C18), MC1412 (40% C12, 50% C14, 10% C16), sterylowa pasta lub płatki SC-18 (5% C16, 95% C18), TC-76 lub MQ-2525 (5% C12, 60% C14, 30% C16 i 5% C18) i MC6025-50% (25% C12, 60% C14 i 15% C16). Jet Quat 2C-75 zawiera 50-75% czwartorzędowego chlorku dikokodimetyloamoniowego, 20-50% alkoholu izopropylowego i ma ciężar właściwy 0,88 i temperaturę wrzenia 65,6°C (180°F). CarSpray 400 zawiera 55-65% czwartorzędowych związków amoniowych, 20-30% amin, nienasycone C14-18 i C16-18 etoksylowane alkile, 10-20% izopropanolu i mniej niż 0,03% chlorku metylu i ma ciężar właściwy około 0,88 przy około 23,9°C (75°F), prężność par około 4,4 kPa (33 mm/Hg) w 20°C (68°F) i temperaturę wrzenia równą około 65,6°C (180°F) w 101,3 kPa (760 mm/Hg) i lotność 10-20%. Carnauba Spray 200 zawiera 50-60% czwartorzędowych związków amoniowych, 10-20% izopropanolu, 15-25% wody, 1-10% alkoilowanego wosku carnauba i mniej niż 0,03% chlorku metylu i ma ciężar właściwy około 0,90 przy około 26,7°C (80°F), ciśnienie par około 4,4 kPa (33 mm/Hg) w 20°C (68°F) i temperaturę wrzenia równą około 65,6°C (180°F) w około 101,3 kPa (760 mm/Hg) i lotność 20-40%.

Niejonowe substancje powierzchniowo czynne są związkami powierzchniowo czynnymi, które nie dysocjują jonowo w roztworach wodnych. Często posiadają one charakter hydrofilowy dzięki występującemu w nich utlenionemu łańcuchowi (np. łańcuchowi poli-oksyetylenowemu), lipofilowa część cząsteczki bywa pochodną kwasów tłuszczowych, fenoli, alkoholi, amidów lub amin. Przykładowymi składnikami są polimeryczne produkty kondensacji tlenku etylenu z fenolami alkilowymi, np. produkt kondensacji jednego mola fenolu nonylowego i dziesięciu moli tlenku etylenu i produkty kondensacji alkoholi alifatycznych i tlenku etylenu np. produktu kondensacji otrzymanego z 1mola tridekanolu i 12 moli tlenku etylenu.

Niejonowe substancje powierzchniowo czynne mogą zawierać etoksylowane fenole zawierające produkty kondensacji tlenku etylenu i alkilowych pochodnych fenoli lub alkoholi alifatycznych. Korzystnie, gdy niejonowa substancja powierzchniowo czynna zawiera etoksylowany nonofenol taki jak T-DET, i/lub etoksylowany oktafenol. Niejonowe substancje powierzchniowo aktywne są produktami reakcji tlenku etylenu i nonofenoli i/lub oktafenoli. Proporcje fenolu do tlenku etylenu mogą mieścić się w zakresie 2:20 do 4:16 korzystnie około 8:12.

Syntetyczne niejonowe substancje powierzchniowo czynne mogą zawierać niejonowe detergenty. Syntetyczne niejonowe substancje powierzchniowo czynne mogą również powstawać przez kondensację tlenku etylenu z hydrofobową zasadą uzyskaną przez kondensację tlenku propylenu z glikolem propylowym. Hydrofobowa część cząsteczki, która oczywiście charakteryzuje się brakiem rozpuszczalności w wodzie ma masę cząsteczkową od około 1200 do 2500. Obserwowano, że dodanie rodnika polioksyetylenowego do tej hydrofobowej części wywołuje zwiększanie rozpuszczalności całych cząsteczek w wodzie, a płynny charakter produktu może zostać zachowany aż do momentu gdy zawartość polioksyetylenu osiągnęła około 50% całkowitej wagi produktu kondensacji. Inne syntetyczne niejonowe substancje czynne powierzchniowo mogą zawierać: kondensaty tlenku polietylenu i alkilofenoli np. produkty kondensacji alkilofenoli lub dialkilofenoli gdzie grupa alkilowa zawiera około 6 do 12 atomów węgla zarówno w postaci łańcucha prostego jak i łańcucha rozgałęzionego, z tlenkiem etylenu. Tlenek etylenu może być obecny w ilości odpowiadającej 8 do 25 molom tlenku etylenu na 1 mol alkilofenolu. Podstawnikiem alkilowym w takim związku może być pochodna z polimeryzacji propylenu, diizobutylenu, n-oktanu lub n-nonenu.

Niejonowe substancje powierzchniowo czynne mogą również być wytwarzane przez kondensację tlenku etylenu z produktem reakcji tlenku propylenu i etylenodiaminy np. związek zawierający od około 40% do około 60% wagowych polioksyetylenu o masie cząsteczkowej od około 5,000 do około 11,000

PL 196 036 B1 otrzymany w reakcji grup tlenku etylenu z hydrofobową zasadą będącą produktem reakcji etylenodiaminy z nadmiarem tlenku propylenu, zasady o masie cząsteczkowej w zakresie od 2,500 do 3,000.

Inne niejonowe substancje powierzchniowo czynne obejmujące produkty kondensacji alkoholi alifatycznych posiadających od 8 do 18 atomów węgla zarówno w postaci łańcucha prostego jak i rozgałęzionego z tlenkiem etylenu np. kondensacji alkoholu kokosowego i tlenku etylenu gdzie 10 do 30 moli tlenku etylenu przypada na mol alkoholu kokosowego i frakcja alkoholu kokosowego zawiera od 10 do14 atomów węgla.

Kolejne substancje powierzchniowo czynne obejmują długołańcuchowe czwartorzędowe tlenki amin odpowiadające następującemu ogólnemu wzorowi:

R1R3R3N —— O gdzie R1 jest rodnikiem alkilowym o około 8 do 14 atomach węgla i każda R2 i R3 rodnikiem metylowym lub etylowym. Strzałka we wzorze jest konwencjonalnym oznaczeniem wiązania semi-polarnego. Przykłady dogodnych dla użycia tlenków amin obejmują: tlenek dimetylododecyloaminy, tlenek dimetylooktyloaminy, tlenek dimetylodecyloaminy, tlenek dimetylotetradecyloaminy i tlenek dimetyloheksadecyloaminy.

Inne niejonowe substancje powierzchniowo czynne mogą obejmować długołańcuchowe czwartorzędowe tlenki fosfin odpowiadające następującemu ogólnemu wzorowi:

RR^IR^IIP — O gdzie R jest rodnikiem alkilowym, alkenylowym lub monohydroksyalkilowym o łańcuchu o długości od 10 do 18 atomów węgla i każdy z R^I i R^II jest grupą alkilową lub monohydroksyalkilową zawierającą od 1do 3 atomów węgla. Strzałka we wzorze jest konwencjonalnym oznaczeniem wiązania semipolarnego. Przykładami użytecznych tlenków fosfin są: tlenek dimetylododecylofosfiny, tlenek dimetylotetradecylofosfiny, tlenek etylometylotetradecylofosfiny, tlenek cetydimetylofosfiny, tlenek dimetylostearylofosfiny, tlenek cetyloetylopropylofosfiny, tlenek dietylododecylofosfiny, tlenek dietylotetradecylofosfiny, tlenek dipropylododecylofosfiny, tlenek bis-(2-hydroksymetylo)dodecylofosfiny, tlenek bis-(2-hydroksymetylo)dodecylofosfiny, tlenek (2-hydroksypropylo)metylotetradecylofosfiny, tlenek dimetylooleilofosfiny i tlenek dimetylo-(2-hydroksydodecylo)fosfiny.

W pewnych warunkach użytecznym może być użycie innych substancji powierzchniowo czynnych takich jak inne kationowe substancje powierzchniowo czynne, amfolityczne substancje powierzchniowo aktywne i środki powierzchniowo czynne w postaci jonów obojnaczych.

Kationowe substancje powierzchniowo czynne mogą obejmować detergenty kationowe. Kationowe substancje powierzchniowo czynne obejmują związki dysocjujące jonowo w roztworach wodnych w wyniku czego powstają kationy zawierające grupę liofilową. Typowymi dla tych związków są czwartorzędowe sole amoniowe które zawierają grupę alkilową o od około 12 do około 18 węglach, taki jak chlorek laurylobenzylodimetyloamoniowy.

Amfolityczne substancje powierzchniowo czynne są związkami posiadającymi w tej samej cząsteczce zarówno grupy kationowe jak i anionowe. Przykładami takich związków są pochodne alifatycznych amin, które posiadają długie łańcuchy zbudowane z od około 8 do około 18 atomów węgla i grupę anionową rozpuszczalną w wodzie np. karboksysulfonianową, sulfonianową lub siarczanową. Przykładami detergentów amfolitycznych są: 3-dodecyloaminopropanosulfonian sodu, N-metylo winian sodu i podobne im substancje takie jak wyższe aminokwasy dipodstawione grupą alkilową, betainy, tetyny, sulfonowe pochodne amin alkenów długo łańcuchowych i pochodne sulfoimidazoliny.

Środki powierzchniowo czynne w postaci jonów obojnaczych mogą obejmować syntetyczne detergenty. Środki powierzchniowo czynne w postaci jonów obojnaczych są ogólnie pochodnymi alifatycznych czwartorzędowych związków amoniowych w których rodnik alifatyczny może być łańcuchem prostym lub łańcuchem rozgałęzionym i gdzie jeden z alifatycznych podstawników zawiera od około 8 do 18 atomów węgla, a drugi posiada grupę anionową zapewniającą rozpuszczanie w wodzie np. karboksylową, sulfonową lub siarczanową. Przykładami związków odpowiadających tej definicji są: 3-(N,N-dimetylo-N-heksadecyloamonio)-propano-1-sulfonian i 3-(N,N-dimetylo-N-heksadecyloamonio)-2-hydroksypropano-1-sulfonian.

Farmakologia kliniczna

Gdy fitochemikalia z Echinacea i Commiphora (izobaty wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe, wyciągi roślinne i inhibitory drobnoustrojów) zmieszano, połączono i podawano z: substancją powierzchniowo czynną, korzystnie z chlorkiem benzalkonium; składnikiem odżywczym, korzystnie

PL 196 036 B1 kwasem foliowym i jałowym nośnikiem wodnym; wyniki leczenia (cofanie się choroby) HIV i innych chorób infekcyjnych były niespodziewane i zaskakująco dobre, a efektywność leku (drobnoustrojobójcza) dramatycznie wzrosła. Co znaczące, gdy badano in vitro pojedyncze związki wykazywały nieoczekiwaną i zaskakująco dobrą aktywność względem HIV włącznie z hamowaniem absorpcji HIV na komórce docelowej. Gdy badano in vivo podawane miejscowo leki synergistyczne, infekcja Herpes simplex była natychmiast hamowana. Gdy lek synergistyczny badano in vitro, chlorek benzalkonium, będący substancją powierzchniowo czynną, był mniej toksyczny, jego toksyczność mieściła się w zakresie bezpieczeństwa i wykazywał większe działanie hamujące względem HIV i HSV 1i 2. Synergistyczne oddziaływanie i mieszanie fitochemikali Echinacea i Commiphora, kwasu foliowego i substancji powierzchniowo czynnych pokazano i obserwowano przez uwidocznienie gwałtownego rozpuszczania się związków w czasie mieszania i nabywania przez roztwór lekkiej przyczepności wywoływanej poprzez właściwości roztworu. Co więcej chemiczne właściwości fitochemikaliów z Echinacea i Commiphora, substancji powierzchniowo czynnych, składnika odżywczego i nośnika wodnego, zwiększają stabilność i reaktywność co jest użyteczne w leczeniu chorób zakaźnych.

Lek może być użyty w różnych rozcieńczeniach: doustnie, na śluzówkę nosa; tkankę pochwy, tkankę warg, odbytu i tkankę przyodbytową, tkankę prącia, tkankę skórną, korzystnie lek podawany jest doodbytniczo i dopochwowo. Zmieniając stężenie, lek przypuszczalnie może być podawany pozajelitowo. Mogą istnieć przeciwwskazania w stosowaniu leku w przewodach pochwy i odbytu w postaci opatrunku, w kanałach ucha, jako opatrunek okluzyjny, jako opatrunek unieruchamiający lub jako pokarm, bowiem może wtedy powodować podrażnienia i oparzenia chemiczne. Może nie być zalecane użycie leku w leczeniu infekcji wywołanych beztlenowymi grzybami, bowiem grzyby mogą być oporne na leczenie.

Przykłady 1-7

Badania in vivo

W początkowym stosowaniu miejscowym, celem oceny skutków leczenia i działania leku według przedmiotowego wynalazku, przeprowadzono badania in vivo u siedmiu badanych ludzi, wykazujących pozytywny wynik badania względem HSV 1lub 2. Pacjentom podawano miejscowo lek zawierający jako substancję powierzchniowo czynną - chlorek benzalkonium w roztworze wodnym (w stosunku 1:750) w połączeniu ze sproszkowanym ziołowym wyciągiem roślinnym z Echinacea purpurea zawierającym wcześniej wymienione fitochemikalia. Nanoszenie kompozycji przeprowadzano w dwóch etapach, gdzie pierwszy polega na zwilżeniu porażonego obszaru lub pęcherzyków powierzchniowo czynnym chlorkiem benzalkonium w roztworze wodnym przez rozpylanie, wklepywanie lub przy pomocy zakraplacza, a następnie naniesienie warstwy fitochemikaliów na zwilżony obszar przez pędzlowanie lub ręcznie rozsypując proszek na zainfekowany obszar. Ważnym aspektem takiego leczenia jest utrzymywanie całkowitego pokrycia porażonego obszaru w czasie trwania wybuchu choroby. Dlatego, obszar wybuchu choroby utrzymywano pokryty kompozycją leczniczą, a powłokę uzupełniano w miarę potrzeby.

Wśród siedmiu osób na których prowadzono badania, sześć było kobietami, a jedna mężczyzną. Na początki badań mężczyzna miał 38 lat, a kobiety 8, 27, 30, 32, 38 i 39. W ciągu sześciu tygodni wystąpiło dwanaście wybuchów infekcji. Spośród wybuchów choroby, dziewięć stanowiły infekcje genitaliów przez HSV2, a trzy przez HSV1, który wywołał opryszczkę na wargach. 8 letnia dziewczynka i 27 letnia kobieta ujawniły HSV 1 (opryszczkę na wargach). Kobiety w wieku 30, 38 i 39 lat ujawniały HSV 2 (opryszczka genitaliów). 38 latka miał również HSV 1 - opryszczkę na wargach. Mężczyzna ujawniał HSV 2 (opryszczka genitaliów). Wszyscy badani mieli dobrze udokumentowaną historię choroby i mogli określić jej przebieg. By uzyskać obiektywne dane, żadnemu z pacjentów nie udzielono żadnej informacji dotyczącej leczenia doświadczalnego lub jakiegokolwiek działania leku. W powtórnych badaniach, pacjentów poinformowano, że użyte mogło być placebo.

W siedmiu przypadkach związek o działaniu przeciwdrobnoustrojowym nanoszono bezpośrednio na tkankę w stadium zapowiadającym wybuch choroby. W pięciu przypadkach związek przeciwdrobnoustrojowy podawano bezpośrednio na wysypane pęcherzyki. W przypadku gdy było to potrzebne, związek o działaniu przeciwdrobnoustrojowym nanoszono ponownie aby utrzymać pokrycie leczonego miejsca.

Obserwacje: Dla każdego podania leku i każda osoba (badany) informowała o odczuwanym przez kilka sekund mrowieniu. Donosiły również o istniejących różnicach w przyleganiu leku (przeciwdrobnoustrojowego) do pęcherzyk(a)ów na porażonym obszarze. Przyleganie kompozycji do tkanki nabłonkowej pozostaje w pewnym stopniu zachowane nawet po wzięciu prysznica lub spłukaniu powierzchni.

PL 196 036 B1

Wyniki: Wyniki badań przeprowadzonych na 7 osobach z zastosowaniem lekarstwa były nieoczekiwanie zaskakująco dobre i bardzo spójne. W każdym przypadku badani radośnie donosili, że gdy kompozycja (lek) została naniesiona na chory obszar, ból całkowicie ustawał w ciągu 10 do 20 minut, a nigdy wcześniej nic nie mogło uśmierzyć bólu. W siedmiu przypadkach, w których związek (lek) był nanoszony w stadium zapowiadających chorobę, badani informowali o ustawaniu bólu, wszystkie symptomy, które uprzednio nasilały się, aż do pełnego rozwoju choroby zanikły i wybuch choroby nigdy nie nastąpił. Wszystkie zewnętrzne objawy i fizyczne manifestacje wirusa opryszczki zanikły w przeciągu kilku godzin po podaniu leku. W pięciu przypadkach, w których związek (lek) został podany na rozwinięte pęcherzyki, badani donosili o ustaniu bólu w ciągu minut i ustąpieniu uczucia pieczenia, swędzenia i podrażnienia w ciągu dwóch do czterech godzin, pęcherzyki zasychały i zanikały w ciągu dwudziestu jeden godzin. We wszystkich przypadkach, inne poważniejsze objawy osłabiające: gorączka, złe samopoczucie, obrzęk pachwin, sączące się owrzodzenia i bolesne oddawanie moczu ustępowały po podaniu leku.

Ponadto, gdy w celu badania następnych wybuchów choroby, badanych zaopatrzono w zapas kompozycji (leku), informowali oni, że jeśli związek (lek) był podawany zgodnie z instrukcją na etapie zapowiedzi choroby, gdy pojawiły się jej zwiastuny wysyp choroby ulegał całkowitemu zahamowaniu i zanikowi. Co ważne, badani u których kilkakrotnie w ciągu roku występowały wybuchy choroby, donosili również o wydłużeniu się okresu uśpienia wirusa (latencji). Po trzech latach badania, jedna osoba u której przez cztery lata przed użyciem leku ostre wybuchy choroby następowały co miesiąc donosiła, że od chwili zastosowania leku nie miała w ciągu roku wybuchów choroby.

Dodatkowe obserwacje: Mężczyzna poddany badaniom donosił, że po początkowym naniesieniu w czasie fazy zapowiadającej chorobę wziął prysznic i zapomniał nanieść kompozycję (lek) przez około 30 godz.. W konsekwencji pojawiło się kilka pęcherzyków, które zaczęły się zlewać. Badany ponownie naniósł kompozycję (lek), a następnie utrzymywał powierzchnię pokrytą kompozycją. Następnie, wysyp choroby zanikł w ciągu 21 godzin tak jak opisano u innych ludzi.

Kolejna obserwacja wykazuje, że kompozycja (lek) może zostać osłabiona lub stać się mniej skuteczna w obecności określonych białek lub mydeł. Jedna z badanych kobiet, była prawdopodobnie nadgorliwa w myciu chorej powierzchni przed naniesieniem kompozycji (leku). Nastąpiło to w czasie trzeciego wybuchu choroby, po pomyślnym zastosowaniu z kompozycji (leku) w czasie poprzednich dwóch wybuchów choroby. W tym przypadku, po zastosowaniu kompozycji nie zaobserwowała mrowienia i ustąpienia objawów. Minęło około 24 godzin zanim poprosiła o konsultację, a choroba rozwinęła się do pełnej fazy wybuchu pęcherzyków z pełnymi objawami choroby. Została poinstruowana, aby starannie spłukać jakiekolwiek resztki mydła, osuszyć powierzchnię i ponownie nanieść kompozycję (lek). Po wykonaniu instrukcji, poinformowała o pełnym zaniku wybuchu choroby po zastosowaniu kompozycji leczniczej, tak jak to miało miejsce w przypadku dwóch poprzednich wybuchów.

Przykłady 8-13

Badania dermatologiczne i weterynaryjne.

Celem określenia wszelkich możliwych dermatologicznych reakcji alergicznych na działanie kompozycji medycznej (leku) przeprowadzono badania na zwierzętach. Badania przeprowadzono na sześciu zwierzętach. Wśród zwierząt były 3 samice królików (wiek nieznany), dwa psy (1 samica 2 letnia i 1 samiec 9 letni), jeden 3 letni kot - kastrat. W badaniach na zwierzętach, kompozycję (lek) podawano wszystkim zwierzętom we wcześniej opisany sposób na wewnętrzną stronę ucha zewnętrznego. We wszystkich przypadkach, poddany badaniu obszar utrzymywano przykryty związkiem przez dwadzieścia cztery godziny, co odpowiada czasowi jego stosowania u człowieka. Badania przeprowadzone na sześciu zwierzętach wykazały, że nie pojawiły się ślady podrażnień dermatologicznych lub reakcji alergicznych.

Przykład 14

Powyższe lekarstwo zawierające inhibitor wirusowy było również badane w stosunku do brodawek wywołanych przez wirusa brodawczaka na pysku dwuletniego nierasowego wałacha. Brodawki wywołane przez wirusa brodawczaka są trudne w leczeniu. Brodawki miała 25 mm średnicy. Związek drobnoustrojobójczy (lek) podawano dwa razy dziennie. Brodawki mierzono po każdym podaniu leku.

Wyniki: Całkiem niespodziewanie, brodawki uległy dramatycznemu zmniejszeniu w tempie 3 mm dziennie i całkowicie zanikły piątego dnia podawania leku. Zaobserwowano, że na początku rozpadała się powierzchnia brodawki odsłaniając duże rumieniowate grudki. Następnie, co ciekawe, brodawki nie zmniejszały po prostu swojej wielkości przez złuszczanie się lub obieranie, lecz zmniejszały się w miejscu przyczepienia do macierzystego naskórka i odpadały bez pozostawiania blizn.

PL 196 036 B1

W kolejnych związanych z wynalazkiem długookresowych badaniach in vivo, które rozpoczęto z pierwszymi siedmioma osobami w kwietniu 1989 roku i które obecnie trwają 7 lat, stosuje się w uprzednio opisany sposób, różne stężenia lekarstwa leczono około 100 wybuchów infekcji. We wszystkich przypadkach, zaskakująco dobre wyniki były takie same: 1. w ciągu minut zanikał ból; 2. nie następował wybuch choroby gdy kompozycja była podawana w stadium zapowiadającym chorobę; 3. gdy lek podawano w stadium pojawiania się pęcherzyków wybuch choroby cofał się w ciągu dwudziestu jeden godzin.

Badania in vitro

Badania laboratoryjne prowadzone dla określenia in vitro hamującej aktywności kompozycji (leku) podjęto w Clinical Microbiology Laboratories na Uniwersytecie Chicago. Badania laboratoryjne były prowadzone przez dyrektora grupy (dr) i profesora patologii. Badanie in vitro kompozycji leczniczej określanej poniżej jako „lek” zaowocowały zaskakująco dobrymi wynikami. Stwierdzono, że kompozycja wykazuje nieoczekiwanie, zaskakująco doskonałą aktywność hamującą względem HSV 1 i HSV 2. Patolog, który badał „setki innych związków stwierdził, że nie widział nic tak dobrego jak działanie tego związku.

Poniżej opisano badania leku, które przeprowadzono i wyniki, które otrzymano na Uniwersytecie Chicago. Dla ułatwienia interpretacji niektórych danych naukowych i wyników testów, zastosowano poniższe definicje:

„MEM” określa pożywkę minimalną (Minimal Essential Medium.). Pożywka ta jest stosowana do hodowli komórek, na których prowadzone były testy.

„Fibroblast” jest ludzką komórką mezenchymatyczną (komórki występujące w tkance łącznej, krwi, kości, tkance limfatycznej i chrząstkach).

„IC50” określa stężenie hamujące (Inhibitory Concentrate). Dla tego badania jako typową wybrano 50% skuteczność środka. Kolejne wartości wskazują największe rozcieńczenie działające z 50% skutecznością. Co za tym idzie określa punkt końcowy.

Jeśli pole pod rozcieńczeniem pozostawiono niewypełnione wskazuje, że przy danym stężeniu może występować efekt toksyczny, a test mógł nie być wart odczytu lub brak było danych umożliwiających interpretację.

Jeśli obszar pod rozcieńczeniem oznaczono myślnikiem (-) oznacza to, że nie zaobserwowano łysinek, a co za tym idzie z powodzeniem zahamowano (HSV).

P r z y k ł a d y 15-17

W tych badaniach in vitro zastosowano poniższe leki (lekarstwa):

Lek # 1 = powierzchniowo czynny chlorek benzalkonium w roztworze wodnym w stosunku 1:750. Przed użyciem substancja powierzchniowo czynna była filtrowana i rozpuszczana odpowiednią objętością 2X MEM tak by otrzymać rozcieńczenie 1:1500 w 1X MEM.

Lek # 2 = Roztwór wodny proszku z Echinacea (fotochemikalia). Preparat ekstrahowano poprzez ciepłą infuzję w jałowej wodzie. Wyekstrahowane fitochemikalia są przed użyciem wirowane i filtrowane. Przefiltrowane fitochemikalia rozcieńcza się odpowiednią objętością 2X MEM tak aby uzyskać nierozcieńczony preparat w 1X MEM.

Lek # 3 = Proszek z Echinacea (fitochemikalia) ekstrahowano i łączono w procesie zimnej infuzji z powierzchniowo czynnym chlorkiem benzalkonium. Przed użyciem, połączony preparat wirowano, filtrowano i rozcieńczano odpowiednią objętością 2X MEM tak aby uzyskać nierozcieńczony preparat w 1X MEM.

1. Trzy 24-studzienkowe płytki zaszczepiano fibroblastami. Dla śledzenia aktywności przeciwwirusowej badano trzy różne ekstrakty (dla porównania) w pięciu stężeniach, przy czym stężenie rozcieńczeń wynosiło: nierozcieńczony, 1:2, 1:4, 1:8 i 1:16 w 1X MEM. Na każdej płytce znajdowały się cztery studzienki kontrolne zawierające zamiast leku MEM.

2. Pożywkę hodowlaną usuwano ze studzienek i do każdej studzienki znajdującej się w górnej połowie płytki dodawano 200 μΐ HSV-1. HSV-1 był rozcieńczany 1:5000 (2,0 μΐ wyjściowego roztworu HSV-1 w 10 ml MEM). Miano wirusa wynosiło 3x10⁶ na ml. Ponadto, do studzienek znajdujących się w dolnej połowie płytki dodawano 200 μΐ HSV-2. HSV-2 był rozcieńczony 1:2000 (5,0 μΐ wyjściowego ₅ roztworu HSV-2 w 10 ml MEM). Miano wirusa wynosiło 6x10 na ml.

3. Płytki inkubowano w 37°C przez dwie godziny.

4. Inokulum usuwano i do czterech studzienek dodawano 1 ml MEM zawierający Lek #1-3. Stężenie leku w porównaniu do MEM podano poniżej.

PL 196 036 B1

Tabel a 1

Stężenie	nierozcieńczony	1:2	1:4	1:8	1:16
Lek (μΐ)	4000	2000	1000	500	250
MEM (μΐ)	-	2000	3000	3500	3750

5. Wyniki: Zalano roztworem HSV-1. Lek dodano natychmiast po absorpcji wirusa. Płytka 1, Lek # 1 zakażony bakteriami. Brak wzrostu, możliwe szczątki organiczne. Płytka 2, Lek # 2 zakażony bakteriami. Brak wzrostu, możliwe szczątki organiczne. Płytka 3, Lek # 3 Wyniki pokazano poniżej w Tab. 2 i 3.

Tabel a 2-Lek #3 HSV-1. Wyniki testu

Stężenie	nierozcieńczony	1:2	1:4	1:8	1:16
łysinki 54	toksyczny	toksyczny	-	6*	12**
łysinki 42	toksyczny	toksyczny	-	4*	16**
średnio 48				5	14	IC50>1:16

Tabel a 3 -Lek #3 HSV-2. Wyniki testu

Stężenie	nierozcieńczony	1:2	1:4	1:8	1:16
łysinki 46	toksyczny	toksyczny	-	22*	32**
łysinki 49	toksyczny	toksyczny	-	21*	28**
średnio 48				22	30	ICs0>1:8

*nieznaczna toksyczność **bardzo małe łysinki

Komentarze: Badanie lekarstwa (lek # 3) dało znakomite wyniki. Komórki wyglądały dobrze, były pozbawione zanieczyszczeń. Przy małym rozcieńczeniu preparat może być toksyczny dla niektórych komórek. Hamująca aktywność preparatu była nieoczekiwanie skuteczna.

Przykłady 18-20

24-studzienkowe płytki zaszczepiano fibroblastami i następującymi lekami

Badany lek # 1A = Roztwór wodny powierzchniowo czynnego chlorku benzalkonium. Powierzchniowo czynny chlorek benzalkonium przygotowywano przez sporządzenie wodnego rozcieńczenia 1:375 (32 μΐ w 12,0 ml jałowej wody). Roztwór ten filtrowano przed użyciem. Rozcieńczano równą objętością 2X MEM otrzymując rozcieńczenie 1:750 w 1X MEM. Rozcieńczenie wykonano dla zachowania stosunku.

Badany lek # 2A = Roztwór wodny proszku z Echinacea purpurea(fitochemikalia). Preparat ten zawierał 50 mg/ml (300 mg w 6,0 ml wody) proszku z Echinacea purpurea w sterylnej wodzie. Mieszaninę wytrząsano i zamrażano przez czterygodziny. Preparat z proszku Echinaceawirowano przy 3500 obr./min przez 15 min. w 10°C, przed użyciem filtrowano i rozcieńczano równą objętością 2X MEM otrzymując nierozcieńczony preparat w 1X MEM.

Badany lek # 3A = Proszek z Echinacea purpurea rozpuszczony w powierzchniowo czynnym chlorku benzalkonium. Preparat ten był roztworem 50 mg/ml (300 mg w 6,0 ml chlorku benzalkonium 1:375). Mieszaninę wytrząsano i zamrażano przez cztery godziny. Fitochemikalia i substancję powierzchniowo czynną wirowano przy 3500 obr./min przez 15 min. w 10°C, przed użyciem filtrowano i rozcieńczano równą objętością 2XMEM otrzymując nierozcieńczony preparat w 1XMEM.

1. Trzy płytki użyto do przebadania preparatów trzech leków. Do przebadania aktywności przeciwwirusowej stosowano następujące stężenia: 1:2, 1:4, 1:8 i 1:16 w 1XMEM. Na każdej płytce znajdowały się cztery studzienki kontrolne, które niezawierały leku.

2. Pożywkę usuwano ze studzienek i do każdej studzienki z górnej połowy płytki 200 μΐ HSV-1 dodawano. HSV-1 rozcieńczono 1:5000 (2,0 μΐ wyjściowego roztworu HSV-1 w 10 ml MEM). Miano wirusa wynosiło 3x10⁶ na ml.

3. Płytki inkubowano w 37°C przez cztery godziny.

PL 196 036 B1

4. Inokulum usuwano i do czterech studzienek dodawano 1 ml MEM zawierający Lek # 1A-3A. Stężenie leku w porównaniu do MEM podano poniżej.

Tabel a 4

Stężenie	nierozpuszczony	1:2	1:4	1:8	1:16
Lek (μ!)	4000	2000	1000	500	250
MEM (pl)	-	2000	1000	3500	3750

5.Wyniki: Zalano roztworem HSV-1. Lek dodano natychmiast po absorpcji wirusa.

Tabel a 5 Lek# 1A - wyniki badań dla HSV 1

Stężenie	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32
łysinki 70	toksyczny	toksyczny	toksyczny	toksyczny	toksyczny
łysinki 68
łysinki 58
łysinki 74
średnio 70			IC50

Komentarze: w tych studzienkach wokół komórek był delikatny osad. Prawdopodobnie chlorek benzalkonium wytrącał się wraz z białkami pożywki.

Tabel a 6 -Lek # 2A - wyniki badań dla HSV 1

Stężenie	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32
łysinka 72	-	-	-	9*	12*
łysinka 74	-	-	-	7	8
łysinka 79	-	-	-	4	12
łysinka 71	-	-	-	7	11
średnio 70		IC50>1:32

Komentarz: choć występowały łysinki to były one bardzo małe.

Tabel a 7 -Lek # 3A - wynik badań dla HSV 1

Stężenie	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32
łysinki 72	toksyczny	toksyczny	toksyczny	toksyczny	-*
łysinki 68				-
łysinki 67				-
łysinki 70				-
średnio 70			ICS0>1:32

Komentarz: choć stwierdzono pewną toksyczność to ten lek był bardzo skuteczny w hamowaniu wirusów, nie stwierdzono występowania łysinek.

PL 196 036 B1

Przykłady 21-24

Cztery 24-studzienkowe płytki zaszczepiono fibroblastami.

Badany lek # 1B - powierzchniowo czynny chlorek benzalkonium w wodnym rozpuszczalniku. Chlorek benzalkonium przygotowywano rozcieńczając go w wodzie 1:1000 (10 (4,1 w 10,0 ml wody). Uzyskany roztwór filtrowano przed użyciem i rozcieńczano równą objętością 2X MEM, co dawało rozcieńczenie 1:2000 w 1X MEM (500 μ! leku plus 500 pl 2X MEM).

Badany lek # 2B = Roztwór wodny proszku z Echinacea purpurea (fitochemikalia). Preparat był roztworem 50 mg/ml (250 mg w 5,0 ml wody) proszku Echinacea purpurea w jałowej wodzie. Mieszaninę wytrząsano i zamrażano przez cztery godziny. Preparat z proszku Echinacea wirowano przy 3500 obr./min przez 15 min. w 10°C, przed użyciem filtrowano i rozcieńczano równą objętością 2X MEM otrzymując nierozcieńczony preparat w 1X MEM (500 pl leku plus 500 pl 2X MEM).

Badanie leku # 3B = Proszek z Echinacea purpurea (fitochemikalia) rozpuszczony w powierzchniowo czynnym chlorku benzalkonium. Preparat był roztworem 50 mg/ml (250 mg w 5,0 ml chlorku benzalkonium 1:1000). Mieszaninę wytrząsano i zamrażano przez cztery godziny. Preparat z proszku Echinacea wirowano przy 3500 obr./min przez 15 min. w 10°C, przed użyciem filtrowano i rozcieńczano równą objętością 2X MEM otrzymując nierozcieńczony preparat w 1X MEM (500 pl leku plus 500 pl2X MEM).

Badanie leku # 4B = Proszek Echinacea purpurea (fitochemikalia) w roztworze wodnym (rozcieńczalnik), następnie zmieszany z powierzchniowo czynnym chlorkiem benzalkonium w stosunku 1:1000. Preparat był roztworem proszku z Echinacea purpurea 50 mg/ml (250 mg w 5,0 ml w 5,0 ml wody) w jałowej wodzie. Mieszaninę wytrząsano i zamrażano przez cztery godziny. Wodny roztwór fitochemikaliów wirowano przy 3500 obr./min przez 15 min. w 10°C i filtrowano przed użyciem. Dla otrzymania mieszaniny Echinacea-chlorek benzalkonium preparat rozcieńczano równą objętością chlorku benzalkonium 1:1000. Mieszaninę rozcieńczano równą objętością 2X MEM otrzymując nierozcieńczony preparat w 1XMEM (500 pl leku # 1i 250pl leku # 2 plus 500 pl2XMEM).

1. Cztery płytki użyto dla przebadania preparatów czterech leków. Stężeniami potrzebnymi do przebadania aktywności antywirusowej były: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 i 1:320 w 1X MEM. Na każdej płytce znajdowały się cztery kontrolne studzienki zawierające MEM bez leku.

2. Pożywkę usuwano ze studzienek i 200 pl HSV-1 dodawano do studzienek z dwóch górnych rzędów płytki. HSV-1 rozcieńczono 1:5000 (2,0 pl wyjściowego roztworu HSV-1 w 10 ml MEM). Miano wirusa wynosiło 3x10⁶ na ml. Dodawano również 200 pl HSV-2 do studzienek z dwóch dolnych rzędów płytki. HSV-1 rozcieńczono 1:2000 (5,0 pl wyjściowego roztworu HSV-2 w 10 ml MEM). Miano wirusa wynosiło 6x10⁵ na ml.

3. Płytki inkubowano w 37°C przez cztery godziny.

4.Inokulum usuwanoi do czterech studzienek dodawano1ml MEM zawierający lek # 1-4

Tabela 8

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
Lek (pl)	400	200	100	50	25
MEM (pl)	3600	3800	3900	3950	3975

5.Wyniki: zalano roztworem HSV-1. Lek dodano natychmiast po absorpcji wirusa.

Tabela 9 -Lek # 1B - wynik badań dla HSV 1

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
łysinki 37	toksyczny	toksyczny	toksyczny	toksyczny	15?*
łysinki 45					18?*
średnio 41				IC50

Komentarz: nieznacznie toksyczne, badania były trudne do odczytania. Zalano roztworem HSV-2. Lek dodano natychmiast po absorpcji wirusa.

PL 196 036 B1

T ab el a 10 -Lek # 1B wynik badań dla HSV 2

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
łysinki 38	toksyczny	toksyczny	toksyczny	toksyczny	21
łysinki 42					17
średnio 40					19	IC5O>1:320

Komentarz: badania były zbyt toksyczne, aby dać dobry odczyt.

T ab el a 11 -Lek # 2B wyniki badań dla HSV 1

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
łysinki 39	2*	8*	23*	24	44
łysinki 40	3	18	11	28	38
średnio 40	3	13	17	26		IC50>1:80

Komentarz: małe łysinki

T ab el a 12 -Lek # 2B - wyniki badań dla HSV 2

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
łysinki 48	21	33
łysinki 52	22	38
średnio 50	21,5	35,5				ICsq>1: 20

T ab el a 13 -Lek # 3B - wyniki badań dla HSV 1

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
łysinki 44	1*	17	31	37
łysinki 46	-	16	28	27
średnio 45	-	17	30	32		ICsq>1:40

Komentarz: choć występowała pewna toksyczność to lek był bardzo skuteczny, łysinki nie występowały.

T ab el a 14 -Lek # 3B - wyniki badań dla HSV 2

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
kilka komórek	11*	27	30	35
łysinki 44	10	32
średnio 44	11	29,5				ICsq>1:80

Komentarz: test trudny dla naprawdę dobrego odczytu. Jakkolwiek lek skutecznie hamuje aktywność.

PL 196 036 B1

Tabel a 15 -Lek # 4B - wyniki badań dla HSV 1

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
łysinki 47	toksyczny	toksyczny	toksyczny	33
łysinki 48			28
średnio 48			30			IC50>1:80

Komentarz: Zbyt toksyczny przy wysokim stężeniu. Pomimo tego obserwowano aktywność hamującą przy 1:320.

Tabel a 16 -Lek #4B - wyniki badań dla HSV 2

Stężenie	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
łysinki 38	toksyczny	toksyczny	toksyczny	2*	16
łysinki 40				4	20
średnio 39				3	18	ICs0>1:640

Komentarz: toksyczność prawdopodobnie zależna od chlorku benzalkonium. Lek przy rozcieńczeniu 1:320 wykazuje bardzo silne działanie hamujące.

W testach in vitro z Przykładów 21-24 używano surowych materiałów, które nie były oczyszczane. Niezależnie od tego badania wykazały zaskakująco dobre hamowanie aktywności wirusów i prawdopodobnie efekt synergistyczny składników.

W przeprowadzonych badaniach in vitro Leki # 3, 3A i 3B stanowiły fitochemikalia wyekstrahowane z Echinacea purpurea połączone z powierzchniowo czynnym chlorkiem benzalkonium, przy czym otrzymane lekarstwo wykazało większą aktywność przeciwwirusową, a co najbardziej godne odnotowania wykazało synergistyczne działanie składników: Echinacea purpurea i chlorek benzalkonium. Może to prawdopodobnie być wytłumaczone przez wzajemne stabilizowanie się i wzajemne wzmaganie reaktywności składników. Chlorek benzalkonium w synergistycznej mieszaninie wykazuje mniejszą toksyczność, a synergiczna kombinacja (lekarstwo) wykazuje większe działanie antywirusowe, zwłaszcza względem HSV-2.

Badania z HIV

Viracea-1 i Viracea-2 były badane celem oszacowania aktywności przeciw HIV w próbach modelowej ostrej infekcji. Dodatkowe próby przeprowadzono dla oceny zakresu i mechanizmu działania dwóch komponentów.

Viracea-1 i Viracea-2 były dostarczone jako roztwory. Przygotowanie obejmuje filtrowanie roztworu i wirowanie. Najwyższe testowane stężenia stosowane w każdym oznaczeniu były rozcieńczeniami 1:5 do 1:100 przygotowanymi w pożywce do hodowli komórkowych. Każdy ze składników przed użyciem był przechowywany w 70°C. We wspomnianych testach użyto następujące leki (kompozycje).

Przygotowanie i ocena linii komórkowych i roztworów podstawowych wirusa.

Do oznaczenia składników wybrano komórki linii CEM-SS. Komórki te są wysoce wrażliwe na zarażenie HIV, szybko tworzą wielojądrowe syncytia i w końcu są zabijane przez HIV. Komórki są łatwo utrzymywane (2-7 x 10³ komórek na ml) w pożywce RPMI 1640 dla hodowli tkankowych uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, glutaminą i antybiotykami. Komórki pasażowano dwukrotnie w ciągu tygodnia rozcieńczając je 1:20. Każdego tygodnia odnotowana jest liczba pasaży, a komórki są odrzucane po dwudziestu tygodniach pasażowania, a nowe komórki CEM-SS rozmrażane i wykorzystywane do oznaczeń. Przechowywane w kolekcji komórki CEM-SS znajdują się w płynnym azocie w 1 ml fiolkach typu NUNC w 90% płodowej surowicy cielęcej i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Po rozmrożeniu i 2 tygodniach hodowli, komórki CEM-SS są rutynowo gotowe do wykorzystania w pierwszych oznaczeń przesiewowych. Przed zastąpieniem starej pasażowanej linii komórkowej, nowe komórki CEM-SS są badane zgodnie z protokołem, przy wykorzystaniu obecnie stosowanej zawiesiny wirusów i AZT. Jeśli dla nowych komórek zakażalność wirusa jest znacząco odmienna lub jeśli AZT wydaje się mniej aktywny niż oczekiwano, to nowe komórki nie są wprowadzane do badań przesiewowych. Dla wszystkich linii komórkowych rutynowo przeprowadzany jest test z mykoplazmą (patrz powyżej).

PL 196 036 B1

Pule wirusów są przygotowywane i mianowane w komórkach CEM-SS, umieszczane w 5 ml roztworu i zamrażane w -135°C. Po rozmrożeniu niewykorzystane wirusy są odrzucane dla uniknięcia zmian w ich zakażalności. Oznaczenie optymalizujące wykazało spadek zakażalności wirusa o logarytmiczny rząd wielkości po jednym cyklu zamrożenia-rozmrożenia i mniej drastycznie po kolejnych cyklach zamrożenie-rozmrożenie. Pule wirusów są przygotowywane przez ostrą infekcję 5x10⁵ komórek CEM-SS przez HIV w objętości 200 μΙ przy wielokrotności infekcji ustalonej tak aby wszystkie komórki były zabite w 7 dni po infekcji (około 0,05 dla izolatu HIV-1 llle i 0,01 dla izolatu HIV-1 RF). Infekcję prowadzono przez jedną godzinę w 37°C a następnie komórki przenoszono do butelki T25, a objętość zwiększano do 2 ml. W 1 dniu po infekcji objętość zwiększano do 5 ml, a w dniu 2 objętość zwiększano do 10 ml. Począwszy od dnia 4 komórki zbierano i łączono, zachowywano nadsącze, a komórki ponownie przeprowadzano w zawiesinę w świeżej 10 ml porcji pożywki do hodowli tkankowych. Codzienna, całkowita wymiana pożywki, zamiast pozostawiania komórek w pożywce przez dłuższe okresy, umożliwia umknięcie zubożenia inokulum wirusa stosowanego w pierwszym przesiewie z substancji odżywczych, gdy jest ono stosowane do zakażenia komórek. Zastosowana reakcja barwienia (XTT) wymaga by stężenie glukozy pozostawało wysokie. Studzienki zubożone w glukozę przez wzrost komórek nie pozwalają na metaboliczne przekształcenie barwnika tetrazolowego w produkt formazonowy.

Wolne od komórek nadsącze zebrane w 4, 5, 6 i 7 dniu hodowli zachowywano. Nadsącze zebrane w kolejnych dniach przechowywano niezależnie dla określenia miana wirusów. Oznaczenie miana obejmuje oznaczenie aktywności odwrotnej transkryptazy, miareczkowanie do punktu końcowego lub oznaczenie liczby łysinek (CEM-SS) i obliczenie kinetyki uśmiercania komórek. Określono, że najwięcej zakażających wirusów wytwarzają ostro zarażone komórki gdy ich żywotność spada do poziomu 50%. Podczas gdy początkowe oznaczenie przesiewowe ocenia efekt ochronnego działania związku przez jego zdolność do hamowania indukowanego przez HIV efektu cytopatycznego, to liczba wirusów wymagana do zabicia komórek CEM-SS w ciągu 6 dni jest rutynowo wykorzystywana do określenia liczby wirusów, która powinna być dodawana do studzienki w przy wykorzystaniu protokołu pierwszego badania przesiewowego XTT poprzez wykonywanie dwukrotnych rozcieńczeń wirusów o dwa rzędy, począwszy od najwyższego stężenia badanego, równego 50 μl wirusa. Dla oznaczenia dokładnej liczby wirusów, wymaganej dla zabicia w każdej studzience komórek CEM-SS stosowano barwienie XTT, a oznaczoną minimalną ilość wykorzystywano dla przeprowadzenia wszystkich testów pierwotnych. Identyczne sposoby wykorzystywano w czasie przygotowywania wszystkich wykorzystywanych w laboratorium izolatów wirusowych włącznie z laboratoryjnymi pochodnymi szczepów HIV-1, HIV-2 i STV. Wykorzystywane kliniczne izolaty są pasażowane przez świeże komórki ludzkie, a sposoby hodowania tychkomórek i uzyskiwania pul wirusów opisano poniżej.

Oznaczenie aktywności przeciwwirusowej przez mikromiareczkowanie z wykorzystaniem XTT.

Przygotowanie komórek.

Celem zastosowania w oznaczeniu, komórki ludzkie CEM-SS lub inne, stosowane w tych doświadczeniach, ustabilizowane linie komórek ludzkich pasażowano w kolbach T-150. W dniu poprzedzającym oznaczenia, komórki rozdzielano w proporcjach 1:2, aby mieć pewność, że w momencie infekcji będą znajdowały się w eksponencjalnej fazie wzrostu. W dniu oznaczenia komórki dwukrotnie przemywano pożywką do hodowli tkankowej i ponownie przeprowadzane w zawiesinę w świeżej pożywce do hodowli tkankowych. Całkowitą liczbę komórek i ich żywotność określano przy pomocy hemacytometru i wykluczania przy barwieniu błękitem trypanowym. W przypadku komórek używanych w oznaczeniach ich żywotność była większa niż 95%. Komórki osadzano i przeprowadzano w zawiesinę, tak aby stężenie wynosiło 2,5 x 10⁴ komórki na ml pożywki do hodowli tkankowej. Komórki dodawano do płytek zawierających lek w ilości 50 pl.

Przygotowanie wirusa.

W pomieszczeniu z zabezpieczeniami biologicznymi wstępnie oznaczony roztwór wirusa wyjmowano z zamrażalnika (-80°C) i pozwalano mu powoli się rozmrozić. Wirus ponownie przeprowadzano w zawiesinę i rozcieńczano pożywką do hodowli tkankowych, tak, że liczba wirusów dodawanych w objętości 50 pl do każdej studzienki była liczbą zdolną zabić wszystkie komórki w 6 dniu po infekcji. Ogólnie, pule wytwarzane przez izolaty HIV IIIB wymagały dodania do studzienki 5 pl wirusa. Pule wirusa RF były pięć do dziesięciokrotnie bardziej aktywne, i wymagały dodania do studzienki 0,5-1 pl. Obliczenie TCID50 dla komórek CRM-SS przez miareczkowanie do punktu końcowego wykazało, że zwielokrotnienie zarażenia wynosiło w tym oznaczeniu 0,005-2,5.

PL 196 036 B1

Wielkość płytek.

Ujednolicone płytki testowe zawierały studzienki kontrolne dla komórek (tylko z komórkami) i studzienki kontrolne dla wirusa (komórki plus wirus), studzienki kontrolne dla określenia toksyczności leku (tylko komórki plus lek), studzienki kontrolne dla kolorymetrycznego pomiaru leku (tylko lek) jak również studzienki eksperymentalne (lek plus komórki plus wirus).

Przykłady 25-48

Barwienie XTT płytek do badań przesiewowych.

Po 6 dniach inkubacji w 37°C w inkubatorze w atmosferze 5% CO2, płytki testowe analizowano barwiąc je barwnikiem tetrazolowym XTT. XTT-tetrazol jest metabolizowany w metabolicznie aktywnych komórkach przez enzymy mitochondrialne do produktu, którym jest rozpuszczalny formazan, co pozwala na szybką analizę ilościową aktywności hamującej indukowanej przez HIV śmiertelności komórek badanych substancji wykazujących działanie przeciw-HIV. W szóstym dniu po infekcji płytki wyjmowano z inkubatora i obserwowano. Użycie okrągłodennych płytek do oznaczeń, pozwoliło na szybką makroskopową analizę aktywności użytych w teście związków przez ocenę wielkości osadu. Wyniki obserwacji makroskopowych potwierdzono i uwiarygodniono przez dalszą analizę mikroskopową. Roztwór XTT był przygotowywany jedynie jako roztwór wyjściowy w PBS o stężeniu 1 mg/ml. Przygotowywano roztwór metylosulfonianu fenazyny (PMS) o stężeniu 15 mg/ml w PBS, po czym przechowywano w ciemności w -20°C, roztwór wyjściowy XTT/PMS przygotowywano bezpośrednio przed użyciem rozcieńczając PMS 1:100 w PBS i dodając XTT w ilości 40 μl na 1 ml roztworu. Do każdej studzienki dodawano pięćdziesiąt mikrolitrów XTT/PMS i płytki ponownie inkubowano przez 4 godz. w 37°C. Po zaklejeniu płytek taśmą klejącą, którą użyto zamiast wieczka, płytki obracano kilkukrotnie, aby wymieszać powstały rozpuszczalny formazan, a następnie płytki odczytywano spektrofotometryczme przy 450 nm stosując urządzenie do odczytywania płytek z Molecular Devices Vmax. Wykorzystując procentową wielkość redukcji CPE, obliczono % przeżycia komórek, IC25, 50 i 95, TC25, 50 i95 i inne wskaźniki.

Tabel a 17

Wyniki oznaczenia XTT in vitro przeciwwirusowej aktywności dla Viracea 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
		Tło odczynników					Tło tworzywa sztucznego
0,169	0,160	0,160	0,159	0,154	0,167	0,066	0,063	0,058	0,061	0,063	0,067
Toks.	cc/vc		Wysokie stężenie doświadczalne		Toks.	Toks.	Niskie stężenie doświadczalne	cc/vc	Toks.
1,498	1,461	0,196	0,378	0,278	1,466	1,474	0,204	0,211	0,208	1,517	1,511
1,392	1,461	0,192	0,196	0,293	1,414	1,479	0,205	0,247	0,185	1,496	1,497
1,333	1,462	0,318	1,410	1,372	1,356	1,482	0,242	0,182	0,215	1,478	1,519
1,208	0,219	1,134	1,181	1,110	1,206	1,487	0,219	0,208	0,215	0,189	1,512
1,032	0,193	0,940	0,828	0,968	0,944	1,480	0,192	0,207	0,254	0,309	1,506
0,656	0,222	0,596	0,582	0,544	0,572	1,464	0,206	0,254	0,186	0,184	1,468
	Tło kolorymetryczne - wysokie stężenie			Tło kolorymetryczne	- niskie stężenie
0,289	0,182	0,168	0,171	0,166	0,167	0,163	0,173	0,172	0,166	0,164	0,180

T a b e l a 18 Viracea 1

STRN RF

Odczynnik	0,62	Lek Viracea 1	25%	50%	95%
Studzienki kontrolne dla wirusów	0,058	TC	1:66	1:18,5	1:10
Studzienki kontrolne dla komórek	1,312	IC	1:625	1:400
Różnica	1,254	Wskaźnik przeciwwirusowy (AJ)	9,47	21,6

PL 196 036 B1

T a b e l a 19

Viracea 1

	Lek Viracea 1	Wartości testu przeciwwirusowego	Wartości testu cytotoksyczności
	rząd na	stęż.	średnia	%	średnia	% żywych	Studzienki kontrolne
	czerwonego	dla pomiaru kolorymetrycznego
	płytce	(pm)	O.D.	w wirusowym CPE	O.D.	komórek
W oparciu o wartości	niski B	0,00003	-,030	0%	1,313	100%	0,018
z kolumn	C	0,0001	-,010	0%	1,324	100%	0,003
od 7 do 12 (prawa	D	0,00032	-,0,11	0%	1,334	100%	0,005
strona	E	0,001	-,015	0%	1,328	100%	0,010
płytki)	F	0,0032	-,013	0%	1,321	100%	0,011
	G	0,01	-,006	0%	1,303	99%	0,002
W oparciu o wartości	B	0,032	0,059	5%	1,315	100%	0,006
z kolumn	C	0,1	0,003	0%	1,237	94%	0,005
od 1 do 6 (lewa	D	0,32	0,804	64%	1,173	89%	0,010
strona	E	1	0,915	73%	1,039	79%	0,007
płytki)	F	3,2	0,673	54%	0,807	62%	0,020
	wysoki G	10	0,228	18%	0,326	25%	0,127

T a b e l a 20

Wyniki oznaczenia XTT in vitro przeciwwirusowej aktywności dla Viracea 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
		Tło odczynników					Tło tworzywa sztucznego
0,169	0,163	0,164	0,166	0,160	0,170	0,074	0,072	0,067	0,067	0,067	0,068
Toks.	cc/vc	Wysokie stężenie doświadczalne	Toks.	Toks.	Niskie stężenie doświadczalne	cc/vc	Toks.
1,498	1,421	0,461	0,257	1,170	1,467	1	,501	0,207	0,222	0,214	1,506	1,503
1,321	1,397	1,316	0,209	0,191	1,340	1	,494	0,200	0,202	0,204	1,446	1,487
0,906	1,345	0,249	0,764	0,836	0,956	1	,485	0,227	0,179	0,179	1,453	1,500
0,219	0,256	1,190	0,207	0,210	0,234	1	,493	0,204	0,191	0,228	0,192	1,506
0,168	0,190	0,161	0,161	0,148	0,157	1	,503	0,237	0,195	0,202	0,186	1,501
0,242	0,223	0,238	0,239	0,230	0,242	1	,495	0,201	0,204	0,227	0,189	1,503
	Tło kolorymetryczne	- wysokie stężenie			Tło kolorymetryczne - niskie stężenie
0,258	0,172	0,159	0,165	0,163	0,165	0,165	0,166	0,166	0,171	0,159	0,169

T a b e l a 21

Viracea 2

STRN RF

Odczynnik	0,165	Lek Viracea 1	25%	50%	95%
Studzienki kontrolne dla wirusów	0,041	TC	1:450	1:250	1:100
Studzienki kontrolne dla komórek	1,263	IC	1:900
Różnica	1,222	Wskaźnik przeciwwirusowy (AJ)	2,02

PL 196 036 B1

T a b e l a 22 Viracea 2

	Lek Viracea 2	Wartości testu przeciwwirusowego	Wartości testu cytotoksyczności
	rząd na	stęż.	średnia	%	średnia	% żywych	Studzienki kontrolne
	czerwonego	dla pomiaru kolorymetrycznego
	płytce	(pm)	O.D.	w wirusowym CPE	O.D.	komórek
W oparciu o wartości	niski B	0,00003	0,004	0%	1,335	100%	0,004
z kolumn	C	0,0001	0,002	0%	1,331	100%	-,006
od 7 do 12 (prawa	D	0,00032	-,017	0%	1,321	100%	0,006
strona	E	0,001	0,000	0%	1,332	100%	0,001
płytki)	F	0,0032	0,004	0%	1,336	100%	0,001
	G	0,01	0,005	0%	1,334	100%	0,000
W oparciu o wartości	B	0,032	0,090	7%	1,302	100%	0,000
z kolumn	C	0,1	0,368	30%	1,167	92%	-,002
od 1 do 6 (lewa	D	0,32	0,410	34%	1,764	61%	0,000
strona	E	1	0,002	0%	1,067	5%	-,006
płytki)	F	3,2	-,056	0%	-0,10	0%	0,007
	wysoki G	10	-,063	0%	-0,16	0%	0,093

Przykłady 49-54

Oznaczenie aktywności odwrotnej transkryptazy.

Wykorzystano reakcję mikromiareczkowania opartą na aktywności odwrotnej transkryptazy (RT). Trytowany trifosforan tymidyny (NEN) (TTP) rozpuszczono w wodzie destylowanej przy 5 Ci/ml. Roztwory poli rA i oligo dT przygotowano jako roztwory wyjściowe, przechowywane w -20°C. Codziennie przygotowywano świeży bufor do reakcji RT zawierający 125 pl 1M EGTA, 125 pl dH2O, 125pl Triton X-100, 50 pl 1M Tris (pH 7,4), 50 pl 1M DTT i 40 pl 1M MgCl2. Te trzy roztwory mieszano ze sobą w proporcjach 1 część TTP, 2,5 części poli rA:oligo dT, 2,5 części buforu do reakcji i 4 części wody. Dziesięć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej umieszczano w okrągłodennej płytce do mikromiareczkowania po czym dodano 15 pl nadsączu zawierającego wirusa i mieszano je razem. Płytkę inkubowano przez 60 minut w 37°C. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną nakraplano na filtr z włókna szklanego, przemywano 6 razy przez 5 minut 5% buforem fosforanowym, 2 razy przez 1 minutę wodą destylowaną, 2 razy przez 1minutę 70% etanolem i suszono. Wysuszone filtry z włókna szklanego umieszczano w plastikowej torebce. Dodawano płynu scyntylacyjnego betaplate i zamykano torebkę na gorąco. Wprowadzoną radioaktywność mierzono stosując licznik scyntylacyjny Wallac Microbeta.

T a b e l a 23

Viracea-1: PBMC/HOJO

Aktywność odwrotnej transkryptazy

Stężenie	1:0	1:100,000	1:32,000	1:10,000	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	28139	31490	35838	42526	39967	38024	20042	12715	415	1742
Próbka 2	24587	35989	35757	32780	34191	25895	16677	7587	12495	12513
Próbka 3	32527	34334	34782	31899	43755	34038	28838	10896	4251	7551
Próbka 4	28418	33938	35459	35768	39304	32652	21852	10399	5720	7269
% VC	100,0	119,4	124,8	125,9	138,3	114,9	76,9	36,6	20,1	25,6

PL 196 036 B1

T a b e l a 24 Viracea-1: PBMC/ROJO

Wartość toksyczności
Stężenie	1:0	1:100,000	1:32,000	1:10,000	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	2,029	2,167	2,200	2,137	1,975	2,025	0,966	0,764	0,840	1,033
Próbka 2	2,120	2,234	2,169	2,203	2,263	1,895	1,009	0,696	0,916	1,058
Próbka 3	1,879	2,176	2,160	2,053	2,038	1,847	0,916	0,734	0,768	1,128
Próbka 4	2,009	2,192	2,176	2,131	2,092	1,922	0,964	0,731	0,841	1,073
% VC	100,0	109,1	108,3	106,1	104,1	96,7	48,0	38,4	41,9	53,4

T a b e l a 25 Viracea-2: PBMC/ROJO

Aktywność odwrotnej transkryptazy

Stężenie	1:0	1:100,000	1:32,000	1:10,000	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	28139	31734	36488	34880	31240	2287	7436	463	96	38
Próbka 2	24587	27559	33120	23103	33408	20550	9478	265	103	81
Próbka 3	32527	24114	23828	28137	23174	25825	11132	309	77	55
Próbka 4	28418	27802	31145	26677	29274	16221	9349	346	92	58
% VC	100,0	97,8	109,6	100,9	103,0	57,1	32,9	1,2	0,3	0,2

T a b e l a 26 Viracea-2: PBMC/ROJO

Wartość toksyczności
Stężenie	1:0	1:100,000	1:32,000	1:10,000	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	2,029	1,547	1,460	1,488	1,345	1,354	0,860	0,546	0,429	0,611
Próbka 2	2,120	1,503	1,548	1,622	1,902	1,489	0,971	0,529	0,434	0,627
Próbka 3	1,879	1,364	1,463	1,720	1,649	1,223	0,772	0,451	0,433	0,633
Próbka 4	2,009	1,471	1,490	1,610	1,632	1,355	0,868	0,509	0,432	0,624
% VC	100,0	73,2	74,2	80,1	81,2	67,5	43,2	25,3	21,5	31,0

ELISA

Zestawy do testu ELISA otrzymano z firmy Coulter. Oznaczenie przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Dla określenia rozcieńczenia próbki wymaganego dla oznaczenia ELISA, przed analizą ELISA wykonywano rutynowe oznaczenie aktywności odwrotnej transkryptazy i wartość radioaktywności wprowadzonej przy zastosowaniu oznaczenia RT. Aby dokładnie określić w każdej próbce ilość białek kapsydu dla każdego oznaczenia przygotowano krzywe kontrolne. Dane uzyskiwano przez pomiar spektrofotometryczny przy 450 nm przy pomocy czytnika płytek Molecular Devices Vmax. Stężenie P24 obliczano z wartości gęstości optycznej stosując zestaw oprogramowania Soft Max z firmy Molecular Devices.

Cząstki zakażające

Ilość zakażających cząstek wirusa oznaczano używając testu łysinkowego z komórkami CEM-SS i ilościowego oznaczenia zakażania dla HIV-1 i HIV-2. Płaskodenne 96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania pokrywano przez 2 godz. w 37°C przez 50 μl poli-L-lizyny. Następnie studzienki przemywano PBS i umieszczano w nich 2,5 x 10⁵ komórek CEM-SS, które przytwierdzały się do dna płytki. Dodawano wystarczająco dużo komórek, aby w każdej studzience utworzyły monowarstwę komórek CEM-SS. Dodawano nadsącz zawierający wirusa z każdej studzienki z fazy XTT, włącznie

PL 196 036 B1 ze studzienkami kontrolnymi wirusami i komórek, i każdą serią rozcieńczeń badanej substancji. W 4 dniu po infekcji w płaskodennych studzienkach 96 studzienkowej płytki do mikromiareczkowań oznaczono liczbę komórek syncytialnych, a do analizy stosowano odwrócony mikroskop Olympus CK2. Każda komórka syncytialna powstała w wyniku zarażenia pojedynczym wirionem HIV.

Aktywność przeciw-HIV w świeżych komórkach człowieka: oznaczenie w świeżych ludzkich limfocytach T.

Z krwi honorowego dawcy z Czerwonego Krzyża, która była seronegatywna z uwagi na HIV i HBV, izolowano świeże ludzkie limfocyty z krwi obwodowej (PBL). Leukoforetyczną krew rozcieńczano 1:1 roztworem soli buforowany buforem fosforanowym Dulbecco (PBS) nałożonym na 14 ml gradientu gęstości z Ficoll-Hypaque umieszczonego w 50 ml probówce wirówkowej. Następnie probówkę wirowano 30 minut przy 600 X g. Tworzące prążek PBL były delikatnie zbierane z powstałej interfazy i następnie płukane 2 razy przy pomocy PBS i wirowania przy niskich obrotach. Po ostatecznym płukaniu komórki różnicowano błękitem tryptanowym i zliczano, a następnie ponownie przeprowadzano w zawiesinę przy stężeniu 1 x 10⁷/ml w RPMI 1640 z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminą, 4 pg/ml PHA-P i inkubowano w 37°C przez 48-72 godzin. Po inkubacji, PBL wirowano i ponownie przeprowadzano w zawiesinę w RPMI 1640 z 15% FBS, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny, 10 pg/ml gentamycyny i 20 U/ml zrekombinowanej ludzkiej IL-2. PBL były utrzymywane w pożywce w stężeniu 1-2x10^-6/ml, którą zmieniano co dwa tygodnie, aż do użycia w teście.

Dla oznaczenia PBL, zebrano i połączono komórki pobudzane PHA-P pochodzące od dwóch dawców, które umieszczono w świeżej pożywce tak, aby ich stężenie wynosiło 2 x 10^-6 pg/ml i umieszczano w wewnętrznych studzienkach 96 studzienkowej płytki do mikromiareczkowań po 50 pg/studzienkę. Przygotowano 2 x stężone preparaty leku w probówkach dla mikromiareczkowania, a następnie każde ze stężeń umieszczano w typowym układzie w odpowiedniej studzience. W każdej studzience, w której prowadzono oznaczenia umieszczano 50 pl pierwotnego rozcieńczenia wirusa. Jako grupę kontrolną, wirusa używano studzienki w których znajdował się jedynie wirus lub komórki. Dla badania cytotoksyczności leku testem XTT przygotowywano identyczny zestaw bez wirusa.

W typowym oznaczeniu PBL (MOI:0,2) test kończy się w 7 dniu kiedy dla oznaczenia aktywności odwrotnej transkryptazy zbiera się wolny od komórek nadsącz. W oznaczeniach niskiego MOI PBL (MOI: 0,02) niezależne próbki nadsączu zbierano w 6, 11 i 14 dniu po infekcji, a następnie badano aktywność RI. Trytowany trójfosforan tymidyny (NEN) (TTP) przeprowadzano w zawiesinę w wodzie destylowanej przy 5 Ci/ml. Roztwory poli rA i oligo dT przygotowywano jako roztwory wyjściowe, przechowywane w -20°C. Codziennie przygotowywano świeży bufor do reakcji RT zawierający 125 pl 1M EGTA, 125 pl dH2O, 110 pl SDS, 50 pl 1M Tris (pH 7,4), 50 pl 1M DTT i 40 pl 1M MgCl2. Te trzy roztwory mieszano ze sobą w proporcjach 2 części TTP, 1część poli rA:oligo dT, 1 część buforu do reakcji. Dziesięć mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej umieszczano w okrągłodennej płytce do mikromiareczkowania, po czym dodawano 15 pl nadsączu zawierającego wirusa i mieszano je razem. Płytkę inkubowano przez 60 minut w 37°C w łaźni wodnej zabezpieczywszy ją przed zanurzeniem. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną nakraplano na filtr z bibuły DE81, przemywano 5 razy przez 5 minut 5% sodowym buforem fosforanowym, 2 razy przez 1 minutę wodą destylowaną, 2 razy przez 1 minutę 70% etanolem i suszono. Do każdej próbki dodawano Opti-Fluor O, a wprowadzoną radioaktywność mierzono stosując licznik scyntylacyjny Wallac 1450 Microbetaplus.

Wprowadzoną trytowaną tymidynę oznaczano w równolegle prowadzonych hodowlach w 7 dniu. Do każdej studzienki dodawano w postaci pulsu 1 pCi trytowanej tymidyny, a komórki zbierano po 18 godzinach na filtr z włókna szklanego używając urządzenia Skatron do zbierania komórek. Filtr suszono umieszczano w fiolce scyntylacyjnej z 1 ml koktajlu scyntylacyjnego, a wbudowana radioaktywność była mierzona w liczniku scyntylacyjnym Packard Tri-Carbh 1900 TR.

P r zyk ł a dy 55-78

Aktywność przeciw-HIV w świeżych komórkach człowieka: oznaczenie w świeżych ludzkich monocytowych makrofagach.

Dla izolacji komórek zdolnych do przylegania, 3 x 10⁶ nie stymulowanych PHA komórek z krwi obwodowej człowieka przeprowadzano w zawiesinę w buforowanym roztworze soli Hanks z wapniem i magnezem uzupełnionym 10% ludzką surowicą AB. Komórki umieszczano w 24 studzienkowej płytce do mikromiareczkowania i pozostawiano na 2 godziny w 37°C. Nieprzylegające komórki usuwano przez sześciokrotne intensywne płukanie. Przylegające komórki hodowano przez 7 dni w pożywce dla hodowli tkankowych RPMI 1640 z 15% płodową surowicą bydlęcą. W czasie inkubacji hodowlę starannie

PL 196 036 B1 sprawdzano z uwagi na łączenie się komórek. Komórki infekowano monocytotropowymi szczepami wirusa HIV-1 - BaL lub ADA i odpowiadającymi im wrażliwymi na AZT lub AZT opornymi izolatami wirusów. Każdy z powyższych izolatów wirusów otrzymano z NLAID AIDS Research and Reference Reagent Program. Pule tych wirusów charakteryzujące się wysokim mianem zbierano z hodowli zainfekowanych, wykazujących przyczepność komórek z obwodowej krwi człowieka i zamrażano w 1,0 ml porcjach w -80°C. Warstwy komórek monocytów-makrofagów infekowano przy MOI 0,1. Związki przeznaczone do badanych w mono warstwach infekowano przy MOI 0,1. Dla polepszenia identyfikacji związków aktywnych, związki badane w teście wykorzystującym monocyty-makrofagi, dodawano do warstwy komórek krótko przed infekcją.

W dwa dni po infekcji pożywkę odsączano, a hodowlę, celem usunięcia nadmiaru wirusa, dwukrotnie płukano kompletną pożywką. Dodawano świeżą pożywkę lub pożywkę zawierającą lek o odpowiednim stężeniu, a hodowlę kontynuowano przez następne 5 dni. W 7 dniu po infekcji celem określenia żywotności komórek przeprowadzano testy XTT-tetrazolowy lub różnicowanie błękitem tryptanowym oraz test ELISA dla oznaczenia wytwarzania białka p24 będącegoantygenemz kapsydu wirusa. Zestawy ELISA otrzymano z firmy Coulter. Aby dokładnie określić, w każdej próbce, ilość białek kapsydu dla każdego oznaczenia przygotowano krzywe kontrolne. Dane uzyskiwano przez pomiar spektrofotometryczny przy 450 nm przy pomocy czytnika płytek Molecular Devices Vmax. Stężenie p24 obliczano z wartości gęstości optycznej stosując zestaw oprogramowania Soft Max z firmy Molecular Devices.

T a b e l a 27

Test makrofagowy dla Viracea 1 aktywność P-24 w pg/ml

μM	Grupa kontrolna AZT vs ADA	Rozcieńczenie	Viracea #1 vs ADA
4	20,94	27,07	57,73	1:100	110,1	46,0	78,9
1,28	3,66	11,46	35,99	1:312	145,2	87,3	143,0
0,410	25,96	20,94	27,07	1:976	505,4	126,9	590,1
0,131	28,19	28,19	57,17	1:3051	811,9	98,4	652,5
0,042	34,87	79,47	105,70	1:9536	129,6	1055,0	1106,0
0,013	149,10	279,60	217,70	1:29802	1058,0	1098,0	1266,0
0,004	470,80	660,90	912,30	1:93132	1185,0	1067,0	1195,0
0,0014	919,00	1150,00	678,70	1:291038	1043,0	754,0	1287,0
0,004	1005,00	1252,00	954,10	1:909494	1053,0	1035,0	712,7

T a b e l a 28

Test makrofagowy dla Viracea 2 aktywność P-24 w pg/ml

μM	Grupa kontrolna AZT vs ADA	Rozcieńczenie	Viracea #1 vs ADA
4	8,65	8,65	17,45	1:100	42,19	22,95	34,49
1,28	9,20	6,45	25,15	1:312	4,25	15,25	41,09
0,410	13,60	10,00	16,35	1:976	14,70	17,45	39,44
0,131	53,74	13,60	62,54	1:3051	63,64	26,25	48,79
0,042	82,89	72,44	96,63	1:9536	48,79	570,60	180,80
0,013	175,80	168,70	316,00	1:29802	278,60	243,50	450,80
0,004	914,90	891,20	499,20	1:93132	305,60	599,80	435,90
0,0014	821,90	594,80	983,10	1:291038	548,10	947,90	913,20
0,0004	1097,00	1160,00	1098,00	1:909494	814,80	790,60	820,80

PL 196 036 B1

T a b e l a 29

Test makrofagowy dla Viracea 1 aktywność P-24 w pg/ml

μΜ	Grupa kontrolna AZT vs XTT	Rozcieńczenie	Viracea #1 vs XTT
4	1,947	1,750	2,002	1:100	1,936	1,754	2,089
1,28	2,244	2,021	2,097	1:312	1,835	1,850	1,931
0,410	2,205	2,107	2,144	1:976	2,039	2,007	1,992
0,131	2,067	2,223	2,191	1:3051	2,040	1,710	1,903
0,042	2,357	2,175	2,339	1:9536	2,156	2,057	2,156
0,013	2,506	2,204	2,160	1:29802	2,073	1,573	1,858
0,004	2,372	2,325	2,191	1:93132	2,225	1,978	2,433
0,0014	2,558	2,091	1,884	1:291038	2,037	1,559	2,169
0,0004	2,037	2,389	2,166	1:909494	2,405	2,198	2,275

T a b e l a 30

Test makrofagowy dla Viracea 2 Absorbancyjne badania toksyczności

μΜ	Grupa kontrolna AZT vs ADA	Rozcieńczenie	Viracea vs ADA
4	1,140	0,981	1,427	1:100	1,271	1,244	1,289
1,28	1,692	1,318	0,985	1:312	1,081	1,154	1,393
0,410	1,505	1,258	1,522	1:976	1,073	1,183	1,536
0,131	1,427	1,347	1,043	1:3051	1,482	1,032	1,518
0,042	1,534	1,752	1,720	1:9536	1,031	1,330	1,053
0,013	1,818	1,526	1,363	1:29802	1,344	1,449	1,497
0,004	1,578	1,112	1,034	1:93132	1,024	1,554	1,446
0,0014	1,386	1,350	1,133	1:291038	1,692	1,112	1,411
0,0004	1,451	1,081	1,342	1:909494	1,182	1,163	1,373

T a b e l a 31

Makrofazowe oznaczenie aktywności przeciw-HIV (P24) dla Viracea #2-4

Aktywność P24 (pg/ml)
Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	1366,8	1347	524,1	634,4	457,5	349,9	193,5	138	120,9	46,96
Próbka 2	1366,8	1151	693,8	782,2	321,5	228	271,4	190,2	4,718	96,46
Próbka 3	1366,8	1000	877,9	642,9	507	382,2	136,1	202,1	171,7	92,5
Próbka 4	1366,8	1166,0	695,6	686,5	428,7	320,0	200,3	176,8	99,1	78,5
% VC	100,0	85,3	51,1	50,2	31,4	23,4	14,7	12,9	7,3	5,8

PL 196 036 B1

T a b e l a 32 Viracea #2-4

Wartość toksyczności XRR (absorbancja)

Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	3,293	3,85	3,606	3,787	3,693	3,657	2,927	3,134	3,131	3,393
Rozcieńczenie	3,293	3,005	3,662	3,542	3,685	3,828	3,408	2,833	3,074	3,263
Próbka 1	3,293	3,457	3,648	2,59	2,808	2,558	2,735	2,932	2,892	3,345
Próbka 4	3,293	3,437	3,639	3,306	3,395	3,348	3,023	2,966	3,032	3,334
% CC	100,0	104,4	110,5	100,4	103,1	101,7	91,8	90,1	92,1	101,2

T a b e l a 33

Makrofazowe oznaczenie aktywności przeciw-HIV (P24) dla Viracea #2-5

Aktywność P24 (pg/ml)
Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	1298,2	1350	793,9	1001	515,9	274	196,3	65,8	16,28	3,904
Próbka 2	1298,2	1350	858,6	851	780,4	393,3	102,9	110,2	38,79	16,28
Próbka 3	1298,2	1454	1262	801,2	837,8	396,1	222,2	113,1	42,73	15,72
Próbka 4	1298,2	1384,7	971,5	884,4	711,4	354,5	173,8	96,4	32,6	12,0
% VC	100,0	106,7	74,8	68,1	54,8	27,3	13,4	7,4	2,5	0,9

T a b e l a 34 Viracea #2-5

Wartość toksyczności XTT (absorbancja)

Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	3,139	3,459	3,568	3,567	3,634	3,562	3,134	3,311	3,171	2,974
Próbka 2	3,139	3,018	3,295	3,505	3,533	3,359	2,833	3,313	3,133	2,909
Próbka 3	3,139	3,21	3,261	3,263	3,297	3,051	2,932	2,829	3,151	3,35
Próbka 4	3,139	3,228	3,375	3,445	3,488	3,312	2,966	3,151	3,152	3,078
% CC	100,0	102,9	107,5	109,7	111,1	105,5	91,8	100,4	100,4	98,0

T a b e l a 35

Mikrofazowe oznaczenie aktywności przeciw-HIV in vitro (P24) dla Viracea 1

P24 (pg/mL)
Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	1171,0	712,7	1287,0	1196,0	1266,0	1106,0	652,5	590,1	143,0	78,9
Próbka 2	1171,0	1035,0	754,0	1067,0	1098,0	1055,0	98,4	126,9	87,3	46,0
Próbka 3	1171,0	1053,0	1043,0	1185,0	1058,0	129,6	811,9	505,4	145,2	110,1
Średnio	1171,0	933,6	1028,0	1149,0	1140,7	763,5	520,9	407,5	125,2	78,3
% VC	100,0	79,7	87,8	98,1	97,4	65,2	44,5	34,8	10,7	6,7

PL 196 036 B1

T a b e l a 36 Viracea 1

Wartość toksyczności XTT (absorbancja)

Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	2,275	2,275	2,169	2,433	1,856	2,156	1,903	1,992	1,931	2,089
Próbka 2	2,275	2,198	1,559	1,978	1,573	2,057	1,710	2,007	1,850	1,754
Próbka 3	2,275	2,405	2,037	2,225	2,073	2,156	2,040	2,089	1,835	1,936
Średnio	2,275	2,293	1,922	2,212	1,835	2,123	1,884	2,013	1,872	1,926
% CC	100,0	100,8	84,5	97,2	80,6	93,3	82,8	88,5	82,3	84,7

T a b e l a 37

Makrofazowe oznaczenie aktywności przeciw-HIV in vitro (P24) dla Viracea 2

P24 (pg/mL)
Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	1045,9	820,80	913,20	435,90	450,80	180,80	48,78	39,44	41,09	34,49
Próbka 2	1046,8	790,60	947,90	599,80	243,50	570,60	26,25	17,45	15,25	22,95
Próbka 3	1045,8	814,80	548,10	305,60	276,60	48,79	63,64	14,70	4,25	42,19
Średnio	1045,8	808,7	803,1	447,1	324,3	266,7	46,2	23,9	20,2	33,2
% VC	100,0	77,3	76,8	42,8	31,0	26,6	4,4	2,3	1,9	3,2

T a b e l a 38 Viracea 2

Wartość toksyczności XTT (absorbancja)
Rozcieńczenie	0	1:909494	1:291038	1:93132	1:29802	1:9536	1:3051	1:976	1:312	1:100
Próbka 1	1,439	1,373	1,411	1,446	1,497	1,053	1,518	1,536	1,393	1,289
Próbka 2	1,439	1,163	1,112	1,554	1,494	1,330	1,032	1,183	1,154	1,244
Próbka 3	1,439	1,182	1,692	1,024	1,334	1,031	1,482	1,073	1,081	1,271
Średnio	1,439	1,239	1,405	1,341	1,442	1,138	1,344	1,264	1,209	1,268
% CC	100,0	86,1	97,6	93,2	100,2	78,1	93,4	87,8	84,0	88,1

P r z y k ł a d y 79-90

Oznaczenia hamowania wiązania i fuzji.

Oznaczenia te wykorzystują komórki HeLa-CD4-LTR-e-galaktozydaza które realizują, wywoływaną przez białko tat, transaktywację genu kodującego β-galaktozydazę kierowaną przez promotor długiej powtórzonej sekwencji (LTR) HIV-1. Oznaczenie użyto zarówno dla oceny wiązania zakażającego wirionu do komórek i fuzji komórka-komórka. Zainfekowane komórki tworzą syncytia, które mogą być łatwo policzone po inkubacji z X-gal. Oznaczenie hamowania wiązania HIV wymaga wszczepienia 1x10⁴ komórek HeLa-CD4-LTR-e-galaktoza w objętości 200 pl w płaskodennej 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania. Komórki inkubowano przez noc, pożywkę usuwano i zastępowano 100 pl roztworu o różnym stężeniu ISIS 5320 lub związkiem kontrolnym. Godzinę później do każdej studzienki dodawano pożywkę zawierającą wirusa. Komórki inkubowano przez następną godzinę, a następnie warstwę komórek delikatnie płukano celem usunięcia niezwiązanego wirusa i związku znajdującego się poza komórkami. Po 48 godzinach komórki utrwalano i barwiono X-gal. Pod odwróconym mikroskopem zliczano wielojądrowe niebieskie komórki. W płaskodennej 96 studzienkowej płytce do mikromiareczkowania przeprowadzono również oznaczenie zahamowania fuzji komórka-komórka.

PL 196 036 B1 ₃

Do każdej studzienki dodano komórki (5 x 10³) HeLa-CD4-LTR-galaktooksydaza i przez godzinę przed dodaniem 5 x 10³ HL2/3 komórek (28) inkubowano z badanym związkiem. Komórki inkubowano przez następne 48 godzin, utrwalano i barwiono X-gal. Pod mikroskopem liczono niebieskie komórki syncytialne. Barwienie komórek przeprowadzono przez utrwalenie komórek roztworem 1% formaldehydu i 0,2% aldehydu glutarowego i barwiono utrwalone komórki 4 μΜ, heksacyjanożelazianem potasu, 2 μΜ, MgCl₂ i 0,4% X-gal w PBS. Transaktywację ekspresji β-galaktozydazy śledzono również przez ELISA. Ekstrakt komórkowy przygotowano przez zamrażanie-rozmrażanie, a oznaczenie aktywności β-galaktozydazy wykonano zgodnie z zaleceniami producenta. Wyniki ELISA odczytywano spektrofotometrycznie przy 405 nm używając czytnika do płytek dla mikromiareczkowań Molecular Device Vmax.

Ta b e l a 39

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #1/SK1 liczba niebieskich komórek w studzience

Rozcieńczenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	49,0	10,0	11,0	19,0	4,0	6,0	3,0
Próbka 2	32,0	15,0	10,0	4,0	5,0	5,0	8,0
Próbka 3	59,0	15,0	10,0	5,0	4,0	4,0	4,0
Średnio	46,7	13,3	10,3	9,3	4,3	5,0	5,0
% VC	100,0	28,6	22,1	20,0	9,3	10,7	10,7
STD DEV	29,3	6,2	1,2	18,0	1,2	2,1	5

Ta b e l a 40

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #1/SK1

Procent toksyczności
Rozcieńczenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	1,596	1,574	1,931	1,925	1,34	1,576	1,63
Próbka 2	1,578	1,692	1,734	1,728	2,152	1,633	1,711
Próbka 3	1,66	1,38	1,811	1,646	1,647	1,308	1,545
Średnio	1,612	1,649	1,825	1,768	1,946	1,672	1,629
% żywotności	100,0	96,1	113,2	109,6	120,7	103,07	101,0

Ta b e l a 41

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #2/SK1 liczba niebieskich komórek w studzience

Rozcieńczenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	49,0	26,0	16,0	17,0	10,0	2,0	1,0
Próbka 2	32,0	18,0	16,0	11,0	3,0	2,0	0,0
Próbka 3	59,0	19,0	20,0	14,0	5,0	3,0	1,0
Średnio	46,7	21,0	17,3	14,0	6,0	2,3	0,7
% VC	100,0	45,0	37,1	30,0	12,8	5,0	1,4
STD DEV	29,3	9,3	4,9	6,4	7,7	1,2	1,2

PL 196 036 B1

T a b e l a 42

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #2/SK1

Procent toksyczności
Rozcieńczenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	1441	1,59	1,965	1,972	1,799	1,932	0,829
Próbka 2	1,5	1,543	1,83	1,835	1,897	1,386	0,882
Próbka 3	1,425	1,536	1,839	1,867	2,036	1,615	0,758
Średnio	1,455	1,558	1,875	1,891	1,911	1,644	0,823
% żywotności	100,0	106,9	129,0	130,0	131,3	113,0	56,6

T a b e l a 43

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #1 liczba niebieskich komórek w studzience

Stężenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	38,0	37,0	47,0	37,0	42,0	55,0	18,0
Próbka 2	48,0	34,0	75,0	37,0	37,0	50,0	14,0
Próbka 3	32,0	41,0	48,0	52,0	57,0	64,0	9,0
Średnio	39,3	37,3	56,7	42,0	45,3	56,3	13,7
% VC	100,0	94,9	144,1	106,8	115,3	143,2	34,7
STD DEV	20,5	8,9	40,4	22,0	26,5	18,0	11,5

T a b e l a 44

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #1

Procent toksyczności
Stężenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	1,425	1,951	1,981	1,815	1,796	1,639	1,644
Próbka 2	1,5	1,971	1,983	1,826	1,833	1,845	1,547
Próbka 3	1,441	1,913	1,942	1,835	1,823	1,932	1,644
Średnio	1,455	1,945	1,969	1,825	1,817	1,872	1,612
% żywotności	100,0	133,6	135,3	125,4	124,9	126,6	110,7

T a b e l a 45

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #2 liczba niebieskich komórek w studzience

Stężenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	38,0	64,0	50,0	56,0	40,0	50,0	0,0
Próbka 2	48,0	56,0	77,0	54,0	53,0	54,0	0,0
Próbka 3	32,0	44,0	46,0	42,0	48,0	47,0	0,0
Średnio	39,3	54,7	57,7	50,7	47,0	50,3	0,0
% VC	100,0	139,0	146,6	128,8	119,5	128,0	0,0
STD DEV	20,5	25,6	42,9	19,3	16,7	8,9	0,0

PL 196 036 B1

Ta b e l a 46

Oznaczenie fuzji beta-gal: Viracea #1

Procent toksyczności
Stężenie	0	1:3200	1:1000	1:320	1:100	1:32	1:10
Próbka 1	1,425	1,998	1,87	1,85	1,592	0,956	0,174
Próbka 2	1,5	1,911	1,959	1,904	1,645	0,988	0,174
Próbka 3	1,441	1,976	1,902	1,939	1,623	0,965	0,182
Średnio	1,456	1,962	1,914	1,898	1,620	0,970	0,177
% żywotności	100,0	134,8	131,5	130,4	111,3	56,6	12,1

Oznaczenie miejscowego działania drobnoustrojobójczego

W każdej centralnie położonej płaskodennej studzience 96-studzienkowej płytki do mikromiareczkowania umieszczono 5 x 10 komórek MEI 180 z nabłonka szyjki i inkubowano przez noc. Przewlekle zainfekowane komórki H9 traktowano, przez jedną godzinę, w pożywce kompletnej 200 pg/ml mitomycyny C, starannie płukano i przeprowadzano w zawiesinę przy stężeniu 4 x 10⁵ komórek na ml. Mitomycyna C w zastosowanym stężeniu w ciągu 48 godzin zabijała wszystkie przewlekle zarażone komórki, pozwalając na przeniesienie wirusa do komórek ME-180 co gwarantowało, że na ostateczne oznaczenie ilości wirusa nie będą wpływały przewlekle zarażone komórki. Do każdej studzienki zawierającej MEI 80 komórki dodawano związki przeciwwirusowe i przewlekle zarażone komórki (2 x 10⁴) i inkubowano przez 6 godzin. Po współhodowaniu, monowarstwę komórek dokładnie płukano i dodawano świeżą pożywkę. Celem usunięcia martwych limfocytów pożywkę usuwano dodając świeżą pożywkę w 24 i 48 godzin po infekcji. W 6 dniu po infekcji próbki nadsączu usuwano i dla policzenia ilości wirusa analizowano testem ELISA p24.

Oznaczenie ekspresji CD4.

Określenie wpływu Viracea na ekspresję CD4 przeprowadzono stosując typową technikę cytometrii przepływowej. Przez godzinę w 37°C komórki poddano działaniu Viracea w pożywce dla hodowli tkankowych. W skrócie, przez 60 minut w temperaturze pokojowej 10⁶ komórek CEM-SS inkubowano w obecności lub nieobecności związków. Do komórek dodano przeciwciało monoklonalne przeciwciało przeciw CD4 (20 pl, 3 pg/ml) (Becton-Dickson, San Jose, CA) i inkubowano w 4°C przez 40 min. Następnie komórki dwukrotnie płukano PBS i przeprowadzono w zawiesinę paraformaldehydzie w 1°C i analizowano przy pomocy cytometru przepływowego Becton-DickinsonFACSort.

Synteza makrocząsteczek

Przez 24 godziny komórki CRM-SS hodowano w 37°C w cieplarce w wilgotnej atmosferze CO2, w trzech powtórzeniach, w obecności i nieobecności związku. Po 24 godzinach dodawano 1 pCi [metylo-³H]-tymidyny, [5-³H]-urydyny lub [3,4,5-³H]-leucyny, po czym hodowlę prowadzono przez następne 8 godzin. Komórki przenoszono na filtr z włókna szklanego stosując urządzenie Skatron do zbierania komórek. Filtr szklany płukano destylowaną wodą, umieszczano w fiolce scyntylacyjnej i wprowadzoną radioaktywność mierzono licznikiem scyntylacyjnym Packard Tri-Carb.

Wyniki badań dla HIV

Viracea-1 i Viracea-2 oceniano w teście mikromiareczkowania przeciw-HIV, w którym określano zdolność badanych związków do hamowania replikacji HIV i zależnego od HIV niszczenia komórek. Wykazano, że dla komórek CEM-SS dwa związki są aktywne wobec szczepu RF HIV-1. Viracea-1 hamuje indukowany przez HIV efekt cytopatyczny (IC30) przy rozcieńczeniu 1:400, podczas gdy Viracea-2 wykazuje IC25 przy rozcieńczeniu 1:900 nie osiągając 50% wartości hamowania. Zarówno Viracea-1 jak i Viracea-2 wykazują działanie toksyczne (TC30) względem komórek CEM-SS odpowiednio przy rozcieńczeniach około 1:20 i 1:250. Pozytywny związek kontrolny, ddC, wykazywał oczekiwany poziom aktywności względem wirusa RF.

Viracea-1 i Viracea-2 oceniano z uwagi na ich aktywność na świeżych ludzkich komórkach PBMC infekowanych klinicznymi izolatem HIV ROJO. Ten niskopasażowany izolat, był określony jako wirus wrażliwy na lek (AZR, ddC, newirapina) indukujący powstawanie komórek syncytialnych. Ani Viracea-1 jak i Viracea-2 nie hamowały replikacji tego izolatu przy stężeniach nietoksycznych. Dalszą ocenę związków przeprowadzono na PMBC infekowanych ROJO stosując pobudzanie PBMC przez

PL 196 036 B1

IL2 zamiast wywołanej PHA blastogenezy. Ponownie nie wykryto aktywności poniżej stężeń które hamowały wzrost PBMC. W oznaczeniu tym AZT wykazywał oczekiwany poziom aktywności.

Viracea-1 i Viracea-2 oceniano na ludzkich monocytach-makrofagach zarażonych klinicznym, nisko-pasażowanym izolatem ADA. W oznaczeniach tych, oba preparaty wykazały wysokąaktywność przy czym Viracea-2 był wyraźnie lepszy. Stężenie o 50% skuteczności było równe odpowiednio dla Viracea-1 i Viracea-2 1:4000 i 1:10000. Zarówno badania morfologiczne jak i barwienie XTT-tetrazolem nie wykazały toksycznego działania na monowarstwę monocytów-makrofagów. W oznaczeniu tym, AZT wykazał oczekiwany poziom aktywności.

Stwierdzono, że hamują wiązanie się wirusa do komórek HeLa-CD4-LTR-e-galaktooksydaza wyrażających CD4. Dla obu związków hamowanie wiązania wirusa do komórek docelowych wykrywano odpowiednio dla rozcieńczeń 1:1000 i 1:3200. Żaden ze związków nie wykazywał działania przeciwwirusowego względem fuzji wytwarzających otoczkę komórek HL2/3 z komórkami Viracea-1i Viracea-2 HeLa-CD4-LTR-e-galaktoosydaza. Dla obu związków obserwowano toksyczność przy oznaczeniu fuzji gdzie związek był obecny przez cały czas oznaczenia jak również w oznaczeniu wiązania Viracea-2 gdy związek był obecny jedynie przez 2 godziny. W każdym z tych oznaczeń Chicago Sky Blue i barwniki sulfonowe ujawniały oczekiwany poziom aktywności.

Przy rozcieńczeniu 1:500 (IC30) Viracea-2 zapobiega przekazywaniu wirusa z przewlekle zarażonych limfocytów do linii śródbłonkowych komórek szyjkowych ME180. W oznaczeniu tym nie obserwowano działania toksycznego na komórki ME180. W oznaczeniu lek był obecny tylko przez czas infekcji (4 godz). W oznaczeniu, siarczan dekstranu (kontrola pozytywna, sulfonowany polisacharyd) i dekstran (kontrola negatywna) wykazały oczekiwany poziom aktywności.

Viracea-2 nie ma wpływu na ujawnianie się CD4 na powierzchni komórek.

Zahamowanie wbudowywania tymidyny (DNA), urydyny (RNA) lub leucyny (białko) do cząsteczek o dużej masie cząsteczkowej obserwowano przy rozcieńczeniach większych niż 1:320. Hamowanie syntezy makrocząsteczek było zbieżne z cytotoksycznością związku względem komórek CEM-SS.

Podsumowanie wyników badań dla HIV

Viracea-1i Viracea-2 hamują infekcję HIV w przypadku ustalonych komórek T wykazując wąski indeks terapeutyczny. Viracea-1 i Viracea-2 potencjalnie hamują replikację HIV w monocytachmakrofagach. Viracea-1 i Viracea-2 hamują osadzanie się wirusa na komórkach docelowych nie zapobiegając fuzji zainfekowanych i niezainfekowanych komórek. W oznaczeniu miejscowego działania drobnoustrojobójczego Viracea-2 hamuje przekazywanie wirusa i może być użyteczny w zapobieganiu przekazywania wirusa HIV drogą płciową. Viracea-2 nie ma wpływu na eksponowane na powierzchni komórki CD4.

Zapobieganie i leczenie.

Związki przeciwdrobnoustrojowe stanowią środek drobnoustrojobójczy i lek, które mogą (1) pomóc przy zapobieganiu przekazywania HIV drogą płciową, (2) kontrolować zakażenie HIV i innymi wirusami, (3) niszczyć HIV; (4) wydłużyć okres latencji w zespole nabytego niedoboru odporności immunologicznej (AIDS) u pacjentów będących nosicielami HIV; (5) zmniejszyć ból i ulżyć w cierpieniu pacjentom z HIV; (6) ograniczyć rozprzestrzenianie się infekcji i (7) zapewnić lepsze i bardziej skuteczne leczenie pacjentów z HIV. Leczenie może również spowodować zanik fizycznych objawów infekcji HIV i wirusów Herpes simplex 1 lub 2 (HSV 1 lub HSV 2) lub innych wywołanych przez drobnoustroje chorób zakaźnych. Postępowanie może być zrealizowane przez podawanie ogólnoustrojowe lub wstrzykiwanie, 8-12 razy dziennie, korzystnie 10 razy dziennie, z dwugodzinnymi przerwami, przez kolejnych 10-18, korzystnie dla lepszego wyniku 14 kolejnych dni (dwa tygodnie), wyżej opisanych związków o działaniu przeciwdrobnoustrojowym (lekarstwa) przy pomocy strzykawki do światła odbytnicy(odbytnica, tkanka odbytnicy, odbytu lub tkanki odbytu) lub pochwy (tkanka pochwy) pacjenta zarażonego HIV lub innymi zakaźnymi wywoływanymi przez drobnoustroje chorobami. Dawka, stężenie i ilość związku przeciwdrobnoustrojowego (lekarstwa) może różnić się w zależności od poważności i czasu trwania choroby jak również wieku, płci, wagi, rasy i stanu zdrowia pacjenta. Korzystnie jeśli, przed naniesieniem związku drobnoustrojobójczego (lekarstwa) zarażona powierzchnia będzie spłukana, wymyta tak by usunąć resztki mydła, i wysuszona. Dla leczenia wirusów Herpes simplex 1 lub 2 związek przeciwdrobnoustrojowy może być nanoszony na zarażoną powierzchnię, na przykład na czas 19-24 godzin. Korzystnie, wywołane przez wirusa opryszczki wysypy pęcherzyków będą zanikały w 19-24 godziny, a spowodowane wirusem ubytki będą zaleczone.

PL 196 036 B1

Pomiędzy licznymi korzyściami wynikającymi lekarstwa (kompozycji) będących przedmiotem wynalazku są:

1. wspaniałe leczenie i zapobieganie HIV i innym chorobom zakaźnym.

2. wspaniałe wyniki w uśmierzaniu bóluwywoływanego HIV, infekcjami wirusem Herpes simplex i innymi chorobami wywoływanymi przez drobnoustroje, bez działania toksycznego.

3. doskonała wydajność przy szybkim usuwaniu wybuchów infekcji HIV, wirusa Herpes simplex i innych chorób zakaźnych.

4. ratowanie życia noworodków, dzieci, dorosłych i zwierząt.

5. ograniczenie światowych strat ekonomicznych spowodowanych HIV i innymi chorobami wywołanymi przez drobnoustroje.

6. usuwanie licznych, poważnych zaburzeń emocjonalnych i psychicznych wywołanych przez HIV i opryszczkę.

7. dostępne gotowe składniki.

8. ekonomiczność.

9. bezpieczeństwo.

10. łatwość użycia

11. pewność.

12. skuteczność.

Choć przedstawione i opisane zostały warianty wynalazku i przykłady, zrozumiałym jest, że specjaliści w dziedzinie mogą wprowadzić wiele modyfikacji i zmian jak również przebudować części, składniki i etapy postępowania, sposobu i leczenia bez odchodzenia od formy i treści wynalazku.

Claims (7)

1. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu chorób lub zapobieganiu ich przekazywania drogą płciową, znamienna tym, że zawiera roślinę z gatunku Echinacea purpurea, roślinę wybraną z grupy obejmującej Commiphora myrrha, Commiphora molmol i Commiphora Erythraea oraz dodatek w postaci kwasu foliowego.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że rośliną jest Commiphora myrrha.

3. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu lub zapobieganiu przekazywania drogą płciową wirusa nabytego niedoboru odporności lub innych chorób zakaźnych, znamienna tym, że zawierająca wagowo:

od około 2% do około 90% stężonych fitochemikaliów z Commiphora myrrha, Echinacea purpurea i Echinacea augustifolia;

od około 0,005% do około 0,8% powierzchniowo czynnej czwartorzędowej soli amoniowej będącej chlorkiem benzalkonium jałową wodę będącą rozcieńczalnikiem i nośnikiem dla wspomnianych stężonych fitochemikaliów, a ogólna proporcja jałowej wody do wspomnianych stężonych fitochemikaliów i powierzchniowo czynnych czwartorzędowych soli amoniowych mieści się w zakresie od około 2:1 do około 100:1.

4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera od około 40% do około 60% wagowych Echinacea purpurea, Echinacea augustifolia i Commiphora myrrha, od około 20% do około 60% wagowych jałowej wody, od około 0,02% do około 0,30% wagowych powierzchniowo czynnej soli amoniowej będącej chlorkiem benzalkonium, oraz dodatkowo od około 2% do około 12% wagowych kwasu foliowego.

5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że proporcje Commiphora myrrha do Echinacea purpurea i Echinacea augustifolia mieszczą się w granicach od około 1:2 do około 1:4.

6. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej: choroby wywoływane przez wirus nabytego niedoboru odporności (HIV), wirus opryszczki typu 1, opryszczki typ 2, wirus ospy wietrznej (herpes zoster), wirus cytomegalii, wirus Epsteina-Barra, wirus brodawczaka, wirusową grypę, wirusową grypę rzekomą, choroby wywoływane przez adenowirus, wirus zapalenia mózgu, wirus zapalenia opon, arbowirus, arenawirus, pikornawirusy, koronawirus, wirusy syncytialne, zapalenie tkanki łącznej, choroby wywoływane przez

PL 196 036 B1 gronkowce, paciorkowce, mykobakterie, bakteryjne zapalenie mózgu, bakteryjne zapalenie opon lub choroby wywoływane przez beztlenowe laseczki.

7. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 3 albo 4, albo 5 do wytwarzania leku do leczenia chorób wybranych z grupy obejmującej: choroby wywoływane przez wirus nabytego niedoboru odporności (HIV), wirus opryszczki typu 1, opryszczki typ 2, wirus ospy wietrznej (herpes zoster), wirus cytomegalii, wirus Epsteina-Barra, wirus brodawczaka, wirusową grypę, wirusową grypę rzekomą, choroby wywoływane przez adenowirus, wirus zapalenia mózgu, wirus zapalenia opon, arbowirus, arenawirus, pikornawirusy, koronawirus, wirusy syncytialne, zapalenie tkanki łącznej, choroby wywoływane przez gronkowce, paciorkowce, mykobakterie, bakteryjne zapalenie mózgu, bakteryjne zapalenie opon lub choroby wywoływane przez beztlenowe laseczki.