RS99704A - Poboljšana bakterijska vakcina mycoplasma hyopneumoniae - Google Patents

Abstract

Pronalazak obezbeđuje poboljšanu kompoziciju bakterijske vakcine Mycoplasma hyopneumoniae, koja poželjno obezbeđuje imunitet od infekcija posle jednog davanja. Kompozicija se sastoji od inaktivirane bakterije Mycoplasma hyopneumoniae i smeše pomoćnih sredstava, koje u kombinaciji, obezbeđuju imunitet naspram Mycoplasma hypneumoniae infekcije posle jednog davanja i izazivaju imuni odgovor specifičan na bakteriju Mycoplasma hyopneumoniae, uključujući imunitet posredovan ćelijama i lokalni (sekrecija IgA) imunitet. U poželjnom izvođenju, smeša pomoćnih sredstava se sastoji od polimera akrilne kiseline, najpoželjnije Carbopol-a i smeše metaboličnog ulja, kao što su jednom ili više nezasićeni terpenski ugljovodonici poželjno skvalen ili skvalan i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera kao što je Pluronic(R). Kompozicija vakcine može opciono uključivati konzervanse, poželjno timerosol i/ili EDTA. U još jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje poboljšanu kompoziciju vakcine naspram Mycoplasma hyopneumoniae, koja poželjno obezbeđuje imunitet od infekcije posle jednog davanja i sastoji se od inaktivirane Mycoplasma hyopneumoniae bakterije i pomoćnog sredstva ili smeše pomoćnih sredstava koje u kombinaciji obezbeđuju imunitet naspram Mycoplasma hyopneumoniae infekcije posle jednog davanja i izazivaju specifični imuni odgovor na Mycoplasma hyopneumoniae bakteriju uključuju imunitet posredovan ćelijama i lokalni (sekrecija IgA) imunitet u kombinaciji sa ostalim komponentama vakcine.

Description

POBOLJŠANABAKTERIJSKA VAKCINAMYCOPLASMA

HYOPNEUMONIAE

Ovaj pronalazak se odnosi na poboljšane postupke za izazivanje zaštitnog imuniteta protivMycoplasma hyopneumoniae,naročito koji uključuju inaktivanu bakterijuMycoplasma hyopneumoniaeu količini efikasnoj da imunizira životinju primaoca protiv infekcijeMycoplasma hyopneumoniaeu jednoj dozi.

Mycoplasma hyopneumoniaeje etiološki agens svinjske mikoplazmatične upale pluća. Bolest je važan uzrok ekonomskog gubitka u industriji svinja zbog postignute smanjene težine i slabe efikasnosti hranjenja. Bolest uzrokuje hroničan kašalj, slabu životinjsku dlaku, zaostajanje u rastu i neuspešan izgled koji traje nekoliko nedelja. Kod zaraženih životinja primećene su površine karakterističnih lezija od crvenih do sivih koje se integrišu, naročito u prednjem vršnom i srčanom režnju. Mada bolest izaziva ;; malo smrtnih slučajeva, napadnute svinje su često sklone sekundarnoj infekciji oportunističkih patogena, što rezultuje smrću ili stresom. Samo su ekonomski gubici procenjeni između 200 i 250 miliona dolara godišnje.

Mycoplasma hyopneumoniaeje izbirljiva bakterija koja polako raste i koja nema ćelijski zid. Veoma često ju je teško izolovati iz respiratornog trakta zbogMycoplasma hyorhinis,uobičajenog sekundarnog agensa koji je takođe smešten u respiratornom traktu. Bolest se prenosi aerosolom, dobijenim kašljanjem i direktnim kontaktom sa bolesnom ili konvalescentnom svinjom nosiocem. Mešanje zaraženih životinja i nezaraženim životinja dovodi do ranih i čestih ponovnih infekcija. Infekcija često počinje infekcijom prasića od noseće krmače prilikom prašenja. Zbog načina upravljanja krdom, infekcija ne mora da bude očigledna nego tek kasnije u životu. Dodatne infekcije uglavnom su primećene posle odbijanja od sisanja kada se svinje objedine. Očigledna bolest se normalno primeti kod svinja u šestoj nedelji starosti ili kasnije. Odnos rasta i odnos konverzije hrane su primetno smanjene kod bolesnih životinja. Lečenja sa antibioticima su skupa i zahtevaju produženu upotrebu. Ponovna infekcija je takođe problem. Vakcine su sada najefikasniji postupak za izbegavanje infekcija i njihovih posledica.

Fort Dodge Animal Health (FDAH) prodaje bakterijuMycoplasma hyopneumoniaepod imenom Suvaxyn® Respifend® MH koja se koristi kao vakcina da bi se zaštitile zdrave svinje od kliničkih znaka izazvanih saMycoplasma hyopneumoniae.Vakcina sadrži Carbopol kao pomoćno sredstvo i preporučena je kao vakcina u dve doze za svinje koje su stare bar jednu nedelju, sa drugom dozom dve ili tri nedelje posle prve vakcinacije. Međutim, vakcine u dve doze imaju očigledni nedostatak u tome što zahtevaju drugi postupak sa životinjama u cilju obezbeđivanja potpune zaštite protiv bolesti.

Prema tome predmet ovog pronalaska je da se obezbedi efikasna vakcina protivMycoplasma hyopneumoniaekoja izaziva zaštitni imunitet i sprečava bolest izazvanu sa organizmom davanjem jedne doze vakcine.

Drugi predmet ovog pronalaska je obezbeđivanje kompozicije vakcine pogodne za upotrebu kod svinja protiv infekcije i bolesti izazvane saMycoplasma hyopneumoniae,koja može biti korišćena u kombinaciji sa drugim bakterijama i/ili toksoidima.

Još jedan predmet ovog pronalaska je da obezbedi postupak za sprečavanje ili ublažavanje bolesti gde je organizam izazivačMycoplasma hyopneumoniae,korišćenjem formulacije sa pomoćnim sredstvima koja poboljšava imugeno svojstvo bakterije tako da izaziva zaštitni imunitet posle jedne doze vakcine.

Drugi predmeti i karakteristike pronalaska će postati očigledne iz dole izloženog detaljnog opisa.

Ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju vakcine za imuniziranje životinje protiv infekcijeMycoplasma hyopneumoniaekoja sadrži imunizirajuću količinu inaktivirane bakterijeMycoplasma hyopneumoniae\smešu pomoćnih sredstava koja obuhvata polimer akrilne kiseline i smešu metaboličnog ulja i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera; i farmaceutski prihvatljivih nosača, gde kompozicija vakcine, posle jednog davanja, izaziva zaštitniimunitet protiv Mycoplasma hyopneumoniae.

U drugom aspektu, prikazani pronalazak obezbeđuje kompoziciju sa imunogenim svojstvom za imunizaciju životinje protiv infekcijeMycoplasma hyopneumoniae,koja se sastoji od inaktivirane bakterijeMycoplasma hyopneumoniaezajedno sa gore navedenim pomoćnim sredstvima i farmaceutski prihvatljivim stabilizatorima, nosačima ili razblaživačima. Pomoćno sredstvo je uglavnom prisutno u ovoj kompoziciji vakcine u krajnjoj koncentraciji od oko 1-25% (v/v) i poželjno oko 5-12%

(v/v). Kompozicija takođe može da uključuje druge komponente vakcine, uključujući inaktivirane bakterije ili prečišćene toksoide, iz jednog ili više patogena (uključujući jedan ili više sojeva, tipova, serotipova ili slično tih patogena), kao što suHaemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida,

Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae, Bordetella

bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae,

leptospira i viralni antigeni kao što su virus svinjskog gripa (swine influenza virus-SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (porcine reproductive and respiratorv svndrome virus-PRRSV), svinjski cirkovirus (porcine circovirus-PCV) i može biti davana intramuskularno, subkutanozno, oralno, aerosolom ili intranazalnim putem. U drugom izvođenju prema pronalasku, druge komponente vakcine će uključivati jedan ili više antigena izabranih od SIV;Heamonphilus parasuis;grupe koja se sastoji od PRRSV i PCV; grupe koja se sastoji od SIV iErysipelotrix rhusiopathiae;grupe koja se sastoji odPasteurella multicodaiBordetella bronchiseptica.U još jednom izvođenju pronalaska, druge komponente vakcine prema pronalasku, kada je izabran SIV će uključivati odabir između SIV-H1N1 soja, SIV-H1N2 i SIV-H3N2 soja.

U još jednom aspektu, prikazani pronalazak obezbeđuje postupak za zaštitu životinja protiv bolesti izazvaneMycoplasma hyopneumoniaedavanjem jedne doze gore pomenute vakcine koja sadrži inaktiviranu bakterijuMycoplasma hyopneumoniaei smešu pomoćnih supstanci.

U još jednom aspektu pronalaska, prikazani pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju ili vakcinu za imunizaciju životinja naspram infekcijeMycoplasma hyopneumoniae,koja sadrži inaktiviranu bakterijuMycoplasma hyopneumoniaekombinovanu sa pomoćnim sredstvima ili smešom pomoćnih sredstava, pojedinačnu ili u smeši, obezbeđujući ćelijski posredovan i lokalni (izlučeni IgA) imuni odgovor na kompoziciju ili vakcinu; druge komponente vakcine sadrže bar jedan dodatni bakterijski i/ili virusni antigen; i farmaceutski prihvatljivi nosač, a kompozicija vakcine, posle jednog davanja, izaziva zaštitini imunitet naspramMycoplasma

■ hyopneumoniae.U ovoj kompoziciji ili vakcini , ostale komponente vakcine mogu uključivati inaktivirane bakterije, prečišćene toksoide, jednog ili više patogena (uključujući jedan ili više sojeva, tipova, serotipova ili slično takvih patogena), kao što suHaemonphilus parasuis, Pasteurella

multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae,

Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix

rhusiopathiae,leptospira i virusni antigeni (uključujući jedan ili više sojeva, tipova, serotipova i slično tih virusnih antigena) kao što su virus svinjskog gripa (swine influenza virus-SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (porcine reproductive and respiratorv svndrome virus-PRRSV), svinjski cirkovirus (porcine circovirus-PCV) i može biti davana intramuskularno, subkutanozno, oralno, aerosolom ili intranazalnim putem.

U još jednom aspektu pronalaska, prikazani pronalazak obezbeđuje kompoziciju vakcine za imuniziranje životinja naspram infekcijeMycoplasma hyopneumoniaei virusnih patogena, a kompozicija vakcine sadrži imunizirajuću količinu bakterijeMycoplasma hyopneumoniae;imunizirajuću količinu bar jednog virusnog antigena izabranog iz grupe koju čine virus svinjskog gripa (svvine influenza virus-SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (porcine reproductive and respiratorv svndrome virus-PRRSV), svinjski cirkovirus (porcine circovirus -PCV); i sistem pomoćnih sredstava koji se sastoji od polimera akrilne kisleine, metaboličnog ulja i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera u obliku ulja u vodenoj emulziji; a kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet premaMycoplasma hyopneumoniae.

U još jednom aspektu pronalaska, prikazani pronalazak obezbeđuje kompoziciju vakcine i postupak za imuniziranje životinje naspram infekcijeMycoplasma hyopneumoniaei bar jednog virusnog patogena, i opciono dodatnih virusnih i/ili bakterijskih patogena, a kompozicija vakcine i postupak(ci) posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet naspram

Mycoplasma hyopneumoniae.

Svi ovde citirani patenti, patentne prijave i druga literatura obuhvaćeni su referencom u svojoj celosti. U slučaju nedoslednosti, prikazani pronalazak će preovladati.

Ovde korišćen izraz 'bakterijska vakcina' je sakupljena bakterija koja je .inaktivirana i koja u kombinaciji sa izvesnim pomoćnim sredstvima može izazvati zaštitni imunitet protiv bolesti ili infekcije kada se daje životinjama.

'Pomoćno sredstvo' označava kompoziciju koja sadrži jednu ili više supstanci koje pojačavaju imugeno svojstvo i efikasnost bakterijeMycoplasma hyopneumoniaeu kompoziciji vakcine.

U opisu i zahtevima korišćen izraz MHDCE označavaMycoplasma hyopneumoniaeDNA ćelijske ekvivalente.

'Imunizirajuća količina' je količina bakterijske vakcine koja će obezbediti imunitetvis a vis Mycoplasma hyopneumoniae.'Imunizirajuća količina'će zavisiti od vrste, pasmine, starosti, veličine, zdravstvenog stanja i da li je životinja prethodno bila vakcinisana protiv istog organizma.

Ovaj pronalazak obezbeđuje vakcinu protivMycoplasma hyopneumoniaekoja je pogodna za imunizaciju u jednoj dozi. Vakcina prema ovom pronalsku uključuje smešu pomoćnih sredstava koja povećava imugeno svojstvo bakterije i na taj način obezbeđuje jedno davanje za izazivanje zaštitnog imuniteta.

Vakcina može biti pripremljena od sveže sakupljenih kultura postupcima ;t ;; standardnim u stanju tehnike (videti, na primer, US patent 5,338,543 ili US patent 5,565,205 kao i dole primer 2). To jest, organizam može rasti u medijumu za kulture kao što je PPLO (Tleuropneumonia-like organisam') kompletni medijum [Difico]. Laboratories]. Rast organizama je praćen standardnim tehnikama kao što je određivanje jedinica koje menjaju boju (CCU-color changing units) i sakupljanjem kada je postignut dovoljno visok titar. Stokovi moraju dalje biti koncentrovani ili liofilizirani konvencionalnim postupcima pre uključivanja u formulaciju vakcine. Mogu se koristiti drugi postupci, kao što su oni opisani kod Thomas,et al,Agri-Practice, Vol. 7 Br. 5, str.26-30.

Vakcina prema ovom pronalasku se sastoji od inaktivirane bakterijeMycoplasma hyopneumoniaeu kombinaciji sa smešom pomoćnih sredstava i jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Nosači pogodni za upotrebu uključuju vodeni medijum, na primer, rastvor soli, rastvor soli sa fosfatnim puferom, minimalni esencijalni medijum (MEM) ili MEM sa HEPES puferom.

Smeša pomoćnih sredstava za upotrebu u kompoziciji vakcine ovog pronalaska povećava imuni odgovor i sastoji se od smeše polimera akrilne kiseline sa smešom metaboličkog ulja, na pr. nezasićenih terpenskih ugljvodonika ili njihovih proizvoda hidrogenizacije, poželjno skvalana (2,3,10,15,19,23-heksametiItetrakozana) ili skvalena i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera. Takav polimer akrilne kiseline može biti homopolimer ili kopolimer. Polimer akrilne kiseline je poželjno karbomer. Karbomeri su komercijalno dostupni pod komercijalnim imenom Carbopol. Polimeri akrilne kiseline su opisani, na primer, u US patentima 2,909,462 i 3,790,665 čiji opisi su uključeni ovde kao reference. Polioksietilen-polioksipropilen blok polimeri su površinski aktivna sredstva, poželjno tečna površinski aktivna sredstva, koja pomažu u suspendovanju čvrstih i tečnih komponenti. Površinski aktivne supstance su komercijalno dostupne kao polimeri pod komercijalnim imenom Pluronic®. Poželjno površinski aktivno sredstvo je poloksamer 401 koji je komercijalno dostupan pod imenom Pluronic® L121.

Smeša pomoćnih sredstava koja stimuliše imunogeno svojstvo je tipično prisutna u kompoziciji vakcine prema pronalasku u v/v količini od oko 1%

do 25%, poželjno od oko 2% do 15%, poželjnije oko 5% do 12% v/v. Količina smeše pomoćnih sredstava koja se koristi i odnosa dve komponente pomoćnih sredstava može varirati u zavisnosti od dodavanja drugih # bakterijskih vakcina ili prečišćenih toksoida. Smeše pomoćnih supstanci generalno se sastoje od metaboličnog ulja, polimera akrilne kiseline i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera formulisanih kao emulzija u vodenom medij umu.

U ovoj smeši pomoćnih sredstava, metaboličko ulje i polimer akrilne kiseline mogu biti prisutni u količini u opsegu od oko 10 do 150 ml/l i oko 0.5 do 10 g/l, respektivno. U poželjnom izvođenju smeša pomoćnih supstanci, smeša metaboličnog ulja i polioksietilen-polioksipropilen blok kompolimernih komponenti je smeša skvalana i Pluronic® L121 (poloxamer 401) koja može biti prisutna u količini od oko 50 do 100 ml/L i karboksimetilen polimer je Carbopol 934P (Carbamer 934P) koji može biti prisutan u količini od oko 2 ml/l. Tipično, smeša pomoćnih supstanci sadrži oko 1:25 do 1:50 polimera akrilne kiseline u odnosu na smešu metaboličnog ulja/polioksietilen-polipropilen blok kopolimera.

Poželjni polimeri akrilne kiseline su oni koje prodaje B. F. Goodrich kao Carbopol 934 P NF i 941 NF koji su polimeri akrilne kiseline umrežene sa polialilsaharozom i koji imaju hemijsku formulu (CH2CHOOOH)n. Ovi polimeri daju vodeni gel koji pogodno formuliše sa vodenim nosačima. Poželjni polioksietilen-polipropilen blok kompolimeri su nejonska površinski aktivna sredstva koje prodaje BASF kao Pluronic® L121, L61, L81 iliLIOl.

U kompoziciji vakcine prema pronalasku koja se odnosi na kombinaciju imunizirajuće količine inaktivirane bakterijeMycoplasma hyopneumoniae\druge komponente vakcine su izabrane od bakterijskih i/ili virusnih antigena; i faramaceutski prihvatljiv nosač, a kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet naspramMycoplasma hyopneumoniae,a kompozicija vakcine dalje se sastoji od pomoćnih sredstava ili smeše pomoćnih sredstava koje, pojedinačno ili u kombinaciji obezbeđuju ćelijski posredovan i lokalan (izlućeni IgA) imunitet. Ova pomoćna sredstva ili adjuvanti mogu dalje biti izabrani od pomoćnih sredstava kao što su saponin, kao što je QUIL®A; citokini, kao što su IL-12

i IL-18 i lokalni (izlučeni IgA) imunitet; aluminujum hidroksid, metabolično ulje, polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimer i polimer akrilne kiseline u obliku ulja u vodenoj emulziji, kopolimer etilen maleinske kisleine; polimer akrilne kisleine sa još jednim pomoćnim sredstvom, DEAE dekstran, pomoćna sredstva koja potiču od ćelijskog zida mikrobakterija i slično. Druge komponenete vakcime u ovoj kompoziciji prema proanalsku Vfemogu uključivati, bakterijske antigene, uključujući inaktivirane bakterije ili prečišćene toksoide, iz jednog ili više patogena (uključujući jedan ili više sojeva, tipova, serotipova i slično tih patogena) kao što suHaemonphilus

parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus

pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis,

Erysipelothrix rhusiopathiae,leptospira i virusni antigeni (uključujući jedan

ili više sojeva, tipova, serotipova i slično tih virusnih antigena) kao što su virus svinjskog gripa (swine influenza virus-SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (porcine reproductive and respiratorv svndrome virus - PRE.SV), svinjski cirkovirus (porcine circovirus

- PCV). U još jednom izvođenju, druge komponente vakcine će uključivati jedan ili više antigena izabranih od SIV;Haemonphilus parasuis;grupe koja se sastoji od PRRSV i PCV; grupe koja se sastoji od SIV IErysipelothrix

rhusiopathiae;grupe koja se sastoji odPasteurella multiocidaiBordetella bronchiseptica.U još jednom izvođenju prema pronalasku druge komponente vakcine prema pronalasku, kada su izabrane od SIV, će uključivati selekciju od SIV-H1N1 soja, H1N2 i SIV-H3N2 soja.

Vakcina prema ovom pronalsku može se davati intramuskularno, subkutanozno, intranazalno, intraperitonealno ili oralnim putem, poželjno intramuskularnim ili subkutanoznim putem.

Vakcina prema pronalasku generalno se sastoji od inaktiviraneMycoplasma hyopneumoniae,metaboličnog ulja, polioksietilen-polipropilen blok kopolimera i polimera akrilne kisleline u obliku ulja u vodenoj emulziji. Vakcina poželjno sadrži polimer akrilne kiseline u koncentraciji u opsegu od 0.5 do 10 g/l. Vakcina poželjno sadrži metaboličko ulje u koncentraciji u opsegu od 2 do 6 ml/l. Vakcina poželjno sadrži polioksietilen-propilen blok kopolimer u koncentraciji opsega od 1 do 3 ml/l.

Za pojedinačno davanje, vakcina bi poželjno sadržala količinu bakterijske vakcineMycoplasma hyopneumoniaekoja odgovara oko 1x10 8 do 3x1011 MHDCE/ml, poželjno oko lxl0<9>do 3xl0<9>MHDCE/ml. Oko jedan do pet ml, poželjno 2 ml, može se davati životinji, intramuskularno, subkutanozno ili intraperitonealno. Jedan do deset ml, poželjno 2 do 5 ml, može biti dato oralno ili intranazalno.

Sledeći primeri imaju nameru da dalje prikažu pronalazak bez ograničavanja negovog obima.

PRIMERI

PRIPREMANJE KOMPOZICIJE BAKTERIJSKE VAKCINE

MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

OPIS VIRUSNIH ŠTOKOVA.Mycoplasma hyopneumoniaemože biti dobijena iz brojnih lako dostupnih izvora. U jednom izvođenju, može biti korišćen soj P-5722-3Mycoplasma hyopneumoniae.Kultura je dobijena od C. Armstrong, Purdue Universitv, West Lafavette, Indiana. Posle prijema kultureMycoplasma hyopneumoniae,bila je dodata uMycoplasma hyopneumoniaebuljon, sedam puta da bi se ustanovilo originalno seme.

ĆELIJSKA KULTURA.Mycoplasma hyopneumoniaeje rasla u medij umu koji sardrži Bacto PPLO prah, ekstrakt kvasca, glukozu, L-cistein hidrohlorid, ampicilin, talijum acetat, fenol crveno, sredstvo protiv stvarnja pene, normalni sterilni svinjski serum i vodu u periodu od 18-144 sati. Za inaktivaciju, dodat je binarni etilenimin (BEI) direktno pri proizvodnji

•kulture u fermentacioni sud. pH je prilagođen na 7.4 i zatim je sakupljena prema konvencionalnim postupcima da bi se obezbedila bakterija

Mycoplasma hyopneumoniae.

PRIPREMANJE KOMPOZICIJE VAKCINE

Kompozicija konzervanasa i korišćene proporcije. Sakupljena bakterija je konzervisana dodavanjem timerozala i tetranatrijumove soli etilen diamin tetra sirćetne kiseline (EDTA) ne više od 0.01% i 0.07% respektivno. U medijumu za rast prisutan je ampicilin U.S.P. sa 0.250 grama/litri. Koncentracija zaostalog ampicilina će varirati u krajnjem proivodu u zavisnosti od zapremine sakupljene tečnosti, tako da koncentracija zaostalog ampicilina u završnom proizvodu ne prelazi 30 ug/ml.

STANDARDIZACIJA PROIZVODA.KoncentratMycoplasma-&je kvantifikovan sa DNA fluorometriskim testom.

Smeša metaboličkog ulja koja se sastoji od jednog ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilen-polipropilen blok kopolimera,na pr.,smeša Skvalan/Pluronic L121, je pripremljena rastvaranjem 10 g natrijum hlorida, ; 0.25 g kalijum hlorida, 2.72 dibaznog natrijum fosfata, 0.25 monobaznog natrijum fosfata, 20 ml Pluronic LI21 (BASF Corporation), 40 ml skvalana (Kodak), 3.2 ml Tween 80 i 900 ml prečišćene vode, do 1000 ml. Posle mešanja, sastojci su bili u autoklavu. Smeša je zatim homogenizirana dok nije nastala stabilna emulzija. Može biti dodat formalin do krajnje koncentracije od 0.2% ili može biti dodat timerozal do krajnje koncentracije od 1:10,000.

SPAJANJE JEDINICA DA BI SE NAPRAVILA SERIJA.

Zadovoljavajući koncentratiMycoplasma hyopneumoniaesu aseptički spojeni sa pomoćnim sredstvima, konzervansima i razblaživačima u sterilnim posudama snabdevenim sa mešalicom i mešanim ne manje od 30 minuta.

POSTUPAKI TEHNIKEPUNJENJA I ZATAPANJA KRAJNJIH

POSUDA.Proizvod može biti ceo proceđen kroz sterilni filter od 200-500 mikrona i punjen pod uslovima navedenim u 9 CRF 114.6 u sterilne krajnje posude u sobi označenoj za operaciju punjenja. Staklene ili plastične posude su zatvorene sa gumenim zapušačem i savijanjem zatvorene sa aluminijumskim zatvaračem. Svaka doza od 2.0 ml će sadržati ne manje od 2 x 109Mycoplasma hyopneumoniaeDNA ćelijskih ekvivalenata.

TESTIRANJE AKTIVNOSTI.Uzorci glavne mase ili iz krajnjih posuda završnog proivoda mogu biti testirani na aktivnost na sledeći način: Proba postupka za testiranje aktivnosti: Korišćeni su ICR ženski miševi, šest do sedam nedelja stari, jedne konsignacije od Harlan Sprague Dawley-a ili drugog prihvatljivog snabdevača. Minimum od 20 miševa je potreban za imunizaciju sa svakom nepoznatom i referentnom bakterijom. Minimum od pet miševa je uzet kao kontrola bez ubrizgavanja. Testirane i referentne bakterije su pojedinačno potpuno promešane. Sterilni, špricevi za jednu upotrebu, za odmeravanje 25, sa iglama od 5/8 inča su korišćeni za ubrizgavanje miševima subkutanozno u region prepona 1/10 (jedne desetine) doze životinje domaćina (0.2 ml). Svaka grupa miševa je smeštena u zasebnu jedinicu i omogućen joj je slobodan prilaz hrani i vodi u toku 14 dana. Svaki miš je zatim anesteziran. Anestezirani miševi su smešteni na leđa. Koristeći jednu ruku, glava je držana dole i jedna prednja noga je ispružena u odnosu na telo. Korišćenjem skalpela, napravljen je rez na koži približno dugačak<l>Ainča, između ispružene prednje noge i toraksa, •prekidajući ručnu arteriju. Korišćenjem šprica od 3.0 ml, bez igle, sakupljena je krv koja je curila iz reza. Krv je ispuštena u obeleženu epruvetu za testiranje i omogućeno je da se zgruša. Epruvete sa zgrušanom krvi su centrifugirane na l,000xg da bi se odvojio serum od ugruška. Individulani serumi su čuvani na -20°C ili na još hladnijem do testiranja.

SEROLOŠKO TESTIRANJE:ELISA postupak je korišćen za merenje odgovora antitela miša na referentnu i/ili nepoznatu bakteriju. ELISA Postupak je izvođen korišćenjem jednokratnih Immulon II mikrotitarskih ploča sa ravnim dnom (Disposable Immulon II Flat-Bottom Microtiter Plates) od Dynatech-a ili ekvivalentnih i čitača za ELISA ploča.

REAGENSI ZA TEST:

Rastvor soli puferisan sa fosfatima-Tween (PBST-Phosphate Buffered Saline-Tvveen) (pH podešen na 7.2 do 7.4 sa 5M NaOH ili 5M HC1).

Puferisani rastvor soli i glicina (GBS-Glycine Buffered Saline) (pH podešen na 9.5 do 9.7 sa 5M NaOH ili 5M HC1).

Serum za pozitivnu kontrolu: Serum za pozitivnu kontrolu su objedinjeni serumi iz miševa vakcinisanih sa bakterijomMycoplasma hyopneumoniae.

Konjugat i supstrat

Afinitetno prečišćen, anti-miš IgG peroksidazno-obeležen konjugat je dobijen iz Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc. (Kataloški br. 074-1802). Postupak za određivanje optimalnog razblaženja konjugata je detaljno dole opisan. Rastvori supstrata peroksidaze (ABTS) su dobijeni od Kirkegaard and Perry, Inc. Titracija konjugata: Imulon II ploča sa ravnim dnom je prevučena sa 100 ul po otvoru 20 ug po mlMycoplasma hyopneumoniaecelim ćelijski antigenom razblaženim u 10 mM GBS. Ploča je inkubirana ne manje od jednog sata na 37°C+2°C i premeštena je na 2-7°C za ne manje od 18 sati i ne više od jedne nedelje. Pre korišćena ploča je isprana tri puta sa PBST, sa vremenom od jednog minuta za natapanje između svakog ispiranja

i lupkana je da se osuši. Pripremljeno je razblaženje seruma za pozitivnu kontrolu 1:40 u PBST i razblaženi pozitivni serum (100 ul/otvoru) je dodat u jednu polovinu otvora na ploči. PBST je dodat u drugu polovinu otvora. Ploča je inkubirana u toku jednog sata na sobnoj temperaturi, posle čega je ploča isprana tri puta. Konjugovani serum je serijski razblažen sa PBST dvostruko, polazeći od 1:100 razblaženjem i završavanjem sa razblaženjem 1:10,240. 100 ul od svakog razblaženja konjugata je dodato u četiri otvora pozitivnog seruma i četiri otvora PBST-a i omogućeno je da reaguju pola sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane četiri puta i dodato je 100 ul rastvora supstrata peroksidaze (abts) u otvore. Ploča je čitana na dvojnoj talasnoj dužini podešenoj na T X.=450. Razblaženje konjugata je izabrano da daje očitavanja od 0.850 do 1.050 za serum pozitivne kontrole kada se vrednost PBST kontrole oduzme od vrednosti seruma pozitivne kontrole.

Test antigen:

AntigenMycoplasma hyopneumoniae jeceli ćelijski preparat i dobijen je od Fort Dodge Animal Health.

ELISA je izveden na sledeći način: Korišćene su Immulon II mikrotitarske ploče sa ravnim dnom (Dvnatech Immulon II Flat-Bottom Microtiter Plates). Jedna fiola liofiliziranog antigena cele ćelijaMycoplasma hyopneumoniaeje rekonstituisana do deset ml sa puferisanim rastvorom soli i glicina (GBS). w Koncentracija rekonstitusanogMycoplasmaproteina je 20 ul/ml. 100 ul (2 ul) razblaženog antigena je zatim dodato u sve otvore na ploči. Ploča je inkubirana na 37°C ± 2°C ne manje od jednog sata i zatim je premeštena na 2-7°C za najmanje 18 sati i maksimalno jednu nedelju. Ploče su isprane tri puta sa PBST, sa natapanjem od jednog minuta između svakog ispiranja, i zatim lupkanjem da se osuše. Serumi su razblaženi 1:40 u PBST. Serum pozitivne kontrole će biti uključen u kvadriplikatu na svakoj ploči. Zapremina uzorka po otvoru je 100 ul. Uzorci serije testiranog seruma i uzorci referentnog seruma će biti testirani u duplikatu na istoj ploči. Ploče su inkubirane u toku jednog sata na sobnoj temperaturi i isprane su tri puta sa PBST. Dodato je 100 ul anti-miš IgG peroksidazno-obeleženog konjugata (Kirkegaard and Perry), razblaženog u PBST u sve otvore i otvori su inkubirani u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane četiri puta sa PBST-om. U sve otvore dodato je 100 ul rastvora supstrata peroksidaze (ABTS) i ploče su inkubirane dok serum za pozitivnu kontrolu ne dostigne OD405(450) 0.850 do 1.050 kada je u mašini PBST iz kontrolnog otvora. Ploče su čitane naspram PBST otvora. Da bi test bio validan, serum miševa kojima je ubrizgana referentna bakterija mora proizvesti minimum prosečne vrednosti od 0.500 i serum nevakcinisanih kontrolnih miša ne sme preći maksimalnu prosečnu vrednost od 0.100. Ili, razlika između prosečne vrednosti seruma miševa kojima je ubrizgana referentna bakterija i seruma nevakcinisanih kontrolnih miševa mora biti veća nego ili jednaka 0.400.

Srednje vrednosti za serijsko vakcinisanje, referentno vakcinisanje i kontrole je izračunato i procenjeno na sledeći način: Da bi se smatrao zadovljavajućim, bakterijski test mora pokazivati prošek srednje vrednosti optičke gustine jednak ili veći od referentne. Ili, korišćenjem Studentovog T-testa sa jednim krajem, bakterijski test ne mora značajno biti (p<<>0.05 nivo pouzdanosti) niži nego za referentnu bakteriju. Bilo koja izračunata T-vrednost jednaka, ili veća od 1.686 će pokazivati značajnu razliku između referentne i testirane bakterije, i prouzrokovaće da bakterijski test bude odbačen. Bilo koja izračunata T-vrednost manja od 1.686 će ukazivati na zadovoljavajući serijal. Bilo koji bakterijski test određen testom da je nezadovoljavajući iz bilo kog razloga nevezanog sa efikasnošću proizvoda je ponovo testiran i inicijalni test se smatra nevažećim.

PRIMER 2

TEST VAKCINA:

Vakcina za testiranje je pripremljena prema postupcima opisanim u primeru 1 korišćenjem 5% smeše mataboličnog ulja koje se sastoji od jednog ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilen-polipropilen blok kopolimera (Skvalan/Pluronic L121 smeša) i 0.2% polimera akrilne kiselina (Carbopol) kao pomoćnog sredstva i 2xl0<9>M. hyopneumoniaeDNA ćelijskog ekvivalenta (MHDCE) po dozi.

PRIMER 3

Ova studija je osmišljena da pokaže trajanje imuniteta (DOI) u toku četiri .meseca kod svinja indukovanog vakcinacijom sa jednom dozom vakcine Primera 2 u trećoj nedelji starosti.

Dva odvojena eksperimenta na životinjama su izvedena za ovu studiju. Sve svinje u oba eksperimenta su bile sero-negativne (titar antitela<10) u vreme vakcinacije, ukazujući da su životinje bile osetljive naMycoplasma hyopneumoniae.Sve svinje u kontrolnoj grupi ostale su sero-negativne pre izazivanja. Ovo ukazuje daje imuni odgovor kod vakcinisanih svinja poticao od vakcine, a ne zbog izlaganja okolini.

U prvom eksperimentu, vakcina prema primeru 2 je procenjena zajedno sa komercijalno dostupnim proizvodom, Ingelvac M. hypo® proizvedenim od Boehringer Ingelheim (BI), izazivanjem sa visokim nivoom virulentneM. hyopneumoniae(.4xl0<6>organizma). Dvadeset dve (22) svinje starosti od 18-21 dana su vakcinisane sa vakcinom iz primera 2 intramuskularno (IM) i osam (8) svinja sa Ingelvac M. hyo®[serija 271 032]. Dvadeset dve (22) svinje su služile kao izazivana kontrola i 10 svinja kao ne-izazivana kontrola. Svinje u vakcinisanoj i izazvanoj kontrolnoj grupi su izazivane sa virulentnim M. hvopneumoniae četiri meseca posle vakcinacije. Svinje vakcinisane sa vakcinom iz primera 2 imale su prosečno plućne lezije 15.9%

a izazivane kontrolne svinje imale su u prošeku plućne lezije 19.6%. Prošek plućnih lezija u vakcinisanoj grupi sa vakcinom iz primera 2 je bio manjiV:nego kod kontrolnih i ako su snažne svinje bile izazivane sa višom dozom nego što je preporučena od strane Univerziteta države Ajova (Iowa State Universitv(ISU)), međutim razlika nije bila značajna (p=0.19). Prema tome, kada je komercijalni proizvod, Ingelvac M hyo®, procenjivan u istoj grupi životinja izazivanjem sa istom dozom, takođe je primećen sličan nivo plućnih lezija (14.6%). Takođe nije postojala značajna razlika između grupe vakcinisane sa Ingelvac M. hyo® i kontrolne grupe (p=0.27) i između grupe vakcinisane sa Inglevac M. hypo® i grupe vakcinisane sa vakcinom iz primera 2.

U drugom eksperimentu, vakcina iz primera 2 je procenjena izazivanjem sa virulentomM. hyopneumoniaepri nivou sugerisanom od ISU (1.0xl0<6>organizama) četiri meseca posle vakcinacije. Dvadeset tri (23) svinje su vakcinisane sa jednom dozom vakcine pri starosti od 21 dan, 25 svinja je služilo kao izazivana kontrola i 7 svinja kao neizazivana kontrola. Svinje u vakcinisanoj i izazvanoj kontrolnoj grupi su izazivane sa virulentnomM hyopneumoniaečetiri meseca posle vakcinacije. Kontrolna grupa je imala prosečno plućne lezije 10.4% a vakcinisana grupa je imala prosečno plućne lezije 5.5%). Bila je značajna razlika između vakcinisane grupe i kontrolne grupe (p=0.031). Ovo ukazuje da je vakcina iz primera 2 efikasna u stimulaciji zaštitinog imuniteta, koji može trajati četiri meseca posle vakcinacije jednom dozom kod svinja starih tri nedelje.

Kada su sakupljeni i analizirani podaci oba eksperimenta koji se odnose na vakcinu iz primera 2, prosečne plućne lezije vakcinisane grupe su značajno niže nego kontrolne grupe.

U zaključku, vakcina iz primera 2 izaziva zaštitni imunitet protiv izazivanja sa virulentnomM. hyopneumoniaečetiri meseca posle vakcinacije sa jednom dozom kod svinja u trećoj nedelji starosti.

EKSPERIMENTALNI PODACI

Dva odvojena eksperimenta su izvedena u ovoj studiji. U prvom eksperimentu, šezdeset sedam (67) svinja je dodeljeno u četiri grupe korišćenjem Microsoft Exel programa za nasumičnu raspodelu. Dvadeset četiri (24) svinje starosti od 18-21 dana su vakcinisane sa jednom dozom vakcine pripremljenom prema primeru 2 intramuskularno (IM). Dvadeset četiri (24) svinje su služile kao izazivana kontrola i deset (10) svinja kao ne-izazivana kontrola. Devet svinja je vakcinisano IM sa komercijalnim proizvodima, Inglevac M. hyo®, [serija 271 032, proizvedenim od Boehringer Ingelheim (BI)], po navedenom uputstvu. Pet svinja (dve svinje vakcinisane sa vakcinom iz primera 2, jedna sa BI vakcinom i dve kontrole) su uginule u toku perioda vakcinacije iz razloga koji nisu u vezi sa vakcinacijom. Preostale svinje u vakcinisanim grupama i izazivanoj kontrolnoj grupi su izazivane sa 14 ml virulentneM. hyopneumoniae(1.4 xl0<6>organizama) četvrtog meseca posle vakcinacije. Svinje u sve četiri grupe su eutanizirane 30 dana posle izazivanja i procenjene su plućne lezije za svaku svinju u eksperimentu.

U drugom eksperimentu, dvadeset pet (25) svinja starosti 21 dan je vakcinisano IM sa jednom dozom vakcine pripremljene prema primeru 2, Dvadeset pet (25) svinja je služilo kao izazivane kontrole i 10 svinja kao neizazivane kontrole. Dve svinje su uginule iz razloga koji nisu u vezi sa vakcinacijom i jedna svinja je greškom prodata u toku perioda vakcinacije. Preostale svinje u vakcinisanoj i izazivanoj kontrolnoj grupi su izazivani sa 10 ml virulentnogM. hyopneumoniae(1.0xl06 organizama) četiri meseca posle vakcinacije. Dve svinje su umrle u toku posmatranja posle izazivanja iz razloga koji nisu u vezi sa vakcinacijom/izazivanjem. Preostale svinje u sve tri grupe su eutanizirane 30 dana posle izazivanja i procenjene su plućne lezije za svaku svinju u eksperimentu.

Vakcinacija:

Svakoj svinji u vakcinisanoj grupi je data jedna doza od 2 ml testirane vakcine IM sa strane u vrat.

Izazivanje i autopsija:

VirulentniM. hyopneumoniaeštok za izazivanje, smrznuti (-70°C) homogenat pluća je pripremila Dr. Eileen Thacker sa Univerziteta države Ajova (ISU). Rastvor za izazivanje je potvrđeno da je čist i da je sadržao približno 10M. hyopneumoniaeorganizama po ml. Preporučena doza za izazivanje je 10 ml 1:100 razblaženog stoka (tj. 1.0xl0<6>organizma).

Svinje u vakcinisanim i izazivanim kontrolnim grupama u prvom eksperimentu su izazavane sa 14 ml 1:100 razblaženog stoka, (tj. 1.4 xl0<6>organizama). Svinje u drugom ispitivanju su izazvane sa 10 ml 1:100 razblaženog stoka (tj. 1.0xl0<6>organizama) kao što je preporučeno.

Na dan izazivanja, homogenat je brzo otopljen u toploj vodi i razblažen prema preporukama ISU korišćenjem sterilnog medijuma za rastM. hyopneumoniae.Svinjama je dat sedativ, smeša Xylazine-Ketamine-Telazol™ koja se sastoji od 50 mg/ml Xylazine-a, 50 mg/ml Ketamine-a i 100 mg/ml Telazol-a. Anestetička smeša je data IM pri 0.01-0.02 ml/lb telesne težine. Svakoj svinji dato je pojedinačno 14 ml (prvi eksperiment) ili 10 ml doze (drugi eksperiment) materijala za izazivanje, intra-trahealno. Da bi se osiguralo ispravno postavljanje igle, vazduh je izvučen iz šprica pre davanja doze za izazivanje. Nevakcinisane neizazivane kontrolne svinje su zadržane u odvojenim sobama i nisu izazivane.

Tridesetog dana posle izazivanja (DPI), sve svinje su eutanizirane. Pluća su uklonjena i većina plućnih lezija je procenjena individualno bez znanja o ) j-testiranoj grupi.

Sakupljanje uzoraka i testiranje

Uzorci krvi su sakupljeni od svih svinja na dan vakcinacije (0 DPV), jedan mesec posle vakcinacije (1 MPV), 4 MPV/0 DPI i 30 DPI zbog serumskih antitela protivM. hyopneumoniaekoja su detektovana sa kompetativnim ELISA kit-om (napravljenim od DAKO Co.). Pre nego što su testirani, uzorci seruma su čuvani na -20°C.

Analize podataka

Procene plućnih lezija su poređene između vakcinisanih i nevakcinisanih grupa analizom varijanse (ANOVA). Plućne procene su transformisane sa arcsin-om da bi se poboljšala raspodela ostataka.

REZULTATI I DISKUSIJA

Serologija:Sve svinje u oba eksperimenta su testirane na serumska antitela protivM. hyopneumoniaekomercijalnim kompetitivnim ELISA kitom, korišćenjem 1:10 serumskog razblaženja za sva testiranja. Sve svinje su bile seronegativne (titar antitela <10) u vreme vakcinacije, ukazujući da su životinje bile osetljive naM. hyopneumoniae.Sve svinje u kontrolnoj grupi su ostale seronegativne pre izazivanja. Ovo ukazuje daje imuni odgovor kod vakcinisanih svinja poticao od vakcine, a ne zbog izlaganja okolini. Sve svinje u vakcinisanoj grupi i većina svinja u izazivanoj kontrolnoj grupi (18 od 22 svinje u prvom eksperimentu i 15 od 25 u drugom eksperimentu) sero-konvertovaneM. hyopneumoniaeposle izazivanja dok neizazivane životinje su ostale sero-negativne. Ovo ukazuje da je izazivanje biloM hyopneumoniaespecifično. Serološki status testiranih životinja je ukratko prikazan u Tabeli 1.

Testiranje imunogenog svojstva u prvom eksperimentu:

Prvi eksperiment je izveden da se odredi da li vakcina iz primera 2 može da stimuliše jak imunitet koji može štititi naspram višeg nivoa izazivanja nego onog preporučenog od ISU četiti meseca posle vakcinacije. Ovaj eksperiment takođe upoređuje vakcinu iz primera 2 sa komercijalno dostupnom, Ingelvac M. hyo®, u sposobnosti stimulisanja zaštitnog imuniteta četiri meseca posle vakcinacije.

Dvadeset dve svinje vakcinisane sa FDAH Suvaxyn MH-One i osam svinja sa licenciranim proizvodom, Ingelvac M. hyo® serija 271,032 su izazivane sa 1.4xl0<6>organizama po svinji materijala za izazivanje (1.0xl0<6>organizama po svinji je preporučeno od ISU, videti Odeljak 5.5). Dvadeset i dve svinje su služile kao izazivane kontrole i 10 svinja kao neizazivane kontrole. Procenti plućnih lezija su ukratko dati u Tabeli 2. Svinje vakcinisane sa vakcinom prema primeru 2, imaju prosečno plućne lezije 15.9% a izazivane kontrolne svinje imaju prosečno plućne lezije 19.6%. Bilo je manje plućnih lezija u grupi vakcinisanoj sa vakcinom iz primera 2 nego kod kontrolnih čak i kada su svinje izazivane višim dozama Mhyopneumoniae.Međutim, razlika nije bila značajna (p=0.19). Prema tome, kada je procenjivan komercijalni proizvod Ingelvac M. hyo® u istoj grupi životinja izazivanjem sa istom dozom, dobijen je sličan nivo plućni lezija (14.6%). Ne postoji značajna razlika između grupa vakcinisanih sa Ingelvac M. hyo® i kontrolne grupe (p=0.27) i između grupe vakcinisane sa Ingelvac

M. hyo® i grupe vakcinisane sa vakcinom iz primera 2 (p=0.88).

Mada je neznatno numeričko smanjenje u lezijama zabeleženo u grupi koja je primila vakcinu iz primera 2, podaci dobijeni u ovom eksperimentu sugerišu da viša doza za izazivanje (1.4 xl0<6>organizama) korišćena u ovom eksperimentu je verovatno ekstremna, čak i za imunitet svinja stimulisan sa komercijalnim Inglavec proizvodom. Ovaj nivo izazivanja verovatno nije odgovarajući za studije procene vakcinacije/izazivanja korišćenjem veličine grupe od 20-25, mada sa većom grupom moguće da bi značaj bio dokazan.

Testiranje imunogenog svojstva u drugom eksperimentu:

Svinje u vakcinisanoj i izazivanoj kontrolnoj grupi u drugom eksperimentu su procenjivane sa dozom za izazivanje (1.0xl0<6>organizama) kao što preporučuje ISU, četiri meseca posle vakcinacije da bi se pokazao četvoromesečni DOL Procenat plućnih lezija je ukratko izložen u Tabeli 3. Kontrolna grupa je imala prosečno plućnih lezija 10.4%. Vakcinisana gupa je imala prosečno plućnih lezija 5.5%. Postoji značajna razlika između vakcinisanih i kontrolnih grupa (p=0.031). Ovo ukazuje daje vakcina iz primera 2 efikasna u stimulisanju zaštitnog imuniteta, koji može trajati bar četiri meseca posle vakcinacije sa jednom dozom, kod svinja koje su stare tri nedelje.

Procenjivanje sakupljenih rezultata iz oba eksperimenta:

Dok su dva eksperimenta bila značajno različita, efekat eksperimenta na grupu nije bio značajan. Magnituda efekta grupe je bila slična između dva eksperimenta. Prema tome, efekat grupe može biti procenjivan bez obzira na eksperimant. S obzirom da analize potpunog modela pokazuju da interakcija imeđu grupe i eksperimenta nije bila značajna, ovo podržava mišljenje daje efekat grupe bio isti u oba eksperimanta i opravdava spajanje podataka iz dva eksperimenta u jednu analizu. Tako, kada su podaci koji se odnose na vakcinu primera 2 iz oba eksperimenta spojeni i varjabla transformisana arcsin-om za plućne lezije je analizirana sa grupom, a eksperiment kao nezavisna promenjiva (redukovan model), grupa je statistički značajna (p=0.013).

Primer 4

Procenjivanje dugotrajnog imuniteta izazvanog sa kompozicijom

vakcine prema pronalsku protiv virulentnog izazivanja šest meseci posle

davanja jedne doze

Korišćenjem suštinski istog postupka opisanog u primerima 1 i 2 i korišćenjem dole prikazane količine, pripremljena je test vakcina A.

KRATAKPREGLED

Trideset tri svinje od 21 dan su upisane za ovo procenjivanje. Dvadeset svinja starosti od tri nedelje je vakcinisano sa jednom dozom vakcine A intramuskularno (IM). Deset svinja je poslužilo kao nevakcinisane kontrole i tri svinje kao neizazivana kontrola okoline.

Sve svinje su bile seronegativne (titar antitela <10) u vreme vakcinacije ukazuje da su životinje bile osetljive naM. hyopneumoniae.Sve svinje u kontrolnim grupama su ostale seronegativne pre izazivanja. Ovo ukazuje da je imuni odgovor kod vakcinisanih svinja bio od vakcine, a ne zbog izlaganja okolini.

Šest meseci posle vakcinacije, 20 vakcinisanih svinja i 10 nevakcinisanih kontrolnih svinja je izazivano sa virulentnimM. hyopneumoniae(1.0xl0<6>organizama po svinji). Tri svinje su služile kao neizazivane kontrole. Vakcinisane svinje su imale u prošeku procenjene plućne lezije 3.6%, a izazivane kontrolne svinje su imale u prošeku procenjene plućne lezije 14.6%. Plućne lezije u vakcinisanoj grupi su bile značajno manje nego kontrolnim (p=0.0215).

Podaci dobijeni u ovom procenjivanju pokazuju da test vakcina A izaziva dugoročni zaštitini imunitet protiv izazivanja sa virulentnomMhvopneumoniae šest meseci posle vakcinacije sa jednom dozom.

Plan eksperimenta

Trideset tri svinje stare 21 dan su nasumično raspoređene u tri grupe (vakcinisanu grupu, izazivanu kontrolnu grupu i neizazivanu kontrolnu grupu okoline) korišćenjem Microsoft Excel programa nasumične raspodele od Iitter-a. Dvadeset svinja starosti od tri nedelje je bilo vakcinisano sa jednom dozom test vakcine A intramuskularno. Deset svinja je poslužilo kao izazivane kontrole i tri svinje kao neizazivane kontrole okoline. Svinje u vakcinisanoj grupi i izazivanoj kontroli su izazivane sa 10 ml virulentneM hyopneumoniae(1.0xl0<6>organizama) kulturom po svinji, šest meseci posle vakcinacije. Tri n'evakcinisane svinje su korišćene kao neizazivana kontrola. Izazivane svinje i neizazivane kontrole su eutanazirane 26 dana posle izazivanja i procenjene su plućne lezije kod svake svinje.

Svakoj svinji u vakcinisanoj grupi je data doza od 2 ml test vakcine IM sa strane u vrat.

Izazivanje i autopsija

Virulentni štokM. hyopneumoniaeza izazivanje, i zamrznuti (<-70°C) homogenat pluća je pripremila Dr. Eileen Thacker sa Univerziteta države Ajova (ISU). Potvrđeno je daje štok za izazivanje čist i da sadrži približno 10M. hyopneumoniaeorganizama po ml.

Svinje su izazivane sa 10 ml štoka razblaženja 1:100 (tj., približno 1.0xl0<6>organizama).

Na dan izazivanja, homogenat je otopljen brzo pod toplom vodom i razblažen prema preporukama ISU korišćenjem sterilnog medijuma za rastM hyopneumoniae.Svinjama je dat sedativ, smeša Xylazine-Ketamine-Telazol™ koja se sastoji od 50 mg/ml Xylazine-a, 50 mg/ml Ketamine-a i 100 mg/ml Telazol-a. Anestetička smeša je data IM pri 0.01-0.02 ml/lb telesne težine. Svakoj svinji data je pojedinačna doza 10 ml materijala za izaivanje (lxl0<6>organizama), intra-trahealno. Da bi se osiguralo ispravno postavljanje igle, vazduh je izvučen iz šprica pre davanja doze za izazivanje. Nevakcinisane neizazivane kontrolne svinje su zadržane u odvojenim sobama i nisu izazivane.

26-tog dana posle izazivanja (DPI), sve svinje su eutanazirane. Pluća su uklonjena i procenjena je većina plućnih lezija kao što je opisano u Primeru 3.

Sakupljanje uzorka i testiranje

Uzorci krvi su sakupljeni od svih svinja na dan vakcinacije (0 DPV), 35 DPV, -1 DPI i 26 DPI za određivanje serumskih antitela protivM. hyopneumoniaešto je detektovano sa kompetativnim ELISA kitom (napravljenim od DAKO Co.). Uzorci seruma su čuvani na <-20°C pre testiranja.

Analiza podataka

Procene lezija pluća su poređene između vakcinisanih i kontrola sa jednosmernim ANOVA. Procene plućnih lezija su bile transformisane sa are sin-om da bi se poboljšala raspodela ostataka. S obzirom da je normalna pretpostavka za plućne lezije dovedena u pitanje, i procene plućnih lezija i are sin transformisane procene plućnih lezija su analizirane sa Wilcoxon Rank sumarnim testom. Nivo značajnosti je podešen na p<0.05. Rezultati iz neparametarskog, Wilcoxon Rank sumarnog testa su bili korišćeni za svrhe izveštavanja.

REZULTATI IDISKUSUJA

Serologija

Sve svinje su testirane na serumska antitela protivM. hyopneumoniaesa komercijalnim kompetirivnim ELISA kitom, korišćenjem 1:10 razblaženja seruma za sva testiranja. Uzorci sa sumljivim rezultatima testa po instrukcijama kita su tretirani kao pozitivni u analizi podataka. Sve svinje su bile sero-negativne (titar antitela <10) u vreme vakcinacije, ukazujući da su životinje bile osetljive naM. hyopneumoniae.Sve svinje u kontrolnoj grupi su ostale sero-negativne pre izazivanja. Posle vakcinacije, petnaest od dvadeset vakcinanata (15/20) su postali sero-pozitivni naM. hyopneumoniaebar jednom (uzorci sakupljeni 35 DPV i -1DPC). Ovo ukazuje daje imuni odgovor kod vakcinisanoh svinja bio usled vakcine, a ne zbog izlaganja okolini. Sve vakcinisane svinje i četiri od deset svinja u izazivanoj kontrolnoj grupi su postale seropozitivne naM. hyopneumoniaeposle izazivanja dok neizazivane životinje su ostale sero-negativne. Serološki status je ukratko prikazan u Tabeli 4.

Procenjivanje plućnih lezija

Dvadeset vakcinisanih svinja sa test vakcinom A i deset nevakcinisanih kontrolnih svinja su bile izazivane sa virulentimM. hyopneumoniae(1.0xl0<6>organizama po svinji), šest meseci posle vakcinacije. Tri svinje su služile kao neizazivane kontrole. Osam od dvadeset vakcinanata (40%) nije razvilo plućne lezije posle izazivanja dok u kontrolnoj grupi samo jedna od 10 svinja (10%) nema plućne lezije. Procenti plućnih lezija su ukratko dati u Tabeli 5. Vakcinisane svinje imaju prošek procenjenih plućnih lezija 3.6% i izazivne kontrolne svinje imaju prošek procenjenih plućnih lezija 14.6%. Plućne lezije u vakcinisanoj grupi su bili značajno manje nego u kontrolnim (p=0.0215). Kao što se može videti iz podataka prikazanih u tabeli 4 i 5, test vakcina A izaziva zaštitni imunitet protiv virulentneM. hyopneumoniaizazivane šest meseci posle davanja jedne doze svinjama vakcinisanim u trećoj nedelji

.starosti.

Primer 5

Vakcine protov virusa svinjskog gripa mogu biti napravljene postupcima poznatim u stanju tehnike. Takođe soj SIV, kao što su HINI i H3N2 su takođe dobro poznati u stanju tehnike i lako dostupni, na primer od NVSL, Ames, Iowa, USDA i drugih. Ovi sojevi mogu tipično biti odgajani, na primer na Maidin Darby Canine Kidney (MDCK) ćelijskoj liniji korišćenjem na primer Opti-Mem® medijuma za rast, obogaćenog kao što odgovara, sa jednim ili više od goveđeg fetalnog seruma, albumina goveđeg seruma, laktalbumina, hidrozilata i natrijum bikarbonata. U jednom primeru, da bi se pomogao optimalni rast virusa, medijum za rast za odgajanje HINI soja će još biti obogaćen sa odgovarajućim količinama buljona triptoza fosfata, natrijum butirata i tripsina; i medijum za rast za odgajanje H3N2 soja će dalje biti obogaćen sa odgovarajućim količinama tripsina. Pri sakupljanju, sakupljene virusne tečnosti mogu biti inaktivirane sa formalinom. SIV kompozicija vakcine koja sadrži ove sojeve vakcine može zatim tipično biti formulisana kao što sledi:

Kombinacija vakcine sa SIV-om prema pronalasku može biti tipično pripremljena kao što sledi:

Tri različite studije su korišćene da se pokaže efiksanost različitih frakcija u kombinaciji. U svakoj od studija nasumično raspoređene svinje odgovarajuće starosti su raspoređene u tri grupe: vakcinisana grupa, izazivana kontrolna grupa za frakciju koja se testira i kontrolna grupa okoline.

Rezultati ovih studija su kao što sledi:

KRATKI PRIKAZ STUDIJE - M. hvo. frakcija

Ovaj eksperiment sa životinjama je osmišljen da pokaže efiksanostM hyopneumoniaefrakcije vakcine protiv svinjskog gripa, HINI i H3N2, mrtvog virusa-Mvcoplasma Hvopneumoniae bakterije prema pronalasku i nedostatka antigen blokade od strane SIV frakcije.

Sve svinje su bile sero-negativne (titar antitela < 10) u vreme vakcinisanja, ukazujući da su životinje osetljive naM. hyopneumoniae.Sve svinje u kontrolnoj grupi su ostale sero-negativne pre izazivanja. Ovo ukazuje da imuni odgovor kod vakcinisanih svinja je posledica vakcinacije a ne bilo kakvom izlaganja okolini.

Dvadeset dve (22) svinje su vakcinisane sa SIV vakcinom (vakcina A) u prvoj nedelji starosti i revakcinisane sa MH/SIV vakcinom (Vakcina B) tri nedelje posle prve vakcinacije. Dvadeset dve (22) svinje su služile kaoM. hyopneumoniaeizazivane kontrole i tri svinje kao kontrola okoline. Četiri nedelje posle druge vakcinacije, svinje u vakcinisanoj grupi i kontrolnoj izazivanoj grupi su izazivane sa virulentnomM. hyopneumoniae.Svinje su eutanazirane 28 dana posle izazivanja i procenjivane su plućne lezije za svaku svinju.

Kod osamnaest (18) od 20 svinja (90%) u kontrolnoj grupi su razvijene plućne lezije više od 5% dok u vakcinisanoj grupi samo osam od 21 svinje (38%>) ima procenjene plućne lezije više od 5%. Vakcinisana grupa je imala u prošeku 10. 2% plućnih lezija i izazivane kontrolne svinje su imale u prošeku 16. 9% plućnih lezija. Postojala je značajna razlika između vakcinisane grupe i kontrolne grupe (p = 0.02). Ovo ukazuje da svinje vakcinisane sa SIV vakcinom u prvoj nedelji starosti i vakcinisane sa MH/SIV vakcinom tri nedelje kasnije razvile su zaštitni imunitet naspram izazivanja sa virulentnomM. hyopneumoniae.Ovo takođe ukazuje da ne postoji efekat blokiranja atigena uM. hyopneumoniaefrakciji sa SIV frakcijom u MH/SIV kombinovanoj vakcini.

KRATKI PRIKAZ STUDIJE - SIV HINI frakcija

Ovaj eksperiment sa životinjama je osmišljen da pokaže efiksanost frakcije virusa svinjskog gripa (SIV) HINI vakcine protiv svinjskog gripa, HINI i H3N2, mrtvogvirusa- Mycoplasma Hyopneumoniaebakterije prema pronalasku.

Sve svinje su bile sero-negativne (titar antitela < 10) do SIV HINI u vreme vakcinisanja. Sve kontrole su ostale sero-negativne pre izazivanja dok su sve vakcinisane svinje sero-konverotovane u SIV HINI. Ovo ukazuje da zaštitni imuni odgovor kod vakcinisanih svinja, kao što je pokazano izazivanjem, je posledica vakcinacije, a ne bilo kakvog izlaganja okolini.

Dvadeset pet (25) svinja su vakcinisane sa SIV vakcinom (vakcina A) u prvoj nedelji starosti i revakcinisane sa MH/SIV vakcinom (vakcina B) tri nedelje posle prve vakcinacije. Dvadeset četiri (24) svinje su služile kao izazivane kontrole i pet svinja kao kontrola okoline. Svinje su izazivane tri nedelje posle druge vakcinacije. Posmatrani su klinički znaci kod svinja i rektalne temperature su zabeležene dnevno polazeći od drugog dana pre izazivanja do petog dana posle izazivanja (DPI). 5 DPI svinje su eutanazirane i procenjene su plućne lezije za svaku svinju. Pokušana je izolacija virusa iz nazalnih tampona sakupljenih 0 DPI, 3 DPI i 5 DPI i sakupljenih uzorca plućnog tkiva pri autopsiji.

Virus nije izolovan iz nazalnih tampona sakupljenih od svinja pre izazivanja (0 DPI). Virus je izolovan iz 10 od 24 svinje u kontrolnoj grupi u poređenju sa 1 od 25 vakcinanata iz nazalnih tampona sakupljenih posle izazivanja (3 DPI i 5DPI). Postoji značajna razlika između vakcinisane gupe i kontrolne grupe u nazalnom skidanju virusa posle izazivanja (p=0.0011). Virus je takođe izolovan iz uzoraka tkiva pluća sakupljenih pri autopsiji kod 14 od 24 kontrolne svinje i kod 1 od 25 vakcinisanih svinja. Postoji značajna razlika između vakcinisane grupe i kontrolne grupe (p<0.0001). Kolektivno, virus je izolovan iz 19 od 24 kontrole (79%) i samo 2 od 25 vakcinanata (8%) posle izazivanja. Pored toga, SIV HINI izazivanje je takođe izazvalo febrilan odgovor. Dok celokupan febrilan odgovor nije bio značajan (p = 0.07) između vakcinanata i kontrola, kontrole su imale značajnije veće povećanje temperature 2 DPI u poređenju sa vakcinantima (p=0.0355). Klinički znaci indukovani izazivanjem su bili veoma blagi i frekfenca individualnih znakova je bila tako niska da je neodgovarajuće koristiti ove podatke za procenjivanje izazivanja. Vakcinisana grupa je imala prosečano procenjene plućne lezije 6.9% i izazivana kontrolna grupa je imala prosečno procenjene plućne lezije 9. 2%.

Ukratko, učestalost i frekfencija virusnog skidanja u nazalnoj šupljini i preovlađivanje izolacije virusa iz tkiva pluća je značajno niže kod vakcinisane grupe ako se poredi sa kontrolom. Vakcinisane svinje takođe su okusile manji febrilan odgovor posle izazivanja i takođe imaju manje plućnih lezija u poređenju sa kontrolnim svinjama. Ovo ukazuje da vakcinisane svinje su zaštićene naspram SIV HINI izazivanja.

KRATKI PRIKAZ STUDIJE - SIV H3N2 frakcija

Ovaj eksperiment sa životinjama je osmišljen da pokaže efiksanost virusa svinjskog gripa (SIV) H3N2 frakcije vakcine protiv svinjskog gripa, HINI i H3N2, mrtvog virusa-Mvcoplasma Hvopneumoniae bakterije prema pronalasku.

Sve svinje su ili sero-negativne (titar antitela <10) ili imaju niska materinska antitela na SIV H3N2 na dan prve vakcinacije (0 DPV1). Nizak titar materinskih antitela kod ovih svinja opada prema sero-negatinom do vremena izazivanja. Sve svinje u kontrolnoj grupi preostaju seronegativne pre izazivanja. Ovo ukazuje da zaštitni imuni odgovor kod vakcinisanih svinja, kao što je pokazano izazivanjem, je bio zbog vakcinacije a ne zbog bilo kojeg izlaganja okolini.

Dvadeset-dve svinje (22) su vakcinisane sa SIV vakcinom (vakcina A) u prvoj nedelji starosti i revakcinisane sa SIV-MHP vakcinom (vakcina B), tri nedelje posle prve vakcinacije. Osamnaest (18) svinja je služilo kao izazivana kontrola i pet sinja kao kontrola okoline. Posmatrani su klinički znaci kod svinja i rektalna temperatura je zabeležena tri dana pre i pet dana posle izazivanja (DPI). 5 DPI svinje su eutanazirane i plućne lezije su zabeležene za svaku svinju. Izolacija virusa je pokušana sa nazalnim tamponima sakupljenim 0 DPI, 3 DPI i 5 DPI i uzoracima plućnog tkiva.

SIV H3N2 virulentno izazivanje je indukovano febrilnim odgovorom kod kontrolnih svinja. Dok 78% kontrola je imalo groznicu, samo 18%> vakcinanata je imalo groznicu. Postoji značajana razlika u febrilnom odgovoru između vakcinisane grupe i kontrola (p=0.0002). Klinički znaci izazvani izazivanjem su blagi i frekvenca individualnih znakova je bila niska. Šest svinja u izazivanoj kontrolnoj grupi (33%) je imala kašalj u toku jednog ili dva dana dok su samo dve svinje u vakcinisanoj grupi ( 9. 1%) imale kašalj. Slično, nije bilo značajnije razlike u drugim kliničkim znacima između vakcinisane grupe i drugih kontrola. Petnaest (15) od 18 svinja u kontrolnoj grupi (83%) je razvio broj plućnih lezija veći od 5% dok u vakcinisanoj grupi samo 5 od 22 svinje (23%) ima procenjene plućne lezije veće od 5%. Vakcinisana grupa ima prosečan broj plućnih lezija 4.9% i izazivana kontrolna grupa ima prosečan broj plućnih lezija od 23. 2%. Postoji značajna razlika u proceni plućnih lezija između vakcinisane grupe i kontrolne grupe (p=0.0003). Virus nije izolovan iz nazalnih tampona sakupljenih od svinja pre izazivanja (0 DPI). Iz sakupljnih nazalnih tampona 3 DPI, virus je izolovan kod 12 od 18 svinja u kontrolnoj grupi (67%) u poređenju sa 5 od 22 vakcinisanih (23%). Virus je izolovan iz sakupljenih nazalnih tampona 5 DPI kod 3 od 18 svinja u kontrolnoj grupi, ali ne i kod bilo koje vakcinisane svinje. Virus je takođe izolovan iz uzoraka plućnog tkiva sakupljenog autopsijom (5 DPI) kod 5 od 18 svinja u kontrolnoj grupi, ali ne i kod bilo koje vakcinisane svinje. Postoji značajna razlika između vakcinisane grupe i kontrolne grupe u izolovanju virusa iz nazalnih tampona sakupljenih posle izazivanja (p=0.0035 za pojedinačni dan, p=0.0008 za skidanje virusa 3DPI i DPI u kombinaciji) i iz plućnog tkiva (p=0.013).

Ukratko, vakcinisane svinje su imale značajno manji febrilni odgovor posle izazivanja i takođe imaju mnogo manji broj plućnih lezija u poređenju sa kontrolnim svinjama. Postoji značajna razlika između vakcinanata i kontrola u sakupljanju virusa iz nazalne šupljine i negovom ponovnom nalaženju u uzoracima plućnog tkiva. Ovo ukazuje da vakcinisane svinje sa SIV vakcinom u prvoj nedelji starosti i ojačane sa SIV-MHP vakcinom tri nedelje kasnije su razvile zaštitni imunitet naspram virulentnog SIV H3N2 izazivanja.

Claims (22)

1. Kompozicija vakcine za imunizaciju životinja protiv infekcijeMycoplasma hyopneumoniaei viralnog patogena, naznačena time, što uključuje imunizirajuću količinu bakterijeMycoplasma hyopneumoniae\imunizirajuću količinu bar jednog virusnog antigena izabranog iz grupe koju čine virus svinjskog gripa (SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV) i svinjski cirkovirus (PCV); smešu pomoćnih sredstava koju čine polimer akrilne kiseline i smeša metaboličnog ulja i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera; i farmaceutski prihvatljiv nosač, gde kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet odMycoplasma hyopneumoniae.

2.Kompozicija vakcine prema zahtevu 1, naznačena time, što se smeša pomoćnih sredstava sastoji od polimera akrilne kiseline i smeše metaboličnog ulja koje se sastoji od jednog ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilena i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera u odnosu od oko 1:25 do 1:50 polimera akrilne kiseline u odnosu na smešu metabolično ulje/polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera.

3. Kompozicija vakcine prema zahtevu 1, naznačena time, što smeša pomoćnih sredstava čini oko 1-25% v/v kompozicije vakcine.

4. Kompozicija vakcine prema zahtevu 3, naznačena time, što polimer akrilne kiseline je prisutan u koncentraciji od oko 1% v/v i smeša terpenski ugljovodonici/polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimer je prisutna u krajnjoj koncentraciji od oko 5%> do 10%> v/v.

5. Kompozicija vakcine prema zahtevu 3, naznačena time, što smeša pomoćnih sredstava se sastoji od oko 2%o-15%o v/v kompozicije vakcine.

6. Kompozicija vakcine prema zahtevu 5, naznačena time, što smeša pomoćnih sredstava se sastoji od oko 5%-12% v/v kompozicije vakcine.

7. Kompozicija vakcine prema zahtevu 1, naznačena time, što metabolično ulje je skvalan ili skvalen.

8. Kompozicija vakcine prema zahtevu 6 ili 7, naznačena time, što polimer akrilne kiseline je karbomer.

9. Kompozicija vakcine prema bilo kom zahtevu 1-8, naznačena time, što dalje uključuje bar jednu bakteriju izabranu iz grupe koju čineHaemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiaei bakterija leptospire.

10. Kompozicija vakcine prema bilo kog od zahteva 1-8, naznačen time, što se dalje sastoji od bakterijskog ili virusnog antigena izabranog od jedne ili više od sledećih grupa, SIV;Haemonphilus parasuis;grupa se sastoji od PRRSV i PCV; grupa se sastoji od SIV iErysipelothrix rhusiopathiae:grupa se sastoji odPasteurella multiocidaiBordetella bronchiseptica.

11. Postupak zaštite životinja protiv bolesti uzrokovane saMycoplasma hyopneumoniaei bar još jednim virusnih antigenom, naznačen time, što uključuje stupanj davanja pomenutoj životinji kompozicije vakcine koja se sastoji od imunizirajuće količine bakterijeMycoplasma hyopneumoniae;imunizirajuće količine bar jednog virusnog antigena izabranog iz grupe koju čine virus svinjskog gripa (SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV) i svinjski cirkovirus (PCV); smeše pomoćnih sredstava koju čine polimer akrilne kiseline i smeša metaboličnog ulja i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera; i farmaceutski prihvatljivog nosača, gde kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet od infekcijeMycoplasma hyopneumoniae.

12. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što imunizirajuća količina pomenute bakterije je oko lxl0<8>do 3xl0<11>MHDCE/ml.

13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time, što imunizirajuća količina pomenute bakterije je oko lxl0<9>do 3xl0<9>MHDCE/ml.

14. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što način davanja u pomenutom stupnju davanja je intramuskularni, subkutanozni, intraperitonealni, aerosolom, oralno ili intranazalno.

15. Postupak prema zahtevu 11, naznačen time, što smeša pomoćnih sredstava se sastoji od polimera akrilne kiseline i smeše metaboličnog ulja koje čine jedan ili više terpenskih ugljovodonika i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimera prisutan u krajnjoj koncentraciji od oko 1-25% v/v.

16. Postupak prema zahtevu 15, naznačen time, što polimer akrilne kiseline smeše pomoćnih sredstava je karbomer.

17. Postupak prema zahtevu 15, naznačen time, što metabolično ulje smeše pomoćnih sredstava je terpenski ugljovodonik izabran iz grupe koju čine skvalen i skvalan.

18. Postupak prema bilo kom od zahteva 11-17, naznačen time, što se dalje sastoji od zajedničkog davanja bar jedne dodatne bakterije izabrane iz grupe koju čineHaemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiaei bakterija leptospire.

19. Postupak prema zahtevima 11-17 za zaštitu životinja naspram bolesti izazvnih saMycoplasma hyopneumoniaei bar jednog virusnog patogena i bar jednog dodatnog patogena, naznačen time, što dalje uključuje zajedničko davanje bar jednog dodatnog bakterijskog ili virusnog antigena izabranog od jednog ili više bakteriskih ili virusnih antigena izabranih iz jedne ili više sledećih grupa SIV;Haemonphilus parasuis;grupe koja se sastoji od PRRSV i PCV; grupe koja se sastoji od SIV iErysipelothrix rhusiopathiae;grupe koja se sastoji odPasteurella multiocidaiBordetella bronchiseptica.

20. Kompozicija vakcine za imuniziranje životinja naspram infekcijeMycoplasma hyopneumoniaei virusnog patogena, naznačena time, što se sastoji od imunizirajuće količine bakterijeMycoplasma hyopneumoniae;imunizirajuće količine bar jednog virusnog antigena izabranog iz grupe koju čineHaemonphilus parasuis, Pasteurella multiocida, Streptococcum suis, Actionobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae,bakterija leptospira, virus svinjskog gripa (SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV) i svinjski cirkovirus (PCV); bar jedno pomoćno sredstvo; i farmaceutski prihvatljivog nosača, gde kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet od infekcijeMycoplasma hyopneumoniae.

21. Kompozicija vakcine prema zahtevu 20, naznačena time, što dalje sadrži bakterijski i virusni antigen izabran iz jedne ili više sledećih grupa, SIV;Haemonphilus parasuis;grupe koja se sastoji od PRRSV i PCV; grupe koja se sastoji od SIV iErysipelothrix rhusiopathiae;grupe koja se sastoji odPasteurella multiocida \, Bordetella bronchiseptica.

22. Kompozicija vakcine za imuniziranje životinja naspram infekcijaMycoplasma hyopneumoniaei virusnih patogena, naznačena time, što se sastoji od imunizirajuće količine bakterijeMycoplasma hyopneumoniae;imunizirajuće količine bar jednog virusnog antigena izabranog iz grupe koju čine virus svinjskog gripa (SIV), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV) i svinjski cirkovirus (PCV); smešu pomoćnih sredstava koju čine polimer akrilne kiseline i metaboličnog ulje i polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimer u obliku emulzije ulja u vodi;i gde kompozicija vakcine posle jednog davanja izaziva zaštitni imunitet odMycoplasma hvopneumoniae. itX/V?rr!Br 7Ae7?.'.''.'?*"'\