RS67775B1 - Kombinovana terapija koja uključuje inhibitor kras-g12c i jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih agenasa za lečenje kancera - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] Predmetna prijava polaže pravo prvenstva na osnovu i u korist privremene američke prijave br.62/865,819, podnete 24. juna 2019. godine, privremene američke prijave br.

[0004] 62/821,376, podnete 20. marta 2019. godine i privremene američke prijave br.62/769,355, podnete 19. novembra 2018. godine.

[0006] LISTE SEKVENCI

[0007] Predmetna prijava se podnosi zajedno sa listom sekvenci u elektronskom formatu. Lista sekvenci je dostavljena kao datoteka pod nazivom A-2326-US-NP_SeqList_102919_ST25.txt, kreirana 29. oktobra 2019. godine, čija je veličina 15,4 kb. Informacije u elektronskom formatu liste sekvenci su u celosti uključene u ovaj dokument putem reference.

[0009] OBLAST PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje kombinovanu terapiju koja uključuje KRAS<G12C>inhibitor i jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih agenasa, naročito za lečenje kancera. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže KRAS<G12C>inhibitor i jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih agenasa za lečenje kancera. Upućivanja na metode lečenja u narednim stavovima treba tumačiti kao upućivanja na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove predmetnog pronalaska za upotrebu u metodi lečenja ljudi (ili životinja) terapijom.

[0012] POZADINA PRONALASKA

[0013] [0004] Mutacije KRAS gena su uobičajene kod kancera pankreasa, adenokarcinoma pluća, kolorektalnog kancera, kancera žučne kese, kancera tiroidne žlezde i kancera žučnih puteva. KRAS mutacije se takođe uočavaju kod oko 25% pacijenata sa NSCLC, a neke studije su ukazale na to da su KRAS mutacije negativan prognostički faktor kod pacijenata sa NSCLC. Nedavno je utvrđeno da mutacije homologa virusnog onkogena Kirstenovog sarkoma pacova V-Ki-ras2 (KRAS) uzrokuju rezistenciju na terapije usmerene na receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) kod kolorektalnog kancera; u skladu sa tim, status mutacije KRAS može pružiti važne informacije pre propisivanja TKI terapije. Sveukupno gledano, postoji potreba za novim medicinskim tretmanima za pacijente sa kancerom pankreasa, adenokarcinomom pluća ili kolorektalnim kancerom, naročito one kod kojih je dijagnostikovano da takve kancere karakteriše KRAS mutacija, uključujući i one kod kojih je bolest progresirala nakon hemioterapije. Onkogene KRAS mutacije na ostacima G12, G13 i Q61 predstavljaju najčešće RAS mutacije pronađene u solidnim malignitetima. Nedavno je pokazano da KRAS<G12C>može biti meta kovalentnih inhibitora u vidu malih molekula koji reaguju sa mutantnim cisteinom koji se nalazi pored džepa u regiji „switch II” (SIIP), zaključavajući KRAS u njegovom neaktivnom stanju vezanom za GDP.

[0015] KRAS je najčešće mutirani onkogen u kanceru kod ljudi i kodira ključni signalni protein u tumorima. Mutant KRAS<G12C>poseduje cistein koji je iskorišćen za dizajniranje kovalentnih inhibitora sa obećavajućom pretkliničkom aktivnošću. Optimizovali smo seriju inhibitora sa novim vezivnim interakcijama i značajno povećanom jačinom i selektivnošću. Ovi napori su doveli do otkrića (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-(2-propenoil)-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona (AMG 510), prvog inhibitora KRAS<G12C>u kliničkom razvoju. Pretklinički, tretman sa AMG 510 doveo je do regresije KRAS p.G12C tumora i značajno poboljšao antitumorsku efikasnost hemioterapije i ciljanih agenasa. Kod imunokompetentnih miševa, tretman sa AMG 510 rezultirao je proinflamatornim tumorskim mikrokruženjem i proizveo trajna izlečenja u kombinaciji sa inhibicijom imunoloških kontrolnih tačaka. Izlečeni miševi su odbacili rast izogenih KRAS p.G12D tumora, što ukazuje na adaptivni imunitet protiv zajedničkih antigena. AMG 510 je pokazao preliminarne dokaze kliničke antitumorske aktivnosti u prvoj kohorti doziranja i predstavlja potencijalno transformativnu terapiju za pacijente kojima nedostaju efikasni tretmani.

[0017] KRAS onkoprotein je GTPaza koja je suštinski medijator intracelularnih signalnih puteva uključenih u rast i preživljavanje tumorskih ćelija. U normalnim ćelijama, KRAS funkcioniše kao molekularni prekidač, menjajući stanja između neaktivnog stanja vezanog za GDP i aktivnog stanja vezanog za GTP. Prelaz između ovih stanja olakšavaju faktori razmene guanin nukleotida (GEF) koji učitavaju GTP i aktiviraju KRAS, i hidroliza GTP-a, koju katalizuju proteini koji aktiviraju GTPazu (GAP) kako bi inaktivirali KRAS. Vezivanje GTPa za KRAS promoviše vezivanje efektora radi pokretanja puteva transdukcije signala uključujući RAF-MEK-ERK (MAPK). Somatske, aktivirajuće mutacije u KRAS-u su obeležje kancera i sprečavaju asocijaciju GAP-ova, čime stabilizuju vezivanje efektora i pojačavaju KRAS signalizaciju. Pacijenti sa KRAS mutantnim tumorima imaju značajno lošije ishode i lošiju prognozu. Iako postoje klinički odobreni inhibitori nekoliko proteina MAPK puta (npr. MEK, BRAF, EGFR) za podskup tipova tumora, do danas nije bilo kliničkih molekula koji su selektivni za KRAS mutantne tumore. Štaviše, nekoliko ciljanih terapija za MAPK put su kontraindikovane za lečenje KRAS mutantnih tumora zbog nedostatka kliničke efikasnosti. Dodatno, terapije koje nisu selektivne za tumor ili za mutant mogu izazvati ciljanu toksičnost zbog inhibicije MAPK signalizacije u normalnim ćelijama. Ovo može ograničiti korisnost kombinovanja takvih agenasa sa standardnom negom ili imunoterapijom. Dakle, postoji značajna neispunjena potreba za razvojem tumor-selektivnih terapija koje ne uvode rizike za normalne ćelije.

[0019] KRAS p.G12C je prisutan u približno 13% adenokarcinoma pluća, 3% kolorektalnog kancera i 2% drugih solidnih tumora. Mutantni cistein KRAS<G12C>nalazi se pored džepa (P2) koji je prisutan u neaktivnom obliku KRAS-a vezanom za GDP. Blizina džepa P2 i mutantnog cisteina dovela je do široke potrage za kovalentnim inhibitorima. Prvi objavljeni skrining elektrofilla za KRAS<G12C>doveo je do eventualne identifikacije ARS-1620, koji pokazuje in vivo efikasnost u pretkliničkim KRAS p.G12C modelima. Iako je ARS-1620 kompanije Araxes Pharma bio prekretnica za dokaz koncepta selektivne inhibicije mutantnog KRAS-a, on je bio pozicioniran kao test jedinjenje za pretkliničke studije. Naučnici iz Amgen, Inc. identifikovali su seriju novih molekula na bazi akrilamida koji koriste prethodno neiskorišćeni površinski žleb u KRAS<G12C>kako bi značajno povećali jačinu i selektivnost. Intenzivni skrining elektrofilla i dizajn zasnovan na strukturi kulminirali su otkrićem AMG 510, prvog inhibitora KRAS<G12C>koji je stigao do kliničkog ispitivanja na ljudima (videti www.clinicaltrials.gov NCT03600883). Predmetni pronalazak obuhvata uverljivu pretkliničku aktivnost AMG 510, njegovu sposobnost da poveća ubijanje tumorskih ćelija kao monoterapija ili u kombinaciji sa drugim terapijama, i dramatičan uticaj na infiltraciju imunih ćelija, što čini mikrokruženje tumora izuzetno osetljivim na imunoterapiju. Preliminarni dokazi kliničke efikasnosti su takođe predstavljeni u ovom dokumentu.

[0021] [0008] WO2016044772A1 otkriva kombinovane terapije za lečenje kancera povezanih sa mutacijama u KRAS genu. WO2018119183A2 otkriva inhibitore KRAS G12C, njihove kompozicije i metode njihove upotrebe. EP3401314A1 otkriva ireverzibilne inhibitore G12C mutantnog K-Ras proteina. WO2018217651A1 otkriva inhibitore KRAS G12C, njihove kompozicije i metode njihove upotrebe.

[0023] SAŽETAK PRONALASKA

[0024] Predmetni pronalazak obuhvata jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta, pri čemu upotreba obuhvata davanje pacijentu terapijski efikasne količine (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-(2-propenoil)-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona koji ima sledeću hemijsku strukturu

[0026]

[0028] ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i terapijski efikasne količine najmanje jednog dodatnog farmaceutski aktivnog agensa, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens karboplatin, anti-PD-1 antitelo, MEK inhibitor, EGFR inhibitor, mTOR inhibitor, SHP2 inhibitor, PI3K inhibitor ili AKT inhibitor.

[0030] Predmetni pronalazak dalje otkriva metodu lečenja kancera, kao što su solidni tumori, uključujući kancer pluća, debelog creva i pankreasa, kombinacijom AMG 510, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i najmanje jednog terapijskog agensa, pri čemu je terapijski agens odabran od anti-PD-1 antitela, karboplatina, MEK inhibitora, EGFR inhibitora, TOR inhibitora, SHP2 inhibitora, PI3K inhibitora i AKT inhibitora.

[0032] Predmetni pronalazak dalje otkriva izolovanu ćelijsku liniju koja obuhvata dva KRAS<G12C>alela, pri čemu je ćelijska linija CT-26 KRAS p.G12C.

[0034] Predmetni pronalazak dalje otkriva metodu za generisanje ćelijske linije koja obuhvata dva KRAS<G12C>alela, pri čemu metoda obuhvata:

[0035] 1. a) inkubiranje ćelijske linije koja obuhvata dva KRAS<G12D>alela sa CRISPR konstruktom koji indukuje zamenu nukleotida na oba KRAS alela tako da se formiraju dva KRAS<G12C>alela; i

[0036] 2. b) izolovanje ćelijske linije koja obuhvata ta dva KRAS<G12C>alela.

[0037] Predmetni pronalazak je definisan u priloženom skupu patentnih zahteva.

[0039] KRATAK OPIS CRTEŽA

[0040]

[0041] Slika 1 prikazuje da AMG 510 u kombinaciji sa karboplatinom pojačava supresiju rasta NCI-H358 NSCLC tumora.

[0042] Slika 2 prikazuje da AMG 510 u kombinaciji sa MEK inhibitorom PD-325901 rezultira povećanom efikasnošću u ksenograft modelu NSCLC NCI-H358.

[0043] Slika 3 prikazuje da AMG 510 inhibira in vivo rast CT-26 KRAS p.G12C tumora.

[0044] Slika 4 prikazuje da AMG 510 u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom rezultira povećanim preživljavanjem i trajnim izlečenjima u mišjem modelu KRAS p. G12C mutantnog kancera. Slika 5 prikazuje da tretman sa AMG 510 dovodi do povećanja infiltracije CD8+ i CD4+ T-ćelija u CT-26 G12C-H10 tumorima.

[0045] Slika 6 prikazuje da tretman sa AMG 510 dovodi do povećanja PD-L1 pozitivnih neutrofila u CT-26 G12C-H10 tumorima.

[0046] Slika 7 prikazuje da matrica viška aditivnosti identifikuje regione sinergističke interakcije. Slika 8 prikazuje da matrice samoukrštanja eksperimentalno modeluju aditivnost.

[0047] Slika 9 prikazuje da AMG 510 deluje sinergistički i sa RMC-4550 (SHP2i) i sa trametinibom (MEKi) kako bi se postiglo ubijanje ćelija u ćelijskoj liniji NCI-H358.

[0048] Slika 10 prikazuje da nedostatak aktivnosti pojedinačnog agensa kod afatiniba ili RMC-4550 može doprineti slabijoj sinergiji u ćelijskoj liniji MIA PaCA-2.

[0049] Slika 11 prikazuje da kombinacije u 3D kulturi mogu otkriti povećanu sinergiju.

[0050] Slika 12 prikazuje da je AMG 510 X trametinib sinergističan u NCI-H358.

[0051] Slika 13 prikazuje samoukrštanje AMG-a u ćelijskoj liniji NCI-H358.

[0052] Slika 14 prikazuje samoukrštanje trametiniba u ćelijskoj liniji NCI-H358.

[0053] Slika 15 prikazuje da AMG 510 X trametinib pokazuje slabu sinergiju u ćelijskoj liniji MIA PaCa-2.

[0054] Slika 16 prikazuje da 3D kultura poboljšava sinergiju AMG 510 X trametiniba u MIA PaCa-2.

[0055] Slika 17 prikazuje AMG 510 X trametinib (3D) u ćelijskoj liniji NCI-H1373.

[0056] Slika 18 prikazuje da AMG 510 X trametinib pokazuje slabu sinergiju zbog velike jačine svakog pojedinačnog agensa u CT-26 KRAS p.G12C.

[0057] Slika 19 prikazuje da AMG 510 X PD-325901 pokazuje slabu sinergiju u MIA PaCa-2.

[0058] Slika 20 prikazuje da je AMG 510 X afatinib sinergističan u ćelijskoj liniji NCI-H358.

[0059] Slika 21 prikazuje da je AMG 510 X afatinib slabo sinergističan u ćelijskoj liniji MIA PaCa-2.

[0060] Slika 22 prikazuje da 3D kultura ne poboljšava sinergiju AMG 510 X afatiniba u ćelijskoj liniji MIA PaCa-2.

[0061] Slika 23 prikazuje AMG 510 X afatinib (3D) u ćelijskoj liniji NCI-H1373.

[0062] Slika 24 prikazuje da je AMG 510 X afatinib umereno sinergističan u CT-26 KRAS p.G12C. Slika 25 prikazuje da je AMG 510 X lapatinib sinergističan u ćelijskoj liniji NCI-H358. Slika 26 prikazuje da je AMG X erlotinib umereno sinergističan u ćelijskoj liniji NCI-H358. Slika 27 prikazuje da nije uočena sinergija kod AMG 510 X erlotiniba u ćelijskoj liniji MIA PaCa-2 zbog nedostatka aktivnosti erlotiniba.

[0063] Slika 28 prikazuje da nije uočena sinergija kod AMG 510 X cetuksimaba u SW837 zbog nedostatka aktivnosti cetuksimaba in vivo.

[0064] Slika 29 prikazuje da je AMG 510 X RMC-4550 sinergističan u ćelijskoj liniji NCI-H358. Slika 30 prikazuje da je AMG 510 X RMC-4550 slabo sinergističan u ćelijskoj liniji MIA PaCa-2.

[0065] Slika 31 prikazuje da je AMG 510 X RMC-4550 umereno sinergističan u CT-26 KRAS p.G12C.

[0066] Slika 32 prikazuje da je AMG 510 X AMG 511 umereno sinergističan u ćelijskoj liniji NCI-H358.

[0067] Slika 33 prikazuje da je AMG 510 X AMG 511 slabo sinergističan u ćelijskoj liniji MIA PaCa-2.

[0068] Slika 34 prikazuje da je AMG 510 X AMG 511 umereno sinergističan u CT-26 KRAS p.G12C.

[0069] Slika 35 prikazuje da je AMG 510 X buparlisib (BKM120) umereno sinergističan u ćelijskoj liniji NCI-H358.

[0070] Slika 36 prikazuje da je AMG 510 X AZD5363 slabo sinergističan u ćelijskoj liniji NCI-H358.

[0071] Slika 37 prikazuje da je AMG 5120 X AZD5363 slabo sinergističan u MIA PaCa-2.

[0072] Slika 38 prikazuje da AMG 510 inhibira KRAS signalizaciju u CT-26 KRAS p.G12C u 2D kulturi.

[0073] Slika 39 prikazuje da su mišje CT-26 KRAS p.G12C ćelije osetljive na AMG 510 u 3D kulturi.

[0074] Slika 40a prikazuje rendgensku ko-kristalnu strukturu KRAS<G12C/C51S/C80L/C118S>vezanog za GDP i ARS-1620 (PDB ID: 5V9U).

[0075] Slika 40b prikazuje rendgensku ko-kristalnu strukturu KRAS<G12C/C51S/C80L/C118S>vezanog za GDP i AMG 510 pri rezoluciji od 1,65 Å (PDB ID: još nije dodeljen).

[0076] Slika 40c prikazuje biohemijsku aktivnost AMG 510 i ARS-1620 merenu testom razmene nukleotida katalizovanom SOS1 sa prečišćenim KRAS<G12C/C118A>ili

[0077] KRAS<C118A>proteinom, n=4.

[0078] Slika 40d prikazuje kinetička svojstva AMG 510 i ARS-1620 određena masenom spektrometrijom (n≥2).

[0079] Slika 40e prikazuje ćelijsku aktivnost AMG 510 i ARS-1620 u NCI-H358 i MIA PaCa-2 merenu inhibicijom fosforilacije ERK1/2 nakon 2-časovnog tretmana (n=2).

[0080] Slika 40f prikazuje inhibiciju fosforilacije ERK i zauzeće KRAS<G12C>bod strane AMG 510 u ćelijama NCI-H358 i MIA PaCa-2 nakon 2-časovnog tretmana (n=3).

[0081] Slika 40g prikazuje ćelijsku aktivnost AMG 510 i ARS-1620 u NCI-H358 i MIA PaCa-2 merenu efektima na vijabilnost ćelija nakon tretmana od 72 sata (n=3).

[0082] Slika 40h prikazuje kinetička svojstva AMG 510 i ARS-1620 određena inhibicijom fosforilacije ERK (n≥2).

[0083] Slika 41a prikazuje efekat na ćelijsku signalizaciju u NCI-H358 ili MIA PaCa-2 nakon 4-časovnog ili 24-časovnog tretmana sa dozno-zavisnim odgovorom na AMG 510.

[0084] Slika 41b prikazuje efekat na ćelijsku signalizaciju u NCI-H358 ili MIA PaCa-2 nakon tretmana sa 0,1 µM AMG 510 u vremenskim tačkama do 24 sata.

[0085] Slika 41c prikazuje ćelijsku aktivnost AMG 510 kroz panel KRAS p.G12C i ne-KRAS p.G12C mutantnih ćelijskih linija merenu inhibicijom fosforilacije ERK1/2 nakon 2-časovnog tretmana (n≥2).

[0086] Slika 41d prikazuje ćelijsku aktivnost AMG 510 kroz panel KRAS p.G12C i ne-KRAS p.G12C mutantnih ćelijskih linija merenu efektima na vijabilnost ćelija nakon tretmana od 72 sata.

[0087] Slika 41e prikazuje da su krive dozno-zavisnog odgovora vijabilnosti reprezentativni primeri od najmanje n=2 eksperimenta. Efekat tretmana od 72 sata sa AMG 510 na vijabilnost ćelija u uslovima adherentnog monosloja ili sferoidne kulture (n=2).

[0088] Slika 41f prikazuje analizu proteoma cisteina u lizatima celih ćelija NCI-H358 nakon 4 sata tretmana sa 1 µM AMG 510 (n=5).

[0089] Slike 42a-d prikazuju da AMG 510 inhibira fosforilaciju ERK 1/2 u KRAS

[0090] p.G12C mutantnim tumorima in vivo. Miševima koji nose MIA PaCa-2 T2 (slike 42a, c, d) ili NCI-H358 (slika 42b) tumore data je pojedinačna doza bilo vehikuluma oralno ili AMG 510 oralno (svi ostali stubići), a uzorci su prikupljeni 2 sata kasnije (slike 42a, b) ili tokom vremena kako je naznačeno (slike 42c, d) i procenjeni su nivoi p-ERK mereni MSD imunotestom. Uzorci plazme i tumora su prikupljeni i analizirani na koncentracije AMG 510 (crveni trouglovi, odnosno crni otvoreni krugovi). Podaci su predstavljeni kao procenat kontrole u odnosu na vehikulum. Podaci predstavljaju srednju zapreminu tumora ± SEM (n=3/grupa). Na slikama 42a-d, **** P < 0,0001; * P < 0,05 prema Danetovom testu.

[0091] Slika 42f prikazuje rezultate tretmana sa AMG 510 tokom režima doziranja u kovalentnoj modifikaciji KRAS<G12C>koristeći masenu spektrometriju koja korelira sa inhibicijom p-ERK kod miševa koji nose MIA PaCa-2 T2.

[0092] Slika 42f prikazuje rezultate tretmana sa AMG 510 tokom režima doziranja u kovalentnoj modifikaciji KRAS<G12C>koristeći masenu spektrometriju koja korelira sa inhibicijom p-ERK kod miševa koji nose NCI-H358.

[0093] Slika 42g prikazuje rezultate tretmana sa AMG 510 tokom vremena u kovalentnoj modifikaciji KRAS<G12C>koristeći masenu spektrometriju koja korelira sa inhibicijom p-ERK kod miševa koji nose MIA PaCa-2 T2.

[0094] Slika 43a prikazuje da su miševima sa uspostavljenim MIA PaCa-2 T2 KRAS

[0095] p.G12C tumorima davani ili vehikulum ili AMG 510. AMG 510 selektivno inhibira in vivo rast KRAS p.G12C mutantnih tumora.

[0096] Slika 43b prikazuje da su miševima sa uspostavljenim NCI-H358 KRAS p.G12C tumorima davani ili vehikulum ili AMG 510. AMG 510 selektivno inhibira in vivo rast KRAS p.G12C mutantnih tumora.

[0097] Slika 43c prikazuje da su miševima sa uspostavljenim CT-26 KRAS p.G12C tumorima davani ili vehikulum ili AMG 510. AMG 510 selektivno inhibira in vivo rast KRAS

[0098] p.G12C mutantnih tumora.

[0099] Slika 43d prikazuje efekte na rast tumora u KRAS<G12C>NSCLC PDX modelu kod miševa tretiranih ili vehikulumom ili sa AMG 510. AMG 510 selektivno inhibira in vivo rast KRAS p.G12C mutantnih tumora.

[0100] Na slikama 43a, b, c i d, podaci predstavljaju srednju zapreminu tumora ± SEM (n=10/grupa). Slike 43a, b i c, **** P < 0,0001, * P < 0,05 za poređenja vehikuluma sa grupom tretmana prema Danetovom testu, # P < 0,05 regresija uparenim t-testom, i **** P < 0,0001 prema dvosmernoj ANOVA-i sa ponovljenim merenjima.

[0101] Slika 43e prikazuje CT skenove dva pacijenta sa KRAS p.G12C karcinomom pluća lečenih sa AMG 510. Reprezentativni skenovi pre tretmana („polazna vrednost“) i posle tretmana (R<x>).

[0102] Krajnje levo: gornji paneli predstavljaju gornji levi režanj pluća, a donji paneli predstavljaju donji desni režanj pluća. Krajnje desno: gornji panel predstavlja gornji levi režanj pluća; donji panel predstavlja pleuru. AMG 510 selektivno inhibira in vivo rast KRAS

[0103] p.G12C mutantnih tumora.

[0104] Slika 43f i slika 47a predstavljaju miševe koji nose CT-26 KRAS p.G12C tumore kojima je davan vehikulum ili AMG 510. Grafikoni pojedinačnih CT-26 KRAS p.G12C tumora kod miševa tretiranih sa AMG 510 (100 mg/kg).

[0105] Slika 43g i slika 47a ilustruju miševe koji nose CT-26 KRAS p.G12C tumore kojima je davan vehikulum ili AMG 510. Grafikoni pojedinačnih CT-26 KRAS p.G12C tumora kod miševa tretiranih sa AMG 510 (200 mg/kg). Nastavak tretmana u grupi od 100 mg/kg sugerisao je da regresija nije bila trajna (slika 43f), verovatno zbog nepotpune inhibicije p-ERK (slika 47a). Stoga je procenjena doza od 200 mg/kg AMG 510, što je rezultiralo skoro potpunom inhibicijom p-ERK (slika 47a) i dovelo do osam od deset trajnih izlečenja (slika 43g), sa nivoima AMG 510 u plazmi neposredno ispod ćelijskog IC90 (slika 47h).

[0106] Slika 44a ilustruje AMG 510 u kombinaciji sa karboplatinom na NCI-H358 tumorskim ksenograftima.

[0107] Na slici 44b ilustruju se rezultati sinergije za kombinacije AMG 510 sa ciljanim agensima koji su izračunati korišćenjem Luveovog algoritma viška aditivnosti i predstavljeni kao toplotna mapa, pri čemu viši rezultati (tamnije crvena boja) označavaju jače sinergističke interakcije.

[0108] Slika 44c ilustruje AMG 510 u kombinaciji sa MEK inhibitorom (PD-0325901) na NCI-H358 tumorskim ksenograftima.

[0109] Na slikama 44a i c, podaci predstavljaju srednju zapreminu tumora ± SEM (n=10/grupa). U delu a *** P < 0,001 za poređenje kombinovanog tretmana sa svakim pojedinačnim agensom prema Danetovom testu, # P < 0,001 regresija uparenim t-testom. U delu c **** P < 0,001 kombinovani tretman u poređenju sa svakim pojedinačnim agensom prema Danetovom testu, # P < 0,001 regresija uparenim t-testom. Rezultati svih grupa tretmana bili su značajni u poređenju sa vehikulumom (**** P < 0,0001 prema Danetovom testu).

[0110] Slika 45a prikazuje rast CT-26 KRAS p.G12C umora kod pojedinačnih miševa tretiranih ili vehikulumom, AMG 510, anti-PD-1, ili AMG 510 u kombinaciji sa anti-PD-1 (n=10/grupa). Linije sa krugovima označavaju miševe bez tumora.

[0111] Slika 45b prikazuje Kaplan-Majerovu analizu surogatne krajnje tačke preživljavanja (veličina tumora >800 mm<3>). Mantel-Koksov test **** P < 0,001 u odnosu na kontrolu vehikulumom; # P < 0,005 kombinacija naspram samo AMG 510 ili samo anti-PD-1.

[0114] 1

[0115] Slika 45c prikazuje CT-26 KRAS p.G12C tumore miševa tretiranih tokom četiri dana vehikulumom, AMG 510, anti-PD-1, AMG 510 u kombinaciji sa anti-PD-1 ili MEKi, čiji je imunofenotip određen protočnom citometrijom (n=8/grupa). **** P < 0,0001, *** P < 0,001, ** P < 0,01, *P < 0,05 prema Takijevom testu u poređenju sa kontrolom vehikulumom; NS = nije značajno.

[0116] Slika 45d prikazuje da je RNK izolovana iz CT-26 KRAS p.G12C tumora nakon dva dana tretmana (n=5/grupa). Ekspresija gena i rezultati su izračunati NanoString tehnologijom (videti metode). **** P < 0,0001, *** P < 0,001 prema Takijevom testu.

[0117] Slika 45e prikazuje ekspresiju MHC klase I antigena H-2K<d>na površini ćelije na CT-26 KRAS p.G12C ćelijama nakon 24-časovnog tretmana sa AMG 510 u prisustvu ili odsustvu interferona gama („IFNγ”) merenu protočnom citometrijom. Nivoi sekretovanog IFN-γ mereni su ELISpot imunotestom (n=4-5/grupa).

[0118] Slika 45f prikazuje rast pojedinačnih tumora kod miševa koji su izlečeni kombinacijom AMG 510 i anti-PD-1 tretmana i ponovo izloženi ćelijama CT-26 KRAS p. G12C, CT-26 ili 4T1. Slika 45g prikazuje da su splenociti prikupljeni i izloženi navedenim ćelijama, CT-26, CT-26 KRAS p.G12C ili 4T1 ćelijama. * P = 0,0269 prema neuparenom t-testu za poređenje kontrole naspram kombinacije.

[0119] Slika 45h Tretman sa AMG 510 indukuje proinflamatorno tumorsko mikrokruženje. CT-26 KRAS p.G12C tumori miševa tretiranih tokom četiri dana vehikulumom, AMG 510, anti-PD-1, AMG 510 u kombinaciji sa anti-PD-1 ili MEKi, imunofenotipizirani su imunohistohemijom (n=5/grupa), imunohistohemijsko bojenje na CD3/Ki67. Ki67 imunopozitivna mrlja je plava i nuklearna, a CD3 i CD8 imunopozitivne mrlje su braon i citoplazmatske. Strelica u h ukazuje na primere ćelija sa dvostrukom imunopozitivnošću na CD3 i Ki67.

[0120] Slika 45i Tretman sa AMG 510 indukuje proinflamatorno tumorsko mikrokruženje, CT-26 KRAS p.G12C tumori miševa tretiranih tokom četiri dana vehikulumom, AMG 510, anti-PD-1, AMG 510 u kombinaciji sa anti-PD-1 ili MEKi, imunofenotipizirani su imunohistohemijom (n=5/grupa), imunohistohemijsko bojenje na CD8. Ki67 imunopozitivna mrlja je plava i nuklearna, a CD3 i CD8 imunopozitivne mrlje su braon i citoplazmatske. Slika 46a prikazuje biohemijsku aktivnost AMG 510 i njegovog nereaktivnog propionamidnog analoga merenu testom razmene nukleotida katalizovanom SOS1 sa prečišćenim KRAS<G12C/C118A>ili KRAS<C118A>proteinom (n≥2). Za sve slike 46a-e, podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD za naznačeni broj nezavisnih replikata.

[0121] Slika 46b prikazuje izračunate maksimalne brzine reakcije i koncentracije koje postižu polumaksimalnu brzinu za AMG 510 i ARS-1620.

[0122] Slika 46c prikazuje inhibiciju fosforilacije ERK pomoću RMC-4550 u ćelijama NCI-H358 sa t<1/2>=12,2 min (n=2).

[0123] Slika 46d prikazuje efekat tretmana od 72 sata sa AMG 510 na vijabilnost ćelija u uslovima adherentnog monosloja ili sferoidne kulture u MIA PaCa-2 i NCI-H1373 (n=2).

[0124] Slika 46e prikazuje određivanje vremena poluraspada KRAS-a u ćelijama MIA PaCa-2 i NCI-H358 obeležavanjem stabilnim izotopima pomoću aminokiselina u ćelijskoj kulturi (SILAC).

[0125] Na slikama 47a-c prikazano je da su miševi koji nose CT-26 KRAS p.G12C tumore tretirani pojedinačnom dozom vehikuluma oralno ili naznačenim dozama AMG 510 oralno, a uzorci su prikupljeni 2 sata kasnije. Nivoi p-ERK mereni su MSD imunotestom. Uzorci plazme i tumora su prikupljeni i analizirani na koncentracije AMG 510 (crveni trouglovi, odnosno crni otvoreni krugovi). Podaci su predstavljeni kao procenat kontrole (POC) u odnosu na vehikulum. **** P < 0,0001, * P < 0,05 prema Danetovom testu u poređenju sa vehikulumom.

[0126] Slika 47d prikazuje da tretman sa AMG 510 rezultira kovalentnom modifikacijom KRASG12C koja je u obrnutoj korelaciji sa inhibicijom p-ERK.

[0127] Slika 47e prikazuje efekat AMG 510 na rast tumora u SW480-1AC ksenograft modelu.

[0128] Slika 47f prikazuje efekat tretmana sa AMG 510 na rast tumora u KRAS<G12C>SCLC PDX modelu. Na slikama 47e i f, tretman je započeo kada su tumori dostigli približno 200 mm<3>. **** P < 0,0001 prema dvosmernoj ANOVA-i sa ponovljenim merenjima.

[0129] Slika 47g prikazuje nivoe AMG 510 u plazmi iz MIA PaCa-2 T2, NCI-H358 ksenografta. Slika 47h prikazuje nivoe AMG 510 u plazmi iz CT-26 KRASp.G12C ksenografta.

[0130] Slika 47i prikazuje grafikone pojedinačnih CT-26 KRAS p.G12C tumora kod miševa tretiranih sa AMG 510 (200 mg/kg) kod BALB/c bezdlakih miševa od 14. do 32. dana.

[0131] Slika 47j prikazuje CT skenove dva pacijenta sa KRAS p.G12C karcinomom pluća lečenih sa AMG 510. Dodatni reprezentativni skenovi pre tretmana („polazna vrednost”) i posle tretmana (R<x>) kod pacijenata koji su prethodno opisani na slici 43d (krajnje levo od vrha do dna), gornji levi režanj pluća, donji levi režanj pluća, limfni čvor, gornji levi režanj pluća, gornji levi režanj pluća. Krajnje desno odozgo nadole, donji levi režanj pluća, donji levi režanj pluća, pleura i nadbubrežna žlezda.

[0132] Slika 47k ilustruje AMG 510 kao pojedinačni agens ili u kombinaciji sa karboplatinom na NCI-H358 tumorskim ksenograftima. **** P < 0,0001 bprema Danetovom testu u poređenju sa kontrolom vehikulumom, # P < 0,001 regresija uparenim t-testom.

[0133] Slika 48 prikazuje matrice inhibicije rasta i višak po Luveovom algoritmu aditivnosti za AMG 510 doziran u kombinaciji sa ciljanim agensima u naznačenoj ćelijskoj liniji, pri čemu tamnije boje označavaju veće ubijanje ćelija (inhibiciju rasta) i jaču sinergističku interakciju (Luveov višak). Navedene su maksimalne testirane koncentracije inhibitora i raspon doza obuhvaćen matricama u svakoj kombinaciji. Pojedinačne heterologne kombinacije (AxB) su procenjene upoređivanjem njihovih rezultata sinergije sa rezultatima njihovih komponenti samoukrštanja (AxA ili BxB). Heterologne kombinacije su smatrane sinergističkim samo kada je njihov rezultat sinergije premašio trostruku vrednost rezultata sinergije bilo koje komponente samoukrštanja.

[0134] Slika 49a prikazuje ćelijsku aktivnost AMG 510 i MEK inhibitora trametiniba u CT-26 KRAS p.G12C i roditeljskim CT-26 ćelijskim linijama merenu inhibicijom fosforilacije ERK1/2 nakon 2-časovnog tretmana (n≥2).

[0135] Slika 49b prikazuje ćelijsku aktivnost AMG 510 i MEK inhibitora trametiniba u CT-26 KRAS p.G12C i roditeljskim CT-26 ćelijskim linijama merenu efektima na vijabilnost ćelija nakon tretmana od 72 sata u sferoidnoj kulturi (n=2).

[0136] Slika 50a prikazuje CT-26 KRAS p.G12C tumore kod miševa tretiranih tokom četiri dana vehikulumom, AMG 510, anti-PD-1, AMG 510 plus anti-PD-1 ili MEKi, čiji je imunofenotip određen protočnom citometrijom (n=8/grupa).

[0137] Slika 50b prikazuje da su miševi koji nose CT-26 KRAS p.G12C tumore tretirani pojedinačnom dozom vehikuluma oralno (crni stub) ili naznačenom dozom MEKi oralno (plavi stub) i žrtvovani 2 sata kasnije. Nivoi p-ERK mereni su MSD imunotestom. Uzorci plazme i tumora su prikupljeni i analizirani na koncentraciju MEKi (crveni trougao, odnosno crni otvoreni krug). Podaci su predstavljeni kao procenat kontrole (POC) u odnosu na vehikulum.

[0138] Slika 50c prikazuje efekat tretmana MEKi na rast tumora tokom vremena, meren kod miševa koji nose CT-26 KRAS p. G12C tumore. Podaci predstavljaju srednju zapreminu tumora ± SEM (n=10/grupa).

[0139] Slika 50d prikazuje zapremine tumora kod miševa koji nose CT-26 KRAS p.G12C tumore tretiranih tokom četiri dana vehikulumom, AMG 510, anti-PD-1, AMG 510 plus anti-PD-1 ili MEKi. Podaci predstavljaju srednju zapreminu tumora ± SEM (n=8/grupa).

[0142] 1

[0143] Slika 50e prikazuje da je RNK izolovana iz CT-26 KRAS p.G12C tumora nakon dva dana tretmana. Ekspresija gena i rezultati su izračunati NanoString tehnologijom (n=5/grupa). Slika 50f prikazuje ekspresiju MHC klase I antigena (H-2D<d>i H-2L<d>) na površini ćelije na CT-26 KRAS p.G12C ćelijama nakon 24-časovnog tretmana sa AMG 510 u prisustvu ili odsustvu IFNγ merenu protočnom citometrijom.

[0144] Slika 50g prikazuje krive rasta kod Balb/c miševa koji nose ili CT-26 ili CT-26 KRAS p.

[0145] G12C tumore.

[0146] Slika 50h prikazuje kvantifikaciju transkripta CXCL10 ili CXCL11, kao i sekretovanog IP-10 proteina, nakon 24-časovnog tretmana roditeljskih CT-26 ili CT-26 KRAS p.G12C ćelija sa AMG 510 ili MEKi.

[0147] Slika 50i prikazuje ekspresiju MHC klase I antigena (HLA, H-2D<d>i H-2K<d>) na površini ćelije na CT-26 KRAS p.G12C ćelijama nakon 24-časovnog tretmana SW-1573 nakon 48 sati tretmana i MIA PaCA-2 nakon 48 sati tretmana sa AMG 510 u prisustvu ili odsustvu IFNγ merenu protočnom citometrijom.

[0148] Na slikama 50a, b, c i e, * P < 0,05 prema Takijevom testu u odnosu na kontrolu vehikulumom; NS nije značajno; *** P < 0,001 prema Danetovom testu u poređenju sa vehikulumom; i **** P < 0,0001 prema Danetovom testu u poređenju sa kontrolom vehikulumom.

[0150] DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0151] Predmetni pronalazak obezbeđuje kombinovanu terapiju koja uključuje KRAS<G12C>inhibitor kao što je gore definisano i jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih agenasa, posebno za lečenje kancera. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže KRAS<G12C>inhibitor kao što je gore definisano i jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih agenasa kao što je gore definisano za lečenje kancera.

[0152] Jedinjenja otkrivena u ovom dokumentu uključuju sva farmaceutski prihvatljiva izotopski obeležena jedinjenja u kojima je jedan ili više atoma jedinjenja otkrivenih u ovom dokumentu zamenjen atomima koji imaju isti atomski broj, ali atomsku masu ili maseni broj drugačiji od atomske mase ili masenog broja koji se obično sreću u prirodi. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u otkrivena jedinjenja uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora, hlora i joda, kao što su 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 150, 170, 180, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 123I, odnosno 125I. Ova radioaktivno obeležena jedinjenja mogu biti korisna za pomoć pri određivanju ili merenju efikasnosti jedinjenja, karakterizacijom, na primer, mesta ili načina delovanja, ili afiniteta vezivanja za farmakološki važno mesto delovanja. Određena izotopski obeležena jedinjenja iz ovog otkrića, na primer, ona koja uključuju radioaktivni izotop, korisna su u studijama distribucije leka i/ili supstrata u tkivima. Radioaktivni izotopi tricijum, tj.3H, i ugljenik-14, tj.14C, posebno su korisni u ovu svrhu s obzirom na lakoću njihove ugradnje i dostupna sredstva za detekciju.

[0154] Supstitucija težim izotopima kao što je deuterijum, tj.2H, može pružiti određene terapijske prednosti koje proističu iz veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećanog vremena poluraspada in vivo ili smanjenih potreba za doziranjem, te se stoga u nekim okolnostima preferiraju.

[0156] Supstitucija izotopima koji emituju pozatrone, kao što su 11C, 18F, 150 i 13N, može biti korisna u studijama pozitronske emisione tomografije (PET) za ispitivanje zauzeća receptora supstratom. Izotopski obeležena jedinjenja strukture (I) se generalno mogu pripremiti konvencionalnim tehnikama poznatim stručnjacima u datoj oblasti ili postupcima analognim onima koji su opisani u preparatima i primerima kao što je dole navedeno, koristeći odgovarajući izotopski obeležen reagens umesto prethodno korišćenog neobeleženog reagensa.

[0158] Izotopski obeležena jedinjenja kao što su ovde otkrivena generalno se mogu pripremiti konvencionalnim tehnikama poznatim stručnjacima u datoj oblasti ili postupcima analognim onima koji su opisani u priloženim primerima i shemama, koristeći odgovarajući izotopski obeležen reagens umesto prethodno korišćenog neobeleženog reagensa.

[0160] Određena jedinjenja koja su ovde otkrivena mogu postojati kao stereoizomeri (tj. izomeri koji se razlikuju samo u prostornom rasporedu atoma), uključujući optičke izomere i konformacione izomere (ili konformere). Jedinjenja otkrivena u ovom dokumentu uključuju sve stereoizomere, kako u vidu čistih preparata pojedinačnih stereoizomera, tako i obogaćenih preparata svakog od njih, kao i racemske smeše takvih stereoizomera, kao i pojedinačne dijastereomere i enantiomere koji se mogu razdvojiti prema metodama poznatim stručnjacima u datoj oblasti. Dodatno, jedinjenja otkrivena u ovom dokumentu uključuju sve tautomerne oblike jedinjenja.

[0162] Određena jedinjenja otkrivena u ovom dokumentu mogu postojati kao atropizomeri, koji predstavljaju konformacione stereoizomere koji se javljaju kada je rotacija oko

[0165] 1

[0166] jednostruke veze u molekulu sprečena ili znatno usporena kao rezultat sternih interakcija sa drugim delovima molekula. Jedinjenja otkrivena u ovom dokumentu uključuju sve atropizomere, bilo kao čiste preparate pojedinačnih atropizomera, obogaćene preparate svakog od njih ili nespecifičnu smešu svakog od njih. Tamo gde je rotaciona barijera oko jednostruke veze dovoljno visoka, a interkonverzija između konformacija dovoljno spora, može se dozvoliti razdvajanje i izolovonje izomernih vrsta. Razdvajanje i izolovanje izomernih vrsta propisno se označava dobro poznatim i prihvaćenim simbolima „M” ili „P”.

[0168] Ova jedinjenja se mogu koristiti kao intermedijeri u postupku pravljenja jedinjenja u predmetnoj prijavi.

[0170] Ova jedinjenja mogu biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli i u farmaceutskoj formulaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0172] Ovde su takođe otkrivene farmaceutske kompozicije koje uključuju jedinjenje kao što je ovde otkriveno, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, kao što je, na primer, diluent ili nosač. Jedinjenja i farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju one kod kojih se jedinjenje može primeniti u efikasnoj količini za postizanje njegove predviđene svrhe. Primena jedinjenja detaljnije je opisana u daljem tekstu.

[0174] Ova jedinjenja se mogu koristiti kao intermedijeri u postupku pravljenja jedinjenja u predmetnoj prijavi.

[0176] Ova jedinjenja mogu biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli i u farmaceutskoj formulaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0178] Ovde su takođe otkrivene farmaceutske kompozicije koje uključuju jedinjenje kao što je ovde otkriveno, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, kao što je, na primer, diluent ili nosač. Jedinjenja i farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju one kod kojih se jedinjenje može primeniti u efikasnoj količini za postizanje njegove predviđene svrhe. Primena jedinjenja detaljnije je opisana u daljem tekstu.

[0180] Odgovarajuće farmaceutske formulacije može odrediti stručnjak u datoj oblasti u zavisnosti od puta primene i željene doze. Videti npr. Remington's Pharmaceutical Sciences,

[0183] 1

[0184] 1435-712 (18th ed., Mack Publishing Co, Easton, Pennsylvania, 1990). Formulacije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu eliminacije primenjenih agenasa in vivo. U zavisnosti od puta primene, odgovarajuća doza se može izračunati prema telesnoj težini, površini tela ili veličini organa. Dalje preciziranje proračuna neophodnih za određivanje odgovarajuće terapijske doze rutinski vrše stručnjaci u datoj oblasti bez nepotrebnog eksperimentisanja, naročito u svetlu informacija o doziranju i testova otkrivenih u ovom dokumentu, kao i farmakokinetičkih podataka koji se mogu dobiti putem kliničkih ispitivanja na životinjama ili ljudima.

[0186] Fraze „farmaceutski prihvatljivo” ili „farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekularne entitete i kompozicije koje ne proizvode neželjene, alergijske ili druge nepredviđene reakcije kada se primene na životinji ili čoveku. Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljivo” uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije i slično. Upotreba takvih ekscipijenasa za farmakološki aktivne supstance dobro je poznata u datoj oblasti. Izuzev u meri u kojoj je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa terapijskim kompozicijama, predviđena je njihova upotreba u terapijskim kompozicijama. Dopunski aktivni sastojci se takođe mogu ugraditi u kompozicije. U primerima otelotvorenja, formulacija može obuhvatati suvu materiju kukuruznog sirupa, visoko-oleinsko ulje šafranike, kokosovo ulje, sojino ulje, L-leucin, kalcijum-fosfat tribazni, L-tirozin, L-prolin, L-lizin acetat, DATEM (emulgator), L-glutamin, L-valin, kalijum-fosfat dibazni, L-izoleucin, L-arginin, L-alanin, glicin, L-asparagin monohidrat, L-serin, kalijumcitrat, L-treonin, natrijum-citrat, magnezijum-hlorid, L-histidin, L-metionin, askorbinsku kiselinu, kalcijum-karbonat, L-glutaminsku kiselinu, L-cistin dihidrohlorid, L-triptofan, L-asparaginsku kiselinu, holin-hlorid, taurin, m-inozitol, fero-sulfat, askorbil-palmitat, cinksulfat, L-karnitin, alfa-tokoferil acetat, natrijum-hlorid, nijacinamid, mešane tokoferole, kalcijum-pantotenat, kupri-sulfat, tiamin-hlorid hidrohlorid, vitamin A palmitat, mangansulfat, riboflavin, piridoksin hidrohlorid, folnu kiselinu, beta-karoten, kalijum-jodid, filohinon, biotin, natrijum-selenat, hrom-hlorid, natrijum-molibdat, vitamin D3 i cijanokobalamin.

[0188] Jedinjenje može biti prisutno u farmaceutskoj kompoziciji kao farmaceutski prihvatljiva so. Kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljive soli” uključuju, na primer, bazne adicione soli i kiselinske adicione soli.

[0191] 1

[0192] Farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli mogu se formirati sa metalima ili aminima, kao što su alkalni i zemnoalkalni metali ili organski amini. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja se takođe mogu pripremiti sa farmaceutski prihvatljivim katjonom. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi katjoni su dobro poznati stručnjacima u datoj oblasti i uključuju alkalne, zemnoalkalne, amonijum i kvaternarne amonijum katjone. Takođe su mogući karbonati ili hidrogen karbonati. Primeri metala koji se koriste kao katjoni su natrijum, kalijum, magnezijum, amonijum, kalcijum ili feri i slično. Primeri odgovarajućih amina uključuju izopropilamin, trimetilamin, histidin, N,N'-dibenziletilendiamin, hlorprokain, holin, dietanolamin, dicikloheksilamin, etilendiamin, N-metilglukamin i prokain.

[0194] Farmaceutski prihvatljive kiselinske adicione soli uključuju soli neorganskih ili organskih kiselina. Primeri odgovarajućih kiselinskih soli uključuju hidrohloride, formate, acetate, citrate, salicilate, nitrate, fosfate. Druge odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate stručnjacima u datoj oblasti i uključuju, na primer, mravlju, sirćetnu, limunsku, oksalnu, vinsku ili mandelnu kiselinu, hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu ili fosfornu kiselinu; sa organskim karboksilnim, sulfonskim, sulfo ili fosfo kiselinama ili N-supstituisanim sulfaminskim kiselinama, na primer sirćetnu kiselinu, trifluoro-sirćetnu kiselinu (TFA), propionsku kiselinu, glikolnu kiselinu, ćilibarnu kiselinu, maleinsku kiselinu, hidroksimaleinsku kiselinu, metilmaleinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, jabučnu kiselinu, vinsku kiselinu, mlečnu kiselinu, oksalnu kiselinu, glukonsku kiselinu, glukarnu kiselinu, glukuronsku kiselinu, limunsku kiselinu, benzojevu kiselinu, cimetnu kiselinu, mandelnu kiselinu, salicilnu kiselinu, 4-aminosalicilnu kiselinu, 2-fenoksibenzojevu kiselinu, 2-acetoksibenzojevu kiselinu, embonsku kiselinu, nikotinsku kiselinu ili izonikotinsku kiselinu; i sa aminokiselinama, kao što je 20 alfa aminokiselina uključenih u sintezu proteina u prirodi, na primer glutaminsku kiselinu ili asparaginsku kiselinu, a takođe i sa fenilsirćetnom kiselinom, metansulfonskom kiselinom, etansulfonskom kiselinom, 2-hidroksietansulfonskom kiselinom, etan 1,2-disulfonskom kiselinom, benzensulfonskom kiselinom, 4-metilbenzensulfonskom kiselinom, naftalen 2-sulfonskom kiselinom, naftalen 1,5-disulfonskom kiselinom, 2- ili 3-fosfogliceratom, glukoza 6-fosfatom, N-cikloheksilsulfaminskom kiselinom (sa formiranjem ciklamata) ili sa drugim kiselim organskim jedinjenjima, kao što je askorbinska kiselina.

[0196] Farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde otkrivena jedinjenja mogu se proizvoditi na konvencionalan način, npr. konvencionalnim postupcima mešanja, rastvaranja,

[0199] 1

[0200] granulacije, izrade dražeja, levigacije, emulgovanja, kapsuliranja, zarobljavanja ili liofilizacije. Pravilna formulacija zavisi od odabranog puta primene.

[0202] Za oralnu primenu, odgovarajuće kompozicije se mogu lako formulisati kombinovanjem ovde otkrivenog jedinjenja sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima kao što su nosači dobro poznati u datoj oblasti. Takvi ekscipijensi i nosači omogućavaju da se predmetna jedinjenja formulišu kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, kaše, suspenzije i slično, za oralno unošenje od strane pacijenta koji se leči. Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu mogu se dobiti dodavanjem ovde otkrivenog jedinjenja čvrstom ekscipijensu, opciono mlevenjem dobijene smeše i obradom smeše granula, nakon dodavanja odgovarajućih pomoćnih sredstava, ako se želi, da bi se dobile tablete ili jezgra dražeja. Odgovarajući ekscipijensi uključuju, na primer, punila i preparate celuloze. Ako se želi, mogu se dodati agensi za dezintegraciju. Farmaceutski prihvatljivi sastojci su dobro poznati za različite tipove formulacija i mogu biti, na primer, veziva (npr. prirodni ili sintetički polimeri), lubrikanti, surfaktanti, agensi za zaslađivanje i aromu, materijali za oblaganje, konzervansi, boje, zgušnjivači, adjuvansi, antimikrobni agensi, antioksidansi i nosači za različite tipove formulacija.

[0204] Kada se terapijski efikasna količina ovde otkrivenog jedinjenja primenjuje oralno, kompozicija je tipično u obliku čvrste (npr. tableta, kapsula, pilula, prašak ili troše) ili tečne formulacije (npr. vodena suspenzija, rastvor, eliksir ili sirup).

[0206] Kada se primenjuje u obliku tablete, kompozicija može dodatno sadržati funkcionalnu čvrstu materiju i/ili čvrsti nosač, kao što je želatin ili adjuvans. Tableta, kapsula i prašak mogu sadržati od oko 1 do oko 95% jedinjenja, a prvenstveno od oko 15 do oko 90% jedinjenja.

[0208] Kada se primenjuje u obliku tečnosti ili suspenzije, može se dodati funkcionalna tečnost i/ili tečni nosač kao što su voda, petroleum ili ulja životinjskog ili biljnog porekla. Tečni oblik kompozicije može dalje sadržati fiziološki rastvor soli, rastvore šećernih alkohola, dekstroze ili druge rastvore saharida ili glikole. Kada se primenjuje u obliku tečnosti ili suspenzije, kompozicija može sadržati od oko 0,5 do oko 90% masenih udela ovde otkrivenog jedinjenja, a prvenstveno oko 1 do oko 50% ovde otkrivenog jedinjenja. U jednom predviđenom otelotvorenju, tečni nosač je nevodeni ili suštinski nevodeni. Za

[0211] 1

[0212] primenu u tečnom obliku, kompozicija se može isporučiti kao brzo-rastvorljiva čvrsta formulacija za rastvaranje ili suspendovanje neposredno pre primene.

[0214] Kada se terapijski efikasna količina ovde otkrivenog jedinjenja primenjuje intravenskom, kutanom ili supkutanom injekcijom, kompozicija je u obliku sterilnog vodenog rastvora bez pirogena koji je parenteralno prihvatljiv. Priprema takvih parenteralno prihvatljivih rastvora, uz dužno poštovanje pH vrednosti, izotoničnosti, stabilnosti i sličnog, spada u veštinu stručnjaka u datoj oblasti. Poželjna kompozicija za intravensku, kutanu ili supkutanu injekciju tipično sadrži, pored ovde otkrivenog jedinjenja, izotonično sredstvo. Takve kompozicije se mogu pripremiti za primenu kao rastvori slobodne baze ili farmakološki prihvatljivih soli u vodi koja je na odgovarajući način pomešana sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilenglikolima i njihovim smešama, kao i u uljima. Pod običnim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati mogu opciono sadržati konzervans radi sprečavanja rasta mikroorganizama.

[0216] Injektabilne kompozicije mogu uključivati sterilne vodene rastvore, suspenzije ili disperzije i sterilne praškove za ekstempore pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, suspenzija ili disperzija. U svim otelotvorenjima, oblik mora biti sterilan i mora biti fluidan u meri u kojoj postoji laka mogućnost prolaska kroz iglu šprica. Mora biti stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti otporan na kontaminirajuće delovanje mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice, opcionim uključivanjem konzervansa. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr. glicerol, propilenglikol i tečni polietilenglikol i slično), njihove odgovarajuće smeše i biljna ulja. U jednom predviđenom otelotvorenju, nosač je nevodeni ili suštinski nevodeni. Pravilna fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica jedinjenja u otelotvorenju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim otelotvorenjima, biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere ili natrijum-hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići upotrebom agenasa u kompozicijama koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum-monostearata i želatina.

[0219] 2

[0220] Sterilni rastvori za injekcije pripremaju se ugradnjom aktivnih jedinjenja u zahtevanoj količini u odgovarajući rastvarač sa različitim drugim gore navedenim sastojcima, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom različitih sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilno sredstvo koje sadrži osnovni disperzioni medijum i zahtevane druge sastojke od onih gore navedenih. U otelotvorenju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjne metode pripreme su tehnike sušenja u vakuumu i liofilizacije, koje daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora.

[0222] Formulacije sa sporim ili produženim oslobađanjem takođe se mogu pripremiti kako bi se postiglo kontrolisano oslobađanje aktivnog jedinjenja u kontaktu sa telesnim tečnostima u gastrointestinalnom (GI) traktu i kako bi se obezbedio suštinski konstantan i efikasan nivo aktivnog jedinjenja u krvnoj plazmi. Na primer, oslobađanje se može kontrolisati putem jednog ili više mehanizama rastvaranja, difuzije i jonske razmene. Pored toga, pristup sporog oslobađanja može poboljšati apsorpciju putem zasićenih ili ograničavajućih puteva unutar GI trakta. Na primer, jedinjenje može biti, na primer, uklopljeno u polimernu matricu biološki razgradivog polimera, polimera rastvorljivog u vodi ili smeše oba, i opciono odgovarajućih surfaktanata. Uklapanje u ovom kontekstu može značiti ugradnju mikro-čestica u matricu polimera. ormulacije sa kontrolisanim oslobađanjem takođe se dobijaju putem enkapsulacije dispergovanih mikro-čestica ili emulgovanih mikro-kapljica putem poznatih tehnologija oblaganja disperzija ili emulzija.

[0224] Za primenu inhalacijom, jedinjenja iz predmetnog pronalaska se pogodno isporučuju u obliku aerosol spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz upotrebu odgovarajućeg potisnog gasa. U otelotvorenju aerosola pod pritiskom, jedinica doze se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i patroni od, npr. želatina, za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže praškastu smešu jedinjenja i odgovarajuće praškaste baze kao što su laktoza ili skrob.

[0226] [0043] Ovde otkrivena jedinjenja mogu se formulisati za parenteralnu primenu injekcijom (npr. bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom). Formulacije za injekciju mogu biti predstavljene u jediničnom doznom obliku (npr. u ampulama ili u višedoznim posudama), sa dodatim konzervansom. Kompozicije mogu imati oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim sredstvima, i mogu sadržati agense za formulisanje kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje.

[0228] Farmaceutske formulacije za parenteralnu primenu uključuju vodene rastvore jedinjenja u obliku rastvorljivom u vodi. Pored toga, suspenzije jedinjenja se mogu pripremiti kao odgovarajuće uljane suspenzije za injekciju. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili sredstva uključuju masna ulja ili sintetičke estre masnih kiselina. Vodene suspenzije za injekciju mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije. Opciono, suspenzija takođe može sadržati odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visoko koncentrovanih rastvora. Alternativno, predmetna kompozicija može biti u obliku praška za rekonstituciju sa odgovarajućim sredstvom (npr. sterilnom vodom bez pirogena) pre upotrebe.

[0230] Ovde otkrivena jedinjenja se takođe mogu formulisati u rektalnim kompozicijama, kao što su supozitorije ili retencione klistire (npr. koje sadrže konvencionalne baze za supozitorije). Pored prethodno opisanih formulacija, jedinjenja se takođe mogu formulisati kao depo preparati. Takve formulacije sa dugotrajnim delovanjem mogu se primeniti implantacijom (npr. supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Tako se, na primer, jedinjenja mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.

[0232] Posebno, jedinjenje otkriveno u ovom dokumentu može se primeniti oralno, bukalno ili sublingvalno u obliku tableta koje sadrže ekscipijense, kao što su skrob ili laktoza, ili u kapsulama ili ovulama, bilo samostalno ili u smeši sa ekscipijensima, ili u obliku eliksira ili suspenzija koje sadrže agense za aromu ili bojenje. Takvi tečni preparati mogu se pripremiti sa farmaceutski prihvatljivim aditivima, kao što su agensi za suspendovanje. Jedinjenje se takođe može ubrizgati parenteralno, na primer, intravenski, intramuskularno, supkutano ili intrakoronarno. Za parenteralnu primenu, jedinjenje je najbolje koristiti u obliku sterilnog vodenog rastvora koji može sadržati druge supstance, na primer, soli ili šećerne alkohole, kao što su manitol ili glukoza, kako bi rastvor bio izotoničan sa krvlju.

[0234] Za veterinarsku upotrebu, jedinjenje otkriveno u ovom dokumentu primenjuje se kao odgovarajuća prihvatljiva formulacija u skladu sa normalnom veterinarskom praksom.

[0235] Veterinar može lako odrediti režim doziranja i put primene koji su najprikladniji za određenu životinju.

[0237] U nekim otelotvorenjima, sve neophodne komponente za lečenje poremećaja povezanog sa KRAS-om korišćenjem jedinjenja kao što je ovde otkriveno, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim agensom ili intervencijom koja se tradicionalno koristi za lečenje takve bolesti, mogu biti upakovane u komplet. Konkretno, predmetni pronalazak otkriva komplet za upotrebu u terapijskoj intervenciji bolesti koji obuhvata upakovani set lekova koji uključuju jedinjenje otkriveno u ovom dokumentu, kao i pufere i druge komponente za pripremu isporučivih oblika navedenih lekova, i/ili uređaje za isporuku takvih lekova, i/ili bilo koje agense koji se koriste u kombinovanoj terapiji sa jedinjenjem otkrivenim u ovom dokumentu, i/ili uputstva za lečenje bolesti upakovana sa lekovima. Uputstva mogu biti fiksirana u bilo kom opipljivom medijumu, kao što je štampani papir ili kompjuterski čitljiv magnetni ili optički medijum, ili uputstva za upućivanje na udaljeni kompjuterski izvor podataka, kao što je veb stranica dostupna putem interneta.

[0239] „Terapijski efikasna količina” znači količinu efikasnu za lečenje ili sprečavanje razvoja, ili za ublažavanje postojećih simptoma subjekta koji se leči. Određivanje efikasnih količina je u okviru sposobnosti stručnjaka u datoj oblasti, naročito u svetlu detaljnog otkrića datog u ovom dokumentu. Generalno, „terapijski efikasna doza” odnosi se na onu količinu jedinjenja koja rezultira postizanjem željenog efekta. Na primer, terapijski efikasna količina jedinjenja otkrivenog u ovom dokumentu smanjuje KRAS aktivnost za najmanje 5% u poređenju sa kontrolom, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85% ili najmanje 90%.

[0241] Količina primenjenog jedinjenja može zavisiti od subjekta koji se leči, od starosti, zdravlja, pola i težine subjekta, vrste istovremenog tretmana (ako postoji), težine oboljenja, prirode željenog efekta, načina i učestalosti tretmana, kao i procene lekara koji propisuje terapiju. Učestalost doziranja takođe može zavisiti od farmakodinamičkih efekata na pritisak kiseonika u arterijama. Međutim, najpoželjnija doza se može prilagoditi individualnom subjektu, kao što je razumljivo i odredivo od strane stručnjaka u datoj oblasti, bez

[0244] 2

[0245] nepotrebnog eksperimentisanja. To tipično uključuje prilagođavanje standardne doze (npr. smanjenje doze ako pacijent ima malu telesnu težinu).

[0247] Iako se individualne potrebe razlikuju, određivanje optimalnih opsega efikasnih količina jedinjenja spada u veštinu stručnjaka u datoj oblasti. Za primenu kod ljudi u kurativnom ili profilaktičkom lečenju stanja i poremećaja koji su ovde identifikovani, na primer, tipične doze jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu biti od oko 0,05 mg/kg/dan do oko 50 mg/kg/dan, na primer najmanje 0,05 mg/kg, najmanje 0,08 mg/kg, najmanje 0,1 mg/kg, najmanje 0,2 mg/kg, najmanje 0,3 mg/kg, najmanje 0,4 mg/kg ili najmanje 0,5 mg/kg, i prvenstveno 50 mg/kg ili manje, 40 mg/kg ili manje, 30 mg/kg ili manje, 20 mg/kg ili manje ili 10 mg/kg ili manje, što može biti, na primer, od oko 2,5 mg/dan (0,5 mg/kg x 5 kg) do oko 5000 mg/dan (50 mg/kg x 100 kg). Na primer, doze jedinjenja mogu biti od oko 0,1 mg/kg/dan do oko 50 mg/kg/dan, oko 0,05 mg/kg/dan do oko 10 mg/kg/dan, oko 0,05 mg/kg/dan do oko 5 mg/kg/dan, oko 0,05 mg/kg/dan do oko 3 mg/kg/dan, oko 0,07 mg/kg/dan do oko 3 mg/kg/dan, oko 0,09 mg/kg/dan do oko 3 mg/kg/dan, oko 0,05 mg/kg/dan do oko 0,1 mg/kg/dan, oko 0,1 mg/kg/dan do oko 1 mg/kg/dan, oko 1 mg/kg/dan do oko 10 mg/kg/dan, oko 1 mg/kg/dan do oko 5 mg/kg/dan, oko 1 mg/kg/dan do oko 3 mg/kg/dan, oko 1 mg/dan do oko 1000 mg/dan, oko 20 mg/dan do oko 750 mg/dan, oko 3 mg/dan do oko 500 mg/dan, oko 5 mg/dan do oko 250 mg/dan, oko 10 mg/dan do oko 100 mg/dan, oko 3 mg/dan do oko 10 mg/dan ili oko 100 mg/dan do oko 250 mg/dan. Takve doze se mogu primeniti u jednoj dozi ili se mogu podeliti u više doza.

[0248] METODE KORIŠĆENJA KRAS<G12C>INHIBITORA

[0249] Predmetno otkriće obelodanjuje metod inhibicije ćelijske signalizacije posredovane RAS-om koji obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa efikasnom količinom jednog ili više jedinjenja otkrivenih u ovom dokumentu. Inhibicija transdukcije signala posredovane RAS-om može se proceniti i dokazati na širok spektar načina poznatih u datoj oblasti.

[0250] Neograničavajući primeri uključuju prikazivanje (a) smanjenja GTPazne aktivnosti RAS-a; (b) smanjenja afiniteta vezivanja GTP-a ili povećanja afiniteta vezivanja GDP-a; (c) povećanja K off za GTP ili smanjenja K off za GDP; (d) smanjenja nivoa molekula za transdukciju signala nizvodno u RAS putu, kao što je smanjenje nivoa pMEK, pERK ili pAKT; i/ili (e) smanjenja vezivanja RAS kompleksa za nizvodne signalne molekule uključujući, ali ne ograničavajući se na Raf. Za određivanje jednog ili više od gore navedenog mogu se koristiti kompleti i komercijalno dostupni testovi.

[0251] Otkriće takođe obelodanjuje metode korišćenja jedinjenja ili farmaceutskih kompozicija iz predmetnog otkrića za lečenje bolesnih stanja, uključujući stanja u koja je uključena G12C KRAS, HRAS ili NRAS mutacija (npr. kancer).

[0253] Obelodanjen je metod za lečenje kancera, pri čemu metod obuhvata primenu efikasne količine bilo koje od prethodno navedenih farmaceutskih kompozicija koje obuhvataju jedinjenje kao što je ovde otkriveno subjektu kome je to potrebno. U nekim otelotvorenjima, kancer je posredovan KRAS, HRAS ili NRAS G12C mutacijom. U različitim otelotvorenjima, kancer je kancer pankreasa, kolorektalni kancer ili kancer pluća. U nekim otelotvorenjima, kancer je kancer žučne kese, kancer štitne žlezde i kancer žučnih puteva.

[0255] Otkriće obelodanjuje metod lečenja poremećaja kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu navedeni metod obuhvata određivanje da li subjekt ima KRAS, HRAS ili NRAS G12C mutaciju i ako se utvrdi da subjekt ima KRAS, HRAS ili NRAS G12C mutaciju, tada se subjektu primenjuje terapijski efikasna doza najmanje jednog jedinjenja kao što je ovde otkriveno ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0257] Otkrivena jedinjenja inhibiraju rast ćelija nezavisan od podloge i stoga imaju potencijal da inhibiraju metastaziranje tumora. Shodno tome, u drugom otelotvorenju, otkriće obelodanjuje metod za inhibiciju metastaziranja tumora, pri čemu metod obuhvata primenu efikasne količine jedinjenja otkrivenog u ovom dokumentu.

[0259] KRAS, HRAS ili NRAS G12C mutacije su takođe identifikovane kod hematoloških maligniteta (npr. kancera koji zahvataju krv, koštanu srž i/ili limfne čvorove). Shodno tome, određena otelotvorenja su usmerena na primenu otkrivenih jedinjenja (npr. u obliku farmaceutske kompozicije) pacijentu kome je potrebno lečenje hematološkog maligniteta. Takvi maligniteti uključuju, ali nisu ograničeni na leukemije i limfome. Na primer, trenutno otkrivena jedinjenja mogu se koristiti za lečenje bolesti kao što su akutna limfoblastna leukemija (ALL), akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfocitna leukemija (CLL), limfom malih limfocita (SLL), hronična mijeloidna leukemija (CML), akutna monocitna leukemija (AMoL) i/ili druge leukemije. U drugim otelotvorenjima, jedinjenja su korisna za lečenje limfoma kao što su svi podtipovi Hočkinovog limfoma ili ne-Hočkinovog limfoma. U različitim otelotvorenjima, jedinjenja su korisna za lečenje maligniteta plazma ćelija kao što su multipli mijelom, limfom plaštnih ćelija i Valdenstremova makroglobulinemija.

[0262] 2

[0263] Određivanje da li tumor ili kancer obuhvata G12C KRAS, HRAS ili NRAS mutaciju može se preduzeti procenom nukleotidne sekvence koja kodira KRAS, HRAS ili NRAS protein, procenom aminokiselinske sekvence KRAS, HRAS ili NRAS proteina, ili procenom karakteristika pretpostavljenog KRAS, HRAS ili NRAS mutantnog proteina. Sekvenca humanog KRAS, HRAS ili NRAS divljeg tipa poznata je u datoj oblasti (npr. pristupni br. NP203524).

[0265] Metode za detekciju mutacije u nukleotidnoj sekvenci KRAS, HRAS ili NRAS poznate su stručnjacima u datoj oblasti. Ove metode uključuju testove polimorfizma dužine restrikcionih fragmenata dobijenih lančanom reakcijom polimeraze (PCR-RFLP), testove polimorfizma konformacije jednolančanih fragmenata dobijenih lančanom reakcijom polimeraze (PCR-SSCP), PCR testove u realnom vremenu, PCR sekvenciranje, testove PCR amplifikacije specifične za mutantni alel (MASA), direktno sekvenciranje, reakcije produžavanja prajmera, elektroforezu, testove ligacije oligonukleotida, testove hibridizacije, TaqMan testove, testove genotipizacije SNP-a, testove topljenja visoke rezolucije i mikročip analize. U nekim otelotvorenjima, uzorci se procenjuju na G12C KRAS, HRAS ili NRAS mutacije pomoću PCR-a u realnom vremenu. U PCR-u u realnom vremenu koriste se fluorescentne sonde specifične za KRAS, HRAS ili NRAS G12C mutaciju. Kada je mutacija prisutna, sonda se vezuje i detektuje se fluorescencija. U nekim otelotvorenjima, KRAS, HRAS ili NRAS G12C mutacija se identifikuje korišćenjem metode direktnog sekvenciranja specifičnih regiona (npr. egzon 2 i/ili egzon 3) u genu KRAS, HRAS ili NRAS. Ova tehnika će identifikovati sve moguće mutacije u sekvenciranom regionu.

[0267] Metode za detekciju mutacije u KRAS, HRAS ili NRAS proteinu poznate su stručnjacima u datoj oblasti. Ove metode uključuju detekciju KRAS, HRAS ili NRAS mutanta korišćenjem reagensa za vezivanje (npr. antitela) specifičnog za mutantni protein, elektroforezu proteina i Western blotting, kao i direktno sekvenciranje peptida.

[0269] Metode za određivanje da li tumor ili kancer obuhvata G12C KRAS, HRAS ili NRAS mutaciju mogu koristiti različite uzorke. U nekim otelotvorenjima, uzorak se uzima od subjekta koji ima tumor ili kancer. U nekim otelotvorenjima, uzorak je svež uzorak tumora ili kancera. U nekim otelotvorenjima, uzorak je zamrznuti uzorak tumora ili kancera. U nekim otelotvorenjima, uzorak je uzorak fiksiran u formalinu i uklopljen u parafin. U nekim otelotvorenjima, uzorak je uzorak cirkulišućih tumorskih ćelija (CTC). U nekim

[0272] 2

[0273] otelotvorenjima, uzorak je obrađen u ćelijski lizat. U nekim otelotvorenjima, uzorak je obrađen u DNK ili RNK.

[0275] Otkriće se takođe odnosi na metod lečenja hiperproliferativnog poremećaja kod sisara koji obuhvata primenu terapijski efikasne količine jedinjenja kao što je ovde otkriveno, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, navedenom sisaru. U nekim otelotvorenjima, navedeni metod se odnosi na lečenje subjekta koji boluje od kancera kao što je akutna mijeloidna leukemija, kancer kod adolescenata, karcinom kore nadbubrežne žlezde kod dece, kanceri povezani sa AIDS-om (npr. limfom i Kapošijev sarkom), kancer analnog otvora, kancer apendiksa (slepog creva), astrocitomi, atipični teratoidni tumor, bazocelularni karcinom, kancer žučnih puteva, kancer mokraćne bešike, kancer kostiju, gliom moždanog stabla, tumor mozga, kancer dojke, bronhijalni tumori, Berkitov limfom, karcinoidni tumor, embrionalni tumori, tumor germinativnih ćelija, primarni limfom, kancer grlića materice, kanceri u detinjstvu, hordom, tumori srca, hronična limfocitna leukemija (CLL), hronična mijeloidna leukemija (CML), hronični mijeloproliferativni poremećaji, kancer kolona, kolorektalni kancer, kraniofaringiom, kutani T-ćelijski limfom, ekstrahepatični duktalni karcinom in situ (DCIS), kancer CNS-a, kancer endometrijuma, ependimom, kancer jednjaka, estezioneuroblastom, Juingov sarkom, ekstrakranijalni tumor germinativnih ćelija, ekstragonadalni tumor germinativnih ćelija, kancer oka, fibrozni histiocitom kosti, kancer žučne kese, gastrični kancer, gastrointestinalni karcinoidni tumor, gastrointestinalni stromalni tumori (GIST), gestacioni trofoblastni tumor, leukemija vlasastih ćelija, kancer glave i vrata, kancer srca, kancer jetre, Hočkinov limfom, hipofaringealni kancer, intraokularni melanom, tumori ostrvaca ćelija, neuroendokrini tumori pankreasa, kancer bubrega, laringealni kancer, kancer usne i usne duplje, lobularni karcinom in situ (LCIS), kancer pluća, limfom, metastatski skvamozni kancer vrata sa nepoznatim primarnim poreklom, karcinom srednje linije, kancer usta, sindromi multiple endokrine neoplazije, multipli mijelom/neoplazma plazma ćelija, mycosis fungoides, mijelodisplastični sindromi, mijelodisplastične/mijeloproliferativne neoplazme, karcinom Merkelovih ćelija, maligni mezoteliom, maligni fibrozni histiocitom kosti i osteosarkom, kancer nosne šupljine i paranazalnih sinusa, nazofaringealni kancer, neuroblastom, ne-Hočkinov limfom, kancer pluća nemalih ćelija (NSCLC), orofaringealni kancer, kancer jajnika, kancer pankreasa, papilomatoza, paragangliom, kancer paratireoidne žlezde, kancer penisa, kancer ždrela, pleuropulmonalni blastom, primarni limfom centralnog nervnog sistema (CNS), kancer prostate, rektalni kancer, kancer prelaznih ćelija, retinoblastom, rabdomiosarkom, kancer

[0278] 2

[0279] pljuvačnih žlezda, kancer kože, kancer tankog creva, sarkom mekih tkiva, T-ćelijski limfom, kancer testisa, kancer grla, timom i karcinom timusa, kancer štitne žlezde, kancer prelaznih ćelija bubrežne karlice i uretera, trofoblastni tumor, neuobičajeni kanceri u detinjstvu, uretralni kancer, sarkom materice, kancer vagine, kancer vulve ili kancer izazvan virusom. U nekim otelotvorenjima, navedeni metod se odnosi na lečenje nekanceroznog hiperproliferativnog poremećaja kao što je benigna hiperplazija kože (npr. psorijaza), restenoza ili prostate (npr. benigna hipertrofija prostate (BPH)).

[0281] Metode lečenja su usmerene na lečenje kancera pluća, pri čemu metode obuhvataju primenu efikasne količine bilo kojeg od gore opisanih jedinjenja (ili farmaceutske kompozicije koja ih sadrži) subjektu kome je to potrebno. U određenim otelotvorenjima, kancer pluća je nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), na primer adenokarcinom, skvamoznocelularni karcinom pluća ili krupnoćelijski karcinom pluća. U nekim otelotvorenjima, kancer pluća je sitnoćelijski karcinom pluća. Ostali kanceri pluća koji se mogu lečiti otkrivenim jedinjenjima uključuju glandularne tumore, karcinoidne tumore i nediferencirane karcinome.

[0283] Otkriće dalje obelodanjuje metode modulacije aktivnosti G12C mutantnog KRAS, HRAS ili NRAS proteina dovođenjem proteina u kontakt sa efikasnom količinom jedinjenja iz ovog otkrića. Modulacija može biti inhibicija ili aktivacija aktivnosti proteina. U nekim otelotvorenjima, otkriće obezbeđuje metode inhibicije aktivnosti proteina dovođenjem G12C mutantnog KRAS, HRAS ili NRAS proteina u kontakt sa efikasnom količinom jedinjenja iz otkrića u rastvoru. U nekim otelotvorenjima, otkriće obezbeđuje metode inhibicije aktivnosti G12C mutantnog KRAS, HRAS ili NRAS proteina dovođenjem u kontakt ćelije, tkiva ili organa koji eksprimiraju protein od interesa. U nekim otelotvorenjima, otkriće obezbeđuje metode inhibicije aktivnosti proteina kod subjekta, uključujući glodare i sisare (npr. ljude), primenom efikasne količine jedinjenja iz otkrića subjektu. U nekim otelotvorenjima, procenat modulacije premašuje 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90%. U nekim otelotvorenjima, procenat inhibicije premašuje 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90%.

[0285] Otkriće obezbeđuje metode inhibicije KRAS, HRAS ili NRAS G12C aktivnosti u ćeliji dovođenjem navedene ćelije u kontakt sa količinom jedinjenja iz otkrića koja je dovoljna da inhibira aktivnost KRAS, HRAS ili NRAS G12C u navedenoj ćeliji. U nekim

[0288] 2

[0289] otelotvorenjima, otkriće obezbeđuje metode inhibicije KRAS, HRAS ili NRAS G12C aktivnosti u tkivu dovođenjem navedenog tkiva u kontakt sa količinom jedinjenja iz otkrića koja je dovoljna da inhibira aktivnost KRAS, HRAS ili NRAS G12C u navedenom tkivu. U nekim otelotvorenjima, otkriće obezbeđuje metode inhibicije KRAS, HRAS ili NRAS G12C aktivnosti u organizmu dovođenjem navedenog organizma u kontakt sa količinom jedinjenja iz otkrića koja je dovoljna da inhibira aktivnost KRAS, HRAS ili NRAS G12C u navedenom organizmu. Otkriće obezbeđuje metode inhibicije KRAS, HRAS ili NRAS G12C aktivnosti kod životinje dovođenjem navedene životinje u kontakt sa količinom jedinjenja iz otkrića koja je dovoljna da inhibira aktivnost KRAS, HRAS ili NRAS G12C kod navedene životinje. U nekim otelotvorenjima, otkriće obezbeđuje metode inhibicije KRAS, HRAS ili NRAS G12C aktivnosti kod sisara dovođenjem navedenog sisara u kontakt sa količinom jedinjenja iz otkrića koja je dovoljna da inhibira aktivnost KRAS, HRAS ili NRAS G12C kod navedenog sisara. U nekim otelotvorenjima, otkriće obezbeđuje metode inhibicije KRAS, HRAS ili NRAS G12C aktivnosti kod čoveka dovođenjem navedenog čoveka u kontakt sa količinom jedinjenja iz otkrića koja je dovoljna da inhibira aktivnost KRAS, HRAS ili NRAS G12C kod navedenog čoveka. Predmetno otkriće obezbeđuje metode lečenja bolesti posredovane KRAS, HRAS ili NRAS G12C aktivnošću kod subjekta kome je takvo lečenje potrebno.

[0291] KOMBINOVANA TERAPIJA

[0292] Predmetno otkriće takođe obelodanjuje metode za kombinovane terapije u kojima se agens za koji je poznato da moduliše druge puteve, ili druge komponente istog puta, ili čak preklapajući setovi ciljnih enzima, koristi u kombinaciji sa jedinjenjem iz predmetnog otkrića, ili njegovom farmaceutski prihvatljivom solju kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 i u preostalim patentnim zahtevima. Takva terapija obezbeđuje sinergistički ili aditivni terapijski efekat.

[0294] Obelodanjeno je da su mnogi hemoterapeutici trenutno poznati u datoj oblasti i da se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjima iz otkrića. Jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz otkrića mogu se koristiti u kombinaciji sa najmanje jednim ili više hemoterapijskih agenasa. Hemoterapeutik se bira iz grupe koju čine inhibitori mitoze, alkilirajući agensi, antimetaboliti, interkalirajući antibiotici, inhibitori faktora rasta, inhibitori ćelijskog ciklusa, enzimi, inhibitori topoizomeraze, modifikatori biološkog odgovora, antihormoni, inhibitori angiogeneze i antiandrogeni. Neograničavajući primeri su

[0297] 2

[0298] hemoterapijski agensi, citotoksični agensi i nepeptidni mali molekuli kao što su Gleevec<®>(imatinib-mezilat), Kyprolis<®>(karfilzomib), Velcade<®>(bortezomib), Casodex (bikalutamid), Iressa<®>(gefitinib), Venclexta<™>(venetoklaks) i Adriamycin<™>, (doksorubicin), kao i mnoštvo hemoterapijskih agenasa. Neograničavajući primeri hemoterapijskih agenasa uključuju alkilirajuće agense kao što su tiotepa i ciklofosfamid (Cytoxan<™>); alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietiltiofosforamid i trimetilolmelamin; azotne plikavce kao što su hlorambucil, hlornafazin, hlorociklofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin-oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil-mustard; nitrozoureje kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su aklacinomicini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kalihijamicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, Casodex<™>, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubericidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon-propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenale kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; dopunu folne kiseline kao što je folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; amsakrin; bestrabucil; bizantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; dijazikvon; elfomitin; eliptinijum-acetat; etoglucid; galijum-nitrat; hidroksiureju; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonidnu kiselinu; triazikvon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Ara-C”); ciklofosfamid; tiotepu; taksane, npr. paklitaksel i docetaksel; retinoinsku kiselinu; esperamicine; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo čega od gore navedenog.

[0299] Obelodanjeno je da se kao odgovarajući hemoterapijski kondicioneri ćelija uključe antihormonski agensi koji deluju tako što regulišu ili inhibiraju dejstvo hormona na tumore, kao što su antioestrogeni uključujući, na primer, tamoksifen (Nolvadex<™>), raloksifen, 4(5)-imidazole koji inhibiraju aromatazu, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY 117018, onapriston i toremifen (Fareston); i antiandrogeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i gozerelin; hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; kamptotecin-11 (CPT-11); inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO).

[0301] Obelodanjeno je da se tamo gde je poželjno, jedinjenja ili farmaceutska kompozicija iz predmetnog otkrića mogu koristiti u kombinaciji sa uobičajeno propisivanim lekovima protiv kancera kao što su Herceptin<®>, Avastin<®>, Erbitux<®>, Rituxan<®>, Taxol<®>, Arimidex<®>, Taxotere<®>, ABVD, AVICINE, abagovomab, akridin-karboksamid, adekatumumab, 17-N-alilamino-17-demetoksigeldanamicin, alfaradin, alvocidib, 3-aminopiridin-2-karboksaldehid tiosemikarbazon, amonafid, antracendion, anti-CD22 imunotoksini, antineoplastici, antitumorigene biljke, apazikvon, atiprimod, azatioprin, belotekan, bendamustin, BIBW 2992, birikodar, brostalicin, briostatin, butionin-sulfoksimin, CBV (hemoterapija), kalikulin, nespecifični antineoplastični agensi za ćelijski ciklus, dihlorosirćetna kiselina, diskodermolid, elsamitrucin, enocitabin, epotilon, eribulin, everolimus, ekstatekan, eksisulind, ferruginol, forodezin, fosfestrol, ICE hemoterapijski režim, IT-101, imekson, imikvimod, indolokarbazol, irofulven, lanikvidar, larotaksel, lenalidomid, lukanton, lurtotekan, mafosfamid, mitozolomid, nafoksidin, nedaplatin, olaparib, ortataksel, PAC-1, asimina, piksantron, inhibitor proteazoma, rebekamicin, resikvimod, rubitekan, SN-38, salinosporamid A, sapacitabin, Stanford V, svainsonin, talaporfin, tarikvidar, tegafur-uracil, Temodar, tesetaksel, triplatin-tetranitrat, tris(2-hlorometil)amin, troksacitabin, uramustin, vadimezan, vinflunin, ZD6126 ili zosukvidar.

[0303] Ovo otkriće dalje obelodanjuje metod za korišćenje jedinjenja ili farmaceutskih kompozicija navedenih u ovom dokumentu, u kombinaciji sa terapijom zračenjem radi inhibicije abnormalnog rasta ćelija ili lečenja hiperproliferativnog poremećaja kod sisara. Tehnike za primenu terapije zračenjem poznate su u datoj oblasti i te tehnike se mogu

[0306] 1

[0307] koristiti u ovde opisanoj kombinovanoj terapiji. Primena jedinjenja iz otkrića u ovoj kombinovanoj terapiji može se odrediti kao što je opisano u ovom dokumentu.

[0309] Obelodanjeno je da se terapija zračenjem može primeniti putem jedne od nekoliko metoda, ili kombinacijom metoda, uključujući bez ograničenja zračenje eksternim snopom, unutrašnju terapiju zračenjem, implantatno zračenje, stereotaktičnu radiohirurgiju, sistemsku terapiju zračenjem, radioterapiju i permanentnu ili privremenu intersticijalnu brahiterapiju. Termin „brahiterapija”, kako se ovde koristi, odnosi se na terapiju zračenjem koja se isporučuje putem prostorno ograničenog radioaktivnog materijala umetnutog u telo na mestu ili blizu tumora ili drugog mesta proliferativne bolesti tkiva. Termin je namenjen da bez ograničenja uključi izlaganje radioaktivnim izotopima (npr. At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32 i radioaktivni izotopi Lu). Odgovarajući izvori zračenja za upotrebu kao kondicioneri ćelija iz predmetnog otkrića uključuju i čvrste materije i tečnosti. Kao neograničavajući primer, izvor zračenja može biti radionuklid, kao što su I-125, I-131, Yb-169, Ir-192 kao čvrsti izvor, I-125 kao čvrsti izvor, ili drugi radionuklidi koji emituju fotone, beta čestice, gama zračenje ili druge terapijske zrake. Radioaktivni materijal takođe može biti fluid napravljen od bilo kog rastvora radionuklida, npr. rastvor I-125 ili I-131, ili se radioaktivni fluid može proizvesti korišćenjem suspenzije odgovarajućeg fluida koji sadrži male čestice čvrstih radionuklida, kao što su Au-198, Y-90. Štaviše, radionuklid(i) mogu biti otelotvoreni u gelu ili radioaktivnim mikrosferama.

[0311] Obelodanjeno je da se jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz otkrića mogu koristiti u kombinaciji sa količinom jedne ili više supstanci odabranih iz grupe koju čine hemoterapijski agensi, antiangiogeni agensi, inhibitori transdukcije signala, antiproliferativni agensi, inhibitori glikolize ili inhibitori autofagije.

[0313] Obelodanjeno je da se antiangiogeni agensi, kao što su inhibitori MMP-2 (matriksmetaloproteinaze 2), inhibitori MMP-9 (matriks-metaloproteinaze 9) i inhibitori COX-11 (ciklooksigenaze 11), mogu koristiti zajedno sa jedinjenjem iz otkrića i ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama. Antiangiogeni agensi uključuju, na primer, rapamicin, temsirolimus (CCI-779), everolimus (RAD001), sorafenib, sunitinib i bevacizumab. Primeri korisnih COX-II inhibitora uključuju alekoksib, valdekoksib i rofekoksib. Primeri korisnih inhibitora matriks-metaloproteinaza opisani su u WO 96/33172 WO 96/27583 evropskoj patentnoj publikaciji EP0818442, evropskoj patentnoj publikaciji EP1004578 , WO

[0316] 2

[0317] 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO

[0318] 98/30566, evropskoj patentnoj publikaciji 606046, evropskoj patentnoj publikaciji 931 788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO1999007675, evropskoj patentnoj publikaciji EP1786785, evropskoj patentnoj publikaciji br. EP1181017, publikaciji Sjedinjenih Država br. US20090012085, publikaciji Sjedinjenih Država US5863 949, publikaciji Sjedinjenih Država US5861510 i evropskoj patentnoj

[0319] publikaciji EP0780386, koji su svi ovde uključeni u celosti putem reference. Poželjni inhibitori MMP-2 i MMP-9 su oni koji imaju malu ili nikakvu aktivnost u inhibiciji MMP-1. Još poželjniji su oni koji selektivno inhibiraju MMP-2 i/ili MMP-9 u odnosu na ostale matriks- metaloproteinaze (tj. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 i MMP-13). Neki specifični primeri MMP inhibitora korisnih u ovom otkriću su AG-3340, RO 32-3555 i RS 13-0830.

[0321] [0074] Obelodanjeno je da se predmetna jedinjenja takođe mogu koristiti u ko-terapijama sa drugim antineoplastičnim agensima, kao što su acemanan, aklarubicin, aldesleukin, alemtuzumab, alitretinoin, altretamin, amifostin, aminolevulinska kiselina, amrubicin, amsakrin, anagrelid, anastrozol, ANCER, ancestim, ARGLABIN, arsen-trioksid, BAM 002 (Novelos), beksaroten, bikalutamid, broksuridin, kapecitabin, celmoleukin, cetroreliks, kladribin, klotrimazol, citarabin-okfosfat, DA 3030 (Dong-A), daklizumab, denileukindiftitoks, dezlorelin, deksrazoksan, dilazep, docetaksel, dokozanol, dokserkalciferol, doksifluridin, doksorubicin, bromokriptin, karmustin, citarabin, fluorouracil, HIT diklofenak, interferon alfa, daunorubicin, doksorubicin, tretinoin, edelfozin, edrekolomab, eflornitin, emitefur, epirubicin, epoetin beta, etopozid-fosfat, eksemestan, eksisulind, fadrozol, filgrastim, finasterid, fludarabin-fosfat, formestan, fotemustin, galijum-nitrat, gemcitabin, gemtuzumab-zogamicin, kombinacija gimeracil/oteracil/tegafur, glikopin, gozerelin, heptaplatin, humani horionski gonadotropin, humani fetalni alfa-fetoprotein, ibandronska kiselina, idarubicin, imikvimod, interferon alfa, prirodni interferon alfa, interferon alfa-2, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfa-N1, interferon alfa-<n3>, interferon alfakon-1, prirodni interferon alfa, interferon beta, interferon beta-1a, interferon beta-1b, interferon gama, prirodni interferon gama-1a, interferon gama-1b, interleukin-1 beta, iobenguan, irinotekan, irsogladin, lanreotid, LC 9018 (Yakult), leflunomid, lenograstim, lentinan-sulfat, letrozol, leukocitni alfa-interferon, leuprorelin, levamizol fluorouracil, liarozol, lobaplatin, lonidamin, lovastatin, mazoprokol, melarsoprol, metoklopramid, mifepriston, miltefozin, mirimostim, dvolančana RNK sa pogrešno uparenim bazama, mitoguazon, mitolaktol, mitoksantron, molgramostim, nafarelin, nalokson pentazocin, nartograstim, nedaplatin, nilutamid, noskapin, novi protein koji stimuliše eritropoezu, NSC 631570, oktreotid, oprelvekin, ozateron, oksaliplatin, paklitaksel, pamidronska kiselina, pegaspargaza, peginterferon alfa-2b, pentozan-polisulfat-natrijum, pentostatin, picibanil, pirarubicin, zečije antitimiocitno poliklonalno antitelo, polietilenglikol-interferon alfa-2a, porfimer-natrijum, raloksifen, raltitreksed, otelotvorenje koje obuhvata rasburikas, renijum Re 186 etidronat, RII retinamid, rituksimab, romurtid, samarijum (153 Sm) leksidronam, sargramostim, sizofiran, sobuzoksan, sonermin, stroncijum-89-hlorid, suramin, tasonermin, tazaroten, tegafur, temoporfin, temozolomid, tenipozid, tetrahlorodekaoksid, talidomid, timalfazin, tirotropin alfa, topotekan, toremifen, tositumomab-jod 131, trastuzumab, treosulfan, tretinoin, trilostan, trimetreksat, triptorelin, prirodni faktor nekroze tumora alfa, ubenimeks, vakcina protiv kancera mokraćne bešike, Maruyama vakcina, vakcina od lizata melanoma, valrubicin, verteporfin, vinorelbin, VIRULIZIN, zinostatin-stimalamer ili zoledronska kiselina; abareliks; AE 941 (Aeterna), ambamustin, antisens oligonukleotid, bcl-2 (Genta), APC 8015 (Dendreon), cetuksimab, decitabin, deksaminoglutetimid, dijazikvon, EL 532 (Elan), EM 800 (Endorecherche), eniluracil, etanidazol, fenretinid, filgrastim SD01 (Amgen), fulvestrant, galocitabin, imunogen gastrin 17, HLA-B7 genska terapija (Vical), faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga, histamin-dihidrohlorid, ibritumomab-tiuksetan, ilomastat, IM 862 (Cytran), interleukin-2, iproksifen, LDI 200 (Milkhaus), leridistim, lintuzumab, CA 125 MAb (Biomira), kancer MAb (Japan Pharmaceutical Development), HER-2 i Fc MAb (Medarex), idiotipsko 105AD7 MAb (CRC Technology), idiotipsko CEA MAb (Trilex), LYM-1-jod 131 MAb (Techniclone), polimorfni epitelni mucin-itrijum 90 MAb (Antisoma), marimastat, menogaril, mitumomab, moteksafin-gadolinijum, MX 6 (Galderma), nelarabin, nolatreksed, P 30 protein, pegvizomant, pemetreksed, porfiromicin, prinomastat, RL 0903 (Shire), rubitekan, satraplatin, natrijum-fenilacetat, sparfosična kiselina, SRL 172 (SR Pharma), SU 5416 (SUGEN), TA 077 (Tanabe), tetratiomolibdat, taliblastin, trombopoetin, tin-etiletiopurpurin, tirapazamin, vakcina protiv kancera (Biomira), vakcina protiv melanoma (New York University), vakcina protiv melanoma (Sloan Kettering Institute), vakcina od onkolizata melanoma (New York Medical College), vakcina od virusnih lizata ćelija melanoma (Royal Newcastle Hospital) ili valspodar.

[0323] Obelodanjeno je da se jedinjenja iz pronalaska mogu dalje koristiti sa VEGFR inhibitorima. Druga jedinjenja opisana u sledećim patentima i patentnim prijavama mogu se koristiti u kombinovanoj terapiji: US 6,258,812, US 2003/0105091, WO 01/37820, US

[0326] 4

[0327] 6,235,764, WO 01/32651, US 6,630,500, US 6,515,004, US 6,713,485, US 5,521,184, US 5,770,599, US 5,747,498, WO 02/68406, WO 02/66470, WO 02/55501, WO 04/05279, WO 04/07481, WO 04/07458, WO 04/09784, WO 02/59110, WO 99/45009, WO 00/59509, WO 99/61422, US 5,990,141, WO 00/12089 i WO 00/02871.

[0329] Obelodanjeno je da kombinacija obuhvata kompoziciju iz predmetnog pronalaska u kombinaciji sa najmanje jednim antiangiogenim agensom. Agensi uključuju in vitro sintetički pripremljene hemijske kompozicije, antitela, regione koji vezuju antigen, radionuklide, kao i njihove kombinacije i konjugate. Agens može biti agonista, antagonista, alosterni modulator, toksin ili, opštije, može delovati tako što inhibira ili stimuliše svoj cilj (npr. aktivacija ili inhibicija receptora ili enzima), i time podstiče ćelijsku smrt ili zaustavlja rast ćelija.

[0331] IObelodanjeno je da kolektivno antitela formiraju porodicu proteina plazme poznatih kao imunoglobulini i sastoje se od imunoglobulinskih domena. (Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed., Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, 1999. Kako se ovde koristi, termin „antitelo” odnosi se na protein koji ima konvencionalni imunoglobulinski format, koji obuhvata teške i lake lance, i koji obuhvata varijabilne i konstantne regione. Na primer, antitelo može biti IgG koje predstavlja strukturu u obliku slova „Y” od dva identična para polipeptidnih lanaca, gde svaki par ima jedan „laki” (tipično molekulske mase od oko 25 kDa) i jedan „teški” lanac (tipično molekulske mase od oko 50-70 kDa). Antitelo ima varijabilni region i konstantni region. U IgG formatima, varijabilni region obično ima oko 100-110 ili više aminokiselina, obuhvata tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR), prvenstveno je odgovoran za prepoznavanje antigena i značajno varira u odnosu na druga antitela koja se vezuju za različite antigene. Konstantni region omogućava antitelu da regrutuje ćelije i molekule imunog sistema.

[0332] Varijabilni region se sastoji od N-terminalnih regiona svakog lakog i teškog lanca, dok se konstantni region sastoji od C-terminalnih delova svakog od teških i lakih lanaca. (Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)).

[0334] [0078] Obelodanjeno je da su opšta struktura i svojstva CDR-ova antitela opisani u datoj oblasti. Ukratko, u skeletu antitela, CDR-ovi su uklopljeni unutar okvirnog regiona u varijabilnom regionu teškog i lakog lanca, gde čine regione koji su u velikoj meri odgovorni za vezivanje i prepoznavanje antigena. Varijabilni region tipično obuhvata najmanje tri CDR-a teškog ili lakog lanca (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; videti takođe Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), unutar okvirnog regiona (označenih kao okvirni regioni 1-4, FR1, FR2, FR3 i FR4, prema Kabat et al., 1991; videti takođe Chothia and Lesk, 1987, supra).

[0336] Obelodanjeno je da antitela mogu obuhvatati bilo koji konstantni region poznat u datoj oblasti. Humani laki lanci klasifikovani su kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci se klasifikuju kao mi, delta, gama, alfa ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, odnosno IgE. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgM ima podklase, uključujući, ali ne ograničavajući se na, IgM1 i IgM2. Otelotvorenja predmetnog otkrića uključuju sve takve klase ili izotipove antitela. Konstantni region lakog lanca može biti, na primer, konstantni region lakog lanca kapa- ili lambda-tipa, npr. humani konstantni region lakog lanca kapa- ili lambda-tipa. Konstantni region teškog lanca može biti, na primer, konstantni region teškog lanca alfa-, delta-, epsilon-, gama- ili mitipa, npr. humani konstantni region teškog lanca alfa-, delta-, epsilon-, gama- ili mi-tipa. Shodno tome, u primerima otelotvorenja, antitelo je antitelo izotipa IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM, uključujući bilo koji od IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

[0338] [0080] Obelodanjeno je da antitelo može biti monoklonalno antitelo ili poliklonalno antitelo. Antitelo obuhvata sekvencu koja je suštinski slična prirodnom antitelu koje proizvodi sisar, npr. miš, zec, koza, konj, kokoška, hrčak, čovek i slično. U tom pogledu, antitelo se može smatrati antitelom sisara, npr. antitelom miša, antitelom zeca, antitelom koze, antitelom konja, antitelom kokoške, antitelom hrčka, humanim antitelom i slično. U određenim aspektima, antitelo je humano antitelo. U određenim aspektima, antitelo je himerno antitelo ili humanizovano antitelo. Termin „himerno antitelo” odnosi se na antitelo koje sadrži domene iz dva ili više različitih antitela. Himerno antitelo može, na primer, sadržati konstantne domene jedne vrste i varijabilne domene druge vrste ili, opštije, može sadržati nizove aminokiselinskih sekvenci iz najmanje dve vrste. Himerno antitelo takođe može sadržati domene dva ili više različitih antitela unutar iste vrste. Termin „humanizovano”, kada se koristi u vezi sa antitelima, odnosi se na antitela koja imaju barem CDR regione iz nehumanog izvora koji su modifikovani tako da imaju strukturu i imunološku funkciju sličniju pravim humanim antitelima nego originalna izvorna antitela. Na primer, humanizacija može uključivati presađivanje CDR-a iz nehumanog antitela, kao što je mišje antitelo, u humano antitelo. Humanizacija takođe može uključivati odabrane aminokiselinske supstitucije kako bi nehumana sekvenca postala sličnija humanoj sekvenci.

[0340] Obelodanjeno je da se antitelo može podeliti na fragmente pomoću enzima, kao što su npr. papain i pepsin. Papain cepa antitelo dajući dva Fab fragmenta i jedan Fc fragment. Pepsin cepa antitelo dajući jedan F(ab')2 fragment i jedan pFc' fragment. Kako se ovde koristi, termin „antigenski vezujući fragment antitela” odnosi se na deo molekula antitela koji je sposoban da se veže za antigen tog antitela i poznat je i kao „antigenski vezujući fragment” ili „antigenski vezujući deo”. U primerima, antigenski vezujući fragment antitela je Fab fragment ili F(ab')2 fragment.

[0342] [0082] Obelodanjeno je da je arhitektura antitela iskorišćena za stvaranje rastućeg opsega alternativnih formata koji obuhvataju opseg molekulskih masa od najmanje oko 12-150 kDa i imaju opseg valencije (n) od monomerne (n = 1), preko dimerne (n = 2), trimerne (n = 3), do tetramerne (n = 4) i potencijalno više; takvi alternativni formati se ovde nazivaju „proteinski proizvodi antitela”. Proteinski proizvodi antitela uključuju one koji su zasnovani na punoj strukturi antitela i one koji oponašaju fragmente antitela koji zadržavaju puni kapacitet vezivanja antigena, npr. scFv, Fab i VHH/VH (o kojima se diskutuje u nastavku). Najmanji antigenski vezujući fragment antitela koji zadržava svoje kompletno mesto za vezivanje antigena je Fv fragment, koji se u potpunosti sastoji od varijabilnih (V) regiona. Rastvorljivi, fleksibilni aminokiselinski peptidni linker se koristi za povezivanje V regiona u scFv (jednolančani varijabilni fragment) fragment radi stabilizacije molekula, ili se konstantni (C) domeni dodaju V regionima da bi se generisao Fab fragment [antigenski vezujući fragment]. I scFv i Fab fragmenti se mogu lako proizvesti u ćelijama domaćinima, npr. prokariotskim ćelijama domaćinima. Ostali proteinski proizvodi antitela uključuju scFv stabilizovan disulfidnom vezom (ds-scFv), jednolančani Fab (scFab), kao i dimerne i multimerne formate antitela kao što su dija-, tria- i tetra-tela, ili minitela (miniAb) koja obuhvataju različite formate koji se sastoje od scFv-ova povezanih sa domenima oligomerizacije. Najmanji fragmenti su VHH/VH teških lanaca antitela kamelida, kao i antitela sa jednim domenom (sdAb). Gradivni blok koji se najčešće koristi za kreiranje novih formata antitela je jednolančani varijabilni (V)-domenski fragment antitela (scFv), koji obuhvata V domene teškog i lakog lanca (VH i VL domen) povezane peptidnim linkerom od ~15 aminokiselinskih ostataka. Peptitelo ili peptid-Fc fuzija je još jedan proteinski proizvod antitela. Struktura peptitela sastoji se od biološki aktivnog peptida presađenog na Fc domen. Peptitela su dobro opisana u datoj oblasti. Videti npr. Shimamoto et al., mAbs 4(5): 586-591 (2012).

[0344] Obelodanjeno je da drugi proteinski proizvodi antitela uključuju jednolančano antitelo (SCA); dijatelo; triatelo; tetratelo; bispecifična ili trispecifična antitela i slično. Bispecifična antitela mogu se podeliti u pet glavnih klasa: BsIgG, pridodata IgG, BsAb fragmenti, bispecifični fuzioni proteini i BsAb konjugati. Videti npr. Spiess et al., Molecular Immunology 67(2) Part A: 97-106 (2015).

[0346] Obelodanjeno je da primeri antiangiogenih agenasa uključuju ERBITUX<™>(IMC-C225), agense koji inhibiraju KDR (receptor domena kinaze) (npr. antitela i regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za receptor domena kinaze), anti-VEGF agense (npr. antitela ili regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za VEGF, ili rastvorljivi VEGF receptori ili njihov region koji vezuje ligand) kao što su AVASTIN<™>ili VEGF-TRAP<™>, agense protiv VEGF receptora (npr. antitela ili regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za njih), agense koji inhibiraju EGFR (npr. antitela ili regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za njih) kao što su Vectibix (panitumumab), TARCEVA<™>(erlotinib), anti-Ang1 i anti-Ang2 agense (npr. antitela ili regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za njih ili za njihove receptore, npr. Tie2/Tek), i agense koji inhibiraju anti-Tie2 kinazu (npr. antitela ili regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za njih). Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska takođe mogu uključivati jedan ili više agenasa (npr. antitela, regione koji vezuju antigen ili rastvorljive receptore) koji se specifično vezuju i inhibiraju aktivnost faktora rasta, kao što su antagonisti faktora rasta hepatocita (HGF, takođe poznat kao faktor raspršivanja), i antitela ili regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za njegov receptor „c-met”.

[0348] Obelodanjeno je da drugi antiangiogeni agensi uključuju Campath, IL-8, B-FGF, Tek antagoniste (Ceretti et al., američka publikacija br.2003/0162712; američki patent br.

[0349] 6,413,932), anti-TWEAK agense (npr. specifično vezujuća antitela ili regione koji vezuju antigen, ili rastvorljive antagoniste TWEAK receptora; videti Wiley, američki patent br.

[0350] 6,727,225), ADAM dezintegrinski domen za antagonizovanje vezivanja integrina za njegove ligande (Fanslow et al., američka publikacija br.2002/0042368), specifično vezujuća anti-eph receptor i/ili anti-efrin antitela ili regione koji vezuju antigen (američki patent br.

[0351] 5,981,245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447; 6,057,124 i članove njihovih patentnih porodica), i anti-PDGF-BB antagoniste (npr. specifično vezujuća antitela ili regione koji vezuju antigen) kao i antitela ili regione koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za PDGF-BB ligande, i agense koji inhibiraju PDGFR kinazu (npr. antitela ili regioni koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za njih).

[0353] Obelodanjeno je da dodatni antiangiogeni/antitumorski agensi uključuju: SD-7784 (Pfizer, SAD); cilengitid (Merck KGaA, Nemačka, EPO 770622); pegaptanib-oktanatrijum (Gilead Sciences, SAD); Alphastatin (BioActa, UK); M-PGA (Celgene, SAD, US 5712291); ilomastat, (Arriva, SAD, US 5892112); emaksanib (Pfizer, SAD, US 5792783); vatalanib, (Novartis, Švajcarska); 2-metoksioestradiol (EntreMed, SAD)); TLC ELL-12, (Elan, Irska); anekortav-acetat (Alcon, SAD); alfa-D148 Mab (Amgen, SAD); CEP-7055 (Cephalon, SAD); anti-Vn Mab (Crucell, Holandija) DAC: antiangiogenik (ConjuChem, Kanada);

[0354] Angiocidin (InKine Pharmaceutical, SAD); KM-2550 (Kyowa Hakko, Japan); SU-0879 (Pfizer, SAD); CGP-79787 (Novartis, Švajcarska, EP 970070); ARGENT tehnologija (Ariad, SAD); YIGSR-Stealth (Johnson & Johnson, SAD); fragment fibrinogena-E (BioActa, UK); inhibitor angiogeneze (Trigen, UK); TBC-1635 (Encysive Pharmaceuticals, SAD); SC-236 (Pfizer, SAD); ABT-567 (Abbott, SAD); Metastatin (EntreMed, SAD); inhibitor angiogeneze (Tripep, Švedska); maspin (Sosei, Japan); 2-metoksioestradiol (Oncology Sciences Corporation, SAD); ER-68203-00 (IVAX, SAD); Benefin (Lane Labs, SAD); Tz-93 (Tsumura, Japan); TAN-1120 (Takeda, Japan); FR-111142 (Fujisawa, Japan, JP 02233610); trombocitni faktor 4 (RepliGen, SAD, EP 407122); antagonist vaskularnog endotelnog faktora rasta (Borean, Danska); bevacizumab (pINN) (Genentech, SAD); inhibitori angiogeneze (SUGEN, SAD); XL 784 (Exelixis, SAD); XL 647 (Exelixis, SAD); MAb, alfa5beta3 integrin, druga generacija (Applied Molecular Evolution, SAD i MedImmune, SAD); genska terapija, retinopatija (Oxford BioMedica, UK); enzastaurin-hidrohlorid (USAN) (Lilly, SAD); CEP 7055 (Cephalon, SAD i Sanofi-Synthelabo, Francuska); BC 1 (Genoa Institute of Cancer Research, Italija); inhibitor angiogeneze (Alchemia, Australija); VEGF antagonist (Regeneron, SAD); rBPI 21 i antiangiogenik izveden iz BPI (XOMA, SAD); PI 88 (Progen, Australija); cilengitid (pINN) (Merck KGaA, Nemačka; Tehnički univerzitet u Minhenu, Nemačka, Scripps Clinic and Research Foundation, SAD); cetuksimab (INN) (Aventis, Francuska); AVE 8062 (Ajinomoto, Japan); AS 1404 (Cancer Research Laboratory, Novi Zeland); SG 292 (Telios, SAD); Endostatin (Boston Childrens Hospital, SAD); ATN 161 (Attenuon, SAD); ANGIOSTATIN (Boston Childrens Hospital, SAD); 2-metoksioestradiol (Boston Childrens Hospital, SAD); ZD 6474 (AstraZeneca, UK); ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals, UK); PPI 2458 (Praecis, SAD); AZD 9935 (AstraZeneca, UK); AZD 2171 (AstraZeneca, UK); vatalanib (pINN) (Novartis, Švajcarska i Schering AG, Nemačka); inhibitori puta tkivnog faktora (EntreMed, SAD); pegaptanib (pINN) (Gilead Sciences, SAD); ksantorizol (Yonsei University, Južna Koreja); vakcina, zasnovana na genima, VEGF-2 (Scripps Clinic and Research Foundation, SAD); SPV5.2 (Supratek, Kanada); SDX 103 (Univerzitet Kalifornije u San Dijegu, SAD); PX 478 (ProlX, SAD); METASTATIN (EntreMed, SAD); troponin I (Harvard University, SAD); SU 6668 (SUGEN, SAD); OXI 4503 (OXiGENE, SAD); o-guanidini (Dimensional Pharmaceuticals, SAD); motuporamin C (British Columbia University, Kanada); CDP 791 (Celltech Group, UK); atiprimod (pINN) (GlaxoSmithKline, UK); E 7820 (Eisai, Japan); CYC 381 (Harvard University, SAD); AE 941 (Aeterna, Kanada); vakcina, angiogeneza (EntreMed, SAD); inhibitor aktivatora urokinaznog plazminogena (Dendreon, SAD); oglufanid (pINN) (Melmotte, SAD); HIF-1alfa inhibitori (Xenova, UK); CEP 5214 (Cephalon, SAD); BAY RES 2622 (Bayer, Nemačka); Angiocidin (InKine, SAD); A6 (Angstrom, SAD); KR 31372 (Korea Research Institute of Chemical Technology, Južna Koreja); GW 2286 (GlaxoSmithKline, UK); EHT 0101 (ExonHit, Francuska); CP 868596 (Pfizer, SAD); CP 564959 (OSI, SAD); CP 547632 (Pfizer, SAD); 786034 (GlaxoSmithKline, UK); KRN 633 (Kirin Brewery, Japan); sistem za isporuku leka, intraokularni, 2-metoksioestradiol (EntreMed, SAD); angineks (Univerzitet u Mastrihtu, Holandija i Univerzitet u Minesoti, SAD); ABT 510 (Abbott, SAD); AAL 993 (Novartis, Švajcarska); VEGI (ProteomTech, SAD); inhibitori faktora nekroze tumora-alfa (National Institute on Aging, SAD); SU 11248 (Pfizer, SAD i SUGEN SAD); ABT 518 (Abbott, SAD); YH16 (Yantai Rongchang, Kina); S-3APG (Boston Childrens Hospital, SAD i EntreMed, SAD); MAb, KDR (ImClone Systems, SAD); MAb, alfa5 beta1 (Protein Design, SAD); inhibitor KDR kinaze (Celltech Group, UK i Johnson & Johnson, SAD); GFB 116 (South Florida University, SAD i Yale University, SAD); CS 706 (Sankyo, Japan); prolek kombretastatina A4 (Arizona State University, SAD); hondroitinaza AC (IBEX, Kanada); BAY RES 2690 (Bayer, Nemačka); AGM 1470 (Harvard University, SAD, Takeda, Japan i TAP, SAD); AG 13925 (Agouron, SAD); tetratiomolibdat (University of Michigan, SAD); GCS 100 (Wayne State University, SAD) CV 247 (Ivy Medical, UK); CKD 732 (Chong Kun Dang, Južna Koreja); MAb, vaskularni endotelni faktor rasta (Xenova, UK); irsogladin (INN) (Nippon Shinyaku, Japan); RG 13577 (Aventis, Francuska); WX 360 (Wilex, Nemačka); skvalamin (pINN) (Genaera, SAD); RPI 4610 (Sirna, SAD); terapija kancera (Marinova, Australija); inhibitori heparanaze (InSight, Izrael);

[0357] 4

[0358] KL 3106 (Kolon, Južna Koreja); honokiol (Emory University, SAD); ZK CDK (Schering AG, Nemačka); ZK Angio (Schering AG, Nemačka); ZK 229561 (Novartis, Švajcarska i Schering AG, Nemačka); XMP 300 (XOMA, SAD); VGA 1102 (Taisho, Japan); modulatori VEGF receptora (Pharmacopeia, SAD); antagonisti VE-kadherina-2 (ImClone Systems, SAD); vazostatin (National Institutes of Health, SAD); vakcina, Flk-1 (ImClone Systems, SAD); TZ 93 (Tsumura, Japan); TumStatin (Beth Israel Hospital, SAD); skraćeni rastvorljivi FLT 1 (vaskularni endotelni receptor faktora rasta 1) (Merck & Co, SAD); Tie-2 ligandi (Regeneron, SAD); i inhibitor trombospondina 1 (Allegheny Health, Education and Research Foundation, SAD).

[0360] Obelodanjeno je da inhibitori autofagije uključuju, ali nisu ograničeni na hlorokin, 3-metiladenin, hidroksihlorokin (Plaquenil<™>), bafilomicin A1, 5-amino-4-imidazol karboksamid ribozid (AICAR), okadaičnu kiselinu, toksine algi koji supresuju autofagiju koji inhibiraju proteinske fosfataze tipa 2A ili tipa 1, analoge cAMP-a i lekove koji povećavaju nivoe cAMP-a kao što su adenozin, LY204002, N6-merkaptopurin ribozid i vinblastin. Pored toga, mogu se koristiti i antisens ili siRNA koje inhibiraju ekspresiju proteina uključujući, ali ne ograničavajući se na ATG5 (koji su uključeni u autofagiju).

[0362] Obelodanjeno je da dodatna farmaceutski aktivna jedinjenja/agensi koji se mogu koristiti u lečenju kancera i koji se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja iz predmetnog pronalaska uključuju: epoetin alfa; darbepoetin alfa; panitumumab; pegfilgrastim; palifermin; filgrastim; denosumab; ancestim; AMG 102; AMG 176; AMG 386; AMG 479; AMG 655; AMG 745; AMG 951; i AMG 706, ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0364] [0089] Obelodanjeno je da se kompozicija obelodanjena u ovom dokumentu primenjuje zajedno sa hemoterapijskim agensom. Odgovarajući hemoterapijski agensi mogu uključivati prirodne proizvode kao što su vinka alkaloidi (npr. vinblastin, vinkristin i vinorelbin), paklitaksel, epidipodotoksini (npr. etopozid i tenipozid), antibiotici (npr. daktinomicin (aktinomicin D), daunorubicin, doksorubicin i idarubicin), antraciklini, mitoksantron, bleomicini, plikamicin (mitramicin), mitomicin, enzimi (npr. L-asparaginaza koja sistemski metaboliše L-asparagin i lišava ćelije koje nemaju kapacitet da sintetišu sopstveni asparagin), antiagregacioni agensi (antiplatelet agensi), antiproliferativni/antimitotički alkilirajući agensi kao što su azotni senfovi (npr. mehloretamin, ciklofosfamid i analozi, melfalan i hlorambucil), etilenimini i metilmelamini (npr. heksametilmelamin i tiotepa), CDK inhibitori (npr. seliciklib, UCN-01, P1446A-05, PD-0332991, dinaciklib, P27-00, AT-7519, RGB286638 i SCH727965), alkil sulfonati (npr. busulfan), nitrozoureje (npr. karmustin (BCNU) i analozi, i streptozocin), trazeni-dakarbazinin (DTIC), antiproliferativni/antimitotički antimetaboliti kao što su analozi folne kiseline (npr. metotreksat), analozi pirimidina (npr. fluorouracil, floksuridin i citarabin), analozi purina i srodni inhibitori (npr. merkaptopurin, tioguanin, pentostatin i 2-hlordeoksiadenozin), inhibitori aromataze (npr. anastrozol, eksemestan i letrozol), i kompleksna jedinjenja platine (npr. cisplatin i karboplatin), prokarbazin, hidroksiureja, mitotan, aminoglutetimid, inhibitori histonske deacetilaze (HDAC) (npr. trihostatin, natrijum butirat, apicidan, suberoil anilid hidroksamska kiselina, vorinostat, LBH 589, romidepsin, ACY-1215 i panobinostat), mTor inhibitori (npr. temsirolimus, everolimus, ridaforolimus i sirolimus), KSP(Eg5) inhibitori (npr. Array 520), agensi koji vezuju DNK (npr. Zalypsis), PI3K delta inhibitor (npr. GS-1101 i TGR-1202), PI3K delta i gama inhibitor (npr. CAL-130), multi-kinazni inhibitor (npr. TG02 i sorafenib), hormoni (npr. estrogen) i hormonski agonisti kao što su agonisti hormona koji oslobađa luteinizirajući hormon (LHRH) (npr. goserelin, leuprolid i triptorelin), BAFF-neutrališuće antitelo (npr. LY2127399), IKK inhibitori, p38MAPK inhibitori, anti-IL-6 (npr. CNTO328), inhibitori telomeraze (npr. GRN 163L), inhibitori aurora kinaze (npr.

[0365] MLN8237), monoklonska antitela na površini ćelije (npr. anti-CD38 (HUMAX-CD38), anti-CS1 (npr. elotuzumab)), HSP90 inhibitori (npr.17 AAG i KOS 953), PI3K / Akt inhibitori (npr. perifozin), Akt inhibitor (npr. GSK-2141795), PKC inhibitori (npr. enzastaurin), FTI (npr. Zarnestra<™>), anti-CD138 (npr. BT062), Torc1/2 specifični inhibitor kinaze (npr.

[0366] INK128), inhibitor kinaze (npr. GS-1101), agens koji cilja ER/UPR (npr. MKC-3946), cFMS inhibitor (npr. ARRY-382), JAK1/2 inhibitor (npr. CYT387), PARP inhibitor (npr. olaparib i veliparib (ABT-888)), antagonist BCL-2. Ostali hemoterapijski agensi mogu uključivati mehloretamin, kamptotecin, ifosfamid, tamoksifen, raloksifen, gemcitabin, navelbin, sorafenib, ili bilo koju varijantu analoga ili derivata prethodno navedenih.

[0368] Obelodanjeno je da se jedinjenja iz predmetnog pronalaska takođe mogu koristiti u kombinaciji sa radioterapijom, hormonskom terapijom, hirurgijom i imunoterapijom, koje su terapije dobro poznate stručnjacima u datoj oblasti.

[0370] [0091] Obelodanjeno je da se farmaceutska kompozicija obelodanjena u ovom dokumentu primenjuje zajedno sa steroidom. Odgovarajući steroidi mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, 21-acetoksipregnenolon, alklometazon, algeston, amcinonid, beklometazon, betametazon, budezonid, hloroprednizon, klobetazol, klokortolon, kloprednol, kortikosteron, kortizon, kortivazol, deflazakort, dezonid, dezoksimetazon, deksametazon, diflorazon, diflukortolon, difuprednat, enoksolon, fluazakort, flukloronid, flumetazon, flunizolid, fluocinolon acetonid, fluocinonid, fluokortin butil, fluokortolon, fluorometolon, fluperolon acetat, flupredniden acetat, fluprednizolon, flurandrenolid, flutikazon propionat, formokortal, halcinonid, halobetazol propionat, halometazon, hidrokortizon, loteprednol etabonat, mazipredon, medrizon, meprednizon, metilprednizolon, mometazon furoat, parametazon, prednikarbat, prednizolon, prednizolon 25-dietilaminoacetat, prednizolon natrijum fosfat, prednizon, prednival, predniliden, rimeksolon, tiksokortol, triamcinolon, triamcinolon acetonid, triamcinolon benetonid, triamcinolon heksacetonid, i njihove soli i/ili derivate. U konkretnom otelotvorenju, jedinjenja iz predmetnog pronalaska se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa dodatnim farmaceutski aktivnim agensima koji leče mučninu. Primeri agenasa koji se mogu koristiti za lečenje mučnine uključuju: dronabinol; granisetron; metoklopramid; ondansetron; i prohlorperazin; ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0372] Obelodanjeno je da se KRAS<G12C>inhibitori iz predmetnog pronalaska mogu koristiti u kombinaciji sa inhibitorima Aurora kinaze, kao što su oni koji se nalaze u objavljenoj PCT prijavi WO2011/031842. Posebno jedinjenje je AMG 900 (primer 1 iz WO2011/031842).

[0374] Obelodanjeno je da se KRAS<G12C>inhibitori iz predmetnog pronalaska mogu koristiti u kombinaciji sa inhibitorima MAP kinaznog puta. Primeri proteina u MAP kinaznom putu koji mogu biti inhibirani i inhibitori takvih proteina koji se koriste u kombinaciji sa KRAS<G12C>inhibitorima su BRAF inhibitori, Pan-RAF inhibitori i MEK inhibitori. Postoje tri glavne izoforme RAF-a: ARAF, BRAF i CRAF. an-RAF inhibitor pokazuje inhibitornu aktivnost na više od jedne RAF izoforme. Nasuprot tome, BRAF inhibitor ispoljava veću inhibitornu aktivnost (ili selektivnost) prema BRAF-u nego prema drugim RAF proteinima.

[0376] Obelodanjeno je da se jedinjenja iz predmetnog pronalaska takođe mogu koristiti u kombinaciji sa dodatnim farmaceutski aktivnim jedinjenjem koje narušava ili inhibira signalne puteve RAS-RAF-ERK ili PI3K-AKT-TOR. U drugim takvim kombinacijama, dodatno farmaceutski aktivno jedinjenje je antagonist PD-1 i PD-L1. Jedinjenja ili farmaceutske kompozicije iz obelodanjenja se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa količinom jedne ili više supstanci odabranih iz grupe koju čine EGFR inhibitori, MEK

[0379] 4

[0380] inhibitori, PI3K inhibitori, AKT inhibitori, TOR inhibitori, Mcl-1 inhibitori, BCL-2 inhibitori, SHP2 inhibitori, inhibitori proteazoma i imunoterapije, uključujući monoklonska antitela, imunomodulatorne imide (IMiD), anti-PD-1 (ili alternativno inhibitor PD-1), anti-PDL-1, anti-CTLA4, anti-LAG1 i anti-OX40 agense, GITR agoniste, CAR-T ćelije i BiTE.

[0382] Obelodanjeno je da EGFR inhibitori uključuju male molekulske antagoniste, inhibitorna antitela, ili specifične antisens nukleotide ili siRNA. GFR inhibitori koji se mogu koristiti u predmetnim kombinacijama uključuju afatinib (trgovačko ime: Gilotrif<®>, komercijalno dostupan od Boehringer Ingelheim), erlotinib (trgovačko ime: Tarceva<®>, komercijalno dostupan od Genetech/Astellas) i lapatinib (trgovačko ime: Tykerb<®>, komercijalno dostupan od Novartis). KRAS<G12C>inhibitori se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa EGFR antitelima u predmetnom pronalasku. EGFR antitela koja se mogu koristiti u predmetnim kombinacijama uključuju cetuksimab (trgovačko ime: Erbitux<®>od Lilly). Korisni inhibitorni antitela na EGFR uključuju panitumumab (Vectibix), zalutumumab, nimotuzumab i matuzumab.

[0384] [0096] Obelodanjeno je da primeri malih molekulskih EGFR inhibitora uključuju bilo koji od EGFR inhibitora opisanih u sledećim patentnim publikacijama, i sve farmaceutski prihvatljive soli i solvate navedenih EGFR inhibitora: evropska patentna prijava EP 520722, objavljena 30. decembra 1992.; evropska patentna prijava EP 566226, objavljena 20 oktobra 1993.; PCT međunarodna publikacija WO 96/33980, objavljena 31. oktobra 1996.; američki patent br.5,747,498, izdat 5. maja 1998; PCT međunarodna publikacija WO 96/30347, objavljena 3. oktobra 1996.; evropska patentna prijava EP 787772, objavljena 6. avgusta 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 97/30034, objavljena 21. avgusta 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 97/30044, objavljena 21. avgusta 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 97/38994, objavljena 23. oktobra 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 97/49688, objavljena 31. decembra 1997.; evropska patentna prijava EP 837063, objavljena 22. aprila 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 98/02434, objavljena 22. januara 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 97/38983, objavljena 23. oktobra 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 95/19774, objavljena 27. jula 1995.; PCT međunarodna publikacija WO 95/19970, objavljena 27. jula 1995.; PCT međunarodna publikacija WO 97/13771, objavljena 17. aprila 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 98/02437, objavljena 22. januara 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 98/02438, objavljena 22. januara 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 97/32881, objavljena 12. septembra 1997.; nemačka prijava DE 19629652, objavljena 29. januara 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 98/33798, objavljena 6. avgusta 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 97/32880, objavljena 12. septembra 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 97/32880 objavljena 12. septembra 1997.; evropska patentna prijava EP 682027, objavljena 15. novembra 1995.; PCT međunarodna publikacija WO 97/02266, objavljena 23. januara 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 97/27199, objavljena 31. jula 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 98/07726, objavljena 26. februara 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 97/34895, objavljena 25. septembra 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 96/31510', objavljena 10. oktobra 1996.; PCT međunarodna publikacija WO 98/14449, objavljena 9. aprila 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 98/14450, objavljena 9. aprila 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 98/14451, objavljena 9. aprila 1998.; PCT međunarodna publikacija WO 95/09847, objavljena 13. aprila 1995.; PCT međunarodna publikacija WO 97/19065, objavljena 29. maja 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 98/17662, objavljena 30. aprila 1998.; američki patent br.5,789,427, izdat 4. avgusta 1998.; američki patent br.

[0385] 5,650,415, izdat 22. jula 1997.; američki patent br.5,656,643, izdat 12. avgusta 1997.; PCT međunarodna publikacija WO 99/35146, objavljena 15. jula 1999.; PCT međunarodna publikacija WO 99/35132, objavljena 15. jula 1999.; PCT međunarodna publikacija WO 99/07701, objavljena 18. februara 1999.; i PCT međunarodna publikacija WO 92/20642 objavljena 26. novembra 1992.. Dodatni primeri malih molekulskih EGFR inhibitora uključuju bilo koji od EGFR inhibitora opisanih u Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12):1599-1625.

[0387] Obelodanjeno je da EGFR inhibitori zasnovani na antitelima uključuju bilo koje anti-EGFR antitelo ili fragment antitela koji može delimično ili potpuno blokirati aktivaciju EGFR-a njegovim prirodnim ligandom. Primeri EGFR inhibitora zasnovanih na antitelima uključuju one opisane u Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J. Cancer 67:247-253; Teramoto, T., et al., 1996, Cancer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res.1:1311-1318; Huang, S. M., et al., 1999, Cancer Res.15:59(8):1935-40; i Yang, X., et al., 1999, Cancer Res.59:1236-1243. Dakle, EGFR inhibitor može biti monoklonsko antitelo Mab E7.6.3 (Yang, 1999 supra), ili Mab C225 (ATCC pristupni br. HB-8508), ili antitelo ili fragment antitela koji ima specifičnost vezivanja istih.

[0389] Obelodanjeno je da se KRAS<G12C>inhibitori iz predmetnog pronalaska mogu koristiti zajedno sa MEK inhibitorima, kao što su oni koji se nalaze u objavljenoj PCT prijavi

[0392] 4

[0393] WO2002/006213. Posebno jedinjenje je N-(((2R)-2,3-dihidroksipropil)oksi)-3,4-difluoro-2-((2-fluoro-4-jodofenil)amino)benzamid, takođe poznat kao AMG 1009089 ili 1009089, (primer 39).

[0395] Obelodanjeno je da se KRAS<G12C>inhibitori iz predmetnog pronalaska mogu koristiti zajedno sa BRAF inhibitorima, kao što su oni koji se nalaze u objavljenoj PCT prijavi WO2008/153947. Posebno jedinjenje je AMG 2112819 (takođe poznato kao 2112819) (primer 56). Još jedan poseban BRAF inhibitor koji se može koristiti u kombinacijama iz predmetnog pronalaska je dabrafenib. Još jedan BRAF inhibitor koji se može koristiti u kombinacijama iz predmetnog pronalaska je vemurafenib.

[0397] IObelodanjeno je da se pan-RAF inhibitori takođe mogu koristiti uz

[0398] KRAS<G12C>inhibitore u kombinacijama iz predmetnog pronalaska. Posebni pan-RAF inhibitori uključuju RAF265 i MLN-2480.

[0400] Obelodanjeno je da se KRAS<G12C>inhibitori iz predmetnog pronalaska mogu koristiti zajedno sa MEK inhibitorima. Posebni MEK inhibitori koji se mogu koristiti u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju PD-325901, trametinib, pimasertib, MEK162 [takođe poznat kao binimetinib], TAK-733, GDC-0973 i AZD8330. Poseban MEK inhibitor koji se može koristiti uz KRAS<G12C>inhibitor u kombinacijama iz predmetnog pronalaska je trametinib (trgovačko ime: Mekinist<®>, komercijalno dostupan od Novartis Pharmaceuticals Corp.). Još jedan poseban MEK inhibitor je N-(((2R)-2,3-dihidroksipropil)oksi)-3,4-difluoro-2-((2-fluoro-4-jodofenil)amino)benzamid, takođe poznat kao AMG 1009089, 1009089 ili PD-325901. Još jedan poseban MEK inhibitor koji se može koristiti u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuje kobimetinib.

[0402] Obelodanjeno je da MEK inhibitori uključuju CI-1040, AZD6244, PD318088, PD98059, PD334581, RDEA119, ARRY-142886 i ARRY-438162.

[0404] Obelodanjeno je da se predmetni pronalazak odnosi na upotrebu jedinjenja iz predmetnog pronalaska u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutskih agenasa koji su inhibitori proteina u putu fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K). Primeri proteina u PI3K putu uključuju PI3K, mTOR i PKB (takođe poznat kao Akt ili AKT). Protein PI3K postoji u nekoliko izoformi uključujući α, β, δ ili γ. Predviđeno je da PI3K inhibitor koji se može

[0407] 4

[0408] koristiti u predmetnom pronalasku može biti selektivan za jednu ili više izoformi. Pod selektivnim se podrazumeva da jedinjenja inhibiraju jednu ili više izoformi više od drugih izoformi. Selektivnost je koncept dobro poznat stručnjacima u datoj oblasti i može se meriti dobro poznatim in vitro testovima ili testovima aktivnosti zasnovanim na ćelijama. Poželjna selektivnost uključuje veću od 2 puta, po mogućstvu 10 puta, ili još poželjnije 100 puta veću selektivnost za jednu ili više izoformi u odnosu na druge izoforme. U jednom aspektu, PI3K inhibitori koji se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjima iz predmetnog pronalaska su selektivni inhibitori PI3K α. U drugom aspektu, jedinjenje je selektivni inhibitor PI3K δ. U još jednom aspektu, jedinjenje je selektivni inhibitor PI3K β.

[0410] Obelodanjeno je da primeri PI3K inhibitora koji se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više jedinjenja iz predmetnog pronalaska uključuju one obelodanjene u nastavku: objavljena PCT prijava br. WO2010/151791; objavljena PCT prijava br.

[0411] WO2010/151737; objavljena PCT prijava br.WO2010/151735; objavljena PCT prijava br. WO2010151740; objavljena PCT prijava br. WO2008/118455; objavljena PCT prijava br. WO2008/118454; objavljena PCT prijava br. WO2008/118468; objavljena američka prijava br. US20100331293; objavljena američka prijava br. US20100331306; objavljena američka prijava br. US20090023761; objavljena američka prijava br. US20090030002; objavljena američka prijava br. US20090137581;objavljena američka prijava br. US2009/0054405; objavljena američka prijava br. U.S.2009/0163489; objavljena američka prijava br. US 2010/0273764; objavljena američka prijava br. U.S.2011/0092504; ili objavljena PCT prijava br. WO2010/108074. PI3K inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, vortmanin, analoge 17-hidroksivortmanina opisane u WO 06/044453, 4-[2-(1H-indazol-4-il)-6-[[4-(metilsulfonil)piperazin-1-il]metil]tieno[3,2-d]pirimidin-4-il]morfolin (takođe poznat kao GDC 0941 i opisan u PCT publikacijama br. WO 09/036,082 i WO 09/055,730), 2-metil-2-[4-[3-metil-2-okso-8-(hinolin-3-il)-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]hinolin-1-il]fenil]propionitril (takođe poznat kao BEZ 235 ili NVP-BEZ 235, i opisan u PCT publikaciji br. WO 06/122806), (S)-1-(4-((2-(2-aminopirimidin-5-il)-7-metil-4-morfolinotieno[3,2-d]pirimidin-6-il)metil)piperazin-1-il)-2-hidroksipropan-1-on (opisan u PCT publikaciji br. WO 2008/070740), LY294002 (2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-on dostupan od Axon Medchem), PI 103 hidrohlorid (3-[4-(4-morfolinilpirido-[3',2':4,5]furo[3,2-d]pirimidin-2-il]fenol hidrohlorid dostupan od Axon Medchem), PIK 75 (N'-[(1E)-(6-bromoimidazo[1,2-a]piridin-3-il)metilen]-N,2-dimetil-5-nitrobenzensulfono-hidrazid hidrohlorid dostupan od Axon Medchem), PIK 90 (N-(7,8-dimetoksi-2,3-dihidro-imidazo[1,2-c]hinazolin-5-il)-

[0414] 4

[0415] nikotinamid dostupan od Axon Medchem), GDC-0941 bizmezilat (2-(1H-indazol-4-il)-6-(4-metansulfonil-piperazin-1-ilmetil)-4-morfolin-4-il-tieno[3,2-d]pirimidin bizmezilat dostupan od Axon Medchem), AS-252424 (5-[1-[5-(4-fluoro-2-hidroksifenil)-furan-2-il]-met-(Z)-iliden]-tiazolidin-2,4-dion dostupan od Axon Medchem), i TGX-221 (7-metil-2-(4-morfolinil)-9-[1-(fenilamino)etil]-4H-pirido-[1,2-a]pirimidin-4-on dostupan od Axon Medchem), XL-765, i XL-147. Ostali PI3K inhibitori uključuju demetoksiviridin, perifozin, CAL101, PX-866, BEZ235, SF1126, INK1117, IPI-145, BKM120, XL147, XL765, Palomid 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-115, CAL263, PI-103, GNE-477, CUDC-907 i AEZS-136.

[0417] Obelodanjeno je da preferirani PI3K inhibitori za upotrebu zajedno sa jedinjenjem iz predmetnog pronalaska uključuju:

[0419]

[0421] BKM120, takođe poznat kao buparlisib, ispitivani mali molekul kompanije Novartis Pharmaceuticals,

[0423]

[0425] njihovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0427] Obelodanjeno je da je takođe preferirano jedinjenje formule IIa ispod, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so,

[0430] 4

[0431]

[0434] pri čemu je X<1>fluor ili vodonik; Y<1>je vodonik ili metil; a Z<1>je vodonik ili metil. Poseban PI3K inhibitor koji se može koristiti u kombinacijama iz predmetnog pronalaska je AMG 511 (takođe poznat kao AMG 2539965 ili 2539965), koji je primer 148 objavljene PCT prijave WO2010/126895.

[0436] IObelodanjeno je da drugi PI3K inhibitori koji se mogu koristiti u kombinaciji sa KRAS<G12C>inhibitorima u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju pan-PI3K inhibitore kao što su BKM120 i GDC-0941; selektivne inhibitore PI3Kα kao što je BYL719; i selektivne inhibitore PI3Kβ kao što je GSK-2636771.

[0438] Obelodanjeno je da su poznata jedinjenja koja inhibiraju i PI3K i mTOR (dualni inhibitori). U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu dualnih inhibitora PI3K i mTOR za upotrebu zajedno sa KRAS<G12C>inhibitorima. Primer posebnog dualnog inhibitora je GDC-0980.

[0440] Obelodanjeno je da se KRAS<G12C>inhibitori takođe mogu koristiti zajedno sa SHP2 inhibitorima u predmetnom pronalasku. SHP2 inhibitori koji se mogu koristiti u predmetnim kombinacijama uključuju SHP099, i RMC-4550 ili RMC-4630, kompanije Revolutions Medicines iz Redwood City-ja, Kalifornija, SAD.

[0442] Obelodanjeno je da je mTOR protein u PI3K putu. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je upotreba mTOR inhibitora zajedno sa KRAS<G12C>inhibitorima. mTOR inhibitori koji se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjem iz predmetnog pronalaska uključuju one obelodanjene u sledećim dokumentima: objavljena PCT prijava br.

[0443] WO2010/132598 i objavljena PCT prijava br. WO2010/096314. mTOR inhibitori koji se mogu koristiti u kombinaciji sa KRAS<G12C>inhibitorima u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju AZD2014 i MLN0128.

[0446] 4

[0447] Obelodanjeno je da TOR inhibitori uključuju AP-23573, CCI-779, everolimus, RAD-001, rapamicin, temsirolimus, ATP-kompetitivne TORC1/TORC2 inhibitore, uključujući PI-103, PP242, PP30 i Torin 1. Ostali TOR inhibitori u FKBP12 pojačivaču; rapamicini i njihovi derivati, uključujući: CCI-779 (temsirolimus), RAD001 (everolimus; WO 9409010) i AP23573; rapaloge, npr. kao što je obelodanjeno u WO 98/02441 i WO 01/14387, npr. AP23573, AP23464 ili AP23841; 40-(2-hidroksietil)rapamicin, 40-[3-hidroksi(hidroksimetil)metilpropanoat]-rapamicin (takođe nazvan CC1779), 40-epi-(tetrazolil)-rapamicin (takođe nazvan ABT578), 32-deoksirapamicin, 16-pentiniloksi-32(S)-dihidrorapamicin, i druge derivate obelodanjene u WO 05005434; derivate obelodanjene u američkom patentu br.5,258,389, WO 94/090101, WO 92/05179, američkom patentu br. 5,118,677, američkom patentu br.5,118,678, američkom patentu br.5,100,883, američkom patentu br.5,151,413, američkom patentu br.5,120,842, WO 93/111130, WO 94/02136, WO 94/02485, WO 95/14023, WO 94/02136, WO 95/16691, WO 96/41807, WO

[0448] 96/41807 i američkom patentu br.5,256,790; rapamicin derivate koji sadrže fosfor (npr. WO 05016252); derivate 4H-1-benzopiran-4-ona (npr. američka privremena prijava br.

[0449] 60/528,340).

[0451] Obelodanjeno je da je PKB (AKT) takođe protein u PI3K putu. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je upotreba AKT inhibitora u kombinaciji sa KRAS<G12C>inhibitorom. AKT inhibitori koji se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjem iz predmetnog pronalaska uključuju one obelodanjene u sledećim dokumentima: američki patent br.

[0452] 7,354,944; američki patent br.7,700,636; američki patent br.7,919,514; američki patent br.

[0453] 7,514,566; objavljena američka patentna prijava br. US 2009/0270445 A1; američki patent br.

[0454] 7,919,504; američki patent br.7,897,619; ili objavljena PCT prijava br. WO 2010/083246 A1. Posebni AKT inhibitori koji se mogu koristiti u kombinaciji sa KRAS<G12C>inhibitorima u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju MK-2206, GDC-0068 i AZD5363.

[0456] [0113] Obelodanjeno je da AKT inhibitori uključuju Akt-1-1 (inhibira Akt1) (Barnett et al. (2005) Biochem. J., 385 (Pt.2), 399-408); Akt-1-1,2 (inhibira Ak1 i 2) (Barnett et al. (2005) Biochem. J.385 (Pt.2), 399-408); API-59CJ-Ome (npr. Jin et al. (2004) Br. J. Cancer 91, 1808-12); 1-H-imidazo[4,5-c]piridinil jedinjenja (npr. WO05011700); indol-3-karbinol i njegove derivate (npr. američki patent br.6,656,963; Sarkar and Li (2004) J Nutr.134(12 Suppl), 3493S-3498S); perifozin (npr. ometa membransku lokalizaciju Akt-a); Dasmahapatra et al. (2004) Clin. Cancer Res.10(15), 5242-52, 2004); analoge etarskih lipida fosfatidilinozitola (npr. Gills and Dennis (2004) Expert. Opin. Investig. Drugs 13, 787-97); i triciribin (TCN ili API-2 ili NCI identifikator: NSC 154020; Yang et al. (2004) Cancer Res.

[0457] 64, 4394-9).

[0459] Obelodanjeno je da Mcl-1 inhibitori uključuju AMG-176, MIK665 i S63845. Protein leukemije mijeloidnih ćelija-1 (MCL-1) je jedan od ključnih anti-apoptotičkih članova porodice proteina limfoma B-ćelija-2 (BCL-2). Prekomerna ekspresija MCL-1 je blisko povezana sa progresijom tumora kao i sa rezistencijom, ne samo na tradicionalne hemoterapije već i na ciljane terapije uključujući BCL-2 inhibitore kao što je ABT-263.

[0461] Obelodanjeno je da inhibitori proteazoma uključuju Kyprolis<®>(karfilzomib), Velcade<®>(bortezomib) i oprozomib.

[0463] Obelodanjeno je da imunoterapije uključuju anti-PD-1 agense, anti-PDL-1 agense, anti-CTLA-4 agense, anti-LAG1 agense i anti-OX40 agense.

[0465] Obelodanjeno je da monoklonska antitela uključuju Darzalex<®>(daratumumab), Herceptin<®>(trastuzumab), Avastin<®>(bevacizumab), Rituxan<®>(rituksimab),

[0466] Lucentis<®>(ranibizumab) i Eylea<®>(aflibercept).

[0468] Obelodanjeno je da su imunomodulatorni agensi (IMiD) klasa imunomodulatornih lekova (lekovi koji prilagođavaju imune odgovore) koji sadrže imidnu grupu. Klasa IMiD uključuje talidomid i njegove analoge (lenalidomid, pomalidomid i apremilast).

[0470] Obelodanjeno je da anti-PD-1 inhibitori, uključujući antitela, uključuju pembrolizumab (Keytruda<®>) i nivolumab (Opdivo<®>). Primeri anti-PD-1 antitela i metode za njihovu upotrebu opisani su od strane Goldberg et al., Blood 110(1): 186-192

[0471] (2007), Thompson et al., Clin. Cancer Res.13(6):1757-1761 (2007) i Korman et al., međunarodna prijava br. PCT/JP2006/309606 (publikacija br. WO 2006/121168 A1, uključuju: Yervoy<™>(ipilimumab) ili tremelimumab (na CTLA-4), galiksimab (na B7.1), BMS-936558 (na PD-1), MK-3475 (na PD-1), AMP224 (na B7DC), BMS-936559 (na B7-H1), MPDL3280A (na B7-H1), MEDI-570 (na ICOS), AMG557 (na B7H2), MGA271 (na B7H3), IMP321 (na LAG-3), BMS-663513 (na CD137), PF-05082566 (na CD137), CDX-1127 (na CD27), anti-OX40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (na OX40L),

[0474] 1

[0475] atacicept (na TACI), CP-870893 (na CD40), lukatumumab (na CD40), dacetuzumab (na CD40), muromonab-CD3 (na CD3), ipilimumab (na CTLA-4). Imune terapije takođe uključuju genetski modifikovane T-ćelije (npr. CAR-T ćelije) i bispecifična antitela (npr. BiTE).

[0477] U posebnom otelotvorenju, jedinjenja iz predmetnog pronalaska se koriste u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom, kao što je AMG 404. U specifičnom otelotvorenju, anti-PD-1 antitelo (ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen) obuhvata 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 CDR aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 1-6 (predstavljajući HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 i LC CDR3, tim redosledom). U primerima otelotvorenja, anti-PD-1 antitelo (ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen) obuhvata svih 6 CDR aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 1-6. U drugim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo (ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen) obuhvata (a) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca u SEQ ID NO: 7, ili njenu varijantnu sekvencu koja se razlikuje za samo jednu ili dve aminokiseline ili koja ima najmanje ili oko 70% identičnosti sekvence, ili (b) aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca u SEQ ID NO: 8 ili njenu varijantnu sekvencu koja se razlikuje za samo jednu ili dve aminokiseline ili koja ima najmanje ili oko 70% identičnosti sekvence. U primeru otelotvorenja, anti-PD-1 antitelo (ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen) obuhvata aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca u SEQ ID NO: 7 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca u SEQ ID NO: 8. U drugim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo (ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen) obuhvata (a) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 9 ili njenu varijantnu sekvencu koja se razlikuje za samo jednu ili dve aminokiseline ili koja ima najmanje ili oko 70% identičnosti sekvence; ili (b) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 10 ili njenu varijantnu sekvencu koja se razlikuje za samo jednu ili dve aminokiseline ili koja ima najmanje ili oko 70% identičnosti sekvence. U primeru otelotvorenja, anti-PD-1 antitelo (ili njegov fragment antitela koji vezuje antigen) obuhvata aminokiselinsku sekvencu teškog lanca iz SEQ ID NO: 9 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca iz SEQ ID NO: 10.

[0479] Predmetno obelodanjivanje dalje obezbeđuje sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju anti-PD-1 antitelo (ili njegov deo koji vezuje antigen). U primernim aspektima, antitelo obuhvata 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 CDR-ova kodiranih nukleinskom(im) kiselinom(ama) iz SEQ ID NO: 11-16 (predstavljajući HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC

[0482] 2

[0483] CDR2 i LC CDR3, tim redosledom). U drugom primernom aspektu, antitelo obuhvata svih 6 CDR-ova kodiranih nukleinskim kiselinama iz SEQ ID NO: 11-16. U nekim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo (ili njegov deo koji vezuje antigen) obuhvata (a) varijabilni region teškog lanca kodiran putem SEQ ID NO: 17 ili njene varijantne sekvence koja se razlikuje za samo 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleinskih kiselina ili koja ima najmanje ili oko 70%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence, ili (b) varijabilni region lakog lanca kodiran putem SEQ ID NO: 18 ili njene varijantne sekvence koja se razlikuje za samo 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleinskih kiselina ili koja ima najmanje ili oko 70%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence. U primeru otelotvorenja, anti-PD-1 antitelo (ili njegov deo koji vezuje antigen) obuhvata varijabilni region teškog lanca kodiran putem SEQ ID NO: 17 i varijabilni region lakog lanca kodiran putem SEQ ID NO: 18. U drugim otelotvorenjima, anti-PD-1 antitelo (ili njegov deo koji vezuje antigen) obuhvata (a) težak lanac kodiran putem SEQ ID NO: 19 ili njene varijantne sekvence koja se razlikuje za samo 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleinskih kiselina ili koja ima najmanje ili oko 70%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence, ili (b) lak lanac kodiran putem SEQ ID NO: 20 ili njene varijantne sekvence koja se razlikuje za samo 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleinskih kiselina ili koja ima najmanje ili oko 70%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sekvence. U primeru otelotvorenja, anti-PD-1 antitelo (ili njegov deo koji vezuje antigen) obuhvata težak lanac kodiran putem SEQ ID NO: 19 i lak lanac kodiran putem SEQ ID NO: 20. CT-26 KRAS p.G12C ćelije su generisane iz mišje kolorektalne linije T-26 (ATCC) korišćenjem CRISPR tehnologije kako bi se oba KRAS p.G12D alela zamenila sa p.G12C (ThermoFisher Scientific) kao što je kodirano putem SEQ ID NO: 21.

[0485]

[0486] SEQ ID Tip sekvence Sekvenca

[0487]

[0490] 4

[0491]

[0492] SEQ ID Tip sekvence Sekvenca

[0493]

[0494] SEQ ID Tip sekvence Sekvenca

[0495]

[0496] SEQ ID Tip sekvence Sekvenca

[0498]

[0501] Obelodanjeno je da GITR agonisti uključuju GITR fuzione proteine i anti-GITR antitela (npr. bivalentna anti-GITR antitela), kao što su GITR fuzioni protein opisan u američkom patentu br.6,111,090box.c, evropskom patentu br.090505B1, američkom patentu br.8,586,023, PCT publikacijama br. WO 2010/003118 i 2011/090754, ili anti-GITR antitelo opisano, npr. u američkom patentu br.7,025,962, evropskom patentu br.

[0502] 1947183B1, američkom patentu br.7,812,135, američkom patentu br.8,388,967, američkom patentu br.8,591,886, evropskom patentu br. EP 1866339, PCT publikaciji br. WO 2011/028683, PCT publikaciji br. WO 2013/039954, PCT publikaciji br.

[0503] WO2005/007190, PCT publikaciji br. WO 2007/133822, PCT publikaciji br.

[0504] WO2005/055808, PCT publikaciji br. WO 99/40196, PCT publikaciji br. WO 2001/03720, PCT publikaciji br. WO99/20758, PCT publikaciji br. WO2006/083289, PCT publikaciji br. WO 2005/115451, američkom patentu br.7,618,632 i PCT publikaciji br. WO 2011/051726.

[0506] Obelodanjeno je da se KRAS<G12C>inhibitori takođe mogu koristiti zajedno sa inhibitorima CDK4 i/ili 6 u predmetnom pronalasku. Inhibitori CDK 4 i/ili 6 koji se mogu koristiti u predmetnim kombinacijama uključuju one obelodanjene u sledećim dokumentima: objavljena PCT prijava br. WO 2009/085185 objavljena američka patentna prijava br. US2011/0097305.

[0508] Obelodanjeno je da druga jedinjenja koja se mogu koristiti zajedno sa KRAS<G12C>inhibitorima u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju jedinjenja koja inhibiraju proteine koji su deo intrinzičnog puta apoptoze. Primeri takvih jedinjenja uključuju Bcl2/BclxL inhibitore kao što je navitoklaks i Bcl2 inhibitore kao što je ABT-199.

[0509] Obelodanjeno je da druga jedinjenja koja se mogu koristiti zajedno sa KRAS<G12C>inhibitorima u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju BCR-ABL inhibitore kao što je dazatinib i HDAC inhibitore kao što je panobinostat.

[0511] Obelodanjeno je da druga jedinjenja koja se mogu koristiti zajedno sa KRAS<G12C>inhibitorima u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju jedinjenja platine, kao što su cisplatin, karboplatin i oksaliplatin; inhibitore topoizomeraze II, tipično iz klase antraciklina, kao što su doksorubicin, daunorubicin, idarubicin, epirubicin, pegilovani lipozomalni doksorubicin hidrohlorid, miocet i etopozid; inhibitore topoizomeraze I kao što je irinotekan (CPT-11); agense za alkilaciju DNK kao što je temozolomid; i analoge nukleozida kao što su citarabin i decitabin.

[0513] Obelodanjeno je da druga jedinjenja koja se mogu koristiti zajedno sa KRAS<G12C>inhibitorima u kombinacijama iz predmetnog pronalaska uključuju receptorske i nereceptorske kinazne inhibitore uključujući inhibitore tirozinske kinaze. Primeri takvih jedinjenja uključuju imatinib, dazatinib, ponatinib, bozutinib, nilotinib, kvizartinib, midostaurin, erlotinib i lapatinib.

[0515] Jedinjenja opisana u ovom dokumentu mogu se koristiti u kombinaciji sa agensima koji su ovde obelodanjeni ili drugim odgovarajućim agensima, u zavisnosti od stanja koje se leči. Stoga će se u nekim otelotvorenjima jedno ili više jedinjenja iz obelodanjivanja primenjivati zajedno sa drugim agensima kao što je gore opisano. Kada se koriste u kombinovanoj terapiji, jedinjenja opisana u ovom dokumentu se primenjuju sa drugim agensom istovremeno ili odvojeno. Ova primena u kombinaciji može uključivati istovremenu primenu dva agensa u istom obliku doze, istovremenu primenu u odvojenim oblicima doza i odvojenu primenu. Odnosno, jedinjenje opisano u ovom dokumentu i bilo koji od gore opisanih agenasa mogu se formulisati zajedno u istom obliku doze i primeniti istovremeno. Alternativno, jedinjenje iz obelodanjivanja i bilo koji od gore opisanih agenasa mogu se primeniti istovremeno, pri čemu su oba agensa prisutna u odvojenim formulacijama. U drugoj alternativi, jedinjenje iz predmetnog obelodanjivanja može se primeniti neposredno pre, a zatim bilo koji od gore opisanih agenasa, ili obrnuto. U nekim otelotvorenjima protokola odvojene primene, jedinjenje iz obelodanjivanja i bilo koji od gore opisanih agenasa primenjuju se u razmaku od nekoliko minuta, nekoliko sati ili nekoliko dana.

[0516] Pošto jedan aspekt predmetnog pronalaska predviđa lečenje bolesti/stanja kombinacijom farmaceutski aktivnih jedinjenja koja se mogu primeniti odvojeno, pronalazak se dalje odnosi na kombinovanje odvojenih farmaceutskih kompozicija u obliku kompleta. Komplet obuhvata dve odvojene farmaceutske kompozicije: jedinjenje iz predmetnog pronalaska i drugo farmaceutsko jedinjenje. Komplet obuhvata posudu za smeštanje odvojenih kompozicija, kao što je podeljena boca ili podeljeno pakovanje od folije. Dodatni primeri posuda uključuju špriceve, kutije i kese. U nekim otelotvorenjima, komplet obuhvata uputstva za upotrebu odvojenih komponenti. Oblik kompleta je posebno prednostan kada se odvojene komponente poželjno primenjuju u različitim oblicima doza (npr. oralno i parenteralno), kada se primenjuju u različitim intervalima doziranja, ili kada zdravstveni radnik koji propisuje terapiju želi titraciju pojedinačnih komponenti kombinacije.

[0517] SINTEZA AMG 510

[0518] KRAS<G12C>inhibitori iz predmetnog pronalaska uključuju one obelodanjene u objavljenoj PCT prijavi WO 2018/119183. Sinteza AMG 510, koji ima strukturu

[0520]

[0522] navedena je u U.S.S.N.15/984,855, podnetom 21. maja 2018., koji se poziva na prvenstvo i korist na osnovu privremene prijave br.62/509,629, podnete 22. maja 2017., kao što je opisano u nastavku.

[0524] 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-(2-propenoil)-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on je pripremljen korišćenjem sledećeg postupka, u kojem je finalni proizvod razdvojen radi izolovanja M-atropizomera.

[0525]

[0528] Korak 1: 2,6-dihloro-5-fluoronikotinamid (Intermedijer S). Smeši 2,6-dihloro-5-fluoro-nikotinske kiseline (4,0 g, 19,1 mmol, AstaTech Inc., Bristol, PA) u dihlorometanu (48 mL) dodat je oksalil-hlorid (2M rastvor u DCM, 11,9 mL, 23,8 mmol), a zatim katalitička količina DMF-a (0,05 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, a potom koncentrovana. Ostatak je rastvoren u 1,4-dioksanu (48 mL) i ohlađen na 0 °C.

[0529] Rastvor amonijum-hidroksida (baza 28,0-30% NH3, 3,6 mL, 28,6 mmol) dodat je polako putem šprica. Dobijena smeša je mešana na 0 °C tokom 30 minuta, a zatim koncentrovana. Ostatak je razblažen smešom EtOAc/heptan u odnosu 1:1 i mešan 5 minuta, a potom profiltriran. Profiltrirane čvrste materije su odbačene, a preostali matični lug je delimično koncentrovan na polovinu zapremine i profiltriran. Profiltrirane čvrste materije su isprane heptanom i sušene u peći pod sniženim pritiskom (45 °C) preko noći kako bi se dobio 2,6-dihloro-5-fluoronikotinamid.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) δ ppm 8,23 (d, J = 7,9 Hz, 1 H) 8,09 (br s, 1 H) 7,93 (br s, 1 H). m/z (ESI, jon): 210,9 (M+H)<+>.

[0531] Korak 2: 2,6-dihloro-5-fluoro-N-((2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)karbamoil)nikotinamid. U suspenziju 2,6-dihloro-5-fluoronikotinamida (Intermedijer S, 5,0 g, 23,9 mmol) u THF-u (20 mL), hlađenu ledom, polako je dodat oksalil-hlorid (2 M

[0534] 1

[0535] rastvor u DCM, 14,4 mL, 28,8 mmol) putem šprica. Dobijena smeša je zagrevana na 75 °C tokom 1 sata, zatim je zagrevanje prekinuto, a reakciona smeša koncentrovana na polovinu zapremine. Nakon hlađenja na 0 °C, dodat je THF (20 mL), a zatim rastvor 2-izopropil-4-metilpiridin-3-amina (Intermedijer R, 3,59 g, 23,92 mmol) u THF-u (10 mL), kap po kap putem kanile. Dobijena smeša je mešana na 0 °C tokom 1 sata, a zatim je reakcija ugašena smešom zasićenog rastvora soli i zasićenog vodenog rastvora amonijum-hlorida u odnosu 1:1. Smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3x), a kombinovani organski slojevi su osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrovani kako bi se dobio 2,6-dihloro-5-fluoro-N-((2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)karbamoil)nikotinamid. Ovaj materijal je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. m/z (ESI, jon): 385,1(M+H)<+>.

[0537] Korak 3: 7-hloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)pirido[2,3-d]pirimidin-2,4(1H,3H)-dion. U rastvor 2,6-dihloro-5-fluoro-N-((2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)karbamoil)nikotinamida (9,2 g, 24,0 mmol) u THF-u (40 mL), hlađen ledom, polako je dodat KHMDS (1 M rastvor u THF, 50,2 mL, 50,2 mmol) putem šprica. Ledeno kupatilo je uklonjeno i dobijena smeša je mešana tokom 40 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je ugašena zasićenim vodenim rastvorom amonijum-hlorida i ekstrahovana sa EtOAc (3x). Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrovani. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silikagelu (eluent: 0-50% 3:1 EtOAc-EtOH/heptan) kako bi se dobio 7-hloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)pirido[2,3-d]pirimidin-2,4(1H,3H)-dion.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) δ ppm 12,27 (br s, 1H), 8,48-8,55 (m, 2 H), 7,29 (d, J= 4,8 Hz, 1 H), 2,87 (quin, J = 6,6 Hz, 1 H), 1,99-2,06 (m, 3 H), 1,09 (d, J = 6,6 Hz, 3 H), 1,01 (d, J = 6,6 Hz, 3 H).<19>F NMR (376 MHz, DMSO-d<6>) δ: -126,90 (s, 1 F). m/z (ESI, jon): 349,1 (M+H)<+>.

[0539] Korak 4: 4,7-dihloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on. U rastvor 7-hloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)pirido[2,3-d]pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (4,7 g, 13,5 mmol) i DIPEA (3,5 mL, 20,2 mmol) u acetonitrilu (20 mL) dodat je fosfor-oksihlorid (1,63 mL, 17,5 mmol), kap po kap putem šprica. Dobijena smeša je zagrevana na 80 °C tokom 1 sata, a zatim ohlađena na sobnu temperaturu i koncentrovana kako bi se dobio 4,7-dihloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on. Ovaj materijal je korišćen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja. m/z (ESI, jon): 367,1 (M+H)<+>.

[0542] 2

[0543] Korak 5: (S)-terc-butil 4-(7-hloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il)-3-metilpiperazin-1-karboksilat. U rastvor 4,7-dihloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona (13,5 mmol) u acetonitrilu (20 mL), hlađen ledom, dodat je DIPEA (7,1 mL, 40,3 mmol), a zatim (S)-4-N-Boc-2-metil piperazin (3,23 g, 16,1 mmol, Combi-Blocks, Inc., San Diego, CA, SAD). Dobijena smeša je zagrejana na sobnu temperaturu i mešana tokom 1 sata, a zatim razblažena hladnim zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata (200 mL) i EtOAc (300 mL). Smeša je mešana dodatnih 5 minuta, slojevi su razdvojeni, a vodeni sloj je još jednom ekstrahovan sa EtOAc (1x). Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrovani. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silikagelu (eluent: 0-50% EtOAc/heptan) kako bi se dobio (S)-terc-butil 4-(7-hloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il)-3-metilpiperazin-1-karboksilat. m/z (ESI, jon): 531,2 (M+H)<+>.

[0545] Korak 6: (3S)-terc-butil 4-(6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il)-3-metilpiperazin-1-karboksilat. Smeša (S)-terc-butil 4-(7-hloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il)-3-metilpiperazin-1-karboksilata (4,3 g, 8,1 mmol), kalijum-trifluoro(2-fluoro-6-hidroksifenil)borata (Intermedijer Q, 2,9 g, 10,5 mmol), kalijum-acetata (3,2 g, 32,4 mmol) i kompleksa [1,1'-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijuma(II) sa dihlorometanom (661 mg, 0,81 mmol) u 1,4-dioksanu (80 mL) otplinjavana je azotom tokom 1 minuta. Dodata je deoksigenizovana voda (14 mL), i dobijena smeša je zagrevana na 90 °C tokom 1 sata. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi na sobnu temperaturu, reakcija je ugašena poluzasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata i smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2x) i DCM (1x).

[0546] Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrovani. Ostatak je prečišćen hromatografijom na silikagelu (eluent: 0-60% 3:1 EtOAc-EtOH/heptan) kako bi se dobio (3S)-terc-butil 4-(6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il)-3-metilpiperazin-1-karboksilat.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) δ ppm 10,19 (br s, 1 H), 8,38 (d, J = 5,0 Hz, 1 H), 8,26 (dd, J = 12,5, 9,2 Hz, 1 H), 7,23-7,28 (m, 1 H), 7,18 (d, J = 5,0 Hz, 1 H), 6,72 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 6,68 (t, J = 8,9 Hz, 1 H), 4,77-4,98 (m, 1 H), 4,24 (br t, J = 14,2 Hz, 1 H), 3,93-4,08 (m, 1 H), 3,84 (br d, J=12,9 Hz, 1 H), 3,52-3,75 (m, 1 H), 3,07-3,28 (m, 1 H), 2,62-2,74 (m, 1 H), 1,86-1,93 (m, 3 H), 1,43-1,48 (m, 9 H), 1,35 (dd, J = 10,8, 6,8 Hz, 3 H), 1,26-1,32 (m, 1 H), 1,07 (dd, J = 6,6, 1,7 Hz, 3 H), 0,93 (dd, J = 6,6, 2,1 Hz, 3 H).<19>F NMR (376 MHz, DMSO-d<6>) δ: -115,65 (s, 1 F), -128,62 (s, 1 F). m/z (ESI, jon): 607,3 (M+H)<+>.

[0548] Korak 7: 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-(2-propenoil)-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on. Trifluoroacetatna kiselina (25 mL, 324 mmol) dodata je u rastvor (3S)-terc-butil 4-(6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il)-3-metilpiperazin-1-karboksilata (6,3 g, 10,4 mmol) u DCM (30 mL). Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata, a zatim je koncentrovana. Ostatak je rastvoren u DCM (30 mL), ohlađen na 0 °C, i sekvencijalno tretiran sa DIPEA (7,3 mL, 41,7 mmol) i rastvorom akriloil-hlorida (0,849 mL, 10,4 mmol) u DCM (3 mL; dodat kap po kap putem šprica). Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 10 minuta, a zatim je ugašena poluzasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata i ekstrahovana sa DCM (2x). Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad anhidrovanog natrijum-sulfata i koncentrovani. Hromatografsko prečišćavanje ostatka (silikagel; eluent: 0-100% EtOAc-EtOH (3:1)/heptan), nakon čega je usledilo hiralno razdvajanje korišćenjem superkritične fluidne hromatografije (Chiralpak IC, 30 × 250 mm, 5 µm, 55% MeOH/CO<2>, 120 mL/min, 102 bar; sakupljen prvi eluirani pik), dalo je AMG 510 (2,25 g, prinos 43%).6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-(2-propenoil)-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d<6>) δ ppm 10,20 (s, 1 H), 8,39 (d, J = 4,8 Hz, 1 H), 8,24-8,34 (m, 1 H), 7,23-7,32 (m, 1 H), 7,19 (d, J = 5,0 Hz, 1 H), 6,87 (td, J = 16,3, 11,0 Hz, 1 H), 6,74 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 6,69 (t, J = 8,6 Hz, 1 H), 6,21 (br d, J= 16,2 Hz, 1 H), 5,74-5,80 (m, 1 H), 4,91 (br s, 1 H), 4,23-4,45 (m, 2 H), 3,97-4,21 (m, 1 H), 3,44-3,79 (m, 2 H), 3,11-3,31 (m, 1 H), 2,67-2,77 (m, 1 H), 1,91 (s, 3 H), 1,35 (d, J = 6,8 Hz, 3 H), 1,08 (d, J = 6,6 Hz, 3 H), 0,94 (d, J = 6,8 Hz, 3 H).<19>F NMR (376 MHz, DMSO-d<6>) δ ppm -115,64 (s, 1 F), -128,63 (s, 1 F). m/z (ESI, jon): 561,2 (M+H)<+>.

[0550] AMG 510, kako se ovde navodi, jeste M-atropizomer 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-(2-propenoil)-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona, koji ima formulu:

[0553] 4

[0554]

[0556] ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0558] Sinteza intermedijera

[0560]

[0563] 2-izopropil-4-metilpiridin-3-amin (R): Kompleks [1,1'-bis(difenilfosfino)ferocen]dihloropaladijuma(II) sa dihlorometanom (79 mg, 0,10 mmol) dodat je u suspenziju 3-amino-2-bromo-4-pikolina (3; 360 mg, 1,9 mmol, Combi-Blocks, San Diego, CA) u THF-u (4 mL), a dobijena smeša je prostrujana argonom tokom 2 minuta.

[0564] Dodat je 2-propilcink-bromid (0,5 M rastvor u THF-u, 5,40 mL, 2,7 mmol) i dobijeni rastvor je zagrevan na 60 °C tokom 17 sati, a zatim ostavljen da se ohladi na sobnu temperaturu. Dodati su voda (10 mL) i 1 N vodeni rastvor NaOH (20 mL), a dobijena smeša je ekstrahovana sa EtOAc (2x). Kombinovani organski slojevi su osušeni iznad bezvodnog natrijum-sulfata i koncentrovani u vakuumu. Hromatografsko prečišćavanje ostatka (silikagel, eluent: 0-15% MeOH/DCM) dalo je R (284 mg, prinos 98%).<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d<6>): δ 7,66 p.p.m. (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 4,72 (br s, 2H), 3,14-3,25 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,14 (d, J = 6,8 Hz, 6H); m/z (ESI, jon): 151,1 (M+H)<+>.

[0566]

[0569] [0142] (2-fluoro-6-hidroksifenil)kalijum-trifluoroborat (Q): Rastvor kalijum-fluorida (44,7 g, 770 mmol) u vodi (75 mL) dodat je u suspenziju (2-fluoro-6-hidroksifenil)boronske kiseline (9; 30 g, 192 mmol, Combi-Blocks, San Diego, CA) u acetonitrilu (750 mL). Nakon 2 minuta mešanja, dodat je rastvor L-(+)-vinske kiseline (72,2 g, 481 mmol) u THF-u (375 mL) tokom 10 minuta. Dobijena smeša je mehanički mešana tokom 1 sata. Suspendovane čvrste materije su uklonjene filtracijom i isprane malom količinom THF-a. Kombinovani filtrat je zatim delimično koncentrovan u vakuumu dok čvrste materije nisu počele da se talože. Filtrat je ohlađen na -20 °C i mešan tokom 16 sati, a zatim polako zagrejan na sobnu temperaturu. Dodat je 2-propanol (20 mL), a nataložene čvrste materije su sakupljene filtracijom i isprane 2-propanolom kako bi se dobilo 27,5 g čvrste materije. Filtrat je ponovo delimično koncentrovan (dok nije uočeno taloženje), ohlađen na -20 °C i mešan tokom 20 minuta. Dodat je dodatni 2-propanol, a nataložena čvrsta materija je sakupljena filtracijom i isprana 2-propanolom. Dve serije čvrste materije su kombinovane kako bi se dobio intermedijer Q (34,6 g, prinos 82%).<1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d<6>): δ 8,07 p.p.m. (q, J = 14,7 Hz, 1H), 6,93 (q, J = 7,5 Hz, 1H), 6,30-6,38 (m, 2H).

[0570] Sinteza AMG 510 propionamida

[0572]

[0575] (M)-6 i (M)-11: Racemsko jedinjenje 6 je razdvojeno superkritičnom fluidnom hromatografijom (Chiralpak AD, 21 × 250 mm, 5 µm, 40% MeOH/CO<2>, 80 mL/min, 110 bar; sakupljen drugi eluirani pik) kako bi se dobio (M)-6, koji je konvertovan u (M)-11 korišćenjem postupaka prijavljenih za racemske supstrate.

[0577] (M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-propanoil-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on (AMG 510 propionamid): Trifluoroacetatna kiselina (4,0 ml, 51,9 mmol) dodata je u rastvor (M)-11 (0,196 g, 0,323 mmol) u DCM-u (5 mL), a dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta. Smeša je zatim koncentrovana u vakuumu, a ostatak je rastvoren u DCM-u (10 mL), ohlađen na 0 °C i sekvencijalno tretiran sa DIPEA (0,169 mL, 0,969 mmol) i propionil-hloridom (0,016 mL, 0,194 mmol). Dobijena smeša je mešana na 0 °C tokom 10 minuta, zatim razblažena zasićenim vodenim rastvorom natrijum-bikarbonata i ekstrahovana sa DCM-om (2x). Kombinovani ekstrakti su osušeni iznad bezvodnog natrijumsulfata i koncentrovani u vakuumu. Hromatografsko prečišćavanje ostatka (silikagel; eluent: 0-70% EtOAc-EtOH (3:1)/heptan) dalo je AMG 510 propionamid (0,180 g, prinos 99%).<1>HNMR (400 MHz, DMSO-d<6>): δ 10,20 p.p.m (s, 1H), 8,40 (d, J=5,0 Hz, 1H), 8,27 (br dd, J=15,1, 9,3 Hz, 1H), 7,27 (m, 1H), 7,21 (br d, J=4,8 Hz, 1H), 6,73 (d, J=8,3 Hz, 1H), 6,69 (t, J=8,9 Hz, 1H), 4,87 (br s, 1H), 4,31 (m, 1,5H), 4,21 (br d, J=13,5 Hz, 0,5H), 3,94 (br d, J=12,2 Hz, 0,5H), 3,82 (br d, J=13,3 Hz, 0,5H), 3,62-3,76 (m, 1H), 3,52-3,62 (m, 0,5H), 3,43-3,51 (m, 0,5H), 3,18 (br dd, J=13,3, 3,3 Hz, 0,5H), 3,06 (br t, J=10,7 Hz, 0,5H), 2,73 (br dd, J=10,5, 6,1 Hz, 1H), 2,33-2,48 (m, 2H), 1,91 (s, 3H), 1,29-1,42 (m, 3H), 0,98-1,12 (m, 6H), 0,94 (d, J=6,6 Hz, 3H); m/z (ESI, jon): 563,2 (M+H)<+>.

[0579] U alternativnom postupku, AMG 510 je sintetisan, a relevantni intermedijeri su opisani u američkoj privremenoj patentnoj prijavi br.62/768,802, podnetoj 16. novembra 2018. godine. Alternativni postupak obuhvata sledeće korake pri čemu razdvajanje rac-diona u koracima 4 i 5 potpomaže uspešno odvajanje atropizomera:

[0582]

[0583] Opis postupka

[0585] Korak 1

[0587]

[0590]

[0593] [0148] U rastvor 2,6-dihloro-5-fluoro-3-piridinkarboksilne kiseline (jedinjenje 1) (25 kg; 119,1 mol) u dihlorometanu (167 kg) i DMF-u (592 g) dodat je oksalil-hlorid (18,9 kg; 148,9 mol) uz održavanje unutrašnje temperature između 15-20 °C. Dodatni dihlorometan (33 kg) dodat je radi ispiranja, a reakciona smeša je mešana tokom 2 sata. Reakciona smeša je ohlađena, a zatim je reakcija ugašena amonijum-hidroksidom (40,2 L; 595,5 mol) uz održavanje unutrašnje temperature na 0 ± 10 °C. Dobijena suspenzija je mešana tokom 90 minuta, a zatim je proizvod sakupljen filtracijom. Profiltrirane čvrste materije su isprane dejonizovanom (DI) vodom (3X 87 L) i osušene kako bi se dobio 2,6-dihloro-5-fluoronikotinamid (jedinjenje 2).

[0594] Korak 2

[0596]

[0599]

[0602] [0150] IU reaktor A, u rastvor 2,6-dihloro-5-fluoronikotinamida (jedinjenje 2) (16,27 kg; 77,8 mol) u dihlorometanu (359,5 kg), dodat je oksalil-hlorid (11,9 kg; 93,8 mol) uz održavanje temperature ≤ 25 °C tokom 75 minuta. Dobijeni rastvor je zatim zagrejan na 40 °C ± 3 °C i ostavljen da reaguje tokom 3 sata. Korišćenjem vakuuma, rastvor je destilovan radi uklanjanja dihlorometana dok nivo rastvora nije opao ispod mešalice. Zatim je dodat dihlorometan (300 kg) i smeša je ohlađena na 0 ± 5 °C. U čist, suv reaktor (reaktor B) dodat je 2-izopropil-4-metilpiridin-3-amin (ANILIN) (12,9 kg; 85,9 mol), a zatim dihlorometan (102,6 kg). Rastvor ANILINA je azeotropno isušen putem vakuum destilacije uz održavanje unutrašnje temperature između 20-25 °C, uz dopunjavanje dodatnim dihlorometanom sve dok rastvor nije postao suv prema KF analizi (granica ≤ 0,05%). Zapremina rastvora je podešena na približno 23 L pomoću dihlorometana. Isušeni rastvor ANILINA je zatim dodat u reaktor A uz održavanje unutrašnje temperature od 0 ± 5 °C tokom celog dodavanja. Smeša je potom zagrejana na 23 °C i ostavljena da reaguje tokom 1 sata. Rastvor je fino profiltriran u čist reaktor kako bi se dobio 2,6-dihloro-5-fluoro-N-((2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)karbamoil)nicotinamid (jedinjenje 3) kao rastvor u DCM-u i korišćen je direktno u sledećem koraku.

[0603] Korak 3

[0605]

[0608]

[0609]

[0611] Rastvor 2,6-dihloro-5-fluoro-N-{[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]karbamoil}piridin-3-karboksamida (UREA (jedinjenje 3)) u dihlorometanu (15 kg sadržano; 38,9 mol) podvrgnut je zameni rastvarača u 2-MeTHF korišćenjem vakuum destilacije uz održavanje unutrašnje temperature od 20-25 °C. Zapremina u reaktoru je podešena na 40 L, a zatim je dodat dodatni 2-MeTHF (105,4 kg). Natrijum-terc-butoksid je dodat (9,4 kg; 97,8 mol) uz održavanje temperature na 5-10 °C. Sadržaj je zagrejan na 23 °C i mešan tokom 3 sata. Zatim je sadržaj ohlađen na 0-5 °C i dodat je amonijum-hlorid (23,0 kg; 430 mol) kao rastvor u 60 L dejonizovane (DI) vode. Smeša je zagrejana na 20 °C, dodata je DI voda (15 L) i dalje ostavljena da reaguje tokom 30 minuta. Mešanje je zaustavljeno i slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je uklonjen, a organskom sloju je dodata DI voda (81,7 L). Pripremljena je smeša koncentrovane HCl (1,5 kg) i vode (9 L), koja je polako dodavana u reaktor dok izmerena pH vrednost nije bila između 4 i 5. Slojevi su razdvojeni, a vodeni sloj je ponovo ekstrahovan pomoću 2-MeTHF (42,2 kg). Dva organska sloja su kombinovana i isprana 10% rastvorom limunske kiseline (75 kg), nakon čega je usledilo ispiranje smešom vode (81,7 L) i zasićenog NaCl (19,8 kg). Organski sloj je zatim ispran zasićenim natrijumbikarbonatom (75 kg), uz ponavljanje po potrebi kako bi se postigla ciljna pH vrednost vodenog sloja ≥ 7,0. Organski sloj je ponovo ispran zasićenim rastvorom soli (54,7 kg), a zatim osušen iznad magnezijum-sulfata (5 kg). Smeša je profiltrirana radi uklanjanja magnezijum-sulfata, uz ispiranje filter-sloja sa 2-MeTHF (49,2 kg). Kombinovani filtrat i tečnosti od ispiranja su destilovani pod vakuumom do zapremine od 40 L. Koncentrovani rastvor je zagrejan na 55 °C i polako je dodavan heptan (10-12 kg) do tačke zamućenja Rastvor je ohlađen na 23 °C tokom 2 sata, a zatim je dodat heptan (27,3 kg) tokom 2 sata. Suspenzija proizvoda je ostavljena da reaguje tokom 3 sata na 20-25 °C, zatim profiltrirana i isprana smešom 2-MeTHF (2,8 kg) i heptana (9 kg). Proizvod je osušen pomoću azota i vakuuma kako bi se dobio čvrsti 7-hloro-6-fluoro-1-(2-izopropil-4-metilpiridin-3-il)pirido[2,3-d]pirimidin-2,4(1H,3H)-dion (rac-DION (jedinjenje 4)).

[0612] Korak 4

[0615] 1

[0616]

[0619]

[0622] U posudu sa mešanom suspenzijom jedinjenja 4 (1,0 ekviv.) u 2-metiltetrahidrofuranu (7,0 L/kg) dodata je (+)-2,3-dibenzoil-D-vinska kiselina (2,0 ekviv.) u atmosferi azota.2-MeTHF je hiralan, ali se koristi kao racemska smeša. Različiti enantiomeri 2-MeTHF-a se nasumično ugrađuju u ko-kristal. Dobijena suspenzija je zagrejana na 75 °C i ostavljena da reaguje na 75 °C dok nije uočeno potpuno rastvaranje (≤ 30 minuta). Dobijeni rastvor je fino profiltriran na 75 °C u sekundarnu posudu. U fino profiltrirani rastvor dodat je n-heptan (2,0 L/kg) brzinom kojom je održavana unutrašnja temperatura iznad 65 °C. Rastvor je zatim

[0625] 2

[0626] ohlađen na 60 °C, inokulisan kristalima (0,01 kg/kg) i ostavljen da reaguje 30 minuta.

[0627] Dobijena suspenzija je ohlađena na 20 °C tokom 4 sata, a zatim je uzorkovana za analizu hiralne čistoće putem HPLC-a. U suspenziju je dodat n-heptan (3,0 L/kg), a zatim je smeša ostavljena da odleži 4 sata na 20 °C u atmosferi azota. Suspenzija je profiltrirana, a izolovane čvrste materije su isprane dva puta smešom (2:1) n-heptan:2-metiltetrahidrofuran (3,0 L/kg). Materijal je osušen azotom i vakuumom kako bi se dobio kompleks M-dion:DBTA: Me-THF (jedinjenje 4a).

[0628] Korak 5

[0630]

[0633]

[0634] U posudi A, suspenzija dinatrijum-hidrogenfosfata (21,1 kg, 2,0 ekviv.) u DI vodi (296,8 L, 6,3 L/kg) mešana je dok nije uočeno rastvaranje (≥ 30 minuta). U posudi B, suspenzija kompleksa M-dion:DBTA: Me-THF (kompozicija 4a) [46,9 kg (25,9 kg korigovano za M-dion, 1,0 ekviv.)] u metil-terc-butil etru (517,8 L, 11,0 L/kg) mešana je tokom 15 do 30 minuta. Dobijeni rastvor iz posude A dodat je u posudu B, a zatim je smeša mešana duže od 3 sata. Mešanje je zaustavljeno, a dvofazna smeša je ostavljena da se razdvoji duže od 30 minuta. Donja vodena faza je uklonjena, a zatim ponovo ekstrahovana metil-terc-butil etrom (77,7 L, 1,7 L/kg). Organske faze su kombinovane u posudi B i osušene magnezijum-sulfatom (24,8 kg, 0,529 kg/kg). Dobijena suspenzija iz posude B mešana je duže od tri sata, a zatim profiltrirana u posudu C. U posudu B je dodato sredstvo za ispiranje, metil-terc-butil etar (46,9 L, 1,0 L/kg), koji je potom profiltriran u posudu C.

[0635] Sadržaj posude C je ohlađen na 10 °C, a zatim destilovan pod vakuumom uz polako zagrevanje do 35 °C. Destilacija je nastavljena dok nije sakupljeno 320-350 kg (6,8-7,5 kg/kg) metil-terc-butil etra. Nakon hlađenja sadržaja posude C na 20 °C, dodat je n-heptan (278,7 L, 5,9 L/kg) tokom jednog sata, a zatim je smeša destilovana pod vakuumom uz polako zagrevanje do 35 °C. Destilacija je nastavljena dok nije sakupljeno 190-200 kg (4,1-4,3 kg/kg) smeše metil-terc-butil etra i n-heptana. Nakon hlađenja sadržaja posude C na 20 °C, n-heptan (278,7 L, 5,9 L/kg) je dodat po drugi put tokom jednog sata, a zatim je smeša destilovana pod vakuumom uz polako zagrevanje do 35 °C. Destilacija je nastavljena dok ponovo nije sakupljeno 190-200 kg (4,1-4,3 kg/kg) smeše rastvarača. Nakon hlađenja sadržaja posude C na 20 °C, n-heptan (195,9 L, 4,2 L/kg) je dodat po treći put tokom jednog sata, a zatim je uzorkovan za određivanje sastava rastvarača putem GC analize. Suspenzija u posudi C je nastavila da se meša duže od jednog sata. Suspenzija je profiltrirana, a zatim isprana n-heptanom (68,6 L, 1,5 L/kg) iz posude C. Izolovane čvrste materije su osušene na 50 °C, a uzorak je predat na ispitivanje pogodnosti sirovine Dobijen je 7-hloro-6-fluoro-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]pirido[2,3-d]pirimidin-2,4(1H,3H)-dion (M-DION), jedinjenje 5M.

[0637] Gore istaknuti proces prve generacije uspešno je uvećan na 200+ kg polaznog materijala rac-diona (jedinjenje 5). U ovom procesu, inokulacija kristalizacije termodinamički stabilnim kristalnim oblikom rac-diona (koji pokazuje nisku rastvorljivost) izazvala bi neuspeh serije. Na osnovu naših naknadnih studija, otkrili smo da povećanje ekvivalenata DBTA i snižavanje temperature inokulacije podešavanjem rasporeda dodavanja heptana poboljšava robusnost procesa. Poboljšani proces je otporan na prisustvo

[0640] 4

[0641] termodinamički stabilnog kristalnog oblika rac-diona i podstiče uspešno razdvajanje atropizomera. Naredne serije će uključivati poboljšani proces za proizvodnju velikih razmera.

[0642] Korak 6

[0644]

[0647]

[0650] [0159] 7-hloro-6-fluoro-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]pirido[2,3-d]pirimidin-2,4(1H,3H)-dion (M-DION) (3,7 kg; 9,8 mol) je kombinovan u reaktoru (A) sa 10,5 kg toluena i destilovan do ulja radi uklanjanja vode uz održavanje zadate vrednosti od 45 °C. Toluen (21 kg) je dodat u ostatak i smeša je mešana tokom 30 minuta na 40-45 °C. Sadržaj je ohlađen na 22 °C, a zatim je dodat fosfor-oksihlorid (1,8 kg; 11,7 mol). Smeša je ohlađena na 0-5 °C pre dodavanja N,N-diizopropiletilamina (2,5 kg; 19,34 mol) uz održavanje temperature < 5 °C. Rastvor je ostavljen da reaguje tokom 3 sata na 22 °C. U odvojenom reaktoru (B), (s)-1-boc-3-metilpiperazin (2,21 kg; 10,8 mol) i N,N-diizopropiletilamin (1,26 kg; 9,75 mol) su kombinovani u toluenu (6 kg), a zatim su ubačeni u reaktor (A) uz održavanje temperature < 25 °C. Reakciona smeša je ostavljena da reaguje tokom 15 minuta na 22 °C, a zatim je reakcija ugašena natrijum-bikarbonatom (973 g) u vodi (12,9 L) uz održavanje temperature < 25 °C. Smeša je mešana tokom 30 minuta, a zatim je dodat DCM (36,8 kg) uz nastavak mešanja tokom 1 sata. Slojevi su ostavljeni da se razdvoje, a donji organski sloj je istočen u reaktor (C). Vodeni sloj u reaktoru (A) je ponovo ekstrahovan pomoću DCM-a (18,4 kg), a kombinovani organski slojevi su isprani rastvorom soli (6,0 kg NaCl; 16,5 kg DI vode). Organski sloj je destilovan pod atmosferskim pritiskom uz održavanje unutrašnje temperature između 45-55 °C. DCM se zamenjuje tokom destilacije radi azeotropnog isušivanja rastvora. Nakon destilacije, zapremina rastvora je podešena na 19 L pomoću DCM-a. Rastvor je ohlađen na 30 °C i fino profiltriran. Filtrat je kombinovan sa etil-acetatom (8,5 kg), a zatim destilovan pod atmosferskim pritiskom dok u prijemniku nije sakupljeno 11-13 kg. Rastvor je inokulisan sa 30 g autentičnog proizvoda i ostavljen da reaguje tokom 1 sata na 25-30 °C, a zatim dalje destilovan pod atmosferskim pritiskom na unutrašnjoj temperaturi od 45-55 °C dok nije sakupljeno 8,2 kg destilata. Suspenzija je ohlađena na 22 °C i ostavljena da reaguje preko noći, a zatim dodatno ohlađena na 0-5 °C. Proizvod je sakupljen filtracijom i ispran dva puta etil-acetatom (po 4,2 kg). Filter-kolač je osušen azotom i vakuumom kako bi se dobio terc-butil (3S)-4-{7-hloro-6-fluoro-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il}-3-metilpiperazin-1-karboksilat (jedinjenje 6, PIPAZOLIN).

[0651] Korak 7

[0653]

[0654]

[0655] TU reaktor su dodati degasifikovani dioksan (74,2 kg), terc-butil (3S)-4-{7-hloro-6-fluoro-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il}-3-metilpiperazin-1-karboksilat (jedinjenje 6, pipazolin) (24,0 kg, 45,2 mol), kalijumacetat (22,2 kg, 45,2 mol) i (dppf)PdCl<2>(0,74 kg, 1,01 mol). Reaktor je inertizovan gasovitim azotom. Rastvor je prostrujan azotom dok sadržaj kiseonika nije pao na < 500 mg/L.

[0656] Reakciona smeša je zagrejana na 87,5 °C. Rastvor kalijum-trifluoro(2-fluoro-6-hidroksifenil)borata (12,6 kg, 54,3 mol) u degasifikovanom dioksanu (49,4 kg) i degasifikovanoj vodi (14,4 kg) sa sadržajem kiseonika < 500 mg/L prebačen je u reakcionu smešu, uz održavanje unutrašnje temperature od 82,5 °C ± 7,5 °C. Reakcija je podešena na 87,5 °C ± 1,5 °C i mešana tokom 75 minuta ± 15 minuta.1,0 M rastvor EDTA (47,3 kg), a zatim voda (40,1 kg) dodati su u reaktor uz održavanje unutrašnje temperature od 85 °C ± 5 °C. Reakciona smeša je ohlađena na 20 °C ± 3 °C tokom > 2 sata, a zatim mešana > 16 sati. Reakciona smeša je profiltrirana, a sirove čvrste materije su isprane vodom (3 x 120 kg). Čvrste materije su isprane smešom heptana (28,8 kg) i 2-propanola (33,1 kg), a zatim osušene na < 50 °C tokom > 10 sati. U čist reaktor su stavljene sirove čvrste materije i dihlorometan (240 kg). Sadržaj je mešan na 20 °C ± 5 °C tokom > 30 minuta. U reaktor je dodat Si-Tiol (144 kg) i dihlorometan (14,9 kg). Smeša je mešana na 20 °C ± 5 °C tokom 18 sati.

[0657] Reakciona smeša je profiltrirana i isprana dihlorometanom (84 kg). Rastvor je destilovan i rastvarač je zamenjen 2-propanolom. Smeša je zagrejana na 60 °C ± 3 °C i dodat je heptan (108 kg) uz održavanje reakcione temperature od 60 °C ± 3 °C. Reakciona smeša je mešana tokom 45 minuta, a zatim ohlađena i mešana na 20 °C ± 5 °C tokom 2,5 sata. Reakciona smeša je profiltrirana i isprana 50% v/v smešom heptan/2-propanol (61,9 kg). Izolovane čvrste materije su osušene na < 50 °C tokom > 12 sati kako bi se dobio terc-butil (3S)-4-{6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il}-3-metilpiperazin-1-karboksilat (jedinjenje 7, BIARIL).

[0658] Korak 8

[0660]

[0661] Opšta napomena: Svi ekvivalenti i zapremine su navedeni u odnosu na BIARIL 7

[0662]

[0664]

[0667] U reaktor su dodati terc-butil (3S)-4-{6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]-2-okso-1,2-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-4-il}-3-metilpiperazin-1-karboksilat (jedinjenje 7, BIARIL) (2,75 kg, 5,27 mol), DCM (13,7 L) i TFA (5,67 kg, 49,7 mol). Reakciona smeša je mešana 8-16 sati na 20 ± 5 °C. U drugi reaktor su dodati kalijum-karbonat (11,24 kg), voda (54,8 L) i metanol (13,7 L) kako bi se formirao homogeni rastvor. Reakciona smeša je dodata u rastvor kalijum-karbonata tokom 2 sata. Smeša je mešana na 20 ± 5 °C dodatnih 12 sati. Dobijena suspenzija je profiltrirana i isprana vodom (2 x 27,5 L). Vlažni filter-kolač je sušen tokom 24 sata kako bi se dobio 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-4-[(2S)-2-metilpiperazin-1-il]-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on (jedinjenje 8, DESBOC).

[0668] Korak 9

[0669]

[0672] Opšta napomena: Svi ekvivalenti i zapremine su navedeni u odnosu na Des-BOC

[0673]

[0675]

[0677] <1>akriloil-hlorid je dodat tokom 7 minuta na ovoj skali. Izbegavati prekomerno hlađenje reakcije. Niže reakcione temperature dovode do dužeg vremena reakcije, što uzrokuje više nivoe nečistoće m/z 1066, jer polazni materijal reaguje sa proizvodom. Idealan temperaturni opseg je 22-25 °C

[0678] <2>Sadržaj NMP-a u osušenom kolaču je obično 1-2 mas%.

[0679] <3>Dinatrijum-fosfat u tabeli je na bezvodnoj bazi. Može se koristiti hidrat, prilagoditi masu u skladu sa tim kako bi se dobila željena količina u mmol.

[0681] 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-4-[(2S)-2-metilpiperazin-1-il]-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on (jedinjenje 8, DESBOC) (156,25 g) kombinovan je sa N-metilpirolidinonom (625 mL) i mešan na ambijentalnoj temperaturi. U dobijeni rastvor dodat je akriloil-hlorid (36,29 g; 401,0 mmol) uz održavanje unutrašnje temperature < 30 °C. Sadržaj je mešan tokom 2 sata na 25 °C. U odvojenom reaktoru pripremljen je rastvor dinatrijum-fosfata (175,1 g; 1234 mmol) u dejonizovanoj (DI) vodi (3,1 L). Rastvor sirovog proizvoda je zatim prebačen u reaktor koji sadrži rastvor dinatrijumfosfata tokom > 2 sata na 25 °C. Suspenzija je zagrejana na 45 °C na polovini dodavanja, a nakon završenog dodavanja, ostavljena je da reaguje tokom 2 sata na istoj temperaturi. Smeša je ohlađena na 25 °C i ostavljena da reaguje tokom 4 sata pre sakupljanja čvrstih materija vakuum filtracijom. Čvrste materije su isprane dva puta vodom (po 1,5 L), a proizvod je osušen pod azotom i vakuumom kako bi se dobio proizvod 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]-4-[(2S)-2-metil-4-(prop-2-enoil)piperazin-1-il]pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on (sirovo jedinjenje 9).<4>

[0682] <4>Rezultati za ovu glavnu seriju: 154,06 g izolovane mase, 93 mas%, 82,9% korigovan prinos, 18.000 ppm NMP

[0683] Korak 10

[0685]

[0688] Opšta napomena: Svi ekvivalenti i zapremine su navedeni u odnosu na sirovu lekovitu supstancu

[0691] 1

[0692]

[0695] 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-(1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]-4-[(2S)-2-metil-4-(prop-2-enoil)piperazin-1-il]pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on (sirovo jedinjenje 9) (142,33 g; 253,9 mmol) kombinovano je sa etanolom (996 mL) i vodom (270 mL). Dodata je sirćetna kiselina (21,8 ml; 380,8 mmol) i smeša je zagrejana na 75 °C kako bi se formirao rastvor koji je fino profiltriran u čist reaktor. Rastvor je ohlađen na 45 °C, a zatim je dodata voda (1067 mL) uz održavanje unutrašnje temperature > 40 °C. Rastvor je inokulisan autentičnim jedinjenjem 9 i dobijena smeša je ostavljena da reaguje tokom 30 minuta. Voda (1138 mL) je zatim dodata tokom 2 sata. Smeša je ohlađena na 25 °C i ostavljena da reaguje tokom 8 sati, nakon čega je čvrsta materija sakupljena vakuum filtracijom i isprana smešom etanola (355,8 mL) i vode (711,6 mL). Čvrsta materija je osušena pomoću vakuuma i azota kako bi se dobilo 6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-

[0698] 2

[0699] (1M)-1-[4-metil-2-(propan-2-il)piridin-3-il]-4-[(2S)-2-metil-4-(prop-2-enoil)piperazin-1-il]pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-on (jedinjenje 9).

[0700] Korak A1 Reakciona šema i tabela punjenja

[0702]

[0705]

[0708] [0172] U reaktor A su dodati THF (6 zapr.) i diizopropilamin (1,4 ekviv.). Dobijeni rastvor je ohlađen na -70 °C i polako je dodat n-BuLi (2,5 M u heksanu, 1,5 ekviv.). Nakon što je dodavanje završeno, polako je dodat rastvor 3-fluoroanizola (1,0 ekviv.) u THF-u (6 zapr.) i smeša je držana na -70 °C tokom 5 minuta. B(EtO)<3>(2,0 ekviv.) je dodat polako i smeša je držana na -70 °C tokom 10 minuta. Reakciona smeša je ugašena sa 2N HCl. Ugašena reakciona smeša je ekstrahovana sa MTBE-om (3 x 4 zapr.). Kombinovane organske faze su koncentrovane do 1,5~3 ukupne zapremine. Heptan (7-9 zapr.) je dodat kap po kap, a smeša je ohlađena na 0-10 °C i mešana tokom 3 sata. Smeša je profiltrirana i isprana heptanom (1,5 zapr.). Čvrsta materija je osušena pod azotom na < 30 °C kako bi se dobila (2-fluoro-6-metoksifenil)borna kiselina.

[0709] Korak A2 Reakciona šema i tabela punjenja

[0711]

[0714]

[0717] U reaktor A su dodati dihlorometan (4 zapr.) i 2-fluoro-6-metoksi-4-metilfenilborna kiselina (1 ekviv.). Reakciona smeša je ohlađena na -30 °C i 1,5 BBr<3>(1,5 ekviv.) je dodat kap po kap. Kada je dodavanje završeno, smeša je zagrejana na 25 °C i mešana 2 sata.

[0718] Reakciona smeša je ugašena u ledeno hladnoj (0-5 °C) vodi (10 zapr.). Dodat je MTBE (10

[0721] 4

[0722] zapr.) i smeša je zagrejana na 25 °C i mešana 1-2 sata ili dok se sve čvrste materije nisu rastvorile. Vodena faza je razdvojena i ekstrahovana MTBE-om (3 zapr.). Kombinovani organski ekstrakti su isprani vodom (3 zapr.), a zatim koncentrovani do 1 ukupne zapremine. Heptan (10 zapr.) je dodat u smešu i mešan 2 sata. Dobijeni proizvod je izolovan filtracijom i osušen na < 30 °C kako bi se dobila (2-fluoro-6-hidroksifenil)borna kiselina.

[0723] Korak A3 Reakciona šema i tabela punjenja

[0725]

[0728]

[0731] Korak A3

[0732] [0176] Kalijum-fluorid (21,0 kg; 20,87 mol) je kombinovan sa vodom (28 L) u reaktoru (reaktor A) i sadržaj je mešan tokom 30 minuta. U odvojenom reaktoru (reaktor B), dodata je (2-fluoro-6-hidroksifenil)borna kiselina (14,00 kg, 89,79 mol), a zatim acetonitril (206,1 kg) i limunska kiselina (30,94 kg; 147,26 mol) na 25 °C. Sadržaj reaktora A je dodat u reaktor B na 25 °C i mešan na toj temperaturi tokom 10 sati. Reakciona smeša je profiltrirana kroz sloj celita (7,0 kg) i isprana acetonitrilom (42 kg). Filtrat je kombinovan sa izopropanolom (56 kg), a zatim destilovan pod vakuumom na temperaturi < 35 °C, uz zamenu destilovane zapremine u reaktoru izopropanolom, i postupak je ponavljan po potrebi kako bi se završila zamena rastvarača iz acetonitrila u izopropanol. Suspenzija je ohlađena na 15 °C i ostavljena da reaguje tokom 1 sata pre filtriranja i pranja sa 28 kg izopropanola. Filter-kolač je osušen pomoću vakuuma i azota i upakovan kako bi se dobilo jedinjenje A3.

[0733] Rezolucija M-dion jedinjenja 5

[0735] Hromatografska rezolucija M-dion intermedijera

[0736] Brojne hiralne hromatografske tehnike i metode korišćene su za izolovanje M-diona iz jedinjenja 4. Tehnike i stacionarne faze su dobro poznate u struci i navedene su u tabeli 1.

[0738]

[0741] Tabela 1

[0743]

[0744] Tehnike SFC, HPLC i SMB su dobro poznate u struci, a Chiralpak<®>stacionarne faze su komercijalno dostupne iz komercijalnih izvora, kao što su Fisher Scientific i Daicel Corporation.

[0746] Međutim, poželjno je razviti efikasniji proces za izolovanje M-diona (jedinjenje 5). Klasična rezolucija

[0747] Predmetni pronalazak je usmeren na razvoj održivog procesa klasične rezolucije za racemat M/P-diona (jedinjenje 4).

[0749] Izvršeno je ukupno 100 eksperimenata skrininga ko-kristala i identifikovana su tri potencijalna ko-kristala diona. Na osnovu najvećeg odnosa površina M/P-diona u preostalom čvrstom ostatku i najmanjeg odnosa površina u supernatantu, (+)-2,3-dibenzoil-D-vinska kiselina (DBTA) je izabrana kao hiralni reagens za rezoluciju.

[0751] Prema rezultatima 100 eksperimenata skrininga ko-kristala i još 20 skrininga rastvarača, utvrđeno je da 2-MeTHF/n-heptan obezbeđuje bolji rezultat rezolucije od drugih sistema rastvarača. Na osnovu rezultata rastvorljivosti ko-kristala M-diona i ko-kristala P-diona u različitim odnosima 2-MeTHF i n-heptana, 2-MeTHF/n-heptan (1,4:1, v/v) je izabran kao optimalna kompozicija rastvarača za rezoluciju.

[0753] Kako bi se otkrila bilo kakva moguća konverzija oblika u racemat diona ili M/P-dion tokom procesa kristalizacije hiralne rezolucije, određena je rastvorljivost ko-kristala M-diona, ko-kristala P-diona, smeše ko-kristala M+P-diona (1:1, w/w), racemata diona i DBTA na različitim temperaturama u 2-MeTHF/n-heptanu (1,4:1, v/v). Nije uočena promena oblika kokristala M-diona i ko-kristala P-diona na različitim temperaturama tokom 7 dana. Međutim, racemat diona tipa C dobijen je nakon mešanja smeše ko-kristala M+P-diona (1:1, w/w) na različitim temperaturama tokom 7 dana. Racemat diona tipa D (na 20 i 30 °C) ili racemat diona tipa C (na 40, 50, 60 i 65 °C) uočeni su nakon mešanja racemata diona na odgovarajućim temperaturama tokom 7 dana. Rastvorljivost od ~100 mg/mL uočena je na svim temperaturama za DBTA.

[0755] [0184] Radi dalje optimizacije procesa rezolucije, nacrtan je ternarni fazni dijagram kokristala M/P-diona na osnovu rezultata ravnotežne rastvorljivosti i nije dobijena eutektička tačka, verovatno zato što bi racemat tipa C mogao da iskristališe kada su prisutni i ko-kristal M-diona i ko-kristal P-diona. Drugi ternarni fazni dijagram M/P-diona nacrtan je na osnovu rezultata ravnotežne rastvorljivosti i nije dobijena eutektička tačka, verovatno zato što bi racemat diona tipa C ili tipa D mogao da iskristališe kada su prisutni i M-dion i P-dion.

[0757] Ukratko, hiralni reagens (DBTA) i sistem rastvarača (2-MeTHF/n-heptan (1,4:1, v/v)) identifikovani su za rezoluciju racemata diona. Proces kristalizacije u malim razmerama korišćenjem reagensa za rezoluciju i sistema rastvarača mogao bi postići prinos od 39% i ee čistoću od 99% za M-dion. Pored toga, polimorfizam racemata diona je uočen i istražen tokom eksperimenata skrininga.

[0759] Jedinjenje prema predmetnom pronalasku može se takođe koristiti u kombinaciji sa farmaceutski aktivnim agensima koji leče mučninu. Primeri agenasa koji se mogu koristiti za lečenje mučnine uključuju: dronabinol; granisetron; metoklopramid; ondansetron; i prohlorperazin; ili njihovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0761] Jedinjenje prema predmetnom pronalasku može se takođe koristiti u kombinaciji sa radioterapijom, hormonskom terapijom, hirurgijom i imunoterapijom, koje su terapije dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.

[0763] Pošto jedan aspekt predmetnog pronalaska predviđa lečenje bolesti/stanja kombinacijom farmaceutski aktivnih jedinjenja koja se mogu primenjivati odvojeno, pronalazak se dalje odnosi na kombinovanje odvojenih farmaceutskih kompozicija u obliku kompleta. Komplet obuhvata dve odvojene farmaceutske kompozicije: jedinjenje prema predmetnom pronalasku i drugo farmaceutsko jedinjenje. Komplet obuhvata posudu za smeštanje odvojenih kompozicija, kao što je podeljena boca ili podeljeno pakovanje od folije. Dodatni primeri posuda uključuju špriceve, kutije i vreće. Tipično, komplet obuhvata uputstva za upotrebu odvojenih komponenti. Oblik kompleta je posebno prednostan kada je poželjno da se odvojene komponente primenjuju u različitim dozirnim oblicima (npr. oralno i parenteralno), kada se primenjuju u različitim intervalima doziranja ili kada lekar koji propisuje terapiju ili veterinar želi titraciju pojedinačnih komponenti kombinacije.

[0765] [0189] Primer takvog kompleta je takozvano blister pakovanje. Blister pakovanja su dobro poznata u industriji pakovanja i široko se koriste za pakovanje farmaceutskih jedinica dozirnog oblika (tablete, kapsule i slično). Blister pakovanja se generalno sastoje od lista relativno krutog materijala prekrivenog folijom od po mogućstvu providnog plastičnog materijala. Tokom procesa pakovanja formiraju se udubljenja u plastičnoj foliji. Udubljenja su veličine i oblika tableta ili kapsula koje treba upakovati. Zatim se tablete ili kapsule stavljaju u udubljenja, a list relativno krutog materijala se zalepi za plastičnu foliju na strani folije koja je nasuprot smeru u kojem su formirana udubljenja. Kao rezultat toga, tablete ili kapsule su hermetički zatvorene u udubljenjima između plastične folije i lista. Po mogućstvu, čvrstina lista je takva da se tablete ili kapsule mogu izvaditi iz blister pakovanja ručnim pritiskom na udubljenja, čime se formira otvor na listu na mestu udubljenja. Tableta ili kapsula se zatim može izvaditi kroz navedeni otvor.

[0767] Može biti poželjno da se na kompletu obezbedi podsetnik, npr. u obliku brojeva pored tableta ili kapsula, pri čemu brojevi odgovaraju danima režima tokom kojih bi specifikovane tablete ili kapsule trebalo da se progutaju. Drugi primer takvog podsetnika je kalendar odštampan na kartici, npr. na sledeći način: „Prva nedelja, ponedeljak, utorak, ... itd... Druga nedelja, ponedeljak, utorak, ... “ itd. Druge varijacije podsetnika biće lako očigledne.

[0768] „Dnevna doza“ može biti jedna tableta ili kapsula ili nekoliko pilula ili kapsula koje treba uzeti u datom danu. Takođe, dnevna doza jedinjenja prema predmetnom pronalasku može se sastojati od jedne tablete ili kapsule, dok se dnevna doza drugog jedinjenja može sastojati od nekoliko tableta ili kapsula i obrnuto. Podsetnik treba da odražava ovo i da pomaže u pravilnoj primeni aktivnih agenasa.

[0770] U drugom specifičnom otelotvorenju pronalaska, predviđen je dozator dizajniran da ispušta dnevne doze jednu po jednu, prema redosledu njihove predviđene upotrebe. Poželjno je da dozator bude opremljen podsetnikom, kako bi se dodatno olakšalo pridržavanje režima lečenja. Primer takvog podsetnika je mehanički brojač koji pokazuje broj ispuštenih dnevnih doza. Drugi primer takvog podsetnika je mikročip memorija sa baterijskim napajanjem povezana sa ekranom sa tečnim kristalima ili zvučnim signalom za podsetnik koji, na primer, ispisuje datum kada je uzeta poslednja dnevna doza i/ili podseća korisnika kada treba uzeti sledeću dozu.

[0772] [0192] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku i druga farmaceutski aktivna jedinjenja, po želji, mogu se primenjivati pacijentu oralno, rektalno, parenteralno (na primer, intravenski, intramuskularno ili supkutano), intracisternalno, intravaginalno, intraperitonealno, intravezikalno, lokalno (na primer, u vidu praškova, masti ili kapi) ili kao bukalni ili nazalni sprej. Predviđene su sve metode koje stručnjaci u ovoj oblasti koriste za primenu farmaceutski aktivnog agensa.

[0774] Kompozicije pogodne za parenteralnu injekciju mogu obuhvatati fiziološki prihvatljive sterilne vodene ili nevodene rastvore, disperzije, suspenzije ili emulzije, i sterilne praškove za rekonstituciju u sterilne rastvore ili disperzije za injekcije. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača, diluenata, rastvarača ili vehikuluma uključuju vodu, etanol, poliole (propilenglikol, polietilenglikol, glicerol i slično), njihove pogodne smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje) i organske estre za injekcije, kao što je etiloleat. Odgovarajuća tečljivost se može održavati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.

[0776] Ove kompozicije takođe mogu sadržati aditive kao što su agensi za konzervaciju, kvašenje, emulgovanje i dispergovanje. Kontaminacija mikroorganizmima može se sprečiti dodavanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Takođe može biti poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, natrijum-hlorid i slično. Produžena apsorpcija farmaceutskih kompozicija za injekcije može se postići upotrebom agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum-monostearata i želatina.

[0778] Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu uključuju kapsule, tablete, praškove i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivno jedinjenje je pomešano sa najmanje jednim inertnim uobičajenim ekscipijensom (ili nosačem) kao što je natrijum-citrat ili dikalcijumfosfat ili (a) puniocima ili sredstvima za povećanje zapremine, kao što su skrobovi, laktoza, saharoza, manitol i silicijumova kiselina; (b) vezivima, kao što su karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinilpirolidon, saharoza i arapska guma; (c) humektantima, kao što je glicerol; (d) dezintegrantima, kao što su agar-agar, kalcijum-karbonat, skrob od krompira ili tapioke, alginska kiselina, određeni kompleksni silikati i natrijum-karbonat; (e) usporivačima rastvaranja, kao što je parafin; (f) akceleratorima apsorpcije, kao što su kvaternarna amonijumova jedinjenja; (g) agensima za kvašenje, kao što su cetil-alkohol i glicerolmonostearat; (h) adsorbentima, kao što su kaolin i bentonit; i (i) lubrikantima, kao što su talk, kalcijum-stearat, magnezijum-stearat, čvrsti polietilenglikoli, natrijum-laurilsulfat ili njihove smeše. U slučaju kapsula i tableta, dozni oblici mogu takođe obuhvatati puferske agense.

[0779] Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu se takođe koristiti kao punioci u mekim i tvrdim punjenim želatinskim kapsulama, uz upotrebu ekscipijenasa kao što su laktoza ili mlečni šećer, kao i polietilenglikoli visoke molekulske mase i slično.

[0781] Čvrsti dozni oblici, kao što su tablete, dražeje, kapsule, pilule i granule, mogu se pripremiti sa oblogama i omotačima, kao što su enterične obloge i druge dobro poznate u struci. Oni takođe mogu sadržati agense za zamućenje i mogu biti takve kompozicije da oslobađaju aktivno jedinjenje ili jedinjenja u određenom delu crevnog trakta na odložen način. Primeri kompozicija za uklapanje koje se mogu koristiti su polimerne supstance i voskovi. Aktivno jedinjenje takođe može biti u mikrokapsuliranom obliku, ako je to prikladno, sa jednim ili više gore pomenutih ekscipijenasa.

[0783] Tečni dozni oblici za oralnu primenu uključuju farmaceutski prihvatljive emulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Pored aktivnih jedinjenja, tečni dozni oblik može sadržati inertne diluente koji se uobičajeno koriste u struci, kao što su voda ili drugi rastvarači, agensi za solubilizaciju i emulgatori, kao na primer, etil-alkohol, izopropilalkohol, etil-karbonat, etil-acetat, benzil-alkohol, benzil-benzoat, propilenglikol, 1,3-butilenglikol, dimetilformamid, ulja, naročito ulje pamuka, ulje kikirikija, ulje kukuruznih klica, maslinovo ulje, ricinusovo ulje i susamovo ulje, glicerol, tetrahidrofurfuril-alkohol, polietilenglikoli i estri masnih kiselina sorbitana, ili smeše ovih supstanci i slično.

[0785] Pored takvih inertnih diluenata, kompozicija takođe može uključivati aditive, kao što su agensi za kvašenje, agensi za emulgovanje i suspendovanje, agensi za zaslađivanje, sredstva za popravljanje ukusa i mirisa. Suspenzije, pored aktivnog jedinjenja, mogu sadržati agense za suspendovanje, kao na primer, etoksilovane izostearil-alkohole, polioksietilensorbitol i estre sorbitana, mikrokristalnu celulozu, aluminijum-metahidroksid, bentonit, agaragar i tragakant, ili smeše ovih supstanci i slično.

[0787] Kompozicije za rektalnu primenu su prvenstveno supozitorije, koje se mogu pripremiti mešanjem jedinjenja prema predmetnom pronalasku sa pogodnim neiritirajućim ekscipijensima ili nosačima kao što su kakao-puter, polietilenglikol ili vosak za supozitorije, koji su čvrsti na običnoj sobnoj temperaturi, ali tečni na temperaturi tela, te se stoga tope u rektumu ili vaginalnoj šupljini i oslobađaju aktivnu komponentu.

[0790] 1

[0791] Dozni oblici za lokalnu primenu jedinjenja prema predmetnom pronalasku uključuju masti, praškove, sprejeve i inhalante. Aktivno jedinjenje ili jedinjenja se mešaju u sterilnim uslovima sa fiziološki prihvatljivim nosačem i svim konzervansima, puferima ili propelentima koji mogu biti potrebni. Oftalmofarmazeutski oblici, masti za oči, praškovi i rastvori takođe se smatraju obuhvaćenim opsegom ovog pronalaska.

[0793] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu se primenjivati pacijentu u nivoima doziranja u opsegu od oko 0,1 do oko 3.000 mg dnevno. Za normalnu odraslu osobu telesne mase od oko 70 kg, doziranje u opsegu od oko 0,01 do oko 100 mg po kilogramu telesne mase je tipično dovoljno. Specifična doza i opseg doziranja koji se mogu koristiti zavise od brojnih faktora, uključujući potrebe pacijenta, težinu stanja ili bolesti koja se leči i farmakološku aktivnost jedinjenja koje se primenjuje. Određena doza jedinjenja prema predmetnom pronalasku je doza odobrena od strane FDA, ukoliko je jedinjenje odobreno.

[0795] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu se primenjivati kao farmaceutski prihvatljive soli, estri, amidi ili prolekovi. Termin „soli“ odnosi se na neorganske i organske soli jedinjenja prema predmetnom pronalasku. Soli se mogu pripremiti in situ tokom finalne izolacije i prečišćavanja jedinjenja, ili odvojenim reagovanjem prečišćenog jedinjenja u obliku njegove slobodne baze ili kiseline sa pogodnom organskom ili neorganskom bazom ili kiselinom i izolovanjem tako formirane soli. Reprezentativne soli uključuju hidrobromid, hidrohlorid, sulfat, bisulfat, nitrat, acetat, oksalat, palmitat, stearat, laurat, borat, benzoat, laktat, fosfat, tozilat, citrat, maleat, fumarat, sukcinat, tartrat, naftilat, mezilat, glukoheptonat, laktobionat i laurilsulfonatne soli i slično. Soli mogu uključivati katjone na bazi alkalnih i zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum i slično, kao i netoksične amonijumove, kvaternarne amonijumove i aminske katjone uključujući amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, trietilamin, etilamin i slično. Videti, na primer, S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J Pharm Sci, 66: 1-19 (1977).

[0797] Primeri farmaceutski prihvatljivih estara jedinjenja prema predmetnom pronalasku uključuju C<1>-C<8>alkil estre. Prihvatljivi estri takođe uključuju C<5>-C<7>cikloalkil estre, kao i arilalkil estre kao što je benzil. Obično se koriste C<1>-C<4>alkil estri. Estri jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu se pripremiti prema metodama koje su dobro poznate u struci.

[0800] 2

[0801] Primeri farmaceutski prihvatljivih amida jedinjenja prema predmetnom pronalasku uključuju amide izvedene od amonijaka, primarnih C<1>-C<8>alkil amina i sekundarnih C<1>-C<8>dialkil amina. U slučaju sekundarnih amina, amin takođe može biti u obliku 5-člane ili 6-člane heterocikloalkil grupe koja sadrži najmanje jedan atom azota. Obično se koriste amidi izvedeni od amonijaka, C<1>-C<3>primarnih alkil amina i C<1>-C<2>dialkil sekundarnih amina. Amidi jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu se pripremiti prema metodama koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.

[0803] Termin „prolek“ označava jedinjenja koja se in vivo transformišu kako bi se dobilo jedinjenje prema predmetnom pronalasku. Transformacija se može desiti različitim mehanizmima, kao što je hidroliza u krvi. Diskusija o upotrebi prolekova data je u T. Higuchi and W. Stella, "Prodrugs as Novel Delivery Systems," Vol.14 of the A.C.S. Symposium Series, i u Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

[0805] Radi ilustracije, pošto jedinjenje prema pronalasku sadrži funkcionalnu grupu karboksilne kiseline, prolek može obuhvatati estar formiran zamenom atoma vodonika u kiselinskoj grupi grupom kao što je (C<1>-C<8>alkil, (C<2>-C1<2>)alkanoiloksimetil, 1-(alkanoiloksi)etil koji ima od 4 do 9 atoma ugljenika, 1-metil-1-(alkanoiloksi)etil koji ima od 5 do 10 atoma ugljenika, alkoksikarboniloksimetil koji ima od 3 do 6 atoma ugljenika, 1-(alkoksikarboniloksi)etil koji ima od 4 do 7 atoma ugljenika, 1-metil-1-(alkoksikarboniloksi)etil koji ima od 5 do 8 atoma ugljenika, N-(alkoksikarbonil)aminometil koji ima od 3 do 9 atoma ugljenika, 1-(N-(alkoksikarbonil)aminometil koji ima od 4 do 10 atoma ugljenika, 3-ftalidil, 4-krotonolaktonil, gama-butirolakton-4-il, di-N,N-(C<1>-C<2>)alkilamino(C<2>-C<3>)alkil (kao što je β-dimetilaminoetil), karbamoil-(C<1>-C<2>)alkil, N,N-di(C<1>-C<2>)alkilkarbamoil-(C<1>-C<2>)alkil i piperidino-, pirolidino- ili morfolino(C<2>-<3>)alkil.

[0807] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu sadržati asimetrične ili hiralne centre i stoga postojati u različitim stereoizomernim oblicima. Predviđeno je da svi stereoizomerni oblici jedinjenja, kao i njihove smeše, uključujući racemske smeše, čine deo predmetnog pronalaska. Pored toga, predmetni pronalazak predviđa sve geometrijske i pozicione izomere. Na primer, ako jedinjenje sadrži dvostruku vezu, predviđeni su i cis i trans oblici (označeni kao Z, odnosno E), kao i njihove smeše.

[0808] Smeša stereoizomera, kao što su dijastereomerne smeše, može se razdvojiti na svoje pojedinačne stereohemijske komponente na osnovu njihovih fizičko-hemijskih razlika poznatim metodama kao što su hromatografija i/ili frakciona kristalizacija. Enantiomeri se takođe mogu razdvojiti prevođenjem enantiomerne smeše u dijastereomernu smešu reakcijom sa odgovarajućim optički aktivnim jedinjenjem (npr. alkoholom), razdvajanjem dijastereomera i prevođenjem (npr. hidrolizom) pojedinačnih dijastereomera u odgovarajuće čiste enantiomere. Takođe, neka jedinjenja mogu biti atropizomeri (npr. supstituisani biarili).

[0810] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu postojati u nesolvatizovanim, kao i u solvatizovanim oblicima sa farmaceutski prihvatljivim rastvaračima kao što su voda (hidrat), etanol i slično. Predmetni pronalazak predviđa i obuhvata i solvatizovane i nesolvatizovane oblike.

[0812] Takođe je moguće da jedinjenja prema predmetnom pronalasku postoje u različitim tautomernim oblicima. Predviđeni su svi tautomeri jedinjenja prema predmetnom pronalasku. Na primer, svi tautomerni oblici tetrazolnog dela molekula uključeni su u ovaj pronalazak. Takođe, na primer, svi keto-enolni ili imin-enaminski oblici jedinjenja uključeni su u ovaj pronalazak.

[0814] Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati da nazivi i strukture jedinjenja sadržani u ovom dokumentu mogu biti zasnovani na određenom tautomeru jedinjenja. Iako se može koristiti naziv ili struktura samo za određeni tautomer, namera je da svi tautomeri budu obuhvaćeni predmetnim pronalaskom, osim ako nije drugačije navedeno.

[0816] Takođe je namera da predmetni pronalazak obuhvati jedinjenja koja su sintetisana in vitro korišćenjem laboratorijskih tehnika, kao što su one dobro poznate sintetičkim hemičarima; ili sintetisana korišćenjem in vivo tehnika, kao što je putem metabolizma, fermentacije, digestije i slično. Takođe se predviđa da jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti sintetisana korišćenjem kombinacije in vitro i in vivo tehnika.

[0817] Predmetni pronalazak takođe uključuje izotopski obeležena jedinjenja, koja su identična onima navedenim u ovom dokumentu, izuzev činjenice da su jedan ili više atoma zamenjeni atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj drugačiji od atomske mase ili masenog broja koji se obično nalazi u prirodi. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u

[0820] 4

[0821] jedinjenja prema pronalasku uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fosfora, fluora i hlora, kao što su<2>H,<3>H,<13>C,<14>C,<15>N,<16>O,<17>O,<18>O,<31>P,<32>P,<35>S,<18>F i<36>Cl. U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja kod kojih su jedan ili više atoma vodonika zamenjeni atomima deuterijuma (<2>H).

[0823] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku koja sadrže pomenute izotope i/ili druge izotope drugih atoma su u okviru opsega ovog pronalaska. Određena izotopski obeležena jedinjenja prema predmetnom pronalasku, na primer ona u koja su ugrađeni radioaktivni izotopi kao što su<3>H i<14>C, korisna su u ispitivanjima distribucije leka i/ili supstrata u tkivima. Tricijumski, tj.<3>H, i ugljenik-14, tj.<14>C, izotopi su posebno poželjni zbog njihove lakoće pripreme i detekcije. Dalje, supstitucija težim izotopima kao što je deuterijum, tj.<2>H, može pružiti određene terapijske prednosti koje proističu iz veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećano vreme poluraspada in vivo ili smanjene potrebe za doziranjem i, stoga, mogu biti poželjniji u nekim okolnostima. Izotopski obeležena jedinjenja prema ovom pronalasku generalno se mogu pripremiti zamenom neizotopski obeleženog reagensa lako dostupnim izotopski obeleženim reagensom.

[0825] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu postojati u različitim čvrstim stanjima, uključujući kristalna stanja i amorfno stanje. Različita kristalna stanja, takođe nazvana polimorfi, i amorfna stanja predmetnih jedinjenja predviđena su kao deo ovog pronalaska.

[0827] Pri sintetisanju jedinjenja prema predmetnom pronalasku, može biti poželjno koristiti određene odlazeće grupe. Termin „odlazeće grupe“ („LG“) generalno se odnosi na grupe koje se mogu zameniti nukleofilom. Takve odlazeće grupe su poznate u struci. Primeri odlazećih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, halide (npr. I, Br, F, Cl), sulfonate (npr. mezilat, tozilat), sulfide (npr. SCH<3>), N-hidroksisukcinimid, N-hidroksibenzotriazol i slično. Primeri nukleofila uključuju, ali nisu ograničeni na, amine, tiole, alkohole, Grignardove reagense, anjonske vrste (npr. alkokside, amide, karbanjone) i slično.

[0829] Primeri predstavljeni u nastavku ilustruju specifične varijante predmetnog pronalaska.

[0830] PRIMERI

[0832] AAMG 510 je razvijen kao oralno bioraspoloživ, kovalentni inhibitor KRAS<G12C>sa snažnom biohemijskom i ćelijskom aktivnošću i robusnom in vivo efikasnošću. Analiza proteoma cisteina ćelija NCI-H358 tretiranih sa AMG 510 otkrila je da je kovalentno modifikovan samo peptid KRAS-a koji sadrži G12C. AMG 510 je inhibirao nukleotidnu razmenu rekombinantnog mutantnog KRAS<G12C/C118A>katalizovanu SOS-om, ali je imao minimalan efekat na KRAS<C118A>, koji je divlji tip na poziciji 12. U ćelijskim ispitivanjima, AMG 510 je kovalentno modifikovao KRAS<G12C>i inhibirao signalizaciju KRAS<G12C>mereno fosforilacijom ERK1/2 u svim testiranim ćelijskim linijama sa KRAS p.G12C mutacijom, ali nije inhibirao fosforilaciju ERK1/2 u ćelijskim linijama sa različitim drugim KRAS mutacijama. AMG 510 je takođe selektivno narušio održivost ćelijskih linija

[0833] sa KRASp.G12C mutacijom, ali nije uticao na ćelijske linije sa drugim KRAS mutacijama. In vivo farmakodinamička ispitivanja pokazala su dozno-zavisnu i vremenski zavisnu inhibiciju KRAS<G12C>signalizacije, mereno fosforilacijom ERK1/2 (p-ERK) u ksenograftima humanih tumora pankreasa (MIA PaCa-2 T2) i NSCLC (NCI-H358). Kovalentna modifikacija KRAS<G12C>pomoću AMG 510 izmerena je masenom spektrometrijom i korelisana je sa inhibicijom p-ERK u tumorima. Studije vremenskog toka na miševima sa tumorima pokazale su da je izloženost plazme AMG 510 dostigla vrhunac 0,5 sati nakon doze, što je blisko pratila inhibicija p-ERK u tumorima. AMG 510 je značajno inhibirao rast ksenografta MIA PaCa-2 T2 i NCI-H358 i doveo do regresije tumora pri višim dozama. Tretman KRAS p.G12C linija kovalentnim inhibitorima KRAS<G12C>povećao je ekspresiju HLA. Kombinovani tretman AMG 510 sa inhibitorima drugih ćelijskih signalnih puteva pokazao je dokaze sinergističkih efekata na održivost ćelija. Kombinovani tretman AMG 510 sa standardnom terapijom karboplatinom pokazao je pojačanu inhibiciju rasta tumora NCI-H358 u poređenju sa bilo kojim pojedinačnim agensom. Slično tome, AMG 510 u kombinaciji sa MEK inhibitorom rezultirao je pojačanom antitumorskom efikasnošću u poređenju sa bilo kojim pojedinačnim agensom.

[0835] Da bi se testirao uticaj inhibicije KRAS<G12C>na imuni nadzor in vivo, generisana je nova singena ćelijska linija tumora koja je pogodna za testiranje AMG 510 u kombinaciji sa terapijama inhibitorima kontrolnih tačaka i na taj način okarakterisana in vitro. U novorazvijenom modelu karcinoma sa KRAS-G12C mutacijom, tretman sa AMG 510 značajno je inhibirao rast tumora i izazvao regresiju. Izuzetno, kombinacija AMG 510 sa inhibitorom imunih kontrolnih tačaka rezultirala je značajno poboljšanim ukupnim preživljavanjem i dovela do trajnih izlečenja. Imunofenotipizacija mišjih KRAS

[0836] p.G12C tumora otkrila je značajno povećanje infiltracije T-ćelija nakon tretmana, što sugeriše da AMG 510 može indukovati tumorsko mikrookruženje koje je osetljivije na inhibiciju imunih kontrolnih tačaka.

[0838] Novi singeni CT-26 KRAS p.G12C tumorski model

[0839] Mišje CT26 (tumor debelog creva br.26) ćelije razvijene su 1975. godine izlaganjem BALB/c miševa N-nitrozo-N-metiluretan (NMU), što je rezultiralo brzorastućim karcinomom IV stepena koji se lako implantira i brzo metastazira. Korišćena u preko 500 objavljenih studija, CT26 linija karcinoma debelog creva jedna je od najčešće korišćenih ćelijskih linija u razvoju lekova. Na ovim ćelijama proučavani su brojni citotoksični agensi, kao i terapeutici koji ciljaju specifične signalne puteve. Štaviše, pošto CT26 model kod BALB/c miševa obezbeđuje singeni in vivo sistem za ispitivanje, često se koristi za razvoj i ispitivanje imunoterapijskih koncepata. BMC

[0840] Genomics. 2014 Mar 13;15:190. doi: 10.1186/1471-2164-15-190. Imunomska, genomska i transkriptomska karakterizacija CT26 kolorektalnog karcinoma.

[0842] Singeni CT-26 KRAS p.G12C tumorski model razvijen je kako bi se omogućile studije kombinacije sa ćelijskim linijama i imunoterapijom, kao što je navedeno u tabeli A i slikama 3, 4, 5, 6, 18, 24, 31, 34, 38 i 39. CT-26 singena tumorska ćelijska linija izabrana je na osnovu toga što je u roditeljskoj liniji bila prisutna KRAS-G12D mutacija. Prisustvo KRAS-G12D mutacije sugerisalo je da rast i preživljavanje ćelijske linije mogu biti vođeni konstitutivnom KRAS signalizacijom (G12D), i da bi potencijalno mogla biti osetljiva na inhibiciju KRAS-a. CT-26 KRAS p.G12C ćelije generisane su iz CT-26 mišje kolorektalne tumorske ćelijske linije. Tehnologija CRISPR, kako su je opisali Liang et al. u prethodnom stanju tehnike (Journal of Biotechnology 241 (2017) 136-146), korišćena je za zamenu oba alela KRAS p.G12D sa KRAS p.G12C, korišćenjem sekvence CTTGTGATGGTTGGAGCTGA (SEQ ID NO: 21). Za klon 10 je sekvenciranjem sledeće generacije (NGS) utvrđeno da je homozigotan za alel KRAS p.G12C i on je identifikovan kao CT-26 KRAS G12C-H10. Ova nova izolovana singena tumorska ćelijska linija, CT-26 KRAS p.G12C, koja omogućava inhibiciju KRAS signalizacije pomoću AMG 510, korišćena je za sva in vivo ispitivanja CT-26 G12C (videti slike 3, 4, 5 i 6) i in vitro ispitivanja (videti slike 18, 24, 31, 34, 38 i 39).

[0843] Predmetni pronalazak obuhvata novu izolovanu ćelijsku liniju koja sadrži dva KRAS<G12C>alela i metodu generisanja ćelijske linije koja sadrži dva KRAS<G12C>alela, pri čemu metoda obuhvata:

[0844] 1. a) inkubiranje ćelijske linije koja obuhvata dva KRAS<G12D>alela sa CRISPR konstruktom koji indukuje zamenu nukleotida na oba KRAS alela tako da se formiraju dva KRAS<G12C>alela; i

[0845] 2. b) izolovanje ćelijske linije koja obuhvata ta dva KRAS<G12C>alela.

[0847] Sekvenciranje sledeće generacije (NGS), takođe poznato kao sekvenciranje visoke propusne moći, je opšti termin koji se koristi za opisivanje brojnih različitih savremenih tehnologija sekvenciranja uključujući:

[0848] • Illumina (Solexa) sekvenciranje

[0849] • Roche 454 sekvenciranje

[0850] • Ion torrent: Proton / PGM sekvenciranje

[0851] • SOLiD<™>sekvenciranje

[0853] U predmetnom pronalasku korišćena je platforma Ion Torrent<™>Personal Genome Machine<™>, komercijalno dostupna od Thermo-Fisher Scientific. Ove novije tehnologije omogućavaju naučnicima da sekvenciraju DNK i RNK mnogo brže i jeftinije od prethodno korišćenog Sangerovog sekvenciranja.

[0855] In Vitro ispitivanja kombinacija na ćelijama

[0856] Ćelijske linije su kupljene od American Type Culture Collection (ATCC), German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) i Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB). Svaka linija je kultivisana u svom preporučenom medijumu za rast.

[0858] Za dvosmerne kombinacije jedinjenja, ćelije su zasejane ili u ploče za kulturu ćelija sa 96 bunarčića ili 384 bunarčića pri početnim gustinama u rasponu od 500 do 2500 ćelija po bunarčiću.

[0860] Šesnaest do 24 sata kasnije, jedinjenja su dodata u ploče za kulturu u matričnom formatu, sa jednim agensom titriranim duž x-ose i drugim agensom duž y-ose.

[0861] Za sve kombinacije testirane u bilo kojoj datoj ćelijskoj liniji, početna visoka koncentracija i faktor razblaženja svakog jedinjenja su izabrani tako da dobro definišu maksimum krive, minimum krive i nagib u opsegu doza odabranih za format skrininga kombinacija. CellTiter-Glo<®>Luminescent Cell Viability (Promega) kompleti za ispitivanje korišćeni su za određivanje broja vijabilnih ćelija.

[0863] Luminiscencija je merena pomoću instrumenta EnVision<®>Multilabel Reader (Perkin Elmer) za svaku ćelijsku liniju u nultom vremenu (V0) pre dodavanja jedinjenja, kao i nakon 72 sata tretmana jedinjenjem. Inhibicija rasta (GI) je izračunata na skali od 200 tačaka prema sledećim jednačinama, gde je V72 bila luminiscencija DMSO kontrole nakon 72 sata, a T72 luminiscencija uzorka tretiranog jedinjenjem: ako je T72 > V0, onda GI = 100 x (1 - ((T72-V0) / (V72 - V0))); ako je T72 < V0, onda GI = 100 x (1 - ((T72-V0) / V0)). Vrednosti GI od 0, 100 i 200 predstavljale su neinhibirani rast ćelija (tj. DMSO kontrolu), zastoj ćelija, odnosno potpuno ubijanje ćelija. Sigmoidalne krive dozno-zavisnog odgovora su iscrtane korišćenjem 4-parametarskog logističkog modela. Podaci su analizirani na sinergističke interakcije pomoću softvera Chalice<™>Analyzer (Zalicus) oji je generisao ocene sinergije na osnovu Luveovog modela aditivnosti.

[0865] Inhibicija rasta za svaki bunarčić matrice izračunata je kao što je prethodno opisano, a podaci su analizirani na sinergističke interakcije korišćenjem softvera Chalice<™>Analyzer (Zalicus; Cambridge, MA) koji je generisao ocene sinergije na osnovu Luveovog modela aditivnosti (Lehàr, J., et al. (2009). "Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity." Nat Biotech 27(7): 659-666) i Rickles, et al (2012) "Adenosine A2A and Beta-2 Adrenergic Receptor Agonists: Novel Selective and Synergistic Multiple Myeloma Targets Discovered through Systematic Combination Screening" Mol Cancer Therapeutics 11 (7): 1432.

[0867] [0232] Luveov model aditivnosti (ADD model) (kao što je prikazano na slikama 7-37) kvantifikuje efekte kombinacije. Kombinacije su inicijalno rangirane prema višku zapremine aditivnosti, koji je definisan kao ADD zapremina = ∑ C<X>,C<Y>(I<data>- I<Loewe>), gde je I<Loewe>(C<X>,C<Y>) inhibicija koja zadovoljava (C<X>/EC<X>) (C<Y>/EC<Y>) = 1, a EC<X,Y>su efektivne koncentracije pri I<Loewe>za krive pojedinačnih agenasa. Takođe je korišćena „Ocena sinergije”, gde je ocena sinergije S = log f<X>log f<Y>∑ I<data>(I<data>-I<Loewe>), sumirano preko svih parova koncentracija koji nisu pojedinačni agensi, i gde je log f<X,Y>prirodni logaritam faktora razblaženja korišćenih za svaki pojedinačni agens. Ovo efektivno izračunava zapreminu između izmerene i Luveove aditivne površine odgovora, ponderisanu ka visokoj inhibiciji i korigovanu za varirajuće faktore razblaženja. Nesigurnost σ<S>je izračunata za svaku ocenu sinergije, na osnovu izmerenih grešaka za I<data>vrednosti i standardne propagacije greške.

[0869] U prikazanim primerima, matrice inhibicije rasta (%) sadrže konsenzusne vrednosti inhibicije rasta izračunate iz podataka o luminiscenciji korišćenjem gore opisanih formula; matrice inhibicije rasta po Luveovom modelu (%) sadrže predviđene vrednosti inhibicije rasta na osnovu Luveovog modela aditivnosti, koji je izveden iz modelovanih kriva inhibicije rasta pojedinačnih agenasa; a matrice viška inhibicije rasta u odnosu na aditivnost (%) sadrže vrednosti inhibicije rasta koje su veće od modela aditivnosti. Model aditivnosti služi kao „nulta hipoteza” i pretpostavlja da nema sinergističke interakcije između dva agensa. Svaka aktivnost uočena nakon oduzimanja Luveovog modela od matrice dozno-zavisnog odgovora inhibicije rasta (= ADD višak inhibicije rasta) ukazuje na sinergiju.

[0871] Tabela A u nastavku ilustruje specifične in vitro kombinacije KRAS<G12C>inhibitora sa jednim ili više dodatnih farmaceutski aktivnih agenasa za određene tipove karcinoma. Podaci dobijeni i sumirani na slikama 7-39 ukazuju na to da kombinacije navedene u tabeli A pokazuju pojačanu antitumorsku aktivnost u odnosu na ono što se očekuje kada se pojedinačni članovi kombinovane terapije koriste sami. Napominje se da veličina terapijske sinergije koja se uočava može varirati u zavisnosti od tipa karcinoma koji se leči i korišćenog agensa.

[0872] TABELA A

[0874]

[0878] 1

[0879]

[0882] In Vivo ispitivanja na tumorskim ksenograftima

[0883] In vivo ispitivanja na tumorskim ksenograftima sprovedena su prema sledećim opštim postupcima:

[0884] Tumorske ćelije su kultivisane, sakupljene i implantirane potkožno u desni bok ženki atimičnih bezdlakih miševa. Kada su tumori dostigli oko 200mm<3>, miševi su randomizovani u grupe za tretman (n=10/grupa) i tretman je započet (na dane naznačene na grafikonima). Veličine tumora i telesne težine merene su 2 do 3 puta nedeljno. Zapremina tumora merena je digitalnim kaliperom, izračunata kao L x W x H i izražena u mm<3>. Statistička značajnost uočenih razlika između kriva rasta procenjena je analizom kovarijanse ponovljenih merenja (RMANOVA) logaritamski transformisanih podataka o zapremini tumora sa Danetovim

[0887] 1 1

[0888] prilagođenim višestrukim poređenjima kontrolne grupe sa grupama za tretman. Za studije kombinacija, RMANOVA je rađena poređenjem grupe sa kombinacijom „jedan na jedan” sa svakom grupom tretiranom pojedinačnim agensom.

[0890] BD Matrigel<™>Bmatrica bazalne membrane je rastvoreni preparat bazalne membrane ekstrahovan iz Engelbret-Holm-Svarm (EHS) mišjeg sarkoma (BD Biosciences, San Jose, CA).

[0892] Sva ispitivanja su sprovedena po principu slepe probe.

[0894] Na slikama 3, 4, 5 i 6, anti-mišje PD-1 antitelo (klon 29F.1A12) komercijalno je dostupno kod Bio X Cell, West Lebanon, New Hampshire.

[0896] Slike 1, 2, 3, 4, 5 i 6 ilustruju specifične in vivo kombinacije KRAS<G12C>inhibitora sa jednim ili više dodatnih farmaceutski aktivnih agenasa za određene tipove karcinoma. I podaci dobijeni i sumirani na slikama ukazuju na to da kombinacije navedene na slikama pokazuju pojačanu antitumorsku aktivnost u odnosu na ono što se očekuje kada se pojedinačni članovi kombinovane terapije koriste sami. Napominje se da veličina terapijske sinergije koja se uočava može varirati u zavisnosti od tipa karcinoma koji se leči i korišćenog agensa.

[0898] Na slici 4, kombinovani tretman AMG 510 i anti-PD1 antitela (klon 29F.1A12) u singenom CT26-KRASG12C tumorskom modelu rezultirao je značajno poboljšanim preživljavanjem i doveo do trajnih izlečenja u poređenju sa tretmanom bilo kojim pojedinačnim agensom. AMG 510 monoterapija, ili anti-PD1 monoterapija, rezultirala je odloženim rastom tumora u poređenju sa kontrolnom grupom. Svaki tretman monoterapijom rezultirao je sa 1/10 potpunim odgovorom. Kombinovani tretman AMG 510 anti-PD1 rezultirao je sa 9/10 potpunih odgovora. Oni su smatrani trajnim izlečenjima i tih 9 miševa je ostalo bez tumora nakon prekida tretmana (43. dan), sve do 57. dana kada je ispitivanje završeno.

[0899] Poboljšano vezivanje i potentnost AMG 510

[0900] Iako je ARS-1620 potvrdio pristup direktne inhibicije KRAS<G12C>, identifikacija poboljšanih inhibitora pogodnih za kliničko testiranje pokazala se teškom. Verujemo da značajan izazov predstavlja suboptimalna potentnost zbog male zapremine alosternog džepa

[0903] 1 2

[0904] koji zauzima ARS-1620, što nudi ograničene puteve za dodatne interakcije protein-ligand. Ovo je ilustrovano rendgenskom kristalnom strukturom kovalentnog kompleksa KRAS<G12C>/ARS-1620 (slika 40a), u kojoj je vodonična veza između ARS-1620 i histidina 95 (H95) bila istaknuta (isprekidana linija). Naš preokret bio je otkriće da površinski žleb, stvoren alternativnom orijentacijom H95, mogu zauzeti supstituisani aromatični prstenovi, što je pojačalo interakcije sa KRAS<G12C>. AMG 510 se pojavio kao najbolji kandidat iz kampanje optimizacije molekula koji se vezuju za H95 žleb, jer je predstavljao konvergenciju poboljšane potentnosti i povoljnih razvojnih svojstava. Rendgenska ko-kristalna struktura kovalentnog kompleksa AMG 510-KRAS<G12C>(slika 40b) naglašava vezivanje AMG 510 u P2 džepu KRAS-a. Izopropil-metilpiridinski supstituent zauzima žleb između Y96, H95 i Q99 i učestvuje u kontinuiranoj mreži od 25 van der Valsovih kontakata liganda i proteina koji se protežu od osnovnog lanca heliksa 2 (H95, Y96) do osnovnog lanca fleksibilne petlje Switch II (E62, E63).

[0906] Da bismo procenili uticaj koji su pojačane interakcije imale na potentnost AMG 510, koristili smo dva ispitivanja koja su primenjivala rekombinantni GDP-vezani KRAS<C118A>ili KRAS<G12C/C118A>sa dodatnom supstitucijom cisteina u alanin na ostatku 118 kako bi se izbegla reaktivnost sa cisteinima koji nisu C12. Enzimsko ispitivanje nukleotidne razmene koristilo je SOS1-katalizovanu GDP/GTP razmenu za podsticanje vezivanja domena koji vezuje RAS (RBD) c-RAF-a za obe verzije KRAS-a. U reakciji od 40 minuta, AMG 510 je pokazao ~10 puta veću potentnost (srednja vrednost IC<50>= 0,09 µM) od ARS-1620 (slika 40c). AMG 510 nije značajno inhibirao KRAS<C118A>(slika 40c), a nereaktivni analog AMG 510 imao je minimalnu aktivnost u ovim ispitivanjima (slika 46a). Kinetika reakcije između AMG 510 i GDP-KRAS<G12C/C118A>pod uslovima pseudo-prvog reda merena je masenom spektrometrijom (MS). Nelinearno uklapanje podataka o zavisnosti brzine od koncentracije (slika 40d) utvrdilo je maksimalnu brzinu reakcije k<inact>= 0,85 ± 0,08 s<-1>i koncentraciju AMG 510 pri polumaksimalnoj brzini K<I>= 8,6E-05 ± 1,4E-05 M, što rezultira odnosom k<inact>/K<I>od 9,8E+03 ± 1,8E+03 M<-1>s<-1>. Kinetika reakcije između AMG 510 i KRAS<G12C/C118A>bila je značajno poboljšana u odnosu na ARS-1620. U poređenju sa inhibitorima kinaze koji ciljaju cistein u klinici, AMG 510 je okarakterisan značajno većim k<inact>, što je u skladu sa mehanizmom katalize indukovane KRAS-om koji je prethodno opisan za ARS-1620.

[0907] Nespecifična reaktivnost AMG 510 sa 5 mM glutationa bila je relativno spora (AMG 510 t<1/2>= 196 min) i u opsegu kliničkih kovalentnih akrilamida.

[0908] Inhibicija signalizacije i rasta tumorskih ćelija

[0911] 1

[0912] Ćelijska aktivnost AMG 510 procenjena je merenjem bazalne fosforilacije ERK1/2 (p-ERK) i pomoću MS-a radi detekcije kovalentne konjugacije (tj. zauzetosti)

[0913] KRAS<G12C>pomoću AMG 510. U dve KRAS p.G12C ćelijske linije, AMG 510 je snažno inhibirao p-ERK (IC<50>~0,02, odnosno 0,03 µM) do nivoa koji se skoro ne mogu detektovati nakon tretmana od 2 sata i bio je 20 puta potentniji od ARS-1620 (slika 40e). Ova inhibicija je blisko pratila zauzetost KRAS<G12C>od strane AMG 510, pri čemu su skoro maksimalni nivoi postignuti u oba ispitivanja pri ~0,2 µM (slika 40f). AMG 510 je takođe snažno narušio ćelijsku održivost u obe linije (IC<50>~0,006 µM i 0,009 µM, ~40 puta potentniji od ARS-1620) (slika 40g).

[0915] Ćelijska kinetika AMG 510 u dve KRAS p. G12C ćelijske linije određena je korišćenjem vremenske i koncentracione zavisnosti inhibicije p-ERK, što odražava zauzetost KRAS<G12C>od strane AMG 510. Brzina inhibicije p-ERK rasla je sa koncentracijom AMG 510, uz zasićenje koje se javlja pri koncentracijama iznad 3 µM. Uklapanje kriva brzine u zavisnosti od koncentracije za AMG 510 i ARS-1620 (slika 40h i slika 46b) ukazalo je na to da je ćelijska kinetička efikasnost za inhibiciju KRAS<G12C>pomoću AMG 510 bila približno 23 puta veća od ARS-1620. Maksimalna brzina inhibicije fosforilacije ERK pomoću AMG 510 (8,9E-04 s<-1>) je približno 2 puta veća od brzine hidrolize GTP-KRAS<G12C>koja ograničava brzinu, predložene u nedavnom kinetičkom modelu (procenjena brzina iz EGFR-inhibicije = 4,2E-04 s<-1>; t<1/2>= 27,4 min). Da bi se obezbedila alternativna procena brzine hidrolize GTP-a od strane KRAS<G12C>, korišćen je SHP2 inhibitor da bi se eliminisala sva uzvodna signalizacija ka KRAS-u. Ovaj eksperiment je dao ćelijsku brzinu hidrolize GTP-a od 9,4E-04 s<-1>, (t<1/2>= 12,2 min; slika 46c), što je podudarno sa brzinom uočenom za AMG 510.

[0917] Za širu procenu uticaja na signalizaciju usled inhibicije KRAS<G12C>, dve ćelijske linije su tretirane višestrukim dozama AMG 510 tokom 4 i 24 sata, i izvedeni su western blot testovi radi procene višestrukih čvorova signalizacije (slika 41a). Formiranje kovalentnog adukta AMG 510 sa KRAS<G12C>detektovano je pomeranjem u mobilnosti sporije migrirajuće trake KRAS-a (gornja strelica). Ova pomerena vrsta se akumulirala sa povećanjem vremena i doze i bila je u skladu sa nizvodnom inhibicijom MAPK puta (tj. p-MEK1/2 i p-ERK1/2) u obe ćelijske linije (slika 41a, 41b). Inhibicija KRAS-a pomoću AMG 510 takođe je dovela do akumulacije aktivnog EGFR (p-EGFR Y1068). Inhibicija fosforilacije AKT (p-AKT) bila je vidljiva u jednoj liniji, ali je smanjenje fosforilacije ribozomalnog proteina S6 (p-S6) uočeno nakon 24 sata u obe linije. Cepanje kaspaze-3 takođe je uočeno nakon 24 sata, što ukazuje na

[0920] 1 4

[0921] indukciju apoptoze. U opsežnijem vremenskom toku, tretman AMG 510 pri 0,1 µM (slika 41b) izazvao je brze (<2 h) i održive (>24 h) efekte na MAPK i EGFR, dok su p-S6 i cepanje kaspaze nastupili 8-16 sati nakon tretmana u obe linije.

[0923] Da bi se procenila aktivnost i selektivnost, AMG 510 je profilisan u 22 ćelijske linije koje nose bilo heterozigotne ili homozigotne KRAS p.G12C mutacije ili KRAS mutacije koje nisu p.G12C, kao i u linijama sa divljim tipom (WT) KRAS-a. Tretman od dva sata sa AMG 510 inhibirao je bazalni p-ERK u svim KRAS p.G12C ćelijskim linijama, sa vrednostima IC<50>u rasponu od 0,010 µM do 0,123 µM (slika 41c i dopunska tabela 1). AMG 510 nije inhibirao p-ERK ni u jednoj liniji koja nije KRAS p.G12C (IC<50>> 10 µM; slika 41c i dopunska tabela 1).

[0925] U ispitivanjima ćelijske održivosti, AMG 510 je narušio rast svih homozigotnih i heterozigotnih KRAS p.G12C ćelijskih linija, osim SW1573, sa vrednostima IC<50>u rasponu od 0,004 µM do 0,032 µM (slika 41d i dopunska tabela 1). Iako su sve KRAS p.G12C linije pokazale sličnu maksimalnu inhibiciju p-ERK, maksimalni efekat na održivost ćelija je varirao. Ćelijske linije sa KRAS mutacijama koje nisu p.G12C ili sa mutacijama u genima koji nisu KRAS bile su neosetljive na AMG 510 (IC<50>>7,5 µM; slika 41d i dopunska tabela 1). Podskup KRAS p.G12C ćelijskih linija odabran je za procenu održivosti u uslovima niske adherencije kako bi se indukovalo formiranje sferoida. Kao što je prijavljeno za druge KRAS<G12C>inhibitore, ovi uslovi su pojačali osetljivost svih testiranih linija na AMG 510 i dali do 20 puta veći porast potentnosti i 2,5 puta veći porast maksimalne inhibicije (slika 41e, slika 46d i dopunska tabela 1). SW1573 je ostao minimalno osetljiv, verovatno zbog udružene drajver mutacije, PIK3CA p.K111E.

[0927] Da bi se dalje utvrdila selektivnost kovalentne interakcije AMG 510 sa KRAS<G12C>identifikovali drugi potencijalni cistein-sadržavajući proteini „van cilja” u ćelijama, izvršeno je profilisanje proteoma cisteina pomoću MS-a kao što je opisano. Nakon tretiranja ćelija sa DMSO ili 1 µM AMG 510 (>30 puta p-ERK IC<50>) tokom 4 sata, proteom cisteina je obogaćen i peptidi su identifikovani. Među 6451 jedinstvenim peptidom koji sadrži cistein, Cys12 peptid iz KRAS<G12C>bio je jedini identifikovani peptid koji je ispunio kriterijume za kovalentno angažovanje cilja (slika 41f).

[0928] AMG 510 inhibira KRAS signalizaciju in vivo

[0931] 1

[0932] Efekat oralnog tretmana jedinjenjem AMG 510 na KRAS<G12C>signalizaciju procenjen je u farmakodinamičkim (PD) ispitivanjima merenjem p-ERK. U humanim tumorima koji nose KRASp.G12C, AMG 510 je inhibirao p-ERK na dozno-zavisni način 2 sata nakon tretmana (slike 42a, b). Inhibicija p-ERK nakon tretmana jedinjenjem AMG 510 (100 mg/kg) kretala se u rasponu od 69% (MIA PaCa-2 T2) do 83% (NCI-H358) smanjenja u poređenju sa kontrolom. Slični efekti AMG 510 na nivoe p-ERK uočeni su u mišjem tumorskom modelu (slika 47a) korišćenjem singene CT-26 KRAS p.G12C linije koja je generisana CRISPR tehnologijom. PD ispitivanja u vremenskom toku pokazala su pik izloženosti AMG 510 u plazmi i tumoru nakon 0,5 sati nakon pojedinačne doze (10 mg/kg), što je dovelo do maksimalne inhibicije p-ERK 2-4 sata nakon tretmana i održive, značajne inhibicije tokom 48 sati (slike 42c, 42d). Ovo je u skladu sa relativno dugim vremenom poluraspada KRAS<G12C>proteina od 20 do 24 sata (slika 46e).

[0934] Dodatno, u paralelnim eksperimentima, zauzetost KRAS<G12C>od strane AMG 510 merena je pomoću MS-a i približila se vrednosti od 100% pri najvišoj dozi (100 mg/kg), što je u korelaciji sa maksimalnom supresijom p-ERK (slike 42e i 42f). Studije vremenskog toka pokazale su da se delimična zauzetost od strane AMG 510 može detektovati nakon 0,5 sati, a zauzetost od ~100% uočena je nakon 2 sata (slika 42g).

[0936] Inhibicija tumora in vivo selektivna na mutante

[0937] AMG 510 je procenjen u pogledu sposobnosti da inhibira rast humanih KRAS p.G12C i KRAS p.G12V (SW480-1AC) tumorskih ksenografta kod miševa. AMG 510 je značajno inhibirao rast MIA PaCa-2 T2 i NCI-H358 tumora pri svim nivoima doza, uz uočenu regresiju tumora pri višim dozama (slike 43a, 43b). Nasuprot tome, tretman jedinjenjem AMG 510 nije imao efekta na rast KRAS p.G12V tumora (slika 47b). Nivoi AMG 510 u plazmi bili su dosledni u svim modelima (podaci nisu prikazani). U mišjem CT-26 KRAS p.G12C tumorskom modelu gajenom kod imunokompetentnih miševa, AMG 510 je doveo do inhibicije rasta tumora i regresije pri najvišoj dozi (slika 43c). Dva od 10 miševa (grupa od 100 mg/kg) nisu imala tumore koji se mogu detektovati kada je ispitivanje završeno 29. dana. AMG 510 je takođe značajno inhibirao rast humanih ksenografta poreklom od pacijenata (PDX) sa KRAS p.G12C mutacijom kod miševa (slika 43d i slika 47c).

[0940] 1

[0941] Dokaz kliničke aktivnosti

[0942] Poboljšana potentnost, robusna efikasnost i povoljan farmaceutski profil jedinjenja AMG 510 podstakli su njegov izbor kao prvog KRAS<G12C>inhibitora koji je ušao u klinička ispitivanja (Clinical trials.gov NCT03600883). Primetno, u prve dve kohorte pacijenata, tretman jedinjenjem AMG 510 rezultirao je objektivnim delimičnim odgovorima (prema RECIST 1.1) kod dva pacijenta sa KRAS p.G12C NSCLC (slika 43e i slika 47d). Kod oba pacijenta je bolest napredovala uprkos višestrukim prethodnim sistemskim tretmanima, uključujući karboplatin, pemetreksed i nivolumab sa dokumentovanom progresijom bolesti. Prva jedinka je pokazala smanjenje tumora od 34% nakon 6 nedelja tretmana jedinjenjem AMG 510. Druga jedinka sa pozitivnim odgovorom pokazala je smanjenje tumora od 67% nakon samo 2 nedelje tretmana jedinjenjem AMG 510. Ovi pacijenti ostaju na tretmanu jedinjenjem AMG 510 nakon 6 meseci, odnosno 2 meseca (u vreme trenutnog datuma podnošenja privremene prijave patenta u SAD). Nisu prijavljeni neželjeni događaji. Ovi pacijenti su postali prvi ikada koji su odgovorili na KRAS inhibitor specifičan za mutante, što predstavlja prekretnicu za pacijente sa karcinomom koji imaju KRAS p. G12C mutantne tumore.

[0944] Pojačana efikasnost u kombinaciji

[0945] S obzirom na visoku prevalenciju KRAS p. G12C kod adenokarcinoma pluća, kombinovani tretman AMG 510 sa karboplatinom, standardnim hemioterapeutikom za karcinom pluća, istražen je u modelu NCI-H358. Tretman bilo kojim pojedinačnim agensom (AMG 510 ili karboplatin) rezultirao je značajnom inhibicijom rasta tumora (slika 44a). Međutim, kombinovani tretman pri različitim dozama rezultirao je značajno poboljšanom antitumorskom efikasnošću (slika 44a i slika 47e). Prema našim saznanjima, ovo je prva demonstracija pojačane efikasnosti kombinovanjem KRAS inhibitora selektivnog za mutante sa hemioterapeutikom i pruža osnovu za ovaj pristup u klinici.

[0947] Klinički potvrđena strategija kombinovanja BRAF i MEK inhibitora sugeriše da bi kombinacije sa AMG 510 i drugim inhibitorima u MAPK (i AKT) signalnim putevima mogle pojačati ubijanje tumorskih ćelija i prevazići rezistenciju<26>. Stoga su sprovedena in vitro ispitivanja kombinacija u nekoliko KRAS p.G12C ćelijskih linija sa matricama AMG 510 i inhibitora HER kinaza, EGFR, SHP2, PI3K, AKT i MEK (slika 48). Kao što je sugerisano indukcijom p-EGFR pomoću AMG 510 (slika 41a), kombinacija AMG 510 sa višestrukim agensima rezultirala je sinergističkim ubijanjem tumorskih ćelija u NCI-H358 (slika 44b i slika 48). Sinergija je bila ograničenija u drugim linijama, ali je kombinacija sa MEKi bila

[0950] 1

[0951] sinergistička u višestrukim postavkama i bila je pojačana u uslovima rasta sferoida (slika 44b). Značajno pojačana antitumorska aktivnost je takođe uočena in vivo sa minimalno efikasnom dozom AMG 510 u kombinaciji sa MEKi, u poređenju sa bilo kojim pojedinačnim agensom (slika 44c). Zajedno, ovi podaci sugerišu intrigantan klinički pristup kombinovanju AMG 510 sa agensima koji ciljaju druge čvorove u MAPK putu kako bi se ugasila preostala signalizacija ili signalizacija bajpasa koja bi mogla ograničiti efikasnost ili indukovati rezistenciju.

[0953] Proinflamatorno tumorsko mikrookruženje

[0954] Blokada ose imunološke kontrolne tačke receptor programirane ćelijske smrti 1 / ligand programirane smrti 1 (PD-1/PD-L1) je klinički potvrđena i odobrena za određene pacijente sa karcinomom. Aktivnost AMG 510 u kombinaciji sa anti-PD-1 terapijom procenjena je u imunokompetentnom okruženju u CT-26 KRAS p.G12C modelu. Ova linija zavisi od KRAS p.G12C alela (slika 49a, b) i bila je osetljiva na AMG 510 (slika 43c i slika 47a). Kao što je ranije pokazano (slika 43c), AMG 510 je doveo do regresije tumora kao pojedinačni agens (slika 45a). Međutim, tokom vremena, samo 1 od 10 tumora je ostao potpuno regresiran (slika 45a). Anti-PD-1 monoterapija je dovela do odloženog rasta tumora sa samo 1 od 10 tumora koji je pokazao potpunu regresiju. Zapanjujuće, kombinovani tretman doveo je do 9 od 10 potpunih odgovora (slika 45a). Tretman je prekinut nakon 43. dana, a miševi su nastavili da se prate dodatnih 112 dana. Sve jedinke sa potpunim odgovorom iz kombinovanog tretmana nastavili su da budu bez tumora koji se mogu detektovati, što ukazuje na to da je kombinacija AMG 510 sa anti-PD-1 antitelom dovela do trajnih izlečenja. Koristeći surogat krajnju tačku preživljavanja (zapremina tumora > >800 mm<3>), kombinovani tretman doveo je do izraženog povećanja preživljavanja u poređenju sa monoterapijama (slika 45b).

[0956] Da bi se razumeli efekti tretmana na sastav imunoloških ćelija u tumorima, CT-26 KRAS p.G12C tumori su imunofenotipizirani nakon tretmana. Nakon 4 dana tretmana, AMG 510 je rezultirao značajno povećanom infiltracijom T ćelija, prvenstveno CD8+ T ćelija (slika 45c i slika 50a). Povećana infiltracija CD8+ T ćelija takođe je uočena u kombinovanoj grupi, prvenstveno vođena jedinjenjem AMG 510, jer se to nije dogodilo nakon anti-PD-1 monoterapije. Kao dodatni komparator, inhibitor MEK-a (MEKi) koji je blokirao MAPK signalizaciju nizvodno od RAS-a (slika 50b) i rezultirao sličnom inhibicijom rasta CT-26 KRAS p.G12C tumora kao AMG 510 (slike 50c, 50d), nije uticao na broj

[0959] 1

[0960] infiltrirajućih CD8+ T ćelija (slika 45c). Tretman jedinjenjem AMG 510 takođe je doveo do povećane infiltracije makrofaga i dendritskih ćelija, što nije uočeno sa MEKi (slika 45c). Ekspresija PD-1 na CD8+ T ćelijama bila je umereno povećana i pomoću AMG 510 i pomoću MEKi (slika 44a). RNK celog tumora je prečišćena nakon tretmana i procenjeni su transkripcioni profili panela imunoloških gena. Nakon samo 2 dana tretmana, inhibicija KRAS<G12C>pomoću AMG 510 indukovala je proinflamatorno mikrookruženje okarakterisano povećanom signalizacijom interferona, obradom antigena, aktivnošću citotoksičnih i NK ćelija, kao i markerima stimulacije urođenog imuniteta koji su bili značajno viši u poređenju sa efektima indukovanim inhibicijom MEK-a (slika 45d i slika 44e). AMG 510 je takođe indukovao ekspresiju MHC-I proteina na tumorskim ćelijama CT-26 KRAS p.G12C (slika 45e i slika 50f). Ovi podaci sugerišu da efekti tretmana jedinjenjem AMG 510 na tumorske ćelije mogu dovesti do povećanog prajminga T ćelija i prepoznavanja antigena. Da bi se ovo testiralo, izlečene jedinke iz kombinovanog tretmana (slika 45a) ponovo su podvrgnute izazovu sa bilateralnim tumorima CT-26 KRAS p.G12C i roditeljskog CT-26 (KRAS p.

[0961] G12D), ili CT-26 KRAS p.G12C i nepovezanog mišjeg modela tumora dojke, 4T1. Svi 4T1 tumori (4/4) su porasli, ali nijedan (0/8) od CT-26 KRAS p.G12C tumora se nije primio (slika 45f). Primetno, sve jedinke koje su primile roditeljske CT-26 tumore bile su bez tumora nakon 40 dana (slika 45f). U posebnoj kontrolnoj grupi prethodno netretiranih miševa, 15 od 15 (stopa primanja od 100%) roditeljskih CT-26 i CT-26 KRAS p.G12C tumora je poraslo (slika 50g). Splenociti sakupljeni od izlečenih jedinki stimulisani su ili sa CT-26, CT-26 KRAS p.G12C ili 4T1 tumorskim ćelijama, i nivoi sekretovanog IFN-γ mereni su kao marker prajminga i aktivnosti tumorski-specifičnih T ćelija. CT-26 KRAS p.G12C ćelije i roditeljske CT-26 ćelije izazvale su ~3 puta veći porast IFN-γ koji nije bio indukovan 4T1 ćelijama (slika 45g).

[0963] DISKUSIJA

[0964] Otkriće nove interakcije sa H95 žlebom proteina KRAS<G12C>omogućilo je značajno povećanje potentnosti i identifikaciju jedinjenja AMG 510, prvog u klasi oralnog KRAS<G12C>inhibitora sa dokazanom kliničkom aktivnošću kod pacijenata. AMG 510 selektivno cilja KRAS p.G12C tumore i kombinuje se sa citotoksičnim i ciljanim agensima kako bi sinergistički ubijao tumorske ćelije. Smrt tumorskih ćelija indukovana jedinjenjem AMG 510 dovela je do inflamiranog tumorskog mikrookruženja koje je izuzetno reagovalo na inhibiciju imunoloških kontrolnih tačaka. Kombinovani tretman anti-PD-1 i MEKi pokazao je ubedljivu pretkliničku efikasnost u nekoliko izveštaja, što je bilo povezano sa

[0967] 1

[0968] povećanom infiltracijom T ćelija. U ovom ispitivanju, infiltracija imunoloških ćelija nakon selektivne inhibicije KRAS<G12C>bila je značajno robusnija od one indukovane pomoću MEKi. Za razliku od prijavljenih efekata neselektivnih MEKi koji blokiraju ekspanziju i prajming T ćelija, selektivna inhibicija KRAS<G12C>pomoću AMG 510 rezultirala je povećanim prajmingom T ćelija. Ovi podaci podržavaju model pojačanog prepoznavanja antigena i memorije T ćelija, pri čemu smrt tumorskih ćelija indukovana jedinjenjem AMG 510, u kombinaciji sa anti-PD-1 tretmanom, rezultira adaptivnim imunološkim odgovorom tako da se prepoznaju i iskorenjuju čak i tumori koji nisu p.G12C. Postoji mnoštvo dokaza da status KRAS mutacije unutar tumora može biti heterogen, kako unutar samog tumora, tako i između primarnih i metastatskih mesta. Posmatrano u celini, naši podaci sugerišu da bi AMG 510 mogao biti efikasan antitumorski agens čak i u uslovima gde je ekspresija

[0969] KRAS<G12C>heterogena.

[0970] METODE

[0972] Rekombinantni proteini

[0973] Rekombinantni humani KRAS<G12C/C118A>(1-169) sa His-tagom, GST-humani c-RAF (1-149) i rekombinantni humani KRAS<C118A>(1-169) sa His-tagom eksprimovani su

[0974] u Escherichia coli i prečišćeni korišćenjem afinitetne hromatografije i ekskluzione hromatografije po veličini. Rekombinantni humani SOS1 (564-1049, optimizovan za kodone insekata) sa His-tagom eksprimovan je u Trichoplusia ni i prečišćen afinitetnom hromatografijom; nakon uklanjanja His-taga, dodatno je prečišćen ekskluzionom hromatografijom po veličini. Za studije ko-kristalizacije korišćen je mutantni konstrukt sa smanjenim brojem cisteina, zasnovan na radu Ostrem et al<15>. Rekombinantni humani KRAS<G12C/C51S/C80L/C118S>(1-169) sa His-tagom eksprimovan je u E. coli i prečišćen afinitetnom hromatografijom, jonoizmenjivačkom hromatografijom i ekskluzionom hromatografijom po veličini, uz uklanjanje His-taga radi kristalizacije.

[0975] Jedinjenja i antitela

[0976] ARS-1620, PD-0325901, trametinib, afatinib, erlotinib, RMC-4550 i AZD5363 nabavljeni su iz komercijalnih izvora. AMG 511 je sintetisan interno. Sinteza jedinjenja AMG 510 i njegovog nereaktivnog propionamida opisana je u ovom dokumentu. Osnovni rastvori AMG 510 i svih ostalih inhibitora korišćenih za in vitro ispitivanja pripremljeni su kao rastvori od 10 mM u 100% dimetilsulfoksidu (DMSO). Za in vivo studije, AMG 510 i MEKi (PD-0325901) formulisani su u 2% HPMC, 1% Tween 80 i primenjivani oralnom sondom svakodnevno u dozi od 10 mL/kg. Osnovni rastvor karboplatina od 10 mg/mL dalje je

[0979] 11

[0980] razblažen na 5 mg/mL ili 3 mg/mL u 1% PBS-u i primenjivan intraperitonealnom injekcijom (IP) jednom nedeljno. Pacovsko anti-mišje PD1 antitelo klon 29F.1A12 himerizovano je tako da sadrži mišju IgG1 osnovu. Pored toga, mutacija N297G za utišavanje Fc receptora uvedena je u region teškog lanca IgG-a kako bi se smanjila efektorska funkcija. Anti-PD-1 antitelo, 29F.1A12, razblaženo je u 1X PBS-u do koncentracije od 500 µg/mL i primenjivano jednom svaka 3 dana u ukupno 3 injekcije putem I.P. Sva antitela korišćena u western blot testu kupljena su od Cell Signaling, osim anti-RAS (Abcam), anti-fosfo-ERK1/2 (ThermoFisher Scientific) i anti-beta-aktin-HRP (Sigma).

[0982] Ćelijske linije

[0983] Sve ćelijske linije kupljene su od American Type Culture Collection (ATCC), osim KM12 i NCI-H3122, koje su dobijene od Nacionalnog instituta za rak. Ćelijske linije su autentifikovane profilisanjem kratkih uzastopnih ponavljanja (STR). Da bi se poboljšala kinetika rasta in vivo, ćelijske linije MIA PaCa-2 T2 i SW480-1AC generisane su pasažom MIA PaCa-2, odnosno SW480 ćelija kroz miševe. CT-26 KRAS p.G12C ćelije su generisane iz mišje CT-26 kolorektalne linije korišćenjem CRISPR tehnologije kako bi se oba KRAS p.G12D alela zamenila sa p.G12C (ThermoFisher Scientific). Utvrđeno je da je klon H10 homozigotan za alel KRAS p.G12C, identifikovan je kao CT-26 KRAS p.G12C-H10 i u tekstu se navodi kao CT-26 KRAS p.G12C. Sve ćelijske linije su kultivisane u RPMI 1640 medijumu dopunjenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma i 1x penicilinom/streptomicinom/L-glutaminom na 37°C, 5% CO<2>u vlažnom inkubatoru.

[0985] Rendgenska kristalografija

[0986] Prečišćeni KRAS<G12C/CS1S/C80L/C118S>(„KRAS”) u 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl koncentrisan je na 40 mg/mL i dodat dvostrukom molarnom višku čvrstog jedinjenja AMG 510 rastvorenog u DMSO. Uzorak protein-kompleksa postavljen je na orbitalnu mućkalicu na sobnoj temperaturi tokom 16 sati, a zatim je filtriran centrifugiranjem. Kokristalizacija je izvršena metodom difuzije pare u sedećoj kapi. Pomešani su uzorak proteinkompleksa „KRAS”-AMG 510 i pufer za kristalizaciju (1 mM MgCl<2>, 0,1 M MES pH 6,5, 30% w/v polietilenglikola 4000). Spljošteni kristali u obliku štapića pojavili su se za jedan dan na 20°C.

[0987] [0262] Kristal je uravnotežen u puferu za kristalizaciju kao krioprotektantu pre zamrzavanja u tečnom azotu. Skup podataka je prikupljen na Pilatus 6M detektoru silicijumskih piksela na Advanced Light Source Beamline 5.0.1 pri talasnoj dužini od 0,97741 Å i temperaturi od 100K. Podaci su integrisani i skalirani pomoću HKL2000. Kristal pripada ortorombičnoj prostornoj grupi P2<1>2<1>2<1>sa dimenzijama jedinične ćelije a = 40,9 Å, b = 58,4 Å, c = 65,9 Å, α = 90°, β = 90°, γ = 90° (videti dopunsku tabelu 2). Struktura je rešena molekularnom zamenom pomoću MolRep-a, sa apo KRAS strukturom kao modelom za pretragu. U asimetričnoj jedinici postoji jedan molekul proteina. Struktura je utačnjena pomoću Refmac5, a izgradnja modela je izvršena pomoću grafičkog programa Coot. Ligand je generisan pomoću PRODRG-a. Struktura KRAS<G12C/C51S/C80L/C118S>vezanog za GDP i AMG 510 utačnjena je na 1,65 Å sa R-faktorom od 18,1% i R<free>od 21,5%. Ramačandranova statistika pokazala je 98,2% favorizovanih i 1,8% dozvoljenih regiona, bez ekstremnih vrednosti Aminokiselinski ostaci 105-107 nisu bili razlučeni u kristalnoj strukturi. Atomske koordinate i strukturni faktori biće deponovani u Protein Data Bank (PDB ID kod: još nije dodeljen).

[0989] Ispitivanja spregnute nukleotidne razmene

[0990] Inhibicija aktivnosti SOS1-katalizovane nukleotidne razmene proteina KRAS<G12C/C118A>ili KRAS<C118A>merena je korišćenjem Alpha tehnologije (homonogeno ispitivanje na bazi pojačane luminescentne blizine).20 nM humanog KRAS<G12C/C118A>ili KRAS<C118A>proteina vezanog za GDP inkubirano je sa dvostruko serijski razblaženim jedinjenjem AMG 510 ili DMSO-om tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi (RT) u reakcionom puferu (25 mM HEPES, pH 7,4; 10 mM MgCl<2>; 0,01% Triton X-100). Za sve naredne korake, DTT je dodat u reakcioni pufer do finalne koncentracije od 1 mM. Zatim su GTP i SOS-1 dodati u DTT-reakcioni pufer do finalnih koncentracija od 1,25 mM, odnosno 500 nM, i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Na kraju su dodati c-RAF RBD (finalno 50 nM), Alpha donor kuglice sa glutationom (PerkinElmer; finalno 20 µg/mL) i AlphaLISA<®>akceptor kuglice sa nikl-helatom (PerkinElmer; finalno 20 µg/mL), sve razblaženo u DTT-reakcionom puferu. Reakciona smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta, a zatim su ploče očitane na instrumentu EnVision<®>Multilabel Reader korišćenjem AlphaScreen protokola. Luminescentni signal je meren na 570 nm nakon ekscitacije od 180 ms na 680 nm. Intenzitet signala je odgovarao asocijaciji c-RAF RBD sa KRAS<G12C/C118A>ili KRAS<C118A>vezanim za GTP i normalizovan je u odnosu na kontrolu sa DMSO-om.

[0991] Ispitivanja fosforilacije ERK1/2

[0992] [0264] Za ćelijska ispitivanja, 2,5E+04 ćelija je zasejano po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića i inkubirano na 37°C, 5% CO<2>, preko noći. Sledećeg dana, ćelijama je dodato trostruko serijski razblaženo jedinjenje ili DMSO, a ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO<2>tokom 2 sata. Nakon tretmana, ćelije su isprane ledeno hladnim PBS-om i lizirane u RIPA puferu za lizu (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1% Igepal; 0,5% natrijum-deoksiholat; 150 mM NaCl; 0,1% natrijum-dodecil-sulfat) koji je sadržao inhibitore proteaza i fosfataza. Bazalni nivoi fosforilacije ERK1/2 mereni su u lizatima tretiranih ćelija korišćenjem kompleta za lizat celih ćelija za fosfo-ERK1/2 (Meso Scale Discovery) prema protokolu proizvođača. Intenzitet signala je odgovarao nivoima fosfo-ERK1/2 i normalizovan je u odnosu na kontrolu sa DMSO-om.

[0994] Za lizate tumorskih ćelija iz in vivo farmakodinamičkih ispitivanja, analizirano je 50 µg ukupnih proteina po uzorku korišćenjem kompleta za lizat celih ćelija za fosfo-ERK1/2 i ukupni ERK1/2 (Meso Scale Discovery) prema protokolu proizvođača. Signal za fosfo-ERK1/2 normalizovan je na signal za ukupni ERK1/2 za dati uzorak, a procenat inhibicije fosforilacije ERK izračunat je u odnosu na grupu koja je primala vehikulum.

[0996] Ispitivanja ćelijske održivosti

[0997] Za ispitivanja održivosti adherentnih ćelija, 0,5-1,0E+03 ćelija je zasejano po bunarčiću u pločama sa 384 bunarčića (ili 2,5-4,0E+04 ćelija po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića) i inkubirano na 37°C, 5% CO<2>, preko noći. Sledećeg dana, ćelijama je dodato serijski razblaženo jedinjenje ili DMSO, a ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO<2>tokom 72 sata. Održivost ćelija merena je korišćenjem kompleta CellTiter-Glo<®>za luminescentno ispitivanje ćelijske održivosti (Promega) prema protokolu proizvođača. Luminescentni signal tretiranih uzoraka normalizovan je u odnosu na kontrolu sa DMSO-om.

[0999] Za ispitivanja održivosti sferoida, 2,5-4,0E+04 ćelija je zasejano po bunarčiću u mikropločama za sferoide sa 96 bunarčića (Corning) i inkubirano na 37°C, 5% CO<2>tokom 24 sata. Primenjen je isti postupak kao što je gore opisano, osim što je održivost merena korišćenjem kompleta CellTiter-Glo<®>za 3D ispitivanje ćelijske održivosti (Promega) prema protokolu proizvođača.

[1000] Ispitivanja sinergističkih kombinacija

[1001] Eksperimenti kombinovanja radi procene sinergističkih interakcija AMG 510 sa drugim inhibitorima in vitro sprovedeni su kao što je prethodno opisano (Saiki, A. Y. et al. MDM2 antagonists synergize broadly and robustly with compounds targeting fundamental oncogenic signaling pathways. Oncotarget 5, 2030-2043, doi:10.18632/oncotarget.1918 (2014)).

[1004] 11

[1005] Kinetičke analize

[1006] Formiranje kovalentnih adukata inhibitor-KRAS<G12C>mereno je pomoću MS-a kao što je prethodno opisano<44>. Relativne vrednosti procenta vezivanja za različite koncentracije inhibitora pri različitim vremenima inkubacije uklopljene su u eksponencijalnu jednačinu radi generisanja k<obs>vrednosti za svaku testiranu koncentraciju pomoću softvera Prism (GraphPad Software). Dobijene k<obs>vrednosti su zatim ponovo ucrtane u zavisnosti od koncentracije inhibitora radi generisanja k<inact>i Ki vrednosti.

[1008] Da bi se odredile kinetičke vrednosti formiranja kovalentnih adukata inhibitor-KRAS<G12C>u ćelijama, bazalni nivoi fosforilacije ERK1/2 mereni su nakon tretmana različitim koncentracijama inhibitora pri različitim vremenima inkubacije tačno onako kako je gore opisano, a vrednosti procenta aktivnosti korišćene su za kinetičke proračune.

[1009] Analiza proteoma cisteina

[1010] Ćelije humanog karcinoma pluća nemalih ćelija NCI-H358 zasejane su u gustini od 2,0E+06 ćelija po ploči od 10 cm i inkubirane na 37°C, 5% CO<2>, preko noći. Sledećeg dana, ćelije su tretirane sa 1 µM AMG 510 ili DMSO-om (n=5) i inkubirane na 37°C, 5%

[1011] CO<2>tokom 4 sata. Nakon tretmana, ćelije su isprane ledeno hladnim PBS-om koji je sadržao inhibitore proteaza, a zatim uklonjene sa ploča. Brzo zamrznuti ćelijski peleti obrađeni su u kompaniji IQ Proteomics, LLC pomoću masene spektrometrije (MS) prema njihovom protokolu koji su opisali Patricelli et al. Ukratko, ćelijski peleti su lizirani i tretirani sa 100 µM destiobiotin jodoacetamida kako bi se obeležili preostali nereagovali cisteini izloženi rastvaraču. Nakon digestije tripsinom, smeša peptida generisana iz svakog uzorka obeležena je izobaričnim reagensima za obeležavanje TMT-10 pleks (tandemna masena oznaka) (ThermoFisher Scientific). Nakon obeležavanja, uzorci su pomešani pre obogaćivanja destiobiotinilovanih peptida korišćenjem streptavidin agaroze visokog kapaciteta. Obogaćeni peptidi su analizirani nano-LC-MS metodom korišćenjem tročasovnog gradijenta i MS3 metode zasnovane na sinhronoj selekciji prekurzora (SPS) na Orbitrap Lumos masenom spektrometru (ThermoFisher Scientific). Identifikacija destiobiotinilovanih peptida dobijena je pretragom baze podataka putem prilagođenog informatičkog protoka razvijenog u laboratoriji Gygi na Medicinskom fakultetu u Harvardu koji koristi SEQUEST. Svi spektri su pretraženi u odnosu na bazu sekvenci humanih proteina Uniprot (2018) kojoj je dodata sekvenca mutantnog KRAS<G12C>proteina i uobičajeni kontaminanti. Peptidi i proteini su filtrirani na stopu lažnog otkrića (FDR) od 1%, a za kvantitativnu analizu korišćeni su samo oni peptidi koji su ispunili kriterijum minimalnog odnosa signal-šum od 200 i čistoće izolacije veće od 50%. Sva obrada podataka za statističku analizu izvršena je u programu Microsoft Excel korišćenjem normalizovanih obilnosti pikova peptida koji sadrže cistein. Izračunate su log<2>promene između DMSO kontrole i grupa uzoraka tretiranih jedinjenjem AMG 510. Dvostrani t-test za svaki peptid je izvršen radi procene statističke značajnosti razlike između tretiranih i DMSO kontrolnih grupa uzoraka uz pretpostavku jednake varijanse. Grafik vulkana koji prikazuje negativne log<10>p-vrednosti iscrtan je u odnosu na log<2>promene za svaki destiobiotinilovani peptid koji sadrži cistein. Peptidi koji su pokazali log<2>smanjenje obilnosti veće od 2 i p-vrednost manju od 0,0001 označeni su kao kovalentni ciljevi AMG 510 (n = 5 bioloških replikata).

[1013] Studije na životinjama

[1014] Svi eksperimentalni postupci na životinjama sprovedeni su u skladu sa smernicama Komiteta za negu i upotrebu životinja kompanije Amgen i standardima Udruženja za procenu i akreditaciju nege laboratorijskih životinja. U svim studijama korišćene su ženke atimičnih bezdlakih miševa ili ženke Balb/c miševa starosti od 4 do 7 nedelja (Charles River Laboratories). Atimični miševi su bili smešteni po pet u kavezima sa filter-poklopcem u sterilnim uslovima, dok su Balb/c miševi bili smešteni po pet u kavezima sa filter-poklopcem u nesterilnim uslovima, u prostoriji sa kontrolisanim okruženjem (temperatura 23 ± 2°C, relativna vlažnost 50 ± 20%) sa ciklusom svetlosti i tame od 12 sati. Jedinke su hranjene komercijalnom hranom za glodare.

[1016] Analiza ekspresije gena

[1017] Ukupna RNK je prečišćena pomoću kompleta RNeasy Mini (QIAGEN) iz CT-26 KRAS p.G12C tumora koji su tokom dva dana tretirani oralno vehikulumom, oralno jedinjenjem AMG 510 (100 mg/kg QD) ili oralno pomoću MEKi (PD-0325901, 10 mg/kg QD) (n=5/grupa). RNK je kvantifikovana pomoću instrumenta DropSense 96 (PerkinElmer Inc). RNK u količini od 300 ng analizirana je na sistemu nCounter<™>(NanoString Technologies) korišćenjem panela za imunološko profilisanje pan-karcinoma kod miševa koji sadrži 750 ciljanih gena, 20 kućepaziteljnih gena, 8 internih negativnih kontrola i 6 internih pozitivnih kontrola. Kontrola kvaliteta sirovih podataka, normalizacija i analiza izvršeni su pomoću softvera nSolver (NanoString Technologies). Sirovi podaci su log<2>transformisani i izvršene su statističke analize. Rezultati signalnih puteva (rezultat za interferon, rezultat za obradu antigena, MHC rezultat, TLR rezultat i rezultat za funkciju T-ćelija) i rezultati

[1020] 11

[1021] profilisanja ćelija (rezultat za NK ćelije, rezultat za citotoksične ćelije i CD45 rezultat) generisani su pomoću nSolver Advanced Analysis (NanoString Technologies).

[1023] Videti Dopunske tabele 3A, 3B, 3C, 3D i 3E za detaljnu listu gena uključenih u svaki rezultat, kao i p-vrednosti korišćene za izračunavanje rezultata signalnih puteva i profilisanja ćelija.

[1025] Farmakodinamičko ispitivanje tumora

[1026] Efekat AMG 510 na fosforilaciju ERK1/2 procenjen je kod miševa koji nose MIA PaCa-2 T2, NCI-H358 i CT-26 KRAS p.G12C tumore. Tumorske ćelije MIA PaCa-2 T2 ili NCI-H358 (5,0E+06 ćelija) ubrizgane su supkutano u bok ženki atimičnih miševa u odnosu ćelija i Matrigel-a (BD Bioscience, San Jose, CA) od 2:1. Jedinke su primile pojedinačnu oralnu dozu vehikuluma ili AMG 510 (0,3, 1, 3, 10, 30 i 100 mg/kg) kada je prosečna veličina tumora dostigla ~300-600 mm<3>(n=3/grupa), a uzorci su prikupljeni 2 sata kasnije. Pojedinačna oralna doza AMG 510 (10 mg/kg) korišćena je za studije vremenskog toka. Ženkama Balb/c miševa supkutano su ubrizgane tumorske ćelije CT-26 KRAS

[1027] p.G12C (3,0E+05 ćelija). Jedinke su randomizovane u grupe (n=3/grupa) kada je zapremina tumora u proseku iznosila 486 mm<3>i primile su pojedinačnu oralnu dozu vehikuluma ili AMG 510 (3, 10, 30 ili 100 mg/kg) ili MEKi (PD-0325901, 10 mg/kg), a uzorci su prikupljeni 2 sata kasnije. Za sve studije, plazma i tumor su analizirani radi određivanja koncentracija testirane supstance. Uzorci tumora su takođe prikupljeni u navedenim vremenima, brzo zamrznuti u tečnom azotu i obrađeni za bioanalizu ili usitnjeni pomoću uređaja cryoPREP<®>Dry Impactor (Covaris). Usitnjeni uzorci su resuspendovani u RIPA puferu za lizu koji je sadržao inhibitore proteaza i fosfataza i homogenizovani. Bistri lizati su zatim analizirani na nivoe fosforilacije ERK1/2 kao što je gore opisano i na kovalentnu modifikaciju KRAS<G12C>pomoću MS-a.

[1029] Ksenografne i singene studije

[1030] MIA PaCa-2 T2, NCI-H358 ili SW480-1AC ćelije (5,0E+06 ćelija sa Matrigel-om u odnosu 2:1) ubrizgane su supkutano u bok ženki atimičnih miševa (n=10/grupa). Tretman je počeo kada su tumori uspostavljeni i iznosili približno 170 mm<3>za MIA PaCa-2 T2 i NCI-H358 studije, ili približno 200 mm<3>za SW480-1AC model. U studijama odgovora na dozu, jedinke su primale ili vehikulum oralno (QD) ili AMG 510 oralno (3, 10, 30 i 100 mg/kg QD). U studiji kombinacije NCI-H358 sa AMG 510 i karboplatinom, jedinke su

[1033] 11

[1034] randomizovane u 8 grupa (n=10/grupa) i primale su ili vehikulum oralno (QD) PBS intraperitonealno (1x nedeljno); AMG 510 oralno (10 ili 30 mg/kg QD) PBS intraperitonealno (1x nedeljno); vehikulum oralno (QD) karboplatin (50 ili 100 mg/kg) intraperitonealno (1x nedeljno); AMG 510 oralno (10 ili 30 mg/kg QD) karboplatin (50 ili 100 mg/kg) intraperitonealno (1x nedeljno). Za studiju kombinacije sa AMG 510 i MEKi, jedinke su randomizovane u 4 grupe n=10/grupa i primale su ili vehikulum oralno (QD); AMG 510 oralno (10 mg/kg QD); MEKi oralno (1 mg/kg QD); AMG 510 oralno (10 mg/kg QD) MEKi oralno (1 mg/kg QD). Za singene studije, CT-26 KRAS p.G12C ćelije (3,0E+05 ćelija) ubrizgane su supkutano u bok ženki Balb/c miševa. Tretman je počeo kada su tumori uspostavljeni i iznosili približno 170 mm<3>za studije odgovora na dozu i približno 130mm<3>za studiju kombinacije, n=10/grupa; izuzev studije odgovora na dozu MEKi gde je n=8/grupa. U studijama odgovora na dozu, jedinke su primale ili vehikulum oralno (QD), AMG 510 oralno (3, 10, 30 i 100 mg/kg QD) ili MEKi (PD-0325901) oralno (1, 3 ili 10 mg/kg QD). U studiji kombinacije, jedinke su randomizovane u 4 grupe od po n=10/grupa i primale su ili vehikulum oralno (QD) PBS intraperitonealno (Q3Dx3); AMG 510 oralno (100 mg/kg QD) PBS intraperitonealno (Q3Dx3); vehikulum oralno (QD) anti-PD-1 antitelo (29F.1A12; 100 µg po dozi, Q3Dx3) intraperitonealno; AMG 510 oralno (100 mg/kg QD) anti-PD-1 antitelo (29F.1A12; 100 µg po dozi, Q3Dx3) intraperitonealno od 15. dana do 43. dana.

[1035] Studije kombinovanog tretmana sprovedene su po principu slepe probe. Dimenzije tumora su procenjivane dva puta nedeljno pomoću Pro-Max elektronskog digitalnog merila (Japan Micrometer Mfg. Co. LTD), a zapremina tumora je izračunata korišćenjem formule: dužina x širina x visina i izražena u mm<3>. U PDX modelima pluća sa KRAS p.G12C mutacijom, miševima su supkutano implantirani delovi tumora veličine ~70 mg. Jedinke su randomizovane kada je zapremina tumora iznosila približno 160-200 mm<3>i primale su ili vehikulum oralno (QD) ili AMG 510 oralno (100 mg/kg QD) dan nakon randomizacije. Dimenzije tumora su prikupljane dva puta nedeljno korišćenjem formule: širina<2>x dužina x 0,52 i izražene u mm<3>. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM.

[1037] Detekcija konjugata AMG 510-KRAS<G12C>

[1038] Anti-humano RAS (anti-RAS) antitelo je kupljeno od kompanije Abcam i biotinilovano pomoću EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (ThermoFisher Scientific) korišćenjem protokola koji je opisao prodavac. Preostali biotin je uklonjen, a dobijeno biotin-anti-RAS antitelo je naneto na Dynabeads<®>MyOne<™>Streptavidin C1 beads Streptavidin C1 kuglice (ThermoFisher Scientific) u odnosu 1:1 tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz

[1041] 11

[1042] mućkanje. Lizati iz in vitro tretiranih ćelija ili in vivo tretiranih tumorskih ćelija, prethodno opisanih, inkubirani su sa biotinilovanim anti-RAS kuglicama tokom 3 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Pomoću magneta, kuglice su isprane sa PBST (3x), zatim sa PBS (1x) i na kraju vodom (1x). Uzorci su eluirani sa kuglica korišćenjem 2% vodenog rastvora mravlje kiseline/10% vodenog rastvora acetonitrila, nakon čega je usledila inkubacija na sobnoj temperaturi uz mućkanje tokom 10 minuta. Supernatant je prebačen u ploču sa 96 bunarčića i osušen. Uzorci su resuspendovani u puferu za denaturaciju (10 mM TCEP, 8 M urea) i inkubirani na 65°C uz mućkanje tokom 15 minuta. Dodat je jodoacetamid (40 mM) i inkubiran na 37°C tokom 30 minuta, zaštićen od svetlosti. Dodati su 50 mM NH<4>HCO<3>i tripsin (0,01 µg/µL), a uzorci su digestirani preko noći na 37°C tokom ~16-20 sati, i na kraju je reakcija ugašena mravljom kiselinom do finalne koncentracije od 1% (v:v). Uzorci su zatim analizirani tečnom hromatografijom-tandemnom masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) metodom praćenja više reakcija (MRM) u modu pozitivne jonske elektrosprej jonizacije korišćenjem instrumenta 6500 QTRAP (AB SCIEX) spregnutog sa Acquity UPLC (Waters). Uzorci su injektovani na Acquity UPLC BEH C8 kolonu 1,7 µm, 2,1 x 100 mm (Waters). Mobilne faze su se sastojale od mobilne faze A (voda 0,1% mravlja kiselina) i mobilne faze B (acetonitril 0,1% mravlja kiselina). LC gradijent je bio 5-50% B tokom 5 minuta, 50-95% B tokom 0,5 minuta i 95% B tokom 1 minuta. Peptidi

[1043] KRAS<G12C>LVVVGAC(CAM)GVGK (529,8 → 846,3) i AMG 510 modifikovani-KRAS<G12C>AMG 510- LVVVGAC(CAM)GVGK (521,4 → 675,2) su praćeni. Zauzetost je izračunata kao procenat AMG 510 modifikovanog-KRAS<G12C>peptida normalizovanog na zbir nemodifikovanog i modifikovanog KRAS<G12C>peptida.

[1045] Protočna citometrija

[1046] Za in vitro analizu efekta AMG 510 na ekspresiju antigena MHC klase I, CT-26 KRAS p.G12C ćelije (5,0E+04 ćelija po bunarčiću) zasejane su u ploču sa 96 bunarčića i tretirane trostrukim serijskim razblaženjem AMG 510 u odsustvu ili prisustvu IFN-γ do finalne koncentracije od 25 ili 250 pg/mL. Ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO<2>tokom 24 sata. Ćelije su neenzimski odvojene iz bunarčića, isprane puferom za bojenje (PBS/0,5% BSA), a zatim inkubirane sa PE-konjugovanim H-2D<d>, H-2K<d>ili H-2L<d>antitelima (BioLegend) tokom 30 minuta na ledu. Nakon pranja, ćelije su resuspendovane u puferu za bojenje koji je sadržao SYTOX Blue boju za mrtve ćelije (Life Technologies), a zatim analizirane protočnom citometrijom. Prikupljanje i analiza su izvršeni na protočnom citometru BD LSRFortessa korišćenjem softvera BD FACSDiva.

[1049] 11

[1050] Za in vivo studije, CT-26 KRAS p.G12C ćelije su implantirane ženkama Balb/c miševa starosti od približno 6 nedelja. 22. dana nakon implantacije, jedinke su randomizovane u kohortu za četvorodnevno doziranje koja se sastojala od 5 grupa od po n=8/grupa, koje su primale ili vehikulum oralno (QD) PBS intraperitonealno (Q3Dx2); AMG 510 oralno (100 mg/kg QD) PBS intraperitonealno (Q3Dx2); vehikulum oralno (QD) anti-PD-1 antitelo (29F.1A12; 100 µg po dozi, Q3Dx2) intraperitonealno; AMG 510 oralno (100 mg/kg QD) anti-PD-1 antitelo (29F.1A12; 100 µg po dozi, Q3Dx2) intraperitonealno; ili pomoću MEKi oralno (10 mg/kg, QD) PBS intraperitonealno (Q3Dx2) tokom 4 dana. Nakon četiri dana doziranja, tumori su prikupljeni i izdvojeni iz okolne fascije, izmereni, mehanički usitnjeni i stavljeni u Liberase TL (0,2 mg/ml, Roche) i DNase I (20 µg/ml, Ambion). Rastvori tumora su zatim mehanički homogenizovani korišćenjem uređaja gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotech) i inkubirani na 37°C tokom 15 minuta na rotoru MACSmix Tube Rotator (Miltenyi Biotech). Ćelije su zatim tretirane sa 0,02% EDTA (Sigma) i toplotno inaktivisanim FBS-om (ThermoFisher Scientific) i proceđene kroz filter od 70 µm radi uklanjanja grudvica. Ćelije su zatim centrifugirane, supernatant je odbačen, a ćelijski peleti su resuspendovani u LIVE/DEAD Fixable Blue boji za mrtve ćelije (ThermoFisher Scientific) tokom 30 minuta. Zatim je izvršeno bojenje površine ćelija navedenim antitelima (dopunska tabela 4) pre fiksacije i permeabilizacije ćelija (komplet pufera za intracelularnu fiksaciju i permeabilizaciju, eBiosciences) radi intracelularnog bojenja. Kuglice za apsolutno brojanje CountBright<™>(ThermoFisher Scientific) dodate su u svaki bunarčić sa uzorkom kako bi se omogućilo brojanje ćelija pre analize na protočnom citometru LSR II (BD Biosciences). Sve analize su urađene softverom FlowJo v10 (FlowJo). Apsolutni broj ćelija određen je normalizacijom broja ćelija u odnosu na zabeležene kuglice, podeljen zapreminom analiziranog alikvota tumora i masom tumora.

[1052] Ispitivanja enzimski vezanih imunospotova (ELISpot)

[1053] Odgovor T-ćelija specifičan za antigen procenjen je korišćenjem IFN-γ ELISpot ispitivanja (Cellular Technology Ltd.). Splenociti su prikupljeni (n=4-5/grupa) i korišćeni u ELISpot ispitivanju celih ćelija. Ukratko, 2,5E+05 splenocita je pomešano sa 2,5E+04 tumorskih ćelija CT-26, CT-26 KRAS p.G12C or 4T1 i inkubirano na 37°C tokom 20 sati. Za prebrojavanje spotova korišćen je analizator CTLS6 Fluorospot (Cellular Technology Ltd.).

[1056] 11

[1057] Statistička analiza

[1058] Farmakodinamički eksperimenti analizirani su jednosmernom ANOVA analizom, nakon čega je usledio Danetov post-hoc test. Za studije efikasnosti sprovedena je analiza varijanse sa ponovljenim merenjima (RMANOVA), nakon čega je usledio Danetov post-hoc test korišćenjem softvera GraphPad Prism 7.04. Regresiona analiza je sprovedena uparenim ttestom. Statistička analiza preživljavanja određena je Kaplan-Majerovom procenom sa Mantel-Koksovim log-rank testom radi poređenja krivi pomoću softvera GraphPad Prism 7.04. Podaci protočne citometrije analizirani su dvosmernom ANOVA analizom višestrukih poređenja, nakon čega je usledio Tjukijev post-hoc test. NanoString podaci analizirani su jednosmernom ANOVA analizom višestrukih poređenja uz Tjukijev post-hoc test. Poređenja ELISpot podataka izvršena su neuparenim t-testom pomoću softvera GraphPad Prism.

[1060] LC-MS/MS bioanalitičke metode za AMG 510

[1061] Homogenati tumorskog tkiva pripremljeni su dodavanjem vode u tkivo (4:1 mL:g) korišćenjem kuglica od volfram-karbida u uređaju TissueLyzer (Qiagen). U 20 µL uzorka (plazma ili homogenat tumorskog tkiva) dodato je 100 µL acetonitrila koji sadrži unutrašnji standard (IS) (200 ng/mL tolbutamida), uzorak je vorteksiran 10 minuta, centrifugiran na 3500 g tokom 10 minuta, a prikupljeno je 90 µL supernatanta. Prikupljenom supernatantu dodato je 100 µL vode (koja sadrži 0,1% mravlje kiseline), a 5 µL dobijenog rastvora je injektovano u LC-MS/MS sistem. Hromatografska razdvajanja su postignuta korišćenjem Phenomenex Kinetex C18 kolone (50 x 2,1 mm, 2,7 µm), održavane na 50°C, korišćenjem 0,1% mravlje kiseline u H<2>O (mobilna faza A) i 0,1% mravlje kiseline u acetonitrilu (mobilna faza B). Hromatografski gradijent je tekao na sledeći način: izokratično od 0 minuta do 0,1 minuta sa 10% mobilne faze B, linearno povećanje od 0,1 do 0,85 minuta na 95% mobilne faze B, izokratično zadržavanje od 0,85 do 1,10 minuta sa 95% mobilne faze B, linearno smanjenje od 1,10 do 1,11 minuta na 10% mobilne faze B, izokratično zadržavanje od 1,11 do 1,40 minuta sa 10% mobilne faze B. Maseni spektrometar API 4000 je tipično korišćen za analizu i radio je u pozitivnom modu ESI prateći MS/MS prelaz 561,179 > 134,100 (AMG 510) i 271,100 > 134,100 (tolbutamid). Površine pikova su integrisane pomoću programa Analyst<®>(Sciex). I podaci su, nakon integracije površine pika, izvezeni u Watson LIMS<™>(ThermoFisher Scientific), a koncentracije su određene ponderisanom (1/x<2>) linearnom regresijom odnosa površina pikova (površina pika AMG 510 / površina pika IS) u odnosu na nominalne koncentracije kalibracionih standarda plazme. Kalibracioni opseg za AMG 510 u plazmi bio je od 1,0 do 10.000 ng/mL (donja granica kvantifikacije, LLOQ 1,0

[1064] 12

[1065] ng/mL). Kalibracioni opseg za AMG 510 u homogenatu tumorskog tkiva bio je od 5,0 do 50.000 ng/mL (LLOQ 5,0 ng/mL).

[1067] Stabilno izotopsko obeležavanje aminokiselinama u ćelijskoj kulturi (SILAC)

[1068] Laki medijum (LM) pripremljen je dodavanjem sledećih komponenti do finalne zapremine od 1 L: 100 mL dijalizovanog FBS-a, 10,4 g praškastog RPMI-1640 medijuma, 2 g natrijum-bikarbonata, 200 mg L-arginina, 48 mg L-lizina, 100 mg L-leucina i 1x Pen-Strepa, što je filtrirano sistemom filtera od 0,22 µm. Teški medijum (HM) pripremljen je identično kao LM, ali je 100 mg [<13>C<6>]-L-leucina (Cambridge Isotope Laboratories) zamenilo neizotopski obogaćen L-leucin. Ćelije MIA PaCa-2 i NCI-H358 zasejane su (3E+05 ćelija) u T75 boce sa LM; LM je menjan svakodnevno. Nakon 48 sati, ćelije su isprane sa 1x PBS-om, a medijum je zamenjen sa HM; HM je menjan svakodnevno tokom 4 dana.6. dana, ćelije su isprane sa 1x PBS-om i medijum je zamenjen sa LM; LM je menjan svakodnevno. Počevši od 6. dana, uzorci MIA PaCa-2 sakupljani su u 0, 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 30, 36, 48 i 72 sata. Počevši od 6. dana, uzorci NCI-H358 sakupljani su u 0, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72 i 96 sati. Posebne T75 boce, pripremljene u triplikatu, sakupljane su u svakoj vremenskoj tački i obrađivane u lizate.

[1070] Sakupljanje SILAC uzoraka i priprema proteina lizata

[1071] T75 boce su isprane sa 1x PBS-om, tretirane tripsinom i inkubirane tokom 2 minuta, nakon čega je dodat ledeno hladan PBS koji sadrži 10% dijalizovanog FBS-a. Ćelije su dobro pomešane i sakupljene, a zatim je izvršeno brojanje ćelija pomoću uređaja Vi-CELL XR. Preostale ćelije su centrifugirane i isprane ledeno hladnim PBS-om (bez Mg<+2>, bez Ca<+2>). Ćelije su ponovo centrifugirane, PBS je uklonjen, a ćelije su lizirane u maloj zapremini ledeno hladnog RIPA pufera koji sadrži inhibitore fosfataza (PhosSTOP, Roche) i proteaza (cOmplete bez EDTA, Roche). Dobijeni lizati su vorteksirani, stavljeni na led tokom 10 minuta, centrifugirani radi uklanjanja nerastvorljivih ostataka, a zatim čuvani na -80°C do dalje obrade.

[1073] Određivanje vremena poluraspada ciljnog SILAC KRAS<G12C>pomoću SILAC metode [0285] Anti-humano RAS (anti-RAS) antitelo je kupljeno od kompanije Abcam i biotinilovano pomoću EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (ThermoFisher Scientific) korišćenjem protokola koji je opisao prodavac. Preostali biotin je uklonjen, a dobijeno biotin-anti-RAS antitelo je naneto na Dynabeads<®>MyOne<™>Streptavidin C1 kuglice (ThermoFisher Scientific) tokom 1,5 sati na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Ćelijski lizat (prethodno opisan) inkubiran je sa biotinilovanim anti-RAS kuglicama tokom 2 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje. Pomoću magneta, kuglice su isprane sa PBST (3x), a zatim sa PBS (1x). Uzorci su eluirani sa kuglica korišćenjem 3% vodenog rastvora mravlje kiseline/30% vodenog rastvora ACN-a, nakon čega je usledila inkubacija na sobnoj temperaturi uz mućkanje tokom 10 minuta. Supernatanti su prebačeni u ploču sa 96 bunarčića i osušeni. Uzorci su resuspendovani u puferu za denaturaciju (10 mM TCEP, 8 M urea) i inkubirani na 37°C tokom 1 sata korišćenjem vodenog kupatila. Dodat je jodoacetamid (40 mM) i inkubiran na 25°C tokom 1 sata, zaštićen od svetlosti. Dodati su 50 mM NH<4>HCO<3>i tripsin (0,1 µg/µL), a uzorci su digestirani na 37°C tokom 24 sata, a zatim je reakcija ugašena mravljom kiselinom do finalne koncentracije od 1% (v:v). Uzorci su koncentrovani na približno 80 µL pre analize masenom spektrometrijom. Uzorci su analizirani tečnom hromatografijom-tandemnom masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) metodom praćenja više reakcija (MRM) u modu pozitivne jonske elektrosprej jonizacije korišćenjem instrumenta 6500 QTRAP (AB SCIEX) spregnutog sa Acquity UPLC (Waters). Uzorci su injektovani na Acquity UPLC BEH C8 kolonu 1,7 µm, 2,1 x 100 mm (Waters). Mobilne faze su se sastojale od mobilne faze A (voda 0,1% mravlja kiselina) i mobilne faze B (acetonitril 0,1% mravlja kiselina). LC gradijent je bio 5-50% B tokom 5 minuta, 50-95% B tokom 0,5 minuta i 95% B tokom 1 minuta. Za praćenje prelaza sa teškog na lako obeležavanje korišćeni su sledeći peptidi za KRAS<G12C>(LVVVGAC(CAM)GVGK (529,8 → 846,3) i 13C-LVVVGAC(CAM)GVGK (532,8 → 846,3)) i RAS WT (LVVVGAGGVGK (478,3 → 743,2) i 13C-LVVVGAGGVGK (481,3 → 743,2)). Relativna obilnost izotopa (RIA) određena je korišćenjem sledeće formule:

[1075]

[1077] Određivanje vremena poluraspada KRAS<G12C>pomoću SILAC metode

[1078] Da bi se uzela u obzir uloga ćelijskog rasta na određivanje vremena poluraspada proteina, broj ćelija i RIA podaci povezani sa svakom vremenskom tačkom istovremeno su uklopljeni u niz jednačina radi određivanja vremena poluraspada KRAS<G12C>u MIA PaCa-2 i NCI-H358 ćelijama. Korišćene su sledeće jednačine:

[1079] Jednačina prvog reda za teški peptid:

[1081]

[1083] Jednačina prvog reda za laki peptid:

[1084]

[1086] Jednačina prvog reda za rast ćelija:

[1088]

[1091] Vreme 0 je definisano kao vreme kada je HM zamenjen sa LM, Hv je koncentracija teškog peptida, lt je koncentracija lakog peptida, cell<new>je broj novih ćelija, k<dec>je konstanta brzine prvog reda za degradaciju, k<syn>je konstanta brzine nultog reda za sintezu, k<dil>je konstanta rasta ćelija prvog reda, cell<(0)>je broj ćelija u vremenu 0, Hv<(0)>je koncentracija teškog peptida u vremenu 0, lt<(0)>je koncentracija lakog peptida u vremenu 0. Za modelovanje je korišćen pristup korak po korak, pri čemu se u prvom koraku k<dil>procenjuje na osnovu broja ćelija, a u drugom koraku se k<dec>procenjuje korišćenjem gore navedenih jednačina.

[1093] k<dil>je procenjena kvantifikacijom broja ćelija nakon prelaska na LM i primenom sledeće jednačine: A= A<0>e<-kdil t>gde A i A<0>predstavljaju broj ćelija u vremenu t, odnosno 0. Dopunska tabela 1. Podaci ćelijskih ispitivanja

[1096]

[1100] 12

[1101]

[1102]

[1104] Dopunska tabela 2. Statistika prikupljanja i prečišćavanja podataka (molekularna zamena)

[1105]

[1108] 12

[1109]

[1111] Dopunska tabela 3. Analiza rezultata signalnih puteva ekspresije gena Dopunska tabela 3A

[1112]

[1115] 12

[1116]

[1119] 12

[1122] 12 Dopunska tabela 3B

[1123]

[1125] Dopunska tabela 3C

[1126]

[1129] 12

[1131] Dopunska tabela 3D

[1132]

[1135] 1

[1137] Dopunska tabela 3E

[1138]

[1141] 11

[1143] Dopunska tabela 4. Antitela za protočnu citometriju

[1144]

[1147] 1 2

[1149] Predmetni pronalazak je opisan u vezi sa poželjnim otelotvorenjima.

[1151] 1

Claims (35)

1. Patentni zahtevi

1. Jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera kod pacijenta, pri čemu upotreba obuhvata davanje pacijentu terapijski efikasne količine (1M)-6-fluoro-7-(2-fluoro-6-hidroksifenil)-1-(4-metil-2-(2-propanil)-3-piridinil)-4-((2S)-2-metil-4-(2-propenoil)-1-piperazinil)pirido[2,3-d]pirimidin-2(1H)-ona koji ima sledeću hemijsku strukturu

ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i terapijski efikasne količine najmanje jednog dodatnog farmaceutski aktivnog agensa, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens karboplatin, anti-PD-1 antitelo, MEK inhibitor, EGFR inhibitor, mTOR inhibitor, SHP2 inhibitor, PI3K inhibitor ili AKT inhibitor.

2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je kancer posredovan KRAS G12C mutacijom.

3. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je kancer nemalocelularni kancer pluća, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer slepog creva, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, kancer želuca, kancer tankog creva, kancer nosne šupljine, kancer paranazalnih sinusa, kancer žučnih puteva, kancer kože ili intraokularni melanom.

4. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 3, pri čemu je kancer, kancer pankreasa.

5. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 3, pri čemu je kancer kolorektalni kancer.

6. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 3, pri čemu je kancer nemalocelularni kancer pluća.

7. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens karboplatin.

8. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens anti-PD-1 antitelo.

9. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i 8, pri čemu je anti-PD-1 antitelo AMG 404, pembrolizumab ili nivolumab.

10. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i 8, pri čemu je anti-PD-1 antitelo pembrolizumab.

11. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i 8, pri čemu je anti-PD-1 antitelo nivolumab.

12. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i 8, pri čemu anti-PD-1 antitelo obuhvata aminokiselinsku sekvencu regiona 1 koji određuje komplementarnost (CDR) teškog lanca (HC) koja obuhvata SEQ ID NO: 1, aminokiselinsku sekvencu HC CDR2 koja obuhvata SEQ ID NO: 2; aminokiselinsku sekvencu HC CDR3 koja obuhvata SEQ ID NO: 3; aminokiselinsku sekvencu CDR1 lakog lanca (LC) koja obuhvata SEQ ID NO: 4; aminokiselinsku sekvencu LC CDR2 koja obuhvata SEQ ID NO: 5; i aminokiselinsku sekvencu LC CDR3 koja obuhvata SEQ ID NO: 6.

13. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i 8, pri čemu anti-PD-1 antitelo obuhvata sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 8.

14. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i 8, pri čemu anti-PD-1 antitelo obuhvata sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 9 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 10.

15. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i 8, pri čemu je anti-PD-1 antitelo AMG 404.

16. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens MEK inhibitor.

1

17. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je MEK inhibitor trametinib, pimasertib, PD-325901, MEK162, TAK-733, GDC-0973 ili AZD8330.

18. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu je MEK inhibitor trametinib.

19. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens EGFR inhibitor.

20. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, pri čemu je EGFR inhibitor afatinib, erlotinib, lapatinib, cetuksimab ili panitumumab.

21. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, pri čemu je EGFR inhibitor afatinib.

22. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, pri čemu je EGFR inhibitor panitumumab.

23. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens SHP2 inhibitor.

24. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, pri čemu je SHP2 inhibitor RMC 4550.

25. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, pri čemu je SHP2 inhibitor RMC 4630.

26. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens mTOR inhibitor.

27. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 26, pri čemu je mTOR inhibitor everolimus.

28. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens PI3K inhibitor.

1

29. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 28, pri čemu je PI3K inhibitor AMG 511 ili buparlisib.

30. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 29, pri čemu je PI3K inhibitor AMG 511.

31. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 29, pri čemu je PI3K inhibitor buparlisib.

32. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu je taj najmanje jedan dodatni farmaceutski aktivni agens AKT inhibitor.

33. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 32, pri čemu je AKT inhibitor AZD5363.

34. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-33, pri čemu je pacijent odrasla osoba.

35. Jedinjenje za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-34, pri čemu se jedinjenje i dodatni farmaceutski aktivni agens daju istovremeno ili odvojeno.

1