CN113038953B - 用于治疗癌症的包括krasg12c抑制剂和一种或多种其他药学活性药剂的组合疗法 - Google Patents

用于治疗癌症的包括krasg12c抑制剂和一种或多种其他药学活性药剂的组合疗法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包括KRASG12C抑制剂(例如(参见下式))或其药学上可接受的盐和一种或多种其他药学活性药剂的组合疗法，特别是用于治疗癌症。本发明还涉及用于治疗癌症的含有KRASG12C抑制剂和一种或多种其他药学活性药剂的药物组合物。

Description

用于治疗癌症的包括KRASG12C抑制剂和一种或多种其他药学活 性药剂的组合疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年6月24日提交的美国临时申请62/865,819、2019年3月20日提交的美国临时申请62/821,376和2018年11月19日提交的美国临时申请62/769,355的优先权和权益，所有申请均出于所有目的以引用方式全文并入本文。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为A-2326-US-NP_SeqList_102919_ST25.txt的文件提供，该文件创建于2019年10月29日，大小为15.4kb。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明提供了包括KRASG12C抑制剂和一种或多种其他药学活性药剂的组合疗法，特别是用于治疗癌症。本发明还涉及用于治疗癌症的含有KRASG12C抑制剂和一种或多种其他药学活性药剂的药物组合物。
背景技术
KRAS基因突变在胰腺癌、肺腺癌、结直肠癌、胆囊癌、甲状腺癌和胆管癌中是常见的。在约25％的NSCLC患者中也观察到KRAS突变，并且一些研究已指示，KRAS突变在NSCLC患者中是阴性预后因子。最近，已发现V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)突变在结直肠癌中赋予对表皮生长因子受体(EGFR)靶向疗法的抗性；因此，KRAS的突变状态可以在开具TKI疗法之前提供重要信息。总体而言，需要针对胰腺癌、肺腺癌或结直肠癌的患者的新的医学治疗，特别是那些已被诊断出患有以KRAS突变表征的此类癌症的患者并且包括那些化疗后进展的患者。残基G12、G13和Q61的致癌性KRAS突变代表了实体恶性肿瘤中最常见的RAS突变。最近已经证明，KRASG12C可以被共价小分子抑制剂靶向，该抑制剂与邻近开关II口袋(switch II pocket，SIIP)的突变半胱氨酸反应，将KRAS锁定在其非活性GDP结合状态。
KRAS是人类癌症中最频繁突变的癌基因，并编码肿瘤中的关键信号传导蛋白。KRASG12C突变体带有一个半胱氨酸，其已被用于设计具有有前景的临床前活性的共价抑制剂。我们优化了一系列具有新颖结合相互作用与显著增强的效力和选择性的抑制剂。这些努力导致了AMG 510的发现，AMG 510是临床开发中的首款KRASG12C抑制剂。临床前AMG 510治疗消退了KRAS p.G12C肿瘤，并显著改善化学疗法和靶向药剂的抗肿瘤功效。在免疫活性的小鼠中，AMG 510治疗产生促炎性肿瘤微环境，并结合免疫检查点抑制产生持久治愈。治愈的小鼠排斥等基因KRAS p.G12D肿瘤的生长，这表明对共有抗原的适应性免疫。AMG 510在首次给药队列中证明了临床抗肿瘤活性的初步证据，并且代表了对缺乏有效治疗的患者的潜在转化疗法。
KRAS癌蛋白是一种GTP酶，其是参与肿瘤细胞生长和存活的细胞内信号传导通路的重要介质。在正常细胞中，KRAS充当分子开关，在非活性GDP结合状态与活性GTP结合状态之间交替。加载GTP并活化KRAS的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)和GTP水解促进了这些状态之间的转换，GTP水解通过GTP酶激活蛋白(GAP)催化而使KRAS失活。GTP与KRAS的结合促进了效应子的结合以触发信号转导通路，包括RAF-MEK-ERK(MAPK)。KRAS中的体细胞激活突变是癌症的标志并防止GAP缔合，从而稳定效应子结合并增强KRAS信号传导。患有KRAS突变肿瘤的患者的结果显著更不良，并且预后更差。尽管临床上批准的若干种MAPK通路蛋白(例如MEK、BRAF、EGFR)的抑制剂针对一小组肿瘤类型，但迄今为止尚无对KRAS突变型肿瘤具有选择性的临床分子。此外，由于缺乏临床功效，因此禁止使用若干种MAPK通路靶向疗法来治疗KRAS突变肿瘤。此外，由于抑制了正常细胞中的MAPK信号传导，因此非肿瘤或非突变的选择性疗法可能会引入中靶(on-target)毒性。这可能会限制将此类药剂与护理标准或免疫疗法结合使用的效用。因此，对开发未引入对正常细胞的负担的肿瘤选择性疗法存在明显未满足的需求。
KRAS p.G12C存在于约13％的肺腺癌，3％的结直肠癌和2％的其他实体瘤中。KRASG12C的突变半胱氨酸与非活性GDP结合形式的KRAS中存在的口袋(P2)相邻。P2和突变半胱氨酸的接近导致对共价抑制剂的广泛搜索。首次报道的对KRASG12C的亲电筛选最终鉴定出ARS-1620，这在临床前KRAS p.G12C模型中显示了体内功效。尽管Araxes Pharma公司的ARS-1620是概念验证突变选择性KRAS抑制的里程碑，但其已被定位为临床前研究的工具化合物。美商安进公司(Amgen,Inc.)的科学家们鉴定了一系列新颖的基于丙烯酰胺的分子，这些分子利用了KRASG12C中以前未被利用的表面凹槽，从而实质上提高了效能和选择性。密集型亲电筛选和基于结构的设计最终导致了AMG 510的发现，AMG 510是首款在人体中进行临床测试的KRASG12C抑制剂(参见www.clinicaltrials.gov NCT 03600883)。本发明包括AMG 510的令人信服的临床前活性，其作为单一疗法或与其他疗法组合时增强肿瘤细胞杀伤的能力，以及对免疫细胞浸润的显著影响，这使得肿瘤微环境对免疫疗法非常敏感。本文还提供了临床功效的初步证据。
发明内容
本发明包括一种药物组合物，其包含AMG 510或其药学上可接受的盐；和一种或多种治疗剂或药学活性药剂；和药学上可接受的赋形剂。
本发明进一步包括一种用AMG 510或药学上可接受的盐和至少一种治疗剂的组合治疗癌症(例如实体瘤，包括但不限于肺癌、结肠癌和胰腺癌)的方法，其中所述治疗剂选自抗PD-1抗体、化学治疗剂、MEK抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂、PI3K抑制剂和AKT抑制剂。
本发明进一步包括分离的细胞系，其包含两个KRASG12C等位基因，其中所述细胞系是CT-26KRAS p.G12C。
本发明进一步包括一种产生包含两个KRASG12C等位基因的细胞系的方法，所述方法包括：
a)将包含两个KRASG12D等位基因的细胞系与CRISPR构建体一起孵育，所述CRISPR构建体诱导两个KRAS等位基因上的核苷酸替代，从而形成两个KRASG12C等位基因；以及
b)分离包含两个KRASG12C等位基因的细胞系。
第一组实施例
1.在本发明的一个实施例中，本发明包括一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和至少一种化学治疗剂。
2.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和至少一种化学治疗剂。
3.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例2所述的方法，其中所述结肠癌具有KRAS p.G12C突变。
4.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗肺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和化学治疗剂。
在一些这样的实施例中，所述肺癌是非小细胞肺癌。
5.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例1所述的方法，其中所述胰腺癌具有KRAS p.G12C突变。
6.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例1-5中任一项所述的方法，其中所述化学治疗剂是卡铂。
7.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和MEK抑制剂。
8.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和MEK抑制剂。
9.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗肺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和MEK抑制剂。
10.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例9所述的方法，其中所述肺癌具有p.KRAS G12C突变。
11.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例7-10中任一项所述的方法，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼。
12.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例7-10中任一项所述的方法，其中所述MEK抑制剂是匹马塞替尼(pimasertib)、PD-325901、MEK162、TAK-733、GDC-0973或AZD8330。
13.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和EGFR抑制剂。
14.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和EGFR抑制剂。
15.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗肺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和EGFR抑制剂。
16.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例13-15中任一项所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼。
17.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例13和15中任一项所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼。
18.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例15所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是拉帕替尼。
19.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和SHP2抑制剂。
20.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和SHP2抑制剂。
21.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗肺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和SHP2抑制剂。
22.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例19-21中任一项所述的方法，其中所述SHP2抑制剂选自RMC-4550。
23.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例22所述的方法，其中所述SHP2抑制剂是RMC 4550。
24.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和PI3K抑制剂。
25.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和PI3K抑制剂。
26.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗肺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和PI3K抑制剂。
27.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例24-26中任一项所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是AMG 511。
28.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例26所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是布帕尼西。
29.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗胰腺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和AKT抑制剂。
30.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗肺癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和AKT抑制剂。
31.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例29-30中任一项所述的方法，其中所述AKT抑制剂是AZD5363。
32.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和EGFR抗体。
33.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例32所述的方法，其中所述EGFR抗体是西妥昔单抗。
32.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和抗PD-1抗体。
33.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例32所述的方法，其中所述抗PD-1抗体选自AMG 404、派姆单抗和纳武单抗。
34.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例33所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗。
35.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例33所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是AMG 404。
36.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例33所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗。
37.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；卡铂；和药学上可接受的赋形剂。
38.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；曲美替尼；和药学上可接受的赋形剂。
39.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含：或其药学上可接受的盐；阿法替尼；和药学上可接受的赋形剂。
40.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；厄洛替尼；和药学上可接受的赋形剂。
41.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；拉帕替尼；和药学上可接受的赋形剂。
42.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；RMC-4550；和药学上可接受的赋形剂。
43.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；AMG 511；和药学上可接受的赋形剂。
44.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；布帕尼西；和药学上可接受的赋形剂。
45.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；AZD5363；和药学上可接受的赋形剂。
46.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；西妥昔单抗；和药学上可接受的赋形剂。
47.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；抗PD-1抗体；和药学上可接受的赋形剂。
48.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；AMG 404；和药学上可接受的赋形剂。
49.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；派姆单抗；和药学上可接受的赋形剂。
50.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；纳武单抗；和药学上可接受的赋形剂。
51.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例1-4或7-36中任一项所述的方法，其中所述KRASG12C抑制剂是或其药学上可接受的盐。
52.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗实体瘤的KRASG12C抑制剂药物和MEK抑制剂药物的组合。
53.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗肺癌的KRASG12C抑制剂药物和MEK抑制剂药物的组合。
54.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗结肠癌的KRASG12C抑制剂药物和MEK抑制剂药物的组合。
55.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗胰腺癌的KRASG12C抑制剂药物和MEK抑制剂药物的组合。
56.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗实体瘤的KRASG12C抑制剂药物和化学治疗剂药物的组合。
57.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗肺癌的KRASG12C抑制剂药物和化学治疗剂药物的组合。
58.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗结肠癌的KRASG12C抑制剂药物和化学治疗剂药物的组合。
59.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗胰腺癌的KRASG12C抑制剂药物和化学治疗剂药物的组合。
60.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗实体瘤的KRASG12C抑制剂药物和EGFR抑制剂药物的组合。
61.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗肺癌的KRASG12C抑制剂药物和EGFR抑制剂药物的组合。
62.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗结肠癌的KRASG12C抑制剂药物和EGFR抑制剂药物的组合。
63.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗胰腺癌的KRASG12C抑制剂药物和EGFR抑制剂药物的组合。
64.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗实体瘤的KRASG12C抑制剂药物和抗PD-1抗体药物的组合。
65.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗肺癌的KRASG12C抑制剂药物和抗PD-1抗体药物的组合。
66.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗结肠癌的KRASG12C抑制剂药物和抗PD-1抗体药物的组合。
67.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗胰腺癌的KRASG12C抑制剂药物和抗PD-1抗体药物的组合。
68.在本发明的另一个实施例中，本发明包括KRASG12C抑制剂与化学治疗剂组合在制造用于管理或治疗受试者的胰腺癌、肺癌或结肠癌的药物中的用途。
69.在本发明的另一个实施例中，本发明包括KRASG12C抑制剂与MEK抑制剂组合在制造用于管理或治疗受试者的胰腺癌、肺癌或结肠癌的药物中的用途。
70.在本发明的另一个实施例中，本发明包括KRASG12C抑制剂与EGFR抑制剂组合在制造用于管理或治疗受试者的胰腺癌、肺癌或结肠癌的药物中的用途。
71.在本发明的另一个实施例中，本发明包括KRASG12C抑制剂与抗PD-1抗体组合在制造用于管理或治疗受试者的胰腺癌、肺癌或结肠癌的药物中的用途。
72.在本发明的另一个实施例中，本发明包括包含两个KRASG12C等位基因的分离的细胞系。
73.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例68所述的细胞系，其中所述细胞系是CT-26KRAS p.G12C。
74.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种产生包含两个KRASG12C等位基因的细胞系的方法，所述方法包括：
a)将包含两个KRAS G12D等位基因的细胞系与CRISPR构建体一起孵育，所述CRISPR构建体诱导两个KRAS等位基因上的核苷酸替代，从而形成两个KRASG12C等位基因；以及
b)分离包含两个KRASG12C等位基因的细胞系。
75.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例70所述的方法，其中所述CRISPR构建体包含序列CTTGTGATGGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO:21)。
76.在本发明的另一个实施例中，本发明包括一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和至少一种其他化学治疗剂。
77.在本发明的另一个实施例中，本发明包括用于治疗实体瘤的KRASG12C抑制剂药物和抗PD-1抗体药物的组合。
78.在本发明的另一个实施例中，本发明包括KRASG12C抑制剂与至少一种其他化学治疗剂组合在制造用于管理或治疗受试者的胰腺癌、肺癌或结肠癌的药物中的用途。
79.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例76所述的方法，其中所述KRASG12C抑制剂是
或其药学上可接受的盐。
80.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例77所述的组合，其中所述KRASG12C抑制剂是
或其药学上可接受的盐。
81.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例78所述的用途，其中所述KRASG12C抑制剂是
或其药学上可接受的盐。
82.在本发明的另一个实施例中，本发明包括如实施例78所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
第二组实施例
1.在本发明的另一个实施例中，本发明涉及一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和至少一种其他药学活性药剂。
2.在另一个实施例中，如实施例1所述的方法，其中所述KRASG12C抑制剂是
或其药学上可接受的盐。
3.在另一个实施例中，如实施例1所述的方法，其中所述癌症为KRAS p.G12C突变。
4.在另一个实施例中，如实施例1所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、阑尾癌、子宫内膜癌或小肠癌。
5.在另一个实施例中，如实施例4所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
6.在另一个实施例中，如实施例4所述的方法，其中所述癌症是结肠直肠癌。
7.在另一个实施例中，如实施例4所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
8.在另一个实施例中，如实施例7所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
9.在另一个实施例中，如实施例4所述的方法，其中所述癌症是阑尾癌。
10.在另一个实施例中，如实施例4所述的方法，其中所述癌症是子宫内膜癌。
11.在另一个实施例中，如实施例4所述的方法，其中所述癌症是小肠癌。
12.在另一个实施例中，如实施例1所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是卡铂、抗PD-1抑制剂、MEK抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂、PI3K抑制剂或AKT抑制剂。
13.在另一个实施例中，如实施例12所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是卡铂。
14.在另一个实施例中，如实施例12所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是抗PD-1抑制剂。
15.在另一个实施例中，如实施例14所述的方法，其中所述抗PD-1抑制剂选自AMG404、派姆单抗和纳武单抗。
16.在另一个实施例中，如实施例15所述的方法，其中所述抗PD-1抑制剂是派姆单抗。
17.在另一个实施例中，如实施例15所述的方法，其中所述抗PD-1抑制剂是AMG404。
18.在另一个实施例中，如实施例15所述的方法，其中所述抗PD-1抑制剂是纳武单抗。
19.在另一个实施例中，如实施例12所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是MEK抑制剂。
20.在另一个实施例中，如实施例19所述的方法，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼、匹马塞替尼、PD-325901、MEK162、TAK-733、GDC-0973或AZD8330。
21.在另一个实施例中，如实施例20所述的方法，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼。
22.在另一个实施例中，如实施例12所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是EGFR抑制剂。
23.在另一个实施例中，如实施例22所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼、厄洛替尼、拉帕替尼或西妥昔单抗。
24.在另一个实施例中，如实施例23所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼。
25.在另一个实施例中，如实施例23所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗。
26.在另一个实施例中，如实施例12所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是SHP2抑制剂。
27.在另一个实施例中，如实施例26所述的方法，其中所述SHP2抑制剂是RMC4550。
28.在另一个实施例中，如实施例26所述的方法，其中所述SHP2抑制剂是RMC4630。
29.在另一个实施例中，如实施例12所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是PI3K抑制剂。
30.在另一个实施例中，如实施例29所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是AMG 511或布帕尼西。
31.在另一个实施例中，如实施例30所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是AMG 511。
32.在另一个实施例中，如实施例30所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是布帕尼西。
33.在另一个实施例中，如实施例12所述的方法，其中所述至少一种其他药学活性药剂是AKT抑制剂。
34.在另一个实施例中，如实施例33所述的方法，其中所述AKT抑制剂是AZD5363。
35.在另一个实施例中，一种药物组合物，其包含或其药学上可接受的盐；至少一种其他药学活性药剂；和药学上可接受的赋形剂。
36.在另一个实施例中，如实施例35所述的组合物，其中至少一种其他药学活性药剂是卡铂、抗PD-1抑制剂、MEK抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂、PI3K抑制剂或AKT抑制剂。
37.在另一个实施例中，如实施例36所述的组合物，其中至少一种其他药学活性药剂是卡铂。
38.在另一个实施例中，如实施例36所述的组合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是抗PD-1抑制剂。
39.在另一个实施例中，如实施例38所述的组合物，其中所述抗PD-1抑制剂选自AMG 404、派姆单抗和纳武单抗。
40.在另一个实施例中，如实施例39所述的组合物，其中所述抗PD-1抑制剂是派姆单抗。
41.在另一个实施例中，如实施例39所述的组合物，其中所述抗PD-1抑制剂是AMG404。
42.在另一个实施例中，如实施例39所述的组合物，其中所述抗PD-1抑制剂是纳武单抗。
43.在另一个实施例中，如实施例36所述的组合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是MEK抑制剂。
44.在另一个实施例中，如实施例43所述的组合物，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼、匹马塞替尼、PD-325901、MEK162、TAK-733、GDC-0973或AZD8330。
45.在另一个实施例中，如实施例44所述的组合物，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼。
46.在另一个实施例中，如实施例36所述的组合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是EGFR抑制剂。
47.在另一个实施例中，如实施例46所述的组合物，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼、厄洛替尼、拉帕替尼或西妥昔单抗。
48.在另一个实施例中，如实施例47所述的组合物，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼。
49.在另一个实施例中，如实施例47所述的组合物，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗。
50.在另一个实施例中，如实施例36所述的组合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是SHP2抑制剂。
51.在另一个实施例中，如实施例50所述的组合物，其中所述SHP2抑制剂是RMC4550。
52.在另一个实施例中，如实施例50所述的组合物，其中所述SHP2抑制剂是RMC4630。
53.在另一个实施例中，如实施例36所述的组合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是PI3K抑制剂。
54.在另一个实施例中，如实施例53所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是AMG511或布帕尼西。
55.在另一个实施例中，如实施例54所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是AMG511。
56.在另一个实施例中，如实施例54所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是布帕尼西。
57.在另一个实施例中，如实施例36所述的组合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是AKT抑制剂。
58.在另一个实施例中，如实施例57所述的组合物，其中所述AKT抑制剂是AZD5363。
59.在另一个实施例中，一种试剂盒，其包含：KRASG12C抑制剂或其药学上可接受的盐；和至少一种其他药学活性药剂。
60.在另一个实施例中，如实施例59所述的试剂盒，其中所述KRASG12C抑制剂是或其药学上可接受的盐。
61.在另一个实施例中，如实施例59所述的试剂盒，其中至少一种其他药学活性药剂是卡铂、抗PD-1抑制剂、MEK抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂、PI3K抑制剂或AKT抑制剂。
62.在另一个实施例中，如实施例59所述的试剂盒，其中至少一种其他药学活性药剂是卡铂。
63.在另一个实施例中，如实施例59所述的试剂盒，其中所述至少一种其他药学活性药剂是抗PD-1抑制剂。
64.在另一个实施例中，如实施例63所述的试剂盒，其中所述抗PD-1抑制剂选自AMG 404、派姆单抗和纳武单抗。
65.在另一个实施例中，如实施例64所述的试剂盒，其中所述抗PD-1抑制剂是派姆单抗。
66.在另一个实施例中，如实施例64所述的试剂盒，其中所述抗PD-1抑制剂是AMG404。
67.在另一个实施例中，如实施例64所述的试剂盒，其中所述抗PD-1抑制剂是纳武单抗。
68.在另一个实施例中，如实施例61所述的试剂盒，其中所述至少一种其他药学活性药剂是MEK抑制剂。
69.在另一个实施例中，如实施例68所述的试剂盒，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼、匹马塞替尼、PD-325901、MEK162、TAK-733、GDC-0973或AZD8330。
70.在另一个实施例中，如实施例69所述的试剂盒，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼。
71.在另一个实施例中，如实施例61所述的试剂盒，其中所述至少一种其他药学活性药剂是EGFR抑制剂。
72.在另一个实施例中，如实施例61所述的试剂盒，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼、厄洛替尼、拉帕替尼或西妥昔单抗。
73.在另一个实施例中，如实施例62所述的试剂盒，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼。
74.在另一个实施例中，如实施例62所述的试剂盒，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗。
75.在另一个实施例中，如实施例61所述的试剂盒，其中所述至少一种其他药学活性药剂是SHP2抑制剂。
76.在另一个实施例中，如实施例75所述的试剂盒，其中所述SHP2抑制剂是RMC4550。
77.在另一个实施例中，如实施例75所述的试剂盒，其中所述SHP2抑制剂是RMC4630。
78.在另一个实施例中，如实施例61所述的试剂盒，其中所述至少一种其他药学活性药剂是PI3K抑制剂。
79.在另一个实施例中，如实施例78所述的试剂盒，其中所述PI3K抑制剂是AMG511或布帕尼西。
80.在另一个实施例中，如实施例79所述的试剂盒，其中所述PI3K抑制剂是AMG511。
81.在另一个实施例中，如实施例79所述的试剂盒，其中所述PI3K抑制剂是布帕尼西。
82.在另一个实施例中，如实施例61所述的试剂盒，其中所述至少一种其他药学活性药剂是AKT抑制剂。
83.在另一个实施例中，如实施例82所述的试剂盒，其中所述AKT抑制剂是AZD5363。
84.在另一个实施例中，如实施例59所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于治疗癌症。
85.在另一个实施例中，如实施例84所述的试剂盒，其中所述癌症为KRAS p.G12C突变。
86.在另一个实施例中，如实施例84所述的试剂盒，其中所述癌症是胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、阑尾癌、子宫内膜癌或小肠癌。
87.在另一个实施例中，如实施例86所述的试剂盒，其中所述癌症是胰腺癌。
88.在另一个实施例中，如实施例86所述的试剂盒，其中所述癌症是结肠直肠癌。
89.在另一个实施例中，如实施例86所述的试剂盒，其中所述癌症是肺癌。
90.在另一个实施例中，如实施例89所述的试剂盒，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
91.在另一个实施例中，如实施例86所述的试剂盒，其中所述癌症是阑尾癌。
92.在另一个实施例中，如实施例86所述的试剂盒，其中所述癌症是子宫内膜癌。
93.在另一个实施例中，如实施例86所述的试剂盒，其中所述癌症是小肠癌。
94.在另一个实施例中，KRASG12C抑制剂与至少一种其他化学治疗剂组合用于制造用于管理或治疗受试者的癌症的药物的用途。
95.在另一个实施例中，如实施例94所述的用途，其中所述KRASG12C抑制剂是
或其药学上可接受的盐。
96.在另一个实施例中，一种化合物，其为KRASG12C抑制剂，用于与至少一种其他药学活性药剂一起在治疗癌症中使用。
97.在另一个实施例中，如实施例96所述的化合物，其中所述KRASG12C抑制剂是
或其药学上可接受的盐。
98.在另一个实施例中，如实施例96所述的化合物，其中所述癌症为KRAS p.G12C突变。
99.在另一个实施例中，如实施例96所述的化合物，其中所述癌症是胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、阑尾癌、子宫内膜癌或小肠癌。
100.在另一个实施例中，如实施例99所述的化合物，其中所述癌症是胰腺癌。
101.在另一个实施例中，如实施例99所述的化合物，其中所述癌症是结肠直肠癌。
102.在另一个实施例中，如实施例99所述的化合物，其中所述癌症是肺癌。
103.在另一个实施例中，如实施例102所述的化合物，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
104.在另一个实施例中，如实施例99所述的化合物，其中所述癌症是阑尾癌。
105.在另一个实施例中，如实施例99所述的化合物，其中所述癌症是子宫内膜癌。
106.在另一个实施例中，如实施例99所述的化合物，其中所述癌症是小肠癌。
107.在另一个实施例中，如实施例96所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是卡铂、抗PD-1抑制剂、MEK抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂、PI3K抑制剂或AKT抑制剂。
108.在另一个实施例中，如实施例107所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是卡铂。
109.在另一个实施例中，如实施例107所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是抗PD-1抑制剂。
110.在另一个实施例中，如实施例109所述的化合物，其中所述抗PD-1抑制剂选自AMG 404、派姆单抗和纳武单抗。
111.在另一个实施例中，如实施例110所述的化合物，其中所述抗PD-1抑制剂是派姆单抗。
112.在另一个实施例中，如实施例110所述的化合物，其中所述抗PD-1抑制剂是AMG 404。
113.在另一个实施例中，如实施例110所述的化合物，其中所述抗PD-1抑制剂是纳武单抗。
114.在另一个实施例中，如实施例107所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是MEK抑制剂。
115.在另一个实施例中，如实施例114所述的化合物，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼、匹马塞替尼、PD-325901、MEK162、TAK-733、GDC-0973或AZD8330。
116.在另一个实施例中，如实施例115所述的化合物，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼。
117.在另一个实施例中，如实施例107所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是EGFR抑制剂。
118.在另一个实施例中，如实施例117所述的化合物，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼、厄洛替尼、拉帕替尼或西妥昔单抗。
119.在另一个实施例中，如实施例118所述的化合物，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼。
120.在另一个实施例中，如实施例118所述的化合物，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗。
121.在另一个实施例中，如实施例107所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是SHP2抑制剂。
122.在另一个实施例中，如实施例121所述的化合物，其中所述SHP2抑制剂是RMC4550。
123.在另一个实施例中，如实施例121所述的化合物，其中所述SHP2抑制剂是RMC4630。
124.在另一个实施例中，如实施例107所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是PI3K抑制剂。
125.在另一个实施例中，如实施例124所述的化合物，其中所述PI3K抑制剂是AMG511或布帕尼西。
126.在另一个实施例中，如实施例125所述的化合物，其中所述PI3K抑制剂是AMG511。
127.在另一个实施例中，如实施例125所述的化合物，其中所述PI3K抑制剂是布帕尼西。
128.在另一个实施例中，如实施例107所述的化合物，其中所述至少一种其他药学活性药剂是AKT抑制剂。
129.在另一个实施例中，如实施例128所述的化合物，其中所述AKT抑制剂是AZD5363。
130.在另一个实施例中，如实施例1所述的方法，其中所述KRASG12C抑制剂和所述至少一种其他药学活性药剂同时施用。
131.在另一个实施例中，如实施例1所述的方法，其中所述KRASG12C抑制剂和所述至少一种其他药学活性药剂分开施用。
本发明的另一个实施例包括使用包含KRASG12C抑制剂和另一种治疗剂的组合，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂。本发明的另一实施例包括组合在治疗癌症中的用途，所述组合包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂。本发明的另一个实施例包括一种使用组合用于治疗癌症的方法，所述组合包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂。本发明的另一个实施例包括组合在治疗癌症中的用途，所述组合包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂的，其中所述用途包括自我施用所述组合。
本发明的另一个实施例包括一种治疗癌症的方法，所述方法包括开具进一步包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂的组合，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂的。本发明的另一个实施例包括一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者开具进一步包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂的组合，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂。
本发明的另一个实施例包括一种使用组合治疗癌症的方法，该组合包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂，其中所述方法进一步包括在处方中列出所述组合并指导需要这种癌症治疗的患者。
本发明的另一个实施例包括一种使用组合用于治疗癌症的方法，所述组合包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂，其中所述方法包括购买所述组合以由需要这种癌症治疗的患者自行施用。
本发明的另一个实施例包括一种治疗癌症的方法，所述方法包括指示需要这种治疗的受试者施用组合，所述组合包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、抗PD-1抑制剂、MEK抑制剂、Pi3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂。
本发明的另一个实施例包括一种治疗癌症的方法，所述方法包括
A]开处方
B]销售或广告销售，
C]购买，
D]指示自我施用，或
E]施用
本文描述的组合，其中该组合已被管理机构批准用于需要癌症治疗的受试者的癌症治疗。
本发明的另一个实施例包括一种提供组合用于治疗癌症的方法，所述组合包含KRASG12C抑制剂与另一种治疗剂，所述另一种治疗剂选自化学治疗剂、PD-1抑制剂、MEK抑制剂、PI3K选择性抑制剂、EGFR抑制剂、TOR抑制剂、SHP2抑制剂或AKT抑制剂，所述方法包括就所述组合的销售向医师、处方师、患者或保险公司补偿。
为了清楚起见，“指示”一词的含义是除通常理解的定义外，还包括监管机构批准的标签上的信息。
附图说明
图1显示了AMG 510与卡铂的组合增强对NCI-H358 NSCLC肿瘤生长的抑制作用。
图2显示了AMG 510与MEK抑制剂PD-325901的组合在NSCLC NCI-H358异种移植模型中导致增强的功效。
图3显示了AMG 510抑制CT-26KRAS p.G12C肿瘤的体内生长。
图4显示了AMG 510与抗PD-1抗体的组合在KRAS p.G12C突变癌症小鼠模型中导致提高的存活率和持久治愈。
图5显示了AMG 510治疗导致CT-26G12C-H10肿瘤中CD8+和CD4+T细胞浸润的增加。
图6显示了AMG 510治疗导致CT-26G12C-H10肿瘤中PD-L1阳性嗜中性粒细胞的增加。
图7显示了加和性过量矩阵标识了协同相互作用的区域。
图8显示了自交叉矩阵模型的实验加和性。
图9示出了AMG 510与RMC-4550(SHP2i)和曲美替尼(MEKi)两者协同作用以在NCI-H358细胞系中实现细胞杀伤。
图10显示了缺乏与阿法替尼或RMC-4550的单一药剂活性在MIA PaCA-2细胞系中可导致更弱的协同作用。
图11显示了3D培养中的组合可能揭示出增强的协同作用。
图12显示了AMG 510X曲美替尼在NCI-H358中具有协同作用。
图13显示了NCI-H358细胞系中的AMG自交。
图14显示了NCI-H358细胞系中的曲美替尼自交。
图15显示了AMG 510X曲美替尼在MIA PaCa-2细胞系中表现出弱协同作用。
图16显示了3D培养改善AMG 510X曲美替尼在MIA PaCa-2中的协同作用。
图17显示了NCI-H1373细胞系中的AMG 510X曲美替尼(3D)。
图18显示了AMG 510X曲美替尼由于每种单一药剂在CT-26KRAS p.G12C中的高功效而表现出弱协同作用。
图19显示了AMG 510X PD-325901在MIA PaCa-2中表现出弱协同作用。
图20显示了AMG 510X阿法替尼在NCI-H358细胞系中具有协同作用。
图21显示了AMG 510X阿法替尼在MIA PaCa-2细胞系中具有弱协同作用。
图22显示了3D培养不能改善AMG 510X阿法替尼在MIA PaCa-2细胞系中的协同作用。
图23显示了NCI-H1373细胞系中的AMG 510X阿法替尼(3D)。
图24显示了AMG 510X阿法替尼在CT-26KRAS p.G12C中具有适度协同作用。
图25显示了AMG 510X拉帕替尼在NCI-H358细胞系中具有协同作用。
图26显示了AMG X厄洛替尼在NCI-H358细胞系中具有适度协同作用。
图27显示了由于缺乏厄洛替尼活性而在MIA PaCa-2细胞系中未观察到AMG 510X厄洛替尼的协同作用。
图28显示了由于缺乏西妥昔单抗体内活性而在SW837中未观察到AMG 510X西妥昔单抗的协同作用。
图29显示了AMG 510X RMC-4550在NCI-H358细胞系中具有协同作用。
图30显示了AMG 510X RMC-4550在MIA PaCa-2细胞系中具有弱协同作用。
图31显示了AMG 510X RMC-4550在CT-26KRAS p.G12C中具有适度协同作用。
图32显示了AMG 510X AMG 511在NCI-H358细胞系中具有适度协同作用。
图33显示了AMG 510X AMG 511在MIA PaCa-2细胞系中具有弱协同作用。
图34显示了AMG 510X AMG 511在CT-26KRAS p.G12C中具有适度协同作用。
图35显示了AMG 510X布帕尼西(BKM120)在NCI-H358细胞系中具有适度协同作用。
图36显示了AMG 510X AZD5363在NCI-H358细胞系中具有弱协同作用。
图37显示了AMG 5120X AZD5363在MIA PaCa-2中具有弱协同作用。
图38显示了AMG 510在2D培养中抑制在CT-26KRAS p.G12C中的KRAS信号传导。
图39显示了小鼠CT-26KRAS p.G12C细胞在3D培养中对AMG510敏感。
图40a显示了与GDP和ARS-1620结合的KRASG12C/C51S/C80L/C118S的X射线共晶结构(PDBID：5V9U)。
图40b显示了分辨率下与GDP和AMG 510结合的KRASG12C/C51S/C80L/C118S的X射线共晶结构(PDB ID：尚未指定)。
图40c显示了在用纯化的KRASG12C/C118A或KRASC118A蛋白进行SOS1催化的核苷酸交换测定中测量的AMG 510和ARS-1620的生化活性，n＝4。
图40d显示了如通过质谱法确定的AMG 510和ARS-1620的动力学特性(n≥2)。
图40e显示了在2小时处理后通过抑制ERK1/2磷酸化测量的AMG 510和ARS-1620在NCI-H358和MIA PaCa-2中的细胞活性(n＝2)。
图40f显示了在2小时处理后在NCI-H358和MIA PaCa-2细胞中AMG 510对ERK磷酸化的抑制作用和对KRASG12C的占用率(n＝3)。
图40g显示了在72小时处理后如通过对细胞活力的影响所测量的AMG 510和ARS-1620在NCI-H358和MIA PaCa-2中的细胞活性(n＝3)。
图40h显示了如通过抑制ERK磷酸化确定的AMG 510和ARS-1620的动力学特性(n≥2)。
图41a显示了用AMG 510的剂量反应处理4或24小时后对NCI-H358或MIA PaCa-2中细胞信号传导的影响。
图41b显示了在长达24小时的时间点用0.1μM AMG 510处理后对NCI-H358或MIAPaCa-2中细胞信号传导的影响。
图41c显示了在2小时处理后如通过抑制ERK1/2磷酸化所测量的AMG 510在一组KRAS p.G12C和非KRAS p.G12C突变细胞系中的细胞活性(n≥2)。
图41d显示了在72小时处理后如通过对细胞活力的影响所测量的AMG 510在一组KRAS p.G12C和非KRAS p.G12C突变细胞系中的细胞活性。
图41e显示了活力剂量响应曲线是至少n＝2个实验的代表性实例。在粘附的单层或球状体培养条件下，用AMG 510处理72小时对细胞活力的影响(n＝2)。
图41f显示了用1μM AMG 510处理4小时后NCI-H358全细胞裂解物的半胱氨酸蛋白质组分析(n＝5)。
图42a-d显示了AMG 510在体内抑制在KRAS p.G12C突变肿瘤中的ERK 1/2磷酸化。对携带MIA PaCa-2 T2(图42a、c、d)或NCI-H358(图42b)的小鼠进行单剂口服媒剂或口服AMG 510(所有其他条)，并在2小时后收获(图42a、b)或按指示随时间收获(图42c、d)，并如通过MSD免疫测定法测量评估p-ERK水平。收集血浆和肿瘤样品，并分析AMG 510浓度(分别为红色三角形，黑色空心圆圈)。将数据表示为相对于媒剂的对照百分比。数据代表平均肿瘤体积±SEM(n＝3/组)。图42a-d，****P<0.0001；*P<0.05，通过邓尼特法(Dunnett’s)。
图42e显示了在携带MIA PaCa-2 T2的小鼠中，与p-ERK抑制相关，使用质谱，在共价修饰KRASG12C的给药方案中的AMG 510治疗结果。
图42f显示了在携带NCI-H358的小鼠中，与p-ERK抑制相关，使用质谱，在共价修饰KRASG12C的给药方案中的AMG 510治疗结果。
图42g显示了在携带MIA PaCa-2 T2的小鼠中，与p-ERK抑制相关，使用质谱，在共价修饰KRASG12C中随时间的AMG 510治疗结果。
图43a显示了向患有已确立的MIA PaCa-2 T2 KRAS p.G12C肿瘤的小鼠给药媒剂或AMG510。AMG 510选择性抑制KRAS p.G12C突变肿瘤的体内生长。
图43b显示了向患有已确立的NCI-H358 KRAS p.G12C肿瘤的小鼠给药媒剂或AMG510。AMG 510选择性抑制KRAS p.G12C突变肿瘤的体内生长。
图43c显示了向患有已确立的CT-26KRAS p.G12C肿瘤的小鼠给药媒剂或AMG510。AMG 510选择性抑制KRAS p.G12C突变肿瘤的体内生长。
图43d显示了在用媒剂或AMG 510治疗的小鼠的KRASG12CNSCLC PDX模型中肿瘤生长的影响。AMG 510选择性抑制KRAS p.G12C突变肿瘤的体内生长。
在图43a、b、c和d中，数据代表平均肿瘤体积±SEM(n＝10/组)。图43a、b和c，****P<0.0001，*P<0.05，用于通过邓尼特法比较媒剂与治疗组，#P<0.05回归配对t检验，和****P<0.0001，通过RM双向ANOVA。
图43e显示了用AMG 510治疗的两名KRAS p.G12C肺癌患者的CT扫描。代表性的治疗前(“基线”)和治疗后)Rx)扫描。最左端：顶图代表肺左上叶，底图代表肺右下叶。最右端：顶图代表肺左上叶；底图代表胸膜。AMG 510选择性抑制KRAS p.G12C突变肿瘤的体内生长。
图43f和图47a展示了向携带CT-26KRAS p.G12C肿瘤的小鼠给药媒剂或AMG 510。来自AMG 510治疗的小鼠(100mg/kg)的单个CT-26KRAS p.G12C肿瘤图。
图43g和图47a图示了向携带CT-26KRAS p.G12C肿瘤的小鼠给药媒剂或AMG 510。来自AMG 510治疗的小鼠(200mg/kg)的单个CT-26KRAS p.G12C肿瘤图。100mg/kg组的继续治疗表明消退不是持久的(图43f)，可能是由于p-ERK的不完全抑制(图47a)。因此，评估了200mg/kg剂量的AMG 510，其几乎完全抑制了p-ERK(图47a)，并导致十个中有八个持久治愈(图43g)，AMG 510血浆水平刚好低于细胞IC90(图47h)。
图44a说明了针对NCI-H358肿瘤异种移植物的AMG 510与卡铂组合。
图44b说明了使用Loewe加和性过量算法计算AMG 510与靶向药剂组合的协同作用得分，并表示为热图，更高得分(更深的红色)表示更强的协同相互作用。
图44c说明了针对NCI-H358肿瘤异种移植物的AMG 510与MEK抑制剂(PD-0325901)组合。
在图44a和c中，数据代表平均肿瘤体积±SEM(n＝10/组)。a***P<0.001，用于通过邓尼特法比较组合治疗与每种单一药剂，#P<0.001，通过配对t检验进行回归。c****P<0.001通过邓尼特法比较组合治疗与每种单一药剂，#P<0.001通过配对t检验进行回归。与媒剂相比，来自所有治疗组的结果均是显著的(****P<0.0001，通过邓尼特法)。
图45a显示了用媒剂、AMG 510、抗PD-1或AMG 510与抗PD-1组合治疗的单个小鼠中CT-26KRAS p.G12C肿瘤的生长(n＝10/组)。带圆圈的线指示无肿瘤的小鼠。
图45b显示了替代存活终点(肿瘤大小>800mm3)的Kaplan Meier分析。与媒剂对照相比，Mantel-Cox****P<0.001；组合与单独的AMG 510或抗PD-1相比，#P<0.005。
图45c显示了来自用媒剂、AMG 510、抗PD-1、AMG 510与抗PD-1组合或MEKi治疗四天的小鼠的CT-26KRAS p.G12C肿瘤，并通过流式细胞术进行了免疫分型(n＝8/组)。与媒剂对照相比，通过图凯法(Tukey’s)，****P<0.0001，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；NS＝不显著。
图45d显示了在治疗两天后从CT-26KRAS p.G12C肿瘤中分离RNA(n＝5/组)。基因表达和得分通过NanoString技术计算(参见方法)。通过图凯法，****P<0.0001，***P<0.001。
图45e显示了如通过流式细胞术测量的在存在或不存在干扰素γ(“IFNγ”)的情况下，在用AMG 510处理24小时后CT-26KRAS p.G12C细胞上MHC I类抗原H-2Kd的细胞表面表达。通过ELISpot测定法测量分泌的IFN-γ水平(n＝4-5/组)。
图45f显示了用AMG 510加上抗PD-1治疗治愈并用CT-26KRAS p.G12C、CT-26或4T1细胞再次激发的小鼠的单个肿瘤生长。
图45g显示收获脾细胞并用所示细胞CT-26、CT-26KRAS p.G12C或4T1细胞激发。通过对照相对于组合的非配对t检验比较，*P＝0.0269。
图45h AMG 510治疗诱导了促炎性肿瘤微环境。通过免疫组织化学(对CD3/Ki67的免疫组织化学染色)对来自用媒剂、AMG 510、抗PD-1、AMG 510与抗PD-1组合或MEKi治疗四天的小鼠的CT-26KRAS p.G12C肿瘤进行免疫分型(n＝5/组)。Ki67免疫阳性染色为蓝色和细胞核，而CD3和CD8免疫阳性染色为棕色和细胞质。h中的箭头指向对CD3和Ki67具有双重免疫阳性的细胞的实例。
图45i AMG 510治疗诱导了促炎性肿瘤微环境，通过免疫组织化学(对CD8的免疫组织化学染色)对来自用媒剂、AMG 510、抗PD-1、AMG 510与抗PD-1组合或MEKi治疗四天的小鼠的CT-26KRAS p.G12C肿瘤进行免疫分型(n＝5/组)。Ki67免疫阳性染色为蓝色和细胞核，而CD3和CD8免疫阳性染色为棕色和细胞质。
图46a显示了如在用纯化的KRASG12C/C118A或KRASC118A蛋白进行的SOS1催化的核苷酸交换测定中测量的AMG 510及其非反应性丙酰胺类似物的生化活性(n≥2)。对于所有图46a-e，数据表示对于所示独立重复数的平均值±SD。
图46b显示了计算的最大反应速率和达到AMG 510和ARS-1620的最大速率一半的浓度。
图46c显示了在NCI-H358细胞中用RMC-4550抑制ERK磷酸化，t1/2＝12.2min(n＝2)。
图46d显示了在MIA PaCa-2和NCI-H1373中，在粘附的单层或球状体培养条件下，用AMG 510处理72小时对细胞活力的影响(n＝2)。
图46e显示了通过在细胞培养中，用/以氨基酸进行稳定的同位素标记(SILAC)在MIA PaCa-2和NCI-H358细胞中，KRAS的半衰期确定。
图47a-c显示了用单剂口服媒剂或指定剂量的口服AMG 510治疗携带CT-26KRASp.G12C肿瘤的小鼠，并在2小时后收获。通过MSD免疫测定法测量p-ERK的水平。收集血浆和肿瘤样品，并分析AMG510浓度(分别为红色三角形，黑色空心圆圈)。将数据表示为相对于媒剂的对照百分比(POC)。****P<0.0001，*P<0.05，与媒剂相比，通过邓尼特法。
图47d显示了与p-ERK抑制成反比的KRASG12C共价修饰中的AMG 510治疗结果。
图47e显示了在SW480-1AC异种移植模型中AMG 510对肿瘤生长的影响。
图47f显示了在KRASG12C SCLC PDX模型中，AMG 510治疗对肿瘤生长的影响。在图47e和f中，当肿瘤达到约200mm3时开始治疗。****P<0.0001，通过RM双向ANOVA。
图47g显示了来自MIA PaCa-2 T2，NCI-H358异种移植物的AMG510的血浆水平。
图47h显示了来自CT-26KRAS p.G12C异种移植物的AMG 510的血浆水平。
图47i显示了从第14天到第32天，在BALB/c裸小鼠中AMG 510治疗的小鼠(200mg/kg)的单个CT-26KRAS p.G12C肿瘤图。
图47j显示了用AMG 510治疗的两名KRAS p.G12C肺癌患者的CT扫描。来自先前在图43d中描述的患者的其他代表性治疗前(“基线”)和治疗后(Rx)扫描(最左端从上至下)肺左上叶、肺左下叶、淋巴结、肺左上叶、肺左上叶。最右端从上至下，肺左下叶、肺左下叶、胸膜和肾上腺。
图47k说明了针对NCI-H358肿瘤异种移植物的作为单一药剂或与卡铂组合的AMG510。****P<0.0001，与媒剂对照相比，通过邓尼特法，#P<0.001，通过配对t检验进行回归。
图48显示了在指定的细胞系中与靶向药剂组合给药的AMG 510的生长抑制矩阵和Loewe加和性过量，更深的颜色表示更大的细胞杀伤(生长抑制)和更强的协同相同作用(Loewe过量)。列出了每种组合中测试的抑制剂的最大浓度和矩阵覆盖的剂量范围。通过将其各自的协同作用得分与其组分自交(AxA或BxB)的协同作用得分进行比较来评估单个异源组合(AxB)。仅当异源组合的协同作用得分超过任一组分自交的协同作用得分的三倍时，才认为它们具有协同作用。
图49a显示了如通过在2小时处理后对ERK1/2磷酸化的抑制测量的AMG 510和MEK抑制剂曲美替尼在CT-26KRAS p.G12C和亲代CT-26细胞系中的细胞活性(n≥2)。
图49b显示了在球状体培养中如通过在72小时处理后对细胞活力的影响所测量的AMG 510和MEK抑制剂曲美替尼在CT-26KRAS p.G12C和亲代CT-26细胞系中的细胞活性(n＝2)。
图50a显示了来自用媒剂、AMG 510、抗PD-1、AMG 510加抗PD-1、或MEKi治疗四天的小鼠的CT-26KRAS p.G12C肿瘤，并通过流式细胞术进行了免疫分型(n＝8/组)。
图50b显示了用单剂口服媒剂(黑条)或指示剂量的口服MEKi(蓝条)治疗携带CT-26KRAS p.G12C肿瘤的小鼠，并在2小时后收获。通过MSD免疫测定法测量p-ERK的水平。收集血浆和肿瘤样品并分析MEKi浓度(分别为红色三角形，黑色空心圆圈)。将数据表示为相对于媒剂的对照百分比(POC)。
图50c显示了在携带CT-26KRAS p.G12C肿瘤的小鼠中测量了MEKi治疗对肿瘤生长随时间的影响。数据代表平均肿瘤体积±SEM(n＝10/组)。
图50d显示了用媒剂、AMG 510、抗PD-1、AMG 510加抗PD-1、或MEKi治疗四天的携带CT-26KRAS p.G12C肿瘤的小鼠中的肿瘤体积。数据代表平均肿瘤体积±SEM(n＝8/组)。
图50e显示了治疗两天后从CT-26KRAS p.G12C肿瘤分离RNA。基因表达和得分通过NanoString技术计算(n＝5/组)。
图50f显示了如通过流式细胞术测量的在存在或不存在IFNγ的情况下，在用AMG510处理24小时后，CT-26KRAS p.G12C细胞上MHC I类抗原(H-2Dd和H-2Ld)的细胞表面表达。
图50g显示了携带CT-26或CT-26KRAS p.G12C肿瘤的Balb/c小鼠的生长曲线。
图50h显示了用AMG 510或MEKi对亲代CT-26或CT-26KRAS p.G12C细胞处理24小时后，对CXCL10或CXCL11转录本以及分泌的IP-10蛋白的定量。
图50i显示了如通过流式细胞术测量的在存在或不存在IFNγ的情况下，在用SW-1573处理24小时后，在处理48小时后，CT-26KRAS p.G12C细胞上，以及在用AMG 510处理48小时后，MIA PaCA-2上MHC I类抗原(HLA、H-2Dd和H-2Kd)的细胞表面表达。
在图50a、b、c和e中，*P<0.05，相对于媒剂对照，通过图凯法；NS是不显著的；***P<0.001，与媒剂相比，通过邓尼特法；和****P<0.0001，与媒剂对照相比，通过邓尼特法。
具体实施方式
本发明提供了包含KRASG12C抑制剂和一种或多种其他药学活性药剂的组合疗法，其特别用于治疗癌症。本发明还涉及用于治疗癌症的含有KRASG12C抑制剂和一种或多种其他药学活性药剂的药物组合物。本文所披露的化合物包括所有药学上可接受的同位素标记的化合物，其中本文所披露的化合物的一个或多个原子由具有相同原子序数、但原子质量或质量数与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子替代。可掺入所披露化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，例如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I和125I。这些放射性标记的化合物可用于帮助通过表征例如作用位点或方式，或与药理学上重要的作用位点的结合亲和性，来确定或测量化合物的有效性。本披露的某些同位素标记的化合物(例如，那些掺入放射性同位素的化合物)可用于药物和/或底物组织分布研究中。鉴于易于掺入以及即用的检测方式，放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)尤其可用于这个目的。
用较重同位素(例如氘，即2H)取代可以提供源自较高代谢稳定性的某些治疗优势(例如，延长的体内半衰期或降低的剂量要求)，并且因此在一些情况下是优选的。
用正电子发射同位素(例如11C、18F、15O和13N)取代可用于正电子发射断层扫描(PET)研究，以检查底物受体占有率。结构(I)的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术，或者通过与如下文所述的制备和实例(Preparations andExamples)中所述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前采用的未经标记的试剂来制备。
如本文所披露的同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术，或者通过与所附实例和方案中所述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前采用的未经标记的试剂来制备。
如本文所披露的某些化合物可以作为立体异构体(即，只有原子的空间排布不同的异构体)存在，包括光学异构体和构象异构体(或构象体)。本文所披露的化合物包括作为纯的个别立体异构体制剂和每一种的富集制剂的所有立体异构体、以及此类立体异构体的外消旋混合物以及可以根据本领域技术人员已知的方法分离的个别非对映异构体和对映异构体。另外，本文所披露的化合物包括这些化合物的所有互变异构体形式。
某些本文所披露的化合物可以作为阻转异构体存在，其为在由于与分子其他部分的空间相互作用，围绕分子中单键的旋转被阻止或大大减慢时出现的构象立体异构体。本文所披露的化合物包括作为纯的个别阻转异构体制剂、每一种的富集制剂或者每一种的非特定混合物的所有阻转异构体。如果围绕单键的旋转势垒足够高，并且构象之间的互变足够缓慢，那么可以容许异构体种类的分离和分开。异构体种类的分离和分开通过熟知并且广为接受的符号“M”或“P”适当表示。
在另一实施例中，这些化合物可以在制备本申请的化合物的方法中用作中间体。
在另一实施例中，这些化合物可以呈药学上可接受的盐的形式并且在与药学上可接受的赋形剂的药物配制品中。
本文还提供了药物组合物，这些药物组合物包含如本文所披露的化合物以及药学上可接受的赋形剂，例如稀释剂或载体。适合用于本发明的化合物和药物组合物包括能以有效量施用化合物以实现其既定目的的那些。化合物的施用更详细地描述于下文中。
在另一实施例中，这些化合物可以在制备本申请的化合物的方法中用作中间体。
在另一实施例中，这些化合物可以呈药学上可接受的盐的形式并且在与药学上可接受的赋形剂的药物配制品中。
本文还提供了药物组合物，这些药物组合物包含如本文所披露的化合物以及药学上可接受的赋形剂，例如稀释剂或载体。适合用于本发明的化合物和药物组合物包括能以有效量施用化合物以实现其既定目的的那些。化合物的施用更详细地描述于下文中。
适合的药物配制品可以由技术人员根据施用途径和所需剂量来决定。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],1435-712(第18版，宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司(Mack Publishing Co,Easton,Pennsylvania)，1990)。配制品可以影响所施用药剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。取决于施用途径，可以根据体重、体表面积或器官尺寸来计算适合的剂量。本领域普通技术人员在不进行过度实验的情况下，尤其根据本文所披露的剂量信息和测定以及可通过动物或人类临床试验获得的药物代谢动力学数据，以常规方式进行决定适当治疗剂量所需计算的进一步细化。
短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指在施用于动物或人类时不产生不良反应、过敏反应或其他不利反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类赋形剂用于药学活性物质的使用是本领域所熟知的。除非任何常规介质或药剂与治疗组合物不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。还可以将补充性活性成分掺入组合物中。在示例性实施例中，配制品可以包含玉米糖浆固体、高油酸红花油、椰子油、大豆油、L-亮氨酸、磷酸三钙、L-酪氨酸、L-脯氨酸、乙酸L-赖氨酸、DATEM(乳化剂)、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸、磷酸氢二钾、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺一水合物、L-丝氨酸、柠檬酸钾、L-苏氨酸、柠檬酸钠、氯化镁、L-组氨酸、L-甲硫氨酸、抗坏血酸、碳酸钙、L-谷氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐、L-色氨酸、L-天冬氨酸、氯化胆碱、牛磺酸、m-肌醇、硫酸亚铁、抗坏血酸棕榈酸酯、硫酸锌、L-肉碱、α-生育酚乙酸酯、氯化钠、烟酰胺、混合生育酚、泛酸钙、硫酸酮、氯化硫胺素盐酸盐、维生素A棕榈酸酯、硫酸锰、核黄素、盐酸吡哆辛、叶酸、β-胡萝卜素、碘化钾、叶绿醌、生物素、硒酸钠、氯化铬、钼酸钠、维生素D3和氰钴胺。
化合物可以作为药学上可接受的盐存在于药物组合物中。如本文所用，“药学上可接受的盐”包括例如碱加成盐和酸加成盐。
药学上可接受的碱加成盐可以用金属或胺(例如碱金属和碱土金属或有机胺)来形成。化合物的药学上可接受的盐也可以用药学上可接受的阳离子来制备。适合的药学上可接受的阳离子是本领域技术人员所熟知的并且包括碱金属阳离子、碱土金属阳离子、铵阳离子和季铵阳离子。碳酸盐或碳酸氢盐也是可能的。用作阳离子的金属的实例是钠、钾、镁、铵、钙或三价铁等。适合的胺的实例包括异丙胺、三甲胺、组氨酸、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
药学上可接受的酸加成盐包括无机酸盐或有机酸盐。适合的酸盐的实例包括盐酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、硝酸盐、磷酸盐。其他适合的药学上可接受的盐是本领域技术人员所熟知的并且包括例如甲酸、乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸或扁桃酸、盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸；与有机羧酸、磺酸、磺酸基酸或磷酸基酸或N-取代的氨基磺酸，例如乙酸、三氟乙酸(TFA)、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、草酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、扑酸、烟酸或异烟酸的盐；以及与氨基酸，例如在自然界中参与蛋白质合成的20种α氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸，以及与苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷1,2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘2-磺酸、萘1,5-二磺酸、2-磷酸甘油酸或3-磷酸甘油酸、葡萄糖6-磷酸、N-环己基氨基磺酸(用于环己氨磺酸盐的形成)，或与其他酸性有机化合物，例如抗坏血酸的盐。
含有本文所披露的化合物的药物组合物能以常规方式来制造，例如通过常规混合、溶解、造粒、糖衣丸制备、磨细、乳化、囊封、捕集或冻干方法。适当的配制品取决于所选的施用途径。
对于口服施用，可以通过将本文所披露的化合物与本领域熟知的药学上可接受的赋形剂(例如载体)组合来容易地配制适合的组合物。此类赋形剂和载体使得能将本发明化合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供要治疗的患者口服摄食。用于口服使用的药物制剂可以通过以下方式来获得：向如本文所披露的化合物添加固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并且在添加适合的辅助剂后(如果需要)加工颗粒混合物，获得片剂或糖衣丸核心。适合的赋形剂包括例如填充剂和纤维素制剂。如果需要，可以添加崩解剂。用于各种类型的配制品的药学上可接受的成分是熟知的，并且可以是例如用于各种配制品类型的粘合剂(例如，天然或合成聚合物)、润滑剂、表面活性剂、甜味和矫味剂、包衣材料、防腐剂、染料、增稠剂、佐剂、抗微生物剂、抗氧化剂和载体。
在口服施用治疗有效量的本文所披露的化合物时，组合物通常呈固体(例如，片剂、胶囊、丸剂、粉末或糖锭)或液体配制品(例如，水性悬浮液、溶液、酏剂或糖浆)的形式。
在以片剂形式施用时，组合物可以另外含有功能性固体和/或固体载体，例如明胶或佐剂。片剂、胶囊和粉末可以含有约1％至约95％化合物，并且优选地约15％至约90％化合物。
在以液体或悬浮液形式施用时，可以添加功能性液体和/或液体载体，例如水、石油或动物或植物来源的油。组合物的液体形式可以进一步含有生理盐水溶液、糖醇溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇。在以液体或悬浮液形式施用时，组合物可以含有以重量计约0.5％至约90％的本文所披露的化合物，并且优选地约1％至约50％的本文所披露的化合物。在考虑到的一个实施例中，液体载体是非水性的或基本上非水性的。对于以液体形式施用，组合物可以作为快速溶解的固体配制品来供应，用于在即将施用前溶解或悬浮。
在通过静脉内、经皮肤或皮下注射施用治疗有效量的本文所披露的化合物时，组合物呈无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。此类肠胃外可接受的溶液的制备应充分考虑pH、等渗性、稳定性等，是在本领域技术范围的。除了本文所披露的化合物以外，用于静脉内、经皮肤或皮下注射的优选组合物通常含有等渗媒剂。此类组合物可以经制备用于作为与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的游离碱或药理学上可接受的盐于水中的溶液来施用。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散液。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可以任选地含有防腐剂以防止微生物生长。
可注射组合物可以包括无菌水性溶液、悬浮液或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液、悬浮液或分散液的无菌粉末。在所有实施例中，该形式必须是无菌的，并且流动性必须达到存在易可注射性的程度。其必须在制造和储存条件下稳定，并且必须通过任选地包括防腐剂来抵抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物以及植物油。在考虑到的一个实施例中，载体是非水性的或基本上非水性的。适当流动性可以例如通过以下方式来保持：通过使用包衣，例如卵磷脂；在分散液的实施例中通过保持化合物的所需粒径；以及通过使用表面活性剂。对微生物作用的防止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多实施例中，包括等渗剂(例如，糖或氯化钠)将是优选的。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用吸收延迟剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液通过以下方式来制备：将活性化合物以所需量掺入视需要含有上文所列举的各种其他成分的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，分散液通过以下方式来制备：将各种经灭菌活性成分掺入无菌媒剂中，该媒剂含有基础分散介质和来自上文所列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的实施例中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分加来自其预先经无菌过滤的溶液的任何所需的其他成分的粉末。
还可以制备缓慢释放或持续释放配制品，以实现在胃肠道中与体液接触的活性化合物的受控释放，并且在血浆中提供基本上恒定且有效的活性化合物水平。例如，可以通过溶解、扩散和离子交换中的一种或多种来控制释放。另外，缓慢释放方法可以通过胃肠道内的可饱和或限制通路促进吸收。例如，出于这个目的，可以将化合物包埋于生物可降解聚合物、水溶性聚合物或二者的混合物以及任选地适合的表面活性剂的聚合物基质中。在这种情况下，包埋可以意指在聚合物基质中掺入微粒。还通过经由已知的分散液或乳液包衣技术囊封经分散的微粒或经乳化的微滴来获得受控释放配制品。
对于通过吸入施用，本发明的化合物便捷地以气溶胶喷雾剂呈递的形式从加压包装或雾化器使用适合的推进剂来递送。在加压气溶胶的实施例中，可以通过提供阀来确定剂量单位，以递送经计量的量。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可以经配制含有化合物与适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文所披露的化合物可以经配制用于通过注射(例如，通过推注或连续输注)肠胃外施用。注射用配制品能以单位剂型(例如，于安瓿中或于多剂量容器中)呈现，并添加有防腐剂。组合物可以采取例如以下等形式：于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物配制品包括呈水溶性形式的化合物的水溶液。另外，可以将化合物的悬浮液制备为适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒剂包括脂肪油或合成脂肪酸酯。水性注射悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质。任选地，悬浮液还可以含有适合的稳定剂或提高化合物的溶解度并允许制备高度浓缩的溶液的试剂。可替代地，本发明组合物可以呈粉末形式以供在使用前用适合的媒剂(例如，无菌无热原水)构造。
本文所披露的化合物还可以配制于直肠组合物中，例如栓剂或滞留型灌肠剂(例如，含有常规栓剂基质)。除了先前所述的配制品以外，还可以将化合物配制为长效制剂。此类长效配制品可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，化合物可以用适合的聚合或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，或作为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)来配制。
特别地，本文所披露的化合物能以含有赋形剂(例如淀粉或乳糖)的片剂的形式，或以单独的或与赋形剂混合的胶囊或珠囊(ovule)，或以含有矫味剂或着色剂的酏剂或悬浮液的形式，口服、经颊或舌下施用。此类液体制剂可以用药学上可接受的添加剂(例如悬浮剂)来制备。还可以肠胃外注射化合物，例如静脉内、肌内、皮下或冠状动脉内。对于肠胃外施用，化合物最佳地以无菌水溶液的形式来使用，其可以含有其他物质，例如盐或糖醇(例如甘露醇)或葡萄糖，以使溶液与血液等渗。
对于兽用，本文所披露的化合物根据正规兽医实践作为适合地可接受的配制品来施用。兽医可以容易地确定对于特定动物最适合的给药方案和施用途径。
在一些实施例中，可以将用于使用如本文所披露的化合物(单独的或与传统地用于治疗这种疾病的另一种药剂或干预组合的)治疗KRAS相关障碍的所有所需组分包装至试剂盒中。具体地，本发明提供了用于疾病的治疗干预的试剂盒，该试剂盒包含经包装的成套药物，包括本文所披露的化合物以及用于制备所述药物的可递送形式的缓冲剂和其他组分；和/或用于递送此类药物的装置；和/或用于与本文所披露的化合物的组合疗法的任何药剂；和/或与药物一起包装的疾病治疗说明书。说明书可以固定于任何可触摸介质中，例如印刷纸张、或计算机可读取的磁性或光学介质、或参考远程计算机数据源的说明，例如可通过互联网访问的万维网网页。
“治疗有效量”意指有效治疗或预防所治疗受试者的已有症状的发展或减轻已有症状的量。尤其根据本文所提供的详细披露，有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。通常，“治疗有效剂量”是指导致实现所需效果的化合物的量。例如，在一个优选实施例中，与对照相比，治疗有效量的本文所披露的化合物将KRAS活性降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
所施用的化合物的量可以取决于所治疗的受试者、受试者的年龄、健康状况、性别和体重、并行治疗(如果有)的种类、病情的严重程度、所需效果的性质、治疗的方式和频率以及开处方医师的判断。给药频率还可以取决于对动脉氧分压的药效学作用。然而，可以根据个别受试者调整最优选的剂量，如本领域技术人员所理解并且不经过度实验即可确定的。这通常包括调整标准剂量(例如，如果患者体重低，那么减小剂量)。
虽然个体需求不同，但化合物的有效量的最佳范围的确定是在本领域技术范围的。对于在本文所鉴别的病症和障碍的治愈性或预防性治疗中施用人类，例如，本发明的化合物的典型剂量可以是约0.05mg/kg/天至约50mg/kg/天，例如至少0.05mg/kg、至少0.08mg/kg、至少0.1mg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.4mg/kg或至少0.5mg/kg，并且优选地50mg/kg或更少、40mg/kg或更少、30mg/kg或更少、20mg/kg或更少或10mg/kg或更少，例如，其可以是约2.5mg/天(0.5mg/kg x 5kg)至约5000mg/天(50mg/kg x 100kg)。例如，化合物的剂量可以是约0.1mg/kg/天至约50mg/kg/天、约0.05mg/kg/天至约10mg/kg/天、约0.05mg/kg/天至约5mg/kg/天、约0.05mg/kg/天至约3mg/kg/天、约0.07mg/kg/天至约3mg/kg/天、约0.09mg/kg/天至约3mg/kg/天、约0.05mg/kg/天至约0.1mg/kg/天、约0.1mg/kg/天至约1mg/kg/天、约1mg/kg/天至约10mg/kg/天、约1mg/kg/天至约5mg/kg/天、约1mg/kg/天至约3mg/kg/天、约1mg/天至约1000mg/天、约20mg/天至约750mg/天、约3mg/天至约500mg/天、约5mg/天至约250mg/天、约10mg/天至约100mg/天、约3mg/天至约10mg/天或约100mg/天至约250mg/天。此类剂量能以单一剂量来施用，或者可以将其分为多个剂量。
使用KRASG12C抑制剂的方法
本披露提供了抑制RAS介导的细胞信号传导的方法，所述方法包括使细胞与有效量的一种或多种本文所披露的化合物接触。对RAS介导的信号转导的抑制可以通过本领域已知的众多种方式来评估和证实。非限制性实例包括显示以下项：(a)RAS的GTP酶活性的降低；(b)GTP结合亲和性的降低或GDP结合亲和性的增加；(c)GTP的K解离的增加或GDP的K解离的减小；(d)RAS途径中下游的信号传导转导分子水平的降低，例如pMEK、pERK或pAKT水平的降低；和/或(e)RAS复合物与下游信号传导分子(包括但不限于Raf)的结合的降低。可以利用试剂盒和市售测定来确定上述项中的一种或多种。
本披露还提供了使用本披露的化合物或药物组合物治疗疾病病症的方法，这些疾病病症包括但不限于受累于G12C KRAS、HRAS或NRAS突变的病症(例如，癌症)。
在一些实施例中，提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的任一种包含如本文所披露的化合物的前述药物组合物。在一些实施例中，癌症是由KRAS、HRAS或NRAS G12C突变介导的。在各个实施例中，癌症是胰腺癌、结直肠癌或肺癌。在一些实施例中，癌症是胆囊癌、甲状腺癌和胆管癌。
在一些实施例中，本披露提供了治疗有需要的受试者的障碍的方法，其中所述方法包括确定受试者是否具有KRAS、HRAS或NRAS G12C突变，以及如果确定受试者具有KRAS、HRAS或NRAS G12C突变，那么向受试者施用治疗有效剂量的至少一种如本文所披露的化合物或其药学上可接受的盐。
所披露化合物抑制非锚定依赖性细胞生长，并且因此具有抑制肿瘤转移的潜力。因此，本披露的另一个实施例提供了抑制肿瘤转移的方法，所述方法包括施用有效量的本文所披露的化合物。
还已经在血液恶性肿瘤(例如，影响血液、骨髓和/或淋巴结的癌症)中鉴别出KRAS、HRAS或NRAS G12C突变。因此，某些实施例涉及将所披露化合物(例如，呈药物组合物形式)施用需要治疗血液恶性肿瘤的患者。此类恶性肿瘤包括但不限于白血病和淋巴瘤。例如，当前所披露的化合物可以用于治疗诸如以下等疾病：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)和/或其他白血病。在其他实施例中，这些化合物可用于治疗淋巴瘤，例如所有亚型的霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在各个实施例中，这些化合物可用于治疗浆细胞恶性肿瘤，例如多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症。
确定肿瘤或癌症是否包含G12C KRAS、HRAS或NRAS突变可以通过评估编码KRAS、HRAS或NRAS蛋白的核苷酸序列，通过评估KRAS、HRAS或NRAS蛋白的氨基酸序列，或通过评估推定的KRAS、HRAS或NRAS突变体蛋白的特征来进行。野生型人类KRAS、HRAS或NRAS的序列是本领域已知的(例如，登录号NP203524)。
检测KRAS、HRAS或NRAS核苷酸序列中的突变的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括但不限于聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)测定、聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)测定、实时PCR测定、PCR测序、突变体等位基因特异性PCR扩增(MASA)测定、直接测序、引物延伸反应、电泳、寡核苷酸连接测定、杂交测定、TaqMan测定、SNP基因分型测定、高分辨率熔解测定和微阵列分析。在一些实施例中，通过实时PCR针对G12C KRAS、HRAS或NRAS突变评估样品。在实时PCR中，使用对KRAS、HRAS或NRAS G12C突变具特异性的荧光探针。在突变存在时，探针结合并检测到荧光。在一些实施例中，使用KRAS、HRAS或NRAS基因中的特定区域(例如，外显子2和/或外显子3)的直接测序方法来鉴别KRAS、HRAS或NRAS G12C突变。这种技术将鉴别所测序区域中所有可能的突变。
检测KRAS、HRAS或NRAS蛋白中的突变的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括但不限于使用对突变体蛋白具特异性的结合剂(例如，抗体)检测KRAS、HRAS或NRAS突变体、蛋白质电泳和蛋白质印迹法、以及直接肽测序。
确定肿瘤或癌症是否包含G12C KRAS、HRAS或NRAS突变的方法可以使用多种样品。在一些实施例中，样品取自患有肿瘤或癌症的受试者。在一些实施例中，样品是新鲜肿瘤/癌症样品。在一些实施例中，样品是冷冻肿瘤/癌症样品。在一些实施例中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋的样品。在一些实施例中，样品是循环肿瘤细胞(CTC)样品。在一些实施例中，将样品加工为细胞裂解物。在一些实施例中，将样品加工为DNA或RNA。
本披露还涉及治疗哺乳动物的过度增生障碍的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的如本文所披露的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，所述方法涉及治疗患有癌症的受试者，该癌症是例如急性髓样白血病、青少年癌症、儿童肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症(例如，淋巴瘤和卡波西肉瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干细胞神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、非典型畸胎样瘤、胚胎瘤、胚细胞瘤、原发性淋巴瘤、宫颈癌、儿童癌症、脊索瘤、心脏肿瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性障碍、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、肝外导管原位癌(DCIS)、胚胎瘤、CNS癌症、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文肉瘤、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、眼癌、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、胚细胞瘤、妊娠滋养细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌症、肝癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肾癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、肝癌、小叶原位癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、转移性伴隐匿性原发性鳞状颈癌、中线癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、脊髓发育不良/骨髓增生肿瘤、多发性骨髓瘤、梅克尔细胞癌、恶性间皮瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、口癌、嘴唇和口腔癌、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、皮肤癌、胃(stomach/gastric)癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养细胞瘤、儿童罕见癌症、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌或病毒诱发的癌症。在一些实施例中，所述方法涉及治疗非癌性过度增生障碍，例如皮肤的良性增生(例如，银屑病)、再狭窄或前列腺(例如，良性前列腺肥大(BPH))。
在一些实施例中，治疗方法涉及治疗肺癌，这些方法包括向有此需要的受试者施用有效量的任一种上述化合物(或包含该化合物的药物组合物)。在某些实施例中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，例如腺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌。在一些实施例中，肺癌是小细胞肺癌。可用所披露化合物治疗的其他肺癌包括但不限于腺瘤、类癌瘤和未分化癌。
本披露进一步提供了调节G12C突变体KRAS、HRAS或NRAS蛋白活性的方法，其通过使该蛋白质与有效量的本披露的化合物接触来进行。调节可以是抑制或激活蛋白质活性。在一些实施例中，本披露提供了抑制蛋白质活性的方法，其通过使G12C突变体KRAS、HRAS或NRAS蛋白与有效量的本披露的化合物在溶液中接触来进行。在一些实施例中，本披露提供了抑制G12C突变体KRAS、HRAS或NRAS蛋白活性的方法，其通过接触表达感兴趣的蛋白质的细胞、组织或器官来进行。在一些实施例中，本披露提供了在包括但不限于啮齿动物和哺乳动物(例如，人类)的受试者中抑制蛋白质活性的方法，其通过向该受试者施用有效量的本披露的化合物来进行。在一些实施例中，调节百分比超过25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，抑制百分比超过25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施例中，本披露提供了抑制细胞中的KRAS、HRAS或NRAS G12C活性的方法，其通过使所述细胞与一定量的本披露的化合物接触来进行，该量足以抑制所述细胞中KRAS、HRAS或NRAS G12C的活性。在一些实施例中，本披露提供了抑制组织中的KRAS、HRAS或NRAS G12C活性的方法，其通过使所述组织与一定量的本披露的化合物接触来进行，该量足以抑制所述组织中KRAS、HRAS或NRAS G12C的活性。在一些实施例中，本披露提供了抑制生物体中的KRAS、HRAS或NRAS G12C活性的方法，其通过使所述生物体与一定量的本披露的化合物接触来进行，该量足以抑制所述生物体中KRAS、HRAS或NRAS G12C的活性。在一些实施例中，本披露提供了抑制动物中的KRAS、HRAS或NRAS G12C活性的方法，其通过使所述动物与一定量的本披露的化合物接触来进行，该量足以抑制所述动物中KRAS、HRAS或NRAS G12C的活性。在一些实施例中，本披露提供了抑制哺乳动物中的KRAS、HRAS或NRAS G12C活性的方法，其通过使所述哺乳动物与一定量的本披露的化合物接触来进行，该量足以抑制所述哺乳动物中KRAS、HRAS或NRAS G12C的活性。在一些实施例中，本披露提供了抑制人类中的KRAS、HRAS或NRAS G12C活性的方法，其通过使所述人类与一定量的本披露的化合物接触来进行，该量足以抑制所述人类中KRAS、HRAS或NRAS G12C的活性。本披露提供了治疗需要这种治疗的受试者的由KRAS、HRAS或NRAS G12C活性介导的疾病的方法。
组合疗法
本披露还提供了用于组合疗法的方法，其中将已知可调节其他途径或相同途径的其他组分的药剂，或甚至靶标酶的重叠组与本披露的化合物或其药学上可接受的盐组合使用。在一方面，这种疗法包括但不限于本披露的一种或多种化合物与化学治疗剂、治疗性抗体和辐射治疗的组合，以提供协同或累加的治疗效果。
许多化学治疗剂目前是本领域已知的，并且可以与本披露的化合物组合使用。本披露的化合物或药物组合物可以与至少一种或多种化学治疗剂组合使用。在一些实施例中，化学治疗剂选自由以下组成的组：有丝分裂抑制剂、烷基化剂、抗代谢药、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应修饰剂、抗激素药、血管发生抑制剂和抗雄激素。非限制性实例是化学治疗剂、细胞毒性剂和非肽小分子，例如(甲磺酸伊马替尼)、(卡非佐米(carfilzomib))、(硼替佐米)、Casodex(比卡鲁胺)、(吉非替尼)、VenclextaTM(维纳妥拉)和AdriamycinTM(多柔比星)以及多种化学治疗剂。化学治疗剂的非限制性实例包括烷基化剂，例如噻替派和环磷酰胺(CytoxanTM)；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、CasodexTM、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(azacitidine)、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷，雄激素例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；倍曲布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加赛特辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉酚和多西他赛；视黄酸；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
作为适合的化学治疗性细胞调理剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素药，包括例如他莫昔芬(NolvadexTM)、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素药，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；喜树碱-11(CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)。
如果需要，本披露的化合物或药物组合物可以与通常开具的抗癌药物组合使用，例如 ABVD、阿维金(AVICINE)、阿巴伏单抗(Abagovomab)、吖啶羧酰胺(Acridine carboxamide)、阿德木单抗(Adecatumumab)、17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、阿法雷丁(Alpharadin)、阿瓦昔地(Alvocidib)、3-氨基吡啶-2-甲醛氨基硫脲、氨萘非特(Amonafide)、蒽二酮(Anthracenedione)、抗CD22免疫毒素、抗肿瘤药、抗肿瘤发生草药(Antitumorigenic herbs)、阿帕兹醌(Apaziquone)、阿替莫德(Atiprimod)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、贝洛替康(Belotecan)、苯达莫司汀(Bendamustine)、BIBW 2992、比立考达(Biricodar)、伯斯塔利辛(Brostallicin)、苔藓抑素(Bryostatin)、丁硫氨酸亚砜胺(Buthionine sulfoximine)、CBV(化学疗法)、花萼海绵诱癌素(Calyculin)、细胞周期非特异性抗肿瘤剂、二氯乙酸、圆皮海绵内酯(Discodermolide)、依沙芦星(Elsamitrucin)、依诺他滨(Enocitabine)、埃博霉素(Epothilone)、艾日布林(Eribulin)、依维莫司(Everolimus)、依沙替康(Exatecan)、依昔舒林(Exisulind)、铁锈醇(Ferruginol)、氟罗德辛(Forodesine)、磷雌酚(Fosfestrol)、ICE化学治疗方案、IT-101、伊美克(Imexon)、咪喹莫特(Imiquimod)、吲哚并咔唑(Indolocarbazole)、伊罗夫文(Irofulven)、拉尼喹达(Laniquidar)、拉洛他赛(Larotaxel)、来那度胺(Lenalidomide)、硫蒽酮(Lucanthone)、勒托替康(Lurtotecan)、马磷酰胺(Mafosfamide)、米托唑胺(Mitozolomide)、萘福昔定(Nafoxidine)、奈达铂(Nedaplatin)、奥拉帕尼(Olaparib)、沃塔紫杉醇(Ortataxel)、PAC-1、木瓜(Pawpaw)、匹杉琼(Pixantrone)、蛋白酶体抑制剂、蝴蝶霉素(Rebeccamycin)、瑞喹莫德(Resiquimod)、鲁比特康(Rubitecan)、SN-38、盐孢菌酰胺A(Salinosporamide A)、沙帕他滨(Sapacitabine)、斯坦福V(Stanford V)、苦马豆素(Swainsonine)、他拉泊芬(Talaporfin)、塔利喹达(Tariquidar)、优福定(Tegafur-uracil)、特莫多(Temodar)、替司他赛(Tesetaxel)、四硝酸三铂(Triplatin tetranitrate)、三(2-氯乙基)胺、曲沙他滨(Troxacitabine)、乌拉莫司汀(Uramustine)、瓦帝莫泽(Vadimezan)、长春氟宁(Vinflunine)、ZD6126或唑喹达(Zosuquidar)。
本披露进一步涉及使用本文所提供的化合物或药物组合物与放射疗法的组合在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗过度增生障碍的方法。施用放射疗法的技术是本领域已知的，并且这些技术可以用于本文所述的组合疗法中。这种组合疗法中本披露的化合物的施用可以如本文所述来确定。
放射疗法可以通过若干种方法之一或方法的组合来施用，包括但不限于外射束疗法、内放射疗法、植入物放射、立体定位性放射外科手术、全身放射疗法、放射疗法和永久性或临时性间质近距离放射疗法。如本文所用，术语“近距离放射疗法”是指通过空间受限的放射性材料递送的放射疗法，该放射性材料是在肿瘤或其他增生性组织患病位点处或附近插入体内的。该术语意图不受限制地包括暴露于放射性同位素(例如，At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32和Lu的放射性同位素)。用作本披露的细胞调理剂的适合的放射源包括固体和液体。通过非限制性实例，放射源可以是放射性核素，例如作为固体来源的I-125、I-131、Yb-169、Ir-192，作为固体来源的I-125，或发射光子、β粒子、γ辐射或其他治疗性射线的其他放射性核素。放射性材料还可以是从一种或多种放射性核素的任何溶液(例如，I-125或I-131的溶液)制备的流体，或者放射性流体可以使用含有固体放射性核素(例如Au-198、Y-90)的小颗粒的适合的流体的浆液产生。此外，可以将一种或多种放射性核素包埋于凝胶或放射性微球中。
本披露的化合物或药物组合物可以与一定量的一种或多种选自以下的物质组合使用：化学治疗剂、抗血管发生剂、信号转导抑制剂、抗增殖剂、糖酵解抑制剂或自体吞噬抑制剂。
抗血管发生剂可以结合本披露的化合物和本文所述的药物组合物使用，这些抗血管发生剂是例如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂和COX-11(环氧酶11)抑制剂。抗血管发生剂包括例如雷帕霉素、替西罗莫司(temsirolimus，CCI-779)、依维莫司(RAD001)、索拉非尼、舒尼替尼和贝伐单抗。有用COX-II抑制剂的实例包括阿来昔布(alecoxib)、伐地昔布和罗非昔布。有用基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述于以下专利中：WO 96/33172、WO 96/27583、欧洲专利公开案EP 0818442、欧洲专利公开案EP1004578、WO 98/07697、WO 98/03516、WO 98/34918、WO 98/34915、WO 98/33768、WO 98/30566、欧洲专利公开案606046、欧洲专利公开案931 788、WO 90/05719、WO 99/52910、WO99/52889、WO 99/29667、WO 1999007675、欧洲专利公开案EP 1786785、欧洲专利公开案号EP 1181017、美国公开案US 20090012085、美国公开案US 5863 949、美国公开案US 5861510和欧洲专利公开案EP 0780386，将所有这些专利通过引用以其整体并入本文。优选的MMP-2和MMP-9抑制剂是具有极小或无抑制MMP-1的活性的那些。更优选的是相对于其他基质金属蛋白酶(即，MAP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)选择性抑制MMP-2和/或AMP-9的那些。可用于本披露中的MMP抑制剂的一些具体实例是AG-3340、RO 32-3555和RS 13-0830。
本发明化合物还可以用于与其他抗瘤剂的共同疗法中，这些其他抗瘤剂是例如醋孟南(acemannan)、阿柔比星、阿地白介素、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利维A酸(alitretinoin)、六甲蜜胺、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、ANCER、安西司亭(ancestim)、阿加来必(ARGLABIN)、三氧化二砷、BAM002(诺夫洛斯公司(Novelos))、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺、溴尿苷、卡培他滨、西莫白介素、西曲瑞克、克拉屈滨、克霉唑、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、DA 3030(Dong-A)、达克珠单抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin diftitox)、地洛瑞林(deslorelin)、右雷佐生、地拉卓(dilazep)、多西他赛、二十二醇、度骨化醇(doxercalciferol)、去氧氟尿苷、多柔比星、溴隐亭、卡莫司汀、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、HIT双氯酚酸、干扰素-α、道诺霉素、多柔比星、维甲酸、依地福新、依决洛单抗、依氟鸟氨酸(eflornithine)、乙嘧替氟、表柔比星、红细胞生成素β、磷酸依托泊苷、依西美坦、依昔舒林(exisulind)、法倔唑、非格司亭(filgrastim)、非那雄胺、磷酸氟达拉滨、福美司坦(formestane)、福莫司汀、硝酸镓、吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab zogamicin)、吉美拉西(gimeracil)/奥替拉西(oteracil)/替加氟组合、格莱克滨(glycopine)、戈舍瑞林、庚铂(heptaplatin)、人绒毛膜促性腺素、人类胎儿甲胎蛋白、伊班膦酸、伊达比星、咪喹莫特、干扰素α、干扰素α、天然干扰素α-2、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-N1、干扰素α-n3、复合α干扰素(interferonalfacon-1)、干扰素α、天然干扰素β、干扰素β-1a、干扰素β-1b、干扰素γ、天然干扰素γ-1a、干扰素γ-1b、白介素-1β、碘苄胍、伊立替康、伊索拉定(irsogladine)、兰瑞肽(lanreotide)、LC 9018(养乐多集团(Yakult))、来氟米特、来格司亭(lenograstim)、硫酸香菇多糖、来曲唑、白细胞α干扰素、亮丙瑞林、左旋咪唑+氟尿嘧啶、利阿唑(liarozole)、洛铂、氯尼达明、洛伐他汀、马索罗酚、美拉胂醇、甲氧氯普胺、米非司酮、米替福新、米立司亭、错配双链RNA、米托胍腙、二溴卫矛醇、米托蒽醌、莫拉司亭(molgramostim)、那法瑞林、纳洛酮+喷他佐辛、那托司亭(nartograstim)、奈达铂、尼鲁米特(nilutamide)、那可丁、新颖红细胞生成刺激蛋白、NSC 631570奥曲肽、奥普瑞白介素(oprelvekin)、奥沙特隆、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉酚、帕米膦酸(pamidronic acid)、培门冬酶、聚乙二醇干扰素-α-2b、木聚硫钠(pentosan polysulfate sodium)、喷司他丁、毕西巴尼(picibanil)、吡柔比星、兔抗胸腺细胞多克隆抗体、聚乙二醇干扰素-α-2a、卟吩姆钠、雷洛昔芬、雷替曲塞、拉斯伯门特(rasburiembodiment)、羟乙膦酸铼(Re 186)、RII维甲酰酚胺(RII retinamide)、利妥昔单抗、罗莫肽、来昔决南钐(153Sm)(samarium(153Sm)lexidronam)、沙格司亭(sargramostim)、西佐喃、索布佐生、索纳明(sonermin)、氯化锶-89、苏拉明、他索那明(tasonermin)、他扎罗汀、替加氟、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺、替尼泊苷、四氯十氧化物、沙利度胺、胸腺法新、促甲状腺素α、托泊替康(topotecan)、托瑞米芬、托西莫单抗(tositumomab)-碘131、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维甲酸、曲洛司坦、三甲曲沙、曲普瑞林、肿瘤坏死因子α、天然乌苯美司、膀胱癌疫苗、丸山(Maruyama)疫苗、黑色素瘤裂解物疫苗、戊柔比星(valrubicin)、维替泊芬、长春瑞滨、维鲁利秦(VIRULIZIN)、净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)或唑来膦酸；阿巴瑞克(abarelix)；AE 941(依特纳公司(Aeterna))、氨莫司汀(ambamustine)、反义寡核苷酸、bcl-2(珍塔公司(Genta))、APC 8015(丹德里昂公司(Dendreon))、西妥昔单抗、地西他滨(decitabine)、德氨鲁米特(dexaminoglutethimide)、地吖醌、EL 532(义隆公司(Elan))、EM 800(英杜里奇公司(Endorecherche))、恩尿嘧啶、依他硝唑、芬维A铵(fenretinide)、非格司亭SD01(安进公司(Amgen))、氟维司群、加洛他滨、胃泌素17免疫原、HLA-B7基因疗法(伟科公司(Vical))、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、组胺二盐酸盐、替伊莫单抗、伊洛马司他、IM 862(兴创公司(Cytran))、白介素-2、艾泼昔芬(iproxifene)、LDI 200(米克豪公司(Milkhaus))、来立司亭(leridistim)、林妥珠单抗(lintuzumab)、CA 125MAb(巴米拉公司(Biomira))、癌症MAb(日本制药发展公司(Japan Pharmaceutical Development))、HER-2和Fc MAb(梅达拉公司(Medarex))、独特型105AD7 MAb(CRC技术公司(CRC Technology))、独特型CEA MAb(特里莱公司(Trilex))、LYM-1-碘131MAb(特尼克隆公司(Techniclone))、多态性上皮粘液素-钇90MAb(安特索玛公司(Antisoma))、马立马司他(marimastat)、美诺立尔、米妥莫单抗(mitumomab)、莫特沙芬钆(motexafin gadolinium)、MX 6(高德美公司(Galderma))、奈拉滨(nelarabine)、诺拉曲塞(nolatrexed)、P 30蛋白、培维索孟(pegvisomant)、培美曲塞、泊非霉素(porfiromycin)、普马司他(prinomastat)、RL 0903(夏尔公司(Shire))、鲁吡替康、沙铂(satraplatin)、苯乙酸钠、斯帕磷酸(sparfosic acid)、SRL 172(SR制药公司(SRPharma))、SU 5416(苏根公司(SUGEN))、TA 077(田边公司(Tanabe))、四硫钼酸盐、厚果糖松草碱(thaliblastine)、血小板生成素、本紫红素乙酯锡(tin ethyl etiopurpurin)、替拉扎明、癌症疫苗(巴米拉公司)、黑色素瘤疫苗(纽约大学(New York University))、黑色素瘤疫苗(斯隆-凯特琳研究所(Sloan Kettering Institute))、黑色素瘤肿瘤裂解物疫苗(纽约医学院(New York Medical College))、病毒黑色素瘤细胞裂解物疫苗(皇家纽卡斯尔医院(Royal Newcastle Hospital))或伐司朴达(valspodar)。
本发明的化合物可以进一步与VEGFR抑制剂一起使用。以下专利和专利申请案中所述的其他化合物可以用于组合疗法中：US 6,258,812、US 2003/0105091、WO 01/37820、US 6,235,764、WO 01/32651、US 6,630,500、US 6,515,004、US 6,713,485、US 5,521,184、US 5,770,599、US 5,747,498、WO 02/68406、WO 02/66470、WO 02/55501、WO 04/05279、WO04/07481、WO 04/07458、WO 04/09784、WO 02/59110、WO 99/45009、WO 00/59509、WO 99/61422、US 5,990,141、WO 00/12089和WO 00/02871。
在一些实施例中，该组合包含本发明的组合物与至少一种抗血管发生剂的组合。药剂包括但不限于在体外以合成方式制备的化学组合物、抗体、抗原结合区、放射性核素及其组合和缀合物。药剂可以是激动剂、拮抗剂、变构调节剂、毒素，或者更通常地，可以用于抑制或刺激其靶标(例如，受体或酶激活或抑制)，并且由此促进细胞死亡或阻止细胞生长。
总而言之，抗体形成称为免疫球蛋白的血浆蛋白的家族，并且由免疫球蛋白结构域组成。(Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版，爱思唯尔科学有限公司(Elsevier ScienceLtd.)/加兰出版社(Garland Publishing),1999。如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式、包含重链及轻链且包含可变区及恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常为约100-110或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。可变区由每条轻链和重链的N末端区域构成，而恒定区由每条重链和轻链的C末端部分构成。(Janeway等人,“Structure of the Antibody Molecule and the ImmunoglobulinGenes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology:The Immune System inHealth and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(Garland Publishing),(1999))。
本领域已经描述了抗体CDR的一般结构和特性。简而言之，在抗体支架中，CDR嵌埋于重链及轻链可变区中的框架内，其中，其构成主要负责抗原结合及识别的区域。可变区通常包含至少三个重链CDR或三个轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫相关蛋白质序列],Public Health Service[公共卫生署]N.I.H.,贝塞斯达,马里兰州；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，位于框架区内(由Kabat等人,1991指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3、和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)。
抗体可以包含本领域已知的任何恒定区。人类轻链分类为κ轻链及λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本披露的实施例包括所有这种抗体类别或同种型。轻链恒定区可为例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人类κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如人类α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，该抗体为同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施例中，抗体包含与由哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)产生的天然存在的抗体基本上相似的序列。在这方面，抗体可以被认为是哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人抗体等。在某些方面，抗体是人抗体。在某些方面，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”是指含有来自两种或更多种不同抗体的结构域的抗体。嵌合抗体可以例如含有来自一个物种的恒定结构域，和来自第二物种的可变结构域，或更一般地，可以含有来自至少两个物种的氨基酸序列的区段。嵌合抗体还可以含有同一物种内的两种或更多种不同抗体的结构域。术语“人源化”在关于抗体使用时是指至少具有来自经工程改造以具有比原始来源抗体更类似于真人类抗体的结构和免疫学功能的非人类来源CDR区的抗体。例如，人源化可涉及将来自非人类抗体(例如小鼠抗体)的CDR接枝到人类抗体中。人源化还可以涉及所选择的氨基酸取代以使非人序列更类似于人序列。
抗体可以通过酶(例如像木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)切割成片段。木瓜蛋白酶切割抗体以产生两个Fab片段和单个Fc片段。胃蛋白酶裂解抗体从而产生F(ab’)2片段和pFc'片段。如本文所用，术语“抗原结合抗体片段”是指能够结合抗体的抗原，并且也被称为“抗原结合片段”或“抗原结合部分”的抗体分子的一部分。在示例性实例中，抗原结合抗体片段是Fab片段或F(ab')2片段。
抗体架构已经被用于产生越来越多的替代形式，其跨越至少约12-150kDa的分子量范围和具有从单体(n＝1)、二聚体(n＝2)和三聚体(n＝3)到四聚体(n＝4)并且可能更高的化合价(n)范围；此类替代形式在本文中称为“抗体蛋白质产物”。抗体蛋白产物包括基于完整抗体结构的那些和模拟保留完整抗原结合能力的抗体片段的那些，例如scFv、Fab和VHH/VH(以下讨论的)。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合抗体片段为Fv片段，其完全由可变(V)区组成。使用可溶性柔性氨基酸肽接头将V区连接至scFv片段(可变单链片段)以使该分子稳定，或将恒定(C)结构域添加至V区以产生Fab片段[抗原结合片段]。scFv和Fab片段可以容易地在宿主细胞中产生，例如原核宿主细胞。其他抗体蛋白产物包括经二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚及多聚抗体形式，如双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体，或包含由与寡聚结构域连接的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小的片段是骆驼科重链Ab的VHH/VH以及单结构域Ab(sdAb)。最常用于建造新颖抗体形式的构件为单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，其包含由具有约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的V结构域(VH结构域和VL结构域)。肽体(peptibody)或肽-Fc融合体是另一种抗体蛋白产物。肽体的结构由接枝到Fc结构域上的生物活性肽组成。此项技术中已充分描述了肽抗体。参见，例如，Shimamoto等人.,mAbs 4(5):586-591(2012)。
其他抗体蛋白产物包括单链抗体(SCA)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可分成五个主要类别：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白以及BsAb缀合物。参见，例如，Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学]67(2)部分A:97/-106(2015)。
示例性抗血管发生剂包括ERBITUXTM(IMC-C225)、KDR(激酶结构域受体)抑制剂(例如，特异性结合至激酶结构域受体的抗体和抗原结合区)、抗VEGF剂(例如，特异性结合VEGF的抗体或抗原结合区、或可溶VEGF受体或其配体结合区)(例如AVASTINTM或VEGF-TRAPTM)和抗VEGF受体剂(例如，与其特异性结合的抗体或抗原结合区)、EGFR抑制剂(例如，与其特异性结合的抗体或抗原结合区)(例如维克替比(Vectibix))帕尼单抗)、IRESSATM(吉非替尼)、TARCEVATM(厄洛替尼)、抗Ang1剂和抗Ang2剂(例如，与其或与其受体(例如Tie2/Tek)特异性结合的抗体或抗原结合区)以及抗Tie2激酶抑制剂(例如，与其特异性结合的抗体或抗原结合区)。本发明的药物组合物还可以包含一种或多种特异性结合生长因子并抑制生长因子的活性的药剂(例如，抗体、抗原结合区或可溶受体)，例如肝细胞生长因子(HGF，还称为散射因子)的拮抗剂、以及特异性结合其受体“c-met”的抗体或抗原结合区。
其他抗血管发生剂包括坎帕斯(Campath)、IL-8、B-FGF、Tek拮抗剂(Ceretti等人,美国公开案号2003/0162712；美国专利号6,413,932)、抗TWEAK剂(例如，特异性结合抗体或抗原结合区，或可溶TWEAK受体拮抗剂；参见Wiley，美国专利号6,727,225)、用于拮抗整联蛋白与其配体的结合的ADAM去整合素结构域(Fanslow等人,美国公开案号2002/0042368)、特异性结合抗eph受体和/或抗蝶素(ephrin)抗体或抗原结合区(美国专利号5,981,245；5,728,813；5,969,110；6,596,852；6,232,447；6,057,124和其专利族成员)和抗PDGF-BB拮抗剂(例如，特异性结合抗体或抗原结合区)以及特异性结合PDGF-BB配体的抗体或抗原结合区和PDGFR激酶抑制剂(例如，与其特异性结合的抗体或抗原结合区)。
其他抗血管发生/抗肿瘤剂包括：SD-7784(美国辉瑞公司(Pfizer))；西仑吉肽(cilengitide)(德国默克集团(Merck KGaA)，EPO 770622)；哌加他尼八钠(pegaptaniboctasodium)(美国吉利德科学公司(Gilead Sciences))；阿耳法他汀(Alphastatin)(英国百克塔公司(BioActa))；M-PGA(美国赛尔基因公司(Celgene)，US 5712291)；伊洛马司他(美国爱瑞发公司(Arriva)，US 5892112)；艾玛夏尼(emaxanib)(美国辉瑞公司，US5792783)；瓦他拉尼(vatalanib)(瑞士诺华制药公司(Novartis))；2-甲氧基雌二醇(美国安翠梅德公司(EntreMed))；TLC ELL-12(爱尔兰义隆公司)；乙酸阿奈可他(anecortaveacetate)(美国爱尔康公司(Alcon))；α-D148Mab(美商安进公司)；CEP-7055(美国瑟法隆公司(Cephalon))；抗Vn Mab(荷兰克鲁赛尔公司(Crucell))；DAC:抗血管发生剂(加拿大康久化学公司(ConjuChem))；安吉西丁(Angiocidin)(美国英可因制药公司(InKinePharmaceutical))；KM-2550(日本协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko))；SU-0879(美国辉瑞公司)；CGP-79787(瑞士诺华制药公司，EP 970070)；ARGENT技术(美国阿瑞雅德公司(Ariad))；YIGSR-Stealth(美国强生公司(Johnson&Johnson))；纤维蛋白原-E片段(英国百克塔公司)；血管发生抑制剂(英国三杰公司(Trigen))；TBC-1635(美国恩赛斯夫制药公司(Encysive Pharmaceuticals))；SC-236(美国辉瑞公司)；ABT-567(美国雅培公司(Abbott))；转移抑制素(Metastatin)(美国安翠梅德公司)；血管发生抑制剂(瑞典瑞派公司(Tripep))；乳腺丝抑蛋白(maspin)(日本创成公司(Sosei))；2-甲氧基雌二醇(美国肿瘤学公司(Oncology Sciences Corporation))；ER-68203-00(美国爱华克斯公司(IVAX))；氟草胺(美国莱恩实验室公司(Lane Labs))；Tz-93(日本津村株式会社(Tsumura))；TAN-1120(日本武田株式会社(Takeda))；FR-111142(日本藤泽株式会社(Fujisawa)，JP 02233610)；血小板因子4(美国瑞普利金公司(RepliGen)，EP 407122)；血管内皮生长因子拮抗剂(丹麦波伦公司(Borean))；贝伐单抗(pINN)(美国基因泰克公司(Genentech))；血管发生抑制剂(美国苏根公司)；XL 784(美国伊克塞利克斯公司(Exelixis))；XL 647(美国伊克塞利克斯公司)；第二代MAbα5β3整联蛋白(美国应用分子进化基金会(Applied MolecularEvolution)和美国英商梅迪缪思有限公司(MedImmune))；视网膜病变的基因疗法(英国牛津生物医药公司(Oxford BioMedica))；盐酸恩扎妥林(enzastaurin hydrochloride)(USAN)(美国礼来公司(Lilly))；CEP 7055(美国瑟法隆公司和法国赛诺菲圣德拉堡集团(Sanofi-Synthelabo))；BC 1(意大利热那亚癌症研究所(Genoa Institute of CancerResearch))；血管发生抑制剂(澳大利亚沃奇米亚公司(Alchemia))；VEGF拮抗剂(美国再生元公司(Regeneron))；rBPI 21和BPI衍生的抗血管发生剂(美国逍马公司(XOMA))；PI 88(澳大利亚普健公司(Progen))；西仑吉肽(pINN)(德国默克集团；德国慕尼黑技术大学(Munich Technical University)，美国斯克里普斯诊所和研究基金会(Scripps Clinicand Research Foundation))；西妥昔单抗(INN)(法国安万特公司(Aventis))；AVE 8062(日本味之素公司(Ajinomoto))；AS 1404(新西兰癌症研究实验室(Cancer ResearchLaboratory))；SG 292(美国泰利奥斯公司(Telios))；内皮抑素(美国波士顿儿童医院(Boston Childrens Hospital))；ATN 161(美国阿特纽公司(Attenuon))；血管抑素(美国波士顿儿童医院)；2-甲氧基雌二醇(美国波士顿儿童医院)；ZD 6474(英国阿斯利康公司(AstraZeneca))；ZD 6126(英国安吉奥金尼制药公司(Angiogene Pharmaceuticals))；PPI2458(美国普雷西斯公司(Praecis))；AZD 9935(英国阿斯利康公司)；AZD 2171(英国阿斯利康公司)；瓦他拉尼(pINN)(瑞士诺华制药公司和德国先灵公司(Schering AG))；组织因子途径抑制剂(美国安翠梅德公司)；哌加他尼(Pinn)(美国吉利德科学公司)；束骨姜黄醇(xanthorrhizol)(韩国延世大学(Yonsei University))；基于基因的VEGF-2疫苗(美国斯克里普斯诊所和研究基金会)；SPV5.2(加拿大萨普泰克公司(Supratek))；SDX 103(美国圣地亚哥的加利福尼亚大学(University of California))；PX 478(美国派克斯公司(ProlX))；转移抑制素(美国安翠梅德公司)；肌钙蛋白I(美国哈佛大学(HarvardUniversity))；SU 6668(美国苏根公司)；OXI4503(美国奥克斯吉尼公司(OXiGENE))；邻胍(美国维度制药公司(Dimensional Pharmaceuticals))；莫托普胺C(motuporamine C)(加拿大不列颠哥伦比亚大学(British Columbia University))；CDP791(英国细胞科技集团(Celltech Group))；阿替莫德(pINN)(英国葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))；E 7820(日本卫材株式会社(Eisai))；CYC 381(美国哈佛大学)；AE 941(加拿大依特纳公司)；血管发生疫苗(美国安翠梅德公司)；尿激酶纤溶酶原激活剂抑制剂(美国丹德里昂公司)；奥谷法奈(oglufanide)(pINN)(美国麦尔墨特公司(Melmotte))；HIF-1α抑制剂(英国新诺瓦公司(Xenova))；CEP 5214(美国瑟法隆公司)；BAY RES 2622(德国拜耳公司(Bayer))；安吉西丁(美国英可因公司)；A6(美国奥创公司(Angstrom))；KR 31372(韩国的韩国化学技术研究所(Korea Research Institute of Chemical Technology))；GW 2286(英国葛兰素史克公司)；EHT 0101(法国埃克森海特公司(ExonHit))；CP 868596(美国辉瑞公司)；CP 564959(美国OSI公司)；CP 547632(美国辉瑞公司)；786034(英国葛兰素史克公司)；KRN 633(日本麒麟啤酒株式会社(Kirin Brewery))；眼内2-甲氧基雌二醇药物递送系统(美国安翠梅德公司)；安吉尼克(anginex)(荷兰马斯特里赫特大学(Maastricht University)和美国明尼苏达大学(Minnesota University))；ABT 510(美国雅培公司)；AAL 993(瑞士诺华制药公司)；VEGI(美国普若技术公司(ProteomTech))；肿瘤坏死因子-α抑制剂(美国国立衰老研究所(National Institute on Aging))；SU 11248(美国辉瑞公司和美国苏根公司)；ABT 518(美国雅培公司)；YH16(中国烟台荣昌公司(Yantai Rongchang))；S-3APG(美国波士顿儿童医院和美国安翠梅德公司)；MAb,KDR(美国英克隆系统公司(ImClone Systems))；MAbα5β1(美国蛋白质设计公司(Protein Design))；KDR激酶抑制剂(英国细胞科技集团和美国强生公司)；GFB 116(美国南佛罗里达大学(South Florida University)和美国耶鲁大学(YaleUniversity))；CS 706(日本三协株式会社(Sankyo))；康普瑞汀(combretastatin)A4前药(美国亚利桑那州立大学(Arizona State University))；软骨素酶AC(chondroitinaseAC)(加拿大阿卑斯公司(IBEX))；BAY RES 2690(德国拜耳公司)；AGM 1470(美国哈佛大学、日本武田株式会社和美国TAP公司)；AG 13925(美国阿古伦公司(Agouron))；四硫钼酸盐(美国密歇根大学(University of Michigan))；GCS 100(美国韦恩州立大学(Wayne StateUniversity))；CV 247(英国常春藤医疗公司(Ivy Medical))；CKD 732(韩国钟根堂公司(Chong Kun Dang))；血管内皮生长因子MAb(英国新诺瓦公司)；伊索拉定(irsogladine)(INN)(日本新药株式会社(Nippon Shinyaku))；RG 13577(法国安万特公司)；WX 360(德国威莱克斯公司(Wilex))；角鲨胺(pINN)(美国吉纳诺公司(Genaera))；RPI 4610(美国瑟纳公司(Sirna))；癌症疗法(澳大利亚马力诺瓦公司(Marinova))；类肝素酶抑制剂(以色列洞见公司(InSight))；KL 3106(韩国科隆公司(Kolon))；和厚朴酚(美国埃默里大学(EmoryUniversity))；ZK CDK(德国先灵公司)；ZK Angio(德国先灵公司)；ZK 229561(瑞士诺华制药公司和德国先灵公司)；XMP 300(美国逍马公司)；VGA 1102(日本大正株式会社(Taisho))；VEGF受体调节剂(美国药典公司(Pharmacopeia))；VE-钙粘蛋白-2拮抗剂(美国英克隆系统公司)；伐索他汀(Vasostatin)(美国国立卫生研究院(National Institutesof Health))；Flk-1疫苗(美国英克隆系统公司)；TZ 93(日本津村株式会社)；肿瘤抑素(美国贝斯以色列医院(Beth Israel Hospital))；截短型可溶FLT 1(血管内皮生长因子受体1)(美国默克公司(Merck&Co))；Tie-2配体(美国再生元公司)；和血小板反应蛋白1抑制剂(美国阿列格尼健康、教育和研究基金会(Allegheny Health,Education and ResearchFoundation))。
自体吞噬抑制剂包括但不限于氯喹、3-甲基腺嘌呤、羟氯喹(PlaquenilTM)、巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核糖核苷(AICAR)、冈田酸、抑制2A型或1型蛋白磷酸酶的自体吞噬抑制性海藻毒素、cAMP类似物以及升高cAMP水平的药物例如腺苷、LY204002、N6-巯嘌呤核糖核苷和长春碱。另外，还可以使用抑制蛋白质表达的反义或siRNA，这些蛋白质包括但不限于ATG5(其参与自体吞噬)。
可以用于治疗癌症并且可以与本发明的一种或多种化合物组合使用的其他药学活性化合物/药剂包括：红细胞生成素α；阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)；帕尼单抗；培非格司亭(pegfilgrastim)；帕利夫明(palifermin)；非格司亭；地诺单抗(denosumab)；安西司亭；AMG 102；AMG 176；AMG 386；AMG 479；AMG 655；AMG 745；AMG 951；和AMG 706，或其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，将本文所提供的组合物与化学治疗剂联合施用。适合的化学治疗剂可以包括天然产物，例如长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、紫杉酚、表鬼臼毒素(Epidipodophyllotoxin)(例如，依托泊苷和替尼泊苷)、抗生素(例如，更生霉素(放线菌素D)、道诺霉素、多柔比星和伊达比星)、蒽环类抗生素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉素、酶(例如，L-天冬酰胺酶，其系统性地代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成自身天冬酰胺的能力的细胞)、抗血小板剂、抗增殖/抗有丝分裂烷基化剂(例如氮芥，例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑和苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基蜜胺(例如，六甲基蜜胺(hexaamethylmelaamine)和噻替派)、CDK抑制剂(例如，塞利西利(seliciclib)、UCN-01、P1446A-05、PD-0332991、迪那西利(dinaciclib)、P27-00、AT-7519、RGB286638和SCH727965)、烷基磺酸酯(例如，白消安)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀(BCNU)和类似物和链脲霉素)、三氮烯-达卡巴嗪(Trazenes-dacarbazinine)(DTIC)、抗增殖/抗有丝分裂抗代谢药例如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如，氟尿嘧啶、氟尿苷和阿糖胞苷)、嘌呤类似物和相关抑制剂(例如，巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷)、芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、依西美坦和来曲唑)和铂配位络合物(例如，顺铂和卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(例如，曲古抑菌素、丁酸钠、阿匹西坦(apicidan)、辛二酰苯胺异羟肟酸(hydroamic acid)、伏立诺他(vorinostat)、LBH 589、罗米地辛(romidepsin)、ACY-1215和帕比司他(panobinostat))、mTor抑制剂(例如，替西罗莫司、依维莫司、地磷莫司(ridaforolimus)和西罗莫司)、KSP(Eg5)抑制剂(例如，Array 520)、DNA结合剂(例如，扎利普斯(Zalypsis))、PI3Kδ抑制剂(例如，GS-1101和TGR-1202)、PI3Kδ和γ抑制剂(例如，CAL-130)、多激酶抑制剂(例如，TG02和索拉非尼)、激素(例如，雌激素)和激素激动剂例如黄体化激素释放激素(LHRH)激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林和曲普瑞林)、BAFF中和性抗体(例如，LY2127399)、IKK抑制剂、p38MAPK抑制剂、抗IL-6(例如，CNTO328)、端粒酶抑制剂(例如，GRN 163L)、极光激酶抑制剂(例如，MLN8237)、细胞表面单克隆抗体(例如，抗CD38(HUMAX-CD38)、抗CS1(例如，埃罗妥珠单抗(elotuzumab))、HSP90抑制剂(例如，17AAG和KOS 953)、P13K/Akt抑制剂(例如，哌立福辛(perifosine))、Akt抑制剂(例如，GSK-2141795)、PKC抑制剂(例如，恩扎妥林)、FTI(例如，ZarnestraTM)、抗CD138(例如，BT062)、Torc1/2特异性激酶抑制剂(例如，INK128)、激酶抑制剂(例如，GS-1101)、ER/UPR靶向剂(例如，MKC-3946)、cFMS抑制剂(例如，ARRY-382)、JAK1/2抑制剂(例如，CYT387)、PARP抑制剂(例如，奥拉帕尼和维利帕尼(veliparib)(ABT-888))、BCL-2拮抗剂。其他化学治疗剂可以包括二氯甲基二乙胺、喜树碱、异环磷酰胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、吉西他滨、诺维本、索拉非尼或前述项的任何类似物或衍生物变体。
本发明的化合物还可以与放射疗法、激素疗法、手术和免疫疗法组合使用，这些疗法是本领域技术人员所熟知的。
在某些实施例中，将本文所提供的药物组合物与类固醇联合施用。适合的类固醇可以包括但不限于21-乙酰氧基孕烯醇酮、阿氯米松、阿尔孕酮、安西奈德、倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松、布地奈德、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯倍他索(clobetasol)、氯可托龙、氯泼尼醇、皮质酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龙(diflucortolone)、二氟孕甾丁酯(difuprednate)、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德(flucloronide)、氟米松(flumethasone)、氟尼缩松、氟轻松(fluocinolone acetonide)、醋酸氟轻松、氟考丁酯(fluocortinbutyL)、氟可龙、氟米龙(fluorometholone)、醋酸甲氟龙(fluperolone acetate)、醋酸氟泼尼定(fluprednidene acetate)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、氟氢缩松(flurandrenolide)、丙酸氟替卡松、福莫可他(formocortal)、氯氟舒松(halcinonide)、丙酸卤倍他索(halobetasol propionate)、卤米松(halometasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、依碳酸氯替泼诺(loteprednol etabonate)、马泼尼酮、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙(methylprednisolone)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松龙25-二乙氨基乙酸酯、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙戊酸酯(prednival)、泼尼立定(prednylidene)、利美索龙、替可的松(tixocortol)、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、苯曲安奈德(triamcinolone benetonide)、己曲安奈德(triamcinolone hexacetonide)及其盐和/或衍生物。在一个特定实施例中，本发明的化合物还可以与治疗恶心的其他药学活性药剂组合使用。可以用于治疗恶心的药剂的实例包括：屈大麻酚；格拉司琼；甲氧氯普胺；昂丹司琼；和丙氯拉嗪；或其药学上可接受的盐。
本发明的KRASG12C抑制剂可以与Aurora激酶抑制剂组合使用，例如在公开的PCT申请WO 2011/031842中发现的那些。具体的化合物是AMG 900(WO 2011/031842的实例1，出于所有目的通过引用并入本文)。
本发明的KRASG12C抑制剂可以与MAP激酶途径抑制剂组合使用。可以受到抑制的MAP激酶途径中的蛋白质以及与KRASG12C抑制剂组合使用的此类蛋白质的抑制剂的实例是BRAF抑制剂、Pan-RAF抑制剂和MEK抑制剂。有三种主要的RAF同种型：ARAF、BRAF和CRAF。pan-RAF抑制剂显示出对一种以上的RAF同种型具有抑制活性。相反，BRAF抑制剂表现出对BRAF的抑制剂活性(或选择性)比其他RAF蛋白更高。
本发明的化合物还可以与破坏或抑制RAS-RAF-ERK或PI3K-AKT-TOR信号传导途径的其他药学活性化合物组合使用。在其他此类组合中，其他药学活性化合物是PD-1和PD-L1拮抗剂。本披露的化合物或药物组合物还可以与一定量的一种或多种选自以下的物质组合使用：EGFR抑制剂、MEK抑制剂、PI3K抑制剂、AKT抑制剂、TOR抑制剂、Mcl-1抑制剂、BCL-2抑制剂、SHP2抑制剂、蛋白酶体抑制剂和免疫疗法，包括单克隆抗体、免疫调节性酰亚胺(IMiD)、抗PD-1(或可替代地PD-1抑制剂)、抗PDL-1、抗CTLA4、抗LAG1和抗OX40剂、GITR激动剂、CAR-T细胞和BiTE。
EGFR抑制剂包括但不限于小分子拮抗剂、抗体抑制剂或特定反义核苷酸或siRNA。可以在本发明组合中使用的EGFR抑制剂包括但不限于阿法替尼(商品名：可购自勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))、厄洛替尼(商品名:可购自基因泰克/安斯泰来公司(Genetech/Astellas))、和拉帕替尼(商品名：可购自诺华制药公司(Novartis))。在本发明中，KRASG12C抑制剂也可以与EGFR抗体组合使用。可以在本发明组合中使用的EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗(商品名：来自美国礼来公司(Lilly))。有用的EGFR抗体抑制剂包括帕尼单抗(维克替比)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)和马妥珠单抗(matuzumab)。
小分子EGFR抑制剂的非限制性实例包括以下专利公开案中描述的任何EGFR抑制剂、以及所述EGFR抑制剂的所有药学上可接受的盐和溶剂化物：欧洲专利申请案EP520722，1992年12月30日公开；欧洲专利申请案EP 566226，1993年10月20日公开；PCT国际公开案WO 96/33980，1996年10月31日公开；美国专利号5,747,498，1998年5月5日授权；PCT国际公开案WO 96/30347，1996年10月3日公开；欧洲专利申请案EP 787772，1997年8月6日公开；PCT国际公开案WO 97/30034，1997年8月21日公开；PCT国际公开案WO 97/30044，1997年8月21日公开；PCT国际公开案WO 97/38994，1997年10月23日公开；PCT国际公开案WO 97/49688，1997年12月31日公开；欧洲专利申请案EP 837063，1998年4月22日公开；PCT国际公开案WO 98/02434，1998年1月22日公开；PCT国际公开案WO 97/38983，1997年10月23日公开；PCT国际公开案WO 95/19774，1995年7月27日公开；PCT国际公开案WO 95/19970，1995年7月27日公开；PCT国际公开案WO 97/13771，1997年4月17日公开；PCT国际公开案WO 98/02437，1998年1月22日公开；PCT国际公开案WO 98/02438，1998年1月22日公开；PCT国际公开案WO 97/32881，1997年9月12日公开；德国申请案DE 19629652，1998年1月29日公开；PCT国际公开案WO 98/33798，1998年8月6日公开；PCT国际公开案WO 97/32880，1997年9月12日公开；PCT国际公开案WO 97/32880，1997年9月12日公开；欧洲专利申请案EP 682027，1995年11月15日公开；PCT国际公开案WO 97/02266，197年1月23日公开；PCT国际公开案WO 97/27199，1997年7月31日公开；PCT国际公开案WO 98/07726，1998年2月26日公开；PCT国际公开案WO 97/34895，1997年9月25日公开；PCT国际公开案WO 96/31510′，1996年10月10日公开；PCT国际公开案WO 98/14449，1998年4月9日公开；PCT国际公开案WO 98/14450，1998年4月9日公开；PCT国际公开案WO 98/14451，1998年4月9日公开；PCT国际公开案WO 95/09847，1995年4月13日公开；PCT国际公开案WO 97/19065，1997年5月29日公开；PCT国际公开案WO98/17662，1998年4月30日公开；美国专利号5,789,427，1998年8月4日授权；美国专利号5,650,415，1997年7月22日授权；美国专利号5,656,643，1997年8月12日授权；PCT国际公开案WO 99/35146，1999年7月15日公开；PCT国际公开案WO 99/35132，1999年7月15日公开；PCT国际公开案WO 99/07701，1999年2月18日公开；和PCT国际公开案WO 92/20642，1992年11月26日公开。小分子EGFR抑制剂的其他非限制性实例包括描述于Traxler,P.,1998,Exp.Opin.Ther.Patents[治疗术专利专家评述]8(12):1599-1625中的任何EGFR抑制剂。
基于抗体的EGFR抑制剂包括可以部分或完全阻断EGFR被其天然配体激活的任何抗EGFR抗体或抗体片段。基于抗体的EGFR抑制剂的非限制性实例包括以下文献中描述的那些：Modjtahedi,H.等人,1993,Br.J.Cancer[英国癌症杂志]67:247-253；Teramoto,T.等人,1996,Cancer[癌症]77:639-645；Goldstein等人,1995,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]1:1311-1318；Huang,S.M.等人,1999,Cancer Res.[癌症研究]15:59(8):1935-40；和Yang,X.等人,1999,Cancer Res.[癌症研究]59:1236-1243。因此，EGFR抑制剂可以是单克隆抗体Mab E7.6.3(Yang,1999，同上)、或Mab C225(ATCC登录号HB-8508)、或具有其结合特异性的抗体或抗体片段。
本发明的KRASG12C抑制剂可以与MEK抑制剂组合使用，例如在公开的PCT申请WO2002/006213中发现的那些。一种特定化合物是N-(((2R)-2,3-二羟丙基)氧基)-3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯甲酰胺，也称为AMG 1009089或1009089(实例39)。
本发明的KRASG12C抑制剂可以与BRAF抑制剂组合使用，例如在公开的PCT申请WO2008/153,947中发现的那些。一种特定化合物是AMG 2112819(也称为2112819)(实例56)。可以在本发明的组合中使用的另一种特定的BRAF抑制剂是达拉非尼。可以在本发明的组合中使用的另一种BRAF抑制剂是维罗非尼。
在本发明的组合中，Pan-RAF抑制剂也可以与KRASG12C抑制剂一起使用。特定的Pan-Raf抑制剂包括RAF265和MLN-2480。
本发明的KRASG12C抑制剂可以与MEK抑制剂组合使用。可以在本发明的组合中使用的特定的MEK抑制剂包括PD-325901、曲美替尼、匹马塞替尼、MEK162[也称为比尼替尼]、TAK-733、GDC-0973和AZD8330。可以在本发明的组合中与KRASG12C抑制剂一起使用的特定MEK抑制剂是曲美替尼(商品名：可购自诺华制药公司(NovartisPharmaceuticals Corp.))。另一种特定的MEK抑制剂是N-(((2R)-2,3-二羟丙基)氧基)-3,4-二氟-2-((2-氟-4-碘苯基)氨基)苯甲酰胺，也称为AMG 1009089、1009089或PD-325901。可用于本发明组合的另一种特定的MEK抑制剂包括考比替尼(cobimetinib)。
MEK抑制剂包括但不限于CI-1040、AZD6244、PD318088、PD98059、PD334581、RDEA119、ARRY-142886和ARRY-438162。
在另一方面，本发明涉及本发明的化合物与一种或多种药剂的组合的用途，所述药剂在磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径中作为蛋白质的抑制剂。PI3K途径中的蛋白质实例包括PI3K、mTOR和PKB(也称为Akt或AKT)。PI3K蛋白以若干种同种型存在，包括α、β、δ或γ。预期可以在本发明中使用的PI3K抑制剂可以对一种或多种同种型具有选择性。选择性是指该化合物与其他同种型相比，更多地抑制一种或多种同种型。选择性是本领域技术人员熟知的概念，并且可以用熟知的体外或基于细胞的活性测定法进行测量。优选的选择性包括对一种或多种同种型的选择性，与其他同种型相比，大于2倍，优选大于10倍，或更优选100倍更大。在一方面，可与本发明的化合物组合使用的PI3K抑制剂是PI3Kα选择性抑制剂。在另一方面，该化合物是PI3Kδ选择性抑制剂。在又另一方面，该化合物是PI3Kβ选择性抑制剂。
可与一种或多种本发明的化合物组合使用的PI3K抑制剂的实例包括以下披露的那些：PCT公开申请号WO 2010/151791；PCT公开申请号WO 2010/151737；PCT公开申请号WO2010/151735；PCT公开申请号WO 2010151740；PCT公开申请号WO 2008/118455；PCT公开申请号WO 2008/118454；PCT公开申请号WO 2008/118468；美国公开申请号US 20100331293；美国公开申请号US 20100331306；美国公开申请号US 20090023761；美国公开申请号US20090030002；美国公开申请号US 20090137581；美国公开申请号US 2009/0054405；美国公开申请号U.S.2009/0163489；美国公开申请号US 2010/0273764；美国公开申请号U.S.2011/0092504；或PCT公开申请号WO 2010/108074。PI3K抑制剂包括但不限于渥曼青霉素、WO 06/044453中描述的17-羟基渥曼青霉素类似物、4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(还称为GDC 0941，并且描述于PCT公开案号WO 09/036,082和WO 09/055,730中)、2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(还称为BEZ 235或NVP-BEZ 235，并且描述于PCT公开案号WO 06/122806中)、(S)-1-(4-((2-(2-氨基嘧啶-5-基)-7-甲基-4-吗啉代噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)哌嗪-1-基)-2-羟基丙-1-酮(描述于PCT公开案号WO 2008/070740中)、LY 294002(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，可从艾克松医学化学公司(Axon Medchem)获得)、PI 103盐酸盐(3-[4-(4-吗啉基吡啶并-[3′,2′:4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚盐酸盐，可从艾克松医学化学公司获得)、PIK 75(N′-[(1E)-(6-溴代咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)亚甲基]-N,2-二甲基-5-硝基苯磺酰基-酰肼盐酸盐，可从艾克松医学化学公司获得)、PIK 90(N-(7,8-二甲氧基-2,3-二氢-咪唑并[1,2-c]喹唑啉-5-基)-烟酰胺，可从艾克松医学化学公司获得)、GDC-0941二甲磺酸盐(2-(1H-吲唑-4-基)-6-(4-甲烷磺酰基-哌嗪-1-基甲基)-4-吗啉-4-基-噻吩并[3,2-d]嘧啶二甲磺酸盐，可从艾克松医学化学公司获得)、AS-252424(5-[1-[5-(4-氟-2-羟基-苯基)-呋喃-2-基]-甲-(Z)-亚基]-噻唑烷-2,4-二酮，可从艾克松医学化学公司获得)以及TGX-221(7-甲基-2-(4-吗啉基)-9-[1-(苯基氨基)乙基]-4H-吡啶并-[1,2-a]嘧啶-4-酮，可从艾克松医学化学公司获得)、XL-765和XL-147。其他PI3K抑制剂包括去甲氧基绿胶霉素(demethoxyviridin)、哌立福辛、CAL101、PX-866、BEZ235、SF1126、INK1117、IPI-145、BKM120、XL147、XL765、帕罗米德529(Palomid 529)、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、PI-103、GNE-477、CUDC-907和AEZS-136。
与本发明的化合物组合使用的优选PI3K抑制剂包括：也称为布帕尼西，一种来自诺华制药公司(Novartis Pharmaceuticals)的研究小分子，
或其药学上可接受的盐。
还优选的是下面的式IIa化合物或其药学上可接受的盐，
其中X1是氟或氢；Y1是氢或甲基；以及Z1是氢或甲基。可用于本发明的组合的特定PI3K抑制剂是AMG 511(也称为AMG 2539965或2539965)，其是公开的PCT申请WO 2010/126895的实例148。
可在本发明的组合中与KRASG12C抑制剂组合使用的其他PI3K抑制剂包括Pan-PI3K抑制剂，例如BKM120和GDC-0941；PI3Kα选择性抑制剂，例如BYL719；和PI3Kβ选择性抑制剂，例如GSK-2636771。
抑制PI3K和mTOR两者的化合物(双重抑制剂)是已知的。在又另一方面，本发明提供了PI3K和mTOR双重抑制剂与KRASG12C抑制剂组合使用的用途。特定的双重抑制剂的实例是GDC-0980。
在本发明中，KRASG12C抑制剂也可以与SHP2抑制剂组合使用。可以在本发明组合中使用的SHP2抑制剂包括但不限于SHP099，以及RMC-4550或RMC-4630(来自加利福尼亚州红木市(Redwood City,CA)的Revolutions Medicines)。
mTOR是PI3K途径中的蛋白质。本发明的另一方面是将mTOR抑制剂与KRASG12C抑制剂组合使用。可与本发明的化合物组合使用的mTOR抑制剂包括以下文件中披露的那些：PCT公开申请WO 2010/132598和PCT公开申请WO 2010/096314。在本发明的组合中可以与KRASG12C抑制剂组合使用的mTOR抑制剂包括AZD2014和MLN0128。
TOR抑制剂包括但不限于，AP-23573、CCI-779、依维莫司、RAD-001、雷帕霉素、替西罗莫司、ATP竞争性TORC1/TORC2抑制剂，包括PI-103、PP242、PP30和托林1(Torin 1)。其他TOR抑制剂包括FKBP12增强剂；雷帕霉素及其衍生物，包括：CCI-779(替西罗莫司)、RAD001(依维莫司；WO 9409010)和AP23573；雷帕霉素类似物(rapalog)，例如如WO 98/02441和WO01/14387中所披露，例如AP23573、AP23464或AP23841；40-(2-羟乙基)雷帕霉素、40-[3-羟基(羟甲基)甲基丙酸酯]-雷帕霉素(还称为CC1779)、40-表-(四唑基)-雷帕霉素(还称为ABT578)、32-脱氧雷帕霉素、16-戊炔氧基-32(S)-二氢雷帕霉素和WO 05005434中披露的其他衍生物；以下专利中披露的衍生物：美国专利号5,258,389、WO 94/090101、WO 92/05179、美国专利号5,118,677、美国专利号5,118,678、美国专利号5,100,883、美国专利号5,151,413、美国专利号5,120,842、WO 93/111130、WO 94/02136、WO 94/02485、WO 95/14023、WO94/02136、WO 95/16691、WO 96/41807、WO 96/41807和美国专利号5,256,790；含磷雷帕霉素衍生物(例如，WO 05016252)；4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物(例如，美国临时申请案号60/528,340)。
PKB(AKT)也是PI3K途径中的蛋白质。本发明的另一方面是将AKT抑制剂与KRASG12C抑制剂组合使用。可与本发明的化合物组合使用的AKT抑制剂包括以下文件中披露的那些：美国专利号7,354,944；美国专利号7,700,636；美国专利号7,919,514；美国专利号7,514,566；美国专利申请公开号US 2009/0270445 A1；美国专利号7,919,504；美国专利号7,897,619；或PCT公开申请号WO 2010/083246A1。可在本发明的组合中与KRASG12C抑制剂组合使用的特定AKT抑制剂包括MK-2206、GDC-0068和AZD5363。
AKT抑制剂包括但不限于Akt-1-1(抑制Akt1)(Barnett等人(2005)Biochem.J.[生物化学杂志],385(Pt.2),399-408)；Akt-1-1,2(抑制Ak1和2)(Barnett等人(2005)Biochem.J.[生物化学杂志]385(Pt.2),399-408)；API-59CJ-Ome(例如，Jin等人(2004)Br.J.Cancer[英国癌症杂志]91,1808-12)；1-H-咪唑并[4,5-c]吡啶基化合物(例如，WO05011700)；吲哚-3-甲醇(carbinol)及其衍生物(例如，美国专利号6,656,963；Sarkar和Li(2004)J Nutr.[营养学杂志]134(12增刊),3493S-3498S)；哌立福辛(例如，干扰Akt膜定位；Dasmahapatra等人(2004)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]10(15),5242-52,2004)；磷脂酰肌醇醚脂质类似物(例如，Gills和Dennis(2004)Expert.Opin.Investig.Drugs[研究药物专家评论]13,787-97)；和曲西立滨(TCN或API-2或NCI标识符：NSC 154020；Yang等人(2004)Cancer Res.[癌症研究]64,4394-9)。
MCl-1抑制剂包括但不限于AMG-176、MIK665和S63845。髓样细胞白血病-1(MCL-1)蛋白是B细胞淋巴瘤2(BCL-2)蛋白家族的关键抗凋亡成员之一。MCL-1的过表达与肿瘤进展以及不仅针对传统化学疗法还针对包括BCL-2抑制剂(例如ABT-263)的靶向疗法的抗性密切相关。
蛋白酶体抑制剂包括但不限于(卡非佐米)、(硼替佐米)和奥普佐米(oprozomib)。
免疫疗法包括但不限于抗PD-1剂、抗PDL-1剂、抗CTLA-4剂、抗LAG1剂和抗OX40剂。
单克隆抗体包括但不限于(达雷木单抗(daratumumab))、(曲妥珠单抗(trastuzumab))、(贝伐珠单抗(bevacizumab))、(利妥昔(rituximab))、(雷珠单抗(ranibizumab))、和(阿柏西普(aflibercept))。
免疫调节剂(IMiD)是一类含有酰亚胺基团的免疫调节药物(调节免疫反应的药物)。IMiD类包括沙利度胺及其类似物(来那度胺、泊马利度胺和阿米司特)。
包括但不限于抗体的抗PD-1抑制剂包括但不限于派姆单抗和纳武单抗示例性抗PD-1抗体及其使用方法描述于以下文献中：Goldberg等人,Blood[血液]110(1):186-192(2007)；Thompson等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]13(6):1757-1761(2007)；和Korman等人,国际申请案号PCT/JP 2006/309606(公开案号WO2006/121168 A1)，将其各自通过引用明确并入本文。包括：YervoyTM(伊匹单抗(ipilimumab))或曲美目单抗(Tremelimumab)(针对CTLA-4)、加利昔单抗(galiximab)(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、抗OX40(普罗维登斯卫生服务(Providence Health Services))、huMAbOX40L(针对OX40L)、阿塞西普(Atacicept)(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)(针对CD40)、达西珠单抗(Dacetuzumab)(针对CD40)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)。免疫疗法还包括遗传工程化的T细胞(例如，CAR-T细胞)和双特异性抗体(例如，BiTE)。
在特定的实施例中，本发明的化合物与抗PD-1抗体例如AMG404组合使用。在特定的实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合抗体片段)包括SEQ ID NO:1-6的1、2、3、4、5或所有6个CDR氨基酸序列(依次表示HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在特定实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合抗体片段)包含SEQ ID NO:1-6的所有6个CDR氨基酸序列。在其他实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合抗体片段)包含(a)SEQ ID NO:7中的重链可变区氨基酸序列或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％序列同一性的其变体序列，或(b)SEQ ID NO:8中的轻链可变区氨基酸序列或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％序列同一性的其变体序列。在一个示例性实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合抗体片段)包含SEQ ID NO:7中的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:8中的轻链可变区氨基酸序列。在其他实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合抗体片段)包含(a)SEQ IDNO:9的重链氨基酸序列或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％序列同一性的其变体序列，或(b)SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％序列同一性的其变体序列。在一个示例性实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合抗体片段)包含SEQ ID NO:9的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:10的轻链氨基酸序列。
本披露进一步提供了编码抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)的核酸序列。在示例性方面，抗体包含由SEQ ID NO:11-16的核酸编码的1、2、3、4、5或所有6个CDR(依次表示HCCDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在另一个示例性方面，该抗体包含由SEQ ID NO:11-16的核酸编码的所有6个CDR。在一些实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)包含(a)由SEQ ID NO:17编码的重链可变区或仅相差1、2、3、4、5或6个核酸或具有至少或约70％、85％、90％或95％序列同一性的其变体序列，或(b)由SEQ ID NO:18编码的轻链可变区或仅相差1、2、3、4、5或6个核酸或具有至少或约70％、85％、90％或95％序列同一性的其变体序列。在一个示例性的实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)包含由SEQID NO:17编码的重链可变区和由SEQ ID NO:18编码的轻链可变区。在其他实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)包含(a)SEQ ID NO:19编码的重链或仅相差1、2、3、4、5或6个核酸或具有至少或约70％、85％、90％或95％序列同一性的其变异序列，或(b)SEQ ID NO:20编码的轻链或仅相差1、2、3、4、5或6个核酸或具有至少或约70％、85％、90％或95％序列同一性的其变异序列。在一个示例性的实施例中，抗PD-1抗体(或其抗原结合部分)包含SEQID NO:19编码的重链和SEQ ID NO:20编码的轻链。使用CRISPR技术由鼠T-26结肠直肠细胞系(ATCC)产生CT-26KRAS p.G12C细胞，以用如SEQ ID NO:21编码的p.G12C(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))替代两个KRAS p.G12D等位基因。
GITR激动剂包括但不限于GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)，例如美国专利号6,111,090box.c、欧洲专利号：090505B1、美国专利号8,586,023、PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754中所述的GITR融合蛋白，或例如在以下中描述的抗GITR抗体：美国专利号7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公开号：WO 2011/028683、PCT公开号：WO 2013/039954、PCT公开号：WO 2005/007190、PCT公开号：WO 2007/133822、PCT公开号：WO 2005/055808、PCT公开号：WO 99/40196、PCT公开号：WO 2001/03720、PCT公开号：WO 99/20758、PCT公开号：WO 2006/083289、PCT公开号：WO 2005/115451、美国专利号7,618,632和PCT公开号：WO 2011/051726。
在本发明中，KRASG12C抑制剂也可以与CDK4和/或6抑制剂组合使用。可以用于本发明组合的CDK4和/或6抑制剂包括但不限于以下文件中披露的那些：PCT公开申请号WO2009/085185或美国专利申请公开号US 2011/0097305。
可在本发明的组合中与KRASG12C抑制剂组合使用的其他化合物包括抑制作为内在凋亡途径一部分的蛋白质的化合物。此类化合物的实例包括但不限于Bcl2/BclxL抑制剂(例如纳威托克斯(navitoclax))和Bcl2抑制剂(例如ABT-199)。
可在本发明的组合中与KRASG12C抑制剂组合使用的其他化合物包括BCR-ABL抑制剂，例如但不限于达沙替尼和HDAC抑制剂，例如帕比司他。
在本发明的组合中可以与KRASG12C抑制剂组合使用的其他化合物包括铂，例如顺铂、卡铂和奥沙利铂；拓扑异构酶II抑制剂，通常为蒽环类药物，例如多柔比星、道诺霉素、伊达比星、表柔比星、聚乙二醇化脂质体多柔比星盐酸盐、myocet和依托泊苷；拓扑异构酶I抑制剂，例如伊立替康(CPT-11)；DNA烷基化剂，例如替莫唑胺；核苷类似物，例如阿糖胞苷和地西他滨。
可在本发明的组合中与KRASG12C抑制剂组合使用的其他化合物包括受体和非受体激酶抑制剂，包括酪氨酸激酶抑制剂。此类化合物的实例包括伊马替尼、达沙替尼、帕纳替尼、博舒替尼、尼洛替尼、奎扎替尼、米司他林、厄洛替尼和拉帕替尼。
本文所述的化合物可以与本文所披露的药剂或其他适合的药剂组合使用，这取决于所治疗的病症。因此，在一些实施例中，本披露的一种或多种化合物将与如上所述的其他药剂共施用。在用于组合疗法中时，本文所述的化合物与第二药剂同时或分开施用。这种组合施用可以包括以相同剂型同时施用两种药剂、以单独剂型同时施用和分开施用。也就是说，本文所述的化合物和上述任何药剂可以一起配制于相同剂型中并同时施用。可替代地，本披露的化合物和上述任何药剂可以同时施用，其中两种药剂存在于单独配制品中。在另一个替代方案中，可以在施用本披露的化合物后立即施用上述任何药剂，或反之亦然。在单独施用方案的一些实施例中，本披露的化合物和上述任何药剂的施用相隔几分钟，或相隔几小时，或相隔几天。
由于本发明的一个方面考虑了用可以分开施用的药学活性化合物的组合治疗疾病/病症，本发明进一步涉及以试剂盒形式组合单独的药物组合物。该试剂盒包含两种单独的药物组合物：本发明的化合物和第二药物化合物。该试剂盒包含用于容纳单独组合物的容器，例如分开的瓶子或分开的箔袋。容器的其他实例包括注射器、盒和袋。在一些实施例中，该试剂盒包含单独组分的使用说明。在优选地以不同剂型(例如，口服和肠胃外)施用单独组分时，以不同剂量间隔施用时，或在开方的医护专业人员需要组合中个别组分的滴定时，试剂盒形式是特别有利的。
AMG 510的合成
本发明的KRASG12C抑制剂包括公开的PCT申请WO 2018/119183中披露的那些。如下所述，具有结构的AMG 510的合成在2018年5月21日提交的U.S.S.N.15/984,855中陈述，其要求2017年5月22日提交的临时申请号62/509,629的优先权和权益。
使用以下方法制备6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮，其中将最终产物拆分以分离M-阻转异构体。
步骤1：2,6-二氯-5-氟烟酰胺(中间体S)。向2,6-二氯-5-氟-烟酸(4.0g，19.1mmol，爱斯特科技有限公司(AstaTech Inc.),布里斯托尔,宾夕法尼亚州))在二氯甲烷(48mL)中的混合物中添加草酰氯(2M DCM溶液，11.9mL，23.8mmol)，随后添加催化量的DMF(0.05mL)。将反应在室温下搅拌过夜，然后浓缩。将残余物溶于1,4-二噁烷(48mL)中，并冷却至0℃。通过注射器缓慢添加氢氧化铵溶液(基于NH3 28.0％-30％，3.6mL，28.6mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌30min，然后浓缩。用EtOAc/庚烷的1:1混合物稀释残余物，并搅拌5min，然后过滤。丢弃过滤的固体，并将剩余的母液部分浓缩至一半体积并过滤。将过滤的固体用庚烷洗涤，并在减压烘箱(45℃)中干燥过夜，提供2,6-二氯-5-氟烟酰胺。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.23(d,J＝7.9Hz,1H)8.09(br s,1H)7.93(br s,1H)。m/z(ESI,+ve离子):210.9(M+H)+。
步骤2：2,6-二氯-5-氟-N-((2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)氨基甲酰基)烟酰胺。通过注射器向冰冷却的2,6-二氯-5-氟烟酰胺(中间体S，5.0g，23.9mmol)在THF(20mL)中的浆液中缓慢添加草酰氯(2M DCM溶液，14.4mL，28.8mmol)。将所得混合物在75℃下加热1h，然后停止加热，并将反应浓缩至一半体积。冷却至0℃后，通过套管逐滴添加THF(20mL)，随后添加2-异丙基-4-甲基吡啶-3-胺(中间体R，3.59g，23.92mmol)的THF(10mL)溶液。将所得混合物在0℃下搅拌1h，然后用盐水和饱和氯化铵水溶液的1:1混合物淬灭。将混合物用EtOAc萃取(3x)，将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，提供2,6-二氯-5-氟-N-((2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)氨基甲酰基)烟酰胺。该材料无需进一步纯化即可用于以下步骤。m/z(ESI,+ve离子):385.1(M+H)+。
步骤3：7-氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。通过注射器向冰冷却的2,6-二氯-5-氟-N-((2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)氨基甲酰基)烟酰胺(9.2g，24.0mmol)的THF(40mL)溶液中缓慢添加KHMDS(1M THF溶液，50.2mL，50.2mmol)。除去冰浴，并将所得混合物在室温下搅拌40min。用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，并用EtOAc萃取(3x)。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化(洗脱液：0-50％3：1EtOAc-EtOH/庚烷)，提供7-氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶基[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 12.27(brs,1H),8.48-8.55(m,2H),7.29(d,J＝4.8Hz,1H),2.87(quin,J＝6.6Hz,1H),1.99-2.06(m,3H),1.09(d,J＝6.6Hz,3H),1.01(d,J＝6.6Hz,3H)。19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ:-126.90(s,1F)。m/z(ESI,+ve离子):349.1(M+H)+。
步骤4：4,7-二氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮。通过注射器向7-氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(4.7g，13.5mmol)和DIPEA(3.5mL，20.2mmol)在乙腈(20mL)中的溶液中逐滴添加三氯氧化磷(1.63mL，17.5mmol)。将所得混合物在80℃下加热1h，然后冷却至室温并浓缩，提供4,7-二氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮。该材料无需进一步纯化即可用于以下步骤。m/z(ESI,+ve离子):367.1(M+H)+。
步骤5：4-(7-氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-叔丁基酯。向冰冷却的4,7-二氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮(13.5mmol)在乙腈(20mL)中的溶液中添加DIPEA(7.1mL，40.3mmol)，随后添加(S)-4-N-Boc-2-甲基哌嗪(3.23g，16.1mmol，Combi-Blocks有限公司(Combi-Blocks,Inc.),圣地亚哥市,加利福尼亚州,美国)。将所得混合物温热至室温并搅拌1h，然后用冷的饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)和EtOAc(300mL)稀释。将混合物再搅拌5min，分离各层，并将水层用更多的EtOAc萃取(1x)。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化(洗脱液：0-50％EtOAc/庚烷)，提供4-(7-氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-叔丁基酯。m/z(ESI,+ve离子):531.2(M+H)+。
步骤6：4-(6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸(3S)-叔丁基酯。将4-(7-氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸(S)-叔丁基酯(4.3g，8.1mmoL)，三氟(2-氟-6-羟基苯基)硼酸钾(中间体Q，2.9g，10.5mmol)，乙酸钾(3.2g，32.4mmol)和与二氯甲烷复合的[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(661mg，0.81mmol)在1,4-二噁烷(80mL)中的混合物用氮气脱气1min。添加脱氧水(14mL)，并将所得混合物在90℃加热1h。使反应冷却至室温，用半饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，并用EtOAc(2x)和DCM(1x)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化(洗脱液：0-60％3:1EtOAc-EtOH/庚烷)，提供4-(6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸(3S)-叔丁基酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.19(br s,1H),8.38(d,J＝5.0Hz,1H),8.26(dd,J＝12.5,9.2Hz,1H),7.23-7.28(m,1H),7.18(d,J＝5.0Hz,1H),6.72(d,J＝8.0Hz,1H),6.68(t,J＝8.9Hz,1H),4.77-4.98(m,1H),4.24(br t,J＝14.2Hz,1H),3.93-4.08(m,1H),3.84(br d,J＝12.9Hz,1H),3.52-3.75(m,1H),3.07-3.28(m,1H),2.62-2.74(m,1H),1.86-1.93(m,3H),1.43-1.48(m,9H),1.35(dd,J＝10.8,6.8Hz,3H),1.26-1.32(m,1H),1.07(dd,J＝6.6,1.7Hz,3H),0.93(dd,J＝6.6,2.1Hz,3H)。19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ:-115.65(s,1F),-128.62(s,1F)。m/z(ESI,+ve离子):607.3(M+H)+。
步骤7：6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮。将三氟乙酸(25mL，324mmol)添加4-(6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸(3S)-叔丁基酯(6.3g，10.4mmol)在DCM(30mL)中的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌1h，然后浓缩。将残余物溶于DCM(30mL)中，冷却至0℃，并依次用DIPEA(7.3mL，41.7mmol)和丙烯酰氯(0.849mL，10.4mmol)的DCM(3mL；通过注射器逐滴添加)溶液处理。将反应在0℃下搅拌10min，然后用半饱和碳酸氢钠水溶液淬灭，并用DCM萃取(2x)。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩。色谱法纯化残留物(硅胶；洗脱液：0-100％EtOAc-EtOH(3:1)/庚烷)，随后使用超临界流体色谱(Chiralpak IC，30×250mm，5μm，55％MeOH/CO2，120mL/min，102巴；收集第一个洗脱峰)进行手性拆分，提供AMG 510(2.25g，43％产率)。6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.20(s,1H),8.39(d,J＝4.8Hz,1H),8.24-8.34(m,1H),7.23-7.32(m,1H),7.19(d,J＝5.0Hz,1H),6.87(td,J＝16.3,11.0Hz,1H),6.74(d,J＝8.6Hz,1H),6.69(t,J＝8.6Hz,1H),6.21(br d,J＝16.2Hz,1H),5.74-5.80(m,1H),4.91(br s,1H),4.23-4.45(m,2H),3.97-4.21(m,1H),3.44-3.79(m,2H),3.11-3.31(m,1H),2.67-2.77(m,1H),1.91(s,3H),1.35(d,J＝6.8Hz,3H),1.08(d,J＝6.6Hz,3H),0.94(d,J＝6.8Hz,3H)。19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δppm-115.64(s,1F),-128.63(s,1F).m/z(ESI,+ve离子):561.2(M+H)+。
如本文所指，AMG 510是6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮的M阻转异构体，其具有下式：或其药学上可接受的盐。
中间体的合成
2-异丙基-4-甲基吡啶-3-胺(R)：将与二氯甲烷复合的[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(79mg，0.10mmol)添加到3-氨基-2-溴-4-甲基吡啶(3；360mg，1.9mmol，Combi-Blocks有限公司(Combi-Blocks),圣地亚哥市,加利福尼亚州)在THF(4mL)中的浆液中，将所得混合物用氩气鼓泡2min。添加2-丙基溴化锌(0.5MTHF溶液，5.40mL，2.7mmol)，并将所得溶液在60℃下加热17h，然后冷却至室温。添加水(10mL)和1N NaOH水溶液(20mL)，并将所得混合物用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。色谱法纯化残留物(硅胶，洗脱液：0-15％MeOH/DCM)，供给R(284mg，98％产率)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.66p.p.m.(d,J＝4.6Hz,1H),6.78(d,J＝4.8Hz,1H),4.72(br s,2H),3.14-3.25(m,1H),2.08(s,3H),1.14(d,J＝6.8Hz,6H)；m/z(ESI,+ve离子):151.1(M+H)+。
(2-氟-6-羟基苯基)三氟硼酸钾(Q)：将氟化钾(44.7g，770mmol)在水(75mL)中的溶液添加(2-氟-6-羟基苯基)硼酸(9；30g，192mmol，Combi-Blocks有限公司(Combi-Blocks),圣地亚哥市,加利福尼亚州)在乙腈(750mL)中的悬浮液中。搅拌2min后，经10min添加L-(+)-酒石酸(72.2g，481mmol)的THF(375mL)溶液。将所得混合物机械搅拌1h。通过过滤除去悬浮的固体，并用少量THF洗涤。然后将合并的滤液在真空中部分浓缩，直到固体开始沉淀。将滤液冷却至-20℃，搅拌16h，然后缓慢温热至环境温度。添加2-丙醇(20mL)，并通过过滤收集沉淀的固体，并用2-丙醇洗涤，提供27.5g固体。将滤液再次部分浓缩(直到观察到沉淀)，冷却至-20℃，并搅拌20min。添加另外的2-丙醇，并通过过滤收集沉淀的固体，并用2-丙醇洗涤。将两批固体合并，提供Q(34.6g，82％产率)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.07p.p.m.(q,J＝14.7Hz,1H),6.93(q,J＝7.5Hz,1H),6.30-6.38(m,2H)。
AMG 510丙酰胺的合成
(M)-6和(M)-11:通过超临界流体色谱法(Chiralpak AD，21×250mm，5μm，40％MeOH/CO2，80mL/min，110巴；收集到第二个洗脱峰)拆分消旋体6，提供(M)-6，使用针对外消旋底物报道的程序将其转化为(M)-11。
(M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-丙酰基-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮(AMG 510丙酰胺)：将三氟乙酸(4.0ml，51.9mmol)添加到(M)-11(0.196g，0.323mmol)在DCM(5mL)中的溶液中，并将所得混合物在室温下搅拌20min。然后将混合物真空浓缩，并将残余物吸收于DCM(10mL)中，冷却至0℃，并依次用DIPEA(0.169mL，0.969mmol)和丙酰氯(0.016mL，0.194mmol)处理。将所得混合物在0℃下搅拌10min，然后用饱和碳酸氢钠水溶液稀释并用DCM(2x)萃取。将合并的萃取物经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。色谱法纯化残留物(硅胶；洗脱液：0-70％EtOAc-EtOH(3:1)/庚烷)，提供AMG 510丙酰胺(0.180g，99％产率)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.20p.p.m(s,1H),8.40(d,J＝5.0Hz,1H),8.27(br dd,J＝15.1,9.3Hz,1H),7.27(m,1H),7.21(br d,J＝4.8Hz,1H),6.73(d,J＝8.3Hz,1H),6.69(t,J＝8.9Hz,1H),4.87(br s,1H),4.31(m,1.5H),4.21(br d,J＝13.5Hz,0.5H),3.94(br d,J＝12.2Hz,0.5H),3.82(br d,J＝13.3Hz,0.5H),3.62-3.76(m,1H),3.52-3.62(m,0.5H),3.43-3.51(m,0.5H),3.18(brdd,J＝13.3,3.3Hz,0.5H),3.06(br t,J＝10.7Hz,0.5H),2.73(br dd,J＝10.5,6.1Hz,1H),2.33-2.48(m,2H),1.91(s,3H),1.29-1.42(m,3H),0.98-1.12(m,6H),0.94(d,J＝6.6Hz,3H)；m/z(ESI,+ve离子):563.2(M+H)+。
在替代方法中，合成了AMG 510，并且相关中间体在2018年11月16日提交的美国临时专利申请号62/768,802中进行了描述。替代方法包括以下步骤，其中在步骤4和5中拆分外消旋-二酮促进阻转异构体的成功分离：
方法描述
步骤1
向2,6-二氯-5-氟-3-吡啶甲酸(化合物1)(25kg；119.1mol)在二氯甲烷(167kg)和DMF(592g)中的溶液中添加草酰氯(18.9kg；148.9mol)，同时保持内部温度在15℃-20℃之间。添加另外的二氯甲烷(33kg)作为冲洗液，并将反应混合物搅拌2h。冷却反应混合物，然后用氢氧化铵(40.2L；595.5mol)淬灭，同时保持内部温度为0℃±10℃。将所得浆液搅拌90min，然后通过过滤收集产物。将过滤的固体用去离子水(3×87L)洗涤，干燥，以提供2,6-二氯-5-氟烟酰胺(化合物2)。
步骤2
在反应器A中，向2,6-二氯-5-氟烟酰胺(化合物2)(16.27kg；77.8mol)的二氯甲烷(359.5kg)溶液添加草酰氯(11.9kg；93.8mol)，同时将温度保持≤25℃长达75min。然后将所得溶液加热至40℃±3℃并老化3h。使用真空，蒸馏溶液以除去二氯甲烷，直到溶液在搅拌器以下。然后添加二氯甲烷(300kg)，并将混合物冷却至0±5℃。向干净的干燥反应器(反应器B)中，添加2-异丙基-4-甲基吡啶-3-胺(苯胺)(12.9kg；85.9mol)，随后添加二氯甲烷(102.6kg)。将苯胺溶液通过真空蒸馏进行共沸干燥，同时保持内部温度在20℃-25℃之间，用另外的二氯甲烷替代，直至通过KF分析将该溶液干燥(极限值≤0.05％)。用二氯甲烷将溶液体积调节至约23L体积。然后将干燥的苯胺溶液添加到反应器A中，同时在整个添加过程中保持内部温度为0±5℃。然后将混合物加热至23℃并老化1h。将该溶液精细过滤至干净的反应器中，得到2,6-二氯-5-氟-N-((2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)氨基甲酰基)烟酰胺(化合物3)的DCM溶液并直接用于下一步。
步骤3
使用真空蒸馏将2,6-二氯-5-氟-N-{[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]氨基甲酰基}吡啶-3-甲酰胺(UREA(化合物3))(含有15kg；38.9mol)的二氯甲烷溶液溶剂更换成2-MeTHF，同时保持内部温度为20℃-25℃。将反应器体积调节至40L，然后充入另外的2-MeTHF(105.4kg)。添加叔丁醇钠(9.4kg；97.8mol)，同时保持5℃-10℃。将内容物温热至23℃并搅拌3h。然后将内容物冷却至0-5℃，并添加氯化铵(23.0kg；430mol)在60L去离子水中的溶液。将混合物温热至20℃，并添加去离子水(15L)，并进一步老化30min。停止搅拌并分离各层。除去水层，并向有机层中添加去离子水(81.7L)。制备浓HCl(1.5kg)和水(9L)的混合物，然后将其缓慢添加至反应器中，直到所测pH值在4-5之间为止。分离各层，并用2-MeTHF(42.2kg)反萃取水层。合并两个有机层，并用10％柠檬酸溶液(75kg)洗涤，随后用水(81.7L)和饱和NaCl(19.8kg)的混合物洗涤。然后将有机层用饱和碳酸氢钠(75kg)洗涤，如果必要的话，重复进行以达到水溶液目标pH≥7.0。再次用盐水(54.7kg)洗涤有机层，然后用硫酸镁(5kg)干燥。过滤混合物以除去硫酸镁，用2-MeTHF(49.2kg)冲洗滤床。将合并的滤液和洗涤液在真空下蒸馏至40L体积。将浓缩的溶液加热至55℃，并缓慢添加庚烷(10-12kg)直至达到浊点。经2h将溶液冷却至23℃，然后经2h添加庚烷(27.3kg)。将产物浆液在20℃-25℃下老化3h，然后过滤并用2-MeTHF(2.8kg)和庚烷(9kg)的混合物洗涤。使用氮气和真空干燥产物，得到固体7-氯-6-氟-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(外消旋-二酮(化合物4))。
步骤4
在氮气气氛下，向容器中，向化合物4(1.0当量)在2-甲基四氢呋喃(7.0L/kg)中的搅拌悬浮液添加(+)-2,3-二苯甲酰基-D-酒石酸(2.0当量)。2-MeTHF是手性的，但用作外消旋混合物。将2-MeTHF的不同对映异构体随机掺入共晶体中。将所得悬浮液温热至75℃并在75℃下老化直至观察到完全溶解(≤30min)。将所得溶液在75℃下精细过滤至第二容器中。以保持内部温度高于65℃的速率，向精细过滤的溶液中充入正庚烷(2.0L/kg)。然后将溶液冷却至60℃，用晶体(0.01kg/kg)接种，并老化30分钟。经4小时将所得悬浮液冷却至20℃，然后取样以通过HPLC进行手性纯度分析。向该悬浮液中充入正庚烷(3.0L/kg)，然后在氮气气氛下在20℃下老化4小时。将悬浮液过滤，并将分离的固体用(2:1)正庚烷:2-甲基四氢呋喃(3.0L/kg)洗涤两次。将该材料用氮气和真空干燥，得到间二酮:DBTA:Me-THF复合物(化合物4a)。
步骤5
在容器A中，搅拌磷酸氢二钠(21.1kg，2.0当量)在去离子水(296.8L，6.3L/kg)中的悬浮液，直到观察到溶解(≥30min)。在容器B中，将间二酮:DBTA:Me-THF复合物(组合物4a)[46.9kg(对于间二酮校正为25.9kg，1.0当量)]在甲基叔丁基醚(517.8L，11.0L/kg)中的悬浮液搅拌15至30分钟。将来自容器A的所得溶液添加至容器B，然后将混合物搅拌超过3小时。停止搅拌，并将双相混合物分离超过30分钟。除去下面的水相，然后用甲基叔丁基醚(77.7L，1.7L/kg)反萃取。将有机相在容器B中合并，并用硫酸镁(24.8kg，0.529kg/kg)干燥。将来自容器B的所得悬浮液搅拌超过三小时，并且然后过滤至容器C中。向容器B中充入甲基叔丁基醚(46.9L，1.0L/kg)冲洗液，并且然后过滤至容器C中。将容器C的内容物冷却至10℃，然后在真空下蒸馏，同时缓慢温热至35℃。继续蒸馏直到收集到320-350kg(6.8-7.5kg/kg)甲基叔丁基醚。将容器C的内容物冷却至20℃后，经1小时充入正庚烷(278.7L，5.9L/kg)，然后在真空下蒸馏，同时缓慢温热至35℃。继续蒸馏直到收集到190-200kg(4.1-4.3kg/kg)的甲基叔丁基醚和正庚烷的混合物。将容器C中的内容物冷却至20℃后，经1小时第二次充入正庚烷(278.7L，5.9L/kg)，然后在真空下蒸馏，同时缓慢温热至35℃。继续蒸馏直到收集到190-200kg(4.1-4.3kg/kg)的甲基叔丁基醚和正庚烷的混合物。将容器C的内容物冷却至20℃后，经1小时第三次充入正庚烷(195.9L，4.2L/kg)，然后采样以通过GC分析溶剂组成。继续搅拌容器C的悬浮液超过一小时。过滤该悬浮液，然后用正庚烷(68.6L，1.5L/kg)冲洗液从容器C中洗涤。将分离的固体在50℃下干燥，并提交样品便于储备。得到7-氯-6-氟-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(间二酮)化合物5M。
以上突出显示的第一代方法已成功按比例放大至200+kg外消旋-二酮起始材料(化合物5)。在此方法中，用热力学稳定的外消旋-二酮晶体形式(表现出低溶解度)接种会导致批次失败。基于我们的后续研究，我们发现通过调节庚烷进料时间表来提高DBTA当量并降低种子温度，提高了方法的稳健性。改善的方法可抵抗热力学稳定的外消旋-二酮晶体形式的存在，并促进阻转异构体的成功分离。随后的批次将合并改善的方法进行大规模制造。
步骤6
将7-氯-6-氟-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(间二酮)(3.7kg；9.8mol)与10.5kg甲苯在反应器(A)中合并，蒸馏到只剩油以除去水，同时保持设定点为45℃。将甲苯(21kg)添加到残余物中，并将混合物在40℃-45℃下搅拌30min。将内容物冷却至22℃，然后添加磷酰氯(1.8kg；11.7mol)。将混合物冷却至0-5℃，然后添加N,N-二异丙基乙胺(2.5kg；19.34mol)，同时保持温度<5℃。将该溶液在22℃下老化3h。在单独的反应器(B)中，将(s)-1-boc-3-甲基哌嗪(2.21kg；10.8mol)和N,N-二异丙基乙胺(1.26kg；9.75mol)合并在甲苯(6kg)中，然后充入反应器(A)中，同时保持<25℃。将反应混合物在22℃下老化15min，然后用碳酸氢钠(973g)的水(12.9L)溶液淬灭，同时保持温度<25℃。将混合物搅拌30min，然后添加DCM(36.8kg)，同时继续搅拌1h。使各层分离，并将下部有机层排至反应器(C)。用DCM(18.4kg)反萃取反应器(A)中的水层，将合并的有机层用盐水溶液(6.0kg NaCl；16.5kg去离子水)洗涤。将有机层在大气压下蒸馏，保持内部温度在45℃-55℃之间。在蒸馏过程中将DCM替代以共沸干燥溶液。蒸馏后，使用DCM将溶液体积调节至19L。将该溶液冷却至30℃，并精细过滤。将滤液与乙酸乙酯(8.5kg)合并，然后在大气压下蒸馏直到在接收器中收集到11-13kg。将溶液用30g真品接种，然后在25℃-30℃下老化1h，然后在45℃-55℃内部温度下于大气压下进一步蒸馏，直到收集到8.2kg馏出液为止。将浆液冷却至22℃并老化过夜，然后进一步冷却至0-5℃。通过过滤收集产物，并用乙酸乙酯洗涤两次(每次4.2kg)。将滤饼用氮气和真空干燥，得到(3S)-4-{7-氯-6-氟-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基}-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物6，PIPAZOLINE)。
步骤7
向反应器中添加脱气的二噁烷(74.2kg)、(3S)-4-{7-氯-6-氟-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基}-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物6，Pipazoline)(24.0kg，45.2mol)、乙酸钾(22.2kg，45.2mol)和(dppf)PdCl2(0.74kg，1.01mol)。将反应器用氮气惰性化。向溶液中鼓泡入氮气直至氧气含量<500mg/L。将反应加热至87.5℃。将三氟(2-氟-6-羟基苯基)硼酸钾(12.6kg，54.3mol)在脱气的二噁烷(49.4kg)和脱气的水(14.4kg)中的含氧量<500mg/L的溶液转移到反应中，保持内部温度为82.5℃±7.5℃。将反应调节至87.5℃±1.5℃，并搅拌75min±15min。向反应器中充入1.0M EDTA溶液(47.3kg)，随后充入水(40.1kg)，同时保持内部温度为85℃±5℃。经>2h将反应混合物冷却至20℃±3℃，然后搅拌>16h。将反应过滤，并将粗固体用水(3×120kg)冲洗。将固体用庚烷(28.8kg)和2-丙醇(33.1kg)的混合物冲洗，然后在<50℃下干燥>10h。在干净的反应器中装入粗固体和二氯甲烷(240kg)。将内容物在20℃±5℃下搅拌>30min。向反应器中添加硅硫醇(144kg)和二氯甲烷(14.9kg)。将反应在20℃±5℃下搅拌18h。将反应过滤并用二氯甲烷(84kg)冲洗。蒸馏溶液，并将溶剂交换为2-丙醇。将反应加热至60℃±3℃，充入庚烷(108kg)，同时保持反应温度为60℃±3℃。将反应搅拌45min，然后冷却并在20℃±5℃下搅拌2.5h。将反应过滤并用50体积％庚烷/2-丙醇(61.9kg)冲洗。将分离出的固体在<50℃下干燥>12h，得到(3S)-4-{6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基}-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物7，BIARYL)。
步骤8
一般注释：所有当量和体积均参考BIARYL 7报告
向反应器中添加(3S)-4-{6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]-2-氧-1,2-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-基}-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物7，BIARYL)(2.75kg，5.27mol)、DCM(13.7L)和TFA(5.67kg，49.7mol)。将反应在20℃±5℃下搅拌8-16h。向第二反应器中添加碳酸钾(11.24kg)、水(54.8L)和甲醇(13.7L)以形成均匀溶液。经2h将反应混合物添加碳酸钾溶液中。将混合物在20℃±5℃下再搅拌12h。过滤所得浆液，并用水(2×27.5L)冲洗。将湿滤饼干燥24h，得到6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-4-[(2S)-2-甲基哌嗪-1-基]-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮(化合物8，DESBOC)。
步骤9
一般注释：所有当量和体积均参考Des-BOC报告
将6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-4-[(2S)-2-甲基哌嗪-1-基]-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮(化合物8，DESBOC)(156.25g)与N-甲基吡咯烷酮(625mL)合并并在环境温度下搅拌。向所得溶液中添加丙烯酰氯(36.29g；401.0mmol)，同时保持<30℃内部温度。在25℃下将内容物搅拌2h。在单独的反应器中，制备磷酸二钠(175.1g；1234mmol)在去离子水(3.1L)中的溶液。然后在25℃下经>2h将粗产物溶液转移到含有磷酸二钠溶液的反应器中。在添加到一半时中将浆液加热至45℃，并且在完全添加之后，在相同温度下老化2h。将混合物冷却至25℃并老化4h，然后通过真空过滤收集固体。用水洗涤固体两次(每次1.5L)，将产物在氮气和真空下干燥，得到产物6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]-4-[(2S)-2-甲基-4-(丙-2-烯酰基)哌嗪-1-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮(粗制化合物9)。4
步骤10
一般注释：所有当量和体积均参考粗药物物质报告
将6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]-4-[(2S)-2-甲基-4-(丙-2-烯酰基)哌嗪-1-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮(粗化合物9)(142.33g；253.9mmol)与乙醇(996mL)和水(270mL)合并。添加乙酸(21.8ml；380.8mmol)，并将混合物加热至75℃以形成溶液，将其精细过滤至干净的反应器中。将该溶液冷却至45℃，然后添加水(1067mL)，同时保持内部温度>40℃。将该溶液用真品化合物9接种，将所得混合物老化30min。然后经2h添加水(1138mL)。将混合物冷却至25℃并老化8h，然后通过真空过滤收集固体，并使用乙醇(355.8mL)和水(711.6mL)的混合物洗涤。使用真空和氮气干燥固体，以获得6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-(1M)-1-[4-甲基-2-(丙烷-2-基)吡啶-3-基]-4-[(2S)-2-甲基-4-(丙-2-烯酰基)哌嗪-1-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮(化合物9)。
步骤A1反应方案和进料表
向反应器A中充入THF(6体积)和二异丙胺(1.4当量)。将所得溶液冷却至-70℃，并缓慢添加n-BuLi(2.5M己烷，1.5当量)。加完后，缓慢添加3-氟苯甲醚(1.0当量)在THF(6体积)中的溶液，并在-70℃下保持5min。缓慢添加B(EtO)3(2.0当量)，并在-70℃下保持10min。将反应混合物用2N HCl淬灭。用MTBE(3×4体积)萃取淬灭的反应混合物。将合并的有机相浓缩至1.5～3总体积。逐滴添加庚烷(7-9体积)，并将混合物冷却至0-10℃，搅拌3h。将混合物过滤并用庚烷(1.5体积)冲洗。将固体在<30℃下在氮气下干燥，得到(2-氟-6-甲氧基苯基)硼酸。
步骤A2反应方案和进料表
向反应器A中充入二氯甲烷(4体积)和2-氟-6-甲氧基-4-甲基苯基硼酸(1当量)。将反应混合物冷却至-30℃，并逐滴添加1.5BBr3(1.5当量)。加完后，将混合物温热至25℃，并搅拌2h。将反应混合物在冰冷的(0-5℃)水(10体积)中淬灭。添加MTBE(10体积)，将混合物温热至25℃，并搅拌1-2h或直至所有固体溶解。分离水相，并用MTBE(3体积)萃取。用水(3体积)洗涤合并的有机萃取物，然后浓缩至1总体积。将庚烷(10体积)添加到混合物中并搅拌2h。通过过滤分离所得产物，并在<30℃下干燥，得到(2-氟-6-羟基苯基)硼酸。
步骤A3反应方案和进料表
步骤A3
在反应器(反应器A)中将氟化钾(21.0kg；20.87mol)与水(28L)合并，并将内容物搅拌30min。在单独的反应器(反应器B)中，在25℃下充入(2-氟-6-羟基苯基)硼酸(14.00kg，89.79mol)，随后充入乙腈(206.1kg)和柠檬酸(30.94kg；147.26mol)。在25℃下将反应器A的内容物添加反应器B中，并在该温度下搅拌10h。通过硅藻土床(7.0kg)过滤反应混合物，并用乙腈(42kg)冲洗。将滤液与异丙醇(56kg)合并，然后在真空下在<35℃的温度下蒸馏，用异丙醇替代反应器的蒸馏体积，并根据需要重复进行以完成从乙腈到异丙醇的溶剂交换。将浆液冷却至15℃并老化1h，然后过滤并用28kg异丙醇洗涤。使用真空和氮气干燥滤饼并包装，得到化合物A3。
间二酮化合物5的拆分
间二酮中间体的色谱拆分
使用了许多手性色谱技术和方法以从化合物4中分离间二酮。该技术和固定相在本领域中是熟知的，并列于表1中。
表1
^产率定义为以>98％ee的所需纯度回收的可用间二酮的％。
*该分离进行了多次。对于每批材料，可能已对流动相进行了稍微修改，以适应批次中的变化。用于纯化的其他流动相包括：
1)25/75甲醇/CO2，
2)30/70甲醇/CO2，以及
3)50/50甲醇/CO2。
SFC、HPLC和SMB技术是本领域熟知的，并且固定相可购自商业来源，例如飞世尔科技公司(Fisher Scientific)和大赛璐公司(Daicel Corporation)。
然而，期望开发出更有效的方法来分离间二酮(化合物5)。
经典拆分
本发明涉及用于间/对-二酮外消旋体(化合物4)的可行的经典拆分方法的开发。
总共进行了100次共晶筛选实验，并鉴定出三种潜在的二酮的共晶。基于残留固体中，间/对-二酮的最高面积比和上清液中的最低面积比，选择(+)-2,3-二苯甲酰基-D-酒石酸(DBTA)作为手性试剂进行拆分。
根据100次共晶筛选实验和20次更多的溶剂筛选的结果，发现2-MeTHF/正庚烷比其他溶剂系统提供更好的拆分结果。基于间-二酮共晶和对-二酮共晶在不同比例的2-MeTHF和正庚烷下的溶解度结果，选择2-MeTHF/正庚烷(1.4:1，v/v)作为最佳溶剂组合物进行拆分。
为了找出手性拆分结晶过程中转化为二酮外消旋体或间/对-二酮的任何可能形式，确定间-二酮共晶、对-二酮共晶、间+对-二酮共晶混合物(1:1，w/w)、二酮外消旋体和DBTA在不同温度下在2-MeTHF/正庚烷(1.4:1，v/v)中的溶解度。在不同温度下持续7天未观察到间-二酮共晶和对-二酮共晶的形式变化。但是，在不同温度下将间+对-二酮共晶混合物(1:1，w/w)的混合物搅拌7天后，获得C型二酮外消旋体。在相应温度下搅拌二酮外消旋体7天后，观察到D型二酮外消旋体(20℃和30℃)或C型二酮外消旋体(40℃、50℃、60℃和65℃)。在所有温度下，DBTA的溶解度均为约100mg/mL。
为了进一步优化拆分过程，基于平衡溶解度结果绘制了间/对-二酮共晶的三元相图，并且未获得共晶点，这可能是因为当存在间-二酮共晶和对-二酮时，C型外消旋体会结晶出来。基于平衡溶解度结果绘制了间/对-二酮的另一个三元相图，并且未获得共晶点，这可能是因为当存在间-二酮共晶和对-二酮时，C型或D型二酮外消旋体会结晶出来。
总之，已鉴定出用于拆分二酮外消旋体的手性试剂(DBTA)和溶剂系统((2-MeTHF/正庚烷(1.4:1，v/v))。使用该拆分试剂和溶剂系统进行小规模结晶过程，对间-二酮的产率可达39％，ee纯度可达99％。另外，在筛选实验中观察和研究了二酮外消旋体的多态性。
本发明的化合物还可以与治疗恶心的药学活性药剂组合使用。可以用于治疗恶心的药剂的实例包括：屈大麻酚；格拉司琼；甲氧氯普胺；昂丹司琼；和丙氯拉嗪；或其药学上可接受的盐。
本发明的化合物还可以与放射疗法、激素疗法、手术和免疫疗法组合使用，这些疗法是本领域技术人员所熟知的。
由于本发明的一个方面考虑了用可以分开施用的药学活性化合物的组合治疗疾病/病症，因此本发明进一步涉及以试剂盒形式组合单独的药物组合物。该试剂盒包含两种单独的药物组合物：本发明的化合物和第二药物化合物。该试剂盒包含用于容纳单独组合物的容器，例如分开的瓶子或分开的箔袋。容器的其他实例包括注射器、盒和袋。通常，该试剂盒包含单独组分的使用说明。在优选地以不同剂型(例如，口服和肠胃外)施用单独组分时，以不同剂量间隔施用时，或在处方医师或兽医需要组合中个别组分的滴定时，试剂盒形式是特别有利的。
这种试剂盒的实例是所谓的泡罩包装。泡罩包装在包装工业中是熟知的，并且被广泛用于药物单位剂型(片剂、胶囊等)的包装。泡罩包装通常由相对坚硬的材料的片组成，该材料的片覆盖有优选透明塑料材料的箔。在包装过程中，在塑料箔中形成了凹槽。凹槽具有待包装的片剂或胶囊的大小和形状。然后，将片剂或胶囊放入凹槽中，将相对坚硬的材料的片在箔的与凹槽形成方向相反的面上密封在塑料箔上。结果，片剂或胶囊被密封在塑料箔和片之间的凹槽中。优选地，片的强度使得可以通过在凹槽上手动施加压力而在片中的凹槽处形成开口，从而可从泡罩包装中取出片剂或胶囊。然后可以通过所述开口取出片剂或胶囊。
可能需要在试剂盒上提供记忆辅助，例如以片剂或胶囊旁边的数字的形式，其中数字对应于应摄入如此指定的片剂或胶囊的方案的天数。这种记忆辅助的另一个实例是印在卡上的日历，例如，如下所示：“第一周，星期一，星期二......等......，第二周，星期一，星期二......”等。记忆辅助的其他变化将是易于了解的。“日剂量”可以是在给定的一天服用的单个片剂或胶囊或若干个丸剂或胶囊。而且，本发明的化合物的日剂量可以由一个片剂或胶囊组成，而第二种化合物的日剂量可以由若干个片剂或胶囊组成，且反之亦然。记忆辅助应反映这一点，并有助于正确地施用活性剂。
在本发明的另一特定实施例中，提供了一种分配器，该分配器被设计成按其预期用途的顺序一次分配一次日剂量。优选地，分配器配备有记忆辅助，以便进一步促进对方案的依从性。这种记忆辅助的一个实例是机械计数器，该机械计数器指示已分配的日剂量数。这种记忆辅助的另一个实例是电池供电的微芯片存储器，该微芯片存储器与液晶读数或听觉提醒信号相偶联，例如，该读数或信号读出上一次服用日剂量的日期和/或提醒下一次服药的日期。
如果需要，可以将本发明的化合物和其他药物活性化合物口服、直肠、肠胃外(例如静脉内、肌肉内或皮下)脑池内、阴道内、腹膜内、膀胱内、局部(例如粉末、软膏剂或滴剂)、或以经颊或鼻腔喷雾剂施用给患者。考虑了本领域技术人员用来施用药学活性药剂的所有方法。
适用于肠胃外注射的组合物可包含生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液、以及用于重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。适合的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其适合的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。可以例如通过使用例如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下，通过保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过添加各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可以防止微生物污染。还可能希望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物组合物的延长吸收。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、粉末和颗粒。在这样的固体剂型中，将活性化合物与以下混合：至少一种惰性惯用赋形剂(或载体)(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)或(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如甘油；(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些复合的硅酸盐和碳酸钠；(a)溶液缓凝剂，例如石蜡；(f)吸收促进剂，例如季铵化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土；以及(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠或其混合物。在胶囊和片剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物也可以在使用例如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中用作填充剂。
固体剂型例如片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒可以用包衣和外壳，例如肠溶包衣和本领域熟知的其他形式制备。它们还可以含有遮光剂，并且也可以具有这样的组合物，使得它们以延迟的方式在肠道的某些部分中释放一种或多种活性化合物。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。若适当，活性化合物还可呈具有一种或多种上述赋形剂的微囊封形式。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型还可含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄基醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油，尤其是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻籽油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、或这些物质的混合物等。
除了这种惰性稀释剂之外，组合物还可以包含佐剂，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和加香剂。除活性化合物外，悬浮液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶、或这些物质的混合物等。
用于直肠施用的组合物是优选的栓剂，其可以通过将本发明的化合物与适合的无刺激性的赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合而制备，它们在普通室温下为固体，但是在体温下为液体，并且因此会在直肠或阴道腔中融化并释放出活性组分。
用于本发明的化合物的局部施用的剂型包括软膏剂、粉末、喷雾剂和吸入剂。将一种或多种活性化合物在无菌条件下与生理上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼科配制品、眼膏、粉末和溶液也被认为在本发明的范围内。
本发明的化合物可以以每天约0.1至约3,000mg范围内的剂量水平施用给患者。对于体重约70kg的正常成年人，在每千克体重约0.01至约100mg范围内的剂量通常就足够了。可以使用的具体剂量和剂量范围取决于许多因素，包括患者的需求，所治疗的病症或疾病的严重性以及所施用化合物的药理活性。如果该化合物已经被批准，则本发明的化合物的特定剂量是FDA批准的剂量。
本发明的化合物可作为药学上可接受的盐、酯、酰胺或前药施用。术语“盐”是指本发明的化合物的无机和有机盐。这些盐可在化合物的最终分离及纯化期间原位制备，或通过使经纯化的化合物以其游离碱或酸形式与适合有机或无机碱或酸单独反应且分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。盐可以包括基于碱金属和碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。参见，例如，S.M.Berge,等人,“Pharmaceutical Salts[药用盐],”JPharm Sci[药物科学杂志],66:1-19(1977)。
本发明的化合物的药学上可接受的酯的实例包括C1-C8烷基酯。可接受的酯还包括C5-C7环烷基酯，以及芳烷基酯，例如苄基酯。通常使用C1-C4烷基酯。本发明的化合物的酯可以根据本领域熟知的方法制备。
本发明的化合物的药学上可接受的酰胺的实例包括衍生自氨、C1-C8烷基伯胺和C1-C8二烷基仲胺的酰胺。在仲胺的情况下，胺也可以是含有至少一个氮原子的5或6元杂环烷基的形式。通常使用衍生自氨、C1-C3烷基伯胺和C1-C2二烷基仲胺的酰胺。本发明的化合物的酰胺可以根据本领域技术人员熟知的方法制备。
术语“前药”是指在体内转化以产生本发明的化合物的化合物。转化可以通过多种机制发生，例如通过在血液中水解。前药的使用的论述提供于T.Higuchi及W.Stella，“Prodrugs as Novel Delivery Systems[作为新颖给药系统的前药]”,A.C.S.SymposiumSeries[A.C.S.研讨会文集]的第14卷及Bioreversible Carriers in Drug Design[药物设计中的生物可逆载体],Edward B.Roche编辑,American Pharmaceutical Associationand Pergamon Press[美国制药协会和佩加蒙出版社],1987中。
为了说明，因为本发明的化合物含有羧酸官能团，所以前药可包含通过用例如以下的基团替代酸基的氢原子所形成的酯：(C1-C8)烷基、(C2-C12)烷酰基氧基甲基、具有4至9个碳原子的1-(烷酰基氧基)乙基、具有5至10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰基氧基)乙基、具有3至6个碳原子的烷氧基羰基氧基甲基、具有4至7个碳原子的1-(烷氧基羰基氧基)乙基、具有5至8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰基氧基)乙基、具有3至9个碳原子的N-(烷氧基羰基)氨基甲基、具有4至10个碳原子的1-(N-(烷氧基羰基)氨基甲基、3-酞基、4-巴豆酸内酯基(4-crotonolactonyl)、γ-丁内酯-4-基、二-N,N-(C1-C2)烷基氨基(C2-C3)烷基(例如β-二甲基氨基乙基)、胺甲酰基-(C1-C2)烷基、N,N-二(C1-C2)烷基胺甲酰基-(C1-C2)烷基及哌啶并(C2-3)烷基、吡咯烷并(C2-3)烷基或吗啉基(C2-3)烷基。
本发明的化合物可以含有不对称或手性中心，并且因此以不同的立体异构形式存在。预期化合物的所有立体异构形式及其混合物(包括外消旋混合物)构成本发明的一部分。另外，本发明涵盖所有几何和位置异构体。例如，如果化合物含有双键，则考虑顺式和反式形式(分别称为Z和E)以及混合物。
可以基于物理化学差异通过已知方法(例如色谱法和/或分段结晶)将立体异构体的混合物(例如非对映异构体混合物)分离为其个别立体化学组分。对映异构体还可通过以下来分离：通过与适当光学活性化合物(例如醇)反应将对映异构体混合物转化为非对映异构体混合物，分离非对映异构体且将个别非对映异构体转化(例如水解)成相应纯对映异构体。而且，一些化合物可以是阻转异构体(例如，取代的联芳基)。
本发明的化合物可以非溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂(例如水(水合物)、乙醇等)的溶剂化形式存在。本发明考虑并涵盖溶剂化和非溶剂化形式。
本发明的化合物也可能以不同的互变异构形式存在。考虑了本发明的化合物的所有互变异构体。例如，四唑部分的所有互变异构形式都包括在本发明中。而且，例如，化合物的所有酮-烯醇或亚胺-烯胺形式都包括在本发明中。
本领域技术人员应认识到，本文所含有的化合物名称及结构可基于化合物的具体互变异构体。尽管可使用仅用于具体互变异构体的名称或结构，但除非另有说明，否则本发明意欲涵盖所有互变异构体。
本发明还意欲涵盖使用实验室技术(例如合成化学师所熟知的那些技术)在活体外合成的化合物；或使用体内技术(例如通过代谢、发酵、消化等)合成的化合物。还预期本发明的化合物可使用体外和体内技术的组合来合成。
本发明还包括同位素标记的化合物，其与本文所述的那些相同，但是由于以下事实：一个或多个原子被具有与通常在自然界中发现的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子替代。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如2H、3H、13C、14C、15N、16O、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。在一方面，本发明涉及其中一个或多个氢原子被氘(2H)原子替代的化合物。
含有前述同位素和/或其他原子的其他同位素的本发明的化合物在本发明的范围内。本发明的某些同位素标记的化合物(例如其中掺入有放射性同位素如3H和14C的那些)可用于药物和/或底物组织分布测定。由于易于制备和检测，因此氚化即3H和碳-14即14C同位素是特别优选的。进一步地，用更重同位素(例如氘，即2H)取代可以提供源自较高代谢稳定性的某些治疗优势(例如，延长的体内半衰期或降低的剂量要求)，并且因此在一些情况下是优选的。通常可以通过用容易获得的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂来制备本发明的同位素标记的化合物。
本发明的化合物可以多种固体状态(包括结晶状态)及作为非晶形状态存在。预期本发明化合物的不同结晶状态(还称为多晶型)及非晶形状态为本发明的一部分。
在合成本发明的化合物时，可能希望使用某些离去基团。术语“离去基团”(“LG”)通常是指可被亲核试剂置换的基团。这样的离去基团是本领域已知的。离去基团的实例包括但不限于卤化物(例如I、Br、F、Cl)、磺酸盐(例如甲磺酸盐、甲苯磺酸盐)、硫化物(例如SCH3)、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑等。亲核试剂的实例包括但不限于胺、硫醇、醇、格氏试剂、阴离子物质(例如醇盐、酰胺、碳负离子)等。
本文引用的所有专利、专利申请和其他文件均通过引用全文并入本文。
下文所呈现的实例说明本发明的具体实施例。这些实例是代表性的，无意以任何方式限制权利要求书的范围。
实例
已开发出AMG 510作为KRASG12C的口服生物利用型共价抑制剂，其具有强大的生化和细胞活性，并且具有强大的体内功效。用AMG 510处理的NCI-H358细胞的半胱氨酸蛋白质组分析显示，只有KRAS的含G12C肽被共价修饰。AMG 510抑制重组突变体KRASG12C/C118A的SOS催化的核苷酸交换，但对KRASC118A(在位置12处为野生型)的影响很小。在细胞测定中，AMG510共价修饰KRASG12C，并抑制KRASG12C信号传导，如通过ERK1/2在测试的所有KRAS p.G12C突变细胞系中的磷酸化所测量，但没有抑制ERK1/2在具有其他各种KRAS突变的细胞系中的磷酸化。AMG 510还选择性损害KRASp.G12C突变细胞系的活力，但不影响具有其他KRAS突变的细胞系。体内药效学测定展示KRASG12C信号传导受到剂量和时间依赖性抑制，如通过在人胰腺(MIA PaCa-2 T2)和NSCLC(NCI-H358)肿瘤异种移植物中ERK1/2(p-ERK)的磷酸化所测量。通过质谱法测量了AMG 510对KRASG12C的共价修饰，并与肿瘤中p-ERK的抑制相关。在荷瘤小鼠中进行的时程研究展示，AMG 510的血浆暴露在给药后0.5小时达到峰值，紧接着肿瘤中p-ERK受到抑制。AMG 510在更高剂量下显著抑制MIA PaCa-2 T2和NCI-H358异种移植物的生长，并导致肿瘤消退。用共价KRASG12C抑制剂处理KRAS p.G12C细胞系增加HLA的表达。AMG 510与其他细胞信号传导通路抑制剂的组合处理表现出对细胞活力的协同作用的证据。与任一种单一药剂相比，AMG 510与护理标准卡铂的组合治疗展示出增强的NCI-H358肿瘤生长抑制作用。类似地，与任一种单一药剂相比，AMG 510与MEK抑制剂的组合导致增强的抗肿瘤功效。
为了测试KRASG12C抑制对体内免疫监视的影响，产生了一种新颖同系肿瘤细胞系，其适用于结合检查点抑制剂疗法测试AMG 510，并且因此体外表征。在新开发的KRAS-G12C突变癌症模型中，AMG510治疗显著抑制肿瘤生长并引起消退。意外的是，AMG 510与免疫检查点抑制剂的组合导致显著提高了总存活率，并导致了持久治愈。鼠KRAS p.G12C肿瘤的免疫分型显示治疗后T细胞浸润显著增加，这表明AMG 510可能诱导对免疫检查点抑制更敏感的肿瘤微环境。
新颖同系CT-26KRAS p.G12C肿瘤模型
鼠CT26(结肠癌#26)细胞是1975年通过将BALB/c小鼠暴露于N-亚硝基-N-甲基聚氨酯(NMU)而开发的，导致易于植入并且易于转移的快速生长的IV级癌。在500多个已发表的研究中使用的CT26结肠癌是药物开发中最常用的细胞系之一。用这些细胞已经研究了许多细胞毒性剂以及靶向特定信号传导通路的治疗剂。此外，由于BALB/c小鼠中的CT26模型提供了同系体内测试系统，因此它经常用于开发和测试免疫治疗概念。BMC Genomics.[BMC基因组学]2014年3月13日；15:190.doi:10.1186/1471-2164-15-190.Immunomic,genomicand transcriptomic characterization of CT26 colorectal carcinoma[CT26结肠直肠癌的免疫，基因组和转录组学表征]。
如表A和图3、4、5、6、18、24、31、34、38和39所概述，开发了同系CT-26KRAS p.G12C肿瘤模型以实现与细胞系和免疫疗法的组合研究。基于其亲本系中存在KRAS-G12D突变而选择CT-26同系肿瘤细胞系。KRAS-G12D突变的存在表明细胞系生长和存活可能受到组成型KRAS信号传导(G12D)驱动，并且潜在地对KRAS抑制敏感。CT-26KRAS p.G12C细胞是从CT-26鼠结肠直肠肿瘤细胞系产生的。如Liang等人(Journal of Biotechnology[生物技术杂志]241(2017)136-146)在现有技术中所述的CRISPR技术用于利用序列CTTGTGATGGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO:21)，将两个KRAS p.G12D等位基因替代为KRAS p.G12C。通过下一代测序(NGS)，克隆10被确定对于KRAS p.G12C等位基因是纯合的，并被鉴定为CT-26KRAS G12C-H10。这种新型分离的同系肿瘤细胞系CT-26KRAS p.G12C允许通过AMG 510抑制KRAS信号传导，并用于所有CT-26G12C体内研究(参见图3、4、5和6)和体外研究(参见图18、24、31、34、38和39)。
本发明涵盖包含两个KRASG12C等位基因的新颖分离的细胞系和产生包含两个KRASG12C等位基因的细胞系的方法，所述方法包括：
a)将包含两个KRASG12D等位基因的细胞系与CRISPR构建体一起孵育，所述CRISPR构建体诱导两个KRAS等位基因上的核苷酸替代，从而形成两个KRASG12C等位基因；以及
b)分离包含两个KRASG12C等位基因的细胞系。
下一代测序(NGS)(也称为高通量测序)是一种通用术语，用于描述许多不同的现代测序技术，其包括：
·Illumina(Solexa)测序
·罗氏(Roche)454测序
·离子激流(Ion torrent)：质子/PGM测序
·SOLiDTM测序
将可购自赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fisher Scientific)的IonTorrentTMPersonal Genome MachineTM平台用于本发明。这些最新技术使科学家能够比以前使用的桑格(Sanger)测序更快并更便宜地对DNA和RNA进行测序。
体外基于细胞的组合研究
细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms andCell Cultures，DSMZ)和日本研究生物资源保藏中心(Japanese Collection of ResearchBioresources，JCRB)。将每个细胞系在其推荐的生长培养基中培养。
对于双向化合物组合，将细胞以范围从500至2500个细胞/孔的初始密度接种到96孔或384孔细胞培养板中。16至24小时后，将化合物以矩阵形式添加到培养板中，其中一种试剂沿x轴滴定，并且第二种试剂沿y轴滴定。对于在任何给定细胞系中测试的所有组合，选择每种化合物的起始高浓度和稀释因子以在针对组合筛选形式所选择的剂量范围内很好地定义曲线最大值，曲线最小值和斜率。使用CellTiter-发光细胞活力(普洛麦格公司(Promega))测定试剂盒以确定活细胞的数量。
在添加化合物之前在零时(V0)以及化合物处理72小时后，用多标记读取器(珀金埃尔默公司(Perkins Elmer))测量每个细胞系的发光。根据以下等式，以200点制计算生长抑制(GI)，其中V72是72小时DMSO对照的发光，T72是化合物处理的样品的发光：如果T72>V0，则GI＝100x(1-((T72-V0)/(V72-V0)))；如果T72<V0，则GI＝100x(1-((T72-V0)/V0))。GI值0、100和200分别代表不受抑制的细胞生长(即DMSO对照)、细胞停滞和完全细胞杀伤。使用4参数逻辑模型绘制S形剂量反应曲线。使用ChaliceTM分析软件(Zalicus公司)分析数据以产生协同相互作用，该软件基于Loewe加和性模型生成协同作用得分。
如前所述计算矩阵每个孔的生长抑制，并使用ChaliceTM分析软件(Zalicus公司；剑桥,马萨诸塞州)分析数据以得出协同相互作用，该软件基于Loewe加和性模型产生协同作用得分(Lehàr,J.,等人(2009)。“Synergistic drug combinations tend to improvetherapeutically relevant selectivity.[协同药物组合倾向改善治疗相关的选择性]”Nat Biotech[自然生物技术]27(7):659-666)和Rickles,等人(2012)“Adenosine A2A andBeta-2 Adrenergic Receptor Agonists:Novel Selective and Synergistic MultipleMyeloma Targets Discovered through Systematic Combination Screening[腺苷A2A和β2肾上腺素能受体激动剂：通过系统组合筛选发现新颖选择性和协同多发性骨髓瘤靶标]”,Mol Cancer Therapeutics[分子癌症治疗]11(7):1432。
Loewe ADD(加和性)模型(如图7-37所示)量化了组合效果。组合最初按加和过量体积进行排序，其定义为ADD体积＝∑CX,CY(Idata-ILoewe)，其中ILoewe(CX,CY)是满足(CX/ECX)+(CY/ECY)＝1的抑制作用，而ECX,Y是单一药剂曲线在ILoewe下的有效浓度。还使用“协同得分”，其中协同得分S＝log fX log fY∑Idata(Idata-ILoewe)，对所有非单一药剂浓度对求和，其中log fX,Y是每个单一药剂所使用的稀释因子的自然对数。这样有效地计算出所测值和Loewe加和反应表面之间的体积，对高度抑制进行加权并针对不同的稀释因子进行校正。基于Idata值的测量误差和标准误差传播，对每个协同得分计算不确定性σS。
在所示的实例中，生长抑制(％)矩阵含有使用上述公式由发光数据计算得出的共有生长抑制值；ADD模型生长抑制(％)矩阵含有基于Loewe加和性模型预测的生长抑制值，该模型衍生自建模的单一药剂生长抑制曲线；而ADD过量生长抑制(％)矩阵含有超出加和性模型的生长抑制的值。加和性模型充当“零假设”，并且假定两种药剂之间没有协同相互作用。从生长抑制剂量反应矩阵(＝ADD过量生长抑制)减去ADD模型后观察到的任何活性均表明协同作用。
下表A说明了针对特定癌症类型的KRASG12C抑制剂与一种或多种其他药学活性药剂的具体体外组合。在图7-39中获得并总结的数据表明，与单独使用组合疗法的各个成员时所预期情况相比，表A中列出的组合显示出增强的抗癌活性。应当注意，所看到的治疗协同作用的幅度可以取决于所治疗的癌症类型和所使用的药剂而变化。
表A
·更高浓度下的脱靶效应可能有助于提高协同作用得分
体内肿瘤异种移植组合研究
按照这些以下一般程序进行体内肿瘤异种移植研究：
培养，收获肿瘤细胞并将其皮下植入雌性无胸腺裸小鼠的右侧腹肋部。当肿瘤达到约200mm3时，将小鼠随机分为治疗组(n＝10/组)并开始治疗(在图上指示的天数)。每周测量2至3次肿瘤大小和体重。通过数字卡尺测量肿瘤体积，以L×W×H计算并以mm3表示。通过对数转换后的肿瘤体积数据的重复测量协方差分析(RMANOVA)，并用邓尼特调整后的多重比较，将对照组与治疗组进行比较，从而评估生长曲线之间观察到的差异的统计显著性。对于组合研究，对组合组进行RMANOVA，与每个单一药剂治疗组进行一对一的比较。
BD MatrigelTM基底膜基质是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA))提取的增溶基底膜制剂。
所有研究均以盲法进行。
在图3、4、5和6中，抗小鼠PD-1(克隆29F.1A12)抗体可购自新罕布什尔州西黎巴嫩Bio X Cell公司(Bio X Cell,West Lebanon,New Hampshire)。
图1、2、3、4、5和6说明了针对特定癌症类型的KRASG12C抑制剂与一种或多种其他药学活性药剂的具体体内组合。附图中获得和总结的数据表明，与单独使用组合疗法的各个成员时所预期情况相比，附图中所示的组合显示出增强的抗癌活性。应当注意，所看到的治疗协同作用的幅度可以取决于所治疗的癌症类型和所使用的药剂而变化。
在图4中，与任一单一药剂治疗相比，AMG 510和抗PD1抗体(克隆29F.1A12)在CT26-KRASG12C同系肿瘤模型中的组合治疗可显著提高存活率并导致持久治愈。与对照组相比，AMG 510单一疗法或抗PD1单一疗法导致肿瘤生长延迟。每种单一疗法治疗均导致1/10的完全反应者。AMG 510+抗PD1的组合治疗导致9/10的完全反应者。这些被认为是持久治愈，并且在停止治疗后(第43天)，直到研究终止的第57天，那9只小鼠仍然没有肿瘤。
增强AMG 510的结合和效力
尽管ARS-1620验证了直接抑制KRASG12C的方法，但已证明难以鉴定适合临床测试的改善抑制剂。我们认为，一个重要的挑战是由于ARS-1620占用的变构口袋体积很小而导致效力欠佳，这为另外的蛋白质-配体相互作用提供了有限的途径。KRASG12C/ARS-1620共价复合物的X射线晶体结构(图40a)说明了这一点，其中ARS-1620和组氨酸95(H95)之间的氢键突出表示(虚线)。我们的突破是发现由H95的替代性取向所产生的表面凹槽可能被取代的芳香环所占据，从而增强了与KRASG12C的相互作用。AMG 510成为H95凹槽结合分子优化运动的最佳候选者，因为它代表了改善的效力和良好的开发特性的融合。共价AMG 510-KRASG12C复合物的X射线共晶结构(图40b)突出显示了AMG 510在KRAS的P2口袋中的结合。异丙基甲基吡啶取代基占据Y96、H95和Q99之间的凹槽，并参与25个配体-蛋白质范德华接触的连续网络，该网络从螺旋2的骨架(H95，Y96)延伸到柔性开关II环的骨架(E62，E63)。
为了评估增强的相互作用对AMG 510效力的影响，我们使用了两种测定方法，其采用在残基118处进行另外的半胱氨酸-丙氨酸取代的重组GDP结合的KRASC118A或KRASG12C /C118A，以避免与非C12半胱氨酸的反应性。酶促核苷酸交换测定法利用SOS1催化的GDP/GTP交换来促进c-RAF的RAS结合域(RBD)与两种形式的KRAS结合。在40分钟的反应中，AMG 510展示了比ARS-1620高出约10倍(平均IC50＝0.09μM)的效力(图40c)。AMG 510没有明显抑制KRASC118A(图40c)，并且在这些测定中AMG 510的非反应性类似物具有最小的活性(图46a)。通过质谱法(MS)测量AMG 510与GDP-KRASG12C/C118A之间在拟一级反应条件下的反应动力学。浓度-速率数据的非线性拟合(图40d)确立了最大反应速率kinact＝0.85±0.08s-1，而AMG510在半最大速率下的浓度KI＝8.6E-05±1.4E-05M，导致kinact/KI比为9.8E+03±1.8E+03M-1s-1。相对于ARS-1620，AMG510和KRASG12C/C118A之间的反应动力学得到了显著改善。相对于临床中靶向半胱氨酸的激酶抑制剂，AMG 510的特征在于显著更大的kinact，与先前针对ARS-1620描述的KRAS诱导的催化机制一致。AMG510与5mM谷胱甘肽的非特异性反应性相对较慢(AMG 510t1/2＝196min)，并且在临床共价丙烯酰胺范围内。
抑制肿瘤细胞信号传导和生长
通过测量ERK1/2的基础磷酸化(p-ERK)并通过MS检测KRASG12C与AMG 510的共价缀合(即占有)来评估AMG 510的细胞活性。在两个KRAS p.G12C细胞系中，在2小时处理后，AMG510有效抑制p-ERK(IC50分别为约0.02和0.03μM)至接近不可检测的水平，且效力比ARS-1620高20倍(图40e)。这种抑制作用密切跟踪了AMG 510对KRASG12C的占有，具有在两种测定中在约0.2μM下实现的近最大水平(图40f)。AMG 510还有效损害了两种细胞系中的细胞活力(IC50约0.006μM和0.009μM，效力比ARS-1620高约40倍)(图40g)。
使用p-ERK的时间和浓度依赖性抑制作用来确定AMG 510在两种KRAS p.G12C细胞系中的细胞动力学，这反映了AMG 510对KRASG12C的占有。p-ERK抑制速率随AMG 510浓度增加，浓度高于3μM时达到饱和。AMG 510和ARS-1620的浓度-速率曲线拟合(图40h和图46b)表明，AMG 510抑制KRASG12C的细胞动力学效率比ARS-1620高约23倍。AMG 510对ERK磷酸化的最大抑制速率(8.9E-04s-1)比最近动力学模型中提出的限速GTP-KRASG12C水解速率高约2倍(从EGFR抑制估计的速率＝4.2E-04s-1；t1/2＝27.4min)。为了提供KRASG12C对GTP水解速率的替代性估计，采用SHP2抑制剂消除了所有向KRAS的上游信号传导。该实验产生的细胞GTP水解速率为9.4E-04s-1(t1/2＝12.2min；图46c)，与对AMG 510观察到的速率一致。
为了更广泛地评估KRASG12C抑制的信号传导影响，用多剂量的AMG 510处理了两种细胞系4小时和24小时，并进行了蛋白质印迹以评估多个信号传导节点(图41a)。AMG 510与KRASG12C的共价加合物形成通过迁移更慢的KRAS谱带的迁移率的变化来检测(顶部箭头)。这种改变的种类随着时间和剂量的增加而积累，并且与两种细胞系中MAPK途径(即p-MEK1/2和p-ERK1/2)的下游抑制作用一致(图41a，41b)。AMG 510对KRAS的抑制作用还导致了活性EGFR(p-EGFR Y1068)的积累。AKT磷酸化(p-AKT)的抑制作用在一种细胞系中很明显，但是在两种细胞系中24小时都观察到了核糖体蛋白S6的磷酸化(p-S6)的降低。在24小时也观察到caspase-3的切割，这表明诱导了细胞凋亡。在更广泛的时程内，以0.1μM进行AMG 510处理(图41b)对MAPK和EGFR产生快速(<2h)和持续(>24h)作用，而在两种细胞系中处理后8-16小时出现p-S6和caspase切割。
为了评估活性和选择性，在具有杂合或纯合KRAS p.G12C或p.G12C以外的KRAS突变的22种细胞系，以及野生型(WT)KRAS细胞系中分析AMG 510。在所有KRAS p.G12C细胞系中，用AMG 510处理两小时均抑制了基础p-ERK，IC50值范围为0.010μM至0.123μM(图41c和补充表1)。AMG 510在任何非KRAS p.G12C细胞系中均不抑制p-ERK(IC50>10μM；图41c和补充表1)。
在细胞活力测定中，AMG 510损害了除SW1573外的所有纯合和杂合KRAS p.G12C细胞系的生长，其中IC50值范围为0.004μM至0.032μM(图41d和补充表1)。尽管所有KRASp.G12C细胞系均显示出对p-ERK的类似的最大抑制作用，但对细胞活力的最大影响却有所不同。具有p.G12C以外的KRAS突变或具有KRAS以外的基因突变的细胞系对AMG 510不敏感(IC50>7.5μM；图41d和补充表1)。选择了KRAS p.G12C细胞系的一个子集，以评估在低粘附条件下诱导球状体形成的活力。如对其他KRASG12C抑制剂所报道的那样，这些条件增强了所有测试细胞系对AMG 510的敏感性，并且导致效力提高了20倍，并且最大抑制提高了2.5倍(图41e，图46d和补充表1)。SW1573保持最低敏感度，可能是由于同时发生的驱动突变PIK3CAp.K111E。
为了进一步确定AMG 510与KRASG12C的共价相互作用的选择性并鉴定细胞中其他潜在的“脱靶”的含半胱氨酸的蛋白质，按上述方法通过MS进行了半胱氨酸蛋白质组分析。用DMSO或1μM AMG 510(>30倍p-ERK IC50)处理细胞4小时后，富集半胱氨酸蛋白质组，并鉴定了肽。在6451种独特的含半胱氨酸的肽中，来自KRASG12C的Cys12肽是唯一鉴定出的满足共价靶标接合标准的肽(图41f)。
AMG 510在体内抑制KRAS信号传导
AMG 510口服治疗对KRASG12C信号传导的影响在测量p-ERK的药效学(PD)测定中进行评估。在具有KRAS p.G12C的人类肿瘤中，AMG 510在治疗后2小时以剂量依赖性方式抑制p-ERK(图42a，b)。与对照组相比，AMG 510治疗(100mg/kg)后对p-ERK的抑制作用降低69％(MIA PaCa-2 T2)至83％(NCI-H358)。使用同系CT-26KRAS p.G12C细胞系(使用CRISPR技术产生)，在小鼠肿瘤模型中观察到了AMG 510对p-ERK水平的相似作用(图47a)。时程PD测定展示，单次剂量(10mg/kg)后0.5小时，AMG 510的血浆和肿瘤暴露达到峰值，导致在治疗后2-4小时对p-ERK的抑制作用达到最大，并保持显著抑制48小时(图42c，42d)。这与KRASG12C蛋白相对较长的20至24小时半衰期一致(图46e)。
另外，在平行实验中，通过MS测量了AMG 510对KRASG12C的占有率，并且在最高剂量(100mg/kg)下接近100％，这与p-ERK的最大抑制作用有关(图42e和42f)。时程研究表明，在0.5小时后可检测到AMG 510的部分占有，而在2小时后观察到约100％占有率(图42g)。
体内突变选择性肿瘤抑制
评估了AMG 510在小鼠中抑制人KRAS p.G12C和KRAS p.G12V(SW480-1AC)肿瘤异种移植物生长的能力。AMG 510在所有剂量水平下均显著抑制MIA PaCa-2 T2和NCI-H358肿瘤的生长，其中在更高剂量下观察到肿瘤消退(图43a，43b)。相反，AMG 510治疗对KRASp.G12V肿瘤生长没有影响(图47b)。在所有模型中，AMG510的血浆水平均一致(数据未显示)。在免疫活性小鼠中生长的鼠CT-26KRAS p.G12C肿瘤模型中，AMG 510在最高剂量下导致肿瘤生长抑制和消退(图43c)。当研究在第29天终止时，10只小鼠中有两只(100mg/kg组)没有可检测到的肿瘤。AMG510还显著抑制了小鼠中人KRAS p.G12C突变患者源性异种移植物(PDX)的生长(图43d和图47c)。
临床活性的证据
AMG 510的增强的效力，强大的功效和良好的药物特性促使其被选为第一个进入临床试验的KRASG12C抑制剂(临床试验数据库NCT03600883(Clinical trials.gov NCT03600883))。值得注意的是，在前两组患者中，AMG 510治疗导致两名KRAS p.G12C NSCLC患者发生客观的部分反应(根据RECIST 1.1)(图43e和图47d)。两名患者均已进行了多种先前的全身治疗，包括卡铂、培美曲塞和纳武单抗，并记录有疾病进展。第一名患者在AMG 510治疗6周后显示出34％肿瘤缩小。第二名反应者在AMG 510治疗仅2周后显示出肿瘤减少67％。这些患者分别在6个月和2个月后(当前的美国临时专利申请日时)继续接受AMG 510治疗。没有不良事件的报道。这些患者成为有史以来第一个对突变体特异性KRAS抑制剂产生反应的患者，代表患有KRAS p.G12C突变肿瘤的癌症患者的里程碑。
组合的增强功效
鉴于KRAS p.G12C在肺腺癌中的高患病率，在NCI-H358模型中研究了AMG 510与卡铂(肺癌化疗药物的标准治疗)的组合治疗。用任一种单一药剂(AMG 510或卡铂)进行治疗均能导致显著抑制肿瘤生长(图44a)。但是，各种剂量下的组合治疗导致显著改善抗肿瘤功效(图44a和图47e)。据我们所知，这是将突变选择性KRAS抑制剂与化学治疗剂组合使用可增强功效的第一个证明，并为这种方法在临床中提供了理论依据。
经临床验证的将BRAF和MEK抑制剂组合的策略表明，在MAPK(和AKT)信号传导通路中AMG 510和其他抑制剂组合可增强肿瘤细胞杀伤并克服抗性26。因此，用AMG 510和HER激酶、EGFR、SHP2、PI3K、AKT和MEK抑制剂的矩阵在若干种KRAS p.G12C细胞系中进行了体外组合实验(图48)。如AMG 510诱导p-EGFR所表明的(图41a)，AMG 510与多种药剂的组合导致在NCI-H358中协同杀死肿瘤细胞(图44b和图48)。协同作用在其他细胞系中更为有限，但与MEKi组合在多种情况下具有协同作用，并在球状体生长条件下得到增强(图44b)。当与任一种单独单一药剂相比时，在最小有效剂量的AMG 510与MEKi组合下在体内也观察到了显著增强的抗肿瘤活性(图44c)。这些数据共同表明了一种有趣的临床方法，也就是将AMG 510与靶向MAPK途径中其他节点的药剂组合，以消除可能限制功效或诱导抗性的残留或旁路信号传导。
促炎性肿瘤微环境
免疫检验点程序性细胞死亡1/程序性死亡配体1(PD-1/PD-L1)轴的阻断经临床验证并批准用于某些癌症患者。在CT-26KRAS p.G12C模型中在免疫活性环境下评估了AMG510与抗PD-1疗法组合的活性。此细胞系取决于KRAS p.G12C等位基因(图49a，b)，并且对AMG 510敏感(图43c和图47a)。如先前所示(图43c)，AMG 510作为单一药剂导致肿瘤消退(图45a)。然而，随着时间的流逝，10个肿瘤中只有1个保持完全消退(图45a)。抗PD-1单一疗法导致肿瘤生长延迟，10个肿瘤中只有1个显示出完全消退。意外的是，组合治疗导致10名中有9名是完全反应者(图45a)。在第43天后停止治疗，并再继续监测小鼠112天。组合治疗的所有完全反应者持续不具有可检测的肿瘤，这表明AMG 510与抗PD-1抗体的组合导致了持久治愈。使用替代存活终点(肿瘤体积>800mm3)，与单一疗法相比，组合治疗导致了存活率的显著增加(45b)。
为了了解治疗对肿瘤中免疫细胞组成的影响，在治疗后对CT-26KRAS p.G12C肿瘤进行了免疫分型。治疗4天后，AMG 510导致T细胞浸润明显增加，主要是CD8+T细胞(图45c和图50a)。在主要由AMG 510驱动的组合组中，也观察到CD8+T细胞浸润增加，因为在抗PD-1单一疗法后并未发生这种情况。作为另一个比较剂，MEK抑制剂(MEKi)阻断RAS下游的MAPK信号传导(图50b)，并产生与AMG 510类似的CT-26KRAS p.G12C肿瘤生长抑制作用(图50c，50d)，但不会影响浸润CD8+T细胞的数量(图45c)。AMG 510治疗还导致巨噬细胞和树突状细胞的浸润增加，而用MEKi则未观察到这些(图45c)。AMG 510和MEKi均适度增加了CD8+T细胞上PD-1的表达(图44a)。治疗后纯化全肿瘤RNA，并评估一组免疫基因的转录谱图。仅2天的治疗后，AMG 510对KRASG12C的抑制作用诱导了促炎性微环境，其特征在于干扰素信号传导、抗原加工、细胞毒性和NK细胞活性增强，以及与MEK抑制诱导的效果相比显著更高的先天性免疫刺激的标志物(图45d和图44e)。AMG 510还诱导了MHC-I蛋白在CT-26KRAS p.G12C肿瘤细胞上的表达(图45e和图50f)。这些数据表明，AMG 510对肿瘤细胞的治疗作用可能导致T细胞引发和抗原识别增加。为了测试这一点，将来自组合治疗的治愈小鼠(图45a)用CT-26KRAS p.G12C和亲代CT-26(KRAS p.G12D)或CT-26KRAS p.G12C的双侧肿瘤和无关的小鼠乳腺肿瘤模型4T1再次激发。所有4T1肿瘤(4/4)均生长，但没有(0/8)CT-26KRAS p.G12C肿瘤被确立(图45f)。值得注意的是，所有接受CT-26亲代肿瘤的小鼠在40天后均无肿瘤(图45f)。在一个单独的未免疫小鼠对照组中，15例(100％取用比率)亲代CT-26和CT-26KRASp.G12C肿瘤中15例生长(图50g)。用CT-26、CT-26KRAS p.G12C或4T1肿瘤细胞刺激从治愈小鼠中收获的脾细胞，并测量分泌的IFN-γ的水平作为肿瘤特异性T细胞引发和活性的标志。CT-26KRAS p.G12C细胞和亲代CT-26细胞导致IFN-γ升高约3倍，而4T1细胞并未诱导此升高(图45g)。
讨论
与KRASG12C的H95凹槽发生新颖相互作用的发现显著提高了功效，并鉴定了AMG510，其为一流的口服KRASG12C抑制剂并在患者中具有临床活性的证据。AMG 510选择性靶向KRAS p.G12C肿瘤，并与细胞毒性和靶向药剂组合以协同杀伤肿瘤细胞。AMG 510诱导的肿瘤细胞死亡导致发炎的肿瘤微环境，其对免疫检查点抑制反应非常好。抗PD-1和MEKi的组合治疗在若干报道中显示出令人信服的临床前功效，这与T细胞浸润增加有关。在本研究中，选择性KRASG12C抑制后的免疫细胞浸润比MEKi诱导的浸润显著更强。与报道的阻断T细胞扩增和引发的非肿瘤选择性MEKi作用相反，AMG 510对KRASG12C的选择性抑制导致T细胞引发增加。这些数据支持了增强的抗原识别和T细胞记忆的模型，由此AMG 510诱导的肿瘤细胞死亡与抗PD-1治疗组合，可导致适应性免疫反应，从而识别并根除非p.G12C肿瘤。有充分的证据表明，在同一肿瘤内以及原发和转移部位之间，肿瘤内KRAS突变状态可能是异质的。综上所述，我们的数据表明，即使在KRASG12C表达是异质的情况下，AMG 510仍可能是有效的抗肿瘤药剂。
方法
重组蛋白
在大肠杆菌中表达重组His标记的人KRASG12C/C118A(1-169)，GST-人c-RAF(1-149)和His标记的人KRASC118A(1-169)，并使用亲和色谱和尺寸排阻色谱进行纯化。在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中表达重组His标记的人SOS1(564-1049，昆虫密码子优化)，并用亲和色谱进行纯化；除去His标签后，通过尺寸排阻色谱进行进一步纯化。基于Ostrem等人15的工作，将半胱氨酸光突变体构建体用于共结晶研究。在大肠杆菌中表达重组His标记的人KRASG12C/C51S/C80L/C118S(1-169)，并使用亲和色谱，离子交换色谱和尺寸排阻色谱进行纯化，除去His标签以进行结晶。
化合物和抗体
ARS-1620、PD-0325901、曲美替尼、阿法替尼、厄洛替尼、RMC-4550和AZD5363从商业来源获得。AMG 511是内部合成的。本文描述了AMG 510及其非反应性丙酰胺的合成。将AMG 510和用于体外实验的所有其他抑制剂的储备液制成100％二甲基亚砜(DMSO)中的10mM溶液。对于体内研究，将AMG 510和MEKi(PD-0325901)在2％HPMC，1％Tween 80中配制，并每天以10mL/kg通过口管饲喂施用。将10mg/mL的卡铂储备液在1％PBS中进一步稀释至5mg/mL或3mg/mL，并每周一次通过腹膜内注射(IP)进行施用。大鼠抗小鼠PD1克隆29F.1A12被嵌合以含有小鼠IgG1骨架。另外，将Fc受体沉默突变N297G引入IgG重链区域以降低效应子功能。将抗PD-1抗体29F.1A12在1X PBS中稀释至500μg/mL的浓度，每3天施用一次，共通过I.P.注射3次。除了抗RAS(艾博抗公司(Abcam))、抗磷酸ERK1/2(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))和抗β-肌动蛋白-HRP(希格玛公司(Sigma))以外，用于蛋白质印迹的所有抗体均购自细胞信号传导公司(Cell Signaling)。
细胞系
除从美国国家癌症研究所获得的KM12和NCI-H3122外，所有细胞系均从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购买。通过短串联重复序列(STR)谱图鉴定细胞系。为了改善体内生长动力学，分别通过在小鼠中传代MIA PaCa-2和SW480细胞来产生MIA PaCa-2 T2和SW480-1AC细胞。使用CRISPR技术由鼠CT-26结肠直肠细胞系产生CT-26KRAS p.G12C细胞，以用p.G12C(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))替代两个KRAS p.G12D等位基因。克隆H10被确定对于KRAS p.G12C等位基因是纯合的，被鉴定为CT-26KRAS p.G12C-H10，并且被称为CT-26KRAS p.G12C。将所有细胞系在补充有10％胎牛血清和1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO2下在潮湿培养箱中培养。
X射线晶体学
将在20mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl中的纯化的未标记的KRASG12C/C51S/C80L/C118S(“KRAS”)浓缩至40mg/mL，并添加到溶解于DMSO的两倍摩尔过量的固体AMG 510化合物中。将蛋白质复合物样品在室温下置于定轨振荡器上16小时，并且然后进行旋转过滤。使用坐滴蒸气扩散法进行共结晶。将“KRAS”-AMG 510蛋白复合物样品和结晶缓冲剂(1mM MgCl2、0.1M MES pH 6.5、30％w/v聚乙二醇4000)混合。于20℃下在一天内出现扁平的棒状晶体。
在液氮中冷冻之前，将晶体在作为冷冻保护剂的结晶缓冲剂中平衡。在高级光源束线5.0.1下，在Pilatus 6M硅像素检测器上以波长和温度100K收集数据集。使用HKL2000对数据进行整合和缩放。该晶体属于正交晶空间群P212121，其晶胞尺寸为 α＝90°、β＝90°、γ＝90°(请参见补充表2)。将apoKRAS结构作为搜索模型，使用MolRep通过分子替代来解析该结构。不对称单元中只有一个蛋白质分子。使用Refmac5改善了结构，并使用图形程序Coot进行了模型构建。使用PRODRG产生配体。与GDP和AMG 510结合的KRASG12C/C51S/C80L/C118S的结构被细化到其中R因子为18.1％，Rfree为21.5％。Ramachandran统计数据获得98.2％支持，1.8％允许，没有异常值。氨基酸残基105-107未在晶体结构中解析出。原子坐标和结构因子将存放在蛋白质数据库中(PDB ID代码：尚未指定)。
偶联核苷酸交换测定
使用Alpha(扩增发光邻近均相测定)技术测量KRASG12C/C118A或KRASC118A对SOS1催化的核苷酸交换活性的抑制作用。将20nM GDP结合的人KRASG12C/C118A或KRASC118A蛋白与两倍连续稀释的AMG 510或DMSO在室温(RT)下于反应缓冲剂(25mM HEPES，pH 7.4；10mM MgCl2；0.01％Triton X-100)中孵育5分钟。对于所有后续步骤，将DTT以1mM的最终浓度添加反应缓冲剂中。接下来，将GTP和SOS-1分别以1.25mM或500nM的最终浓度添加DTT反应缓冲剂中，并在室温下孵育30分钟。最后，添加均在DTT反应缓冲剂中稀释的c-RAF RBD(最终浓度为50nM)，α谷胱甘肽供体珠(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)；最终浓度为20μg/mL)和镍螯合物受体珠(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)；最终浓度为20μg/mL)。将反应混合物在室温下孵育5min，并且然后使用AlphaScreen方案在多标记读取器上读取板。在680nm处180ms激发后，在570nm处测量发光信号。信号强度对应于c-RAF RBD与GTP结合的KRASG12C/C118A或KRASC118A的缔合，并归一化为DMSO对照。
ERK1/2磷酸化测定
为了进行细胞测定，将每孔2.5E+04个细胞接种在96孔板中，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将三倍连续稀释的化合物或DMSO添加细胞中，并将板在37℃、5％CO2下孵育2小时。处理后，将细胞用冰冷的PBS洗涤，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲剂(50mM Tris-HCl，pH 7.5；1％Igepal；0.5％脱氧胆酸钠；150mM NaCl；0.1％十二烷基硫酸钠)中裂解。根据制造商方案，使用磷酸ERK1/2全细胞裂解物试剂盒(美莎帝公司(Meso Scale Discovery))测量了处理过的细胞裂解物的基础ERK1/2磷酸化水平。信号强度对应于磷酸-ERK1/2水平，并归一化为DMSO对照。
对于来自体内药效学测定的肿瘤细胞裂解物，根据制造商方案，使用磷酸-ERK1/2和总ERK1/2全细胞裂解物试剂盒(美莎帝公司(Meso Scale Discovery))分析了每个样品中50μg总蛋白。对于给定的样品，将磷酸-ERK1/2信号归一化为总ERK1/2信号，并相对于媒剂组计算ERK磷酸化的抑制％。
细胞活力测定
对于粘附活力测定，将每孔0.5-1.0E+03个细胞接种在384孔板中(或将每孔2.5-4.0E+04个细胞接种在96孔板中)并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将连续稀释的化合物或DMSO添加至细胞，并将板在37℃、5％CO2下孵育72小时。根据制造商方案，使用CellTiter-发光细胞活力测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega))测量细胞活力。将处理过的样品的发光信号归一化为DMSO对照。
对于球状体活力测定，将每孔2.5-4.0E+04个细胞接种在96孔球状体微孔板(康宁公司(Corning))中，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。除了根据制造商方案使用CellTiter-3D细胞活力测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega))测量活力以外，如上所述进行相同程序。
协同组合研究
如先前所述(Saiki,A.Y.等人MDM2 antagonists synergize broadly androbustly with compounds targeting fundamental oncogenic signaling pathways[MDM2拮抗剂与靶向基本致癌信号传导通路的化合物广泛而稳固地协同作用].Oncotarget[癌症靶标]5,2030-2043,doi:10.18632/oncotarget.1918(2014))，进行了组合实验以评估AMG510与其他抑制剂在体外的协同相互作用。
动力学分析
如先前所述44，使用MS测量共价抑制剂-KRASG12C加合物的形成。使用Prism(GraphPad软件)，将在各种孵育时间下各种抑制剂浓度的相对％结合值拟合到指数方程，以产生测试的每种浓度的kobs值。然后相对于抑制剂浓度重新绘制所得的kobs值以产生kinact和Ki值。
为了确定细胞中共价抑制剂-KRASG12C加合物形成的动力学值，精确地如上所述，在各种孵育时间下，用各种抑制剂浓度处理后，测量了基础ERK1/2磷酸化水平，并将％活性值用于动力学计算。
半胱氨酸蛋白质组学分析
将人非小细胞肺癌NCI-H358细胞以2.0E+06个细胞/10cm板接种，并在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天，将细胞用1μM AMG 510或DMSO(n＝5)处理，并在37℃、5％CO2下孵育4小时。处理后，将细胞用含有蛋白酶抑制剂的冰冷的PBS洗涤，然后从板中移除。根据Patricelli等人的描述，按其方案使用质谱(MS)在IQ Proteomics，LLC上处理速冻细胞沉淀。简而言之，将细胞沉淀裂解并用100μM脱硫生物素碘乙酰胺处理，以标记剩余的未反应的溶剂暴露的半胱氨酸。胰蛋白酶消化后，将从每个样品中产生的肽混合物用TMT-10plex(串联质谱标签)等压标记试剂(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))标记。标记后，将样品混合，然后使用大容量链霉亲和素琼脂糖富集脱硫生物素化肽。在OrbitrapLumos质谱仪(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))上，使用基于三小时梯度和同步前体选择(SPS)的MS3方法，通过纳米LC-MS分析富集的肽。脱硫生物素化肽的鉴定是经哈佛医学院的Gygi实验室利用SEQUEST开发的定制信息学管道通过数据库搜索而获得的。所有光谱均在Human Uniprot(2018)蛋白序列数据库中搜索，该数据库附有突变体KRASG12C蛋白序列和常见污染物。将肽和蛋白质过滤到1％假发现率(FDR)，并且只有满足最小信噪比200和分离纯度大于50％的标准的那些肽才能用于定量分析。使用含半胱氨酸的肽的归一化峰丰度，在Microsoft Excel中执行用于统计分析的所有数据处理。计算DMSO对照和AMG 510处理的样品组之间的Log2倍数变化。假设相等方差，对每种肽进行两尾t检验以评估处理组和DMSO对照样品组之间差异的统计学显著性。针对每个脱硫生物素化的含半胱氨酸肽，相对于log2倍数变化绘制显示负log10 p值的火山图。将显示出丰度的log2倍数降低大于2且p值小于0.0001的肽指定为AMG 510的共价靶标(n＝5个生物学重复)。
动物研究
所有动物实验程序均根据美商安进公司(Amgen)动物护理和使用委员会指南以及实验室动物护理评估和鉴定协会标准进行。所有研究均利用4至7周大的雌性无胸腺裸小鼠或雌性Balb/c小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))。将无胸腺裸小鼠在每个过滤器加盖的笼子中放五只并以无菌方式安置，并且将Balb/c小鼠在每个过滤器加盖的笼子中放五只并以非无菌方式安置在环境控制的房间中(温度23℃±2℃，相对湿度50±20％)，光照/黑暗周期为12小时。向小鼠喂食商业性啮齿动物食物。
基因表达分析
通过RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))从CT-26KRAS p.G12C肿瘤中纯化总RNA，这些肿瘤经口服媒剂，口服AMG 510(100mg/kg QD)或口服MEKi(PD-0325901，10mg/kgQD)治疗两天(n＝5/组)。通过DropSense 96(珀金埃尔默公司(PerkinElmer Inc))定量RNA。利用含有750个靶基因，20个管家基因，8个内部阴性对照和6个内部阳性对照的小鼠泛癌免疫谱分析组，将300ng RNA在nCounterTM(纳斯瑞技术公司(NanoStringTechnologies))上运行。通过nSolver软件(纳斯瑞技术公司(NanoString Technologies))对原始数据进行质量控制，归一化和分析。将原始数据进行log2转换，并进行统计分析。通过nSolver高级分析(纳斯瑞技术公司(NanoString Technologies))产生通路得分(干扰素得分、抗原加工得分、MHC得分、TLR得分和T细胞功能得分)和细胞谱分析得分(NK细胞得分、细胞毒性细胞得分和CD45得分)。
参见补充表3A、表3B、表3C、表3D和表3E，以获取每个得分中包含的基因的详细列表，以及用于计算通路和细胞谱分析得分的p值。
肿瘤药效学测定
在携带MIA PaCa-2 T2、NCI-H358和CT-26KRAS p.G12C肿瘤的小鼠中评估了AMG510对ERK1/2磷酸化的影响。将MIA PaCa-2T2或NCI-H358肿瘤细胞(5.0E+06个细胞)皮下注射到雌性无胸腺裸小鼠的腹肋部，其中细胞与基质胶(BD生物科学公司(BD Biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)的比率为2:1。当平均肿瘤大小达到约300-600mm3(n＝3/组)，小鼠接受单次口服剂量的媒剂或AMG 510(0.3、1、3、10、30和100mg/kg)并在2小时后收获。将单次口服剂量的AMG 510(10mg/kg)用于时程研究。向雌性Balb/c小鼠皮下注射CT-26KRASp.G12C肿瘤细胞(3.0E+05个细胞)。当肿瘤平均体积为486mm3时，将小鼠随机分组(n＝3/组)，并接受单次口服剂量的媒剂或AMG 510(3、10、30或100mg/kg)或MEKi(PD-0325901，10mg/kg)，并在2小时后收获。对于所有研究，均分析血浆和肿瘤以确定测试物品的浓度。在指定的时间也收集肿瘤样品，在液氮中速冻并加工进行生物分析或使用干式撞击取样器(Covaris公司)进行粉碎。将粉碎的样品重悬在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲剂中并均质化。然后如上所述测定澄清裂解物的ERK1/2磷酸化水平并通过MS测定KRASG12C的共价修饰。
异种移植物和同系研究
将MIA PaCa-2 T2、NCI-H358或SW480-1AC细胞(5.0E+06个细胞与基质胶的比率为2:1)皮下注射到雌性无胸腺裸小鼠的腹肋部(n＝10/组)。当肿瘤确立，且对于MIA PaCa-2T2和NCI-H358研究为约170mm3时，或对于SW480-1AC模型为约200mm3时，开始治疗。在剂量反应研究中；小鼠接受口服媒剂(QD)或口服AMG 510(3、10、30和100mg/kg QD)。在使用AMG510和卡铂进行的NCI-H358组合研究中，将小鼠随机分为8组(n＝10/组)，并接受口服媒剂(QD)+腹膜内PBS(1x/周)；口服AMG 510(10或30mg/kg QD)+腹膜内PBS(1x/周)；口服媒剂(QD)+腹膜内卡铂(50或100mg/kg)(1x/周)；口服AMG 510(10或30mg/kg QD)+腹膜内卡铂(50或100mg/kg)(1x/周)。对于使用AMG 510和MEKi的组合研究，将小鼠随机分为4组，n＝10/组，并接受口服媒剂(QD)；口服AMG 510(10mg/kg QD)；口服MEKi(1mg/kg QD)；口服AMG510(10mg/kg QD)+口服MEKi(1mg/kg QD)。对于同系研究，将CT-26KRAS p.G12C细胞(3.0E+05个细胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的腹肋部。当肿瘤确立，且对于剂量反应研究为约170mm3时，并且对于组合研究为约130mm3时，开始治疗，n＝10/组；除了MEKi剂量反应研究(其中n＝8/组)。在剂量反应研究中，小鼠接受口服媒剂(QD)，口服AMG 510(3、10、30和100mg/kg QD)或口服MEKi(PD-0325901)(1、3或10mg/kg QD)。在组合研究中，将小鼠随机分为4组，n＝10/组，并从第15天到第43天接受口服媒剂(QD)+腹膜内PBS(Q3Dx3)；口服AMG510(100mg/kg QD)+腹膜内PBS(Q3Dx3)；口服媒剂(QD)+腹膜内抗PD-1抗体(29F.1A12；100μg/剂量，Q3Dx3)；口服AMG 510(100mg/kg QD)+腹膜内抗PD-1抗体(29F.1A12；100μg/剂量，Q3Dx3)。组合治疗研究以盲法进行。每周两次用Pro-Max电子数字卡尺(日本千分尺制造有限公司(Japan Micrometer Mfg.Co.LTD))评估肿瘤尺寸，并使用以下公式计算肿瘤体积：长x宽x高，并表示为mm3。在KRAS p.G12C肺PDX模型中，将小鼠皮下植入约70mg大小的肿瘤块。当肿瘤体积为约160-200mm3时，将小鼠随机分组，并在随机分组后第二天接受口服媒剂(QD)或口服AMG 510(100mg/kg QD)。每周两次使用以下公式收集肿瘤尺寸：宽度2x长度x0.52，并表示为mm3。将数据表示为平均值±SEM。
AMG 510-KRASG12C缀合物检测
抗人RAS(抗RAS)抗体购自艾博抗公司(Abcam)，并使用供应商描述的方案用EZ-Link NHS-PEG4-生物素(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))进行生物素化。除去残留的生物素，并将所得生物素-抗RAS以1:1的比率加载到MyOneTM链霉亲和素C1珠(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))上，在室温下持续1小时并伴有振荡。将来自先前描述的体外处理的细胞或体内处理的肿瘤细胞的裂解物与生物素化的抗RAS珠在室温下孵育3小时并伴有振荡。使用磁铁，将珠用PBST(3x)，随后是PBS(1x)和水(1x)洗涤。使用2％甲酸水溶液/10％乙腈水溶液从珠上洗脱样品，随后在室温下孵育10分钟并伴有振荡。将上清液转移至96孔板并干燥。将样品重悬于变性缓冲剂(10mM TCEP，8M尿素)中，并在65℃下孵育15分钟并伴有振荡。添加碘乙酰胺(40mM)并在37℃下孵育30分钟，避光进行。添加50mM NH4HCO3和胰蛋白酶(0.01μg/μL)，并将样品在37℃消化过夜，持续约16-20小时，然后最后用甲酸淬灭，使其最终浓度为1％(v:v)。然后使用与Acquity UPLC(沃特斯公司(Waters))耦合的6500QTRAP(AB SCIEX公司)，通过正离子电喷雾模式下的多反应监测(MRM)，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析样品。将样品注射到AcquityUPLC BEH C8 1.7μm,2.1x 100mm柱(沃特斯公司(Waters))上。流动相由流动相A(水+0.1％甲酸)和流动相B(乙腈+0.1％甲酸)组成。LC梯度为：经5分钟5-50％B，经0.5分钟50％-95％B，以及经1分钟95％B。监测以下肽KRASG12C LVVVGAC(CAM)GVGK(529.8→846.3)和AMG 510修饰的KRASG12C AMG 510-LVVVGAC(CAM)GVGK(521.4→675.2)。将占有率计算为归一化为未修饰和修饰的KRASG12C肽的总和的AMG 510修饰的KRASG12C肽的百分比。
流式细胞术
为了体外分析AMG 510对MHC I类抗原表达的影响，将CT-26KRAS p.G12C细胞(5.0E+04个细胞/孔)接种到96孔板中，并在不存在或存在IFNγ的情况下用三倍连续稀释的AMG 510处理，最终浓度为25或250pg/mL。将培养板在37℃、5％CO2下孵育24小时。将细胞从孔中非酶法分离，用染色缓冲剂(PBS/0.5％BSA)洗涤，并且然后与PE缀合的H-2Dd、H-2Kd或H-2Ld抗体(BioLegend公司)在冰上孵育30分钟。洗涤后，将细胞重悬于含有SYTOX蓝色死细胞染色剂(生命技术公司(Life Technologies))的染色缓冲剂中，并且然后通过流式细胞术进行分析。使用BD FACSDiva软件在BD LSRFortessa流式细胞仪上进行采集和分析。
对于体内研究，将CT-26KRAS p.G12C细胞植入约6周龄的Balb/c雌性小鼠体内。植入后第22天，将小鼠随机分为4天给药群组，该群组由5组组成，n＝8/组，接受口服媒剂(QD)+腹膜内PBS(Q3Dx2)；口服AMG 510(100mg/kg QD)+腹膜内PBS(Q3Dx2)；口服媒剂(QD)+腹膜内抗PD-1抗体(29F.1A12；100μg/剂量，Q3Dx2)；口服AMG 510(100mg/kg QD)+腹膜内抗PD-1抗体(29F.1A12；100μg/剂量，Q3Dx2)；或口服MEKi(10mg/kg，QD)+腹膜内PBS(Q3Dx2)，持续4天。给药四天后，收获肿瘤并从周围筋膜切开，称重，机械切碎，并放入Liberase TL(0.2mg/ml，罗氏)和DNA酶(DNase)I(20μg/ml，Ambion公司)中。然后使用轻柔的MACS离解器(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotech))将肿瘤溶液机械均质化，并在MACSmix管旋转器(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotech))上在37℃下孵育15分钟。然后将细胞用0.02％EDTA(西格玛公司(Sigma))和热灭活的FBS(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))处理，并通过70μm过滤器以除去团块。然后将细胞离心，弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于LIVE/DEAD可固定的蓝色死细胞染色剂(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))中30分钟。然后在将细胞固定和通透化(细胞内固定和通透缓冲剂套件，eBiosciences公司)进行细胞内染色之前，用指定的抗体(补充表4)进行细胞表面染色。在LSR II流式细胞仪(BD生物科学公司(BD Biosciences))上进行分析之前，将CountBrightTM绝对计数珠(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))添加到每个样品孔中，以便进行细胞计数。所有分析均使用FlowJo软件v10(FlowJo公司)进行。通过将细胞数归一化为记录的珠，除以分析的肿瘤等分试样的体积和肿瘤的质量来确定绝对细胞计数。
酶联免疫斑点(ELISpot)测定
使用IFN-γELISpot测定法(细胞技术有限公司(Cellular Technology Ltd.))评估抗原特异性T细胞应答。收获脾细胞(n＝4-5/组)，并用于全细胞ELISpot测定。简而言之，将2.5E+05个脾细胞与2.5E+04CT-26、CT-26KRAS p.G12C或4T1肿瘤细胞混合，并在37℃下孵育20小时。使用CTLS6荧光斑点分析仪(细胞技术有限公司(Cellular TechnologyLtd.))来计数斑点。
统计分析
通过单向ANOVA随后是邓尼特事后检验对药效学实验进行分析。对于功效研究，进行了重复测量方差分析(RMANOVA)，随后使用GraphPad Prism 7.04进行邓尼特事后检验。通过配对t检验进行回归分析。通过具有Mantel-Cox对数秩的卡普兰一梅尔估计量(Kaplan-Meier estimator)确定存活率的统计分析，以使用GraphPad Prism 7.04来比较曲线。通过双向ANOVA多重比较随后是图凯事后检验分析流式细胞术数据。通过单向ANOVA多重比较随后是图凯事后检验分析纳斯瑞(NanoString)数据。通过非配对t检验使用GraphPad Prism进行ELISpot数据比较。
用于AMG 510的LC-MS/MS生物分析方法
通过在TissueLyzer(凯杰公司(Qiagen))中使用碳化钨珠，向组织中添加水(4:1mL:g)，来制备肿瘤组织匀浆。向20μL样品(血浆或肿瘤组织匀浆)中添加100μL含IS(200ng/mL甲苯磺丁脲)的乙腈，将样品涡旋10min，以3500g离心10min，并且收集90μL上清液。向收集的上清液中添加100μL水(含0.1％甲酸)，并将5μL所得溶液注射入LC-MS/MS系统。使用保持在50℃下的Phenomenex Kinetex C18 50x 2.1mm，2.7μm，使用0.1％甲酸的H2O溶液(流动相A)和0.1％甲酸的乙腈溶液(流动相B)实现色谱分离。色谱梯度如下运行：使用10％流动相B从0min到0.1min进行等度洗脱，从0.1到0.85min线性增加到95％流动相B，使用95％流动相B从0.85到1.10min保持等度洗脱，从1.10到1.11min线性下降到10％流动相B，使用10％流动相B从1.11到1.40min保持等度洗脱。API 4000质谱仪通常用于分析，并在561.179>134.100(AMG 510)和271.100>134.100(甲苯磺丁脲)的MS/MS过渡后以正离子模式ESI运行。使用(Sciex公司)对峰面积进行积分。进行峰面积积分后，将数据导出到Watson LIMSTM(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))，并通过峰面积比(AMG 510的峰面积/IS的峰面积)相对于血浆校准标准品的标称浓度的加权(1/x2)线性回归确定浓度。血浆中AMG 510的校准范围为1.0到10,000ng/mL(LLOQ 1.0ng/mL)。肿瘤组织匀浆中AMG 510的校准范围为5.0至50,000ng/mL(LLOQ 5.0ng/mL)。
在细胞培养中通过氨基酸进行稳定的同位素标记(SILAC)
通过将以下组分添加到1L的最终体积中来制备轻质培养基(LM)：100mL透析FBS，10.4g粉末状RPMI-1640培养基，2g碳酸氢钠，200mg L-精氨酸，48mg L-赖氨酸，100mg L-亮氨酸和1xPen-Strep，用0.22μm过滤系统进行过滤。用与LM相同的方法制备重质培养基(HM)，但是用100mg[13C6]-L-亮氨酸(剑桥同位素实验室(Cambridge IsotopeLaboratories))取代非同位素富集的L-亮氨酸。将MIA PaCa-2和NCI-H358细胞接种(3E+05个细胞)到具有LM的T75烧瓶中；每天更换LM。48小时后，将细胞用1x PBS洗涤，并将培养基切换为HM；每天更换HM，持续4天。在第6天，将细胞用1x PBS洗涤，并将培养基切换为LM；每天更换LM。从第6天开始，在0、1、3、6、9、12、15、18、21、24、30、36、48和72h收集MIA PaCa-2样品。从第6天开始，在0、3、6、9、12、24、36、48、72和96h收集NCI-H358样品。在每个时间点收集一式三份制备的分开的T75烧瓶，并处理为裂解物。
SILAC样品收集和裂解蛋白的制备
用1×PBS洗涤T75烧瓶，用胰蛋白酶处理并孵育2min，随后添加冰冷的含有10％透析FBS的PBS。充分混合细胞并收集，随后使用Vi-CELL XR进行细胞计数。离心剩余的细胞，并用冰冷的PBS(无Mg+2，无Ca+2)洗涤。再次离心细胞，除去PBS，将细胞溶解在少量冰冷的含有磷酸酶(PhosSTOP，罗氏)和蛋白酶(不含EDTA的cOmplete，罗氏)抑制剂的RIPA中。将所得裂解物涡旋，置于冰上10分钟，离心以除去不溶性碎片，然后在-80℃下储存直至进一步处理。
SILAC KRASG12C靶标半衰期确定
抗人RAS(抗RAS)抗体购自艾博抗公司(Abcam)，并使用供应商描述的方案用EZ-Link NHS-PEG4-生物素(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))进行生物素化。除去残留的生物素，并将所得生物素-抗RAS加载到MyOneTM链霉亲和素C1珠(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))上，在室温下持续1.5h并伴有振荡。将细胞裂解物(如上所述)与生物素化的抗RAS珠在室温下孵育2小时并伴有振荡。使用磁铁，将珠用PBST(3x)，随后是PBS(1x)洗涤。使用3％甲酸水溶液/30％乙腈水溶液从珠上洗脱样品，随后在室温下孵育10min并伴有振荡。将上清液转移至96孔板并干燥。将样品重悬于变性缓冲剂(10mM TCEP，8M尿素)中，并使用水浴在37℃下孵育1h。添加碘乙酰胺(40mM)并在25℃下孵育1h，避光进行。添加50mM NH4HCO3和胰蛋白酶(0.1μg/μL)，并将样品在37℃下消化24小时，然后用甲酸淬灭，使其最终浓度为1％(v:v)。在通过质谱进行分析之前，将样品浓缩至约80μL。使用与Acquity UPLC(沃特斯公司(Waters))耦合的6500QTRAP(ABSCIEX公司)，通过正离子电喷雾模式下的多反应监测(MRM)，通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析样品。将样品注射到Acquity UPLC BEH C8 1.7μm,2.1x 100mm柱(沃特斯公司(Waters))上。流动相由流动相A(水+0.1％甲酸)和流动相B(乙腈+0.1％甲酸)组成。LC梯度为：经5分钟5％-50％B，经0.5分钟50％-95％B，以及经1分钟95％B。将用于KRASG12C(LVVVGAC(CAM)GVGK(529.8→846.3)&13C-LVVVGAC(CAM)GVGK(532.8→846.3))和RAS WT(LVVVGAGGVGK(478.3→743.2)&13C-LVVVGAGGVGK(481.3→743.2))的以下肽用于监测从重标签到轻标签的过渡。相对同位素丰度(RIA)使用以下公式确定：
SILAC确定KRASG12C半衰期
为了说明细胞生长对确定蛋白质半衰期的影响，将与每个时间点相关的细胞数和RIA数据同时拟合到一系列等式，以确定KRASG12C在MIA PaCa-2和NCI-H358细胞中的半衰期。使用了以下等式：
重肽的一阶等式：
轻肽的一阶等式：
细胞生长的一阶等式：
其他等式：
ksyn＝kdec(Hv0+It0)
时间0定义为HM变为LM的时间，Hv是重肽的浓度，lt是轻肽的浓度，cellnew是新细胞的数量，kdec是降解的一阶速率常数，ksyn是合成的零阶速率常数，kdil是一阶细胞生长常数，cell(0)是时间0时的细胞数，Hv(0)是时间0时的重肽浓度，lt(0)是时间0时的轻肽浓度。使用逐步方法进行建模，其中在第一步中，由细胞数估计kdil，并且在第二步中，使用上述等式估计kdec。
通过在更换为LM后量化细胞数并应用以下等式来估计kdil：其中A和A0分别代表时间t和0时的细胞数。
补充表1细胞测定数据
突变注释是从Catalogue of Somatic Mutations in Cancer[癌症体细胞突变目录](COSMIC)1或Misale等人20192获得的。基础ERK1/2磷酸化和细胞活力测定的平均IC50值是从至少n＝2个实验中获得的。ND＝未确定
补充表2.数据收集和细化统计(分子替代)
收集此结构的一个晶体数据集
*括号中的值是针对最高分辨率shell。
补充表3.基因表达通路得分分析
补充表3A
补充表3B
补充表3C
补充表3D
补充表3E
补充表4.流式细胞术抗体
结合优选实施例描述了本发明。然而，应了解，本发明并不限于所披露的实施例。应理解，鉴于本文中对本发明的实施例的描述，本领域技术人员可以做出多种修改。此类修改涵盖于下文的权利要求书中。

Claims (43)

1.KRASG12C抑制剂和至少一种其他药学活性药剂在制备用于治疗患者中由KRAS G12C突变介导的癌症的药物中的用途，其中所述KRASG12C抑制剂是(1M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮或其药学上可接受的盐，其中向患者施用治疗有效量的KRASG12C抑制剂和治疗有效量的至少一种其他药学活性药剂，并且其中所述至少一种其他药学活性药剂是卡铂、抗PD-1抗体、MEK抑制剂、EGFR抑制剂、mTOR抑制剂、SHP2抑制剂、PI3K抑制剂或AKT抑制剂。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、阑尾癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、小肠癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、胆管癌、皮肤癌或眼内黑色素瘤。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是卡铂。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是抗PD-1抗体。
8.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1抗体是AMG 404、派姆单抗和纳武单抗。
9.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗。
10.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1抗体是纳武单抗。
11.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列、含有SEQ ID NO:2的HC CDR2氨基酸序列；含有SEQ IDNO:3的HC CDR3氨基酸序列；含有SEQ ID NO:4的轻链(LC)CDR1氨基酸序列；含有SEQ IDNO:5的LC CDR2氨基酸序列；和含有SEQ ID NO:6的LC CDR3氨基酸序列。
12.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变区序列和SEQ ID NO:8的轻链可变区。
13.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1抗体包含SEQ ID NO:9的重链序列和SEQ ID NO:10的轻链序列。
14.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抗PD-1抗体是AMG 404。
15.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是MEK抑制剂。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼、匹马塞替尼、PD-325901、MEK162、TAK-733、GDC-0973或AZD8330。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述MEK抑制剂是曲美替尼。
18.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是EGFR抑制剂。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是阿法替尼。
21.如权利要求19所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是帕尼单抗。
22.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是SHP2抑制剂。
23.如权利要求22所述的用途，其中所述SHP2抑制剂是RMC 4550。
24.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是mTOR抑制剂。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述mTOR抑制剂是依维莫司。
26.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是PI3K抑制剂。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述PI3K抑制剂是AMG 511或布帕尼西。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述PI3K抑制剂是AMG 511。
29.如权利要求27所述的用途，其中所述PI3K抑制剂是布帕尼西。
30.如权利要求1或2所述的用途，其中所述至少一种其他药学活性药剂是AKT抑制剂。
31.权利要求30所述的用途，其中所述AKT抑制剂是AZD5363。
32.(1M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮和卡铂在制备用于治疗患者中由KRAS G12C突变介导的癌症的药物中的用途，其中向患者施用治疗有效量的(1M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮和治疗有效量的卡铂。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、阑尾癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、小肠癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、胆管癌、皮肤癌或眼内黑色素瘤。
34.如权利要求32所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
35.如权利要求32所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌。
36.如权利要求32所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
37.如权利要求32-36中任一项所述的用途，其中所述(1M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮和所述卡铂是同时或分开施用。
38.(1M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮和帕尼单抗在制备用于治疗患者中由KRAS G12C突变介导的癌症的药物中的用途，其中向患者施用治疗有效量的(1M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮和治疗有效量的帕尼单抗。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、阑尾癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、小肠癌、鼻腔癌、副鼻窦癌、胆管癌、皮肤癌或眼内黑色素瘤。
40.如权利要求38所述的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
41.如权利要求38所述的用途，其中所述癌症是结肠直肠癌。
42.如权利要求38所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
43.如权利要求38-42中任一项所述的用途，其中所述(1M)-6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(4-甲基-2-(2-丙烷基)-3-吡啶基)-4-((2S)-2-甲基-4-(2-丙烯酰基)-1-哌嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1H)-酮和所述帕尼单抗是同时或分开施用。
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