RS62078B2 - Aav vektori za gensku terapiju mrežnjače i cns - Google Patents

Aav vektori za gensku terapiju mrežnjače i cns

Info

Publication number
RS62078B2
RS62078B2 RS20210849A RSP20210849A RS62078B2 RS 62078 B2 RS62078 B2 RS 62078B2 RS 20210849 A RS20210849 A RS 20210849A RS P20210849 A RSP20210849 A RS P20210849A RS 62078 B2 RS62078 B2 RS 62078B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
raav
cases
acid substitutions
nucleic acid
Prior art date
Application number
RS20210849A
Other languages
English (en)
Inventor
Abraham Scaria
Jennifer Sullivan
Lisa M Stanek
Lamya Shihabuddin
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53189202&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62078(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS62078B1 publication Critical patent/RS62078B1/sr
Publication of RS62078B2 publication Critical patent/RS62078B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNO UPUĆIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava ima prioritet u odnosu na U.S. provizionu prijavu serijski br.61/988,131, podnetu 2. maja 2014. i U.S. provizionu prijavu serijski br.62/114,575, podnetu 10. februara 2015.
PODNOŠENJE LISTE SEKVENCI U ASCII TEKSTUALNOJ DATOTECI
[0002] Sadržaj sledećeg podneska u ASCII tekstualnoj datoteci je ovde uključen putem reference u svojoj celini: oblik koji može da se čita na računaru (computer readable form,CRF) liste sekvenci (naziv datoteke: 159792010440SEQLIST.txt, datum snimanja: 29. april 2015, veličina: 85 KB).
OBLAST PRONALASKA
[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na varijante rekombinantnih adenoasociranih virusnih (rAAV) vektora za poboljšanu isporuku u oko; na primer, za poboljšanu gensku terapiju mrežnjače.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0004] Degenerativne bolesti mrežnjače su obećavajući fokus za gensku terapiju posredovanu adenoasociranim vektorom (AAV). AAV vektori mogu da posreduju dugoročnu ekspresiju gena u mrežnjači i da izazovu minimalni imunski odgovor, što ove vektore čini atraktivnim izborom za isporuku gena u oko. Mrežnjača je tkivo osetljivo na svetlost u zadnjem delu oka koje je sačinjeno od različitih vrsta ćelija, uključujući fotoreceptorske ćelije, pigmentovane epitelne ćelije mrežnjače i ganglijske ćelije mrežnjače. Vrsta ciljne ćelije i načina isporuke vektora za AAV vektor za gensku terapiju zavisiće od naznačene bolesti. Na primer, u kliničkoj studiji faze I za senilnu degeneraciju makule koristi se intravitrealna isporuka vektora za postizanje transdukcije ganglijskih ćelija mrežnjače, a u nedavnom kliničkom ispitivanju za lečenje pacijenata sa Leberovom kongenitalnom amaurozom tipa 2, koja je vrsta retinitis pigmentoze, koristi se subretinalna isporuka RPE65 gena za transdukciju pigmentovanih epitelnih ćelija mrežnjače.
Allocca et al. (2007, J. Virology 81:11372-11380) izveštavaju o transdukciji mišjih fotoreceptora sa AAV serotipovima.
[0005] Imajući u vidu takvu primenu, postoji potreba za razvojem novih agensa i postupaka za unapređenje AAV isporuke u oko.
U ovom pronalasku, poremećaj je očni poremećaj, a primena je na subretinu, a rAAV čestica sadrži rAAV2 kapsid kako je definisano u zahtevima.
[0006] Vektori na bazi adenoasociranih virusa (AAV) takođe su postali poželjni sistem vektora za neurološku gensku terapiju, sa izuzetnim bezbednosnim rezultatima u brojnim kliničkim ispitivanjima (Kaplitt, M.G. et al. (2007) Lancet 369:2097-2105; Eberling, J.L. et al. (2008) Neurology 70:1980-1983; Fiandaca, M.S. et al. (2009) Neuroimage.47 Suppl 2:T27-35). Međutim, delotvorno lečenje neuroloških poremećaja je u velikoj meri ometeno problemima povezanim sa isporukom AAV vektora ugroženim ćelijskim populacijama. Ovaj problem sa isporukom je bio posebno problematičan kod poremećaja koji obuhvataju centralni nervni sistem (CNS). Shodno tome, postoji dalja potreba za unapređenjem isporuke AAV u CNS.
[0007] Na osnovu otkrića koje je ovde sadržano, predmetni pronalazak obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za upotrebu u postupku lečenja očnog poremećaja kod sisara, pri čemu navedeni postupak obuhvata isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko pojedinca, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu navedene čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na subretinu pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) rekombinantni AAV2 (rAAV2) kapsid koji sadrži proteine AAV2 kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, pri čemu je jedna od više aminokiselinskih supstitucija sa ostatkom hidrofobne aminokiseline, i pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV.
[0008] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za upotrebu u postupku za lečenje očnog poremećaja kod pojedinca, pri čemu navedeni postupak obuhvata subretinalnu isporuku navedene kompozicije u mrežnjaču pojedinca, pri čemu čestice rAAV sadrže a) kapsid rAAV2 koji sadrži proteine kapsida AAV2 sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, pri čemu je jedna od više aminokiselinskih supstitucija sa ostatkom hidrofobne aminokiseline, i pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV.
[0009] Predmetni pronalazak, njegovi drugi aspekti i neka njegova poželjna otelotvorenja prikazani su u priloženim zahtevima.
[0010] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko pojedinca, koji obuhvataju primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) u subretinu pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine kapsida rAAV sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije ćelije u oku ili CNS-u putem čestice rAAV. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije ćelije u oku putem čestice rAAV za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%, npr. u poređenju sa referentnim kapsidom rAAV koji sadrži protein kapsida AAV divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, ćelija oka je ćelija mrežnjače, fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače, bipolarna ćelija, horizontalna ćelija, amakrina ćelija, Milerova ćelija i/ili ganglijska ćelija. U nekim slučajevima, ćelija CNS je oligodendrocit, astrocit, neuron, ćelija moždanog parenhima, mikroglijalna ćelija, ependimalna ćelija i/ili Purkinjeova ćelija.
[0011] U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim otelotvorenjima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R532. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije na poziciji R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije R484A i R487A ili supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV-2. U ovom pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV2.
[0012] U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528 ili 533, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528 ili 533, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji R485, R488, R533 ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, jedna aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R.
[0013] U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži AAV1, AAV6 ili AAV9 kapsid, i pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV1, AAV6 ili AAV9; i/ili pri čemu čestica rAAV sadrži AAV8 ili AAVrh10 kapsid, i pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 487, 490, 535, 588 i/ili 591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV8 ili AAVrh10.
[0014] U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od antioksidansa, neurotrofnog faktora, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora. U daljim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od: Prph2, RPE65, AIPL1, GUCY2D, LCA5, CRX, CEP290, MYO 7a, klarina, ABCA4, RDH12, IMPDH1, CRB1, LRAT, NMNAT1, TULP1, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3, GNAT2, GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO, BCL2, BCL-X, NPκB, endostatina, angiostatina, sFlt, sPDGF-R, IL10, anti-IL17, sIL17R, IL1-ra, anti-TGFβ, sTNF-R I, sTNF-R II i IL4. U drugim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U daljim otelotvorenjima, terapeutska nukleinska kiselina je siRNK, shRNK, RNKi, miRNK, antisens RNK, ribozim ili DNKzim. U nekim otelotvorenjima, vektor rAAV je samokomplementarni vektor rAAV.
[0015] U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid koji uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu, pri čemu je heterologna nukleinska kiselina pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u mrežnjači. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više vrsta ćelija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, ćelija mrežnjače je fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače, bipolarna ćelija, horizontalna ćelija, amakrina ćelija, Milerova ćelija i/ili ganglijska ćelija. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter rodopsin kinaze (RK), promoter opsina, promoter citomegalovirusa (CMV), promoter β-aktina kokoške (CBA).
[0016] U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i heterolognu nukleinsku kiselinu za isporuku heterologne nukleinske kiseline u mrežnjaču pojedinca. U nekim otelotvorenjima, pojedinac je čovek. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina se koristi za lečenje očnog poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od: autozomne recesivne teške rane degeneracije mrežnjače (Leberova kongenitalna amauroza), kongenitalne ahromatopsije, Stargartove bolesti, Bestove bolesti, Dojnove bolesti, distrofije čepića, retinitis pigmentoze, X-vezane retinošize, Ušerovog sindroma, senilne degeneracije makule, atrofijske senilne degenerecije makule, neovaskularne AMD, dijabetičke makulopatije, proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), cistoidnog edema makule, centralne serozne retinopatije, ablacije mrežnjače, intraokularne inflamacije, glaukoma i posteriornog uveitisa.
[0017] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje transdukcije rAAV ćelija nakon subretinalne isporuke čestice rAAV u oko pojedinca u poređenju sa transdukcijom ćelija sa rAAV koji sadrži kapsid divljeg tipa, pri čemu postupak obuhvata uključivanje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u proteinu kapsida AAV na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2; pri čemu čestica rAAV sadrži protein kapsida rAAV i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV.
[0018] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje ekspresije heterologne nukleinske kiseline nakon subretinalne isporuke čestica rAAV u oko pojedinca, pri čemu postupak obuhvata uključivanje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u protein kapsida AAV na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2; pri čemu čestica rAAV sadrži protein kapsida rAAV i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV.
[0019] U pronalasku, čestice rAAV sa poboljšanom transdukcijom i/ili poboljšanom ekspresijom heterologne nukleinske kiseline sadrže kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%.
[0020] U nekim slučajevima, čestice rAAV sa poboljšanom transdukcijom i/ili poboljšanom ekspresijom heterologne nukleinske kiseline sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim otelotvorenjima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije na poziciji R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije R484A i R487A ili supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV-2. U ovom pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV2.
[0021] U nekim slučajevima, čestice rAAV sa poboljšanom transdukcijom i/ili poboljšanom ekspresijom heterologne nukleinske kiseline sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528 ili 533, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina ostatkom arginina ili lizina. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528 ili 533, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji R485, R488, R533 ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, jedna aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R.
[0022] U nekim slučajevima, čestice rAAV sa poboljšanom transdukcijom i/ili poboljšanom ekspresijom heterologne nukleinske kiseline sadrže kapsid koji sadrži jednu ili više
1
aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i rAAV vektor koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od antioksidansa, neurotrofnog faktora, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora. U daljim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od: Prph2, RPE65, AIPL1, GUCY2D, LCA5, CRX, CEP290, MYO 7a, klarina, ABCA4, RDH12, IMPDH1, CRB1, LRAT, NMNAT1, TULP1, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3, GNAT2, GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO, BCL2, BCL-X, NPκB, endostatina, angiostatina, sFlt, sPDGF-R, IL10, anti-IL17, sIL17R, IL1-ra, anti-TGFβ, sTNF-R I, sTNF-R II i IL4. U drugim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U daljim otelotvorenjima, terapeutska nukleinska kiselina je siRNK, shRNK, RNKi, miRNK, antisens RNK, ribozim ili DNKzim. U nekim otelotvorenjima, vektor rAAV je samokomplementarni vektor rAAV.
[0023] U nekim slučajevima, čestice rAAV sa poboljšanom transdukcijom i/ili poboljšanom ekspresijom heterologne nukleinske kiseline sadrže kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu, pri čemu je heterologna nukleinska kiselina pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u mrežnjači. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više vrsta ćelija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, ćelija mrežnjače je fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače i/ili ganglijska ćelija. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter rodopsin kinaze (RK), promoter opsina, promoter citomegalovirusa (CMV), promoter β-aktina kokoške (CBA).
[0024] U nekim slučajevima, čestice rAAV sa poboljšanom transdukcijom i/ili poboljšanom ekspresijom heterologne nukleinske kiseline sadrže kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i heterolognu nukleinsku kiselinu za isporuku heterologne nukleinske kiseline u mrežnjaču pojedinca. U nekim otelotvorenjima, pojedinac je čovek. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina se koristi za lečenje očnog poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od: autozomne recesivne teške rane degeneracije mrežnjače (Leberova kongenitalna amauroza), kongenitalne ahromatopsije, Stargartove bolesti, Bestove bolesti, Dojnove bolesti, distrofije čepića, retinitis pigmentoze, X-vezane retinošize, Ušerovog sindroma, senilne degeneracije makule, atrofijske senilne degenerecije makule, neovaskularne AMD, dijabetičke makulopatije, proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), cistoidnog edema makule, centralne serozne retinopatije, ablacije mrežnjače, intraokularne inflamacije, glaukoma i posteriornog uveitisa.
[0025] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za lečenje očnog poremećaja kod pojedinca (npr. čoveka) koji obuhvataju isporuku kompozicije koja sadrži čestice rAAV u mrežnjaču pojedinca, pri čemu čestice rAAV sadrže a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%.
[0026] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju subretinalnu isporuku čestica rAAV koje sadrže vektor rAAV koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu korišćenu u lečenju očnog poremećaja kod pojedinca (npr. čoveka), pri čemu čestice rAAV sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim otelotvorenjima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije na poziciji R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije R484A i R487A ili supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV-2. U ovom pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV2.
[0027] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju subretinalnu isporuku čestica rAAV koje sadrže vektor rAAV koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu korišćenu u lečenju očnog poremećaja kod pojedinca (npr. čoveka), pri čemu čestice rAAV sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528 ili 533, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan
1
pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina ostatkom arginina ili lizina. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528 ili 533, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji R485, R488, R533 ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, jedna aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R.
[0028] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju subretinalnu isporuku čestica rAAV koje sadrže vektor rAAV koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu korišćenu u lečenju očnog poremećaja kod pojedinca (npr. čoveka), i kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od antioksidansa, neurotrofnog faktora, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora. U daljim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od: Prph2, RPE65, AIPL1, GUCY2D, LCA5, CRX, CEP290, MYO 7a, klarina, ABCA4, RDH12, IMPDH1, CRB1, LRAT, NMNAT1, TULP1, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3, GNAT2, GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO, BCL2, BCL-X, NPXB, endostatina, angiostatina, sFlt, sPDGF-R, IL10, anti-IL17, sIL17R, IL1-ra, anti-TGFβ, sTNF-R I, sTNF-R II i IL4. U drugim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U daljim otelotvorenjima, terapeutska nukleinska kiselina je siRNK, shRNK, RNKi, miRNK, antisens RNK, ribozim ili DNKzim. U nekim otelotvorenjima, vektor rAAV je samokomplementarni vektor rAAV.
[0029] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju subretinalnu isporuku čestica rAAV koje sadrže vektor rAAV koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu korišćenu u lečenju očnog poremećaja kod pojedinca (npr. čoveka), i kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, pri čemu je heterologna nukleinska kiselina pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u mrežnjači. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više vrsta ćelija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, ćelija mrežnjače je fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače i/ili ganglijska ćelija. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter rodopsin kinaze (RK), promoter opsina, promoter citomegalovirusa (CMV), promoter β-aktina kokoške (CBA).
[0030] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju subretinalnu isporuku čestica rAAV koje sadrže vektor rAAV koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu korišćenu u lečenju očnog poremećaja kod pojedinca (npr. čoveka), i kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, pri čemu je očni poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od: autozomne recesivne teške rane degeneracije mrežnjače (Leberova kongenitalna amauroza), kongenitalne ahromatopsije, Stargartove bolesti, Bestove bolesti, Dojnove bolesti, distrofije čepića, retinitis pigmentoze, X-vezane retinošize, Ušerovog sindroma, senilne degeneracije makule, atrofijske senilne degenerecije makule, neovaskularne AMD, dijabetičke makulopatije, proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), cistoidnog edema makule, centralne serozne retinopatije, ablacije mrežnjače, intraokularne inflamacije, glaukoma i posteriornog uveitisa.
[0031] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju subretinalnu isporuku kompozicije koja sadrži čestice rAAV, pri čemu čestice rAAV sadrže vektor rAAV koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu korišćenu u lečenju očnog poremećaja kod pojedinca (npr. čoveka), i
1
kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim otelotvorenjima, koncentracija čestica u kompoziciji je oko 1 x 10<6>DRP/ml do oko 1 x 10<14>DRP/ml. U nekim otelotvorenjima, kompozicija čestica rAAV je delotvorna u lečenju funkcije vida pojedinca. U nekim otelotvorenjima, funkcija vida se procenjuje mikroperimetrijom, perimetrijom sa adaptacijom na mrak, procenom mobilnosti vida, oštrine vida, ERG ili procenom čitanja. U nekim otelotvorenjima, postupak dovodi do poboljšanja funkcije vida pojedinca. U nekim otelotvorenjima, postupak dovodi do prevencije ili usporavanja progresije propadanja funkcije vida čoveka usled progresije poremećaja oka.
[0032] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje sisteme za subretinalnu isporuku vektora u oko pojedinca, koji obuhvataju a) kompoziciju koja sadrži delotvornu količinu čestica rAAV, pri čemu i) protein kapsida čestica rAAV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i ii) vektor sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku RNK i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV; i b) sredstvo za retinalnu isporuku rAAV. U nekim slučajevima, sredstvo sadrži kanilu sa malim otvorom i špric, pri čemu je kanila sa malim otvorom veličine 27 do 45. U nekim slučajevima, kompozicija čestica rAAV je sadržana u špricu. U nekim slučajevima, kanila je povezana sa špricem. U nekim slučajevima, koncentracija čestica u kompoziciji je oko 1 x 10<6>DRP/ml do oko 1 x 10<14>DRP/ml.
[0033] U nekim slučajevima, čestice rAAV iz sistema sadrže kapsid AAV2 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije putem čestice rAAV ćelije u oku ili CNS-u. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije putem čestice rAAV ćelije u oku ili CNS-u za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%,
1
najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%, npr. u poređenju sa referentnim kapsidom rAAV koji sadrži protein AAV kapsida divljeg tipa. U nekim slučajevima, ćelija oka je ćelija mrežnjače, fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače, bipolarna ćelija, horizontalna ćelija, amakrina ćelija, Milerova ćelija i/ili ganglijska ćelija. U nekim slučajevima, ćelija CNS je oligodendrocit, astrocit, neuron, ćelija moždanog parenhima, mikroglijalna ćelija, ependimalna ćelija i/ili Purkinjeova ćelija.
[0034] U nekim slučajevima, čestice rAAV iz sistema sadrže kapsid AAV2 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija sadrži supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije na poziciji R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje R484A i R487A supstitucije ili R585A i R588A supstitucije, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U daljim slučajevima, AAV kapsid sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV-2. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV1, kapsid AAV2, kapsid AAV3, kapsid AAV6, kapsid AAV8, kapsid AAVrh8R, kapsid AAV9 ili kapsid AAVrh10.
1
[0035] U nekim slučajevima, čestice rAAV iz sistema sadrže kapsid AAV2 koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina ostatkom arginina ili lizina. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji R485, R488, R533 ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, jedna aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R.
[0036] U nekim slučajevima, čestice rAAV iz sistema sadrže kapsid AAV sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i vektor rAAV koji sadrži
1
heterolognu nukleinsku kiselinu. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od antioksidansa, neurotrofnog faktora, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora. U daljim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od: Prph2, RPE65, AIPL1, GUCY2D, LCA5, CRX, CEP290, MYO 7a, klarina, ABCA4, RDH12, IMPDH1, CRB1, LRAT, NMNAT1, TULP1, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3, GNAT2, GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO, BCL2, BCL-X, NPκB, endostatina, angiostatina, sFlt, sPDGF-R, IL10, anti-IL17, sIL17R, IL1-ra, anti-TGFβ, sTNF-R I, sTNF-R II i IL4. U drugim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U daljim slučajevima, terapeutska nukleinska kiselina je siRNK, RNKi, miRNK i antisens RNK, ribozom ili DNKzim. U nekim slučajevima, vektor rAAV je samokomplementarni vektor rAAV.
[0037] U nekim slučajevima, čestice rAAV iz sistema sadrže kapsid AAV sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu, pri čemu je heterologna nukleinska kiselina pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u mrežnjači. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više vrsta ćelija mrežnjače. U nekim slučajevima, ćelija mrežnjače je fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače i/ili ganglijska ćelija. U nekim slučajevima, promoter je promoter rodopsin kinaze (RK), promoter opsina, promoter citomegalovirusa (CMV), promoter βaktina kokoške (CBA).
[0038] U nekim slučajevima, čestice rAAV iz sistema sadrže kapsid AAV sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu se koriste za isporuku heterologne nukleinske kiseline u mrežnjaču pojedinca. U nekim slučajevima, pojedinac je čovek. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina se koristi za lečenje očnog poremećaja izabranog iz grupe
1
koja se sastoji od: autozomne recesivne teške rane degeneracije mrežnjače (Leberova kongenitalna amauroza), kongenitalne ahromatopsije, Stargartove bolesti, Bestove bolesti, Dojnove bolesti, distrofije čepića, retinitis pigmentoze, X-vezane retinošize, Ušerovog sindroma, senilne degeneracije makule, atrofijske senilne degenerecije makule, neovaskularne AMD, dijabetičke makulopatije, proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), cistoidnog edema makule, centralne serozne retinopatije, ablacije mrežnjače, intraokularne inflamacije, glaukoma i posteriornog uveitisa.
[0039] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za isporuku heterologne nukleinske kiseline u centralni nervni sistem (CNS) pojedinca, koji obuhvata primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) u CNS pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za poboljšanje transdukcije rAAV ćelija u centralnom nervnom sistemu (CNS) pojedinca u poređenju sa transdukcijom ćelija sa rAAV koji sadrži kapsid divljeg tipa, pri čemu postupak obuhvata primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na CNS pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U daljim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za poboljšanje ekspresije heterologne nukleinske kiseline u centralnom nervnom sistemu (CNS) pojedinca, pri čemu postupak obuhvata primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na CNS pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U još nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje poremećaja centralnog nervnog sistema
2
(CNS) pojedinca koji obuhvata primenu delotvorne količine kompozicije koja sadrži česticu rAAV na CNS pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV.
[0040] U nekim otelotvorenjima prethodnog, heterologna nukleinska kiselina se eksprimira sa povećanim nivoom ekspresije, u poređenju sa nivoom ekspresije heterologne nukleinske kiseline čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV. U nekim otelotvorenjima, ekspresija nukleinske kiseline je povećana za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV uzrokuje smanjenu neuroinflamaciju, u poređenju sa česticom rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV. U nekim otelotvorenjima, neuroinflamacija je smanjena za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%, u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, referentni kapsid rAAV sadrži kapsid rAAV ili protein kapsida divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, referentni kapsid rAAV sadrži kapsid rAAV ili protein kapsida kome nedostaje jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije ćelije u oku putem čestice rAAV. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije ćelije u oku putem čestice rAAV za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%, npr. u poređenju sa referentnim kapsidom rAAV koji sadrži protein kapsida AAV divljeg tipa. U ovom pronalasku čestica rAAV sadrži kapsid AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV se primenjuje na jednom mestu.
[0041] U nekim otelotvorenjima prethodnog, čestica rAAV se isporučuje stereotaktičkom isporukom. U nekim slučajevima, čestica rAAV se isporučuje isporukom pojačanom konvekcijom. U nekim slučajevima, čestica rAAV se primenjuje koristeći CED sistem za isporuku. U nekim slučajevima, CED sistem za isporuku sadrži kanilu i/ili pumpu. U nekim slučajevima, kanila je kanila otporna na refluks ili stepenasta kanila. U nekim otelotvorenjima, pumpa je manuelna pumpa. U nekim slučajevima, pumpa je osmotska pumpa. U nekim slučajevima, pumpa je infuziona pumpa.
[0042] U nekim slučajevima prethodnog, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585 i/ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim otelotvorenjima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R347, R350, K390, K395, R448, R451, R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje R347A, R350A, K390A, K395A, R448A, R451A, R484A, R487A, K527A, K532A, R585A i/ili R588A supstituciju, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije na poziciji R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije R484A i R487A ili supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije K532A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2.
[0043] U nekim slučajevima prethodnog, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina ostatkom arginina ili lizina. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji R485, R488, R533 ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100%
2
identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, jedna aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R.
[0044] U nekim otelotvorenjima prethodnog, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira gen povezan sa CNS. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od enzima, neurotrofnog faktora, polipeptida koji je deficitaran ili mutiran kod pojedinca sa poremećajem povezanim sa CNS, antioksidansa, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora, alfa-sinukleina, kisele beta glukozidaze (GBA), beta galaktozidaze-1 (GLB1), iduronat 2-sulfataze (IDS), galaktozilceramidaze (GALC), manozidaze, alfa-D-manozidaze (MAN2B1), beta manozidaze (MANBA), pseudoaril sulfataze A (ARSA), N-acetilglukozamin-1-fosfotransferaze (GNPTAB), kisele sfingomijelinaze (ASM), Niman-Pikovog C proteina (NPC1), kisele alfa-1,4-glukozidaze (GAA), beta podjedinice heksozaminidaze, HEXB, N-sulfoglukozamin sulfohidrolaze (MPS3A), N-alfaacetilglukozaminidaze (NAGLU), heparin acetil-CoA, alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaze (MPS3C), N-acetilglukozamin-6-sulfataze (GNS), alfa-N-acetilgalaktozaminidaze (NAGA), beta-glukuronidaze (GUSB), alfa podjedinice heksozaminidaze (HEXA), hantingtina (HTT), lizozomske kisele lipaze (LIPA), aspartil glukozaminidaze, alfa galaktozidaze A, palmitoil proteinske tioesteraze, tripeptidil peptidaze, lizozomskog transmembranskog proteina, cisteinskog transportera, kisele ceramidaze, kisele alfa-L-fukozidaze, katepsina A, alfa-L-iduronidaze, arilsulfataze B, arilsulfataze A, N-acetilgalaktozamin-6-sulfata, kisele beta galaktozidaze ili alfa neuramidaze. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od proteina inhibitora apoptoze neurona (NAIP), faktora rasta nerva (NGF), glijalnog faktora rasta (GDNF), moždanog faktora rasta (BDNF), cilijarnog neurotrofnog faktora (CNTF), tirozin hidroksilaze (TH), GTP-ciklohidrolaze (GTPCH), aminokiselinske dekarboksilaze (AADC), antioksidansa, antiangiogenog polipeptida, antiinflamatornog polipeptida i aspartoacilaze (ASPA). U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, terapeutska nukleinska kiselina je siRNK, shRNK, RNKi, miRNK i antisens RNK, ribozom ili DNKzim. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u jednoj ili više ćelija CNS. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je pod kontrolom promoterske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od neposrednog ranog promotera citomegalovirusa (CMV), RSV LTR, MoMLV LTR, promotera fosfoglicerat kinaze-1 (PGK), promotera simijan virusa 40 (SV40), promotera CK6, transtiretinskog promotera (TTR), TK promotera, tetraciklinskog responsivnog promotera (TRE), HBV promotera, hAAT promotera, LSP promotera, himernog promotera specifičnog za jetru (LSP), E2F promotera, promotera telomeraze (hTERT); promotera pojačivača citomegalovirusa/kokošjeg beta-aktina/zečjeg β-globina (CAG), promotera faktora elongacije 1-alfa (EFl-alpha), promotera humane β-glukuronidaze, promotera β-aktina kokoške (CBA), LTR promotera retrovirusnog Rausovog virusa sarkoma (RSV), promotera dihidrofolat reduktaze i promotera 13-aktina. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više ćelija CNS. U nekim slučajevima, jedna ili više ćelija CNS obuhvata jednu ili više ćelija mozga. U nekim slučajevima, jedna ili više ćelija CNS je oligodendrocit, astrocit, neuron, ćelija moždanog parenhima, mikroglijalna ćelija, ependimalna ćelija i/ili Purkinjeova ćelija. U nekim slučajevima, ćelija mozga je neuron.
[0045] U nekim otelotvorenjima gore navedenog, rAAV vektor je samokomplementarni rAAV vektor. U nekim otelotvorenjima, vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement nukleinske kiseline, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline može da formira intralančane bazne parove sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž većeg dela ili celom svojom dužinom. U nekim otelotvorenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline i druga sekvenca nukleinske kiseline su povezane mutiranim AAV ITR, pri čemu mutirani AAV ITR sadrži deleciju D regiona i sadrži mutaciju terminalne rezolucione sekvence.
[0046] U nekim otelotvorenjima prethodnog, pojedinac je čovek.
[0047] U nekim slučajevima, poremećaj je bolest lizozomskog skladištenja izabrana iz grupe koja se sastoji od aspartilglusoaminurije, Fabrijeve bolesti, infantilne Batenove bolesti (CNL1), klasične kasne infantilne Batenove bolesti (CNL2), juvenilne Batenove bolesti (CNL3), Batenove bolesti oblik CNL4, Batenove bolesti oblik CNL5, Batenove bolesti oblik CNL6, Batenove bolesti oblik CNL7, Batenove bolesti oblik CNL8, cistinoze, Farberove bolesti, fukozidoze, galaktozidozijalidoze, Gošeove bolesti tip 1, Gošeove bolesti tip 2, Gošeove bolesti tip 3, GM1 gangliozidoze, Hanterove bolesti, Krabeove bolesti, bolesti α
2
manozidoze, bolesti β manozidoze, Maroto-Lamijevog sindroma, bolesti metahromatske leukodistrofije, Morkiovog sindroma A, Morkiovog sindroma B, bolesti mukolipidoze II/III, Niman-Pikove bolesti A, Niman-Pikove bolesti B, Niman-Pikove bolesti C, Pompeove bolesti, Sandhofove bolesti, Sanfilipove bolesti A, Sanfilipove bolesti B, Sanfilipove bolesti C, Sanfilipove bolesti D, Šindlerove bolesti, Šindler-Kanzakijeve bolesti, sijalidoze, mukopolisaharidoze tip VII, Tej-Saksove bolesti i Volmanove bolesti.
[0048] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje Hantingtonove bolesti kod pojedinca, koji obuhvata primenu delotvorne količine kompozicije koja sadrži česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na strijatumu pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu.
[0049] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje Parkinsonove bolesti kod pojedinca, koji obuhvata primenu delotvorne količine kompozicije koja sadrži česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na strijatumu pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid je TH, GTPCII, GDNF, BDNF, i/ili AADC; ili njegov fragment. U nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid je AADC ili njegov fragment.
[0050] U nekim otelotvorenjima prethodnog, heterologna nukleinska kiselina se eksprimira sa povećanim nivoom ekspresije, u poređenju sa nivoom ekspresije heterologne nukleinske kiseline čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV. U ovom pronalasku, čestica rAAV
2
uzrokuje smanjenu neuroinflamaciju, u poređenju sa česticom rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%, u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, referentni kapsid rAAV sadrži kapsid rAAV ili protein kapsida divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, referentni kapsid rAAV sadrži kapsid rAAV ili protein kapsida kome nedostaje jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom.
[0051] U nekim otelotvorenjima prethodnog, čestica rAAV se isporučuje stereotaktičkom isporukom. U nekim slučajevima, čestica rAAV se isporučuje isporukom pojačanom konvekcijom. U nekim slučajevima, čestica rAAV se primenjuje koristeći CED sistem za isporuku. U nekim slučajevima, kanila je kanila otporna na refluks ili stepenasta kanila. U nekim slučajevima, CED sistem za isporuku sadrži kanilu i/ili pumpu. U nekim slučajevima, čestica rAAV se primenjuje koristeći CED sistem za isporuku. U nekim slučajevima, pumpa je manuelna pumpa. U nekim slučajevima, pumpa je osmotska pumpa. U nekim slučajevima, pumpa je infuziona pumpa.
[0052] U nekim slučajevima prethodnog, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim otelotvorenjima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U nekim
2
otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R347, R350, K390, K395, R448, R451, R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje R347A, R350A, K390A, K395A, R448A, R451A, R484A, R487A, K527A, K532A, R585A i/ili R588A supstituciju, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije na poziciji R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije R484A i R487A ili supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije K532A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2.
[0053] U nekim slučajevima prethodnog, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528 ili 533, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka
2
arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina ostatkom arginina ili lizina. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji R485, R488, R533 ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, jedna aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U ovom pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV2.
[0054] U nekim slučajevima prethodnog, heterologna nukleinska kiselina je pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u jednoj ili više ćelija CNS. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je pod kontrolom promoterske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od neposrednog ranog promotera citomegalovirusa (CMV), RSV LTR, MoMLV LTR, promotera fosfoglicerat kinaze-1 (PGK), promotera simijan virusa 40 (SV40), promotera CK6, transtiretinskog promotera (TTR), TK promotera, tetraciklinskog responsivnog promotera (TRE), HBV promotera, hAAT promotera, LSP promotera, himernog promotera specifičnog za jetru (LSP), E2F promotera, promotera telomeraze (hTERT); promotera pojačivača citomegalovirusa/kokošjeg beta-aktina/zečjeg β-globina (CAG), promotera faktora elongacije 1-alfa (EFl-alpha), promotera humane β-glukuronidaze, promotera β-aktina kokoške (CBA), LTR promotera retrovirusnog Rausovog virusa sarkoma (RSV), promotera dihidrofolat reduktaze i promotera 13-aktina. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više ćelija
2
CNS. U nekim slučajevima, jedna ili više ćelija CNS obuhvata jednu ili više ćelija mozga. U nekim slučajevima, jedna ili više ćelija CNS je oligodendrocit, astrocit, neuron, ćelija moždanog parenhima, mikroglijalna ćelija, ependimalna ćelija i/ili Purkinjeova ćelija. U nekim slučajevima, ćelija mozga je neuron.
[0055] U nekim otelotvorenjima gore navedenog, rAAV vektor je samokomplementarni rAAV vektor. U nekim otelotvorenjima, vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement nukleinske kiseline, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline može da formira intralančane bazne parove sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž većeg dela ili celom svojom dužinom. U nekim otelotvorenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline i druga sekvenca nukleinske kiseline su povezane mutiranim AAV ITR, pri čemu mutirani AAV ITR sadrži deleciju D regiona i sadrži mutaciju terminalne rezolucione sekvence.
[0056] U nekim otelotvorenjima prethodnog, pojedinac je čovek.
[0057] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje komplet za upotrebu u bilo kom od prethodnih otelotvorenja koji sadrži česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV), pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno AAV invertovano terminalno ponavljanje. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje komplet za isporuku heterologne nukleinske kiseline u centralni nervni sistem (CNS) pojedinca, koji obuhvata kompoziciju koja sadrži česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV), pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje komplet za lečenje poremećaja centralnog nervnog sistema (CNS) kod pojedinca, koji obuhvata kompoziciju koja sadrži česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV), pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu za lečenje poremećaja CNS i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV.
[0058] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid je TH, GTPCII, GDNF, BDNF, i/ili AADC; ili njegov fragment. U nekim otelotvorenjima, terapeutski polipeptid je AADC ili njegov fragment.
[0059] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za upotrebu u bilo kom od prethodnih otelotvorenja. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za isporuku heterologne nukleinske kiseline u centralni nervni sistem (CNS) pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za lečenje poremećaja centralnog nervnog sistema (CNS) pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za lečenje Hantingtonove bolesti kod pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV, pri čemu je čestica rAAV formulisana za isporuku u strijatum. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za lečenje Parkinsonove bolesti kod pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih
1
supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV, pri čemu je čestica rAAV formulisana za isporuku u strijatum. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za lečenje Hantingtonove bolesti kod pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV, pri čemu je čestica rAAV formulisana za isporuku na jedno mesto (npr. u CNS pojedinca). U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za lečenje Parkinsonove bolesti kod pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV, pri čemu je čestica rAAV formulisana za isporuku na jedno mesto (npr. u CNS pojedinca).
[0060] U nekim otelotvorenjima prethodnog, heterologna nukleinska kiselina se eksprimira sa povećanim nivoom ekspresije, u poređenju sa nivoom ekspresije heterologne nukleinske kiseline čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV. U nekim slučajevima, čestica rAAV uzrokuje smanjenu neuroinflamaciju, u poređenju sa česticom rAAV koja sadrži kapsid rAAV koji sadrži referentni kapsid. U pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice
2
rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%, u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži referentni kapsid za heparan sulfat proteoglikan. U nekim otelotvorenjima, referentni kapsid rAAV sadrži kapsid rAAV ili protein kapsida divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima, referentni kapsid rAAV sadrži kapsid rAAV ili protein kapsida kome nedostaje jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom.
[0061] U nekim slučajevima prethodnog, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R347, R350, K390, K395, R448, R451, R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje R347A, R350A, K390A, K395A, R448A, R451A, R484A, R487A, K527A, K532A, R585A i/ili R588A supstituciju, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije na poziciji R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstitucije R484A i R487A ili supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije K532A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U ovom pronalasku, čestica rAAV sadrži kapsid AAV2.
[0062] U nekim slučajevima prethodnog, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 485, 488, 528, 533 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji R485, R488, R533 ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina rAAV kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:11. U nekim slučajevima, jedna aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R.
[0063] U nekim slučajevima prethodnog, heterologna nukleinska kiselina je pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u jednoj ili više ćelija CNS. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je pod kontrolom promoterske sekvence
4
izabrane iz grupe koja se sastoji od neposrednog ranog promotera citomegalovirusa (CMV), RSV LTR, MoMLV LTR, promotera fosfoglicerat kinaze-1 (PGK), promotera simijan virusa 40 (SV40), promotera CK6, transtiretinskog promotera (TTR), TK promotera, tetraciklinskog responsivnog promotera (TRE), HBV promotera, hAAT promotera, LSP promotera, himernog promotera specifičnog za jetru (LSP), E2F promotera, promotera telomeraze (hTERT); promotera pojačivača citomegalovirusa/kokošjeg beta-aktina/zečjegβ-globina (CAG), promotera faktora elongacije 1-alfa (EFl-alpha), promotera humane β-glukuronidaze, promotera β-aktina kokoške (CBA), LTR promotera retrovirusnog Rausovog virusa sarkoma (RSV), promotera dihidrofolat reduktaze i promotera 13-aktina. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više ćelija CNS. U nekim slučajevima, jedna ili više ćelija CNS obuhvata jednu ili više ćelija mozga. U nekim slučajevima, jedna ili više ćelija CNS je oligodendrocit, astrocit, neuron, ćelija moždanog parenhima, mikroglijalna ćelija, ependimalna ćelija i/ili Purkinjeova ćelija.
[0064] U nekim otelotvorenjima gore navedenog, rAAV vektor je samokomplementarni rAAV vektor. U nekim otelotvorenjima, vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement nukleinske kiseline, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline može da formira intralančane bazne parove sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž većeg dela ili celom svojom dužinom. U nekim otelotvorenjima, prva sekvenca nukleinske kiseline i druga sekvenca nukleinske kiseline su povezane mutiranim AAV ITR, pri čemu mutirani AAV ITR sadrži deleciju D regiona i sadrži mutaciju terminalne rezolucione sekvence.
[0065] U nekim otelotvorenjima prethodnog, pojedinac je čovek.
[0066] U nekim otelotvorenjima prethodnog, čestice rAAV su u kompoziciji. U nekim otelotvorenjima, kompozicija sadrži pufer i/ili farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U nekim otelotvorenjima, komplet ili čestica rAAV dalje sadrži uputstvo za isporuku kompozicije čestica rAAV u CNS. U nekim otelotvorenjima, komplet ili čestica rAAV dalje sadrži uputstvo za isporuku kompozicije čestica rAAV u strijatum.
[0067] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAVrh8R kapsida, pri čemu protein AAVrh8R kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAVrh8R kapsida, ili pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 586, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji A586, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju A586R ili A586K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:10.
[0068] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za povećanje vezivanja čestice rAAV koja sadrži protein AAVrh8R kapsida za heparan sulfat proteoglikan, koji obuhvata uvođenje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u protein kapsida, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAVrh8R kapsida. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija je na poziciji 586, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju na poziciji A586, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, aminokiselinska supstitucija obuhvata supstituciju A586R ili A586K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida SEQ ID NO:10.
[0069] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za isporuku heterologne nukleinske kiseline u mrežnjaču pojedinca, koji obuhvata intravitrealnu primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na pojedincu, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za poboljšanje transdukcije rAAV ćelija nakon intravitrealne isporuke čestice rAAV u oko pojedinca u poređenju sa transdukcijom ćelija sa rAAV koji sadrži kapsid divljeg tipa, pri čemu postupak obuhvata uključivanje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u proteinu AAV kapsida na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2; pri čemu čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za poboljšanje ekspresije heterologne nukleinske kiseline nakon intravitrealne isporuke čestica rAAV u oko pojedinca, pri čemu postupak obuhvata uključivanje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u proteinu AAV kapsida na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2; pri čemu čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje očnog poremećaja kod pojedinca, koji obuhvata intravitrealnu isporuku kompozicije koja sadrži čestice rAAV u mrežnjaču pojedinca, pri čemu čestice rAAV sadrže a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje sistem za intravitrealnu isporuku vektora u oko pojedinca, koji obuhvata a) kompoziciju koja sadrži delotvornu količinu čestica rAAV, pri čemu i) protein kapsida čestica rAAV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, i ii) vektor sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku RNK i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV; i b) sredstvo za intravitrealnu isporuku rAAV.
U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAVrh8R, AAV1, AAV6, AAV8, AAV9 ili AAVrh10 serotipa. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje komplet za lečenje očnog poremećaja, koji obuhvata a) kompoziciju koja sadrži čestice rAAV, pri čemu čestica rAAV sadrži i) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i ii) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu za lečenje očnog poremećaja i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV; i b) farmaceutski ekscipijens pogodan za intravitrealnu primenu. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAVrh8R, AAV1, AAV6, AAV8, AAV9 ili AAVrh10. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAV1 kapsida, pri čemu protein AAV1 kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV u ćeliju oka u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina kapsida AAV1, ili, pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAV6 kapsida, pri čemu protein AAV6 kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV u ćeliju oka u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAV6 kapsida, ili, pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAV8 kapsida, pri čemu protein AAV8 kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV u ćeliju oka u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAV8 kapsida, ili, pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAV9 kapsida, pri čemu protein AAV9 kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV u ćeliju oka u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAV9 kapsida, ili, pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAVrh10 kapsida, pri čemu protein AAVrh10 kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV u ćeliju oka u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAVrh10 kapsida, ili, pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAV3 kapsida, pri čemu protein AAV3 kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV1, kapsid AAV2, kapsid AAV3, kapsid AAV6, kapsid AAV8, kapsid AAVrh8R, kapsid AAV9 ili kapsid AAVrh10. U nekim otelotvorenjima, delotvornost transdukcije je povećana za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%.
[0070] U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV za ćeliju u oku ili centralnom nervnom sistemu, u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAVrh8R kapsida, za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim slučajevima, ćelija oka je ćelija mrežnjače, fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače, bipolarna ćelija, horizontalna ćelija, amakrina ćelija, Milerova ćelija i/ili ganglijska ćelija. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak zamenjuje hidrofobni aminokiselinski ostatak. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatkom arginina ili lizina. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija obuhvata supstituciju ostatka alanina, serina, glutamina ili treonina ostatkom arginina ili lizina. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa rh8R (AAVrh8R). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji A586 i/ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju A586R ili A586K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju T589R ili T589K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 1 (AAV1). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV1. U nekim slučajevima, VP1 iz AAV1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji S586 i/ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju S586R ili S586K, numeracija na bazi VP1 iz AAV1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju T589R ili T589K, numeracija na bazi VP1 iz AAV1. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 6 (AAV6). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV6. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV6 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija sadrži supstituciju na poziciji S586 i/ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija sadrži supstituciju S586R, numeracija na bazi VP1 iz AAV6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija sadrži supstituciju T589R ili T589K, numeracija na bazi VP1 iz AAV6. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 8 (AAV8). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 588 i/ili 591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV8. U nekim slučajevima, VP1 iz AAV8 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji Q588 i/ili T591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV8. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju Q588R ili Q588K, numeracija na bazi VP1 iz AAV8. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju T591R, numeracija na bazi VP1 iz AAV8. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 9 (AAV9). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih
4
supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV9. U nekim slučajevima, VP1 iz AAV9 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji S586 i/ili A589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju S586R ili S586K, numeracija na bazi VP1 iz AAV9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju A589R ili A589K, numeracija na bazi VP1 iz AAV9. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa rh10 (AAVrh10). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 588 i/ili 591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh10. U nekim slučajevima, VP1 iz AAVrh10 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji Q588 i/ili A591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh10. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju Q588R ili Q588K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh10. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju A591R ili A591K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh10. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje česticu rAAV koja sadrži protein AAV3 kapsida, pri čemu protein AAV3 kapsida sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV za ćeliju u oku ili centralnom nervnom sistemu, u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAVrh8R kapsida, za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV1, kapsid AAV2, kapsid AAV3, kapsid AAV6, kapsid AAV8, kapsid AAVrh8R, kapsid AAV9 ili kapsid AAVrh10. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od antioksidansa, neurotrofnog faktora, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora. U daljim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od: Prph2, RPE65, AIPL1, GUCY2D, LCA5, CRX, CEP290, MYO 7a, klarina, ABCA4, RDH12, IMPDH1, CRB1, LRAT, NMNAT1, TULP1, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3, GNAT2, GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO, BCL2, BCL-X, NPκB, endostatina, angiostatina, sFlt, sPDGF-R, IL10, anti-IL17, sIL17R, IL1-ra, anti-TGFβ, sTNF-R I, sTNF-R II i IL4. U drugim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U daljim slučajevima, terapeutska nukleinska kiselina je siRNK, shRNK, RNKi, miRNK i antisens RNK, ribozom ili DNKzim. U nekim slučajevima, vektor rAAV je samokomplementarni vektor rAAV. U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje menjaju vezivanje za HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG) ili na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, i heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu, pri čemu je heterologna nukleinska kiselina pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u mrežnjači. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više vrsta ćelija mrežnjače. U nekim slučajevima, ćelija mrežnjače je fotoreceptorska ćelija, pigmentovana epitelna ćelija mrežnjače, bipolarna ćelija, horizontalna ćelija, amakrina ćelija, Milerova ćelija i/ili ganglijska ćelija. U nekim slučajevima, promoter je promoter rodopsin kinaze (RK), promoter opsina, promoter citomegalovirusa (CMV), promoter β-aktina kokoške (CBA). U nekim slučajevima, pojedinac je čovek. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina se koristi za lečenje očnog poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od: autozomne recesivne teške rane degeneracije mrežnjače (Leberova kongenitalna amauroza), kongenitalne ahromatopsije, Stargartove bolesti, Bestove bolesti, Dojnove bolesti, distrofije čepića, retinitis pigmentoze, X-vezane retinošize, Ušerovog sindroma, senilne degeneracije makule, atrofijske senilne degenerecije makule, neovaskularne AMD, dijabetičke makulopatije, proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), cistoidnog edema makule, centralne serozne retinopatije, ablacije mrežnjače, intraokularne inflamacije, glaukoma i posteriornog uveitisa. U nekim slučajevima, vektor rAAV je samokomplementarni vektor rAAV. U nekim slučajevima, vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement nukleinske kiseline, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline može da gradi unutarlančane bazne parove sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž njenog većeg dela ili celokupne dužine. U nekim slučajevima, prva sekvenca nukleinske kiseline i druga sekvenca nukleinske kiseline su povezane mutiranim AAV ITR, pri čemu mutirani AAV ITR sadrži deleciju D regiona i sadrži mutaciju sekvence terminalne rezolucije. U nekim slučajevima, pojedinac je čovek. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija povećava delotvornost transdukcije čestice rAAV za ćeliju u oku ili centralnom nervnom sistemu, u poređenju sa česticom AAV koja sadrži divlji tip proteina AAVrh8R kapsida, za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0071]
SL. 1 pokazuje ostatke kapsida uključene u vezivanje heparan sulfat proteoglikana, i mutacije koje su uvedene za stvaranje mutanta AAV2 HBKO. Numeracija je na bazi VP1 aminokiselinske sekvence.
SL. 2 pokazuje smanjenje transdukcije 293 ćelija u kulturi koje je uočeno sa HBKO mutantnim česticama AAV2 (AAV2 HBKO CBA-sFLT02), u poređenju sa česticama AAV2 divljeg tipa (AAV2 CBA-sFLT02). Transdukcija je testirana merenjem količine rastvorljivog Flt (sFLT) prisutnog u medijumu za uzgajanje ćelija 48 sati nakon injekcije divljeg tipa ili mutantnih HBKO čestica AAV2 koje nose vektore koji koriste CBA promoter za pokretanje ekspresije Flt.
SL. 3 pokazuje smanjenje transdukcije 293 i Hela ćelija u kulturi koje je uočeno sa HBKO mutantnim česticama AAV2 (AAV2 HBKO CBA-GFP), u poređenju sa česticama AAV2 divljeg tipa (AAV2 CBA-GFP). Transdukcija je testirana fluorescentnim snimanjem ćelija obavljenim 48 sati nakon injekcije divljeg tipa ili mutantnih HBKO čestica AAV2 koje nose vektore koji koriste CBA promoter za pokretanje ekspresije EGFP.
SL. 4A i 4B prikazuju transdukciju koja je uočena nakon intravitrealne (SL.4A) ili subretinalne (SL. 4B) injekcije divljeg tipa ili HBKO mutantnih čestica AAV2.
Transdukcija je testirana ekspresijom rastvorljivog Flt (sFLT) nakon transdukcije sa vektorima koji kodiraju Flt. Broj injektovanih vektorskih genoma je naznačen za svaki eksperiment (10<8>ili 10<9>vg).
SL. 5 pokazuje da HBKO mutantne čestice AAV2 ne uspevaju da transdukuju oko miša nakon intravitrealne injekcije. Miševima je data intravitrealne injekcija divljeg tipa (AAV2 CBA-GFP) ili HBKO mutantnih (AAV2 HBKO CBA-GFP) čestica
4
AAV2 koje nose vektore koji koriste CBA promoter za pokretanje ekspresije EGFP, i sekcije su snimljene fluorescentnom mikroskopijom.
SL. 6 pokazuje da HBKO mutantne čestice AAV2 (AAV2 CBA HBKO) uzrokuju značajno povećanje transdukcije nakon subretinalne injekcije, u poređenju sa česticama divljeg tipa (AAV2 CBA). Transdukcija je testirana ekspresijom rastvorljivog Flt (sFLT) nakon injekcije čestica AAV2 koje nose vektore koji koriste CBA promoter za pokretanje ekspresije Flt. Broj injektovanih vektorskih genoma je naznačen (10<8>ili 10<9>vg).
SL. 7 pokazuje da HBKO mutantne čestice AAV2 (AAV2 HBKO CBA-GFP) uzrokuju značajno povećanje transdukcije fotoreceptorskih ćelija (kako je obeleženo) nakon subretinalne injekcije, u poređenju sa česticama divljeg tipa (AAV2 CBA-GFP). Transdukcija je izmerena fluorescentnim snimanjem ekspresije GFP nakon transdukcije sa česticama AAV2 koje nose vektore koji koriste CBA promoter za pokretanje ekspresije EGFP.
SL. 8 pokazuje da HBKO mutantne čestice AAV2 (AAV2 RK HBKO) uzrokuju značajno povećanje transdukcije fotoreceptora nakon subretinalne injekcije, u poređenju sa česticama divljeg tipa (AAV2 RK). Transdukcija je testirana ekspresijom rastvorljivog Flt (sFLT) nakon injekcije čestica AAV2 koje nose vektore koji koriste promoter rodopsin kinaze (RK) za pokretanje ekspresije Flt. Broj injektovanih vektorskih genoma je naznačen (10<8>ili 10<9>vg).
SL. 9A i 9B pokazuju ekspresiju EGFP u mozgu miša 30 dana nakon intrastrijatalne injekcije AAV2HBKO-EGFP (SL.9A), u poređenju sa AAV2-EGFP (SL.9B) kod miševa divljeg tipa. U svakom panelu, ekspresiju EGFP pokreće CBA promoter, i vizuelizovana je koristeći fluorescentnu mikroskopiju.
SL. 10A i 10B pokazuju ekspresiju GFP u mozgu miša 30 dana nakon intrastrijatalne injekcije AAV2HBKO-miRNK-Htt-GFP (SL. 9A), u poređenju sa AAV1-miRNK-Htt-GFP (SL.9B) kod YAC128 HD miševa. Vektori miRNK-Htt-GFP označavaju konstrukte koji eksprimiraju veštačku miRNK koja cilja humani Htt i GFP reporter. U svakom panelu, ekspresiju GFP pokreće CBA promoter, i vizuelizovana je koristeći fluorescentnu mikroskopiju sa tri različita uvećanja (4X, 10X i 20X, kako je obeleženo).
SL. 11A pokazuje qPCR analizu nivoa mRNK humanog HTT u strijatalnim uzorcima mozga dobijenim probijanjem, 30 dana nakon injekcije AAV1-miRNA-Htt i AAV2HBKO-miRNA-Htt, u poređenju sa kontrolnim uzorcima koji nisu tretirani.
SL. 11B pokazuje vestern blot analizu nivoa humanog Htt proteina u kortikalnim uzorcima mozga dobijenim probijanjem, 30 dana nakon injekcije AAV1-miRNA-Htt i AAV2HBKO-miRNA-Htt, u poređenju sa kontrolnim uzorcima koji nisu tretirani.
SL. 12A-12C pokazuju ekspresiju Iba1 u strijatumu YAC128 miša, 30 dana nakon injekcije AAV2HBKO-miRNK-Htt-GFP (SL. 12B) ili AAV1-miRNK-Htt-GFP (SL.
12C), u poređenju sa netretiranom kontrolom (SL. 12A).
SL. 13A-13C pokazuju ekspresiju GFP u strijatumu YAC128 miša, 30 dana nakon injekcije AAV2HBKO-miRNK-Htt-GFP (SL. 13B) ili AAV1-miRNK-Htt-GFP (SL.
13C), u poređenju sa netretiranom kontrolom (SL. 13A).
SL. 14 poredi kapsidne ostatke koji učestvuju u vezivanju heparan sulfat proteoglikana između kapsida AAV2 i AAVrh8R. Numeracija je na bazi VP1 aminokiselinske sekvence.
SL. 15 pokazuje aminokiselinsko poravnanje AAV2 i AAVrh8R na ostacima koji su odgovorni za heparansko vezivanje AAV2. Pozicije modifikacija AAVrh8R arginin kapsida su zaokružene.
SL. 16A pokazuje poboljšanu in vitro transdukciju HeLa ćelija koju pokazuje mutant AAVrh8R A586R, u poređenju sa divljim tipom AAVrh8R. Transdukcija je praćena pomoću sFLT02 u medijumu za uzgajanje 48 sati nakon infekcije vektorima AAVrh8R ili AAVrh8R modifikovanih argininom.
SL. 16B pokazuje smanjenu in vitro transdukciju HeLaRC32 ćelija koju pokazuje mutant AAVrh8R R533A, u poređenju sa divljim tipom AAVrh8R. Transdukcija je
4
praćena pomoću sFLT02 u medijumu za uzgajanje 48 sati nakon infekcije vektorima AAVrh8R ili AAVrh8R modifikovanih argininom.
SL. 17A-17D pokazuju nivoe in vitro transdukcije koju pokazuju mutanti AAVrh8R A586R i R533A, u poređenju sa divljim tipom AAVrh8R. Mutant AAVrh8R A586R (SL. 17B) pokazuje povećanu in vitro transdukciju NS1 ćelija, u poređenju sa divljim tipom AAVrh8R (SL.17A). Mutant AAVrh8R R533A (SL.17D) pokazuje smanjenu in vitro transdukciju HeLa ćelija, u poređenju sa divljim tipom AAVrh8R (SL.17C). Transdukcija je praćena putem ekspresije EGFP u ćelijama 48 sati nakon infekcije vektorima AAVrh8R ili AAVrh8R modifikovanih argininom.
SL. 18A i 18B pokazuju nivoe subretinalne transdukcije kod C57B16 miševa koje ispoljavaju AAVrh8R A586R i R533A mutanti. (SL.18A) AAVrh8R A586R mutant pokazuje smanjenu subretinalnu transdukciju u poređenju sa divljim tipom AAVrh8R. Vektor AAV2 je takođe testiran. (SL.18B) AAVrh8R R533A mutant pokazuje povećanu subretinalnu transdukciju u poređenju sa divljim tipom AAVrh8R i naivnim miševima. Transdukcija je praćena pomoću sFLT02 u retinalnim lizatima C57B16 miševa, 30 dana nakon subretinalne primene vektora AAVrh8R ili AAVrh8R modifikovanih argininom.
SL. 19 pokazuje nivoe sFLT02 u retinalnim lizatima C57B16 miševa, 30 dana nakon intravitrealne primene vektora AAV2, AAVrh8R ili AAVrh8R-A586R.
SL. 20 pokazuje aminokiselinsko poravnanje ostataka koji su odgovorni za heparansko vezivanje AAV2 sa AAVrh8R, AAV1, AAV6, AAV8, AAV9 i AAVrh10.
DETALJAN OPIS
[0072] Kao što je ovde opisano, pronalazači su došli do iznenađujućeg otkrića da modifikacije u česticama rAAV koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 532, 585 i/ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, pokazuju povećanu transdukciju ćelija nakon primene na oko ispitanika. Bez želje da se ograničimo bilo kojom teorijom, veruje se da ove čestice rAAV imaju smanjeno ili ukinuto vezivanje za HSPG ili imaju modifikovanu promenu na kapsidu tako da primena čestica rAAV dovodi do povećane transdukcije ćelija u
4
oku ispitanika. Predmetno otkriće stoga obezbeđuje postupke za isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko pojedinca, koji obuhvataju primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na oko pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. U ovom pronalasku, aminokiselinske supstitucije dovode do smanjenog ili ukinutog vezivanja za HSPG.
[0073] U nekim slučajevima, predmetno otkriće obezbeđuje postupke za isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko pojedinca, koji obuhvataju primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na subretinu pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV.
[0074] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje transdukcije rAAV ćelija nakon subretinalne isporuke čestice rAAV u oko pojedinca u poređenju sa transdukcijom ćelija sa rAAV koji sadrži kapsid divljeg tipa, pri čemu postupak obuhvata uključivanje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u proteinu AAV kapsida na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom; pri čemu čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U ovom pronalasku, aminokiselinske supstitucije dovode do smanjenog ili ukinutog vezivanja za HSPG. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži R585A i R588A supstitucije rAAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAV2 (SEQ ID NO:1). U nekim slučajevima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži A586R i/ili R533A supstitucije AAVrh8R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R (SEQ ID NO:9).
[0075] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje ekspresije heterologne nukleinske kiseline nakon subretinalne isporuke čestica rAAV u oko pojedinca, pri čemu postupak obuhvata uključivanje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u proteinu AAV kapsida na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom; pri čemu čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida i vektor rAAV koji
4
sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U ovom pronalasku, aminokiselinske supstitucije dovode do smanjenog ili ukinutog vezivanja za HSPG. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži R585A i R588A supstitucije rAAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAV2 (SEQ ID NO:1). U nekim slučajevima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži A586R i/ili R533A supstitucije AAVrh8R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R (SEQ ID NO:9).
[0076] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje ekspresije heterologne nukleinske kiseline nakon subretinalne isporuke čestica rAAV u oko pojedinca, pri čemu postupak obuhvata uključivanje jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u proteinu AAV kapsida na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom; pri čemu čestica rAAV sadrži protein rAAV kapsida i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV.
Poboljšana transdukcija je u poređenju sa česticama rAAV koje sadrže kapsid divljeg tipa. U ovom pronalasku, aminokiselinske supstitucije dovode do smanjenog ili ukinutog vezivanja za HSPG. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži R585A i R588A supstitucije rAAV2 kapsida, numeracija na bazi VP1 iz AAV2 (SEQ ID NO:1). U nekim slučajevima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži A586R i/ili R533A supstitucije AAVrh8R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R (SEQ ID NO:9).
[0077] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za lečenje očnog poremećaja kod pojedinca, koji obuhvataju isporuku kompozicije koja sadrži delotvornu količinu čestica rAAV u mrežnjaču pojedinca, pri čemu čestice rAAV sadrže a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U ovom pronalasku, aminokiselinske supstitucije dovode do smanjenog ili ukinutog vezivanja za HSPG. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži R585A i R588A supstitucije rAAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAV2 (SEQ ID NO:1). U nekim slučajevima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži A586R i/ili R533A supstitucije AAVrh8R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R (SEQ ID NO:9).
[0078] Otkriće takođe obezbeđuje sisteme za subretinalnu isporuku vektora u oko pojedinca, koji obuhvataju a) kompoziciju koja sadrži delotvornu količinu čestica rAAV, pri čemu i)
4
protein kapsida čestica rAAV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i ii) vektor sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku RNK i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV; i b) sredstvo za intravitrealnu isporuku rAAV. U ovom pronalasku, aminokiselinske supstitucije dovode do smanjenog ili ukinutog vezivanja za HSPG. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži R585A i R588A supstitucije rAAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAV2 (SEQ ID NO:1). U nekim slučajevima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži A586R i/ili R533A supstitucije AAVrh8R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R (SEQ ID NO:9).
[0079] U nekim slučajevima, predmetno otkriće dalje obezbeđuje postupke za isporuku heterologne nukleinske kiseline u centralni nervni sistem (CNS) pojedinca, koji obuhvataju primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na CNS pojedinca. Čestica rAAV sadrži (a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i (b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. Ovi postupci pokazuju poboljšanu ekspresiju heterologne nukleinske kiseline i/ili transdukciju rAAV ćelija nakon isporuke čestice rAAV u CNS pojedinca, npr. u poređenju sa transdukcijom ćelija sa rAAV koji sadrži kapsid divljeg tipa. Takve čestice rAAV i postupci pogodni su za upotrebu u lečenju poremećaja CNS, uključujući, bez ograničenja, Hantingtonovu bolest. U ovom pronalasku, aminokiselinske supstitucije dovode do smanjenog ili ukinutog vezivanja za HSPG. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži R585A i R588A supstitucije rAAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAV2 (SEQ ID NO:1). U nekim slučajevima, čestice rAAV sadrže kapsid koji sadrži A586R i/ili R533A supstitucije AAVrh8R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R (SEQ ID NO:9).
I. Opšte tehnike
[0080] Tehnike i procedure koje su ovde opisane ili se na njih poziva su uopšteno dobro poznate, i stručnjaci za ovu oblast ih uobičajeno upotrebljavaju koristeći konvencionalnu metodologiju, kao što su, na primer, rasprostranjeno korišćene metodologije koje su opisane u Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4. izd. Cold Spring Harbor
4
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. izd., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames i G.R. Taylor izd., 1995);
Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow i Lane, izd., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6. izd. J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, izd.1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, izd., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather i P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, i D.G.
Newell, izd., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir i C.C. Blackwell, izd., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller i M.P. Calos, izd., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., izd., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., izd., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., izd., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., izd., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P.
Shepherd i C. Dean, izd., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow i D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti i J. D. Capra, izd., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., izd., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Definicije
[0081] „Vektor“, kako se ovde koristi, odnosi se na rekombinantni plazmid ili virus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja treba da se isporuči u ćeliju domaćina, bilo in vitro ili in vivo.
[0082] Termin „polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“, kako se ovde koristi, odnosi se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo ribonukleotida ili dezoksiribonukleotida. Tako, ovaj termin obuhvata, ali nije ograničena na, jedno-, dvo- ili višelančanu DNK ili RNK, genomsku DNK, kDNK, hibride DNK-RNK ili polimer koji sadrži purinske i pirimidinske baze, ili druge prirodne, hemijski ili biohemijski modifikovane, neprirodne ili derivatizovane nukleotidne baze. Skelet polinukleotida može da sadrži šećere i fosfatne grupe (kao što tipično može da se nađe u RNK ili DNK) ili modifikovane ili supstituisane šećere ili fosfatne grupe. Alternativno, skelet polinukleotida može da sadrži polimer sintetičkih podjedinica kao što su fosforamidati, te tako može biti oligodezoksinukleozid fosforamidat (P-NH2) ili mešoviti oligomer fosforamidat- fosfodiestar. Pored toga, dvolančani polinukleotid može da se dobije od jednolančanog polinukleotidnog proizvoda hemijske sinteze sintezom komplementarnog lanca i komplementarnim vezivanjem lanaca u odgovarajućim uslovima, ili sintezom komplementarnog lanca de novo koristeći DNK polimerazu sa odgovarajućim prajmerom.
[0083] Termini „polipeptid“ i „protein“ koriste se naizmenično da označe polimer od aminokiselinskih ostataka, i nisu ograničeni na minimalnu dužinu. Takvi polimeri aminokiselinskih ostataka mogu da sadrže prirodne ili neprirodne aminokiselinske ostatke, i uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide, oligopeptide, dimere, trimere i multimere aminokiselinskih ostataka. I proteini kompletne dužine i njihovi fragmenti su obuhvaćeni definicijom. Termini takođe uključuju postekspresione modifikacije polipeptida, na primer, glikozilaciju, sijalilaciju, acetilovanje, fosforilaciju, i slično. Nadalje, za svrhe predmetnog pronalaska, „polipeptid“ se odnosi na protein koji obuhvata modifikacije, kao što su delecije, adicije i supstitucije (uopšteno konzervativne prirode) nativne sekvence, sve dok protein zadržava željenu aktivnost. Ove modifikacije mogu biti namerne, recimo putem mutageneze usmerene na mesto, ili mogu biti slučajne, kao što je putem mutacija domaćina koje proizvode proteine ili greške usled PCR amplifikacije.
[0084] „Rekombinantni virusni vektor“ odnosi se na rekombinantni vektor polinukleotida koji sadrži jednu ili više heterolognih sekvenci (tj. sekvenca nukleinske kiseline koja nije virusnog porekla). U slučaju rekombinantnih vektora AAV, rekombinantna nukleinska kiselina je okružena najmanje jednom sekvencom invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR). U nekim otelotvorenjima, rekombinantna nukleinska kiselina je okružena sa dva ITR.
[0085] „Rekombinantni vektor AAV (vektor rAAV)“ odnosi se na polinukleotidni vektor koji sadrži jednu ili više heterolognih sekvenci (tj. sekvenca nukleinske kiseline koja nije virusnog porekla) koje su okružene najmanje jednom sekvencom AAV invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR). Takvi vektori rAAV mogu da se replikuju i pakuju u infektivne virusne čestice kada su prisutni u ćeliji domaćinu koja je inficirana odgovarajućim pomoćničkim virusom (ili onim koji ispoljava odgovarajuće pomoćne funkcije) i koja eksprimira genske proizvode AAV rep i cap (tj. AAV Rep i Cap proteine). Kada je vektor rAAV uključen u veći polinukleotid (npr. u hromozom ili u drugi vektor kao što je plazmid koji se koristi za
1
kloniranje ili transfekciju), vektor rAAV tada može da se naziva „pro-vektor“ koji može da se „spase“ replikacijom i enkapsidacijom u prisustvu funkcija za pakovanje AAV i odgovarajućih pomoćnih funkcija. Vektor rAAV može biti u bilo kom od brojnih oblika, uključujući, bez ograničenja, plazmide, linearne veštačke hromozome, kompleksiran sa lipidima, enkapsuliran u lipozomima i enkapsuliran u virusnoj čestici, npr. čestici AAV. Vektor rAAV može biti upakovan u virusni kapsid AAV radi stvaranja „čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (čestica rAAV)“.
[0086] „Virus rAAV“ ili „virusna čestica rAAV“ označava virusnu česticu sačinjenu od najmanje jednog proteina AAV kapsida i enkapsidovanog genoma vektora rAAV.
[0087] „Heterologno“ znači dobijeno od genotipski različitog entiteta od ostatka entiteta sa kojim se poredi ili u koji se uvodi ili inkorporira. Na primer, polinukleotid koji je različitim tehnikama konstruisanja uveden u različitu vrstu ćelija je heterologni polinukleotid (i, kada se eksprimira, može da kodira heterologni polipeptid). Slično tome, ćelijska sekvenca (npr. gen ili njegov deo) koja je inkorporirana u virusni vektor je sekvenca heterolognog nukleotida u odnosu na vektor.
[0088] Termin „transgen“ označava polinukleotid koji je uveden u ćeliju, i može da bude transkribovan u RNK i opciono, translatovan i/ili eksprimiran u odgovarajućim uslovima. U aspektima, on ćeliji u koju je uveden daje željeno svojstvo, ili na drugi način dovodi do željenog terapeutskog ili dijagnostičkog ishoda. U drugom aspektu, on može biti transkribovan u molekul koji posreduje u ometanju RNK, kao što je miRNK, siRNK ili shRNK.
[0089] Termini „genomske čestice (genome particles, gp)“, „genomski ekvivalenti“ ili „genomske kopije“, kako se koriste u odnosu na virusni titar, označavaju broj viriona koji sadrže genom DNK rekombinantnog AAV, bez obzira na nedelotvornost ili funkcionalnost. Broj genomskih čestica u određenom vektorskom preparatu može da se izmeri procedurama kao što je opisano u ovde datim Primerima, ili na primer, u Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
[0090] Termin „vektorski genom (vg)“, kako se ovde koristi, može da se odnosi na jedan ili više polinukleotida koji sadrže skup polinukleotidnih sekvenci vektora, npr. virusni vektor.
2
Vektorski genom može biti enkapsidiran u virusnoj čestici. U zavisnosti od konkretnog virusnog vektora, vektorski genom može da sadrži jednolančanu DNK, dvolančanu DNK, ili jednolančanu RNK, ili dvolančanu RNK. Vektorski genom može da uključuje endogene sekvence povezane sa konkretnim virusnim vektorom i/ili heterologne sekvence umetnute u konkretni virusni vektor putem rekombinantnih tehnika. Na primer, rekombinantni genom vektora AAV može da uključuje najmanje jednu sekvencu ITR koja se naslanja na promoter, punilo, sekvencu od interesa (npr. RNKi) i sekvencu poliadenilacije. Kompletni vektorski genom može da uključuje kompletan skup polinukleotidnih sekvenci vektora. U nekim otelotvorenjima, titar nukleinske kiseline virusnog vektora može da se meri kao vg/ml.
Postupci pogodni za merenje ovog titra su poznati u struci (npr. kvantitativna PCR).
[0091] Termini „jedinica infekcije (infection unit, iu)“, „infektivna čestica“ ili „jedinica replikacije“, kako se koriste u odnosu na virusni titar, označavaju broj infektivnih čestica i čestica rekombinantnog vektora AAV sposobnih za kombinaciju kako je izmereno testom infektivnog centra, koji je poznat i kao test centra replikacije, kako je opisano, na primer, u McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
[0092] Termin „transdukujuća jedinica (transducing unit, tu)“, kako se koristi u odnosu na virusni titar, označava broj infektivnih čestica rekombinantnog vektora AAV koje dovode do proizvodnje funkcionalnog transgenog proizvoda kako je izmereno u funkcionalnim testovima, kako je opisano u ovde datim Primerima, ili, na primer, u Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; ili u Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU test).
[0093] Sekvenca „invertovanog terminalnog ponavljanja“ ili „ITR“ je termin koji je dobro poznat u struci, i odnosi se na relativno kratke sekvence koje se mogu naći na terminusima virusnih genoma koje su suprotne orijentacije.
[0094] Sekvenca „invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) AAV“, termin koji je dobro poznat u struci, predstavlja sekvencu od približno 145 nukleotida koja je prisutna na oba terminusa nativnog jednolančanog genoma AAV. Poslednjih 125 nukleotida ITR može biti prisutno u jednoj od dve alternativne orijentacije, što dovodi do heterogenosti između različitih genoma AAV i između dva kraja jednog genoma AAV. Poslednjih 125 nukleotida takođe sadrže nekoliko kraćih regiona samokomplementarnosti (označeni kao A, A', B, B', C, C' i D regioni), što omogućava da dođe do unutarlančanog baznog sparivanja u ovom delu ITR.
[0095] „Sekvenca terminalne rezolucije“ ili „trs“ je sekvenca u D regionu ITR AAV koju rep proteini AAV otcepljuju tokom virusne DNK replikacije. Mutantna sekvenca terminalne rezolucije je refraktorna na cepanje pomoću rep proteina AAV.
[0096] „Pomoćnički virus“ za AAV označava virus koji omogućava da AAV (koji je defektivni parvovirus) bude replikovan i upakovan od strane ćelije domaćina. Identifikovani su brojni takvi pomoćnički virusi, uključujući adenoviruse, herpesviruse i poksviruse, kao što je vakcinija. Adenovirusi obuhvataju brojne različite podgrupe, mada se najčešće koristi adenovirus tipa 5 iz podgrupe C (Ad5). Brojni adenovirusi humanog, nehumanog sisarskog i ptičjeg porekla su poznati i dostupni su iz depozitorija kao što je ATCC. Virusi iz familije herpesa, koji su takođe dostupni iz depozitorija kao što je ATCC, uključuju, na primer, viruse herpes simpleks (HSV), Epštajn-Barove viruse (EBV), citomegaloviruse (CMV) i viruse Aujeckijeve bolesti (PRV).
[0097] „Procenat (%) identičnosti sekvence“ u pogledu sekvence referentnog polipeptida ili nukleinske kiseline definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida u kandidatskoj sekvenci koji su identični aminokiselinskim ostacima ili nukleotidima u sekvenci referentnog polipeptida ili nukleinske kiseline, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, po potrebi, radi postizanja maksimalnog procenta identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir nijednu konzervativnu supstituciju u okviru identičnosti sekvence.
Poravnavanje za svrhe određivanja procenta identičnosti sekvence aminokiseline ili nukleinske kiseline može da se postigne na različite načine koji su u okviru struke, na primer, koristeći javno dostupne kompjuterske softverske programe, na primer, one koji su opisani u Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., izd., 1987), Supp.30, odeljak 7.7.18, tabela 7.7.1, i uključujući softver BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR). Primer programa za poravnavanje je ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania). Stručnjaci za oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme koji su potrebni za postizanje maksimalnog poravnanja celom dužinom sekvenci koje se porede. Za svrhe ovog dokumenta, % identičnosti sekvence aminokiselina date sekvence aminokiselina A sa datom sekvencom aminokiselina B, ili naspram nje (što alternativno može da se formuliše kao data sekvenca
4
aminokiselina A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence aminokiselina sa sekvencom aminokiselina B, ili naspram nje) izračunava se na sledeći način: 100 puta količnik X/Y, gde je X broj aminokiselinskih ostataka koji su ocenjeni kao identična slaganja pomoću programa za poravnanje sekvenci kada taj program poravna A i B, i pri čemu je Y ukupni broj aminokiselinskih ostataka u B. Biće jasno da, kada dužina sekvence aminokiselina A nije jednaka dužini sekvence aminokiselina B, % identičnosti sekvence aminokiselina A sa B neće biti jednak % identičnosti sekvence aminokiselina B sa A. Za svrhe ovog dokumenta, % identičnosti sekvence aminokiselina date sekvence nukleinske kiseline C sa datom sekvencom nukleinske kiseline D, ili naspram nje (što alternativno može da se formuliše kao data sekvenca nukleinske kiseline C koja ima ili sadrži određeni % identičnosti sekvence nukleinske kiseline sa sekvencom nukleinske kiseline B, ili naspram nje) izračunava se na sledeći način: 100 puta količnik W/Z, gde je W broj nukleotida koji su ocenjeni kao identična slaganja pomoću programa za poravnanje sekvenci kada taj program poravna C i D, i gde je Z ukupan broj nukleotida u D. Biće jasno da, kada dužina sekvence nukleinske kiseline C nije jednaka dužini sekvence nukleinske kiseline D, % identičnosti sekvence nukleinske kiseline C sa D neće biti jednak % identičnosti sekvence nukleinske kiseline D sa C.
[0098] „Izolovani“ molekul (npr. nukleinska kiselina ili protein) ili ćelija znači da je identifikovan i razdvojen i/ili izolovan iz komponente svog prirodnog okruženja.
[0099] „Delotvorna količina“ je količina dovoljna za postizanje korisnih ili željenih rezultata, uključujući kliničke rezultate (npr. ublažavanje simptoma, postizanje kliničkih krajnjih tačaka, i slično). Delotvorna količina može da se primeni u jednoj ili više primena. U pogledu stadijuma bolesti, delotvorna količina je količina koja je dovoljna za ublažavanje, stabilizaciju ili odlaganje razvoja bolesti.
[0100] „Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljudi i nehumani primati kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.
[0101] Kako se ovde koristi, „lečenje“ je pristup za postizanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjenje opsega bolesti, stabilizovani (npr. bez pogoršavanja) stadijum bolesti, prevenciju širenja (npr. metastaze) bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, poboljšanje ili palijaciju stadijuma bolesti i remisiju (bilo delimičnu ili potpunu), bilo da mogu da se detektuju ili ne. „Lečenje“ takođe može da znači produžetak preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem u nedostatku lečenja.
[0102] Kako se ovde koristi, termin „profilaktičko lečenje“ odnosi se na lečenje, pri čemu je za pojedinca poznato ili se sumnja da postoji rizik da ima poremećaj, ali nije ispoljio simptome, ili je ispoljio minimalne simptome poremaćaja. Pojedinac koji je podvrgnut profilaktičkom lečenju može da se leči pre pojave simptoma.
[0103] Kako se ovde koristi, „terapeutski“ agens (npr. terapeutski polipeptid, nukleinska kiselina ili transgen) je onaj koji obezbeđuje korisni ili željeni klinički rezultat, kao što su primeri kliničkih rezultata koji su prethodno opisani. Tako, terapeutski agens može da se koristi u lečenju kako je prethodno opisano.
[0104] Termin „centralna mrežnjača“, kako se ovde koristi, odnosi se na spoljašnju makulu i/ili unutrašnju makulu i/ili foveu. Termin „vrste ćelija centralne mrežnjače“, kako se ovde koristi, odnosi se na vrste ćelija centralne mrežnjače kao što su, na primer, RPE i fotoreceptorske ćelije.
[0105] Termin „makula“ odnosi se na region centralne mrežnjače kod primata koji sadrži veću relativnu koncentraciju fotoreceptorskih ćelija, specifično štapića i čepića, u poređenju sa perifernom mrežnjačom. Termin „spoljašnja makula“, kako se ovde koristi, takođe može da se označi kao „periferna makula“. Termin „unutrašnja makula“, kako se ovde koristi, takođe može da se označi kao „centralna makula“.
[0106] Termin „fovea“ odnosi se na malu oblast u centralnoj mrežnjači primata koja je prečnika koji je približno jednak ili manji od 0,5 mm, koja sadrži veću relativnu koncentraciju fotoreceptorskih ćelija, specifično čepića, u poređenju sa perifernom mrežnjačom i makulom.
[0107] Termin „subretinalni prostor“, kako se ovde koristi, odnosi se na mesto u mrežnjači između fotoreceptorskih ćelija i pigmentovanih epitelnih ćelija mrežnjače. Subretinalni prostor može biti potencijalni prostor, kao što je pre bilo koje subretinalne injekcije tečnosti. Subretinalni prostor takođe može da sadrži tečnost koja je injektovana u potencijalni prostor. U ovom slučaju, tečnost je „u dodiru sa subretinalnim prostorom“. Ćelije koje su „u kontaktu sa subretinalnim prostorom“ uključuju ćelije koje ograničavaju subretinalni prostor, kao što su RPE i fotoreceptorske ćelije.
[0108] Termin „mehur“, kako se ovde koristi, odnosi se na prostor sa fluidom u subretinalnom prostoru oka. Mehur iz pronalaska može da nastane jednom injekcijom fluida u jedan prostor, putem više injekcija jednog ili više fluida u isti prostor, ili putem više injekcija u više prostora, koji prilikom premeštanja stvaraju ukupni prostor sa fluidom koristan za postizanje terapeutskog efekta na željenom delu subretinalnog prostora.
[0109] „Promoter rodopsin kinaze (RK)“ odnosi se na sekvencu polinukleotida koja je dobijena od gena rodopsin kinaze (npr. humana RK, koju predstavlja GenBank Entrez gen ID 6011) koja pokreće ekspresiju specifično u fotoreceptorskim ćelijama štapićima i čepićima, kao i u ćelijskim linijama mrežnjače, kao što je WERI Rb-1. Kako se ovde koristi, „promoter rodopsin kinaze“ može da se odnosi na celu promotersku sekvencu ili na fragment promoterske sekvence koji je dovoljan za pokretanje ekspresije specifične za fotoreceptor, kao što su sekvence opisane u Khani, S.C., et al. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.
48(9):3954-61 i Young, J.E., et al. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.44(9):4076-85. U nekim otelotvorenjima, RK promoter se prostire od -112 do 180 u odnosu na mesto početka transkripcije.
[0110] „Promoter β-aktina kokoške (CBA)“ odnosi se na sekvencu polinukleotida koja je dobijena od gena β-aktina kokoške (npr. Gallus gallus beta aktin, koji predstavlja GenBank Entrez gen ID 396526). Kako se ovde koristi, „promoter β-aktina kokoške“ može da se odnosi na promoter koji sadrži rani pojačavački element citomegalovirusa (CMV), promoter i prvi egzon i intron gena β-aktina kokoške, i splajs akceptor gena zečjeg beta-globina, kao što su sekvence opisane u Miyazaki, J., et al. (1989) Gene 79(2):269-77. Kako se ovde koristi, termin „CAG promoter“ može da se koristi naizmenično. Kako se ovde koristi, „promoter CMV ranog pojačavača/beta aktina kokoške (CAG)“ može da se koristi naizmenično.
[0111] Upućivanje na „oko“ vrednosti ili parametar ovde uključuje (i opisuje) otelotvorenja koja su usmerena na tu vrednost ili parametar sam po sebi. Na primer, opis koji ukazuje na „oko X“ obuhvata opis „X“.
[0112] Kako se ovde koriste, odrednice za jedninu uključuju odrednice za množinu, ako nije drugačije naznačeno.
[0113] Jasno je da ovde opisani aspekti i otelotvorenja iz pronalaska obuhvataju „sadrži“, „sastoji se od“ i/ili se „suštinski se sastoji od“ aspekata i otelotvorenja.
III. Virusne čestice
[0114] Heparan sulfat proteoglikan (HSPG) poznat je u struci, i deluje kao ćelijski receptor za čestice AAV2 (Summerford, C. i Samulski, R.J. (1998) J. Virol.72(2):1438-45).
Vezivanje između čestice AAV2 i HSPG na ćelijskoj membrani služi da se čestica zakači za ćeliju. Drugi proteini ćelijske površine, kao što su receptor faktora rasta fibroblasta i αvβ5 integrin, takođe mogu da olakšaju ćelijsku infekciju. Nakon vezivanja, čestica AAV2 može da uđe u ćeliju putem mehanizama uključujući endocitozu posredovanu receptorom putem jamica obloženih klatrinom. Čestica AAV2 može da se otpusti iz endocitne vezikule nakon endozomske acidifikacije. To omogućava čestici AAV2 da putuje u perinuklearni region, a zatim u jedro ćelije. Takođe je poznato da čestice AAV3 vezuju heparan (Rabinowitz, J.E., et al. (2002) J. Virol.76(2):791-801).
[0115] Protokoli genske terapije za poremećaje oka zahtevaju lokalizovanu isporuku vektora u ćelije u oku (npr. ćelije mrežnjače). Ćelije koje će biti cilj lečenja kod ovih bolesti mogu da uključuju, između ostalog, jednu ili više ćelija oka (npr. fotoreceptori, neuroni oka, itd.). Postupci iz pronalaska se zasnivaju, barem delimično, na otkriću da specifični kapsidi rAAV (npr. oni koji sadrže protein rAAV kapsida koji ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom) omogućavaju opsežnu distribuciju vektora u ćelijama oka. Kao takvi, ovi kapsidi mogu biti naročito pogodni za isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko pojedinca, poboljšavanje transdukcije rAAV ćelija nakon isporuke čestice rAAV u oko pojedinca, poboljšavanje ekspresije heterologne nukleinske kiseline nakon isporuke čestica rAAV u oko pojedinca i/ili lečenje poremećaja oka pojedinca koristeći čestice rAAV.
[0116] Isto tako, protokoli genske terapije za poremećaje CNS zahtevaju lokalizovanu isporuku vektora u ćelije u CNS. Ćelije koje će biti cilj lečenja kod ovih bolesti mogu da uključuju, između ostalog, jednu ili više ćelija mozga (npr. neurone). Postupci iz otkrića se zasnivaju, barem delimično, na otkriću da specifični kapsidi rAAV (npr. oni koji sadrže protein rAAV kapsida koji ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom) omogućavaju opsežnu distribuciju vektora u ćelijama CNS. Kao takvi, ovi kapsidi mogu biti naročito pogodni za isporuku heterologne nukleinske kiseline u centralni nervni sistem (CNS) pojedinca, poboljšavanje transdukcije rAAV ćelija nakon isporuke čestice rAAV u CNS pojedinca, poboljšavanje ekspresije heterologne nukleinske kiseline nakon isporuke čestica rAAV u CNS pojedinca i/ili lečenje poremećaja CNS pojedinca koristeći čestice rAAV.
[0117] Poznato je da kapsid AAV (npr. AAV2, AAVrh8R, itd.) uključuje tri kapsidna proteina: VP1, VP2 i VP3. Ovi proteini sadrže značajne količine preklapajućih sekvenci aminokiselina i jedinstvenih N-terminalnih sekvenci. Kapsid AAV2 sadrži 60 podjedinica raspoređenih u ikosaedralnoj simetriji (Xie, Q., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci.
99(16):10405-10). Otkriveno je da su VP1, VP2 i VP3 prisutni u odnosu 1:1:10.
[0118] Poznato je da se vezivanje između proteina AAV2 kapsida i HSPG odvija putem elektrostatičkih interakcija između baznih ostataka proteina AAV2 kapsida i negativno naelektrisanih ostataka glikozaminoglikana (Opie, SR et al., (2003) J. Virol.77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol.77:11072-11081). Specifični kapsidni ostaci umešani u ove interakcije uključuju R484, R487, K532, R585 i R588. Pokazalo se da mutacije u ovim ostacima smanjuju vezivanje AAV2 za Hela ćelije i sam heparan (Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol.77:11072-11081; WO 2004/027019 A2, US patent br.7,629,322). Nadalje, bez želje da se ograničimo teorijom, smatra se da aminokiselinske supstitucije na jednom ili više ostataka koji odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, mogu da modulišu transdukciona svojstva vrsta AAV kapsida koje se ne vezuju za HSPG, ili mogu da modulišu transdukciona svojstva vrsta AAV kapsida nezavisno od njihove sposobnosti da vezuju HSPG.
[0119] U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom. U pronalasku, čestica rAAV iz pronalaska sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U nekim slučajevima, čestica rAAV iz otkrića sadrži kapsid AAV serotipa rh8R (AAVrh8R).
[0120] Kako je ovde opisano, čestice rAAV sa mutacijama u kapsidnim proteinima na ostacima koji interaguju sa HSPG ili na jednom ili više ostataka koji odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, pokazuju pogodna svojstva, kao što je pojačana ekspresija i/ili smanjena neuroinflamacija. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kiselina kodirana vektorom rAAV se nakon isporuke eksprimira na povećanom nivou ekspresije, u poređenju sa nivoom ekspresije heterologne nukleinske kiseline čestice rAAV koja sadrži kapsid rAAV koji sadrži referentni protein rAAV kapsida (npr. divlji tip proteina rAAV kapsida). U nekim otelotvorenjima, ekspresija nukleinske kiseline je povećana za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim slučajevima, čestica rAAV nakon isporuke uzrokuje smanjenu neuroinflamaciju, u poređenju sa česticom rAAV koja sadrži referentni protein rAAV kapsida (npr. divlji tip proteina rAAV kapsida). U nekim slučajevima, neuroinflamacija je smanjena za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. Pogodni referentni protein rAAV kapsida može da uključuje bilo koji protein kapsida kome nedostaje jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom (referentni kapsid može tako da sadrži jednu ili više „osnovnih“ supstitucija koje ne menjaju vezivanje za HSPG).
[0121] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko pojedinca, koji obuhvataju primenu čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na subretinalni prostor pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži a) kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV.
[0122] U pronalasku, čestica rAAV iz pronalaska sadrži kapsid AAV serotipa 2 (AAV2). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka bilo kog od VP1, VP2 i/ili VP3 iz AAV2, pri čemu amino supstitucije menjaju interakciju čestice rAAV sa HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG). U pronalasku, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP1 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP2 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP3 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka kombinacije VP1, VP2 i VP3 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz bilo kog od VP1, VP2 i/ili VP3 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz bilo kog kapsidnog proteina SEQ ID NO:1, 3 i/ili 5. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV iz pronalaska sadrže kapsidne proteine SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6.
[0123] U nekim slučajevima, čestica rAAV iz otkrića sadrži kapsid AAV serotipa 3 (AAV3). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka bilo kog od VP1, VP2 i/ili VP3 iz AAV3, pri čemu amino supstitucije menjaju interakciju čestice rAAV sa HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP1 AAV3. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP2 AAV3. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP3 AAV3. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka kombinacije VP1, VP2 i VP3 AAV3. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz bilo kog od VP1, VP2 i/ili VP3 AAV3. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju kapsidnom proteinu SEQ ID NO:7.
[0124] U nekim slučajevima, čestica rAAV iz otkrića sadrži kapsid AAV serotipa rh8R (AAVrh8R), npr. kako je opisano u U.S. PG pub. br.20090317417. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka bilo kog
1
od VP1, VP2 i/ili VP3 iz AAVrh8R, pri čemu amino supstitucije menjaju interakciju čestice rAAV sa HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP1 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP2 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP3 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka kombinacije VP1, VP2 i VP3 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz bilo kog od VP1, VP2 i/ili VP3 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka kapsidnog proteina koji je prikazan sa SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, čestice rAAV iz otkrića sadrže kapsidne proteine SEQ ID NO: 10 i/ili 11.
[0125] U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili najmanje oko 100% (u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži divlji tip kapsida). U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za bilo koju vrednost od oko 10% do oko 100%, oko 20% do oko 100%, oko 30% do oko 100%, oko 40% do oko 100%, oko 50% do oko 100%, oko 60% do oko 100%, oko 70% do oko 100%, oko 80% do oko 100%, oko 90% do oko 100%, oko 10% do oko 90%, oko 20% do oko 90%, oko 30% do oko 90%, oko 40% do oko 90%, oko 50% do oko 90%, oko 60% do oko 90%, oko 70% do oko 90%, oko 80% do oko 90%, oko 10% do oko 80%, oko 20% do oko 80%, oko 30% do oko 80%, oko 40% do oko 80%, oko 50% do oko 80%, oko 60% do oko 80%, oko 70% do oko 80%, oko 10% do oko 70%, oko 20% do oko 70%, oko 30% do oko 70%, oko 40% do oko 70%, oko 50% do oko 70%, oko 60% do oko 70%, oko 10% do oko 60%, oko 20% do oko 60%, oko 30% do oko 60%, oko 40% do oko 60%, oko 50% do oko 60%, oko 10%
2
do oko 50%, oko 20% do oko 50%, oko 30% do oko 50%, oko 40% do oko 50%, oko 10% do oko 40%, oko 20% do oko 40%, oko 30% do oko 40%, oko 10% do oko 30%, oko 20% do oko 30% ili oko 10% do oko 20% (u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV koja sadrži divlji tip kapsida). U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija ne dovodi do izostanka detektabilnog vezivanja čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan u poređenju sa vezivanjem čestice rAAV divljeg tipa. Sredstva za merenje vezivanja čestica AAV za HSPG su poznata u struci, npr. vezivanje za hromatografski medijum heparan sulfata ili vezivanje za ćelije za koje je poznato da eksprimiraju HSPG na svojoj površini. Vidite, na primer, Opie, SR et al., (2003) J. Virol.77:6995-7006 i Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081.
[0126] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje čestice rAAV za subretinalnu isporuku terapeutske nukleinske kiseline, pri čemu čestice rAAV sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija kapsidnih proteina koje smanjuju ili ukidaju vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP1 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP2 AAV2, numeracija na bazi VP1 AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP3 AAV2, numeracija na bazi VP1 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP1 AAV2, VP2 AAV2, i/ili VP3 AAV2, numeracija na bazi VP1 AAV2. U nekim otelotvorenjima, VP1 iz rAAV2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.
[0127] U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP1 AAV3, numeracija na bazi VP1 AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP2 AAV3, numeracija na bazi VP1 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP3 AAV3, numeracija na bazi VP1 AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP1 AAV3, VP2 AAV3, i/ili VP3 AAV3, numeracija na bazi VP1 rAAV2. U nekim otelotvorenjima, VP1 iz rAAV2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.
[0128] U nekim slučajevima, čestice AAV iz otkrića sadrže kapsid sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 485, 488, 528, 533, 586 ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostatak je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R533 i/ili A586, numeracija na bazi VP1 AAVrh8R. U daljim slučajevima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije A586R i/ili R533A, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži proteine rAAV kapsida SEQ ID NO:10 i/ili 11.
[0129] U nekim slučajevima otkrića, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija obuhvata supstituciju pozitivno naelektrisanog aminokiselinskog ostatka (npr. aminokiselina sa pozitivno naelektrisanim bočnim lancem) aminokiselinskim ostatkom koji nije pozitivno naelektrisan (npr. aminokiselina koja ne sadrži pozitivno naelektrisani bočni lanac). Pozitivno naelektrisane aminokiseline uključuju arginin, histidin i lizin. Primeri za aminokiselinske ostatke koji nisu pozitivno naelektrisani uključuju negativno naelektrisane aminokiseline (asparaginska kiselina i glutaminska kiselina), aminokiseline sa nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (serin, treonin, asparagin i glutamin), aminokiseline sa hidrofobnim bočnim lancima (alanin, valin, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, tirozin i triptofan), glicin, cistein i prolin. U nekim slučajevima, jedan ili više pozitivno naelektrisanih aminokiselinskih ostataka AAV kapsida je supstituisan hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom. U nekim
4
otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina. U daljim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka koji nije pozitivno naelektrisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U nekim slučajevima, hidrofobni aminokiselinski ostatak je supstituisan pozitivno naelektrisanim aminokiselinskim ostatkom. U daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka alanina. U još daljim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju ostatka arginina ili lizina ostatkom alanina.
[0130] U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588 VP1, VP2 i/ili VP3, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija sadrži supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588 VP1, VP2 i/ili VP3 AAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, i/ili R588 VP1, VP2 i/ili VP3 AAV2, numeracija na bazi SEQ ID NO:1. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje jednu ili više supstitucija R484A, R487A, R585A i/ili R588A VP1, VP2 i/ili VP3 AAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588 VP1, VP2 i/ili VP3 AAV3, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje jednu ili više supstitucija R484A, R487A, R585A i/ili R588A VP1, VP2 i/ili VP3 AAV3, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, čestica rAAV sadrži proteine rAAV kapsida SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6.
[0131] U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R485, R488, R533, A586 i/ili T589 VP1, VP2 i/ili VP3, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji R485, R488, R533, A586 i/ili T589 VP1, VP2 i/ili VP3, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R, numeracija na bazi SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje jednu ili više supstitucija R533A i/ili A586R VP1, VP2 i/ili VP3 AAV2, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži proteine rAAV kapsida SEQ ID NO:10 i/ili 11.
[0132] U nekim slučajevima, kapsid AAV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa HSPG. U ovom pronalasku, kapsid AAV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV ima jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži supstitucije na poziciji R484 i R487, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV ima supstitucije na poziciji R484 i R487, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži supstitucije na poziciji R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV ima supstitucije na poziciji R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži supstitucije R484A i R487A, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV ima supstitucije R484A i R487A, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV ima supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2.
[0133] Poznato je da se heparan sulfat proteoglikani (HSPG) eksprimiraju u mnogim tkivima u telu i imaju značajnu ulogu u ekstracelularnoj matrici, ćelijskoj adheziji i ćelijskoj signalizaciji.
[0134] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje čestice rAAV za isporuku terapeutske nukleinske kiseline u CNS, pri čemu čestice rAAV sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija kapsidnih proteina koje smanjuju ili ukidaju vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585 i/ili 588, numeracija na bazi VP1 AAV2. Kako se ovde koristi, „numeracija na bazi VP1 iz AAV2“ odnosi se na aminokiselinu navedenog proteina kapsida koja odgovara navedenoj aminokiselini iz VP1 AAV2. Na primer, ako je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na poziciji 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585 i/ili 588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2, onda je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija na aminokiselinama navedenog proteina kapsida koje odgovaraju aminokiselinama 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585 i/ili 588 VP1 iz AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji R347, R350, K390, K395, R448, R451, R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 iz AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 484, 487, 532, 585 ili 588 VP1 AAV2, VP2 AAV2, i/ili VP3 AAV2, numeracija na bazi VP1 AAV2. U nekim otelotvorenjima, VP1 iz AAV2 (npr. rAAV2) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1.
[0135] U pronalasku, kapsid AAV sadrži supstitucije na pozicijama R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV iz pronalaska sadrže kapsidne proteine SEQ ID NO:2, 4 i/ili 6. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži supstitucije na pozicijama R484 i R487 ili R585 i R588, numeracija na bazi VP1 iz rAAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži supstitucije R484A i R487A ili supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim otelotvorenjima, kapsid AAV sadrži aminokiselinsku supstituciju K532A, numeracija na bazi VP1 iz AAV2. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija sadrži R347A, R350A, K390A, K395A, R448A, R451A, R484A, R487A, K527A, K532A, R585A i/ili R588A supstitucije, numeracija na bazi VP1 iz AAV2.
[0136] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje čestice rAAV za isporuku terapeutske nukleinske kiseline u CNS, pri čemu čestice rAAV sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija kapsidnih proteina koje smanjuju ili ukidaju vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan. U nekim slučajevima, čestica rAAV iz otkrića sadrži kapsid AAV serotipa rh8R (AAVrh8R), npr. kako je opisano u U.S. PG pub. br.20090317417. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka bilo kog od VP1, VP2 i/ili VP3 iz AAVrh8R, pri čemu amino supstitucije menjaju interakciju čestice rAAV sa HSPG (npr. smanjuju ili ukidaju vezivanje za HSPG). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP1 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP2 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz VP3 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka kombinacije VP1, VP2 i VP3 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka iz bilo kog od VP1, VP2 i/ili VP3 AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je supstitucija aminokiselinskih ostataka kapsidnog proteina koji je prikazan sa SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, čestice rAAV iz otkrića sadrže kapsidne proteine SEQ ID NO: 10 i/ili 11.
[0137] U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa rh8R (AAVrh8R). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh8R koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji A586 i/ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju A586R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju T589R ili T589K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh8R.
[0138] Kao što je prethodno razmotreno, bez želje da se ograničimo teorijom, smatra se da aminokiselinske supstitucije na jednom ili više ostataka koji odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 532, 585 ili 588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2, mogu da modulišu transdukciona svojstva vrsta AAV kapsida koje se ne vezuju za HSPG, ili mogu da modulišu transdukciona svojstva vrsta AAV kapsida nezavisno od njihove sposobnosti da vezuju HSPG. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija obuhvata jednu ili više aminokiselina koje odgovaraju aminokiselini prikazanoj na SL. 20. Na primer, u nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju aminokiselinama 585 i/ili 588 (numeracija na bazi VP1 iz AAV2) zamenjena je ostacima arginina (npr. S586 i/ili T589 za AAV1 ili AAV6; S586 i/ili A589 za AAV9; A586 i/ili T589 za AAVrh8R; Q588 i/ili T591 za AAV8; i Q588 i/ili A591 za AAVrh10). Ovi modifikovani kapsidi mogu naći primenu, između ostalog, u poboljšanju intravitrealne transdukcije koja cilja mrežnjaču. U drugim slučajevima, jedna ili više aminokiselina (npr. arginin ili lizin) na pozicijama koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 527 i/ili 532 (numeracija na bazi VP1 iz AAV2) zamenjena je aminokiselinama poput alanina koje nisu pozitivno naelektrisane (npr. R485, R488, K528, i/ili K533 za AAV1 ili AAV6; R485, R488, K528, i/ili R533 za AAV9 ili AAVrh8R; i R487, R490, K530, i/ili R535 za AAV8 ili AAVrh10). Ovi modifikovani kapsidi mogu naći primenu, između ostalog, u poboljšanju subretinalne ili CNS transdukcije.
[0139] U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 1 (AAV1). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV1. U nekim slučajevima, VP1 iz AAV1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji S586 i/ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju S586R ili S586K, numeracija na bazi VP1 iz AAV1. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju T589R, numeracija na bazi VP1 iz AAV1. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 6 (AAV6). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV6. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV6 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji S586 i/ili T589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju S586R ili S586K, numeracija na bazi VP1 iz AAV6. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju T589R, numeracija na bazi VP1 iz AAV6. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 8 (AAV8). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 588 i/ili 591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV8. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV8 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji Q588 i/ili T591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV8. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju Q588R ili Q588K, numeracija na bazi VP1 iz AAV8. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju T591R, numeracija na bazi VP1 iz AAV8. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa 9 (AAV9). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 586 i/ili 589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV9. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAV9 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15.
U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji S586 i/ili A589, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju S586R ili S586K, numeracija na bazi VP1 iz AAV9. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju A589R ili A589K, numeracija na bazi VP1 iz AAV9. U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži kapsid AAV serotipa rh10 (AAVrh10). U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija je na poziciji 588 i/ili 591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh10. U nekim slučajevima, numeracija se zasniva na VP1 iz AAVrh10 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:16. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju na poziciji Q588 i/ili A591, numeracija na bazi VP1 numeracije AAVrh10. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju Q588R ili Q588K, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh10. U nekim slučajevima, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija uključuje supstituciju A591R, numeracija na bazi VP1 iz AAVrh10.
IV. Postupci lečenja
[0140] Protokoli genske terapije za bolesti mrežnjače, kao što su LCA, retinitis pigmentoza i senilna degeneracija makule, zahtevaju lokalizovanu isporuku vektora u ćelije mrežnjače. Ćelije koje će biti cilj lečenja kod ovih bolesti su fotoreceptorske ćelije u mrežnjači ili ćelije RPE ispod neurosenzorne retine. Isporuka vektora za gensku terapiju u ove ćelije zahteva injekciju u subretinalni prostor između mrežnjače i RPE. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za isporuku vektora rAAV za gensku terapiju u ćelije mrežnjače kada su vektori rAAV enkapsidovani u kapsidu AAV koji sadrži supstitucije jednog ili više ostataka aminokiselina koji interaguju sa HSPG.
[0141] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za lečenje poremećaja CNS kod pojedinca, koji obuhvataju isporuku kompozicije koja sadrži čestice rAAV u CNS pojedinca, pri čemu čestice rAAV sadrže (a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i (b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim otelotvorenjima, pojedinac je čovek.
Terapeutski vektori
[0142] Otkriće obezbeđuje postupke genske terapije za poremećaje oka, pri čemu se čestice rAAV koje sadrže terapeutske vektore isporučuju u mrežnjaču pojedinca. Poboljšana transdukcija ćelija mrežnjače može da se postigne enkapsidovanjem vektora rAAV u kapsidima rAAV (npr. čestice rAAV2, rAAVrh8R, itd.) kada je jedna ili više aminokiselina kapsida koje interaguju sa HSPG supstituisana tako da je vezivanje čestica rAAV za HSPG umanjeno ili ukinuto. Vektor može da sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid (npr. terapeutski ili dijagnostički polipeptid) i/ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. Nukleinska kiselina koja kodira terapeutske ili dijagnostičke polipeptide i/ili terapeutsku nukleinsku kiselinu može da se dobije koristeći postupke koji su poznati u struci, koristeći standardnu sintezu i rekombinantne postupke. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira dijagnostički polipeptid. Neograničavajući primeri nukleinske kiseline koja kodira terapeutske polipeptide uključuju: nukleinske kiseline za zamenu nedostajućeg ili mutiranog gena za koji je poznato da izaziva bolest mrežnjače, na primer Prph2, RPE65, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3 i GNAT2. Drugi neograničavajući primeri nukleinskih kiselina koje kodiraju terapeutske polipeptide uključuju one koje kodiraju neurotrofne faktore (kao što je GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO), antiapoptotske gene (kao što je BCL2, BCL-X, NFκB), antiangiogene faktore (kao što je endostatin, angiostatin, sFlt), i antiinflamatorne faktore (kao što je IL10, IL1-ra, TGFβ, IL4). Drugi terapeutski polipeptidi za poremećaje oka uključuju, ali nisu ograničeni na, Myo7a, ABCA4, REP1, GUCY2D, PDE6C, RS1, RPGRIP, Lpcat1, AIPL1, RDH12, CHM. U nekim otelotvorenjima, kodirani polipeptid je humana varijanta polipeptida.
[0143] Nukleinske kiseline iz otkrića mogu da kodiraju polipeptide koji su intracelularni proteini, zakačeni za ćelijsku membranu, ostaju u ćeliji ili ih luči ćelija transdukovana vektorima iz pronalaska. Za polipeptide koje luči ćelija koja prima vektor; polipeptid može biti rastvorljiv (tj. nije vezan za ćeliju). Na primer, rastvorljivim polipeptidima nedostaje transmembranski region i izlučuju se iz ćelije. Tehnike za identifikaciju i uklanjanje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju transmembranske domene su poznate u struci.
[0144] Vektori koji mogu da se primene u skladu sa predmetnim pronalaskom takođe uključuju vektore koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira RNK (npr. RNKi, ribozime, miRNK, siRNK, antisens RNK) tako da, kada su transkribovani iz nukleinskih kiselina
1
vektora, mogu da leče poremećaj oka putem ometanja translacije ili transkripcije abnormalnog ili prekomernog proteina povezanog sa bolešću iz otkrića. Na primer, nukleinske kiseline iz otkrića mogu da kodiraju RNK koja leči bolest pomoću veoma specifične eliminacije ili redukcije mRNK koja kodira abnormalne i/ili prekomerne proteine. Sekvence terapeutske RNK uključuju RNKi, malu inhibitorsku RNK (siRNK), mikro RNK (miRNK) i/ili ribozime (kao što su Hamerhedovi ribozimi i ribozimi tipa ukosnice) koji mogu da leče bolesti pomoću veoma specifične eliminacije ili redukcije mRNK koja kodira abnormalne i/ili prekomerne proteine, kao što su oni koji se javljaju kod različitih oblika nasledne degeneracije mrežnjače. Neograničavajući primeri poremećaja oka koji mogu da se leče terapeutskim sekvencama RNK uključuju, na primer, autozomnu dominatnu retinitis pigmentozu (ADRP) i dijabetičku retinopatiju. Primeri terapeutskih sekvenci RNK i nukleinskih kiselina koje kodiraju ove sekvence koje mogu da se koriste u pronalasku uključuju one opisane, na primer, u U.S. pat. br.6225291. U nekim otelotvorenjima, sekvenca terapeutske RNK je miR-708. U nekim otelotvorenjima, miR-708 se koristi u kombinaciji sa nukleinskom kiselinom koja kodira rodopsin divljeg tipa, ili u okviru istog vektora rAAV ili u okviru drugog vektora rAAV. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira rodopsin divljeg tipa nema ciljnu sekvencu miR-708 lociranu u 3' netranslatovanom regionu gena rodopsina. Vektore rAAV koji kodiraju miR-708 i/ili rodopsin daje US privremena patentna prijava ser. br.61/969, 027.
[0145] Određeni primeri otkrića se odnose na upotrebu čestica rAAV (npr. terapeutskog vektora) koje sadrže (a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i (b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. Kako se ovde koristi, terapeutska nukleinska kiselina može da eksprimira bilo koju terapeutsku nukleinsku kiselinu iz predmetnog otkrića ili bilo koju nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid iz predmetnog otkrića. Terapeutska nukleinska kiselina može da se koristi, na primer, za ublažavanje simptoma, prevenciju ili odlaganje progresije, i/ili za pružanje lečenja poremećaja (npr. poremećaja koji je ovde opisan).
[0146] Poboljšana transdukcija ćelija CNS može da se postigne enkapsidovanjem vektora rAAV u kapsidima rAAV (npr. čestice rAAV2, rAAVrh8R, itd.) kada je jedna ili više
2
aminokiselina kapsida koje interaguju sa HSPG supstituisana tako da je vezivanje čestica rAAV za HSPG umanjeno ili ukinuto. Vektor može da sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid (npr. terapeutski ili dijagnostički polipeptid) i/ili terapeutsku nukleinsku kiselinu. Nukleinska kiselina koja kodira terapeutske ili dijagnostičke polipeptide i/ili terapeutsku nukleinsku kiselinu može da se dobije koristeći postupke koji su poznati u struci, koristeći standardnu sintezu i rekombinantne postupke. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira dijagnostički polipeptid. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira gen povezan sa CNS.
[0147] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, terapeutska nukleinska kiselina može da uključuje, bez ograničenja, siRNK, shRNK, RNKi, miRNK, antisens RNK, ribozim ili DNKzim. Tako, terapeutska nukleinska kiselina može da kodira RNK koja, kada je transkribovana iz nukleinskih kiselina vektora, može da leči poremećaj iz otkrića (npr. poremećaj CNS) putem ometanja translacije ili transkripcije abnormalnog ili prekomernog proteina povezanog sa poremećajem iz otkrića. Na primer, nukleinske kiseline iz otkrića mogu da kodiraju RNK koja leči poremećaj pomoću veoma specifične eliminacije ili redukcije mRNK koja kodira abnormalne i/ili prekomerne proteine. Sekvence terapeutske RNK uključuju RNKi, malu inhibitorsku RNK (siRNK), mikro RNK (miRNK) i/ili ribozime (kao što su Hamerhedovi ribozimi i ribozimi tipa ukosnice) koji mogu da leče bolesti pomoću veoma specifične eliminacije ili redukcije mRNK koja kodira abnormalne i/ili prekomerne proteine.
[0148] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutski polipeptid. Terapeutski polipeptid može, npr. da obezbedi polipeptid i/ili enzimsku aktivnost koja je odsutna ili prisutna sa nižim nivoom u ćeliji ili organizmu. Alternativno, terapeutski polipeptid može da obezbedi polipeptid i/ili enzimsku aktivnost koja se indirektno suprotstavlja disbalansu u ćeliji ili organizmu. Na primer, terapeutski polipeptid za poremećaj povezan sa nakupljanjem metabolita uzrokovanim nedostatkom metaboličkog enzima ili aktivnosti može da obezbedi nedostajući metabolički enzim ili aktivnost, ili može da obezbedi alternativni metabolički enzim ili aktivnost koji dovodi do smanjenja metabolita. Terapeutski polipeptid takođe može da se koristi za smanjenje aktivnosti polipeptida (npr.
koji je prekomerno eksprimiran, aktiviran mutacijom dobijanja funkcije, ili čija aktivnost je na drugi način pogrešno regulisana) tako što deluje, npr. kao dominantno negativni polipeptid.
[0149] U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran od enzima, neurotrofnog faktora, polipeptida koji je u manjku ili je mutiran kod pojedinca sa poremećajem povezanim sa CNS, antioksidansa, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora. Takvi polipeptidi mogu da se koriste za lečenje poremećaja CNS tako što, npr. obezbeđuju polipeptid i/ili enzimsku aktivnost koja je smanjena, odsutna ili pogrešno regulisana kod poremećaja CNS, ublažavajući uzrok i/ili simptom poremećaja CNS, i/ili uklanjajući oštećenje CNS uzrokovano poremećajem CNS (npr. apoptoza, inflamacija, ili druge vrste ćelijske smrti). Neograničavajući primeri nukleinske kiseline koja kodira terapeutske polipeptide uključuju: nukleinske kiseline za zamenu nedostajućeg ili mutiranog gena za koji je poznato da izaziva poremećaj CNS, na primer Prph2, RPE65, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3 i GNAT2. Drugi neograničavajući primeri nukleinskih kiselina koje kodiraju terapeutske polipeptide uključuju one koje kodiraju neurotrofne faktore (kao što je GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO), antiapoptotske gene (kao što je BCL2, BCL-X, NFκB), antiangiogene faktore (kao što je endostatin, angiostatin, sFlt), i antiinflamatorne faktore (kao što je IL10, IL1-ra, TGFβ, IL4). Drugi terapeutski polipeptidi za poremećaje CNS uključuju, ali nisu ograničeni na, Myo7a, ABCA4, REP1, GUCY2D, PDE6C, RS1, RPGRIP, Lpcat1, AIPL1, RDH12, CHM. U nekim otelotvorenjima, kodirani polipeptid je humana varijanta polipeptida. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina kodira protein inhibitora apoptoze neurona (NAIP), faktor rasta nerva (NGF), glijalni faktor rasta (GDNF), moždani faktor rasta (BDNF), cilijarni neurotrofni faktor (CNTF), tirozin hidroksilazu (TH), GTP-ciklohidrolazu (GTPCH), aminokiselinsku dekarboksilazu (AADC), antioksidans, antiangiogeni polipeptid, antiinflamatorni polipeptid i/ili aspartoacilazu (ASPA). Primeri za antioksidanse uključuju, bez ograničenja, SOD1; SOD2; katalazu; sirtuine 1, 3, 4 ili 5; NRF2; PGC1a; GCL (katalitička podjedinica); GCL (modifikujuća podjedinica); adiponektin; glutation peroksidazu 1; i neuroglobin. Primeri za antiangiogene polipeptide uključuju, bez ograničenja, angiostatin, endostatin, PEDF, rastvorljivi receptor VEGF i rastvorljivi receptor PDGF.
Primeri za antiinflamatorne polipeptide uključuju, bez ograničenja, IL-10, rastvorljivi IL17R, rastvorljivi TNF-R, TNF-R-Ig, IL-1 inhibitor i IL18 inhibitor. Drugi primeri za polipeptide iz ovih klasa koji mogu da se koriste za lečenje poremećaja CNS su dati u nastavku.
4
[0150] Nukleinske kiseline iz otkrića mogu da kodiraju polipeptide koji su intracelularni proteini, zakačeni za ćelijsku membranu, ostaju u ćeliji, ili ih luči ćelija transdukovana vektorima iz otkrića. Za polipeptide koje luči ćelija koja prima vektor; polipeptid može biti rastvorljiv (tj. nije vezan za ćeliju). Na primer, rastvorljivim polipeptidima nedostaje transmembranski region i izlučuju se iz ćelije. Tehnike za identifikaciju i uklanjanje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju transmembranske domene su poznate u struci.
[0151] U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom. Primeri za promotere uključuju, ali nisu ograničeni na, neposredni rani promoter citomegalovirusa (CMV), RSV LTR, MoMLV LTR, promoter fosfoglicerat kinaze-1 (PGK), promoter simijan virusa 40 (SV40) i promoter CK6, transtiretinski promoter (TTR), TK promoter, tetraciklinski responsivni promoter (TRE), HBV promoter, hAAT promoter, LSP promoter, himerni promoter specifičan za jetru (LSP), E2F promoter, promoter telomeraze (hTERT); promoter pojačivača citomegalovirusa/kokošjeg beta-aktina/zečjeg βglobina (CAG promoter; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9) i promoter faktora elongacije 1-alfa (EFl-alpha) (Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 i Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). U nekim otelotvorenjima, promoter obuhvata promoter humane βglukuronidaze ili pojačavač citomegalovirusa povezan sa promoterom β-aktina kokoške (CBA). Promoter može biti konstitutivni, inducibilni ili represibilni promoter. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje rekombinantni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira heterologni transgen iz predmetnog otkrića koji je operativno povezan sa CBA promoterom. Primeri promotera i opisa mogu se naći, npr. u U.S. PG pub.20140335054.
[0152] Primeri za konstitutivne promotere uključuju, bez ograničenja, LTR promoter retrovirusnog Rausovog virusa sarkoma (RSV) (opciono sa pojačavačem RSV), promoter citomegalovirusa (CMV) (opciono sa pojačavačem CMV) [vidite, npr. Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] SV40 promoter, promoter dihidrofolat reduktaze, promoter 13-aktina, promoter fosfoglicerol kinaze (PGK) i EFla promoter [Invitrogen].
[0153] Inducibilni promoteri omogućavaju regulaciju ekspresije gena, i mogu da se regulišu pomoću egzogeno obezbeđenih jedinjenja, faktora okruženja kao što je temperatura, ili prisustva specifičnog fiziološkog stanja, npr. akutne faze, konkretnog stanja diferencijacije ćelije, ili samo u replikujućim ćelijama. Inducibilni promoteri i inducibilni sistemi su dostupni iz različitih komercijalnih izvora, uključujući, bez ograničenja, Invitrogen, Clontech i Ariad. Opisani su brojni drugi sistemi, i stručnjak za oblast lako može da ih izabere. Primeri za inducibilne promotere koji su regulisani egzogeno obezbeđenim promoterima uključuju promoter ovčjeg metaltionina inducibilan cinkom (MT), deksametazonom (Dex) inducibilni promoter virusa mišjeg tumora mlečne žlezde (MMTV), promoterski sistem T7 polimeraze (WO 98/10088); ekdizonski promoter insekata (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 93:3346-3351 (1996)), tetraciklinski represiblni sistem (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 89:5547-5551 (1992)), tetraciklinski inducibilni sistem (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), vidite takođe Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), RU486 inducibilni sistem (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) i Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) i rapamicinom inducibilni sistem (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Još neke vrste inducibilnih promotera koji mogu biti korisni u ovom kontekstu su oni koji su regulisani određenim fiziološkim stanjem, npr. temperaturom, akutnom fazom, konkretnim stanjem diferencijacije ćelije, ili samo u replikujućim ćelijama.
[0154] U drugom otelotvorenju, biće korišćen nativni promoter, ili njegov fragment, za transgen. Nativni promoter može da se koristi kada je poželjno da ekspresija transgena oponaša nativnu ekspresiju. Nativni promoter može da se koristi kada ekspresija transgena mora da se reguliše vremenski ili razvojno, ili na način specifičan za tkivo, ili kao odgovor na specifične transkripcione stimuluse. U daljem otelotvorenju, drugi nativni kontrolni elementi ekspresije, kao što su pojačavački elementi, mesta poliadenilacije ili Kozakove sekvence konsenzusa mogu takođe da se koriste za oponašanje nativne ekspresije.
[0155] U nekim otelotvorenjima, regulatorne sekvence daju sposobnosti ekspresije gena specifične za tkivo. U nekim slučajevima, regulatorne sekvence specifične za tkivo vezuju faktore transkripcije specifične za tkivo na način specifičan za tkivo. Takve regulatorne sekvence specifične za tkivo (npr. promoteri, pojačavači, itd.) dobro su poznate u struci.
Primeri za regulatorne sekvence specifične za tkivo uključuju, ali nisu ograničene na sledeće promotere specifične za tkivo: neurone kao što je promoter enolaze specifične za neurone (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), promoter gena lakog lanca neurofilamenta (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 88:5611-5 (1991)) i promoter vgf gena specifičnog za neurone (Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)). U nekim otelotvorenjima, promoter specifičan za tkivo je promoter gena izabran od: neuronskih nukleusa (NeuN), glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP), adenomatozne polipoze koli (APC) i jonizovanog kalcijum-vezujućeg adapterskog molekula 1 (Iba-1). Drugi odgovarajući promoteri specifični za tkivo biće poznati stručnjaku. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter beta-aktina kokoške.
[0156] U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je pod kontrolom promoterske sekvence koja se eksprimira u jednoj ili više ćelija CNS. Mnoge od prethodno navedenih promoterskih sekvenci (npr. CBA promoter) poznate su u struci za ekspresiju u jednoj ili više ćelija CNS. U nekim slučajevima, promoterska sekvenca može biti sveprisutno eksprimirana u organizmu, te tako može da se eksprimira u jednoj ili više ćelija CNS zahvaljujući njenoj isporuci u CNS. U drugim slučajevima, može da se koristi promoterska sekvenca koja je specifično eksprimirana u CNS, ili u jednoj ili više ćelija CNS. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je operativno povezana sa promoterom pogodnim za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više ćelija CNS. Tako, u nekim slučajevima, terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina iz otkrića može da se koristi za lečenje poremećaja CNS.
[0157] U nekim slučajevima, promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u moždanoj ćeliji. Moždana ćelija može da se odnosi na bilo koju moždanu ćeliju poznatu u struci, uključujući, bez ograničenja, neuron (kao što je senzorni neuron, motorni neuron, interneuron, dopaminergijski neuron, srednji bodljikavi neuron, holinergijski neuron, GABAergijski neuron, piramidalni neuron, itd.), glijalnu ćeliju (kao što su mikroglija, makroglija, astrociti, oligodendrociti, ependimske ćelije, radijalne glije, itd.), ćelije moždanog parenhima, ependemske ćelije i/ili Purkinjeove ćelije. U nekim slučajevima, promoter eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u neuronu. U nekim slučajevima, heterologna nukleinska kiselina je eksprimirana isključivo u neuronima (npr. eksprimirana je u neuronu i nije eksprimirana u drugim ćelijama CNS, kao što su glijalne ćelije).
[0158] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje vektore rAAV za upotrebu u postupcima za prevenciju ili lečenje jednog ili više genskih defekata (npr. nasledni genski defekti, somatske genske izmene, i slično) kod sisara, kao što je, na primer, genski defekt koji dovodi do nedostatka polipeptida ili viška polipeptida kod ispitanika, ili za lečenje ili smanjenje težine ili obima deficijencije kod ispitanika koji ispoljava poremećaj povezan sa CNS povezan sa nedostatkom takvih polipeptida u ćelijama i tkivima. U nekim slučajevima, postupci obuhvataju primenu vektora rAAV koji kodira jedan ili više terapeutskih peptida, polipeptida, funkcionalnih RNK, inhibitorskih nukleinskih kiselina, shRNK, mikroRNK, antisens nukleotida, itd. u farmaceutski prihvatljivom nosaču na ispitaniku u količini i vremenskom periodu koji su dovoljni za lečenje poremećaja povezanog sa CNS kod ispitanika koji ima, ili se sumnja da ima, takav poremećaj.
[0159] Vektor rAAV može da sadrži transgen, nukleinsku kiselinu koja kodira protein ili funkcionalnu RNK koja moduliše ili leči poremećaj povezan sa CNS. Sledeće predstavlja neograničavajući spisak gena povezanih sa poremećajem povezanim sa CNS: protein inhibitora apoptoze neurona (NAIP), faktor rasta nerva (NGF), glijalni faktor rasta (GDGF), moždani faktor rasta (BDNF), cilijarni neurotrofni faktor (CNTF), tirozin hidroksilaza (TH), GTP-ciklohidrolaza (GTPCH), aspartoacilaza (ASPA), superoksid dismutaza (SOD1), antioksidans, antiangiogeni polipeptid, antiinflamatorni polipeptid i aminokiselinska dekorboksilaza (AADC). Na primer, korisni transgen u lečenju Parkinsonove bolesti kodira TH, koji je enzim koji ograničava brzinu u sintezi dopamina. Transgen koji kodira GTPCII, koji stvara TII kofaktor tetrahidrobiopterin, takođe može da se koristi u lečenju Parkinsonove bolesti. Transgen koji kodira GDNF ili BDNF ili AADC, koji olakšava konverziju L-Dopa u DA, takođe može da se koristi za lečenje Parkinsonove bolesti. Za lečenje ALS, korisni transgen može da kodira: GDNF, BDNF ili CNTF. Takođe, za lečenje ALS, korisni transgen može da kodira funkcionalnu RNK, npr. shRNK, miRNK, koja inhibira ekspresiju SOD1. Za lečenje ishemije, korisni transgen može da kodira NAIP ili NGF. Transgen koji kodira betaglukuronidazu (GUS) može biti koristan za lečenje određenih bolesti lizozomskog skladištenja (npr. mukopolisaharidoza tip VII (MPS VII)). Transgen koji kodira gen aktivacije proleka, npr. HSV-timidin kinaza koja konvertuje ganciklovir u toksični nukleotid koji ometa sintezu DNK i dovodi do ćelijske smrti, može biti koristan za lečenje određenih kancera, npr. kada se primenjuje u kombinaciji sa prolekom. Transgen koji kodira endogeni opioid, kao što je β-endorfin, može biti koristan za lečenje bola. Primeri za antioksidanse uključuju, bez ograničenja, SOD1; SOD2; katalazu; sirtuine 1, 3, 4 ili 5; NRF2; PGC1a; GCL (katalitička podjedinica); GCL (modifikujuća podjedinica); adiponektin; glutation peroksidazu 1; i neuroglobin. Primeri za antiangiogene polipeptide uključuju, bez ograničenja, angiostatin, endostatin, PEDF, rastvorljivi receptor VEGF i rastvorljivi receptor PDGF.
Primeri za antiinflamatorne polipeptide uključuju, bez ograničenja, IL-10, rastvorljivi IL17R, rastvorljivi TNF-R, TNF-R-Ig, IL-1 inhibitor i IL18 inhibitor. Drugi primeri transgena koji mogu da se koriste u vektorima rAAV iz otkrića biće očigledni stručnjaku za oblast (vidite, npr. Costantini L C, et al., Gene Therapy (2000) 7, 93-109).
[0160] Bez želje da se ograničimo teorijom, smatra se da terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina mogu da se koriste za smanjenje ili eliminaciju ekspresije i/ili aktivnosti polipeptida čiji je dobitak funkcije povezan sa poremećajem, ili za pojačavanje ekspresije i/ili aktivnosti polipeptida kao dopuna nedostatka koji je povezan sa poremećajem (npr. mutacija u genu čija ekspresija pokazuje sličnu ili srodnu aktivnost). Neograničavajući primeri poremećaja iz otkrića koji mogu da se leče pomoću terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline iz otkrića (primeri gena koji mogu da se ciljaju ili isporučuju su obezbeđeni u zagradi za svaki poremećaj) uključuju moždani udar (npr. kaspaza-3, Beclinl, Ask1, PAR1, HIF1α, PUMA, i/ili bilo koji od gena opisanih u Fukuda, A.M. i Badaut, J.
(2013) Genes (Basel) 4:435-456), Hantingtonovu bolest (mutant HTT), epilepsiju (npr.
SCN1A, NMDAR, ADK, i/ili bilo koji od gena opisanih u Boison, D. (2010) Epilepsia 51:1659-1668), Parkinsonovu bolest (alfa-sinuklein), Lu Gerigovu bolest (poznata i kao amiotrofična lateralna skleroza; SOD1), Alchajmerovu bolest (tau, amiloidni prekursorski protein), kortikobazalnu degeneraciju ili CBD (tau), kortikobazalnu ganglionsku degeneraciju ili CBGD (tau), frontotemporalnu demenciju ili FTD (tau), progresivnu supranuklearnu paralizu ili PSP (tau), multiplu sistemsku atrofiju ili MSA (alfa-sinuklein), kancer mozga (npr. mutantni ili prekomerno eksprimirani onkogen koji učestvuje u kanceru mozga) i bolesti lizozomskog skladištenja (LSD). Poremećaji iz otkrića mogu da uključuju one koji zahvataju velike oblasti korteksa, npr. više od jedne funkcionalne oblasti korteksa, više od jednog režnja korteksa i/ili ceo korteks. Drugi neograničavajući primeri poremećaja iz otkrića koji mogu da se leče terapeutskim polipeptidom ili terapeutskom nukleinskom kiselinom iz otkrića uključuju traumatsku povredu mozga, poremećaje enzimske disfunkcije, psihijatrijske poremećaje (uključujući posttraumatski stresni sindrom), neurodegenerativne bolesti i kognitivne poremećaje (uključujući demenciju, autizam i depresiju). Poremećaji enzimske disfunkcije uključuju, bez ograničenja, leukodistrofije (uključujući Kanavanovu bolest) i bilo koju od bolesti lizozomskog skladištenja koje su opisane u nastavku.
[0161] U nekim slučajevima, terapeutski polipeptid ili terapeutska nukleinska kiselina se koriste za bolesti lizozomskog skladištenja. Kao što je uobičajeno poznato u struci, bolesti lizozomskog skladištenja su retki, nasledni metabolički poremećaji koje karakterišu defekti u funkciji lizozoma. Takvi poremećaji su često uzrokovani nedostatkom enzima koji je potreban za pravilan metabolizam mukopolisaharida, glikoproteina i/ili lipida, što dovodi do patološkog taloženja lizozomski uskladištenih ćelijskih supstanci. Neograničavajući primeri bolesti lizozomskog skladištenja iz otkrića koje mogu da se leče terapeutskim polipeptidom ili terapeutskom nukleinskom kiselinom iz otkrića (primeri gena koji mogu da se ciljaju ili isporučuju su obezbeđeni u zagradi za svaki poremećaj) uključuju Gošeovu bolest tip 2 ili tip 3 (kisela beta-glukozidaza, GBA), GM1 gangliozidozu (beta-galaktozidaza-1, GLB1), Hanterovu bolest (iduronat 2-sulfataza, IDS), Krebovu bolest (galaktozilceramidaza, GALC), bolest manozidozu (manozidaza, kao što je alfa-D-manozidaza, MAN2B1), bolest β manozidozu (beta-manozidaza, MANBA), bolest metahromatske leukodistrofije (pseudoaril sulfataza A, ARSA), bolest mukolipidozu II/III (N-acetilglukozamin-1-fosfotransferaza, GNPTAB), Niman-Pikovu bolest A (kisela sfingomijelinaza, ASM), Niman-Pikovu bolest C (Niman-Pikov C protein, NPC1), Pompeovu bolest (kisela alfa-1,4-glukozidaza, GAA), Sandhofovu bolest (beta podjedinica heksozaminidaze, HEXB), Sanfilipovu bolest A (N-sulfoglukozamin sulfohidrolaza, MPS3A), Sanfilipovu bolest B (N-alfa-acetil glukozaminidaza, NAGLU), Sanfilipovu bolest C (heparin acetil-CoA:alfa-glukozaminidaza N-acetiltransferaza, MPS3C), Sanfilipovu bolest D (N-acetil glukozamin-6-sulfataza, GNS), Šindlerovu bolest (alfa-N-acetilgalaktozaminidaza, NAGA), mukopolisaharidozu tip VII (beta-glukuronidaza, GUSB), Tej-Saksovu bolest (alfa jedinica heksozaminidaze, HEXA) i Volmanovu bolest (lizozomska kisela lipaza, LIPA).
[0162] Dodatne bolesti lizozomskog skladištenja, kao i defektivni enzim povezan sa svakom bolešću, navedene su u tabeli 1 u nastavku. U nekim slučajevima, bolest navedena u tabeli u nastavku se leči terapeutskim polipeptidom ili terapeutskom nukleinskom kiselinom iz otkrića koja dopunjava ili na drugi način nadoknađuje odgovarajući enzimski defekt.
Tabela 1. Bolesti lizozomskog skladištenja i povezani defektni enzimi.
1
rAAV kompozicije
[0163] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje kompozicije koje sadrže bilo koju od ovde opisanih čestica rAAV. Uopšteno, kompozicije za upotrebu u postupcima i sistemima iz otkrića sadrže delotvornu količinu čestica rAAV koje sadrže vektore rAAV koji kodiraju polipeptid i/ili RNK, opciono u farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu. Virusne čestice sadrže kapsid AAV (npr. kapsid AAV2 ili AAVrh8R), pri čemu je jedna ili više aminokiselina koje interaguju sa HSPG supstituisana tako da je vezivanje čestice rAAV za HSPG smanjeno ili ukinuto. Kao što je dobro poznato u struci, farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su relativno inertne supstance koje olakšavaju primenu farmaceutski delotvorne supstance, i mogu da se nabave kao tečni rastvori ili suspenzije, kao emulzije, ili kao čvrsti oblici koji su pogodni za rastvaranje ili suspendovanje u tečnosti pre upotrebe. Na primer, ekscipijens može da daje oblik ili konzistenciju, ili da deluje kao razblaživač. Pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, stabilizatore, kvašljivce i emulgatore, soli različite osmolarnosti, agense za enkapsulaciju, pH puferujuće supstance i pufere. Takvi ekscipijensi uključuju bilo koji farmaceutski agens pogodan za neposrednu isporuku u oko koji može da se primeni bez nepotrebne toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, sorbitol, bilo koje od različitih jedinjenja TWEEN i tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti tu obuhvaćene, na primer, soli mineralne kiseline kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati, i slično; i soli organskih kiselina, kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati, i slično. Temeljno razmatranje farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa je dostupno u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J.1991).
2
[0164] Uopšteno, ove kompozicije su formulisane za primenu putem subretinalne injekcije. Shodno tome, ove kompozicije mogu da se kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim nosačima kao što su fiziološki rastvor, Ringerov balansirani rastvor soli (pH 7,4), i slično. Iako to nije neophodno, kompozicija može opciono da se obezbedi u jediničnom doznom obliku koji je pogodan za primenu precizne količine.
Postupci za subretinalnu isporuku rAAV
[0165] Postupci za subretinalnu isporuku su poznati u struci. Vidite, na primer, WO 2009/105690. Ukratko, opšti postupak za isporuku čestica rAAV (npr. čestica rAAV2, rAAVrh8R, itd.) u subretinu makule i foveu može da se ilustruje sledećim kratkim prikazom. Ovaj primer treba samo da ilustruje određene karakteristike postupka, i ne treba ga tumačiti kao ograničavajući.
[0166] Uopšteno, vektor rAAV može da se isporuči u obliku kompozicije koja se injektuje intraokularno (subretinalno) pod direktnim posmatranjem koristeći operativni mikroskop. U nekim otelotvorenjima, vektor je enkapsidovan u čestici rAAV, pri čemu čestica rAAV sadrži kapsid rAAV koji sadrži proteine rAAV kapsida koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom (npr. inhibira ili ukida vezivanje HSPG), i vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV. Ovaj postupak može da obuhvata vitrektomiju nakon koje sledi injekcija suspenzije vektora rAAV koristeći finu kanilu kroz jednu ili više malih retinotomija u subretinalni prostor.
[0167] Ukratko, infuziona kanila može biti učvršćena šavovima kako bi se održala normalna zapremina očne jabučice putem infuzije (npr. fiziološkog rastvora) tokom operacije.
Vitrektomija se vrši koristeći kanilu sa odgovarajućom veličinom otvora (na primer, veličina 20 do 27), pri čemu je zapremina staklastog gela koja je uklonjena zamenjena infuzijom fiziološkog rastvora ili drugog izotoničnog rastvora iz infuzione kanile. Vitrektomija se pogodno obavlja jer (1) uklanjanje njegovog korteksa (posteriorna hijaloidna membrana) olakšava probijanje mrežnjače kanilom; (2) njegovo uklanjanje i zamena tečnošću (npr, fiziološkim rastvorom) stvara prostor za prijem intraokularne injekcije vektora i (3) njegovo kontrolisano uklanjanje smanjuje mogućnost pucanja retine i neplanirane ablacije mrežnjače.
[0168] U nekim slučajevima, kompozicija rAAV je neposredno injektovana u subretinalni prostor izvan centralne mrežnjače, koristeći kanilu sa odgovarajućom veličinom otvora (npr. veličina 27-45), stvarajući tako mehurić u subretinalnom prostoru. U drugim otelotvorenjima, subretinalnoj injekciji kompozicije rAAV prethodi subretinalna injekcija male zapremine (npr. oko 0,1 do oko 0,5 ml) odgovarajuće tečnosti (kao što je fiziološki rastvor ili Ringerov rastvor) u subretinalni prostor izvan centralne mrežnjače. Ovom inicijalnom injekcijom u subretinalni prostor uspostavlja se inicijalni mehurić tečnosti u subretinalnom prostoru, što uzrokuje lokalizovanu ablaciju mrežnjače na mestu inicijalnog mehurića. Inicijalni mehurić tečnosti može da olakša ciljanu isporuku kompozicije rAAV u subretinalni prostor (tako što definiše ravan injekcije pre isporuke rAAV) i da minimizuje moguću primenu rAAV u horoid i mogućnost injekcije rAAV ili refluksa u staklastu šupljinu. U nekim otelotvorenjima, ovaj inicijalni mehurić tečnosti može dalje da se injektuje sa tečnostima koje sadrže jednu ili više kompozicija rAAV i/ili jedan ili više dodatnih terapeutskih agensa putem primene ovih tečnosti neposredno u inicijalni mehurić tečnosti sa istim ili dodatnim kanilama sa finom iglom.
[0169] Intraokularna primena kompozicija rAAV i/ili inicijalne male zapremine tečnosti može da se obavi koristeći kanilu sa finom iglom (npr. veličine 27-45) povezanu za špric. U nekim otelotvorenjima, klip ovog šprica može da pokreće mehanički uređaj, recimo putem pritiska nožne pedale. Kanila sa finom iglom napreduje putem sklerotomije, kroz staklastu šupljinu u mrežnjaču na mesto koje je prethodno određeno kod svakog ispitanika u skladu sa delom mrežnjače koji se cilja (ali izvan centralne mrežnjače). Uz direktno posmatranjem, vektorska suspenzija se mehanički injektuje ispod neurosenzorne mrežnjače, što dovodi do lokalizovane ablacije mrežnjače sa samozatvarajućom neekspandujućom retinotomijom. Kao što je prethodno uočeno, kompozicija rAAV može direktno da se injektuje u subretinalni prostor stvarajući mehurić izvan centralne mrežnjače, ili vektor može da se injektuje u inicijalni mehurić izvan centralne mrežnjače, što dovodi do njenog širenja (i povećavanja oblasti ablacije mrežnjače). U nekim slučajevima, injekcija kompozicije rAAV je praćena injekcijom druge tečnosti u mehurić.
[0170] Bez želje da se ograničimo teorijom, brzina i mesto subretinalne injekcije mogu da dovedu do lokalizovanih sila smicanja koje mogu da oštete makulu, foveu i/ili RPE ćelije ispod. Subretinalna injekcija može da se obavi brzinom koja minimizuje ili izbegava sile smicanja. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje tokom oko 15-17 minuta. U
4
nekim slučajevima, vektor se injektuje tokom oko 17-20 minuta. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje tokom oko 20-22 minuta. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje protokom od oko 35 do oko 65 µl/min. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje sa brzinom od oko 35 µl/min. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje protokom od oko 40 µl/min. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje protokom od oko 45 µl/min. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje protokom od oko 50 µl/min. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje protokom od oko 55 µl/min. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje protokom od oko 60 µl/min. U nekim slučajevima, kompozicija rAAV se injektuje protokom od oko 65 µl/min. Osoba sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci će prepoznati da protok i trajanje injekcije mehurića mogu biti određeni, na primer, zapreminom kompozicije rAAV ili veličinom mehurića koja je neophodna za nastanak ablacije mrežnjače dovoljne za pristup ćelijama centralne mrežnjače, veličinom kanile koja se koristi za isporuku kompozicije rAAV i sposobnošću da se bezbedno očuva pozicija kanile iz otkrića.
[0171] U nekim otelotvorenjima otkrića, zapremina kompozicije koja je injektovana u subretinalni prostor mrežnjače je veća od približno bilo koje zapremine od 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl, 6 µl, 7 µl, 8 µl, 9 µl, 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl, ili 1 ml, ili bilo koje količine između.
[0172] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju primenu na oku (npr. subretinalnom i/ili intravitrealnom primenom) delotvorne količine rekombinantnih virusnih čestica koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom koji sadrži vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje oko 5 × 10<12>, 6 × 10<12>, 7 × 10<12>, 8 × 10<12>, 9 × 10<12>, 10 × 10<12>, 11 × 10<12>, 15 × 10<12>, 20 × 10<12>, 25 × 10<12>, 30 × 10<12>ili 50 × 10<12>genomskih kopija/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<12>do 6 × 10<12>, 6 × 10<12>do 7 × 10<12>, 7 × 10<12>do 8 × 10<12>, 8 × 10<12>do 9 × 10<12>, 9 × 10<12>do 10 × 10<12>, 10 × 10<12>do 11 × 10<12>, 11 × 10<12>do 15 × 10<12>, 15 × 10<12>do 20 × 10<12>, 20 × 10<12>do 25 × 10<12>, 25 × 10<12>do 30 × 10<12>, 30 × 10<12>do 50 × 10<12>ili 50 × 10<12>do 100 × 10<12>genomskih kopija/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<12>do 10 × 10<12>, 10 × 10<12>do 25 × 10<12>ili 25 × 10<12>do 50 × 10<12>genomskih kopija/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje oko 5 × 10<9>, 6 × 10<9>, 7 × 10<9>, 8 × 10<9>, 9 × 10<9>, 10 × 10<9>, 11 × 10<9>, 15 × 10<9>, 20 × 10<9>, 25 × 10<9>, 30 × 10<9>ili 50 × 10<9>transdukujućih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<9>do 6 × 10<9>, 6 × 10<9>do 7 × 10<9>, 7 × 10<9>do 8 × 10<9>, 8 × 10<9>do 9 × 10<9>, 9 × 10<9>do 10 × 10<9>, 10 × 10<9>do 11 × 10<9>, 11 × 10<9>do 15 × 10<9>, 15 × 10<9>do 20 × 10<9>, 20 × 10<9>do 25 × 10<9>, 25 × 10<9>do 30 × 10<9>, 30 × 10<9>do 50 × 10<9>ili 50 × 10<9>do 100 × 10<9>transdukujućih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<9>do 10 × 10<9>, 10 × 10<9>do 15 × 10<9>, 15 × 10<9>do 25 × 10<9>ili 25 × 10<9>do 50 × 10<9>transdukujućih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje bilo šta od oko 5 × 10<10>, 6 × 10<10>, 7 × 10<10>, 8 × 10<10>, 9 × 10<10>, 10 × 10<10>, 11 × 10<10>, 15 × 10<10>, 20 × 10<10>, 25 × 10<10>, 30 × 10<10>, 40 × 10<10>ili 50 × 10<10>infektivnih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje bilo šta od oko 5 × 10<10>do 6 × 10<10>, 6 × 10<10>do 7 × 10<10>, 7 × 10<10>do 8 × 10<10>, 8 × 10<10>do 9 × 10<10>, 9 × 10<10>do 10 × 10<10>, 10 × 10<10>do 11 × 10<10>, 11 × 10<10>do 15 × 10<10>, 15 × 10<10>do 20 × 10<10>, 20 × 10<10>do 25 × 10<10>, 25 × 10<10>do 30 × 10<10>, 30 × 10<10>do 40 × 10<10>, 40 × 10<10>do 50 × 10<10>ili 50 × 10<10>do 100 × 10<10>infektivnih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje bilo šta od oko 5 × 10<10>do 10 × 10<10>, 10 × 10<10>do 15 × 10<10>, 15 × 10<10>do 25 × 10<10>ili 25 × 10<10>do 50 × 10<10>infektivnih jedinica/ml.
[0173] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju primenu na oku (npr. subretinalnom i/ili intravitrealnom primenom) pojedinca (npr. čoveka) delotvorne količine rekombinantnih virusnih čestica koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom. U nekim otelotvorenjima, doza virusnih čestica koje se primenjuju na pojedincu je najmanje oko 1 × 10<8>do oko 1 × 10<13>genomskih kopija/kg telesne težine. U nekim otelotvorenjima, doza virusnih čestica koje se primenjuju na pojedincu je oko 1 × 10<8>do oko 1 × 10<13>genomskih kopija/kg telesne težine.
[0174] Može da se stvori jedan ili više (npr.2, 3 ili više) mehurića. Uopšteno, ukupna zapremina jednog ili više mehurića stvorenih postupcima i sistemima iz otkrića ne može da prekorači zapreminu tečnosti oka, na primer oko 4 ml kod uobičajenog ljudskog ispitanika. Ukupna zapremina svakog pojedinačnog mehurića može biti najmanje oko 0,3 ml, ili najmanje oko 0,5 ml, kako bi se omogućila ablacija mrežnjače dovoljne veličine za izlaganje ćelijskih vrsta centralne mrežnjače i stvaranje mehurića koji je dovoljno pouzdan za optimalnu manipulaciju. Osoba sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci će razumeti da se prilikom stvaranja mehurića u skladu sa postupcima i sistemima iz otkrića mora održati odgovarajući intraokularni pritisak kako bi se izbeglo oštećenje struktura oka. Veličina svakog pojedinačnog mehurića može biti, na primer, oko 0,5 do oko 1,2 ml, oko 0,8 do oko 1,2 ml, oko 0,9 do oko 1,2 ml, oko 0,9 do oko 1,0 ml, oko 1,0 do oko 2,0 ml, oko 1,0 do oko 3,0 ml. Tako, u jednom primeru, kako bi se injektovalo ukupno 3 ml suspenzije kompozicije rAAV, može se uspostaviti 3 mehurića, svaki od oko 1 ml. Ukupna zapremina svih mehurića u kombinaciji može biti, na primer, oko 0,5 do oko 3,0 ml, oko 0,8 do oko 3,0 ml, oko 0,9 do oko 3,0 ml, oko 1,0 do oko 3,0 ml, oko 0,5 do oko 1,5 ml, oko 0,5 do oko 1,2 ml, oko 0,9 do oko 3,0 ml, oko 0,9 do oko 2,0 ml, oko 0,9 do oko 1,0 ml.
[0175] Kako bi se bezbedno i delotvorno transdukovale oblasti ciljne mrežnjače (npr. centralne mrežnjače) van granica prvobitne lokacije mehurića, mehurićem može da se upravlja radi repozicioniranja mehurića na ciljnu oblast za transdukciju. Upravljanje mehurićem može da se odigra zahvaljujući zavisnosti mehurića koji nastaje od zapremine mehurića, pomeranja oka koje sadrži mehurić, pomeranja glave čoveka sa okom ili očima koje sadrže jedan ili više mehurića i/ili razmene tečnost-vazduh. To je naročito relevantno za centralnu mrežnjaču, pošto ta oblast obično odoleva ablaciji putem subretinalne injekcije. U nekim otelotvorenjima, razmena tečnost-vazduh se koristi za repozicioniranje mehurića; tečnost iz infuzione kanile se privremeno zamenjuje vazduhom, npr. iz uduvavanja vazduha na površinu mrežnjače. Kada zapremina vazduha pomera tečnost staklaste šupljine sa površine mrežnjače, tečnost u staklastoj šupljini može da isteče kroz kanilu. Privremeni nedostatak pritiska tečnosti staklaste šupljine uzrokuje da se mehurić pomeri i gravitira ka zavisnom delu oka. Odgovarajućim pozicioniranjem očne jabučice, mehurićem subretinalne kompozicije rAAV se upravlja da zahvati susedne oblasti (npr. makula i/ili fovea). U nekim slučajevima, masa mehurića je dovoljna da dovede do toga da on gravitira, čak i bez upotrebe razmene tečnost-vazduh. Kretanje mehurića do željene lokacije može dalje da se olakša promenom pozicije ispitanikove glave, kako bi se omogućilo da mehurić gravitira ka željenoj lokaciji u oku. Nakon što je postignuta željena konfiguracija mehurića, tečnost se vraća u staklastu šupljinu. Tečnost je odgovarajuća tečnost, npr. svež fiziološki rastvor. Uopšteno, subretinalna kompozicija rAAV može biti ostavljena in situ bez retinopeksije do retinotomije i bez intraokularne tamponade, i mrežnjača će se spontano ponovo pričvrstiti u roku od 48 sati.
[0176] Bezbednom i delotvornom transdukcijom okularnih ćelija (npr. RPE i/ili focoreceptorskih ćelija iz, npr. makule i/ili fovee) vektorom koji sadrži terapeutski polipeptid ili sekvencu RNK, postupci iz otkrića mogu da se koriste za lečenje pojedinca, npr. čoveka, koji ima poremećaj oka, pri čemu transdukovane ćelije proizvode terapeutski polipeptid ili sekvencu RNK u količini koja je dovoljna za lečenje poremećaja oka. U nekim slučajevima, transdukcija očnih ćelija je poboljšana koristeći čestice rAAV (npr. čestice rAAV2, rAAVrh8R, itd.) koje sadrže proteine AAV kapsida koji sadrže jednu ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG (npr. inhibiraju ili ukidaju vezivanje za HSPG). U pronalasku, čestice rAAV pokazuju smanjeno vezivanje za HSPG; npr. smanjeno za više od oko 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, ili bilo koji broj između. U nekim otelotvorenjima, vezivanje rAAV za HSPG je smanjeno za oko 5% do oko 100%, za oko 10% do oko 50%, za oko 10% do oko 30%, za oko 25% do oko 75%, za oko 25% do oko 50%, ili za oko 30% do oko 50%.
[0177] Primenjuje se delotvorna količina rAAV (u nekim otelotvorenjima u obliku čestica) u zavisnosti od ciljeva lečenja. Na primer, kada pomoću malog procenta transdukcije može da se postigne željeno terapeutsko dejstvo, cilj lečenja je onda generalno da se dostigne ili premaši ovaj nivo transdukcije. U nekim slučajevima, ovaj nivo transdukcije može da se postigne transdukcijom od samo oko 1 do 5% ciljnih ćelija, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 20% ćelija željene vrste tkiva, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 50%, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 80%, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 95%, u nekim otelotvorenjima najmanje oko 99% ćelija željene vrste tkiva. Kao što je prethodno razmotreno, supstitucije jedne ili više aminokiselina iz kapsida rAAV koje interaguju sa HSPG poboljšavaju transdukciju rAAV. Kao smernica, broj čestica koje su primenjene po injekciji je uopšteno između oko 1x10<6>i oko 1x10<14>čestica, između oko 1x10<7>i 1x10<13>čestica, između oko 1x10<9>i 1x10<12>čestica ili oko 1x10<11>čestica. Kompozicija rAAV može da se primenjuje pomoću jedne ili više subretinalnih injekcija, bilo tokom iste procedure ili sa razmakom od nekoliko dana, nedelja, meseci ili godina. U nekim otelotvorenjima, za lečenje čoveka može se koristiti više vektora.
[0178] U nekim slučajevima, primena na mrežnjači delotvorne količine virusnih čestica rAAV koje sadrže kapsid rAAV sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG transdukuje fotoreceptorske ćelije na mestu primene ili blizu njega. U nekim otelotvorenjima, transdukovano je više od oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili 100% fotoreceptorskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, transdukovano je oko 5% do oko 100%, oko 10% do oko 50%, oko 10% do oko 30%, oko 25% do oko 75%, oko 25% do oko 50% ili oko 30% do oko 50% fotoreceptorskih ćelija. Postupci za identifikaciju fotoreceptorskih ćelija koje su transdukovane virusnim česticama AAV koje sadrže kapsid rAAV sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG su poznati u struci; na primer, imunohistohemija ili upotreba markera kao što je pojačano zeleni fluorescentni protein mogu da se koriste za detekciju transdukcije virusnih čestica koje sadrže kapsid rAAV sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG.
[0179] U nekim otelotvorenjima otkrića, postupci obuhvataju primenu na subretini sisara (npr. subretinalnom prostoru) delotvorne količine virusnih čestica AAV koje sadrže kapsid rAAV sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG radi lečenja pojedinca sa poremećajem oka, npr. čoveka sa poremećajem oka. U nekim slučajevima, kompozicija je injektovana na jednu ili više lokacija u subretini kako bi se omogućila ekspresija heterologne nukleinske kiseline u fotoreceptorskim ćelijama. U nekim slučajevima, kompozicija je injektovana na jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, ili više od deset lokacija u subretini.
[0180] U nekim slučajevima, virusne čestice rAAV koje sadrže kapsid rAAV sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG su primenjene na više od jedne lokacije istovremeno ili redom. U nekim slučajevima, više injekcija virusnih čestica rAAV je razdvojeno za najviše jedan sat, dva sata, tri sata, četiri sata, pet sati, šest sati, devet sati, dvanaest sati ili 24 sata.
Postupci intravitrealne injekcije
[0181] U ovom pronalasku, primena se vrši u subretinu.
[0182] Opšti postupak za intravitrealnu injekciju može da se ilustruje pomoću sledećeg kratkog prikaza. Ovaj primer treba samo da ilustruje određene karakteristike postupka, i ne treba ga tumačiti kao ograničavajući. Procedure za intravitrealnu injekciju su poznate u struci (vidite, npr. Peyman, G.A., et al. (2009) Retina 29(7):875-912 i Fagan, X.J. i Al-Qureshi, S. (2013) Clin. Experiment. Ophthalmol. 41(5):500-7).
[0183] Ukratko, ispitanik može da se pripremi za intravitrealnu injekciju širenjem zenica, sterilizacijom oka i primenom anestetika. Bilo koji pogodan mijadrijatički agens koji je poznat u struci može da se koristi za širenje zenica. Odgovarajuće širenje zenica može da se potvrdi pre lečenja. Sterilizacija može da se postigne nanošenjem sterilišućeg leka za oko, npr. rastvora koji sadrži jod, kao što je povidon jod (BETADINE®). Sličan rastvor takođe može da se koristi za čišćenje kapka, trepavica i bilo kog drugog okolnog tkiva (npr. kože). Može da se koristi bilo koji odgovarajući anestetik, kao što je lidokain ili proparakain, sa bilo kojom odgovarajućom koncentracijom. Anestetik može da se primeni bilo kojim postupkom koji je poznat u struci, uključujući, bez ograničenja, topikalne kapi, gelove ili želee, i subkonjuktivnu primenu anestetika.
[0184] Pre injekcije, sterilisani spekulum za trepavice može da se koristi za uklanjanje trepavica iz oblasti. Mesto injekcije može da se označi špricem. Mesto injekcije može da se izabere na osnovu sočiva pacijenta. Na primer, mesto injekcije može biti 3-3,5 mm od limbusa kod pacijenata sa pseudofakijom ili afakijom, a 3,5-4 mm od limbusa kod pacijenata sa fakijom. Pacijent može da gleda u smeru suprotnom od mesta injekcije.
[0185] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju primenu na oku (npr. subretinalnom i/ili intravitrealnom primenom) delotvorne količine rekombinantnih virusnih čestica koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom koji sadrži vektor koji kodira heterolognu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje oko 5 × 10<12>, 6 × 10<12>, 7 × 10<12>, 8 × 10<12>, 9 × 10<12>, 10 × 10<12>, 11 × 10<12>, 15 × 10<12>, 20 × 10<12>, 25 × 10<12>, 30 × 10<12>ili 50 × 10<12>genomskih kopija/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<12>do 6 × 10<12>, 6 × 10<12>do 7 × 10<12>, 7 × 10<12>do 8 × 10<12>, 8 × 10<12>do 9 × 10<12>, 9 × 10<12>do 10 × 10<12>, 10 × 10<12>do 11 × 10<12>, 11 × 10<12>do 15 × 10<12>, 15 × 10<12>do 20 × 10<12>, 20 × 10<12>do 25 × 10<12>, 25 × 10<12>do 30 × 10<12>, 30 × 10<12>do 50 × 10<12>ili 50 × 10<12>do 100 × 10<12>genomskih kopija/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<12>do 10 × 10<12>, 10 × 10<12>do 25 × 10<12>ili 25 × 10<12>do 50 × 10<12>genomskih kopija/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje oko 5 × 10<9>, 6 × 10<9>, 7 × 10<9>, 8 × 10<9>, 9 × 10<9>, 10 × 10<9>, 11 × 10<9>, 15 × 10<9>, 20 × 10<9>, 25 × 10<9>, 30 × 10<9>ili 50 × 10<9>transdukujućih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<9>do 6 × 10<9>, 6 × 10<9>do 7 × 10<9>, 7 × 10<9>do 8 × 10<9>, 8 × 10<9>do 9 × 10<9>, 9 × 10<9>do 10 × 10<9>, 10 × 10<9>do 11 × 10<9>, 11 × 10<9>do 15 × 10<9>, 15 × 10<9>do 20 × 10<9>, 20 × 10<9>do 25 × 10<9>, 25 × 10<9>do 30 × 10<9>, 30 × 10<9>do 50 × 10<9>ili 50 × 10<9>do 100 × 10<9>transdukujućih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je oko 5 × 10<9>do 10 × 10<9>, 10 × 10<9>do 15 × 10<9>, 15 × 10<9>do 25 × 10<9>ili 25 × 10<9>do 50 × 10<9>transdukujućih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje bilo šta od oko 5 × 10<10>, 6 × 10<10>, 7 × 10<10>, 8 × 10<10>, 9 × 10<10>, 10 × 10<10>, 11 × 10<10>, 15 × 10<10>, 20 × 10<10>, 25 × 10<10>, 30 × 10<10>, 40 × 10<10>ili 50 × 10<10>infektivnih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje bilo šta od oko 5 × 10<10>do 6 × 10<10>, 6 × 10<10>do 7 × 10<10>, 7 × 10<10>do 8 × 10<10>, 8 × 10<10>do 9 × 10<10>, 9 × 10<10>do 10 × 10<10>, 10 × 10<10>do 11 × 10<10>, 11 × 10<10>do 15 × 10<10>, 15 × 10<10>do 20 × 10<10>, 20 × 10<10>do 25 × 10<10>, 25 × 10<10>do 30 × 10<10>, 30 × 10<10>do 40 × 10<10>, 40 × 10<10>do 50 × 10<10>ili 50 × 10<10>do 100 × 10<10>infektivnih jedinica/ml. U nekim otelotvorenjima, virusni titar kompozicije je najmanje bilo šta od oko 5 × 10<10>do 10 × 10<10>, 10 × 10<10>do 15 × 10<10>, 15 × 10<10>do 25 × 10<10>ili 25 × 10<10>do 50 × 10<10>infektivnih jedinica/ml.
[0186] U nekim slučajevima, postupci obuhvataju primenu na oku (npr. subretinalnom i/ili intravitrealnom primenom) pojedinca (npr. čoveka) delotvorne količine rekombinantnih virusnih čestica koje sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom. U nekim slučajevima, doza virusnih čestica koje se primenjuju na pojedincu je najmanje oko 1 × 10<8>do oko 1 × 10<13>genomskih kopija/kg telesne težine. U nekim slučajevima, doza virusnih čestica koje se primenjuju na pojedincu je oko 1 × 10<8>do oko 1 × 10<13>genomskih kopija/kg telesne težine.
[0187] Prilikom injekcije, igla može da se umetne pod pravim uglom u odnosu na beonjaču, i usmerena ka centru oka. Igla može da se umetne tako da se vrh završava u staklastom telu, a ne u subretinalnom prostoru. Za injekciju može da se koristi bilo koja odgovarajuća zapremina poznata u struci. Nakon injekcije, oko može da se tretira agensom za sterilizaciju, kao što je antibiotik. Oko takođe može da se ispere kako bi se uklonio višak agensa za sterilizaciju.
Struktura mrežnjače i sredstva za određivanje delotvornosti isporuke rAAV
[0188] Poznato je da mrežnjača sadrži više slojeva. Ćelijski slojevi u mrežnjači mogu da uključuju slojeve unutrašnje ograničavajuće membrane, nervnog vlakna, ganglijskih ćelija, unutrašnji pleksiformni, unutrašnji nuklearni, spoljašnji pleksiformni, spoljašnji nuklearni, spoljašnje ograničavajuće membrane, fotoreceptorski i pigmentovani epitel retine. Sloj koji je najbliži staklastom telu je unutrašnja ograničavajuća membrana. Sloj može da sadrži
1
Milerove ćelije, koje su klasa glija. Nervno vlakno može da sadrži aksone iz ganglijskih ćelija koje grade optički nerv. Sloj ganglijskih ćelija može da uključuje ganglijske ćelije i amakrine ćelije. Sloj unutrašnje pleksiforme može da sadrži sinapse između dendrita ganglijskih i amakrinih ćelija i aksona bipolarnih ćelija. Unutrašnji nuklearni sloj može da sadrži ćelijska jedra amakrinih, bipolarnih i horizontalnih ćelija. Sloj spoljašnje pleksiforme može da sadrži sinapse između dendrita horizontalnih ćelija i projekcija fotoreceptorskih ćelija. Spoljašnji nuklearni sloj može da sadrži tela fotoreceptorskih ćelija. Eksterna ili spoljašnja ograničavajuća membrana može da uključuje ćelijske veze, kao što su adhezivni spojevi i dezmozomi, među apikalnim procesima Milerovih ćelija i između tih procesa i unutrašnjih segmenata fotoreceptorskih ćelija. Fotoreceptorski sloj, poznat i kao sloj štapića i čepića i Džejkobova membrana, može da sadrži fotoreceptorske ćelije, uključujući štapiće i čepiće. Retinalni sloj koji je najudaljeniji od staklastog tela je pigmentovani epitel retine (RPE), koji može da sadrži sloj šestougaonih epitelnih ćelija koje sadrže granule pigmenta.
[0189] Takođe je poznato da mrežnjača sadrži mnogo različitih vrsta ćelija. Retinalni neuroni mogu da uključuju fotoreceptorske ćelije, bipolarne ćelije, ganglijske ćelije, amakrine ćelije i horizontalne ćelije. Fotoreceptorske ćelije su osetljive na svetlost. One mogu da osete svetlo i reaguju emitovanjem signala u optički nerv putem bipolarnih ćelija i ganglijskih ćelija.
Fotoreceptorske ćelije mogu da uključuju ćelije štapića, koje uobičajeno osećaju svetlo u uslovima niskog osvetljenja, i ćelije čepića, koje uopšteno osećaju boju i snažniju svetlost. Bipolarne ćelije mogu da primaju inpute iz fotoreceptorske ćelije i sinapsom ih šalju do amakrinih i ganglijskih ćelija. Ganglijske ćelije mogu da primaju informacije od amakrinih ćelija ili horizontalnih ćelija, i njihovi aksoni grade optički nerv. Horizontalne ćelije mogu da integrišu inpute iz više fotoreceptora, i pomažu u prilagođavanju na nivoe svetlosti. Amakrine ćelije su interneuroni koji pomažu u regulisanju bipolarnih ćelija i pružaju inpute za ganglijske ćelije. Glijalne ćelije mrežnjače mogu da uključuju Milerove ćelije, astroglije i mikroglije.
[0190] Delotvornost isporuke rAAV pomoću subretinalne ili intravitrealne injekcije može da se prati pomoću nekoliko kriterijuma, kako je ovde opisano. Na primer, nakon tretiranja ispitanika koristeći postupke iz predmetnog otkrića, ispitanik može da se proceni npr. na poboljšanje i/ili stabilizaciju i/ili odlaganje progresije jednog ili više znakova ili simptoma bolesti putem jednog ili više kliničkih parametara, uključujući one koji su ovde opisani. Primeri takvih testova su poznati u struci, i uključuju objektivne kao i subjektivne mere (npr.
2
koje prijavljuje ispitanik). Na primer, za merenje delotvornosti lečenja za funkciju vida ispitanika može da se proceni jedno ili više od sledećeg: ispitanikov subjektivni kvalitet vida ili poboljšana funkcija centralnog vida (npr. poboljšanje ispitanikove sposobnosti da tečno čita i da prepoznaje lica), ispitanikova mobilnost vida (npr. smanjeno vreme koje je potrebno za kretanje kroz lavirint), oštrina vida (npr. poboljšanje ispitanikovog rezultata LogMAR), mikroperimetrija (npr. poboljšanje ispitanikovog dB rezultata), perimetrija nakon prilagođavanja na mrak (npr. poboljšanje ispitanikovog dB rezultata), mapiranje fine matrice (npr. poboljšanje ispitanikovog dB rezultata), Goldmanova perimetrija (npr. smanjenje veličine skotomatozne oblasti (tj. oblasti slepila) i poboljšana sposobnost rešavanja manjih ciljeva), osetljivost na treptanje (npr. poboljšanje u hercima), autofluorescencija i elektrofiziološka merenja (npr. poboljšanje u ERG). U nekim otelotvorenjima, funkcija vida se meri pomoću ispitanikove mobilnosti vida. U nekim otelotvorenjima, funkcija vida se meri pomoću ispitanikove oštrine vida. U nekim otelotvorenjima, funkcija vida se meri pomoću mikroperimetrije. U nekim otelotvorenjima, funkcija vida se meri pomoću perimetrije nakon prilagođavanja na mrak. U nekim otelotvorenjima, funkcija vida se meri pomoću ERG. U nekim otelotvorenjima, funkcija vida se meri pomoću ispitanikovog subjektivnog kvaliteta vida.
[0191] U slučaju bolesti koje dovode do progresivno degenerativne funkcije vida, lečenje ispitanika u ranom dobu može dovesti ne samo do usporavanja ili zaustavljanja progresije bolesti, već može ublažiti ili sprečiti gubitak funkcije vida usled stečene ambliopije. Mogu postojati dva tipa ambliopije. U studijama kod nehumanih primata i mačića koji se drže u potpunom mraku od rođenja sve do nekoliko meseci starosti, životinje su čak i kada se potom izlože svetlosti funkcionalno nepovratno slepe, iako imaju funkcionalne signale koje šalje mrežnjača. Do tog slepila dolazi jer su neuronske veze i „obrazovanje“ korteksa razvojno zaustavljeni od rođenja usled prekida stimulusa. Nije poznato da li ova funkcija ikad može da se povrati. U slučaju bolesti degeneracije retine, normalna kola vizuelnog korteksa su inicijalno „naučena“ ili razvojno prikladna sve do trenutka u kome degeneracija stvara značajnu disfunkciju. Gubitak vizuelnog stimulansa vezanog za signalizaciju u disfunkcionalnom oku dovodi do „stečene“ ili „naučene“ disfunkcije („stečena ambliopija“), što dovodi do nesposobnosti mozga da tumači signale, ili da „koristi“ to oko. Kod ovih slučajeva „stečene ambliopije“, nije poznato da li bi uz pomoć poboljšane signalizacije iz mrežnjače usled genske terapije ambliopičnog oka uopšte moglo da dođe do vraćanja normalnije funkcije uz usporavanje progresije ili stabilizaciju bolesti. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 30 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 20 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 18 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 15 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 14 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 13 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 12 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 10 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 8 godina. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči je mlađi od 6 godina.
[0192] Kod nekih poremećaja oka, postoji fenomen „ćelije dadilje“ kada poboljšanje funkcije jedne vrste ćelija poboljšava funkciju druge. Na primer, transdukcija RPE centralne mrežnjače pomoću rAAV iz otkrića može zatim da poboljša funkciju štapića, a, zauzvrat, poboljšana funkcija štapića dovodi do poboljšane funkcije čepića. Shodno tome, tretiranje jedne vrste ćelija može dovesti do poboljšanja funkcije kod druge.
[0193] Odabir konkretnog vektora rAAV i kompozicije zavisi od brojnih različitih faktora, uključujući, bez ograničenja, zdravstvenu istoriju pojedinačnog čoveka i karakteristike stanja i pojedinca koji se leči. Procena takvih karakteristika i osmišljavanje odgovarajućeg terapeutskog režima na kraju je odgovornost nadležnog lekara.
[0194] U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči ima genetski poremećaj oka, ali još nije ispoljio kliničke znake ili simptome. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči ima poremećaj oka. U nekim otelotvorenjima, čovek koji se leči ispoljio je jedan ili više znakova ili simptoma poremećaja oka.
[0195] Neograničavajući primeri poremećaja oka koji mogu da se leče sistemima i postupcima iz otkrića uključuju: autozomnu recesivnu tešku ranu degeneraciju mrežnjače (Leberova kongenitalna amauroza), kongenitalnu ahromatopsiju, Stargartovu bolest, Bestovu bolest, Dojnovu bolest, distrofiju čepića, retinitis pigmentozu, X-vezanu retinošizu, Ušerov sindrom, senilnu degeneraciju makule, atrofijsku senilnu degenereciju makule, neovaskularnu AMD, dijabetičku makulopatiju, proliferativnu dijabetičku retinopatiju (PDR), cistoidni edem makule, centralnu seroznu retinopatiju, ablaciju mrežnjače, intraokularnu inflamaciju, glaukom, posteriorni uveitis, horoidermiju i Leberovu naslednu optičku neuropatiju.
4
[0196] Kompozicije iz otkrića (npr. virusne čestice AAV za subretinalnu ili intravitrealnu isporuku koje sadrže kapsid AAV sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija koje interaguju sa HSPG na jednoj ili više pozicija koje odgovaraju aminokiselinama 484, 487, 532, 585 ili 588) mogu da se koriste samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agensa za lečenje poremećaja oka. Interval između redne primene može biti reda veličine od najmanje (ili, alternativno, manje od) minuta, sati ili dana.
[0197] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više terapeutskih agensa može da se primeni na subretinu ili staklasto telo (npr. intravitrealnom primenom). Neograničavajući primeri dodatnih terapeutskih agensa uključuju polipeptidne neurotrofne faktore (npr. GDNF, CNTF, BDNF, FGF2, PEDF, EPO), polipeptidne antiangiogene faktore (npr. sFlt, angiostatin, endostatin), na primer, antiangiogene nukleinske kiseline na VEGF, antiangiogene morfoline, na primer, antiangiogene morfoline na VEGF, antiangiogena antitela i/ili fragmente antitela (npr. fragmenti Fab), na primer antiangiogena antitela i/ili fragmenti antitela na VEGF.
V. Ekspresioni konstrukti
[0198] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko putem subretinalne isporuke vektora rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i pri čemu je vektor rAAV enkapsidovan u rAAV kapsidu (npr. kapsid rAAV2, kapsid rAAVrh8R, itd.) koji sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za lečenje poremećaja CNS kod pojedinca, koji obuhvataju isporuku kompozicije koja sadrži čestice rAAV u CNS pojedinca, pri čemu čestice rAAV sadrže (a) kapsid rAAV koji sadrži protein rAAV kapsida koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i (b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV. U nekim otelotvorenjima, heterologna nukleinska kiselina (npr. transgen) je operativno povezana sa promoterom. Primeri za promotere uključuju, ali nisu ograničeni na, neposredni rani promoter citomegalovirusa (CMV), RSV LTR, MoMLV LTR, promoter fosfoglicerat kinaze-1 (PGK), promoter simijan virusa 40 (SV40) i promoter CK6, transtiretinski promoter (TTR), TK promoter, tetraciklinski responsivni promoter (TRE), HBV promoter, hAAT promoter, LSP promoter, himerni promoter specifičan za jetru (LSP), E2F promoter, promoter telomeraze (hTERT); promoter pojačivača citomegalovirusa/kokošjeg beta-aktina/zečjeg βglobina (CAG promoter; Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9) i promoter faktora elongacije 1-alfa (EFI-alpha) (Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 i Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). U nekim otelotvorenjima, promoter obuhvata promoter humane βglukuronidaze ili pojačavač citomegalovirusa povezan sa promoterom β-aktina kokoške (CBA). Promoter može biti konstitutivni, inducibilni ili represibilni promoter. U nekim otelotvorenjima, promoter može da eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u ćeliji oka. U nekim otelotvorenjima, promoter može da eksprimira heterolognu nukleinsku kiselinu u fotoreceptorskim ćelijama ili RPE. U otelotvorenjima, promoter je promoter rodopsin kinaze (RK); npr. humani promoter RK. U nekim otelotvorenjima, promoter je promoter opsina, npr. promoter humanog opsina ili promoter mišjeg opsina.
[0199] Predmetno otkriće razmatra upotrebu rekombinantnog virusnog genoma za uvođenje jedne ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju terapeutski polipeptid i/ili nukleinsku kiselinu za pakovanje u virusnu česticu rAAV koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje interaguju sa HSPG. Rekombinantni virusni genom može da obuhvata bilo koji element za uspostavljanje ekspresije terapeutskog polipeptida i/ili nukleinske kiseline, na primer, promoter, ITR, element za vezivanje ribozoma, terminator, pojačivač, selekcioni marker, intron, polyA signal i/ili poreklo replikacije.
[0200] U nekim otelotvorenjima, vektor rAAV je samokomplementarni vektor rAAV, npr. onaj koji sadrži rekombinantni samokomplementirajući (termin „samokomplementarni“ ovde može da se koristi naizmenično) genom. Virusne čestice AAV sa samokomplementirajućim genomima i postupci za samokomplementaciju genoma AAV opisani su u US patentima br.
6,596,535; 7,125,717; 7,465,583; 7,785,888; 7,790,154; 7,846,729; 8,093,054; i 8,361,457; i Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111.
rAAV koji sadrži samokomplementirajući genom će brzo graditi molekul dvolančane DNK zahvaljujući delimično komplementnim sekvencama (npr. komplementni kodirajući i nekodirajući lanci transgena). U nekim otelotvorenjima, vektor sadrži prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterolognu nukleinsku kiselinu i drugu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira komplement nukleinske kiseline, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline može da gradi unutarlančane bazne parove sa drugom sekvencom nukleinske kiseline duž njenog većeg dela ili celokupne dužine.
[0201] U nekim otelotvorenjima, prva sekvenca heterologne nukleinske kiseline i druga sekvenca heterologne nukleinske kiseline su povezane putem mutiranog ITR (npr. desni ITR). U nekim otelotvorenjima, ITR sadrži polinukleotidnu sekvencu 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCC CACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (SEQ ID NO:8). Mutirani ITR sadrži deleciju D regiona koji sadrži sekvencu terminalne rezolucije. Usled toga, prilikom replikacije virusnog genoma AAV, rep proteini neće otcepljivati virusni genom na mutiranom ITR, te će tako rekombinantni virusni genom koji sadrži sledeće u poretku 5' do 3' biti upakovan u virusni kapsid: AAV ITR, prva heterologna polinukleotidna sekvenca uključujući regulatorne sekvence, mutirani AAV ITR, drugi heterologni polinukleotid sa obrnutom orijentacijom u odnosu na prvi heterologni polinukleotid, i treći AAV ITR.
VI. Virusne čestice i postupci za proizvodnju virusnih čestica
Virusne čestice rAAV
[0202] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke za isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko putem subretinalne isporuke vektora rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu, i pri čemu je vektor rAAV enkapsidovan u kapsidu rAAV (npr. rAAV2, rAAVrh8R, itd.) koji sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina koje interaguju sa HSPG. U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje postupke i komplete povezane sa isporukom čestica rAAV u CNS pojedinca.
[0203] U nekim slučajevima, čestica rAAV sadrži vektor rAAV. U nekim otelotvorenjima, virusna čestica je čestica rekombinantnog AAV koja sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži heterologni transgen okružen sa jednim ili dva invertovana terminalna ponavljanja AAV (ITR). Nukleinska kiselina je enkapsidovana u čestici AAV. Čestica AAV takođe sadrži kapsidne proteine. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina sadrži kodirajuće sekvence od interesa (npr. heterologni transgen), operativno povezane komponente u smeru transkripcije, kontrolne sekvence, uključujući sekvence za inicijaciju i prekid transkripcije, čime nastaje ekspresiona kaseta.
[0204] Ekspresiona kaseta je na 5' i 3' okružena sekvencama najmanje jednog funkcionalnog AAV ITR. Pod „funkcionalnim sekvencama AAV ITR“ podrazumeva se da ITR sekvence funkcionišu kako je nameravano za izdvajanje, replikaciju i pakovanje viriona AAV. Vidite Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; i Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16.
[0205] Za praktikovanje nekih aspekata pronalaska, rekombinantni vektori sadrže najmanje sve sekvence AAV koje su ključne za enkapsidaciju i fizičke strukture za infekciju putem rAAV. AAV ITR za upotrebu u vektorima iz otkrića ne moraju da imaju nukleotidnu sekvencu divljeg tipa (npr. kako je opisano u Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), i mogu da se izmene insercijom, delecijom ili supstitucijom nukleotida, ili AAV ITR mogu da se dobiju iz bilo kog od nekoliko AAV serotipa. Trenutno je poznato više od 40 serotipa AAV, pri čemu se i dalje identifikuju novi serotipovi i varijante postojećih serotipa. Vidite Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; i Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810.
[0206] U nekim otelotvorenjima, vektor rAAV je vektor dobijen od serotipa AAV, uključujući, bez ograničenja, AAV ITR koji su AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV ITR i slično. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži ITR od AAV ITR koji su AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV, ili mišji AAV ili slično. U određenim otelotvorenjima, nukleinska kiselina u AAV sadrži AAV2 ITR. Kao što je prethodno opisano, čestice rAAV sadrže rAAV2 kapsid koji sadrži proteine rAAV2 kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom.
[0207] U nekim otelotvorenjima, vektor može da uključuje nukleinsku kiselinu punilo. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina može da kodira zeleni fluorescentni protein. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina punilo može biti locirana između promotera i nukleinske kiselina koja kodira RNKi.
[0208] Različiti serotipovi AAV su korišćeni za optimizaciju transdukcije određenih ciljnih ćelija ili za ciljanje specifičnih vrsta ćelija u određenom ciljnom tkivu (npr. tkivu CNS). Čestica rAAV može da sadrži virusne proteine i virusne nukleinske kiseline istog serotipa ili mešovitog serotipa. Na primer, u nekim otelotvorenjima, čestica rAAV može da sadrži proteine AAV2 kapsida iz otkrića i najmanje jedno AAV2 ITR ili može da sadrži proteine AAV2 kapsida i najmanje jedno AAV1 ITR. U ovom pronalasku, rAAV čestica sadrži rAAV2 kapsid koji sadrži proteine rAAV2 kapsida.
Proizvodnja čestica AAV
[0209] U struci su poznati brojni postupci za proizvodnju vektora rAAV, uključujući transfekciju, proizvodnju stabilne ćelijske linije, i proizvodne sisteme za infektivni hibridni virus koji uključuju hibride adenovirus-AAV, hibride herpesvirus-AAV Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789) i hibride bakulovirus-AAV. proizvodne kulture rAAV za proizvodnju virusnih čestica rAAV zahtevaju; 1) prikladne ćelije domaćine, uključujući, na primer, humane ćelijske linije, kao što su HeLa, A549 ili 293 ćelije, ili ćelijske linije dobijene od insekata poput SF-9, u slučaju proizvodnih sistema bakulovirusa; 2) odgovarajuću funkciju pomoćničkog virusa koju pruža divlji tip ili mutantni adenovirus (kao što je adenovirus osetljiv na temperaturu), herpes virus, bakulovirus ili plazmidni konstrukt koji obezbeđuje pomoćne funkcije; 3) rep i cap gene i genske proizvode AAV; 4) transgen (kao što je terapeutski transgen) okružen sekvencama najmanje jednog AAV ITR; i 5) odgovarajući medijum i komponente medijuma za proizvodnju rAAV. Odgovarajući medijumi koji su poznati u struci mogu da se koriste za proizvodnju vektora rAAV. Ovi medijumi uključuju, bez ograničenja, medijume koje proizvode Hyclone Laboratories i JRH, uključujući modifikovani Iglov medijum (MEM), Dulbekov modifikovani Iglov medijum (DMEM), formulacije po meri, kao što su one opisane u U.S. patentu br.6,566,118, i Sf-900 II SFM medijumi kao što je opisano u U.S. patentu br.6,723,551, naročito u pogledu formulacija medijuma po meri za upotrebu u proizvodnji rekombinantnih vektora AAV.
[0210] Čestice rAAV mogu da se proizvedu koristeći postupke koji su poznati u struci. Vidite, npr. U.S. pat. br.6,566,118; 6,989,264; i 6,995,006. U praktikovanju otkrića, ćelije domaćini za proizvodnju čestica rAAV uključuju ćelije sisara, ćelije insekata, ćelije biljaka, mikroorganizme i kvasce. Ćelije domaćini takođe mogu da budu ćelije za pakovanje u kojima se rep i cap geni AAV stabilno održavaju u ćeliji domaćinu, ili proizvodne ćelije u kojima se genom vektora AAV stabilno održava. Primeri ćelija za pakovanje i proizvodnju su dobijeni od 293, A549 ili HeLa ćelija. Vektori AAV su prečišćeni i formulisani koristeći standardne tehnike poznate u struci.
[0211] U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV mogu da se proizvedu postupkom trostruke transfekcije, kao što je primer postupka trostruke transfekcije koji je dat u nastavku. Ukratko, plazmid koji sadrži rep gen i kapsidni gen, zajedno sa pomoćnim adenovirusnim plazmidom, može da se transficira (npr. koristeći postupak sa kalcijum fosfatom) u ćelijsku liniju (npr. HEK-293 ćelije), i virus može da se sakupi i opciono prečisti.
[0212] U nekim otelotvorenjima, čestice rAAV mogu da se proizvedu postupkom proizvodne ćelijske linije, poput primera postupka proizvodne ćelijske linije koji je dat u nastavku (vidite takođe (navedeno u Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269).
Ukratko, ćelijska linija (npr. HeLa ćelijska linija) može biti stabilno transficirana plazmidom koji sadrži rep gen, kapsidni gen i sekvencu promoterskog transgena. Ćelijske linije mogu da se pretraže kako bi se izabrao vodeći klon za proizvodnju rAAV, koji zatim može da se proširi na proizvodni bioreaktor i inficira adenovirusom (npr. adenovirus divljeg tipa) kao pomoćnikom za započinjanje proizvodnje rAAV. Virus nakon toga može da se sakupi, adenovirus može da se inaktivira (npr. toplotom) i/ili ukloni, a čestice rAAV mogu da se prečiste.
[0213] U nekim slučajevima, obezbeđen je postupak za proizvodnju bilo koje čestice rAAV, kako je ovde otkriveno, koji obuhvata (a) uzgajanje ćelije domaćina pod uslovom da se proizvode čestice rAAV, pri čemu ćelija domaćin sadrži (i) jedan ili više gena za pakovanje AAV, pri čemu svaki gen za pakovanje AAV kodira protein replikacije i/ili enkapsidacije AAV; (ii) provektor rAAV koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid i/ili nukleinsku kiselinu, kako je ovde opisano, okružen najmanje jednim AAV ITR i (iii) pomoćnu funkciju AAV; i (b) izolovanje čestica rAAV koje proizvodi ćelija domaćin. U
1
nekim slučajevima, navedeni najmanje jedan AAV ITR je izabran iz grupe koja se sastoji od AAV ITR koji su AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, kozji AAV, goveđi AAV ili mišji AAV ili slično. U nekim slučajevima, navedeni protein za enkapsidaciju sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom. U nekim slučajevima, protein za enkapsidaciju je protein za enkapsidaciju AAV2. U nekim slučajevima, protein za enkapsidaciju je protein za enkapsidaciju AAVrh8R.
[0214] Odgovarajući medijumi za proizvodnu kulturu rAAV iz predmetnog otkrića mogu biti dopunjeni serumom ili rekombinantnim proteinima dobijenim iz seruma sa nivoom od 0,5%-20% (V/V ili m/V). Alternativno, kao što je poznato u struci, vektori rAAV mogu da se proizvedu u uslovima bez seruma, što može da se naziva i medijumom bez proizvoda dobijenih od životinja. Osobi sa uobičajenim znanjem i veštinama u struci biće poznato da komercijalni ili prilagođeni medijumi za podršku proizvodnji vektora rAAV mogu biti dopunjeni sa jednom ili više komponenti ćelijske kulture koje su poznate u struci, uključujući, bez ograničenja, glukozu, vitamine, aminokiseline i/ili faktore rasta, kako bi se povećao titar rAAV u proizvodnim kulturama.
[0215] Proizvodne kulture rAAV mogu da se uzgajaju u različitim uslovima (u širokom temperaturnom rasponu, u različitim vremenskim periodima, i slično) koji su pogodni za konkretnu ćeliju domaćina koja se koristi. Kao što je poznato u struci, proizvodne kulture rAAV uključuju kulture koje zavise od vezivanja koje mogu da se uzgajaju u odgovarajućim sudovima zavisnim od vezivanja, kao što su, na primer, valjkaste boce, filteri sa šupljim vlaknima, mikronosači, i reaktori sa spakovanim slojem ili fluidizovanim slojem. Proizvodne kulture rAAV takođe mogu da uključe ćelije domaćine prilagođene suspenziji, kao što su HeLa, 293, i SF-9 ćelije koje se mogu uzgajati na razne načine uključujući, na primer, boce sa magnetnom mešalicom, bioreaktore sa mešanjem, i jednokratne sisteme, kao što je sistem sa talasastim kesama.
[0216] Čestice vektora rAAV iz otkrića mogu da se sakupe iz proizvodnih kultura rAAV putem lize ćelija domaćina iz proizvodne kulture ili sakupljanjem iscrpljenog medijuma iz proizvodne kulture, pod uslovom da se ćelije uzgajaju u uslovima za koje je poznato u struci da izazivaju otpuštanje čestica rAAV u medijum iz netaknutih ćelija, kako je detaljnije
1 1
opisano u U.S. patentu br.6,566,118). Odgovarajući postupci za liziranje ćelija su takođe poznati u struci, i uključuju, na primer, više ciklusa zamrzavanja/otapanja, sonikaciju, mikrofluidizaciju, i tretiranje hemikalijama, kao što su deterdženti i/ili proteaze.
[0217] U daljem otelotvorenju, čestice rAAV su prečišćene. Termin „prečišćeno“, kako se ovde koristi, obuhvata pripremu čestica rAAV koje nemaju barem neke od drugih komponenti koje takođe mogu biti prisutne kada se čestice rAAV javljaju u prirodi ili iz kojih se inicijalno pripremaju. Tako, na primer, izolovane čestice rAAV mogu da se pripreme koristeći tehniku prečišćavanja kako bi se obogatile iz izvorne smeše, kao što je lizat kulture ili supernatant proizvodne kulture. Obogaćivanje može da se meri različitim načinima, na primer, pomoću udela čestica otpornih na DNazu (DRP) ili genomskih kopija (gc) koje su prisutne u rastvoru, ili pomoću infektivnosti, ili može da se meri u odnosu na drugu, potencijalno ometajuću supstancu prisutnu u izvornoj smeši, kao što su kontaminanti, uključujući kontaminante iz proizvodne kulture ili kontaminante iz procesa, uključujući pomoćnički virus, komponente medijuma, i slično.
[0218] U nekim slučajevima, sakupljena proizvodna kultura rAAV je prečišćena kako bi se uklonio ćelijski otpad. U nekim slučajevima, sakupljena proizvodna kultura je prečišćena filtracijom kroz niz dubinskih filtera, uključujući, na primer, filter uložak klase DOHC Millipore Millistak+ HC, filter uložak klase A1HC Millipore Millistak+ HC i 0,2 µm filter sa hidrofilnom membranom Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC. Prečišćavanje takođe može da se postigne različitim drugim standardnim tehnikama koje su poznate u struci, kao što su centrifugiranje ili filtracija kroz bilo koji filter od celuloznog acetata sa porama od najmanje 0,2 µm koji je poznat u struci.
[0219] U nekim slučajevima, sakupljena proizvodna kultura rAAV je dalje tretirana pomoću Benzonase® kako bi se razgradila bilo koja DNK velike molekulske mase prisutna u proizvodnoj kulturi. U nekim slučajevima, digestija pomoću Benzonase® se vrši u standardnim uslovima koji su poznati u struci, uključujući, na primer, konačnu koncentraciju od 1-2,5 jedinica/ml Benzonase® na temperaturi u rasponu od temperature okruženja do 37°C u periodu od 30 minuta do nekoliko sati.
[0220] Čestice rAAV mogu da se izoluju ili prečiste koristeći jedan ili više od sledećih koraka prečišćavanja: ravnotežno centrifugiranje; filtraciju sa protočnom anjonskom
1 2
izmenom; filtraciju tangencijalnog protoka (TFF) za koncentrovanje čestica rAAV; hvatanje rAAV apatitnom hromatografijom; toplotnu inaktivaciju pomoćničkog virusa; hvatanje rAAV hromatografijom hidrofobne interakcije; pufersku izmenu hromatografijom na molekulskim sitima (SEC); nanofiltraciju; i hvatanje rAAV hromatografijom anjonske izmene, hromatografijom katjonske izmene ili afinitetnom hromatografijom. Ovi koraci mogu da se koriste samostalno, u različitim kombinacijama, ili različitim redosledom. U nekim slučajevima, postupak obuvata sve korake prema redosledu koji je opisan u nastavku. Postupci za prečišćavanje čestica rAAV mogu se naći, na primer, u Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; US patentima broj 6,989,264 i 8,137,948; i WO 2010/148143.
[0221] Ovde su takođe obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže česticu rAAV koja sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid i/ili terapeutsku nukleinsku kiselinu, pri čemu čestica rAAV sadrži kapsid rAAV koji sadrži jednu ili više supstitucija ili aminokiselina koje interaguju sa HSPG, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutske kompozicije mogu biti pogodne za bilo koji režim primene koji je ovde opisan; na primer, subretinalnu primenu.
[0222] U nekim otelotvorenjima, farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde opisani rAAV i farmaceutski prihvatljiv nosač su pogodne za primenu na čoveku. Takvi nosači su dobro poznati u struci (vidite, npr. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. izdanje, str.1035-1038 i 1570-1580). U nekim otelotvorenjima, farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde opisani rAAV i farmaceutski prihvatljiv nosač su pogodne za okularnu injekciju. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulje, uključujući one sa poreklom iz nafte, sa životinjskim, biljnim ili sintetičkim poreklom, kao što je kikirikijevo ulje, sojino ulje, mineralno ulje, i slično. Fiziološki rastvori i vodeni rastvori dekstroze, polietilen glikola (PEG) i glicerola takođe mogu da se koriste kao vodeni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Farmaceutska kompozicija može dalje da sadrži dodatne sastojke, na primer, konzervanse, pufere, agense za toničnost, antioksidanse i stabilizatore, nejonske kvašljivce ili agense za prečišćavanje, agense za povećanje viskoznosti, i slično. Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu da se pakuju u pojedinačne doze ili u višedozne oblike. Kompozicije su uopšteno formulisane kao sterilni i suštinski izotonični rastvor.
1
VII. Sistemi i kompleti
[0223] Kompozicije rAAV, kako su ovde opisane, mogu da se nalaze u sistemu koji je konstruisan za upotrebu u jednom od postupaka iz otkrića, kako je ovde opisano.
Subretinalna isporuka
[0224] U nekim slučajevima, otkriće obezbeđuje sistem za subretinalnu isporuku vektora u oko pojedinca, koji obuhvata a) kompoziciju koja sadrži delotvornu količinu čestica rAAV, pri čemu i) protein kapsida čestica rAAV sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija koje interaguju sa heparan sulfat proteoglikanom, i ii) vektor sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski polipeptid ili terapeutsku RNK i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV; i b) sredstvo za retinalnu isporuku rAAV.
[0225] Uopšteno, sistem sadrži kanilu sa finom iglom, pri čemu je kanila veličine 27 do 45, jedan ili više špriceva (npr.1, 2, 3, 4 ili više), i jednu ili više tečnosti (npr.1, 2, 3, 4 ili više) odgovarajućih za upotrebu u postupcima iz otkrića.
[0226] Kanila sa finom iglom je pogodna za subretinalnu injekciju suspenzije vektora i/ili drugih tečnosti koje treba da se injektuju u subretinalni prostor. U nekim slučajevima, kanila je veličine 27 do 45. U nekim slučajevima, kanila sa finom iglom je veličine 35-41. U nekim slučajevima, kanila sa finom iglom je veličine 40 ili 41. U nekim slučajevima, kanila sa finom iglom je veličine 41. Kanila može biti bilo koja odgovarajuća vrsta kanile, na primer, kanila vrste de-Juan® ili kanila vrste Eagle®.
[0227] Špric može biti bilo koji odgovarajući špric, pod uslovom da može da se poveže sa kanilom radi isporučivanja tečnosti. U nekim slučajevima, špric je Accurus® sistem šprica. U nekim slučajevima, sistem ima jedan špric. U nekim slučajevima, sistem ima dva šprica. U nekim slučajevima, sistem ima tri šprica. U nekim slučajevima, sistem ima četiri ili više špriceva.
[0228] Sistem može dalje da sadrži automatsku injekcionu pumpu, koja može da se aktivira, npr. nožnom pedalom.
1 4
[0229] Tečnosti koje su pogodne za upotrebu u postupcima iz otkrića uključuju one koje su ovde opisane, na primer, jednu ili više tečnosti od kojih svaka sadrži delotvornu količinu jednog ili više vektora kako je ovde opisano, jednu ili više tečnosti za stvaranje inicijalnog mehurića (npr. fiziološki rastvor ili druga odgovarajuća tečnost) i jednu ili više tečnosti koje sadrže jedan ili više terapeutskih agensa.
[0230] Tečnosti koje su pogodne za upotrebu u postupcima iz otkrića uključuju one koje su ovde opisane, na primer, jednu ili više tečnosti od kojih svaka sadrži delotvornu količinu jednog ili više vektora kako je ovde opisano, jednu ili više tečnosti za stvaranje inicijalnog mehurića (npr. fiziološki rastvor ili druga odgovarajuća tečnost) i jednu ili više tečnosti koje sadrže jedan ili više terapeutskih agensa.
[0231] U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je veća od oko 0,8 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je najmanje oko 0,9 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je najmanje oko 1,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je najmanje oko 1,5 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je najmanje oko 2,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je veća od oko 0,8 do oko 3,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je veća od oko 0,8 do oko 2,5 ml. U nekim otelotvorenjima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je veća od oko 0,8 do oko 2,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je veća od oko 0,8 do oko 1,5 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je veća od oko 0,8 do oko 1,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je oko 0,9 do oko 3,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je oko 0,9 do oko 2,5 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je oko 0,9 do oko 2,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je oko 0,9 do oko 1,5 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je oko 0,9 do oko 1,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je oko 1,0 do oko 3,0 ml. U nekim slučajevima, zapremina tečnosti koja sadrži delotvornu količinu vektora je oko 1,0 do oko 2,0 ml.
1
[0232] Tečnost za stvaranje inicijalnog mehurića može biti, na primer, oko 0,1 do oko 0,5 ml. U nekim slučajevima, ukupna zapremina svih tečnosti u sistemu je oko 0,5 do oko 3,0 ml.
[0233] U nekim slučajevima, sistem sadrži jednu tečnost (npr. tečnost koja sadrži delotvornu količinu vektora). U nekim slučajevima, sistem sadrži 2 tečnosti. U nekim slučajevima, sistem sadrži 3 tečnosti. U nekim slučajevima, sistem sadrži 4 ili više tečnosti.
Ekscipijensi
[0234] Kao što je dobro poznato u struci, farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su relativno inertne supstance koje olakšavaju primenu farmaceutski delotvorne supstance, i mogu da se nabave kao tečni rastvori ili suspenzije, kao emulzije, ili kao čvrsti oblici koji su pogodni za rastvaranje ili suspendovanje u tečnosti pre upotrebe. Na primer, ekscipijens može da daje oblik ili konzistenciju, ili da deluje kao razblaživač. Pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, stabilizatore, kvašljivce i emulgatore, soli različite osmolarnosti, agense za enkapsulaciju, pH puferujuće supstance i pufere. Takvi ekscipijensi uključuju bilo koji farmaceutski agens pogodan za neposrednu isporuku u oko koji može da se primeni bez nepotrebne toksičnosti. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, sorbitol, bilo koje od različitih jedinjenja TWEEN i tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Farmaceutski prihvatljive soli mogu biti tu obuhvaćene, na primer, soli mineralne kiseline kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati, i slično; i soli organskih kiselina, kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati, i slično. Temeljno razmatranje farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa je dostupno u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J.1991).
[0235] U nekim otelotvorenjima koja se odnose na subretinalnu isporuku, farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi mogu da uključuju farmaceutski prihvatljive nosače. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulje, uključujući one sa poreklom iz nafte, sa životinjskim, biljnim ili sintetičkim poreklom, kao što je kikirikijevo ulje, sojino ulje, mineralno ulje, i slično. Fiziološki rastvori i vodeni rastvori dekstroze, polietilen glikola (PEG) i glicerola takođe mogu da se koriste kao vodeni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Mogu da se koriste i dodatni sastojci, na primer, konzervansi, puferi, agensi za toničnost, antioksidansi i stabilizatori, nejonski kvašljivci ili agensi za prečišćavanje, agensi za povećanje viskoznosti, i slično. Kompleti koji su ovde
1
opisani mogu da se pakuju u pojedinačne doze ili u višedozne oblike. Sadržaj kompleta je uopšteno formulisan kao sterilni i suštinski izotonični rastvor.
PRIMERI
[0236] Pronalazak će biti jasniji uz upućivanje na sledeće primere. Međutim, njih ne treba tumačiti kao ograničenje opsega pronalaska. Jasno je da su ovde opisani primeri i otelotvorenja samo za ilustrativne svrhe, i da će njihove različite modifikacije ili promene u svetlu navedenog biti predložene stručnjaku.
Primer 1: Mutacije argininskih ostataka koje se potrebne za smanjenje vezivanja HSPG AAV2-posredovanom transdukcijom u uzgojenim ćelijskim linijama
[0237] Vektori AAV2 za gensku terapiju se trenutno koriste u kliničkim ispitivanjima za indikacije na oku. Ovi vektori mogu da se isporuče intravitrealnim načinom primene, koji kod miševa i nehumanih primata dovodi do transdukcije ganglijskih ćelija mrežnjače i Milerovih ćelija, ili subretinalnim načinom primene, koji cilja pigmentovane epitelne ćelije mrežnjače i fotoreceptorske ćelije. Različiti serotipovi AAV koriste različite receptore i koreceptore ćelijske površine za infekciju. Poznato je da je primarni receptor ćelijske površine za AAV2 heparan sulfat proteoglikan (HSPG) (Summerford, C. i Samulski, R.J. (1998) J. Virol.72(2):1438-45). Razumevanje mehanizma kojim se AAV2 transdukuje u mrežnjači je važno za dalji razvoj vektora AAV za gensku terapiju.
[0238] Kako bi se istražila uloga vezivanja HSPG u AAV2 transdukciji mrežnjače, napravljeni su vektori AAV2 sa kapsidnim proteinima koji nose mutacije u argininskim ostacima za koje se zna da su potrebni za vezivanje HSPG (AAV2 HBKO). Ovi vektori su doveli do značajno smanjene transdukcije 293 i HeLa ćelija u kulturi, u poređenju sa divljim tipom AAV2. Iznenađujuće, vektor AAV2HBKO isporučen subretinalno u oko miša doveo je do 2-log povećanja transdukcije u poređenju sa divljim tipom AAV2. Međutim, kada je vektor AAV2HBKO isporučen intravitrealno, nije uočena transdukcija. Ovi rezultati pokazuju da mutacije u aminokiselinama koje su potrebne za vezivanje HSPG imaju suprotno dejstvo na delotvornost transdukcije nakon subretinalne i intravitrealne injekcije čestica AAV2.
1
Postupci
Konstruisanje AAV2 plazmida sa mutacijom arginina
[0239] AAV2 rep/cap plazmid, pIM45BD, mutiran je koristeći komplet za mutagenezu usmerenu na više mesta Quikchange Lightning (Agilent Technologies). PCR prajmer za mutagenezu je konstruisan za uvođenje promene arginina 585 i 588 u alanine. Pozitivni mutanti su potvrđeni sekvenciranjem.
Dobijanje vektora rAAV
[0240] Rekombinantni vektori AAV koji eksprimiraju pojačani zeleni fluorescentni protein (EGFP) ili rastvorljivi hibrid VEGF receptora (sFLT02) proizvedeni su trostrukom transfekcijom 293 ćelija koristeći pIM45BD ili pIM45BDR585A/R588A rep/cap plazmid i pAdHelper. Transgeni su bili pod kontrolom β-aktina kokoške (CBA) ili promotera humane rodopsin kinaze (RK).
Testovi transdukcije in vitro
[0241] 293 ili HeLa ćelije su zasejane u ploče sa 24 bunarčića (1 - 2x10<5>ćelija po bunarčiću).
24 sata nakon zasejavanja, ćelije su inficirane sa 1 x 10<3>vg/ćeliji (+) Ad5ts149. Delotvornost transdukcije je izmerena 48 sati nakon infekcije pomoću fluorescencije EGFP ili pomoću ELISA radi kvantifikacije sFLT02 u medijumu (ELISA sa humanim rastvorljivim VEGF R1 kompanije R&D Systems).
Životinje
[0242] Kupljeni su odrasli C57BL/6 miševi nabavljeni od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) i držani su u vivarijumu kompanije Genzyme. Životinje su imale slobodan pristup hrani i vodi tokom trajanja studije. Sve procedure su obavljene u skladu sa protokolom koji je odobrio Institucionalni odbor za negu i upotrebu životinja.
Intravitrealna injekcija
1
[0243] Tromost je indukovana i održavana koristeći 3,5% izofluran u 800 ml/minutu kiseonika koji se životinji isporučuje putem nosnog konusa. Jedan mikrolitar ispitivanog proizvoda je injektovan u staklasti humor koristeći Hamiltonov špric sa iskošenom iglom veličine 33 (Hamilton Co., Reno, NV). Igla je usmerena kroz beonjaču približno 2 mm ispod limbusa, i pažljivo je napredovala kroz staklastu komoru kako bi se izbegao kontakt sa sočivom. Ispitivani proizvod je isporučen u periodu od 1-2 sekunde. Nakon injekcije, igla je zadržana na poziciji tokom približno pet sekundi pre nego što je izvađena. Životinja je ostavljena da se oporavi od anestezije pre nego što je vraćena u svoj kavez.
Subretinalna injekcija
[0244] Midrijaza i cikloplegija su indukovane topikalnom primenom tropikamida (Alcon, Fort Worth, TX). Tromost je indukovana i održavana koristeći 3,5% izofluran u 800 ml/minutu kiseonika koji se životinji isporučuje putem nosnog konusa. Oko je imobilisano koristeći pincetu sa prstenastim vrhom (World Precision Instruments, Sarasota, FL) i probni rez je načinjen približno 2 mm ispod limbusa na beonjači koristeći iglu veličine 30. Igla sa tupim vrhom veličine 33 je usmerena kroz rez i posteriorno je napredovala sve dok vrh nije probio posteriornu neurosenzornu mrežnjaču. Jedan mikrolitar ispitivanog proizvoda je isporučen tokom jedne sekunde. Igla je zadržana na poziciji tokom približno pet sekundi pre nego što je izvađena. Životinja je ostavljena da se oporavi od anestezije pre nego što je vraćena u svoj kavez.
Histologija za EGFP
[0245] Sirovi EGFP signal je uočen koristeći epifluorescentni mikroskop na očima fiksiranim u formalinu obrađenim za ugrađivanje u parafin.
Rezultati
[0246] Kao što je prikazano na SL.1, pokazalo se da je pet kapsidnih ostataka ključno za vezivanje AAV2 za HSPG. Mutant AAV2 je konstruisan sa dve aminokiselinske supstitucije u ovim ostacima: R585A i R588A (numeracija se zasniva na aminokiselinskoj sekvenci VP1). Ovaj mutant, koji se naziva HBKO, testiran je na sposobnost da transdukuje ćelije u kulturi.
1
[0247] Humane ćelijske linije su uzgajane u kulturi i transdukovane divljim tipom ili HBKO mutantnim česticama AAV2. Kako bi se izmerila delotvornost transdukcije, virusni genomi obe vrste čestica AAV2 su modifikovani da obuhvataju transgene koristeći sveprisutni CBA promoter za pokretanje ekspresije rastvorljivog Flt (humani VEGF receptor 1).48 sati nakon transdukcije, delotvornost transdukcije je izmerena koristeći imunotest na bazi ELISA za kvantifikaciju proizvedene količine Flt. SL.2 pokazuje da HBKO mutant ispoljava značajno smanjenu sposobnost transdukcije humanih 293 ćelija u kulturi. Koristeći podjednak broj čestica AAV2 i 293 ćelija, HBKO mutant je pokazao 99,6% smanjenja delotvornosti transdukcije u poređenju sa divljim tipom.
[0248] Kako bi se izmerio ovaj efekat u više humanih ćelijskih linija, 293 i HeLa ćelije su transdukovane kako je prethodno opisano. Za ove testove, vektori su modifikovani da eksprimiraju EGFP, pre nego Flt, iz CBA promotera. SL.3 pokazuje da je divlji tip AAV2 bio sposoban da transdukuje obe ćelijske linije, kako je izmereno EGFP fluorescencijom. Nasuprot tome, HBKO mutant je imao drastično smanjenje transdukcije obe ćelijske linije. Ovi rezultati potvrđuju da HBKO mutant ima drastično smanjenju sposobnost da transdukuje ćelijske linije bubrega humanog embriona i kancera grlića materice u kulturi.
Primer 2: Mutacije u argininskim ostacima koje su potrebne za vezivanje HSPG imaju suprotno dejstvo na AAV2 posredovanu transdukciju nakon intravitrealne i subretinalne injekcije
[0249] Sposobnost HBKO mutantnih čestica AAV2 da transdukuju ćelije oka nakon intravitrealne i subretinalne injekcije je testirana kod miša. Na SL.4A i 4B poredi se delotvornost transdukcije divljeg tipa i HBKO čestica AAV2 nakon intravitrealne ili subretinalne injekcije. Za ove eksperimente, delotvornost transdukcije je testirana merenjem ekspresije rastvorljivog Flt (sFLT) nakon transdukcije česticama AAV2 koje imaju transgen koji koristi sveprisutni promoter CBA za pokretanje ekspresije Flt. Koristeći intravitrealnu injekciju, HBKO mutant je pokazao znatno smanjenu sposobnost da transdukuje ćelije (SL.
4A).
[0250] Iznenađujuće, HBKO mutant je pokazao pojačanu transdukciju nakon subretinalne injekcije (SL.4B). Ovo povećanje je konzistentno uočavano kada je količina genoma vektora AAV2 varirana 10-struko (10<8>i 10<9>vg, kao što je obeleženo). Ovi rezultati su u suprotnosti
11
sa onima koji su uočeni u uzgojenim ćelijskim linijama i nakon intravitrealne injekcije. Ovi podaci ukazuju na značaj sposobnosti vezivanja HSPG u posredovanju transdukcije različitih očnih ćelijskih vrsta i retinalnih slojeva putem različitih vrsta intraokularnih injekcija.
[0251] Kako bi se vizuelizovala transdukcija ćelija mrežnjače, korišćene su čestice AAV2 divljeg tipa ili HBKO mutantne čestice AAV2 sa transgenom koji eksprimira EGFP iz sveprisutnog CBA promotera. Kao što je prikazano na SL.5, čestice AAV2 divljeg tipa su mogle da transdukuju mrežnjaču nakon intravitrealne injekcije, kako je pokazano GFP fluorescencijom. Međutim, HBKO mutantne čestice AAV2 nisu pokazale uočljivu GFP fluorescenciju nakon intravitrealne primene. Ovi rezultati su u skladu sa onima koji su predstavljeni na SL.4A.
[0252] SL.6 kvantifikuje delotvornost transdukcije divljeg tipa (AAV2 CBA) i HBKO mutantnih (AAV2 CBA HBKO) čestica AAV2 nakon subretinalne injekcije. Kako bi se izmerila transdukcija, obe čestice AAV2 su imale vektorske genome koji sadrže transgen koji eksprimira Flt koristeći sveprisutni CBA promoter. Za injekcije su korišćene dve količine vektorskih genoma, kako je naznačeno na SL.6. Ovi rezultati potvrđuju zapažanje prikazano na SL.4B i pokazuju iznenađujuće otkriće da mutacija ostataka koji su potrebni za vezivanje HSPG povećava sposobnost AAV2 da transdukuje ćelije nakon subretinalne injekcije.
[0253] Kako bi se vizuelizovala transdukcija, korišćene su čestice AAV2 divljeg tipa ili HBKO mutantne čestice AAV2 sa transgenom koji eksprimira EGFP iz sveprisutnog CBA promotera. Kao što je prikazano na SL.7, GFP fluorescencija u mrežnjači je pojačana nakon transdukcije HBKO mutantnim česticama AAV2, u poređenju sa divljim tipom.
[0254] Pošto je poznato da subretinalna injekcija cilja ćelijske slojeve sa fotoreceptorskim ćelijama, ispitana je sposobnost HBKO mutantnih čestica AAV2 da transdukuju fotoreceptore. Poznato je da promoter rodopsin kinaze (RK) u oku specifično pokreće ekspresiju u fotoreceptorskim ćelijama, kao što su ćelije štapića i čepića (Khani, S.C., et al. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.48(9):3954-61). Zato su napravljene čestice AAV2 divljeg tipa i HBKO mutantne čestice AAV2 koristeći vektorske genome koji imaju transgen koji koristi RK promoter za pokretanje ekspresije Flt. Kao što je prikazano na SL.8, HBKO mutantne čestice AAV2 pokazale su pojačanu transdukciju fotoreceptorskih ćelija nakon subretinalne injekcije, u poređenju sa divljim tipom. Ovo zapažanje je konzistentno uočavano nakon injekcije sa 10-struko različitim količinama vektorskih genoma (10<8>i 10<9>vg, kao što je obeleženo). Ovi rezultati pokazuju iznenađujući rezultat da mutacija ostataka koji su potrebni za vezivanje HSPG povećava sposobnost čestica AAV2 da transdukuju fotoreceptorske ćelije mrežnjače nakon subretinalne injekcije. Mutacija ovih ostataka predstavlja potencijalni način da se pojača transdukcija fotoreceptorskih ćelija za AAV2 posredovanu gensku terapiju.
[0255] AAV je virus jednolančane DNK bez omotača koji je član familije parvovirusa.
Različiti serotipovi AAV uključujući AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, itd. pokazuju različite profile raspodele u tkivu. Tropizmi raznovrsnih tkiva ovih AAV kapsida su omogućili da se vektori na bazi AAV koriste za rasprostranjene primene genskog transfera in vitro i in vivo za jetru, skeletne mišiće, mozak, mrežnjaču, srce i kičmenu moždinu (Wu, Z., et al., (2006) Molecular Therapy, 14: 316-327). Vezivanje virusa za ćeliju domaćina zahteva specifične interakcije virusnog kapsida sa molekulima ćelijskog receptora. Prethodno je pokazano da AAV2 kapsid koristi heparan sulfat proteoglikan (HSPG), V 5 integrin i receptor faktora rasta humanog fibroblasta 1 kao primarne i sekundarne receptore za posredovanje ćelijskog ulaza vektora za gensku terapiju na bazi AAV2 (Summerford, C. i R.J. Samulski (1998) J. Virology, 72: 1438-1445; Summerford, C. et al., (1999) Nat. Medicine, 5: 78-82; Qing, K., et al., (1999) Nat. Medicine, 5: 71-77). Mutaciona analiza proteina AAV2 kapsida pokazala je da grupa baznih aminokiselina, poimence arginina R484, R487, R585, R588 i lizina K532, doprinosi vezivanju heparana i in vitro transdukciji ćelija i in vivo transdukciji vektora AAV2 u jetri. Mutacije ovih aminokiselinskih ostataka dovode do značajno smanjene transdukcije u jetri vektora na bazi AAV2 pomoću intravenskog načina primene i do povećanog kardijalnog i skeletno mišićnog genskog transfera (Kern, A. et al., (2003) J. Virology, 77: 11072-11081; Muller, O.J. et al., (2006) Cardiovascular Research, 70: 70-78).
[0256] Uloga ovih baznih aminokiselina je istražena na transdukciji AAV2 vektora u mrežnjači, intravitrealnim putem i subretinalnim putem primene vektora. Mutacija R585 i R588 je značajno eliminisala in vitro transdukciju HEK293 ćelija i Hela ćelija (SL.2 i 3). Dalkara D et al., ((2009) Molecular Therapy, 17: 2096-2102) ukazali su na to da intravitrealno isporučeni AAV2 vektori ne uspevaju da se probiju u spoljašnju mrežnjaču zbog vezivanja za heparan sulfat proteoglikane kojih ima u izobilju u unutrašnjoj ograničavajućoj membrani mrežnjače. Kao što je prikazano predmetnim primerima, nakon intravitrealne isporuke R585/R588 mutirani vektori su manje sposobni za transdukciju unutrašnje mrežnjače u poređenju sa divljim tipom AAV2 vektora (SL.4A i 5) što ukazuje na to da je vezivanje za HSPG važno za intravitrealnu transdukciju mrežnjače. Subretinalna isporuka vektora na bazi AAV2 dovodi pretežno do transdukcije pigmentovanog epitela mrežnjače (RPE) i određene transdukcije fotoreceptorskih ćelija. Iznenađujuće je otkriveno da R585/R588 mutirani vektori transdukuju spoljašnju mrežnjaču najmanje 10 puta bolje nego vektori AAV2 divljeg tipa (SL.4B, 6, i 7). Koristeći promoter rodopsin kinaze (RK) specifičan za fotoreceptor, ekspresija transgena u fotoreceptorima je značajno povećana sa R585/R588 mutantnim vektorom AAV2 (SL.8). Ovi vektori koji se zasnivaju na mutacijama baznih aminokiselinskih ostataka na AAV2 kapsidu biće veoma korisni za transdukciju spoljašnje mrežnjače, naročito fotoreceptorskih ćelija za lečenje različitih poremećaja mrežnjače.
Referentni Primer 3: Rasprostranjena GFP ekspresija nakon intrastrijatalne isporuke vektora AAV2HBKO
[0257] Pomoću mutacija usmerenih na mesto koje su uvedene u kapsid AAV2, stvoren je AAV2 HBKO mutantni vektor koji je nesposoban da vezuje heparin. Profil transdukcije ovog HBKO vektora je procenjen u miševima divljeg tipa i na mišjem modelu HB (YAC128) koristeći jednu intrastrijatalnu injekciju.
Postupci
Konstruisanje AAV2 plazmida sa mutacijom arginina
[0258] AAV2 rep/cap plazmid, pIM45BD, mutiran je koristeći komplet za mutagenezu usmerenu na više mesta Quikchange Lightning (Agilent Technologies). PCR prajmer za mutagenezu je konstruisan za uvođenje promene arginina u alanin na ostacima 585 i 588. Pozitivni mutanti su potvrđeni sekvenciranjem.
Proizvodnja vektora AAV
[0259] Rekombinantni vektori AAV su proizvedeni trostrukom transfekcijom (koristeći kalcijum fosfat) 293 ćelija karcinoma bubrega humanog embriona (HEK- 293) kao što je prethodno opisano (Xiao et al. (1998) J. Virol.72:2224-2232). Ukratko, korišćen je plazmid
11
koji sadrži rep gen iz serotipa 2 i kapsidni gen iz serotipa 1 ili 2 zajedno sa pomoćnim adenovirusnim plazmidom (Stratagene, Palo Alto, CA). Transgeni su bili pod kontrolom promotera beta-aktina kokoške (CBA). Virus je sakupljen 72 sata nakon transfekcije, i kolona je prečišćena kao što je prethodno opisano (Xiao et al. (1998) J. Virol.72:2224-2232).
Životinje
[0260] Sve procedure su obavljene koristeći protokol koji je odobrio Institucionalni odbor za nego i upotrebu životinja kompanije Genzyme, kompanije grupe Sanofi (Department of Health and Human Services, NIH Publikacija 86-23). Miševi koji su korišćeni uključivali su YAC128 miševe (veštački hromozom kvasca koji nosi humani mutantni HTT transgen kompletne dužine sa 128 CAG ponavljanja na čistoj FVB/NJ pozadini) i divlji tip FVB/NJ miševa iz istog legla (Slow et al. (2003) Hum. Mol. Genet.12:1555-1567; Van Raamsdonk et al. (2005) Hum. Mol. Genet.14:3823-3835). YAC128 miševi i FVB/NJ miševi iz istog legla nabavljeni su iz kolonije kompanije Genzyme koja je čuvana u Charles River Laboratories. Miševi su držani u ciklusu 12 h svetlosti/mraka sa dostupnom hranom i vodom po potrebi. Sva testiranja ponašanja su obavljena tokom ciklusa svetlosti životinja (između 8 ujutru i 4 posle podne). N-vrednosti za sve eksperimente su prikazane u tabelama 2 i 3 u nastavku.
Tabela 2. Miševi divljeg tipa tretirani AAV česticama koje eksprimiraju GFP (eksperiment 1).
Tabela 3. YAC128 miševi tretirani AAV česticama koje eksprimiraju Htt miRNK i GFP (eksperiment 2).
Hirurške procedure
[0261] Životinje su anestezirane koristeći 3% izofluoran i stavljene u stereotaksični ram. Intrakranijalne injekcije su obavljene kao što je prethodno opisano (Stanek et al. (2014) Hum. Gene Ther.25:461-474). Ukratko, 3 µl rekombinantnih virusnih vektora je injektovano u strijatum (AP, 0,50; ML, ±2,00; DV, -2,5 od bregme i tvrde moždane opne; traka za sekutiće 0.0) koristeći Hamiltonov špric od 10 µl pri protoku od 0,5 µl/min. Igla je ostavljena na poziciji tokom 1 minuta nakon završetka infuzije. Jedan sat pre operacije i 24 h nakon operacije, miševima je za analgeziju supkutano dat ketoprofen (5 mg/kg).
Perfuzija životinja i sakupljanje tkiva
[0262] Miševima je kroz srce perfundovan fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS) kako bi se uklonila sva krv. Za eksperiment 1, mozgovi su sečeni duž koronalne ravni, zatim su fiksirani u 4% paraformaldehidu, zatim 30% saharozi. Koronalne sekcije od 20 µm su isečene koristeći kriostat. Za eksperiment 2, mozgovi su sečeni sagitalno duž sredine, i leva hemisfera je zatim fiksirana u 4% paraformaldehidu, zatim 30% saharozi, i potom isečena na sekcije od 20 µm koristeći kriostat. Desna hemisfera (korišćena za biohemijske testove) sečena je duž koronalne ose koristeći matricu mišjeg mozga (Harvard Apparatus, Holliston, MA), i strijatalni i kortikalni region su disecirani koristeći biopsiju ubodom od 3 mm. Moždano tkivo je zatim brzo zamrznuto koristeći tečni azot i čuvano na -80°C do upotrebe.
Kvantitativna PCR u realnom vremenu (TaqMan)
[0263] Nivoi RNK su mereni kvantitativnom RT-PCR u realnom vremenu. Strijatalni ubodi su korišćeni za RT-PCR analizu. Ukupna RNK je ekstrahovana koristeći QIAGEN RNEasy mini komplet, a zatim je reversno transkribovana koristeći komplet TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems) prema uputstvu proizvođača. TaqMan reakcije kvantitativne RT-PCR su sprovedene i analizirane na ABI PRISM® 7500 Real Time PCR sistemu (Applied Biosystems). Nivoi ekspresije HTT mRNK su normalizovani na mRNK nivoe hipoksantin guanin fosforibozil transferaze 1 (HPRT1). Standardne krive su dobijene koristeći 5-struka serijska razblaženja kDNK mišjeg mozga. Svaki uzorak je analiziran u
11
duplikatu. Relativna ekspresija gena je utvrđena koristeći standardnu krivu ili ΔΔCTpostupak i normalizaciju na HPRT1 nivoe mRNK. Za detekciju humanog HTT, korišćeni su sledeći prajmeri: 5' CTCCGTCCGGTAGACATGCT 3' i 5' CCATTTTGAGGGTTCTGATTTCC 3'. Za detekciju mišjeg HTT, korišćeni su sledeći prajmeri: 5' TGCTACACCTGACAGCGAGTCT 3' i 5' ATCCCTTGCGGATCCTATCA 3'.
Vestern bloting
[0264] Nivoi proteina su izmereni vestern blot analizom. Kortikalni ubodi su korišćeni za sve vestern blot analize. Tkiva, sa konačnom koncentracijom od 50 mg/ml u T-Per puferu za lizu (Pierce) i sa kompletnim inhibitorskim koktelom proteaze (Roche), su homogenizovana. Homogenati su prečišćeni centrifugiranjem na 10.000 ×g tokom 6 minuta na 4°C.
Koncentracija proteina je izmerena koristeći BSA test (Pierce). Dvadeset do trideset mikrograma homogenata je rastvoreno na 3-8% Novex tris-acetatnom gelu i zatim preneto na nitroceluloznu membranu. Membrane su sondirane mišjim antihantingtin monoklonskim antitelom (Mab2166; razblaženje 1:2.000, Millipore) i zečjim poliklonskim anti-β-tubulin antitelom (razblaženje 1:750, Santa Cruz Biotechnology). Membrane su zatim inkubirane sa infracrvenim sekundarnim antitelima (razblaženje 1:20.000, Rockland), i proteini su vizuelizovani kvantitativnom fluorescencijom koristeći Odyssey (LI-COR Biosciences). Kako bi se kontrolisale varijanse pri nanošenju, Htt protein je normalizovan na β-tubulin i eksprimiran kao procenat netretiranih životinja ili životinja tretiranih fiziološkim rastvorom. Markeri molekulske mase su korišćeni za potvrdu identiteta proteina.
Imunohistohemija
[0265] Zamrznuti delovi mozga su obojeni zečjim anti-GFAP antitelom radi bojenja astrocita (1:2.500; DAKO, Glostrup, Nemačka) ili anti-Ibal antitelom radi vizuelizacije mikroglija (1:500; WAKO Chemicals USA, Richmond, VA). Sekundarna antitela koja su korišćena bila su magareća antispecifična za vrstu antitela konjugovana sa FITC ili Cy3. Odeljci su vizuelizovani koristeći Nikon Eclipse E800 fluorescentni mikroskop (Nikon, Melville, NY).
Statistika
11
[0266] Za statističke analize su korišćene srednje vrednosti. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM. Za studije koje su koristile dve grupe, Studentov t-test je korišćen za statističko poređenje. Za poređenje više od dve grupe, korišćena je jednostrana ANOVA, zatim Takijev post-hoc test za višestruko poređenje (Prism GraphPad). p<0,05 je smatrano statistički značajnom razlikom.
Rezultati
[0267] Kao što je prethodno opisano, AAV2-eGFP i AAV2HBKO-GFP vektori su injektovani u miševe divljeg tipa u eksperimentu 1 (tabela 2). Sve životinje su žrtvovane 30 dana nakon injekcije. Fluorescentna mikroskopija je otkrila da AAV2 i AAV2HBKO vektori pokreću ekspresiju GFP transgena u transdukovanim neuronima (SL.9A i 9B). Ekspresija GFP je ograničena na injekcioni put za AAV2, uz minimalno širenje dalje od mesta injekcije (SL. 9B). Međutim, kada se poredi sa tradicionalnim AAV2, AAV2HBKO je pokretao robusniju i sveobuhvatniju ekspresiju GFP, gde je ekspresija uočena daleko izvan mesta injekcije (SL.9A). Ovi rezultati pokazuju da je robusna i sveobuhvatna ekspresija transgena isporučena u CNS koristeći AAV2HBKO vektor.
Referentni Primer 4: Poređenje AAV2HBKO- i AAV1-posredovane ekspresije GFP nakon intrastrijatalne injekcije u mozgove YAC128 miševa
[0268] Kao što je prethodno opisano, vektori AAV2HBKO i AAV1 serotipa su injektovani u YAC128 miševe u eksperimentu 2 (tabela 3). Ovi vektori su pokretali ekspresiju veštačke miRNK koja cilja humani HTT i GFP reporter. AAV1 i AAV2HBKO vektori su pokazali robusnu distribuciju GFP 30 dana nakon injekcije u strijatum (SL.10A i 10B). Međutim, obrazac ekspresije GFP je izgledao značajno drugačije između dva vektorska serotipa. AAV1 ekspresija GFP (SL. 10A bila je u većoj meri neujednačena i manje jednoobrazna od GFP ekspresije AAV2HBKO (SL.10B). Delovalo je da je transdukcija vektora isključivo neuronska u AAV2HBKO mozgovima u poređenju sa AAV1 serotipovima koji su transdukovali neurone i glijalne ćelije, primarno astrocite. Ovi rezultati su pokazali da AAV2HBKO pokazuje veoma različit profil ekspresije i transdukcije u poređenju sa tradicionalnim AAV1.
11
Referentni Primer 5: AAV2HBKO-miRNK-Htt injekcija YAC128 miševa dovodi do smanjenja HTT mRNK
[0269] Sledeća je procenjena sposobnost AAV1 i AAV2HBKO vektorskih serotipa da eksprimiraju miRNK koja utišava ekspresiju HTT u strijatumu YAC128 miševa. Odrasli YAC128 miševi su primili bilateralne intrastrijatalne injekcije AAV2/1-miRNK-Htt ili AAV2HBKO-miRNK-Htt, i mozgovi su analizirani 30 dana nakon lečenja. Strijatalni nivoi mRNK mutantnog humanog HTT su značajno smanjeni kod miševa kojima su injektovani AAV2/1-miRNK-Htt i AAV2HBKO-miRNK-Htt u poređenju sa nelečenim kontrolama (SL.
11A). Vestern blot analiza kortikalnih moždanih uboda je pokazala trend ka smanjenju Htt u obe grupe lečenja; međutim, varijabilnost netretiranih kontrolnih uzoraka je sprečila da podaci dobiju statističku značajnost (SL.11B). Ovi rezultati pokazuju delotvornost izbacivanja gena pomoću RNKi koristeći AAV1 i AAV2HBKO vektore.
Referentni Primer 6: Injekcija AAV2HBKO-miRNKHtt YAC128 miševa ne uzrokuje neuroinflamaciju
[0270] Kako bi se utvrdilo da li injekcije AAV dovode do neuroinflamacije, nivoi neuroinflamatornih markera, glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP, marker astrocita) i Iba1 (marker mikroglija), su ispitani 30 dana nakon lečenja. Nije uočen značajan porast nivoa Iba1 nakon lečenja sa AAV2HKO, u poređenju sa netretiranim mozgovima (vidite SL.12A i 12B). Međutim, lečenje sa AAV2/1 jeste uzrokovalo porast nivoa Iba1 na mestu injekcije (SL. 12C) koje je prethodno uočeno. Nisu uočeni značajni porasti nivoa GFAP u bilo kom od lečenih mozgova 30 dana nakon injekcije u poređenju sa netretiranim kontrolama (SL.13A-13C). Ovi rezultati pokazuju da je AAV2HBKO mogao da pokreće ekspresiju miRNK usmerenu na humani HTT i dovede do smanjenja HTT u odsustvu mikroglijalne aktivacije, u poređenju sa AAV1 serotipom.
Zaključci
[0271] Postojeći serotipovi AAV vektora pokazuju ograničenu distribuciju u mozgu nakon jedne primene na mestu (npr. Christine, C.W. et al. (2009) Neurology 73:1662-1669; Mandel, R.J. (2010) Curr. Opin. Mol. Ther.12:240-247). Kao što je ovde detaljno razmotreno, pronalazači su otkrili da primena AAV vektora sa smanjenim vezivanjem za heparan sulfat
11
proteoglikane (HSPG) na ćelijskoj površini pojačava transdukciju AAV u CNS. Ovi rezultati pokazuju korisnost AAV sa modifikovanim HSPG vezivanjem u genskoj terapiji CNS kada je poželjna široka distribucija vektora. Štaviše, pronalazači su takođe otkrili da vektori AAV2 sa smanjenim HSPG vezivanjem pokazuju idealan bezbednosni profil (pošto ciljaju isključivo neurone), pri čemu postižu široku i robusnu delotvornost transdukcije. Takvi vektori su stoga korisni za CNS indikacije koje zahtevaju široku neuronsku transdukciju iz intraparenhimske isporuke.
Referentni Primer 7: In vitro i subretinalna transdukcija putem AAVrh8R i AAVrh8R mutantnih vektora
Postupci
Konstruisanje AAVrh8R plazmida sa modifikovanim argininom
[0272] AAVrh8R rep/cap plazmid je mutiran koristeći komplet za mutagenezu usmerenu na više mesta Quikchange Lightning (Agilent Technologies). PCR prajmer za mutagenezu je konstruisan za uvođenje promena alanina 586 u arginin (AAVrh8R-A586R) ili arginina 533 u alanin (AAVrh8R-R533A). Pozitivni mutanti su potvrđeni sekvenciranjem.
Dobijanje vektora rAAV
[0273] Vektori rekombinantnog AAV koji eksprimiraju pojačani zeleni fluorescentni protein (EGFP) ili rastvorljivi hibrid VEGF receptora (sFLT02) proizvedeni su trostrukom transfekcijom 293 ćelija koristeći pAAVrh8R, pAAVrh8R-A586R ili pAAVrh8R-R533A rep/cap plazmide i pAdHelper. Transgeni su bili pod kontrolom promotera β-aktina kokoške (CBA).
Testovi transdukcije in vitro
[0274] HeLa, HeLaRC32 ili NS1 ćelije su zasejane u ploče sa 24 bunarčića (1 - 2 x10<5>ćelija po bunarčiću).24 sata nakon zasejavanja, ćelije su inficirane sa 1 x 10<4>vg/ćeliji - 1 x 10<5>vg/ćeliji (+) Ad5ts149. Delotvornost transdukcije je izmerena 48 sati nakon infekcije pomoću
11
fluorescencije EGFP ili pomoću ELISA radi kvantifikacije sFLT02 u medijumu (ELISA sa humanim rastvorljivim VEGF R1 kompanije R&D Systems).
Životinje.
[0275] Kupljeni su odrasli C57BL/6 miševi nabavljeni od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) i držani su u vivarijumu. Životinje su imale slobodan pristup hrani i vodi tokom trajanja studije. Sve procedure su obavljene u skladu sa protokolom koji je odobrio Institucionalni odbor za negu i upotrebu životinja.
Subretinalna injekcija.
[0276] Midrijaza i cikloplegija su indukovane topikalnom primenom tropikamida (Alcon, Fort Worth, TX). Tromost je indukovana i održavana koristeći 3,5% izofluran u 800 ml/minutu kiseonika koji se životinji isporučuje putem nosnog konusa. Oko je imobilisano koristeći pincetu sa prstenastim vrhom (World Precision Instruments, Sarasota, FL) i probni rez je načinjen približno 2 mm ispod limbusa na beonjači koristeći iglu veličine 30. Igla sa tupim vrhom veličine 33 je usmerena kroz rez i posteriorno je napredovala sve dok vrh nije probio posteriornu neurosenzornu mrežnjaču. Jedan mikrolitar ispitivanog proizvoda je isporučen tokom jedne sekunde. Igla je zadržana na poziciji tokom približno pet sekundi pre nego što je izvađena. Životinja je ostavljena da se oporavi od anestezije pre nego što je vraćena u svoj kavez.
Kvantifikacija sFLT02 u retinalnim lizatima.
[0277] sFLT02 u mišjim retinalnim lizatima je izmeren koristeći ELISA komplet za humani rastvorljivi VEGF R1 kompanije R&D Systems.
Rezultati
[0278] Kako bi se istražila uloga argininskih ostataka kapsidne površine u AAVrh8 transdukciji mrežnjače, napravljeni su AAVrh8 vektori sa kapsidnim proteinima koji imaju mutacije u ostacima koji odgovaraju argininima AAV2 koji učestvuju u vezivanju HSPG. SL.
14 poredi pet kapsidnih ostataka koji su kritični za vezivanje AAV2 za HSPG sa
12
odgovarajućim ostacima u AAVrh8R. Kao što je prikazano na SL.15, konstruisana su dva mutanta AAVrh8R, svaki sa aminokiselinskom supstitucijom na ovim ostacima: A586R i R533A (numeracija se zasniva na aminokiselinskoj sekvenci VP1).
[0279] Kako bi se procenilo dejstvo dodavanja argininskih ostataka u kapsid AAVrh8R na in vitro transdukciju, HeLa ćelije su inficirane AAVrh8R-sFLT02 ili modifikovanim AAVrh8R-A586R-sFLT02 vektorom koji ima arginin dodat na poziciji A586 (AAVrh8R A586R), oba sa 1 x 10<4>DRP/ćeliji.48 sati nakon infekcije, delotvornost transdukcije je procenjena merenjem sFLT02 u medijumu za uzgajanje ćelija. AAVrh8R-A586R je pokazao nekoliko puta veću transdukciju u poređenju sa nemodifikovanim AAVrh8R (SL.16A).
[0280] Kako bi se procenilo dejstvo uklanjanja kapsidnih arginina na in vitro transdukciju, HeLaRC32 ćelije su inficirane AAVrh8R ili AAVrh8R-R533A vektorom (oba sa 1 x 10<4>DRP/ćeliji). AAVrh8R-R533A je imao značajno smanjenu transdukciju u poređenju sa AAVrh8R (SL. 16B).
[0281] Slični eksperimenti su obavljeni koristeći ekspresiju EGFP kao meru delotvornosti transdukcije. AAVrh8R-A586R-EGFP je pokazao značajno poboljšanu transdukciju NS1 ćelija u poređenju sa AAVrh8R (uporedite SL.17B sa SL.17A). Nasuprot tome, AAVrh8R-R533A-EGFP vektor je imao smanjenu transdukciju na HeLa ćelijama u poređenju sa AAVrh8R (uporedite SL.17D sa SL.17C).
[0282] Ovi eksperimenti zajedno ukazuju na to da dodatak arginina kapsidu AAVrh8R poboljšava in vitro transdukciju AAVrh8R dok uklanjanje arginina iz kapsida AAVrh8R smanjuje in vitro transdukciju. Ovi rezultati pokazuju da na in vitro transdukciju pomoću AAVrh8R u velikoj meri utiču argininski ostaci na kapsidu.
[0283] Kako bi se utvrdilo dejstvo arginina na subretinalnu transdukciju AAVrh8R, C57B16 miševi su injektovani sa 1 x 10<8>DRP AAVrh8R, AAVrh8R-A586R ili AAVrh8R-R533A koji eksprimira sFLT02 iz CBA promotera. Miševi su žrtvovani 30 dana nakon primene vektora i sFLT02 je izmeren u retinalnim lizatima.
[0284] AAVrh8R-A586R transdukcija mrežnjače miša je značajno smanjena u poređenju sa AAVrh8R, i zapravo je bila uporediva sa AAV2 koji takođe ima arginin na istoj poziciji, R585 (SL.18A). AAVrh8R-R533A transdukcija mrežnjače miša je poboljšana u poređenju sa AAVrh8R (SL.18B).
[0285] Ovi podaci ističu uticaj kapsidnih arginina na subretinalnu transdukciju AAVrh8R i sugerišu da se subretinalna transdukcija poboljšava uklanjanjem arginina iz kapsida AAVrh8R. Ovi rezultati pokazuju da na subretinalnu transdukciju pomoću AAVrh8R u velikoj meri utiču argininski ostaci na kapsidu.
Referentni Primer 8: Intravitrealna transdukcija AAVrh8R je poboljšana dodatkom arginina na poziciji 586
Postupci
Intravitrealna injekcija
[0286] Tromost je indukovana i održavana koristeći 3,5% izofluran u 800 ml/minutu kiseonika koji se životinji isporučuje putem nosnog konusa. Jedan mikrolitar ispitivanog proizvoda je injektovan u staklasti humor koristeći Hamiltonov špric sa iskošenom iglom veličine 33 (Hamilton Co., Reno, NV). Igla je usmerena kroz beonjaču približno 2 mm ispod limbusa, i pažljivo je napredovala kroz staklastu komoru kako bi se izbegao kontakt sa sočivom. Ispitivani proizvod je isporučen u periodu od 1-2 sekunde. Nakon injekcije, igla je zadržana na poziciji tokom približno pet sekundi pre nego što je izvađena. Životinja je ostavljena da se oporavi od anestezije pre nego što je vraćena u svoj kavez.
Kvantifikacija sFLT02 u retinalnim lizatima
[0287] sFLT02 u mišjim retinalnim lizatima je izmeren koristeći ELISA komplet za humani rastvorljivi VEGF R1 kompanije R&D Systems.
Rezultati
[0288] Kako bi se procenilo dejstvo dodavanja arginina u AAV kapsid na intravitrealnu transdukciju, 57B16 miševi su injektovani sa 1 x 10<9>DRP AAV2, AAVrh8R ili AAVrh8R-A586R, pri čemu svaki nosi konstrukt koji eksprimira sFLT02 iz CBA promotera. Miševi su žrtvovani 30 dana nakon primene vektora i sFLT02 je izmeren u retinalnim lizatima.
AAVrh8R-A586R transdukcija mrežnjače miša je poboljšana u poređenju sa AAVrh8R, i zapravo je bila uporediva sa AAV2 koji takođe ima arginin na istoj poziciji, R585 (SL.19).
Ovi podaci pokazuju da intravitrealna transdukcija mrežnjače može da se poboljša dodatkom arginina u AAV kapsid. Na osnovu ovih rezultata i homologije sekvence između AAV kapsida (SL.20), intravitrealna transdukcija mrežnjače pomoću čestica AAV koje imaju kapside AAV1, AAV6, AAV8, AAV9 i AAVrh10 može slično da poboljša retinalnu transdukciju.
SEKVENCE
[0289] Sve polipeptidne sekvence su date od N-terminusa do C-terminusa, ako nije drugačije navedeno. Sve nukleinske kiseline su date od 5' do 3', ako nije drugačije navedeno.
Aminokiselinska sekvenca AAV2 VP1
Aminokiselinska sekvenca AAV2 VP1 HBKO
Aminokiselinska sekvenca AAV2 VP2
12
Aminokiselinska sekvenca AAV2 VP2 HBKO
Aminokiselinska sekvenca AAV2 VP3
Aminokiselinska sekvenca AAV2 VP3 HBKO
Aminokiselinska sekvenca AAV3 VP1
Aminokiselinska sekvenca AAVrh8R VP1
Aminokiselinska sekvenca AAVrh8R A586R mutantnog VP1
Aminokiselinska sekvenca AAVrh8R R533A mutantnog VP1
12
Aminokiselinska sekvenca AAV1 VP1
Aminokiselinska sekvenca AAV6 VP1
Aminokiselinska sekvenca AAV8 VP1
12
Aminokiselinska sekvenca AAV9 VP1
Aminokiselinska sekvenca AAVrh10 VP1
12
SPISAK SEKVENCI
[0290]
<110> Genzyme Corporation
Scaria, Abraham
Sullivan, Jennifer
Stanek, Lisa M.
<120> Vektori AAV za gensku terapiju mrežnjače i CNS <130> 159792010440
<140> Još nije dodeljeno
<141> Istovremeno sa tim
<150> US 62/114,575
<151> 2015-02-10
<150> US 61/988,131
<151> 2014-05-02
<160> 16
<170> FastSEQ za Windows verzija 4.0
<210> 1
<211> 735
<212> PRT
<213> Adenoasocirani virus
12
<211> 735
<212> PRT
<213> Sintetička sekvenca <220>
<223> Sintetički konstrukt <400> 2
12
�
11
<211> 598
<212> PRT
<213> Sintetička sekvenca <220>
<223> Sintetički konstrukt <400> 4
1 2
�
14
<211> 533
<212> PRT
<213> Sintetička sekvenca <220>
<223> Sintetički konstrukt
1
1
�
<213> Sintetička sekvenca <220>
<223> Sintetički konstrukt
<211> 736
<212> PRT
<213> Sintetička sekvenca <220>
<223> Sintetički konstrukt
1
�
<212> PRT
<213> Sintetička sekvenca <220>
<223> Sintetički konstrukt
14
<211> 736
<212> PRT
<213> Sintetička sekvenca <220>
<223> Sintetički konstrukt
14
<211> 736
<212> PRT
<213> Adenoasocirani virus <400> 13
��
14
��
14
14
�
11

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Čestica rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za upotrebu u postupku lečenja očnog poremećaja kod sisara, pri čemu navedeni postupak obuhvata isporuku heterologne nukleinske kiseline u oko pojedinca, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu navedene čestice rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) na subretinu pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži
a) rekombinantni kapsid AAV2 (rAAV2) koji sadrži proteine AAV2 kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2,
pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom, i
pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, i
b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno invertovano terminalno ponavljanje AAV.
2. Kompozicija koja sadrži česticu rekombinantnog adenoasociranog virusa (rAAV) za upotrebu u postupku za lečenje očnog poremećaja kod pojedinca, pri čemu navedeni postupak obuhvata subretinalnu isporuku navedene kompozicije u mrežnjaču pojedinca, pri čemu čestica rAAV sadrži
a) kapsid rAAV2 koji sadrži proteine AAV2 kapsida sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednoj ili više pozicija R484, R487, K527, K532, R585 i/ili R588, numeracija na bazi VP1 numeracije AAV2,
pri čemu je jedna ili više aminokiselinskih supstitucija hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom, i
pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan, i
b) vektor rAAV koji sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu i najmanje jedno terminalno ponavljanje AAV.
3. Čestica rAAV za upotrebu prema zahtevu 1, ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, pri čemu je heterologna nukleinska kiselina operativno povezana sa promoterom koji je pogodan za ekspresiju terapeutskog polipeptida ili terapeutske nukleinske kiseline u jednoj ili više vrsta ćelija mrežnjače.
4. Čestica rAAV za upotrebu prema zahtevu 3, ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 3, pri čemu je ćelija mrežnjače fotoreceptorska ćelija.
5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-4, pri čemu se heterologna nukleinska kiselina koristi za lečenje očnog poremećaja kod čoveka izabranog iz grupe koja se sastoji od: autozomne recesivne teške rane degeneracije mrežnjače (Leberova kongenitalna amauroza), kongenitalne ahromatopsije, Stargartove bolesti, Bestove bolesti, Dojnove bolesti, distrofije čepića, retinitis pigmentoze, X-vezane retinošize, Ušerovog sindroma, senilne degeneracije makule, atrofijske senilne degenerecije makule, neovaskularne AMD, dijabetičke makulopatije, proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), cistoidnog edema makule, centralne serozne retinopatije, ablacije mrežnjače, intraokularne inflamacije, glaukoma i posteriornog uveitisa.
6. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 3-4, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-5, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija smanjuje vezivanje čestice rAAV za heparan sulfat proteoglikan za najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% ili najmanje oko 100%.
7. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-6, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija obuhvata supstituciju argininskog ili lizinskog ostatka alaninskim ostatkom.
8. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6-7, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-7, pri čemu jedna ili više aminokiselinskih supstitucija obuhvata supstitucije na pozicijama R484 i R487 ili na pozicijama R585 i R588, numeracija na bazi VP1 AAV2.
9. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6-8, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-8, pri čemu proteini AAV2 kapsida sadrže aminokiselinske supstitucije R585A i R588A, numeracija na bazi VP1 AAV2.
1
10. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6-9, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-9, pri čemu proteini AAV2 kapsida sadrže aminokiselinsku supstituciju K532A, numeracija na bazi VP1 AAV2.
11. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6-10, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-10, pri čemu čestica rAAV sadrži jedan ili više proteina AAV2 kapsida sa najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 2, 4 ili 6.
12. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6-11, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-11, pri čemu heterologna nukleinska kiselina kodira polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od antioksidansa, neurotrofnog faktora, antiapoptotskog faktora, antiangiogenog faktora i antiinflamatornog faktora.
13. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6-11, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-11, pri čemu heterologna nukleinska kiselina kodira terapeutsku nukleinsku kiselinu.
14. Čestica rAAV za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 3-4 i 6-13, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2-13, pri čemu je vektor rAAV samokomplementarni vektor rAAV.
1 4
RS20210849A 2014-05-02 2015-05-02 Aav vektori za gensku terapiju mrežnjače i cns RS62078B2 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461988131P 2014-05-02 2014-05-02
US201562114575P 2015-02-10 2015-02-10
EP15723386.7A EP3137497B2 (en) 2014-05-02 2015-05-02 Aav vectors for retinal and cns gene therapy
PCT/US2015/028966 WO2015168666A2 (en) 2014-05-02 2015-05-02 Aav vectors for retinal and cns gene therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS62078B1 RS62078B1 (sr) 2021-07-30
RS62078B2 true RS62078B2 (sr) 2025-06-30

Family

ID=53189202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210849A RS62078B2 (sr) 2014-05-02 2015-05-02 Aav vektori za gensku terapiju mrežnjače i cns

Country Status (32)

Country Link
US (3) US10982228B2 (sr)
EP (3) EP4600255A3 (sr)
JP (4) JP6741591B2 (sr)
KR (3) KR20160147974A (sr)
CN (2) CN106661591B (sr)
AU (3) AU2015252797C1 (sr)
CA (1) CA2946593A1 (sr)
CL (2) CL2016002713A1 (sr)
CR (1) CR20160555A (sr)
DK (1) DK3137497T4 (sr)
DO (1) DOP2016000280A (sr)
EA (1) EA034355B1 (sr)
ES (1) ES2879636T5 (sr)
FI (1) FI3137497T4 (sr)
GT (1) GT201600227A (sr)
HR (1) HRP20211024T4 (sr)
HU (1) HUE054768T2 (sr)
IL (2) IL248102B (sr)
LT (1) LT3137497T (sr)
MX (2) MX2016014220A (sr)
MY (1) MY188987A (sr)
PE (1) PE20170260A1 (sr)
PH (1) PH12016502046A1 (sr)
PL (1) PL3137497T5 (sr)
PT (1) PT3137497T (sr)
RS (1) RS62078B2 (sr)
SG (3) SG11201607991WA (sr)
SI (1) SI3137497T2 (sr)
TW (1) TWI686476B (sr)
UY (1) UY36106A (sr)
WO (1) WO2015168666A2 (sr)
ZA (1) ZA201606763B (sr)

Families Citing this family (179)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
RS67077B1 (sr) 2009-05-02 2025-08-29 Genzyme Corp Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
EP3514232A1 (en) 2010-04-23 2019-07-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
WO2011133874A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
JP2013533847A (ja) 2010-04-23 2013-08-29 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ コレステロール関連障害のａａｖベースの治療
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2012145624A2 (en) 2011-04-21 2012-10-26 University Of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
RS66184B1 (sr) 2011-04-22 2024-12-31 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
RU2692251C2 (ru) 2013-05-15 2019-06-24 Риджентс Оф Зэ Юниверсити Оф Миннесота Опосредованный аденоассоциированным вирусом перенос генов в центральную нервную систему
ES2897508T3 (es) 2013-05-31 2022-03-01 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
US9585971B2 (en) 2013-09-13 2017-03-07 California Institute Of Technology Recombinant AAV capsid protein
WO2015127128A2 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Massachusetts Recombinant aavs having useful transcytosis properties
KR102288849B1 (ko) 2014-03-17 2021-08-12 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 원추세포에서 증강된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
DK3119797T3 (da) 2014-03-18 2021-03-15 Univ Massachusetts Raav-baserede sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af amyotrofisk lateralsklerose
US10975391B2 (en) 2014-04-25 2021-04-13 University Of Massachusetts Recombinant AAV vectors useful for reducing immunity against transgene products
EP4600255A3 (en) 2014-05-02 2025-10-22 Genzyme Corporation Aav vectors for retinal and cns gene therapy
MX383227B (es) * 2014-05-14 2025-03-13 UNIV AUTòNOMA DE BARCELONA Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosomico.
US10689653B2 (en) 2014-06-03 2020-06-23 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
US10711270B2 (en) 2014-10-03 2020-07-14 University Of Massachusetts High efficiency library-identified AAV vectors
RU2020140209A (ru) 2014-10-21 2021-01-25 Юниверсити Оф Массачусетс Варианты рекомбинантных aav и их применения
US10450563B2 (en) 2015-02-10 2019-10-22 Genzyme Corporation Variant RNAi
AU2016219398A1 (en) 2015-02-10 2017-09-28 Genzyme Corporation Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex
EP3256170B1 (en) 2015-02-13 2020-09-23 University of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
KR20170137730A (ko) 2015-03-02 2017-12-13 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 망막 추상체에 폴리뉴클레오타이드의 유리체 내 전달을 위한 조성물 및 방법
EP3719134B1 (en) 2015-03-11 2023-08-23 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Rp2 vectors for treating x-linked retinitis pigmentosa
EP3277819B1 (en) 2015-03-24 2021-03-03 The Regents of The University of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
RS61907B1 (sr) 2015-04-06 2021-06-30 Subdomain Llc Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena
US20180104289A1 (en) 2015-04-08 2018-04-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Viral gene therapy as treatment for cholesterol storage disease or disorder
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
WO2016172008A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 University Of Massachusetts Modified aav constructions and uses thereof
GB201508026D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Capsid
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
EP3831842A1 (en) 2015-09-28 2021-06-09 The University of North Carolina at Chapel Hill Methods and compositions for antibody-evading virus vectors
CA3002982A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance in neurodegenerative disease
US11426469B2 (en) 2015-10-22 2022-08-30 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
EP3368054A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Voyager Therapeutics, Inc. REGULATORY EXPRESSION USING THE ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV)
AU2016366549B2 (en) 2015-12-11 2022-11-10 California Institute Of Technology Targeting peptides for directing adeno-associated viruses (AAVs)
MX2018007330A (es) * 2015-12-15 2019-03-14 Genzyme Corp Vectores virales adeno-asociados para tratar mucolipidosis de tipo ii.
US11826433B2 (en) 2016-02-02 2023-11-28 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic AAV gene delivery to the central nervous system
CA3012344A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 University Of Massachusetts Anti-angiogenic mirna therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
US20190071681A1 (en) * 2016-02-26 2019-03-07 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav heparin mutants that display significantly improved eye and brain transduction
WO2017176929A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 University Of Massachusetts Compositions and methods for selective inhibition of grainyhead-like protein expression
CN107287238B (zh) * 2016-04-11 2020-10-16 厦门继景生物技术有限责任公司 一种基因载体及其用于治疗雷柏氏先天性黑矇2型疾病的基因治疗药物
US11413356B2 (en) 2016-04-15 2022-08-16 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
GB201608046D0 (en) 2016-05-09 2016-06-22 Cambridge Entpr Ltd And Syndey Children S Hospitals Network Randwick And Westmead Incorporating The Treatment of complement-mediated disorders
AU2017268382B2 (en) * 2016-05-18 2023-09-28 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating Huntington's disease
US11882815B2 (en) 2016-06-15 2024-01-30 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
EP3481958A4 (en) * 2016-07-08 2019-12-25 The Trustees of The University of Pennsylvania METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING DISTURBANCES AND DISEASES WITH RDH12
WO2018011572A1 (en) * 2016-07-12 2018-01-18 The University Of Manchester Gene therapy
JP7071332B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-18 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 変異カプシドを有するアデノ随伴ウイルスビリオン及びその使用方法
BR112019002904A2 (pt) * 2016-08-16 2019-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill métodos e composições para transferência gênica direcionada
IL264872B2 (en) * 2016-08-18 2025-02-01 Univ California CRISPR-CAS genome engineering using a modular AAV delivery system
WO2018035457A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Calimmune, Inc. Methods and compositions for treating canine conditions using recombinant self-complementary adeno-associated virus
KR102759317B1 (ko) 2016-08-19 2025-01-31 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스를 이용한 병태의 치료 방법 및 조성물
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
KR20190057110A (ko) 2016-09-28 2019-05-27 코바, 인크. 치료적 mots-c 관련 펩타이드
US11078238B2 (en) 2016-09-29 2021-08-03 University Of Florida Research Foundation, Incorporated AAVrh.10 variants with host antibody escape capabilities and altered tissue targeting properties
AU2017341849B2 (en) 2016-10-13 2024-03-21 University Of Massachusetts AAV capsid designs
US11192925B2 (en) 2016-10-19 2021-12-07 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified AAV capsids and uses thereof
MX2019006614A (es) 2016-12-07 2019-10-15 Univ Florida Adnc del antagonista del receptor de interleucina-1.
WO2018145009A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 University Of Tennessee Research Foundation Dna-zyme based methods & compositions for treating huntington's disease
US11117930B2 (en) 2017-02-23 2021-09-14 Adrx, Inc. Peptide inhibitors of transcription factor aggregation
JOP20190200A1 (ar) 2017-02-28 2019-08-27 Univ Pennsylvania تركيبات نافعة في معالجة ضمور العضل النخاعي
US10898585B2 (en) 2017-04-14 2021-01-26 Ptc Therapeutics .Inc. Gene therapy for AADC deficiency
WO2018200419A1 (en) * 2017-04-23 2018-11-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Viral vectors comprising engineered aav capsids and compositions containing the same
WO2018204803A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
JP7327803B2 (ja) 2017-05-09 2023-08-16 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）を処置する方法
JP7330899B2 (ja) 2017-05-10 2023-08-22 マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー ウイルスのアセンブリ活性化タンパク質（ａａｐ）依存性を改変する方法および組成物
CN110997693A (zh) 2017-06-07 2020-04-10 阿德克斯公司 τ聚集抑制剂
US20200121746A1 (en) 2017-06-30 2020-04-23 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsids and methods of use thereof
EP3662060A2 (en) * 2017-08-03 2020-06-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
US11680249B2 (en) 2017-08-28 2023-06-20 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus capsid variants and methods of use thereof
US20200377887A1 (en) * 2017-09-22 2020-12-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
EP3684932A1 (en) 2017-09-22 2020-07-29 Genzyme Corporation Variant rnai
CN111448321A (zh) 2017-09-22 2020-07-24 马萨诸塞大学 Sod1双表达载体及其用途
CN111601884A (zh) * 2017-10-16 2020-08-28 维格内罗有限责任公司 Aav载体
WO2019077159A1 (en) * 2017-10-20 2019-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS OF EXPRESSING POLYNUCLEOTIDE OF INTEREST IN CONE PHOTORECCEPTORS OF A SUBJECT COMPRISING SUB-RETINAL ADMINISTRATION OF A THERAPEUTICALLY EFFECTIVE AMOUNT OF A RECOMBINANT AAV9 DERIVATIVE VECTOR
US11464803B2 (en) 2017-11-14 2022-10-11 Arcellx, Inc. D-domain containing polypeptides and uses thereof
AU2018368431B2 (en) 2017-11-14 2024-03-21 Arcellx, Inc. Multifunctional immune cell therapies
CR20200210A (es) * 2017-11-15 2020-09-23 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Promotor especìfico de las cèlulas del epitelio pigmentario retinal en primates
AU2018367606B2 (en) * 2017-11-15 2024-08-29 The Regents Of The University Of Michigan Viral vectors comprising RDH12 coding regions and methods of treating retinal dystrophies
US20190153440A1 (en) 2017-11-21 2019-05-23 Casebia Therapeutics Llp Materials and methods for treatment of autosomal dominant retinitis pigmentosa
CN108085316B (zh) * 2017-12-25 2021-02-09 中国人民解放军第四军医大学 一种通过抑制微小核糖核酸来促进小鼠视网膜前体细胞体外扩增的方法
US20210017509A1 (en) * 2018-03-23 2021-01-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Gene Editing for Autosomal Dominant Diseases
WO2019195449A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Stridebio, Inc. Antibody-evading virus vectors
CN112543766A (zh) 2018-04-03 2021-03-23 斯特里迪比奥公司 抗体逃避性病毒载体
EP3773743A1 (en) 2018-04-03 2021-02-17 Stridebio, Inc. Virus vectors for targeting ophthalmic tissues
BR112020021903A2 (pt) 2018-04-27 2021-03-02 Rocket Pharmaceuticals, Ltd. terapia genética para degeneração do snc
MX2020012077A (es) 2018-05-15 2021-03-09 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
TW202015742A (zh) 2018-05-15 2020-05-01 美商航海家醫療公司 投遞腺相關病毒（ａａｖ）之組成物和方法
EP3813845A4 (en) 2018-05-15 2022-10-26 President And Fellows Of Harvard College Viral vectors exhibiting improved gene delivery properties
WO2019222444A2 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Voyager Therapeutics, Inc. Directed evolution
JP7563694B2 (ja) * 2018-06-01 2024-10-08 ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク． 優性網膜色素変性症の処置のための組成物および方法
EP3802829A4 (en) 2018-06-08 2022-10-19 University of Massachusetts ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES TO RESTORE DYSFERLIN PROTEIN EXPRESSION IN CELLS FROM PATIENTS WITH DYSFERLINOPATHY
PH12021550254A1 (en) 2018-08-03 2023-02-06 Genzyme Corp Variant rnai against alpha-synuclein
CN109022487A (zh) * 2018-08-15 2018-12-18 上海市第人民医院 一种表达p65的基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物
KR20210084459A (ko) 2018-09-26 2021-07-07 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 표적화된 유전자 요법을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물
SG11202103151RA (en) 2018-09-28 2021-04-29 Voyager Therapeutics Inc Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
WO2020077091A1 (en) * 2018-10-10 2020-04-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Kir 7.1 gene therapy vectors and methods of using the same
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
EP3863662A1 (en) * 2018-10-12 2021-08-18 Genzyme Corporation Generation of improved human pah for treatment of severe pku by liver-directed gene replacement therapy
UY38407A (es) 2018-10-15 2020-05-29 Novartis Ag Anticuerpos estabilizadores de trem2
WO2020099956A1 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Indian Institute Of Technology Kanpur A process for producing a plurality of sumoylation target-site modified aav vector and product thereof
CA3120923A1 (en) * 2018-11-26 2020-06-04 Universitat Autonoma De Barcelona Fibroblast growth factor 21 (fgf21) gene therapy
JP7558167B2 (ja) 2018-12-03 2024-09-30 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム オリゴベンズアミド類似体およびがん処置におけるそれらの使用
US20220089670A1 (en) * 2018-12-28 2022-03-24 University Of Rochester Gene Therapy for BEST1 Dominant Mutations
WO2020142653A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Gene therapy constructs for treating wilson disease
CN113631225A (zh) 2019-01-18 2021-11-09 沃雅戈治疗公司 用于生产aav颗粒的方法和系统
CA3125294A1 (en) * 2019-01-23 2020-07-30 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Highly efficient transduction and lateral spread in the retina by a novel aav virus enhanced by rational design
CN113518784A (zh) 2019-01-28 2021-10-19 科巴公司 治疗性肽
FI3850089T3 (fi) 2019-02-04 2024-02-14 Freeline Therapeutics Ltd Polynukleotidejä
US20200297869A1 (en) * 2019-03-04 2020-09-24 Adverum Biotechnologies, Inc. Sequential intravitreal administration of aav gene therapy to contralateral eyes
JP7549360B2 (ja) * 2019-03-04 2024-09-11 デューク ユニバーシティ 網膜症の診断および処置のための組成物および方法
WO2020182722A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 Universite Paris-Saclay Improved therapeutic method for rare ocular diseases by gene replacement
CN113727992A (zh) 2019-03-21 2021-11-30 斯特里迪比奥公司 重组腺相关病毒载体
WO2020210713A1 (en) * 2019-04-10 2020-10-15 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
EP3966227A1 (en) 2019-05-07 2022-03-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
US12491263B2 (en) 2019-05-13 2025-12-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Polymer-based implant for retinal therapy and methods of making and using the same
KR20220009427A (ko) * 2019-05-17 2022-01-24 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 글리코시드 가수분해효소를 사용하는 망막 세포에 대한 유전자 치료 벡터의 개선된 전달
MX2021015076A (es) * 2019-06-10 2022-06-02 Homology Medicines Inc Composiciones de virus adeno-asociados para transferencia del gen de la enzima lisosomal arilsulfatasa-a (arsa) y metodos de uso de las mismas.
WO2020264438A2 (en) 2019-06-27 2020-12-30 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Enhancing aav-mediated transduction of ocular tissues with hyaluronic acid
US11446084B2 (en) 2019-07-12 2022-09-20 Neuralink Corp. Laser drilling of pia mater
HRP20241647T1 (hr) * 2019-07-15 2025-02-14 Meiragtx Uk Ii Limited Modificirani proteini aav kapsida za liječenje artritične bolesti
CN110295151A (zh) * 2019-07-17 2019-10-01 博鑫仪器(天津)有限公司 一类腺依赖病毒病毒重组质粒、重组病毒及构建方法
WO2021041324A2 (en) * 2019-08-23 2021-03-04 Duke University Compositions and methods for the treatment of pathological pain and itch
WO2021046155A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Voyager Therapeutics, Inc. Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations
EP4025258A4 (en) * 2019-09-03 2023-09-06 University of Cincinnati METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
JP2022551487A (ja) * 2019-10-10 2022-12-09 ソリッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレーテッド 改変されたａａｖカプシドおよびその使用
TW202128736A (zh) 2019-10-17 2021-08-01 美商史崔德生物公司 用於治療ｃ型尼曼—匹克病之腺相關病毒載體
CA3155154A1 (en) * 2019-10-23 2021-04-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for drg-specific reduction of transgene expression
US20220396808A1 (en) * 2019-11-08 2022-12-15 President And Fellows Of Harvard College Viral capsid polypeptides
CN113025618B (zh) * 2019-12-24 2024-02-06 朗信启昇(苏州)生物制药有限公司 一种x连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用
AU2021213786A1 (en) 2020-01-29 2022-09-22 Genzyme Corporation Modified adeno-associated viral capsid proteins for ocular gene therapy and methods of use thereof
KR20220150906A (ko) * 2020-02-07 2022-11-11 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 신경변성의 발병 지연 또는 치료를 위한 대사체의 재프로그래밍
JP2023515795A (ja) * 2020-02-18 2023-04-14 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル Ａａｖカプシド－プロモーター相互作用および細胞選択的遺伝子発現
EP4110913A4 (en) * 2020-02-28 2024-07-24 University of Massachusetts OLIGONUCLEOTIDES FOR PRNP MODULATION
CN115379834A (zh) * 2020-03-11 2022-11-22 马萨诸塞眼科耳科诊所 用于nmnat1相关视网膜变性的基因疗法
US20230138766A1 (en) * 2020-03-31 2023-05-04 University Of Massachusetts Aav capsids variants and uses thereof
WO2021209521A1 (en) * 2020-04-14 2021-10-21 Genethon Vectors for the treatment of acid ceramidase deficiency
MX2022012752A (es) 2020-04-15 2023-01-16 Voyager Therapeutics Inc Compuestos de union a tau.
US20230203102A1 (en) 2020-05-13 2023-06-29 Voyager Therapeutics, Inc. Redirection of tropism of aav capsids
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
JP2023529503A (ja) * 2020-06-13 2023-07-10 オクロジェネクス インコーポレイテッド 網膜症のためのａａｖ媒介性遺伝子導入
CN113952472A (zh) * 2020-07-21 2022-01-21 英斯培瑞有限公司 用于治疗眼部疾病的组合物和方法
WO2022017630A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Ucl Business Ltd GENE THERAPY VECTOR FOR eEF1A2 AND USES THEREOF
CA3190309A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
US20230285596A1 (en) 2020-07-27 2023-09-14 Voyager Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease
BR112023001336A2 (pt) 2020-08-05 2023-02-14 Spacecraft Seven Llc Terapia gênica de csrp3 (proteína 3 rica em cisteína e glicina)
CN116194154A (zh) 2020-08-07 2023-05-30 太空飞船七有限责任公司 使用aav载体的plakophilin-2(pkp2)基因疗法
TW202227632A (zh) 2020-08-19 2022-07-16 美商史崔德生物公司 用於治療雷特症候群之腺相關病毒載體
US20230330267A1 (en) * 2020-09-04 2023-10-19 Ohio State Innovation Foundation Novel engineered capsid serotype of recombinant adeno-associated viral vector with enhanced transduction efficiency and widespread distribution in the brain
WO2022087238A1 (en) * 2020-10-21 2022-04-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Anti-apoptotic vector and method of using the same
US20220160825A1 (en) * 2020-11-25 2022-05-26 The Penn State Research Foundation Brain repair after traumatic brain injury through neurod1-mediated astrocyte-to-neuron conversion
WO2022178410A1 (en) * 2021-02-22 2022-08-25 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Viral vector-based gene therapy for ocular conditions
CN115044614B (zh) * 2021-03-09 2023-10-20 上海目镜生物医药科技有限公司 一种用于基因靶向与表达的aav-8型血清型的改造型载体及其构建方法及应用
EP4329824A4 (en) * 2021-04-26 2025-08-20 Grace Science Llc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NGYL1 DEFICIENCY
EP4399314A4 (en) * 2021-09-06 2025-09-10 Huidagene Therapeutics Singapore Pte Ltd TREATMENT OF EYE DISEASES AND DISORDERS ASSOCIATED WITH RPE65
US20250049955A1 (en) 2021-11-17 2025-02-13 Voyager Therapeutics, Inc. Compositons and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
WO2023093905A1 (zh) 2021-11-29 2023-06-01 上海瑞宏迪医药有限公司 Aadc、gdnf多核苷酸及其用于治疗帕金森病
WO2023155918A1 (zh) 2022-02-21 2023-08-24 上海瑞宏迪医药有限公司 Vegf结合分子及其医药用途
EP4499154A1 (en) * 2022-03-25 2025-02-05 REGENXBIO Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
CN119487188A (zh) * 2022-04-19 2025-02-18 上海天泽云泰生物医药有限公司 用于治疗神经退行性障碍的重组aav载体
US20250171778A1 (en) * 2022-04-25 2025-05-29 Myrtelle Inc. Treatments of Disorders of Myelin
AU2023260469A1 (en) 2022-04-25 2024-11-14 Cell Cure Neurosciences, Ltd. Methods and compositions for treating vision loss
US20250353883A1 (en) 2022-05-06 2025-11-20 Novartis Ag Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides
WO2023240220A1 (en) * 2022-06-09 2023-12-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Aav-sgsh vectors for treatment of mucopolysaccharidosis iiia
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders
WO2024008950A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Ospedale San Raffaele S.R.L. Transgene cassettes
EP4303226A1 (en) 2022-07-08 2024-01-10 Ospedale San Raffaele S.r.l. Transgene cassettes and epigenetic silencers for the treatment of disorders
AU2023306319A1 (en) * 2022-07-12 2025-02-13 The Research Institute At Nationwide Children's Hospital Adeno-associated virus gene therapy products and methods
AU2023427408A1 (en) 2023-02-02 2025-09-04 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
WO2024218311A1 (fr) 2023-04-21 2024-10-24 Pulsesight Therapeutics Compositions à base de décorine pour la réparation et la régéneration de l'épithélium pigmentaire de la rétine
GB202306952D0 (en) * 2023-05-11 2023-06-28 Neurochase Innovations Ltd Method
WO2025128817A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting tau
WO2025160452A1 (en) 2024-01-25 2025-07-31 Genzyme Corporation Methods for fus-based delivery of viral particles to the brain
WO2025160434A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting huntington's disease
WO2025160429A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Genzyme Corporation Artificial micrornas targeting snca

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4692147A (en) 1980-04-02 1987-09-08 Medtronic, Inc. Drug administration device
US5735815A (en) 1993-07-26 1998-04-07 Sentinel Medical, Inc. Method of using fluid jet surgical cutting tool
EP0931158A1 (en) 1996-09-06 1999-07-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
NZ500427A (en) 1997-04-21 2002-12-20 Univ Florida The use of ribozyme treatment for retinal diseases
US6042579A (en) 1997-04-30 2000-03-28 Medtronic, Inc. Techniques for treating neurodegenerative disorders by infusion of nerve growth factors into the brain
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
ES2326893T3 (es) 1998-05-27 2009-10-21 Genzyme Corporation Vectores aav para la fabricacion de medicamentos para administracion potenciada por conveccion.
DE60039766D1 (de) 1999-08-09 2008-09-18 Targeted Genetics Corp Terologen nukleotidsequenz von einem rekombinanten viralen vektor durch ausgestaltung der sequenz in einer art und weise, dass basenpaarungen innerhalb der sequenz entstehen
ES2256265T3 (es) 2000-06-01 2006-07-16 University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de parvovirus duplicados.
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
GB2389791B (en) 2002-04-30 2006-12-13 Steven Gill Implantable drug delivery pump
US20060093589A1 (en) * 2004-02-19 2006-05-04 Warrington Kenneth H Vp2-modified raav vector compositions and uses therefor
DK1496944T3 (da) 2002-05-01 2008-12-01 Univ Florida Forbedrede rAAV-ekspressionssystemer til genetisk modificering af specifikke sapsid-proteiner
AU2004226961B2 (en) * 2002-05-01 2009-06-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. VP2-modified rAAV vector compositions and uses therefor
PT1625210E (pt) 2003-05-21 2011-03-15 Genzyme Corp Métodos para produzir preparações de vírions de aav recombinantes substancialmente livres de capsídeos vazios
EP1486567A1 (en) * 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
PL3235827T3 (pl) * 2003-06-19 2021-07-05 Genzyme Corporation Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowania
CA2581714C (en) 2004-10-05 2017-09-12 Avigen, Inc. Stepped cannula
EP2357010B1 (en) * 2005-04-07 2013-06-12 The Trustees of The University of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
WO2007024841A2 (en) 2005-08-23 2007-03-01 The Regents Of The University Of California Reflux resistant cannula and system for chronic delivery of therapeutic agents using convection-enhanced delivery
US7867484B2 (en) * 2006-01-27 2011-01-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
SI2019683T2 (sl) 2006-04-25 2022-10-28 The Regents Of The University Of California Dajanje rastnih faktorjev za zdravljenje motenj CŽS
EP2023949A4 (en) 2006-04-26 2009-08-26 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR CONVECTION-REINFORCED RELEASE OF NEUROTHERAPEUTICS WITH HIGH MOLECULAR WEIGHT
US20090317417A1 (en) 2006-04-28 2009-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified AAV Vectors Having Reduced Capsid Immunogenicity and Use Thereof
WO2008144585A1 (en) 2007-05-17 2008-11-27 Medgenesis Therapeutix Inc. Convection-enhanced delivery catheter with removable stiffening member and method for using same
US20100081707A1 (en) 2008-02-21 2010-04-01 Ali Robin R Devices and methods for delivering polynucleotides into retinal cells of the macula and fovea
BRPI1007155A2 (pt) 2009-01-29 2017-05-30 Univ Of California San Francisco métodos para tratar um distúrbio neurológico cortical, e para dispensar um agente terapêutico para o córtex em um primata
ES2634118T3 (es) 2009-02-11 2017-09-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de virus modificados y métodos para fabricar y utilizar los mismos
CN102803478B (zh) 2009-06-16 2016-04-27 建新公司 用于纯化重组aav载体的改进方法
EP3514232A1 (en) 2010-04-23 2019-07-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
RS66184B1 (sr) * 2011-04-22 2024-12-31 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
TWI775096B (zh) * 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
WO2015012501A1 (ko) 2013-07-25 2015-01-29 주식회사 스마트캐스터 비공기압 바퀴
GB201403684D0 (en) * 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
EP4600255A3 (en) 2014-05-02 2025-10-22 Genzyme Corporation Aav vectors for retinal and cns gene therapy

Also Published As

Publication number Publication date
CA2946593A1 (en) 2015-11-05
SG10201809739QA (en) 2018-12-28
AU2023285817A1 (en) 2024-01-18
AU2015252797B2 (en) 2020-10-15
US20250320522A1 (en) 2025-10-16
EP3137497B2 (en) 2025-03-05
MX2022012490A (es) 2022-10-27
GT201600227A (es) 2018-01-22
JP7682142B2 (ja) 2025-05-23
CN114231563B (zh) 2024-08-16
SG10201912977RA (en) 2020-02-27
PL3137497T3 (pl) 2021-10-25
JP2020164540A (ja) 2020-10-08
HUE054768T2 (hu) 2021-09-28
SG11201607991WA (en) 2016-10-28
SI3137497T1 (sl) 2021-08-31
PL3137497T4 (pl) 2023-04-11
AU2015252797A1 (en) 2016-11-17
BR112016025263A2 (pt) 2018-02-20
CR20160555A (es) 2017-01-27
KR20240032156A (ko) 2024-03-08
MX2016014220A (es) 2017-02-06
CN106661591B (zh) 2021-10-29
EP3137497B1 (en) 2021-04-07
IL248102B (en) 2022-07-01
JP2023011812A (ja) 2023-01-24
PE20170260A1 (es) 2017-04-12
PT3137497T (pt) 2021-07-12
CL2016002713A1 (es) 2017-08-11
IL292951A (en) 2022-07-01
HRP20211024T4 (hr) 2025-06-20
WO2015168666A3 (en) 2015-12-23
JP2017518271A (ja) 2017-07-06
KR20160147974A (ko) 2016-12-23
AU2021200242B9 (en) 2023-10-05
DOP2016000280A (es) 2016-11-30
JP6741591B2 (ja) 2020-08-19
PH12016502046A1 (en) 2017-02-06
CL2018000170A1 (es) 2018-06-29
SI3137497T2 (sl) 2025-07-31
EA034355B1 (ru) 2020-01-30
FI3137497T4 (fi) 2025-06-02
AU2015252797C1 (en) 2021-04-22
CN106661591A (zh) 2017-05-10
IL292951B1 (en) 2024-06-01
EP4600255A3 (en) 2025-10-22
CN114231563A (zh) 2022-03-25
DK3137497T4 (da) 2025-05-26
LT3137497T (lt) 2021-07-26
EP4600255A2 (en) 2025-08-13
US10982228B2 (en) 2021-04-20
IL248102A0 (en) 2016-11-30
MY188987A (en) 2022-01-17
ES2879636T3 (es) 2021-11-22
US12241078B2 (en) 2025-03-04
ZA201606763B (en) 2023-05-31
US20170096683A1 (en) 2017-04-06
EP3137497A2 (en) 2017-03-08
EP3913061A1 (en) 2021-11-24
US20210189430A1 (en) 2021-06-24
KR20250141850A (ko) 2025-09-29
RS62078B1 (sr) 2021-07-30
JP2025065116A (ja) 2025-04-17
WO2015168666A2 (en) 2015-11-05
TWI686476B (zh) 2020-03-01
UY36106A (es) 2015-11-30
AU2021200242A1 (en) 2021-03-18
EA201692206A1 (ru) 2017-03-31
JP7174011B2 (ja) 2022-11-17
IL292951B2 (en) 2024-10-01
TW201625792A (zh) 2016-07-16
KR102863726B1 (ko) 2025-09-25
DK3137497T3 (da) 2021-07-12
HRP20211024T1 (hr) 2021-10-01
PL3137497T5 (pl) 2025-06-09
AU2021200242B2 (en) 2023-09-21
ES2879636T5 (en) 2025-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12241078B2 (en) AAV vectors for retinal and CNS gene therapy
HK40064049A (en) Aav vectors for retinal and cns gene therapy
HK40071052B (zh) 用於视网膜及cns基因疗法的aav载体
HK40071052A (en) Aav vectors for retinal and cns gene therapy
HK1234076B (en) Aav vectors for retinal and cns gene therapy
BR112016025263B1 (pt) Usos: de uma partícula de vírus adenoassociado recombinante (raav), de um kit, e de uma composição compreendendo uma partícula de vírus adenoassociado recombinante (raav)
BR122020026753B1 (pt) Uso de uma partícula de vírus adenoassociado recombinante (raav) na fabricação de um medicamento para distribuir um ácido nucleico heterólogo ao olho de um indivíduo