JP2022551487A - 改変されたａａｖカプシドおよびその使用 - Google Patents

改変されたａａｖカプシドおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書に記載の本発明は、筋肉組織における目的の遺伝子（ＧＯＩ）の優先的な標的化発現を可能にする改変されたＶＰ１カプシドならびに改変されたＶＰ１カプシドでパッケージ化されたＧＯＩを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびにそれらの使用を提供する。

Description

関連出願の参照
本出願は、２０１９年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６２／９１３，２２３号および２０２０年５月８日出願の米国仮特許出願第６３／０２１，７１２号の出願日の利益を主張するものであり、そのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、インビボ遺伝子送達の主要なプラットフォームとしての大きな可能性を実証する。種々のｒＡＡＶベクターは、多くの遺伝性疾患および他の複雑な疾患の処置のための筋肉系を含めた複数の組織への送達を可能にする。一部の天然の血清型ならびに操作されたｒＡＡＶカプシドは、筋肉への広範囲な体内分布の増進を示し、必要な総投与量を低減させ得る。
以前は、筋肉へのｒＡＡＶベクターの直接の注入によって筋肉の遺伝子送達が実施された。より最近では、ｒＡＡＶの静脈内（ＩＶ）投与が多くの種類の筋肉への分布を促進するために次第に利用されるようになっており、現在では複数の臨床試験の好ましい投与経路である。
発明を解決するための手段
本発明の一側面は、配列番号１～１２からなる群から選択されるポリペプチドを含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドの残基５８８と５８９の間、あるいは非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ１／６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０もしくはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシドの対応する２残基の間に挿入されているアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドを提供する。すなわち、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドの残基５８８と５８９の間、あるいは非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０もしくはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシドの対応する２残基の間に挿入された配列番号１～１２のいずれか１つのポリペプチド以外には、野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶ９またはＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０またはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシド中に他の配列変化は存在しない。
つまり、本発明は、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドの残基５８８と５８９の間、あるいは非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０もしくはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシドの対応する２残基の間に挿入されたポリペプチドを含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドの残基５８８と５８９の間、あるいは非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０もしくはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシドの対応する２残基の間に挿入された前記ポリペプチドが、配列番号１～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、配列番号１～１２のいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になるか、または配列番号１～１２のいずれか１つのアミノ酸配列からなるアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドを提供する。
特定の態様では、ｍＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号１、１１または１２のポリペプチドを含む。
すなわち、本発明の特定の側面は、配列番号１のポリペプチドを含むか、配列番号１のポリペプチドから本質的になるか、または配列番号１のポリペプチドからなる、改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドを提供する。
関係する特定の側面では、本発明は、配列番号１１のポリペプチドを含むか、配列番号１１のポリペプチドから本質的になるか、または配列番号１１のポリペプチドからなる、改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドを提供する。
さらに別の特定の側面では、本発明は、配列番号１２のポリペプチドを含むか、配列番号１２のポリペプチドから本質的になるか、または配列番号１２のポリペプチドからなる、改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドを提供する。
本発明の別の側面は、本明細書に記載の主題のｍＡＡＶカプシドポリペプチドのいずれか１つを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ、例えば組換え型の、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．７４またはＡＡＶ９）を提供する。
特定の態様では、ｒＡＡＶのＶＰ１カプシドは、本発明のｍＡＡＶカプシドポリペプチドのいずれか１つからなるか、または本発明のｍＡＡＶカプシドポリペプチドのいずれか１つから本質的になる。
特定の態様では、ｒＡＡＶは、１対のＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む。
特定の態様では、１対のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．７４またはＡＡＶ９のＩＴＲ配列である。
特定の態様では、目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因となる遺伝子／それらにおいて欠陥のある遺伝子、またはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群すなわちムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に対して）、スルファミダーゼすなわちＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型すなわちＭＰＳ ＩＩＩＡに対して）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症すなわちＳＭＡに対して）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ ＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に対して）、アルファ－ガラクトシダーゼＡすなわちＧＬＡ（ファブリー病に対して）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンもしくはマイクロジストロフィンの遺伝子またはコード配列を含む。
特定の態様では、ＧＯＩはマイクロジストロフィンをコードする。
特定の態様では、マイクロジストロフィンは、米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，００１，７６１号；米国特許第７，５１０，８６７号；米国特許第６，８６９，７７７号；米国特許第８，５０１，９２０号；米国特許第７，８９２，８２４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３または米国特許第１０，１６６，２７２号に記載のものである。
特定の態様では、マイクロジストロフィンは、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１６およびＲ１７スペクトリン様リピート（例えば米国特許第７，８９２，８２４号に記載のもの）のコード配列を含む。
特定の態様では、マイクロジストロフィンは、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３およびＲ２４スペクトリン様リピート；または国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３もしくは米国特許第１０，４７９，８２１号に記載のマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列を含む。
特定の態様では、ＧＯＩは、転写調節カセット、例えば筋肉特異的プロモーター（例えばＣＫ８プロモーターまたは心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター）に動作可能なように連結される。
特定の態様では、ＧＯＩは、ＮからＣ末端にかけて、アミノ末端アクチン結合（ＡＢ１）ドメイン、β－ジストログリカン結合ドメイン、ヒンジ１ドメイン（Ｈ１）、スペクトリン様リピート１（ＳＲ１）、スペクトリン様リピート１６（ＳＲ１６）、スペクトリン様リピート１７（ＳＲ１７）、スペクトリン様リピート２３（ＳＲ２３）およびスペクトリン様リピート２４（ＳＲ２４）を含む５つのスペクトリン様リピートからなるスペクトリン様リピートドメイン、ならびにヒンジ４ドメイン（Ｈ４）を含むタンパク質をコードするマイクロジストロフィン遺伝子であり、マイクロジストロフィン遺伝子は筋肉特異的なヒト筋肉クレアチンキナーゼＣＫ８プロモーター（例えば米国特許第１０，４７９，８２１号の配列番号１９）に動作可能なように連結され、ＧＯＩは１対のＡＡＶ２ ＩＴＲ（逆位末端リピート）配列と隣接する。
本発明の別の側面は、本発明の改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドまたはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。
特定の態様では、ポリヌクレオチドは哺乳動物発現用にコドン最適化される。
本発明の別の側面は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
特定の態様では、ベクターはプラスミドまたはウイルスベクター（例えばＨＳＶベクターもしくはＡＡＶベクター）である。
本発明の別の側面は、（ａ）（１）本発明の改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチド、または（２）（１）に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列、をコードする組換え核酸分子であって、任意選択で異種の非ＡＡＶ配列をさらに含む組換え核酸分子；あるいは（ｂ）本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、を含む培養宿主細胞を提供する。
本発明の別の側面は、処置を必要とする対象における筋ジストロフィー等の疾患または状態を処置する方法であって、対象に治療有効量の本発明のｒＡＡＶのいずれか１つを投与するステップを含む方法を提供する。
特定の態様では、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドを有する他の点では同一の参照ｒＡＡＶと比較した場合、ｒＡＡＶのＧＯＩは、心筋、骨格筋および／または平滑筋（例えば横隔膜における平滑筋）において優先的に発現する。
特定の態様では、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドを有する他の点では同一の参照ｒＡＡＶと比較した場合、ｒＡＡＶのＧＯＩは、肝臓中に統計学的に有意に低いレベルで発現する。
特定の態様では、筋ジストロフィーはＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）またはＢＭＤ（ベッカー型筋ジストロフィー）である。
特定の態様では、（１）筋ジストロフィーはＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）または脊髄性筋萎縮症すなわちＳＭＡであるか；
（２）疾患または状態は、サンフィリポ症候群すなわちムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型すなわちＭＰＳ ＩＩＩＡ、ポンペ病またはファブリー病であるか；あるいは、
（３）疾患または状態は、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ ＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）またはグルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子における遺伝子欠陥によって特徴づけられるかまたはそれに起因する。
本発明の別の側面は、本発明のｍＡＡＶカプシドポリペプチドのいずれか１つを含むｒＡＡＶを産生する方法であって、本発明のｍＡＡＶカプシドポリペプチドのいずれか１つを発現する産生細胞株すなわちパッケージング細胞株に、１対のＩＴＲ配列と隣接するＧＯＩをコードするｒＡＡＶベクターを導入するステップを含む方法を提供する。
特定の態様では、産生細胞株すなわちパッケージング細胞株を、本発明のｍＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするＨＳＶベクターに感染させる。
特定の態様では、産生細胞株すなわちパッケージング細胞株を、本発明のｍＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするコード（endoing）配列でトランスフェクトする。
特定の態様では、産生細胞株すなわちパッケージング細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞である。
明確に否定されない限りまたは明確に不適切でない限り、実施例でのみまたは本発明の一側面下でのみ記載されるものを含めた本発明の任意の１つの態様は、任意の１つまたは複数の本発明の他の態様と組み合わせることができると理解されるべきである。
図１Ａ～図１Ｅは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８を、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシド（図中では「ＡＡＶ－１０１」と略記される、または他では「ＳＬＢ１０１」、「ＳＬＢ－１０１」もしくはそれらの変形で称される）と比較した、インビトロ効力アッセイを示す。 図１Ａ～図１Ｅは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８を、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシド（図中では「ＡＡＶ－１０１」と略記される、または他では「ＳＬＢ１０１」、「ＳＬＢ－１０１」もしくはそれらの変形で称される）と比較した、インビトロ効力アッセイを示す。 図１Ａ～図１Ｅは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８を、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシド（図中では「ＡＡＶ－１０１」と略記される、または他では「ＳＬＢ１０１」、「ＳＬＢ－１０１」もしくはそれらの変形で称される）と比較した、インビトロ効力アッセイを示す。 図１Ａ～図１Ｅは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８を、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシド（図中では「ＡＡＶ－１０１」と略記される、または他では「ＳＬＢ１０１」、「ＳＬＢ－１０１」もしくはそれらの変形で称される）と比較した、インビトロ効力アッセイを示す。 図１Ａ～図１Ｅは、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８を、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシド（図中では「ＡＡＶ－１０１」と略記される、または他では「ＳＬＢ１０１」、「ＳＬＢ－１０１」もしくはそれらの変形で称される）と比較した、インビトロ効力アッセイを示す。 図２Ａおよび２Ｂは、Ｃ２Ｃ１２細胞と患者由来ＤＭＤムーリー細胞（ＤＭＤ Ｍｏｕｌｙ ｃｅｌｌ）の両方における、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８を主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシドと比較したインビトロ効力アッセイを示す。 図２Ａおよび２Ｂは、Ｃ２Ｃ１２細胞と患者由来ＤＭＤムーリー細胞（ＤＭＤ Ｍｏｕｌｙ ｃｅｌｌ）の両方における、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８を主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシドと比較したインビトロ効力アッセイを示す。 図３Ａ～３Ｃは、ＡＡＶ９と比較した主題のｒＡＡＶカプシドについての、３種の筋肉組織のすべてにおける肝臓組織と比べて良好な体内分布および高レベルのマイクロジストロフィン発現、ならびに末梢組織、例えば肺、脾臓、腎臓、および脳における発現の差の欠如を示す。 図３Ａ～３Ｃは、ＡＡＶ９と比較した主題のｒＡＡＶカプシドについての、３種の筋肉組織のすべてにおける肝臓組織と比べて良好な体内分布および高レベルのマイクロジストロフィン発現、ならびに末梢組織、例えば肺、脾臓、腎臓、および脳における発現の差の欠如を示す。 図３Ａ～３Ｃは、ＡＡＶ９と比較した主題のｒＡＡＶカプシドについての、３種の筋肉組織のすべてにおける肝臓組織と比べて良好な体内分布および高レベルのマイクロジストロフィン発現、ならびに末梢組織、例えば肺、脾臓、腎臓、および脳における発現の差の欠如を示す。 図４は、野生型ＡＡＶ９カプシドと比較した、本発明の新規カプシドの産生収量を示す。主題のＡＡＶカプシドの拡張パネル（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎｅｌ）（ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１～ＡＡＶ－ＳＬＢ１１２）を、接着２９３Ｔ細胞のトリプルトランスフェクションおよび段階的なイオジキサノール超遠心分離による精製からのＡＡＶ収量について、野生型ＡＡＶ９と比較した。さらなる２つの改変されたカプシドＡＡＶ－ＳＬＢ１１３およびＡＡＶ－ＳＬＢ１１４（以下の図６中の配列アライメントを参照のこと）も比較に含めた。 図５Ａ～５Ｃは、Ｃ２Ｃ１２細胞における、野生型ＡＡＶ９カプシドとの比較のための、主題の改変されたＡＡＶカプシドのインビトロでの特徴づけの結果を示す。具体的には、図５Ａは、４℃で１時間インキュベーションした後に単離されたＤＮＡのｑＰＣＲによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞の細胞表面に結合するＡＡＶカプシドの定量化を示す。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１（ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ－ＳＬＢ１１２（ｐ＜０．０１）およびＡＡＶ－ＳＬＢ１１４（ｐ＜０．００１）は、ＡＡＶ９よりも有意に多くＣ２Ｃ１２細胞に結合する。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。図５Ｂは、４℃で１時間インキュベーションした後にさらに３７℃で１時間インキュベーションした後に単離されたＤＮＡのｑＰＣＲによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞へのＡＡＶの取り込みの定量化を示す。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１０８、１１１、１１２、１１３、１１４は、ＡＡＶ９よりも有意に多く、Ｃ２Ｃ１２細胞によって吸収された（ｐ＜０．０００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。図５Ｃでは、Ｃ２Ｃ１２細胞を、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１および１３個のさらなるカプシド（ＡＡＶ－ＳＬＢ１０２～ＡＡＶ－ＳＬＢ１１４）中にパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ベクターで形質導入した。形質導入後９６時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。示されるデータはＡＡＶ９に対して正規化されており、表には倍率変化が示される。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１１１、１１２および１１３は、ＡＡＶ９と比べてマイクロジストロフィンタンパク質発現が最も高く（ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０９および１１４は、ＡＡＶ９よりもわずかにのみ高い発現をもたらした（ｐ＜０．００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。 図５Ａ～５Ｃは、Ｃ２Ｃ１２細胞における、野生型ＡＡＶ９カプシドとの比較のための、主題の改変されたＡＡＶカプシドのインビトロでの特徴づけの結果を示す。具体的には、図５Ａは、４℃で１時間インキュベーションした後に単離されたＤＮＡのｑＰＣＲによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞の細胞表面に結合するＡＡＶカプシドの定量化を示す。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１（ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ－ＳＬＢ１１２（ｐ＜０．０１）およびＡＡＶ－ＳＬＢ１１４（ｐ＜０．００１）は、ＡＡＶ９よりも有意に多くＣ２Ｃ１２細胞に結合する。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。図５Ｂは、４℃で１時間インキュベーションした後にさらに３７℃で１時間インキュベーションした後に単離されたＤＮＡのｑＰＣＲによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞へのＡＡＶの取り込みの定量化を示す。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１０８、１１１、１１２、１１３、１１４は、ＡＡＶ９よりも有意に多く、Ｃ２Ｃ１２細胞によって吸収された（ｐ＜０．０００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。図５Ｃでは、Ｃ２Ｃ１２細胞を、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１および１３個のさらなるカプシド（ＡＡＶ－ＳＬＢ１０２～ＡＡＶ－ＳＬＢ１１４）中にパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ベクターで形質導入した。形質導入後９６時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。示されるデータはＡＡＶ９に対して正規化されており、表には倍率変化が示される。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１１１、１１２および１１３は、ＡＡＶ９と比べてマイクロジストロフィンタンパク質発現が最も高く（ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０９および１１４は、ＡＡＶ９よりもわずかにのみ高い発現をもたらした（ｐ＜０．００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。 図５Ａ～５Ｃは、Ｃ２Ｃ１２細胞における、野生型ＡＡＶ９カプシドとの比較のための、主題の改変されたＡＡＶカプシドのインビトロでの特徴づけの結果を示す。具体的には、図５Ａは、４℃で１時間インキュベーションした後に単離されたＤＮＡのｑＰＣＲによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞の細胞表面に結合するＡＡＶカプシドの定量化を示す。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１（ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ－ＳＬＢ１１２（ｐ＜０．０１）およびＡＡＶ－ＳＬＢ１１４（ｐ＜０．００１）は、ＡＡＶ９よりも有意に多くＣ２Ｃ１２細胞に結合する。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。図５Ｂは、４℃で１時間インキュベーションした後にさらに３７℃で１時間インキュベーションした後に単離されたＤＮＡのｑＰＣＲによって測定された、Ｃ２Ｃ１２細胞へのＡＡＶの取り込みの定量化を示す。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１０８、１１１、１１２、１１３、１１４は、ＡＡＶ９よりも有意に多く、Ｃ２Ｃ１２細胞によって吸収された（ｐ＜０．０００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。図５Ｃでは、Ｃ２Ｃ１２細胞を、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１および１３個のさらなるカプシド（ＡＡＶ－ＳＬＢ１０２～ＡＡＶ－ＳＬＢ１１４）中にパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ベクターで形質導入した。形質導入後９６時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。示されるデータはＡＡＶ９に対して正規化されており、表には倍率変化が示される。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１１１、１１２および１１３は、ＡＡＶ９と比べてマイクロジストロフィンタンパク質発現が最も高く（ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０９および１１４は、ＡＡＶ９よりもわずかにのみ高い発現をもたらした（ｐ＜０．００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。 図６は、野生型ＡＡＶ９、およびＳＬＢ１０１～ＳＬＢ１１４（それぞれ、２行目から１６行目）の配列アライメントならびに共通配列（最上部の１行目の配列）を示す。野生型ＡＡＶ９、ＳＬＢ１０１、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ１１４の間の、より狭い領域のアライメントも含まれる。 図７は、心臓、四頭筋（ｑｕａｄ）および横隔膜の筋肉ならびに肝臓における、野生型ＡＡＶ９と比較した、バリアントカプシドＳＬＢ－１０１、ＳＬＢ－１０２、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４を有するＡＡＶ９バリアントウイルスの体内分布を示す。統計学的有意水準が異なる場合は「＊」で示される。 図８は、肺、腎臓、脳および脾臓における、野生型ＡＡＶ９と比較した、バリアントカプシドＳＬＢ－１０１、ＳＬＢ－１０２、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４を有するＡＡＶ９バリアントウイルスの広範な体内分布を示す。統計学的有意水準が異なる場合は「＊」で示される。 図９は、野生型ＡＡＶ９と比較した、バリアントＡＡＶ９カプシドＳＬＢ－１０１、ＳＬＢ－１０２、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４を有するＡＡＶ９ベクターによってコードされるマイクロジストロフィン発現を示す。統計学的有意水準が異なる場合は「＊」で示される。
１．概要
本明細書に記載の本発明は、野生型のカプシドよりも優れた体内分布を示す最適化されたｒＡＡＶカプシドに部分的に基づく、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の最適化された送達を提供する。改変されたＶＰ１カプシドを有するそのようなｒＡＡＶを使用して、ＧＯＩを、より高い発現レベルおよび／またはより低い用量で筋肉組織に優先的に送達することができ、これにより、筋肉組織（例えば骨格、心臓および／または平滑筋の組織）を標的化する遺伝子治療のより大きな成功を促進する。
具体的には、本発明の一側面によれば、改変されたＡＡＶカプシド、ならびに筋肉組織および筋細胞型へのＧＯＩの優先的な標的化送達を可能にするＡＡＶカプシド選択のための方法が、本明細書で提供される。
本発明の別の側面によれば、遺伝子治療の成功に必要な有効ＡＡＶ用量の潜在的な低下のための、強力な感染性ＡＡＶカプシドを選択するための方法が本明細書で提供される。
ｒＡＡＶの薬物製品が臨床的に進歩する時、これらの複雑な製品を特徴づけるための分析ツールが必要である。例としては、哺乳動物細胞の宿主またはウイルスのヘルパーＤＮＡの、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、変性ゲル電気泳動およびサザンブロットによる検出および定量化が挙げられる。これらのアッセイおよびさらなるアッセイの開発および検証が、ｒＡＡＶベクターの完全な特徴づけを可能にするであろう。従って、本発明のさらに別の側面は、主題のｒＡＡＶカプシド、ベクターおよび製品、例えば実施例に記載のものを特徴づけるための分析ツールを提供する。
本発明のさらなる側面は、主題のｒＡＡＶカプシドおよびベクターの開発のための決定的なツールとしてのインビトロ効力アッセイを提供する。種々の天然血清型のカプシドおよび操作されたカプシドを有するｒＡＡＶベクターが、全身投与に対するそれらの効果、および遺伝子治療によって処置可能な疾患適応症、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置の開発に対するそれらの可能性を見積もるために比較される。高用量のベクターの全身投与を必要とする適用、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーでは、これらの分析ツールおよびアッセイは、ｒＡＡＶ製品をさらに特徴づけかつ改善する可能性を有しており、それにより遺伝子導入治療の安全性および効果を向上させる。
本発明の詳細な側面が、以下でさらに記載される。
２．改変されたＶＰ１カプシド
本発明の改変されたＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質の残基Ｑ５８８とＡ５８９の間に挿入された約７～１３残基の短ペプチドを有する。特定の態様では、短ペプチドは配列番号１～１２のうちのいずれか１つである。
ＲＧＤＬＧＬＳ（配列番号１）（ＳＬＢ１０１としても知られる）
ＲＧＤＭＳＲＥ（配列番号２）（ＳＬＢ１０２としても知られる）
ＧＥＡＲＩＳＡ（配列番号３）（ＳＬＢ１０３としても知られる）
ＥＳＧＬＳＱＳ（配列番号４）（ＳＬＢ１０４としても知られる）
ＥＹＲＤＳＳＧ（配列番号５）（ＳＬＢ１０５としても知られる）
ＤＬＧＳＡＲＡ（配列番号６）（ＳＬＢ１０６としても知られる）
ＳＧＮＳＧＡＡ（配列番号７）（ＳＬＢ１０７としても知られる）
ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号８）（ＳＬＢ１０８としても知られる）
ＮＤＶＲＳＡＮ（配列番号９）（ＳＬＢ１０９としても知られる）
ＮＤＶＲＡＶＳ（配列番号１０）（ＳＬＢ１１０としても知られる）
ＧＧＧＲＧＤＬＧＬＳＧＧＧ（配列番号１１）（ＳＬＢ１１１としても知られる）
ＧＧＳＲＧＤＬＧＬＳＧＧＳ（配列番号１２）（ＳＬＢ１１２としても知られる）
挿入改変は類似するが、周辺／隣接配列が異なる２つのさらなる配列は、ＳＬＢ１１３およびＳＬＢ１１４と称される（図６を参照のこと）。
野生型（Wile-type）ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質の配列が当分野において知られており、以下に転記する。間に配列番号１～１２のうちの１つが挿入される、残基Ｑ５８８およびＡ５８９に二重下線を引く。
Figure 2022551487000001
特定の態様では、本発明の改変されたＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドは、以下の通り、配列番号１３の残基Ｑ５８８とＡ５８９（両方に二重下線を引く）の間に挿入された、配列番号１のポリペプチド（太字の斜体）を有する：
Figure 2022551487000002
特定の態様では、本発明の改変されたＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドは、以下の通り、配列番号１３の残基Ｑ５８８とＡ５８９（両方に二重下線を引く）の間に挿入された、配列番号１１のポリペプチド（太字の斜体）を有する：
Figure 2022551487000003
特定の態様では、本発明の改変されたＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドは、以下の通り、配列番号１３の残基Ｑ５８８とＡ５８９（両方に二重下線を引く）の間に挿入された、配列番号１２のポリペプチド（太字の斜体）を有する：
Figure 2022551487000004
本発明の改変されたＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドは、特に、心筋（すなわち心臓における筋肉）、骨格筋（例えば大腿四頭筋）および／または平滑筋（例えば横隔膜筋）を含む筋肉組織において、そのような改変されたＡＡＶ９ ＶＰ１カプシド中にパッケージ化されたｒＡＡＶからのＧＯＩの優先的な標的化発現を可能にする。
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、挿入箇所（すなわち、Ｑ５８８のＮ末端の１、２、３、４、５、６、７もしくは８残基および／またはＱ５８８それ自体、ならびに／あるいはＡ５８９のＣ末端の１、２、３、４、５、６、７もしくは８残基および／またはＡ５８９それ自体）の周囲で、ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシド配列中の野生型のアミノ酸配列を変化させることは、組織の標的化および／または標的組織におけるＧＯＩの発現レベルに影響を及ぼす（例えば有害な影響を及ぼす）可能性がある。この影響または変化の一態様は、残基Ｑ５８８およびＡ５８９の周囲と残基Ｑ５８８およびＡ５８９を含む野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシド配列が完全に保存された主題の改変されたＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドでパッケージ化されたＡＡＶと比較した場合の、望ましい特定の（１つまたは複数の）組織、例えば筋肉組織、例えば心臓、骨格および／または平滑筋の（１つまたは複数の）組織のいずれかにおける組織感染速度または発現レベルであり得る。
特定の態様では、ＧＯＩの優先的な発現は、野生型ＡＡＶ９カプシドを使用すること以外の点では同一のｒＡＡＶ構築物と比較して、少なくとも５０％高いか、１００％高い（すなわち２倍）か、３倍か、５倍か、１０倍か、１２倍か、１５倍か、２０倍か、２２倍か、２５倍か、３０倍か、５０倍か、７５倍かまたは１００倍以上である。特定の態様では、増加の倍率は、実施例（明確さのためかつ重複を回避するために参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものと実質的に同様に、インビトロアッセイおよび／またはインビボアッセイに基づいて測定される。例えば、特定の態様では、インビトロ細胞株はＣ２Ｃ１２または患者由来ムーリー細胞である。特定の態様では、インビボアッセイは、ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおいて行われる。
特定の態様では、改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドは、ＡＡＶ９ではなく、非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０またはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシドの野生型の配列に基づく。すなわち、配列番号１～１２からなる群から選択されるポリペプチドは、非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０もしくはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシドの対応する２残基の間に挿入される。
本明細書で使用される場合、「対応する残基」とは、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドの残基５８８および５８９とそれぞれアラインした、非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３７またはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシド中の残基を指す。
本明細書で使用される場合、非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ ＡＡＶはＡＡＶｈｕ．３２を含む。野生型Ｃｌａｄ Ａ ＡＡＶはＡＡＶ１／６、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３およびＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３を含む。野生型Ｃｌａｄ Ｅ ＡＡＶはＡＡＶ８、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．７４およびＡＡＶｒｈ．４３を含む。
例えば、代表的なＣｌａｄ ＡのＡＡＶ６、Ｃｌａｄ ＥのＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ．７４、ならびにＣｌａｄ ＦのＡＡＶ９およびＡＡＶｈｕ．３２中の挿入箇所が、以下に示される。配列の違いのために、ＡＡＶ８の残基Ｎ５９０およびＴ５９１が、ＡＡＶ９の残基Ｑ５８８およびＡ５８９にそれぞれに対応することに留意されたい。
Figure 2022551487000005
３．ｒＡＡＶ中の目的の遺伝子（ＧＯＩ）および処置可能な疾患
改変されたＶＰ１カプシドを有する本発明の組換えＡＡＶベクターは、遺伝子治療によって疾患または状態を処置するための任意の目的の遺伝子（ＧＯＩ）を担持することができる。ＧＯＩは、ｒＡＡＶのパッケージング能力、例えば約４～５ｋｂ、あるいはＩＴＲ配列を含めて約４．７ｋｂまたはＩＴＲ配列を考慮せずに約４．４ｋｂ以内の、任意の遺伝子またはコード配列であることができる。
特定の態様では、ＧＯＩを担持するｒＡＡＶは、宿主における内在性遺伝子の機能の欠如、例えばＧＯＩの欠陥型バージョンに起因する疾患または状態を処置するための遺伝子治療において使用することができる。
本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」すなわちＧＯＩは、一般的には、核酸もしくはポリヌクレオチド配列、例えば遺伝子、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはタンパク質のコード配列、あるいはＲＮＡ、例えはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等を指す。しかし、特定の状況または文脈では、ＧＯＩという用語は、タンパク質（ＧＯＩによってコードされる）、またはＧＯＩによって治療することができる疾患もしくは適応症、またはＧＯＩの機能の喪失に起因し得る（しかし必ずしもそうではない）疾患もしくは適応症のことも広い意味で指す。
例えば、遺伝子ＧＡＬＧＴ２は、ジストログリカンを含む少数の特定のタンパク質上に複合糖質分子を移す酵素であるタンパク質ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（β－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミンガラクトシルトランスフェラーゼ）をコードする。通常の状況下では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは神経筋接合部（ＮＭＪ）にのみ見出され、そこではジストログリカン関連タンパク質複合体（ｄｙｓｔｒｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）の一部の構成要素が、筋肉中のその他の場所とは異なっている。重要なことだが、ＮＭＪでは、ユートロフィンがジストロフィンの代わりに存在する。筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルでは、ＧＡＬＧＴ２のウイルス遺伝子導入は、ＮＭＪの通常の発現ドメインだけではない筋肉膜全体にわたるＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの発現ならびに筋肉繊維全体にわたるユートロフィンの上方調節をもたらす。ｍｄｘマウスでは、この発現は、マイクロジストロフィン遺伝子の発現が正すのと同程度に、筋肉の機能障害を正すことができる。さらに、ＧＡＬＧＴ２の過剰発現は、ＬＧＭＤ２Ａおよび先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ１Ａ）を含む他の筋ジストロフィーのマウスモデルにおける筋肉の病状を正す。従って、処置を必要とする患者において必ずしもＧＡＬＧＴ２それ自体に欠陥があるとは限らないにもかかわらず、ＧＡＬＧＴ２は筋ジストロフィー、例えばＤＭＤ、ＢＭＤ、ＬＧＭＤ２ＡおよびＭＤＣ１Ａを処置するためのＧＯＩである。
別の例では、サルコリピン（ＳＬＮ）は、筋／小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）を阻害し、ＤＭＤの患者および動物モデル、例えばＤＭＤのｍｄｘマウスモデルの筋肉において異常に増加している。ＡＡＶ９が媒介するＲＮＡ干渉によるＳＬＮレベルの低減は、重度のＤＭＤジストロフィン／ユートロフィン二重変異体（ｍｄｘ：ｕｔｒ－／－）マウスモデルにおけるジストロフィーの病変を改善し、それには筋肉病変の減弱化および横隔膜、骨格筋および心臓の機能の改善が含まれる。従って、ＳＬＮ ＲＮＡｉのコード配列は、ＤＭＤを治療するＧＯＩである。
従って、ＧＯＩは、発現した場合に、変異した遺伝子またはタンパク質、損傷した遺伝子またはタンパク質、あるいは不活性な遺伝子またはタンパク質に取って代わる遺伝子（またはタンパク質）であり得る。ＧＯＩは、発現した場合に、疾患、障害または機能不全における治療のために修飾を必要とする既に機能しているプロセスを助ける遺伝子（またはタンパク質）であり得る。ＧＯＩは、発現した場合に、疾患、障害または機能不全における治療のために修飾を必要とする機能不全に陥ったプロセスを助ける遺伝子（またはタンパク質）であり得る。ＧＯＩの核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸分子であり得る。ＧＯＩは、タンパク質、酵素、構造タンパク質、機能性タンパク質、または（１つまたは複数の）細胞機能に基づいて適応可能なタンパク質であり得る。ＧＯＩは、疾患、障害または機能不全のための治療上の利益または処置様式を提供し得る。
特定の態様では、ＧＯＩは、それらの意図される活性のために細胞内送達が必要である、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３、ＴＡＬＥＮ、または遺伝子に基づく他の遺伝子編集タンパク質であり得る。
本明細書で使用されるありとあらゆるＧＯＩは、コンピュータに基づく既知のアルゴリズムによる、発現および活性を強化するためのコドン最適化を必要とする可能性がある。
従って、主題のウイルスのカプシド（例えば、改変されたＶＰ１カプシド）を使用することにより産生され得るｒＡＡＶは、例えば疾患または状態を処置するための遺伝子治療に対して有用な目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードしていてもよい。代表的な（非限定的な）目的の遺伝子（ＧＯＩ）は：ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因となる遺伝子／それらにおいて欠陥のある遺伝子、あるいはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群すなわちムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に対して）、スルファミダーゼすなわちＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型すなわちＭＰＳ ＩＩＩＡに対して）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症すなわちＳＭＡに対して）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ ＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に対して）、アルファ－ガラクトシダーゼＡすなわちＧＬＡ（ファブリー病に対して）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンの遺伝子またはコード配列を含み得る。
特定の態様では、ＧＯＩはマイクロジストロフィン遺伝子である。
特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、以下の特許：米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，００１，７６１号；米国特許第７，５１０，８６７号；米国特許第６，８６９，７７７号；米国特許第８，５０１，９２０号；米国特許第７，８９２，８２４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；米国特許第１０，１６６，２７２号（すべてが参照により本明細書に組み込まれる）に記載のいずれかのものである。特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子を、例えば、約４．７ｋｂ以下のサイズで、ｒＡＡＶビリオン中にパッケージ化することができる。
特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、そのコード配列内に、筋細胞膜に一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）活性を回復させることができるスペクトリン様リピートＲ１６およびＲ１７（例えば米国特許第７，８９２，８２４号に記載されているもの）を含有する。
特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３およびＲ２４スペクトリン様リピート（すなわち、それぞれ、ＳＲ１、ＳＲ１６、ＳＲ１７、ＳＲ２３およびＳＲ２４）のコード配列、例えば国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＳＲ１、ＳＲ１６、ＳＲ１７、ＳＲ２３およびＳＲ２４以外の、完全長ジストロフィンタンパク質のその他のスペクトリンリピートをコードしない。
特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，００１，７６１号；米国特許第７，５１０，８６７号；米国特許第６，８６９，７７７号；米国特許第８，５０１，９２０号；米国特許第７，８９２，８２４号または米国特許第１０，１６６，２７２号、あるいは国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３（すべてが参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３（国際公開第２０１６／１１５５４３Ａ２号）は、調節カセットに動作可能なように接続されたマイクロジストロフィン遺伝子であって、アミノ末端アクチン結合ドメイン；β－ジストログリカン結合ドメイン；および少なくとも４つのスペクトリン様リピートを含むスペクトリン様リピートドメインであって少なくとも４つのスペクトリン様リピートのうちの２つが神経型一酸化窒素合成酵素結合ドメインを含むスペクトリン様リピートドメイン、を含むタンパク質をコードするマイクロジストロフィン遺伝子を提供する。特定の態様では、少なくとも４つのスペクトリン様リピートは、スペクトリン様リピート１（ＳＲ１）、スペクトリン様リピート１６（ＳＲ１６）、スペクトリン様リピート１７（ＳＲ１７）およびスペクトリン様リピート２４（ＳＲ２４）を含む。特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、ヒンジドメインの少なくとも一部、例えばヒンジ１ドメイン、ヒンジ２ドメイン、ヒンジ３ドメイン、ヒンジ４ドメインおよびヒンジ様ドメインのうちの少なくとも１つをさらに含む。特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端の順番で：ヒンジ１ドメイン（Ｈ１）；スペクトリン様リピート１（ＳＲ１）；スペクトリン様リピート１６（ＳＲ１６）；スペクトリン様リピート１７（ＳＲ１７）；スペクトリン様リピート２４（ＳＲ２４）およびヒンジ４ドメイン（Ｈ４）を含む。特定の態様では、Ｈ１はＳＲ１に直接連結される。特定の態様では、ＳＲ１はＳＲ１６に直接連結される。特定の態様では、ＳＲ１６はＳＲ１７に直接連結される。特定の態様では、ＳＲ１７はＳＲ２４に直接連結される。特定の態様では、ＳＲ２４はＨ４に直接連結される。特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＳＲ１とＳＲ１６の間に、Ｎ末端からＣ末端の順番で、スペクトリン様リピート２（ＳＲ２）およびスペクトリン様リピート３（ＳＲ３）をさらに含む。特定の態様では、ＳＲ１はＳＲ２に直接連結され、ＳＲ２はＳＲ３にさらに連結される。特定の態様では、Ｈ１はＳＲ１に直接連結され、ＳＲ１はＳＲ１６に直接連結され、ＳＲ１６はＳＲ１７に直接連結され、ＳＲ１７はＳＲ２３に直接連結され、ＳＲ２３はＳＲ２４に直接連結され、ＳＲ２４はＨ４に直接連結される。
特定の態様では、調節カセットは、ＣＫ８プロモーターおよび心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーターからなる群から選択される。特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、５～８つの間のスペクトリン様リピートを有する。特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子によってコードされるタンパク質は、国際公開第２０１６／１１５５４３Ａ２号（参照により本明細書に組み込まれる）における配列番号４または５のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％または９０％の配列同一性を有する。
主題の改変されたＶＰ１カプシドを含むｒＡＡＶからの恩恵を受ける可能性を有する疾患または状態は：ハンチントン病、Ｘ連鎖性筋細管ミオパチー（ＸＬＭＴＭ）、酸性マルターゼ欠損症（例えば、ポンペ病）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、ミトコンドリアミオパチー、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＤＭ）、眼咽頭筋型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ））、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、バッテン病、レット症候群、クラッベ病、カナバン病、Ｘ連鎖性網膜分離症、色覚異常（ＣＮＧＢ３およびＣＮＧＡ３）、Ｘ連鎖性網膜色素変性、加齢性黄斑変性、血管新生黄斑変性、ポンペ、ファブリー病、ＭＰＳＩ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ゴーシェ病、ダノン病、Ａ１Ａｔ欠乏症、フリードライヒ運動失調症、ウイルソン病、バッテン病（ＣＬＮ１、ＣＬＮ３、ＣＬＮ６、ＣＬＮ８）、ウォールマン病、テイ・サックス、ニーマン・ピックＣ型（Niemann-Lick Type C）、ＣＤＫＬ５欠損障害、Ｂサラセミア、鎌状赤血球症を含む。
特定の態様では、本発明のｒＡＡＶからの恩恵を受ける可能性を有する疾患または状態は：ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、ベスレム型ＣＭＤ、福山型ＣＭＤ、筋・眼・脳病（ＭＥＢｓ）、強直性脊椎症候群、ウルリッヒ型ＣＭＤ、ウォーカー・ワールブルグ症候群（ＷＷＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、眼咽頭筋型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を含む運動ニューロン疾患、を含んでもよい。
特定の態様では、本発明のｒＡＡＶからの恩恵を受ける可能性を有する疾患または状態はイオンチャネル疾患を含んでもよく、それらは筋力低下、筋緊張の欠如または発作性筋麻痺によって典型的には特色づけられる。それらは、アンダーセン・タウィル症候群、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、先天性筋強直症、ベッカー型ミオトニア、トムゼン型ミオトニア、先天性パラミオトニア、カリウム惹起性ミオトニアを含む。
特定の態様では、本発明のｒＡＡＶからの恩恵を受ける可能性を有する疾患または状態は、ミトコンドリア疾患を含んでもよく、これは細胞のためにエネルギーを生成する構造がうまく機能しない時に生じる。そのような疾患は：フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ミトコンドリアミオパチー、カーンズ・セイアー症候群（ＫＳＳ）、リー症候群（亜急性壊死性脳筋症）、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、ニューロパチー、運動失調および網膜色素変性（ＮＡＲＰ）、ピアソン症候群、進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）を含む。
特定の態様では、本発明のｒＡＡＶからの恩恵を受ける可能性を有する疾患または状態はミオパチーを含んでもよく、ミオパチーは、筋線維が正しく機能せず、筋力低下をもたらす筋肉の疾患である。ミオパチーは、：キャップミオパチー、中心核ミオパチー、先天性筋線維不均等症（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ ｗｉｔｈ ｆｉｂｅｒ ｔｙｐｅ ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）、コアミオパチー、中心コア疾患、マルチミニコアミオパチー、ミオシン蓄積性ミオパチー（Ｍｙｏｓｉｎ ｓｔｏｒａｇｅ Ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、筋細管ミオパチー、ネマリンミオパチー、遠位型ミオパチー、ＧＮＥミオパチー／埜中ミオパチー／遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）、レイン型遠位型ミオパチー（Ｌａｉｎｇ ｄｉｓｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、マルケスベルグ－グリッグス型遅発性遠位型ミオパチー（Ｍａｒｋｅｓｂｅｒｇ－Ｇｒｉｇｇｓ ｌａｔｅ－ｏｎｓｅｔ ｄｉｓｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、三好型ミオパチー、Ｕｄｄミオパチー／脛骨筋ジストロフィー、声帯および咽頭遠位型ミオパチー、ウェランダー型遠位型ミオパチー（Ｗｅｌａｎｄｅｒ ｄｉｓｔａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）、内分泌性ミオパチー、甲状腺機能亢進性ミオパチー、甲状腺機能低下性ミオパチー、炎症性ミオパチー、皮膚筋炎、封入体筋炎、多発性筋炎、代謝性ミオパチー、酸性マルターゼ欠損症（ＡＭＤ、ポンペ病）、カルニチン欠乏症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、脱分枝酵素欠損症（コリ病、フォーブス病）、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、ホスホフルクトキナーゼ欠損症（垂井病）、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症（マッカードル病）、筋原線維ミオパチー（ＭＦＭ）、肩甲腓骨型ミオパチー（Ｓｃａｐｕｌｏｐｅｒｏｎｅａｌ ｍｙｏｐａｔｈｙ）を含む。
特定の態様では、本発明のｒＡＡＶからの恩恵を受ける可能性を有する疾患または状態は神経筋接合部疾患を含んでもよく、それは筋肉と神経の間のシグナルの伝達に関与する１種以上の主要なタンパク質の破壊、機能不全または欠如から生じる。そのような疾患は：先天性筋無力症候群（ＣＭＳ）、ランバート・イートン筋無力症症候群（ＬＥＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）を含む。
特定の態様では、本発明のｒＡＡＶからの恩恵を受ける可能性を有する疾患または状態は末梢神経疾患を含んでもよく、そこでは脳および脊髄を体の残りの部分につなげる運動および感覚神経が冒されており、感覚、運動または他の機能の障害を引き起こす。そのような疾患は：シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、巨大軸索ニューロパチー（ＧＡＮ）、悪液質における筋消耗および老化を含む。
４．ｒＡＡＶの産生
その方法／プロデューサー細胞株が野生型ＶＰ１カプシドの代わりに（または少なくともそれに加えて）改変されたＶＰ１カプシドタンパク質をもたらすように改変されている限りにおいては、本発明の改変されたＶＰ１カプシドを有するｒＡＡＶは、任意の標準的なｒＡＡＶ産生方法を使用することにより、典型的にはプロデューサー細胞株を使用することにより、産生することができる。
原理の異なるいくつかの戦略がｒＡＡＶ産生のために使用されており、それらのすべてを主題のｒＡＡＶを産生するために使用することができる。
特定の態様では、主題のｒＡＡＶは、適した宿主細胞、例えば２９３細胞中で、すべてのシスおよびトランス成分（アデノウイルスから単離されたヘルパー遺伝子に加えてベクタープラスミドおよびパッケージングプラスミド）と共に、ヘルパーウイルスを含まない一過性のトランスフェクション方法に基づいて産生される。一過性のトランスフェクション方法は、ベクタープラスミドの構築が単純であり、アデノウイルスを含まない高力価のＡＡＶベクターを生成する。改変されたＶＰ１カプシドタンパク質は、プロデューサー細胞株の一過性のトランスフェクションにおいて使用されるプラスミドの１つによりコードされ得る。
特定の態様では、主題のｒＡＡＶは、プロデューサー細胞にＡＡＶベクターならびにＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子（すなわち本発明の改変されたＶＰ１カプシド遺伝子）をもたらすｒＨＳＶベクターを利用する組換え単純ヘルペスウイルス（ｒＨＳＶ）に基づくＡＡＶ産生システムを使用して産生される。改変されたｃａｐ遺伝子は、ｒＡＡＶゲノムの宿主でもあり得るｒＨＳＶベクター中に存在し得る。
特定の態様では、主題のｒＡＡＶは、ＡＡＶベクターカセットならびにＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子（すなわち本発明の改変されたＶＰ１カプシド遺伝子）を送達するための複数のバキュロウイルスベクターによる昆虫細胞の同時感染が必要なバキュロウイルスシステムを使用して産生される。
特定の態様では、主題のｒＡＡＶは、ＡＡＶ Ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子（すなわち本発明の改変ＶＰ１カプシド遺伝子）を安定して内部に有する、例えばＨｅＬａまたはＡ５４９またはＨＥＫ２９３細胞に由来する特定のＡＡＶプロデューサー細胞株に基づいて産生される。ＡＡＶベクターカセットは、宿主ゲノム中に安定に組み込まれ得るか、またはカセットを含有するアデノウイルスによって導入され得る。
特定の態様では、ｒＡＡＶ産生のためのそのようなプロデューサー細胞株は、ＡＡＶのＩＴＲ配列と隣接するＧＯＩをコードするｒＡＡＶプロウイルスを含み、ここでｒＡＡＶプロウイルスはｒＡＡＶ産生のためにプロデューサー細胞株のゲノム中に組み込まれている。
５．ｒＡＡＶを使用する筋ジストロフィーの処置
本発明の改変されたＶＰ１カプシドを含む主題のｒＡＡＶは、種々の形態の筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＤＭ）、眼咽頭筋型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）等を処置するための遺伝子治療において使用することができる。特定の態様では、筋ジストロフィーはＤＭＤまたはＢＭＤである。
従って、本発明の一側面は、処置を必要とする対象において筋ジストロフィー（例えばＤＭＤおよびＢＭＤ）を処置する方法であって、筋ジストロフィーにおいて欠陥のある遺伝子、例えばマイクロジストロフィン遺伝子の機能バージョンをコードする治療有効量の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを対象に投与するステップを含み、ｒＡＡＶが本発明の改変されたＶＰ１カプシドタンパク質のいずれかを含む方法を提供する。
特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，００１，７６１号；米国特許第７，５１０，８６７号；米国特許第６，８６９，７７７号；米国特許第８，５０１，９２０号；米国特許第７，８９２，８２４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３；または米国特許第１０，１６６，２７２号（すべてが参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものである。
特定の態様では、マイクロジストロフィン遺伝子は、完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３およびＲ２４スペクトリン様リピートのコード配列（例えば国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３に記載のもの）を含む。
特定の態様では、方法は、主題のｒＡＡＶを産生するステップを、そのように産生されたｒＡＡＶを対象に投与するステップの前に、さらに含む。
実施例１
主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１をＡＡＶ９およびＡＡＶ８と比較したインビトロアッセイ
本実験は、筋細胞における組換えＡＡＶベクターからのＧＯＩの発現に対する主題のｒＡＡＶカプシドの効果を、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９の効果と比べて比較する。
具体的には、Ｃ２Ｃ１２細胞－不死化マウス筋芽細胞株の細胞－を、３種の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８および主題のカプシドＡＡＶ－ＳＬＢ１０１（配列番号１４）中にそれぞれパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ｒＡＡＶベクターで形質導入した。形質導入後７２時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現をＥＬＩＳＡによって測定した。データを図１Ａ～１Ｃに示し、図１Ａおよび図１Ｂの各データポイントに対しては平均値±ＳＤで示した。統計学的な有意性は、各ＭＯＩでのＡＡＶ９データと比較した一元配置ＡＮＯＶＡアッセイによって決定した。
図１Ａでは、マイクロジストロフィン発現は、１ｍＬあたりの、発現したマイクロジストロフィンのマイクログラム（μｇ）に基づいて決定した。データは、ＡＡＶ９カプシドと比較してはるかに高いＣ２Ｃ１２筋細胞におけるＧＯＩ（例えばマイクロジストロフィン）の発現と、主題のｒＡＡＶカプシドが関連づけられたことを示す。直接の統計学的比較はしていないが、データはまた、ＡＡＶ８カプシドと比較してはるかに高いＣ２Ｃ１２筋細胞におけるＧＯＩ（例えばマイクロジストロフィン）の発現とも、主題のｒＡＡＶカプシドが関連づけられたことを示唆する。
図１Ｂでは、マイクロジストロフィン発現は、免疫蛍光強度の和積分（ｓｕｍ ｉｎｔｅｇｒａｌ）に基づいて決定した。データは、ＡＡＶ９カプシドと比較してはるかに高いＣ２Ｃ１２筋細胞におけるＧＯＩ（例えばマイクロジストロフィン）の発現と、主題のｒＡＡＶカプシドが関連づけられたことを再度示す。直接の統計学的比較はしていないが、データはまた、ＡＡＶ８カプシドと比較してはるかに高いＣ２Ｃ１２筋細胞におけるＧＯＩ（例えばマイクロジストロフィン）の発現とも、主題のｒＡＡＶカプシドが関連づけられたことを示唆する。
図１Ｃでは、３種の感染多重度（ＭＯＩ）で、Ｃ２Ｃ１２細胞を、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８および主題のカプシドＡＡＶ－ＳＬＢ１０１中にそれぞれパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ｒＡＡＶベクターで同様に形質導入した。細胞を固定化し、形質導入後７２時間で免疫染色し、マイクロジストロフィン発現を免疫蛍光法（ＩＦ）によって可視化した。非感染／未処理細胞を、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）に対する緑色蛍光で染色した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。テストしたすべての用量レベルで、ＡＡＶ９カプシドとＡＡＶ８カプシドの両方と比較して、Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＧＯＩ（例えばマイクロジストロフィン）の直接発現に対する主題のｒＡＡＶカプシドの優れた能力が、データにより視覚的に確認される。
別の実験では、最低のＭＯＩのみでではあるが、Ｃ２Ｃ１２細胞を、上記と同じ３種のＡＡＶで形質導入した。形質導入後９６時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。次いでデータをＡＡＶ９のデータに対して正規化し、図１Ｄ中にプロットし、倍率変化を図１Ｄに挿入した表中に示した。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１のマイクロジストロフィンタンパク質発現が、ＡＡＶ９よりも有意に高いことは明らかである（ｐ＜０．０００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定した。
さらに別の実験では、最低のＭＯＩのみでではあるが、患者由来ＤＭＤ細胞を、上記と同じ３種のＡＡＶで形質導入した。形質導入後７２時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。次いでデータをＡＡＶ９のデータに対して正規化し、図１Ｅ中にプロットし、倍率変化を図１Ｅに挿入した表中に示した。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１のマイクロジストロフィンタンパク質発現が、ＡＡＶ９よりも有意に高いことは明らかである（ｐ＜０．０００１）。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定した。
実施例２
Ｃ２Ｃ１２細胞およびＤＭＤ細胞に対するインビトロ効力アッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞を、３種の用量の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８および主題のカプシドＡＡＶ－ＳＬＢ１０１中にそれぞれパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ｒＡＡＶベクターで形質導入した。形質導入後７２時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。示されるデータは平均値±ＳＤである。統計解析を、各ＭＯＩでのＡＡＶ９と比較した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
図２Ａの最上部のパネルは、主題のｒＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶを使用することによって、分化型Ｃ２Ｃ１２細胞における２種の用量（３Ｅ６および７．５Ｅ５）での、ＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶと比較して統計学的に有意に高いマイクロジストロフィン発現を示す。図２Ａの底部のパネルは、同じＭＯＩでのＡＡＶ９に対して正規化した後の棒グラフにおいて、同じ結果を示す。具体的には、高用量の３Ｅ６では、発現レベルは主題のカプシドで８．０倍高かった。低用量の７．５Ｅ５では、発現レベルは主題のカプシドで１０．６倍高かった。
同様の実験を、患者由来ＤＭＤ細胞－ムーリー細胞において繰り返した。
具体的には、患者由来ＤＭＤムーリー細胞を、３種の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８および主題のカプシドＡＡＶ－ＳＬＢ１０１中にそれぞれパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ベクターで形質導入した。形質導入後７２時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。示されるデータは平均値±ＳＤである。統計解析を、各ＭＯＩでのＡＡＶ９と比較した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
図２Ｂの最上部のパネルは、主題のｒＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶを使用することによって、分化型ＤＭＤムーリー細胞における２種の用量（３Ｅ６および７．５Ｅ５）での、ＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶと比較して統計学的に有意に高いマイクロジストロフィン発現を示す。外れ値をデータから除去した。図２Ｂの底部のパネルは、同じＭＯＩでのＡＡＶ９に対して正規化した後の棒グラフにおいて、同じ結果を示す。具体的には、高用量の３Ｅ６では、発現レベルは主題のカプシドで３．１倍高かった。低用量の７．５Ｅ５では、発現レベルは主題のカプシドで４．１倍高かった。
実施例３
主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシドとＡＡＶ９のインビボでの比較
ＤＭＤのマウスモデル－ｍｄｘマウス－を本実験に使用して、ＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶと比較して主題のカプシドを有するｒＡＡＶにおける優れたマイクロジストロフィン発現レベルを実証した。
約５～６週齢のｍｄｘマウスに、主題のカプシドＡＡＶ－ＳＬＢ１０１中、またはＡＡＶ９カプシド中にパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ｒＡＡＶベクターを、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの用量で、全身的に注入（静脈内送達）した。マウスは、注入（２週間でＮ＝３、４週間でＮ＝４）後２～４週間で解剖し、ベクターの体内分布およびマイクロジストロフィン発現の定量化のために、組織を回収した。全パネルにおける統計値を、ＡＡＶ９と比較した個別のウェルチのｔ検定によって決定した。
図３Ａは、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１は、一方または両方の時点（すなわち１５日目および２９日目）において、心臓（ｐ＜０．００１）および大腿四頭筋（「四頭筋」）（ｐ＜０．０１）における体内分布が有意に高く、横隔膜におけるｖｇは高くなる傾向がある（特に１５日目）ことを示す。その一方で、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１は、ＡＡＶ９よりも肝臓におけるｖｇが有意に低い（ｐ＜０．０１）。示されるデータは平均値±ＳＤである。統計解析を、各時点でのＡＡＶ９と比較した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。脳における有意差は見出されなかった（データは示さない）。
図３Ｂは、筋肉特異的なプロモーターの使用のために予想されるように、主題のカプシドにおけるｒＡＡＶと、ＡＡＶ９カプシドにおけるｒＡＡＶとの間には、２９日目での複数の末梢組織における発現に、観察可能な差がないことを示す。テストした末梢組織には、肺、脾臓、腎臓および脳が含まれる。
図３Ｃは、１５日目と２９日目の両方で、アッセイした３種のすべての筋肉組織（すなわち心臓（心筋）（ｐ＜０．０５）、横隔膜（平滑筋）および四頭筋（骨格筋））（ｐ＜０．０５）において、ＡＡＶ９カプシド中にパッケージ化されたｒＡＡＶよりも主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシド中にパッケージ化されたｒＡＡＶで、マイクロジストロフィン発現が有意に高いことを示す。両構築物に対する、肝臓において認められる発現はない。示されるデータは平均値±ＳＤである。統計解析を、各時点でのＡＡＶ９と比較した一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。
上記のデータは、インビトロ効力アッセイにおいて、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシドが、培養Ｃ２Ｃ１２筋細胞ならびに患者由来ＤＭＤムーリー細胞の両方において優れたＧＯＩ（例えばマイクロジストロフィン）発現効率を有することを実証する。インビトロでの結果は、マウスＤＭＤモデルのｍｄｘマウスにおいて行われたインビボ体内分布試験によっても確認された。
具体的には、ｍｄｘマウスにおけるインビボ体内分布試験は、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシドは、テストした両時点（すなわち１５日目および２９日目）において心臓および四頭筋における体内分布がＡＡＶ９と比べて有意に高く、横隔膜におけるｖｇは、特に１５日目において高くなる傾向があることを示す。さらに、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシドは、マイクロジストロフィン発現が意図されない標的組織である肝臓においてｖｇが有意に低い。
マイクロジストロフィン発現に関しては、主題のＡＡＶ－ＳＬＢ１０１カプシドは、テストした３種のすべての筋肉組織において、ＡＡＶ９よりも有意に高いレベルの発現を示す。
実施例４
さらなる改変されたＡＡＶ－ＳＬＢカプシドの特徴づけ
ＡＡＶ－ＳＬＢ１０２～ＡＡＶ－ＳＬＢ１１２ならびに異なる周辺／隣接配列による類似の挿入配列を有する２つの改変されたカプシド（ＡＡＶ－ＳＬＢ１１３およびＡＡＶ－ＳＬＢ－１１４）を含む、さらなる改変されたカプシドを構築し、野生型ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ＳＬＢ１０１と比較してそれらの効力をテストした。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０２～ＡＡＶ－ＳＬＢ１１２の挿入配列は、それぞれ、配列番号２～１２である。テストした構築物の、野生型ＡＡＶ９配列およびＡＡＶ－ＳＬＢ１０１配列に対する多重配列アライメントについては、図６を参照のこと。
最初の実験では、接着２９３Ｔ細胞のトリプルトランスフェクション、その後の段階的なイオジキサノール超遠心分離による精製に基づいて、種々のカプシド構築物の産生収量を、野生型ＡＡＶ９カプシドの産生収量ならびにＡＡＶ－ＳＬＢ１０１の産生収量と比較した。測定した産生収量を図４中にプロットした。少数の例外はあるものの、ほとんどの構築物が、野生型ＡＡＶ９と比較して類似の（しかしわずかに低い）収量を有した。
一連のインビトロでの特徴づけ実験を実施して、さらなる主題の改変されたＡＡＶ９カプシドを、野生型ＡＡＶ９およびＣ２Ｃ１２細胞中で以前にテストしたＡＡＶ－ＳＬＢ１０１と比較した。結果を図５Ａ～５Ｃ中に報告した。
具体的には、Ｃ２Ｃ１２細胞の細胞表面に結合したＡＡＶカプシドの定量化を、４℃で１時間インキュベーションした後に単離したＤＮＡのｑＰＣＲによって測定した。図５Ａの結果は、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１（ｐ＜０．０００１）、１１２（ｐ＜０．０１）および１１４（ｐ＜０．００１）はすべて野生型ＡＡＶ９よりも有意に多くＣ２Ｃ１２細胞に結合したが、残りの構築物はすべて野生型ＡＡＶ９と比較して類似の結合であったことを示す。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。
しかし、ある程度等しく結合する、異なる改変されたカプシドを有するウイルスベクターのＣ２Ｃ１２細胞による取り込みには、劇的な差があるように見えた。具体的には、図５Ｂでは、Ｃ２Ｃ１２細胞へのＡＡＶの取り込みの定量化を、４℃で１時間インキュベーションした後にさらに３７℃でさらに１時間インキュベーションした後に単離されたＤＮＡのｑＰＣＲによって測定した。結果は、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１０８、１１１、１１２、１１３、１１４が、ＡＡＶ９よりも有意に多く（約２０～４０倍多く）Ｃ２Ｃ１２細胞によって吸収されたことを示した（ｐ＜０．０００１）。他のテストした構築物は、ＡＡＶ９と比較して同等の細胞の取り込みであったように見えた。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。
最後に、図５Ｃでは、Ｃ２Ｃ１２細胞を、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１および１３個のさらなる改変されたＡＡＶカプシド中にパッケージ化されたマイクロジストロフィン発現ベクターで形質導入した。形質導入後９６時間で細胞を回収し、マイクロジストロフィン発現を測定した。データをＡＡＶ９のデータに対して正規化し、倍率変化を図５Ｃに挿入した表中に示した。ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１、１０２、１１１、１１２および１１３は、ＡＡＶ９と比べたマイクロジストロフィンタンパク質発現が最も高く（ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０９および１１４は、ＡＡＶ９よりもわずかにのみ高い発現をもたらした（ｐ＜０．００１）ことは明らかである。通常の一元配置ＡＮＯＶＡにより、統計値を決定する。
特に、ＳＬＢ１０１、ＳＬＢ１１３およびＳＬＢ１１４はすべて同じ挿入配列ＲＧＤＬＧＬＳを有しており、隣接する配列が主に異なるという事実にも関わらず、ＳＬＢ１０１がはるかに有意に高いマイクロジストロフィン発現レベルをもたらすように見える（８．８７：４．１１：１．９４）。すなわち、ＳＬＢ１０１はＳＬＢ１１３のマイクロジストロフィン発現レベルよりも１１６％高く、ＳＬＢ１１３自体はＳＬＢ１１４のマイクロジストロフィン発現レベルよりも１１２％高い。
要約すると、上記のデータは、主題の改変されたＡＡＶ９カプシドの少なくとも１つ、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０１が、マウスとＤＭＤヒトの両方の骨格筋細胞におけるインビトロアッセイにおいて、野生型ＡＡＶ９と比較して優れた効率を示したことを示す。これはまた、ＡＡＶ９と比較しての、大腿四頭筋と心臓の両方におけるインビボの体内分布およびマイクロジストロフィンタンパク質発現の増加ならびに肝臓への体内分布の減少にもつながる。主題の改変されたＡＡＶ９カプシドの拡張パネルはまた、少なくとも２つのさらなる興味深い候補、ＡＡＶ－ＳＬＢ１０２およびＡＡＶ－ＳＬＢ１１１も同定し、それらはＣ２Ｃ１２細胞における結合、取り込みおよびマイクロジストロフィンタンパク質発現に対するインビトロアッセイにおいてＡＡＶ－ＳＬＢ１０１に類似する。
実施例５
挿入ペプチドを取り囲む配列の機能的重要性
本実施例は、改変されたＡＡＶ９カプシドの機能は、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質中に挿入された短ペプチドの同一性だけでなく、挿入された短ペプチドの周辺配列にも依存するという驚くべき知見を実証する。
３つの代表的な改変されたＡＡＶ９カプシド－ＳＬＢ－１０１、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４を使用して、機能比較を行った。図６中の配列アライメントを参照のこと。３つのすべての配列は同じ７残基のコア配列ＲＧＤＬＧＬＳを含むが、７残基のコア配列を取り囲む直近のＮおよびＣ末端配列はわずかに異なる。ＳＬＢ－１０１では、７残基のコア配列を、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１配列の残基５８８と５８９の間に挿入した（すなわち、挿入した７残基のコア配列以外のいかなる野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１配列にも変化はない）。図６中の野生型ＡＡＶ９とＳＬＢ－１０１の間の局所的な配列アライメントを参照のこと。
対照的に、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４では、７残基のコア配列に関して直近のＮ末端３～４残基内と直近のＣ末端４～５残基内の両方においてさらなる変化がある（図６を参照のこと）。全体的に見て、ＳＬＢ－１０１の配列と比較して、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４の配列は互いにより類似しているように見える。
図５Ａは、インビトロでこれらカプシドのＣ２Ｃ１２細胞に結合する能力が異なり、ＳＬＢ－１０１とＳＬＢ－１１４の両方は野生型ＡＡＶ９と比較してＣ２Ｃ１２細胞に有意により強く結合するが、ＳＬＢ－１１３は有意差を示さなかったことを示す。
図５Ｂでは、ＡＡＶ９バリアントＳＬＢ－１０１に感染したＣ２Ｃ１２細胞は、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４よりも驚くほどに高いレベルでコードされたマイクロジストロフィンを発現するように見えた。
そのようなインビトロの結果が、使用した細胞株（すなわちＣ２Ｃ１２細胞）と関連づけられるアーティファクトに起因するものではなかったこと示すために、ＤＭＤｍｄｘモデルマウスを使用するインビボ発現試験を立案した。具体的には、５～６週齢のｍｄｘマウスに、１Ｅ１４ｖｇ／ｋｇの単回用量の、野生型ＡＡＶ９、またはＳＬＢ－１０１、ＳＬＢ－１０２、ＳＬＢ－１１３もしくはＳＬＢ－１１４のバリアントカプシドを有するＡＡＶ９のいずれかを注入した。異なる短ペプチドが挿入されているが、ＳＬＢ－１０２を含めた（図６を参照のこと）。注入したマウスを、注入（２週間でＮ＝３、および４週間でＮ＝３～４）後２～４週間で解剖した。ＭＳＤによるウイルスの体内分布およびマイクロジストロフィン発現を、４群のマウスにおいて、野生型対照群と比較して調べた。
図７は、ＳＬＢ－１０１およびＳＬＢ－１１４の両方が、野生型ＡＡＶ９と比較して、大腿四頭（骨格）筋への体内分布が有意に増加することを示す（それぞれ６．７８倍および８．０９倍）。その一方で、ＳＬＢ－１０２およびＳＬＢ－１１３におけるわずかな増加は統計学的に有意ではない。横隔膜（骨格筋）においても同様の観察がなされた。
心臓においては、ＳＬＢ－１０１の体内分布は、野生型ＡＡＶ９の体内分布よりも有意に高い（４．３５倍）。ＳＬＢ－１１４も高い傾向を示した（２．４８倍）が、統計学的に有意ではなかった。さらに、ＳＬＢ－１０２とＳＬＢ－１１３の両方は、ＡＡＶ９対照の分布と比較しておおよそ同じ分布であった。
興味深いことに、すべてのＡＡＶ９バリアントは肝臓での分布がより低かったが、ＳＬＢ－１１４のみが統計学的に有意に低かった。図７を参照のこと。
いくつかの他の器官における広範な体内分布も調べた。図８は、すべては、脳における分布が統計学的に有意に低かったが、肺、脾臓および腎臓における分布は、ＳＬＢ－１０１が腎臓において高かったことおよびＳＬＢ－１１４が脾臓において高かったことを除いて、野生型ＡＡＶ９の分布と同等であるように見えたことを示す。
図９では、心臓、四頭筋および横隔膜におけるマイクロジストロフィン発現を調べた。ＳＬＢ－１０１とＳＬＢ－１１４の両方は、３種のすべての組織において、野生型ＡＡＶ９よりも発現が統計学的に高かったが、ＳＬＢ－１０２はいずれの組織においても目立たなかった。その一方で、ＳＬＢ－１１３は横隔膜においてのみ高かったが、他の２種の組織においてはＡＡＶ９よりも統計学的に有意に高くはなかった。
ＳＬＢ－１０１、ＳＬＢ－１１３およびＳＬＢ－１１４すべてに同じ７残基のコア配列が挿入されているため、これらのデータは、少なくとも、体内分布およびマイクロジストロフィン発現は周辺配列による影響を受けたことを示した。

Claims (30)

  1. 配列番号１～１２からなる群から選択されるポリペプチドを含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドの残基５８８と５８９の間、あるいは非ＡＡＶ９の野生型Ｃｌａｄ Ｆ（例えばＡＡＶｈｕ．３２）、野生型Ｃｌａｄ Ａ（例えばＡＡＶ６）または野生型Ｃｌａｄ Ｅ（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．１０もしくはＡＡＶｒｈ．７４）のＶＰ１カプシドの対応する２残基の間に挿入されている、アデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
  2. 配列番号１、１１または１２のポリペプチドを含む、請求項１に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチド。
  3. 配列番号１のポリペプチドを含むか、配列番号１のポリペプチドから本質的になるか、または配列番号１のポリペプチドからなる、改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
  4. 配列番号１１のポリペプチドを含むか、配列番号１１のポリペプチドから本質的になるか、または配列番号１１のポリペプチドからなる、改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
  5. 配列番号１２のポリペプチドを含むか、配列番号１２のポリペプチドから本質的になるか、または配列番号１２のポリペプチドからなる、改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチド。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  7. 前記ｒＡＡＶの前記ＶＰ１カプシドが、請求項１～５のいずれか一項に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチドからなるか、または請求項１～５のいずれか一項に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチドから本質的になる、請求項６に記載のｒＡＡＶ。
  8. 前記ｒＡＡＶが１対のＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む、請求項６または７に記載のｒＡＡＶ。
  9. 前記１対のＡＡＶ ＩＴＲ配列がＡＡＶ２またはＡＡＶ９のＩＴＲ配列である、請求項８に記載のｒＡＡＶ。
  10. 前記目的の遺伝子（ＧＯＩ）が、ＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）の原因となる遺伝子／それらにおいて欠陥のある遺伝子、あるいはＮＡＧＬＵ（α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、サンフィリポ症候群すなわちムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）に対して）、スルファミダーゼすなわちＳＧＳＨ（ムコ多糖症ＩＩＩＡ型すなわちＭＰＳ ＩＩＩＡに対して）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ、脊髄性筋萎縮症すなわちＳＭＡに対して）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ ＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）、酸性アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に対して）、アルファ－ガラクトシダーゼＡすなわちＧＬＡ（ファブリー病に対して）、グルコセレブロシダーゼ、ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンの遺伝子またはコード配列を含む、請求項８または９に記載のｒＡＡＶ。
  11. 前記ＧＯＩがマイクロジストロフィンをコードする、請求項８または９に記載のｒＡＡＶ。
  12. 前記マイクロジストロフィンが米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，００１，７６１号；米国特許第７，５１０，８６７号；米国特許第６，８６９，７７７号；米国特許第８，５０１，９２０号；米国特許第７，８９２，８２４号；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３または米国特許第１０，１６６，２７２号に記載のものである、請求項１１に記載のｒＡＡＶ。
  13. 前記マイクロジストロフィンが完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１６およびＲ１７スペクトリン様リピートのコード配列（例えば米国特許第７，８９２，８２４号に記載のもの）を含む、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
  14. 前記マイクロジストロフィンが、前記完全長ジストロフィンタンパク質のＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３およびＲ２４スペクトリン様リピート；または国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３７３３もしくは米国特許第１０，４７９，８２１号に記載のマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶ。
  15. 前記ＧＯＩが、転写調節カセット、例えば筋肉特異的プロモーター（例えばＣＫ８プロモーターまたは心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター）に動作可能なように連結された、請求項８～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  16. 前記ＧＯＩが、ＮからＣ末端にかけて、アミノ末端アクチン結合（ＡＢ１）ドメイン、β－ジストログリカン結合ドメイン、ヒンジ１ドメイン（Ｈ１）、スペクトリン様リピート１（ＳＲ１）、スペクトリン様リピート１６（ＳＲ１６）、スペクトリン様リピート１７（ＳＲ１７）、スペクトリン様リピート２３（ＳＲ２３）およびスペクトリン様リピート２４（ＳＲ２４）を含む５つのスペクトリン様リピートからなるスペクトリン様リピートドメイン、ならびにヒンジ４ドメイン（Ｈ４）を含むタンパク質をコードするマイクロジストロフィン遺伝子であり、前記マイクロジストロフィン遺伝子が筋肉特異的なヒト筋肉クレアチンキナーゼＣＫ８プロモーター（例えば米国特許第１０，４７９，８２１号の配列番号１９）に動作可能なように連結されており、前記ＧＯＩが１対のＡＡＶ２ ＩＴＲ（逆位末端リピート）配列と隣接する、請求項８～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  17. 請求項１～５のいずれか一項に記載の改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチドあるいはそれに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする、ポリヌクレオチド。
  18. 哺乳動物発現用にコドン最適化された、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. 請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  20. プラスミドまたはウイルスベクター（例えばＨＳＶベクターまたはＡＡＶベクター）である、請求項１９に記載のベクター。
  21. （ａ）（１）請求項１～５のいずれか一項に記載の改変されたアデノ随伴ウイルス（ｍＡＡＶ）カプシドポリペプチド、または（２）（１）に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列、をコードする組換え核酸分子であって、任意選択で異種の非ＡＡＶ配列をさらに含む組換え核酸分子；あるいは
    （ｂ）請求項６～１６のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、
    を含む培養宿主細胞。
  22. 処置を必要とする対象における筋ジストロフィー等の疾患または状態を処置する方法であって、前記対象に治療有効量の、請求項１１～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを投与するステップを含む方法。
  23. 野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドを有する他の点では同一の参照ｒＡＡＶと比較して、前記ｒＡＡＶの前記ＧＯＩが、心筋、骨格筋および／または平滑筋（例えば横隔膜における平滑筋）において優先的に発現する、請求項２２に記載の方法。
  24. 野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドを有する他の点では同一の参照ｒＡＡＶと比較して、前記ｒＡＡＶの前記ＧＯＩが、統計学的に有意に低いレベルで肝臓において発現する、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記筋ジストロフィーがＤＭＤ（デュシェンヌ型筋ジストロフィー）またはＢＭＤ（ベッカー型筋ジストロフィー）である、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. （１）前記筋ジストロフィーがＬＧＭＤ２Ｅ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｅ型）、ＬＧＭＤ２Ｄ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｄ型）、ＬＧＭＤ２Ｃ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｃ型）、ＬＧＭＤ２Ｂ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型）、ＬＧＭＤ２Ｌ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ型）、ＬＧＭＤ２Ｉ（肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ型）または脊髄性筋萎縮症すなわちＳＭＡであるか；
    （２）前記疾患または状態が、サンフィリポ症候群すなわちムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型すなわちＭＰＳ ＩＩＩＡ、ポンペ病またはファブリー病であるか；あるいは、
    （３）前記疾患または状態が、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ ＧＡＬＧＴ２、カルパイン－３（ＣＡＰＮ－３）またはグルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子における遺伝子欠陥によって特徴づけられるかまたはそれらに起因する、
    請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 請求項１～５のいずれか一項に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチドを含むｒＡＡＶを産生する方法であって、請求項１～５のいずれか一項に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチドを発現する産生細胞株すなわちパッケージング細胞株に、１対のＩＴＲ配列と隣接するＧＯＩをコードするｒＡＡＶベクターを導入するステップを含む方法。
  28. 前記産生細胞株すなわちパッケージング細胞株を、請求項１～５のいずれか一項に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするＨＳＶベクターに感染させる、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記産生細胞株すなわちパッケージング細胞株を、請求項１～５のいずれか一項に記載のｍＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするコード配列でトランスフェクトする、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記産生細胞株すなわちパッケージング細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞またはＨｅＬａ細胞である、請求項２７または２８に記載の方法。
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