CN114787179A - 经修饰的aav衣壳及其用途 - Google Patents

Abstract

本文所述的方法提供一种能够在肌肉组织内优先靶向感兴趣基因(GOI)的经修饰的VP1衣壳以及具有以该经修饰的VP1衣壳封装的GOI的重组腺相关病毒(rAAV)及其用途。

Description

经修饰的AAV衣壳及其用途

相关申请的引用

本申请主张2019年10月10日提交的美国临时专利申请62/913,223和2020年5月8日提交的美国临时专利申请63/021,712的申请日权益，该临时专利申请各自的整体内容通过引用并入本文。

背景技术

重组腺相关病毒(rAAV)载体有望成为用于体内基因递送的主要平台。多种rAAV载体使得递送至包括肌肉系统在内的多种组织成为可能，用于治疗多种遗传疾病和其他复杂疾病。一些天然血清型以及经工程改造的rAAV衣壳表现出增强的肌肉广泛生物分布，这可以减少所需的总剂量。

以前，肌肉的基因递送是通过将rAAV载体直接注射到肌肉中进行的。最近，rAAV静脉(IV)给药越来越常地用来促进其分布到多种类型的肌肉，现在是一些临床试验的首选给药途径。

发明内容

本发明的一个方面提供一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12组成的组的多肽，其中，该多肽插入在野生型AAV9 VP1衣壳的残基588与589之间，或非AAV9野生型Clad F(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV1)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳的两个对应残基之间。也就是说，除了插入在野生型AAV9 VP1衣壳的残基588与589之间或非AAV9野生型Clad F(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV6)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳的两个对应残基之间的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中的任一者的多肽之外，在野生型Clad F(例如，AAV9或AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV6)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳中不存在其他序列变化。

换言之，本发明提供一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含插入在野生型AAV9 VP1衣壳的残基588与589之间或非AAV9野生型Clad F(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV6)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳的两个对应残基之间的多肽，其中所述插入在野生型AAV9 VP1衣壳的残基588与589之间或非AAV9野生型Clad F(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV6)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳的两个对应残基之间的多肽包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中的任一者的氨基酸序列，或基本上由其组成或由其组成。

在某些实施方案中，mAAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的多肽。

也就是说，本发明的一个具体方面提供一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:1的多肽、基本上由其组成或由其组成。

在一个相关具体方面，本发明提供一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:11的多肽、基本上由其组成或由其组成。

在有一个相关具体方面，本发明提供一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:12的多肽、基本上由其组成或由其组成。

本发明的另一方面提供一种重组腺相关病毒(rAAV，诸如重组AAV6、AAV8、AAVrh.74或AAV9)，其包含本文所述的受试mAAV衣壳多肽中的任一者。

在某些方面，rAAV的VP1衣壳由本发明的任一种mAAV衣壳多肽组成或基本上由其组成。

在某些实施方案中，rAAV包含侧翼具有一对AAV ITR序列的感兴趣基因(GOI)。

在某些实施方案中，该一对AAV ITR序列是AAV2、AAV6、AAV8、AAVrh.74或AAV9 ITR序列。

在一些实施方案中，感兴趣基因(GOI)包括：负责或有缺陷于LGMD2E(肢带型肌营养不良症2E型)、LGMD2D(肢带型肌营养不良症2D型)、LGMD2C肢带型肌营养不良症2C型)、LGMD2B(肢带型肌营养不良症2B型)、LGMD2L(肢带型肌营养不良症2L型)、LGMD2I(肢带型肌营养不良症2I型)的基因；或关于NAGLU(α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，对于Sanfilippo综合征或黏多糖病IIIB型(MPS IIIB))、磺酰胺酶SGSH(对于黏多糖病IIIA型或MPS IIIA)、因子IX、因子VIII、肌微管素1(MTM1)、运动神经元存活(SMN，对于脊髓性肌肉萎缩症或SMA)、GalNAc转移酶GALGT2、钙蛋白酶-3(CAPN-3)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA，对于庞贝氏症)、α-半乳糖苷酶A或GLA(对于Fabry病)、葡糖脑苷脂酶、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)或微小抗肌萎缩蛋白(microdystrophin)的基因或编码序列。

在某些实施方案中，GOI编码微小抗肌萎缩蛋白。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白是US7,906,111、US7,001,761、US7,510,867、US6,869,777、US8,501,920、US7,892,824、PCT/US2016/013733或US10,166,272中描述的微小抗肌萎缩蛋白。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白包含全长抗肌萎缩蛋白的R16和R17血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如US7,892,824中描述的编码序列)。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白包含全长抗肌萎缩蛋白的R1、R16、R17、R23和R24血影蛋白样重复序列的编码序列，或者PCT/US2016/013733或US10,479,821中描述的微小抗肌萎缩蛋白。

在某些实施方案中，GOI可操作地链接至转录调节匣，诸如肌肉特异性启动子(例如CK8启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子)。

在某些实施方案中，GOI是编码一种蛋白质的微小抗肌萎缩蛋白基因，该蛋白质从N端到C端包含：氨基端肌动蛋白结合(AB1)结构域、β-营养不良聚糖结合结构域、铰链1结构域(H1)、包括血影蛋白样重复序列1(SR1)、血影蛋白样重复序列16(SR16)、血影蛋白样重复序列17(SR17)、血影蛋白样重复序列23(SR23)和血影蛋白样重复序列24(SR24)的五个血影蛋白样重复序列组成的血影蛋白样重复单元结构域、和铰链4结构域(H4)，其中，微小抗肌萎缩蛋白基因可操作地链接至肌肉特异性人类肌肉肌酸激酶CK8启动子(例如，US10,479,821的SEQ ID NO:19)，并且其中，GOI侧翼具有一对AAV2 ITR(反向末端重复序列)序列。

本发明的另一方面提供一种多核苷酸，其编码本发明的经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，与该衣壳多肽至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列。

在某些实施方案中，多核苷酸经密码子优化由于哺乳动物表达。

本发明的另一方面提供一种载体，其包含本发明的多核苷酸。

在某些实施方案中，载体是衣壳或病毒载体(诸如HSV载体或AAV载体)。

本发明的另一方提供一种经培养的宿主细胞，其包含：(a)一种重组核酸分子，其编码：(1)本发明的经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，或(2)一种与(1)至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，其中所述重组核酸分子任选地进一步包含异源非AAV序列；或者，(b)本发明的重组腺相关病毒(rAAV)。

本发明的另一方面提供一种治疗有此需要的受试者的疾病或病症诸如肌营养不良的方法，该方法包括向所述受试者给药治疗有效量的本发明的任一种rAAV。

在某些实施方案中，当与具有野生型AAV9 VP1衣壳的其他相同参考rAAV相比时，rAAV的GOI优先在心肌、骨骼肌和/或平滑肌(例如，膈膜中的平滑肌)中表达。

在某些实施方案中，当与具有野生型AAV9 VP1衣壳的其他相同参考rAAV相比时，所述rAAV的GOI以统计学显著较低的水平在肝脏中表达。

在某些实施方案中，肌营养不良是DMD(杜兴(Duchenne)氏肌营养不良症)或BMD(贝克(Becker)型肌营养不良症)。

在某些实施方案中，(1)肌营养不良是LGMD2E(肢带型肌营养不良症2E型)、LGMD2D(肢带型肌营养不良症2D型)、LGMD2C(肢带型肌营养不良症2C型)、LGMD2B(肢带型肌营养不良症2B型)、LGMD2L(肢带型肌营养不良症2L型)、LGMD2I(肢带型肌营养不良症2I型)、或脊髓性肌肉萎缩症或SMA；(2)疾病或病症是Sanfilippo综合征或黏多糖病IIIB型(MPSIIIB)、黏多糖病IIIA型或MPS IIIA、庞贝(Pompe)氏症或Fabry病；或者，(3)疾病或病症的特征或肇因是编码因子IX、因子VIII、肌微管素1(MTM1)、GalNAc转移酶GALGT2、钙蛋白酶-3(CAPN-3)或葡糖脑苷脂酶的基因中的基因缺陷。

本发明的另一方面提供一种生产rAAV的方法，其中，所述rAAV包含本发明的任一种mAAV衣壳多肽，所述方法包括将编码侧翼具有一对ITR序列的GOI引入rAAV载体中以生产或封装表达本发明的任一种mAAV衣壳多肽的细胞系。

在某些实施方案中，生产或封装细胞系是通过编码本发明的mAAV衣壳多肽的HSV载体进行感染。

在某些实施方案中，生产或封装细胞系是通过编码本发明的mAAV衣壳多肽的编码序列进行转染。

在某些实施方案中，生产或封装细胞系是HEK293细胞、A549细胞或HeLa细胞。

应理解，本发明的任何一种实施方案，包括仅在实施例中或在本发明一个方面下描述的那些，可以与任何一种或多种本发明的其他实施方案组合，除非明确否认或不适用。

附图说明

图1A至1E显示将AAV9和AAV8与受试AAV-SLB101衣壳(图中缩写为“AAV-101”或在其他地方称为“SLB101”、“SLB-101”或其变体)进行比较的体外效价测定。

图2A和2B显示将AAV9和AAV8与受试AAV-SLB101衣壳进行比较的体外效价测定，在C2C12细胞和源自患者的DMD Mouly细胞两者上进行。

图3A至3C显示，与AAV9相比，使用受试rAAV衣壳在全部三种肌肉组织与肝组织中均表现出良好的生物分布和较高水平的微小抗肌萎缩蛋白表达，而在周围组织诸如肺、脾、肾和脑中的表达缺乏差异。

图4显示本发明的新颖衣壳与野生型AAV9衣壳相比的生产产率。针对来自粘附293T细胞的三重转染的AAV产率，将受试AAV衣壳(AAV-SLB101至AAV-SLB112)的扩增板与野生型AAV9进行比较，并经由逐步碘沙醇超速离心进行纯化。两种另外的经修饰的衣壳AAV-SLB113和AAV-SLB114(参见下文图6中的序列比对)也包括在该比较中。

图5A至5C显示受试经修饰AAV衣壳的体外表征结果，用于与野生型AAV9衣壳在C2C12细胞中进行比较。具体地，图5A显示对于结合至C2C12细胞的细胞表面的AAV衣壳的定量，如通过在4℃孵育1小时后分离的DNA进行qPCR所测量。AAV-SLB101(p<0.0001)、AAV-SLB-112(p<0.01)和AAV-SLB-114(p<0.001)比AAV9显著更多地结合至C2C12细胞。通过常规单因素方差分析确定统计学。图5B显示对AAV摄入到C2C12细胞内的定量，如通过在4℃孵育1小时后并且在37℃再孵育1小时后分离的DNA进行qPCR所测量。被C2C12细胞吸收的AAV-SLB101、102、108、111、112、113、114显著多于AAV9(p<0.0001)。通过常规单因素方差分析确定统计学。在图5C中，用封装在AAV9、AAV-SLB101和十三种另外的衣壳(AAV-SLB102至AAV-SLB114)中的表达微小抗肌萎缩蛋白的载体转导C2C12细胞。在转导后96小时收获细胞并测量微小抗肌萎缩蛋白表达。将所示数据归一化至AAV9并将倍数变化指示在表中。相对于AAV9，AAV-SLB101、102、111、112和113具有最高的微小抗肌萎缩蛋白表达(p<0.0001)，且AAV-SLB109和114导致仅略高于AAV9的表达(p<0.001)。通过常规单因素方差分析确定统计学。

图6显示野生型AAV9与SLB101至SLB114(分别为第二条线至第十六条线)和共有序列(最上一条线所示序列)的序列比对。也包括野生型AAV9、SLB101、SLB-113和SLB114之间的较小区域性比对。

图7显示，与野生型AAV9相比，具有变体衣壳SLB-101、SLB-102、SLB-113和SLB-114的AAV9变体病毒在心脏、四头肌和膈膜肌肉中以及在肝脏中的生物分布。用“*”指示不同水平的统计学显著性。

图8显示，与野生型AAV9相比，具有变体衣壳SLB-101、SLB-102、SLB-113和SLB-114的AAV9变体病毒在肺、肾、脑和脾中的扩展生物分布。用“*”指示不同水平的统计学显著性。

图9显示，与野生型AAV9相比，由具有变体AAV9衣壳SLB-101、SLB-102、SLB-113和SLB-114的AAV9载体编码的微小抗肌萎缩蛋白的表达。用“*”指示不同水平的统计学显著性。

具体实施方式

1.概述

本文所述的方面提供感兴趣基因(GOI)的优化递送，部分地基于优化的rAAV衣壳，其表现出优于野生型衣壳的生物分布。此类具有经修饰的VP1衣壳的rAAV可用于以更高表达水平和/或更低剂量优先将GOI递送至肌肉组织，因此促进靶向肌肉组织(例如，骨骼肌、心肌和/或平滑肌组织)的更成功的基因疗法。

特别地，根据本发明的一个方面，本文提供经修饰的AAV衣壳和用于选择能够将GOI优先递送至肌肉组织和肌肉细胞类型的AAV衣壳的方法。

根据本发明的另一方面，本文提供一种用于选择潜在感染性AAV衣壳以潜在地降低成功的基因疗法所需的有效AAV剂量的方法。

随着rAAV药物产品在临床上的发展，需要分析工具来表征这些复杂的产品。示例包括通过PCR、qPCR、变型凝胶电泳和南方印迹法检测并定量哺乳动物细胞宿主或病毒辅助DNA。这些和另外测定的发展和验证将能够进行对rAAV载体的完全表征。因此，本发明的又一方面提供用于表征受试rAAV衣壳、载体和产品诸如实施例中描述的那些的分析工具。

本发明的另一方面提供一种体外效价测定，其作为临床工具用于开发受试rAAV衣壳和载体。将具有各种天然血清型的衣壳和工程改造的衣壳的rAAV载体进行比较，以评估它们用于全身性给药的功效，以及它们用于开发对通过基因疗法可治疗的疾病指征诸如杜兴氏肌营养不良症(DMD)的治疗的潜力。在需要全身性给药高剂量载体的应用诸如杜兴氏肌营养不良症中，这些分析工具和测定具有进一步表征和改善rAAV产品的潜力，并因此改善安全性和基因专利疗法的功效。

本发明的细节方面在下文进一步描述。

2.经修饰的VP1衣壳

本发明的经修饰的AAV9 VP1衣壳蛋白具有插入在野生型AAV9 VP1衣壳蛋白的残基Q588与A589之间的约7至13个残基短肽。在某些实施方案中，所述短肽是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中的任一个。

RGDLGLS(SEQ ID NO:1)(也称为SLB101)

RGDMSRE(SEQ ID NO:2)(也称为SLB102)

GEARISA(SEQ ID NO:3)(也称为SLB103)

ESGLSQS(SEQ ID NO:4)(也称为SLB104)

EYRDSSG(SEQ ID NO:5)(也称为SLB106)

DLGSARA(SEQ ID NO:6)(也称为SLB106)

SGNSGAA(SEQ ID NO:7)(也称为SLB107)

CDCRGDCFC(SEQ ID NO:8)(也称为SLB108)

NDVRSAN(SEQ ID NO:9)(也称为SLB109)

NDVRAVS(SEQ ID NO:10)(也称为SLB1010)

GGGRGDLGLSGGG(SEQ ID NO:11)(也称为SLB1011)

GGSRGDLGLSGGS(SEQ ID NO:12)(也称为SLB1012)

两种具有类似插入修饰但具有不同周围/侧翼序列的另外的序列称为SLB113和SLB114(参见图6)。

野生型AAV9 VP1衣壳蛋白序列是本领域中已知的，并且拷贝如下。将SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12插入在其间的残基Q588与A589加双下划线显示。

在某些实施方案中，本发明的经修饰的AAV9 VP1衣壳具有插入在SEQ ID NO:13的残基Q588与A589(两者均加双下划线)之间的SEQ ID NO:1的多肽(加粗斜体)，如下所示：

在某些实施方案中，本发明的经修饰的AAV9 VP1衣壳具有插入在SEQ ID NO:13的残基Q588与A589(两者均加双下划线)之间的SEQ ID NO:11的多肽(加粗斜体)，如下所示：

在某些实施方案中，本发明的经修饰的AAV9 VP1衣壳具有插入在SEQ ID NO:13的残基Q588与A589(两者均加双下划线)之间的SEQ ID NO:12的多肽(加粗斜体)，如下所示：

本发明的经修饰的AAV9 VP1衣壳能使来自封装在此类经修饰的AAV9 VP1衣壳中的rAAV的GOI能够优先靶向表达，尤其在包括心肌(即心脏中的肌肉)、骨骼肌(例如，四头肌)和/或平滑肌(例如，膈膜肌)在内的肌肉组织中表达。

不欲受缚于任何特定理论，改变插入点附近(即，在Q588的N端的1、2、3、4、5、6、7或8个残基和/或Q588本身，和/或A589的C端的1、2、3、4、5、6、7或8个残基和/或A589本身)的AAV9 VP1衣壳中的野生型氨基酸序列，可能影响(例如，负面影响)组织靶向和/或GOI在靶标组织内的表达水平。当与用具有在Q588和A589附近完全保留且包括这两个残基的野生型AAV9 VP1衣壳序列的受试经修饰的AAV9 VP1衣壳封装的AAV比较时，这种影响或改变的一种实施方案可以是组织感染率或在所希望的且特定的组织内的表达水平，所述组织是例如任何肌肉组织诸如心肌、骨骼肌和/或平滑肌组织。

在某些实施方案中，与其他相同的单使用野生型AAV9衣壳的rAAV构建体相比，GOI的优先表达高出至少50％，高出100％(即2倍)、3倍、5倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、30倍、50倍、75倍、或100倍或更高。在某些实施方案中，倍数增加是基于基本上如实施例(为清晰起见并避免冗余，通过引用并入本文)中所述的体外测定和/或体内测定测量的。例如，在某些实施方案中，体外细胞系是C2C12细胞或源自患者的Mouly细胞。在某些实施方案中，体内测定在DMD的mdx小鼠模型中执行。

在某些实施方案中，经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽不是基于AAV9，而是基于非AAV9野生型Clad F(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV6)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳。也就是说，将选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12组成的组的多肽插入在非AAV9野生型Clad F(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV6)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳的对应残基之间。

如本文所用，“对应残基”是指非AAV9野生型Clad F AAV(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A AAV(例如，AAV6)或野生型Clad E AAV(例如，AAV8、AAVrh.10、AAVrh.37或AAVrh.74)VP1衣壳的分别与野生型AAV9 VP1衣壳残基588和589对齐的残基。

如本文所用，非AAV9野生型Clad F AAV包括AAVhu.32。野生型Clad A AAV包括AAV1/6、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3和AAVhu.44R3。野生型Clad E AAV包括AAV8、AAVhu.37、AAVrh.10、AAVpi.2、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.2R、AAVrh.74和AAVrh.43。

例如，代表性的Clad A AAV6、Clad E AAV8和AAVrh.74中的插入点以及Clad FAAV9和AAVhu.32显示如下。注意，由于序列差异，AAV8残基N590和T591分别“对应于”AAV9残基Q588和A589。

AAV9(Clad F)	NHQSAQ<sup>588</sup>_____<sup>589</sup>AQAQTGW
		AAV8(Clad E)	NLQQQN<sup>590</sup>_____<sup>591</sup>TAPQIGT
AAVrh.10(Clad E)	NLQQQN<sup>590</sup>_____<sup>591</sup>AAPIVGA
		AAVrh.74(Clad E)	NLQQQN<sup>590</sup>_____<sup>591</sup>AAPIVGA
AAVrh.37(Clad E)	NLQQQN<sup>590</sup>_____<sup>591</sup>TGPIVGN
		AAV6(Clad A)	NLQSSS<sup>588</sup>_____<sup>589</sup>TDPATGD

3.rAAV中的感兴趣基因(GOI)和可治疗的疾病

本发明的具有经修饰VP1衣壳的重组AAV载体可携带任何感兴趣基因(GOI)，以用于通过基因疗法治疗疾病或病症。GOI可以是处于rAAV封装能力内的任何基因或编码序列，例如，约4至5kb，或约4.7kb(包括ITR序列)，或约4.4kb(不考虑ITR序列)。

在某些实施方案中，携带GOI的rAAV可用于基因疗法中，以治疗由宿主体内的内源性基因缺乏功能(诸如缺陷版本的GOI)造成的疾病或病症。

如本文所用，“感兴趣基因”或GOI通常是指一种核酸或多核苷酸序列，诸如基因、开放阅读框(ORF)、或蛋白质或RNA诸如siRNA、miRNA、shRNA等的编码序列。然而，在某些情况或语境下，术语GOI也泛指蛋白质(由该GOI编码)、或可以通过该GOI补救的疾病或指征、或可以(但不一定)由该GOI的功能丧失造成的疾病或指征。

例如，基因GALGT2编码蛋白质GalNAc转移酶(β-1,4-N-乙酰半乳糖胺半乳糖基转移酶)，它是将复合糖分子转移到一些特异性蛋白质(包括微小抗肌萎缩蛋白)的酶。在正常情况下，GalNAc转移酶仅见于肌神经接合点(NMJ)处，在该处，肌营养不良蛋白聚糖相关蛋白质复合物的一些组分不同于肌肉中的别处。重要的是，在NMJ处，存在抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)代替抗肌萎缩蛋白。在肌营养不良的mdx小鼠模型中，GALGT2的病毒基因转移导致GalNAc转移酶跨整个肌肉膜的表达而不是仅在NMJ的正常表达结构域处表达，并且导致抗肌萎缩蛋白相关蛋白跨整个肌肉纤维的上调。在mdx小鼠中，这种表达可将肌肉功能缺陷校正至微小抗肌萎缩蛋白基因表达所能达到的相同程度。此外，在其他肌营养不良(包括LGMD2A和先天性肌营养不良(MDC1A))的小鼠模型中，GALGT2的过表达校正了肌肉病理。因此，GALGT2是用于治疗肌营养不良诸如DMD、BMD、LGMD2A和MDC1A的GOI，即便是对于需要治疗的患者而言，GALGT2本身不一定是缺陷性的。

在另一示例中，Sarcolipin(SLN)抑制肌肉/内质网(SR)Ca²⁺ATPase(SERCA)，并且在DMD患者和动物模型(诸如DMD的mdx小鼠模型)的肌肉中异常增加。通过AAV9介导的RNA干扰来降低SLN水平，在重症抗肌萎缩蛋白/抗肌萎缩蛋白相关蛋白双突变型(mdx:utr^-/-)DMD小鼠模型中减轻了肌营养不良病理，包括肌肉病理的衰减以及膈膜、骨骼肌和心肌功能的改善。因此，SLN RNAi的编码序列是补救DMD的GOI。

因此，GOI可以是一种基因(或蛋白质)，它在被表达时替换突变的、受损的或失活的基因或蛋白质。GOI可以是一种基因(或蛋白质)，它在被表达时协助已经在发挥功能的过程，该过程需要修饰以进行疾病、疾患或功能障碍的治疗。GOI可以是一种基因(或蛋白质)，它在被表达时协助已经产生功能障碍的过程，该过程需要修饰以进行疾病、疾患或功能障碍的治疗。GOI核酸序列可以是DNA、RNA或合成核酸分子。GOI可以是蛋白质、酶、结构性蛋白、功能性蛋白、或基于细胞功能的适应性蛋白。GOI可以为疾病、疾患或功能障碍提供治疗益处或治疗方式。

在某些实施方案中，GOI可以是CRISPR-Cas9、Cas 13、TALEN或其他基于遗传的基因编辑蛋白，它们是进行细胞内递送以实现其预期活性所需的。

如本文所用，任何和全部GOI可能需要经由已知基于计算机的算法进行密码子优化以提升表达及活性。

因此，可通过使用受试病毒衣壳(例如，经修饰的VP1衣壳)生产的rAAV可以编码可用于例如基因疗法的感兴趣基因(GOI)，以治疗疾病或病症。代表性(非限制性)感兴趣基因(GOI)可包括：负责有缺陷于LGMD2E(肢带型肌营养不良症2E型)、LGMD2D(肢带型肌营养不良症2D型)、LGMD2C肢带型肌营养不良症2C型)、LGMD2B(肢带型肌营养不良症2B型)、LGMD2L(肢带型肌营养不良症2L型)、LGMD2I(肢带型肌营养不良症2I型)的基因；或关于NAGLU(α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，对于Sanfilippo综合征或黏多糖病IIIB型(MPS IIIB))、磺酰胺酶SGSH(对于黏多糖病IIIA型或MPS IIIA)、因子IX、因子VIII、肌微管素1(MTM1)、运动神经元存活(SMN，对于脊髓性肌肉萎缩症或SMA)、GalNAc转移酶GALGT2、钙蛋白酶-3(CAPN-3)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA，对于庞贝氏症)、α-半乳糖苷酶A或GLA(对于Fabry病)、葡糖脑苷脂酶、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)或微小抗肌萎缩蛋白(microdystrophin)的基因或编码序列。

在某些实施方案中，GOI是微小抗肌萎缩蛋白基因。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因是以下专利中描述的任一者：US7,906,111、US7,001,761、US7,510,867、US6,869,777、US8,501,920、US7,892,824、PCT/US2016/013733、US10,166,272(全部通过引用并入本文)。在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因能够被封装在rAAV病毒体中，例如，尺寸上不超过约4.7kb。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因在其编码序列内含有血影蛋白样重复序列R16和R17，这些重复序列能够恢复一氧化氮合成酶(nNOS)对于肌膜的活性(诸如US7,892,824中描述的那些)。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因包含全长抗肌萎缩蛋白的R1、R16、R17、R23和R24血影蛋白样重复序列的编码序列(即，分别为SR1、SR16、SR17、SR23和SR24)，诸如PCT/US2016/013733(通过引用并入本文)中描述的微小抗肌萎缩蛋白。在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因不编码SR1、SR16、SR17、SR23和SR24以外的全长抗肌萎缩蛋白的任何其他血影蛋白重复序列。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因描述在US7,906,111、US7,001,761、US7,510,867、US6,869,777、US8,501,920、US7,892,824或US10,166,272中或PCT/US2016/013733中(全部通过引用并入本文)。例如，PCT/US2016/013733(WO2016/115543A2)提供一种可操作地链接至调节匣的微小抗肌萎缩蛋白基因，其中微小抗肌萎缩蛋白基因编码包含以下的蛋白质：氨基端肌动蛋白结合结构域；β-肌营养不良蛋白聚糖结合结构域；和血影蛋白样重复序列结构域，包含至少四个血影蛋白样重复序列，其中至少四个血影蛋白样重复序列中的两个包含神经元一氧化氮合成酶结合结构域。在某些实施方案中，该至少四个血影蛋白样重复序列包括血影蛋白样重复序列1(SR1)、血影蛋白样重复序列16(SR16)、血影蛋白样重复序列17(SR17)和血影蛋白样重复序列24(SR24)。在某些实施方案中，由微小抗肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质进一步包含铰链结构域的至少一部分，诸如铰链1结构域、铰链2结构域、铰链3结构域、铰链4结构域和铰链样结构域中的至少一者。在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因包含，以N端至C端顺序：铰链1结构域(H1)、血影蛋白样重复序列1(SR1)、血影蛋白样重复序列16(SR16)、血影蛋白样重复序列17(SR17)、血影蛋白样重复序列24(SR24)和铰链4结构域(H4)。在某些实施方案中，H1直接偶联至SR1。在某些实施方案中，SR1直接偶联至SR16。在某些实施方案中，SR16直接偶联至SR17。在某些实施方案中，SR17直接偶联至SR24。在某些实施方案中，SR24直接偶联至H4。在某些实施方案中，由微小抗肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质进一步包含，在SR1与SR16之间，以N端至C端顺序，血影蛋白样重复序列2(SR2)和血影蛋白样重复序列3(SR3)。在某些实施方案中，SR1直接偶联至SR2，且SR2进一步偶联至SR3。在某些实施方案中，H1直接偶联至SR1，SR1直接偶联至SR16，SR16直接偶联至SR17，SR17直接偶联至SR23，SR23直接偶联至SR24，且SR24直接偶联至H4。

在某些实施方案中，调节匣选自由CK8启动子和心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子组成的组。在某些实施方案中，由微小抗肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质具有介于五个血影蛋白样重复序列到八个血影蛋白样重复序列。在某些实施方案中，由微小抗肌萎缩蛋白基因编码的蛋白质与WO2016/115543A2(通过引用并入本文)中的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少80％或90％的序列一致性。

可能受益于包含受试经修饰的VP1衣壳的rAAV的疾病或病症包括：亨廷顿氏症、X连锁肌小管性肌病(XLMTM)、酸性麦芽糖酶缺乏症(例如，庞贝氏病)、脊髓性肌肉萎缩症(SMA)、重症肌无力(MG)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、弗里德希氏共济失调、线粒体性肌病、肌营养不良症(杜兴氏肌营养不良症、肌强直性营养不良症、贝克氏肌营养不良症(BMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、面肩胛肱型肌营养不良症(FSH)、先天性肌营养不良症(CDM)、眼咽肌营养不良症(OPMD)、远端肌营养不良症、Emery-Dreifuss肌营养不良症(EDMD)、黏多糖贮积症(MPS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、贝墩(Batten)氏症、Rett综合征、克拉伯(Krabbe)氏症、卡纳万病(Canavan)、遗传性视网膜劈裂症、全色盲(CNGB3和CNGA3)、X连锁型视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、血管化黄斑变性、庞贝氏症、Fabry病、MPS I、MPS II、MPS IIIA、MPS IIIB、Gaucher氏症、Dannon氏症、A1At缺乏症、弗里德希氏共济失调、Wilson氏症、贝墩氏症(CLN1、CLN3、CLN6、CLN8)、Wolman氏症、泰萨二氏症(Tay-Sachs)、Niemann-Lick二氏症C型、CDKL5缺乏病、B-地中海贫血、镰状细胞病。

在某些实施方案中，可能受益于本发明的rAAV的疾病或病症可包括：贝克氏肌营养不良症(BMD)、先天性肌营养不良症(CMD)、Bethlem CMD、Fukuyama CMD、肌肉-眼-脑肌病(MEBs)、强直脊柱综合征、Ullrich CMD、Walker-Warburg综合征(WWS)、杜兴氏肌营养不良症(DMD)、Emery-Dreifuss二氏肌营养不良症(EDMD)、面肩胛肱型肌营养不良症(FSHD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、肌强直性营养不良症(DM)、眼咽肌营养不良症(OPMD)、包括ALS(肌萎缩性脊髓侧索硬化症)在内的运动神经元疾病、脊髓延髓性肌肉萎缩症(SBMA)、脊髓性肌肉萎缩症(SMA)。

在某些实施方案中，可能受益于本发明的rAAV的疾病或病症可包括离子通道疾病，它们典型表现为肌肉无力、肌肉张力缺失或偶发性肌肉麻痹。它们包括Andersen-Tawil综合征、高钾性周期性麻痹、低钾性周期性麻痹、先天性肌强直症、Becker肌强直症、Thomsen肌强直症、先天性副肌强直症、钾恶化型肌强直症。

在某些实施方案中，可能受益于本发明的rAAV的疾病或病症可包括线粒体疾病，在为细胞产生能量的结构发生故障时出现这些线粒体疾病。此类疾病包括：弗里德希氏共济失调(FA)、线粒体性肌病、Kearns-Sayre综合征(KSS)、Leigh综合征(亚急性坏死性脑肌病)、线粒体DNA耗竭综合症、线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)、线粒体神经消化道脑肌病(MNGIE)、纤维呈不规则红色的肌阵挛性癫痫(MERRF)、神经病变、共济失调和视网膜色素变性(NARP)、Pearson综合征、进行性眼外肌麻痹(PEO)。

在某些实施方案中，可能受益于本发明的rAAV的疾病或病症可包括肌病，它是一种肌肉疾病，其中肌肉纤维不能适当地发挥功能，导致肌肉无力。肌病包括：帽状肌病、中心核肌病、先天性肌病伴纤维型不对称、轴空肌病(Core myopathies)、中央轴空病、多微小轴空肌病、肌球蛋白沉积性肌病、肌小管性肌病、杆状体肌病、远端肌病、GNE肌病/Nonaka肌病/遗传性包涵体肌病(HIBM)、Laing远端肌病、Markesberg-Griggs迟发性远端肌病、Miyoshi肌病、Udd肌病/胫骨肌营养不良、声带和咽部远端肌病、Welander远端肌病、内分泌性肌病、甲亢肌病、甲减肌病、炎症性肌病、皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎、代谢性肌病、酸性麦芽糖酶缺乏症(AMD、庞贝氏症)、肉碱缺乏症、肉碱棕榈基转移酶缺乏症、脱支酶缺乏症(Cori氏症、Forbes氏症)、乳酸脱氢酶缺乏症、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、磷酸果糖激酶缺乏症(Tarui氏症)、磷酸甘油激酶缺乏症、磷酸甘油麦芽糖酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症(McArdle氏症)、肌纤维肌病(MFM)、肩腓骨肌病。

在某些实施方案中，可能受益于本发明的rAAV的疾病或病症可包括神经肌肉接头疾病，其由于参与肌肉与神经之间信号传递的一种或多种关键蛋白质的破坏、故障或缺失所致。此类疾病包括：先天性肌无力综合征(CMS)、Lambert-Eaton肌无力综合征(LEMS)、重症肌无力(MG)。

在某些实施方案中，可能受益于本发明的rAAV的疾病或病症可包括周围神经疾病，其中，连接大脑和脊髓与身体其他部位的运动和感觉神经受到影响，导致感觉、运动或其他功能受损。此类疾病包括：腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)(CMT)、巨轴突神经病(GAN)、恶病质和衰老引起的肌肉萎缩。

4.rAAV的生产

具有本发明的经修饰的VP1衣壳的rAAV可通过使用任何标准rAAV生产方法生产，典型使用生产者细胞系，只要该方法/生产者细胞系经修饰以提供代替野生型VP1衣壳的经修饰的VP1衣壳蛋白(或除了白干野生型VP1衣壳外，至少还包含经修饰的VP1衣壳蛋白)。

多种原理上不同的策略已经用于rAAV生产中，其全部可用于生产受试rAAV。

在某些实施方案中，受试rAAV是基于无辅助病毒的瞬时转染方法生产的，使用合适宿主细胞诸如293细胞中的全部顺式和反式组分(载体质粒和封装质粒，连同从腺病毒分离的辅助基因)。瞬时转染方法在载体质粒构件上是简单的，并且生成不含腺病毒的高滴度AAV载体。经修饰的VP1衣壳蛋白可以由在生产者细胞系中进行瞬时转染时使用的一种质粒编码。

在某些实施方案中，使用基于重组单纯疱疹病毒(rHSV)的AAV生产系统来生产rAAV，该系统利用rHSV载体将AAV载体以及Rep和Cap基因(即，本发明的经修饰的VP1衣壳基因)带至细胞内。经修饰的cap基因可以存在于也作为rAAV基因组宿主的rHSV载体中。

在某些实施方案中，使用杆状病毒系统生产受试rAAV，该系统需要用若干杆状病毒载体对昆虫细胞进行同步感染以递送AAV载体匣以及Rep和Cap基因(即，本发明的经修饰的VP1衣壳基因)。

在某些实施方案中，受试rAAV是基于某些源自例如HeLa或A549或HEK293细胞的AAV生产者细胞生产的，这些细胞稳定地携带AAV Rep/cap基因(即，本发明的经修饰的VP1衣壳基因)。AAV载体匣可以通过该匣中含有的腺病毒被稳定地整合或者引入到宿主基因组中。

在某些实施方案中，此类用于rAAV生产的生产者细胞系包含编码侧翼具有AAVITR序列的GOI的rAAV前病毒，其中，rAAV前病毒被整合到生产者细胞系的基因组中以用于rAAV生产。

5.使用rAAV治疗肌营养不良症

包含本发明的经修饰的VP1衣壳的rAAV可用于基因疗法中，用于治疗各种形式的肌营养不良症，诸如杜兴氏肌营养不良症(DMD)、肌强直性营养不良正、贝克氏肌营养不良症(BMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、面肩胛肱型肌营养不良症(FSH)、先天性肌营养不良症(CDM)、眼咽肌营养不良症(OPMD)、远端肌营养不良症、Emery-Dreifuss二氏肌营养不良症(EDMD)等。在某些实施方案中，肌营养不良症是DMD或BMD。

因此，本发明的一个方面提供一种有此需要的受试者的治疗肌营养不良症(诸如DMD和BMD)的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的重组AAV(rAAV)载体，所述载体编码在肌营养不良症中具有缺陷的基因诸如微小抗肌萎缩蛋白基因的功能性版本，其中，rAAV包含本发明的任何经修饰的VP1衣壳蛋白。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因是US7,906,111、US7,001,761、US7,510,867、US6,869,777、US8,501,920、US7,892,824、PCT/US2016/013733或US10,166,272(全部通过引用并入本文)中描述的微小抗肌萎缩蛋白基因。

在某些实施方案中，微小抗肌萎缩蛋白基因包含全长抗肌萎缩蛋白的R1、R16、R17、R23和R24血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如PCT/US2016/013733中描述的微小抗肌萎缩蛋白)。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括生产受试rAAV，然后将如此生产的rAAV给药至受试者。

实施例

实施例1：将受试AAV-SLB101与AAV9和AAV8进行比较的体外测定

本实验将受试rAAV衣壳对来自重组AAV载体的GOI在肌肉细胞中的表达的效果与AAV8和AAV9的效果进行比较。

特别地，分别以三种感染复数(MOI)用封装在AAV9、AAV8和受试衣壳AAV-SLB101(SEQ ID NO:14)中的表达微小抗肌萎缩蛋白的rAAV载体转导C2C12细胞(永生化的小鼠成肌细胞系细胞)。在转导后72小时收获细胞并通过ELISA测量微小抗肌萎缩蛋白表达。数据显示在图1A至1C中，且在图1A和1B中，每个数据点是均值±SD。通过单因素方差分析测试在每个MOI下与AAV9数据进行的比较中确定统计学显著性。

在图1A中，基于每毫升中被表达的微小抗肌萎缩蛋白的微克(μg)数，确定微小抗肌萎缩蛋白表达。数据显示，与AAV9相比，受试rAAV衣壳与GOI(例如，微小抗肌萎缩蛋白)在C2C12肌肉细胞中的高得多的表达相关联。尽管没有进行直接统计学比较，但数据也表面，与AA8相比，受试rAAV衣壳页与GOI(例如，微小抗肌萎缩蛋白)在C2C12肌肉细胞中的高得多的表达相关联。

在图1B中，基于免疫荧光强度的积分总和，确定微小抗肌萎缩蛋白表达。数据又一次显示，与AAV9相比，受试rAAV衣壳与GOI(例如，微小抗肌萎缩蛋白)在C2C12肌肉细胞中的高得多的表达相关联。尽管没有进行直接统计学比较，但数据也表面，与AA8相比，受试rAAV衣壳页与GOI(例如，微小抗肌萎缩蛋白)在C2C12肌肉细胞中的高得多的表达相关联。

在图1C中，分别以三种感染复数(MOI)用封装在AAV9、AAV8和受试衣壳AAV-SLB101中的表达微小抗肌萎缩蛋白的rAAV载体类似地转导C2C12细胞。在转导后72小时将细胞固定并免疫染色，并且通过免疫荧光(IF)将微小抗肌萎缩蛋白表达可视化。未感染的/未处理的细胞用绿色荧光针对肌球蛋白重链(MyHC)进行染色。细胞核用DAPI染色。数据可视地证实，在全部测试剂量水平下，与AAV9和AAV8衣壳两者相比，受试rAAV衣壳在C2C12肌肉细胞中直接表达GOI(例如，微小抗肌萎缩蛋白)的能力更强。

在另一实验中，用与上述相同的三种AAV但仅以最低MOI转导C2C12细胞。在转导后96小时收获细胞并测量微小抗肌萎缩蛋白表达。然后将数据归一化至AAV9并绘制在图1D中，并且将倍数变化指示在插入在图1D中的表中。AAV-SLB101的微小抗肌萎缩蛋白表达明显高于AAV9(p<0.0001)。通过常规单因素方差分析确定统计学。

在又一实验中，用与上述相同的三种AAV但仅以最低MOI转导源自患者的DMD细胞。在转导后72小时收获细胞并测量微小抗肌萎缩蛋白表达。然后将数据归一化至AAV9并绘制在图1E中，并且将倍数变化指示在插入在图1E中的表中。AAV-SLB101的微小抗肌萎缩蛋白表达明显高于AAV9(p<0.0001)。通过常规单因素方差分析确定统计学。

实施例2：在C2C12和DMD细胞上进行的体外效价测定

分别以三种感染复数(MOI)用封装在AAV9、AAV8和受试衣壳AAV-SLB101中的表达微小抗肌萎缩蛋白的rAAV载体转导C2C12细胞。在转导后72小时收获细胞并测量微小抗肌萎缩蛋白表达。数据显示为均值±SD。通过单因素方差分析在每个MOI下与AAV9进行的比较中确定统计学分析。

在图2A中，上图显示，与具有AAV9衣壳的rAAV相比，通过使用受试rAAV衣壳的rAAV以两个剂量(3E6和7.5E5)在分化C2C12细胞中实现统计学显著更多的微小抗肌萎缩蛋白表达。在图2A中，下图以柱状图显示在归一化至相同MOI的AAV9后的相同结果。具体地，在3E6的较高剂量下，使用受试衣壳的表达水平高出8.0倍。在7.5E5的较低剂量下，使用受试衣壳的表达水平高出10.6倍。

在源自患者的DMD细胞(即Mouly细胞)中重复类似的实验。

具体地，分别以三种感染复数(MOI)用封装在AAV9、AAV8和受试衣壳AAV-SLB101中的表达微小抗肌萎缩蛋白的载体转导源自患者的DMD Mouly细胞。在转导后72小时收获细胞并测量微小抗肌萎缩蛋白表达。数据显示为均值±SD。通过单因素方差分析在每个MOI下与AAV9进行的比较中确定统计学分析。

在图2B中，上图显示，与具有AAV9衣壳的rAAV相比，通过使用受试rAAV衣壳的rAAV以两个剂量(3E6和7.5E5)在分化DMD Mouly细胞中实现统计学显著更多的微小抗肌萎缩蛋白表达。从数据中去除异常值。在图2B中，下图以柱状图显示在归一化至相同MOI的AAV9后的相同结果。具体地，在3E6的较高剂量下，使用受试衣壳的表达水平高出3.1倍。在7.5E5的较低剂量下，使用受试衣壳的表达水平高出4.1倍。

实施例3：将受试AAV-SLB101衣壳与AAV9进行体外比较

在本实验中使用DMD的小鼠模型，即mdx小鼠，来演示与在具有AAV9衣壳的rAAV中相比，微小抗肌萎缩蛋白在具有受试衣壳的rAAV中的杰出表达水平。

向约5至6周龄的mdx小鼠全身性注射(静脉内递送)封装在受试衣壳AAV-SLB101中或AAV9中的表达微小抗肌萎缩蛋白的rAAV载体，剂量为1E14 vg/kg。将小鼠在注射后2至4周尸检(在2周，N＝3；且在4周，N＝4)，并收获组织以对载体生物分布和微小抗肌萎缩蛋白表达进行定量。与AAV9相比，全部小组的统计数据均通过个体韦尔奇(Welch)t检验确定。

图3A显示，AAV-SLB101在一个或两个时间点(即，第15天和第29天)在心脏(p<0.001)和四头肌(“quad”)(p<0.01)中具有显著更高的生物分布，并且在膈膜中具有朝向更高vg的趋势(特别是在第15天)。同时，AAV-SLB101在肝脏中具有显著低于AAV9(p<0.01)的vg。数据显示为均值±SD。通过单因素方差分析在每个时间点与AAV9进行的比较中确定统计学分析。在脑内未见显著差异(数据未显示)。

图3B显示，在第29天，就在多个周围组织中的表达而言，在封装在受试衣壳中的rAAV与封装在AAV9衣壳中的rAAV之间不存在可观察的差异，如由于使用肌肉特异性启动子的预期。所测试的周围组织包括肺、脾、肾和脑。

图3C显示，在第15天和第29天两个时间点，与封装在AAV9衣壳中的rAAV相比，使用封装在受试AAV-SLB101衣壳中的rAAV在全部三种所测定的肌肉组织(即，心脏(心肌)(p<0.05)、膈膜(平滑肌)和四头肌(骨骼肌)(p<0.05))中实现的微小抗肌萎缩蛋白表达显著更高。两种构建体在肝脏中均没有明显表达。数据显示为均值±SD。通过单因素方差分析在每个时间点与AAV9进行的比较中确定统计学分析。

上述数据表明，在体外效力测定中，在经培养的C2C12肌肉细胞以及源自患者的DMD Mouly细胞两者中，受试AAV-SLB101衣壳均具有杰出的GOI(例如，微小抗肌萎缩蛋白)表达效率。体外结果也通过在小鼠DMD模型mdx小鼠中执行的体内生物分布研究得到证实。

具体地，在mdx小鼠中的体内生物分布研究显示，受试AAV-SLB101衣壳在两个测试时间点(即，第15天和第29天)在心脏和四头肌中均具有高于AAV9的显著更高的生物分布，并且在第15天在膈膜中具有朝向更高vg的趋势。再者，受试AAV-SLB101衣壳在肝脏中具有显著更低的vg，而肝脏对于微小抗肌萎缩蛋白表达而言为非预期靶标组织。

就微小抗肌萎缩蛋白表达而言，受试AAV-SLB101衣壳在所测试的全部三种肌肉组织中均具有显著高于AAV9的表达水平。

实施例4：另外的经修饰的AAV-SLBC衣壳的表征

构建另外的经修饰的AAV9衣壳(包括AAV-SLB102至AAV-SLB112)以及两种具有类似插入序列但具有不同附近/侧翼序列的经修饰的衣壳(AAV-SLB113和AAV-SLB-114)，并测试它们与野生型AAV9和AAV-SLB101相比的效力。AAV-SLB102至AAV-SLB112的插入序列分别是SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:12。关于所测试的构建体相对于野生型AAV9序列和AAV-SLB101序列的多序列比对，参见图6。

在第一个实验中，基于粘附293T细胞的三重转染，然后经由分步的碘克沙醇超离心进行纯化，将各种衣壳构建体的生产产率与野生型AAV9衣壳的以及AAV-SLB101比较。所测量的生产产率绘制在图4中。与野生型AAV9相比，除少数例外，大多数构建体具有类似(但略低)的产率。

进行了一系列体外表征实验以在C2C12细胞中将另外的受试经修饰的VP1衣壳与野生型AAV9及先前测试的AAV-SLB101进行比较。结果报告在图5A至图5C中。

具体地，通过对在4℃孵育1小时后分离的DNA进行qPCR，测量对结合至C2C12细胞的细胞表面的AAV的定量。图5A中的结果显示，AAV-SLB101(p<0.0001)、AAV-SLB112(p<0.01)和AAV-SLB114(p<0.001)与C2C12细胞的结合全部显著高于AAV9，而剩余构建体全部具有与野生型AAV9类似的结合。通过常规单因素方差分析确定统计学。

然而，C2C12细胞对具有不同经修饰的衣壳的在一定程度上同等结合的病毒载体的摄入似乎存在显著差异。具体地，在图5B中，通过在4℃孵育1小时后并且在37℃再孵育1小时后分离的DNA进行qPCR，测量对AAV摄入到C2C12细胞内的定量。结果显示，被C2C12细胞吸收的AAV-SLB101、102、108、111、112、113、114显著多于(多出约20至40倍)AAV9(p<0.0001)。所测试的其他构建体似乎具有与AAV9相当的细胞摄入。通过常规单因素方差分析确定统计学。

最后，在图5C中，用封装在AAV9、AAV-SLB101和十三种另外的AAV衣壳中的表达微小抗肌萎缩蛋白的载体转导C2C12细胞。在转导后96小时收获细胞并测量微小抗肌萎缩蛋白表达。将数据归一化至AAV9，并且将倍数变化指示在插入在图5C中的表中。很明显，相对于AAV9，AAV-SLB101、102、111、112和113具有最高的微小抗肌萎缩蛋白表达(p<0.0001)，且AAV-SLB109和114导致仅略高于AAV9的表达(p<0.001)。通过常规单因素方差分析确定统计学。

值得注意的是，尽管SLB101、SLB113和SLB114全部具有相同的插入序列RGDLGLS，并且区别之处主要在侧翼序列上，但SLB101似乎导致显著高得多的微小抗肌萎缩蛋白表达水平(8.87:4.11:1.94)。也就是说，SLB101是SLB113的116％，而SLB113本身是SLB114的112％。

总之，上述数据显示，与野生型AAV9比较，至少一种受试经修饰的VP1衣壳，即AAV-SLB101，在小鼠和DMD人类骨骼肌细胞中进行的体外测定中显示杰出的效率。与AAV9相比，这也导致在四头肌和心脏中的生物分布和微小抗肌萎缩蛋白在体内的表达增加，并减少到肝脏的生物分布。受试经修饰的AAV9衣壳的扩展组还鉴定了至少两个另外的候选基因，即AAV-SLB102和AAV-SLB111，它们在关于在C2C12细胞的结合、摄入和微小抗肌萎缩蛋白表达的体外测定中的表现类似于AAV-SLB101。

实施例5：被插入的肽周围的序列的功能重要性

本实施例表明以下令人惊奇的发现：经修饰的AAV9衣壳的功能不仅取决于插入在野生型AAV9衣壳蛋白中的短肽的身份，还取决于位于被插入的短肽周围的序列。

使用三种代表性的经修饰的AAV9衣壳，即SLB-101、SLB-113和SLB-114，进行功能比较。参见图6中的序列比对。全部三种序列均包含相同的7残基核心序列RGDLGLS，但在环绕该7残基核心序列的紧邻N端和C端序列略有不同。在SLB-101中，7残基核心序列插入在野生型AAV9 VP1衣壳的残基588与589之间(即，除了所插入的7残基核心序列之外，不存在任何野生型AAV9 VP1序列的改变)。参见图6中的野生型AAV9与SLB-101之间的局部序列比对。

相比之下，在SLB-113和SLB-114中，相对于7残基核心序列，在紧邻的N端3至4个残基内和紧邻的C端4至5个残基内两处均存在另外的改变(参见图6)。总体上，与SLB-101的序列相比，SLB-113和SLB-114的序列似乎更类似于彼此。

图5A显示，在体外，这些衣壳结合C2C12细胞的能力存在差异，其中SLB-101和SLB-114两者均比野生型AAV9显著更强烈地结合之C2C12细胞，而SLB-113显示没有显著差异。

在图5B中，与SLB-113和SLB-114相比，通过AAV9变体SLB-101感染的C2C12细胞似乎以令人惊奇的更高水平表达所编码的微小抗肌萎缩蛋白。

为了证明这种体外结果并非由于与所用细胞系(即C2C12细胞)相关的伪影所致，使用模型DMD^mdx小鼠设计了体内表达研究。具体地，向5至6周龄mdx小鼠注射单剂量的1E14vg/kg的野生型AAV9或者具有SLB-101、SLB-102、SLB-113或SLB-114变体衣壳的AAV9。SLB-102包括在内，但它具有不同的插入短肽(参见图6)。经注射的小鼠在注射后2至4周进行尸检(N＝3@2周，且N＝3-4@4周)。在四组的小鼠中检查了经由MSD的病毒和微小抗肌萎缩蛋白的生物分布，与野生型对照组进行比较。

图7显示，与野生型AAV9相比，SLB-101和SLB-114两者均具有显著增加的到四头肌(骨骼)肌肉的生物分布(分别为6.78倍和8.09倍)。同时，在SLB-102和SLB-113中的温和增加是统计学不显著的。在膈膜(骨骼肌)中也作出类似的观察。

在心脏中，SLB-101生物分布显著高于野生型AAV9(4.35倍)。SLB-114也倾向于高(2.48倍)但不是统计学显著的。而且，与AAV9对照相比，SLB-102和SLB-113两者均具有大致相同的生物分布。

有趣的是，尽管全部AAV9变体均具有更低的肝脏分布，但仅SLB-114是统计学显著更低的。参见图7。

也检查了在大量其他器官中的扩展生物分布。图8显示，在脑中全部具有统计学显著更低的分布，而在肺、脾和肾中的分布似乎与野生型AAV9相当，但SLB-101在肾中更高，而SLB-114在脾中更高。

在图9中，检查了在心脏、四头肌和膈膜中的微小抗肌萎缩蛋白表达。与比野生型AAV9相比，SLB-101和SLB-114两者在全部三种组织中均具有统计学更高的表达，而SLB-102在任何组织中均不明显。同时，SLB-113仅在膈膜中更高，而在其他两种组织中均不是统计学显著高于AAV9的。

这些数据显示，至少生物分布和微小抗肌萎缩蛋白表达受到周围序列的影响，因为SLB-101、SLB-113和SLB-114全部具有相同的7残基核心序列插入。

Claims (30)

1.一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含选自由SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:12组成的组的多肽，其中，所述多肽插入在野生型AAV9 VP1衣壳的残基588与589之间，或者非AAV9野生型Clad F(例如，AAVhu.32)、野生型Clad A(例如，AAV6)或野生型Clad E(例如，AAV8、AAVrh.10或AAVrh.74)VP1衣壳的两个对应残基之间。

2.根据权利要求1所述的mAAV衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12的多肽。

3.一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:1的多肽、基本上由其组成，或由其组成。

4.一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:11的多肽、基本上由其组成，或由其组成。

5.一种经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，其包含SEQ ID NO:12的多肽、基本上由其组成，或由其组成。

6.一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的mAAV衣壳多肽。

7.根据权利要求6所述的rAAV，其中，所述rAAV的所述VP1衣壳由或基本上由根据权利要求1至5中任一项所述的mAAV衣壳多肽组成。

8.根据权利要求6或7所述的rAAV，其中，所述rAAV包含侧翼具有一对AAV ITR序列的感兴趣基因(GOI)。

9.根据权利要求8所述的rAAV，其中，所述一对AAV ITR序列是AAV2或AAV9 ITR序列。

10.根据权利要求8或9所述的rAAV，其中，所述感兴趣基因(GOI)包括：负责或有缺陷于LGMD2E(肢带型肌营养不良症2E型)、LGMD2D(肢带型肌营养不良症2D型)、LGMD2C(肢带型肌营养不良症2C型)、LGMD2B(肢带型肌营养不良症2B型)、LGMD2L(肢带型肌营养不良症2L型)、LGMD2I(肢带型肌营养不良症2I型)的基因；或关于NAGLU(α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，对于Sanfilippo综合征或黏多糖病IIIB型(MPS IIIB))、磺酰胺酶SGSH(对于黏多糖病IIIA型或MPS IIIA)、因子IX、因子VIII、肌微管素1(MTM1)、运动神经元存活(SMN，对于脊髓性肌肉萎缩症或SMA)、GalNAc转移酶GALGT2、钙蛋白酶-3(CAPN-3)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA，对于庞贝氏症)、α-半乳糖苷酶A或GLA(对于Fabry病)、葡糖脑苷脂酶、抗肌萎缩蛋白或微小抗肌萎缩蛋白的基因或编码序列。

11.根据权利要求8或9所述的rAAV，其中，所述GOI编码微小抗肌萎缩蛋白。

12.根据权利要求11所述的rAAV，其中，所述微小抗肌萎缩蛋白是US7,906,111、US7,001,761、US7,510,867、US6,869,777、US8,501,920、US7,892,824、PCT/US2016/013733或US10,166,272中描述的微小抗肌萎缩蛋白。

13.根据权利要求12所述的rAAV，其中，所述微小抗肌萎缩蛋白包含全长抗肌萎缩蛋白的R16和R17血影蛋白样重复序列的编码序列(诸如US7,892,824中描述的编码序列)。

14.根据权利要求13所述的rAAV，其中，所述微小抗肌萎缩蛋白包含全长抗肌萎缩蛋白的R1、R16、R17、R23和R24血影蛋白样重复序列的编码序列，或者PCT/US2016/013733或US10,479,821中描述的微小抗肌萎缩蛋白。

15.根据权利要求8至14中任一项所述的rAAV，其中，所述GOI可操作地链接至转录调节匣，诸如肌肉特异性启动子(例如，CK8启动子或心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子)。

16.根据权利要求8至15中任一项所述的rAAV，其中，所述GOI是编码一种蛋白质的微小抗肌萎缩蛋白基因，所述蛋白质从N端到C端包含：氨基端肌动蛋白结合(AB1)结构域、β-营养不良聚糖结合结构域、铰链1结构域(H1)、包括血影蛋白样重复序列1(SR1)、血影蛋白样重复序列16(SR16)、血影蛋白样重复序列17(SR17)、血影蛋白样重复序列23(SR23)和血影蛋白样重复序列24(SR24))的五个血影蛋白样重复序列组成的血影蛋白样重复单元结构域、和铰链4结构域(H4)，其中，所述微小抗肌萎缩蛋白基因可操作地链接至肌肉特异性人类肌肉肌酸激酶CK8启动子(例如，US10,479,821的SEQ ID NO:19)，并且其中，所述GOI侧翼具有一对AAV2 ITR(反向末端重复序列)序列。

17.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，与所述衣壳多肽至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽序列。

18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其经密码子优化用于哺乳动物表达。

19.一种载体，其包含根据权利要求17或18所述的多核苷酸。

20.根据权利要求19所述的载体，其是衣壳或病毒载体(诸如HSV载体或AAV载体)。

21.一种经培养的宿主细胞，其包含：

(a)一种重组核酸分子，其编码：(1)根据权利要求1至5中任一项所述的经修饰的腺相关病毒(mAAV)衣壳多肽，或(2)一种与(1)至少95％、96％、97％、98％或99％相同的多肽，其中所述重组核酸分子任选地进一步包含异源非AAV序列；或者，

(b)一种根据权利要求6至16中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)。

22.一种治疗有此需要的受试者的疾病或病症诸如肌营养不良的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的根据权利要求11至16中任一项所述的rAAV。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，与具有野生型AAV9 VP1衣壳的其他相同参考rAAV相比，所述rAAV的GOI优先在心肌、骨骼肌和/或平滑肌(例如，膈膜中的平滑肌)中表达。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，与具有野生型AAV9VP1衣壳的其他相同参考rAAV相比,所述rAAV的GOI以统计学显著较低的水平在肝脏中表达。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中，所述肌营养不良是DMD(杜兴氏肌营养不良症)或BMD(贝克氏肌营养不良症)。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中：

(1)所述肌营养不良是LGMD2E(肢带型肌营养不良症2E型)、LGMD2D(肢带型肌营养不良症2D型)、LGMD2C(肢带型肌营养不良症2C型)、LGMD2B(肢带型肌营养不良症2B型)、LGMD2L(肢带型肌营养不良症2L型)、LGMD2I(肢带型肌营养不良症2I型)、或脊髓性肌肉萎缩症或SMA；

(2)所述疾病或病症是Sanfilippo综合征或黏多糖病IIIB型(MPS IIIB)、黏多糖病IIIA型或MPS IIIA、庞贝氏症或Fabry病；或，

(3)所述疾病或病症的特征或肇因是编码因子IX、因子VIII、肌微管素1(MTM1)、GalNAc转移酶GALGT2、钙蛋白酶-3(CAPN-3)或葡糖脑苷脂酶的基因中的基因缺陷。

27.一种生产rAAV的方法，其中，所述rAAV包含根据权利要求1至5中任一项所述的mAAV衣壳多肽，所述方法包括将编码侧翼具有一对ITR序列的GOI引入rAAV载体中以生产或封装表达根据权利要求1至5中任一项所述的mAAV衣壳多肽的细胞系。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述生产或封装细胞系是通过编码根据权利要求1至5中任一项所述的mAAV衣壳多肽的HSV载体进行感染。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，所述生产或封装细胞系是通过编码根据权利要求1至5中任一项所述的mAAV衣壳多肽的编码序列进行转染。

30.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述生产或封装细胞系是HEK293细胞、A549细胞或HeLa细胞。

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