JP2021512649A - 転写調節要素及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載されている値の上下10%以内の値を指す。
100×(分数X/Y)
式中、Xは、AとBのそのプログラムのアライメントにおいて、配列アライメントプログラム(例えば、BLAST)によって同一のマッチとしてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Yは、Bにおける核酸の総数である。核酸またはアミノ酸配列Aの長さが核酸またはアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの配列同一性パーセントは、Aに対するBのパーセントアミノ酸配列同一性と等しくないと認識されるであろう。
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得る転写調節要素は、互いに作動可能に連結された様々な部分を含み得る。例えば、本明細書に記載の転写調節要素は、配列番号3に示されるようなアポリポタンパク質E肝臓制御領域(ApoE−HCR)またはその機能部分を含み得る。ApoE−HCRの例示的な機能部分は、Dang et al.,J.Biol.Chem.270:22577−22585(1995)に記載の配列番号2に示される320ヌクレオチド部分であり、その開示は、それがApoE−HCR遺伝子座及びその機能部分に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得るApoE−HCR核酸の別の例は、ApoE−HCRの193ヌクレオチドセグメントであり、その核酸配列は、配列番号1に示されている。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて使用され得るApoE−HCR核酸のさらなる例は、配列番号4に示される50ヌクレオチドセグメントである。本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なさらなる核酸調節要素は、上記の核酸配列に関して少なくとも85%の配列同一性(例えば、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99,9%もしくはそれ以上の配列同一性)を有する核酸分子を含む。
トランスフェクション技術
本明細書に記載の転写調節要素に作動可能に連結された導入遺伝子などの導入遺伝子を標的細胞に導入するために使用することができる技術は、当該技術分野で知られている。例えば、エレクトロポレーションを使用して、対象となる細胞に静電電位を印加することによって、哺乳動物細胞(例えば、ヒト標的細胞)を浸透させることができる。このようにして外部電場にさらされたヒト細胞などの哺乳動物細胞は、その後、外因性核酸の取り込みを起こしやすくなる。哺乳動物細胞のエレクトロポレーションは、例えば、Chu et al.,Nucleic Acids Research 15:1311(1987)に詳細に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。同様の技術であるNucleofection(商標)は、外因性ポリヌクレオチドの真核細胞の核への取り込みを刺激するために、印加電場を利用する。Nucleofection(商標)及びこの技術を実行するために有用なプロトコルは、例えば、Distler et al.,Experimental Dermatology 14:315(2005)、ならびにUS2010/0317114に詳細に記載されており、そのそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
上記に加えて、対象となる遺伝子をヒト細胞などの標的細胞に組み込むために使用することができる様々なツールが開発されている。標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に組み込むために使用することができるそのような方法の1つは、トランスポゾンの使用を含む。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードし、5’切除部位及び3’切除部位に隣接する対象となるポリヌクレオチド配列または遺伝子を含有するポリヌクレオチドである。トランスポゾンが細胞内に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が開始し、トランスポゾンから対象となる遺伝子を切断する活性酵素を生じる。この活性は、トランスポザーゼがトランスポゾン切除部位を部位特異的に認識することによって媒介される。場合によっては、これらの切除部位は、末端反復でもよく逆方向末端反復でもよい。対象となる遺伝子は、トランスポゾンから切り出されると、哺乳動物細胞の核ゲノム内に存在する同様の切除部位の、トランスポザーゼによって触媒される切断によって哺乳動物細胞ゲノムに組み込むことができる。これにより、切断された核DNAの相補的な切除部位に対象となる遺伝子が挿入され、その後に、対象となる遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムのDNAにつなぐホスホジエステル結合の共有結合連結によって組み込みプロセスが完了する。ある特定の場合では、トランスポゾンは、標的遺伝子をコードする遺伝子が最初にRNA生成物に転写され、次いで、DNAに逆転写された後に、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれるようなレトロトランスポゾンでもよい。例示的なトランスポゾン系には、piggybacトランスポゾン(例えば、WO2010/085699に詳細に記載されている)及びsleeping beautyトランスポゾン(例えば、US2005/0112764で詳細に説明されている)であり、それらのそれぞれの開示は、対象となる細胞への遺伝子送達に使用するためのトランスポゾンに関係するため、参照により本明細書に組み込まれる。
核酸送達のためのウイルスベクター
ウイルスゲノムは、対象となる遺伝子を標的細胞(例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞)のゲノムに効率的に送達するために使用することができる豊富なベクター供給源を提供する。ウイルスゲノム内に含まれるポリヌクレオチドは、典型的には、一般化または特殊化された形質導入によって標的細胞のゲノムに組み込まれるため、このようなゲノムは、特に、遺伝子送達に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として行われ、遺伝子組み込みを誘導するために追加のタンパク質または試薬を必要としない。ウイルスベクターの例には、AAV、レトロウイルス、アデノウイルス(例えば、Ad5、Ad26、Ad34、Ad35、及びAd48)、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹及びセンダイ)、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス)を含む二本鎖DNAウイルス、ならびにポックスウイルス(例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ(MVA)、鶏痘、及びカナリアポックス)が含まれる。本発明の抗体軽鎖及び重鎖または抗体断片をコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用な他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV−BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが含まれる(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott−Raven Publishers,Philadelphia,1996)。他の例には、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン・ファイザー(Mason Pfizer)サルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。ベクターの他の例は、例えば、米国特許第5,801,030号に記載されており、その開示は、遺伝子療法で使用するためのウイルスベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法の核酸は、細胞へのそれらの導入を促進するために、rAAVベクター及び/またはビリオンに組み込まれる。本発明において有用なrAAVベクターは、(1)発現される導入遺伝子(例えば、GAAタンパク質をコードするポリヌクレオチド)及び(2)異種遺伝子の組み込み及び発現を促進するウイルス核酸を含む組換え核酸構築物である。ウイルス核酸は、ビリオンへのDNAの複製及びパッケージング(例えば、機能的ITR)のためにシスで必要とされるAAVのそれらの配列を含み得る。典型的な用途では、導入遺伝子は、GAAをコードし、これは、ポンペ病などのリソソーム蓄積障害に罹患している患者のGAA欠乏症を修正するのに有用である。そのようなrAAVベクターはまた、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含み得る。有用なrAAVベクターは、全体的または部分的に欠失したAAV WT遺伝子のうちの1つ以上を有するが、機能的な隣接ITR配列を保持する。AAV ITRは、特定の用途に適している任意の血清型(例えば、血清型2に由来する)であり得る。rAAVベクターを使用するための方法は、例えば、Tal et al.,J.Biomed.Sci.7:279−291(2000)及びMonahan and Samulski,Gene Delivery 7:24−30(2000)に記載されており、それらのそれぞれの開示は、遺伝子送達のためのAAVベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
ポンペ病
ポンペ病(II型糖原病またはGSD IIとして知られている)は、リソソーム酵素GAAの欠乏によって引き起こされる。この疾患は、GAA欠乏症は、最終的には、すべての組織、特に横紋筋細胞にグリコーゲン蓄積をもたらす、先天性の代謝異常である。加えて、中枢神経系内のグリコーゲン蓄積の効果及び骨格筋機能へのその効果が、文書化されている。
野生型GAAのアミノ酸配列は、以下の配列番号14に示されている。
MGVRHPPCSHRLLAVCALVSLATAALLGHILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGASRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPVEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC(配列番号14)
本明細書に記載の転写調節要素は、リソソーム酵素(例えば、GAA)などの導入遺伝子に作動可能に連結され、リソソーム蓄積障害(例えば、ポンペ病)に罹患しているヒト患者などの患者に投与するためのビヒクルに組み込まれ得る。治療用導入遺伝子に作動可能に連結された、本明細書に記載の転写調節要素を含むウイルスベクターなどのベクターを含む薬学的組成物は、当該技術分野で知られている方法を使用して調製することができる。例えば、そのような組成物は、例えば、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)、参照により本明細書に組み込まれる)を使用して、例えば凍結乾燥製剤または水溶液の形で所望の形態で調製することができる。
目的
いくつかのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、ポンペのマウスモデルにおける一連の用量で、異なる組織(例えば、筋肉及び肝臓)での発現を標的とするように設計された。ポンペマウスモデルでの全身投与後、一連の用量で、異なる組織及び/または組織の組み合わせへのヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子(hGAA)の発現を誘導するように設計された6つのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの結果を比較した。ポンペ病の治療のために全身投与されたAAV−GAAの臨床試験への翻訳のために、最適な多組織発現プロファイルを持つベクターが、選択された。
ベクター及びベクター生成
ベクター2(AAV9−Des−hGAAco)、ベクター3(AAV8−LDes−hGAAco)、ベクター4(AAV8−LNDes−hGAAco)、ベクター5(AAV8−LDes2−hGAAco)、及びベクター6(AAV8−Des3−hGAAco)は、標準的な分子生物学技術を介してクローン化され、哺乳動物細胞への2−プラスミド一過性トランスフェクションに基づいたスケール化された生産方法で製造された。各ベクターのゲノム力価は、ddPCRにより決定した。候補ベクターを、以下の表4に要約する。構築物の逆方向末端反復(ITR)領域の一般的な構成の略図を、図1に示す。
ベクター番号1のGAA導入遺伝子に作動可能に連結された転写調節要素の核酸配列は、5’から3’に、ヒトα−1抗トリプシンプロモーター(以下の配列番号13に示されている)に作動可能に連結された、ApoE−HCR(配列番号1に示されている)の193ヌクレオチドセグメントを含む。この構築物で使用された、組み合わせられたApoE−HCR/ヒトα−1抗トリプシン調節要素の核酸配列は、配列番号9に示されている。
CCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGcACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATC(配列番号9)
GAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGcACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGTGAATC(配列番号13)
動物のすべての手順は、Institutional Animal Care and Use Committee of Jackson Laboratories,Bar Harbor,MEによって承認され、Jackson Laboratories,Bar Harbor,MEで行われた。B6.129−Gaawtマウス及びB6.129−Gaatm1Rabnホモ接合性変異マウスは、ジャクソン研究所から入手した。AAVロットは、ビヒクルで希釈することによって注射用に調製され、用量は、マウスの体重測定に従って、ベクターまたはビヒクルの単回静脈内投与によって、示されるように3×1012vg/kg、1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、または1×1014vg/kgで投与された。臨床観察及び死亡率観察は、投与から研究の終了まで毎日行われた。投与から4週間または12週間後に、マウスを殺処分にし、剖検した。採取された組織は、処理され、その後の分析のために第三者開発業務受託機関に送られた。
α−グルコシダーゼ(GAA)活性は、マウス組織(例えば、肝臓、心臓、脳、及び脊椎)ならびに血清で評価された。血清または組織ホモジネートを、GAAによって加水分解されて加水分解生成物4−メチルウンベリフェロン(4−MU)を生成する蛍光発生基質4−メチルウンベリフェリルα−D−グルコピラノシド(4−MUG)とインキュベートした。4−MUは、蛍光プレートリーダーで検出され、サンプルの酵素活性は、4−MU標準曲線を使用して定量化された。
Maxisorp 96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)を、組換えhGAAタンパク質(R&D Systems)でコーティングした。ブロッキング後、1:200で希釈した血漿サンプルを、プレートに加え、37℃で1時間インキュベートした。HRPにコンジュゲートした抗マウス二次抗体を、検出のために使用した。次いで、蛍光発生基質をウェルに加え、光強度をプレートリーダーで評価した。
全RNAを組織から単離し、ポリAを選択した標準的なイルミナ鎖特異的プロトコルを使用してシークエンシングライブラリーを調製した。ライブラリーは、サンプルごとにインデックス化され、組織型ごとにプールし、4レーン(2×150bpリード)にわたってIllumina HiSeqによって配列決定した。アダプター配列は、最初にSkewerを使用してFASTQファイルからトリミングされ、次いでhGAAを含む転写産物量を、Salmon(GCバイアス及びストランド情報を考慮)を使用してトリミングされたFASTQファイルから定量化し、最後に転写数を、BioconductorからのDESeq2パッケージを使用してライブラリーサイズに対して正規化した。
イソペンタンで凍結した組織を切断し、標準的な手順に従って、H&E及びPASで染色した。次いで、切片を、訓練された病理学者が盲目的に分析し、以下の注釈(表5も参照のこと)に従ってスコアを評価した:1.正常、2.繊維の10〜49%に見られる大小のグリコーゲン凝集体、3.繊維の50〜90%に見られる大小のグリコーゲン凝集体、4.小さなグリコーゲンが繊維の90%超凝集し、大きなグリコーゲンがまれな繊維でのみ凝集する、5.小さなグリコーゲンが繊維の90%超凝集し、大きなグリコーゲンが繊維の30%超凝集する。
ハイブリッドプロモーターは、肝臓及び筋肉のGAA発現バランスを調整する
GAA活性は、筋肉及び肝臓組織で評価された。筋肉中のGAA活性を決定するために、1×1013vg/kgで投与した対照及びベクターで処置したマウスについて雄(黒丸)及び雌マウス(灰色三角)からの大腿四頭筋組織におけるGAA活性は、投与から1カ月後に評価した(材料及び方法を参照のこと)(図2)。肝組織中のGAA活性を決定するために、1×1013vg/kgで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス(黒丸)及び雌マウス(灰色三角)からの肝組織に投与してから1カ月後にGAA活性を評価した(図4)。追加的に、hGAA転写産物は、RNA−Seq分析によって1×1013vg/kgで投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス(丸)及び雌マウス(三角)からの肝組織において測定された(図3)。内因性マウスGAAの中央値発現レベルは、横線で示される。
筋肉の病変は、酵素補充療法によってヒトで修正することは古典的に困難である。筋肉の病変の改善における各ベクターの影響を判断するために、1×1013vg/kg(図7A)または3×1013vg/kg(図7B)で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス(黒丸)及び雌マウス(灰色三角)から切断した大腿四頭筋の病理学的スコア(表5)を、評価した。
ハイブリッドベクターがCNSベースのポンペの症状を修復する能力を評価するために、GAA活性を、3×1013vg/kg(図9)で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス(黒丸)及び雌マウス(灰色三角)からの脊髄に投与してから1カ月後に評価した。追加的に、hGAA転写産物は、RNA−seq分析による1×1013vg/kg(図10)で投与した対照及びベクターで処置したマウスにおける雄マウス(丸)及び雌マウス(三角)からの脊髄組織において測定された。内因性マウスGAAの中央値発現レベルは、横線で示される。肝臓またはCNS組織におけるベクターごとの発現レベルの比率をそれぞれ推定するために、RNA−Seq分析によって決定されるように、肝臓または脊髄におけるRNA発現のレベルを、肝臓または脳組織における平均ベクターコピー数(VCN)で除算した(図11)。
この実施例によって示されるように、ベクター3のような操作された合成ハイブリッドプロモーターは、筋肉、肝臓、及びCNS組織における真正なhGAA発現を指示した。肝臓の寄与により、例えば、ベクター3に対して好ましい免疫原性プロファイルをもたらした。筋肉の寄与により、例えばベクター3に対して好ましいGAA活性、グリコーゲンの回復、及び筋肉の病理学的観察結果をもたらす。追加的に、脊髄及びデノボ転写産物におけるGAA活性に基づいてCNS活性(例えば、ベクター3に対する)が証明されている。本発明者らの所見は、ポンペ病のAAV遺伝子療法のために最適化されたhGAAベクターとして本明細書に記載のベクターの臨床翻訳を支持する。
当該技術分野で知られている従来の分子生物学技術を使用して、GAAなどの治療用タンパク質をコードする遺伝子は、転写調節要素(例えば、上記の実施例1に記載の転写調節要素)に作動可能に連結することができる。その後、遺伝子を、ウイルスベクターなどのベクターに組み込み、遺伝子の欠損に関連する疾患に罹患している患者に投与することができる。例えば、GAAの欠乏を特徴とするポンペ病、リソソーム蓄積障害に罹患している患者は、筋肉細胞、ニューロン、及び肝細胞におけるGAAを促進する転写調節要素の制御下でGAA遺伝子を含むウイルスベクターを投与することができる。例えば、偽型AAV2/8またはAAV2/9ベクターなどのAAVベクターは、ベクターの5’逆方向末端反復と3’逆方向末端反復との間にGAA遺伝子を組み込むベクターを生成することができ、遺伝子は、上記の実施例1に記載の転写調節要素の制御下に置くことができる。AAVベクターは、とりわけ、静脈内、筋肉内、または皮下などの様々な投与経路によって対象に投与することができる。
この本明細書に記述されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各独立した刊行物または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (94)
- 第2のセグメントに作動可能に連結された第1のセグメントを含む核酸調節要素であって、前記第1のセグメントが、アポリポタンパク質E肝臓制御領域(ApoE−HCR)またはその機能部分を含み、前記第2のセグメントが、デスミンプロモーターまたはその機能部分を含む、前記核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントの3’末端が、前記第2のセグメントの5’末端に作動可能に連結されている、請求項1に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントの5’末端が、前記第2のセグメントの3’末端に作動可能に連結されている、請求項1に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号4の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号4の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項4に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号4の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項5に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号4の核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項6に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号1の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号1の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項8に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号1の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項9に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号1の核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項10に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号2の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号2の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項12に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号2の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項13に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列を有するApoE−HCRエンハンサー、または配列番号2の核酸配列を有するその機能部分を含む、請求項14に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号4の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号4の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項16に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号4の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項17に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号4の核酸配列を有する核酸を含む、請求項18に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号1の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号1の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項20に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号1の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項21に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号1の核酸配列を有する、請求項22に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号2の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号2の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項24に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号2の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項25に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号2の核酸配列を有する、請求項26に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項28に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項29に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号3の核酸配列を有する、請求項30に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号5の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する5’領域を含む、請求項1〜31のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記5’領域が、配列番号5の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項32に記載の核酸調節要素。
- 前記5’領域が、配列番号5の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項33に記載の核酸調節要素。
- 前記5’領域が、配列番号5の核酸配列を有する、請求項34に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号6の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する3’領域を含む、請求項1〜35のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記3’領域が、配列番号6の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項36に記載の核酸調節要素。
- 前記3’領域が、配列番号6の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項37に記載の核酸調節要素。
- 前記3’領域が、配列番号6の核酸配列を有する、請求項38に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号7の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項1〜39のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号7の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項40に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号7の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項41に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号7の核酸配列を有する、請求項42に記載の核酸調節要素。
- 前記第1及び第2のセグメントに対して5’に位置し、それに作動可能に連結された第3のセグメントをさらに含み、前記第3のセグメントが、シナプシンプロモーターまたはその機能部分を含む、請求項1〜43のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第3のセグメントが、配列番号8の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項44に記載の核酸調節要素。
- 前記第3のセグメントが、配列番号8の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項45に記載の核酸調節要素。
- 前記第3のセグメントが、配列番号8の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項46に記載の核酸調節要素。
- 前記第3のセグメントが、配列番号8の核酸配列を有する、請求項47に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号10の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する、請求項1に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号10の核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、請求項49に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号10の核酸配列と少なくとも95%の同一性を有する、請求項50に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号10の核酸配列を有する、請求項51に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号12の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する、請求項1に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号12の核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、請求項53に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号12の核酸配列と少なくとも95%の同一性を有する、請求項54に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号12の核酸配列を有する、請求項55に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号11の核酸配列と少なくとも85%の同一性を有する、請求項1に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号11の核酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、請求項57に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号11の核酸配列と少なくとも95%の同一性を有する、請求項58に記載の核酸調節要素。
- 前記核酸調節要素が、配列番号11の核酸配列を有する、請求項59に記載の核酸調節要素。
- 第2のセグメントに作動可能に連結された第1のセグメントを含む核酸調節要素であって、前記第1のセグメントが、デスミンプロモーターまたはその機能部分を含み、前記第2のセグメントが、シナプシンプロモーターまたはその機能部分を含む、前記核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントの3’末端が、前記第2のセグメントの5’末端に作動可能に連結されている、請求項61に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントの5’末端が、前記第2のセグメントの3’末端に作動可能に連結されている、請求項61に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号5の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する5’領域を含む、請求項61〜63のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記5’領域が、配列番号5の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項64に記載の核酸調節要素。
- 前記5’領域が、配列番号5の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項65に記載の核酸調節要素。
- 前記5’領域が、配列番号5の核酸配列を有する、請求項66に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号6の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する3’領域を含む、請求項61〜67のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記3’領域が、配列番号6の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項68に記載の核酸調節要素。
- 前記3’領域が、配列番号6の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項69に記載の核酸調節要素。
- 前記3’領域が、配列番号6の核酸配列を有する、請求項70に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号7の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項61〜71のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号7の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項72に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号7の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項73に記載の核酸調節要素。
- 前記第1のセグメントが、配列番号7の核酸配列を有する、請求項74に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号8の核酸配列と少なくとも85%同一である核酸配列を有する、請求項61〜75のいずれか1項に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号8の核酸配列と少なくとも90%同一である核酸配列を有する、請求項76に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号8の核酸配列と少なくとも95%同一である核酸配列を有する、請求項77に記載の核酸調節要素。
- 前記第2のセグメントが、配列番号8の核酸配列を有する、請求項78に記載の核酸調節要素。
- 請求項1〜79のいずれか1項に記載の核酸調節要素を含むベクターであって、前記核酸調節要素が、導入遺伝子に作動可能に連結されており、前記核酸調節要素が、細胞への前記ベクターの導入時に前記導入遺伝子の発現を誘導する、前記ベクター。
- 前記導入遺伝子が、酸性α−グルコシダーゼ(GAA)である、請求項80に記載のベクター。
- 前記細胞が、筋肉細胞、ニューロン、または肝細胞である、請求項80または81に記載のベクター。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項80〜82のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される、請求項83に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、AAVである、請求項84に記載のベクター。
- 前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、またはAAVrh74血清型である、請求項85に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、偽型AAVである、請求項83に記載のベクター。
- 前記偽型AAVが、rAAV2/8またはrAAV2/9である、請求項87に記載のベクター。
- 請求項1〜79のいずれか1項に記載の核酸調節要素を含む核酸分子を含む組成物であって、前記組成物が、リポソーム、小胞、合成小胞、エキソソーム、合成エキソソーム、デンドリマー、またはナノ粒子である、前記組成物。
- 前記核酸調節要素が、導入遺伝子に作動可能に連結されており、前記核酸調節要素が、細胞への前記組成物の導入時に前記導入遺伝子の発現を誘導する、請求項89に記載の組成物。
- 細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞における前記導入遺伝子の転写をシミュレートするのに十分な時間、前記細胞を、請求項80〜88のいずれか1項に記載のベクターあるいは請求項89または90に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
- 前記導入遺伝子が、GAAである、請求項91に記載の方法。
- 治療を必要とするヒト患者におけるポンペ病を治療する方法であって、前記患者に、治療有効量の請求項80〜88のいずれか1項に記載のベクターあるいは請求項89または90に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 請求項80〜88のいずれか1項に記載のベクターあるいは請求項89または90に記載の組成物を含むキットであって、前記ベクターまたは組成物を細胞と接触させ、それにより調節制御要素に作動可能に連結された導入遺伝子を発現させるように、前記キットのユーザーに指示する添付文書をさらに含む、前記キット。
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