PT99410A - Processo para a preparacao de ciclosporinas e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

Description

A presente invenção refére^-se a um processo para a preparação de novas ciclosporinas, ao seu. uso .como lãraiacos e de composições farmacêuticas que as contêm.

As ciclosporinas ,coffipreeadem : uma classe de undeca-péptidos poli - N~- me t i 1 ad o s c í c 1 i c o s, "à s t r u t u r a 1 men t e di s t i nt os, que possuem normalmente actividadelfârmacológica, em particular , actividade imunossupressora, anti-inflamatôria e/ou anti--parasítica. A primeira das ciclosporinas a ser isolada foi a Ciclosporin ou Ciclosporina metabolito que ocorre naturalmente nos fungos, também conhecida como ciclosporina A e â ff> disposição no comércio sob a Marca Registada SÂMDIMMUN ou SANDIMMUNE^ . A Ciclosporina é a ciclosporina da fórmula A. (A) -MeBmt-aAbu-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-(D )Ala-MeLeu~MeLeu~MeVal-1 2 3 4 5 6 7 8 -.:.1 9''ii' em que MeBmt representa o resíduo N-metil-(4R)-4-but~2E-en-l -il-4-metil-(L)treonilo da fórmula B. 4 4

em que ·;;-·/··· é -CH^CH- (trans). " Desde a destoberu uiigitial da : Ciclosporina, foram isoladas:e identificadas uma larga variedade de cíclosporinas que ocorrem naturalfflente, tendo sido preparadas muitas outras ciclosporinas não-naturais, por : meios. totalmente :sintéticos ou semi-sintêticos ou peia aplicação de técnicas deV cultura modificadas. A classe compreendida pelas ciclosporinas é assim, neste momento, substância! e; inclui,: por exemplo, as ri closporinas 1 de A a Z que ocor rem naturalmente [cf. Traber ?.t al ; 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247-1 255 (1977); Traber et

al; 2, Helv. Chim. Acta, 6.5, 1655-1667 { 1982); Kohel et al ,

Europ. J. Applied. Microbioiogy e Bioteohnolc.qy, 14, 273-240 (1982) ; e von Wartburg et: al , Progress in Allergy, 38, 28-45, (1986 ) ] , bem como vários derivados de ciclosporina não· natu · rais e ciciosporinas artificiais ou siuf.éf i cas que i rirlnem di --hidro-cíclosporinas [em que a .parte x-y do resíduo MeBmt ( f 6 r mu 1 a B aci ma) : e sa t ura d o;: par a da r -x-y ·- = - CE_;; -CH_ - ];; > as ci cl nsporinas deriuatizadas ,( e. g . em que o átomo· 3 ' - O do resíduo· MeBmt ê anilado ou um outro substituinte é introduzido no átomo de carbono a do resíduo sarcosílo na posição 3); as oiclosporinas em que o resíduo MeBmt. está presente na forma isomérica (e.g.em que a configuração ao longo das posições 6' e 7' do resíduo MeBmt é mais cis do que trans); e as ciciospo- lantcu de aminoácidoa eit» rinas ém .que a5o incorporados vai posições sspeei ficas dentro da sequência ido pept. ido, e . g. empregando o método sintético total para a produção de ciclos-por.in&3 deacnvolvido por R. Wenger veja·se e.g. Traher et al. 1, Traber et al, 2 e Kobel et al., loc. eit.; Patentes

Americanas Nss 4.108.985, 4.220.641, 4.288.431, 4.554.351 , 4.396.542 e 4.798.823; as Patentes Europeias Publicadas N2s 34.567A, 56.782A, 300.784A, 300.785A e 414.632A; a Publicação da Patente

In terna c.ional N - WO 86 /02080 ê as Publicações das

Patentes Britânicas Nss 2.206.1 19 . e 2.207,678: VJenger 1 , Transpl , Proc . , 2_5 Suppl . 1:2230 (1988) ; «erige r 7 . , Angew . Chem. Int . Ed. :2.^: 7.7 ( 1985) e Wenge r 3, , Progress ia tne

Chemistry o£ Organic Natural Products, 50, 123 (1986). A classe rnmpfififtniiifla ppas rielosporinas é> deste.: modo, neste momento, multo grande ãe facto e inclui, por . exemplo ,1 a [Thr]'-Ciclosporina, [Vai]7-Ciclosporina, [Nva]7- -Cíclospori-na a [ Nva ; [ Nva ] -Ciclospor ina (também conhecidas por ciclò.è- À porinas C, D, G, e M respectivamente) , | 3-0-acetil·· [MèBmt ]”, - -Ciclosporina (também conhecida por acetato de ciclosporina •: ,v.·· A · '' ' A) , (Dihirdro-MôBmt r -[Vai] '-Ciclosporina (também conhecida por dihidro-ciclosporina D), [{D)Ser]^ Ciclosporina, [Melle}^ ~ . . __f " '*.·. ^ ...... - ' ' -Ciclosporina, ({DJMeValj -Ciclosporina (também conhecida por ciclospor Ina II) , [MeAla]p -Ciclospor lua, { ( D) P rt»l. los-p por.ina e assim por diante. .

De acordo com a nomenclatura convencional para as cid osporinas, estias são definidas ao longo da presente memória descritiva e reivindicações, por referência à esr.rutura da Ciclosporina (i.e. Ciclosporina A). Faz-se isto indicando p rimei ro aqueles ; te si d uos . n ac moi é c ul a) qu e di f.e rem dos que se encontram presentes na Ciclosporina e depois aplicando o

termo "Ciclospor.í.na.paria; caract.er izar os resíduos restantes que são idênticos aos que se encontram presentes na;Ciclospo-r i.na . Ao mesmo tempo )\ o prerixo " dihidro" ié; empregue para designar : a s:. ci c 1 os por inas em que o i: ir. és í d u o MeBm t é..·: hidrogen a d o (dihidro-MeBmt) , i e. , em que -x-y- na fórmula B é

Assim, [Thr]!-Ciclosporina é a ciclosporína que tem a sequência mostrada na Fórmula A, «s em que nAbu na posição 2 é substituída por Thr, c [Dihidro-McBmt - [VaiJ?-Giclosporina é a ciclosporína que tem a sequência mostrada na Fórmula A mas em que o resíduo MeBmt na posição 1 é hidrogenado e aAbu na poaição 2 é substituído por Vai. ..........

Adicionalmente, òs resíduos de aminoácidos referidos: pela abreviai, uí d, e.g. Ala, Me Vai , aAbu, etc. devem entender--se, de a c o r d o com a prática convencional, como tendo a conf iguração (I,) , a não ser quei se indique de outro modo, e.g. tal como no caso de "(D) AI a". As abreviaturas dois resíduos precedidos por "Me”i, tal como no caso de "MeLeu", representa resíduidisiia-N-metiilados: Os resíduos individuaisrda molécula de: ci closporina são numerados, tal como na técnica, no sentido; dos pcurtei tos do relógio e partindo com o resíduo MeBmt ou di.hidro--MeBmt na posição 1. A mesma sequência numérica έ j

empregue ao longo da presente memória descritiva e r ei vindica çõés'. .Vi:’·'.'..:. Fica assim bem estabelecido que a Ciclosp orina actua inferferindo com o processo da act.ivação das células: T, bloque ando a iniciação ds : i:ranscr içâo do IL - 2, embora o mecanismo preciso ainda não tenha sido elucidado. rÃV;::Ciclosporina tem sido mostrada :como formando um complexo'· com uma proteína V 'VVV:V':.:''VV::: V" VVVVÍ VV.V.J.: ÍV. ^ V· ' .O.:. V." : ’ V '.'Í'V:,Í cit õ-s 61 ic a,: 17kD, :·..' (, ci c lof i 1 i na} que· o ca r: ré em mu i t o sti pos de células e tem-se revelado como sendo idêntica ao neptidil--prolil cia trana isomerase, ima enziiiw envolvida na dobra da proteína. . Até agora, contudo, não tem ficado claro se a ligação à ciclofilina está directamente correlacionada com a ac t i vi d ade ; imunos s upressw r a nas cic 1 usuor ina s,:: se de facto a ligação da c i clof ilina é e1a própria um ; c ri tério sufi ciente para a actividade imunossupressora.

De scobr i u~se Vago ra que: exis t em c iclospor i na s que s e ligam forternenteVãV ciclofilina, mas não são nada imunossupres-soras. DaquiVsègue que a ligação à ciclofilina é um critério necessário, mas não suficiente para a actívidade imunossupres-sora. í f; 1 À,/' i

: Λ1 -presente invenção ρ rοροrciona ciclospor inas que : sào activas contra e t epl i cação rio HTV-l . 0: vírus da imunedeficiência humana (HlV). infecta, de pref fcxêneia; os Vi nfóci rns T-auxi 1 i adores { T4 ) , embora replique t ambém em váriosouc ros cipos ide cél ui as, era especia 1 as da espécie munocítica . :Causai unia~.doença que progride 1 entamen~ te no sistiema imunológico, caractericaao por uma de st1 ui ção graduai das células T4, denominada SIDA. Outras : caracte--risticas anormais iraunológicas da SIDA são o aumento dos li nfóci tOB: ci eotóxi:Gos/supr easox-.es { T8 ) , ui:i defeito no proces-so de apresentação/reconhecimento do antigene:e uma activação policlonal das células B. 0 mecanismo de destruição das células T4 ainda· uãu é claro. Relativaraence poucas células T4 parecem ser infectadas, pelo que, um efeito citopático directo causado pelo vírus pode não ser a única razão para a depleção das células T4. Tem-se colocado a hipótese de que a destruição das células T4 pode ser amplificada por um processo auto-imune controlado por células T4 produtoras de HIV ou células T4 revestidas com: proteína HIV. Esta e st imulação antig enica contínua pode levar a um estado de activação permanente das células T4, o que aumentaria a replicação HIV nestas células r. Λ/.ν Λ ,·>-xe r ϊ\, . f 'ί:· ΙΟΙ *' e expandiria cloftes T-cítotóxieos. As células T4 não infectadas podem -tornar-.s-e antigénicas 1 igando o gpl20 virai exógeno às §uas molécu 1 as... GD4, sendo assim um alvc de uma resposta 7~ci totóxi ca.. :. A Patente Americana Ns 4.814.323 revela: que a Ciciosporina possui uma actividade contra a SIDA. e que, em geral, as "ciclcspor inas conhecidas; romo imunossupressoras" podem ser úteis nesta indicação, Não existe, .qualquer sugestão de que se possa esperar que as c i cl osporinas não-imunos3upressoras tenham esta propriedade.

Surpreendentemente, descobriu-se agora que as ciclospo-íinas que se ligam à ciclofilina, mas que não são imunossii-pressoras, exibem um efeito inibitória na replicaçào do HIV-1.

Considera se que uma ciclosporiaa we liga à ciclofilina se ela se ligar à ciclofilina recombinante humana, em pelo menos um quinto, tal como faz a Ciciosporina no teste competitivo ELISA, descrito por Quesniaux in Éur. J. Imnnmol. 1187 17 1359-1365. Neste teste, a ciciosporina a ser testada é adicionada durante a inCubação da ciclofilina com BSA-Cxclosporina f/V'^

revestida sendo . calculada.-aL.-co.ncentração necessária para dar uma inibi ção de 501 da... reacção de controlo' sem competi dor (C) . Os resul tados.são :expressos como a Proporção de

Ligação (PI,)-, que é o logaritmo para a base 10 da proporção da :cr do composto do teste a CI,,rt; num teste isimltlneo : da £SO 250.............. ........... própria C ic1osporina. Assim, um PL de 1, 0 indica que o composto do teste liga a cicloíilina de um factor der. menus do que á Ci cl ospor ina e nm valor negativo indica uma ligação maia forte do que a da Ciclosporina. : As ciclosporinas activas contra o HlV tem um PL inferi or a 0,7 (uma ver: que o log^ 5 - 0,7 apt ox i madarnente } , de preferencia, igual ou inferior a xero.

Considera-se que uma ciclosporina é não-imunossupresso-ra quando tem uma ac:t;ividade na Reacção do Linfócito Misto (RLM) de não mais do que 5%, de piefei áuciu uãu ma is do que 21, do que a da Ciclosporina. A Reacção do Linfócito Misto é descrita por T. Meo in "Tmmunological Mtíthods", L. Lefkovits e D. Per is, Eds. , Acedem!c Press, N.Y., pag. 227-239 (1979). Células do baço (0,5 x 106 ) do rat:inho Balb/c (fêmea8-10 semanas) são co-incubadas durante 5 dias com células do rato

CBA (fêmea, 8-10 semanas) 0.5 x 10 irradiadas (2000 rad) ou células do baço do rato CBÃ (fêmea, 8-10 semanas, tratadas com mitomícma C. Ag células alogénicas ii t adiadas induzem uma resposta proliferativa nas células do baço Balb c que pode ser medida pela incorporação de um precursor marcado ao DNA. Uma vez que as células estimuladoras são irradiadas (ou tratadas com mitomicina C}, não respondem às células Balb/c com proliferação mas retêm a sua antiqenicida- ACI^ descoberta para o composto do teste na RLM é comparada com a descoberta para Ciclosporina numa experiência paralela. A actividade das ciclosporinas como inibídoras da replieação do HIY-1 pode ser demonstrada nos sistemas de teste seguintes: 1. Inibição do efeito citopático nas células MT4 induzido pelo Hiv-l É usado com pequenas modificações o processo de ensaio descrito por :Pauwels et al., J. Virol. Meth. 20/309 (1988). É usada como célula alvo a linha de células T4, transformadas

com HTLV- I, MT4, que se revelou previamente como sendo alta mente permissiva à infecção do HIV. A inibição do HIV--1, efeito citopático induzido pela estirpe HTL7-TIIB, e -determinada medindo a viabilidade de ambas as células infectadas cora o HIV e ; ria s cé lu las infe c t a d as a f i n cr i r . ·.: A viab.i 1 idade é determinada:éspecC rofotometricamente a través,ida redução in si tu de brometo de 3 - { 4,5-dimetil - -tiazol-2--il) -Π , 5~difen.il~ tet ra zól i úm (MTT) . . São incluídas, ·· como controlos, cul tu ra s sem composto infectadas com o vírus e não infectadas, tal com são incluídas células não infectadas, tratadas com composto, A concentração dc células é escolhida de forna a: que o nOmcro cio de 10 durante os 4 células por mililitro aumente num factor dias de incubação, nas culturas infectadas a fingir. 0inoculo do vírus é ajustado de forma a causar a destruição das células em. 90% das células alvo, depois de 4 dias de incubação. 0 vírus é adsorvido para dentro de uma suspensão de células 10 vezes concentrada, a 37' C, durante 1 hora. Em seguida, as cé- : lulas infectadas são diluídas para uma proporção de 1:10 e adicionadas a placas de microtitulação contendo o composto do teste.

após a infecçào, são .removidas alíquotas das culturas infec-tadas . As;;; célu 1 as são: ;centrifugadas e os sobrenadantes sãc recolhidos. A : concentração de antigene p24 : virai é determinada, nos sobrenaciantes por mei o dei um ...esto j o comerei al EL IS A ;;: e serve como parâmetro para a produção do virus. Depois de cada remoção dei.; <i li quota s, contam-se ia si célula s e ajust ara-se para uma proporção de 2x10 células/ml, adicionando meio fresco contendo o composto do teste na concentração particular.

Dos compostos de acordo com a invenção,i.e. ciclospori-: nas de ligação ã cíclofilina, não-imunossupressoras activas contra o HIV-1. (Compostos Actívos) , alguns são novos e outros são conhecidos; contudo, a actividade anti-HÍV idos; 'Compostos Act i vos conhecidos :não . :foi: . revelada antériormente o , cm mui.too casos,;os Compostos Activos ccnheeidos não f o r ara d esc ritos pomo tendo qualquer actividade farmacêutica de qualquer coptcie.

Des cobriu -se quei muitos dos Compostos Ac ti vos têm es truturas que dileiem: da dd Cioluspui. ina , especif icamente nas posições 4 e/ou 5.

Um grupo de Compostos Activos são ; ;as·:: elclosporinas:: èm que o grupo MeLeu na posição 4 é substituído por um amínoáciào N-rne-1il ado dif©rente, por cscmplo à hidroxi-MeLeu, Melle,

MeVal, MeThr ou HeAla. Em adição aó Melle e MeThr, as formas alio Mealle e MeaThr podem também ser usadas. Na forma alio, a estereoquimica na posição 0 tem a coufiguração oposta à do aminoácido natural, de forma a que a forma normal e a forma alio constituem um par de diastereoisómeros.

Um outro grupo de Compostos Activos é aquele em que Vai na posição 5 é substituído por um N-alquil-aminoácido, de pr efe rênc i a N-meti 1-"aminoácido . De preferência, o aminoácido que é N-alquilado é Vai ou Leu. De preferência, o hidrogénio do grupo imino de [Vai] é substituído por um grupo alquilo em C1-Cê não ramificado, de preferência metilo, etilo ou n-propilo, em particular imetilo.: Õ último grupo preferido de Compostos Activos são todos novos.

Adicionalmente ou alternativamente, certos Compostos Activos podem dif erir da Ciclosporina nas posições 1, 2, 3 e/ou b. Um grupo preferido de Compostos Activos é constituído! ipelos compostos de Fórmula I:

-W—X-R-γ--z------0- -Ala—í D) Ai a- -MeLeu—MeLeu- —MeVal—| 123 4:5 6 7 8 ' ' : ;:· ·810 11 1 I 8'-hidrQxi-MeBmt; em aue W é HeBmt, dihiaro-MeBmt ou X é sAbu, Vai, Thr, Nva ou O-metil treonina (MeOThr5; ......... R é Sar ou (D)-MeAla; Y é MeLeu, f-hidroxi-MeLeu, Melle, MeVal,

MeThr, MeAla:, Mealle ou MeaTiir; Z é Vai, Leu, MeVal ou MeLeu; e 0 é MeLeu, íf-hidroxi-MeLeu ou MeAla; com a condição de que, quando Y é MeLeu, então ou Zé MeVal ou

MeLeu, ou W é 8'-hidroxi-MeBmt.

Os grupos W,X,Y,Z,Ç> e R têm, independentemente, as signifi c a ções preferidas seguintes: W é, de preferência, W, em que W' é MeBmt ou dihidro- -MeBmt; :X é, de preferência, X', em que X' écAbu ou Nva, raais preferencialmente, X", em que X" ê ct Abu; R é, de preferência, R', em que R' é Sar;: 18 18 MeVál, Y ê, de preferência, Y', era que Y' é ^--hiároxi-MeLeu, MeThr ou Melle; Z é, de preferência, Z', era que Z' é Vai ou MeVai; e Q é, de preferência, 0’, em que Q' é MeLeu;

Ura grupo especialmente preferido de Compostos Activos, são os compostos de Fórmula I, em que W é W', X é X'„ Y é Y', Z é Z', Q é Q' e R é R'.

Os compostos partirnlarmento preferidos da Fórmula T, são os:seguintes: a ) {dihidro-MeBmfc }* - [ Jf-hidroxi-MeLeu -Ciclosporina b) [MeVal-Ciclosporina c) [Melle]*-Ciclosporina d) [MeThr]*-Ciclosporina f) í g) í e) [ Jr-hidroxi-MeLeu]*-Ciclosporina Nva] 2-[ar-hidroxi-MeLeu]* -Ciclosporina if hidroxi MeLeu] [ Jf hidroxi MeLeu] Ciclosporina h) [MeVa1)* -Ci cIosporina i} [MeOThr] -( (DlMeAlal* - {MeVal ]5 -Ciclosporina j} [ 8 - -hidroxi--MeBmt ]* -Ciclosporina 19

.-.5¾.¾ V $' <s|L

Em adição, certos ompostos que nèo estão dentro do âmbito da fórmula I, são Compostos Activos, por exemplo k: [MeAla] -¾ e 1} [$~hidroxi-MeLeur -Oiciasporina. A invenção proporciona também novos Compostos Activos, que são os compostos da Fórmula II:

r-W'- -X- -R- —Y— -Z- -MeLeu- -Ala- -(D)Ala- -MeLeu- -MeLeu- -MeVal—| "J J. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 II em que W', X, K, Y e Z são tal como se definiu acima, com a condição de 1), quando Y é MeLeu ou MeAla, então Z é MeVal ou HeLeu θ 2) , quanáo W' ó MeBmt, R ó Sar e Y é ^~hidroKÍ~MeLeu, encão Z é diferente de Vai. ";Uin grupo preferido de Compostos Ac ti voa novos consiste nos compostos de Fórmula II, em que X éX", Y é Y' e Z é Z' , com a condição de que quando W' é MeBmt, Y' é diferente de ; i d r ÓXi vMe Leu.

Os novos Compostos Activos particularmente preferidos, são os compostos a), b), c), d), t), e b) acima. Descobriu-se que alguns des tes: compostos, por exemplo, os compostos b) : e c) , bloqueiam a acção imunoss.upres.sora: da Ciclosporina, bloqueando: a sua ligação à ciclofilina e, deste modo, actuam como antagonistas da Ciclosporina.

Os Compostos Activos podem ser obtidos de várias maneiras, que podem ser classif içadas :da :seguinte forma: 1) Fermentação 2} Biotransformação i 3) Derivat.inação 4} Síntese Parcial 5} Síntese Total :: 1) Alguns dos Compostos: Activos são produzidos como sub - produtos da fermentação das estirpes originais ou modi-£i cadàs: de organismos que produzem a Ciclospor ina, tais:, como o Tolypocl adlum inf la tuiri Gams , tal como élexeinpli f icado pela produção do composto c), descrito no Exemplo11 abaixo..... 2) Outros Compostos Actívõs, incluindo os compostos j) e Γ)1 conhecidos, são metabol itos de Ciclosporina e podem se

estas e outras transformações metabólicas são possíveis usando microrganismos, por exemplo, a produção dos compostos e) e g) pela biotransformaçlo de cielosporina A, tal como se descreve nos Exemplos 2 e 3, ou a do composto f) pela biotransformação de cielosporina G (Exemplo 4). Estes exemplos demonstram um novo processo para a preparação de ciclosporinas que têm um ou maís resíduos Jf-hidroxi-MeLéu,compreendendo as fases de cultivo de uma nova estirpe modificada de Sebekia benihana, adicio-nando uma cielosporina tendo um ou . tais resíduos MeLeu e isolando o produto do caldo de fermentação. 3) Por derivatização entende-se que as ciclosporinas naturais ou sintécticas podem ser convertidas em Compostos Activos por uma ou mais reacções químicas, em que um; ou maia dosaminoácidos são modificados sem abrir e reformar as ligações do peptido. Por exemplo, a classe de Compostos Acti-voa em que o Vai na posiçãot 5i é N-alquÍlado, pode ser obtida fazendo reagir a cielosporina correspondente, tendo Vai na posição 5, com butil-lítio, seguido pela reacção com um agente de alquilação, tal como exemplificado para o compostoíl)no

Exemplo :5 e para o composto i) no Exemplo 6.

Tal como outros exemplos, o composto a) pode ser preparado .por hidrogenação do composto e) (Exemplo 7) e o composto j) , que é também um metabólito importante 'de Ci r. lospnr i na , pode': ser preparado: a partir do: acetato do composto de Ciclos-porina conhecido, tal como se descreve no Exemplo 8. '"ί , á usado para significar uma que é aberto o anel de uma : 4) 0 termo síntese-parcial série de reacções químicas em ciclosporina natural, são removidoe ura ou mais aminoácidos, são adicionados diferentes aminoácidos e o anel é novamente fechado. 5) A síntese total de ciclosporinas pode ser levada a cabo construindo um undecapéptido linear e ciclizando, tal como descrito por Wenger (loc. ciu.), veja-se também as Patentes Americanas 4,396.542 e 4.798.823. Em princípio, qualquer ciclosporina pode ser preparada pela via de síntese total.

possa total. A de fac to ser mais conveniente do que a síntese síntese total pode ser usada para a preparação do

Ç'.UÍ£.y.:.É.a_ 2 .Çuljçuia em ã g a r de par t i d a : Cult ivam-se em plano 1 n r. li nada de ágar d a estirpe D Γ. M 6627, durante 14 dias, a 27"C, no meio de ágar seguinte: :

Excracto de levedura ; (Gistex) 4 u : Eiítracto :de malte (Wander), 20 g Ágar 20 g Água desmineralizada até 1000 ml. O meio tem um pH de 5,-4--5,6 e é esterilÍEado durante 20 min. a 170 ’ C. ' 2 · Pré;; cultura p E s ρ o r o s d o m i o ái i o de 4 cultura a de partida, são auspensos ; em 4 0 ml de uma solução de o a 1 a 0,9¾ . S:ây inoculados com 20 ml desta suspensão iíma série de recipientes de Erlenmeyer de 500 ml, contendo cada um 100 ml de meio de pré-cultura. A composição do meio de pré-cultura é a seguinte:

Caseína (Amber EHC) 25 g Ma 1 tose 75 g KH2F04 .1 q . 7 KC1 :: : 2,5 Ç( Água desmineralizada até 1000 ml 0 meio é a justado a um pH de 5,2 - 5,5 com HC1,depois é ester.11 izado durante :: 20 min. a 120' C. As pré-culturas : são i

fermentadas durante 24 hir . fa· 27:' C; num agitador : rotativo, a 200 rprrt, com uma descentragem de 56 mm. : 3. Cultura i.Qtermediár.ia: Um íermentador de aço de 25 litros contendo 20 li t r os de meio de pró-cultura, c... inoculado com 20 0 mi de:pré-cultura. A cultura intermediária é fermentada duran -te 5 dias a 27 ‘ Cf com uma taxa de agitação de 150 rpm e uma v©locidade dc corrente dc ar de 0,5 1/min./ por litró de meio, a uma pressão de 0,5 /bar:.::.. 4v,: ·· iG-U-Ltura.. principal : 100 litros de meio de pró-cultura sàu inoculados com 10 1 de cultura intermediária e fermentados num fermentador de aço de 120 litros. A este rneio são adicionados 4 g/1 de D-Treonina, esteiilizada por filtração. A fermentação é levada a cabo a 21' C durante .14 dias, cou uma taxa de agitação de 7 0 rpm e uma velocidade de corrente de ar de 0,4 1/min por licro de meio, sendo usada uma pressão de 0,5 bares, durante os 5 primeiros dias, aumentando-se depois a velocidade de agitação para 100 rpm e a velocidade de corrente de, ar de 0,5 1/min par o resto do periodo de fermentação.

Isolamento: 0 micélio é separado do meio de cultura e extraído num aparelho Turrax, esmagando e agitando 3 vezes mm 10 1 itros de metanol/água (9:1 em vol.). 0 micélio esmagado é separado do dissolvente por filtração por sucção e os filtrados combinados são conoen I: radns por evaporação, sob vácuo, a uma temperatura de 40' C até o.vapor consistir .principalmente em água apenas. A mistura obtida é extraída quatro :vezes/ usando 2vlitros de 1,2-dicloroetuna em cada extracçào c as soluções de 1,2td±cloroetano combinadas são concentradas por evaporação, sob vácuo, a uma temperatura de 40" C. 0 resíduo é submetido a cromatografia em coluna de gel de sílica (10 kg de gel de sílica, granulometria de 0.02- -0,045 mm, "Grace”j usando acetato de eti.lo/água, como eluente (f racções de 2 ,5 1i t ros). As fracções 2 0 - 23, contendo fMelle]V Ciclospòrinã são ligadas e depois: novamente separadas por craniatDyi afiu em coluna de gel de sílica (600 g de gel de sílica, granulometria 0,04 - 0,063 mm, "Merck”) usando clorof órmio/met.anol (98:2 em vol.) como eluente ( tamanho da fíacção 300 ml ) . Consegue -se outra purificação por crornarogra-tia em coluna de:gel de silica (400 g de gel de sílica, granulometria de 0,04 - 0,063 mm,· "Merck") usando cloreto de mer j- 27

leho/metanol (98:2 em vol.) como eluente {tamanho da fracção 200 ml):, originando [Mellej^ -Ciclosporina pura, sob a forma de um pó branco amorfo: p.f. 155-158“ C; [a]20/D = -235’ (c-0,68 érn CHClj ) e -193' (c=0,74 em CH^OH) . O espectro de IV em CH^Cl^ é tal como se mostra na Fig. 1 e o espectro: de RMN protónica em CDCl^: é tal como se mostra na Fig. 2..

Exemplo 2 [ jf-hidroxi -Mel wil^ -Ci closoorína ( Composto s ) O composto e) é obtido a partir da biotransformação da Ciclosporina pelo microrganismo Sebekia benihana. Â estirpe original usada é denominada NRLL 11111 e pertence à espécie Sebekia benihana {Dietz and Lí: Sebekia. um novo género da família Actinoplanaceae. Abstrs. 82nd Ann. Meet. Amor. Soc. Microbiol . , 163, Atlanta, 1982). Esta estirpe é capaz de hidroxilar a novobiocina. A estirpe sub-cultiyada usada para a foi preparação do composto e) e dos compostos relacionados. (D-3300 depositada no German Collection of Microrganisms 6182.

Braunshweig) sob o número DSM

1 . Cultura cie ágar de partida:: As : culturas .de á g a r em plano inclinado, da estirpe DSM 6182 são cultivadas durante ;10 dias, a 27° C, no meio de ágar seguinte;

Glucose io o

Amido { solúvel ) 0 g

Ext:racto de levedura (Gistexj .·' ; 5 g

Peptona (N-Z-Amina Tipo A, Shefrield) v : 5 g

CâCOjj : 1 ÇJ Ágar (Bacto) 1'. 18 g Áqua desmineralizada até 2 Litro. : pH : n a u t: r a 1 i. a d c a 7 com NaOR/JI^O^

Esteri1 viaçãot 120' C/20 min. 2 . ; Prerjcúltur ai Os esporos e o micélio de uma cul tur a : de partida são suspenooa cm 10 ml de uma suluyâo de sal a 0, 9t . Uma série de recipientes de Erlenmyer de 200 ml, contendo cada um 50 mi de meio de pré-cultura,; são inoculados,: cada ura deles, com 5 mi desta auapenaSg. A composição cio meio de pré- -cultura é a seguinte:

Glucose

Amido (solúvel)

Extracto de Levedura (Gistex)

Extracto de.malte (líquido, Wander) Peptona ( Ν-2-Ámina Tipo Λ, Shcfficld) CaCOj

Solução de oligoelementos Nr 235 ' ; Água desmineralizada até 1 Litro pH neutralizado a 7 com NaOH/H^SO^

Ks t ei 11 i zaçâo : : 120C / 20 min ,

Solução de oliyoelementos de Nr 235:

FeSQ .711 Λ ΚΪ :

CoCl^.6H O

CuSO^- . 5H?0 : MnCl .4H 0

ZnSO, . 7FT 0 Ί t Água desmineral izada atê 999 ml HS04 (971)

10 9 4.5 g : 10 g 2.5 g 1 9 : 1 ml ::0,1 g 5 g . 0,0 5 g 2 g 0,2 o 2 o; 4 : g: 1 ml

hs pré-culturas são £ e r m e n v. a d a s d u r a n t: e 4 : dias , a : 27 ' C , ; num agitador rotativo a 200 rpm com uma descentragem de 50'mm, 3· Cu 11:nra 1.ntermediãria : Uma série de recipientes de Erien-meyer dei 200 ml, contendo, cada um 50 ml do meio de. pré-cultura, são inoculados,; cada ura deles, com 5 ml de pré- cultura. A cultura :intermediária é fermentada durante 3 dias,1 a 27‘ C, num : agi tador rotativo, a 200 rpm, com urna: descent ragem : da 50 / .......' ' ' . . . ...... - - - ·---·-··......./ - mm, . 4 . Cul tur a principal :: Hmá: sér ia de : iécipiθnt ea de Er 1 enrneyeri de 500 ml, contendo cada ira 50 ml do meio principal· (total de 12 1 i t r os j , s âo i no c u 1 ado s ca da ' um c om 5 m l d a c u 11 u r a intermediária. Estas culturas são Fermentadas durante 3 diaa, a 27’ C, num agitador rotativo, a 200 rpm, com uma descentra-gém de 50; mm. Depois de 24 horas, adiciona-se a cada uma dás culturáá principaio, cicloaporina A (7,5 mg}, solubx1izada em metanol (“150 mg/L). A;composição do meio de cultura principal é a seguinte:;

Ce rei o.se ] 0 g 10 g

Dextrina : Amido (solúvel) 10 g Extracto de:levedura ÍGistex} 2,5 o Farinha de soja (Nurupan, Edelsoya) 12,5 g V,po4 0,25 g KH PO, C M 0,12 o MgSO, .711,0 0,10 g CaCl .6fí_0.:.c z z. .·. 0,05 g Solução de. ol igp;-é.leméntòs: AC -1 : 1 ml : Água desraineralizada:. até.1 1 Litro. pH: a jus tado a 7, 2 ·· 7,5 {KOH/H SO, ) ......... z <9

Esterilização: 120‘C/dOmin.

Solução de oligo elementos AC 1: Esta solução cera a mesma composição que a solução Nr 235, com a adição de: (NH^ Mo^.0^ 0.2g,: 5> Isolamento: O mícèlío :é: separado cio meio cie cultura e o 'filtrado da cultural resultante (13 L) é extraído três vezes com 1,2~dicloroetana , : usando i , 5: L em cada fuma rias extracções . As soluções de 1,2-dicloroetano combinadas são evaporadas sob vácuo, a uma temperatura de 40’ C. O resíduo impuro é submeti- 32 do a filtração com gel Sephadex LH-2;0: usando: metanol como; eluente.Essas fracções contendo os compostos de ciclosporina (525 mg)são ligadas e cromatografadas em gel de sílica (50g, granulometria de 0,04-0,063 mm, 'Merck') usando cloro-fórmio/metanol como eluente. A cromatografia repetida usando o mesmo sistema produz uma [ ár-hidroxi-MeLeu ]^ -Ciclosporina pura, sob a forma de um pó branco amor£o, p.f. 150-153", -225' {c~0,53 em CHClj), -171’ (c=0,44 em CHjOH). ..... · ..... . y

Exemplo .3 í drnxi-MaheuI- - f ií-hidroxi-M<sLeu1 -Ciclosporitta (composto a)

As fracções secundárias mais polares originárias dá 4 purificação da [ fc-hidroxi-MeLeu] -Ciclosporina são novamebfce separadas por cromatografia em coluna de gel de sílica repetida ( granulometria dc 0,04-0,063 mn); jòánáG àcétona/heKâno. 2:1 como eluente, seguido de cromatografia em gel de sílica Usando éter metil t. butílico/metanol/água 90:9:1 como eluente. As primeiras fracções contêm [ ír-hidroxi Leu]* -Ciclosporina que é novamente purificada por descoloração com carvão,originando o composto puro,: sob a forma de um pó branco amorfo, pvf. 162-164 *, [a]^° -211* (c-0,50 m CHCIj), -157* (c=0,52 em CH^OH), 33.

As últimas fracções originadas da cromatograiia em coluna de ael de sílica acima contêm 1 ^-hidro'xi-MeLeu'}%;-y;;t;'|'r;hidroxi·- -MeLeu ] -Ciclos por ina e são novamente purificadas por descoloração com carvão, originando o composto do título £0 · puro, sob a forma de um pó branco amorfo, p.f. 157-160". falj, -217‘ {c=0,54 em CHC1j}, -176‘ (0=0,42 em Cfí^OH). ...... ú .....£........... ......

Exemplo 4 í Mval - íy-hidroxi-MeLeul ^Ciclosporina (composto £.1

Este composto é preparador por um processo análogo àrpreparação do composto e ([ íT-hidroxi-MeLeu]6 -Ciclosporina) , mas usando ciclosporina Q ([Nva]2-Ciclosporina} como material de partida. Depois da purificação por cromatografia em coluna d© gel de sílica repetida usando acetato de etílo saturado com água e acetona/hexano 2:1 como eluente , respéctivamente. obtem-se o composto do título oob a forma de ura pó branco amorfo, p. f. 138-141", UlJ1 -213" (C=0,69 em CHC1 j ), -168’ (c=0,70 em CHj OH).

Exemplo 5 f MeVaΠ* ~cic1osporina (composto A ciclosporina A (0,60 g = 0,5 moles), dissolvida em tetra-

hidrofurano (20 ml) é incubada: com 0,63 ml M de butil-lítio XI, 0 mmoles) em hexano solução resultante com sulfato de dimet ilo do uma solução 1,6

Faz - se reagi r a (0,1 ml ; 1,5 mo les) a -78' C. Aquece-se lentamente a mistura reaccíonal até à t empera nu a amhi er. e e agita - se dm a n t e a noite. 0 isolamento por cromatografia rápida (SiO^ , metanol a 51 / é ter) , seguida de I1PLC ( f ase inver sa ) deu o produto do título, 0 composto c caracterisado por um espectro dc 30 0 MH?, e um espectro de RMN em CDCl^, que é mostrado na Fig. 3.

Fgíemplo 6 {MeOThr ji2, i ( DlMeAlal^ · •ÍMeVall'^ -Çiçlospçrina · ( Gom posto i).

Ar re £ece -se para -00 ‘ Ç uma, mistura de 400 ml de TIIF (absoluto ) e 6,96 g (49,2 mMoles} de diisopropílamina e adiciona-se :len tament d ;;a través de uma seringa , 33,5 ml de uma sol u ção 1,3:3:::: K de L u t. i 1 --1.11 io ezn heXàíiu; ,X~ 14,5 íuMoles), AgiLe~se α mistura durante 30 mia. a -80' ;:Ç·,depois adiciona-se através de uma seringa, durante 2 - 3 minutos, uma solução de 8 g (6,6 mMoles) de cicl osporina- G ( [Thi } *-Ciclosporina) em 120 ml de THF absoluta., Agi ta-se a solução clara durante mais uma hora a ••80" C,·: “depois adiciona-se lentamente 2,06 ml de X iodeto de φ ίΐ φ * -¾ 35 t. β r.f,; Ι*/^' β &'* * metilo.

Deixa-se aquecer a mistura para a temperatura ambiente, durante 2 horas, depois adicionam-se 40 ml de água e evaporam-se os i dissolventes : num evaporador rotativo a 30 ’::..--0-.-/ 15 ir.m Hg. I .-í.:'-'i'-

Diviae-se o resíduo entre água e éter: e lava-se a camada de éter quatro vezes com salmoura semi-saturada, seca-se sobre MgSO^ e evapora-se para tlax :UKi; resíduo de 0*1 g. Cromatogra£a-se o resíduo em 1200 g de Kieselgel com acetato de e-tílo saturado com água, para dar um produto impuro que depois de uma outra cromatografia em 200 g; de Kieselgel com MeOR a 5I/CH&C1^ , dá o produto do titulo puro, [a]^ - -195* (C= 1,0 em CHC13).

í L

Exemplo 7 fdihidro-HeBmt 1 -í fr-hidroxi-MeLeur -Ciclosnorina {composto.al A uma suspensão de 200 mg de paládio a 10% pré-hidro-genado/carvão, em 40 ml de etanol, adicionam-se 1,2 g de [J--hidroxi-MeLeu ]* -Cíclosporina (composto e) em 10 ml de etanol e realiza-se a hidrogenação à temperatura ambiente até já não sair mais hidrogénio. Depois da remoção do catalisador por filtração, evapora-se a solução originando o composto do 36 titulo sob a forma de p pó branco amorfo;, p.f. 154-156’ 10 p -225' (c=0,87 em CHC13), -169’ {c=0,70 em CH3OH).

Exemplo 8 í 8'-hidroxi^MeBmt1 -Ciclosporina (composto 1) 1.,:- [ Q-acetil-ω -bromo-MeBmt -Ciclosporina: Aquece-se a refluxo durante 2,5:hrs,: uma mistura de 25,0 g {20 mmoles) » ' ..... de [0-acetil-MeBmt] -Ciclosporina (Traber et al* Helv. Chim.

Acta 1982, 65, 1653) , 4,4g {25 mmoles} de N-bromo sucinimida e 400 mg de azo-bis-isobutironitrilo em 250 ml de tetracloreto de carbono. Evapora-se o dissolvente e substitui-se por éter, £iltra-se dos sólidos, lava-se com água, seca-se sobre sulfato de magnésio e evapora-se até à secura, Cromatografa-se o resíduo sobre gel de sílica com éter etílico/acetato de etilo (4:1), para dar 10,7 g (40%) do produto amorfo que é cristalizado a partir de éter/hesiano, para originar 8,4 g de substância pura; p.f. 207-209' C. As últimas fracções do produto cromatografado continham um adicional de 11,2 g de produto com uma qualidade ligeiramente inferior. - ...... . . j» · " '0-acetil-^ -acetoxirMeBmt 1 --Ciclosporina: Aquece se num banho de óleo a 105’ C, durante 3 horas e mantem-se ã

temperatura :ambiente; durante o fim-de-semana, uma mistura de 4,31-9 (3,3 mmoies) do produto da fase 1 (contaminado; com cerca de 15-201 de material de partida) e 2,1 g (8 mmoies) de acetato de tetraetiiamónio tetra-hidratado em 30 ml de me til etil cetona, contendo uma quantidade catalítica de iodeto-de sódio. Dílui-se o dissolvente com éter metil t-butílico e lava-se com água e salmoura. Seca-se a camada orgânica sobre MgSOç e evapora-se para deixar 4,0 g de produto impuro, que é purificado numa coluna de fase inversa RP-18 (240 g), para originar 3,07 g do produto do título; p.f. 191-192" Cr 3· f&~hidroxi-MeBmt1 * -Ciclosoorina: Misturám-se e mantêm-se àt.a. durante 2,5 horas, uma solução de 1,72 g (1,3 mmoies) do produto da fase 2 em 75 ml de metanol e uma solução ide 1,2 g de sódio em 50 ml de metanol. Em seguida, acidifíca-se a solução com ácido acético. Evapora-se o dissolvente sob pressão reduzida e dissolve-se o resíduo em éter metil t--butílico, lava-se seguencialmeate com água, salmoura e uma solução de bicarbonato de sódio, seca se sobre MgSO^ e evapora-se. 0 produto impuro (1,6 g) é eluldo a;partir de uma

v.. J coluna RP-18 (240 g) com metanoi/água 75:15, para dar 1,5 g! V j de produto puro. Criataliza-se uma amostra a partir de! i

éter/hexano para dar um produto: cristalino com um p. f ; de 181--183· C.

Exemplo 9; f MeThr -Ciclospo ri na í composto d) A síntese, total de Ciclosporina conforme descrito nas Patentes

Americanas 4.396.542 e 4.798.823 é levada a cabo usando MeThr; zo ria posição 4 êíí vez dá Mel.eu. 0 produto trem f α ]j> = -24.9,6 ' íc-1,0 em CHCLj). ' ,1_S í McVa 11^ Ci c 1 osporiria í c:puídas tu: b } A. síntese total de Ciclospo ri na conforme descrita nas Pa tentes Americanas 4.396.542 e 4.798.823 ê levada a cabo usando MeVal aa posição 4 em ve:·:. de Mel,eu. 0 produto tem · α ir, -226' (c--0, 3 58 em CHClj } . : li Imunosstipressào e ligação à ,cicl.ofillna- de: Compos;-tos Ac.ti.vos relativos à Çliclgsporiiia A Tabela T dá exemplos de (1) Proporção da : Ligação à cíclofilina {PL) dos Compostos Activos- conforme medida no

ensaio ELISA e {2 j actividade imunossupressora dos; Compostos Activos relativa à Ciciosporina, conforme; medida no ensaio MLR e expressa como percentagem de actividade relativa à Ciciosporina {Proporção Imunossupressora ou PI).:.· Outra explicação do significado destes valores e dos métodos para levar a cabo estes testes são referidos acima.

Tabela I

Composto PLílog )PI{%) a) [dihidro-MeBmt]-“[#“hidraxi-MeLeuJ*-Ciciosporina 0,1 <1 b) [MeValj*-Ciciosporina 0,1 <1 c) [Melle]*1-Ciciosporina -0,2 <1 e) [J-hidroxi-MeLeu}*-Ciciosporina -0,3 <1 ' · .. ..... ..... j;f} [Nva]? s[ #-hidroxi~MeLeu -Ciciosporina 0,4 <1 h) [MoValjf-Ciciosporina 0,4 5,3 j) [8'-hidroxi-MeBmt3*-Ciciosporina 0,35 1,8 k} [MeAla]--Ciciosporina -0,4 3,2 1) [ K hidroxi -MeLeu-Ciclospor ina 0,15 2/9

Exemplo 12 Àctivídade anti>-HTV: -e citotoxlcidade dos: Compostos Activos ................. ................... ......

Exemplos da actividade dos Compostos Activos e da Ciclosporina como inibidores da replicação do HIV-1 nas células MT4 e a citctoxicidade dos Compostos Activos e da Ciclosporina em células MT4 são: referidos na Tabela II. 0 significado destes números e os métodos apropriados sãodiscu-tidos acima.Ϊ

Tabela II

Citotoxicidade Anti-HIV ..(i.taZmLl .Q.C 1 a) [dihidro-HeBmt}^ ~íí~hidroxi“MeLeuI4 " •'Ciclosporina 16,3 0,12 iMeVal-Ciclosporina .5,.4 0,064 c) [Melle]^-Ciclosporina 4,5 0,056 e> i. jr-hidroxi-MeLeuΫ*-Ciclosporina 15,5 0,34 f) [Nva]i-[í-hidroxi-MeLcuj^-CicloGporina 14,0 0,85 h) [MeVal3^-Ciclosporina 4,4 ir 0,45 1) [MeOThrj*-[(D)MeAla}J-[MeVal )*-Ciclosporina >10 0,45 j) [ 8 ' -hidroxi-MeBtnt ] Ciclosporina 10,6 0,56 k) [MeAla] -Ciclosporí na 1) [ #-Mdroxi:-Me:Leu ]9 -Ciclosporina ; 5,2 ,;1;34 >10 o,3i

Ciclosporina 8,45 0,53

Os Compostos Aetivos são indicados para a prevenção da SIDA em pacientes assintomáticos HIV-posítivos eno tratamento de pacientes que sofrem de SIDA, Nos pacientes em que a SIDA já apareceu, a administração do Composto Activo deveria inverter a depleção das células T4 associadas com a SIDA, induzir a regressão de perturbações relacionadas com a SIDA, tais como o sarcoma de Kaposi e reduzir as novas infecções oportunistas.

Deste modo, a invenção proporciona um processo para o ítratamento e prevenção do síndroma da imunodéficlência adqui- vírus EIV-1 num rida e outras perturbações provocadas pelo paciente infectado com o referido vírus, que compreende administração ao referido paciente de uma quantidade efectiva de um Composto · Acti vn da invenção. viâ O Composto Activo pode ser administrado por qualquer convencional, em particular por via entérica, e.g. por via >ra 1, por exemplo na forma de soluções pa I 4f $

fA M j&f. ίΑΛ>< tf** ra beber, comprirnidos ou cápsulas ou por via parentérica, por exemplo na forma de

Pela via intravenosa, uma so1uções injectáveis ou -suspensões. mg/kg7 de dosagem diária indicada pode situar-se entre 1 a 20 preferència entre 3 a mg/kg, de preferência 7 10 mg/kg e pela via oral de 1 a 50 a 20 mg/kg. Λ toxicidade dos Compostos Activos crò-se que c semelhante à da Ciclosporina. Como os Compostos Activos não são 1mu no s s υ p r e s s o r e s , evitam~se certos efeitos secundários da Ciclospor ina relacionadoc· com a imunosauprcooão .. . Contudo ,· outros efeitos secundários associados com a Ciclosporina, em particu 1 ar a nef rdtoxicidade : com uso por largo período, pode também sei': assoe i ada aos Compus tos Ac L i vos .

As formulações galénicas preferidas para os Compostos Activos incluem as que se baseiam · em microemulsões, conforme descritas no Pedido de Patente Britânica 2 222 770A, que inclui formas tópicas e orais; também formas orais e injectáveis obtidas das soluções sólidas que compreendem um raonoéster de sucárido de ácido:gordo, ; e.g. monolaurato de sacarose, conforme descritas no Pedido de Patente Britânica 2 209 671A. As ferinas de unidade de dosagem, apropriadas para administração oral compreendem e,g. de 25 a 200 mg de Composto Ac ti vo: por dosagem.

Exemplo de formulaçãoA;

Produto do Ex . : .1 5 0,0 xng Gliccfurol 75 180,0 mg Higliol 812 90,0 mg Crorno fo r RH40 100,0 mg Alfa-tocoferol : :- 0 -,-5- :mg Exemplo de i formulação B: Produto rio Εκ. 1 100,0 mg Tetraglicol 2 0,0 mg C u p t« x 0 0 0 :20,0 mg Níkkol HCD- 4 0 : k :860,0 mg Butil-hidro:<i- tolueno (BHT) : 1,0 mg Exemolo de formulação C: Produto do Ex. 1 25,0 mg Glicoturol 7 5k : 100,0 mg Migliol 812 ; 35,0 mg

Cremofoi RH 40 90,0 mu >:> " ' ;···*: - ,·/}'' ν

Butil-hidroxi-anisol:(BHAO: 0,2 mg 10 . 0 : mg 10 , 0: mg 5,0 mg 75,0 mg 0 1 mg

Exemplo.·de formulação D Produto do Kx. 1 Tet.r agi icol M i r i t; o 1

Creínofor RH 40 A1 f a -1o co£er o1

Os componentes indiviãuais -destas;: formulações,: ; bem com os métodos p a r a a sua preparação, cot ão çomplefc«mente desc11 Los no Pedido de Patente:Britânica 2 222 770, cujo : eonteúdo aqui se incorpora por referência.

Claims (1)

1. 45.: 45.: RE I V I N D I C A Ç 0 E S: la. — Processo para a prepração de ciclospo rinas de fórmula geral I t-W-X-R-Y-Z-Q-Ala- (D) Aia-MeLeu-Me.Leu-Me Va 1 —.......... na qual m'i significa Metímt. : di-hidro~MeSmt ou 81-hidroxi-MeBmt; : X significa o(Abu, Vai, Thr, Nva ou MeOThr; R /Significa Sar ou (D)-MeA'a; .· Y: significa: Me Leu, s^-hidroxi-iMeLeu , Melie, MeVal, MeThr , MeAlaMealie ou MeaThr ; Z sign.ifica Vai, Leu, MeVal ou MeLeu; e oit Q signilica MeLeu, ^'-hi.droxi-MeLeu ou MeAla; contanto/ /que, quando :Y: significar MeLeu, então ou Z significa: MeVal ou MeLeu ou W significa 8' -hidroxi-MeBnit; caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem era cultivar a estirpe do fungo DSM 6627 num meio nutritivo e isolar o produto do caldo de fermentação. 2a. Processo: para a preparação de eiciosporinas que possuem um ou mais resíduos de y-hidroxi-MeLeu, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em cultivar a estirpe do fungo:DSM 6182 num meio nutritivo, adicionar uma ciclosporina que possui, um ou mais resíduos MeLeu e isolar o produto do caldo de feimentaçao. 3a. Processo de acordo com a : reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter um composto de fórmula 1' W' -X' -Sar-Y' -Z' -MeLeu--A.la- (D) Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal—-— I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 na qual / W' significa Mefimt ou di~hidro MeBmt? X' signif icao(Abu ou Nva; Y': significa j^-hi drox i.-MeLeu, MeVal, MeThr ou Melle; e :: Z' significa Vai ou MeVal. 4a. Processo de acordo com qualquer das reivxndicaçOes anteriores, caracterízado pelo facto de,como produto final, se obter um composto de fórmula geral II —-~W'-X-R-Y-Z-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal·- 123456 7 8 9 10 11 na qual W' significa MeBmt ou di-hidro-MeBmt; X significa O^.bu, Vai Thr, Nva cu MeOThr; R significa Sal ou (D)-MeAia; Y significa MeLeu, y-híclroxi-MeLeu, Melle, MeVal, MeThr, MsAla,;MsaIle:ou HcaTnr; o Z significa Vai, Leu, MeVal ou MeLeu; com a condição de que: 1) quando Y significa MeLeu ou MeAia, Z significa MeVal ou MeLeu; e 2) quando w' significa MeBmt, R significa Sar e Y significa ^-hidroxi-MeLeu, então Z é difrente de Vai<. 5a. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter um composto de fórmula II' !-W' - o^Abu-Snr-Y' —Z" -MeLeu-Aia-{.0)Âla-MeL-au-MoLeu-MeVa 1·^ í : :2 : 3 4;;;;:;"56:;.; 9 ro ::::: xr na qual vT significa MeBmt ou Ui-hiãro-MeBmt; Y'· significa /'-hl d roxi-~MeLeu , Meva 1, MeThr ou Mel le; e • 0·· . Z' significa Vai ou MeVai? contanto que, quando W' significa MeBnt,/ . :e diferente de yÇ—hidroxi-MeLeu. 6a. Processo de acordo : com qualqueri:das ; -reivindicações : ancer iores, caractcrisado pelo facto - de, como . produto final, se obter um dos seguintes compostos: ídi-hidro—MeBmt] Γ j^~hidroxi-MeLeu] ^-ciclosporina, [MeVai J 4-cíclospor ina, f ÍMelle] 4-c.iclospor ina, f·· lMeThr}^-ciclosporina, f ^-hidroxi-MeLeu]^-ciciosporina, fMval—~í K-hidroxi-MeLeu] ^-cicl ospor i na , [ ^-hidroxi-MeLeu]-{ ^-hidroxi-MeLeu] -c.iclosporina .....υ 5 0 [MeVai] -ciclospor .ina, MeOThr]2~f(D)MeAla]3~[MeVai]5-ciclosporina, [8' -hidroxi -MeBmt] ^"-ciclospor ina e [ ^-hidroxi-MeLeu]"^-ciclospor ina. 7a. Processo de acordo com qualquer das reiindicações 1 a 5, earacterizado pelo:facto de, se preparar um composto do grupo formado por: [di“hidro—MeBmt]1 - í ^-hidroxi-MeLeu] 4~cic.losporina, y: [MeVai ] 4~cic.i espor ina , [Melie]^-ciclocpor ina, ÍMeThrj ‘"-ciclospor ina, :::-:0 48 2 . . . 4 (Nval - [ ,Κ-hidroxi-MeLeu! -ciclosporina, • -- U ....... a ... ..... [^-hidroxi-MeLeu] ~ { ^-hidroxi-MeLeu] -ciclosporina [MeVal)^-ciclosporina e MeOThr!2-[(D)MeAla13-[MeVal]5-ciclosporina, 8a. Cultura pura da estirpe do fungo com o numero de acesso da Colecção Alemã de Microrganismos DSM 6182. Sa. Cultura da estirpe do fungo com o numero:de acesso da; Colecção Alemã de Microrganismos DSM 6627, 10a. Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento e a prevenção de perturbações provocadas por vírus em seres humanos, '.ineluindo o .;:.·y£rus ΗΪVi-,1¾'* caracterÍ2ado pelo facto de se mis Lurar pelo menos uma ciclosporina preparada de acordo com qualquer das reivindicações la 7, como ingrediente activo, com as substncias veiculares apropriadas. 11a. Processo para o tratamento terapêutico ou profiláctico de pertubações provocadas por vírus, incluindo o HIV-I, em seres humanos, caracterizado pelo facto de se administrar aoo pacientes que precisam esse tratamento uma dosagem diária duma ciclosporina de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 dê preferência compreendida entre cerca de 1 e 20mg/Kg de peso corporal, no caso de a administração se fazer por via intravenosa e entre cerca de lmg e 50mg/Kg de peso corporal no caso de a administração se fazer por via oral. Lisboa, 31 de Outubro de 1991 /o Agente Oficial da Propriedade Industrial MAaiA SIlVíNA VSEmft PUiEm/V FSIipRA Adjunto Imérícoria Silva Carvalho Ageiite :0ficfáJ ds .Pf-njjfiode.íe Issis-rkl Sua.MárífiiSs is Fronfetrs, Hf [27 - Ê.® SCO tiSBOA Tels,3877373-3877453