ES2200079T3

ES2200079T3 - Ciclopeptolidos.

Info

Publication number: ES2200079T3
Application number: ES96939867T
Authority: ES
Inventors: Michael Dreyfuss; Theodor Fehr; Carolyn Ann Foster; Dieter Geyl; Berndt Oberhauser
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1995-11-21
Filing date: 1996-11-20
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2016-11-20
Also published as: CO4770985A1; SK65698A3; MY115877A; DE69628323T2; NO982280L; AU7694696A; TW450978B; ATE240972T1; BR9611619A; EP0866801A1; AU712900B2; NZ322909A; WO1997019104A1; PL326755A1; MX9804048A; RU2171260C2; HUP9903810A2; PL186010B1; CN1202904A; KR19990071533A

Abstract

CICLOPEPTOLIDOS DE FORMULA (I), EN DONDE A, B, R 1 LEU, LEU, C, X Y Y SON COMO SE DEFINEN; SON INHIBIDORES DE LA EXPRESION DE LAS MOLECULAS DE ADHESION E INHIBIDORES DE LA LIBERACION DE TNF Y SON POR TANTO UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE INFLAMACIONES Y DE OTRAS ENFERMEDADES QUE TIENEN QUE VER CON NIVELES ELEVADOS DE LA EXPRESION DE LAS MOLECULAS DE ADHESION Y/O ESTAN MEDIADAS POR EL TNF.

Description

Ciclopeptólidos.

Esta invención se refiere a ciclopeptólidos y a su uso terapéutico como inhibidores de la expresión de moléculas de adhesión.

Las moléculas de adhesión celular tales como ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina se expresan sobre la superficie de células endoteliales, así como en queratinocitos en el caso de ICAM-1, en respuesta a mediadores proinflamatorios que incluyen TNF\alpha, INF\gamma, IL1 y LPS. Los contra-ligandos correspondientes, por ejemplo LFA-1, VLA-4 y SLE^{x}, se expresan sobre las superficies de células sanguíneas circulantes. La migración transendotelial de los leucocitos durante los procesos inflamatorios, así como las interacciones célula-célula extravasculares, se regulan como resultado de las interacciones entre estas moléculas de adhesión y sus contra-ligandos. Por consiguiente, los inhibidores de la expresión de moléculas de adhesión ofrecen la posibilidad de tratamiento de muchos estados de enfermedad.

Los ciclopeptólidos son moléculas cíclicas que comprenden restos aminoacídicos unidos entre sí por enlaces peptídicos y al menos un resto de ácido carboxílico substituido con hidroxi que está unido a través de su substituyente hidroxilo al resto ácido vecino por un enlace éster.

Nuestra solicitud de patente en trámite junto con la presente, publicación de solicitud de patente internacional WO 96/03430, describe nuevos cicloheptapeptólidos que son inhibidores de la expresión de ICAM-1, VCAM1 y E-selectina. Ahora hemos descubierto nuevos cicloheptapeptólidos de la misma clase general de compuestos, incluyendo compuestos que tienen propiedades particularmente deseables.

La presente invención proporciona cicloheptapeptólidos de fórmula I_{p}

1

en la que:

A_{p} es un resto de ácido glicólico opcionalmente \alpha-substituido con metilo;

B_{p} es un resto de ácido octanoico \alpha-amino-\gamma-metil-substituido;

R_{1p} es hidrógeno o metilo;

C_{p} es un resto de triptófano o de N-metil-triptófano, que está opcionalmente N'-alcoxi (con 1 a 4 átomos de carbono)-substituido;

X_{p} es un resto de ácido carboxílico (con 2 a 14 átomos de carbono) \alpha-amino-substituido; e

Y_{p} es un resto ácido carboxílico (con 2 a 10 átomos de carbono) \alpha-amino- o N-metil-\alpha-amino-substituido.

Son compuestos preferidos de acuerdo con una realización adicional de la invención, compuestos de fórmula I_{p}'

2

en la que B_{p}, R_{1p}, C_{p}, X_{p} e Y_{p} son como se han definido anteriormente y A_{p}' es un resto de ácido butírico \alpha-hidroxi-substituido que está substituido en posición \gamma con un grupo de la fórmula VI

3

en la que R_{2} representa un grupo alquilo inferior con 1 a 4 átomos de carbono.

Más preferiblemente, R_{2} es metilo o etilo.

Son compuestos preferidos de acuerdo con otra realización adicional de la invención, compuestos de fórmula I _{p}''

4

en la que B_{p}, R_{1p}, C_{p}, X_{p} e Y_{p} son como se han definido anteriormente y A _{p}'' es un resto de ácido butírico \alpha-hidroxi substituido, que está substituido en posición \gamma con un grupo de fórmula VII

5

en la que R_{6} representa hidrógeno, alquilo inferior o fenilo, o forma un anillo carbocíclico junto con la posición 5 del anillo de tiazolilo.

Los compuestos de fórmulas I_{p}, I_{p}' e I_{p}'' se denominarán en lo sucesivo "compuestos de la invención", término que también incluye todos los compuestos de la invención cuando están en forma de sal o éster, así como en forma libre.

Los compuestos de la invención contienen átomos asimétricos y, por lo tanto, pueden existir en varias formas epiméricas. La invención incluye todos los epímeros posibles, así como mezclas diastereoisoméricas de los mismos. Se prefieren epímeros que poseen actividad de inhibición de la expresión de moléculas de adhesión. En general, por ejemplo, para el uso farmacéutico de acuerdo con la invención, se preferirán epímeros que posean actividad de inhibición de la expresión de moléculas de adhesión en forma pura o substancialmente pura (por ejemplo, libre o substancialmente libre de epímeros que carecen de actividad de inhibición de la expresión de moléculas de adhesión), por ejemplo, que comprenden al menos un 90%, por ejemplo al menos un 95% de epímero activo (es decir, que comprenden menos del 10%, por ejemplo menos del 5% de epímero inactivo). Más preferiblemente, los compuestos de la invención tienen la misma conformación etereoquímica del anillo de ciclopeptólido que el compuesto particularmente preferido de fórmula VIII mostrado a continuación.

Son compuestos particularmente preferidos de la invención, los compuestos de fórmulas VIII, IX y X

6

7

8

El compuesto de fórmula VIII se ha aislado a partir de cultivos de cepa fúngica F/94-499709, de la que se depositaron muestras en el DMS-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest el 18 de septiembre de 1995, y se identifica con el número de depósito DSM 10275. Las características de la cepa fúngica F/94-499709 se describen más adelante en el ejemplo 1. El compuesto de fórmula VIII es un compuesto particular de la invención.

También pueden obtenerse muestras de la cepa F/94-499709 en Sandoz Ltd. CH-4002 Basilea, Suiza.

Se pone en conocimiento del público que el acceso a las muestras de DSM 10276 está limitado de acuerdo con las estipulaciones de la Norma 28 (4) y (5) EPC.

La invención incluye la cepa F/94-499709 (DMS 10275) en forma aislada.

El compuesto de fórmula VIII y los compuestos relacionados pueden obtenerse cultivando F/94-499709 (DMS 10275) o un mutante o derivado del mismo, o una especie fúngica similar, en medio nutriente y recuperando los compuestos a partir de dicho medio, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2.

Las características del compuesto de fórmula VIII se proporcionan en el ejemplo 3.

Los compuestos de acuerdo con la invención pueden prepararse modificando los compuestos de fórmulas XI, XII o VIII.

\newpage

Por ejemplo, los compuestos de fórmulas XI y XII,

9

10

pueden obtenerse como aislados de cultivos de la cepa fúngica F92-4471/08, depositada en la colección de cultivos NRRL del Departamento de Agricultura de Estados Unidos, según las estipulaciones del Tratado de Budapest, el 2 de julio de 1993, e identificada con el número de depósito NRRL 21123. Las características de la cepa fúngica F92-4471/08 y el aislamiento de compuestos XI y XII se describen con detalle en nuestra solicitud de patente en trámite junto con la presente, solicitud de patente internacional WO 96/03430.

Los compuestos de la invención también pueden prepararse por síntesis química; por ejemplo, usando técnicas de síntesis de péptidos convencionales. Típicamente, la etapa final en la preparación de los compuestos es una etapa de ciclación en la que un péptido lineal o peptólido que comprende los restos ácidos A, B, R_{1}Leu, Leu, C, X e Y unidos entre sí en el orden apropiado, se cicla mediante una reacción de formación de enlaces amida o éster.

Los compuestos de la invención muestran actividad farmacológica y, por lo tanto, son útiles como agentes farmacéuticos. En particular, los compuestos de la invención son inhibidores de la expresión estimulada de moléculas de adhesión celular, especialmente inhibidores de VCAM-1 con respecto a la expresión de E-selectina e ICAM-1. En particular, los compuestos de la invención también son inhibidores de la liberación de TNF, por ejemplo, inhibidores de la liberación de TNF\alpha.

Los ensayos que pueden usarse para detectar la inhibición de la expresión de ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina y la inhibición de la liberación de TNF\alpha por los compuestos de la invención se describen después de los ejemplos.

De esta manera, en vista de su actividad como inhibidores de la expresión de moléculas de adhesión celular, los compuestos son útiles para el tratamiento o profilaxis de procesos de enfermedad que implican la expresión de moléculas de adhesión celular. Estos procesos de enfermedad incluyen muchas enfermedades/trastornos adquiridos y hereditarios en los que la activación y el tráfico de leucocitos juega un papel importante en el proceso patogénico, más notablemente inflamación aguda y crónica (por ejemplo, alergia, asma, dermatitis, psoriasis, lesión de reperfusión y choque séptico), estados autoinmunes (por ejemplo, diabetes, esclerosis múltiple y artritis reumatoide) y neurodegeneración mediada por el sistema inmune (por ejemplo, trastornos de inmunodeficiencia adquirida). Otras indicaciones para los compuestos de la invención incluyen metástasis tumorales (por ejemplo, melanoma, osteocarcinoma), aterosclerosis y rechazo de aloinjertos/xenoinjertos, ya que se sabe que la inhibición de las moléculas de adhesión vascular puede mejorar en gran medida el pronóstico de estos procesos.

Además, los compuestos de la invención tienen potencial terapéutico en enfermedades hiperproliferativas de la piel (por ejemplo, psoriasis), así como en diversas malignidades, en vista de su actividad inhibidora a concentraciones submicromolares cuando se ensayan durante 72 horas en un ensayo basado en queratinocitos así como en otros ensayos de proliferación.

Los compuestos de la invención son activos en la inhibición de la producción de VIH inducida por TNF\alpha/IL-6 en la línea de células monocíticas U1, como se evalúa por un ELISA p24 y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de inmunodeficiencias y enfermedades producidas por virus, especialmente en el tratamiento del SIDA.

Además, en vista de su actividad como inhibidores de la liberación de TNF, los compuestos de la invención son útiles para la profilaxis o tratamiento de enfermedades o estados patológicos mediados por TNF, especialmente TNF\alpha, por ejemplo, estados inflamatorios, enfermedades autoinmunes, infecciones graves y rechazo de transplantes de órganos o tejidos, incluyendo tanto el rechazo a aloinjertos como el rechazo a xenoinjertos, por ejemplo, para el tratamiento de receptores de trasplantes de corazón, pulmón, corazón-pulmón combinado, hígado, riñón, páncreas, piel o córnea y para la prevención de la enfermedad del injerto frente al hospedador, tal como la que se produce después de transplantes de médula ósea.

Los compuestos de la invención son particularmente útiles para el tratamiento, prevención o mejora de enfermedades autoinmunes y de estados inflamatorios, en particular, estados inflamatorios con una etiología que incluya un componente autoinmune, tal como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis crónica progrediente y artritis deformante) y enfermedades reumáticas. Las enfermedades auto-inmunes específicas para las que pueden emplearse los compuestos de la invención incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluyendo, por ejemplo, anemia hemolítica, anemia aplástica, anemia de glóbulos rojos pura y trombocitopenia idiopática), lupus sistémico eritematoso, policondritis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis crónica activa, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Steven-Johnson, esprue idiopático, enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino (incluyendo, por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar primaria, diabetes juvenil (diabetes mellitus de tipo I), uveítis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriática y glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico, por ejemplo, incluyendo síndrome nefrótico idiopático o nefropatía de cambio mínimo).

Los compuestos de la invención también son útiles para el tratamiento, prevención o mejora del asma, bronquitis, neumoconiosis, enfisema pulmonar, y otras enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias.

Los compuestos de la invención son útiles para tratar reacciones inflamatorias indeseables, agudas e hiperagudas, que están mediadas por TNF, especialmente por TNF\alpha, por ejemplo, infecciones agudas, por ejemplo, choque séptico (por ejemplo, choque endotóxico y síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos), meningitis, neumonía; y quemaduras graves; y para el tratamiento de la caquexia o síndrome de emaciación asociado con la liberación mórbida de TNF, posterior a una infección, cáncer o disfunción de órganos, especialmente la caquexia relacionada con el SIDA, por ejemplo, asociada con o posterior a la infección por VIH.

La invención también incluye composiciones terapéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la invención.

Además, la invención incluye el uso de un compuesto de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para aplicación en el tratamiento o profilaxis de enfermedades que implican la expresión de moléculas de adhesión.

En particular, la invención también proporciona, en una serie adicional de realizaciones:

A. Uso de un compuesto de la invención para la preparación de un medicamento para uso como un método para inhibir la producción de TNF soluble, especialmente TNF\alpha, o para reducir la inflamación en un sujeto (es decir, un mamífero, especialmente un ser humano) en necesidad de tal tratamiento, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de la invención, o un método para tratar cualquiera de las afecciones mencionadas anteriormente, particularmente un método para tratar una enfermedad o afección inflamatoria o autoinmune, por ejemplo, esclerosis múltiple o artritis reumatoide, o para aliviar uno o más síntomas de cualquiera de las afecciones mencionadas anteriormente.

B. Un compuesto de la invención para uso como un agente farmacéutico, por ejemplo, para uso en la profilaxis o tratamiento de enfermedades o estados patológicos mediados por TNF, por ejemplo, como un agente inmunosupresor o antiinflamatorio, o para uso en la prevención, mejora o tratamiento de cualquier enfermedad o afección descrita anteriormente, por ejemplo, una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria.

C. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención en asociación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, para uso en la profilaxis o tratamiento de enfermedades o estados patológicos mediados por TNF, por ejemplo, como un agente inmunosupresor o antiinflamatorio, o para uso en la prevención, mejora o tratamiento de cualquier enfermedad o afección descrita anteriormente, por ejemplo, una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria.

D. Uso de un compuesto de la invención en la fabricación de un medicamento para uso en la profilaxis o tratamiento de enfermedades o estados patológicos mediados por TNF, por ejemplo, como un agente inmunosupresor o antiinflamatorio, o para uso en la prevención, mejora o tratamiento de cualquier enfermedad o afección descrita anteriormente, por ejemplo, una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria.

Las composiciones pueden ser para uso parenteral, oral, de aerosol, por inhalación o tópico y normalmente comprenden uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables y pueden comprender aditivos tales como estabilizadores y similares.

Las dosificaciones de los compuestos usados pueden variar en relación con la afección o enfermedad implicada, tanto si el uso es para el tratamiento como si es para la profilaxis de la misma, y con el modo y la vía de administración, entre otras cosas. Sin embargo, en general, se obtienen resultados satisfactorios en la administración oral a dosis de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 10 mg/kg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 7,5 mg/kg/día, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 mg/kg/día administrados de una sola vez o, en dosis divididas, de 2 a 4 veces al día. Como alternativa, para la administración parenteral, por ejemplo, por goteo i.v. o infusión, pueden usarse dosificaciones de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1 mg/kg/día y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 mg/kg/día.

De esta manera, las dosificaciones diarias adecuadas para pacientes humanos son de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 500 mg p.o., preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 250 mg p.o., más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg p.o.; o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 250 mg i.v., preferiblemente de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 125 mg i.v. y más preferiblemente de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 50 mg i.v.

Los compuestos pueden administrarse por cualquier vía apropiada, incluyendo la vía entérica, parenteral y tópica, o por un inhalador. Las formas administradas por vía entérica adecuadas son soluciones para beber, comprimidos o cápsulas. Las formas parenterales adecuadas son soluciones o suspensiones inyectables. Las formas adecuadas para la administración tópica incluyen cremas, lociones y similares, a un intervalo de concentración de 0,01-10%, preferiblemente del 0,1 al 1% en peso para tales formulaciones. Las formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración oral pueden comprender de 1 a 50 mg del compuesto, normalmente de 1 a 10 mg.

La invención se describe adicionalmente, sólo de forma ilustrativa, en los siguientes ejemplos que hacen referencia a los diagramas adjuntos en los que:

la figura 1 muestra el espectro UV del compuesto de fórmula VIII;

la figura 2 muestra el espectro IR del compuesto de fórmula VIII;

la figura 3 muestra el espectro de FD-Masas del compuesto de fórmula VIII;

la figura 4 muestra el espectro de FD-Masas (con adición de LiI) del compuesto de fórmula VIII, y

la figura 5 muestra el espectro de RMN de protón del compuesto de la figura VIII en CDCl_{3}.

Ejemplos Ejemplo 1 Caracterización de la cepa F/94-499709 (DSM 10275)

Para caracterizar la cepa F/94-499709 se usa el siguiente medio, proporcionándose los componentes del medio en peso/volumen en agua desionizada y realizándose la esterilización térmica durante 20 minutos a 121ºC.

MEA: 2% de extracto de malta, 0,4% de extracto de levadura, 2% de agar.

La cepa F/94-499709 muestra las siguientes características cuando se inocula en puntos en MEA en placas Petri y se incuba en la oscuridad:

La temperatura óptima para el crecimiento está comprendida entre 24 y 30ºC. Después de 14 días de incubación, las colonias alcanzan un diámetro de 25 a 32 nm a 24ºC, de 30 a 37 mm a 27ºC y de 7 a 15 mm a 33ºC. Por encima de 37ºC y por debajo de 13ºC, la cepa F/94-499709 no muestra ningún crecimiento.

Las colonias que crecen a 27ºC en la oscuridad generalmente son de color crema a color ante claro, permaneciendo de bastante planas a ligeramente levantadas, con un desarrollo de micelio aéreo de blanquecino a gris claro pequeño y restringido en el centro. Pueden hacerse patentes surcos radiales, y cuando el medio se observa desde el fondo, pueden volverse predominantes unas zonas concéntricas de color gris más obscuro. En cultivos en envejecimiento, el micelio aéreo y del substrato en las partes centrales de las colonias puede volverse de color gris obscuro, mientras que los bordes de las colonias conservan el color crema a ante claro.

Tras el examen microscópico no se han observado estructuras de esporulación y, de esta manera, la cepa F/94-499709 se denomina provisionalmente mycelium sterilum.

Ejemplo 2 Fermentación de la cepa F/94-499709

Los siguientes medios y procedimientos son adecuados para uso en un proceso para producir el compuesto de fórmula VIII por fermentación de la cepa F/94-499709. Si no se indica otra cosa, todos los componentes del medio se proporcionan en peso/volumen en agua desionizada y la esterilización térmica se realiza durante 20 minutos a 121ºC.

PCM (medio de precultivo y de cultivo intermedio): 2% de extracto de malta, 0,4% de extracto de levadura, 0,1% de agar.

PRM (medio de producción): 2% de almidón soluble, 0,5% de extracto de levadura, 2% de glucosa, 2% de licor de maíz macerado, 0,5% de peptona, 0,2% de carbonato cálcico.

Los precultivos se producen por descongelación de dos ml de una suspensión de siembra en nitrógeno líquido de la cepa F/94-499709, por inoculación de los mismos en un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contiene 200 ml de PCM, y por incubación de dicho matraz a 24ºC durante siete días en un agitador rotatorio a 200 RPM.

Para la producción del cultivo intermedio primario, se inoculan catorce matraces Erlenmeyer de 500 ml que contienen, cada uno, 200 ml de PCM con cinco ml del precultivo cada uno.

Los cultivos intermedios secundarios se producen inoculando cada uno de dos fermentadores de 50 litros que contienen PCM con 1,4 litros de cultivos intermedios primarios. La fermentación se realizó durante seis días en las siguientes condiciones: 24ºC, 1 litro de aire/minuto/litro de medio, agitadores de cuchillas con una velocidad de giro de 150 RPM y presión de 0,5 bares. Para la producción del compuesto de fórmula VIII y compuestos relacionados, se inocularon 13 litros del cultivo intermedio secundario en cada uno de tres fermentadores de 500 litros que contenían PRM. La fermentación se realizó en las siguientes condiciones: 21ºC, 1 litro de aire/minuto/litro de medio, agitadores de cuchillas con una velocidad de giro inicial de 100 RPM que se aumentó gradualmente a 150 RPM y presión de 0,5 bares. Se recogieron 1500 litros de la fermentación de producción y se combinaron después de 96 horas para recuperar el compuesto deseado de fórmula VIII y compuestos relacionados.

Ejemplo 3 Aislamiento del peptólido de fórmula VIII a partir de la cepa F/94-499709

Se homogeneiza el caldo de la fermentación de 1500 litros junto con 1700 litros de acetato de etilo en un reactor Dispax y la mezcla se agita vigorosamente durante 3 horas. La fase orgánica se separa con la ayuda de un separador Westfalia. Se repite esta etapa de extracción y las fases orgánicas se evaporaron conjuntamente a presión reducida para dar 2745 g de extracto. El extracto se desgrasa mediante una extracción de tres etapas con 40 litros de una mezcla de metanol/agua (9:1) y 40 litros de ciclohexano. Las fracciones de metanol se combinan y se evaporan a sequedad a presión reducida para producir 960 g de extracto desgrasado. Este extracto se cromatografía en una columna de 15 kg de Sephadex LH20 en solución de metanol para dar fracciones que constituyen un total de 135 g que contienen el peptólido de fórmula VIII. Se impregnan 300 g de gel de sílice con esta fracción total de 135 g y el gel de sílice impregnado después se añade en la parte superior de una columna de 1,5 kg de Silicagel Merck de 0,04 a 0,063 mm y se cromatografía con 1 litro de mezcla de 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 de metil-terc-butiléter/ciclohexano, 3 litros de MTBE y 3 litros de mezcla de 95:5 de MTBE/metanol. Se recogen fracciones de 1 litro y se analizan por HPLC y TLC. Las fracciones 8 y 9 se combinan y se evaporan a sequedad. La cristalización en éter produce 21,9 g del peptólido puro de fórmula VIII. La purificación adicional de las aguas madre y de las fracciones 10 a 13 por cromatografía en Silicagel H Merck (750 g) de un modo similar al descrito anteriormente produce un lote adicional de ciclopeptólido cristalino de fórmula VIII. Se descubre que el peptólido tiene un punto de fusión (p.f.) de 143-146ºC cuando se purifica en éter y una rotación óptica [\alpha]_{D}^{20} = -233,9º (c = 0,908, metanol). El peptólido de fórmula VIII tiene una IC_{50} (concentración inhibidora del 50%) de aproximadamente 2 nM cuando se ensaya en el ELISA de células VCAM-1.

Fórmula molecular: C_{51}H_{83}N_{7}O_{9} (938,3)

Espectro UV en metanol: \lambdamáx (\varepsilon') = 290 (5,4), 279 (5,08), 220 (38,1), 197 (55,7) - véase la figura 1

El espectro IR (KBr) se proporciona en la fig. 2

El espectro de MS FAB se proporciona en la fig. 3

El espectro de MS FAB (con LiI) se proporciona en la fig. 4

El espectro de RMN de protón en CDCl_{3} se proporciona en la fig. 5

MTBE = metil terc-butil éter

VCAM = molécula de adhesión vascular

Ejemplo 4 Síntesis del derivado de N1'-desmetoxi del compuesto de fórmula VIII

Una solución de 4,9 mg del compuesto de fórmula VIII se disuelve en 3 ml de metanol y se añaden 8 mg de paladio sobre carbón (10%). La mezcla se agita en una atmósfera de hidrógeno durante 2 horas, se lava abundantemente con argón, se filtra y se evapora para producir el compuesto del título en forma de una espuma incolora. El compuesto se analiza por cromatografía de capa fina y espectroscopía de RMN y se obtienen los siguientes resultados.

TLC: gel de sílice, 9/1 de tolueno/metanol, Rf = 0,28.

^{1}H RMN (3 confórmeros 56:37:7, marcados con * º ', señales características proporcionadas): 8,72* (d, J = 10 Hz, NH); 8,08* (s, a, NH de indol), 6,97*, 6,90º (2d, J = 2 Hz, H-2 de indol); 6,34º (d, J = 9,5 Hz, NH); 6,00* (d, J = 6,5 Hz, NH); 5,83' (d, NH); 5,32º (ddd, alfa-H de PrLeu); 5,12º, 5,08* (2c, J = 7 Hz, Me de ácido láctico); 4,50* (dd, alfa-H de MeLeu); 4,10* (ddd, alfa-H de Leu); 3,42 (c, J = 7 Hz, alfa-H de MeAla); 3,43º, 3,19º, 3,12*, 2,93*, 2,53*, 2,35º (6s, NMe); 1,54*, 1,50º (2d, J = 7 Hz, alfa-H de MeAla), 1,38º, 1,24* (2d, J = 7 Hz, alfa-H de ácido láctico); 0,57*, -0,01* (2d, J = 6,5 Hz, Me); -0,19* (ddd, beta-H de Leu).

Ejemplo 5 Síntesis del derivado de N1'-metilo del compuesto de fórmula VIII

Se mezcla una solución de 5 mg del producto del ejemplo 4 en 0,5 ml de DMF seca con 100 ml de yodometano y se añade una solución de 3 mg de bis(trimetilsilil)amida sódica en 0,3 ml de DMF. Después de agitar la mezcla de reacción durante 1,5 horas a TA, la mezcla se vierte en HCl acuoso 0,1 M, se extrae con acetato de etilo y se reparte entre acetato de etilo y una solución acuosa saturada de bicarbonato. La fase orgánica se lava con salmuera, se seca sobre sulfato sódico y se evapora al vacío. El producto bruto se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (gradiente: tolueno/metanol = 100/0,25 a 100/2,5) para producir el compuesto del título en forma de una espuma incolora. El compuesto se analiza por cromatografía de capa fina y espectroscopía de RMN y se obtienen los siguientes resultados.

TLC: gel de sílice, 9/1 de tolueno/metanol, Rf = 0,40.

^{1}H RMN (2 confórmeros 60:40, marcados con * º, señales características proporcionadas): 8,72* (d, J = 10 Hz, NH), 6,79*, 6,74º (2s, H-2 de indol), 6,35º (d J = 9,5 Hz, NH), 5,98* (d J = 6,5 Hz, NH), 5,32º (ddd, alfa-H de PrLeu), 5,12º, 5,08* (2c, J = 7 Hz, Me de ácido láctico), 4,50* (dd, alfa-H de MeLeu), 4,06* (ddd, alfa-H de Leu); 3,73 (s, NMe de indol); 3,44º, 3,19º, 3,15*, 2,93*, 2,53*, 2,35º (6s, NMe); 1,55*, 1,51º (2d, J = 7 Hz, alfa-H de MeAla), 1,39º, 1,24* (2d, J = 7 Hz, alfa-H de ácido láctico); 0,57*, -0,09* (2d, J = 6,5 Hz, Me), -0,32* (ddd, beta-H de Leu).

Ejemplo 6 Éster metílico del ácido 5-[8,11-diisobutil-14-(1-metoxi-1H-indol-3-ilmetil)- 7,13,19,20-tetrametil-5,17-bis-(2-metil-hexil)-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxo-1-oxa- 4,7,10,13,16,19-hexaazaciclohenoicos-2-il]-pent-2-enoico

Se agita una solución de 185 mg del compuesto de la fórmula XV (véase más adelante) y 1,26 g de metoxicarbonilmetilenotrifenilfosforano en tolueno a temperatura ambiente durante 1 hora. Después, el disolvente se evapora al vacío, el residuo se cromatografía sobre una columna de filtración de gel LH-20 en metanol, las fracciones que contienen el producto se evaporan al vacío y se purifica adicionalmente por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: gradiente de tolueno/metanol = 99,5/0,5 a 96/4) para producir el compuesto del título en forma de una espuma sólida incolora. El producto se liofiliza en benceno.

^{1}H RMN (CDCl_{3}, señales características, 3 confórmeros 53:41:6, marcados con * º '): 8,67* (d, J = 10 Hz, NH de C9AA); 7,87* (d, J = 10 Hz, NH de C9AA); 7,80º (d, J = 10 Hz, NH); 7,69º (d, J = 10 Hz, NH); 7,45-7,35 (4d, H-4' y H-7' de MeMeOTrp); 7,23*, 7,22º (2m, H-6' de MeMeOTrp); 7,4 (2m, H-5' de MeMeOTrp); 7,06*, 7,00º (2s, H-2' de MeMeOTrp); 6,88º (ddd, J = 15 Hz, J = 7 Hz, -CH=); 6,76* (ddd, J = 15 Hz, J = 7 Hz, -CH=); 6,24º (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 6,04* (d, J = 6 Hz, NH de Leu); 5,82º, 5,78* (2d, J = 15 Hz, =CH-CO); 5,29º (ddd, a-H de MeAla); 5,07-4,98 (m, a-H); 4,92 (dd, a-H de MeMeOTrp); 4,86* (ddd, a-H de C9AA), 4,78* (dd, a-H de Leu); 4,71 (m, a-H); 4,48* (dd, a-H de MeLeu); 4,17* (ddd, a-H de Leu); 4,06*, 4,03', 4,02º (3s, N-OMe); 3,75*, 3,74º (2s, COOMe); 3,43º (s, N-Me); 3,20* (s, NMe de MeAla); 3,17º (s, N-Me); 2,92* (s, N-Me de MeMeOTrp); 2,52* (s, N-Me de MeLeu); 2,47º (s, N-Me); 1,51*, 1,48º (2d, J = 7 Hz, \beta-Me de MeAla); 1,04 (d, J = 6...5 Hz, Me de MeLeu); 0,98-0,84 (m); 0,63* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,56', 0,39' (2d); 0,06* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); -0,11* (ddd, \beta-CH de Leu).

El éster etílico se obtiene de forma análoga a la descrita en el ejemplo 6.

El material de partida de fórmula XV

11

se conoce (documento WO 96/03430). En esta fórmula los substituyentes tienen los siguientes significados:

12

B' = X' =

--–NH---

\delm{C}{\delm{\para}{\delm{CO}{\para}}}

H---CH_{2}---

\delm{C}{\delm{\para}{CH _{3} }}

H---(CH_{2})_{3}---CH_{3}

C' =

14

Y' =

---

\delm{N}{\delm{\para}{CH _{3} }}

------

\delm{C}{\delm{\para}{CH _{3} }}

H------CO---

En los siguientes ejemplos 7-11, se usan las mismas abreviaturas con la excepción de que:

A'' =

16

\newpage

C'' =

17

Ejemplo 7 Compuesto de fórmula IX

(es decir, el compuesto de fórmula I, en la que A = A'', R_{8} = tiazol-2-ilo, B = B', R_{1} = CH_{3}, C = C'', R_{3} = OCH_{3},
- - - - = de (doble enlace), X = X', Y = Y')

Se agita una solución de 400 mg del compuesto de fórmula I en la que A = A'', R_{8} = -CS NH_{2}, B = B', R_{1} = CH_{3}, C = C'', R_{3} = OCH_{3}, - - - - = de, X = X', Y = Y') y 0,5 ml de cloroacetaldehído hidrato en 8 ml de dimetilformamida seca con 0,5 g de tamices moleculares 4 \ring{A} y se calienta a 60º durante 5 horas. Después, la mezcla se diluye con acetato de etilo, se filtra y se extrae con HCl 0,1 N. La fase orgánica se lava con salmuera, se seca y se evapora al vacío. El producto bruto se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: gradiente de tolueno/metanol = 99,5/0,5 a 98/2) para producir el compuesto del título en forma de una espuma sólida.

Los siguientes compuestos de fórmula I (A = A'', B = B', R_{1} = CH_{3}, C = C'', R_{3} = OCH_{3}, - - - - = de, X = X', Y = Y') se obtienen de forma análoga a la descrita en el ejemplo 7.

Ejemplo	R_{8}
8

18

espuma sólida 9

19

-''- 10

20

-''- 11

21

-''-

El material de partida, es decir, el compuesto de fórmula I en la que A = A'', R_{8} = -CS NH_{2}, B = B', R_{1} = CH_{3}, C = C', R_{4} = OCH_{3}, - - - - = de, X = X', Y = Y', se prepara de la siguiente manera:

Una solución de 1,1 g del compuesto de fórmula XI (A es un resto de ácido butírico \alpha hidroxi substituido \gamma substituido con -CN B = B', R_{1} = CH_{3}, C = C', R_{4} = OCH_{3}, - - - - = de, X = X', Y = Y') y 1,8 g de ácido difenilfosfinoditioico en 25 ml de isopropanol se calienta a reflujo durante 7 horas. La mezcla de reacción se evapora al vacío, se disuelve en acetato de etilo y se extrae con una solución de bicarbonato sódico y salmuera. Después de la evaporación de la capa orgánica, el producto bruto se purifica por cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: gradiente de tolueno/metanol = 99,5/0,5 a 98/2) para producir el compuesto de partida en forma de una espuma incolora.

Los compuestos de los ejemplos 4 a 11 tienen actividades similares a las del compuesto de fórmula VIII cuando se miden en el ELISA de células VCAM-1.

Ejemplo 7

3 confórmeros 46:51:3, marcados con * º ': 8,70* (d, J = 10 Hz, NH de LeuPr); 7,89* (d, 10 Hz, NH); 7,83º (d, J = 9 Hz, NH); 7,69, 7,66 (2d, J = 3,3 Hz, H tiazol); 7,58 (d, J = 10 Hz, NH); 7,53*, 7,47º (2dm, J = 7 Hz, H-4' MeTrpOMe); 7,38*, 7,37º (2dm, J =8 Hz, H-7' de MeTrpOMe); 7,22*, 7,20º (2tm, H-6' MeTrpOMe); 7,17, 7,16 (2d, J = 3,3 Hz, tiazol-H); 7,09 (s, H-2' de MeTrpOMe); 7,03*, 7,00º (2dd, H-5' de MeTrpOMe); 6,98º (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,18º (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 6,03* (d, J = 7 Hz, NHde Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 5,30º (ddd, a-H de LeuPr); 5,11* (dd, a-H de ácido hidroxibutírico); 5,05-4,98 (m, a-H); 4,94 (dd, a-H de MeTrpOMe), 4,86º (ddd, a-H de LeuPr); 4,73 (m, a-H), 4,49* (dd, a-H de MeLeu); 4,23* (ddd, a-H de Leu); 4,02, 4,00 (2s, N-OMe); 3,84º (m, a-H); 3,59-3,40 (m); 3,38 (c, J = 7 Hz, a-H de MeAla); 3,33 (s, N-Me); 3,2-2,85 (m); 3,21 (s, N-Me); 3,07 (s, N-Me); 2,93* (s, N-Me de MeTrpOMe); 2,53* (s, N-Me de MeLeu); 2,49 (s, N-Me); 2,43-2,28 (m); 2,18 (m); 1,98 (m); 1,81 (m); 1,7-1,1 (m); 1,48, 1,46 (2d, J = 7 Hz, \beta-Me de MeAla); 1,06* (d, J = 6,5 Hz, Me de MeLeu); 1,00-0,84 (m); 0,61* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,54' (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,35' (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,10* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); -0,12* (ddd, \beta-CH de Leu).

Ejemplo 8

3 confórmeros 47:48:5, marcados con * º ': 8,64* (d, J = 10 Hz, NH de LeuPr); 7,82 (2d, 10 Hz, NH); 7,63º (d, J = 10 Hz, NH); 7,23,7,17, 7,08, 6,97 (4t, H arom.); 7,32, 7,28 (2s, tiazol-H); 7,07 (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,81 (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,22º (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 6,07* (d, J = 7 Hz, NH de Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 5,29º (ddd, a-H de LeuPr); 5,20* (dd, a-H de MeTrpOMe); 5,12º (dd, a-H de ácido hidroxibutírico); 5,03º (ddd, a-H de LeuPr); 4,97* (ddd, a-H de LeuPr); 4,85 (m, a-H de ácido hidroxibutírico + LeuPr); 4,71º (ddd, a-H de Leu); 4,52* (dd, a-H de MeLeu); 4,21* (ddd, a-H de Leu); 4,02, 3,90 (2s, N-OMe); 3,34 (s, N-Me), 3,22 (s, N-Me); 3,02 (s, N-Me); 2,93 (s, N-Me); 2,53 (s, N-Me), 2,48 (s, N-Me), 1,43, 1,42 (2d, J = 7 Hz, \beta-Me de MeAla); 1,06* (d, J = 6,5 Hz, Me de MeLeu); 0,62* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,10* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); -0,04* (ddd, \beta-CH de Leu).

Ejemplo 9

3 confórmeros 42:52:6, marcados con * º ': 8,67* (d, J = 10 Hz, NH de LeuPr); 7,83, 7,80 (2d, 10 Hz, NH); 7,63º (d, J = 10 Hz, NH); 7,55, 7,42, 7,39, 7,36 (4d, MeTrpOMe arom.); 7,22, 7,18, 7,05, 6,97 (4dd, H-5' y H-6' de MeTrpOMe); 7,06º (s, H-2' de MeTrpOMe), 6,88* (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,22º (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 6,02* (d, J = 7 Hz, NH de Leu); 5,77' (d, J =10 Hz, NH de Leu); 5,30º (ddd, a-H de LeuPr); 5,21* (dd, a-H de MeTrpOMe); 5,0 (m, a-H); 4,85 (m, a-H), 4,65 (ddd, a-H de Leu); 4,49 (dd, a-H de MeLeu); 4,13* (ddd, a-H de Leu); 4,03, 3,98 (2s, N-OMe); 3,70 (m); 3,55 (m), 3,45 (c, J = 7 Hz, a-H de MeAla); 3,37, 3,20, 3,11, 2,93, 2,52, 2,43 (6s, N-Me); 2,73 (m, tetrahidro-benzotiazol); 1,50, 1,48 (2d, J = 7 Hz, \beta-Me de Ala); 1,04* (d, J = 6,5 Hz, Me de MeLeu); 0,58* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,50' (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,30' (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); 0,03* (d, J = 6,6 Hz, Me de Leu); -0,22* (ddd, \beta-CH de Leu).

Ejemplo 10

3 confórmeros 44:51:5, marcados con * º ': 8,66* (d, J = 10 Hz, NH de LeuPr); 7,83, 7,81 (2d, 10 Hz, NH); 7,63º (d, J = 10 Hz, NH); 7,57*, 7,43º, 7,38*, 7,36º (4d, J = 8 Hz, indol-H); 7,21*, 7,18º, 7,05, 6,97 (4t, indol-H); 7,06* (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,88º (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,70º, 6,69* (2c, J = 1 Hz, tiazol-H); 6,23º (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 6,05* (d, J = 7 Hz, NH de Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 5,29º (ddd, a-H de LeuPr); 5,11º (dd, a-H de ácido hidroxibutírico); 5,01 (m); 4,97 (dd, a-H); 4,85 (m, 2 x a-H), 4,69º (ddd, a-H de Leu); 4,57' (dd, a-H); 4,48* (dd, a-H de MeLeu); 4,16* (ddd, a-H de Leu); 4,03, 3,98 (2s, N-OMe); 3,43 (c, J = 7 Hz, a-H de MeAla); 3,37, 3,20, 3,10, 2,92, 2,52, 2,46 (6s, N-Me); 2,40, 2,39 (2d, J = 1 Hz, Me-tiazol); 1,48, 1,47 (2d, J = 7 Hz, \beta-Me de MeAla); 1,05* (d, J = 6,5 Hz, d-Me de MeLeu); 0,60* (d, J = 6,6 Hz, d-Me de Leu); 0,52', 0,33' (2d, J = 6,5 Hz, d-Me de Leu); 0,05* (d, J = 6,6 Hz, d-Me de Leu); -0,14* (ddd, \beta-CH de Leu).

Ejemplo 11

3 confórmeros 47:50:3, marcados con * º ': 8,69* (d, J = 10 Hz, NH de LeuPr); 7,79, 7,78 (2d, 10 Hz, NH); 7,65º (d, J = 10 Hz, NH); 7,51*, 7,41º, 7,39*, 7,38º (4d, J = 8 Hz, indol-H); 7,23*, 7,20º, 7,07, 7,00 (4 t, indol-H); 7,04* (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,85º (s, H-2' de MeTrpOMe); 6,71º* (s, tiazol-H); 6,25º (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 6,04* (d, J = 7 Hz, NH de Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH de Leu); 5,30º (ddd, a-H de LeuPr); 5,10º (dd, a-H de ácido hidroxibutírico); 5,02 (m); 4,97 (d, a-H); 4,85 (m, 2 x a-H); 4,72º (ddd, a-H de Leu); 4,60' (dd, a-H); 4,50* (dd, a-H de MeLeu); 4,17* (ddd, a-H de Leu); 4,04, 4,00 (2s, N-OMe); 3,48 (c, J = 7 Hz, a-H de MeAla); 3,41, 3,21, 3,17, 2,92, 2,53, 2,47 (6s, N-Me); 0,97, 0,96 (2s, t-Bu-tiazol); 1,50, 1,49 (2d, J = 7 Hz, \beta-Me de MeAla); 1,06* (d, J = 6,5 Hz, d-Me de MeLeu); 0,62* (d, J = 6,6 Hz), d-Me de Leu); 0,53', 0,35' (2d, J = 6,5 Hz, d-Me de Leu); 0,07* (d, J = 6,6 Hz, d-Me de Leu); -0,08* (ddd, \beta-CH de Leu).

Ejemplo A)

3 confórmeros 44:30:26, marcados con * º ': 8,85 (d, CSNH_{2}); 8,60 (d, NH de LeuPr); 8,17 (d, CSNH_{2}); 8,03, 8,00 (2d, NH); 7,88 (m, CSNH_{2}); 7,6-7,1 (arom.); 6,28* (d, 10 Hz, NH de Leu); 6,07º (d, 7 Hz, NH de Leu); 5,87' (d, 9 Hz, NH de Leu); 5,26* (ddd, a-H de LeuPr); 5,22 (dd, a-H de ácido hidroxi); 5,15-4,95, 5,08* (dd, a-H de ácido hidroxi); 4,83º (dd, a-H de LeuPr); 4,50* (ddd, a-H de Leu); 4,37* (dd, a-H de MeTrpOMe); 4,25º (ddd, a-H de Leu); 4,09, 4,05, 4,03* (3s, OMe); 3,89 (m, a-H); 3,65*, 3,63', 3,52º (3c, 7Hz, a-H de MeAla); 3,57 (m); 3,17, 3,16, 3,15, 3,22, 3,20, 3,05, 2,92, 2,55, 2,53 (9s, N-Me); 1,8-1,1; 1,05 (d, 7Hz); 0,99-0,82, 0,60º, 0,55', 0,23', 0,17º (4d, 7Hz, d-Me de Leu); -0,15º, -0,17' (ddd, b-CH de Leu). PKF 285-916 (tiazol).

Actividad biológica

Las actividades de los compuestos de la invención se ensayan en ensayos de citotoxicidad y de inhibición de la expresión de ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina, de proliferación celular, así como de inhibición de la liberación de TNF y un ensayo correspondiente de citotoxicidad.

Los ensayos se realizan como se indica a continuación:

Para el ensayo de proliferación celular y el ELISA de células ICAM-1, se usan células HaCaT, una línea celular de queratinocitos humanos no tumorigénicos transformados espontáneamente, con características de diferenciación fenotípica muy conservadas de los queratinocitos normales (Boutkamp et al., 1988 J. Cell. Biol. 106, 761-771).

A. Ensayo elisa de células ICAM-1 I. Elisa de células ICAM-1 en queratinocitos

El ELISA de células ICAM-1 usado para determinar la inhibición de la expresión de ICAM-1 es substancialmente como se describe por Winiski y Foster (1992, J. Invest. Dermatol., 99, 48-52). Se siembran células HaCaT en placas de microtitulación de 96 pocillos (2 x 10^{4} células/pocillo en medio de cultivo: DMEM con un 5% de FCS, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, y Na piruvato 1 mM), se cultivan hasta la confluencia, y después se incuban en medio de ensayo nuevo (como el medio de cultivo pero con un 0,5% de FCS en lugar de un 5%) con o sin medio de estimulación de IFN-\gamma/TNF-\alpha (medio de ensayo + 1000 U/ml de IFN-\gamma / 3 ng/ml de TNF-\alpha), tanto en presencia como en ausencia del compuesto de ensayo durante aprox. 24 horas. Después, el medio se retira por lavado y las monocapas celulares se fijan con paraformaldehído al 1%. Las monocapas se incuban con cantidades de saturación de anticuerpos primarios (anticuerpos monoclonales de ratón anti-ICAM-1) y secundarios (anticuerpos de cabra anti-ratón conjugados con peroxidasa). La posterior reacción de peroxidasa usa 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) como substrato y genera un producto insoluble y coloreado que se mide fácilmente en un lector de placas de microtitulación convencional.

II. Medición de la citotoxicidad

Después de completar la reacción con AEC para detectar ICAM-1, las monocapas de HaCaT se aclaran con PBS (200 ml), el PBS se vierte de las placas, que después se secan por contacto con una toalla de papel para retirar el exceso de líquido. Las superficies inferiores de las placas de microtitulación se frotan suavemente con un papel facial húmedo y después se frotan de nuevo con un papel facial seco, y se lee la absorbancia a 492 nm. Antes de que puedan secarse las monocapas, a cada pocillo se le añaden 0,1 ml de una solución de violeta de cristal al 0,1% en PBS (pasada primero a través de un filtro de 0,2 mm). Las placas después se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos, se lavan minuciosamente 5 veces con PBS, se retira el exceso de líquido como se ha descrito anteriormente y se lee de nuevo su absorbancia a 492 nm antes de que las monocapas puedan secarse. La resta de las densidades ópticas antes y después de la tinción proporciona valores debidos a la tinción con violeta de cristal y, por lo tanto, está relacionada con las cantidades de monocapa celular presente en los pocillos. Estos valores se usan para corregir los valores de AEC.

B. Ensayo Elisa de células VCAM-1, ICAM-1 y E-selectina en células endoteliales

El ensayo se basa en un método Elisa de células de 96 pocillos que usa la línea celular endotelial microvascular humana HMEC-1 y las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Las células se pretratan durante cuatro horas con el compuesto de ensayo, se estimulan durante las siguientes 6-16 horas con TNFá, después se fijan con paraformaldehído para la posterior evaluación de la expresión de VCAM-1, ICAM-1 o E-selectina mediante una técnica indirecta de tinción con inmunoperoxidasa. Los efectos citotóxicos se determinan contando el número relativo de células (tinción nuclear Giemsa) después de la exposición a las substancias de ensayo, en comparación con los pocillos de control (sólo disolvente y medio). Los compuestos se consideran positivos si presentan una inhibición de VCAM-1, ICAM-1 o E-selectina \geq50%, con <25% de pérdida celular.

\newpage

Metodología I. Línea celular

El ensayo de VCAM-1 e ICAM-1 utiliza una línea de células endoteliales microvasculares humanas inmortalizadas (antígeno T grande del virus SV-40) (HMEC-1; Ades et al., J. Invest. Dermatol. 99: 683-690, 1992). Las células HMEC-1 expresan constitutivamente bajos niveles de ICAM-1, que están regulados positivamente por mediadores inflamatorios. Sin embargo, sólo expresan VCAM-1 después de la estimulación con citoquinas. Se realizaron experimentos de dosis-respuesta y de transcurso de tiempo para determinar las condiciones óptimas para inducir la expresión de VCAM-1 e ICAM-1.

II. Condiciones de crecimiento

Se cultivan células HMEC-1 en matraces T-75 (Nunc) en condiciones convencionales (37ºC, 5% de CO_{2}) con 1,5 x 10^{6} células/ml de medio de cultivo (CM = medio basal de células endoteliales [EBM; Clonetics] suplementado con un 10% de FCS, 10 ng/ml de EGF humano (Boehringer), 1 mg/ml de hidrocortisona (Sigma Nº 0888), 2,2 g/l de NaHCO_{3}, Hepes 15 mM, 0,11 g/l de piruvato sódico, glutamina 4 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina). Después de una tripsinización suave (0,25% de tripsina + 0,1% de EDTA durante 8 minutos) y de la resuspensión, las células se vuelven a sembrar cada 2-3 días a una relación de división de 1:3.

III. Elisa de células VCAM-1 e ICAM-1

Se pre-recubren placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano con fibronectina bovina (FN, Sigma Nº F1141) y después se siembran con 2 x 10^{4} células/pocillo en 200 ml de medio de crecimiento EBM y se incuban durante una noche. Al día siguiente, el medio de cultivo (CM) se reemplaza inicialmente por 200 ml/pocillo de medio de ensayo EBM (CM suplementado con un 5% de FCS en lugar de un 10%) y posteriormente se reemplaza con 180 ml de medio que contiene (1) concentraciones apropiadas del compuesto de ensayo, (2) concentraciones correspondientes de disolvente/medio extraído con metanol o (3) medio de ensayo EBM solo e incubado durante 4 horas a 37ºC. Cada ensayo de 96 pocillos se realiza con pocillos por duplicado. Las células después se estimulan por la adición de 20 ml de solución de citoquina concentrada (2000 U/ml de TNFa) y se incuban durante 16 horas a 37ºC.

La monocapa de células después se lava con paraformaldehído al 1% en medio EBM, se fija en paraformaldehído al 2% durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA) y se aclara varias veces con PBS. La PBS se retira de las células y la monocapa se incuba durante 30 minutos en PBS que contiene un 10% de suero de cabra normal (NGS). La solución de NGS se reemplaza por 100 ml/pocillo del anticuerpo monoclonal anti-VCAM-1 o ICAM-1 y se incuba durante una noche a 4ºC. Después, la solución de mAb se retira y las células se aclaran varias veces con PBS, seguido de incubación con PBS que contiene un 10% de NGS durante 30-60 minutos a TA. La solución de NGS se retira y se añaden 100 ml de anticuerpo F(Ab')2 de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Tago; dilución 1:500 en PBS que contiene un 5% de NGS) y las placas se incuban durante 1 hora a TA. Después se retira el anticuerpo secundario y las células se aclaran en PBS, que después se reemplaza por 150 ml/pocillo de una solución de AEC recién preparada y filtrada (3-amino-9-etil-carbazol; Sigma) y las placas se incuban durante 45-60 minutos a TA. El substrato de peroxidasa se retira y las células se aclaran en PBS. Los valores de absorbancia AEC se leen en un lector de placas de microtitulación a 550 nm y se corrigen con respecto al "blanco" o los valores de referencia a 690 nm.

IV. Ensayo de E-selectina

El ensayo de E-selectina se realiza usando células HUVEC recién aisladas, esencialmente como se describe para el ensayo de VCAM-1 o ICAM-1, con la excepción de la estimulación con TNFa más corta (6-8 horas).

V. Medición de la citotoxicidad (Pérdida de células basada en la tinción nuclear)

Las células endoteliales se destiñen reemplazando el PBS por etanol al 95% durante 20 minutos (dos cambios de 10 minutos) con control por medio de una evaluación microscópica. Las células después se aclaran en agua destilada (Aquadest) y la monocapa se cubre con una solución de Giemsa al 33% en Aquadest durante 5 minutos a TA. Los pocillos después se lavan con Aquadest en aire seco durante al menos 15 minutos. Se usa evaluación microscópica para comprobar que sólo se tiñen los núcleos, sin que se produzca esencialmente ninguna tinción citoplásmica. Los valores de absorbancia Giemsa se leen en un lector de placas de microtitulación a 550 nm y se corrigen con respecto a los valores "blanco" (filas sin células) a 690 nm.

VI. Evaluación de los datos

Los valores de AEC para la expresión constitutiva de VCAM-1 o E-selectina (pocillos de control no estimulados) son esencialmente iguales a los de un mAb de control de isotipo similar y representan la tinción de fondo. En todas las placas de 96 pocillos, el valor constitutivo medio se resta del valor de AEC medio para cada grupo estimulado con citoquina (EBM y controles de disolvente, así como substancia de ensayo), obteniéndose un número que representa la expresión de la molécula de adhesión celular (CAM) ICAM-1 regulada positivamente y VCAM-1 inducible o E-selectina (denominándose este valor AEC-CAM). Cada valor de AEC-CAM después se divide por el valor Giemsa medio correspondiente, obteniéndose un número que estima los niveles relativos de expresión de CAM para una densidad celular dada, basándose en el número de núcleos (denominándose dicho número relación AEC:Giemsa).

AEC (estimulado) - AEC (no estimulado) = AEC-CAM

AEC-CAM/Giemsa = relación AEC:Giemsa

Por lo tanto, los valores de IC_{50} de CAM "reales" se determinan comparando los valores de AEC:Giemsa para una substancia de ensayo con los del control estimulado (EBM, disolvente). Estos valores después se analizan con respecto a los valores de IC_{50} para Giemsa sólo. Los criterios estrictos determinan si el perfil de inhibición de CAM frente a la citotoxicidad (Giemsa) indica un objetivo "real" que debería perseguirse.

C. Ensayo de proliferación de células HaCat

Se cultivan células HaCat en DMEM (Gibco Nº 074-02100) suplementado con 2,2 g/l de NaHCO_{3}, 0,11 g/l de piruvato sódico, Hepes 15 mM, suero de ternero fetal (FCS) al 5%, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y glutamina (para aumentar la concentración final en 4 mM). Para el ensayo de proliferación, las células se separan por tripsinización, se suspenden en medio nuevo y se siembran en placas de microtitulación de 96 pocillos a una densidad final de 4000 células/0,2 ml/pocillo. Después de 24 horas (día 0), el medio se reemplaza por medio nuevo que contiene concentraciones graduadas de compuesto de ensayo. Después de 3 días de incubación a 37ºC/5% de CO_{2}, se mide el grado de proliferación celular en comparación con los controles de disolvente por medio de un ensayo colorimétrico que mide la masa celular relativa usando el colorante sulforrodamina B (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107-1112). El "número de células de partida" se determina midiendo la masa celular relativa en el día 0. Los resultados se expresan como % de inhibición = 100 - % de absorbancia de control (donde control de disolvente = 100%) y representan la media \pm desviación típica de tres medidas. Se representa una curva de dosis-respuesta semilogarítmicamente y se determina la concentración requerida para la inhibición semimáxima (IC_{50}) por interpolación lineal. La inhibición máxima sin una pérdida neta de células se representa por el "número de células de partida" y normalmente está comprendido entre el 90 y el 98%.

D. Inhibición de liberación de TNF

I.

Se preparan células mononucleares a partir de la sangre periférica de voluntarios sanos usando separación por densidad de ficoll-hypaque de acuerdo con el método de Hansell et al. (J. Imm. Methods (1991) 145: 105.) y se usan a una concentración de 10^{5} células/pocillo en RPMI 1640 más un 10% de FCS. Las células se incuban con diluciones en serie de los compuestos de ensayo durante 30 minutos a 37ºC antes de la adición de IFN\gamma (100 U/ml) y LPS (5 mg/ml), y posteriormente se incuban adicionalmente durante 3 horas. La incubación se termina por centrifugación a 1400 RPM durante 10 minutos. El TNF\alpha en el sobrenadante se mide usando un ELISA comercial (Innotest hTNF\alpha, disponible en Innogenetics N. V., Zwijnaarde, Bélgica). Los compuestos se ensayan a concentraciones de 0 a 10 mM. Los compuestos ilustrados de fórmula I, especialmente los compuestos preferidos de fórmula I_{p}, I_{p}', I_{p}'', VII, IX y X, suprimen la liberación de TNF en este ensayo con una IC_{50} de aproximadamente 5 hasta aproximadamente ... nM.

II. Citotoxicidad

La citotoxicidad se determina en células THP1 (5 x 10_{4}/pocillo) que se incuban en presencia de IFN\gamma (100 U/ml) y LPS (5 mg/ml) y en presencia y ausencia de compuesto de ensayo durante 24 horas a 37ºC. Los porcentajes de células vivas y muertas se evalúan por una lectura colorimétrica (MTT), que mide las enzimas deshidrogenasas mitocondriales de células vivas, como se describe en Mosman, J. Imm. Methods (1983) 65: 55. Los compuestos preferidos de la invención típicamente tienen una citotoxicidad comparativamente baja cuando se miden en este ensayo, por ejemplo, una IC_{50} de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1000 nM.

Claims

1. Un compuesto de fórmula I_{p}

22

en la que:

B_{p} es un resto de ácido octanoico \alpha-amino-\gamma-metil- substituido;

R_{1p} es hidrógeno o metilo;

2. Un compuesto de fórmula I_{p}'

23

en la que B_{p}, R_{1p}, C_{p}, X_{p} e Y_{p} son como se han definido en la reivindicación 1 y A'p es un resto de ácido butírico \alpha-hidroxi-substituido que está substituido en posición \gamma con un grupo de fórmula VI

24

3. Un compuesto de fórmula I_{p}''

25

en la que B_{p}, R_{1p}, C_{p}, X_{p} e Y_{p} son como se han definido en la reivindicación 1 y A_{p}'' es un resto de ácido butírico \alpha-hidroxi substituido, que está substituido en posición \gamma con un grupo de fórmula VII

26

\newpage

4. Un ciclopeptólido de fórmula VIII, IX o X en forma libre o de sal

27

28

29

5. Cepa fúngica F/94-499709 depositada como DSM 10275, como se ha descrito anteriormente en este documento.

6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como un agente farmacéutico.

7. Una composición terapéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

\newpage

8. El uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para aplicación terapéutica al tratamiento o profilaxis de una enfermedad que implica niveles elevados de expresión de moléculas de adhesión y/o que está mediada por TNF.