SK65698A3 - Cyclopeptolides - Google Patents

Cyclopeptolides Download PDF

Info

Publication number
SK65698A3
SK65698A3 SK656-98A SK65698A SK65698A3 SK 65698 A3 SK65698 A3 SK 65698A3 SK 65698 A SK65698 A SK 65698A SK 65698 A3 SK65698 A3 SK 65698A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
formula
compounds
substituted
group
leu
Prior art date
Application number
SK656-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Dreyfuss
Theodor Fehr
Carolyn A Foster
Dieter Geyl
Berndt Oberhauser
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27267982&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK65698(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB9523744.2A external-priority patent/GB9523744D0/en
Priority claimed from GBGB9604406.0A external-priority patent/GB9604406D0/en
Priority claimed from GBGB9613990.2A external-priority patent/GB9613990D0/en
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of SK65698A3 publication Critical patent/SK65698A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K11/02—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof cyclic, e.g. valinomycins ; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/15—Depsipeptides; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Description

Vynález sa týka cyklopeptolidov a ich terapeutického využitia . ako inhibítorov expresie adhéznych molekúl.
* Doterajší stav techniky
Bunkové adhézne molekuly ako sú ICAM-1, VCAM-1 a E-selektín sa exprimujú na povrchu endotelových buniek, a keratinocytov pre ICAM1, ako odozva na prozápalové mediátory vrátane TNFa, IFNy, IL1 a LPS. Zodpovedajúce protiligandy, napríklad LFA-1, VLA-4 a SLEX, sa exprimujú na povrchu cirkulujúcich krviniek. Transendotelová migrácia leukocytov počas zápalových procesov, práve tak ako extravaskulárna interakcia bunka-bunka, sa regulujú v dôsledku interakcií medzi týmito adhéznymi molekulami a ich protiligandami. Inhibítory expresie adhéznych molekúl ponúkajú preto možnosti liečby mnohých chorobných stavov.
Cyklopeptolidy sú cyklické molekuly, ktoré obsahujú - aminokyselinové zvyšky navzájom spojené peptidovými väzbami, a ktoré ďalej obsahujú aspoň jeden zvyšok hydroxykarboxylovej kyseliny, ktorej hydroxyskupina je pripojená k ďalšiemu kyselinovému zvyšku esterovou väzbou.
V súbežnej medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/03430 sa opisujú nové cykloheptapeptolidy, ktoré inhibujú expresiu ICAM-1, VCAM-1 a E-selektínu. Teraz sme objavili ďalšie nové cykloheptapeptolidy rovnakého typu, z ktorých niektoré sa vyznačujú obzvlášť žiadanými vlastnosťami.
Podstata vynálezu
Vynález sa týka cykloheptapeptolidov vzorca I j—A—B—R1 Leu—Leu—C—X—Y—| (I)
A je zvyšok glykolovej kyseliny pripadne α-substituovaný metyB
R1
C lovou skupinou, etylovou skupinou alebo vinylovou skupinou, ktoré sú pripadne substituované atómom halogénu, alkoxyskupinou, voľnou alebo chránenou hydroxyskupinou, voľnou alebo chránenou aminoskupinou, skupinou -CSNH2, skupinou -COOR2, vinylovou skupinou alebo skupinou -OCH alebo tiazolovou skupinou, kde R2 je atóm vodíka alebo nižšia alkylová skupina prípadne substituovaná alkylovou skupinou, atómom halogénu, cykloalkylovou skupinou, nesubstituovanou alebo substituovanou tiazolovou skupinou, skupinou COOR2 alebo skupinou -Cs=CH, kde R2 je definované vyššie;
je zvyšok a-amino-y-metylsubstituovane j oktánovej kyseliny;
je atóm vodíka alebo metylová skupina;
je zvyšok tryptofánu alebo N-metyltryptofánu vzorca II
(II) kde R2 je atóm vodíka, alkoxyskupina, alkylová skupina alebo benzylová skupina, R^ je atóm vodíka alebo atóm halogénu, R2 je atóm vodíka alebo metylová skupina a symbol --- znamená jednoduchú alebo dvojitú väzbu;
/X. je zvyšok α-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 14 atómov uhlíka; a
Y je zvyšok α-amino- alebo N-metyl-a-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, za predpokladu, že A nie je zvyšok nesubstituovanej a-hydroxymaslovej kyseliny a že ak A je zvyšok glykolovej kyseliny, ktorá je α-substituovaná etylovou skupinou, môže byť táto etylová skupina prípadne substituovaná iba aminoskupinou, hydroxyskupinou, atómom chlóru, alkoxyskupinou, nesubstituovanou alebo prípadne substituovanou tiazolovou skupinou, nesubstituovanou alebo prípadne substituovanou vinylovou skupinou, cyklopropylovou skupinou, skupinou -CSNH2 alebo skupinou -C=CH.
Vo vzorci I sú väzby N-terminálne-C-terminálne vo zvyškoch aminokyselín usporiadané v smere hodinových ručičiek a peptolidová esterová väzba sa nachádza medzi zvyškami A a Y. Ak R1 je metylová skupina, R^-Leu znamená N-metylleucínový zvyšok a Leu znamená leucinový zvyšok.
Je výhodné, ak A je zvyšok kyseliny glykolovej, ktorá je v α-polohe substituovaná metylovou skupinou alebo etylovou skupinou, ktorá je prípadne substituovaná aminoskupinou, hydroxyskupinou, atómom chlóru, alkoxyskupinou, nesubstituovanou alebo substituovanou tiazolovou skupinou, nesubstituovanou alebo substituovanou vinylovou skupinou, cyklopropylovou skupinou, skupinou -CSNH2 alebo skupinou -ChCHZvyšok C je s výhodou N-metyltryptofánový zvyšok vzorca II, v ktorom R3 je atóm vodíka, alkoxyskupina, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka (obzvlášť metoxyskupina) alebo alkylová skupina, a R4 je atóm vodíka alebo atóm halogénu.
Zvyšok X je s výhodou zvyšok α-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 4 až 8 atómov uhlíka a ktorá je pripadne β- alebo γ-substituovaná alkylovou skupinou, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka. Najvýhodnejšie je X zvyšok a-aminooktánovej alebo α-aminomaslovej kyseliny, substituovanej v polohe β alebo γ alkylovou skupinou, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka, najmä metylovou skupinou.
Zvyšok Y je s výhodou zvyšok N-metyl-a-aminokarboxylovéj kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 4 atómy uhlíka a ktorá je prípadne substituovaná v polohe βalebo γalkylovou skupinou, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka. 'Najvýhodnejšie je Y zvyšok N-metylalanínu alebo N-metylvalínu.
Vynález zahŕňa necyklické peptidy alebo cyklické peptolidy zodpovedajúce zlúčeninám vzorca I, napríklad necyklické molekuly získané buď rozštiepením esterovej väzby medzi zvyškami Y a A alebo amidovej väzby medzi akýmkoľvek párom kyselinových zvyškov. Výhodnými necyklickými derivátmi sú zlúčeniny vzorca IV a V
H-C-X-Y-A-B-R1Leu-Leu.OR7
H-A-B-R^-Leu-Leu-C-X-Y. OR7 (IV) (V) kde R7 je atóm vodíka alebo alkylová skupina, napríklad nižšia alkylová skupina, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka.
Jednými z výhodných zlúčenín podľa vynálezu sú zlúčeniny vzorca Ip
Ap Bp Rp1Leu Leu Cp Xp Yp (Ip) kde
Ap je zvyšok glykolovej kyseliny prípadne α-substituovanej metylovou skupinou;
Bp je zvyšok a-amino-y-metylsubstituovanej oktánovej kyseliny;
Rp- je atóm vodíka alebo metylová skupina;
Cp je zvyšok tryptofánu alebo N-metyltryptofánu, ktorý je prípadne substituovaný N'-alkoxyskupinou, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka;
Xp je zvyšok a-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 14 atómov uhlíka; a
Yp je zvyšok α-amino- alebo N-metyl-a-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, -ktorá obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka.
Výhodné sú aj ďalšie zlúčeniny podlá vynálezu vzorca Ip'
Ap Bp Rp1Leu Leu Cp Xp Yp (Ip') kde Bp, Rp1, Cp, Xp a Yp sú definované vyššie a Ap' je zvyšok a-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej, ktorá je γ-substituovaná skupinou vzorca VI
kde R^ je nižšia alkylová skupina, napríklad alkylová skupina, ktorá obsahuje·1 až 4 atómy uhlíka.
Najvýhodnejšie je R2 metylová alebo etylová skupina.
Veľmi výhodné sú aj zlúčeniny, podľa vynálezu vzorca Ip'' —Ap—Bp—Rp1 Leu—Leu—Cp—Xp—Yp—
kde Bp, Rp1/ Cp, Xp a Yp sú definované vyššie a Ap'z je zvyšok α-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej, ktorá je v γ-polohe substituovaná skupinou vzorca VII
(VII) kde je atóm vodíka, nižšia alkylová skupina alebo fenylová skupina, alebo tvorí . karbocyklický kruh spolu s polohou 5 tiazolového kruhu.
Zlúčeniny vzorca I, IV, V, I,
sa budú ďalej označovať ako zlúčeniny podía vynálezu, pričom tento termín zahŕňa všetky zlúčeniny podía vynálezu vo volnej forme ako aj vo forme solí alebo esterov.
Zlúčeniny podía vynálezu obsahujú asymetrické atómy a môžu teda existovať v mnohých epimérnych formách. Vynález sa týka všetkých možných epimérov ako aj ich diastereomérnych zmesí. Pritom sú výhodné epiméry, ktoré sa vyznačujú inhibíciou expresie adhéznych molekúl. Napríklad na farmaceutické využitie podía vynálezu sa vo všeobecnosti preferujú epiméry, ktoré inhibujú expresiu adhéznych molekúl v čistej, alebo v podstate čistej forme (t. j. neobsahujú, alebo v podstate neobsahujú epiméry neinhibujúce expresiu adhéznych molekúl) , ktoré napríklad obsahujú najmenej 90 %, napríklad najmenej 95 %, aktívneho epiméru (t. j. obsahujú menej než 10 %, napríklad menej než 5 %, inaktivneho epiméru) . Najvýhodnejšie majú zlúčeniny podľa vynálezu rovnakú stereochemickú konformáciu cyklopeptidového kruhu ako má obzvlášť výhodná zlúčenina vzorca VIII uvedená nižšie.
Obzvlášť výhodné zlúčeniny podľa vynálezu sú zlúčeniny vzorca
VIII, IX a X
Zlúčenina vzorca VIII sa izolovala z kultúr húb kmeňa F/94-499709, ktorého vzorky sú deponované v DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen podlá ustanovení Budapeštianskej dohody z 18. septembra 1995 a vedú sa pod položkou DSM 10275. Charakteristiky kmeňa F/94-499709 sa opisujú nižšie v príklade 1. Zlúčenina vzorca VIII je vyslovene predmetom patentu.
Vzorky kmeňa F/94-499709 možno získať aj od firmy Sandoz Ltd., CH-4002, Bazilej, Švajčiarsko.
Poznamenávame, že prístup k vzorkám DSM 10275 je obmedzený v súlade s ustanoveniami bodu 28(4) a (5) EPC.
Vynález zahŕňa kmeň F/94-499709 (DSM 10275) v izolovanej forme, jeho mutanty a deriváty, a všetky nové cyklopeptolidy, ktoré tento kmeň produkuje.
Zlúčenina vzorca VIII a príbuzné zlúčeniny sa môžu získať kultiváciou kmeňa F/94-499709 (DSM 10275) alebo jeho mutantov alebo derivátov, alebo kultiváciou podobných fungálnych druhov v živnom prostredí a následnou izoláciou, ako sa napríklad opisuje v príklade 2.
Charakteristiky zlúčeniny vzorca VIII sa uvádzajú v príklade
3.
Zlúčeniny podlá vynálezu možno pripraviť derivatizáciou zlúčenín vzorca XI alebo XII (ako sa opisuje ďalej) alebo zlúčeniny vzorca VIII nasledovným spôsobom:
a) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -COOR2, sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, v ktorých A je substituované skupinou -CN, nechajú reagovať s nukleofilmi, s výhodou s alkoholmi, v prítomnosti vhodného bázického alebo kyslého katalyzátora, s výhodou kyseliny chlorovodíkovej, v organických rozpúšťadlách, s výhodou v éteri, alebo
b) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované alkoxymetylovou skupinou, sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH2OH, nechajú reagovať s alkylačnými činidlami, ako sú alkylhalogenidy alebo diazozlúčeniny, v prítomnosti·katalyzátora alebo bez neho, alebo
c) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -COOR2, sa esterifikujú zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -COOH, pričom sa použijú štandardné metódy, s výhodou prevedením na acylchlorid, napríklad pôsobením tionylchloridu, a následným pôsobením vhodného alkoholu v prítomnosti látky viažucej kyseliny alebo bez nej, alebo -
d) · na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou
-CH2OH, sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -COOR^, redukujú kovovými hydridmi alebo borohydridmi, s výhodou s komplexom boránu s dimetylsulfidom, v organických rozpúšťadlách, alebo
e) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované vinylovou skupinou, ktorá je prípadne substituovaná, sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CHO, nechajú reagovať s Wittigovym činidlom, alebo
f) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH2NH2, sa redukujú zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH2N3, alebo
g) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -C=CH, sa dehydrogenujú zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH=CBr2, alebo
h) na prípravu zlúčenín všeobecného vzorca I, kde A je substituované cyklopropylovou skupinou, sa zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované vinylovou skupinou, podrobia reakcii s diazometánom, alebo
i) na prípravu zlúčenín všeobecného vzorca I, kde A je substituované skupinou -CSNH2, sa zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CN, nechajú reagovať so sírnymi derivátmi, obzvlášť s difenylfosfinoditiovou kyselinou, napríklad refluxovaním roztoku sírnej zlúčeniny so zlúčeninou vzorca I, kde A je substituované skupinou -CN, alebo
j) na prípravu výhodných zlúčenín vzorca Ip''
Bp Rp1Leu Leu C p Xp Yp
dp) kde substituenty sú definované vyššie, sa zlúčenina vzorca Ip, v ktorom Ap je zvyšok α-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej substituovanej v polohe γ skupinou -CSNH2, nechá reagovať s α-halogénkarbonylovou zlúčeninou vzorca XIII
Hal-CH2~CO-R6 (XIII) kde je definované vyššie a Hal je atóm halogénu, alebo s acetálom zlúčeniny XIII (reakcia sa môže uskutočniť pomocou známych postupov, napríklad reakciou zlúčeniny vzorca II v rozpúšťadle, ktoré je pri použitých reakčných podmienkach nereaktívne, napríklad v dimetylformamide alebo v pyridíne, pri zvýšenej teplote, s výhodou pri teplote 60 - 100° C, pričom konečné produkty sa môžu následne izolovať a čistiť bežnými metódami), alebo
k) na prípravu výhodných zlúčenín vzorca Ip'
Ap Bp Rp1Leu Leu Cp Xp Yp dp') kde substituenty sú definované vyššie, sa zlúčenina vzorca Ip', kde Ap' je zvyšok α-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej substituovanej v polohe γ skupinou -CHO, nechá reagovať s alkoxykarbonylmetyléntrifenylfosforánom a zlúčenina vzorca Ip' sa izoluje, alebo
l) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde je atóm vodíka, sa zo zlúčenín vzorca I, kde R^ je skupina -OCH3, odstráni metoxyskupina, alebo
m) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde symbol --- znamená jednoduchú väzbu, sa redukujú zlúčeniny vzorca I, kde symbol --- znamená dvojitú väzbu, alebo
n) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde R2 je alkylová alebo benzylová skupina, sa tieto skupiny zavedú do zlúčenín vzorca I, kde R^ je atóm vodíka, alebo
o) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde R^ je atóm halogénu, sa zlúčeniny vzorca I, kde je atóm vodíka, podrobia halogenácii, alebo
p) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde R2 je alkoxylová skupina a symbol --- znamená dvojitú väzbu, sa zlúčeniny vzorca I, kde
R^ je atóm vodíka a symbol --- znamená jednoduchú väzbu, nechajú reagovať s wolframanom alkalického kovu a peroxidom vodíka a N-hydroxyindolový medziprodukt sa následne alkyluje, a podlá potreby sa zlúčenina vzorca I izoluje.
Zlúčeniny vo vyššie uvedených výhodných postupoch a) až i) sú zlúčeniny vzorca I, v ktorých A je zvyšok kyseliny a-hydroxymaslovejktorá je v polohe γ substituovaná skupinou -COOR2, skupinou -CN, alkoxymetylovou skupinou, skupinou -CH2OH, skupinou -COOH, substituovanou alebo nesubstituovanou vinylovou skupinou, skupinou -CHO, skupinou -CH2NH2, skupinou -CH2N3, skupinou -C=CH, skupinou -CH=CBr2 alebo cyklopropylovou skupinou alebo vinylovou skupinou.
Medziprodukty na prípravu zlúčenín vzorca I možno pripraviť nasledovne:
(i) na prípravu medziproduktov, kde A je substituované skupinou -CHO, oxidáciou zodpovedajúcich zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH2OH, a (ii) na prípravu medziproduktov, kde A je substituované skupinou
-COOH, zo zodpovedajúcich zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -COOAlkyl, ich hydrolýzou minerálnou kyselinou, napríklad kyselinou chlorovodíkovou vo vodnom alkohole, alebo bázou.
Medziprodukty na . prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -CN, zahŕňajú prírodné látky. Napríklad zlúčeniny vzorca XI a XII
Í3 sa získajú izoláciou z kultúr kmeňa F92-4471/01 uloženého v US Department of Agriculture, NRRL zbierka kultúr podľa ustanovenia Budapeštianskej dohody z 2. júla 1993 a vedeného pod číslom NRRL 21123. Charakteristiky kmeňa F91-4471/08 a izolácia zlúčenín XI a XII sa podrobne opisujú v našej súbežnej medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/034309.
Zlúčeniny podľa vynálezu sa môžu pripraviť aj chemickou syntézou, napríklad použitím obvyklých techník syntézy peptidov. V závere syntézy je typický cyklizačný stupeň, v ktorom sa lineárny peptid alebo peptolid, ktorý obsahuje zvyšky kyselín A, B, R^Leu, Leu, C, X a Y viazané spoločne v príslušnom poradí, cyklizuje reakciou, pri ktorej sa tvorí amidová alebo esterová väzba.
Vynález sa teda týka aj spôsobu prípravy cyklických peptolidov vzorca I, ktorý zahŕňa cyklizáciu lineárneho peptidu alebo peptolidu, ktorý obsahuje zvyšky kyselín A, B, R^Leu, Leu, C, X a Y viazané spoločne v príslušnom poradí.
Zlúčeniny podľa vynálezu sa vyznačujú farmakologickou aktivitou a sú preto využiteľné ako farmaceutiká, obzvlášť preto, že sú inhibítormi stimulovanej expresie bunkových adhéznych molekúl, obzvlášť VCAM-1 v porovnaní s expresiou E-selektínu a ICAM-1. Zlúčeniny podľa vynálezu sú aj inhibítormi uvoľňovania TNF, napríklad uvoľňovania TNFa.
Testy, ktoré možno použiť pri stanovení inhibície expresie ICAM-1, VCAM-1 a E-selektínu a inhibície uvoľňovania TNFa zlúčeninami podľa vynálezu, sa opisujú za príkladmi uskutočnenia.
Pretože zlúčeniny podľa vynálezu sú aktívne ako inhibítory expresie bunkových adhéznych molekúl, sú užitočné pri liečbe alebo profylaxii chorobných procesov, zahŕňajúcich expresiu bunkových adhéznych molekúl. Takéto chorobné procesy nastávajú pri mnohých získaných alebo dedičných chorobách alebo poruchách, pri ktorých v patogénnom procese zohrávajú významnú úlohu aktivácia a transport leukocytov. Sú to najčastejšie akútne i chronické zápaly (napríklad alergie, astma, dermatitída, psoriáza, reperfúzne poranenia a septický šok), autoimúnne stavy (napríklad diabetes, roztrúsená skleróza a reumatická artritída) a imúnne sprostredkovaná neurodegenerácia (napríklad získané imunodeficientné poruchy). Ďalšie indikácie zlúčenín podlá vynálezu zahŕňajú metastázy nádorov (napríklad melanóm alebo' osteokarcinóm), aterosklerózu a odmietanie aloimplantátov alebo xenoimplantátov, pretože je známe, že inhibícia vaskulárnych adhéznych molekúl môže do veľkej miery zlepšiť prognózu u týchto procesov.
Zlúčeniny podľa vynálezu sú terapeuticky nádejné aj u hyperproliferačných kožných ochorení (napríklad u psoriázy), práve tak ako u rôznych malignít, pretože sa vyznačujú inhibičnou aktivitou v submikromolárnych koncentráciách pri 72 hodinovom testovaní v testoch, ktoré používajú keratinocyty, alebo v iných proliferačných testoch.
Zlúčeniny podľa vynálezu sú aktívne pri inhibícii tvorby HIV v monocytickej bunkovej línii Ul, vyvolanej TNFa/IL-6, ako sa vyhodnotilo p 24 ELISA testom, a preto sú použiteľné pri liečbe imunodeficiencií a ochorení spôsobených vírusmi, obzvlášť pri liečbe AIDS.
Pre svoju schopnosť inhibovať uvoľňovanie TNF sú zlúčeniny podľa vynálezu ďalej vhodné na profylaxiu alebo liečbu ochorení alebo patologických stavov sprostredkovaných TNF, najmä TNFa, napríklad zápalových stavov, autoimúnnych ochorení, ťažkých infekcií a odmietavej reakcii aloimplantátov i xenoimplantátov, napríklad pri transplantáciách srdca, pľúc, srdca a pľúc, pečene, obličiek, pankreasu, kože alebo rohovky, a na prevenciu ochorení z odmietania implantátu príjemcom ako napríklad pri transplantácii kostnej drene.
Zlúčeniny podľa vynálezu sú obzvlášť užitočné pri liečbe, prevencii alebo zlepšovaní autoimúnnych ochorení a zápalových stavov, obzvlášť zápalových stavov s etiológiou zahŕňajúcou autoimunitnú zložku, ako sú artritída (napríklad reumatická artritída, arthritis chronica progrediente a arthritis deformans) a reumatické ochorenia. Špecifické autoimúnne choroby, pri ktorých sa látky podlá vynálezu môžu použiť, zahŕňajú autoimúnne hematologické poruchy (vrátane napríklad hemolytickej anémie, aplastickej anémie, jednoduchej anémie červených krviniek a idiopatickej trombocytopénie), systematický lupus erythematodes, polychondritídu, sklerodermiu, Wegenerovu granulomatózu, dermatomyozitózu, chronickú aktívnu hepatitídu, myasténiu gravis, psoriázu, Stevenov-Johnsonov syndróm, idiopatickú sprue, autoimúnne zápalové ochorenie čriev (vrátane napríklad ulceratívnej kolitídy a Crohnovej choroby), endokrinnú oftalmopatiu, Gravesovu chorobu, sarkoidózu, roztrúsenú sklerózu, primárnu biliárnu cirhózu, juvenilný diabetes (ďiabetes mellitus typu I), uveitídu (anterior i posterior), keratoconjunctivis sicca a vernálnu keratokojuktivitídu, intersticiálnu fibrózu pľúc, psoriatickú artritídu a glomerulonefritídu (s nefrotickým syndrómom alebo bez neho, napríklad vrátane idiopatického nefrotického syndrómu alebo nefropatie s malými zmenami).
Zlúčeniny podlá vynálezu sú prospešné aj pri liečbe, prevencii alebo zlepšení chorôb ako sú astma, bronchitída, pneumokonióza, rozdutie pľúc a iné obštrukčné alebo zápalové choroby dýchacích ciest.
Zlúčeniny podľa vynálezu sú ďalej užitočné pri liečbe nežiaducich akútnych a hyperakútnych zápalových reakcií sprostredkovaných TNF, obzvlášť TNFa, napríklad akútnych infekcií, napríklad septického šoku (napríklad endotoxického šoku a syndrómu respiračnej tiesne v dospelosti) , meningitídy, zápalu pľúc, ťažkých popálenín a pri liečbe kachexie alebo syndrómu vyčerpania spojeného s morbídnym uvoľňovaním TNF po infekciách, rakovine alebo dysfunkcii orgánov, obzvlášť kachexie pri AIDS, napríklad spojenej s infekciou HIV alebo po nej.
Vynález sa teda týka aj terapeutického využitia zlúčenín podlá vynálezu a liečebných prostriedkov obsahujúcich tieto zlúčeniny.
Vynález sa týka aj spôsobu liečby alebo profylaxie chorôb spojených s expresiou adhéznych molekúl, ktoré spočívajú v podávaní terapeutických alebo profylaktických dávok zlúčenín podľa vynálezu pacientovi.
Vynález sa týka aj liečebných prípravkov obsahujúcich terapeuticky účinnú dávku zlúčenín podlá vynálezu.
Vynález sa ďalej týka použitia zlúčenín podľa vynálezu na prípravu liečiv na liečenie alebo profylaxiu chorôb spojených s expresiou adhéznych molekúl.
Vynález sa týka aj nasledovných bodov:
A. Spôsob inhibície tvorby rozpustnej TNF, obzvlášť TNFa, alebo zníženie zápalu u pacienta (t. j. u cicavca, obzvlášť u človeka), ktorého stav to vyžaduje, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu, alebo spôsob liečby ktoréhokoľvek z vyššie uvedených stavov, obzvlášť spôsobu liečby zápalových alebo autoimúnnych chorôb alebo stavov, napríklad roztrúsenej sklerózy alebo reumatickej artritídy, alebo zmiernenie jedného či viacerých symptómov ktoréhokoľvek z uvedených stavov.
B. Použitie zlúčenín podľa vynálezu ako liečiv, napríklad na profylaxiu alebo liečbu chorôb alebo patologických stavov sprostredkovaných TNF, napríklad ako imunosupresíva alebo protizápalové prostriedky na prevenciu, zmiernenie alebo liečbu ktoréhokoľvek z vyššie uvedených chorôb alebo stavov, napríkladautoimúnnych alebo zápalových chorôb alebo stavov.
C. Liečebné prostriedky obsahujúce zlúčeniny podľa vynálezu v spojení s farmaceutický prijateľnými riedidlami alebo nosičmi, napríklad na použitie pri profylaxii alebo liečbe chorôb alebo patologických stavov sprostredkovaných TNF, napríklad ako imunosupresíva alebo protizápalové prostriedky, alebo na po užitie pri prevencii, zmiernení alebo liečbe ktorejkoľvek z vyššie uvedených chorôb alebo stavov, napríklad autoimúnnych alebo zápalových ochorení alebo stavov.
D. Použitie zlúčenín podľa vynálezu pri príprave liečiv používaných na profylaxiu alebo liečbu chorôb alebo patologických stavov sprostredkovaných TNF, napríklad ako imunosupresíva alebo protizápalové prostriedky, alebo na prevenciu, zmiernenie alebo liečbu ktorejkoľvek z vyššie uvedených chorôb alebo stavov, napríklad autoimúnnych alebo zápalových ochorení alebo stavov.
Liečebné prostriedky sa môžu aplikovať parenterálne, orálne, vo forme aerosólu, formou inhalácie alebo topicky a zvyčajne obsahujú jeden alebo viacero farmaceutický prijateľných nosičov, riedidiel alebo excipientov a môžu obsahovať aj rôzne aditiva ako stabilizátory a podobne.
Použité dávky zlúčenín podľa vynálezu môžu byť rôzne a závisia okrem iného od stavu alebo charakteru choroby, od toho, či ide o liečbu alebo profylaxiu, ako aj od spôsobu a cesty aplikácie. Vo všeobecnosti možno povedať, že pri orálnej aplikácii sa dosiahli uspokojivé výsledky u dávok od asi 0,05 do asi 10 mg/kg/deň, najmä od asi 0,lrdo asi 7,5 mg/kg/deň, a najlepšie od asi 0,1 do asi 2 mg/kg/deň pri jednorazovej dávke alebo pri rozdelení do 2 až 4 dávok za deň. Pri parenterálnej aplikácii, napríklad vnútrožilovou infúziou, sa môžu použiť dávky od asi 0,01 do asi 5 mg/kg/deň, lepšie od asi 0,05 do asi 1 mg/kg/deň a ešte lepšie od asi 0,1 do asi 1 mg/kg/deň.
Vhodné denné dávky pre ľudských pacientov sú teda od asi 2,5 do asi 500 mg p. o., lepšie od asi 5 250 mg p. o. a ešte lepšie od asi 5 do asi 100 mg p. o., alebo od asi 0,5 do asi 250 mg i. v., lepšie od asi 2,5 do asi 125 mg i. v. a ešte lepšie od asi 2,5 do asi 50 mg i. v.
Zlúčeniny podlá vynálezu sa môžu aplikovať akýmkoľvek spôsobom, enterálne, parenterálne, topicky alebo inhaláciou. Vhodné formy na enterálne podanie sú roztoky (nápoje), tablety alebo tobolky. Vhodné parenterálne formy sú injekčné roztoky alebo suspenzie. Vhodné formy na topickú aplikáciu sú krémy, roztoky na potieranie a podobne s koncentráciou od 0,01 do 10 % hmotnostných, s . výhodou od 0,1 do 1 % hmotnostných. Vhodné jednotlivé dávky na orálne podávanie môžu obsahovať od 1 do 50 mg zlúčeniny, zvyčajne od 1 do 10 mg zlúčeniny.
Na ilustráciu vynálezu sa ďalej uvádzajú príklady, ku ktorým sú priložené nasledovné-obrázky:
Obr. 1 ukazuje UV spektrum zlúčeniny VIII.
Obr. 2 ukazuje IR spektrum zlúčeniny VIII.
Obr. 3 ukazuje FD-hmotnostné spektrum zlúčeniny VIII.
Obr. 4 ukazuje FD-hmotnostné spektrum (s prídavkom Lil) zlúčeniny VIII.
Obr. 5 ukazuje 1H-NMR spektrum zlúčeniny VIII v CDCI3.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Charakterizácia kmeňa F/94-499709 (DSM 10275)
Na charakterizáciu kmeňa F/94-499709 sa použije nasledovné prostredie (obsah zložiek sa udáva v % ako hmotnosť/objem v deionizovanej vode; sterilizácia teplom sa uskutočňuje počas 20 minút pri 121° C).
MEA: 2 % sladového extraktu, 0,4 % kvasnicového extraktu, 2 % agaru.
Kmeň F/94-499709 sa vyznačuje nasledovnými charakteristikami po bodovej inokulácii na MEA v Petriho miskách a inkubácii v tme:
Optimálna rastová teplota je medzi 24 a 30° C. Po 14 dňoch inkubácie dosiahnu kolónie priemer 25 až 32 mm pri teplote 24° C, 30 až 37 mm pri teplote 27° C a 7 až 15 mm pri teplote 33° C. Pri teplotách nad 37° C a pod 13° C kmeň F/94-499709 neprejavuje známky rastu.
Kolónie rastúce pri teplote 27° C v tme sú krémovo až svetložltohnedo sfarbené, ostávajú ploché alebo len slabo vypuklé a vo svojom strede majú malé obmedzene belavé až svetlosivé vzdušné mycélium. Môže byť dobre viditeľné radiálne zvrásnenie a pri pohľade zospodu môžu prevládať tmavšie sivé koncentrické zóny. Vzdušné i substrátové mycélium v starnúcich kultúrach môže byť tmavo sivé v stredných častiach kolónií, kým . okraje kolónií si zachovávajú krémovú alebo svetložltohnedú farbu.
Pri mikroskopickom pozorovaní sa nezistili žiadne sporulačné štruktúry a kmeň F/94-499709 sa teda tentatívne nazval mycélium sterilum.
Príklad 2
Fermentácia kmeňa F/94-499709
Pri príprave zlúčeniny vzorca VIII fermentáciou kmeňa F/94499709 sa používajú nižšie uvedené médiá a postupy. Ak sa neuvádza inak, obsah zložiek sa udáva v % ako hmôtnosť/objem v deionizovanej vode; sterilizácia teplom sa uskutočňuje počas 20 minút pri teplote 121° C.
PCM (médium na počiatočnú pasáž a intermediálne kultúry): 2 % sladového extraktu, 0,4 % kvasnicového extraktu, 0,1 % agaru.
PRM (produkčné médium): 2 % rozpustného škrobu, 0,5 % kvasnicového extraktu, 2 % glukózy, 2 % kukuričného výluhu, 0,5 % peptónu, 0,2 % uhličitanu vápenatého.
Počiatočné pasáže kultúr sa získajú rozmrazením 2 ml bunkovej suspenzie kmeňa F/94-499709 konzervovanej v kvapalnom dusíku, ich inokuláciou v 500 ml Erlenmayerovej banke obsahujúcej 200 ml PCM a inkubáciou v rotačnej trepačke pri 200 ot./min. a pri teplote 24° C počas 7 dní.
Primárna intermediárna kultúra sa získa inokuláciou štrnástich 500 ml Erlenmayerových baniek, z ktorých každá obsahuje 200 ml PCM, 5 ml počiatočnej pasáže pre každú banku.
Sekundárne intermediárne kultúry sa získajú inokuláciou dvoch 50 1 fermentačných tankov obsahujúcich PCM 1,4 1 primárnej intermediárnej kultúry 'pre každý tank. Fermentácia sa uskutočňuje počas 6 dní, pričom sa dodržiavajú nasledovné podmienky: teplota 24° C, 11 vzduchu/min/1 1 média, lopatkové miesadlá pri 150 ot./min a tlak 0,5 bar. Pri príprave zlúčeniny vzorca VIII a príbuzných látok sa každý z troch 500 1 fermentačných tankov obsahujúcich PRM inokuluje 13 1 sekundárnej intermediárnej kultúry. Fermentácia sa uskutočňuje pri dodržiavaní nasledovných podmienok: teplota 21° C, 1 1 vzduchu/min/1 1 média, lopatkové miešadlá spočiatku pri 100 ot./min, ktoré sa postupne zvyšujú na 150 ot./min a tlak 0,5 bar. Po 96 hodinách sa zo spojených 1 500 1 fermentačnej zmesi izolovala zlúčenina vzorca VIII a príbuzné látky.
Príklad 3
Izolácia peptolidu vzorca VIII z kmeňa F/94-499709
Fermentačná zmes (1 500 1) a 1 700 1 etylacetátu sa homogenizuje v reaktore Dyspax a intenzívne sa mieša počas 3 hodín. Organická fáza sa oddelí v separátore Westfalia. Tento extrakčný krok sa zopakuje a spojené organické fázy sa odparia pri zníženom tlaku. Získa sa 2 745 g extraktu, ktorý sa odmastí trojstupňovou extrakciou 40 1 zmesi metanol/voda v pomere 9 : 1 a 40 1 cyklohexánu. Metanolické frakcie sa spoja a odparia sa dosucha pri zníženom tlaku. Získaný odmastený extrakt (960 g) sa chromatografuje na kolóne Sephadexu LH-20 (15 kg) v metanole, pričom sa získa celkove 135 g frakcii obsahujúcich peptolid vzorca VIII. Celé toto množstvo (135 g) sa zmieša s 300 g silikagélu a takto impregnovaný silikagél sa pridá na vrch kolóny obsahujúcej 1,5 kg silikagélu (Merck, 0,04 - 0,063 mm) a podrobí sa chromatografii. Elúcia sa uskutočňuje postupne zmesou terc-butylmetyléter/cyklohexán v pomeroch 1 : 9, 2 : 8, 3 : 7, 4 : 6, 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3, 8 : 2 a 9 : 1 (po 1 1) , terc-butylmetyléterom (3 1) a zmesou tercbutylmetyléter/metanol v pomere 95 : 5 (31). Odoberajú sa frakcie s objemom 1 1, ktoré sa analyzujú pomocou HPLC a TLC. Frakcie č. 8 a 9 sa spoja a odparia dosucha. Kryštalizácia z éteru poskytne 21,9 g čistého peptolidu vzorca VIII. Ďalšia izolácia z materských lúhov a z frakcií č. 10 až 13 chromatografiou na 750 g silikagélu H (Merck) podobným spôsobom ako sa opisuje vyššie poskytne ďalší podiel kryštalického cyklopeptolidu vzorca VIII. Po kryštalizácii z éteru je teplota topenia získaného produktu 143 - 146° C a optická rotácia [a]d20 -233,9° (c = 0,908, metanol). V teste ELISA na bunkách VCAM-1 má peptolid vzorca VIII IC5Q asi 2 nM.
Molekulový vzorec: ¢51^3^09
Molekulová-hmotnosť: 938,3 g/mol
UV spektrum v metanole: Ámax(s') = 290 (5,4), 279 (5,08), 220 (38,1), 197 (55,7) (viď Obr. 1)
IR spektrum (KBr): viď Obr. 2
Hmotnostné spektrum (FAB): viď Obr. 3
Hmotnostné spektrum (FAB) s prídavkom Lil: viď Obr. 4
1h-NMR spektrum v CDCI3: viď Obr. 5
Príklad 4
Syntéza Nľ-demetoxyderivátu zlúčeniny vzorca VIII
Zlúčenina vzorca VIII (4,9 mg) sa rozpustí v 3 ml metanolu a pridá sa 8 mg paládia na aktívnom uhlí (10 %) . Zmes sa mieša v atmosfére vodíka počas 2 hodín, prepláchne sa argónom, prefiltruje sa a rozpúšťadlo sa odparí. Požadovaný produkt sa získa vo forme bezfarebnej peny. Analýza pomocou TLC a !h-NMR spektroskopie poskytuje nasledovné výsledky:
TLC: silikagél, toluén/metanol v pomere 9 : 1, Rf = 0,28;
^H-NMR (3 konforméry v pomere 56 : 37 : 7 označené symbolmi * 0 a ', uvádzajú sa charakteristické signály): 8,72* (d, J = 10 Hz, NH) ; 8,08* (br s, NH indolu).; 6, 97*, 6, 90° (2d, J = 2 Hz, H-2 indolu);
6,34° (d, J = 9,5 Hz, NH); 6,00* (d, J = 6,5 Hz, NH); 5,83'(d, NH) ; 5,.32° (ddd, a-H v PrLeu); 5,12°, 5,08* (2q, J = 7 Hz, Me v kyseline mliečnej); 4,50* (dd, a-H v MeLeu) ; 4,10* (ddd, a-H v Leu); 3,42 (q, J = 7 Hz, a-H v MeAla); 3,43°, 3,19°, 3,12*, 2,93*, 2,53*,
2,35°(6s, NMe); 1,54*, 1,50° (2d, J = 7 Hz, a-H v MeAla); 1,38°,
1,24* (2d, J = 7 Hz, a-H v kyseline mliečnej); 0,57*, -0,01* (2d, J = 6,5 Hz, Me); -0,19* (ddd, β-Η v Leu).
Príklad 5
Syntéza N1'-metylderivátu zlúčeniny vzorca VIII
Roztok 5 g produktu z príkladu 4 v 0,5 ml suchého DMF sa zmieša so 100 μΐ metyljodidu a pridá sa roztok 3 mg bis (trimetylsilyl) amidu sodného v 0,5 ml DMF. Zmes sa mieša pri teplote miestnosti počas 1,5 hodiny, potom sa vyleje do 0,1 M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej, extrahuje sa etylacetátom a organická vrstva sa premyje vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a soľankou, vysuší sa nad. síranom sodným a rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu. Surový produkt sa prečistí chromatografiou na silikagéli (elúcia gradientom toluén/metanol 100 : 0,25 až 100 :
2,5). Získa sa požadovaná zlúčenina vo forme bezfarebnej peny, ktorá sa analyzuje pomocou TLC a ^H-NMR spektroskopie.
TLC: silikagél, toluén/metanol v pomere 9 : 1, Rf = 0,40
ÍH-NMR (2 konforméry v pomere 60 : 40 označené symbolmi * a °, uvádzajú sa charakteristické signály: 8,72* (d, J = 10 Hz, NH) ;
6, 79*, 6, 74° (2s, H-2 indolu) ; 6,35° (d, J = 9,5 Hz, NH); 5,98* (d J = 6,5 Hz, NH); 5,32° (ddd, a-H v PrLeu); 5,12°, 5,08* (2q,
J = 7 Hz, Me v kyseline mliečnej); 4,50* (dd, a-H v MeLeu); 4,06* (ddd, a-H v Leu); 3,73 (s, NMe indolu); 3,44°, 3,19°, 3,15*, 2,93*, 2,53*, 2, 35°(6s, NMe); 1,55*, 1,51° (2d, J = 7 Hz, a-H v MeAla); 1,39°, 1,24* (2d, J = 7 Hz, a-H v kyseline mliečnej); 0,57*, -0,09* (2d, J = 6,5 Hz, Me); -0,32* (ddd, β-Η v Leu).
Príklad 6
Metylester kyseliny 5 - [8, ll-diizobutyl-14-(l-metoxy-lH-indol-3-ylmetyl) -7,13,19,20-tetrametyl-5,17-bis (2-metylhexyl) -3, 6, 9,12, 15,18, 21-heptaoxo-l-oxa-4,7,10,13,16,19-hexaazacykloheneikoz-2-yl] -pent-2-énovej
Roztok 185 mg zlúčeniny XV (viď nižšie) a 1,26 g metoxykarbonylmetyléntrifenylfosforánu v toluéne sa mieša pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny. Potom sa rozpúšťadlo odparí vo vákuu a odparok sa chromatografuje na kolóne Sephadexu LH-20 v metanole. Frakcie obsahujúce produkt sa odparia vo vákuu a chromatografujú sa na silikagéli (elúcia gradientom toluén/metanol
99,5 : 0,5 až 96 : 4) Požadovaný produkt vo forme bezfarebnej tuhej peny sa lyofilizuje z benzénu.
1H-NMR (3 konforméry v pomere 53 : 41 : 6 označené symbolmi * °a ', uvádzajú sa charakteristické signály): 8,67* (d, J = 10 Hz, NH v CgAA) ; 7,87 (d, J = 10 Hz, NH v CgAA) ; 7,80° (d, J = 10 Hz, NH) ; 7,69°(d, J = 10 Hz, NH); 7,45 - 7,35 (4d, H-4' a H-7' v MeMeOTrp);
7,23*, 7,22° (2m, H-6' v MeMeOTrp); 7,4 (2m, H-5' v MeMeOTrp);
7,06*, 7,00° (2s, H-2' v MeMeOTrp); 6,88° (ddd, J = 15 Hz,
J. = 7 Hz, -CH=) ; 6,76*(ddd, J = 15 Hz, J = 7 Hz, -CH=) ; 6,24° (d,
J = 10 Hz, NH v Leu); 6,04* (d, J = 6 Hz, NH v Leu); 5,82°, 5,78* (2d, J = 15 Hz, =CH-CO-); 5,29° (ddd, a-H v MeAla); 5,07°, 4,98* (m, a-H); 4,92 (dd, a-H v MeMeOTrp); 4,86* (ddd, a-H v C9AA) ; 4,78* (dd, a-H v Leu);· 4,71 (m, a-H); 4,48* (dd, a-H v MeLeu) ; 4,17* (ddd, a-H v Leu); 4,06*, 4,03', 4,02° (3s, NOMe) ; 3,75*, 3,74° (2s,
COOMe); 3,43° (s, NMe); 3,20* (s, NMe v MeAla); 3,17°(s, NMe);
2,92* (s, NMe v MeMeOTrp); 2,52* (s, NME v MeLeu); 2,47° (s, NMe);
1,51*, 1,48° (2d, J = 7 Hz, β-Me v MeAla); 1,04 (d, J = 6,5 Hz, Me v MeLeu); 0,98 - 0,84 (m); 0,63* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); 0,56', 0,39' (2d); 0,06* (d, J = 6 Hz, Me v Leu); -0,11* (ddd, β-Η v Leu).
Etylester kyseliny sa získa analogicky ako metylester v príklade 6.
Východiskový materiál vzorca XV r—A—B—R1Leu—Leu—c—x—Y:— (XV) je známy (viď medzinárodnú patentovú prihlášku WO 96/03430) . V tomto vzorci sú významy substituentov nasledovné:
B' = X' = —NH—C H—C H2-CH—(C H2)3—C H3
CO CH3
C' =
CO—
I ch2-ch-n—
I ch3
Y' =
--N-CH-CO—
I I
CH3CH3
V príkladoch 7 až uvedených nižšie majú použité skratky rovnaké významy a navyše:
Príklad 7
Zlúčenina vzorca IX (t. j. zlúčenina vzorca I, kde A = A'', r8 = tiazol-2-yl, B = B', R = CH3, C = C, R^ = OCH3,
--- = dvojitá väzba, X = X', Y = Y')
Roztok 400 mg zlúčeniny vzorca I (kde A = A, R& = -CSNH2,
B = B', R í = CH3, C = C, R^ = OCH3,---= dvojitá väzba, X = X', = Y') a 0,5 ml chlóracetaldehydhydrátu v 8 ml suchého DMF sa mieša s 0,5 g molekulového sita (4Ä) a zohrieva sa na teplotu 60° C počas 5 hodín. Zmes sa potom zriedi etylacetátom, prefiltruje sa a extrahuje sa 0,1 N roztokom kyseliny chlorovodíkovej. Organická fáza sa premyje soľankou, vysuší sa a rozpúšťadlo sa odparí vo vákuu. Surový produkt sa prečistí chromatografiou na silikagéli (elúcia gradientom toluén/metanol 99,5 : 0,5 až 98 : 2), čím sa získa požadovaná zlúčenina vo forme tuhej peny.
Analogicky ako sa opisuje v príklade 7 sa získajú nasledovné zlúčeniny vzorca I (A = A'', B = B', R1 = CH3, C = C'', R3 = OCH3, --- = dvojitá väzba, X = X', Y = Y'):
Príklad R8 forma
8 . tuhá pena
9 “X NT tuhá pena
10 -Ό hr ^ch3 tuhá pena
11 N X(CH3)3 tuhá pena
Východiskový materiál, t. j. zlúčenina vzorca I, kde A = A'',
R8 = CSNH2, B = B', R1 = CH3, C = C', R3 = OCH3,---= dvojitá väzba, X = X', Y = Y', sa pripraví nasledovným spôsobom.
Roztok 1,1 g zlúčeniny IX (A je zvyšok a-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej substituovanej v polohe γ skupinou -CN, B = B', R1 = CH3, C = C', R^ = OCH3, £ZZ = dvojitá väzba, X = X', Y = Y') a
1,8 g kyseliny difenylfosfínoditiovej v 25 ml izopropylalkoholu sa zohrieva do refluxu počas 7 hodín. Reakčná zmes sa odparí vo vákuu, rozpustí sa v etylacetáte a extrahuje sa roztokom hydrogénuhličítanu sodného a solankou. Po odparení organickej vrstvy sa surový produkt prečistí chromatografiou na silikagéli (elúcia gradientom toluén/metanol 99,5 : 0,5 až 98 : 2), čím sa získa požadovaná zlúčenina vo forme bezfarebnej peny.
Zlúčeniny získané v príkladoch 4 až 11 sa v ELISA testoch na bunkách VCAM-1 vyznačujú podobnými aktivitami ako zlúčenina vzorca VIII.
l-H-NMR spektrá (CDCI3) produktov získaných v príkladoch 7 až 11
Príklad č.:
7. 3 konforméry v pomere 46 : 51 : 3 označené *, 0 a ':8,70* (d,
J = 10 Hz, NH v LeuPr) ; 7,89* (d, J = 10 Hz, NH) ; 7,83° (d, J = 9Hz, NH); 7,69, 7,66 (2d, J = 3,3 Hz, CH v tiazole); 7,58 (d, J = 10 Hz, NH); 7,53*, 7,47° (2dm, J = 7 Hz, H-4' v MeTrpOMe) ; 7,38*, 7,37° (2dm, J = 8 Hz, H-7' v MeTrpOMe) ;
7,22*, 7,20° (2tm, H-6' v MeTrpOMe); 7,17, 7,16 (2d, J = 3,3
Hz, CH v tiazole); 7,09 (s, H-2' v MeTrpOMe); 7,03*, 7,00° (2dd, H-5' v MeTrpOMe); 6,98° (s, H-2' v MeTrpOMe); 6,18° (d, J = 10 Hz,. NH v Leu); 6,03* (d, J = 7 Hz, NH v Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH v Leu); 5,30° (ddd, a-H v LeuPr); 5,11* (dd, aH v kyseline hydroxymaslovej) ; 5,05 - 4,98 (m, a-H); 4,94 (dd, a-H v MeTrpOMe); 4,86° (ddd, a-H v LeuPr); 4,73 (m, a-H);
4,49* (dd, a-H v MeLeu) ; 4,23* (ddd, a-H v Leu); 4,02, 4,00 (2s, NOMe) ; 3,84° (m, a-H); 3, 59 - 3, 40 (m); 3,38 (q, J = 7
Hz, a-H v MeAla) ; 3,33 (s, NMe); 3,2 - 2,85 (m); 3,21 (s, NMe); 3,07 (s, NMe); 2,93* (s, NMe v MeTrpOMe) ; 2,53* (s, NMe v MeLeu); 2,49 (s, NMe); 2,43 - 2,28 (m); 2,18 (m); 1,98 (m); 1,81 (m); 1,7 - 1,1 (m); 1,48, 1, 46 (2d, J = 7 Hz, β-Me v
MeAla); 1,06* (d, J = 6,5 Hz, Me v MeLeu); 1, 00 - 0,84 (m); 0,61* (d, J = 6,6 Hz, Me V Leu); 0,54' (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); 0,35' (d, J = 6,6 Hz, Me V Leu); 0,10* (d, J = 6,6 Hz,
Me v Leu); -0,12* (ddd, β-Η v Leu).
konforméry v pomere 47 : 48 : 5, označené *, ° a ' : 8,64* (d, J = 10 Hz, NH- v LeuPr); 7,82 (2d, J = 10 Hz, NH) ; 7,63° (d, J = 10 Hz, NH) ; 7,23, 7, 17, 7,08, 6, 97 (4t, CH aróm.); 7,32, 7,28 (2s, CH v tiazole)7,07 (s, H-2' v MeTrpOMe); 6,81 (s, H-2' v MeTrpOMe); 6,22° (d, J = 10 Hz, NH v Leu); 6,07* (d, J = 7 Hz, NH v Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH v Leu); 5,29° (ddd, a-H v LeuPr); 5,20* (dd, a-H v MeTrpOMe); 5,12° (dd, a-H v kyseline hydroxymaslovej); 5,03° (ddd, a-H v LeuPr); 4,97* (ddd, a-H v LeuPr); 4,85 (m, a-H v kyseline hydroxymaslovej a
v LeuPr); 4,71° (ddd, a-H v Leu) ; 4,52* (dd, a-H v MeLeu);
4,21* (ddd, a-H v Leu) ; 3,90 (2s, NOMe); 3,34 (s, NMe) ; 3,22
(s, NMe); 3,02 (s, NMe) ; 2,93 (s, NMe); 2,53 (S, NMe) ; 2,48
(s, NMe); 1,43, 1,42 (2d, J = 7 Hz, β-Me v MeAla); 1,06*(d, J =6,5 Hz, Me v MeLeu); 0,62* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu);0,10* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); -0,04* (ddd, β-Η v Leu).
konforméry v pomere 42 : 52 : 6, označené *, 0 a ':8,67* (d, J = 10 Hz, NH v LeuPr); 7,83, 7,80 (2d, J = 10 Hz, NH) ;
7,63° (d, ’J = 10 Hz, NH); 7,55, 7,42, 7,39, 7,36 (4d, CH aróm v MeTrpOMe); 7,22, 7,18, 7,05, 6, 97 (4dd, H-5' a H-6' v MeTrpOMe); 7,06° (s, H-2' v MeTrpOMe); 6,88* (s, H-2' v Me TrpOMe); 6,22° (d, J = 10 Hz, NH v Leu); 6,02* (d, J = 7 Hz, NH v Leu); 5,77' (d, J = 10 Hz, NH v Leu); 5,30° (ddd, a-H v LeuPr); 5,21* (dd, a-H v MeTrpOMe); 5,0 (m, a-H); 4,85 (m, a29
H); 4,65 (ddd, a-H v Leu); 4,49* (dd, a-H v MeLeu); 4,13* (ddd, a-H v Leu); 4,03, 3,98 (2s, NOMe); 3,70 (m); 3,55 (m); 3,45 (q, J = 7 Hz, a-H v Me Ala) ; 3,37, 3,20, 3,112, 93, 2,52,
2,43 (6s, NMe); 2,73 (m, tetrahydrobenzotiazol); 1,50, 1,48 (2d, J = 7 Hz, β-Me v MeAla); 1,04* (d, J = 6,5 Hz, Me v meLeu); 0,58* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); 0,50' (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); 0,30' (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); 0,03* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); -0,22* (ddd, β-Η v Leu).
10. 3 konforméry v pomere 44 : 51 . 5, označené *, ° a ': 8,66* (d, J = 10 Hz, NH· v LeuPr); 7,83, 7,81 (2d, J = 10 Hz, NH) ; 7,63° (d, J = 10 Hz, NH); 7,57*, 7,43°, 7,38*, 7,36° (4d, J = 8 Hz, CH v indole); 7,21*, 7,18°, 7,05, 6, 97 (4t, CH v indole); 7,06* (s, H-2' v MetrpOMe); 6,88° (s, H-2' v
MeľrpOMe) ; 6,70°, 6,69* (2q, J = 1 Hz, CH v tiazole); 6,23° (d, J = 10 Hz, NH v Leu); 6,05* (d, J = 7 Hz, NH v Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH v Leu); 5,29° (ddd, a-H v LeuPr); 5,11° (dd, a-H v kyseline hydroxymaslovej) ; 5,01 (m); 4,97 (dd, a-
H) ; 4,85 (m, 2 x a-H) ; 4,69° (ddd, a-H v Leu); 4, 57' (dd, a
H) ; 4,48* (dd, a-H v MeLeu); 4,16* (ddd, a-H v Leu) ; 4,03
3, 98 (.2 s, NOMe) ; 3,43 (q, J = 7 Hz, a-H v MeAla); 3,37, 3,20
3,10, 2,92, 2,52, 2,46 (6s, NMe); 2,40, 2,39 (2d, J = 1 Hz, Me v tiazole); 1,48, 1,47 (2d, J = 7 Hz, β-Me v MeAla); 1,05* (d, J = 6,5 Hz, Me v MeLeu); 0,60* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); 0,52', 033'(2d, J = 6,5 Hz, Me v Leu); 0,05* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); -0,14* (ddd, β-Η v Leu).
11. 3 konforméry v pomere 47 : 50 : 3, označené *, ° a ':8,69* (d,
J = 10 Hz, NH v LeuPr); 7,79, 7,78 (2d, J = 10 Hz, NH); 7,65° (d, J = 10 Hz, NH); 7,51*, 7,41°, 7,39*, 7,38° (4d, J = 8 Hz, CH v indole); 7,23*, 7,20°, 7,07, 7,00 (4t, CH v indole); 7,04* (s, H-2' v Me TrpOMe) ; 6,85° (s, H-2' v MeľrpOMe) ;
6,71°* (s, CH v tiazole); 6,25° (d, J = 10 Hz, NH v Leu);
6,04* (d, J = 7 Hz, NH v Leu); 5,80' (d, J = 10 Hz, NH v Leu);
5,30° (ddd, a-H v LeuPr); 5,10° (dd, a-H v kyseline hydroxymaslovej); 5,02 (m); 4,97 (dd, a-H); 4,85 (m, 2 x a-H); 4,72° (ddd, a-H v Leu); 4,60' (dd, a-H); 4,50* (dd, a-H v MeLeu) ; 4,17* (ddd, a-H v Leu); 4,04, 4,00 (2s, NOMe); 3,48 (q, J = 7 Hz, a-H v MeAla); 3,41, 3,21, 3,17, 2,92, 2,53, 2,47 (6s, NMe) ; 1,50, 1,49 (2d, J = 7 Hz, β-Me v meAla); 1,06* (d, J = 6,5 Hz, Me v MeLeu); 0,97, 0,96 (2s, t-Bu-tiazol); 0,62* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); 0,53', 0,35' (2d, J = 6,5 Hz, Me v Leu); 0,07* (d, J = 6,6 Hz, Me v Leu); -0,08 (ddd, β-Η v
Leu) .
A) 3 konforméry44:30:26, označené *0': 8,85 (d, CSNHi); 8,60 (d, LeuPr NH); 8,17 (d, CSNHz); 8,03, 8,00 (2d, NH); 7,88 (m, CSNH2); 7,6-7,1 (aróm.); 6,28* (d, 10Hz, Leu NH); 6,07° (d, 7Hz, Leu NH); 5,87' (d, 9Hz, Leu NH); 5,26* (ddd, LeuPr a-H), 5,22 (dd, hydroxykys. a-H); 5,15-4,95,5,O8*(dd, hydroxy.kys. a-H); 4,83° (ddd, LeuPr a-H); 4,50* (ddd, Leu a-H); 4,37* (dd, MeTrpOMe a-H); 4,25° (ddd, Leu a-H); 4,09, 4,05, 4,03* (3s, OMe); 3,89 (m, a-H); 3,65*. 3,63', 3,52° (3q, 7Hz, MeAla a-H); 3,57 (m),
3,17, 3,16. 3,15,3,22, 3,20,3,05,2,92,2,55,2,53 (9s, N-Me); 1,8-1,1; 1,05 (d, 7Hz); 0,99-0,82,0,60°, 0,55', 0,23', 0,17° (4d, 7Hz, Leu d-Me); -0,15°, -0rI7’ (ddd, Leu b-CH). PKF 285-916 (tiazol)
Biologická aktivita
Aktivity zlúčenín podľa vynálezu sa testujú na cytotoxicitu a inhibíciu expresie ICAM-1, VCAM-1 a E-selektínu, proliferáciu buniek a na inhibíciu uvoľňovania TNF so zodpovedajúcim testom na cytotoxicitu.
V teste bunkovej proliferácie i v teste ELISA na bunkách ICAM-1 sa používajú bunky HaCaT, línie spontánne transformovaných netumorogénnych ľudských keratinocytových buniek s vysoko zachovanými fenotypickými charakteristikami normálnych keratinocytov (viď Boukamp et al., J. Celí Biol. 106, 761 - 771 (1988)).
Uskutočnenie testov je opísané nižšie.
A. Elisa test na bunkách ICAM-1
I. ELISA test na keratinocytických bunkách ICAM-1
Test ELISA na bunkách ICAM-1 na určenie inhibície expresie ICAM-1 sa uskutočňuje v podstate spôsobom, ktorý opísali Winiski a Foster (viď Winiski a Foster, J. Invenst. Dermatol. 99, 48 - 52 (1992). Bunky HacaT sa vysejú na 96 jamkových mikrotitračných doskách (2 x 10^ buniek/jamka v nasledovnom kultivačnom médiu: DMEM s 5 % FCS, 100 U/ml penicilínu, 100 mg/ml streptomycínu, 2 mM glutamínu, 1 mM pyruvátu sodného) a nechajú sa rásť až do konfluencie. Potom sa inkubujú počas asi 24 hodín v čerstvom testovacom médiu (rovnaké zloženie ako kultivačné médium, ale miesto 5 % FCS obsahuje iba 0,5 % FCS) v prítomnosti alebo neprítomnosti IFNy/TNFa stimulačného média (testovacie médium + 1000 U/ml IFNy/TNFa/3 ng/ml TNFa) v prítomnosti testovanej zlúčeniny alebo bez nej. Médium sa potom vymyje a jednobunkové vrstvy sa fixujú 1 % paraformaldehydom. Monovrstvy sa inkubujú so saturačným množstvom primárnej (myšej anti-ICAM-1 monoklonálnej) a sekundárnej (konjugovanej s kozou anti-myšou peroxidázou) proti32 látky. Následná reakcia peroxidázy používa ako substrát 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) a poskytuje nerozpustný farebný produkt, ktorý sa môže ľahko merať štandardným zariadením na čítanie mikrotitračnej dosky.
II. Určovanie cytotoxicity
Po ukončení detekcie ICAM-1 reakciou s AEC sa jednobunkové vrstvy buniek HaCaT premyjú PBS (200 ml) , PBS sa z dosiek zleje a prebytočná kvapalina sa vysuší poklepaním na papierový obrúsok. Spodok mikrotitračných dosiek sa zľahka otrie vlhkou buničitou vatou a potom ešte raz suchou buničitou vatou a stanoví sa absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm. Skôr než by jednobunkové vrstvy mohli vyschnúť, pridá sa do každej jamky 0,1 ml 0,1 % roztoku kryštálovej violete v PBS (ktorý sa predtým prefiltroval cez 0,2 μη filter). Dosky sa potom inkubujú pri teplote miestnosti, premyjú sa starostlivo päťkrát PBS, nadbytok kvapaliny sa odstráni ako sa opisuje vyššie a znova sa stanoví absorbancia pri vlnovej dĺžke 492 nm skôr než jednobunkové vrstvy stačia vyschnúť. Rozdiel optických hustôt pred a po vyfarbení udáva hodnoty spojené s vyfarbením kryštálovou violeťou a teda závisí od množstva jednobunkových vrstiev v jamkách. Tieto hodnoty sa použijú na korekciu hodnôt, získaných reakciou s AEC.
B. ELISA test s endotelovými bunkami exprimujúcimi VCAM-1, ICAM-1 a E-selektín
Test sa zakladá na 96 jamkovej metóde ELISA, pri ktorej sa používajú ľudské mikrovaskulárne endotelové bunky línie HMEC-1 a ľudské endotelové bunky z umbilikálnej žily (HUVEC). Bunky sa najskôr vystavia počas 4 hodín pôsobeniu testovanej zlúčeniny. Potom sa stimulujú TNF počas ďalších 6 až 16 hodín a fixujú sa paraformaldehydom na následné vyhodnotenie expresie VCAM-1, ICAM-1 alebo E-selektínu, ktoré sa uskutoční nepriamou imunoperoxidázovou farbiacou technikou. Cytotoxické efekty sa stanovia z množstva buniek (farbivo Giemsa) po pôsobení testovanej relatívneho zlúčeniny v ' porovnaní s kontrolnými jamkami (len rozpúšťadlo a médiá).
Zlúčeniny sa vyhodnotia ako pozitívne, ak sa vyznačujú > 50 % inhibíciou VCAM-1, ICAM-1 alebo E-selektínu pri > 25 % strate buniek.
Metodológia
I. Bunková línia
Pri VCAM-1 a ICAM-1 teste sa používajú immortalizované (veľký T antigén opičieho vírusu SV-40) ľudské mikrovaskulárne endotelové bunkové línie HMEC-1 (viď Ades et al., J. Invest. Dermatol. 99, 683 - 690 (1992)). Bunky HMEC-1 v konštitutívnom stave exprimujú ICAM-1 na nízkej úrovni, ktorá je stimulovaná zápalovými mediátormi, avšak VCAM-1 sa exprimuje iba po stimulácii cytokínom. Aby sa určili optimálne podmienky na indukciu expresie VCAM-1 a ICAM-1, študovala sa závislosť od dávky a časový priebeh.
II. Podmienky rastu
Bunky HMEC-1 sa kultivujú v T-7 5 bankách (Nunc) , pričom sa používajú štandardné podmienky (teplota 37° C, 5 % oxidu uhličitého, 1,5 x 10^ buniek/ml kultivačného média (Endothelial Celí Basal Médium, EBM (Clonetics)) doplneného 10 % FCS, 10 ng/ml ľudského EGF (Boehringer), 1 mg/ml hydrokortizónu (Sigma, No.
0888), 2,2 g/1 hydrogénuhličitanu sodného, 15 mM Hepes, 0,11 g/1 pyruvátu sodného, 4 nM glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 mg/ml streptomycínu).. Po miernej trypsinácii (0,25 % trypsín a 0,1 % EDTA, 8 minút) sa bunky znova suspendujú a každé 2 až 3 dni sa opätovne vysejú v zriedení 1:3.
III. VCAM-1 a ICAM-1 ELISA test
Do 96 jamkovej mikrotitračnej dosky s plochým dnom potiahnutej hovädzím fibronektinom, FN (Sigma, No. F 1141) sa vyseje 2 x 104 buniek/jamka v 200 ml EBM kultivačného média. Po inkubácii cez noc sa kultivačné médium najskôr nahradí testovacím médiom EBM (kultivačné médium s 5 % FCS miesto 10 % FCS) v množstve 200 ml/jamka. Potom sa nahradí 180 ml média, obsahujúceho buď (1) testovanú zlúčeninu v príslušnej koncentrácii, (2) zodpovedajúcu koncentráciu média extrahovaného zmesou rozpúštädlo/metanol, alebo (3) samotné testovacie médium EBM, a podrobí sa inkubácii.pri teplote 37° C počas 4 hodín. Každý 96 jamkový test sa uskutoční v duplikáte. Bunky sa potom stimulujú pr.idavkom 20 ml koncentrovaného roztoku cytokinu (2000 U/ml TNFa) a podrobia sa inkubácii pri teplote 37° C počas 16 hodín.
Jednobunková vrstva sa potom premyje 1 % roztokom paraformaldehydu v médiu EBM, fixuje sa 2 % paraformaldehydom pri teplote miestnosti počas 15 minút a premyje sa niekoľkokrát PBS. Po odstránení PBS z buniek sa jednobunková vrstva inkubuje 30 minút v PBS obsahujúcim 10 % normálne kozie sérum (NGS). Roztok NGS sa vymení za 100 ml/jamka anti-VCAM-1 alebo ICAM-1 monoklonálnej protilátky ra uskutočni sa inkubácia pri teplote 4° C. Roztok protilátky sa potom odstráni a bunky sa premyjú niekoľkokrát PBS a inkubujú sa s PBS obsahujúcim 10 % NGS pri teplote miestnosti počas 30 až 60 minút. Roztok NGS sa odstráni, pridá sa 100 ml roztoku kozieho F(ab') anti-myšej IgG protilátky konjugovanej s reďkovkovou peroxidázou (Tágo; zriedenie 1 : 500 v PBS obsahujúcom 5 % NGC) a dosky sa inkubujú pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Sekundárna protilátka sa ‘odstráni a bunky sa premyjú PBS, ktorý sa potom vymení za čerstvo pripravený a prefiltrovaný roztok AEC (3-amino-9etylkarbazol; Sigma) v množstve 150 ml/jamka. Dosky sa inkubujú pri teplote miestnosti počas 45 až 60 minút, peroxidázový substrát sa odstráni a bunky sa prepláchnu PBS. Stanoví sa absorbancia AEC pri vlnovej dĺžke 550 nm a koriguje sa o blank alebo referenčné hodnoty pri vlnovej dĺžke 690 nm.
IV. E-selektinový test
Tento test sa uskutočňuje použitím čerstvo izolovaných buniek HUVEC v podstate tak, ako sa opisuje pre VCAM-1 alebo ICAM-1 testy, s tým rozdielom, že stimulácia TNFa je kratšia (6 až 8 hodín).
V. Meranie cytotoxicity (úbytok buniek podlá rozsahu vyfarbenia jadier)
Endotelové bunky sa vyfarbia výmenou PBS za etanol a jeho pôsobením počas 20 minút (dve výmeny po 10 minútach). Proces sa vyhodnocuje mikroskopickým sledovaním. Bunky sa potom premyjú destilovanou vodou (Aquadest) a jednobunková vrstva sa prekryje 33 % roztokom Giemsa v destilovanej vode a nechá sa pôsobiť počas 5 minút. Jamky sa potom vypláchnu destilovanou vodou a nechajú sa na vzduchu vysušiť najmenej počas 15 minút. Mikroskopicky sa kontroluje, či sú vyfarbené iba jadrá a či nedošlo k podstatnému vyfarbeniu .cytoplazmy. Potom sa stanoví absorpcia Giemsa pri vlnovej dĺžke 550 nm a koriguje sa o blank hodnoty (pre rady neobsahujúce bunky) pri vlnovej dĺžke 690 nm.
VI. Vyhodnotenie údajov
Hodnoty získané pomocou AEC (AEC hodnoty) pre konštitutívnu expresiu VCAM-1 alebo E-selektín (kontrolné jamky bez stimulácie) sa v podstate zhodujú s výsledkami kontrol pri ktorých sa používajú izotypom značené mAb a vyjadrujú pozadie. Pre každú 96 jamkovú dosku sa priemerná konštitutívna hodnota odčíta od priemernej AEC hodnoty pre každú cytokínom stimulovanú skupinu (pre EBM a rozpúšťadlové kontroly i pre testované zlúčeniny) a získaná hodnota označovaná AEC-CAM vyjadruje stimulovanú expresiu ICAM-1 a indukovateľnú expresiu VCAM-1 alebo expresiu E-selektinových bunkových adhéznych molekúl. Každá hodnota AEC-CAM sa potom vydelí zodpovedajúcou priemernou Giemsa hodnotou, čim sa získa hodnota označovaná ako AEC : Giemsa pomer, vyjadrujúca relatívne úrovne expresie CAM pre danú hustotu buniek na základe počtu jadier.
AEC (stimulované) - AEC (nestimulované = AEC-CAM
AEC-CAM / Giemsa = AEC : Giemsa pomer
Skutočné hodnoty CAM IC5Q sa získajú porovnaním hodnôt AEC' : Giemsa pre testované zlúčeniny s hodnotami stimulovaných kontrol (EBM, rozpúšťadlo). Tieto hodnoty sa potom analyzujú voči hodnotám IC5Q pre samotné Giemsa farbivo. Podlá presných kritérií sa rozhodne, či profil závislosti inhibície expresie CAM oproti cytotoxicite (Giemsa) poukazuje na skutočne perspektívnu zlúčeninu, ktorá sa má ďalej študovať.
C. Test proliferácie buniek HaCaT
Bunky HaCaT sa kultivujú v DMEM (Gibco; No. 074-02100), ku ktorému sa pridá 2,2 g/1 hydrogénuhličitanu sodného, 0,11 g/1 pyruvátu sodného, 15 mM Hepes, 5 % FCS, 100 U/ml penicilínu, 100 mg/ml streptomycínu a glutamín v takom množstve, aby jeho výsledná koncentrácia bola 4 mM). Pri proliferačnom teste sa bunky oddelia trypsináciou, suspendujú sa v čerstvom médiu a vysejú sa na 96 jamkové mikrotitračné dosky v konečnej hustote 4000 buniek/0,2 ml/jamka. Po 24 hodinách (deň 0) sa médium nahradí čerstvým médiom obsahujúcim testované látky v odstupňovaných koncentráciách. Po 3 dňoch inkubácie (teplota 37° C, 5 % oxidu uhličitého) sa miera bunkovej proliferácie voči rozpúšťadlovým kontrolám určí kolorimetrickou metódou, ktorou sa meria relatívna bunková hmota pomocou farbiva sulforodamín B (viď Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107 - 112 (1990). Východiskový počet buniek sa určí zmeraním relatívnej bunkovej hmoty v deň 0. Výsledky sa vyjadrujú ako % inhibície = 100 - % absorbancie kontroly (kde rozpúšťadlová kontrola = 100 %) a sú priemerom ± smerodajná odchýlka z troch meraní. Krivka závislosti účinku od dávky sa nanesie semilogaritmicky a koncentrácia potrebná na dosiahnutie polovice maximálnej inhibície (IC5Q) sa určí lineárnou interpoláciou. Maximálnu inhibíciu bez čistého úbytku buniek udáva východiskový počet buniek a zvyčajne je medzi 90 - 98 %.
D. Inhibícia uvoľňovania TNF
1. Vlastný test
Jednojadrové bunky sa pripravujú z periférnej krvi zdravých dobrovoľníkov, pričom sa používa hustotná separácia v prostredí ficoll-hypaque podľa Hansellovej metódy (viď Hansell et al., J. Imm. Methods 145, 105 (1991) ) a používajú sa v koncentrácii 10^ buniek/jamka v RPMI 1640 s 10 % FCS. Bunky sa inkubujú so sériovo riedenými roztokmi testovaných zlúčenín pri teplote 37° C počas 30 minút. Potom sa pridá IFNy (100 U/ml) a LPS (5 mg/ml) a v inkubácii sa pokračuje počas ďalších 3 hodín. Inkubácia sa ukončí centrifugáciou pri 1 400 ot./min počas 10 minút. Obsah TNFa v supernatante sa meria pomocou komerčného ELISA testu (Innotest hTNF, Innogenetics N. V., Zwijnaarde, Belgicko). Zlúčeniny sa testujú v koncentráciách od 0 do 10 mM. Uvedené zlúčeniny vzorca I, obzvlášť výhodné zlúčeniny vzorca I, Ip', IpVII, IX a X, potláčajú uvoľňovanie TNF v tomto teste s hodnotou od asi 5 do asi nM.
2. Cytotoxicita
Cytotoxicita sa určí na bunkách THP1 (5 x 10^ buniek) , ktoré sa inkubujú pri teplote 37° C počas 24 hodín v prítomnosti IFNy (100 U/ml) a LPS (5 mg/ml) a v prítomnosti testovanej zlúčeniny alebo bez nej. Percentá živých a mŕtvych buniek sa zistia kolorimetrickou (MTT) metódou, ktorá stanovuje mitochondriálne dehydrogenázy v živých bunkách, ako opisuje Mosman (viď Mosman, J. Imm. Methods 65, 55 (1983)). Výhodné zlúčeniny podľa vynálezu sa v tomto teste charakterizujú pomerne nízkou cytotoxicitou, napríklad hodnota IC50 je v rozmedzí od asi 100 do asi 1000 nM.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Cyklopeptolidy vzorca I, voľné alebo vo forme soli alebo esteru f—A—B—R1 Leu—Leu—C-X—Y—i kde:
    A je zvyšok glykolovej kyseliny prípadne α-substituovaný metylovou skupinou, etylovou skupinou alebo vinylovou skupinou, ktoré sú prípadne substituované atómom halogénu, alkoxyskupinou, voľnou alebo chránenou hydroxyskupinou, voľnou alebo chránenou aminoskupinou, skupinou -CSNH2, skupinou -COOR2, vinylovou skupinou alebo skupinou -CsCH alebo tiazolovou skupinou, kde R2 je atóm vodíka alebo nižšia alkylová skupina pripadne substituovaná alkylovou skupinou, atómom halogénu, cykloalkylovou skupinou, nesubstituovanou alebo substituovanou tiazolovou skupinou, skupinou COOR2 alebo skupinou -C=CH, kde R2 je definované vyššie;
    B je zvyšok a-amino-y-metylsubstituovanej oktánovej kyseliny;
    je atóm vodíka alebo metylová skupina;
    Č je zvyšok tryptofánu alebo N-metyltryptofánu vzorca II
    CO— (II) kde R2 je atóm vodíka, alkoxylová skupina, alkylová skupina alebo benzylová skupina, R4 je atóm vodíka alebo atóm halogénu, R$ je atóm vodíka alebo metylová skupina a symbol --- znamená jednoduchú alebo dvojitú väzbu;
    X je zvyšok α-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 14 atómov uhlíka; a
    Y je zvyšok α-amino- alebo N-metyl-a-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka, za predpokladu, že A nie je zvyšok nesubstituovanej a-hydroxymaslovej kyseliny a že ak A je zvyšok glykolovej kyseliny, ktorá je α-substituovaná etylovou skupinou, môže byť táto etylová skupina prípadne substituovaná iba aminoskupinou, hydroxyskupinou, atómom chlóru, alkoxyskupinou, nesubstituovanou alebo prípadne substituovanou tiazolovou skupinou, nesubstituovanou alebo prípadne substituovanou vinylovou skupinou, cyklopropylovou skupinou, skupinou -CSNH2 alebo skupinou -C=CH.
  2. 2. Zlúčeniny vzorca Ip —Ap—Bp—Rp1 Leu—Leu—Cp—Xp—Yp— kde
    Ap je zvyšok glykolovej kyseliny prípadne α-substituovanej metylovou skupinou;
    Bp je zvyšok a-amino-y-metylsubstituovanej oktánovej kyseliny;
    Rp1 je atóm vodíka alebo metylová skupina;
    Cp je zvyšok tryptofánu alebo N-metyltryptofánu, ktorý je prípadne substituovaný N'-alkoxyskupinou, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka;
    Xp je zvyšok α-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 14 atómov uhlíka; a
    Yp je zvyšok α-amino- alebo N-metyl-a-aminosubstituovanej karboxylovej kyseliny, ktorá obsahuje 2 až 10 atómov uhlíka.
  3. 3. Zlúčeniny vzorca Ip'
    Ap Bp Rp1Leu Leu Cp Xp Yp dp') kde Bp, Rpl, Cp, Xp a Ýp sú definované v nároku 2 a Ap' je zvyšok α-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej, ktorá je γ-substituovaná skupinou vzorca VI
    O kde je nižšia alkylová skupina, napríklad alkylová skupina, ktorá obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka.
  4. 4. Zlúčeniny vzorca Ip''
    Ap Bp Rp1Leu Leu Cp Xp Yp dp) kde Bp, Rpl, Cp, Xp a Yp sú definované v nároku 2 a Ap'' je zvyšok α-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej, ktorá je v γ-polohe substituovaná skupinou vzorca VII (VII) kde r6 je atóm vodíka, nižšia alkylová skupina alebo fenylová skupina, alebo tvorí karbôcyklický kruh spolu s polohou 5 tiazolového kruhu.
  5. 5. Cyklopeptolidy vzorca VIII, IX alebo X voľné alebo vo forme soli (IX)
  6. 6. Kmeň húb F/94-499709 deponovaný ako DSM 10275, ako sa opisuje v spise vyššie, alebo jeho mutanty alebo deriváty.
  7. 7. Postup prípravy zlúčenín podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa kmeň F/94-499709 (DSM 10275) alebo jeho mutant alebo derivát alebo podobný druh húb kultivuje v živnom médiu a zlúčeniny sa z neho izolujú.
  8. 8.
    a)
    Postup prípravy zlúčenín podľa nároku 1, vyznačujúci tým, že na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -COOR2, sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, v ktorých A je nukleofilmi, s alebo kyslej v organických
    b)
    c) sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, substituované skupinou -CN, nechajú reagovať s výhodou s alkoholmi, za vhodnej bázickej katalýzy, s výhodou kyselinou chlorovodíkovou, rozpúšťadlách, s výhodou v éteri, alebo na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je alkoxymetylovou skupinou, kde A je substituované alkylačnými činidlami, zlúčeniny, v prítomnosti na prípravu zlúčenín vzorca I, -COOR2, substituované sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, skupinou -CH2OH, nechajú reagovať s ako sú alkylhalogenidy alebo diazokatalyzátora alebo bez neho, alebo kde A je substituované skupinou sa esterifikujú zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde
    A je substituované skupinou -COOH, pričom sa použijú štandardné metódy, s výhodou prevedením na acylchlorid, napríklad pôsobením tionylchloridu, a následným pôsobením vhodného alkoholu v prítomnosti látky viažucej kyseliny alebo bez nej, alebo
    d) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH2OH, sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -COOR^, redukujú kovovými hydridmi alebo borohydridmi, s výhodou s komplexom boránu s dimetylsulfidom, v organických rozpúšťadlách, alebo
    e) ' na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované vinylovou skupinou, ktorá je prípadne substituovaná, sa zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CHO, nechajú reagovať s Wittigovym činidlom, alebo
    f) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH2NH2, sa redukujú zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH2N3, alebo
    g) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde A je substituované skupinou -C=CH, sa dehydrogenujú zodpovedajúce zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CH=CBr2, alebo
    h) na prípravu zlúčenín všeobecného vzorca I, kde A je substituované cyklopropylovou skupinou, sa zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované vinylovou skupinou, podrobia reakcii s diazometánom, alebo
    i) na prípravu zlúčenín všeobecného vzorca I, kde A je substituované skupinou -CSNH2, sa zlúčeniny vzorca I, kde A je substituované skupinou -CN, nechajú reagovať so sírnymi derivátmi,· obzvlášť s difenylfosfinoditiovou kyselinou, napríklad refluxovaním roztoku sírnej zlúčeniny so zlúčeninou vzorca I, kde A je substituované skupinou -CN, alebo
    j) na prípravu výhodných zlúčenín vzorca Ip j—Ap—Bp—Rp1 Leu—Leu—C dp) kde substituenty sú definované v nároku 4, sa zlúčenina vzorca Ip, v ktorom Ap' ' je zvyšok α-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej substituovanej v polohe γ skupinou -CSNH2, nechá reagovať s α-halogénkarbonylovou zlúčeninou vzorca XIII
    Hal-CH2-CO-R6 (XIII) kde R^ je definované v nároku 4 a Hal je atóm halogénu, alebo s acetálom zlúčeniny XIII, alebo
    k) na prípravu výhodných zlúčenín vzorca Ip'
    Ap Bp Rp1Leu Leu Cp Xp Yp dp') kde substituenty sú definované v nároku 3, sa zlúčenina vzorca Ip', kde Ap' je zvyšok α-hydroxysubstituovanej kyseliny maslovej substituovanej v polohe γ skupinou -CHO, nechá reagovať s alkoxykarbonylmetyléntrifenylfosforánom, alebo
    D na prípravu zlúčenín vzorca I, kde R^ je atóm vodíka, sa zo zlúčenín vzorca I, kde R 3 je skupina -OCH3, odstráni metoxyskupina, alebo m) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde symbol --- znamená
    jednoduchú väzbu, sa redukujú zlúčeniny vzorca I, kde symbol --- znamená dvojitú väzbu, alebo
    n) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde R^ je alkylová alebo benzylová skupina, sa tieto skupiny zavedú do zlúčenín vzorca I, kde R^ je atóm vodíka, alebo
    o) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde je atóm halogénu, sa zlúčeniny vzorca I, kde je atóm vodíka, podrobia halogenácii, alebo
    p) na prípravu zlúčenín vzorca I, kde R^ je alkoxylová skupina a symbol --- znamená dvojitú väzbu, sa zlúčeniny vzorca I, kde
    R3 je atóm vodíka a symbol --- znamená jednoduchú väzbu, nechajú reagovať s wolframanom alkalického kovu a peroxidom vodíka a N-hydroxyindolový medziprodukt sa následne alkyluje, a podľa potreby sa zlúčenina vzorca I izoluje.
  9. 9. Postup prípravy zlúčenín podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa cyklizuje lineárny peptid alebo peptolid, ktorý obsahuje zvyšky kyselín Ά, B, R^Leu, Leu, C, X a Y definované v nároku 1, ktoré sú spolu spojené v príslušnom poradí.
  10. 10. · Terapeutické využitie zlúčenín podľa nároku 1.
  11. 11. Liečebné prípravky, vyznačujúce sa tým, že obsahujú terapeuticky účinné množstvá zlúčenín podľa nároku 1.
SK656-98A 1995-11-21 1996-11-20 Cyclopeptolides SK65698A3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9523744.2A GB9523744D0 (en) 1995-11-21 1995-11-21 Organic compounds
GBGB9604406.0A GB9604406D0 (en) 1996-03-01 1996-03-01 Organic compounds
GBGB9613990.2A GB9613990D0 (en) 1996-07-04 1996-07-04 Organic compounds
PCT/EP1996/005123 WO1997019104A1 (en) 1995-11-21 1996-11-20 Cyclopeptolides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK65698A3 true SK65698A3 (en) 1998-11-04

Family

ID=27267982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK656-98A SK65698A3 (en) 1995-11-21 1996-11-20 Cyclopeptolides

Country Status (27)

Country Link
US (1) US6011136A (sk)
EP (1) EP0866801B1 (sk)
JP (1) JP3463691B2 (sk)
KR (1) KR19990071533A (sk)
CN (1) CN1125079C (sk)
AR (1) AR012286A1 (sk)
AT (1) ATE240972T1 (sk)
AU (1) AU712900B2 (sk)
BR (1) BR9611619B1 (sk)
CA (1) CA2237157C (sk)
CO (1) CO4770985A1 (sk)
CZ (1) CZ154998A3 (sk)
DE (1) DE69628323T2 (sk)
ES (1) ES2200079T3 (sk)
HU (1) HUP9903810A3 (sk)
IL (1) IL124310A0 (sk)
MX (1) MX9804048A (sk)
MY (1) MY115877A (sk)
NO (1) NO982280D0 (sk)
NZ (1) NZ322909A (sk)
PE (1) PE22998A1 (sk)
PL (1) PL186010B1 (sk)
RU (1) RU2171260C2 (sk)
SK (1) SK65698A3 (sk)
TR (1) TR199800897T2 (sk)
TW (1) TW450978B (sk)
WO (1) WO1997019104A1 (sk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002223649A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-06 Novartis Ag Vegh inhibitors and their use
CA2560103A1 (en) * 2004-03-17 2005-11-24 Chiron Corporation Treatment of severe community-acquired pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi)
MX2020010156A (es) 2018-03-29 2021-03-09 Kezar Life Sciences Inhibidores de la secrecion de proteina cdp.

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3832059A1 (de) * 1988-09-21 1990-03-29 Howaldtswerke Deutsche Werft Tauchtiefengesteuerte ausblasventil-einrichtung
DE3832362A1 (de) * 1988-09-23 1990-03-29 Sandoz Ag Neue cyclopeptolide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
AT396108B (de) * 1991-08-21 1993-06-25 Biochemie Gmbh Neues verfahren und neue zwischenprodukte zur herstellung von 7-aminocephalosporansaeurederivaten
JPH07109299A (ja) * 1993-10-13 1995-04-25 Shionogi & Co Ltd 抗ｈｉｖ物質ペスタヒビン及びその誘導体
BR9508342A (pt) * 1994-07-27 1997-10-21 Sandoz Ag Compostos orgânicos
US20040219569A1 (en) * 1999-07-06 2004-11-04 Fruma Yehiely Gene identification method

Also Published As

Publication number Publication date
PL326755A1 (en) 1998-10-26
DE69628323D1 (en) 2003-06-26
MX9804048A (es) 1998-09-30
EP0866801B1 (en) 2003-05-21
KR19990071533A (ko) 1999-09-27
MY115877A (en) 2003-09-30
TR199800897T2 (xx) 1998-08-21
CN1202904A (zh) 1998-12-23
PE22998A1 (es) 1998-05-12
BR9611619A (pt) 1999-03-30
ATE240972T1 (de) 2003-06-15
BR9611619B1 (pt) 2010-08-10
JP2000502992A (ja) 2000-03-14
NO982280L (no) 1998-05-19
IL124310A0 (en) 1998-12-06
NZ322909A (en) 1999-07-29
DE69628323T2 (de) 2004-08-19
CA2237157A1 (en) 1997-05-29
RU2171260C2 (ru) 2001-07-27
PL186010B1 (pl) 2003-09-30
CO4770985A1 (es) 1999-04-30
AU712900B2 (en) 1999-11-18
CN1125079C (zh) 2003-10-22
CZ154998A3 (cs) 1998-08-12
NO982280D0 (no) 1998-05-19
TW450978B (en) 2001-08-21
WO1997019104A1 (en) 1997-05-29
ES2200079T3 (es) 2004-03-01
HUP9903810A3 (en) 2001-04-28
EP0866801A1 (en) 1998-09-30
US6011136A (en) 2000-01-04
AU7694696A (en) 1997-06-11
CA2237157C (en) 2009-04-07
HUP9903810A2 (hu) 2000-04-28
JP3463691B2 (ja) 2003-11-05
AR012286A1 (es) 2000-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ424297A3 (cs) Makrolidy, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje
CZ261493A3 (en) Pharmacologically active compounds, process of their preparation and pharmaceutical preparations in which they are comprised
US6013627A (en) Organic compounds
SK65698A3 (en) Cyclopeptolides
US20020128307A1 (en) Chemokine receptor antagonists
DE69519669T2 (de) Cyclodepsipeptide
US5789602A (en) Physiologically active substances PF1092A, PF1092B and PF1092C, process for the production thereof, and contraceptives and anticancer drugs containing the same as active ingredients
US4560703A (en) Clavulone derivatives, process for preparing the same, and use of said compounds
JPH05331172A (ja) 生物活性プソイロチンａおよびｄ、アスペルギルス・フミガタスから得られる新規な代謝産物、その調製方法およびその使用
JPH09110689A (ja) 静脈細胞接着分子−１の産生阻害剤及びナピラジオマイシンｓｃ
KR20070005345A (ko) ２,５-디히드로-４-알킬-２,５-디옥소퓨란 유도체 및이것의 용도
MXPA98000217A (en) Macroli
WO1996026956A1 (en) Protein phosphatase inhibitor
JPH06263789A (ja) 新規イソテトラセノン系物質及びその製造法
JPH09241242A (ja) 新規ピエリサイジン誘導体