PL168609B1

PL168609B1 - Sposób wytwarzania nowych cyklosporyn PL PL

Info

Publication number: PL168609B1
Application number: PL91292248A
Authority: PL
Inventors: Ko Soo Young; Hans Kobel; Brigitte Besemer-Rosenwirth; Dieter Seebach; Rene P Traber; Roland Wenger; Pietro Bollinger
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1990-11-02
Filing date: 1991-10-31
Publication date: 1996-03-29
Also published as: SA92120344B1; EP0484281A2; IE913824A1; US5767069A; IL99912A0; DE69124459T3; DK0484281T3; KR100203556B1; HU913446D0; GR3022592T3; AU8692391A; GR3035323T3; CA2054590C; FI915135L; IL99912A; DE69124459T2; NZ240421A; AU649277B2; JPH05208996A; FI111730B

Abstract

Sposób wytwarzania nowych cyklosporyn, a mianowicie (MeIle)4 -cyklosporyny A, znamienny tym, ze poddaje sie hodowli szczep grzyba Tolypocladium inflatum Gams DSM 6627 w pozywce i wyodrebnia produkt z brzeczki fermentacyjnej. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych cyklosporyn o zastosowaniu farmaceutycznym.

Cyklosporyny obejmują grupę wyróżniających się strukturalnie, cyklicznych, poli-N-metylowanych undekapeptydów wykazujących zazwyczaj działanie farmakologiczne, zwłaszcza immunosupresyjne, przeciwzapalne i/lub antypasożytnicze. Pierwsza z wyodrębnionych cyklosporyn była naturalnie występującym metabolitem grzybowym Ciclosporin lub Cyclosporine, znana również jako cyklosporyna A i dostępna w handlu pod zastrzeżoną nazwą handlową SANDIMMUN^R lub SANDIMMUNE^R. Ciclosporin jest cyklosporyna o wzorze A, w którym MeBmt oznacza grupę N-metylo-/4R/-4-but-2E-en-l-ylo-4-metylo-/L//teonylowąo wzorze B, w którym -x-y- oznacza grupę -CH=CH- (trans).

Od pierwszego odkrycia Ciclosporin wyodrębnia się i identyfikuje wiele odmian naturalnie występujących cyklosporyn i wytwarza się wiele dalszych nie-naturalnych cyklosporyn sposobami całkowicie lub pół-syntetycznymi albo przez zastosowania zmodyfikowanych technik hodowlanych. Grupa złożona z cyklosporyn jest w ten sposób znaczna i obejmuje na przykład naturalnie występująca cyklosporyny A do Z (np. Traber i in., 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247-1255 (1977), Traber i in. 2, Helv. Chim. Acta 65, 1655-1667 (1982), Kobel i in., Europ. J. Applied Microbiology and Biotechnology, 14, 273-240 (1982) oraz von Wartburg i in., Progress in Allergy, 38, 28-45, (1986)), jak również różne nie-naturalne pochodne cyklosporyny i sztuczne lub syntetyczne cyklosporyny włącznie z dihydrocyklosporynami (w którym grupa -x-y- reszty MeBmt we wzorze B jest nasycona, dając -x-y- = -CHi-CH,), pochodne cyklosporyn (np. w których 3' -O-atom reszty MeBmt jest acylowany albo dalszy podstawnik jest wprowadzony przy atomie węgla α grupy sarkozylowej w pozycji 3), cyklosporyny, w których grupa MeBmt występuje w postaci izomerycznej (np. w których konfiguracja w poprzek pozycji 6' i 7' grupy MaBmt jest raczej cis niż trans) i cyklosporyny. w których różne aminokwasy są wbudowane w specyficznych pozycjach w sekwencji peptydowej, np. z zastosowaniem całkowicie syntetycznej metody wytwarzania cyklosporyn opracowanej przez R. Wenger - patrz np. Traber i in., 1, Traber i in., 2 i Kobel i in. tamże, opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr nr 44.108.985., 4.220.641, 4.288.431, 4.554.351, 4.396.542 i 4.798.823, europejskie publikacje patentowe nr nr 34.567A, 56.782A, 300.784A, 300.875A i 414.632A, międzynarodowa publikacja patentowa nr WO 86/02080 i Brytyjskie publikacje patentowe nr nr 2.206.119 i 2.207.678, Wenger 1, Transpl. Proc.., 15 Suppl. 1:2230 (1983), Wenger 2., Angew. Chem. Int. Ed. 24, 77 (1985) i Wenger 3., Progress in the Chemistry of Organie Natural Froducts, 50, 123 (1986). '

Grupa złożona z cyklosporyn jest rzeczywiście bardzo duża i obejmuje na przykład (Thr)2-, (Val)2-, (Nva)2- i (Nva)i- (Nva)⁵ -Ciclosporin, znane również jako cyklosporyny C, D, G i M, (3-O-acetylo-M.eBmt)ⁱ-Ciclosporin, znana również jako octan cyklosporyny A, (dihydro-MeBmt)’-(Val)i-Ciclosporin, znana także jako dihydro-cyklosporyna D, [(D)-Ser]⁸ -Ciclosporin, (Melle) '-Ciclosporin, [(D)MeValj‘‘-Ciclosporin, znana również jako cyklosporyna H, (MeAla)⁶-Ciclosporin, [(D)Pro)³-Ciclosporin itp.

168 609

Zgodnie z konwencjonalną nomenklaturą cyklosporyn są one zdefiniowane w niniejszym opisie i zastrzeżeniach patentowych w nawiązaniu do struktury Ciclosporin (to znaczy cyklosporyny A). Przeprowadza się to wskazując najpierw te reszty w cząsteczce, które różnią się od reszt obecnych w Ciclosporin, a następnie stosując określenie Ciclosporin do charakteryzowania pozostałych reszt, które są identyczne z resztami obecnymi w Ciclosporin. Równocześnie przedrostek dihydro stosuje się do oznaczania cyklosporyn, w których reszta MeBmt jest uwodorniona (dihydro-MeBmt), to znaczy, w których grupa -x-y- we wzorze B stanowi -CH₉-CH₂-. I tak (Thr)²-Ciclosporine oznacza cyklosporynę zawierającą sekwencję wykazaną we wzorze A, lecz w którym a Abu w pozycji 2 jest zastąpione przez Thr, a (dihydro-McBmt)'-(Val)²-Ciclosponn oznacza cyklosporynę zawierającą sekwencję wykazaną we wzorze A, lecz w której reszta MeBmt w pozycji 1 jest uwodorniona, a a Abu w pozycji 2 jest zastąpione przez Val.

Ponadto reszty aminokwasów oznaczane skrótami, np. Ala, MeVal, a Abu itd. są zgodnie z konwencjonalną praktyką rozumiane jako posiadające konfigurację (L), jeśli nie podano inaczej, np. jak w przypadku (D)Ala. Skróty grup poprzedzone przez Me, jak w przypadku MeLeu, oznaczają grupy α -N-metylowane. Poszczególne reszty cząsteczki cyklosporyny są numerowane zgodnie z ruchem wskazówek zegara rozpoczynając od reszty MeBmt lub dihydro-MeBmt w pozycji 1. Taką samą sekwencją numeryczną stosuje się w niniejszym opisie i zastrzeżeniach.

Stwierdzono, że Ciclosporin działa przez interferencję z procesem aktywacji komórek T przez blokowanie transkrypcyjnej inicjacji IL-2, chociaż precyzyjny mechanizm nie został jeszcze wyjaśniony. Stwierdzono, że Ciclosporin tworzy kompleks z białkiem 17 kD cytosolicznym (cyklofilina), które występuje w wielu typach komórek i okazało się identyczne z cis-trans izomerazą peptydylo-prolilową, enzymem biorącym udział w składaniu białka. Dotychczas jednakże nie jest jasne, czy wiązanie z cyklofilin^ą jest bezpośrednio związane z immunosupresyjną aktywnością cyklosporyn, czy też wiązanie cyklofiliny samo jest wystarczającym kryterium aktywności immunosupresyjnej.

Stwierdzono, że istnieją cyklosporyny, które wiążą się silnie z cyklofilina, lecz nie są wcale immunosupresyjne. Wynika z tego, że wiązanie z cyklofiliną jest koniecznym, lecz nie wystarczającym kryterium dla aktywności immunosupresyjnej.

Wynalazek niniejszy dotyczy cyklosporyn, które są aktywne przeciwko odtwarzaniu się HIV-1.

Wirus HIV (human immune deficiency), czyli wirus braku odporności człowieka, zakaża głównie limfocyty wspomagające T (T4), chociaż odtwarza on się również w różnych innych typach komórek, zwłaszcza komórek o rodowodzie monocytowym. Powoduje on powoli postępujące schorzenie układu immunologicznego, charakteryzujące się stopniową destrukcją komórek T4, zwane AIDS. Inną odpornościową nienormalnością w AIDS jest wzrost cytotoksycznych/supresyjnych Limfocytów (T8), defekt w antygenowym procesie przedstawianie/rozpoznawanie i poliklonalna aktywacja komórek B. Mechanizm destrukcji komórek T4 jest jeszcze niejasny. Zakażeniu ulegają względnie nieliczne komórki T4, tak więc bezpośredni efekt cytoplastyczny powodowany przez wirus może nie być jedyną przyczyną utraty komórek T4. Powstała hipoteza, że destrukcja komórek T4 może być powiększona przez autoimmunologiczny proces wywołany przez komórki T4 wytwarzające HIV lub pokryte białkiem HIV. To ciągłe antygenowe stymulowanie może prowadzić do stanu permanentnej aktywacji komórek T4, która potęguje odtwarzanie HIV w tych komórkach i powiększa T-cytotoksyczne klony. Nieząkążone komórki T4 można uczynić antygenowymi przez wiązania egzogennych wirusowych gp 120 do ich cząsteczek CD4 i w ten sposób uczynić obiektem odpowiedzi T-cytotoksycznej.

W opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4.814.323 podaje się, że Ciclosporin wykazuje aktywność przeciwko AIDS i że ogólnie cyklosporyny znane jako substancje immunosupresyjne mogą być użyteczne do tego celu. Nie ma tam żadnych wskazań, że można by oczekiwać, by cyklosporyny nie-immunosupresyjne mogły mieć tę właściwość.

168 609

Nieoczekiwanie stwierdzono, że cyklosporyny, które wiążą się z cyklofiliną, lecz nie są immunosupresyjne, wykazują, efekt hamujący wobec odtwarzania HIV-1.

Cyklosporynę uważa się za wiążącą się z cyklofiliną, jeśli wiąże się ona z ludzką rekombinantową. cyklofiliną na poziomie jednej piątej wartości dla Ciclosporin w teście ELISA opisanym przez Quesniaux w Eur. J. Immunol. 1987, 17, 1359-1365. W teście tym testowaną cyklosporynę dodaje się w czasie inkubacji cyklofiliny z pokrytą BSA-Ciclosporin, i oblicza się stężenie potrzebne do uzyskania 50% hamowania reakcji kontrolnej bez substancji współdziałającej (IC₅₀). Wyniki wyraża się w postaci wskaźnika wiązania (BR), który stanowi log o podstawie 10 stosunku IC₅₀ testowanego związku i IC₅₀ samej Ciclosporin w równoczesnym teście. Tak więc wartość BR wynosząca 1.0 wskazuje, że testowany związek wiąże cyklofilinę jedną silnie dziesięciu mniej niż czyni to Ciclosporin, a wartość ujemna wskazuje na wiązanie silniejsze niż Ciclosporin.

Cykłosporyny aktywne wobec HIV mają BR niższy od 0,7 (log₁₀ 5 = około 0,7), korzyswykazuje ona aktywność tnie równy łub niższy od zera.

Cyklosporynę uważa się za nie-immunosupresyjną, gdy w mieszanej reakcji limfocytowej MLR (Mixed Lymphocyte Reaction) nie wyższą niż 5%, korzystnie nie wyższą niż 2% tej wartości dla Ciclosporin. MLR opisana jest przez T. Meo w Immunological Methods, L. Lefkovits and B. Peris, Eds., Academic Press. N.Y. str. 227-239 (1979). Komórki śledziony (0,5 x 10⁶) z myszy Balb(c) samice, 8-10 tygodni) poddaje się współ-inkubacji przez 5 dni z 0,5 x 106 napromieniowanych przez 2000 radów lub traktowanych mitomycyną. C komórek śledziony z myszy CBA (samice, 8-10 tygodni). Napromieniowane komórki alogeniczne wywołują proliferacyjną odpowiedź w komórkach śledziony Balb c, którą można mierzyć przez wbudowanie znacznego prekursora do DNA. Gdy komórki stymulatora są napromieniowane (lub traktowane mitomycyną C), nie odpowiadają one komórkom Balb/c proliferacją, lecz utrzymują swą antygenowość.

Wartość IC₅0 stwierdzoną dla testowanego związku w MLR porównuje się z wartością stwierdzoną dla Ciclosporin w teście równoległym.

Aktywność cyklosporyn jako inhibitorów odtwarzanie HIV-1 można wykazać na podstawie następujących testów.

1. Hamowanie wywołanego przez HIV-1 efektu cytopatycznego w komórkach MT4

Stosuje się sposób opisany przez Pauwels i in., J. Virol. Meth. 20/309 (1988), z niewielkimi modyfikacjami. Szereg HTLV-I-transformowanych komórek T4, MT4, u których uprzednio stwierdzono wysoką podatność na infekcję HIV, stosuje się jako komórki docelowe. Hamowanie HIV-1, efekt cytopatyczny wywołany przez szczep HTLV-IIIB określa się przez pomiar żywotności komórek zakażonych przez HIV i komórek porównawczo zakażonych. Żywotność oznacza się spektrofotometrycznie poprzez redukcję in situ bromku

3-/4,5-dimetylotiazol-2-ilo/-2,5-difenylotetrazoliowego (MTT). Zakażone wirusem i niezakażone hodowle bez związku włącza się jako próby kontrolne, tak jak i niezakażone komórki traktowane związkiem. Stężenie komórek dobiera się tak, aby liczba komórek na ml wzrastała silnie 10 w ciągu 4 dni inkubacji. Wirusowe inoculum nastawia się tak, aby spowodować śmierć komórek w 90% komórek docelowych po 4 dniach inkubacji. Wirus adsorbuje się w 10-krotnie stężonej zawiesinie komórek w temperaturze 37°C w ciągu 1 godziny. Następnie zakażone komórki rozcieńcza się w stosunku 1:10 i wprowadza do płytek do mikromiareczkowania zawierających testowany związek.

2. Cytotoksyczność

Dla oceny potencjału anty-HIV w dodatkowych szeregach komórek, a zwłaszcza w szeregu komórek monocytowych (U937), najpierw ocenia się cytotoksyczność testowanego związku w stosunku do tego szeregu komórek. Zawiesiny komórek Jurkat i U937 doprowadza się do 1 x 105 komórek/ml i poddaje inkubacji w obecności różnych stężeń badanego związku. Po upływie 48 godzin ilości komórek na ml porównuje się drogą barwienia z MTT. Cytotoksyczność komórek MT4 mierzy się w ten sam sposób.

3. Hamowanie odtwarzania HIV-1 w komórkach Jurkat i U937

168 609

Szereg komórek T4 Jurkat i szereg komórek monocytowych U937 zakaża się przez wytworzenie zawiesiny komórek 10-krotnie stężonych w roztworze wirusa. Mieszaninę pozostawia się do adsorpcji w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C. Następnie komórki odwirowuje się, inoculum usuwa się, a komórki ponownie przeprowadza się w zawiesinę o swym początkowym stężeniu w świeżym środowisku hodowlanym zawierającym testowany związek. Tak więc substancję dodaje się po adsorpcji. W dniach 2, 5, 8, 12, 15 i 19 po zakażeniu usuwa się podwielokrotności zakażonych hodowli. Komórki odwirowuje się, a płyn znad osadu gromadzi się. Stężenie wirusowego antygenu p24 określa się w płynie znad osadu za pomocą handlowego zestawu ELISA i służy ono jako parametr dla wytwarzania wirusa. Po każdym usuwaniu podwielokrotności komórki liczy się i nastawia na 2 x 10⁵ komórek/ml przez dodanie świeżego środowiska zawierającego testowany związek w określonym stężeniu.

Spośród związków zgodnych z wynalazkiem, to jest nieimmunosupresyjnych, wiążących cyklofilinę cyklosporyn aktywnych wobec HYV-1, nazywanych dalej związkami aktywnymi, niektóre są nowe, a inne są znane. Jednakże aktywność anty-HIV znanych związków aktywnych nie była dotychczas znana, a w wielu przypadkach dla znanych związków aktywnych nie opisano jakiejkolwiek aktywności farmaceutycznej.

Stwierdzono, że liczne związki aktywne mają struktury różniące się od Ciclosporin, zwłaszcza w pozycji 4 i/lub 5.

Grupa związków aktywnych obejmuje cyklosporyny, w których grupa MeLeu w pozycji 4 jest zastąpiona przez różne N-metylowane aminokwasy, na przykład Melle. Dodatkowo do Melle można również stosować allo-postacie Melle. W allo-formie stereochemia w pozycji β ma przeciwną konfigurację w stosunku do konfiguracji naturalnego aminokwasu, tak że normalne postacie i allo-formy stanowią parę diastereoizomerów.

Szczególnie korzystnym związkiem jest (Melle)⁴-Ciclosporin, który blokuje immunosupresyjne działanie Ciclosporin przez blokowanie jej wiązania z cyklofiliną i w ten sposób działa jako substancja antagonistyczna wobec Ciclosporin.

Związki aktywne można wytwarzać różnymi drogami, które można sklasyfikować następująco:

1) Fermentacja

2) Biotransformacja

3) Tworzenie pochodnych

4) Częściowa synteza

5) Całkowita synteza

Niektóre związki aktywne wytwarza się jako produkty uboczne przy fermentacji oryginalnych lub modyfikowanych szczepów organizmów produkujących Ciclosporin, takich jak Tolypocladium inflatum Gams, jak to wykazano na przykładzie wytwarzania (Melle)4-Ciclosporin w przykładzie I.

Sposób według wynalazku wytwarzania nowych cyklosporyn, a mianowicie (Melle)4-cyklosporyny A [MeIle)4-Ciclosporin] polega na tym, że poddaje się hodowli szczep grzyba Tolypocladium inflatum Gams DSM 6627 w pożywce i wyodrębnia produkt z brzeczki fermentacyjnej.

Następujące przykłady bliżej wyjaśniają wynalazek.

Przykład I. (MeIle)4-Ciclosporin

Szczep produkujący. (Me Ile))4-Ciclosporin otrzymuje się drogą fermentacji szczepu grzyba Tolypocladium inflatum CyE 4556, który został zdeponowany w Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen pod numerem DSM 6627, zgodnie z postanowieniami umowy zawartej w Budapeszcie 24 lipca 1991 r.

Szczep ten jest mutantem szczepu NRRL 8044 gatunku Tolypocladium inflatum Gams i jest taksonomicznie identyczny ze szczepem macierzystym, który jest całkowicie opisany np. w brytyjskim opisie patentowym nr 1.491.509.

Hodowla. 1. Agarowa hodowla wyjściowa. Agarowe hodowle skośne szczepu DSM 6627 wzrastają w ciągu 14 dni w temperaturze 27°C na następującym środowisku agarowym:

wyciąg z drożdży (Gistex) 4g

168 609 ekstrakt słodowy (Wander) 20g agar 20g woda odmineralizowana do 1000 ml

Środowisko wykazuje wartość pH 5,4-5,6 i jest sterylizowane przez 20 minut w temperaturze 120°C.

2. Hodowlawstępna. Zarodnikizgrzybni 4 hod owliwyjściowychzawiesza się w 40 ml 0,9% roztworu soli. Szereg 500 ml kolb Erlenmeyera, każda zawierająca 100 ml środowiska hodowli wstępnej, zakaża się 20 ml tej zawiesiny. Kompozycja środowiska hodowli wstępnej jest następująca:

kazeina(Amher EHC) 25g maltozę 75 g

KH₂P0₄ lg

KC1 2,5g woda odmineralizamana do 1000 ml

W środowisku doprowadza się mprtaść pH do 5,2-5,5 za pomocą HC1, po czym sterylizuje przez 20 minut w temperaturze 120°C. Hodowle wstępne poddaje się fermentacji w ciągu 24 godzin w temperaturze 27°C na wstrząsarce obrotowej przy 200 obrotach (rpm) z mimośrodawaścią 50 mm.

3. Hodowla pośrednia. Stalowy 25-litrowy fermentor zawierający 20 litrów środowiska hodowli wstępnej zakaża się 200 ml hodowli wstępnej. Hodowlę pośrednią poddaje się fermentacji w ciągu 5 dni w temperaturze 27°C, stosując mieszanie 150 rpm i przepływ powietrza 0,5 litra/minutę na litr środowiska pod ciśnieniem 0,5 x 10⁵ Pa.

4. hodowla główna. 100 litrów środowiska hodowli wstępnej zakaża się za pomocą 10 litrów hodowli pośredniej i poddaje fermentacji w stalowym fermentorze HO-litrowym. Do tego środowiska dodaje się 4 g/litr D-treoniny sterylizowanej przy sączeniu. Fermentację prowadzi się w temperaturze 27°C przez 14 dni, stosując mieszanie przy 70 rpm i przepływ powietrza 0,4 litry/minutę na litr środowiska pod ciśnieniem 0,5 x 10⁵Pa, przez pierwsze 5 dni, po czym mieszanie podwyższa się do 100 rpm, a przepływ powietrza do 0,5 litra/minutę przez pozostały okres fermentacji.

'Wyodrębnianie. Grzybnię oddziela się ze środowiska hodowlanego i ekstrahuje w aparacie Turrax drogą 3-krotoego rozdrabniania i mieszania z 10 litrami mieszaniny metanol/woda (9:1 obj.). Rozdrobnioną grzybnię oddziela się od rozpuszczalnika drogą sączenia z odsysaniem, a połączone przesącze zatęża się przez odparowanie pod obniżonym ciśnieniem rn temperaturze 40°C aż do chwili, gdy para składa się głównie z wody. Uzyskami mieszaninę ekstrahuje się 4-krotnie, stosując 2 litry 1,2-dichloroetanu w każdej ekstrakcji i połączone roztwory 1,2-dichlaroetpnowe zatęża się przez odparowanie pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze 40°C.

Pozostałość poddaje się chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (10 kg żelu krzemionkowego, wielkość granulatu 0,02-0,045 mm, Grace), stosując mieszaninę octan etylu/woda jako eluent (frakcje 2,5 litra). Frakcje 20-23 zawierające (Melle)4-Ciclospario gromadzi się, po czym paoomoie poddaje chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym (600g żelu krzemiookomego, wielkość granulatu 0,04-0,063 mm, Merck), stosując chloroform/metanol (98:2 obj.) jako eluent (wielkość frakcji 300 ml). Dalsze oczyszczanie prowadzi się za pomocą chromatografii na kolumnie z żelem krzemiook'.awym (400g żelu krzemionkowego, wielkość granulatu 0,04-0,063 mm, Merck), stosując chlorek metylenu/metanol (98:2 obj.) jako eluent (frakcje 200 ml), i otrzymuje się czystą (Melle)4-Ciclasporin rn postaci bezpostaciowego białego proszku o temperaturze topnienia 155-158°C./(p(20( D = -235° (c=0,68 w CHC1₃) i -193° (c=0,74 w CH₃OH).

Widmo IR w CH,CL, pokazane jest na fig. 1, a widmo protonowe NMR w CDC1₃ podane jest na fig. 2.

Przykład ll. Działanie immunosupresyjne i wiązanie cyklofilmy związków aktywnych w stosunku do Ciclasporin

168 609

W tabeli 1 podaje się przykłady (1) wskaźnika wiązania cyklofiliny (BR) związków aktywnych, mierzonego zgodnie z testem ELISA i (2) aktywności immunosupresyjnej związków aktywnych w stosunku do Ciclosporin, mierzonej jak w próbie MLR i wyrażonej w procentowym stosunku względem Ciclosporin (wskaźnik działania immunosupresyjnego IR). Dalsze objaśnienia znaczenia tych wartości i metod przeprowadzania testów są omówione wyżej.

Tabela 1

Związek	BR/10g,_o	IR(%)
(MeIle)⁴-Ciclosporin	-0,2	1

Przykład III. Aktywność anty-HIV i cytotoksyczność związków aktywnych Przykłady aktywności związków aktywnych i Ciclosporin jako inhibitorów odtwarzania

HIV-1 w komórkach MT4 oraz cytotoksyczność związków aktywnych i Ciclosporin w komórkach MT4 podane są w tabeli 2. Znacznie tych liczb i odpowiednie metody postępowania omówione są wyżej.

Tabela 2

Związek	Cytotoksyczność (pg/ml)	Anty-HIV <ic₅₀)
(MeIle)⁴-Ciclosporin	4,5	0,056
Ciclosporin	8,45	0,53

Związki aktywne wskazane są do stosowania do zapobiegania AIDS u bezobjawowych pacjentów HIV-dodatnich oraz do leczenia pacjentów chorych na AIDS. U pacjentów, u których wystąpiło AIDS, podawanie związków aktywnych powinno odwracać związany z AIDS nadmierny ubytek komórek T4, wywoływać regresję zaburzeń związanych z AIDS, takich jak mięsak Kaposiego i zmniejszać prawdopodobieństwo nowych oportunistycznych zakażeń.

Tak więc zgodnie z wynalazkiem można leczyć lub zapobiegać zespołowi nabytego braku odporności i innym zaburzeniom wywołanym przez wirus HIV-1 u pacjentów zakażonych tym wirusem podając takim pacjentom efektywną ilość związku aktywnego według wynalazku.

Związki aktywne można podawać w sposób konwencjonalny, zwłaszcza dojelitowo, np. doustnie w postaci roztworów pitnych, tabletek lub kapsułek, albo pozajelitowo, na przykład w postaci roztworów łub zawiesin do iniekcji. Wskazana dawka dzienna w przypadku drogi dożylnej wynosi 1-20 mg/kg, korzystnie 3-10 mg/kg, a w przypadku drogi doustnej 1-50 mg/kg, korzystnie 7-20 mg/kg.

Toksyczność związków aktywnych jest zbliżona do toksyczności Ciclosporin. Ze względu na to, że związki aktywne nie są immunosupresyjne, omija się niektóre efekty uboczne Ciclosporin związane z działaniem immunosupresyjnym. Jednakże inna efekty uboczne związane z Ciclosporin, zwłaszcza nefrotoksyczność przy dłuższym stosowaniu, również występują w przypadku związków aktywnych.

Jako korzystne preparaty galenowe związków aktywnych wymienia się mikroemulsje opisane w brytyjskim opisie patentowym nr 2222770A, obejmujące postacie do stosowania miejscowego i doustnego, jak również postacie do podawania doustnego i do iniekcji uzyskane z roztworów stałych zawierających sacharydowy monoester kwasów tłuszczowych, na przykład monołaurynian sacharozy, jak opisano w brytyjskim opisie patentowym nr 2209671 A. Odpowiednia dawka jednostkowa do podawania doustnego zawiera np. 25-200 mg związku aktywnego na dawkę.

Przykład preparatu A:

50,0 mg 180,0 mg 90,0 mg produkt z przykładu I Glycofurol 75 Miglyol 8 i 2

168 609

Cremophor RH40 α -tokoferol produkt z przykładu I tetraglikol Captex 800 Nikkol HCO-40 butylohydroksytoluen (BHT) produkt z przykładu I Glycofurol 75 Miglyol 812 Cremophor RH 40 butylohydroksyanizol (BHA)

180,0 mg 0,5 mg

Przykład preparatu B_: ' ^K 100,0 mg

22,0 mg 22,ϋ mg

866,2 mg

1,0 mg

Przykład preparatu C:

25,0 mg

11)0,0 mg 33,0 mg 90,0 mg

0,2 mg

Przykład preparatu D:

produkt z przykładu I 10,0 mg tetraglikol 110,0 mg

Myritol 5,0 mg

Cremophor RH 40 75,0 mg α -tokoferol 0,1 mg

Poszczególne składniki w tych preparatach, jak również sposoby ich wytwarzania są w pełni opisane w brytyjskim opisie patentowym nr 2222770.

CH_q

I ^óX ^y^CH₂

HO J^R) Ah ^j^H (R) ^CH3

-N--CH-COI (S)

CHo

WZÓR B

168 609 — W’-X -R-Y -Z-MeLeu-Ala-(D)Ala-Meleu-MeLeu-Me\/al — 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 i

WZÓR 2 — W- °tAbu-Sar-V-Z’-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeL£u-MeL£u-Me\/al — 1234567 8 9 10 11

WZÓR 2' r—W -X - R -Y-Z-Q- Ala -(D)Ala-MeLeu -Me Leu-MeVal — 1234567 8 9 10 11

WZÓR 1 r-W’ - X - Sar -Y'-Z’-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal—i 12345 6 78 9 10 11

WZÓR 1’ —MeBmt-otAbu-Sar-MeLeu-Val-Mel£u-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-Me\/al — 1 2345678 9 10 11

WZÓR A

168 609 % Abscrpticn

s 'Ή er-?

LC

168 609

^J,<N ro uZ) so ru.

0-3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania nowych cyklosporyn, a mianowicie (MeIle)⁴-cyklosporyny A, znamienny tym, że poddaje się hodowli szczep grzyba Tolypocladium inflatum Gams DSM 6627 w pożywce i wyodrębnia produkt z brzeczki fermentacyjnej.