PT853661E

PT853661E - Membros de ligacao especifica para o factor beta de crescimento de transformacao humano; materiais e metodos

Info

Publication number: PT853661E
Application number: PT96932730T
Authority: PT
Inventors: Julia Elizabeth Thomson; Tristan John Vaughan; Andrew James Williams; Jonathan Alexander Green; Ronald Henry Jackson; Louise Bacon; Kevin Stuart Johnson; Alison Jane Wilton; Philip Ronald Tempest; Anthony Richard Pope
Original assignee: Cambridge Antibody Tech
Priority date: 1995-10-06
Filing date: 1996-10-07
Publication date: 2000-08-31
Also published as: ES2146020T3; CA2233042A1; ATE199091T1; DE69611766T2; GB2305921A; CA2233042C; DE69607191D1; EP0945464A1; EP0853661A1; EP0853661B1; AU702049B2; ATE190650T1; GB2305921B; CA2599488A1; DE69611766D1; WO1997013844A1; GR3035775T3; AU7140596A; JP2000500643A; GB9601081D0

Description

84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ DESCRICÃO "Membros de ligação específica para o factor beta de crescimento de transformação humano; materiais e métodos" A presente invenção refere-se a membros de ligação específica para o factor beta de crescimento de transformação (TGFp) humano e a materiais e métodos que com eles se relacionam. Em particular, refere-se a membros de ligação específica compreendendo domínios de ligação de anticorpos humanos. Anticorpos humanos contra o TGFp humano podem ser isolados e utilizados no tratamento de doenças, em particular de doenças fibróticas e também de doenças imunitárias/inflamatórias. O isolamento e auto-anticorpos próprios a partir de repertórios de segmentos de anticorpos exibidos sobre fagos foi descrito (A.D. Griffiths et a/., EMBO J. 12, 725-734, 1993; A. Nissim et a/., EMBO J. 13, 692-698, 1994; A.D. Griffiths eia/., 13, 3245-3260, 1994; C. Barbas et a/., Proc. Nat/. Acad. Sei. USA 90, 10003-10007, 1993; W093/11236). Contudo, a presente invenção proporciona anticorpos específicos contra uma isoforma particular de TGFp, anticorpos estes que possuem propriedades inesperadas e vantajosas. O TGFp é uma citóquina conhecida como estando envolvida em muitos processos celulares tais como a proliferação e a diferenciação celulares, o desenvolvimento embrionário, a formação da matriz extracelular, o desenvolvimento ósseo, a cura de ferimentos, a hematopoiese e as respostas imunitária e inflamatória (A.B. Roberts & M. Sporn 1990, pág. 419-472 em Handbook of Experimenta! Pharmacology eds. M.B. Sporn & A.B. Roberts, Springer Heidelberg; J. Massague et a!., Annua! Rev. Cell Biol. 6, 597-646, 1990). A acumulação de excessiva matriz extracelular está associada a várias doenças fibróticas. Assim, existe uma necessidade de controlar agentes como o TGFpi e o TGFp2 para evitar os seus efeitos prejudiciais nestas doenças e esta é uma aplicação dos anticorpos humanos para o TGFp humano. A modulação das respostas imunitária e inflamatória por TGF beta inclui (i) a inibição da proliferação de todos os subconjuntos de células T, (ii) os 2 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ efeitos inibitórios sobre a proliferação e a função de linfócitos B, (iii) a regulação no sentido da diminuição da actividade de células assassinas naturais e da resposta de células T, (iv) a regulação da produção de citóquinas por células imunitárias, (v) a regulação da função de macrófagos e (vi) o recrutamento e a activação de leucócitos.

Uma aplicação adicional dos anticorpos para o TGFp pode ser no tratamento de doenças imunitárias/inflamatórias tais como a artrite reumatóide, onde estas funções precisam de ser controladas. É uma tarefa exigente isolar um fragmento de anticorpo específico para TGFp da mesma espécie. Os animais não produzem normalmente anticorpos contra auto-antigénios, um fenómeno denominado tolerância (G.J. Nossal Science 245. 147-153, 1989). De um modo geral, a vacinação com um auto-antigénio não resulta na produção de anticorpos em circulação. É portanto difícil criar anticorpos humanos para auto-antigénios humanos. Existem também além disso problemas éticos na vacinação de humanos. Em relação à criação de anticorpos não humanos específicos para ΤβΡβ, existem vários problemas. O TGFp é uma molécula imunossupressora e adicionalmente existe uma forte conservação de sequências entre as moléculas de TGFp humano e de ratinho. O TGFpi humano e o de ratinho apenas diferem em um resíduo de aminoácido, uma alteração de alanina (humano) para serina (ratinho) num resíduo encoberto (R. Derynck et ai., J. Bioi. Chem. 261.4377-4379, 1986). O TGFp2 humano e o de ratinho apenas diferem em três resíduos de aminoácido; o resíduo 59 (T no de ratinho, S no humano); o resíduo 60 (K no de ratinho, R no humano) e o resíduo 94 (N no de ratinho, K no humano). Isto torna difícil criar anticorpos em ratinhos contra o TGFp humano. Adicionalmente, quaisquer anticorpos criados podem apenas ser dirigidos contra um conjunto restrito de epítopos.

Foram criados anticorpos policlonais que se ligam a TGFpi humano e a TGFp2 humano contra ambos os epítopos neutralizante e não neutralizante, no coelho (Danielpoúr et ai., Growth Factors 2 61-71, 1989; A. Roberts et ai., Growth Factors 3, 277-286, 1990), na galinha (R&D Systems, Minneapolis) e no peru (Danielpoúr et ai. J. Cell Physiol., 138. 79-86, 1989). Péptidos que representam sequências parciais de TGFp têm também sido utilizados como imunogénios para criar anti-soros policlonais neutralizantes em coelhos (W.A.

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Border et ai, Nature, 346. 371-374, 1990; K.C. Flanders, Biochemistry, 2JL> 739-746, 1988; K.C. Flanders et a!., Growth Factors, 3, 45-52, 1990). Em adição houve relatórios limitados de isolamento de anticorpos monoclonais de ratinho contra TGFp. Após imunização com TGFP2 bovino (idêntico ao TGFp2 humano), isolaram-se três anticorpos monoclonais não neutralizantes que são específicos para TGFP2 e um anticorpo neutralizante que é específico para TGFpi e TGFp2 (J.R. Dasch et ai, J. Immunol., 142. 1536-1541, 1989). Noutro relatório, após imunização com TGFpi humano, isolaram-se anticorpos neutralizantes que eram específicos para TGFpi ou reagiam de modo cruzado com TGFpl, TGFp2 e TGFp3 (C. Lucas et a/., J. Immunol., 145. 1415-1422, 1990). Um anticorpo monoclonal neutralizante de ratinho que se liga a ambas as isoformas TGFp2 e TGFP3 está disponível no comércio por Genzyme Diagnostics. O presente texto revela o primeiro isolamento de anticorpos humanos dirigidos contra o TGFpl humano e contra o TGFP2 humano. Um anticorpo monoclonal de ratinho dirigido contra o TGFpl humano está disponível de R&D Systems. Este anticorpo neutraliza apenas fracamente o TGFpl num ensaio de neutralização. Os anticorpos monoclonais neutralizantes de ratinho têm também sido gerados a partir de ratinhos imunizados com péptidos de TGFpl humano compreendendo as posições de aminoácidos 48 a 60 (anticorpo reactivo com TGFpl, TGFp2 e TGFP3) e as posições de aminoácidos 86-101 (anticorpo específico para TGFpi; M. Hoefer & F.A. Anderer, Câncer Immunol. Immunother. 41_, 302-308, 1995). A tecnologia de anticorpos sobre fagos (W092/01047; PCT/GB92/00883; PCT/GB92/01755; W093/11236) oferece a capacidade de isolar directamente anticorpos humanos contra TGFp humano. No pedido W093/11236 foi revelado o isolamento de auto-anticorpos a partir de bibliotecas exibidas sobre fagos e foi sugerido que anticorpos específicos para TGFp podiam ser isolados a partir de bibliotecas exibidas sobre fagos. O presente pedido mostra que podem ser isolados anticorpos de especificidades diferentes para moléculas de TGFp. O TGFpl, o TGFp2 e o TGFP3 constituem um grupo estreitamente relacionado de citóquinas. São dímeros que consistem em dois monómeros de 11 2 aminoácidos juntos por uma 4 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ ponte de dissulfureto entre as cadeias. O TGFpi difere do TGFP2 em 27 alterações essencialmente conservativas e do TGFP3 em 22 alterações essencialmente conservativas. Estas diferenças foram relacionadas com a estrutura 3D (M. Schlunegger & M.G. Grutter, Nature, 358, 430-434, 1992). Os presentes requerentes isolaram anticorpos que são essencialmente específicos para TGFpi (muito fraca reactividade cruzada com TGFp2); anticorpos que são essencialmente específicos para TGFp2 (muito fraca reactividade cruzada com TGFpD; e anticorpos que se ligam tanto a TGFpi como a TGFP2. Portanto, estes três diferentes tipos de anticorpos, cada tipo com especificidades de ligação distintas, têm que reconhecer diferentes epítopos sobre as moléculas de TGFp. Estes anticorpos têm fraca reactividade cruzada com TGFP3, como avaliado por estudos de ligação utilizando ensaios com biossensores (e.g., BIACore™), ELISA e ensaios com radiorreceptores. O anticorpo mais profundamente estudado, o lgG4 6B1, apresenta 9% de reactividade cruzada com TGFP3, em comparação com TGFp2, determinada pelas suas constantes de dissociação relativas, determinadas utilizando um biossensor.

As isoformas de TGFp são inicialmente exportadas de células em formas inactivas, latentes (R. Pircher et a/., Biochem. Biophys. Res. Commun., 136. 30-37, 1986; L.M. Wakefield et ai, Growth Factors, 1, 203-218, 1989). Estas formas inactivas são activadas por proteases no plasma para gerar a forma activa do TGFp. É esta forma activa de TGFp2 que se liga a receptores promovendo a deposição de matriz extracelular e os outros efeitos biológicos do TGFp. A forma activa do TGFp representa uma proporção relativamente baixa do TGFp presente no plasma. Portanto, para um anticorpo neutralizante contra TGFp ser mais eficaz na prevenção de fibrose, o anticorpo deverá reconhecer a forma activa mas não a forma latente. No Exemplo 6 demonstra-se que um anticorpo preferido da presente invenção ("lgG4 6B1") reconhece a forma activa mas não a latente do TGFP2. O epítopo de lgG4 6B1 foi identificado utilizando uma combinação de bibliotecas peptídicas de exibição e estudos de inibição utilizando péptidos da região do TGFP2 identificada a partir de fagos seleccionados da biblioteca peptídica de exibição sobre fagos. Isto está descrito nos Exemplos 11 e 14. A sequência identificada a partir da biblioteca peptídica é RVLSL e representa os 5 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ aminoácidos 60 a 64 do TGFP2 (Exemplo 11). Mostrou-se também que o anticorpo lgG4 6B1 se liga a um péptido que corresponde aos aminoácidos 56 a 69 do TGFp2 (TQHSRVLSLYNTIN) com um prolongamento de três aminoácidos (CGG) no terminal N. RVLSL é o epítopo mínimo, lgG4 6B1 liga-se provavelmente a mais aminoácidos adjacentes. De facto, se o epítopo for tridimensional podem haver outras sequências não contíguas às quais o anticorpo se ligará. O lgG4 6B1 apresenta ligação muito mais fraca ao péptido que corresponde aos aminoácidos 56 a 69 do TGFpl (CGG-TQYSKVLSLYNQHN).

Os resultados do Exemplo 14 suportam a atribuição do epítopo de lgG4 6B1 sobre TGFp2 aos aminoácidos na região dos resíduos 60 a 64. O péptido utilizado neste exemplo, os resíduos 56 a 69, corresponde aos aminoácidos da hélice alfa H3 (M.P. Schlunegger & M.G. Grutter, Nature, 358. 430-434, 1992; também conhecida como a hélice a3 (S. Daopin et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, VJ_, 176-192, 1993). O TGFp2 forma um dímero de cauda-para-cabeça com a hélice alfa H3 (também referida como o "calcanhar") de uma subunidade que forma uma interface com regiões “finger" (incluindo os resíduos 24 a 37 e os resíduos na região dos aminoácidos 91 a 95; também referidos como "finger" 1 e 2) da outra subunidade (S. Daopin et al., supra). Foi proposto que as características da estrutura primária que interactuam com o receptor de TGFp2 consistem nos aminoácidos da extremidade do terminal C da hélice alfa H3 de uma cadeia juntamente com os resíduos dos “finger'' 1 e 2 da outra cadeia (D.L. Griffith et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 878-883, 1996). A identificação de um epítopo para lgG4 6B1 no interior da hélice alfa H3 de TGFp2 é consistente com o facto de o lgG4 6B1 evitar a ligação ao receptor e neutralizar a actividade biológica do TGFp2.

Como anteriormente notado, se o epítopo para lgG4 6B1 for tridimensional podem existir outros aminoácidos não contíguos aos quais o anticorpo se pode ligar.

Houve anteriormente notícias de que anticorpos dirigidos contra esta região do TGFP2 podem ser específicos para o TGFp2 e neutralizar a sua actividade. Flanders et al. (Development, 113. 183-191, 1991) mostraram que 6 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ podiam ser criados anti-soros policlonais em coelhos contra os resíduos 50 a 75 do TGFp2 maduro e que estes anticorpos reconheciam o TGFP2 mas não o TGFpi em transferências de Western. Num artigo anterior, K.C. Flanders et al. (Biochemistry, 27, 739-746, 1988) mostraram que anti-soros policlonais criados em coelhos contra os aminoácidos 50 a 75 do TGFpi podiam neutralizar a actividade biológica do TGFpi. O anticorpo isolado neste pedido, lgG4 6B1, é um anticorpo humano dirigido contra os aminoácidos nesta região que neutraliza a actividade biológica do TGFp2 humano. É um facto surpreendente que um tal anticorpo neutralizante contra TGFp2 possa ser isolado em humanos (onde a imunização com um péptido não pode ser utilizada por razões éticas) directamente de um repertório de anticorpos exibidos sobre fagos. 0 conhecimento de que os resíduos da hélice alfa H3 formam um epítopo neutralizante para o TGFp2 significa que fagos que exibam anticorpos neutralizantes podem ser obtidos por selecção a partir de repertórios de anticorpos exibidos sobre fagos através da ligação a um péptido desta região acoplado a uma proteína transportadora tal como albumina sérica bovina ou hemocianina de lapa do género Fissurela. Esta abordagem pode ser aplicada para seleccionar anticorpos que sejam capazes de neutralizar a actividade biológica do TGFpi seleccionando no péptido TQYSKVLSLYNQHN acoplado a uma proteína transportadora. É possível que esta abordagem possa ser estendida a péptidos das regiões de ligação aos receptores das isoformas de TGFp que não a hélice alfa H3.

Foi também demonstrado pelos presentes inventores que se podem obter anticorpos específicos para TGF3 através de isolamento a partir de bibliotecas derivadas de diferentes fontes de genes de imunoglobulinas: de repertórios de domínios variáveis de imunoglobulinas naturais, e.g., de hospedeiros imunizados ou não imunizados; e repertórios sintéticos derivados de genes de V de linhas germinais combinados com CDR3 sintéticos. São descritas as propriedades destes anticorpos no formato Fv de uma só cadeia e de lgG4 completa.

Como anteriormente notado, W093/11236 sugere que podem ser isolados anticorpos humanos dirigidos contra o TGFp humano a partir de bibliotecas de exibição sobre fagos. Mostra-se aqui que as bibliotecas de exibição sobre fagos a partir das quais se isolaram auto-anticorpos em 7 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ W093/11236 podem ser utilizadas como uma fonte de anticorpos humanos específicos para isoformas particulares do TGFp humano. Por exemplo, no Exemplo 1 do presente pedido, isolaram-se o anticorpo 1A-E5 específico para TGFpl e os anticorpos 2A-H11 e 2A-A9 específicos para o TGFP2, a partir da "biblioteca sintética" descrita nos exemplos 5 a 7 de W093/11236 e em Nissim et at. (1994; supra). Adicionalmente, a biblioteca de exibição sobre fagos derivada de leucócitos de sangue periférico (PBL) de um ser humano não imunizado (exemplos 1 a 3 de W093/11236) foi a fonte do anticorpo 1B2 específico para o TGFpi. Bibliotecas de exibição sobre fagos feitas subsequentemente utilizando genes de anticorpos derivados a partir de amígdalas e medula óssea humanas, proporcionaram também fontes de anticorpos específicos para o TGFp humano. Assim, o TGFp humano é um exemplo de um auto-antigénio humano contra o qual podem ser isolados anticorpos a partir de "grandes bibliotecas universais". Os anticorpos humanos contra o TGFp humano com propriedades melhoradas podem ser obtidos por rearranjo ("shuffling") de cadeias, combinando por exemplo os domínios VH de anticorpos derivados de uma biblioteca com os domínios VL de outra biblioteca, expandindo deste modo o conjunto de parceiros VL testados para cada domínio VH. Por exemplo, os anticorpos 6B1, 6A5 e 6H1, específicos para TGFp2, utilizam o domínio VH de 2A-H11 isolado da "biblioteca sintética" combinado com uma cadeia leve da biblioteca de PBL.

Assim, os domínios VH e VL de anticorpos específicos para TGFp podem ser contribuições de bibliotecas de exibição sobre fagos derivadas de genes de V rearranjados tais como os de PBL, amígdala e medula óssea, e de domínios V derivados de segmentos clonados de linhas germinais de V combinados com CDR sintéticas. Mostra-se também que existe uma gama diversa de anticorpos que são específicos para TGFpi ou TGFp2. Os anticorpos que foram isolados tanto contra TGFpi como contra TGFp2, utilizaram principalmente genes de V derivados de linhas germinais de VH da família VH3. Foi utilizada uma variedade mais vasta de regiões variáveis de cadeia leve, de ambos os tipos lambda e capa.

Os anticorpos individuais que foram isolados possuem propriedades vantajosas inesperadas. Por exemplo, mostrou-se que os anticorpos dirigidos contra TGFP2 (6H1, 6A5 e 6B1) se ligam ao TGFP2 com velocidades na 8 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ dissociação ("off-rates") lentas (constantes de velocidade na dissociação, koff, da ordem de 10'3 s'1 e constantes de dissociação inferiores a 10'8 M) para neutralizar a actividade do TGFP2 em ensaios in vitro e para ser potente em aplicações in vivo. Mostrou-se que o anticorpo lgG4 6B1 se liga especificamente ao TGFP2 em imuno-histoquímica em tecidos de mamífero e não reage de modo cruzado com outros antigénios em tecidos humanos. As propriedades destes anticorpos pode torná-los particularmente adequados para aplicações terapêuticas. O facto destes anticorpos partilharem a mesma cadeia pesada, mostra que os domínios VH podem ser eficazes com várias cadeias leves diferentes, apesar de haver diferenças na potência ou alterações subtis de epítopo com diferentes cadeias leves. Tal como mostrado nos Exemplos 3 e 4 e nas Tabelas 4 e 5, o lgG4 6B1 é o anticorpo mais potente na neutralização da actividade do TGFp2 no ensaio com radiorreceptores e no ensaio de proliferação de TF1. Pode-se esperar contudo que as suas propriedades sejam qualitativamente semelhantes à dos anticorpos 6A5 e 6H1 com os quais partilha um domínio VH comum. Assim, seria de esperar que a redução de cicatriz neural observada no tratamento com Fv de uma só cadeia 6A5 e com lgG4 6H1, mostrada no Exemplo 5, fosse reproduzida com ο 6B1. Os anticorpos dirigidos contra o TGFpi (em particular o 1B2 e seus derivados) possuem também propriedades vantajosas inesperadas. O anticorpo 27C1/10A6 derivado de 1B2 por rearranjo de cadeias, "picagem" e conversão no anticorpo lgG4 completo, mostrou ser potente num modelo de cicatriz in vitro. O domínio VH deste anticorpo foi derivado por mutagénese de "picagem" ("spiking") dirigida ao local a partir do anticorpo progenitor 7A3. Obteve-se um grande número de clones "picados" que apresentaram propriedades semelhantes em ensaios in vitro. Pode haver várias alterações no CDR3 do VH em comparação com o 27C1, por exemplo, ο 28A-H11 difere em 7 das 14 posições, sendo 2 duas delas alterações não conservativas. Assim, podem haver até 50% dos resíduos no CDR3 de VH alterados sem afectar as propriedades de ligação.

Mostrou-se que anticorpos específicos para TGFpl humano e para TGFp2 humano eram eficazes em modelos animais para o tratamento de doenças fibróticas e outras doenças tais como artrite reumatóide, onde o TGFp é super-expresso. Mostrou-se que anticorpos contra TGFp eram eficazes no tratamento de glomerulonefrite (W. A. Boeder et. ai., Nature, 346. 371-374, 1990); cicatriz neural (A. Logan et a/., Eur. J. Neurosci., 6, 355-363, 1994);

cicatriz dérmica (M. Shah et a!., Lancet, 339. 213-214, 1992; M. Shah et ai, J. Cell Science, 107. 1137-1157, 1994; M. Shah et a!., 108. 985-1002, 1995); fibrose pulmonar (S.N. Giri et ai, Thorax, 48, 959-966, 1993); lesões arteriais (Y. G. Wolf, L.M. Rasmussen & E. Ruoslahti, J. Clin. Invest. 93, 1172-1178, 1994) e artrite reumatóide (Wahl et ai, J. Exp. Medicine, 177. 225-230, 1993). Foi sugerido que o TGFp3 actua de modo antagonista em relação ao TGFpi e ao TGFp2 na cicatriz dérmica (M. Shah et ai, 1995 supra). Portanto, anticorpos para o TGFpi ou para o TGFP2 com reactividade cruzada aparente para com o TGFP3, como determinado por estudos de ligação utilizando um ensaio com biossensores (e.g. BIACore™), ELISA ou um ensaio com radiorreceptores, tal como descrito neste pedido, ou seja, anticorpos que se ligam preferencialmente ao TGFpl ou ao TGFp2 em relação ao TGFP3, deverão ser vantajosos nesta e em outras condições tais como condições fibróticas em que seja desejável contrariar os efeitos de promoção de fibrose do TGFpi e do TGFP2. Um anticorpo que reage fortemente de modo cruzado com TGFp3 teve contudo efeito num modelo animal de artrite reumatóide (Wahl et ai, 1993, supra).

Haverá provavelmente aplicações para além das condições que foram acima mencionadas, uma vez que existem muitos outros modelos in vitro de doenças em que anticorpos contra TGFp mostraram ser promissores em termos de eficácia terapêutica. Pode ter importância particular a utilização de anticorpos contra TGFp para o tratamento de doenças dos olhos que envolvem fibrose ocular, incluindo retinopatia proliferativa (R.A. Pena et ai., (ref. abaixo), deslocamento da retina e pós-cirurgia de drenagem de glaucoma (P.T. Khaw et ai, Eye, 8, 188-195, 1994). Connor et ai, (J. Clin. Invest., 83. 1661-1666, 1989) mostraram que estavam presentes níveis muito mais elevados de TGFP2 em aspirados vítreos de pacientes com fibrose intra-ocular associada a retinopatia proliferativa do que em pacientes com deslocamento da retina sem complicações sem fibrose ocular e que a actividade biológica deste TGFP2 podia ser neutralizada com anticorpos dirigidos contra TGFp2. Adicionalmente, Pena et ai {Invest. Ophthalmology. Vis. Sei., 35:2804-2808, 1994) mostraram que anticorpos contra TGFp2 inibem a contracção do colagénio estimulada por TGFp2. A contracção do gel vítreo por fibroblastos e outros tipos de células desempenha um papel crítico no processo da doença retinopatia proliferativa, um processo que se pensa ser mediado por TGFp2.

Existe outra evidência que aponta no sentido de o TGFp2 ser a isoforma de TGFp mais importante na promoção de fibrose intra-ocular. Mostrou-se que o TGFP2 era a isoforma predominante de TGFp na retina neural, no pigmento retinal do epitélio coróide e vítreo do olho humano (Pfeffer et a!., Exp. Eye Res. 59: 323-333, 1 994) e se encontra em humor aquoso humano em espécimes de olhos submetidos a extracção de cataratas com implantação de lentes intra-oculares (Jampel et a!., Current Eye Research, 9: 963-969, 1990). As células epiteliais de pigmento retinal humano não transformadas segregam predominantemente TGFP2 (Kvanta Ophthalmic Res. 26: 361-367, 1994).

Outras doenças com potencial para o tratamento com anticorpos contra TGFp incluem o síndrome de dificuldade respiratória do adulto, a cirrose do fígado, o pós-enfarte do miocárdio, o pós-estenose recidiva angioplástica, cicatrizes quelóides e esclerodermia. 0 nível aumentado da expressão de TGFP2 na osteoporose (Erlenbacher et al., J. Cell Biol. 1 32: 195-210, 1996) significa que esta é uma doença potencialmente tratável com anticorpos dirigidos contra o TGFp2. A utilização de anticorpos contra TGFp para o tratamento de doenças tem sido o objecto de pedidos de patente para a doença fibrótica (W091/04748); cicatriz dérmica (W092/17206); doenças de deficiência de macrófagos (PCT/US93/00998); infecções patogénicas de macrófagos (PCT/US93/02017); cicatriz neural (PCT/US93/03068); desordens vasculares (PCT/US93/03795); prevenção de cataratas (W095/1 3827). Os anticorpos humanos contra o TGFp humano descritos neste pedido deverão ser valiosos nestas condições.

Mostra-se aqui que os anticorpos humanos tanto contra o TGFpi humano como contra o TGFP2 humano podem ser eficazes no tratamento de fibrose em modelos animais de cicatriz neural e glomerulonefrite quer no formato de Fv de uma só cadeia quer no de anticorpo completo. Esta é a primeira revelação da eficácia de anticorpos dirigidos contra apenas o TGFp2 como único tratamento nestas indicações, apesar de alguma eficácia de anticorpos contra TGFP2 ter sido apenas observada num modelo de fibrose pulmonar (Giri et a!., Thorax 48: 959-966, 1993 supra). A eficácia dos anticorpos humanos contra TGFp humano no tratamento de doença fibrótica foi determinada através da medição

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11 de uma diminuição na acumulação de componentes da matriz extracelular, incluindo fibronectina e laminina em modelos animais. A evidência da eficácia dos anticorpos contra TGFp2 e TGFpi aqui descrita na prevenção de cicatriz neural na experiência no modelo animal significa que estes anticorpos são provavelmente eficazes em outros estados de doença mediados por TGFp. Para comparação, mostrou-se que anti-soros isolados de perus dirigidos contra isoformas de TGFp por Danielpour et ai. {Cell Physiol. 138: 79-86, 1989) eram eficazes na prevenção de cicatriz dérmica (Shah et a/., J. Cell Science 108: 985-1002, 1995), cicatriz neural (Logan et ai, supra) e em experiências in vitro relacionadas com retinopatia proliferativa (Connor et ai., supra).

TERMINOLOGIA

Membro de ligação específica

Esta expressão descreve um membro de um par de moléculas que têm especificidade de ligação uma para com a outra. Os membros de um par de ligação específica podem ser derivados naturalmente ou podem ser completa ou parcialmente produzidos de modo sintético. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, que se liga especificamente, e é portanto complementar, a uma organização polar e espacial particulares do outro membro do par de moléculas. Assim, os membros do par têm a propriedade de se ligar especificamente um ao outro. São exemplos de tipos de pares de ligação específica antigénio-anticorpo, biotina-avidina, hormona-receptor da hormona, receptor-ligando, enzima-substrato. Este pedido refere-se a reacções do tipo antigénio-anticorpo.

Anticorpo

Este termo descreve uma imunoglobulina natural, ou parcial ou completamente produzida de modo sintético. O termo cobre também qualquer polipéptido ou proteína possuindo um domínio de ligação que seja um domínio de ligação a um anticorpo ou que seja homólogo a um tal domínio. Estes podem ser derivados de fontes naturais ou podem ser parcial ou completamente //

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 12 produzidos sinteticamente. São exemplos de anticorpos os isotipos de imunoglobulinas e as suas subclasses isotípicas; fragmentos que compreendem um domínio de ligação a antigénios tais como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e "diacorpos" ("diabody"). É possível tomar anticorpos monoclonais e outros anticorpos e utilizar técnicas de tecnologia de ADN recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retenham a especificidade do anticorpo original. Estas técnicas podem envolver a introdução de ADN que codifica a região variável da imunoglobulina ou as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo nas regiões constantes, ou em regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Veja-se por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A-239400. Um hibridoma ou outra célula que produza um anticorpo pode ser submetida a mutação genética ou outras alterações, que podem ou não alterar a especificidade de ligação de anticorpos produzidos.

Uma vez que os anticorpos podem ser modificados de várias maneiras, o termo "anticorpo" deve ser considerado como cobrindo qualquer membro de ligação específica ou substância que possua um domínio de ligação com a especificidade requerida. Assim, este termo cobre fragmentos de anticorpos, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipéptido que compreenda um domínio de ligação de imunoglobulina, quer natural quer completa ou parcialmente sintético. Moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundidas com outro polipéptido estão portanto incluídas. A clonagem e a expressão de anticorpos quiméricos estão descritas em EP-A-0120694 e EP-A-0125023.

Mostrou-se que fragmentos de um anticorpo completo podem desempenhar a função de antigénios de ligação. São exemplos de fragmentos de ligação (i) o fragmento Fab que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb (Ward, E.S. et a!., Nature, 341. 544-546 (1989)) que consiste num domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados; (vii) moléculas de Fv de uma só

cadeia (scFV), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um local de ligação ao antigénio (Bird et a/., Science, 242. 423-426, 1988; Huston et a!., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv de uma só cadeia biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos pluriespecíficos e plurivalentes construídos através de fusão de genes (W094/13804; P. Holliger et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 6444-6448, 1993).

Os "diacorpos" são multímeros de polipéptidos, compreendendo cada polipéptido um primeiro domínio que compreende uma região de ligação de uma cadeia leve de uma imunoglobulina e um segundo domínio que compreende uma região de ligação de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina, estando os dois domínios ligados (e.g., por um ligante peptídico) mas sendo incapazes de se associarem um com o outro para formar um local de ligação ao antigénio: os locais de ligação ao antigénio são formados pela associação do primeiro domínio de um polipéptido no multímero com o segundo domínio de outro polipéptido no multímero (W094/1 3804).

Quando se utilizam anticorpos biespecíficos, estes podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados de várias maneiras (Holliger, P. e Winter G., Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), e.g. preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Pode ser preferível utilizar dímeros de scFv ou "diacorpos" em vez de anticorpos completos. Os "diacorpos" e os scFv podem ser construídos sem uma região Fc, utilizando apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de reacção anti-idiotípica. Outras formas de anticorpos biespecíficos incluem os "Janusins" de uma só cadeia descritos em Traunecker et ai, Embo Journal, 10. 3655-3659,(1991).

Os "diacorpos" biespecíficos, ao contrário dos anticorpos completos biespecíficos, podem também ser particularmente úteis pois podem ser prontamente construídos e expressos em E. co/i. Os "diacorpos" (e muitos outros polipéptidos tais como fragmentos de anticorpos) com especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente seleccionados utilizando exibição 14 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ sobre fagos (W094/13804) a partir de bibliotecas. Quando se pretende manter constante um ramo do "diacorpo", por exemplo, com uma especificidade dirigida contra o antigénio X, pode então ser feita uma biblioteca em que se faz variar o outro ramo e pode ser seleccionado um anticorpo com especificidade apropriada.

Domínio de ligação ao antigénio

Esta expressão descreve a parte de um anticorpo que compreende a área que se liga especificamente e é complementar a parte ou todo um antigénio. Quando o antigénio é grande, um anticorpo pode ligar-se apenas a uma parte particular do antigénio, parte essa que é denominada um epítopo. Um domínio de ligação ao antigénio pode ser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpos. Preferencialmente, um domínio de ligação ao antigénio compreende uma região variável de cadeia leve (VL) do anticorpo e uma região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo.

Específico

Este termo pode ser utilizado para referir a situação em que um membro de um par de ligação específica não apresentará qualquer ligação significativa a moléculas que não o(s) seu(s) parceiro(s) de ligação específica. O termo também é aplicável onde e.g., um domínio de ligação ao antigénio é específico para um epítopo particular de que são portadores vários antigénios, caso em que o membro de ligação específica que é portador do domínio de ligação ao antigénio será capaz de se ligar aos vários antigénios portadores do epítopo.

Neutralização

Este termo refere-se à situação em que a ligação de uma molécula a outra molécula resulta na abolição ou inibição da função biológica efectora da outra molécula.

Uma variante, um derivado ou um mutante de um anticorpo podem ser obtidos por modificação da molécula progenitora através de adição, deleção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos, ou através da ligação de

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outra molécula. Estas alterações podem ser realizadas ao nível do nucleótido ou da proteína. Por exemplo, o polipéptido codificado pode ser um fragmento Fab que é depois ligado a uma cauda Fc de outra fonte. Alternativamente, podem-se ligar um marcador, tal como uma enzima, fluoresceína, etc.

Compreender

Este termo é geralmente utilizado no sentido de incluir, ou seja, permitir a presença de uma ou mais características ou componentes. A presente invenção proporciona de um modo geral um membro de ligação específica que compreende um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo humano. Mais particularmente, proporciona um membro de ligação específica para o TGFp2 humano. A presente invenção proporciona um membro de ligação específica que compreende um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo humano, específico para TGFP2, e que tem pouca reactividade cruzada com o TGFp3. A reactividade cruzada pode ser avaliada utilizando qualquer um ou todos os ensaios seguintes: biossensores (e.g. BIACore™), ELISA e radiorreceptores. A presente invenção proporciona um membro de ligação específica que compreende um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo humano, específico para TGFp2 humano, que se liga preferencialmente a esta isoforma em relação ao TGFP3. O membro de ligação específica pode ser na forma de um fragmento de anticorpo tal como o Fv de uma só cadeia (scFv). Podem também ser utilizados outros tipos de fragmentos de anticorpos tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb ou um "diacorpo" (G. Winter & C. Milstein, Nature, 349. 293-299, 1991; W094/13804). O membro de ligação específica pode ser na forma de um anticorpo completo. O anticorpo completo pode estar em qualquer das formas dos isotipos de anticorpos e.g., IgG, IgA, IgE e IgM, e em qualquer das formas das subclasses dos isotipos e.g., IgG 1 ou lgG4. O membro de ligação específica pode também ser na forma de um anticorpo manipulado e.g., moléculas de anticorpos biespecíficas (ou 16 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ fragmentos tais como F(ab')2) que possuem um ramo de ligação ao antigénio (i.e. domínio de ligação específica) contra o TGFp e outro ramo contra uma especificidade diferente. De facto, os membros de ligação específica dirigidos contra o TGFpi e/ou o TGFp2 aqui descritos podem ser combinados num formato de "diacorpo" biespecífico. Por exemplo, os anticorpos 31G9 dirigido contra o TGFpi e 6H1 dirigido contra o TGF32 podem ser combinados para originar uma única molécula dimérica com ambas as especificidades. O domínio de ligação pode compreender parte ou todo de um domínio VH codificado por um segmento de um gene ou um segmento rearranjado de um gene de uma linha germinal. O domínio de ligação pode compreender parte ou todo um domínio VL capa ou um domínio VL lambda. O domínio de ligação pode ser codificado por uma forma alterada ou variante de um gene de uma linha germinal com uma ou mais alterações nos nucleótidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção) e.g., cerca de, ou menos de cerca de 25, 20, 15, 10 ou 5 alterações, 4, 3, 2 ou 1, que podem ser uma ou mais estruturas e/ou CDR. 0 domínio de ligação pode compreender uma sequência de genes de VH3 de uma das seguintes linhas germinais: a linha germinal DP49; a linha germinal DP53; a linha germinal DP50; a linha germinal DP46; ou uma sua forma rearranjada.

Um domínio de ligação VH preferido para membros de ligação específica anti-TGFp2 de acordo com a presente invenção é o VH de 6H1, cuja sequência se mostra na Figura 2(a)(i). Ο 6H1 pode ser emparelhado com vários domínios VL, como aqui exemplificado. Também podem ser empregues variantes da sequência de aminoácidos de VH de 6H1. O membro de ligação específica neutraliza o efeito do TGFP2 in vivo e in vitro. O membro de ligação específica pode ser um anticorpo de alta afinidade. As afinidades preferidas são aqui discutidas adiante. 17 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ Ο domínio de ligação pode compreender o domínio VH de 6H1 possuindo a sequência de aminoácidos mostrada na Fig. 2(a)(i). O domínio de ligação pode compreender um domínio VL possuindo uma sequência de aminoácidos tal como a mostrada em qualquer das Figs. 2(b)(i) a (iii). O membro de ligação específica pode estar na forma de scFv.

Um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo humano pode compreender uma ou mais CDR (região determinante de complementaridade) com uma sequência de aminoácidos tal como as mostradas em qualquer das figuras. Numa concretização preferida, o domínio de ligação compreende uma ou mais das CDR, CDR1, CDR2 e/ou CDR3, mostradas nas Figuras, especialmente as mostradas na Figura 19. Numa concretização preferida, o domínio de ligação compreende uma sequência de CDR3 de VH tal como a mostrada, especialmente como mostrada na Figura 19. O membro de ligação específica pode compreender parte ou todas as regiões de estrutura mostradas em flancos e entre as CDR nas Figuras, especialmente na Figura 19, ou regiões de estrutura diferentes incluindo versões modificadas das mostradas. O denominado "enxerto de CDR", em que uma ou mais sequências de CDR de um primeiro anticorpo são colocadas no interior de uma estrutura de sequências que não são desse anticorpo, e.g., de outro anticorpo, é revelado em EP-B-0239400.

Um membro de ligação específica compreendendo um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo humano de acordo com a presente invenção pode ser um que compete para a ligação ao TGFp2 humano com qualquer membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3. A competição entre membros de ligação pode ser facilmente testada in vitro, por exemplo dirigindo uma molécula repórter específica para um membro de ligação, que possa ser detectada na presença de outro membro ou membros de ligação não marcados, para permitir a identificação de membros de ligação específica que se ligam ao mesmo epítopo ou a um epítopo que se sobreponha. 18 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Os membros de ligação específica para o TGFP2 competem para a ligação ao TGFp2 com o anticorpo 6B1 aqui discutido em maior detalhe noutra secção. Estes podem-se ligar ao epítopo RVLSL ou a um péptido compreendendo a sequência de aminoácidos RVLSL, em particular a um péptido que adopte uma conformação em hélice-α. Podem ligar-se ao péptido TQHSRVLSLYNTIN. Em testes a eles destinados, pode-se utilizar um péptido com esta sequência mais CGG no terminal N. Os membros de ligação específica de acordo com a presente invenção podem ser tais que a sua ligação ao TGFP2 seja inibida por um péptido compreendendo RVLSL, tal como um péptido com a sequência TQHSRVLSLYNTIN. Em testes a eles destinados, pode-se utilizar um péptido com esta sequência mais CGG no terminal N. TQHSRVLSLYNTIN corresponde à hélice alfa H3 (resíduos 56-69) do TGFp2, tal como aqui se discute noutra secção. A região equivalente no TGFpi tem a sequência TQYSKVLSLYNQHN. Anticorpos anti-TGFpi que se ligam a esta região podem ser obtidos por exemplo por prospecção de um péptido com esta sequência (ou com CGG no terminal N) contra uma biblioteca de exibição sobre fagos. Os membros de ligação específica que se ligam ao péptido podem ser seleccionados por meio da sua ligação, e podem ser neutralizantes relativamente à actividade do TGFpi. A ligação destes membros de ligação específica ao TGFpi pode ser inibida por um péptido TQYSKVLSLYNQHN (opcionalmente com CGG no terminal N). O membro de ligação específica de acordo com a presente invenção que é específico para o TGFp2 pode não apresentar ligação ou substancialmente não apresentar ligação à forma latente do TGFp2, i.e., ser específico para a forma activa do TGFp2. Ο 6B1 no Exemplo 6 mostra ter esta propriedade. Ο 6B1 é particularmente adequado para utilização terapêutica no tratamento de desordens fibróticas porque possui as seguintes propriedades vantajosas. 0 6B1 liga-se ao TGFP2 com uma constante de dissociação de 2,3 nM na forma de uma só cadeia e 0,89 nM na forma de anticorpo completo, lgG4 6B1 (Exemplo 13). 0 anticorpo lgG4 6B1 neutraliza a actividade biológica do TGFp2 num ensaio anti-proliferação (IC50 de 2 nM; exemplos 7 e 10) e num ensaio com radiorreceptores (IC50 inferior a 1 nM; Tabela 6). O anticorpo liga-se ao péptido TQHSRVLSLYNTIN (TGFp256.69) a partir da hélice alfa H3 do TGFp2 19 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ e reconhece ο péptido correspondente do TGFpl de um modo mais fraco. O 6B1 reconhece a forma activa mas não a forma latente do TGFp2 (Exemplo 6), reconhece o TGFP2 em tecidos de mamífero por ICQ e não se liga de modo não específico a outros tecidos humanos (Exemplo 12). O anticorpo liga-se preferencialmente ao TGFP2, em comparação com o TGFP3, sendo a reactividade cruzada com o TGFp3 de 9%, determinada pela razão das constantes de dissociação.

Os outros anticorpos descritos neste pedido que contêm o domínio VH de 6H1, 6H1 e 6A5, têm propriedades semelhantes. As constantes de dissociação foram determinadas como sendo 2 nM para o lgG4 6B1 (Exemplo 2) e 0,7 nM para o Fv de uma só cadeia 6A5 (Tabela 1). O lgG4 6H1 neutraliza a actividade biológica do TGFP2 com valores de IC50 de 12 a 15 nM (Exemplos 7 a 10). O 6A5 e ο 6H1 inibiram a ligação ao receptor do TGFp2 num ensaio com radiorreceptores com valores de IC50 de cerca de 1 nM no formato de Fv de uma só cadeia e 10 nM ou inferiores no anticorpo completo, formato lgG4. Tanto o lgG4 6H1 como o scFv 6A5 mostraram-se eficazes na prevenção de cicatriz neural (Exemplo 5).

Portanto, são pela primeira vez proporcionados anticorpos humanos dirigidos contra TGFP2 humano que possuem propriedades adequadas para o tratamento de doenças caracterizadas pela presença prejudicial de TGFP2. Estes anticorpos neutralizam o TGFP2 e preferivelmente possuem uma constante de dissociação em relação ao TGFp2 inferior a cerca de 100 nM, mais preferivelmente de cerca de 10 nM, ainda mais preferivelmente inferior a cerca de 5 nM. Os anticorpos ligam-se preferencialmente ao TGFP2 relativamente ao TGFP3, de preferência possuem menos de 20% de reactividade cruzada com o TGFP3 (medida pela razão das constantes de dissociação) e preferivelmente possuem menos de cerca de 10% de reactividade cruzada. O anticorpo reconhece preferivelmente a forma activa mas não a forma latente do TGFP2.

Para anticorpos contra TGFpi, as propriedades desejadas para um anticorpo ser eficaz no tratamento de doenças fibróticas são semelhantes. Estes anticorpos neutralizam preferivelmente o TGFpi e possuem uma constante de dissociação para o TGFpi inferior a cerca de 100nM, mais preferivelmente inferior a cerca de 10 nM, ainda mais preferivelmente inferior a cerca de 5 nM. 20 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Os anticorpos ligam-se preferencialmente ao TGFpl relativamente ao TGFP3, preferivelmente têm menos de cerca de 20% de reactividade cruzada com o TGFP3 (medida pela razão das constantes de dissociação) e mais preferivelmente possuem menos de cerca de 10% de reactividade cruzada. O anticorpo reconhece preferivelmente a forma activa mas não a forma latente do TGFpi. O anticorpo 31G9 tem uma constante de dissociação de 12 nM (Tabela 5). Os anticorpos scFv CS37 e lgG4 27C1/10A6 apresentam valores de IC50 num ensaio com radiorreceptores de 8 nM e 9 nM, respectivamente, indicando uma constante de dissociação na gama nanomolar baixa. Mostrou-se que o lgG4 27C1/10A6 é eficaz num modelo de cicatriz neural. A reactividade cruzada de anticorpos da linhagem 1B2 com o TGFp3 é muito baixa (Exemplo 9).

Em adição a uma sequência de um anticorpo, o membro de ligação específica pode compreender outros aminoácidos, e.g., que formam um péptido ou um polipéptido, ou para conferir à molécula outra característica funcional em adição à capacidade para se ligar ao antigénio. Por exemplo, o membro de ligação específica pode compreender um marcador, uma enzima, um seu fragmento e por aí adiante. A presente invenção proporciona também um polinucleótido que codifica para um membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10. A presente invenção proporciona também construções na forma de plasmídeos, vectores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um dos polinucleótidos anteriores. A presente invenção proporciona também uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais das construções anteriores.

Um membro de ligação específica de acordo com a presente invenção pode ser preparado por expressão de ácido nucleico codificante. O ácido nucleico que codifica qualquer membro de ligação específica tal como o proporciona é um aspecto da presente invenção, tal como o é um método de produção do membro de ligação específica, método que compreende a 21 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ expressão a partir de ácido nucleico que o codifica. A expressão pode ser convenientemente conseguida por cultura, sob as condições apropriadas, de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico. Após a produção por expressão, um membro de ligação específica pode ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada, e depois utilizado conforme apropriado.

Os membros de ligação específica e as moléculas de ácido nucleico codificante e os vectores de acordo com a presente invenção podem ser proporcionados isolados e/ou purificados, e.g., a partir o seu ambiente natural, numa forma substancialmente pura ou homogénea, ou, no caso do ácido nucleico, isento ou substancialmente isento de ácido nucleico ou genes originários de outra que não a sequência codificante de um polipéptido com a função requerida. O ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender ADN ou ARN e pode ser completa ou parcialmente sintético. O termo "isolado" abrange todas estas possibilidades. O ácido nucleico pode codificar qualquer das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer das Figuras, ou qualquer forma funcionalmente equivalente. As sequências de nucleótidos empregues podem ser quaisquer das apresentadas em qualquer das Figuras, ou podem ser uma sua variante, um seu alelo ou derivado. Podem ser feitas alterações ao nível dos nucleótidos por adição, substituição, deleção ou inserção de um ou mais nucleótidos, alterações estas que podem ou não reflectir-se ao nível dos aminoácidos, dependendo da degenerescência do código genético.

Os sistemas para clonagem e expressão de um polipéptido numa variedade de diferentes células hospedeiras são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamífero, leveduras e sistemas de baculovírus. As linhas de células de mamífero disponíveis na arte para a expressão de um polipéptido heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebé e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum, preferido, éa£ coli. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procariotas tais como a £ coli está bem estabelecida na arte. Para uma revisão

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JfZ veja-se por exemplo Pluckthun, A., Bio/Techno/ogy, 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura está também disponível aos peritos na arte como uma opção para a produção de um membro de ligação específica, veja-se para revisões recentes, por exemplo, Reff, M.E. (1993), Curr. Opinion Biotech., 4: 573-576; Trill J.J. et aí. (1995) Curr. Opinion Biotech., 6: 553-560.

Os vectores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, sequências activadoras, genes marcadores ,e outras sequências conforme apropriado. Os vectores podem ser plasmídeos, virais e.g., fagos, ou fagemídeos, conforme apropriado. Para mais detalhes veja-se, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual·, 2a edição, Sambrook et a!., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo para preparação de construções de ácido nucleico, mutagénese, sequenciação, introdução de ADN em células e expressão de genes, e para análise de proteínas, estão descritos em detalhe em Short Protocols In Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et a!, eds., John Wiley & Sons, 1992. As descrições de Sambrook et a!., e de Ausubel et al. são aqui incorporadas para referência.

Assim, um aspecto adicional da presente invenção proporciona uma célula hospedeira contendo ácido nucleico tal como aqui revelado. Ainda outro aspecto proporciona um método compreendendo a introdução de um tal ácido nucleico na célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir a transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, electroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução utilizando retrovírus ou outros vírus, e.g., vírus da vacina, ou, para células de insectos, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir a transformação com cloreto de cálcio, a electroporação e a transfecção utilizando bacteriófagos. A introdução pode ser seguida por se provocar ou permitir a expressão do ácido nucleico, e.g., por cultura das células hospedeiras sob condições para a expressão do gene.

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Numa concretização, ο ácido nucleico de acordo com a invenção é integrado no genoma (e.g. cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas Standard. A presente invenção proporciona também um método que compreende a utilização de uma construção tal como afirmado anteriormente, num sistema de expressão de modo a expressar um membro de ligação específica ou um polipéptido como acima.

Após a produção de um membro de ligação específica, este pode ser utilizado, por exemplo, de qualquer dos modos aqui descritos, tais como na formulação de uma composição, um fármaco ou um produto de diagnóstico, tal como um estojo compreendendo, em adição ao membro de ligação específica um ou mais reagentes para a determinação da ligação do membro a células, como discutido. Uma composição pode compreender pelo menos um componente em adição ao membro de ligação específica. A presente invenção proporciona também fármacos que compreendem um membro de ligação específica tal como acima, opcionalmente com um ou mais excipientes. A presente invenção proporciona também a utilização de um membro de ligação específica tal como acima na preparação de um medicamento para tratar uma condição em que seja vantajoso contrariar os efeitos de promoção de fibrose do TGFp. A condição pode ser uma condição fibrótica caracterizada por uma acumulação num tecido de componentes da matriz extracelular. Os componentes da matriz extracelular podem ser fibronectina ou laminina. A condição pode ser seleccionada de entre o grupo que consiste em: glomerulonefrite, cicatriz neural, cicatriz dérmica, cicatriz ocular, fibrose pulmonar, lesões arteriais, retinopatia, deslocamento da retina, síndrome da dificuldade respiratória do adulto, cirrose do fígado, pós-enfarte do miocárdio, pós-estenose recidiva angioplástica, cicatriz quelóide, esclerodermia, desordens vasculares, cataratas, glaucoma, retinopatia proliferativa.

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Jp~r- A condição pode ser cicatriz neural ou glomerulonefrite. A presente invenção proporciona também a utilização de um membro de ligação específica tal como acima, na preparação de um medicamento para tratar uma condição de doença imunitária/inflamatória em que seja vantajoso contrariar os efeitos do TGFp. São condições ilustrativas a artrite reumatóide, a doença de deficiência de macrófagos e a infecção patogénica de macrófagos. A presente invenção proporciona também um método que compreende a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um membro de ligação específica tal como acima para tratar uma condição em que seja vantajoso contrariar os efeitos de promoção de fibrose do TGFp. As condições fibróticas estão listadas acima. A presente invenção proporciona também um método que compreende a administração a um paciente de uma quantidade profilacticamente eficaz de um membro de ligação específica como acima para prevenir uma condição em que seja vantajoso evitar os efeitos de promoção de fibrose do TGFp. As condições fibróticas estão listadas acima. A presente invenção proporciona também métodos que compreendem a administração a pacientes de quantidades profilática e/ou terapeuticamente eficazes de um membro de ligação específica tal como acima para prevenir ou tratar uma condição de doença imunitária/inflamatória em que seja vantajoso contrariar os efeitos do TGFp. As condições ilustrativas estão descritas acima.

Assim, vários aspectos da invenção proporcionam métodos de tratamento que compreendem a administração de um membro de ligação específica tal como proporcionado, composições farmacêuticas compreendendo um tal membro de ligação específica, e a utilização de um tal membro de ligação específica no fabrico de um medicamento para administração, por exemplo num método de fabrico de um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo a formulação do membro de ligação específica com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

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De acordo com a presente invenção, as composições proporcionadas podem ser administradas a indivíduos, que podem ser qualquer mamífero, em particular roedores, e.g., ratinho, cavalo, porco, ovelha, cabra, gado vacum, cão, gato ou humano. A administração é preferivelmente de uma "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo esta a suficiente para apresentar benefício ao paciente. Este benefício pode ser pelo menos a melhoria de pelo menos um sintoma. A quantidade realmente administrada e a taxa e período da administração dependerão da natureza e da gravidade do que se estiver a tratar. A prescrição do tratamento e.g., decisões relativas à dosagem, etc., são da responsabilidade do clínicos gerais ou outros médicos. As doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas na arte; veja-se Ledermann J.A. et a!., (1991) Int. J. Câncer, 47: 659-664; Bagshawe K.D. et a/. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 4: 915-922.

Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, simultânea ou sequencialmente, dependendo da condição a · tratar.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção e para utilização de acordo com a presente invenção podem compreender, em adição ao ingrediente activo, um excipiente, transportador, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos peritos na arte. Estes materiais não deverão ser tóxicos e não deverão interferir na eficácia do ingrediente activo. A natureza precisa do transportador ou de outro material dependerá da via de administração, a qual pode ser oral, ou por injecção, e.g., intravenosa.

As composições farmacêuticas para administração oral podem ser na forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode compreender um transportador sólido tal como gelatina ou um adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um transportador líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleos minerais ou sintéticos. Podem-se incluir solução salina fisiológica, dextrose ou solução de outros sacáridos ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol.

Para injecção intravenosa ou injecção no local afectado, o ingrediente activo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que seja isenta de pirogénios e tenha um pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os peritos na arte serão capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos tais como Cloreto de Sódio para Injecção, Solução de Ringer para injecção, solução de Ringer lactada para injecção. Podem ser incluídos, se necessário, conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos.

Outros aspectos da invenção e suas concretizações serão aparentes aos peritos na arte. Para que a presente invenção seja completamente entendida, são proporcionados os exemplos seguintes para exemplificação apenas e não como sua limitação.

Faz-se referências às seguintes figuras. A Figura 1 apresenta as sequências de ADN e proteica de anticorpos específicos para TGFpi. A Figura 1(a) apresenta as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico codificante de domínios variáveis de anticorpos para TGFpl isoladas directamente de repertórios: Figura 1 (a)(i) - VH de 1B2 (também conhecido como VH de 7A3); Figura 1 (a)(ii) - VH de 31G9; Figura 1(a)(iii) - VL de 31G9. A Figura 1 (b) apresenta as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico codificante de domínios variáveis de cadeia leve de anticorpos para TGFpi isoladas por rearranjo de cadeias: Figura 1(b)(i) - VL de 7A3; Figura 1(b)(ii) - VL de 10A6. A Figura 1 (c)(i) apresenta as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico codificante para o VH de 27C1, de um anticorpo para TGFpi isoladas a partir de uma experiência de "picagem" de CDR3.

A Figura 2 apresenta as sequências de ADN e proteica de anticorpos específicos para TGFP2. A Figura 2(a) apresenta as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico codificante para domínios variáveis de anticorpos para TGFp2 isoladas directamente de repertórios: Figura 2(a)(i) - VH de 2A-H11 (também conhecido como VH de 6H1); Figura 2(a)(ii) - VH de 2A-A9 (também conhecido como VH de 11E6). A Figura 2(b) apresenta sequências de aminoácidos e de ácido nucleico codificante de domínios variáveis de anticorpos específicos para TGFp2 isoladas após rearranjo de cadeias: Figura 2(b)(i) - VL 27 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ de 6Η1; Figura 2(b)(ii) - VL de 6A5; Figura 2(b)(iii) - VL de 6B1; Figura 2(b)(iv) - VL de 11 E6; Figura 2(b)(v) - VL de 14F1 2. A Figura 3 apresenta as sequências proteicas de CDR3 de VH de clones derivados de 1B2 por mutagénese de "picagem". As diferenças em relação à CDR3 de VH de 1B2 estão a negrito. A Figura 4 apresenta as sequências de ADN e proteica dos domínios VH e VL de VT37, reactivos de modo cruzado entre TGFpi e TGFP2. A Figura 5 apresenta a sequência de ADN e a sequência de aminoácidos codificada na região de cadeia pesada VH de comando do vector vhcassette2. As enzimas de restrição HindiII, Sfil, Pstl, BstEII, BamHI e EcoRI cortam nos pontos indicados. A Figura 6 apresenta um mapa do vector pG4D100 (não à escala). O local de clonagem múltipla (MCS): õ^Hindlll-Pacl-BamHI-ÍXanD-ÍPmlD-íNhel)-Ascl-(BssHII)-Xhol-Pmel-BsiWI-3'. Os locais de restrição apresentados entre parêntesis não são únicos. A Figura 7 apresenta a sequência de ADN, incluindo o intrão, e a sequência de aminoácidos codificada na região da cadeia leve VL de comando para o vector vlcassettel (vlcassette CAT1). As enzimas de restrição Hindlll, ApaLI, Saci, Xhol e BamHI cortam nos locais indicados (ApaLI dentro da região de comando). A Figura 8 apresenta um mapa do vector pLN10 (não à escala). O local de clonagem múltipla (MCS): S^indllHSphlMPstO-Sall-Xbal-BamHI-S' (1224-1259). Os locais de restrição apresentados entre parêntesis não são únicos. A Figura 9 mostra um mapa do vector ρΚΝΊΟΟ (não à escala). O local de clonagem múltipla (MCS): 5'-Miul-(Avall)-Hindlll-(Sphl)-(Pstl)-Sall-Xbal-

BamHI-3'. Os locais de restrição apresentados entre parêntesis não são únicos. A Figura 10 apresenta a % de neutralização de actividade de TGFp2 por anticorpos Fv de uma só cadeia num ensaio que utiliza a proliferação da linha de 28 r 84 928

EP 0 853 661/PT células de eritroleucemia TF1 em diferentes concentrações nM de scFv. A Figura 11 apresenta a neutralização de actividade de TGFp2 por anticorpos lgG4 completos num ensaio que utiliza a proliferação da linha de células de eritroleucemia TF1 em diferentes concentrações nM de anticorpo. A Figura 12 apresenta o efeito do tratamento de animais com anticorpos, em cicatriz neural, medido através da deposição de fibronectina (Figura 12(a)) e laminina (Figura 12(b)) detectadas utilizando intensidade de fluorescência integrada. Os gráficos apresentam representações dos dados pontuais dispersos para cada animal. 0 gráfico de barras apresenta a intensidade de fluorescência média integrada do grupo. A Figura 13 apresenta os resultados de um ELISA para medir a reactividade cruzada dos anticorpos lgG4 6B1 e lgG4 6A5 com isoformas de TGFp e antigénios não específicos. A Figura 13(a) apresenta a reactividade cruzada de lgG4 6B1 com um painel de antigénios não específicos e TGFp, representando a DO a 405 nm para cada antigénio: 1- interleucina; 2-linfotoxina humana (TNFp); 3- insulina humana; 4- albumina sérica humana; 5- ADNss; 6-oxazolona-albumina sérica bovina; 7- hemocianina de lapa do género Fissurel/a; 8- inibidor de tripsina da clara do ovo de galinha; 9- quimiotripsinogénio; 10-citocromo C; 11- GADPH; 12- ovalbumina; 13- lisozima de ovo de galinha; 14-albumina sérica bovina; 15- TNFa; 16- TGFpi; 17- TGFP2; 18- TGFp3; 19-apenas PBS. A Figura 13(b) apresenta a DO a 405 nm para o anticorpo lgG4 6A5 contra o mesmo painel de antigénios. Tanto na Figura 13(a) como na Figura 13(b) utilizaram-se os antigénios 1 a 15 para o revestimento da placa a uma concentração de 10pg/ml em PBS. Os TGF beta foram utilizados como revestimento a 0,2 pg/ml em PBS. O revestimento foi realizado a 4°C durante a noite. Utilizaram-se 100pg de cada antigénio por poço e duplicados de cada antigénio para cada IgG a testar. Incubaram-se as amostras de IgG com os revestimentos de antigénios a 37°C durante 2 horas após bloqueio com Marvel a 2%-PBS. O segundo anticorpo marcado foi um Fc1 de ratinho anti-humano conjugado com fosfatase alcalina e o substrato utilizado para detectar o segundo anticorpo ligado foi PNPP a 1 mg/ml com a leitura de absorvância a 405 nm. 29 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ A Figura 14 apresenta as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico codificante para o domínio VL do anticorpo CS37 específico para TGFpi. A Figura 15 apresenta dados de um ELISA que detecta ligação de lgG4 6B1 a BSA conjugada com cada um dos péptidos TGFp256_69 ou TGFpi56. 69 que revestem uma placa de ELISA. O lgG4 6B1 foi incubado em várias concentrações em μg/ml e mediu-se a absorvância a 405 nm após adição dos agentes de detecção. Os resultados em termos da DO a 405 nm estão representados para as várias concentrações de BSA-TGFp255.69 ("péptido beta 2" - lozangos) e BSA-TGFpi 56.69 ("péptido beta 1 " - quadrados). A Figura 16 apresenta a % de neutralização de efeito anti-proliferativo de TGFP2 sobre células TF1 por anticorpos completos, lgG4 6H1, lgG4 6B1 e o anticorpo monoclonal de ratinho de Genzyme, a várias concentrações (nM de IgG). A Figura 1 7 apresenta a % de neutralização de efeito anti-proliferativo de TGFpi sobre células TF1 por anticorpos completos, lgG4 6H1, lgG4 6B1 e o anticorpo monoclonal de ratinho de Genzyme, a várias concentrações (nM de IgG). A Figura 18 apresenta a % de neutralização de efeito anti-proliferativo de TGFp3 sobre células TF1 por anticorpos completos, lgG4 6H1, lgG4 6B1 e o anticorpo monoclonal de ratinho de Genzyme, a várias concentrações (nM de IgG). A Figura 1 9 apresenta sequências de aminoácidos e de ADN codificante de regiões de anticorpos dirigidos contra TGFp2 apresentando as sequências da CDR em itálico: Figura 19(i) VH de 2A-H11 (também conhecido como VH de 6H1); Figura 19(ii) VL de 6B1; Figura 19{iii) VL de 6A5 e Figura 19(iv) VL de 6H1. A Figura 20 apresenta o vector p6H1 VH-gama4 (7263 pb). O gene que codifica VH de 6B1 está inserido na forma de um fragmento de restrição Hindlll-Apal. 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 30

A Figura 21 apresenta ο vector ρ6Β1 lambda (10151 pb). Ο gene que codifica VL de 6B1 está inserido na forma de um fragmento de restrição

EcoRI-BstBI. A Figura 22 apresenta o vector p6B1 gama4gs (14176 pb). O genes que codificam as cadeias leve e pesada de lgG4 6B1 estão combinados num único vector. A Figura 23 apresenta os resultados de experiências de ELISA de competição descritas no Exemplo 6. Após incubação durante a noite com TGFP2, as placas foram tratadas com as seguintes soluções 1-4 (número correspondente aos da Figura): 1- 400 μΙ de F12 de Hams/DMEM (branco de reagente), 2- 400 μΙ de F12 de Hams/DMEM mais 4 pg de anticorpo lgG4 6B1 (controlo positivo), 3- 400 μΙ de meios condicionados não tratados com PC3 mais 4 pg de anticorpo lgG4 6B1 (amostra de TGFP2 latente), 4- 400 μΙ de meios condicionados activados com ácido PC3 mais 4 pg de anticorpo lgG4 6B1 (amostra de TGFp2 activo).

Todos os documentos aqui mencionados são incorporados por referência. Lista de Exemplos

Exemplo 1- Isolamento de anticorpos específicos para TGFpi, anticorpos específicos para TGFp2 e anticorpos específicos para TGFpi e TGFp2.

Exemplo 2- Construção de linhas de células que expressam anticorpos completos.

Exemplo 3- Neutralização de actividade de TGFp por anticorpos avaliada utilizando ensaios in vitro.

Exemplo 4- Inibição por anticorpos de ligação de TGFp a receptores.

Exemplo 5- Prevenção de cicatriz neural utilizando anticorpos contra TGFp.

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 31

Exemplo 6- Determinação de Ligação de lgG4 6B1 à forma latente e activa de TGFp2.

Exemplo 7- Neutralização por anticorpos dirigidos contra TGFp2 do efeito inibidor de isoformas de TGFp sobre a proliferação celular.

Exemplo 8- Inibição por anticorpos dirigidos contra TGFP2 de ligação a outras isoformas de TGFp a receptores, medida num ensaio com radiorreceptores.

Exemplo 9- Avaliação de anticorpos de TGFpi quanto a potencial utilização terapêutica.

Exemplo 10- Construção de uma linha de células de alta expressão de lgG4 6B1 utilizando o sistema de selecção da glutamina-sintetase e avaliação num ensaio de neutralização.

Exemplo 11- Determinação do epítopo sobre TGFP2 para o anticorpo 6B1 utilizando uma biblioteca peptídica de exibição sobre fagos.

Exemplo 12- Determinação da ligação de lgG4 6B1 a tecidos por imunocitoquímica (ICQ).

Exemplo 13- Determinação dos parâmetros cinéticos de lgG4 6B1 e Fv de uma só cadeia 6B1 para ligação a TGFp2.

Exemplo 14- Ligação de um péptido correspondente aos resíduos 56 a 69 de TGFp2 a lgG4 6B1. EXEMPLO 1

Isolamento e caracterização de anticorpos que se ligam a TGFpl e TGFp2 32 AÀ-**

84 928 EP 0 853 661/PT 1. Identificação e caracterização de anticorpos para TGFB-1 humano por seleccão de repertórios de anticorpos sobre faaos nativos e sintéticos

Repertórios de anticorpos

Utilizaram-se os seguintes repertórios de anticorpos: 1. Biblioteca de linfócitos de sangue periférico (PBL) derivada de humanos não imunizados (Marks, J.D., Hoogenboom, H.R. Bonnert, T.P., McCafferty, J., Griffiths, A.D. & Winter, G. (1991) J. Mol. Biol. 222, 581-597). 2. Biblioteca sintética (Nissim, A., Hoogenboom, H.R., Tomlinson, I.M., Flynn, G., Midgley, C., Lane, D. e Winter, G. (1994) EMBO J. 13, 692-698) derivada de genes de VH de linha germinal humanos clonados e CDR3 sintéticas com uma cadeia leve fixa. 3. Biblioteca de amígdala derivada de amígdalas de humanos não imunizados. Isolaram-se célula B de amígdala a partir de amígdalas completas recentemente removidas (processadas em 2 horas) proporcionadas por Addenbrookes Hospital, Hiils Road, Cambridge, R.U. Processou-se cada amígdala como se segue: colocaram-se as amígdalas numa placa de Petri contendo 5 ml de PBS e macerarou-se com uma lâmina de bisturi para libertar as células. Transferiu-se a suspensão para um tubo fresco e deixaram-se sedimentar os resíduos maiores por acção da gravidade durante 5 minutos. Colocou-se então a suspensão celular na forma de uma sobrecamada sobre 10 ml de Lymphoprep num tubo de polipropileno de 50 ml (Falcon) e centrifugou-se a 1000xg durante 20 minutos à temperatura ambiente (sem travagem) e recolheram-se as células na interface com uma pipeta de vidro.

Diluiu-se até um volume final de 50 ml em meio RPMI a 37°C e centrifugou-se a 500xg durante 15 minutos à temperatura ambiente. Aspirou-se o sobrenadante e lavaram-se as células mais duas vezes com RPMI.

Preparou-se ARN poliadenilado a partir de células em peletes utilizando o estojo "QuickprepTM mRNA kit" (Pharmacia Biotech, Milton Keynes, R.U.). 33 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Processaram-se todas as células obtidas de uma amígdala (aproximadamente 1x106 células) utilizando uma coluna Oligo(dT)-Cellulose Spun e processou-se exactamente como descrito no protocolo anexo. O ARNm foi precipitado com etanol conforme descrito e ressuspenso em 40 ml de ARNase isenta de água. A reacção de síntese de ADNc foi estabelecida utilizando o estojo "First-Strand cDNA Synthesis Kit" (Pharmacia Biotech, Milton, Keynes, R.U.) como se segue: ARN 20 μΙ (aquecido a 67°C, 10 minutos antes da utilização) Tampão de 10 cadeia 11 μΙ Solução de DTT 1 μΙ Iniciador pd(N)6 1 μΙ

Após mistura suave, incubou-se a mistura reaccional a 37°C durante 1 hora.

Amplificaram-se genes de VH humanos a partir de ADNc de amígdalas utilizando os nove iniciadores de síntese no sentido inverso ("back primer") baseados na família (VH1 b/7a backSf/-VH1 b/6a backS/z, que introduzem um local Sfi \ na extremidade 5', Tabela 1) juntamente com uma mistura equimolar dos quatro iniciadores de síntese no sentido directo ("forward primer") JH (JH 1-2, 3, 4-5, 6, for; Marks et a!., 1991 supra). Assim, realizaram-se nove amplificações por PCR primárias. Cada mistura reaccional (50 μΙ) compreendia 2 μΙ de ADNc molde, 25 pmol de iniciador de síntese no sentido inverso, 25 pmol de iniciadoresde síntese no sentido directo, 250 μΜ dos dNTP, MgCI2 1,5 mM, KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM pH 8,3 e 2,5 u de Taq polimerase (Boehringer). Cobriu-se a mistura reaccional com uma camada de óleo mineral (parafina) e submeteu-se a 30 ciclos (94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min, 72°C durante 1 min) utilizando um ciclizador térmico Techne. Purificaram-se os produtos sobre um gel de agarose a 1 % (p/v), isolaram-se do gel utilizando "Geneclean" (Bio 101 Inc.) e ressuspenderam-se em 15 μΙ de água. Recombinaram-se os genes de VH amplificados com genes de VL humano derivados de PBL (Marks et al., 1991 supra) juntamente com o ligante (Gly4, Ser)3 (Huston, J.S., et ai, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 5879-83) por

montagem por PCR (Marks et a!., 1991, supra). Clonaram-se as construções de anticorpo VH-ligante-VL nos locais Sfil e Notl do vector fagemídeo, pCANTAB6 (McCafferty, J., et al., 1994, AppL Biochem. Biotech., 47: 157-173) para originar uma biblioteca de 6x107 clones. 4. Biblioteca de Fv de uma só cadeia grandes derivada de tecidos linfóides incluindo amígdalas, medula óssea e linfócitos de sangue periférico.

Preparou-se ARN poliadenilado a partir de células B de vários tecidos linfóides de 43 dadores não imunizados utilizando o estojo "Quickprep mRNA Kit" (Pharmacia).

Sintetizou-se ADNc de primeira cadeia a partir de ARNm utilizando o estojo "First-strand cDNA Synthesis Kit" (Pharmacia) utilizando hexâmeros aleatórios para iniciar a síntese. Amplificaram-se os genes de V utilizando iniciadores específicos de famílias para genes de VH, Vk e νλ como previamente descrito (Marks et al., supra) e subsequentemente recombinaram-se juntamente com o ligante de scFv (Gly4, Ser)3 por montagem por PCR. Clonaram-se as construções de anticorpo VH-ligante-VL nos locais S/7l e Not I do vector fagemídeo, pCANTAB6. A ligação, a electroporação e o plaqueamento das células foram conforme descrito anteriormente (Marks et a/., 1991, supra). A biblioteca foi tornada aprox. 1000x maior do que se descreveu anteriormente aumentando as quantidades de vector e inserção utilizados e realizando electroporações múltiplas. Isto gerou um repertório de scFv que se calculou ter aprox. 1,3x1010 recombinantes individuais que por obtenção de "impressão digital" com Bst NI mostrou ser extremamente diversificado. a. Indução de bibliotecas de anticorpos sobre fagos

Os quatro diferentes repertórios de anticorpos sobre fagos anteriores foram seleccionados quanto a anticorpos para TGFpi. Os repertórios de VH sintéticos (Nissim et a!., 1994, supra), amígdala, scFv "grande" e PBL (Marks et al., 1991, supra) foram cada um tratados como se segue de modo a recuperar partículas de fagemídeos. Inocularam-se 500 ml de 2YTAG (meios 2YT suplementados com 100μg/ml de ampicilina e 2% de glucose) pré-aquecidos (37°C) num frasco cónico de 2 I, com aproximadamente 3x1010 células de uma 35 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ cultura-mãe (-70°C) em glicerol da biblioteca apropriada. Cresceu-se a cultura a 37°C com bom arejamento até se atingir uma DO600nm de 0,7 (aproximadamente 2 horas). Adicionou-se fago auxiliar M13K07 (Stratagene) à cultura até uma multiplicidade de infecção (mdi) de aproximadamente 10 (assumindo que uma DO600nm de 1 é equivalente a 5x108 células por ml de cultura). Incubou-se a cultura de modo estacionário a 37°C durante 15 minutos seguindo-se 45 minutos com arejamento suave (200 rpm) à mesma temperatura. Centrifugou-se a cultura e drenou-se o sobrenadante da pelete de células. Ressuspenderam-se as células em 500 ml de 2YTAK (meios 2YT suplementados com 100 μg/ml de ampicilina e 50 ,ug/ml de canamicina) e incubou-se a cultura durante a noite a 30°C com bom arejamento (300 rpm). Purificaram-se e concentraram-se as partículas fágicas através de três precipitações com polietilenoglicol (PEG) (Sambrook, J., Fritsch, E.F., & Maniatis, T. (1990). Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York) e ressuspenderam-se em PBS até 1012 unidades de transdução (ut)/ml (clones resistentes a ampicilina). b. Prospecção ("panning") de bibliotecas de anticorpos sobre fagos em TGFfi-t

Os fagos induzidos de cada um dos quatro repertórios foram prospectados separadamente sobre o TGFpi. Revestiu-se um imuno-tubo de 75 mm x 12 mm (Nunc; Maxisorp) com 2 ml de TGFpi humano recombinante (0,5 pg/ml, Genzyme) em PBS durante a noite a 4°C. Após lavagem 3 vezes com PBS, encheu-se o tubo com MPBS a 3% (3% de leite em pó magro "Marvel", 1xPBS) e incubou-se durante 2 horas a 37°C para bloquear. Repetiu-se a lavagem, adicionaram-se partículas de fagemídeo (1013 ut) em 2 ml de MPBS a 3% e incubou-se o tubo de modo estacionário a 37°C durante 1 hora. Lavou-se o tubo 20 vezes com PBST (0,1 %) e depois 20 vezes com PBS. Eluíram-se as partículas fágicas ligadas do tubo adicionando 2 ml de trietilamina 100 mM e incubando o tubo de modo estacionário à temperatura ambiente durante 10 minutos. Neutralizou-se imediatamente o material eluído pipetando-o para um tubo contendo 1 ml de Tris.HCI 1 M (pH 7,4). Armazenaram-se os fagos a 4°C. Utilizaram-se 1,5 ml dos fagos eluídos para infectar 20 ml de E. coli TG1 em crescimento logarítmico (Gibson, T.J. (1984) PhD thesis, University of Cambridge, R.U.). Cresceram-se as células infectadas durante 1 hora a 37°C com arejamento suave em caldo 2YT e depois plaquearam-se em placas de 243 mm x 243 mm (Nunc) com meio 2YTAG. Incubaram-se as placas 36 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ durante a noite a 30°C. Rasparam-se as colónias das placas para 10 ml de caldo 2YT e adicionou-se glicerol a 15% (v/v) para armazenagem a -70°C.

As culturas-mãe em glicerol do primeiro ciclo de prospecção de cada um dos quatro repertórios sobre TGFpl foram retomadas utilizando fago auxiliar para derivar partículas de fagemídeo para o segundo ciclo de prospecção. Utilizaram-se 250 μΙ de cultura-mãe em glicerol para inocular 50 ml de caldo 2YTAG e incubou-se num frasco cónico de 250 ml a 37°C com bom arejamento até a DO600nm atingir 0,7 (aproximadamente 2 horas). Adicionou-se o fago auxiliar M13K07 (mdi =10) à cultura que foi então incubada de modo estacionário a 37°C durante 15 minutos e depois mais 45 minutos com arejamento suave (200 rpm) à mesma temperatura. Centrifugou-se a cultura e drenou-se o sobrenadante da pelete de células. Ressuspenderam-se as células em 50 ml de 2YTAK pré-aquecido e incubou-se a cultura durante a noite a 30°C com bom arejamento. Purificaram-se as partículas fágicas e concentraram-se por precipitação com PEG (Sambrook et a!., 1990, supra) e ressuspenderam-se em PBS a 1013 ut/ml.

Os fagos induzidos do primeiro ciclo de prospecção de cada um dos três repertórios foram seleccionados uma segunda vez, essencialmente como descrito acima com a excepção de que o tubo de prospecção apenas foi revestido com 1 ml de ΤΰΡβ1 (0,5 pg/ml, Genzyme) e o volume de fago adicionado ao tubo foi reduzido de modo semelhante. Após lavagem prolongada, eluíram-se os fagos ligados do tubo utilizando 1 ml de trietilamina 100 mM e neutralizaram-se por adição de 0,5 ml de Tris.HCI 1 M (pH 7,4) como descrito anteriormente. Repetiu-se o processo de crescimento e prospecção dos fagos um terceiro e depois um quarto ciclos de selecção. c. Crescimento de clones individuais seleccionados para imunoensaio

Utilizaram-se colónias individuais dos terceiro e quarto ciclos de selecção para inocular 100 μΙ de 2YTAG em poços individuais de placas de cultura de tecidos de 96 poços (Corning). Incubaram-se as placas a 30°C durante a noite com agitação moderada (200 rpm). Adicionou-se a cada poço glicerol até 15% e armazenaram-se estas placas principais a -70°C até à análise. 37 j 84 928

EP 0 853 661/PT d. ELISA para identificar scFv anti-TGFfi-1

Identificaram-se clones específicos para TGFp-l por ELISA, utilizando scFv exibidos sobre fagos ou scFv solúvel. i. ELISA de faaos

Utilizaram-se células das placas principais para inocular placas de cultura de tecidos de 96 poços frescas contendo 100μΙ de 2YTAG por poço. Incubaram-se estas placas a 37°C durante 6-8 horas ou até que as células nos poços estivessem em crescimento logarítmico (DO a 600 nm de 0,2-1,0). Adicionou-se M13K07 a cada poço até uma mdi de 10 e incubou-se de modo estacionário durante 15 min e depois 45 min com agitação suave (100 rpm), sempre a 37°C. Centrifugaram-se as placas a 2000 rpm durante 10 min e eluíu-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se cada pelete de células em 100 μΙ de 2YTAK e incubou-se a 30°C durante a noite.

Centrifugou-se cada placa a 2000 rpm e recuperaram-se 100 μΙ do sobrenadante de cada poço e bloqueou-se em 20 μΙ de M6PBS a 18% (18% de leite em pó magro, 6x PBS), de modo estacionário, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Entretanto, placas de microtítulo flexíveis que tinham sido bloqueadas durante a noite de modo estacionário a 4°C com 50 μΙ de TGFp-1 0,2 μg/ml em PBS ou com apenas 50 μΙ de PBS (originando uma placa de controlo não revestida), foram lavadas 3 vezes com PBS e bloqueadas durante 2 horas de modo estacionário a 37°C em PBS 3 M. Estas placas foram então lavadas três vezes com PBS e adicionaram-se 50 μΙ de fagos pré-bloqueados a cada poço de ambas as placas, a revestida com TGFp-1 e a não revestida. Incubaram-se as placas de modo estacionário a 37°C durante 1 h após o que se removeram os fagos por decantação. Lavaram-se as placas por incubação durante 2 min em PBST três vezes e depois incubação durante 2 min em PBS três vezes, sempre à temperatura ambiente. A cada poço de ambas as placas, a revestida com TGFp-1 e a não revestida, adicionaram-se 50 μΙ de uma diluição de 1 em 10 000 de anticorpo de ovelha anti-fd (Pharmacia) em PBS 3 M e incubaram-se as placas a 37°C de modo estacionário durante 1 h. Lavou-se cada placa conforme descrito acima e 38 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ adicionaram-se 50 μΙ de uma diluição de 1 em 5 000 de conjugado de fosfatase alcalina anti-ovelha de burro (Sigma) em PBS 3 M e incubou-se de modo estacionário a 37°C durante 1 h. Lavaram-se as placas conforme descrito acima e depois enxaguou-se duas vezes com NaCI a 0,9%. Visualizou-se a actividade da fosfatase alcalina utilizando o substrato cromagénico pNPP (Sigma) ou o sistema Ampak (Dako). 0 sinal de absorvância gerado por cada clone foi avaliado medindo a densidade óptica a 405 nm (pNPP) ou a 492 nm (Ampak) utilizando um leitor de placas de microtítulo. Escolheram-se para análise posterior os clones em que o sinal de ELISA gerado na placa revestida com TGFp-1 era pelo menos duas vezes o da placa não revestida. ii. ELISA solúvel

Utilizaram-se células das placas principais para inocular placas de cultura de tecidos de 96 poços frescas contendo 100 μΙ de 2YTAG por poço. Incubaram-se estas placas a 30°C durante 8 horas e depois centrifugaram-se a 2000 rpm durante 10 minutos e eluíu-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se cada pelete de células em 100μΙ de 2YTA (meios 2YT suplementados com 100pg/ml de ampicilina) contendo IPTG 10 mM (isopropil-B-D-tiogalactopiranósido) e incubou-se a 30°C durante a noite.

Centrifugou-se cada placa a 2000 rpm e recuperaram-se 100μΙ de sobrenadante de cada poço e bloqueou-se em 20 μΙ de PBS a 18% de modo estacionário, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Entretanto, placas de microtítulo flexíveis que tinham sido bloqueadas durante a noite de modo estacionário a 4°C, com 50 μΙ de TGFpi a 0,2 μg/ml em PBS ou com 50 μΙ de apenas PBS, foram lavadas 3 vezes com PBS e bloqueadas durante a noite 2 h de modo estacionário a 37°C em MPBS a 3%. Lavaram-se então estas placas três vezes com PBS e adicionaram-se a cada poço de ambas as placas, a revestida com TGFpi e a não revestida, 50 μΙ de scFv solúvel pré-bloqueado. Incubaram-se as placas de modo estacionário a 37°C durante 1 h após a qual se removeram as soluções de scFv por decantação. Lavaram-se as placas por incubação durante 2 minutos em PBST (PBS contendo 1 % de Tween) três vezes, seguindo-se incubação durante 2 min em PBS três vezes, sempre à temperatura ambiente. 39 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ A cada poço de ambas as placas, revestida com TGFp-1 e não revestida, adicionaram-se 50 μΙ de uma diluição de 1 em 200 do anticorpo de murídeo tag anti-myc, 9E10 (Munro, S. & Pelham, H.R.B. (1986) Cell, 46, 291-300) em PBS 3 M e incubaram-se as placas a 37°C de modo estacionário durante 1 h. Lavou-se cada placa conforme acima descrito e adicionaram-se 50 μΙ de uma diluição de 1 em 5 000 de conjugado de fosfatase alcalina anti-ratinho de cabra (Pierce) em PBS 3 M e incubou-se de modo estacionário a 37°C durante 1 h. Lavaram-se as placas conforme descrito acima e depois enxaguaram-se duas vezes com NaCI a 0,9%. Visualizou-se a actividade da fosfatase alcalina utilizando o substrato cromogénico pNPP (Sigma) ou o sistema Ampak (Dako). O sinal de absorvância gerado por cada clone foi avaliado medindo a densidade óptica a 405 nm (pNPP) ou a 492 nm (Ampak) utilizando um leitor de placas de microtítulo. Escolheram-se para análise posterior os clones em que o sinal de ELISA gerado na placa revestida com TGFp-1 era peio menos duas vezes o da placa não revestida. iii. ELISA de especificidade

Os clones identificados como se ligando a TGFp-1 e não ao poço não revestido, conforme descrito acima, foram ainda analisados quanto a especificidade fina. Os ELISA de especificidade foram realizados utilizando scFv quer exibido sobre fagos quer em solução, conforme descrito acima, com a excepção de que se inocularam 5 ml de meios em tubos Falcon de 50 ml com cada clone e se cresceram para gerar o fago ou o scFv solúvel utilizado no ELISA. Revestiram-se as placas de microtítulo com 50 μΙ de TGFp-1 0,2 pg/ml, TGFp-2 0,2 μ9/ιτιΙ, albumina sérica bovina (BSA) 10μ9/ιτιΙ ou PBS (poço não revestido). Após pré-bloqueio tanto dos fagos (ou do scFv solúvel) como das placas de microtítulo, adicionaram-se 50 μΙ de fago bloqueado (ou scFv solúvel) de cada clone a um poço revestido com TGFp-1, TGFp-2, ou BSA ou a um poço não revestido. Como anteriormente, visualizou-se a actividade da fosfatase alcalina utilizando o substrato cromagénico pNPP (Sigma) ou o sistema Ampak (Dako). Consideraram-se os clones específicos para TGFp-1 se o sinal de ELISA gerado no poço revestido com TGFp-1 era pelo menos cinco vezes superior ao sinal dos poços revestidos com TGFp-2, BSA ou do poço não revestido. 40 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ iv. Determinação da especificidade por BIACore™

Mostrou-se também que os anticorpos eram específicos para TGFpi em comparação com o TGFp2 (obtido de R&D Systems Abingdon) por ligação relativa aos chips sensores BIACore™ revestidos com o antigénio apropriado. Imobilizaram-se o TGFpi e o TGFp2 por acoplamento com amina aos chips sensores Biosensor CM5 (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. Fragmentos Fv de uma só cadeia (35 μΙ; purificados por cromatografia de afinidade com metal imobilizado como descrito no Exemplo 4) foram injectados sobre o antigénio imobilizado a um caudal de 5 μΙ/min. A quantidade de TGFp ligado foi avaliada como o aumento total de unidades de ressonância (UR) ao longo deste período. Para o scFV 31G9 verificou-se um aumento de 1059 UR com um chip de TGFpl e de 72 UR com um chip de TGFP2. Assim, a ligação é muito mais forte ao TGFpi do que ao TGFp2. e. Sequenciação de anticorpos ScFv específicos para TGFfil

Determinou-se a sequência de nucleótidos dos anticorpos específicos para TGFp-1 utilizando primeiro iniciadores específicos do vector para amplificar o ADN inserido de cada clone. Utilizaram-se células de uma colónia individual sobre uma placa de ágar 2YTAG como molde para uma amplificação por reacção em cadeia com polimerase (PCR) do ADN inserido utilizando os iniciadores pUC19reverse e fdtetseq (Tabela 1). As condições da amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 2 min, seguindo-se 10 min a 72°C. Os produtos da PCR foram purificados utilizando um estojo "PCR Clean-up Kit" (Promega) num volume final de 50 μΙ de H20. Utilizaram-se entre 2 e 5 μΙ de cada preparação de inserção como molde para sequenciação utilizando o sistema de sequenciação Taq Dye-terminator cycle (Applied Biosystems). Utilizaram-se os iniciadores mycseqlO e PCR-L-Link para sequenciar a cadeia leve de cada clone e PCR-H-Link e pUC19reverse para sequenciar a cadeia pesada (Tabela 1). f. Sequência e fonte dos anticorpos ScFv específicos para TGFfi-1 iniciais

Isolaram-se quatro diferentes anticorpos específicos para TGFp-1 a partir das selecções utilizando as quatro bibliotecas descritas acima. O nome de cada 41 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ clone, a sua origem e a linha germinal da sua cadeia leve e pesada são apresentados abaixo. A sequência completa dos genes do domínio VH dos clones 1-B2 e 31-G9 são dados na Figura 1 (a) juntamente com o gene do domínio VL de scFv 31-G9. CLONE BIBLIOTECA FONTE LINHA GERMINAL DE VH ISOTIPO DE VL 1-B2 PBL VH3 DP49 Vcapa 1A-E5 VH sintético VH3 DP53 Vlambda 1A-H6 Amígdala VH3 DP50 Vlambda 31-G9 scFv grande VH3 DP49 Vlambda

Assim, estes isolados iniciais foram obtidos de bibliotecas derivadas de diferentes fontes de genes de V naturais de humanos não imunizados e de bibliotecas sintéticas a partir de genes de V de linhas germinais clonadas juntamente com CDR sintéticas. 2. Maturação de afinidade dos anticorpos ScFv específicos para TGFB-1 iniciais a. Rearranjo de cadeias leves do anticorpo ScFv específico para TGFp~1, 1-B2 i. Construção de repertórios

Recombinou-se a cadeia pesada do clone 1-B2 com o repertório completo de cadeias leves derivado dos repertórios de PBL e de scFv grandes (derivados de amígdalas). Amplificou-se a cadeia pesada de 1-B2 por PCR utilizando os iniciadores HuJh4-5For (Tabela 1) e pUC19reverse. As condições de amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 1 min, seguindo-se 10 min a 72°C. O produto da PCR foi separado através de um gel de agarose a 1%-TAE, a banda que representava o VH amplificado foi excisada e eluída do gel de agarose utilizando o estojo Geneclean (Bio 101).

As cadeias leves de PBL e de amígdalas foram amplificadas por PCR utilizando os iniciadores fdtetseq e uma mistura de RL 1, 2 & 3 (Tabela 1). As condições de amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 1 min, seguindo-se 10 min a 72°C. 42 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Separou-se ο produto da PCR através de um gel de agarose a 1 %-TAE, a banda que representava o VL amplificado foi excisada e eluída do gel de agarose utilizando o estojo Geneclean (Bio 101).

Combinaram-se aproximadamente 50 ng de cadeia pesada de 1-B2 amplificada e 50 ng de cadeias leves amplificadas quer derivadas de PBL quer derivadas de amígdala, e precipitaram-se com acetato de sódio e etanol utilizando 25 pg de glicogénio como transportador. Formou-se uma pelete com 0 ADN precipitado por centrifugação a 13 000 rpm numa microcentrífuga, secou-se ao ar e ressuspendeu-se em 26 μΙ de H20. Utilizou-se numa amplificação de montagem após a adição de tampão de reacção até 1X, dNTP até 200 nM e 5 unidades de Taq polimerase. As condições de amplificação consistiram em 20 ciclos de 94°C durante 1 min, 60°C durante 1 min e 72°C durante 1 min e 30 s, seguindo-se 10 min a 72°C. Utilizaram-se 10 μΙ de cada montagem como molde numa amplificação de "auxílio" ("pull-through") com os iniciadores fdtetseq e pUC1 9reverse. As condições de amplificação consistiram em 25 ciclos de 94°C durante 1 min, 60°C durante 1 min e 72°C durante 1 min e 30 s, seguindo-se 10 min a 72°C. O produto da amplificação de auxílio foi separado através de agarose a 1 %-TAE e a banda que representava VH-VL de auxílio foi excisada e eluída utilizando o estojo Geneclean. Digeriu-se com as endonucleases de restrição Sfi I e Not I (NEB) e ligou-se (sistema de ligação de Amersham) no vector fagemídeo pCantab 6, previamente digerido com Sfi I e Not I. O produto da ligação foi utilizado para transformar células TG1 electrocompetentes, plaqueadas em placas de 2YTAG e incubadas durante a noite a 30°C. Geraram-se aproximadamente 1x105 clones individuais a partir do rearranjo de cadeias leves da cadeia pesada de 1-B2 com as cadeias leves derivadas de PBL e aproximadamente 1x10 para o rearranjo com as cadeias leves derivadas de amígdala. ii. Seleccão de repertórios de rearranjo de cadeias leves

Os dois repertórios de rearranjo de cadeias leves foram seleccionados quanto a anticorpos específicos para TGFp-1. Recuperaram-se partículas de fagemídeo de cada repertório conforme descrito anteriormente para as 43 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ bibliotecas iniciais. Pré-bloquearam-se os fagos recuperados durante 1 h num volume final de 100 μΙ de PBS 3 M. Utilizaram-se aproximadamente 1011 ut de fagos no primeiro ciclo de selecção e entre 109 e 101° nas selecções subsequentes. Para as selecções de primeiro ciclo adicionou-se TGFpi biotinilado até uma concentração final de 100 nM ao fago pré-bloqueado e inoculou-se de modo estacionário a 37°C durante 1 h.

Para cada selecção, separaram-se 100 μΙ de suspensão de pérolas "Dynabeads" (Dynal) num magnete e recuperaram-se as pérolas e pré-bloquearam-se durante 2 h em 1 ml de PBS 3 M. Recuperaram-se as pérolas num magnete e ressuspenderam-se na mistura de fagemídeo/ TGFp-1 biotinilado e incubaram-se à temperatura ambiente durante 1 5 min enquanto eram rodadas na direcção longitudinal. Capturaram-se as pérolas num magnete e lavaram-se quatro vezes com PBST seguindo-se três lavagens com PBS. Após cada lavagem, capturaram-se as pérolas num magnete e ressuspenderam-se para a lavagem seguinte. Finalmente, ressuspendeu-se metade das pérolas em 10 μΙ de DTT 50 mM (a outra metade das pérolas foi armazenada a 4°C como reserva) e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min. Utilizou-se então toda a suspensão de pérolas para infectar 5 ml de células TG1 em crescimento logarítmico. Incubaram-se a 37°C de modo estacionário durante 15 min, com agitação moderada durante 45 min, plaquearam-se em placas de 2YTAG e incubaram-se durante a noite a 30°C.

Rasparam-se as colónias das placas para 10 ml de caldo 2YT e adicionou-se glicerol a 15% (v/v) para armazenagem a -70°C. Utilizou-se uma alíquota de 250 μΙ de material raspado de cada placa para inocular 2YTAG e recuperaram-se partículas de fagemídeo como anteriormente se descreveu. Para cada repertório realizaram-se três ciclos de selecção utilizando TGFp-1 biotinilado, essencialmente como no primeiro ciclo de selecção descrito anteriormente. Todas as selecções foram com TGFp-1 100 nM excepto o terceiro ciclo de selecção do repertório de cadeias leves derivadas de amígdala em que a concentração de TGFp-1 biotinilado na selecção foi reduzida para 50 nM. 44 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ iii. Identificação de anticorpos ScFv específicos para TGFB-1 a partir de repertórios de rearranio de cadeias leves

Identificaram-se os anticorpos ScFv específicos para TGFp*1 por ELISA tanto em fagos como em solução, e sequenciaram-se, conforme descrito anteriormente. Identificaram-se três novos anticorpos scFv específicos para TGFp-1, dois com cadeias leves derivadas de PBL e um com uma cadeia leve derivada de amígdala. Os três tinham a sequência da cadeia pesada de 1B2 (DP49) descrita anteriormente. As sequências estão resumidas abaixo e a sequência completa de cada gene de domínio VL é dada na Figura 1 (b). CLONE FONTE DE VL LINHA GERMINAL ISOTIPO DE VL DE VH 7-A3 PBL DP49 (1B2) Vcapa 10-A6 PBL DP49 (1B2) Vlambda 14-A1 Amígdalas DP49 (1B2) Vlambda

Assim, o domínio VH de 1B2 derivado da biblioteca de PBL pode ser combinado com domínios VL derivados de bibliotecas de PBL e de amígdalas. b. "Picagem" ("Spiking") de CDR3 do anticorpo ScFv específico para TGFfi- 7, 1B2 i. Construção do repertório "picado"

Sintetizou-se primeiro um iniciador oligonucleotídico 84mero mutagénico, 1B2mutVHCDR3 (veja-se a Tabela 1). Este iniciador foi "picado" a 10%; i.e. em cada posição nucleotídica existe uma probabilidade de 10% de que seja incorporado um nucleótido não progenitor. Amplificou-se a cadeia pesada de 1-B2 por PCR utilizando os iniciadores pUC19reverse e 1 B2mutVHCDR3. As condições de amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 1 min, seguindo-se 10 min a 72°C. Separou-se o produto da PCR através de um gel de agarose a 1%-TAE, e excisou-se a banda que representava o VH amplificado e eluíu-se do gel de agarose utilizando o estojo Geneclean (Bio 101). 45 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Amplificou-se a cadeia leve de 1B2 progenitora por PCR utilizando os iniciadores fdtetseq e RL3 (Tabela 1). As condições de amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 1 min, seguindo-se 10 min a 72°C. Separou-se o produto da PCR através de um gel de agarose a 1 %-TAE, excisou-se a banda que representava o VL amplificado e eluíu-se do gel de agarose utilizando o estojo Geneclean (Bio 101).

Combinaram-se aproximadamente 50 ng de cadeia pesada de 1-B2 "picada" ampliada e 50 ng de cadeia leve de 1B2 progenitora amplificada, e precipitaram-se com acetato de sódio e etanol utilizando 25 ,ug de glicogénio como transportador. Formou-se uma pelete com o ADN precipitado, por centrifugação a 13 000 rpm numa microcentrífuga, secou-se ao ar e ressuspendeu-se em 26 μΙ de H20. Utilizou-se numa amplificação de montagem após a adição de tampão de reacção até 1X, dNTP até 200 nM e 5 unidades de Taq polimerase. As condições de amplificação consistiram em 25 ciclos de 94°C durante 1 min, 65°C durante 4 min. Utilizaram-se 5 μΙ de cada montagem como molde numa amplificação de "auxílio" com os iniciadores fdtetseq e pUC1 9reverse. As condições de amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 2 min e 72°C durante 1 min, seguindo-se 10 min a 72°C. 0 produto da amplificação de auxílio foi separado através de agarose a 1 %-TAE e a banda que representava o VH-VL picado de auxílo foi excisada e eluída utilizando o estojo Geneclean. Digeriu-se com as endonucleases de restrição Sfi I e Not I (NEB) e ligou-se (sistema de ligação de Amersham) no vector fagemídeo pCantab 6, previamente digerido com Sfi I e Not I. 0 produto da ligação foi utilizado para transformar células TG1 electrocompetentes, plaqueadas em placas de 2YTAG e incubadas durante a noite a 30°C. Geraram-se aproximadamente 4x106 clones individuais a partir desta "picagem" de CDR3 de VH do VH de CDR3 de 1-B2. ii. Seleccão do repertório de "picagem" de CDR3 de 1 B2

Seleccionou-se o repertório quanto a novos anticorpos scFv específicos para TGFp-1 através de um ciclo de prospecção em TGFp-1 a 1 pg/ml seguido de dois ciclos de selecção com TGFp-1 biotinilado a 50 nM utilizando métodos 46 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ como anteriormente se descreveu. iii. Identificação de anticorpos ScFv específicos para TGFB-1 a partir do repertório de "picaaem" de CDR3 de 1 B2

Identificaram-se anticorpos ScFv específicos para TGFp-1 por ELISA tanto em fagos como em solução, e sequenciaram-se, conforme descrito anteriormente. Isolou-se o clone 27C1 a partir do repertório "picado". É virtualmente idêntico ao clone 1 B2 mas com três diferenças na CDR3 da cadeia pesada. A sequência completa do clone 27C1 é dada na Figura 1 (c). Combinou-se o domínio VH de 27C1 com o domínio VL de 10A6 na construção do anticorpo completo lgG4 27C1/10A6 (Exemplo 2). As propriedades deste anticorpo estão descritas em maior detalhe nos exemplos 2 a 6. Em adição ao 27C1, isolou-se um grande número de anticorpos com até 7 dos 14 aminoácidos diferentes no CDR3 do domínio VH (Figura 3). Estes tinham uma preferência semelhante pela ligação ao TGFp-1 em relação ao TGFP2. 3. Identificação e caracterização de anticorpos para TGFfr2 humano por se/ecção de repertórios de anticorpos sobre fagos nativos e sintéticos a. Indução de bibliotecas de anticorpos sobre faaos

Seleccionaram-se dois repertórios diferentes de anticorpos sobre fagos quanto a anticorpos para o TGFp-2. Os repertórios sintético de VH (Nissim et a!., 1994) e de amígdala (construído como descrito anteriormente) foram cada um tratado como descrito para o TGFp-1 para recuperar partículas de fagemídeo. b. Prosoeccão de biblioteca de anticorpos sobre fagos em TGFp-2

Fagos induzidos dos dois repertórios foram separadamente prospectadas em TGFp-2 conforme descrito anteriormente para o TGFp-1 mas utilizando 0,5 μg/ml de TGFp-2 como antigénio de revestimento. 47 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ c. Identificação e seauenciacão de anticorpos ScFv específicos para TGF6-2

Pesquisaram-se colónias individuais dos terceiro e quarto ciclos de selecção por ELISA tanto sobre fagos como em solução, conforme descrito anteriormente para o TGFp-1 mas utilizando placas de microtítulo flexíveis revestidas com TGFp-2 a 0,2 iug/ml em vez de TGFp-1. Escolheram-se para análise posterior os clones em que o sinal de ELISA gerado na placa revestida com TGFp-2 era pelo menos o dobro do sinal na placa não revestida. Para o ELISA de especificidade, conforme descrito anteriormente para o TGFp-1, consideraram-se os clones como sendo específicos para o TGFp-2 se o sinal de ELISA gerado no poço revestido com TGFp-2 era pelo menos cinco vezes superior ao sinal dos poços revestidos com TGFp-1, BSA ou não revestido. d. Sequência e fonte dos anticorpos ScFv específicos para TGFB-2 iniciais

Isolaram-se quatro anticorpos diferentes específicos para TGFp-2 a partir das selecções utilizando as duas bibliotecas descritas acima. O nome de cada clone, a sua origem e a linha germinal das suas cadeia leve e cadeia pesada são dados abaixo. A sequência completa dos genes do domínio VH de 2A-H11 e 2A-A9 são dadas na Figura 2(a). CLONE BIBLIOTECA FONTE LINHA GERMINAL DE VH ISOTIPO DE VL 1-G2 Amígdala 1-H6 Amígdala DP49 2A-H11 VH sintético DP50 Vlambda 2A-A9 Sintético DP46 Vlambda 11 -Ouro ScFv grande Vlambda

Assim, isolaram-se anticorpos humanos que se ligam a TGFp2 humano, a partir de diferentes fontes, tanto de genes de V naturais de humanos não imunizados como de bibliotecas sintéticas de genes de V de linhas germinais clonadas juntamente com CDR sintéticas. 4. Rearranjo de cadeias leves dos anticorpos ScFv específicos para TGFp-2, 2Α-ΗΊ1 e 2A-A9

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 48

a. Construção de repertórios

Recombinaram-se as cadeias pesadas dos clones 2A-H11 e 2A-A9 com o repertório completo de cadeias leves derivado dos repertórios de PBL e de scFv grandes (derivados de amígdala), como descrito anteriormente para o anticorpo scFv específico para TGFp-1, 1-B2. Ambos os repertórios gerados da recombinação com o repertório de cadeias leves de PBL eram aproximadamente 1x105, e os gerados da recombinação com o repertório de cadeias leves de g amígdala eram aproximadamente 1x10 . b. Seleccão de repertórios de rearranio de cadeias leves

Seleccionaram-se os repertórios de rearranjo de cadeias leves quanto a anticorpos específicos para TGFp-2 utilizando ΤΰΡβ-2 biotinilado, conforme descrito anteriormente para a selecção dos repertórios de rearranjo de cadeias leves para TGFp-1. Em todos os primeiros e segundos ciclos de selecção utilizou-se uma concentração de 100 nM de TGFp-2 biotinilado. No terceiro ciclo de selecção do repertório de rearranjo de cadeias leves derivado de PBL utilizou-se o TGFp-2 biotinilado em concentrações de 100 nM e 1 nM. No terceiro ciclo de selecção do repertório de rearranjo de cadeias leves derivado de amígdala utilizou-se TGFp-2 biotinilado numa concentração de 50 nM. c. Identificação de anticorpos ScFv específicos para TGFB-2 a partir de repertórios de rearranio de cadeias leves

Identificaram-se anticorpos ScFv específicos para TGFp-2 por ELISA, tanto sobre fagos como em solução, e sequenciaram-se, conforme descrito anteriormente. Identificaram-se cinco novos anticorpos scFv específicos para TGFp-2. As sequências estão resumidas abaixo e as sequências completas de cada clone encontram-se na Figura 2(b).

84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ CLONE FONTE DE VL LINHA GERMINAL DE VH ISOTIPO DE VL 6-H1 PBL DP50 (2A-H1 1) Vcapa 6-A5 PBL DP50 (2A-H11) Vlambda 6-B1 PBL DP50 (2A-H11) Vlambda 11-E6 PBL DP46 (2A-A9) Vcapa 14-F12 Amígdala DP46 (2A-A9) Vlambda

d. Determinação de especificidade por ELISA

Os clones identificados que se ligavam a TGFp-2 e não a poços não revestidos, como anteriormente descrito, foram adicionalmente analisados quanto a especificidade fina. Realizaram-se ELISA de especificidade utilizando scFv quer exibidos sobre fagos quer em solução, conforme descrito acima, excepto utilizando 5 ml de meios em tubos Falcon de 50 ml na inoculação com cada clone e crescimento para gerar o scFv sobre fagos ou solúvel utilizado no ELISA. Revestiram-se poços de placas de microtítulo com 50 μΙ de TGFp-1 0,2 μg/ml, TGFp-2 0,2 μg/ml, albumina sérica bovina (BSA) 10μg/ml ou PBS (poço não revestido). Após pré-bloqueio tanto dos fagos (ou do scFv solúvel) como das placas de microtítulo, adicionaram-se 50 μΙ de fagos (ou scFv solúvel) bloqueados de cada clone a um poço revestido com TGFp-1, TGFp-2, BSA ou a um poço não revestido. Tal como acima, visualizou-se a actividade da fosfatase alcalina utilizando ou o substrato cromagénico pNPP (Sigma) ou o sistema Ampak (Dako). Considerou-se que os clones eram específicos para o TGFp-2 quando o sinal de ELISA gerado no poço revestido com TGFp-2 era pelo menos cinco vezes superior ao sinal nos poços revestidos com TGFp-1, BSA ou no poço não revestido. Determinou-se a reactividade cruzada com antigénios não relacionados mais extensivamente para o anticorpo anti-TGFp2 no formato completo, veja-se o Exemplo 2. Mostrou-se que a reactividade cruzada de lgG4 6B1 e lgG4 6A5 com TGFpl e TGFp3 (obtido de R&D Systems, Abingdon) era também muito baixa. e. Determinação de especificidade por BIACore™

Mostrou-se também que os anticorpos eram específicos para TGFP2 em comparação com TGFpl por ligação relativa aos chips sensores BIACore revestidos com o antigénio apropriado. Imobilizaram-se TGFpi e TGFp2 por

acoplamento com amina nos chips sensores Biosensor CM5 (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. Injectaram-se fragmentos Fv de uma só cadeia (35 μΙ; purificados por cromatografia de afinidade de metal imobilizado) sobre o antigénio imobilizado a um caudal de 5 μΙ/min. Determinou-se a quantidade de TGFp ligado como o aumento total em unidades de ressonância (UR) ao longo deste período de tempo. Para os fragmentos Fv de uma só cadeia 6H1, 6A5 e 14F12, estes fragmentos originaram um total de 686, 480 e 616 UR, respectivamente, para o chip sensor revestido com TGFpi e 77, 71 e 11 5 UR, respectivamente, para o chip revestido com TGFP2. 5. Construção de neutra/izantes biológicos anti-TGFp-1 com maior afinidade a. Recombinacão de cadeias pesadas derivadas de scFv anti-TGFpi de alta afinidade com cadeias leves derivadas de scFv anti-TGFBI e anti-TGFB2 apresentando boas propriedades

Anticorpos derivados por "picagem" de CDR3 do anticorpo scFv 1-B2 (secção 2b) ligam-se a TGFp-1 com alta afinidade. Para melhorar a probabilidade de obter anticorpos neutralizantes de alta afinidade decidiu-se proceder a um rearranjo de cadeias VH derivadas de scFv θηΐΐ-ΤαΡβ-1 de alta afinidade com VL derivadas de clones de scFv com propriedades promissoras e em particular os que eram capazes de neutralizar a actividade do TGFp-2 in vitro.

Amplificaram-se as cadeias pesadas por PCR a partir do repertório de clones de 1-B2 com CDR3 "picada" após selecção quanto ao TGFp-1 (secção 2a.ii) utilizando os iniciadores pUC19reverse e PCR-H-Link (Tabela 1). As condições da amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 1 min, seguindo-se 10 min a 72°C. Separou-se o produto da PCR através de um gel de agarose a 1 %-TAE, excisou-se a banda que representava o VH amplificado e eluíu-se do gel de agarose utilizando o estojo Geneclean (Bio 101).

Amplificaram-se separadamente as cadeias leves por PCR a partir de cada um dos neutralizantes anti-TGFp-1 específicos (7-A3, 10A6 e 14-A1; secção 2a.iii) e cada um dos neutralizantes anti-TGFp-2 específicos (6H1, 6A5, 6B1, 11E6 e 14F12; secção 4c) utilizando os iniciadores fdtetseql e PCR-L-Link 51 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (Tabela 1). Utilizaram-se as mesmas condições para a PCR que na amplificação de VH. Purificou-se então separadamente cada produto VL da PCR através de um gel de agarose a 1%-TAE, conforme descrito acima. Finalmente, misturaram-se os produtos purificados em quantidades aproximadamente equimolares (estimadas a partir de um gel de agarose analítico) para proporcionar um "banco" de VL.

Combinaram-se aproximadamente 50 ng de cadeias pesadas amplificadas e 50 ng do banco de cadeias leves amplificadas e precipitaram-se com acetato de sódio e etanol utilizando 25 ,ug de glicogénio como transportador. Formou-se uma pelete com o ADN precipitado por centrifugação a 13 000 rpm numa microcentrífuga, secou-se ao ar e ressuspendeu-se em 23 μΙ de H20. Utilizou-se numa amplificação de montagem após a adição de tampão de reacção, dNTP até 200 nM e 5 unidades de Taq polimerase. As condições de amplificação consistiram em 20 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 2 min, seguindo-se 10 min. A 72°C. Utilizaram-se 5 μΙ de montagem como molde numa amplificação de "auxílio" de 50 μΙ com os iniciadores fdtetseq e pUC19reverse. As condições da amplificação consistiram em 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min e 72°C durante 2 min, seguindo-se 10 min. a 72°C.

Separou-se o produto da amplificação de "auxílio" através de um gel de agarose a 1%-TAE e excisou-se a banda que representava o VH-VL de auxílio e eluíu-se utilizando o estojo Geneclean. Digeriu-se com as endonucleases de restrição Sfi I e Νοΐ I (NEB) e ligou-se no vector fagemídeo pCantab 6 (McCafferty et a/., 1994, supra), previamente digerido com Sfi I e Not I, utilizando o sistema de ligação Amersham. Utilizou-se o produto da ligação para transformar células TG1 electrocompetentes, plaqueou-se em placas de 2YTAG e incubou-se durante a noite a 30°C. Gerou-se um repertório de aproximadamente 3x10 clones individuais. b. Seleccão de repertório de rearranio de cadeias

Seleccionou-se o repertório de cadeias rearranjadas através de um único ciclo de prospecção em TGFp-1 (1 μg/ml), conforme anteriormente descrito (secção 1 b).

52 ί 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ c. Identificação de anticorpos scFv específicos para TGFB-1

Identificaram-se anticorpos scFv específicos para TGFp-1 por ELISA sobre fagos e sequenciaram-se conforme descrito anteriormente (secções 1d.i e 1e). Identificaram-se novos anticorpos scFv específicos para TGFp-1. Isolaram-se cinco novos clones de alta afinidade - CS32 que compreende VH de 31G9 e VL de 7A3; CS39 que compreende VH de 31G9 e VL de 6H1; CS37 que compreende VH de 31G9 (Figura Ί (a)(iii)) e VL de 11 E6, com uma substituição de Vai por lie no resíduo 2 (sequência de VL dada na Figura 14); CS35 que compreende a cadeia pesada de 31G9 com substituições de Gin por Glu no resíduo 1, Glu por Gin no resíduo 5 e VL de 14F12; e CS38 que compreende VH de 31G9 com substituições de Gin por Thr no resíduo 3, Gin por Glu no resíduo 5, Phe por Leu no resíduo 27, Asn por lie no resíduo 56 e Gin por Arg no resíduo 105 e VL de 6A5. d. Determinação da velocidade na dissociação para ligação de fragmentos Fv de uma só cadeia a TGFB1 e TGFB2

As velocidades na dissociação para ligação a TGFpi ou TGFP2 de fragmentos Fv de uma só cadeia descritos neste exemplo foram determinadas conforme descrito por Karlsson et aí. (R. Karlsson et al., J. Immunol. Methods 145. 229-240, 1991). Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 2, juntamente com constantes de dissociação para os que se determinaram. Estes resultados indicam que se isolaram anticorpos de alta afinidade. 53 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Standard), no segundo ciclo utilizaram-se 3,5x109 fagos em 0,5 ml de PBS. O imuno-tubo foi revestido com 10μg de TGFp-2 em 0,5 ml de PBS, tanto no primeiro como no segundo ciclos de selecção. Pesquisaram-se colónias individuais do segundo ciclo de selecção por ELISA utilizando TGFp-1 0,2 pg/ml. Os clones que se ligavam a TGFp-1 foram ainda pesquisados relativamente ao TGFp-2, ao TGFp-3, ao BSA e ao PBS. Consideraram-se os clones como específicos tanto para TGFp-1 como para TGFp-2 quando os sinais de ELISA gerados nos poços revestidos com TGFp-1 e com TGFp-2 eram ambos pelo menos cinco vezes superiores ao sinal no poço de TGFP-3, BSA e no poço não revestido. c. Identificação de um anticorpo ScFv reactivo de modo cruzado com TGFB-1/ TGFB-2

Identificou-se um único anticorpo scFv específico tanto para TGFp-1 como para TGFp-2, por ELISA sobre fagos e em solução, e sequenciou-se, conforme descrito anteriormente. A sequência completa do domínio VL do gene do anticorpo VT37 é dada na Figura 4. A constante de dissociação deste anticorpo Fv de uma só cadeia foi estimada, por análise utilizando BIACore1", como sendo 4 nM para o TGFp-1 e 7 nM para o TGFp-2. A reactividade cruzada para o TGFP3 foi também determinada. Para scFv VT37 purificado a 8,3 pg/ml sobre chips sensores BIACore™ revestidos com TGFpi (500 UR revestidas); TGFP2 (450 UR revestidas) ou TGFP3 (5500 UR revestidas). A resposta relativa para ligação de scFv VT37 foi: TGFpl - 391 UR ligadas; TGFp2 - 261 UR ligadas ou TGFP3 - 24 UR ligadas. Assim, este anticorpo liga-se fortemente a TGFpi e a TGFp2 mas a ligação a TGFp3 não é detectável acima do ruído de fundo. EXEMPLO 2

Construção de linhas de células que expressam anticorpos completos

Para a construção de linhas de células que expressam anticorpos lgG4, clonaram-se domínios variáveis em vectores que expressam a região constante gama 4 humana para os domínios VH ou as regiões constantes capa e lambda humanas para os domínios VL.

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 54

Para construir ο anticorpo completo, lgG4 27C1/10A6 (específico para TGFpi), preparou-se ADN de VH de 27C1 a partir do clone isolado acima, no exemplo 1. Amplificou-se o gene de VH por PCR utilizando os oligonucleótidos VH3BackSfiEu e VHJH6ForBam (Tabela 1) com ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 55°C, 1,5 min a 72°C. Após digestão com Sfil e BamHI, clonou-se o gene de VH no vector vhcassette2 (Figura 5) digerido com Sfil e BamHI. Transformou-se o ADN ligado em E. coli TG1. Obtiveram-se colónias resistentes a ampicilina e as que continham a inserção correcta foram identificadas por sequenciação de ADN.

Preparou-se ADN plasmídico a partir destas colónias e digeriu-se o ADN com Hindlll e BamHI. Ligou-se o fragmento de restrição Hindlll-BamHI ao vector de expressão da cadeia pesada de lgG4 humano pG4D100 (Figura 6), que tinha sido digerido com Hindlll e BamHI e transfectou-se o ADN para E. coli TG1 por electroporação. A sequência da inserção do gene de VH foi novamente verificada por sequenciação de ADN.

Para a cadeia leve, submeteu-se primeiro o gene de VL de 10A6, isolado no exemplo 1, a mutagénese, para remover o seu local BamHI interno utilizando mutagénese dirigida ao local (Amersham RPN 1523) com o oligonucleótido DeltaBamHI (Tabela 1). Amplificou-se o gene de VDLBamHI resultante por PCR utilizando os oligonucleótidos νλ3/4ΒθοΙ<ΕυΑρ3 e HuJX2-3ForEuBam (Tabela 1). Após digestão da inserção amplificada com ApaLI a BamHI, clonou-se o gene de VL no vector vleassetteCATI (Figura 7) digerido com Apal e BamHI. Transformou-se o ADN ligado em E. coli TG1. Obtiveram-se colónias resistentes a ampicilina e as que continham a inserção correcta foram identificadas por sequenciação de ADN.

Preparou-se ADN plasmídico a partir destas colónias e digeriu-se o ADN com Hindlll e BamHI. O fragmento de restrição Hindlll-BamHI que continha a sequência de comando e o domínio VL foi ligado ao vector de expressão da cadeia leve lambda humana, pLN10 (Figura 8), que tinha sido digerido com Hindlll e BamHI. Após electroporação, verificaram-se os transformantes em E. coli por sequenciação de ADN.

Preparou-se ADN plasmídico a partir do clone pG4D100-27C1 e do clone pl_N10-10A6. Co-transfectou-se então este ADN para células de ovário de hamster chinês (CHO) DUKXB11 por electroporação (290 V; 960 pF). Cresceram-se então as células durante 2 dias em meio não selectivo (alfa-MEM mais nucleósidos). Transferiram-se então as células para um meio selectivo (alfa-MEM mais G418 1 mg/ml sem nucleósidos) e cresceram-se em placas de 96 poços. Transferiram-se então as colónias para placas de 24 poços e ensaiaram-se amostras por ELISA sanduíche para pesquisa de anticorpo lgG4 humano montado e por ligação a TGFpi em ELISA (como no exemplo 1). Para o ELISA sanduíche, IgG anti-humano de cabra que revestia a placa de ELISA e lgG4 humano capturado detectado utilizando conjugado de fosfatase alcalina e cadeia leve lambda anti-humana de cabra. Derivaram-se então linhas de células de alta expressão por amplificação dos genes inseridos utilizando selecção na presença de metotrexato (R.J. Kaufman, Methods Enzymol. 185, 537-566, 1990). O anticorpo lgG4 6H1 completo (específico para TGFp2) foi construído de um modo semelhante à construção anterior de lgG4 27C1/10A6. Clonou-se o gene de VH de 6H1 (exemplo 2) em pG4D100 como para o 27C1 anterior, com a excepção de que a amplificação por PCR foi realizada com os oligonucleótidos VH3BackSfiEu e VHJH1 -2FORBam. Subclonou-se o gene de VL de 6H1 (exemplo 2) em vleassetteCATI como anteriormente com a excepção de que a amplificação por PCR foi realizada com os oligonucleótidos Vk2BackEuApa e HuJk3FOREuBam. Contudo, uma vez que a VL de 6H1 é uma cadeia leve capa, o fragmento Hindlll-BanHI foi subclonado no vector de expressão da cadeia leve capa humana pKN100 (Figura 9) que tinha sido digerido com Hindlll e BamHI. Isolaram-se então linhas de células de alta expressão como anteriormente descrito. Identificaram-se os clones que expressavam o anticorpo em placas de cultura por ELISA sanduíche para anticorpo lgG4 humano montado (detectado utilizando conjugado de cadeia leve capa anti-humana de cabra e por ligação a TGFp2 em ELISA (como no exemplo 2).

Para construir os anticorpos completos lgG4 6A5 e lgG4 6B1, utilizou-se a mesma construção de VH de 6H1 em pG4D100 como para lgG4 6H1 uma vez que este anticorpos tinham todos o mesmo gene de VH. Os genes de 6B1 e de 6A5 foram cada um subclonado em vleassetteCATI como anteriormente 56 t' 84 928 EP 0 853 661 /PT para a cadeia leve de 10A6 com a excepção de que a amplificação por PCR foi realizada com os nucleótidos V^3backEuApa e Hu^2-3ForEuBam. Subclónou-se então o fragmento de restrição Hindlll-BamHI em pLN10 como anteriormente. Identificaram-se os clones que expressavam o anticorpo nas placas de cultura por ELISA sanduíche para anticorpo lgG4 humano montado (detectado utilizando conjugado de cadeia leve capa anti-humana de cabra e por ligação a TGFP2 em ELISA (como no exemplo 2).

Propriedades de construções de anticorpos completos

Purificação de anticorpos completos

Clarificou-se o sobrenadante isento de soro de células CHO que produziam a IgG relevante, por centrifugação a 8 000 rpm (Beckman JS2-21) antes da purificação. Aplicou-se o sobrenadante a uma coluna de afinidade pré-compactada com Proteína A-Sepharose, HiTrap, de Pharmacia, de tamanho 1 ou 5 ml, com capacidades de ligação de 25 ou 120 mg, respectivamente. Cada IgG estava atribuída a uma coluna para evitar qualquer potencial arrastamento de material de uma purificação para outra. Equilibrou-se a coluna com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando dez volumes da coluna de 1xPBS antes da aplicação do sobrenadante. Quando todo o sobrenadante tinha já sido aplicado na coluna a um caudal de 2-4 ml/minuto, dependendo do tamanho da coluna, lavou-se novamente a coluna com dez volumes de coluna de 1x PBS para remover qualquer material ligado não especificamente. A eluição da proteína ligada foi conseguida utilizando acetato de sódio 0,1 M e ajustou-se o pH para 3,3 com ácido acético glacial. Recolheu-se o material eluído em 8 fracções de 1,5 ml de volume, e determinou-se a quantidade de proteína medindo a absorvância a 280 nm e multiplicando este valor por 0,7 para obter um valor em mg/ml. Neutralizou-se então com 0,5 ml de Tris.HCI 1M, pH 9,0, por fracção de 1,5 ml e reuniram-se as fracções que continham proteína e dialisaram-se contra 1 x PBS para troca do tampão de IgG. Devolveu-se à coluna um pH neutro fazendo correr dez volumes da coluna de 1xPBS, e depois armazenou-se em etanol a 20% como conservante até ser novamente necessário.

Correu-se então uma amostra em SDS-PAGE 10-15% (Phast System, 57 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Pharmacia) e corou-se com prata. Isto permitiu uma avaliação da pureza da preparação de IgG. Esta verificou-se ser normalmente de cerca de 80-90%, apenas com um par de outras bandas proeminentes no gel corado.

Especificidade de liaacão por ELISA

Mostrou-se que os anticorpos lgG4 6B1 e 6A5 se ligam a TGFp2 com muito pouca reactividade cruzada com TGFpi e com TGFP3 e sem reactividade cruzada detectável com uma gama de antigénios não específicos: interleucina-1; linfotoxina humana (TNFb); insulina humana; albumina sérica humana; ADN de cadeia simples; oxazolona-albumina sérica bovina; hemocianina de lapa do género Fissurel/a; inibidor de tripsina da clara do ovo de galinha; quimiotripsinogénio; citocromo C; gliceraldeídofosfato-desidrogenase; ovalbumina; lisozima de ovo de galinha; albumina sérica bovina e factor a de necrose tumoral (TNFa) (Figura 13(a) e (b)). Do mesmo modo, os anticorpos lgG4 6B1, 6A5 e 6H1 ligaram-se fortemente a um chip sensor BIACore1" revestido com TGFp2 mas não se ligavam significativamente a chips revestidos com TGFpi ou TGFP3.

Propriedades de liaacão de anticorpos completos oor BIACore™

As constantes de afinidade dos anticorpos anteriores foram determinadas por BIACore™, utilizando o método de Karlsson et a!., J. Immunol. Methods, 145. 299-240, 1991 (supra) e verificou-se serem aproximadamente 5 nM para o lgG4 27C1/10A6 relativamente ao TGFpi e 2 nM para o lgG4 6H1 relativamente ao TGFp2. O anticorpo lgG4 27C1/10A6 apresentou também alguma reactividade cruzada com o chips Biosensor revestidos com TGFP2 mas a constante de dissociação é aproximadamente 10 vezes ou mais superior para o TGFp2 em comparação com o TGFpi. Não se verificou-se reactividade cruzada significativa com um chip sensor BIAcore™ revestido com lisozima. A neutralização e a inibição de ligação a radiorreceptores por anticorpos lgG4 de TGFpi e TGFp2 estão descritas nos exemplos 3 e 4. EXEMPLO 3

Neutralização por anticorpos do efeito inibidor de TGFfil e TGFfi2 sobre a

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proliferação celular

Testou-se a actividade de neutralização dos anticorpos descritos nos exemplos 1 e 2 numa modificação de um bioensaio para o TGFp descrito por Randall et aí. (1993), J. Immunol. Methods, 164. 61-67. Este ensaio baseia-se na capacidade do TGFpi e do TGFp2 para inibirem a proliferação induzida por interleucina-5 da linha de células de eritroleucemia, FT1, sendo capaz de reverter esta inibição com anticorpos específicos para TGFp. Método Células e manutenção

Cresceu-se a linha de células de eritroleucemia humana TF1 em meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitelo fetal a 5%, penicilina/estreptomicina e rhGM-CSF 2 ng/ml numa incubadora humidificada contendo 5% de C02 a 37°C. Passaram-se as culturas quando atingiam uma densidade de 2x105/m! e diluíam-se até uma densidade de 5x10s/ml.

Citóquinas e anticorpos

Obtiveram-se rhGM-CSF e rhlL-5 de R&D Systems, o rhTGFp2 foi obtido de AMS Biotechnology. 0 anticorpo de coelho anti-TGFp2 foi obtido de R&D Systems e os anti-TGFp1, 2,3 de ratinho eram de Genzyme. Outros anticorpos contra TGFp2 são como descrito nos exemplos 1&2.

Titulação da inibição da proliferação pelo TGFB2

Prepararam-se diluições de duplicação de TGFP2 (800 pM-25 pM) para a construção de uma curva de resposta à dose numa placa de microtítulo estéril em 100 μΙ de meio RPMI 1640 contendo soro de vitelo fetal a 5% e antibióticos. Todas as diluições foram realizadas pelo menos em quadruplicado. Incluíram-se também poços adicionais contendo 100 μΙ do meio anterior para controlos de reagente e de apenas células.

Lavaram-se células TF1 duas vezes com meio RPMI 1640 isento de soro 59 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ e ressuspenderam-se em meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitelo fetal a 5%, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina e 4 ng/ml de rhlL-5 a uma densidade de 2,5x105/ml. Adicionaram-se alíquotas de 100 μΙ às séries de diluições previamente preparadas e incubou-se a placa durante 48 h numa incubadora humidificada contendo 5% de C02 a 37°C.

Mediu-se a proliferação celular colorimetricamente por adição de 40 μΙ de substrato CellTiter96 (Promega), devolvendo a placa à incubadora mais 4 h e determinando finalmente a absorvância a 490 nm. Calculou-se então a percentagem de inibição para cada concentração de TGFp2 relativa aos poços com apenas células.

Ensaio à neutralização da actividade inibidora de TGFB2 por anticorpos anti-TGFB2

Determinou-se a neutralização de ΤΰΡβ2 fazendo diluições de duplificação de cada anticorpo purificado em 100μΙ de meio como anteriormente. Adicionou-se ΤΩΡβ2 a cada diluição de anticorpo para obter uma concentração final equivalente à que originou 50% de inibição na titulação descrita acima. Preparou-se cada diluição em quadruplicado. Prepararam-se poços adicionais para controlos de apenas anticorpo, células e reagente. A preparação das células e a determinação da proliferação celular foram realizadas como descrito acima.

Resultados

Mostrou-se que ο ΤΰΡβ2 inibe a proliferação de células TF1 em 50% numa concentração de 50 pM. Utilizou-se esta concentração para todas as experiências de neutralização.

Estes ensaios mostraram que a actividade do ΤΰΡβ2 era neutralizada de uma maneira dependente da dose tanto para os fragmentos scFv (Figura 10) como para os anticorpos lgG4 completos (Figura 11). A concentração de anticorpo que originou 50% de inibição foi determinada a partir dos gráficos e está apresentada na Tabela 4. 60 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ EXEMPLO 4

Inibição por anticorpos de ligação de TGFp a receptores medida num ensaio com radiorreceptores

Expressaram-se e purificaram-se fragmentos de anticorpos Fv de uma só cadeia e anticorpos lgG4 completos de diferentes clones e mediu-se a sua capacidade para inibir a ligação de TGFp a receptores num ensaio com radiorreceptores.

Purificação de scFv

Purificaram-se scFv contendo uma cauda de poli-histidina por cromatografia de afinidade de metal imobilizado. O clone bacteriano contendo o plasmídeo apropriado é inoculado em 50 ml de meio 2YT contendo glucose a 2% e ampicilina a 100 pg/ml (2YTAG) e deixou-se crescer durante a noite a 30°C. No dia seguinte, adicionou-se a cultura a 500 ml de 2YTAG pré-aquecido e deixou-se crescer a 30°C durante 1 h. Recolheram-se as células por centrifugação e adicionaram-se a 500 ml de 2TY contendo ampicilina e IPTG 1 mM e deixaram-se crescer a 30°C durante 4 h. Recolheram-se então as células por centrifugação e ressupenderam-se em 30 ml de Tris.HCI 50 mM, pH 8,0, sacarose a 20% (p/v), EDTA 1 mM, gelados. Após 15 min de mistura por rotação na direcção longitudinal a 4°C, centrifugou-se a mistura a 12 k rpm durante 15 min a 4°C. Removeu-se o sobrenadante e adicionou-se-lhe ~1 ml de NTA-agarose (Qiagen 30210) e misturou-se a 4°C durante 30 min. Lavaram-se as pérolas de agarose abundantemente com fosfato de sódio 50 mM, NaCI 300 mM, e carregaram-se numa coluna pequena. Após lavagem adicional com fosfato de sódio 50 mM, NaCI 300 mM, imidazolo 10 mM, pH 7,4, eluíu-se o scFv com fosfato de sódio 50 mM, NaCI 300 mM, imidazolo 250 mM, pH 7,4. Recolheram-se fracções de 0,5 ml e identificaram-se as fracções que continham proteína medindo a A280nm- Concentraram-se as fracções reunidas e purificou-se adicionalmente o scFv por filtração em gel em PBS numa coluna Superdex 75 (Pharmacia). 61 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Purificação de anticorpos completos

Purificaram-se anticorpos lgG4 completos conforme descrito no Exemplo 2.

Ensaio com radiorreceptores ao TGFfi A neutralização da actividade do TGFp é medida através da capacidade 125 dos scFv e das IgG para inibir a ligação de TGFp marcado com -I aos seus receptores em células de carcinoma do pulmão humano A549.

Crescem-se as células A549 (ATCCCCL185) em meio de Eagle modificado por Dulbecco com alta concentração de glucose (Sigma D-6546) suplementado com soro de vitelo fetal (PAA) a 10%, glutamina 2 mM (Sigma G-7513), penicilina/estreptomicina (Sigma P-0781), aminoácidos não essenciais em MEM (Sigma M-7145).

As células são semeadas a 1-2x105 células/ml/poço nos poços de placas em cachos de 24 poços e crescem-se durante 24 h em DMEM isento de soro. Lavam-se duas vezes as monocamadas de células com DMEM isento de soro e adicionam-se 0,5 ml de meio de ligação (DMEM/F12 de Hams (Sigma D-6421) contendo BSA a 0,1 % (v/v) a cada poço.

Pré-incubam-se alíquotas de 125l-TGFp1 ou 125l-TGFp2 (70-90 TBq/mmol; Amersham International) a 20 pM, com anticorpo, em meio de ligação à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionam-se então às monocamadas de células amostras em duplicado de 0,5 ml de misturas de TGFp/anticorpo e incubam-se a 37°C durante 1-2 h. Os poços de controlo contêm apenas TGFp. Remove-se o TGFp não ligado por lavagem 4 vezes com solução salina equilibrada de Hank contendo BSA a 0,1 %. Solubilizam-se as células em 0,8 ml de Tris.HCI 25 mM, pH 7,5, glicerol a 10%, Triton X-100 a 1 %, à temperatura ambiente durante 20 minutos. Remove-se o conteúdo de cada poço e mede-se o 125l num contador gama. A potência de cada scFv ou IgG é medida pela concentração de locais de combinação de anticorpo necessários para inibir a ligação de TGFp em 50% (IC50; Tabela 5). Assim, os valores de IC50 são inferiores a 10 nM e em alguns casos inferiores a 1 nM, indicando anticorpos

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muito potentes. EXEMPLO 5

Prevenção de formação de cicatriz por anticorpos contra TGFpi e ΤΘΕβ2 no sistema nervoso centrai lesionado do rato

Logan et ai. (1994) Eur.3 Neuroscience 6, 355-363 mostraram num modelo em rato de lesão do SNC, o efeito de melhoria de um anti-soro de peru neutralizante contra TGFpl sobre a deposição de tecido fibroso de cicatriz e a formação de uma membrana glial limitante que rodeia a lesão. Estabeleceu-se um estudo para investigar os efeitos de anticorpos humanos neutralizantes manipulados dirigidos tanto contra TGFpi como TGFp2 no mesmo modelo de rato. A derivação dos anticorpos utilizados neste estudo está descrita nos exemplos 1 e 2. Método

Animais e cirurgia

Anestesiaram-se grupos de cinco ratos fêmea Sprague-Dawley (250 g) com uma injecção i.p. Os ratos anestesiados tinham uma lesão estereotacticamente definida feita no córtex occipital direito (Logan et ai., 1992, Brain Res. 587. p216-227) e canulou-se cirurgicamente o ventrículo lateral e exteriorizou-se ao mesmo tempo (Logan et ai., 1994, supra).

Neutralização de TGFB

Injectaram-se intra-ventricularmente os animais diariamente com 5 μΙ de anticorpos anti-TGFp purificados (Tabela 3) diluídos num veículo de fluido cerebrospinal artificial como descrito por Logan et ai., 1994, supra. Catorze dias após a lesão todos os animais foram fixados por perfusão e secções de 7 mm em cera de poliéster foram processadas para avaliação histoquímica do local da lesão por coloração imunofluorescente.

I

Análise imuno-histoauímica de fluorescência e por imaaeoloaia

Seguiram-se as alterações morfológicas no interior do local do ferimento por coloração imunofluorescente com anticorpos para fibronectina e laminina detectados com conjugados de FITC anti-espécies (Logan et a!., 1994, supra). Estas alterações foram avaliadas semi-quantitativamente por análise imageológica utilizando um microscópio confocal Leitz ligado a um sistema de varrimento de laser Biorad MRC500. As leituras foram feitas em posições Standard de meio caminho ao longo da lesão.

Resultados

Efeitos de anticorpos para TGFB no local de lesão no SNC A quantificação da fluorescência relativa específica para cada um dos anticorpos está apresentada na figura 12a e b. A laminina é uma medida da formação da limitante glial externa em torno das fronteiras do ferimento e juntamente com fibronectina forma uma matriz de tecido fibroso no interior do centro do ferimento. A quantificação por análise imageológica destas duas proteínas permite determinar o grau de formação de cicatriz no local do ferimento.

Em comparação com o controlo salino (fig. 12 a,b), há uma considerável diminuição de imuno-localização de fibronectina e laminina no ferimento nos cérebros tratados com anticorpo anti-TGFp. Assim, isto indica que estes anticorpos humanos manipulados dirigidos contra epítopos em TGFpi & TGFP2 melhoram os efeitos de lesão do SNC tanto separadamente como juntos, evitando a deposição das proteínas da matriz celular fibronectina e laminina, no interior do local do ferimento. Previamente, Logan et af. (1994, supra) tinham mostrado a eficácia de um anti-soro policlonal de peru dirigido contra TGFpi. Este é o primeiro relatório de quaisquer anticorpos dirigidos contra TGFp2 que se apresentaram eficazes neste modelo.

I

EXEMPLO 6

Determinação de ligação de lgG4 6B1 à forma activa ou latente de ΤΰΕβ2

Sintetiza-se e segrega-se TGFp2 exclusivamente na forma de um complexo biologicamente activo ou latente (Pircher et a!., (1986) Biochem. Biophys fíes. Commun., 1 58. 30-37). O complexo latente consiste em TGFp2 homodimérico ligado por dissulfureto associado de modo não covalente ao péptido associado à latência (LAP). A activação do TGFP2 ocorre quando este é libertado do seu precursor processado. 0 TGFp2 activo é capaz de dissociação reversível e reassociação com o LAP, de que resulta "ligar" e "desligar" a sua bioactividade, respectivamente.

Mostrou-se que células de adenocarcinoma PC-3 em cultura (Ikeda et al. (1987) Biochemistry, 26, 2406-2410) segregavam quase exclusivamente TGFp2 latente proporcionando uma fonte conveniente para determinação de ligação à forma activa ou latente de TGFP2 pelo anticorpo lgG4 6B1. Método

Cultura de células

Cresceram-se células de adenocarcinoma prostático PC-3 até à confluência em meio suplementado com FBS a 10%. Lavaram-se as células 3x com PBS e cultivaram-se as células mais 7 dias em F12 de Hams/DMEM isento de soro suplementado com 1,4x tamoxifeno a 10'5 M (Brown et a!., (1990) Growth Factors, 3, 35-43). Removeu-se o meio, clarificou-se por centrifugação e dividiu-se em duas alíquotas de 15 ml. Acidificou-se uma alíquota durante 15 min com HCI 5 M por adição, gota a gota, até pH = 3,5 e depois neutralizou-se por adição semelhante de NaOH 5M/HEPES 1M, pH 7,4. Este procedimento activa quantitativamente o TGFp2 latente. ELISA de competição

Dezasseis poços de uma placa de ELISA foram revestidos durante a noite com 100 μΙ de TGFp2 200 ng/ml em PBS a 4°C. Lavou-se a placa 3x com PBS- 65 r 84 928

EP 0 853 661/PT

Tween e bloqueou-se a 37°C com 200 μΙ de Marvel a 3% em PBS.

Incubaram-se as seguintes amostras à temperatura ambiente durante 1 hora. 400 μΙ de F12 de Hams/DMEM (branco de reagente) 400 μΙ de F12 de Hams/DMEM mais 4 μg de anticorpo lgG4 6B1 (controlo positivo) 400 μΙ de meios condicionados activados com ácido PC-3 mais 4 pg de lgG4 6B1 (amostra de TGFP2 activo) 400 μΙ de meios condicionados não tratados com PC3 mais 4 pg de anticorpo lgG4 6B1 (amostra de TGFp2 latente)

Removeu-se da placa de ELISA a solução de bloqueio e adicionaram-se 100 μΙ de uma das soluções anteriores a poços sensibilizados em quadruplicado e incubou-se à temperatura ambiente durante 2 horas. Lavou-se a placa 3x com PBS/Tween e voltou-se a encher os poços com 100μΙ de conjugado de fosfatase alcalina e cadeia γ de IgG de cabra anti-humano diluído de 1:5000 em Marvel a 1 %/PBS. Após 1 hora lavaram-se os poços 3x com PBS/Tween e revelou-se o anticorpo ligado com substrato p-NPP por absorvância a 405 nm.

Resultados

Os resultados desta experiência estão apresentados na Figura 23.

Este resultado mostra claramente que a pré-incubação com TGFp2 activado inibe a ligação de 6B1 a TGFp2 ligado numa placa de ELISA, enquanto a forma latente não se liga. Isto prova que o lgG4 6B1 apenas de liga à forma activa de TGFp2. 66 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ EXEMPLO 7

Neutralização por anticorpos dirigidos contra ΤΰΡβ2 do efeito inibidor de isoformas de ΤΰΡβ sobre a proliferação celular

As actividades de neutralização de lgG4 6B1, de lgG4 6H1 (purificado como no exemplo 2) e de um anticorpo monoclonal de ratinho (Genzyme; J.R. Dasch et ai., supra) foram medidas para cada uma das isoformas de TGFp, TGFpi, TGFP2 e TGFP3, no ensaio de proliferação de células TF1 no Exemplo 3. A concentração da isoforma de TGFp era de 100 pM em cada ensaio.

Como apresentado na Figura 16, o lgG4 6B1 neutraliza fortemente o TGFp2 com uma IC50 de aproximadamente 2 nM (Tabela 6). Em comparação, esta era de 10 nM para o anticorpo monoclonal de ratinho de Genzyme e de 12 nM para o lgG4 6H1. Nem o lgG4 6B1 nem o lgG4 6H1 neutralizam significativamente o TGFpl (Fig. 17). Contudo, há significativa neutralização de TGFp3 tanto por lgG4 6B1 (IC50 ap. 1 1 nM) como por 6H1 (ap. 20 nM; Fig. 18). Isto é consideravelmente menos do que a potência de neutralização do anticorpo monoclonal de Genzyme (IC50 ap. 0,1 nM).

Tanto o lgG4 6B1 como o lgG4 6H1 são neutralizantes da actividade de TGFp2 mais fortes do que da actividade de TGFp3. A neutralização da actividade de TGFp3 é superior à que se previa a partir da ligação relativa destas duas isoformas pelos anticorpos (exemplo 2) e da ligação relativa num ensaio com radiorreceptores (exemplo 8). EXEMPLO 8 inibição por anticorpos dirigidos contra TGFfi2 da ligação de outras isoformas de ΤΰΡβ a receptores, medida num ensaio com radiorreceptores A capacidade de lgG4 6B1 para inibir a ligação de isoformas de TGFp a receptores foi medida num ensaio com radiorreceptores conforme descrito no exemplo 4. O lgG4 6B1 inibiu a ligação de 125l-TGFp2 com uma IC50 de 0,05 nM. 125 67 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ Não houve inibição significativa da ligação de l-TGFpi enquanto para o 125l-TGFp3, o lgG4 6B1 inibiu a ligação com uma IC50 de aproximadamente 4 nM (Tabela 6). Isto indica a potência de lgG4 6B1 neste ensaio e a sua selectividade para a neutralização da actividade de TGFp2. A reactividade cruzada com TGFP3 neste ensaio é inferior a 2%.

Assim, o lgG4 6B1 inibe preferencialmente a ligação de TGFp2 aos seus receptores em relação à de TGFP3. EXEMPLO 9

Avaliação de anticorpos de TGFpi para utilização terapêutica

Os anticorpos isolados no Exemplo 1 foram avaliados quanto a potencial valor terapêutico por medições in vitro da capacidade para inibir a ligação de TGFpi aos seus receptores e propriedades de ligação in vitro.

No Exemplo 4 (Tabela 5) o CS32 apresentou a mais forte inibição dos anticorpos testados da ligação de 125l-TGFpi a receptores em células A549. Realizou-se uma outra comparação entre CS32 e mais anticorpos (CS35, CS37 e CS38) que foram isolados como descrito na experiência do exemplo 1, secção 5c. Isto mostrou que o CS37 parecia ser o mais potente destes anticorpos neste ensaio com uma IC50 de aproximadamente 8 nM, em comparação com 40 nM para o CS32. O valor de IC50 para CS32 é superior ao do ensaio anterior (Tabela 5) porque a natureza do ensaio significa que o valor absoluto de IC50 pode variar com as condições de ensaio.

Os anticorpos 1A-E5 e 1AH-6 (Exemplo 1, secção 1f) e os anticorpos derivados destes foram muito menos potentes do que os anticorpos derivados de 1B2 na neutralização da actividade de TGFp neste ensaio com radiorreceptores.

Assim, o CS37 foi o anticorpo candidato mais potente como avaliado por inibição da ligação de 125l-TGFpi ao seu receptor.

Avaliação da ligação a ΤΘΡβ3 por anticorpos anti-TGFpi

Mostrou-se que os anticorpos 14A1 e 10A6 (Exemplo 1, secção 2(a)(iii)) se ligam preferencialmente a TGFpi, relativamente a TGFp2 e TGFp3, utilizando o mesmo ELISA de especificidade que foi descrito no Exemplo 1, secção 1(d)(iii), com a excepção de que as placas de microtítulo foram revestidas com 50 μΙ de TGFpi 0,2 pg/ml; TGFp2 0,2 pg/ml; TGFp3 0,2 pg/ml; albumina sérica bovina (BSA) 10pg/ml ou PBS (o poço não revestido). Mostrou-se que os clones eram específicos para TGFpi uma vez que o sinal gerado no poço revestido com TGFpi era pelo menos cinco vezes superior ao sinal com TGFp2 e TGFp3.

Os anticorpos derivados a partir da mesma linhagem 1B2 que estes anticorpos, como lgG4 27C1/10A6 (que contém o mesmo VL que 10A6 e o VH de 27C1 foi preparado por mutagénese de resíduo de CDR3) devem apresentar a mesma reactividade cruzada contra TGFP3. EXEMPLO 10

Construção de uma Unha de células de alta expressão de lgG4 6B1 utilizando o sistema de selecção da glutamina-sintetase e avaliação num ensaio de neutralização

Construção de p6H1 VH aamma4

Amplificou-se VH de 6B1 a partir de pG4D100 de 6H1 (Exemplo 2) por PCR utilizando oligonucleótidos P16 e P17. Juntou-se este ADN por PCR com um fragmento de ADN de 158 pb de M13VHPCR1 (R. Orlandi et ai., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 86. 3833-3837, 1989) contendo uma sequência de sinal, locais de união e um intrão, utilizando oligonucleótidos P10 e P17. Cortou-se o produto da PCR com Hindlll e Apal e clonou-se em pGamma4 cortado com Hindlll-Apal (Lonza Biologics pic). Identificou-se um plasmídeo com a inserção correcta e designou-se p6H1Vhgamma4 (veja-se Figura 20). O gene de VH e as regiões flanqueadoras foram sequenciadas nesta etapa.

Construção de p6B1ABam pLN10

Amplificou-se o gene de VH de 6B1 a partir do clone de scFv 6B1 em pCANTAB6 (Exemplo 1) e subclonou-se em pUC119. O gene de VL foi então mutado por mutagénese in vitro para remover um local BamHI interno, modificando a sequência de ADN mas não a sequência da proteína. A mutagénese in vitro foi realizada utilizando o oligonucleótido LamDeltaBamHI (Tabela 1) utilizando um estojo de Amersham International pic. Amplificou-se o gene de VL mutado utilizando os iniciadores νλ3όθοΙ<ΕυΑρ3 e HuJX2-3ForEuBam e subclonou-se como um fragmento ApaLl-BamHI no vector vleassetteCATI. 0 gene de VL foi então clonado como um fragmento Hindlll-BamHI no vector pLN10 (Figura 8) para gerar o vector p6B1 ABampLNI0.

Construção de ρβΒΊλ

Amplificou-se o gene de νλ de 6B1 por PCR a partir de p6B1 ABampLNI0 utilizando os oligonucleótidos P22 e P26. Amplificou-se o gene de CX por PCR a partir de pLN10-10A6 (Exemplo 2) utilizando os oligonucleótidos P25 e P19. Juntaram-se os 2 ADN por PCR de sobreposição utilizando os oligonucleótidos P22 e P19 e cortou-se o produto com BstBI e EcoRI e clonou-se em pMR15.1 cortado com BstBI-EcoRI (Lonza Biologics pic). Identificou-se um plasmídeo com a inserção correcta e designou-se ρ6Β1λ (Figura 21).

Construção do vector de expressão final p6B1qamma4qs

Digeriram-se p6H1VHgamma4 e ρ6Β1λ com BamHI e Notl, purificaram-se os fragmentos e ligaram-se uns aos outros. Identificou-se um plasmídeo com a configuração desejada a partir dos transformantes e designou-se p6B1gamma4gs (Figura 22).

Transfeccão de NSO com p6B1qamma4qs

Seleccionaram-se os transfectantes estáveis que segregavam lgG4 6B1 por introdução em células de mieloma NSO de p6B1 que inclui o gene da glutamina-sintetase (gs) que permite o crescimento em meio isento de glutamina (G-) (C.R. Bebbington et ai., Bio/Techno/ogy, JO, 169-175, 1992). 70 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Linearizaram-se 40 pg de p6B1gamma4gs por digestão com Pvul. Electroporou-se o ADN para 1,5x107 células NSO. Adicionaram-se então as células a DMEM G+/ FCS a 10% e distribuíram-se alíquotas de 50 μΙ em 6 placas de 96 poços e deixou-se recuperar durante 24 h. Tornou-se então o meio selectivo por adição de 150 μΙ de DMEM G-/ FCS a 10%. Três semanas mais tarde pesquisaram-se transfectantes 95-1- por ELISA quanto à capacidade para segregar o anticorpo lgG4X humano. Os melhores produtores foram expandidos e novamente analisados. A partir desta análise seleccionou-se 5D8 como a linha de células de produção candidata. Clonou-se 5D8 uma vez por diluição limitante para obter a linha de células 5D8-2A6.

Avaliação de lgG4 6B1 derivado da linha de células 5D8-2A6 no ensaio de neutralização em TF1

Purificou-se lgG4 6B1 a partir da linha de células de GS/NSO 5D8-2A6 crescida em meio isento de soro como descrito no Exemplo 2. Ensaiou-se o anticorpo IgG 6B1 no ensaio de neutralização em TF1 como descrito no Exemplo 3. Obteve-se um valor de IC50 de 1,8 nM neste ensaio. Ensaios subsequentes de preparações de lgG4 6B1 derivados da linha de células 5D8-2A6 indicaram valores de IC50 na gama de 0,65 a 2 nM. Estes são comparáveis aos valores obtidos para lgG4 6B1 produzido a partir de células CHO (Exemplo 2) e comparam-se favoravelmente com o obtido para lgG4 6B1 derivado de uma linha de células CHO (IC50 de 15 nM). Os valores obtidos de IC50 para lgG4 6B1 e lgG4 6H1 neste exemplo são mais fiáveis do que os obtidos no Exemplo 3 e estão apresentados na Tabela 4, devido a melhoramentos no ensaio e na expressão e purificação dos anticorpos. Pode-se esperar contudo que o valor de IC50 varie com as condições precisas do ensaio.

Assim, o lgG4 6B1 proporciona uma potente neutralização de TGFp2 e é adequado para utilização como terapêutico. EXEMPLO 11

Determinação do epítopo em ΤΘΡβ2 para o anticorpo 6B1 utilizando uma biblioteca peptídica de exibição sobre fagos 71 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ Ο anticorpo 6Β1 foi adicionalmente caracterizado por mapeamento de epítopos. Isto foi realizado utilizando uma biblioteca peptídica de exibição sobre fagos para seleccionar sequências peptídicas que se ligam especificamente a 6B1. Estas sequências peptídicas foram então comparadas com a sequência de aminoácidos do TGFp2. A correlação entre sequências peptídicas que se ligam a 6B1 e partes correspondentes da sequência de aminoácidos do TGFp2 indicam um epítopo de TGFp2 ao qual se liga ο 6B1. Um "epítopo" é a parte da superfície de um antigénio à qual se liga um anticorpo específico.

Neste exemplo, a biblioteca peptídica utilizada foi construída como descrito por Fisch et aí. (I. Fisch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 7761-7766) para dar uma biblioteca de exibição sobre fagos de 1x1013 clones independentes. Os fagos que exibem péptidos que se ligam ao anticorpo 6B1 foram seleccionados a partir desta biblioteca por prospecção. Isto foi realizado como descrito no Exemplo 1.

Revestiu-se um tubo de plástico (Nunc; maxisorp) com anticorpo lgG4 6B1 purificado a 10 pg/ml em 4 ml de PBS, por incubação durante a noite a 4°C. Após lavagem e bloqueio com MPBS (veja-se Exemplo 1) adicionou-se ao tubo uma alíquota da biblioteca peptídica contendo 5x10 fagos em 4 ml de MPBS a 3% e incubou-se à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Lavou-se o tubo 10 vezes com PBST (0,1%), depois 10 vezes com PBS. Eluíram-se as partículas de fagos ligadas do tubo por adição de 4 ml de trietilamina 100 mM e incubação do tubo, de modo estacionário, durante 10 minutos à temperatura ambiente. Adicionaram-se então os fagos eluídos a um tubo contendo 2 ml de Tris.HCI 1 M (pH 7,4) e 10 ml de caldo 2YT. Adicionaram-se então os fagos a 20 ml de células de E. coli TG1 em crescimento logarítmico e cresceu-se durante 1 hora com agitação a 100 rpm a 37°C. Plaquearam-se então as células infectadas em meio de ágar 2YT com tetraciclina 15 pg/ml em placas de 243 mm x 243 mm (Nunc). Incubaram-se as placas a 30°C durante 18 horas. Rasparam-se as colónias das placas para 10 ml de caldo 2YT contendo glicerol a 1 5% (v/v) para armazenamento a -70°C.

Utilizaram-se 250 μΙ de células do primeiro ciclo de selecção para inocular 500 ml de caldo 2YT (contendo tetraciclina 1 5 μg/ml) num frasco cónico de 2 litros e cresceu-se durante a noite, a 30°C, com agitação a 280 rpm. Tomou-se 72 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ então uma alíquota de 2 ml desta cultura e centrifugou-se para remover as células. Utilizou-se 1 ml deste sobrenadante dos fagos para um segundo ciclo de selecção como descrito acima. O padrão de crescimento dos fagos e a prospecção foram repetidos um terceiro e um quarto ciclos de selecção.

Utilizaram-se colónias individuais do quarto ciclo de selecção para inocular 100μΙ de caldo 2YT (contendo tetraciclina 15 pg/ml) em poços individuais de placas de cultura de tecidos de 96 poços e cresceu-se durante a noite com agitação suave a 100 rpm a 30°C. Adicionou-se glicerol até uma concentração final de 15% (v/v) e armazenaram-se estas placas principais congeladas a -70°C.

Pesquisaram-se estes clones quanto a clones que se ligavam especificamente ao anticorpo 6B1 em ELISA. Utilizaram-se células das placas principais para inocular placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo 100 μΙ de caldo 2YT (contendo tetraciclina 15 μg/ml) por poço e cresceu-se durante a noite com agitação suave a 100 rpm a 30°C. Centrifugaram-se então as placas a 2000 rpm. Recolheram-se os 100 μΙ de sobrenadantes dos fagos de cada poço e misturou-se cada um com 100 μΙ de leite em pó magro a 4% em 2x PBS. Ensaiaram-se então 100μΙ de cada um por ELISA em fagos. Revestiram-se placas de microtítulo flexíveis com anticorpo lgG4 6B1 purificado a 10pg/ml em PBS, por incubação durante a noite a 4°C. Prepararam-se também placas de controlo revestidas com um anticorpo lgG4 irrelevante a lOpg/ml. Realizaram-se os ELISA como descrito no Exemplo 1, e visualizaram-se com o substrato cromogénico pNPP (Sigma).

Aproximadamente 20% de todos os clones analisados ligaram-se à placa revestida com 6B1. Nenhum dos clones analisados se ligou às placas de ELISA revestidas com o anticorpo irrelevante. A ligação pareceu portanto ser específica para o local de ligação do anticorpo 6B1.

Analisaram-se os clones que se ligaram ao 6B1 por sequenciação de ADN como descrito por Fisch et al. Sequenciaram-se um total de 31 clones diferentes. Estes foram analisados quanto a possíveis correspondências com a sequência de TGFp2 utilizando o software de Mac vector. Destes clones, 12 apresentaram pobre correspondência com a sequência de TGFp2 e 10 não 73 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ tinham qualquer semelhança. Contudo, houve 4 clones diferentes (alguns dos quais tinham sido seleccionados mais do que uma vez) que apresentaram uma correspondência razoável com uma região da sequência do TGFP2 entre as posições dos aminoácidos 56 a 69. A Tabela 8 apresenta a sequência de aminoácidos do exão de cada um destes clones que parece ser responsável pela ligação a 6B1.

Nenhum destes clones correspondia exactamente à sequência do TGFP2 nem houve uma única sequência de consenso clara entre os clones peptídicos. Apesar disso, um exame cuidadoso das sequências revela uma correspondência com os resíduo 60 a 64 do TGFp2 (Tabela 8). O Alinhamento de quatro clones com L na posição 64 revela 2 clones com R na posição 60, 1 clone com V na posição 61, 2 com L na posição 62 e 3 com S na posição 63. Isto proporciona a sequência RVLSL correspondente aos resíduos 60 a 64 que formam parte da hélice alfa que forma a região calcanhar do TGFP2. Não seria de esperar que um anticorpo que reconhece esta estrutura entrasse em contacto com cada resíduo de aminoácido na hélice e portanto um péptido que imite esta sequência poderia ter considerável variação de sequência nas posições que correspondem a partes da hélice que não entram em contacto. Crê-se que a hélice alfa reconhecida forma parte da região de ligação ao receptor do TGFP2 (D.L. Griffith et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 878-883). EXEMPLO 12

Determinação por imuno-histoquímica da ligação de lgG4 6B1 a TGFfi2 num tecido de mamífero e ausência de reactividade cruzada

Para detectar TGFP2 em secções de tecido fixado em formalina que expressam a citóquina, a secção de tecido é tratada de um modo geral com uma protease, a pronase E. Este passo de digestão desmascara o antigénio, possivelmente activando o TGFp2 latente no TGFp2 activo. O lgG4 6B1 detecta apenas a forma activa do TGFP2 (Exemplo 6).

Utilizando lgG4 6B1 e métodos imuno-histoquímicos, determinou-se a distribuição do TGFp2 em rim de rato normal embebido em cera de parafina fixado em formalina e fez-se experimentalmente uma lesão no tecido de cérebro 74 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ de rato, seguindo-se digestão com pronase E. A reactividade de lgG4 6B1 em secções congeladas em criostato de tecido humano normal depois de fixado em acetona foi também avaliada para determinar se havia alguma ligação a outros antigénios nestes tecidos. Método Tecido de rato

Removeu-se a cera dos tecidos de rato embebidos em parafina e re-hidrataram-se através de uma série de álcoois. Trataram-se então as secções com pronase E a 0,1% durante exactamente 8 minutos e depois lavaram-se com água. Ο ΤΰΡβ2 foi detectado nas secções utilizando lgG4 6B1 a 500 ng/ml seguindo o protocolo proporcionado com um estojo Vectastain ABC (complexo de avidina-biotina) de Vector Laboratories. Nas secções de rim, localizou-se o anticorpo ligado com fosfatase alcalina e utilizou-se peroxidase nos tecidos de cérebro de rato.

Tecido humano

Utilizaram-se as seguintes amostras de tecido humano: adrenal, aorta, sangue, intestino grosso, intestino delgado, cérebro, rim, nódulo linfático, fígado, pulmão, baço, pâncreas, músculo esquelético, músculo cardíaco, tiróide, nervo, pele, olho.

Secções em criostato e esfregaços foram fixados durante 15 minutos em acetona antes da aplicação de anticorpo lgG4 6B1 marcado com FITC utilizando o estojo Sigma Immunoprobe. Incubou-se o anticorpo marcado durante 18 h a 4°C, depois detectou-se utilizando um método indirecto com fosfatase alcalina (detecção com anticorpo anti-FITC seguido de anticorpo de conjugado de enzima anti-espécie). Em casos em que a actividade da fosfatase alcalina endógena não podia ser suprimida utilizou-se um método de detecção com peroxidase. Não se utilizou digestão com pronase neste caso, e portanto este procedimento apenas detectaria antigénios com os quais o anticorpo reagia de modo cruzado. 75 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Resultados Tecido de rato

Os rins de rato apresentaram coloração positiva em túbulos presentes tanto no lado apical como no basolateral, demonstrando a presença de TGFP2 nos tecidos. O cérebro de rato lesionado, 5 dias após a lesão, apresentou coloração positiva de neurónios, astrócitos e macrófagos que estava ausente em cérebro normal. Isto indica que o TGFp2 é expresso no cérebro de rato após a lesão.

Tecido humano Não se observou qualquer coloração específica em nenhum tecido utilizando secções fixadas em criostato dos tecidos acima referidos. Portanto, o lgG4 6B1 não reage de modo cruzado com antigénios nestes tecidos e quando utilizado terapeuticamente apenas se ligará a TGFP2 activo em secções de tecido detectadas por métodos imuno-histoquímicos. EXEMPLO 13

Análise cinética da ligação de Fv de uma só cadeia 6B1 e igG4 6B1 a isoformas de ΤβΡβ

Pode-se utilizar ressonância de plasmon de superfície (SPR) para examinar as interacções em tempo real entre um ligando imobilizado e um analito, e calcular constantes cinéticas a partir destes dados. Isto foi realizado utilizando o sistema BIACore 2000 (Pharmacia Biosensor) com o antigénio imobilizado sobre uma superfície e o anticorpo como analito. O sistema utiliza as propriedades ópticas de ressonância de plasmon de superfície para detectar alterações na concentração de proteína no interior de uma matriz de dextrano. O antigénio é ligado covalentemente à matriz de dextrano numa quantidade estabelecida e à medida que uma solução contendo o anticorpo passa sobre a superfície à qual este está ligado, o anticorpo liga-se ao 76 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ antigénio e há uma alteração detectável na concentração local de proteína, e portanto um aumento no sinal de SPR. Quando a superfície é lavada com tampão, o anticorpo dissocia-se do antigénio e há então uma redução no sinal de SPR, de modo que a taxa de associação e de dissociação, e a quantidade de anticorpo ligado ao antigénio num dado momento, podem ser medidas. As alterações no sinal de SPR são registadas como unidades de ressonância (UR) e são apresentadas em relação ao tempo ao longo do eixo dos y de um diagrama sensor. A densidade de ligando imobilizado sobre a superfície de um chip BIACore é importante quando se calculam dados cinéticos a partir dos diagramas sensores gerados. Tem que ser bastante baixa de modo a que apenas uma pequena quantidade de anticorpo analito seja necessária para a saturação da superfície do chip. Para simplificar, a densidade da superfície de um chip é indicada em UR, e uma quantidade ideal para um ligando tal como TGFP2 ou TGFp3 (25 kDa) e de 400-600 UR relativamente à linha de base estabelecida durante a imobilização do ligando na superfície. A quantidade real de TGFp que tem que ser adicionada para se obter a densidade correcta tem que ser determinada por investigação, mas é reprodutível uma vez encontrada a concentração correcta. A imobilização do ligando na matriz de dextrano da superfície do chip é facilitada por via dos grupos amino, nas cadeias laterais da lisina na proteína, e dos grupos carboxilo na matriz de dextrano. Os grupos carboxilo no dextrano são activados com N-hidroxi-succinimida (NHS) e N-etil-N'-(3-dietilaminopropil)carbodiimida (EDC) e o antigénio em solução ácida é então ligado à superfície, e finalmente quaisquer grupos carboxilo que não reagiram são bloqueados com etanolamina. A imobilização de ligando é automatizada pela máquina BIACore 2000 e todos os passos são realizados no auto-amostrador ou na célula de fluxo, na superfície de dextrano do chip. O tampão utilizado ao longo de todo o procedimento de imobilização e análise das amostras é solução salina tamponada com Hepes (HBS) com um tensioactivo (Pharmacia Biosensor). Os chips (Pharmacia, CM5) têm dextrano a revestir uma fina camada de ouro. Misturam-se NHS a 100 mM e EDC a 400 mM com o auto-amostrador e depois 77 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ injecta-se um volume fixo sobre a superfície da célula de fluxo. Isto é seguido por uma injecção de antigénio num tampão adequado. No caso do TGFp, foi obtida uma superfície com a densidade correcta utilizando uma solução a 25-30 pg/ml de TGFP2 (AMS) ou TGFp3 (R&D Systems) em acetato 10 mM. Após injecção do ligando, bloqueia-se o chip utilizando etanolamina 1 M. Avaliou-se quantidade total de TGFp ligado a partir do aumento total de unidades de ressonância ao longo deste período.

Para determinar os parâmetros cinéticos, fez-se uma série de diluições das amostras do anticorpo em HBS, de cerca de 500 pg/ml até menos de 1 μg/ml, usualmente por diluições de duplicação. Após a injecção do anticorpo sobre a superfície do antigénio, a superfície é lavada com HBS, depois é regenerada por remoção do anticorpo ligado com um pulso de HCI 100 mM. Com as maiores concentrações de anticorpo o antigénio sobre a superfície do chip está saturado e a velocidade na dissociação é determinada na lavagem com tampão na fase de dissociação. Para a determinação da velocidade na ligação("on-rate"), utilizam-se concentrações de anticorpo menores, obtendo-se uma fase de ligação linear no diagrama sensor, que permite a determinação de ^on O conjunto de diluições foi repetido numa preparação separada do mesmo anticorpo.

Para manipular os diagramas sensores para obter constantes cinéticas kon e koff, utiliza-se o software BIAevaluation. Para cada curva de ligação utilizada nos cálculos tem que se ter em atenção que as condições sejam apropriadas para a determinação de constantes cinéticas.

Purificou-se lgG4 6B1 a partir da linha de células GS/NSO do Exemplo 10 como no Exemplo 2. Expressou-se Fv de uma só cadeia 6B1 intracelularmente em E. co/i, redobrou-se in vitro (utilizando a metodologia de W094/18227) e purificou-se para obter um produto homogéneo. Determinaram-se os valores de kon e koff para lgG4 6B1 relativamente à ligação tanto a TGFP2 como a TGFp3, e para Fv de uma só cadeia 6B1 relativamente à ligação a TGFp2. Calculou-se a constante de dissociação dividindo koff por kon. Os valores para estes parâmetros cinéticos estão apresentados na Tabela 7.

Assim, scFv 6B1 e lgG4 6B1 apresentam constantes de dissociação muito baixas de 2,3 nM e 0,89 nM, respectivamente, para ΤΰΡβ2, e há 9% de reactividade cruzada com TGFp3 (avaliada pela razão das constantes de dissociação de lgG4 6B1 para ΤαΡβ3 e para ΤΰΡβ2). Para comparação, em estudos anteriores, onde os erros padrão eram superiores e os valores menos precisos, os valores de Kd para ΤΰΡβ2 foram determinados como sendo 0,7 nM para scFv 6A5 (Tabela 2) e 2 nM para lgG4 6H1 (exemplo 2). Os valores de Kd para todos os anticorpos dirigidos contra ΤΰΡβ2 que partilhavam o mesmo domínio VH de 6H1 são baixos e inferiores a 10 nM. EXEMPLO 14

Ligação de um péptido correspondente aos resíduos 56 a 69 de ΤΘΡβ2 a fgG4 6B1

Sintetizou-se um péptido correspondente aos aminoácidos de ΤΰΡβ2 em torno dos resíduo RVLSL, o epítopo identificado a partir da selecção de fagos da biblioteca de exibição de péptidos (Exemplo 11). O péptido 17-mero CGG-TQHSRVLSLYNTIN (ΤΟΡβ256.69; sintetizado por Cambridge Research Biochemicals) contém os resíduos 56 a 69 do ΤΰΡβ2 com RVLSL (resíduos 60 a 64) no seu centro. O prolongamento CGG no terminal N é um espaçador com um resíduo cisteína para facilitar o acoplamento do péptido a proteínas transportadoras. O péptido correspondente aos resíduos 56 a 69 de τσρβΐ (ΤαΡβ156.69; CGG-TQYSKVLSLYNQHN) foi também sintetizado. Como controlo, utilizou-se o péptido irrelevante GPEASRPPKLHPG.

Utilizaram-se duas abordagens para confirmar que o epítopo em ΤΰΡβ2 para lgG4 6B1 compreendia os aminoácidos RVLSL. (i) Avaliação da capacidade de lgG4 6B1 se ligar a ΤΟΡβ256.69 e a Τ0Ρβ156.69 acoplado a BSA por ELISA. (ii) Avaliação da capacidade de péptidos se ligarem a um chip sensor BIAcore revestido com lgG4 6B1.

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(i) Avaliação da capacidade de igG4 6B1 se ligar a TGFfi256.69 e a TGFfil56.69 acoplado a BSA por ELISA. A ligação de lgG4 6B1 a péptidos sintéticos TGFpi56.69 e TGFp256.69 conjugados com BSA foi avaliada num ensaio ELISA. Esta foi comparada com a ligação de um anticorpo de controlo lgG4 2G6 que é um anticorpo manipulado com uma cadeia pesada contendo um domínio VH de um anticorpo dirigido contra o hapteno NIP combinada com uma cadeia leve contendo um VL de um anticorpo dirigido contra lisozima. Método

Conjugaram-se 2 mg de cada um dos péptidos TGFp156.69 e TGFp256.69 a BSA utilizando um estojo Imject Activated Immunogen Conjugation Kit (Pierce).

Revestiu-se uma placa de microtítulo immunosorp (Nunc) durante a noite com 10 pg/ml dos péptidos conjugados em PBS (linhas A-D, TGFpi 56.69; linhas E-F, TGFp256.69) a ΙΟΟμΙ/poço. Lavaram-se os poços 3x com PBS-Tween e fizeram-se as seguintes adições: Coluna 1 - 100 μΙ de PBS em cada poço como controlo de reagente; Coluna 2, linhas A, B, E e F, 200 μΙ de lgG4 6B1 10 μg/ml; Coluna 2, linhas C, D, G e H, 200 μΙ de lgG4 2G6 10 μg/mL

Colocaram-se em todos os restantes poços 100 μΙ de PBS. Para produzir diluições de duplicação dos anticorpos, removeram-se 100 μΙ de cada poço na coluna 2 e colocaram-se no poço seguinte na coluna 3. Misturou-se a amostra e removeram-se 100μΙ e adicionaram-se ao poço seguinte na coluna 4. Repetiu-se este procedimento ao longo da placa sendo os últimos 100μΙ rejeitados. Incubou-se então a placa a 4°C durante 18 h.

Após 3 lavagens com PBS-Tween encheram-se novamente os poços com 100μΙ de um conjugado de fosfatase alcalina de fragmento F(ab')2 de cabra específico para a cadeia gama de IgG humana diluída de 1:1000 em PBS e incubou-se durante mais 1 h. Após mais 3 lavagens com PBS-Tween revelou-se o anticorpo ligado com substrato pNPP durante 20 min.

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Resultados

Mostrou-se que ο lgG4 6Β1 se liga a ambos os péptidos conjugados (Figura 15) mas o sinal de ELISA obtido com TGFp156_69 foi muito inferior ao obtido com TGFp256.69 com uma concentração equivalente de lgG4 6B1. Foi necessária uma concentração aproximadamente 8 a 10 vezes superior de lgG4 6B1 para obter um sinal equivalente com TGFp156.69 relativamente a TGFp256_ 69. Não se obteve qualquer sinal com o anticorpo de controlo lgG4 2G6 com nenhum dos conjugados péptido-BSA. Portanto, o lgG4 6B1 liga-se fortemente ao TGFp256.69 e liga-se mais fracamente ao TGFpi 56.69 acoplados a BSA. (ii) Avaliação da capacidade de péptidos se ligarem a um chip sensor BIACore revestido com lgG4 6B1.

Confirmou-se a ligação de lgG4 6B1 a TGFp256_69 através da ligação do péptido a um chip sensor BIACore revestido com lgG4 6B1. A determinação de propriedades de ligação por ressonância de plasmon de superfície utilizando o BIACore 2000 de Pharmacia foi descrita no exemplo 13. O método para criar um chip sensor BIACore revestido com lgG4 6B1 foi como para o acoplamento com TGFp, descrito no Exemplo 13, com a excepção de que o lgG4 6B1 foi acoplado a 5 pg/ml em tampão acetato 10 mM, pH 3,5. Gerou-se uma superfície de 5000 UR utilizando 25 μΙ de lgG4 6B1.

Aplicaram-se 20 μΙ dos péptidos à superfície de 6B1 a 1 mg/ml com regeneração da superfície utilizando um pulso de ácido para remover o péptido ligado entre as amostras. A quantidade de ligação foi avaliada estabelecendo uma resposta de linha de base de UR absolutas antes da injecção e depois subtraindo-a ao valor a 20 segundos após a injecção estar completa para obter uma resposta relativa em UR. Considerou-se que esta era a quantidade de ligação à superfície de 6B1. A ligação obtida está apresentada na Tabela 9. Houve um nível muito baixo de ligação do péptido irrelevante. O TGFp1 56.69 pareceu ligar-se especificamente a baixo nível a lgG4 6B1. Contudo, o péptido TGFp256_69 ligou-se a lgG4 6B1 especificamente e muito mais fortemente.

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Ο baixo nível de ligação de lgG4 6B1 ao péptido TGFpl nos ensaios ELISA e BIACore não é inesperado uma vez que 10 dos 14 aminoácidos do TGFp são idênticos aos do péptido TGFp2. Apesar disso, o lgG4 6B1 liga-se ao péptido TGFp256.69 muito mais fortemente do que se liga ao péptido TGFpi 56.69. O nível de discriminação entre estes péptidos TGFpl e TGFp2 é contudo muito inferior ao observado nos ensaios com radiorreceptores (Tabela 6) e de neutralização (Tabela 6 e Figuras 16 e 17) com isoformas nativas. Nestes ensaios, o lgG4 6B1 neutraliza fortemente o TGFP2 mas tem pouco efeito sobre a actividade biológica do TGFpi. Esta maior discriminação reflecte presumivelmente o contexto dos resíduos dos péptidos nas isoformas nativas.

Conclusões

Estes resultados suportam a atribuição do epítopo de lgG4 6B1 sobre o TGFP2 aos aminoácidos na região dos resíduos 60 a 64. O péptido utilizado neste exemplo, resíduos 56-69, corresponde aos aminoácidos da hélice alfa H3 (M.P. Schunegger & M.G. Grutter, Nature, 358. 430-434, 1992). O TGFP2 forma um dímero de cauda-para-cabeça com a hélice alfa H3 (também referida como o calcanhar) de uma subunidade que forma uma interface com regiões finger (incluindo os resíduos 24 a 37 e os resíduos na região dos aminoácidos 91 a 95; também referidas como finger 1 e 2) da outra subunidade (S. Daopin et a/., Protein: Structure, Function and Genetics, 1_7, 176-192, 1993). Foi proposto que as características da estrutura primária que interactuam com o receptor de TGFP2 consistem nos aminoácidos da extremidade C-terminal da hélice alfa H3 de uma cadeia juntamente com resíduos finger 1 e 2 da outra cadeia (D.L. Griffith et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93. 878-883, 1996). A identificação de um epítopo para lgG4 6B1 no interior as hélice alfa H3 de TGFP2 é consistente com o facto de o lgG4 6B1 evitar a ligação ao receptor e neutralizar a actividade biológica do TGFp2.

Se o epítopo para lgG4 6B1 for tridimensional podem haver outros epítopos não contíguos aos quais o anticorpo se pode ligar. Há evidências anteriores de que anticorpos dirigidos contra esta região do TGFp2 podem ser específicos para o TGFp2 e neutralizar a sua actividade. 82 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Flanders et al. (Development, 1 13. 183-191, 1991) mostrou que se podiam criar anti-soros policlonais em coelhos contra os resíduos 50 a 75 do TGFP2 maduro e que estes anticorpos reconheciam o TGFp2 mas não o TGFpi em transferências de Western. Num artigo anterior, K.C. Flanders et al. (Biochemistry, 27. 739-746, 1988) mostraram que anti-soros policlonais criados em coelhos contra os aminoácidos 50 a 75 de TGFpi podiam neutralizar a actividade biológica do TGFpl. O anticorpo que isolámos e caracterizámos, o lgG4 6B1, é um anticorpo humano dirigido contra aminoácidos nesta região que neutraliza a actividade biológica do TGFp2 humano. É surpreendente que um tal anticorpo de neutralização contra TGFp2 possa ser isolado em humanos (onde a imunização com um péptido não pode ser utilizada por razões éticas) directamente a partir de um repertório de anticorpos exibidos sobre fagos. 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

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ΕΡ Ο 853 661/PT

Tabela 2

Propriedades de fragmentos Fv de uma só cadeia quanto a ligação a TGFbetal ou TGFbeta2 determinadas utilizando BIACore Anticorpo k0ff (s ’) Kd (nM) TGFbetal 31G9 9,0x10'4 12 CS32 1,2x10'3 CS39 1,7x10’3 TGFbeta2 6A5 1,4x104 0,7 6B1 6,0x104 6H1 1,1 x 10 3 14F12 2,1x10'3

Tabela 3 Níveis diários de dosagem para animais individuais em cada grupo Grupo Clone Formato do Antigénio Dose anticorpo 1 Controlo de - - - sol. salina 2 31G9 ScFv TGFpl 20 ng 3 6A5 ScFv TGFP2 20 ng 4 27C1/10A6 lgG4 TGFpl 692 ng 5 6H1 lgG4 TGFp2 1,76 pg 6 31G9 ScFv TGFpl 20 ng + 6A5 TGFp2 u 7 27C1/10A6 igG4 TGFpl 692 ng + 6H1 TGFp2 1,76 μg

Tabela 4

Valores de IC50 para anticorpos no ensaio com TF1 Anticorpo scFv (nM) lgG4 (nM) 6H1 1,5 100 6B1 15 11 6A5 8 150 13F12 90 Nd nd = não determinado 87 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Tabela 5 Valores de IC50 para anticorpos medidos utilizando um ensaio com radiorreceptores Anticorpo anti-TGF-βΙ IC50, nM scFv 7A3 >100 scFv 31G9 30 scFv CS32 4,5 scFv CS39 ~ 60 IgG 27C1/10A6 9 scFv VT37 -100 Anticorpo anti-TGF-p2 IC50, nM scFv 6A5 1,5 IgG 6A5 -6 scFv 6B1 0,3 IgG 6B1 0,6 scFv 6H1 0,22 IgG 6H1 -10 IgG 11E6 1,6 scFv 14F12 3 scFv VT37 2

Tabela 6 Potência de neutralização de isoformas de TGFbeta IC50 no ensaio de proliferação de células TF1 (nM de IgG) lgG4 6B1 Genzyme TGFbeta 1 >100 1,5 TGFbeta2 2 10 TGFbeta3 11 0,1 IC50 no ensaio com radiorreceptores em células A 549 (nM de IgG) lgG4 6B1 Genzyme TGFbeta 1 >400 0,55 TGFbeta2 0,05 0,5 TGFbeta3 4 0,03 88 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Tabela 7

Parâmetros cinéticos de lgG4 6B1 e Fv de uma só cadeia 6B1 Formato do anticorpo antigénio k0ff s kon mV Constante de dissociação Kd nM scFv 6B1 TGFP2 6,68x10'4 2,87x10b 2,32 lgG4 6B1 TGFP2 3,36x10'4 3,84x10b 0,89 lgG4 6B1 TGFp3 4,5x10'4 4,5x104 10,0

Tabela 8 Sequências peptídicas a partir da liaacão de faaos a laG4 6B1

Esta tabela apresenta a sequência de aminoácidos de 4 clones peptídicos exibidos sobre fagos que apresentam uma correspondência com a sequência de TGFbeta2. Estes clones foram alinhados por baixo da parte relevante da sequência de TGFbeta2, que é apresentada das posições dos aminoácidos 56 a 77. TFGbeta2 Clone 1 Clone 2 Clone 3 Clone 3

TQH S RVL S LYNTINPEASAS PC RQLSLQQRMH DPMDMVLKLC WSEFMRQSSL

VESTSLQFRG

Tabela 9

Ligação de péptidos de TGFbeta a lgG4 6B1 imobilizado num chip BIACore Péptido Concentração de péptido, μΜ Quantidade de ligação à superfície de lgG4 6B1, UR TGFp256.69 537 1012,8 TGFpl 5g.6g 524 190,7 Péptido irrelevante 745 60,9

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Cambridge Antibody Technology Limited (B) RUA: The Science Park, Melbourn (C) CIDADE: Royston (D) ESTADO: Cambridgeshire (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): SG8 6JJ (A) NOME: Thompson, Julia Elizabeth (B) RUA: 19 Elm Way, Melbourn (C) CIDADE: Royston (D) ESTADO: Herts (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): SG8 6UH (A) NOME: Vaughan, Tristan John (B) RUA: 9, Villa Road, Impington (C) CIDADE: Cambridge (E) PAIS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB4 4NZ (A) NOME: Williams, Andrew James (B) RUA: 27 Green Street, Forest Gate (C) CIDADE: London (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): E7 8DA (A) NOME: Green, Jonathan Alexander (B) RUA: 21 Balsham Road (C) CIDADE: Linton (D) ESTADO: Cambridgeshire (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB1 6LD 90 84 928

ΕΡ Ο 853 661/PT (Α) ΝΟΜΕ: Jackson, Ronald Henry (B) RUA: 31 Kingston Street (C) CIDADE: Cambridge (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB1 2NU (A) NOME: Bacon, Louise (B) RUA: Foxhill Wing, Hinton Way (C) CIDADE: Great Shelford (D) ESTADO: Cambs (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB2 5AN (A) NOME: Johnson, Kevin Stuart (B) RUA: 79 West Drive (C) CIDADE: Caldecote Highfields (D) ESTADO: Cambs (E) PAIS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB3 7NY (A) NOME: Wilton, Alison Jane (B) RUA: 46 Huntington Road (C) CIDADE: Cambridge (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB3 OHH (A) NOME: Tempest, Philip Ronald (B) RUA: 43 High Street, West Wratting (C) CIDADE: Cambridge (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB1 5CU (A) NOME: Pope, Anthony Richard (B) RUA: 178 Gwydir Street (C) CIDADE: Cambridge (E) PAÍS: Reino Unido

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): CB1 3LW 91 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Membros de ligação específica para o factor beta de crescimento de transformação humano; materiais e métodos (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 110 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, versão #1.25 (EPO) (v) DADOS DO ACTUAL PEDIDO: NÚMERO DO PEDIDO: PCT/GB96/02450 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: GB 9520486.3 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 06-0UT-1995 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: GB 9601081.4 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 19-JAN-1996 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Arg Vai Leu Ser Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Cys Gly Gly Thr Gin Tyr Ser Lys Vai Leu Ser Leu Tyr Asn Gin His 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Thr Gin Tyr Ser Lys Vai Leu Ser Leu Tyr Asn Gin His Asn 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 345 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..345

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:5: GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG i GTC CAG CCT GGG AGG 48 Glu val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin ?ro Gly Arg 1 5 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala ?ro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 GCA GTT ATA TGG TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG GAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Ala GlU Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 35 90 95 GGA AGA ACG CTG GAG TCT AGT TTG TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC 336 Gly Arg Thr Leu Glu Ser Ser Leu Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 GTC TCC TCA 345 Vai Ser Ser 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 115 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 94 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Vai Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai S0 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Gly Arg Thr Leu Glu Ser Ser Leu Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 HO

Vai Ser Ser 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 369 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..369 95 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: CAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15 XCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cya Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144

Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192

Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 SS 60 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240.

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG AAA ACT GGG GAA TAT AGT GGC TAC GAT TCT AGT GGT GTG GAC GTC 336

Ala Lys Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 100 105 110 TGG GGC AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 369

Trp Gly Lys Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 96 /r**' (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Glv Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Hie Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asa Ser Ser Gly Vai Asp Vai 100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 369 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..369 97 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:9: CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48 Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 e 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala. Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 GGC ATG CAC TGG GTC CSC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met HÍ3 Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT ATT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192 Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai SO 55 60 AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240 Lye Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG CGA ACT GGT GAA TAT AGT GGC TAC GAT ACG AGT GGT GTG GAG CTC 336 Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Vai Glu Leu 100 105 110 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 369 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ !D NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 98 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:10:

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly ?he Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Hia Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Vai Glu Leu 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 369 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..369

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:11 ' CAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48 Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA CTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr* 20 25 30 GAC ATG CAC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GCC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Asp Met His Trp Vai Arg Gin Pro Pro Ala Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AGT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192 Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 AAG GGC CG A TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC A CG GCT GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 GCG CGA ACT GGT GAA TAT AGT GGC TAC GAC ACG AGT GGT GTG GAG CTC 336 Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Vai· Glu Leu 100 105 110 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 369 Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (,) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 123 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

100 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (xi) DESCRICÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 S

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Aap Met His Trp Vai Arg Gin Pro 35 40

Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser 50 55

Lya Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85

Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 10 15

Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Pro Ala Lys Gly Leu Glu Trp Vai 4S

Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 60

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Vai Glu Leu 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 324 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..324 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13: 101 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCT TCC ACC CTG TCT GCA TCT GTA GGA

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15 GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCC AGT' CAG GGT ATT AGT AGC TGG Aap Arg Vai Thr Ile Thr Cya Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30

TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AGA GCC CCT AAG GTC TTG ATC

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lya Vai Leu Ile 35 40 45

TAT AAG GCA TCT ACT TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC

Tyr Lya Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 50

AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCG TGG

Glu Aap Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95

ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGT

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:14: 102 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Arg Ala Pro Ly3 Vai Leu lie 35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Pha Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 342 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..342 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:15:

GAC ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCA GAC TCC CTG GCT GTG TCT CTG GGC

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 15 10 15

GAG AGG GCC ACC ATC AAC TGC AAG TCC AGC CAG AGT CTT TTA TAC AGC

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 96

TAC AAC AAG ATG AAC TAC TTA GCT TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG 144 Tyr Asn Lys Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45 CCT CCT AAG CTG CTC ATT AAC TGG GCA TCT ACC CGG GAA TCC GGG GTC 192 Pro pro Lys Leu Leu Ile Asn Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai so S5 60 CCT GAC CGA TTC AGT GGC AGC GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC 240 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 ao ATC AGC AGC CTG CAG GCT GAA GAT GTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG CAA 288 Ile Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95 TAT TAT GCA ACT CCT CTG ACG TTC GGC CAC GGG ACC AAG GTG GAA ATC 336 Tyr Tyr Ala Thr Pro Leu Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Vai Glu 100 105 110 AAA CGT Lys Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 114 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Fro Asp ser Leu Ala Vai ser Leu Gly 1 S 10 15

Leu Tyr Ser 30 Pro Gly Gin

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu 20 25

Tyr Asn Lys Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys 35 40 45 104 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Asn Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 SS 60

Pro Aap Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

Tyr Tyr Ala Thr Pro Leu Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Vai Glu Ile 100 105 110

Lys Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 330 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..330 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:17: CAC GTT ATA CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48 His Vai Ile Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 ACA GTC AGG ATC ACG TGC CAA GGA GAC AGC CTC AAA AGC TAC TAT GCA 96 Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 AGT TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 144 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45 GGT GAA AAC AGC CGG CCC TCC GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Gly Glu Asn Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ

Jr^ AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 240 ser ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 GAT GAA GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT ACC CAT 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 CTA GAA GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 330 Leu Glu Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

His Vai Ile Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Val Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Glu Asn Ser Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cya Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Thr His 85 90 95 Leu Glu Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100

10S 110

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19:

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:20:

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Thr Ser Gly Vai Glu Leu 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

Ala Arg Thr Arg Glu Tyr Ser Gly His Asp Ser Ser Gly Vai Asp Asp 1.5 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22: 107 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Ala Arg Thr Gly Pro Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Glu Asp Vai 15 10 15

Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23:

Ala Arg Thr Glu Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 1 5 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24:

Ala Gin Thr Arg Glu Tyr Thr Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25: 10 15

Ala Arg Thr Glu Glu Tyr Ser Gly Phe Asp Ser Thr Gly Glu Asp Vai 1 5

Trp

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 108

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26:

Ala Arg Thr Glu Glu Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27:

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr His Ser Ser Gly Vai Asp Vai 15 10 15

Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28:

Ala Arg Thr Glu Glu Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos

84 928 ΕΡ 0 853 661/PT 109

(Β) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29:

Aia Arg Ala Gly Pro Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Glu Asp Vai 1 Arg 5 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:30:

Ala Arg Thr Gly Pro Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Glu Asp Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:31:

Ala Arg Thr Glu Glu Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32: 110 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Glu Leu Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:33:

Ala Arg Thr Glu Glu Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Thr Gly Glu Glu Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34:

Ala Arg Thr Glu Glu Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Vai Asp Vai 15 10 15

Trp (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35:

Ala Arg Thr Gly Glu Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Glu Asp Vai 15 10 15

Trp 111 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 350 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36: GAGATTCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC GTGGTCCAGC CTGGGAGATC CCTGAGACTC 60 TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTCAGT AGCTATGCTA TGCACTGGGT CCGCCAGGCT 120 CCAGCCAAGG GGCTGGAGTG GGTGGCAGTT ATATCATATG ATGGAAGCAA TAAATACTAC 180 GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT 240 CTGCAAATGA ACAGCCTGAG AGCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC AAGAGCGGGG 300 TTGGAAACGA CGTGGGGCCA AGGAACCCTG GTCACCGTCT CCTCAAGTGG 350 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 117 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:37: 112 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Glu Ιΐβ Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10

Ser Leu Arg Leu Ser Cye Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Ala Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Vai Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Aan Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ala Gly Leu Glu Thr Thr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser Ser Gly 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 324 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..324 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:38: 113 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ GAT GTT GTG ATG ACT CAG tct CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA 48 Asp val Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 e 10 IS GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCC AGT CAG GGC ATT AGC AAT TAT 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Tyr 20 25 30 nwfiA GCC TGG TAT CAG CAA AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lya Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 TAT AAG GCA TCT ACT TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG AGT GGC 192 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGT GGA TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGT CTG CAA CCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCT CGA 288 Giu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA CGT 324 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39: 114 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 s 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Lya Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Arg 35 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Asp Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 327 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..327 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:40: TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 15 10 15

ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA

Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 96 115 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 144 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45 GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC GCT GGC TCC 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser 50 55 60 AAC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAG 240 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AGC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT 288 ASp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn HiS 85 90 95 GTG GTT TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 327 Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:41:

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 ao 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ 116

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 330 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1 ..330 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:42 TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA 96 Thr val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 144 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 GGT AAA AAC AAC CGG ccc TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT AGT ACC CAT 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Ser Thr His 85 90 95 CGA GGG GXG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 330

Arg Gly Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110

84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ 117 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:43:

Ser Ser Glu Leu Thr Gin λβρ Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 15 10 15

Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 2S 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Ser Thr His 85 90 95

Arg Gly Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 324 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..324 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:44: 118 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ GAA GTT GTG CTG ACT CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA 48 Glu Vai Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG GGC ATT GGA GAT GAT 96 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Gly Asp Asp 20 25 30 TTG GGC TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGG AAA GCC CCT ATC CTC CTG ATC 144 Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile 35 40 45 TAT GGT ACA TCC ACT TTA CAA AGT GGG GTC CCG TCA AGG TTC AGC GGC 192 Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGT GGA TCT GGC ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AAC AGC CTG CAG CCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 7S 80 GAA GAT Jtrwn GGA ACT TAT TAC TGT CTA CAA GAT TCC AAT TAC CCG CTC 238 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asp Ser Asn Tyr Pro Leu 35 90 95 ACT TTC GGC GGA GGG ACA CGA CTG GAG ATT AAA CGT 324 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:45: 119 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Glu Vai Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Aap Arg Vai Thr Ile Thr Cya Arg Ala Ser Gin Gly Ile Gly Asp Asp 20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lya Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asp Ser Asn Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 321 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..321 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:46: TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 15 10 15

ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AAC TAT TAT GCA

Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30 96

AAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 144 Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45 GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 AGC TCA GGG AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CGG GCG GAA 240 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Arg Ala Glu 65 70 7S 80 GAT GAG GGT GTC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT GCG GTT 288 Asp Glu Gly Vai Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ala Vai 85 90 95 TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 321 ?he Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 10S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:47:

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30 Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Arg Ala Glu 65 70 75 80 121 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Asp Glu Gly Vai Tyr Tyr Cys Aan Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ala Vai SS 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 327 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..327 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:48: TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 1 Ξ 10 15 ACA GTT AGG ATC ACT TCC CAA GGA GAC AGT CTC AGA AGC TAT TAC ACA 96 Thr Vai Arg Ile Thr Ser Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Thr 20 25 30 AAC TGG TTT CAG CAG AAG CCA GGA CAG CCC CCT CTA CTT GTC GTC TAT 144 Aan Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Leu Leu Vai Vai Tyr 35 40 45 GCT AAA AAT AAG CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Ala Lys Aan Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 240 Ser Ser Gly Aan Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAT TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Arg Asp Ser Ser Gly Aan His 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 122

(A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:108:

Vai Glu Ser Thr Ser Leu Gin Phe Arg Gly 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:109: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:109:

Cys Gly Gly Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile 15 10 is

Asn (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:110: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:110:

Gly Pro Glu Ala Ser Arg Pro Pro Lys Leu His Pro Gly 15 10 GTG CTT TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 327

Vai Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lyg Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 123 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:49:

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Giy Gin 15 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Ser Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Thr 20 25 30

Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Leu Leu Val Val Tyr 35 40 45

Ala Lys Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 144 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..144 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:50: 124 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ AAG CTT GCC GCC ACC ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC 48 Lys Leu Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Arg Vai Phe Cys Leu Leu 1 5 10 15 GCC GTG GCC CCT GGG GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTG CAG CAG TCC GGT 96 Ala Vai Ala Pro Gly Ala His Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly 20 25 30 GCC AAG GGA CCA CGG TCA CCG TCT CCT CAG GTG AGT GGA TCC GAA ttc 144 Ala Lys Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Gin Vai Ser Gly Ser Glu Phe 35 40 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear <ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:51:

Lys Leu Ala Ala Thr Met Asp Trp Thr Trp Arg Vai Phe Cys Leu Leu 15 10 15

Ala Vai Ala Pro Gly Ala His Ser Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly 20 25 30

Ala Lys Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Gin Vai Ser Gly Ser Glu Phe 35 40 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 144 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:52: GAATTCGGAT CCACTCACCT GAGGAGACGG TGACCGTGGT CCCTTGGCAC CGGACTGCTG 60 CAGTTGCACC TGGCTGTGGG CCCCAGGGGC CACGGCGAGC AGGCAAAACA CGCGCCAGGT 120 144

CCAGTCCATG GTGGCGGCAA GCTT 125

I 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 234 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:53: AAGCTTCGCC ACCATGGGAT GGAGCTGTAT CATCCTCTTC TTGGTAGCAA CAGCTACAGG 60 TAAGGGGCTC ACAGTAGCAG GCTTGAGGTC TGGACATATA TATGGGTGAC AATGAGATCC 120 ACTTTGCCTT TCTCTCCACA GGTGTGCACT CCGACATTGA GCTCACCCAG TCTCCAGACA 18 0 AAGCTCGAGC TGAAACGTGA GTAGAATTTA AACTTTGCTT CCTCAATTGG ATCC 234 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:54:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr 1 5 10 '15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:55:

Gly Vai His Ser Asp Ile Glu Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:56:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:56:

Leu Glu Leu Lys 1 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 234 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:57: GGATCCAATT GAGGAAGCAA AGTTTAAATT CTACTCACGT TTCAGCTCGA GCTTTGTCTG 60 GAGACTGGGT GAGCTCAATG TCGGAGTGCA CACCTGTGGA GAGAAAGGCA AAGTGGATGT 120 CATTGTCACC CATATATATG TCCAGACCTC AAGCCTGCTA CTGTGAGCCC CTTACCTGTA 180 GCTGTTGCTA CCAAGAAGAG GATGATACAG CTCCATCCCA TGGTGGCGAA GCTT 234 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 324 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..324 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:58:

GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA 48 Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser ?ro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG GGC ATT GGA GAT GAT 96 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Gly Asp Asp 20 25 30 TTG GGC TGG TAT CAG CAG AAG CCA GGG AAA GCC CCT ATC CTC CTG Λ * w 144 Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys ?ro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile 35 40 45 TAT GGT ACA TCC ACT TTA CAA AGT GGG GTC CCG TCA AGG TTC AGC GGC 192 Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGT GGA TCT GGC ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AAC AGC CTG CAG CCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CTA CAA GAT TCC AAT TAC CCG CTC 288 Glu A3p Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asp Ser Asn Tyr Pro Leu 85 50 95 ACT TTC GGC GGA GGG ACA CGA CTG GAG ATT AAA CGT 324 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:59: 128 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cya Arg Ala Ser Gin Gly Ile Gly Aap Aap 20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile 3S 40 45

Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Aap Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Asp Ser Asn Tyr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:60: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 345 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: IA) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..345 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:60:

GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG 48 Glu Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCG TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG 144 Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 GCA GTT ATA TGG TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG 192 Ala val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 AAG GGC CG A TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 CTG CAA ATG GAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT 288 Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 GGA AGA ACG CTG GAG TCT AGT TTG TGG GGC CAA GGC ACC CTG GTC ACC 336 Gly Arg Thr Leu Glu Ser Ser Leu Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110 GTC TCC TCA 345 Vai Ser Ser 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 115 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:61: 130 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Hia Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ala Vai Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lyá Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 S0

Lya Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Aap Asn Ser Lya Aan Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Aap Ser Leu Arg Ala Glu Aap Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Gly Arg Thr Leu Glu Ser Ser Leu Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr 100 105 110

Vai Ser Ser 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 330 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..330 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:62: 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 131

TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48 Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 1 5 10 15 ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA 96 Thr Vai Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 > O o TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 144 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Ile Tyr 35 40 45 GGT AAA AAC AAC CGG ccc TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA 240 Ser Ser Gly Aen Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT AGT ACC CAT 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Ser Thr His 85 90 95 CGA GGG GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 330 Arg Gly Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:63: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:63: 132 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Aep Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 15 10 IS

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Aap Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45

Gly Lye Aan Aan Arg Pro Ser Gly Ile Pro Aap Arg Phe Ser Gly Ser S0 55 60

Ser Ser Gly Aan Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80

Aap Glu Ala Aap Tyr Tyr Cys Aan Ser Arg Asp Ser Ser Ser Thr Hia 85 90 95

Arg Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:64: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 327 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..327 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:64: TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG 48

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Aap Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gin 15 10 15

ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 96 133 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT 144 Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu val Ile Tyr 35 40 45 GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC GCT GGC TCC 192 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser 50 55 60 AAC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAG 240 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AGC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT 288 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95 GTG GTT TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 327 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:65: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácÍdo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:65:

Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala Vai Ser Vai Ala Leu Gly Gin 15 10 IS

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Xle Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80 134 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Asp Glu Ala Asp

Tyr Tyr Cys Ser Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95

Vai Vai Phe Gly Gly Gly

Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 105 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ !D N0:66: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 324 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..324 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:66: GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA 48 Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 15 GAÇ AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCC AGT CAG GGC ATT AGC AAT TAT 96 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 ΤΓΑ GCC TGG TAT CAG CAA AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC 144 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 TAT AAG GCA TCT ACT TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC 192 Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGT GGA TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGT CTG CAA CCT 240 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCT CGA 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95 324 135 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ ACG TTC GGC CAA GGG ACC ΑΑΑ GTG GAT ATC ΑΑΑ CGT Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lya Vai Asp Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:67: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:67:

Asp val Vai Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 3S 40 45

Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 Θ0

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:68: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 84 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:68:

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 136

CGTGGTCCCT TTGCCCCAGA CGTCCACACC ACTAGAATCG TAGCCACTAT ATTCCCCAGT 60 84

TCGCGCACAG TAATACACAG CCGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:69: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:69: AGCGGATAAC AATTTCACAC AGG 23 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:70: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:70: GTCGTCTTTC CAGACGTTAG T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:71: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:71: ACCGCCAGAG CCACCTCCGC C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:72: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 137

(C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:72: 21

GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG T (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:73: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:73: CTCTTCTGAG ATGAGTTTTT G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:74: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:74: TGAGGAGACG GTGACCAGGG TTCC 24 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:75: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 68 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:75: GMACCCTGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG 60 GCGGATCG 68 138 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:76: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 68 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO:76: GGACAATGGT CACCGTCTCT TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG 60 GCGGATCG 68 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:77: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 68 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:77: GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGGTGGAG GCGGTTCAGG CGGAGGTGGC AGCGGCGGTG 60 GCGGATCG 68 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:78: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:78: GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGRTGC AGCTGGTGCA RTCTGG 56 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:79: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 139 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:79: GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCSAGGTCC AGCTGGTRCA GTCTGG 56 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:80: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:80: GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGRTCA CCTTGAAGGA GTCTGG 56 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:81: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:81: GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCSAGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGG 56 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:82: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:82: 56

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCGAGGTGC AGCTGGTGGA GWCYGG 140 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:83: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:83:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTGC AGCTACAGCA GTGGGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:84: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:84:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGSTC-C AGCTGCAGGA GTCSGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:85: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:85:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCGARGTGC AGCTGGTGCA GTCTGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:86: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 56 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:86:

GTCCTCGCAA CTGCGGCCCA GCCGGCCATG GCCCAGGTAC AGCTGCAGCA GTCAGG 56 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:87: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:87: AGCTCGGTCC TCGCAACTGC GGCCCCTGGG GCCCACAGCG AGGTGCAGCT GGTGGAGTCT 60 GG 62 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:88: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:88: CGAGTCATTC TGCACTTGGA TCCACTCACC TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCC 54 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:89: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:89: GAGAATCGGT CTGGGATTCC TGAGGGCCGG 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:90: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:90: AGCTCGGTCC TCGCAACTGG TGTGCACTCC CACGTTATAC TGACTCAGGA CCC 53 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:91: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:91: GGTCCTCGCA ACTGCGGATC CACTCACCTA GGACGGTCAG CTTGGTCCC 49 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:92: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:92: CGAGTCATTC TGCACTTGGA TCCACTCACC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TGCC 54 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:93: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:93: 53

AGCTCGGTCC TCGCAACTGG TGTGCACTCC GATGTTGTGA TGACTCAGTC TCC 143 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID ΝΟ:94: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:94:

GGTCCTCGCA ACTGCGGATC CACTCACGTT TGATATCCAC TTTGGTCCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:95: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:95:

AGCTCGGTCC TCGCAACTGG TGTGCACTCC TCGTCTGAGC TGACTCAGGA CCC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:96: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:96:

CCGGCCCTCA GGAATCCCAG ACCGATTCTC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:97: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 144

As- 84 928

EP 0 853 661/PT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:97: CTAAGCTTAC TGAGCACACA GGACCTCACC 30 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:98: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:98: TTTGGATATC TCTCCACAGG TGTCCACTCC GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TG 52 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:99: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:99: ATGGGCCCTT GGTGGAAGCT GAAGAGACGG TGACCAGGGT GCC 43 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:100: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:100: TTGAATTCAG GTGGGGGCAC TTCTCCCTCT ATGAACATTC CGTAGGGGCC ACTGTCTTC 59 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:101: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:101: TTAACGATTT CGAACGCCAC CATGGGATGG AGCTGTATCA TCCTC 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:102: GTCCTAGGTG AGTAGATCTA TCTGGGATAA GCATGCTGTT TTC 43 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:103: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:103: GATCTACTCA CCTAGGACGG TCAGCTTGG 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 104:

Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu 10 15

Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser 1 5

Ala Ser Ala Ser Pro Cys 20 % 84 928 ΕΡ Ο 853 661 /ΡΤ 146

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:105: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:105:

Arg Gin Leu Ser Leu Gin Gin Arg Met His 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:106: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:106:

Asp Pro Met Asp Met Vai Leu Lys Leu Cys 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:107: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:107:

Trp Ser Glu Phe Met Arg Gin Ser Ser Leu 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:108: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:108: 147 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ

Cys Gly Gly Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile 15 10 15

Gly Pro Glu Ala Ser Arg Pro Pro Lys Leu His Pro Gly 1 10

Lisboa,

' Ror CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY LIMITED - O AGENTE OFICIAL -

^"Adjunto

ENG.· ANTÓNIO J0A0 BA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. lua dos Flores, 74-4·* 1860 LISBOA

Claims

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 1/7

REIVINDICAÇÕES 1. Membro de ligação específica isolado compreendendo um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo humano específico para TGF-β humano que se liga à isoforma de TGF-β humano, TGF^2, com uma constante de dissociação que é pelo menos cinco vezes inferior à sua constante de dissociação para o TGF^3 e que neutraliza o TGF^2, compreendendo o domínio de ligação ao antigénio do anticorpo humano o domínio VH, VH de 6H1, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(a)(i).
2. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 1 em que o domínio de ligação ao antigénio do anticorpo humano compreende um domínio VL seleccionado de entre VL de 6B1, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(iii), VL de 6H1, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(i) e VL de 6A5, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(ii).
3. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 2 em que o referido domínio VL é 6B1 VL, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(iii).
4. Membro de ligação específica isolado compreendendo um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo humano que compete num ELISA pela ligação a TGF^2 com um membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que se liga a TGF^2 com uma constante de dissociação que é pelo menos cinco vezes inferior à sua constante de dissociação para o TGF^3 e que neutraliza o TGF^2.
5. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 4 que compete, num ELISA pela ligação a TGF^2 com um membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 3.
6. Membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 2/7 reivindicações anteriores, compreendendo uma molécula de anticorpo Fv de uma só cadeia.
7. Membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 que compreende um ou mais aminoácidos para além daqueles que formam o referido domínio de ligação ao antigénio de anticorpo humano.
8. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 7 compreendendo uma região constante de anticorpo.
9. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 8 que compreende um anticorpo completo.
10. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 8 ou 9 em que a referida região constante de anticorpo é o isotipo de lgG4.
11. Isolado de ácido nucleico que codifica para um membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
12. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11 que faz parte de um vector de expressão.
13. Método que compreende a utilização de um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11 ou a reivindicação 12, num sistema de expressão para a produção de um membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
14. Célula hospedeira contendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11 ou 12.
15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14 que é capaz de produzir o referido membro de ligação específica em condições apropriadas de cultura.
16. Método de produção de um membro de ligação específica de

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 3/7 acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15 em condições apropriadas para a produção do referido membro de ligação específica.
17. Método de acordo com a reivindicação 16 em que, após a referida produção, o referido membro de ligação específica é isolado da cultura de células.
18. Método de acordo com a reivindicação 17 em que, após o referido isolamento, o membro de ligação específica é utilizado na formulação de uma composição compreendendo pelo menos um componente adicional.
19. Método de acordo com a reivindicação 18 em que a referida composição compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável.
20. Composição compreendendo um membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
21. Membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para uma utilização num método de tratamento de um indivíduo para contrariar os efeitos de TGF-β que são prejudiciais para o indivíduo.
22. Membro de ligação específica de acordo coma reivindicação 21 em que os referidos efeitos são efeitos que promovem a fibrose.
23. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 22 em que o referido indivíduo tem uma condição seleccionada de entre o grupo que consiste em glomerulonefrite, cicatrizes neurais, cicatrizes dérmicas, cicatrizes oculares, fibrose pulmonar, lesão arterial, retinopatia proliferativa, deslocamento da retina, síndroma da dificuldade respiratória do adulto, cirrose do fígado, pós-enfarte do miocárdio, pós-estenose recidiva angioplástica, cicatriz quelóide, esclerodermia, desordens vasculares, cataratas e glaucoma.
24. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 23 em

84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 4/7 que a referida condição é cicatriz neural ou glomerulonefrite.
25. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 22 em que os referidos efeitos contribuem para uma condição de doença imunitária ou inflamatória.
26. Membro de ligação específica de acordo com a reivindicação 25 em que a referida condição é seleccionada de entre o grupo que consiste em artrite reumatóide, doença de deficiência de macrófagos e infecção patogénica de macrófagos.
27. Utilização de um membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 no fabrico de um medicamento para o tratamento de um indivíduo para contrariar os efeitos do TGF-β que são prejudiciais para o indivíduo.
28. Utilização de acordo com a reivindicação 27 em que os referidos 'ψ efeitos são efeitos que promovem a fibrose.
29. Utilização de acordo com a reivindicação 28 em que o referido indivíduo tem uma condição seleccionada de entre o grupo que consiste em glomerulonefrite, cicatrizes neurais, cicatrizes dérmicas, cicatrizes oculares, fibrose pulmonar, lesão arterial, retinopatia proliferativa, deslocamento da retina, síndrome da dificuldade respiratória do adulto, cirrose do fígado, pós-enfarte do miocárdio, pós-estenose recidiva angioplástica, cicatriz quelóide, esclerodermia, desordens vasculares, cataratas e glaucoma.
30. Utilização de acordo com a reivindicação 29 em que a referida condição é cicatriz neural ou glomerulonefrite.
31. Utilização de acordo com a reivindicação 27 em que os referidos efeitos contribuem para uma condição de doença imunitária ou inflamatória.
32. Utilização de acordo com a reivindicação 31 em que a referida condição é seleccionada de entre o grupo que consiste em artrite reumatóide, doença de deficiência de macrófagos e infecção patogénica de macrófagos.

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33. Método para obter um domínio de ligação ao antigénio de um anticorpo possuindo as propriedades de ser específico para TGF-β humano, de se ligar à isoforma de TGF-β humano, TGF^2, com uma constante de dissociação que é pelo menos cinco vezes inferior à sua constante de dissociação para o TGF^3 e de neutralizar o TGF^2, compreendendo o referido método proporcionar, por meio de adição, deieção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2{a)(i), um domínio VH que é uma variante da sequência de aminoácidos do domínio VH, 6H1 VH, combinar o domínio VH assim proporcionado com um ou mais domínios VL e testar a combinação ou as combinações VH/VL quanto às referidas propriedades para identificar um domínio de ligação ao antigénio de anticorpo possuindo as referidas propriedades.
34. Método de acordo com a reivindicação 33 em que o referido domínio VL ou os referidos domínios VL são seleccionados de entre VL de 6B1, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(iii), VL de 6H1, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(i) e VL de 6A5, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(ii).
35. Método de acordo com a reivindicação 33 em que o referido domínio VL ou os referidos domínios VL são proporcionados por meio de adição, deieção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos num ou mais domínios VL seleccionados de entre VL de 6B1, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(iii), VL de 6H, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(i) e VL de 6A5, cuja sequência de aminoácidos está apresentada na Figura 2(b)(ii).
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35 em que um domínio de ligação ao antigénio do anticorpo, identificado como 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 6/7 possuindo as referidas propriedades, é produzido na forma de uma molécula isolada de anticorpo Fv de uma só cadeia.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35 em que o referido domínio de ligação ao antigénio do anticorpo, identificado como possuindo as referidas propriedades, é produzido num polipéptido compreendendo um ou mais aminoácidos para além daqueles que formam o domínio de ligação ao antigénio do anticorpo.
38. Método de acordo com a reivindicação 37 em que o referido polipéptido compreende uma região constante de anticorpo.
39. Método de acordo com a reivindicação 38 em que o referido polipéptido compreende um anticorpo completo.
40. Método de acordo com a reivindicação 38 ou 39 em que a referida região constante do anticorpo é um isotipo de lgG4.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 40 em que o referido domínio de ligação ao antigénio do anticorpo, identificado como possuindo as referidas propriedades, é produzido por meio de expressão de um ácido nucleico codificante.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 41 em que o referido domínio de ligação ao antigénio do anticorpo, identificado como possuindo as referidas propriedades, é formulado numa composição compreendendo pelo menos um componente adicional.
43. Método de acordo com a reivindicação 42 em que a referida composição compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável.
44. Método que compreende provocar ou permitir a ligação in vitro de um membro de ligação específica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 à isoforma TGF-p2 de TGF-β humano.
45. Método de acordo com a reivindicação 44 em que a referida ligação 84 928 ΕΡ Ο 853 661/ΡΤ 7/7 do membro de ligação específica neutraliza a referida isoforma ou as referidas isoformas. Lisboa, -y 2000 Por CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY LIMITED -O AGENTE OFICIAL-

O AD1URTO ENG.· ANTÓNIO JOÂO DA CUNHA FERREIRA j Ag. Of. Pr. Ind. f R»· das Flores, 74 - 4,· M20Q LISBOA