PT828703E

PT828703E - Sintese assimetrica de (-) 6-cloro-4-ciclopropil-etinil-4-trifluorometil-1,4-dihidro-2h-3,1-benzoxazin-2-ona

Info

Publication number: PT828703E
Application number: PT96920322T
Authority: PT
Inventors: Andrew S Thompson; Edward G Corley; Edward J J Grabowski; Nobuyoshi Yasuda
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-05-21
Publication date: 2001-01-31
Also published as: DE69610422D1; HU223565B1; TW402581B; GR3034897T3; DE69610422T2; WO1996037457A1; KR19990021899A; EA199700426A1; EA000107B1; YU48940B; HUP9802566A3; DK0828703T3; CA2220389C; AU709273B2; CZ370997A3; ATE196463T1; CN1119319C; US5633405A; CN1185146A; EP0828703A1

Description

DESCRIÇÃO " SÍNTESE ASSIMÉTRICA DE (-) 6-CLORO-4-CICLOPROPIL-ETINIL-4-TRIFLUOROMETIL-l,4-DIHIDRO-2H-3,l-BENZOXAZIN-2-ONA m

ESTADO ACTUAL DOS CONHECIMENTOS

Este caso relaciona-se com o Caso Merck 18793IB, que é uma continuação em parte do Caso Merck 18793, apresentado em 7 de Agosto de 1992, U.S.S.N. 07/926.607, e do 19345.

Um retrovírus que se designa vírus da imunodeficiência humana (HIV) é o agente etiológico de uma doença complexa que inclui a destruição progressiva do sistema imune (síndroma de imunodefíciêcia adquirida; SIDA) e a degenerescência do sitema nervoso central e periférico. Este vírus havia anteriormente sido conhecido como LAV, HTLV-III, ou ARV. Uma caracterís-tica comum na replicação dos retrovírus é a transcripção reversa do genoma de RNA por uma transcriptase reversa codificada pelo vírus, para gerar cópia de sequências do HIV no DNA, um passo indispensável da replicação virai. Sabe-se que determinados compostos são inibidores da transcriptase reversa e são agentes eficazes no tratamento da SIDA e doenças semelhantes, por exemplo a azidotimidina ou AZT.

Por sequenciação de nucleótidos de HIV revela-se a presença de um gene pol num quadro aberto de leitura [Ratner, L, et al., Nature, 313, 277, (1985)]. A homologia da sequência de aminoácidos fornece provas no sentido de que a sequência pol codifica para a transcriptase reversa, uma endonuclease e uma protease do HIV [Toh, H, et al., EMBO J., 4, 1267 (1985); Power, M. D., et al, Science, 231, 1567 (1986); Pearl, L. H.eEt al, Nature, 329, 351 (1987)].

Os postulantes demonstarm uma síntese substancialmente melhorada de um inibidor de transcriptase reversa, com a estrutura

designado (-) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l ,4-dihidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona, de ora em diante designado "Compostos A" neste documento. Este composto tem elevada potência, mesmo contra a transcriptáse reversa do HIV que resista a outros compostos antivirais.

Os postulantes inventaram uma síntese assimétrica do Composto A. Os métodos anteriores passavam por um penúltimo produto que era um racemato, com um rendimento global inferior. A invenção presente diz respeito á síntese directa do Composto A ópticamente activo, por adição quiral a uma cetona intermediária para se obter um álcool terciário, com um excesso enantiomérico superior a 95%.

Para além disso, não é de esperar que da reacção de um acetileto com uma trifluorometilcetona resulte um produto ópticamente activo. Esse efeito

consegue-se na invenção presente utilizando um aminoácool quiral para mediar a reacção ao longo de um caminho assimétrico.

Os postulantes também descobriram que se se aquecer (seguido de arrefecimento) a mistura de aminoálcool litiado e cloropropilacetileno, antes de se adicionar a trifluorocetona, o excesso enantiomérico é aumentado de 85%, num ensaio típico, para mais do que 95% os valores singularmente elevados de pureza óptica (>95% ee) tomam este método vantajoso e prático).

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Revela-se uma síntese melhorada de (-) 6-cloro-4-ciclopropiletinil-4-trifluorometil-l,4-dihidro-2H-3,l-benzoxazin-2-ona, que utiliza adição quiral a uma cetona intermediária para dar um álcool terciário. O composto é útil para a inibição da transcriptase reversa (e as suas variedades resistentes), para impedir a infecção com HIV, para o tratamento da infecção por HIV e no tratamento de SIDA e/ou CRS (complexo relacionado com a SIDA), quer o composto, os sais farmaceuticamente aceitáveis (quando apropriado), em ingredientes de composições farmacêuticas, em combinação ou não com outros agentes anti-virais, anti-infecciosos, imunomoduladores, antibióticos ou vacinas. Também se revelam métodos de tratar SIDA, métodos de impedir a infecção pelo HIV, e métodos de tratar a infecção por HIV.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO E DAS SUAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Descreve-se nesta invenção um processo de síntese assimétrica do composto quiral que tem a estrutura -4-

em que P é um grupo protector de amino; que inclui os passos de: (a) preparar uma mistura de um excesso de (lR,2S)-norefedrina N-substituida, com a estrutura

na qual R é alquilo C^, ou NR2 forma pirrolidinilo ou piperidinilo; com um excesso de ciclopropilacetileno e um excesso de um agente litiante seleccionado de entre n-butil-lítio ou sec-butil-lítio ou tert-butil-lítio, a uma gama de temperaturas de entre -78°C e 10°C, num solvente aprótico; (b) misturar com a mistura do passo (a) cerca de um equivalente de reagente com a estrutura

em que P é um grupo protector de amino; -5- Ι/Λη e manter a mistura reaccional resultante a uma temperatura entre - 78°C e -20°C; (c) terminar adicionando um doador de protões; (d) para obter o composto pretendido.

Uma concretização desta invenção é um processo de síntese assimétrica do composto quiral N-(4-metoxibenzil)-6-cloro-2-[(R)-ciclo-propil-etinil-hidroxi-trifluorometil]-metil-anilina, com a estrutura

que inclui os passos de: (a) preparar uma mistura de um excesso de (lR,2S)-norefedrina N-substituida, com a estrutura

na qual R é alquilo Cm, ou NR2 forma pirrolidinilo ou piperidinilo; com um -6- [Μη excesso de ciclopropilacetileno e um excesso de um agente litiante seleccionado de entre n-butil-lítio ou sec-butil-lítio ou tert-butil-lítio, a uma gama de temperaturas de entre -78°C e 10°C, num solvente aprótico; (b) misturar com a mistura do passo (a) cerca de um equivalente de reagente N-(4-metoxibenzil)-6-cloro-2-(2-trifluoro-l-oxo-etil]-anilina com a estrutura

O

e manter a mistura reaccional resultante a uma temperatura entre - 78°C e -20°C; (c) terminar adicionando um doador de protões; (d) para obter o composto pretendido.

Outra concretização desta invenção é um processo de síntese assimétrica do composto quiral com a estrutura

-7-

Uu, ^ na qual P é um grupo protector de amina; que inclui os passos de: (a) preparar uma mistura de um excesso (1R,2S)-N-pirrolidinilnorefedrina, com a estrutura

com um excesso de ciclopropilacetileno e um excesso de um agente litiante seleccionado de entre n-butil-lítio ou sec-butil-lítio ou tert-butil-lítio, a uma temperatura de cerca de -15°C, num solvente aprótico;

(b) misturar com a mistura do passo (a) cerca de um equivalente de reagente com a estrutura em que P é um grupo protector de amino; e manter a mistura reaccional resultante a uma temperatura de cerca de-40°C; -8- (Μη (c) terminar adicionando um doador de protões; (d) para obter o composto pretendido.

Outra concretização desta invenção é um processo de síntese assimétrica do composto quiral N-(4-metoxibenzil)-6-cloro-2-[(R)-ciclopentileti-nil-hidroxi-trifluorometil]-metil-anilina, com a estrutura

que inclui os passos de: (a) preparar uma mistura de um excesso de (lR,2S)-N-pirroli-dinilnorefedrina, com a estrutura

com um excesso de ciclopropilacetileno e um excesso de n-butil-lítio, a uma temperatura de cerca de -15°C, num solvente aprótico; -9-

(b) misturar com a mistura do passo (a) cerca de um equivalente do reagente N-(4-metoxibenzil)-6-cloro-2-(2-trifluoro-l-oxo-etil)-anilina, com a estrutura

O

e manter a mistura reaccional resultante a uma temperatura de cerca de -40°C; (c) terminar adicionando um doador de protões; (d) para obter o composto pretendido, com um rendimento >85%, >95% ee

Poderá modificar-se qualquer dos processos acima para aumentar o excesso enantiomérico introduzindo um passo adicional de aquecimento (seguido de arrefecimento), entre o passo (a) e o passo (b), isto é, aquece-se a mistura do paaso (a) a entre -10°C e 10°C, durante pelo menos 5 minutos, e depois arrefece-se a entre -78°C e -20°C, antes de se adicionar a frifluorocetona. Se a temperatura do passo (a) já estiver compreendida no intervalo de entre -10°c e 10°C, aumentar a temperatura poderá não melhorar o excesso enantiomérico. -10- ί/ίΛη

Uma modificação preferida para aumentar o excesso enantiomérico é introduzir um aquecimento adicional (seguido de arrefecimento) entre o passo (a) e o passo (b) isto é, aquece-se a mistura do paaso (a) a entre -10°C e 0°C, durante entre 10 minutos e 60 minutos, e depois arrefece-se a pelo menos cerca de -40°C, antes de se adicionar a frifluorocetona.

Esta invenção diz também respeito a um composto com a estrutura

em que P é um grupo protector de amino.

Outro composto que se encontra no âmbito da invenção é a N-(4-metoxibenzil)-6-cloro-[(2-(R)-ciclopropiletinil-hidroxi-trifluorometil]-metil-anilina, com a estrutura

Em primeiro lugar, mistura-se um excesso de (lR,2S)-efedrina N- -11- Η <~~2aÀ^1^ substituída, num solvente aprótico, com excesso de ciclopropilacetileno, e removem-se os protões acídicos por litiação com um excesso de n-BuLi ou sec-butil-lítio ou tert-buti 1-lítio. Mantém-se a mistura resultante auma temperatura na gama de -78°C e 10°C, de preferência a cerca de -15°C.

Se se aquecer a mistura resultante a entre -10°C e 10°C, obtém-se o produto 6 num excesso enantiomérico substancialmente superior, tipicamente cerca de 85% em vez de cerca de 85% ou menos. Alguns dos aspectos desta invenção eliminam este passo de aquecimento, outros incluem-no.

Nos processos desta invenção presente, P é qualquer grupo protector de amino apropriado, e inclui, mas não se limita a, grupos benzilo não substituído ou substituído com alquilo Ci_4; parametoxibenzilo; para-nitrobenzilo; para-clorobenzilo; 2,4-diclorobenzilo;2,4-dimetoxibenzilo, 4-metilsulfmilbenzilo; 9-antrilmetilo; difenilmetilo; ou N-trialquilsililo, conforme consta em T. W. Greene etal., Protective Groups in Organic Svnthesis, 2a Ed. John Wiley 1991, pp 309-405. Um grupo protector de amino preferido é o para-metoxibenzilo. Assim que a se inicia a reacção com a adição de cerca de um equivalente da cetona 5, uma trifluorocetona, mantém-se a mistura reaccional resultante entre -78°C e -20°c, de preferência a cerca de -40°C. Leva-se a cabo a reacção num solvente aprótico ou etéreo. Incluem-se como exemplos de solventes apróticos THF, dioxano, Et20, benzeno, DME, tolueno, n-octano, n-hexano, e ciclohexano, ou misturas destes. Um solvente preferido é o THF. O tempo de incubação desta reacção é de pelo menos 2-3 minutos após a adição da cetona.

Nesta altura, termina-se a reacção adicionando à mistura reaccional uma fonte de protões em meio aquoso, tipicamente um ácido fraco. Qualquer - 12- U**j fonte de protões desse tipo é apropriada, por exemplo uma fonte de protões preferida é ácido cítrico 1M. Outra é ácido acético 1M.

Purifica-se o produto quiral 6 pelas técnicas habituais.

Os compostos da invenção presente podem ter centros assimétricos e podem ocorrer, excepto quando se denote especificamente o contrário, como racematos, misturas racémicas ou como diastereómeros individuais, ou enantió-meros, estando todas estas formas isoméricas no âmbito da invenção presente. A expressão (+/-) pretende abarcar os isómeros ópticos (+) ou os isómeros ópticos (-) ou quaisquer misturas de ambos.

Quando uma variável qualquer (por exemplo R) ocorrer mais do que uma vez em cada constituinte ou na Fórmula 1, a sua definição para cada ocorrência é independente da sua definição em cada outra ocorrência. Além disso, só são permitidas combinações de substituintes e/ou de variáveis quando dessas combinações resultem compostos estáveis.

Tal como utilizado neste documento e excepto quando se expresse o contrário, pretende-se significar por "alquilo" tanto grupos hidrocarboneto saturados de cadeia linear ou ramificada, contendo o número de átomos de carbono especificados; quando não se especifique o número de átomos de carbono, "alquilo" incluirá grupos hidrocarboneto saturados de cadeia linear ou ramificada, com 1 a 4 átomos de carbono. "Tal como utilizados neste documento, os termos "halogéneo" ou "halo", significam fluoro, cloro, bromo e iodo.

Pode sintetizar-se o Composto A pelo seguinte método.

- 14-

ESQUEMA 1 (CONTINUAÇÃO)

£OH

THF/0°C a -40°C Ê Ré alquilo C^ou-NR;» pode formar pirrolidinilo ou piperidinilo

- 15- [Μη

Pode preparar-se ο ciclopropilacetileno, que é um dos reagentes para a formação de 6, por um dos esquemas alternativos seguintes;

ESQUEMA IIA

t-BuOK/DMSO ^ (42%) tal como também se descreve em C. E. Hudson et al., J. Am. Chem. Soc. 94, 1158 (1972) e em W. Schoberth et al., Synthesis 703 (1972).

ESQUEMA IIB

fl-Bu Li/ ciclohexano 80°C/3h

H

sol.saturada de NH4CI

Prefere-se 0 Esquema IIB, que se ilustra no Exemplo 3. O Composto A é útil na preparação e execução de ensaios de despiste de compostos antivirais. Por exemplo, o Composto A é útil para isolar enzimas mutantes, que sáo excelentes ferramentas de despiste de compostos antivirais mais potentes. Para além disso, o Composto Aé útil para estabelecer ou determinar o local de ligação de outros antivirais à transcriptase reversa do HIV, por exemplo, por inibição competitiva. Portanto o Composto A é um composto comercial, vendido para esses propósitos. -16- Ι/ίΛη Ο Composto A é útil na inibição da transcrptase reversa de HIV, para a prevenção ou o tratamento da infecção por vírus da imunodefíciência humana (HIV), e para o tratamento de estados patológicos consequentes, como a SIDA. Tratar a SIDA ou impedir ou tratar a infecção pelo HIV define-se como incluindo, mas não se limitando a, tratar uma larga gama de estados da infecção com HIV; SIDA, CRS(complexo relacionado com a SIDA), tanto sintomático como assíntomático, e exposição actual ou potencial ao HIV. Por exemplo, o Composto A é útil para tratar a infecção pelo HIV após exposição suspeitada ao HIV por, por exemplo, transfusão sanguínea, permuta de fluidos corporais, mordeduras, picada acidental com agulha, ou exposição a sangue do paciente durante a cirurgia. A vantagem especial do Composto A é a sua potente inibição da transcriptase reversa do HIV que se tenha tomado resistente a outros antivirais, tais como L-697.661, que é a 3-([(4,7-dicloro-l,3-benzoxazol-2-il)metil]-amino)-5-etil-6-metil-piridin-2(lH)-ona; ou AZT.

Com estas finalidades, pode administrar-se o Composto A por via oral, parentérica (incluindo injecções subcutâneas, injecção endovenosa, intramuscular ou intraestemal ou por técnicas de infusão), por aerossol para inalação, ou por via rectal, em formulações de unidade de dose contendo os veículos, adjuvantes e excipientes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis habituais.

Deste modo, segundo a invenção presente proporciona-se também um método de tratamento, e uma composção farmacêutica para tratar, a infecção por HIV e a SIDA. O tratamento passa por se administrar a um paciente que necessite de um tal tratamento uma composição farmacêutica que inclua um - 17- l/btoj veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção presente.

Estas composições farmacêuticas podem assumir a forma de suspensões ou comprimidos que podem ser administrados por via oral; dispersões para administração nasal; preparações estéreis injectáveis, por exemplo,sob a forma de soluções ou suspensões aquosas ou oleosas estéreis e injectáveis, ou supositórios.

Quando destinadas a administração oral como suspensões, preparam-se estas composições segundo técnicas bem conhecidas dos entendidos em formulação farmacêutica e podem conter celulose microcristalina para lhes dar corpo, ácido algínico ou alginato de sódio como agente de suspensão, metilcelulose para aumentar a viscosidade, e agentes edulcorantes/saborizantes conhecidos dos entendidos. Como comprimidos para libertação imdeiata, estas composiçõe spoderão conter celulose microcristalina, fosfato dicálcico, amido, estearato de magnésio e lactose e/ou outros excipientes, ligantes, cargas, desintegrantes, diluentes e lubrificantes conhecidos pelos entendidos.

Quando administradas por aerossol nasal ou por inalação, estas composições são preparadas segundo técnicas bem conhecidas na tecnologia de formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em soro salino, utilizando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonos e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos pelos entendidos.

As soluções ou suspensões injectáveis podem ser formuladas como habitualmente, utilizando diluentes ou solventes adequados, não tóxicos e aceitáveis para administração parentérica, tais como manitol, 1,3-butanodiol, - 18- Ι/Άη água, solução de Ringer, ou solução isotónica de cloreto de sódio, ou agentes de suspensão ou molhantes apropriados, tais como óleos estéreis, pouco reactivos, fixos, inluindo mono- e di-acilgliceróis de síntese, e ácidos gordos, incluindo ácido oleico.

Quando administradas por via rectal sob a forma de supositórios, estas composições poderão ser preparadas misturando o princípio activo com um excipiente não irritante apropriado, tal como manteiga de cacau, ésteres de glicerol sintéticos ou polietilenoglicóis, que sejam sólidos às temperaturas habituais mas fundam e/ou se dissolvam na cavidade rectal para libertar o fármaco.

Pode administrar-se o Composto A a seres humanos por via oral numa gama de dosagem de 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal em doses repartidas. Uma gama preferida de dosagens é de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, por via oral em doses repartidas. Outra gama de dosagem preferida é de 0,1 a 2 mg/kg de peso corporal, por via oral em doses repartidas. Para terapêutica de combinação com análogos de nucleósidos, uma gama de dosagem preferida é de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal dos compostos desta invenção administrados por via oral em doses repartidas e de 50 mg a 5g/kg de peso corporal dos análogos de nucleósidos administrados por via oral em doses repartidas. Compreender-se-á, no entanto, que o nível de dose específico e a frequência da dosagem para qualquer paciente em particular, possa variar e dependa de uma diversidade de factores incluindo a actividade do composto especificamente utilizado, a estabilidade metabólica e duração de actividade desse composto, a idade, o peso corporal, estado geral de saúde, o género, dieta, modo e período de administração, ritmo de excreção, combinação de fármacos, a severidade do estado, e do paciente que recebe a terapia. -19-

Um EXEMPLO 1

Preparação de 4-clorofenil-pivalamida

c6h6cin PM =127.99 cloreto de pivaloílo Tolueno/Na2C03 C^HuCINO PM = 211.66 1 £ Materiais Ouant. MMole PM 4-cloroanilina 76 g 596 127,57 Cloreto de Pivaloílo (d=0,979) 74 mL 600 120,58 tolueno 600 mL sol. sat de Na2C03 95 mL água desionisada 225 mL

Adiciona-se solução saturada de Na2C03 (95 mL) a uma solução de 4-cloroanilina ( 76 g) em tolueno (600 mL). Arrefece-se a mistura a 10°C e adiciona-se gota a gota cloreto de pivaloílo (74 mL( ao longo de 45 minutos. Agita-se a mistura reaccional a 5-10°C durante 60 minutos enquanto se monitoriza por HPLC o progresso da reacção. A adição do cloreto de pivaloílo à anilina era exotérmica.

Condições de HPLC: Coluna C-8, CH3CN, água, ácido fosfórico, eluição gradiente de 40:60:0,1 a 80:20:0,1 em 20 minutos, caudal = 1,0 mL/min, detecção no UV a 245 nm, matéria prima tR=7,2 min, pivalamida tR=12,6 min. -20- Ι/υιη

Isolou-se ο produto por filtração e lavou-se com água desionisada (3 x 75 mL) e secou-se ao ar com sucç~so durante 10 minutos. Secou-se o produto em forno de vazio com uma purga de N2 a 40°C durante 16 h para se obterem 108,5 g do produto sob a forma de finas agulhas brancas (86%). EXEMPLO 2

Preparação da 4-cloro-ceto-anilina 4

n-BuLi/THF

EtOCOCF

CnH^CINO PM = 211.66 3

EtOH/HCl depois de NaOH

CaH5F3CINO PM =223.58

Materiais 4-clorofenil-pivalamida n-BuLi/hexano (2,5 M) trifluoroacetato de etilo (d=l, 194) THF Etanol HC1 6N hexano

Ouant. 10 g 38 mL 6,7 mL 75 mL 90 mL 50 mL 90 mL MMole PM 211,69 47,2 95 56,6 142,08 240 -21 - l/Αη

NaOH 2Ν 15 mL

água desionisada 350 mL

Num balão de 500 mL com três tubuladuras dissolve-se a pivalamida (10 g) em THF seco (75 mL) e arrefece-se a mistura a 0°C. Adiciona-se gota a gota a esta solução n-BuLi/hexano (2,5 M, 38 mL) deixando a temperatura reaccional subir até +15°C. Mantém-se a mistura reaccional a 0°C durante 2h. A adição do primeiro equivalente de nBuLi à pivalamida foi fortemente exotérmica. Cntrolou-se a exotermia pela velocidade de adição.

Adiciona-se á suspensão amarelo pálido trifluoroacetato de etilo em natureza (6,7 mL), deixando a temperatura interna subir até +10°C. Monitorizou-se o decurso da reacção por HPLC.

Condições de HPLC: Coluna C-8, CH3CN, água, ácido fosfórico, eluição gradiente de 40:60:0,1 a 80:20:0,1 em 20 minutos, caudal =1,0 mL/min, detecção no UV a 245 nm, pivalamida inicial ír=12,6 min, ceto-pivalamida tR=ll,6 min. Obteve-se tipicamente 85A% de produto e 10-15A% de pivalamida por reagir.

Terminou-se a reacção adicionando-lhe HC1 6N (10 mL) e água desionisada (20 mL).

Uma análise por HPLC feita nesta altura indicou 13,1 g (90%) de produto.

Concentrou-se a solução a cerca de 50 mL em vazio para retirar -22-

iA hexano e THF. Adicionou-se à mistura reaccional HC1 6N (40 mL) e aqueceu-se a mistura ao refluxo (80°C) durante lh.

Concentrou-se a mistura reaccional em vazio a cerca de 50 mL, formando-se riesta altura um precipitado (presumivelmente o sal de HC1 do produto). Parou-se a destilação e arrefeceu-se a mistura reaccional a 0°C. Depois de lh de repouso, filtrou-se a mistura reaccional e lavou-se com hexano (3 x 30 mL).

As lavagens com hexano retiram a pivalamida por reagir do produto. Testa-se o sólido por HPLC para confirmar que ela foi completamente removida. Nas águas de lavagem existe tipicamente 1,2-1,5 g de produto (8-12%). A maior parte das perdas de produto dá-se no filtrado aquoso.

Secou-se o sal num forno de vazio a 40°c durante 16 h para se obterem 10,4 g de um sólido com pureza de 71,45 por peso 8rendimento de 70%). Suspendeu-se este sal em água desionisada (260 mL) e neutralizou-se a um pH de cerca 6-7 com NaOH 2N (15 mL).

Era factor crítico não deixar o pH ultrapassar 9,0 devido à decomposição do produto. O sólido amarelo brilhante resultante foi isolado por filtração e lavado com água desionisada (2 x 25 mL). Secou-se o produto num forno de vazio a 40°C durante 16 h para se obterem 6 g da ceto anilina com pureza de 96,6% por peso (rendimento de 54%).

Purifica-se mais o produto por recristalização de hexano. -23-

Uu, ^ EXEMPLO 3

Preparação de uma Ν-4-metoxibenzil-ceto-anilina 5

C16H13F3CINO2 PM =343.735 5.

Materiais Ouant. MMole ceto-anilina 15,5 g 69,5 cloreto de p-metoxibenzilo 10,9 g 69,8 peneiros moleculares de 4Á 90 g Tolueno 70 mL Acetona 500 mL Hexano 120 mL

PM 223,58

Num balão de 250 mL colocou-se a ceto-anilina (15,5 g), peneiros moleculares de 4Á activados (50 g) e tolueno (75 mL). Agitou-se esta mistura sob N2 durante 24 h. Uma análise por HPLC mostrou uma mistura de cerca de 1:1 de matéria prima e produto.

Condições de HPLC: Coluna C-8, CH3CN, água, ácido fosfórico, eluição isocrática a 65:35:0,1 durante 20 minutos, caudal = 1,0 mL/min, detecção no UV a 260 nm, tolueno tR=5,7 min, ceto-anilina inicial tR=6,5 min, produto tR=15,0 min. Obteve-se tipicamente 25A% de tolueno. -24-

Adicionaram-se mais peneiros moleculares (40 g) e agitou-se a mistura reaccional durante mais 3 dias a 23°C. Considerou-se a reacção completa quando restava menos de 2A% de matéria prima.

Pode utilizar-se em alternativa alumina básica ou silicagel em vez dos peneiros, para retirar o HC1 do sistema.

Filtrou-se a mistura através de Celite e lavou-se com acetona (3 x 75 mL) até que a maior parte da cor amarela tivesse saído da Celite. Concentrou-se o filtrado para se obterem 27 g de um óleo amarelo-alaranjado que solidificou ao fim de algum tempo. Purificou-se o sólido dissolvendo-o em hexanos a quente (100 mL). Arrefeceu-se a solução à temperatura ambiente, depois a 0°C num banho de água e gelo. Depois de repousar 1,5 h filtrou-se e lavou-se com hexanos arrefecidos (2x10 mL). Secou-se o sólido ao ar com sucção durante 10 minutos, depois num forno de vazioa 40°C durante 2h. Desta forma obtiveram-se 20,5 g (86%) de um pó amarelo brilhante. EXEMPLO 4

Preparação do ciclopropilacetileno

CJ

n-BuU/ciclohexano

H 80°C/3h * >

Li c5h7ci PM* 102.57

sol.saturada de NH4CI -25-

Ut*l

Materiais Ouant. MMole PM 5-cloro-1 -pentino 10 g 98 102,57 n-BuLi/ciclohexano (2,0 M) 122 mL 244 ciclohexano 80 mL sol. saturada de NH4C1 50 mL

Adicionou-se sob N2 a uma solução de 5-cloro-l-pentíno (10 g) em ciclohexano (80 mL) a 0°C, n-butil-lítio em ciclohexano (2,0 M, 122 mL). Aqueceu-se a 75°C durante 5h. A adição de n-butil-lítio ao alcino foi exotérmica, e manteve-se a temperatura abaixo de +5°C durante esta adição utilizando um banho de água e gelo.

Monitorizou-se o decurso da reacção por HPLC. Considerou-se a reacção completa quando o rendimento observado foi >90%.

Condições de HPLC: Coluna C-8, CH3CN, água, ácido fosfórico, eluição isocrática a 50:50:0,1 durante 20 minutos, caudal =1,0 mL/min, detecção no UV a 195 nm, matéria prima tR=7,5 min, ciclopropilacetileno tR=6,0 min. O produto tinha um factor de resposta que era 20 vezes superior ao da matéria prima.

Completado o passo de ciclização, arrefeceu-se a mistura reaccional a 0°C e terminou-se com solução saturada de NH4C1.

Uma análise por HPLC da fase orgânica mostrou 5,5 g de ciclopropilacetileno (rendimento de 85%). -26- Uuj

Purifícou-se o produto por destilação fraccionada através de uma coluna de 6 polegadas por 0,5 polegadas com enchimento de pérolas de vidro de 4 mm. recolheu-se a fracção com ponto de ebulição de 45-75°C.

Obtiveram-se assim 4,2 g de ciclopropilacetileno, sob a forma de um óleo incolor. EXEMPLO 5 r

Preparação do Amino Álcool

OH

THF/0°C a -40°C

C2iH19p3CIN02 PM =409 £ -27-

Imj

Materiais Ouant. MMole Cetona 10g 29,1 343 1R,2S N-pirrolidinil-norefedrina 13,1 g 64 205 ciclopropilacetileno (d=0,8) 5,3 mL 64 66 n-BuLi (2,6M em ciclohexano) 50 mL 125 THF (KF=20 pg/mL) 80 mL Ácido cítrico 1M 90 mL Acetato de etilo 75 mL

Dissolveu-se a pirrolidinilefedrina (13,1 g) em THF (55 mL) e arrefeceu-se a solução a -15°C. Adicionou-se a esta solução sob N2 e a -15°C ciclopropilacetileno em natureza (5,3 mL) e n-butil-lítio (50 mL), gota a gota. Deixou-se a mistura reaccional repousar durante 30 minutos a -5°C e depois arrefeceu-se a -55°C. A adição de n-butil-lítiou causou uma exotermia que se manteve a entre -5°C e 0°C regulando velocidade de adição.

Dissolveu-se a cetona (10 g) em THF (25 mL) sob N2, e adicionou-se à mistura aniónica ao longo de 15 minutos deixando a temperatura interna da mistura reaccional subir a -40°C durante a adição. Deixou-se repousar a solução laranja-claro obtida durante 60 minutos a -40°C e terminou-se adicionando-lhe ácido cítrico 1M (45 mL) e acetato de etilo (75 mL). Aqueceu-se a mistura reaccional à temperatura ambiente e separaram-se as fases. Lavou-se a fase orgânica com ácido cítrico 1M (45 mL). Analisou-se a mistura reaccional por HPLC para determinar a percentagem de conversão e o ee do produto.

-28- l/MJ

Condições de HPLC: Coluna C-8, CH3CN, água, ácido fosfórico, eluição isocrática a 65:35:0,1 durante 15 minutos, caudal =1,0 mL/min, detecção no UV a 252 nm, matéria prima tR=12,8 min, produto tR=10,3 min.

Condições de HPLC quiral: coluna com fase estacionária de amilose, eluição isocrática com hexano:isopropanol 85:15, caudal=l,0 mL/min, detecção no UV a a 252 nm, matéria prima tR=4,9 min, enantiómero principal tR=5,5 min, enantiómero secundário tR=25,0 min. O excesso enantiomérico foi de 96,5% e a conversão reaccional de 93% (6A% de matéria prima). O rendimento da análise foi de 85%. Purificou-se o produto misturando-o com heptano:tolueno 10:1 (65 mL) durante 18 h a 23°C. Isolou-se o produto por filtração e secou-se num forno a 35°C para se obterem 9,5 g (80%) de produto sob forma de um pó amarelo claro. EXEMPLO 6

Preparação da Benzoxazinona

S

-29 - Ι/Λ*! Materiais Ouant. MMole PM amino álcoo 3,2 g 7,8 409 Fosgénio em tolueno (1,93 M) 4,6 mL 8,89 trietilamina (d=0,726) 5,4 mL 39 101 THF (KF<100 pg/mL) 15 mL Água desionisada 15 mL EtOAc 45 mL Hexanos 30 mL ácido cítrico 1M 40 mL Salmoura concentrada 25 mL

Dissolveu-se o amino álcool em THF (15 mL) e arrefeceu-se a -10°C sob N2. Adicionou-se à solução trietilamina (5,4 mL) e fosgénio em tolueno (4,6 mL). A adição do fosgénio causou uma exotermia que se controlou abaixo dos 20°C através da velocidade de adição. Monitorizou-se o decurso da reacção por HPLC verificando-se tipicamente que se completava em 15 minutos.

Condições de HPLC: Coluna C-8, CH3CN, água, ácido fosfórico, eluição gradiente de 50:50:0,1 a 90:10:0,1 em 20 minutos, caudal = 1,5 mL/min, detecção no UV a 252 nm, matéria prima tR=14,6 min, produto tR=l 6,0 min.

Arrefeceu-se a mistura reaccional a 0°C e interrompeu-se adicionando-lhe água gelada (15 mL) e acetato de etilo (30 mL). Utilizou-se salmoura concentrada para desfazer quaisquer emulsões. Separou-se a fase orgânica e extraíu-se a aquosa com acetato de etilo (15 mL). Lavaram-se as fases orgânicas juntas com ácido cítrico 1M (40 mL) e com salmoura saturada (25 mL). secou-se a fase orgânica (Na2S04) e concentrou-se em vazio para se obterem 3,8 g de um óleo castanho. -30-

Uu, ^

Cristalizou-se o produto de hexano:acetato de etilo 5:1 (25 mL), arrefeceu-se a 0°C, deixou-se lh e filtrou-se. lavou-se o bolo com hexano:acetato de etilo 5:1 (2x5 mL). Secou-se o bolo ao ar com sucção para se obterem 2,9 g (85%) de um sólido laranja claro. EXEMPLO 7

Preparação do Composto A

2

Materiais Ouant. mmol PM Composto A pMB 7 0,8 g 1,83 435 Nitrato cérico e de amónio 4,4 g 8,0 548,23 CH3CN 15 mL acetato de etilo 30 mL àgua desionisada 30 mL salmoura saturada 10 mL

Dissolveu-se o Composto A protegido com p-metoxibenzilo em acetonitrilo (15 mL). Adicionou-se a esta solução uma solução de nitrato cérico e -31- Utoj de amónio (4,4 g) em água (5 mL). A reacção completou-se tipicamente em 2h a 23°C, tal como se determinou por HPLC.

Condições de HPLC: Coluna C-8, CH3CN, água, ácido fosfórico, eluição gradiente de 50:50:0,1 a 90:10:0,1 em 20 minutos, caudal = 1,5 mL/min, detecção no UV a 252 nm, matéria prima tR=16,0 min, produto tR=9,0 min.

Diluiu-se a mistura reaccional com água desionisada (5 mL) e concentrou-se a cerca de metade do volume. Extraíu-se o produto da fase aquosa resultante com acetato de etilo (2 x 15 mL). Juntaram-se as fases orgânicas e lavou-se com água desionisada (2 x 10 mL) e com salmoura (10 mL). Concentrou-se a fase orgânica em vazio para se obter uma goma amarela. Isolou-se o produto por cromatografia sobre silicagel.

DETERMINAÇÃO DA TRANSCRIPTASE REVERSA

Esta análise determina a incorporação de monofosfato de guanosina tritiado pela transcriptase reversa de HIV recombinado (HIV RTr) (ou outra TR) em CDNA precipitável por ácido aos valores de Km de dGTP e poli r(C)*oligo d(G)i2-i8· Os inibidores da invenção prsente inibem esta incorporação.

As determinações foram levadas a cabo em Tris 55 mM (pH 8,2)-30 mM KC1-30 mM MgCl2-l mM dihidrotreitol-20pg de rC:dGi2.i8 (Pharmacia) por mL-8mM [3H]dGTP (New England Nuclear)-0,01% Triton X-100-50 mM ácido etileno g1icol-bis(P-amino-etil éter)-N,N,N',N'-tetracético (EGTA)-l mg de albumina de soro bovino por mL. Depois de 60 min. de incubação a 37°C, recolheu-se o material precipitável por ácido em filtros de fibra de vidro -32- Ιμ, ^ utilizando um aparelho semiautomático de colheita de células. Diluiram-se extractos de células bacterianas contendo TR até à gama em que a determinação é linear, e determinou-se a actividade quer na presença quer na ausência do inibidor. Também se utilizou como controlo o heterodímero purificado de TR de HIV-1 produzido em E. coli. Apresentam-se os resultados como concentração de inibidor necessária para conferir 50% de inibição (IC50 em peso), em nanomoles/litro. O Composto A evidenciou um IC50 em peso de 2 nM.

Para a determinação em duplo mutante (dm), utilizou-se TR AI7 na determinação. A TR AI7 é resistente a diversas aminopiridonas, tal como descrito em Numberg, J. H. et al., J. Virol., 65, 4887 (1991). Os resultados são dados sob a forma de IC50 dm, em nanomoles/litro. O Composto A evidenciou um IC5o dm de 85 nM.

DETERMINAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO CELULAR

Mediu-Se a inibição da proliferação de HIV em cultura de células pelo método de Numberg, J. H. et al, J. Virol, 65, 4887 (1991). Neste ensaio, infectaram-se células T-linfóides MT-4 com HIV-1 (de tipo selvagem, a não ser que se indique o contrário) utilizando um inoculo pré-determinado, e incubaram-se as culturas durante 24 h. Nessa altura, < ou = a 1% das células eram positivas por imunofluorescência indirecta. Lavaram-se então extensivamente as células e distribuiram-se por uma placa de cultura de 96 poços. Adicionaram-se a cada poço uma série de diluições sucessivas a metade do inibidor, e continuou-se a cultura durante mais 3 dias. Aos 4 dias após a infecção, 100% das células das culturas de controlo estavam infectadas. A acumulação de p 24 de HIV-1 estava directamente correlacionada com a proliferação do vírus. Definiu-se a -33- concentração inibidora em cultura celular como sendo a concentração de inibidor em nanomoles/litro que reduzia a proliferação da infecçào de pelo menos 95%, ou CIC95.

Porquanto a especificação supra revele os princípios da invenção presente, com exemplos apresentados com o propósito de ilustração, compreender-se-á que a prática da invenção engloba todas as variações, adaptações, ou modificações habituais, tal como se inserem no âmbito das reivindicações subsequentes, e suas equivalentes.

Lisboa, 9 de Novembro de 2000

LUIS SILVA CARVALHO Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um processo de síntese assimétrica do composto quiral com a estrutura

em que P é um grupo protector de amino; que inclui os passos de: (a) preparar uma mistura de um excesso de (lR,2S)-norefedrina N-substituida, com a estrutura OH

3 y na qual R é alquilo Cm, ou NR2 forma pirrolidinilo ou piperidinilo; com um excesso de ciclopropilacetileno e um excesso de um agente litiante seleccionado de entre n-butil-lítio ou sec-butil-lítio ou tert-butil-lítio, a uma gama de temperaturas de entre -78°C e 10°C, num solvente aprótico; (b) misturar com a mistura do passo (a) cerca de um equivalente de reagente com a estrutura -2-

em que P é tal como acima definido, e manter a mistura reaccional resultante a uma temperatura entre -78°C e -20°C; (c) terminar a reacção adicionando um doador de protões para se obter o composto pretendido
2. O processo conforme a Reivindicação 1 no qual no passo 8A) o solvente aprótico seja seleccionado de entre tetrahidrofurano, dioxano, éter dietílico, benzeno, 1,2-dimetoxietano, tolueno, n-octano, n-hexano. ciclohexano, e misturas destes.
3. O processo conforme a Reivindicação 1 no qual P seja um grupo protector de amino seleccionado de entre benzilo não substituído ou substituído com alquilo Cm, 4-metoxibenzilo, 4-nitrobenzilo, 4-clorobenzilo, 2,4-diclorobenzilo, 2,4-dimetoxibenzilo, 4-metlsulfinilbenzilo, 9-antrilmetilo, difenilmetilo ou N-trialquilsililo.
4. O processo conforme a Reivindicação 1 no qual P seja o grupo 4-metoxibenzilo.
5. O processo conforme a Reivindicação 1 no qual no passo (c) a fonte de protões seja seleccionada de entre ácido cítrico 1M e ácido acético 1M. -3-
6. O processo conforme a Reivindicação 1 no qual no passo (a), a (lR,2S)-N-pirrolidinil norefedrina tenha a estrutura OH

CH3 ô e a temperaturda mistura seja de cerca de -15°C; e no passo (b) a mistura reaccional resultante seja mantida a cerca de -40°C.
7. O processo conforme a Reivindicação 1 no qual no passo (a), a (lR,2S)-N-pirrolidinil norefedrina tenha a estrutura OH

o agente litiante seja n-butil-lítio, e a temperatura seja de cerca de -15°C; e no passo (b) a mistura reaccional resultante seja mantida a cerca de -40°C; e no passo (c), o composto pretendido seja obtido com um rendimento >85%, com ee >95%.
8. Um processo conforme qualquer das reivindicações 1 a 7, no qual ocorra um passo adicional entre os passos (a) e (b), isto é, a mistura do paso (a) seja aquecida a entre -10°C e 10°C, durante pelo menos 5 minutos, e depois arrefecida a uma temperatura entre -78°C e -20°C, antes do passo (b). -4- <r
9. Um processo conforme a reivindicação 8, no qual o passo adiciona] de aquecimento inclua aquecer a mistura do passo (a) seja quecida a entre -10°C e 0°C, durante entre 10 minutos e 60 minutos, e depois a mistura seja arrefecida a uma temperatura de pelo menos -40°C, antes do passo (b).
10. Um composto com a estrutura

na qual P seja um grupo protector de amino.
11. O composto da Reivindicação 10 em que P seja um grupo 4-metoxibenzilo. Lisboa, 9 de Novembro de 2000 LUIS SILVA CARVALHO Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON. 14 1200 USBOA