CZ370997A3

CZ370997A3 - Způsob asymetrické syntézy (-)-6-chlor-4-cyklopropylethinyl-4-trifluormethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-onu

Info

Publication number: CZ370997A3
Application number: CZ973709A
Authority: CZ
Inventors: Andrew S. Thompson; Edward G. Corley; Edward J. J. Grabowski; Nobuyoshi Yasuda
Original assignee: Merck & Co., Inc.
Priority date: 1995-05-25
Filing date: 1996-05-21
Publication date: 1998-04-15
Also published as: WO1996037457A1; US5633405A; GR3034897T3; TW402581B; SK156997A3; HUP9802566A2; KR100399511B1; AU5866796A; HU223565B1; YU31496A; CA2220389A1; BR9608839A; HRP960233B1; UA56137C2; CZ292848B6; CA2220389C; EP0828703B1; ATE196463T1; ES2151666T3; HRP960233A2

Description

Popisuje se zlepšený způsob syntézy (-)-6-chloro-4-cyklopropylethinyl-4-trifluoromethyl-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-onu, který zahrnuje chirální adici na ketonový meziprodukt za poskytnutí terciárního alkoholu. Sloučenina je použitelná při inhibici reverzní transkriptázy HIV (i rezistentních druhů), prevenci infekce HIV, léčení 10 infekce HIV a léčení AIDS a/nebo ARC jak ve formě základní sloučeniny, tak i farmaceuticky přijatelných solí, složek farmaceutických prostředků i v kombinaci s jinými antivirovými, antiinfekčními a imunomodulačními látkami, antibiotiky nebo vakcínami.

Dosavadní stav techniky

Tento spis navazuje na spis Měrek 18793IB, který navazuje na spis 187931A, který navazuje na spis 18793, podaný 7. 8. 1992 jako U.S.S.N. 07/926,607 a 19345.

Retrovirus označovaný virus lidské imunodeficience (HIV) je

Činitelem vyvolávajícím komplexní onemocnění, které zahrnuje progresivní destrukci imunitního systému (syndrom získané imunologické nedostatečnosti, AIDS) a degeneraci centrálního a periferního nervového systému. Virus býval také označován jako

LAV, HTLV-III nebo ARV. Společným rysem replikace retrovirů je reverzní transkripce genomové RNA virem kódovanou reverzní transkriptázou za vytvoření kopií DNA sekvencí HIV, což je nezbytný krok při replikaci viru. Je známo, že některé sloučeniny jsou inhibitory • ·

reverzní transkriptázy a jsou účinnými prostředky při léčení AIDS a podobných onemocnění; jde například o azidothymidin neboli AZT.

V nukleotidové sekvenci HIV je v jednom otevřeném čtecím rámci přítomen gen pol (Ratner, L. a další, Nátuře, 313, 277 (1985). Homologie sekvence aminokyselin poskytuje důkaz, že sekvence poj kóduje reverzní transkriptázu, endonukleázu a HIV proteázu (Toh, H. a další, EMBO J., 4, 1267 (1985); Power, M. D. a další, Science, 231, 1567 (1986); Pearl, L. H. a další, Nátuře, 329, 351 (1987).

Přihlašovatelé ukazují podstatně zlepšenou syntézu inhibitoru reverzní transkriptázy HIV se strukturou

s názvem (-)-6-chloro-4-cyklopropyl-ethinyl-4-trifluoromethyl1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-on a označovanou dále „sloučenina A“. Tato sloučenina je vysoce účinná, a to dokonce proti reverzní transkriptáze HIV, odolné k jiným antivirovým sloučeninám působícím proti AIDS.

Přihlašovatelé popisují asymetrickou syntézu sloučeniny A. Dosud používané způsoby vyžadovaly meziprodukt ve formě racemátů s nízkým celkovým výtěžkem. Předkládaný vynález se týká přímé syntézy opticky aktivní sloučeniny A chirální adicí na ketonový meziprodukt za poskytnutí terciárního alkoholu s enantiomerním přebytkem větším než 95 %. Neočekávané je také to, že reakce acetylidu s trifluormethylketonem poskytne opticky aktivní produkt. V předkládaném vynálezu se toho dosahuje chirálním • · • · aminoalkoholem, který způsobí průběh adiční reakce asymetrickou cestou.

Přihlašovatelé rovněž objevili, že zahřátí (následované ochlazením) směsi lithiovaného chirálního aminoalkoholu a cyklopropylacetylenu před přídavkem trifluoroketonu, zvýší enantiomerní přebytek z přibližně 85 % při typickém průběhu na více než přibližně 95 %. Neobvykle vysoká míra optické aktivity (větší než 95 % ee) činí tuto metodu výhodnou a praktickou.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje způsob asymetrické syntézy chirální

P kde P znamená ochrannou skupinu aminoskupiny;

který zahrnuje kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1 R,2S)-N-substituovaného norefedrinu vzorce

kde R znamená C1-4 alkyl nebo skupina -NR₂ tvoří pyrrolidinyl nebo piperidinyl;

s přebytkem cyklopropylacetylenu a přebytkem lithiačního činidla zvoleného z n-butyllithia nebo sek.-butyllithia nebo terc.-butyllithia v rozmezí teplot mezi přibližně - 78 °C a přibližně 10 °C v aprotickém rozpouštědle;

(b) smísení směsi z kroku (a) s přibližně jedním ekvivalentem reaktantů vzorce

kde P znamená ochrannou skupinu aminoskupiny;

a udržování výsledné reakční směsi při teplotě mezi přibližně

- 78 °C a přibližně - 20 °C;

(c) ukončení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny.

Jedním z provedení tohoto vynálezu je způsob asymetrické syntézy chirální sloučeniny N-(4-methoxybenzyl)-6-chloro-2-[(R)cyklopropylethinylhydroxytrifluoromethylj-methylanilinu vzorce zahrnující kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1 R,2S)-N-substituovaného

• ·

-5kde R znamená Ci-₄ alkyl nebo skupina -NR₂ tvoří pyrrolidinyl nebo piperidinyl;

s přebytkem cyklopropylacetylenu a přebytkem lithiačního činidla zvoleného z n-butyllithia nebo sek.-butyllithia nebo terc.butyllithia v teplotním rozmezí mezi přibližně - 78 °C a přibližně 10 °C v aprotickém rozpouštědle;

(b) smísení směsi z kroku (a) s přibližně jedním ekvivalentem reaktantu N-(4-methoxybenzyl)-6-chloro-2-(2-trifluoro-1 oxoethyl)-anilinu vzorce

a udržování výsledné reakční směsi v teplotním rozmezí přibližně - 78 °C až přibližně - 20 °C;

(c) zastavení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny.

Dalším z provedení tohoto vynálezu je způsob asymetrické syntézy chirální sloučeniny vzorce

·· ·· ·· · ·· ·· • ·· · · · · · « ·· · • · · · · · ···· • «·· · · · * « ··· « · • ···· · · · «··· 99 99 999 99 99

- 6 kde P znamená ochrannou skupinu aminoskupiny;

zahrnující kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1R,2S)-N-pyrrolidinylnorefedrinu vzorce

OH

s přebytkem cyklopropylacetylenu a přebytkem lithiačního činidla zvoleného z n-butyllithia nebo sek.-butyllithia nebo terc.butyllithia při teplotě přibližně -15 °C v aprotickém rozpouštědle;

kde P znamená ochrannou skupinu aminoskupiny a udržování výsledné reakční směsi při teplotě přibližně - 40 °C (c) zastavení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny.

Dalším z provedení tohoto vynálezu je způsob asymetrické syntézy chirální sloučeniny N-(4-methoxybenzyl)-6-chloro-2-[(R)cyklopropylethinylhydroxytrifluoromethylj-methylanilinu vzorce

zahrnující kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1 R,2S)-N-pyrrolidinylnorefedrinu vzorce

s přebytkem cyklopropylacetylenu a přebytkem n-butyllithia při teplotě přibližně -15 °C v aprotickém rozpouštědle;

OMe a udržování výsledné reakční směsi při teplotě přibližně 40 °C;

(c) zastavení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny v > 85 % výtěžku a > 95 % enantiomerním přebytku.

Každý z výše uvedených způsobů může být pro zvýšení enantiomerního přebytku modifikován dodatečným zahříváním (následovaným ochlazením) mezi krokem (a) a krokem (b), tj. směs z kroku (a) se zahřeje na teplotu mezi přibližně - 10 °C a přibližně 10 °C po dobu alespoň 5 min, potom se před přídavkem trifluoroketonu ochladí na teplotu mezi přibližně - 78 °C a přibližně

- 20 °C. Jestliže teplota z kroku (a) již spadá do rozmezí mezi přibližně

- 10 °C a přibližně 10 °C, zvýšení teploty pravděpodobně enantiomerní přebytek nezvýší.

Výhodnou úpravou pro zvýšení enantiomerního přebytku je dodatečné zahřívání (následované ochlazením) před krokem (a) a krokem (b), tj. směs z kroku (a) se zahřeje na teplotu mezi přibližně

- 10 °C a přibližně 0 °C po dobu mezi přibližně 10 minutami a přibližně 60 minutami a potom se před přídavkem trifluoroketonu ochladí na teplotu alespoň přibližně - 40 °C. Vynález rovněž zahrnuje sloučeninu vzorce

kde P znamená ochrannou skupinu aminoskupiny.

Další sloučenina zahrnovaná vynálezem N-(4-methoxybenzyl)-6chloro-2-[(R)-cyklopropylethinylhydroxytrifluoromethyl]-methylanilin vzorce

Nejprve se přebytek (1R,2S)-N-substituovaného norefedrinu smísí v aprotickém rozpouštědle s přebytkem cyklopropylacetylenu a protony kyseliny se odstraní lithiací přebytkem n-butyllithia nebo sek.-butyllithia nebo terc.-butyllithia. Výsledná směs se udržuje na teplotě v rozmezí mezi přibližně - 78 °C a přibližně 10 °C, s výhodou je přibližně 15 °C.

Jestliže se výsledná směs zahřeje na teplotu mezi přibližně - 10 °C a přibližně 10 °C, produkt 6 se produkuje s podstatně vyšším enantiomerním přebytkem, typicky přibližně 95 % namísto přibližně 85 % nebo méně. Některá hlediska vynálezu tento krok zahřívání nepoužívají, jiná ano.

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu je skupinou P jakákoliv vhodná skupina chránící aminoskupinu a zahrnuje bez omezení benzyl nesubstituovaný nebo substituovaný Ci_₄ alkylem; paramethoxybenzyl; paranitrobenzyl; parachlorobenzyl; 2,4dichlorobenzyl; 2,4-dimethoxybenzyl; 4-methylsulfinylbenzyl; 9anthrylmethyl; difenylmethyl; nebo N-trialkylsilylové skupiny podle práce: T. W. Greene a další, Protective qroups in Orqanic Synthesis, 2. vydání, John Wiley 1991, str. 309 - 405. Výhodnou skupinou chránící aminoskupinu je p-methoxybenzyl. Jakmile dojde k zahájení • · • · reakce přídavkem přibližně jednoho ekvivalentu ketonu 5, trifluoroketonu, výsledná reakční směs se udržuje při teplotě mezi přibližně - 78 °C a přibližně - 20 °C, s výhodou přibližně při - 40 °C. Reakce se provádí v aprotickém rozpouštědle nebo etherickém rozpouštědle. Příklady aprotických rozpouštědel jsou THF, dioxan, Et₂O, benzen, DME, PheMe, n-oktan, n-hexan a cyklohexan nebo jejich směsi. Výhodným rozpouštědlem je THF. Doba inkubace reakce je alespoň 2 až 3 minuty po přídavku ketonu. V tomto místě se reakce v reakční směsi ukončí přídavkem zdroje protonů ve vodném médiu, typicky mírné kyseliny. Vhodný je jakýkoliv takový zdroj protonů, výhodným zdrojem protonů je například 1M kyselina citrónová nebo 1M kyselina octová.

Chirální produkt 6 se čistí běžnými způsoby.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou mít asymetrická centra a mohou se vyskytovat, pokud není uvedeno jinak, jako racemáty, racemické směsi nebo jednotlivé diastereomery nebo enantiomery, přičemž předkládaný vynález zahrnuje všechny formy izomerú. Termín (+/-) má zahrnovat (+) optické izomery nebo (-) optické izomery nebo jejich směsi.

Jestliže se jakákoliv proměnná (například R) vyskytuje v jakékoliv složce nebo ve vzorci I více než jednou, její definice je v každém takovém případě nezávislá na definici v jakémkoliv jiném případě výskytu. Zároveň platí, že kombinace substituentů a/nebo proměnných jsou přípustné pouze v tom případě, pokud těmito kombinacemi vzniknou stabilní sloučeniny.

Ve smyslu vynálezu mimo případy, kde je to zvláště vyznačeno, má zahrnovat výraz „alkyl“ jak nasycené alifatické uhlovodíkové skupiny se specifikovaným počtem atomů uhlíku s rozvětveným řetězcem, tak i skupiny s řetězcem přímým; jestliže počet atomů uhlíku není specifikován, termín „alkyl“ má zahrnovat nasycené alifatické uhlovodíkové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku, jak rozvětvené tak • · • ·

s přímým řetězcem. Používané výrazy „halogen“ nebo „halo“ znamenají fluor, chlór, bróm a jód.

Sloučenina A může být syntetizována následujícím způsobem.

pivaloylchlorid methylenchlorid vodný Na₂CO₃

n-8uLi/THF

EtOCOCF₃

EtOH/HCI potom NaOH

p-methoxybenzylchlorid nebo jiný P-X molek.síta 40 nm/toluen

X = halo • ·

SCHÉMA I (pokračování)

P

n-BuLi/hexan

THF/0 °C až -40 °C $

nitrátoceričitan amonný

Sloučenina A ·· • · · · ···· · · · » ♦ · · · · · · * · · • ··· 9 9 9 · « ··· « · • ···· ··· ···· ·· ·· ··· ·· ··

- 13 Cyklopropylacetylen, který je reaktantem při vytváření 6, se připravuje podle následujících alternativních schémat:

SCHÉMA HA

PCIg

t-BuOK/DMSO

(42%) které se rovněž popisuje v publikaci C. E. Hudson a další, J.

io Am. Chem. Soc., 94, 1158 (1972) a W. Schoberth a další, Synthesis,

703 (1972).

SCHÉMA IIB

n-BuLi/cyciohexan

80°C/3h nasycený NH₄CI

Li

2o Schéma IIB je ilustrováno v příkladu 3 a představuje výhodné provedení.

Sloučenina A je použitelná při přípravě a provedení screeningu na antivirové sloučeniny. Sloučenina A je například použitelná pro izolaci enzymových mutant, které jsou vynikajícími nástroji screeningu 25 pro hledání účinnějších antivirových sloučenin. Navíc je sloučenina A použitelná při určování nebo vytváření vazebného místa jiných antivirových látek na reverzní transkriptázu HIV, například • ·

♦ · ·· • · • · ··· · kompetitivní inhibici. Sloučenina A je tedy produktem pro komerční použití k těmto účelům.

Sloučenina A je použitelná při inhibici reverzní transkriptázy HIV, při prevenci nebo léčení infekce virem lidské imunodeficience (HIV) a léčení následných patologických stavů, jako je AIDS. Léčba AIDS nebo prevence nebo léčení infekce HIV jsou definovány jako zahrnující bez omezení léčení širokého rozsahu stavů infekce HIV: AIDS, ARC (AIDS related complex), jak symptomatický tak asymptomatický a skutečnou nebo potenciální expozici viru HIV. Například sloučenina A je použitelná pro léčení infekce HIV po podezření na expozici viru HIV v minulosti, například krevní transfuzí, výměnou tělesných tekutin, kousnutím, náhodným píchnutím jehlou nebo expozicí krvi pacienta v průběhu chirurgického zákroku.

Další konkrétní výhodou sloučeniny A je silná inhibice reverzní transkriptázy HIV rezistentní k jiným antivirovým prostředkům, jako je L-697,661, což je 3-(((4,7-dichloro-1,3-benzoxazol-2-yl)methyi]amino)-5-ethyl-6-methylpyridin-2(1H)-on; nebo L-696,229, což je 3-(2(1,3-benzoxazol-2-yl)ethyl]-5-ethyl-6-methylpyridin-2(1 H)-on; nebo AZT.

Pro tyto účely může být sloučenina A podávána orálně, parenterálně (včetně subkutánních injekcí, intravenózních, intramuskulárních, intrasternálních injekcí nebo infuzí), inhalačním sprejem nebo rektálně v prostředcích ve formě jednotkových dávek obsahujících běžné netoxické farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans a pomocné látky.

V rámci předkládaného vynálezu se tedy dále poskytuje způsob léčení a farmaceutický prostředek pro léčení infekce HIV a AIDS. Léčení zahrnuje podávání farmaceutického prostředku obsahujícího farmaceutický nosič a terapeuticky účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu pacientovi v případě potřeby.

• 4 • · • · · 4 4 44« · 4 « · • · · 4 4 4 44 44

44444 4 4 · 4444 4 • 4444 444 ···· 44 44 444 44 44

- 15 Tyto farmaceutické prostředky mohou být ve formě suspenzí nebo tablet podávaných orálně; nosních sprejů; sterilních prostředků pro injekce, např. ve formě sterilních injikovatelných vodných nebo olejovitých suspenzí, nebo čípků.

Pokud se prostředky podávají orálně ve formě suspenze, připravují se podle v oboru známých způsobů, vytváření farmaceutických prostředků a mohou obsahovat mikrokrystalickou celulózu pro dodání potřebného objemu, kyselinu alginovou nebo alginát sodný jako suspendující prostředek, methylcelulózu jako prostředek pro zvyšování viskozity a sladidla/ochucovací prostředky známé v oboru. Jako tablety s okamžitým uvolňováním mohou tyto prostředky obsahovat mikrokrystalickou celulózu, fosforečnan vápenatý, škrob, stearan hořečnatý a laktózu a/nebo jiné nosiče, pojivá, plniva, rozvolňovadla, ředidla a kluzné látky známé v oboru. Při podávání ve formě nosního aerosolu nebo inhalace mohou být prostředky připraveny podle známých způsobů vytváření farmaceutických prostředků a mohou být připraveny jako roztoky ve fyziologickém roztoku, obsahující benzylalkohol nebo jiné vhodné ochranné látky, látky usnadňující absorpci a tím zvyšující biologickou dostupnost, fluorované uhlovodíky a/nebo jiné solubilizační nebo dispergační prostředky známé v oboru.

Roztoky nebo suspenze pro injekce mohou být vytvořeny známým způsobem s použitím vhodných netoxických parenterálně přijatelných ředicích látek nebo rozpouštědel, jako je mannitol, 1,3butandiol, voda, Ringerův roztok nebo izotonický roztok chloridu sodného nebo vhodných dispergujících nebo smáčejících a suspendujících látek, jako jsou sterilní fixované oleje včetně syntetických mono- nebo diglyceridů a mastné kyseliny, včetně kyseliny olejové. Při rektálním podávání ve formě čípků mohou být prostředky připraveny míšením léčiva s vhodným nedráždivým vehikulem, jako je kakaové máslo, syntetické glyceridové estery nebo

polyethylenglykoly, které jsou při běžných teplotách pevné, ale zkapalňují a/nebo se rozpouštějí v rektální dutině za uvolnění účinné látky.

Sloučenina A může být podávána orálně člověku v rozmezí dávek 1 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti v dělených dávkách. Výhodným dávkovacím rozmezím je 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti, podávaných orálně v dělených dávkách. Dalším výhodným rozmezím dávkování je 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, podávaným orálně v dělených dávkách. Pro kombinovanou terapii s analogy nukleosidů je pro sloučeniny podle vynálezu výhodná dávka 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, podávaná orálně v dělených dávkách a 50 mg až 5 g/kg tělesné hmotnosti pro analogy nukleosidů podávané orálně v dělených dávkách. Je však třeba rozumět, že konkrétní dávkování a četnost dávek pro určitého pacienta se může měnit a bude záviset na řadě faktorů včetně účinnosti specifické použité sloučeniny, metabolické stabilitě a délce působení sloučeniny, věku, tělesné hmotnosti, celkovém zdravotním stavu, pohlaví, dietě, způsobu a době podávání, rychlosti vylučování, kombinaci léčiv, vážnosti konkrétního zdravotního stavu a ošetřovaném pacientovi.

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1

Výroba 4-chlorofenylpivalamidu

Cl pivaloylchlorid

Cl c₆h₆cin

Mh .= 127,99 toluen/Na₂CO₃

CnHuCINO

Mh.= 211,66

	«· • · « • ··<· · - 17 -	·· ·· • · · · 9 9 · · 999 99 9 9 9 9 99 99	• · · ·· 99 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9999 9 • · · · 999 99 99
Materiály	Množství	mmol	Mol. hmot.
4-chloroanilin	76 g	596	127,57
pivaloylchlorid (d=0,979)	74 ml	600	120,58
toluen	600 ml
nasycený Na₂CO₃	95 ml
deion.voda	225 ml

K roztoku 4-chloroanilinu (76 g) v toluenu (600 ml) byl přidán nasycený roztok Na₂CO₃ (95 ml). Směs byla ochlazena na 10 °C a po kapkách bylo v průběhu 40 minut přidáváno 74 ml 5 pivaloylchloridu. Reakční směs byla 60 min míchána při 5 až 10 °C a postup reakce byl sledován HPLC.

Přídavek pivaloylchloridu k anilinu byl exotermní.

Podmínky HPLC: kolona C-8, CH₃CN, voda, kyselina fosforečná; gradientově eluce od 40 : 60 : 0,1 do 80 : 20 : 0,1 v průběhu 20 min, io průtok = 1,0 ml/min, detekce UV 245 nm, výchozí materiál t_R = 7,2 min, pivalamid t_R = 12,6 min.

Produkt byl izolován filtrací a promyt třikrát 75 ml deionizované vody a sušen za odsávání na vzduchu 10 min. Produkt byl sušen při 40 °C ve vakuové sušárně za průchodu dusíku po dobu 16 hod, čímž 15 bylo získáno 108,5 g produktu jako jemných bílých jehliček (86 %).

Příklad 2

Výroba 4-chloroketoanilinu 4

CnHuCINO

Mh.= 211,66

·· • 0 0 0 0 V	00 00 0 0 0 • 0 0 •00 · · 0 0 0 0 ·♦ _ 00	• 00 00 ·· 0000 0 · 0 ·· • 0 000· 0 • 0 0 0 000 ·· 00
	···♦ - 18 -
	O i\|
EtOH / HCI	^:'ΊΓι ^CFj
potom NaOH	U-_N„, C₈H_sF₃CINO
	Mh = 223,58
	4
Materiály	Množství	mmol	Mol. hmot.
4-chlorofenylpivalamid	10 g	47,2	211,69
n-BuLi/hexan (2,5 M)	38 ml	95
ethyltrif luoroacetát(d=1,194)	6,7 mi	56,6	142,08
THF	75 ml
ethanol	90 ml
6N HCI	59 ml	240
hexan	90 ml
2N NaOH	15 ml
deionizovaná voda	350 ml

V 500 ml tříhrdlé baňce bylo 10 g pivalamidu rozpuštěno v suchém THF (75 ml) a směs byla ochlazena na 0 °C. K tomuto roztoku byl přidán po kapkách roztok n-BuLi/hexan (2,5 M, 38 ml), io přičemž teplota byla ponechána vzrůst na + 15 °C. Šarže byla ponechána zrát 2 hod při 0 °C.

Přídavek prvního ekvivalentu n-BuLi k pivalamidu je vysoce exothermní. Vzrůst teploty byl řízen rychlostí přidávání.

K výsledné světležluté suspenzi byl přidán čistý ethyltrifluoroacetát (6,7 ml) a vnitřní teplota byla ponechána stoupnout na + 10 °C. Postup reakce byl monitorován HPLC.

- 19 Podmínky HPLC: kolona C-8, CH₃CN, voda, kyselina fosforečná; gradientová eluce od 40 : 60 : 0,1 do 80 : 20 : 0,1 v průběhu 20 min, průtok = 1,0 ml/min, detekce UV 245 nm, ketopivalamid t_R = 11,6 min, výchozí pivalamid t_R = 12,6 min. Bylo zjištěno typicky 85 % produktu a 10 až 15 % nezreagovaného pivalamidu.

Reakce byla ukončena přídavkem 6N HCI (10 ml) a deionizované vody (20 ml).

Analýza HPLC v tomto místě ukázala 13,1 g (90 %) produktu.

Roztok byl ve vakuu zakoncentrován na přibližně 50 ml a promyt ethanolem (50 ml) pro odstranění hexanu a THF. Ke směsi byla přidána 6N HCI (40 ml) a směs byla zahřívána pod zpětným chladičem (80 °C) po dobu 1 hod.

Analýza HPLC ukazuje 85 až 90 % ketoanilinu, 10 % nezreagovaného pivalamidu. Acylovaný materiál přitom podléhá hydrolýze, zatímco nezreagovaný pivalamid zůstává beze změny. Výtěžek v tomto místě byl 7,78 g (74 %).

Směs byla zakoncentrována ve vakuu na přibližně 50 ml, přičemž se vytvořila sraženina (pravděpodobně sůl produktu s kyselinou chlorovodíkovou. Destilace byla přerušena a směs byla ochlazena na 0 °C. Po 1 hod zrání byla šarže zfiltrována a promyta hexanem (3 x 30 ml).

Praní hexanem odstraní z produktu nezreagovaný pivalamid. Pevná látka se kontroluje HPLC na úplné odstranění pivalamidu. Filtrát a prací rozpouštědlo typicky obsahují 1,2 až 1,5 g produktu (8 až 12 %). Většina ztráty produktu je ve vodném filtrátu.

Sůl byla sušena ve vakuové sušárně 16 hod při 40 °C za získání 10,4 g pevné látky s čistotou 71,4 % hmotnostních (výtěžek 70 %). Byla vytvořena kaše soli v destilované vodě (260 ml) a neutralizována na pH přibližně 6 až 7 2N NaOH (15 ml). Z důvodů rozkladu produktu bylo důležité nezvýšit pH nad 9,0.

Výsledná světležlutá pevná látka byla izolována filtrací a promyta deionizovanou vodou (2 x 25 ml). Produkt byl sušen ve vakuové sušárně 16 hod při 40 °C za získání 6 g ketoanilinu s čistotou 96,6 % hmotnostních (výtěžek 54 %). Produkt se dále čistí 5 rekrystalizací z hexanu.

Příklad 3

Výroba N-4-methoxvbenzylketoanilinu 5

O	O \|\|
^c1YY'cf₃	p-methoxybenzyl- CL	pv^AcF₃
	chlorid I
nh₂	síta 40 nm/toluen	NH I
c₈h₅f₃cino
Mh = 223,58		XX₀ Me
4		Ci₆H₁₃F₃CINO₂ Mh.= 343,735

Materiály	Množství	mmol	Mol.hmot.
ketoanilin	15,5 g	69,5	223,58
p-methoxybenzylchlorid	10,9 g	69,8
molekulární síta 40 nm	90 g
toluen	70 ml
aceton	500 ml
hexan	120 ml

Do 250 ml baňky byl vložen ketoanilin (15,5 g), aktivovaná 40 nm (4 A) molekulární síta (50 g) a toluen (75 ml). Směs byla míchána hod pod dusíkem při 23 °C. Analýza HPLC ukázala směs produktu a výchozího materiálu v poměru přibližně 1:1.

- 21 Podmínky HPLC: kolona C-8, CH₃CN, voda, kyselina fosforečná; izokratická eluce od 65 : 35 : 0,1 v průběhu 20 min, průtok = 1,0 ml/min, detekce UV 260 nm, toluen t_R = 5,7 min, výchozí ketoanilin t_R = 6,5 min, produkt t_R = 15,0 min. Typicky bylo přítomno 25 % 5 toluenu.

Do reakce bylo přidáno 40 g čerstvých molekulárních sít a směs byla míchána další 3 dny při 23 °C. Reakce byla pokládána za skončenou, pokud zůstalo méně než 2 % výchozího materiálu. Pro odstranění HCI ze systému je možno alternativně použít zásadité io aluminy nebo silikagelu.

Směs byla filtrována přes celit a promývána acetonem (7 x 75 ml), dokud z celitu nebyla vyprána většina žlutého zbarvení. Filtrát byl zakoncentrován a bylo získáno 27 g žlutooranžového oleje, který stáním ztuhne. Pevná látka byla čištěna rozpuštěním v horké směsi 15 hexanů (100 ml). Směs byla ochlazena na pokojovou teplotu, potom v ledové lázni na 0 °C. Po stání 1,5 hod byla směs zfiltrována a promyta studenou směsí hexanů (2x10 ml). Získaný materiál byl sušen na vzduchu s odsáváním po dobu 10 min, a potom sušen ve vakuové sušárně 2 hod při 40 °C. Bylo získáno 20,5 g (86 %) 2o světležlutého prášku.

Příklad 4

Výroba cyklopropylacetylenu

n-BuLj/cyclohexan

80°C / 3h

C_sH₇CI

Mh.= 102,57

nasycený NH₄CI
	c₅h₆

Mh. = 66 * ·

Materiály	Množství	mmol	Mol.hmot.
5-chloro-1-pentin	10g	98	102,57
n-BuLi/cyklohexan (2,0 M)	122 ml	244
cyklohexan	80 ml
nasycený NH₄CI	50 ml

K roztoku 5-chloro-1-pentinu v cyklohexanu (80 ml) při 0 °C pod dusíkem bylo přidáno n-butyllithium v cyklohexanu (2,0 M, 122 ml). Směs byla zahřívána 5 hod při 75 °C.

Přídavek n-butyllithia k alkinu je exothermní; teplota v průběhu tohoto přidávání se udržuje pod 5 °C s použitím lázně voda - led.

Postup cyklizačního kroku se monitoruje HPLC. Reakce se pokládá za kompletní, pokud je zjištěný výtěžek větší než 90 %.

Podmínky HPLC: fenylová kolona CH₃CN, voda, kyselina fosforečná; izokratická eluce od 50 : 50 : 0,1 v průběhu 20 min, průtok = 1,0 ml/min, detekce UV 195 nm, výchozí materiál t_R = 7,5 min, cyklopropylacetylen t_R = 6,0 min. Produkt měl faktor odezvy, který byl 20 x vyšší než u výchozího materiálu.

Jakmile byl krok cyklizace úplný, reakce byla ochlazena na 0 °C a ukončena nasyceným roztokem NH₄CI. Testování organické fáze HPLC ukázalo 5,5 g cyklopropylacetylenu (výtěžek 85 %).

Produkt byl čištěn frakční destilací přes kolonu 152 x 12,7 mm, naplněnou 4 mm skleněnými kuličkami. Shromažďuje se frakce s teplotou varu mezi 45 - 75 °C. Postupem se získá 4,2 g (65 %) cyklopropylacetylenu jako bezbarvého oleje.

• ·

Příklad 5

Výroba aminoalkoholu

O

c₅h₆

Mh.= 66

C₁₆H₁₃F₃CINO₂

Mh.= 343

C₁₃H₁₉NO

Mh .= 205

n-BuLi/cyklohexan THF/0 °C až -40 °C

C₂₁Hi₉F₃CINO₂

Mh .= 409

20
Materiály	Množství	mmol	Mol. hmot.
keton	10 g	29,1	343
1 R,2S-N-pyrrolidinylnorefedrin	13,1g	64	205
cyklopropylacetylen (d=0,8)	5,3 ml	64	66
n-BuLi (2,6 M v cyklohexanu)	50 ml	125

·· ·· ·· · ·· • · · 9 9 ·«· 9 9 9 9 • 99 ··· · · 99 • · ♦ · · · · · « 9 · · · · • · · · · · « * ···· ·· ·· ··» ·· ·«

-24 80 ml ml ml

THF (KF=20 pg/ml)

1M kyselina citrónová ethylacetát

Pyrrolidinylefedrin (13,1 g) byl rozpuštěn v THF (55 ml) a směs byla ochlazena na - 15 °C. Ke směsi při - 15 °C pod dusíkem byl přidán čistý cyklopropylacetylen (5,3 ml) a po kapkách n-butyilithium (50 ml). Směs byla ponechána stát 30 min při - 5 až 0 °C a potom 5 ochlazena na - 55 °C.

Přídavek n-butyllithia byl exothermní a teplota byla udržována v rozmezí - 5 až 0 °C rychlostí přidávání.

Keton (10 g) byl rozpuštěn v THF (25 ml) pod dusíkem a přidán k aniontové směsi v průběhu 15 min, což dovolilo zvýšení vnitřní io teploty v průběhu přidávání na - 40 °C. Výsledný světleoranžový roztok byl ponechán stát 60 min při - 40 °C a reakce byla ukončena přídavkem 1M kyseliny citrónové (45 ml) a ethylacetátu (75 ml). Reakce byla ohřátá na pokojovou teplotu a vrstvy byly odděleny. Organické vrstvy byly promyty 45 ml 1M kyseliny citrónové. Reakční 15 směs byla testována HPLC na procento konverze a enantiomerní přebytek produktu.

Podmínky HPLC: kolona C-8, CH₃CN, voda, kyselina fosforečná; izokratická eluce od 65 : 35 : 0,1 v průběhu 20 min, průtok = 1,0 ml/min, detekce UV 252 nm, výchozí materiál t_R = 12,8 min, produkt 20 t_R = 10,3 min.

Podmínky chirální HPLC: kolona se stacionární amylózovou fází, izokratická eluce hexan : izopropanol 85 : 15, průtok = 1,0 ml/min, detekce UV 252 nm, výchozí materiál t_R = 4,9 min, většinový enantiomer t_R = 5,5 min, menšinový enantiomer t_R = 25,0 min.

Enanmtiomerní přebytek byl 96,5 0 a přeměna při reakci byla % (6 % výchozího materiálu). Výtěžek reakce byl 85 %. Produkt byl • ·

-25 čištěn smísením s roztokem heptan : toluen 10 : 1 (65 ml) a mícháním 18 hod při 23 °C. Roztok byl izolován filtrací a sušen v sušárně při 35 °C za získání 9,5 g (80 %) produktu jako světležlutého prášku.

Příklad 6

Výroba benzoxazinonu

Materiály	Množství	mmol	Mol. hmot.
aminoalkohol	3,2 g	7,8	409
fosgen v toluenu (1,93 M)	4,6 ml	8,89
triethylamin (d=0,726)	5,4 ml	39	101
THF (KF < 100 pg/ml)	15 ml
deionizovaná voda	15 ml
EtOAc	45 ml
směs hexanů	30 ml
1M kyselina citrónová	40 ml
nasycený roztok soli	25 ml

Aminoalkohol byl rozpuštěn v THF (15 ml) a ochlazen na -10 °C pod dusíkem. Ke směsi byl přidán triethylamin (5,4 ml) a fosgen v toluenu (4,6 ml). Přídavek fosgenu byl exothermní a teplota byla ·· ·· ·· · ·* ·· ···· ♦ · ·· ♦ · · ♦ • · · · · · · · · · • ····· · · · ««·· · • · · · · · · · ··· · ·· ·· ·«· · · ··

- 26 udržována pod 20 °C rychlostí přidávání. Postup reakce byl monitorován HPLC a ukončení nastalo typicky po 15 min.

Podmínky HPLC: C-8 kolona, CH₃CN : voda kyselina fosforečná, gradientově eluce od 50 : 50 : 0,1 do 90 : 10 : 0,1 v průběhu 20 min, průtok = 1,5 ml/min, detekce UV 252 nm, výchozí materiál t_R = 14,6 min, produkt t_R = 16,0 min.

Reakční směs byla ochlazena na 0 °C a reakce byla ukončena ledovou vodou (15 ml) a ethylacetátem (20 ml). Pro rozbití případných emulzí byl použit nasycený roztok soli. Organická vrstva byla odstraněna a vodná fáze byla extrahována ethylacetátem (15 ml). Spojené organické vrstvy byly promyty 1M kyselinou citrónovou (40 ml) a nasyceným roztokem soli (25 ml). Organická vrstva byla sušena (Na₂SO₄) a koncentrována ve vakuu za získání 3,8 g hnědého oleje.

Produkt byl krystalizován ze směsi hexan : ethylacetát 5 : 1 (25 ml), ochlazen na 0 °C, ponechán stát 1 hod a zfiltrován. Filtrační koláč byl promyt ledovou směsí hexan : ethylacetát 5 : 1 (2 x 5 ml). Koláč byl sušen na vzduchu za odsávání a bylo získáno 2,9 g (85 %) světleoranžové pevné látky.

Příklad 7

Výroba sloučeniny A

Sloučenina A

Mh.= 435,89

-27• »

• ·	• ·	• · *
• · ·	• *	•	•	•
• · ·	• · ·	•	• · ·	• ·
< • · ·	• 9 • ♦	• ·· »	♦ ·	• ·

Materiály	Množství	mmol	Mol. hmot.
PMB sloučenina A, 7	0,8 g	1,83	435
nitrátoceričitan amonný	4,4 g	8,0	548,23
CH₃CN	15 ml
ethylacetát	30 ml
deionizovaná voda	30 ml
nasycený roztok soli	10 ml

Sloučenina A chráněná p-methoxybenzylovou skupinou byla rozpuštěna v CH₃CN (15 ml). K roztoku byl přidán roztok nitrátoceričitanu amonného (4,4 g) ve vodě (5 ml). Reakce byla ukončena typicky po 2 hod při 23 °C podle analýzy HPLC.

Podmínky HPLC: C-8 kolona, CH₃CN : voda kyselina fosforečná, gradientová eluce od 50 : 50 : 0,1 do 90 : 10 : 0,1 v průběhu 20 min, průtok = 1,5 ml/min, detekce UV 252 nm, výchozí materiál t_R = 16,0 min, produkt t_R = 9,0 min.

Reakční směs byla zředěna deionizovanou vodou (5 ml) a zakoncentrována na přibližně 1/2 objemu. Produkt byl extrahován ze vzniklé vodné vrstvy ethylacetátem (2 x 15 ml). Spojené organické vrstvy byly promyty deionizovanou vodou (2 x 10 ml) a roztokem soli (10 ml). Organická fáze byla zakoncentrována ve vakuu za poskytnutí žluté gumy. Produkt byl izolován chromatografií na silikagelu.

Test s reverzní transkriptázou

V testu se měří inkorporace triciovaného deoxyguanozinmonofosfátu rekombinantní reverzní transkriptázou HIV (HIV RT_r) (nebo jinou transkriptázou) do cDNA, která se sráží kyselinou při • · · 9 «

- 28 hodnotách Km dGTP a póly r(C).oligo d(G)i₂-is· Inhibitory podle předkládaného vynálezu tuto inkorporaci inhibují.

Testy byly prováděny v pufru 55 mM tris(pH 8,2)-30 mM KCI-30 mM MgCI₂-1 mM dithiothreitol-20 pg/ml rC : dGi₂-i₈ (Pharmacia) 8 mM [³H]dGTP (New England Nuclear) - 0,01 % Triton X-100 - 50 mM kyselina ethylenglykol-bis(P-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraoctová (EGTA) - 1 mg/ml bovinního sérového albuminu. Po 60 min inkubace při 37 °C byl materiál vysrážený kyselinou zachycen na filtru ze skleněných vláken s použitím poloautomatického přístroje na sklízení buněk. Extrakty bakteriálních buněk obsahujících reverzní transkriptázu byly zředěny tak, aby se pracovalo v lineární oblasti testu a byla měřena aktivita v přítomnosti a nepřítomnosti inhibitoru. Jako kontrola také sloužil purifikovaný heterodimer reverzní transkriptázy HIV-1 produkovaný v E. coli. Výsledky se určí jako koncentrace inhibitoru, při které se dosáhne 50 % inhibice (lC₅o standardní typ) v nanomolech/litr. Sloučenina A má ICso standardního typu 2 nM.

Pro testování dvojitých mutantu (dm) bylo v testu použito reverzní transkriptázy A17. Reverzní transkriptáza A17 je rezistentní na různé aminopyridony, jak se popisuje v: Nunberg, J. H. a další, J. Virol., 65, 4887 (1991). Výsledky se měří jako ICso dm v nanomolech/litr. Sloučenina A poskytla IC_S0 dm 85 nM.

Test šíření v buňkách

Inhibice šíření HIV v buněčné kultuře byla měřena metodou podle Nunberg, J. H. a další, J. Virol., 65, 4887 (1991). V tomto testu se T-lymfoidní buňky MT-4 infikují virem HIV-1 (standardní typ, pokud není uvedeno jinak) použitím předem určeného inokula a kultury byly inkubovány 24 hod. V této době bylo pozitivních < 1 % buněk při stanovení metodou nepřímé imunofluorescence. Buňky potom byly

-29 důkladně promyty a rozděleny do 96 jamkových kultivačních misek. Do jamek bylo potom přidáno sériové dvojnásobné zředění inhibitoru a kultivace pokračovala další 3 dny. Čtyři dny po infekci bylo infikováno 100 % buněk v kontrolních kulturách. S šířením viru přímo 5 korelovala akumulace proteinu p24 HIV-1. Inhibiční koncentrace pro buněčnou kulturu byla definována jako koncentrace inhibitoru v nanomolech/litr, která snížila šíření infekce alespoň o 95 %, nebo CIC₉₅.

Předcházející specifikace vykládá principy předkládaného io vynálezu pomocí příkladů poskytnutých pro ilustraci, avšak je třeba rozumět, že provedení vynálezu zahrnuje všechny obvyklé varianty, adaptace nebo modifikace, pokud spadají do rámce následujících nároků a jejich ekvivalentů.

Claims

1. Způsob asymetrické syntézy chirální sloučeniny vzorce kde P znamená ochrannou skupinu chránící aminoskupinu; vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1 R,2S)-N-substituovaného norefedrinu vzorce kde R znamená Ci-₄alkyl₍nebo skupina -NR₂ tvoří pyrrolidinyl nebo piperidinyl;

(b) smísení směsi z kroku (a) s přibližně jedním ekvivalentem reaktantu vzorce

- 31 kde P je skupina chránící aminovou skupinu;

a udržování výsledné reakční směsi při teplotě mezi přibližně

-78 °C a přibližně -20 °C;

(c) ukončení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny.

2. Způsob asymetrické syntézy chirální sloučeniny N-(4methoxybenzyl)-6-chloro-2-[(R)-cyklopropylethinylhydroxytrifluoromethylj-methylanilinu vzorce vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1 R,2S)-N-substituovaného norefedrinu vzorce

·· ♦ · • · • · · • • · · • to • · to · k * ··· toto to • ·· to • • • · • · • • • ···· ·· • · ··· • · • ·

kde R znamená Ci_4alkyl nebo skupina -NR₂ tvoří pyrrolidinyí nebo piperidinyl;

s přebytkem cyklopropylacetylenu a přebytkem lithiačního činidla zvoleného z n-butyllithia nebo sek.-butyllithia nebo terc.-butyllithia v teplotním rozmezí mezi přibližně - 78 °C a přibližně 10 °C v aprotickém rozpouštědle;

(b) smísení směsi z kroku (a) s přibližně jedním ekvivalentem reaktantu N-(4-methoxybenzyl)-6-chloro-2-(2-trifluoro-1 - oxoethyl)-anilinu vzorce a udržování výsledné reakční směsi v teplotním rozmezí přibližně - 78 °C až přibližně - 20 °C;

(c) zastavení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny.

3. Způsob asymetrické syntézy chirální sloučeniny vzorce

NH i P

- 33 kde P je skupina chránící aminovou skupinu;

vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1R,2S)-N-pyrrolidinylnorefedrinu vzorce

10 s přebytkem cyklopropylacetylenu a přebytkem lithiačního činidla zvoleného z n-butyllithia nebo sek.-butyllithia nebo terc.-butyllithia při teplotě přibližně - 15 °C v aprotickém rozpouštědle;

(b) smísení směsi z kroku (a) s přibližně jedním ekvivalentem

15 reaktantu vzorce

2o kde P znamená skupinu chránící aminovou skupinu a udržování výsledné reakčni směsi při teplotě přibližně - 40 °C (c) zastavení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny.

4. Způsob asymetrické syntézy chirální sloučeniny N-(4methoxybenzyl)-6-chloro-2-[(R)-cyklopropylethinylhydroxytrifluoromethylj-methylanilinu vzorce vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(a) vytvoření směsi přebytku (1R,2S)-N-pyrrolidinylnorefedrinu vzorce s přebytkem cyklopropylacetylenu a přebytkem n-butyllithia při teplotě přibližně - 15 °C v aprotickém rozpouštědle;

(b) smísení směsi z kroku (a) s přibližně jedním ekvivalentem reaktantu N-(4-methoxybenzyl)-6-chloro-2-(2-trifluoro-1 - oxoethyl)-anilinu vzorce

OMe a udržování výsledné reakční směsi při teplotě přibližně - 40 °C (c) zastavení reakce přídavkem zdroje protonů;

(d) za poskytnutí požadované sloučeniny v > 85 % výtěžku

5 a > 95 % enantiomerním přebytku.

5. Způsob podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že mezi krokem (a) a krokem (b) se provede další krok zahřívání, tj. směs z kroku (a) se zahřívá na teplotu v io rozmezí mezi přibližně - 10 °C a přibližně 10 °C po dobu alespoň 5 min, a před krokem (b) se potom ochladí na teplotu mezi přibližně - 78 °C a přibližně - 20 °C.

6. Způsob podle nároků 3 nebo 4, vyznačující se

15 t í m , ž e mezi krokem (a) a krokem (b) probíhá další krok zahřívání, tj. směs z kroku (a) se zahřívá na teplotu v rozmezí mezi přibližně - 10 °C a přibližně 0 °C po dobu v rozmezí přibližně 10 min a přibližně 60 min a před krokem (b) se potom ochladí na teplotu přibližně - 40 °C.

7. Sloučenina vzorce kde P je skupina chránící aminovou skupinu.

8. Sloučenina, kterou je N-(4-methoxybenzyl)-6-chloro-2-[(R) cyklopropylethinylhydroxytrifluoromethylj-methylanilin vzorce