PT717617E

PT717617E - Microparticulas com gas e pprincipios activos

Info

Publication number: PT717617E
Application number: PT94926878T
Authority: PT
Inventors: Thomas Fritzsch; Dieter Heldmann; Werner Weitschies; Peter Hauff; Harald Stahl
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1993-09-09
Filing date: 1994-08-25
Publication date: 2001-04-30
Also published as: WO1995007072A2; AU7729998A; GR3035219T3; NO960973D0; US6068857A; NO960973L; NO312007B1; HU9600599D0; ES2152990T3; DK0717617T3; EP0717617A1; CA2171303A1; CA2171303C; HUT74509A; WO1995007072A3; US6284280B1; DE59409568D1; EP0717617B1; JPH09502191A; AU7655194A

Description

DESCRIÇÃO

MICROPARTÍCULAS COM GÁS E PRINCÍPIOS ACTIVOS A invenção refere-se ao objecto identificado nas reivindicações, ou seja, novas micropartículas contendo princípios activos e tendo, para além do(s) princípio(s) activo(s) pelo menos um gás ou uma fase gasosa, meios que contêm estas partículas (sistemas de micropartículas), cuja utilização destina-se à libertação de princípios activos in vivo controlada por ultra-sons, à incorporação celular de princípios activos (sonoporação) suportada por ultra-sons, assim como a processos para o fabrico das partículas e dos meios. Há muitos anos que existem sistemas de micropartículas para a liberação controlada de princípios activos. E possível utilizar neste âmbito uma multiplicidade de substâncias de revestimento e de princípios activos. Da mesma forma, existe uma grande variedade de diferentes processos de fabrico. E possível ver resumos das substâncias de revestimento e dos processos de fabrico utilizados, por exemplo, em: M. Bornschein, P. Melegari, C. Bismarck, S. Keipert: Mikro- und Nanopartikeln ais Arzneinstofftrãgersysteme unter besonderer Beriicksichtigung der Herstellungsmethoden, Pharmazie 44 (1989) 585-593 e M. Chasin, R. Langer (eds.): Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Mareei Dekker, New York, 1990. A libertação de princípios activos a partir de sistemas de micropartículas diz sobretudo respeito a processos de difusão ou de erosão [ver C. Washington: Drug release from microdisperse Systems: A criticai review, Int. J. Pharm. 58 (1990) 1-12 e J.Heller: Bioerodible Systems, in: R.S. Langer, D.L. Wice (eds.): Medicai applications of controlled release Vol. 1, CRC Press, Florida, 1984, p. 69-101].

No entanto, estes princípios têm a desvantagem de o controlo do momento em que ocorre a libertação dos princípios activos a partir de sistemas de microdispersão in 2

vivo, estar limitado à velocidade do processo de erosão e/ou processo de difusão, não podendo mais ser influenciado após aplicação.

Os conceitos conhecidos até à data para o controlo local da libertação de princípios activos in vivo a partir de sistemas de micropartículas, dizem respeito quase exclusivamente a concentrações inespecíficas das micropartículas portadoras dos princípios activos em determinados órgãos alvo, como o fígado e o baço, ou a medidas para modificar de forma precisa a distribuição pelos órgãos in vivo, após a aplicação, através da modificação das propriedades de superfície dos sistemas de micropartículas, mediante agentes tensioactivos ou de substâncias promotoras da especificidade como, por exemplo, os anticorpos [ver: R.H. Miiller: Colloidal carriers for controlled drug delivery - Modification, characterization and in vivo distribution -, Kiel, 1989; S.D. Trõster, U. Miiller, J. Kreuter: Modification of the biodistribution of poly(methylmethacrylate) nanoparticles in rats by coating with surfactants, Int. J. Pharm. 61 (1991), 85-100; S.S. Davis, L. Illum, J.G. Mcvie, E. Tomlinson (eds.): Microspheres and drug therapy, Elsevier Science publishers B.V., 1984 e H. Tsuji, S. Osaka, H. Kiwada: Targeting of liposomes surface-modified with glycyrrhizin to the liver, Chem. Pharm. Buli. 39 (1991) 1004-1008]. No entanto, todos estes processos não permitem, para além disso, influenciar de forma activa o local da libertação dos princípios activos após a aplicação. Além disso, não é possível influenciar a extensão e a velocidade da libertação dos princípios activos depois da aplicação.

As primeiras tentativas de influenciar activamente o local da libertação dos princípios activos têm a ver com a possibilidade de utilizar diferenças de pH ou de temperatura existentes ou induzidas para a libertação [ver: H. Hazemoto, M. Harada, N. Kamatsubara, M. Haga, Y. Kato: PH-sensitive liposomes composed of phosphatidyl-ethanolamine and fatty acid, Chem. Pharm. Buli. 38 (1990) 748-751 e J.N. Weinstein, R.L. Magin, M.B. Gatwin, D.S. Zaharko: Liposomes and local hyperthermia, Science 204 (1979) 188-191], Porém, estes métodos têm a desvantagem de estarem limitados aos casos em que já se dispõe das diferenças de temperatura ou de pH necessárias (por exemplo, em tecidos tumorais) ou aos casos em que é necessário 3

recorrer a medidas dispendiosas, em parte invasoras, para produzir os parâmetros necessários correspondentes à libertação. Para além disso, a dissolução local neste último caso é reduzida.

Outro processo conhecido para influenciar o local da libertação dos princípios activos consiste na utilização de micropartículas, que podem ser concentradas pelo fluido de ferro encapsulado nas partículas através de campos magnéticos exteriores, dentro de determinados segmentos do corpo [K.J. Widder, A.E. Senyei: Magnetic microspheres: A vehicle for selective targeting of drugs, Pharmac. Ther. 20 (1983) 377-395]. Contudo, a utilização deste tipo de micropartículas requer a utilização precisa, e em simultâneo, de campos magnéticos mais fortes e com uma maior focalização. Porém, os ímans que geram estes campos estão pouco difundidos na Medicina. Para além disso, não é possível influenciar deste modo a velocidade de libertação dos princípios activos.

Na patente norte-americana 4 657 543 descreve-se um processo, em que a libertação é provocada pelo efeito dos ultra-sons em blocos de polímeros contendo princípios activos. Este efeito tem fundamentalmente a ver com uma maior erosão do polímero por meio do efeito do som. A desvantagem deste processo reside no facto de ser apenas adequado aos implantes fixos. Para que se obtenham efeitos claros, também é necessário utilizar pressões do som muito elevadas ou sinais de som prolongados, que podem provocar lesões nos tecidos.

Na WO 92/22298 encontram-se descritos lipossomas que podem ser destruídos pela emissão de ultra-sons na área da frequência de ressonância das microbolhas. Neste caso, o princípio activo encapsulado sai. A frequência de ressonância é indicada com cerca de 7,5 MHz. Contudo, os ultra-sons de diagnóstico de uma frequência mais alta apresentam apenas uma reduzida profundidade de penetração (poucos centímetros), devido à elevada absorção por parte dos tecidos do corpo. Por isso, os lipossomas descritos são apenas apropriados para a libertação de princípios activos em zonas do corpo perto da superfície. 4 0 Γ

Relativamente à utilização de ácidos nucleicos como princípios activos, encontram-se descritos na literatura dois sistemas, com base em vectores virais ou em vectores não virais. Actualmente, são estudados em vivo os retrovírus, adenovírus e os vírus da herpes (ou as respectivas recombinações) como vectores virais, e os lipossomas e os ligandos de receptores específicos das superfícies celulares como vectores não virais (G.Y. Wu & C. H. Wu: Delivery systems for gene therapy, Biotherapy, 3 (1991) 87-95 e F. D. Ledley: Are contemporary methods for somatic gene therapy suitable for clinicai applications?, Clin Invest Med 16 (1) (1993) 78-88.

Os primeiros estudos sobre a utilização da terapia genética nos humanos centram-se nas doenças condicionadas geneticamente como, por exemplo, a deficiência da alfa-1-antitripsina, fibrose cística, deficiência da adenosindesaminase e tumores malignos como, por exemplo, melanomas, tumores mamários e carcinomas intestinais. Até ao momento não se conhecem vectores que permitam ao mesmo tempo um controlo espacial e um controlo temporal da libertação dos ácidos nucleicos.

Na patente norte-americana 5 190 766, misturam-se microcápsulas de albumina (Albunex®) disponíveis no mercado com 5-fluoruracilo (5-FU). Como resultado, obtém-se uma suspensão aquosa, que contém uma proporção não desconsiderável de princípio activo livre no meio de suspensão.

No entanto, a proporção de princípios activos livres nas preparações deste género dispersa-se de forma não controlada no sangue, após a aplicação naturalmente do exterior. Isto origina uma série de efeitos indesejáveis. Os princípios activos sensíveis (como, por exemplo, os ácidos nucleicos) podem ser logo dissociados a caminho do local de actuação, por meio de nucleases. Para além disso, o princípio activo livre poderá provocar efeitos secundários indesejáveis noutros órgãos. Isto acontece sobretudo no caso dos citoestáticos como o 5-FU. Para além disso, o corpo será sobrecarregado, como acontece com as preparações convencionais, pelo metabolismo do princípio activo "supérfluo". 5

Por isso mantém-se, para uma variedade de fins, a necessidade de formulações que possam ser aplicadas de forma precisa e que suplantem as referidas desvantagens do estado da técnica, ou seja, com as quais seja possível controlar com precisão tanto o local e o momento da libertação do princípio activo, como também a quantidade da substância administrada, recorrendo a medidas simples e que não sejam invasoras. Para além disso, as formulações devem conter o princípio activo exclusivamente no núcleo e apresentar uma grande estabilidade, em especial relativamente a influências mecânicas.

Deste modo, a invenção tem por objectivo disponibilizar estas formulações e criar um processo para o fabrico das mesmas.

Este objectivo é atingido pela invenção.

Descobriu-se que quando, no caso dos sistemas de micropartículas compostos por um meio de suspensão compatível em farmacologia, e por micropartículas constituídas por um revestimento biodegradável e por um núcleo com gás e princípios activos, se aplicam ondas de ultra-sons de diagnóstico numa área de frequência inferior à frequência de ressonância das partículas, o revestimento dessas partículas é, de forma surpreendente, destruído e, desse modo, o(s) princ!pio(s) activo(s) encapsulado(s) é(são) libertado(s) com precisão.

De acordo com o referido, a invenção é relativa a novas micropartículas com princípios activos contendo, além do princípio activo, um gás, uma fase gasosa ou uma mistura de gases, assim como a sistemas de micropartículas, compostos pelas micropartículas de acordo com a invenção e por um meio de suspensão compatível em farmacologia.

As partículas apresentam uma densidade inferior a 0,8 g/cm3, de preferência inferior a 0,6 g/cm3, e têm um tamanho entre 0,1 e 8 pm, de preferência entre 0,3 e 7 pm. No caso das células encapsuladas, o tamanho preferido para as partículas encontra-se 6

compreendido entre 5 e 10 pm. Devido ao seu reduzido tamanho, as micropartículas dispersam-se, após injecção intravenosa, dentro de todo o sistema receptor. Por controlo visual do monitor de um aparelho de ultra-sons de diagnóstico, é possível provocar, ao intensificar o sinal de ultra-som, uma libertação controlada pelo utilizador das substâncias contidas nas micropartículas, estando a frequência necessária para a libertação abaixo da frequência de ressonância das micropartículas. As frequências apropriadas encontram-se compreendidas entre 1 e 6 MHz,’ de preferência entre 1,5 e 5 MHz.

Deste modo, torna-se possível pela primeira vez, dentro de todo o corpo e por parte do utilizador, um controlo combinado da taxa de libertação dos princípios activos e do local dessa libertação.

Esta libertação por meio da destruição do revestimento das partículas, também se torna possível, de forma surpreendente, com frequências de ultra-sons muito inferiores à frequência de ressonância das microbolhas, com as pressões de som habituais no diagnóstico médico, sem provocar o aquecimento dos tecidos. Isto é de facto notável, visto que, devido à grande estabilidade mecânica do revestimento das partículas - que constitui uma vantagem, por exemplo, em termos de estabilidade de armazenamento - não se esperava conseguir destruir o revestimento com uma radiação relativamente pouco energética. E possível controlar a libertação de princípios activos, devido à elevada proporção de gás nas partículas e à formação de eco assim implícita, in vivo por meio de redução do sinal de ultra-som recebido.

Descobriu-se ainda que, ao utilizar sistemas de micropartículas de acordo com a invenção, é possível atingir uma melhor transferência dos princípios activos para as células (sonoporação). 7

Para além disso, descobriu-se que os princípios activos libertados dos sistemas de micropartículas de acordo com a invenção demonstram, de forma surpreendente, uma maior eficácia farmacológica comparativamente ao princípio activo puro.

Os sistemas de micropartículas de acordo com a invenção são apropriados, devido às suas propriedades, para uma libertação precisa de princípios activos e para uma transferência aumentada para as células alvo, mediante o efeito exercido por ultra-sons de diagnóstico.

Como materiais de revestimento para as micropartículas com gás/princípio activo, adequam-se, em princípio, todos os materiais biodegradáveis e compatíveis em termos fisiológicos como, por exemplo, as proteínas como a albumina, a gelatina, o fibrinogénio, o colagénio, assim como os respectivos derivados como, por exemplo, a gelatina succinilada, polipeptidos com ligações cruzadas, produtos de transformação das proteínas com polietilenoglicol (por exemplo, albumina conjugada com polietilenoglicol), amido ou derivados de amido, quitina, quitosano, pectina, polímeros sintéticos biodegradáveis como o poliácido láctico, copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico, policianoacrilatos, poliésteres, poliamidas, policarbonatos, polifosfazenos, poliaminoácidos, poli-c-caprolactona, assim como copolímeros de ácido láctico e ε-caprolactona e as respectivas misturas. Especialmente apropriados são a albumina, o poliácido láctico, copolímeros de ácido láctico e de ácido glicólico, policianoacrilatos, poliéster, policarbonatos, poliaminoácidos, poli-s-caprolactona assim como copolímeros de ácido láctico e de ε-caprolactona. 0(s) gás(es) a inserir nas micropartículas podem ser escolhidos livremente, embora seja dada preferência a gases não perigosos a nível fisiológico como o ar, o nitrogénio, o oxigénio, os gases nobres, hidrocarbonetos halogenados, SF6 ou as respectivas misturas. Também são apropriados o amoníaco, o dióxido de carbono assim como líquidos sob a forma de vapor como, por exemplo, o vapor de água ou líquidos com um baixo ponto de ebulição (ponto de ebulição < 37 °C). 8

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Também é possível seleccionar livremente o princípio activo farmacêutico. A título de exemplo, é possível nomear substâncias farmacêuticas, toxinas, vírus, componentes de vírus, componentes de paredes celulares bacteriológicas, peptidos como, por exemplo, a endotelina, proteínas, glicoproteínas, hormonas, substâncias mensageiras solúveis, corantes, co-componentes, adjuvantes, agentes trombolíticos, factores de necrose tumoral, citoquinas (por exemplo, as interleuquinas, factor de estimulação de colónias como GM-CSF, M-CSF, G-CSF) e/ou prostaglandina. As micropartículas de acordo com a invenção são especialmente adequadas ao encapsulamento de ácidos nucleicos, células inteiras e/ou componentes celulares, que deverão ser libertados (por exemplo, na terapia genética) no órgão alvo, por meio de ultra-sons. O conceito princípio activo farmacêutico compreende tanto os princípios activos naturais como os fabricados sintética ou geneticamente. E dada preferência aos princípios activos farmacêuticos, cuja dose aplicada (na injecção sob a forma de bolus) não exceda as 100 mg por aplicação. Ter em consideração, neste caso, que em relação aos sistemas de micropartículas de acordo com a invenção, como anteriormente descrito, consegue-se um aumento da eficácia farmacológica, podendo observar-se uma eficácia acrescida em diversos casos, pelo que os sistemas de micropartículas de acordo com a invenção também podem ser empregues no caso dos princípios activos que tenham de ser doseados, por vias convencionais, num bolus superior a 100 mg por aplicação.

Se forem necessárias dosagens ainda maiores, recomenda-se a administração dos meios por um período mais longo como solução de infusão.

Embora não existam limitações para além das já referidas, é possível empregar os sistemas de micropartículas, de acordo com a invenção, de forma vantajosa especialmente nos casos em que, devido a um reduzido tempo de vida in vivo do princípio activo sob a forma livre, não é possível chegar ao órgão alvo, ou só o é de forma limitada, sem que antes ocorra a desintegração do princípio activo. Entre este 9

tipo de princípios activos encontram-se diversas hormonas, peptidos, proteínas, células e respectivos componentes, assim como ácidos nucleicos.

Um processo para fabricar as micropartículas de acordo com a invenção, consiste em primeiro fabricar as micropartículas enchidas com gás de uma forma de si conhecida (DE 38 03 972, WO 93/00933, EP 0 514 790, WO 92/17213, US 5 147 631, WO 91/12823, EP 0 048 745). De acordo com a invenção, estas micropartículas são depois enchidas com princípios activos solvidos em gases supercríticos. Para isso, as micropartículas com gás secas pelo processo adequado (por exemplo, liofilização) são tratadas dentro de um autoclave com uma solução do princípio activo num gás supercrítico. Convém proceder de forma a que o princípio activo e as micropartículas com gás sejam colocados em conjunto num autoclave, sendo este depois enchido com o gás supercrítico ou com uma mistura de gases supercríticos. Os gases supercríticos adequados são, consoante o princípio activo, todos os gases que podem ser levados a um estado supercrítico mas, em especial, o dióxido de carbono supercrítico, o nitrogénio supercrítico, o amoníaco supercrítico e os gases nobres supercríticos. Após o tratamento das micropartículas com a solução do princípio activo no gás supercrítico ou na mistura de gases, remove-se, se necessário, o princípio activo supérfluo que se encontra na superfície exterior das micropartículas, através da lavagem das mesmas num meio adequado, e estas partículas assim limpas são, se tal for pretendido, liofilizadas. Este processo é adequado a todos os princípios activos que se solvam em gases ou em misturas de gases supercríticos como, por exemplo, os peptidos ou as substâncias farmacêuticas lipofilas.

Um processo alternativo, particularmente adequado ao encapsulamento de princípios activos insolúveis em gases ou em misturas de gases supercríticos (como, por exemplo, as proteínas e as ligações sacaríferas), consiste no encapsulamento de uma fase aquosa contendo princípios activos mediante uma emulsão múltipla. Demonstraram-se especialmente adequadas as emulsões água/óleo/água (A/O/A). Para isso, solve-se o material de revestimento num solvente orgânico adequado, insolúvel na água, numa concentração de 0,01 a 20 % (m/V). Nesta solução, emulsiona-se uma solução aquosa do princípio activo a encapsular, de forma a originar uma emulsão do tipo A/O. Ambas as soluções podem conter aditivos tais como agentes emulsionantes. No entanto, é preferível prescindir destes agentes emulsionantes, devido ao facto de a sua compatibilidade biológica ser de forma geral restrita. Demonstrou-se vantajosa a adição de quase-agentes emulsionantes aceitáveis em farmacologia à fase aquosa, tais como, por exemplo, o álcool de polivinilo, a pirrolidona de polivinilo, a gelatina, a albumina ou o dextrano numa concentração compreendida entre 0,1 e 25 %. Demonstrou-se especialmente vantajoso solver na fase aquosa interna, eventualmente em conjunto com os outros aditivos utilizados, 0,1 a 20 % (m/V) de um sal, de um açúcar ou de um álcool de açúcar facilmente hidrosolúvel e aceitável em farmacologia como, por exemplo, o cloreto de sódio, a galactose, o manitol, a lactose, a sacarose, a glucose e o fosfato de hidrogénio de sódio. Para além disso, é possível que constitua uma vantagem saturar a fase aquosa interna antes do emulsionamento com a fase orgânica utilizada. As gutículas da fase interna da emulsão fabricada do tipo A/O, deverão apresentar um tamanho médio com cerca de 0,1 a 10 pm. Esta emulsão é adicionada por agitação a um volume pelo menos igual de uma solução aquosa de um agente emulsionante ou quase-agente emulsionante. O solvente orgânico é novamente removido por agitação recorrendo-se aos processos adequados (solvent evaporation). As micropartículas enchidas com água que se obtêm são, se necessário, lavadas e depois secas de forma a que a fase aquosa interna seja removida sem destruir as micropartículas. Em princípio, os processos de secagem adequados são a liofilização e a secagem por pulverização, sendo dada preferência à liofilização. Para isso, solve-se na suspensão das micropartículas um aditivo ajudante da lavagem como, por exemplo, açúcar, álcoois de açúcar, gelatina, derivados de gelatina, albumina, aminoácidos, pirrolidona de polivinilo e álcool de polivinilo, numa concentração de cerca de 0,5 a 20 % (m/V). Seguidamente, a suspensão é congelada a temperaturas o mais baixas possível, de preferência inferiores a cerca de -30°C e, depois, liofílizadas. Após a liofilização e a redispersão num meio de suspensão apropriado, é possível, por intermédio de flotação ou centrifugação, separar as micropartículas com gás originadas, e com a necessária densidade, dos sólidos que também possam existir ou de micropartículas ainda cheias de água e, se necessário, voltar a liofilizá-las tanto quanto 11 11

ϋ possível com a adição de ajudantes de lavagem. As micropartículas passam assim a conter ao mesmo tempo o princípio activo encapsulado e o gás ou a fase gasosa. O fabrico dos sistemas de micropartículas, de acordo com a invenção, a partir das partículas fabricadas em conformidade com o processo anteriormente descrito, consiste na resuspensão das partículas num meio de suspensão compatível em farmacologia. A resuspensão num meio apropriado pode seguir-se directamente à última etapa do processo (a liofilização) mas, no entanto e se tal for pretendido, poderá só ter lugar por intermédio do médico em questão antes da aplicação.

Em último caso, os sistemas de micropartículas de acordo com a invenção encontram-se sob a forma de kit, composto por um primeiro recipiente com as partículas e por um segundo recipiente contendo o meio de suspensão. O tamanho do primeiro recipiente deverá ser seleccionado de forma a que também o meio de suspensão possa caber na sua totalidade. Assim, é possível, por exemplo, por meio de uma injecção através da membrana que se encontra no fecho do primeiro recipiente, adicionar totalmente o meio de suspensão às partículas e, após agitação, produzir a suspensão pronta a injectar. Os meios de suspensão são todos os meios injectáveis conhecidos dos especialistas como, por exemplo, uma solução de sal de cozinha fisiológico, água p.i. ou uma solução de glucose a 5%. A quantidade aplicada depende do princípio activo incluído nas micropartículas. Como orientação, o limite superior pode ser um valor utilizado na administração convencional do respectivo princípio activo. Contudo, devido ao efeito melhorado, assim como à possibilidade de libertar o princípio activo especificamente a partir do sistema de micropartículas de acordo com a invenção, a dose necessária permanece geralmente abaixo deste limite superior.

Os exemplos que se seguem servem para explicar o objecto da invenção sem querer dessa forma o limitar. 12

Exemplo 1: Micropartículas de policianoacrilato com cafeína

Micropartículas enchidas com gás fabricadas com base no ácido butilcianacrílico de acordo com a DE 38 03 972, são liofilizadas mediante a adição de 2% (m/V) de álcool de polivinilo. Um autoclave é enchido com cerca de 3 · 109 partículas, sob a forma do liofilizado, juntamente com 50 mg de cafeína. A mistura é tratada com dióxido de carbono a uma temperatura de acerca de 45 °C e com 100 a 120 bar. A cafeína em excesso é removida como se segue: as micropartículas retiradas do autoclave são resuspensas em 3 ml de água, que contém 1% de Lutrol F 127 dissolvido. As partículas são separadas por centrifugação e resuspensas em 3 ml de água contendo 1% de Lutrol F 127. A centrifugação, seguida de redispersão em 3 ml de água contendo 1% de Lutrol F 127, é repetida até que deixem de existir quaisquer provas de cafeína por fotometria nos 273 nm.

Exemplo 2: Micropartículas fibrinolíticas de poli(D,L-ácido láctico-ácido glicólico) 2 g de poli(D,L-ácido láctico-ácido glicólico) (50:50) (Resomer RG 503, Boehringer Ingelheim) são solvidas em 20 ml de CH2C12. 10 mg de r t-PA (ativador plasminogénio do tecido) são solvidas em 4 ml de uma solução aquosa de gelatina a 4%, anteriormente sujeita a autoclave, e adicionadas à fase orgânica, mediante agitação com um agitador de elevada velocidade. Após emulsionamento completo, adicionam-se 200 ml de uma solução de gelatina a 4%, sujeita a autoclave, ao voltar-se a repetir a agitação. A emulsão é agitada durante 8 horas à temperatura ambiente. As partículas originadas são filtradas por um filtro de 5 pm, separadas por centrifugação, resuspensas em 50 ml de uma solução de gelatina a 4% sujeita a autoclave, congeladas a uma temperatura de -78 °C e liofilizadas. Após resuspensão, as micropartículas com gás são separadas por centrifugação (a 1000 Upm, 30 minutos). As micropartículas com gás são adicionadas a 20 ml de água com vista a serem injectadas. Estas micropartículas apresentam uma densidade inferior a 0,7 g/cm3. 13

Exemplo 3: Libertação in vitro de cafeína por ultra-sons 1 ml de uma suspensão de partículas preparada de acordo com o Exemplo 1, diluída com água para uma concentração de 10® partículas/ml, é adicionado a um béclier com 100 ml de água desgasificada. Mergulha-se na água uma cabeça de ressonância de 3,5 MHz de um aparelho de ultra-sons de diagnóstico (HP Sonos 1000) e observa-se a modificação do quadro B. Primeiro, o' aparelho funciona com uma potência de som média (transmissão < 20 dB) reconhecendo-se ecos claros. Uma verificação relativa à cafeína da água isenta de partículas permanece negativa. Ao aumentar-se a pressão do som (transmissão > 30 dB, os ecos desaparecem. O líquido contém agora cafeína livre detectável, sendo possível reconhecer ao microscópio sobretudo fragmentos das micropartículas e apenas muito poucos intactos.

Exemplo 4: Libertação in vitro de ativador plasminogénio do tecido recombinante (r t-Pa) por ultra-sons 14

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Exemplo 5: Micropartículas de poliácido láctico com mitocina 2 g de poliácido láctico (PM cerca de 20 000) são solvidas em 100 ml de CH2C12. 20 mg de mitocina são solvidas em 15 ml de uma solução aquosa de sal de cozinha a 0,9 % e adicionadas à fase orgânica mediante agitação com um agitador de elevada velocidade. Depois do emulsionamento completo, adicionam-se 200 ml de uma solução a 1% de álcool de polivinilo (PM cerca de 15 000) à água ao repetir a agitação. A emulsão é agitada durante 4 horas à temperatura ambiente. As partículas originadas são filtradas por um filtro de 5 pm, separadas por centrifugação, resuspensas em 50 ml de uma solução a 5% de pirrolidona de polivinilo (PM cerca de 10 000) na água, congeladas a uma temperatura de -50 °C e, depois, liofilizadas. Após a resuspensão, as micropartículas com gás são separadas por centrifugação (a 1000 Upm, 30 minutos). As micropartículas com gás são adicionadas a 20 ml de água com vista a serem injectadas. As mesmas apresentam uma densidade inferior a 0,7 g/cm3. Estas micropartículas também são adequadas como meio de contraste para ultra-sons e libertam mitocina quando expostas a ondas ultra-sónicas de diagnóstico.

Exemplo 6: Micropartículas de poli-s-caprolactona com sulfato de vincristina 2 g de poli-e-caprolactona (PM cerca de 40 000) são solvidas em 50 ml de CH2C12. 10 mg de sulfato de vincristina são solvidas em 15 ml de uma solução aquosa a 5 % de galactose e adicionadas à fase orgânica mediante agitação com um agitador de elevada velocidade. Após emulsionamento completo, adicionam-se 200 ml de uma solução a 5% de albumina humana à água ao repetir a agitação. A emulsão é agitada durante 4 horas à temperatura ambiente. As partículas originadas são filtradas por um filtro de 5 μτη, separadas por centrifugação, resuspensas em 50 ml de uma solução a 5% de albumina humana na água, congeladas a uma temperatura de -50 °C e, depois, liofilizadas. Após a resuspensão, as micropartículas com gás são separadas por centrifugação (a 1000 Upm, 30 minutos). As mesmas apresentam uma densidade inferior a 0,7 g/cm3. Estas micropartículas são adequadas como meio de contraste para 15 ( ifjjAAMé, Λ ultra-sons e libertam sulfato de vincristina quando expostas a ondas ultra-sónicas de diagnóstico.

Exemplo 7: Micropartículas de éster de butilo do ácido policianacrílico com ilomedina 3 g de éster de butilo do ácido policianacrílico são solvidas em 50 ml de CH2C12. Solve-se 1 mg de ilomedina em 15 ml de uma solução aquosa de galactose a 5% e adiciona-se a mesma à fase orgânica mediante agitação com um agitador de elevada velocidade. Após emulsionamento completo, adicionam-se 200 ml de uma solução a 2,5 % de álcool de polivinilo (PM 15 000) à água ao prosseguir com a agitação. A emulsão é agitada durante 4 horas à temperatura ambiente. As partículas originadas são filtradas por um filtro de 5 pm, separadas por centrifugação, resuspensas em 50 ml de uma solução a 10 % de lactose na água, congeladas a -50 °C e, depois, liofilizadas. Após resuspensão, as micropartículas com gás são separadas por centrifugação (a 1000 Upm, 30 minutos). As micropartículas com gás apresentam uma densidade inferior a 0,7 g/cm3. As mesmas são adequadas como meio de contraste para ultra-sons e libertam ilomedina quando expostas a ultra-sons de diagnóstico.

Exemplo 8: Micropartículas de poli(D,L-ácido láctico-ácido glicólico) com azul de metileno 4 g de poli(D,L-ácido láctico-ácido glicólico) (50:50) (Resomer RG 503, Boehringer Ingelheim) são solvidas em 50 ml de CH2C12. 20 mg de azul de metileno são solvidas em 4 ml de uma solução aquosa a 4 % de gelatina, anteriormente sujeita a autoclave, e adicionadas à fase orgânica, mediante agitação com um agitador de elevada velocidade. Após emulsionamento completo, adicionam-se 200 ml de uma solução de gelatina a 4% sujeita a autoclave ao continuar a agitar. A emulsão é agitada durante 8 horas à temperatura ambiente. As partículas originadas são filtradas por um filtro de 5 pm, 16 separadas por centrifugação, resuspensas em 50 ml de uma solução de gelatina a 4% sujeita a autoclave, congeladas à temperatura de -78 °C e liofilizadas. Após resuspensão, as micropartículas com gás são separadas por centrifugação (a 1000 Upm, 30 minutos). As micropartículas com gás são adicionadas a 20 ml de água, com vista a serem injectadas. Estas micropartículas apresentam uma densidade inferior a 0,7 g/cm1 2 3 e libertam azul de metileno quando expostas a ultra-sons (pressão do som > 50dB, frequência 2,5 MHz).

Exemplo 9: Micropartículas de poli(D,L-ácido láctico-ácido glicólico) com ácidos nucleicos (Markergen β-Gal + promotor de albumina) 0,4 g de pirrolidona de polivinilo (k < 18) e 2 g de um copolímero de ácido láctico e ácido glicólico 50:50 são solvidas em 50 ml de CH2C12. Mediante agitação, adicionam-se 5 ml de uma solução de 300 pg de Markergen β-Gal com um promotor de albumina numa solução de sal de cozinha a 0,9%. Transfere-se a emulsão originada para 200 ml de uma solução de gelatina a 2% sujeita a autoclave (121 °C, 20 minutos), mediante agitação. Após 3 horas, a suspensão originada é vertida em porções de 5 ml, congelada a -55 °C e, depois, liofilizada durante 70 horas. Após a liofilização, as ampolas são resuspensas em 5 ml de água cada uma e deixadas ficar durante 3 horas. As partículas flutuantes são tiradas de cada 2 ml de água com 10% de PPV, resuspensas e, depois de congeladas a -55 °C, novamente liofilizadas durante 90 horas.

Exemplo 10: Libertação in vitro de ácidos nucleicos (Markergen β-Gal + promotor de albumina) de micropartículas 1 ampola de uma preparação de micropartículas com ácidos nucleicos, fabricada de 2 acordo com o Exemplo 9, é resuspensa com 2 ml de água. 1 ml da suspensão é tratada 3 com ultra-sons (Amostra 1), e 1 ml não é tratado com ultra-sons (Amostra 2). Ambas as amostras são centrifugadas, retiram-se as fases pobres em partículas, e filtram-se por 17

um filtro de 0,2 μιη. Examinam-se os produtos filtrados por electroforese em gel relativamente ao seu teor em Markergen 3-Gal. O filtrado da Amostra 1 contém cerca de mais 100% de β-Gal do que o filtrado da Amostra 2.

Exemplo 11: Libertação in vivo dc ácidos nuclcicos (Markergen β-Gal + promotor de albumina) de micropartículas 2 ampolas de uma preparação de micropartículas com ácidos nucleicos, fabricada de acordo com o Exemplo 9 são resuspensas com 2 ml de água respectivamente. O produto de resuspensão total é aplicado lentamente por via intravenosa (cerca de 0,5 ml/min) aos ratos narcotizados. Durante a aplicação, sujeita-se o fígado à irradiação de ultra-sons (7,5 MHz) durante 20 minutos após se ter dado a injecção. 48 horas após a injecção das partículas, o fígado é retirado e congelado por choque em isopentano a -40 °C. A prova enzimo-histoquímica da β-galactosidase surge nas camadas congeladas com 8 a 10 prn de densidade. A coloração de contraste é realizada com um vermelho genuíno. Na secção congelada do fígado, a β-galactosidase neutral -como resultado da expressão genética - encontra-se representada por sinais azuis escuros numa distribuição difusa.

Lisboa, - 9 JAN. 2001

Dr. Américo da Silva Carvalho Agente On::c!« P,or.:'c i-ih R. Castiiho, 2C1-c! E - 1C?C-05t U3S0A Telets. 213 851 330 - 213 654 613 Λ—í- d*- U )*-

Claims

REIVINDICAÇÕES Utilização de sistemas de micropartículas, consistindo num meio de suspensão isento de princípios activos, compatível em farmacologia, e em micropartículas constituídas por um revestimento de polímero biodegradável e por um núcleo com gás e princípios activos para o fabrico de um medicamento, com vista à libertação in vivo mediante a emissão de ultra-sons do princípio activo incluso. Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a densidade das partículas ser inferior a 0,8 g/cm3. Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o tamanho das partículas se encontrar entre 0,1 e 10 pm. Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de utilizar-se como polímero biodegradável as proteínas, a gelatina, o fibrinogénio, colagénio assim como os respectivos derivados, polipeptidos de ligação cruzada, produtos de transformação das proteínas com o glicol de polietileno, amido ou derivados de amido, quitina, quitosano, pectina, poliácido láctico, copolímeros de ácido láctico e de ácido glicólico, policianoacrilatos, poliéster, poliamida, policarbonatos, polifosfazenos, poliaminoácidos, poli-ε-caprolactona assim como copolímeros de ácido láctico e ε-caprolactona ou as respectivas misturas. Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de estas conterem como princípio activo toxinas, vírus, componentes de vírus, componentes de paredes celulares bacteriológicas, substâncias mensageiras solúveis, corantes, co-componentes, adjuvantes, agentes trombolíticos, factores de necrose tumoral, ácidos nudeicos, peptidos, proteínas, glicoproteínas, hormonas, citoquinas e/ou prostaglandinas. 2 β

Cf 'i? .- 8
6. Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de estas conterem células e/ou os respectivos componentes como princípio activo.
7. Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto estas conterem, como fase gasosa, ar, oxigénio, nitrogénio, dióxido de carbono, gases nobres, amoníaco, hidrocarbonetos halogenados ou parcialmente halogenados, SF6 e/ou vapor de água ou fluidos com baixo ponto de ebulição.

Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a libertação in vivo ser realizada pela emissão de ultra-sons de diagnóstico.
9. Utilização de micropartículas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a libertação in vivo ser realizada pela emissão de ultra-sons de diagnóstico com uma frequência de 1 a 6, de preferência de 1,5 a 5 MHz.

Processo para o fabrico de micropartículas com princípios activos, caracterizado pelo facto de as micropartículas com gás serem tratadas num autoclave com uma solução do princípio activo num gás supercrítico, de preferência em dióxido de carbono supercrítico, nitrogénio supercrítico, amoníaco supercrítico e gases nobres supercríticos, e, seguidamente, lavadas e liofilizadas.
11. Micropartículas contendo pelo menos um princípio activo e uma fase gasosa, fabricadas de acordo com a reivindicação 10.
12. Micropartículas com um revestimento formado pelo menos por um polímero biodegradável, por uma fase gasosa e por, pelo menos, um ácido nucleico, um peptido, uma proteína, uma glicoproteína, uma hormona e/ou uma prostaglandina, que podem ser obtidas de acordo com a reivindicação 10. 3
13. Preparações liofilizadas ou secas por pulverização, a partir das quais se obtêm sistemas de micropartículas, utilizados de acordo com a reivindicação 1, pela resuspensão com um meio compatível em farmacologia. Usboa, _ 9 JAN_ 2Q01 —!--JU U. ^ Dr. Américo da Silva Carvalho Agenie 0!; ::ci: Γ: ,v " ^ ; 'ríal R.CasSiio, ΣΟΙ Mi · 12. X Vi LliàQA Taleis. 213851 320 - £13 554 611