JP4874483B2 - 超臨界流体補助ネブライゼーション及びバブル乾燥 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の背景
遺伝子治療及び組み替えＤＮＡ技術の発達に伴い、蛋白質調合薬が治療薬の中でも重要となっている。例えば、治療用ペプチド及び蛋白質の肺投与は、呼吸器疾患の処置のために、また、高分子物質の全身投与のための注射に対する魅力的な代替として、近年、かなりの注目を受けてきている。しかし、蛋白質調合薬の商業的な製造は、生物学的な不活性化に至る蛋白質の化学的及び物理的な分解によって厳しく制限されている〔M.Ｃ.マニングらの(1989)「蛋白質調合薬の安定性」、Pharm.Res.6:903-918;M.C．ライ及びE.M.トップの(1999)「蛋白質及びペプチドの固体状態化学的安定性」、J.Pharm.Sci.88:489-500〕。これらの分解過程の多くは、加水分解及び／または他の分解経路で水を使用している。したがって、多くの蛋白質調合薬は、製品の使用可能な保存期間及び製品の貯蔵安定性を引き延ばすために、固体状態で、乾燥粉末として製造されている。乾燥固体における蛋白質の変性により、即座の再水和作用で不可逆的に変性され、長期間の貯蔵安定性が著しく減少する。
【０００２】
超臨界流体は、臨界温度と圧力以上の温度と圧力での物質であり、ガスと液体との中間の密度、圧縮性及び粘度を有している。近臨界流体は、超臨界流体に類似しており、臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体として定義される。例えば、ＣＯ2の臨界温度は３１．６℃（３０４．６Ｋ）であり、かつ、臨界圧力は１０７３ｐｓｉであるから、２℃（２７５Ｋ）と９６６ｐｓｉ以上のＣＯ2は、近臨界である。超臨界流体は、調合薬の微粉末の製造に用いるために研究されてきたが、これらの技術は、調合薬が直接超臨界流体に溶解するか、またはジメチルスルホキシドのような非水性溶媒から超臨界流体により沈殿することを必要としている[超臨界流体核生成〔K.A.ラーソン及びM.L.キングの(1986)「製薬産業における超臨界流体抽出の評価」、Biotechnol. Prog. 2:73-82〕、超臨界液体の急膨張〔J.W.トム及びP.G.デベネデッティの(1991)「超臨界液体の急膨張による生侵食性マイクロスフィア及びマイクロ粒子の沈殿」、Biotechnol. Prog. 7:403-411〕、及びガス逆溶剤技術〔T.W.ランドルフらの(1993)「ガス逆溶剤噴霧沈殿法を経由するポリ（Ｌ−乳酸）のサブミクロンサイズの生分解性粒子」、Biotechnol. Prog. 9:429; J.D.マイヤーらの(1998)「骨髄炎の処置に適したゲンタマイシン浸透生分解性ビードの調製と体外特性」、J. Pharm. Sci. 87:1149;M.A.ウインターらの(1996)「超臨界二酸化炭素中での蛋白質の沈殿」、J. Pharm. Sci. 85:586; S.パラコダティらの(1998)「水性溶液からの材料の超臨界流体処理；モデル物質としてのラクトースへのＳＥＤＳの適用」、Pharm. Res. 15:1835〕］。米国特許第５，６３９，４４１号（R.E.シーバー及びU.カースト、１９９７年６月１７日発行）及び分割出願０８／８４７，３１０号に開示されているネブライザー（nebulizer；霧吹き瓶または噴霧器）システムによれば、超臨界流体に溶解しない物質を、水のような非混和性の液体と超臨界流体との混合物を用いて処理し、蒸気のエアロゾルを形成することを可能とする。したがって、米国特許第５，６３９，４４１号に開示されている方法と装置を用いることにより、超臨界流体及び／または有機溶媒に溶解する物質の相応の粒子よりもむしろ、水溶性蛋白質、賦形剤、安定剤、充てん剤、及び／または界面活性剤の粒子を形成することができる。この開示と不一致でない範囲内において、米国特許第５，６３９，４４１号を参照のためにここに組み込む。他の沈殿法（例えば、上記ＳＥＤＳ法及びＧＡＳ法）とは異なり、新しい方法では、有機溶媒を必要とせず、薬剤、水、及び超臨界流体または近臨界流体（例えば、二酸化炭素）のみを必要とする。
【０００３】
水溶性蛋白質及び他の水性製剤の粒子を調製することができるけれども、これらの蛋白質及び／または製剤の好適な乾燥粉末を形成する方法は、今日まで存在していなかった。噴霧乾燥、凍結乾燥、または超音波ネブライゼーション(nebulization；噴霧)のような乾燥蛋白質粉末を製造する既存の技術は、種々の問題をこうむる。一般に、乾燥蛋白質粉末は、従来技術の方法で製造した場合、これらの方法に伴う処理工程、これらの方法を用いて蛋白質を乾燥するのに必要とされる温度、及びこれらの方法での脱水処理が蛋白質の繊細な構造を損傷するため、多くの場合、取り消せないまで不活性化される。また、直接吸入用途での使用には、粉末は、効果的な肺投与を可能とするため、充分に小さくなければならない。肺経路を通しての薬物投与は、痛みを軽減したり、所望箇所への薬物投与をより迅速にするなどの理由により、注射などの他の投与経路より好ましい。乾燥工程で製造される粒子が所望より大きいと、ジェットミルするか機械的に粉砕しなければならない。これにより、分子に追加の物理的ストレスがもたらされ、蛋白質活性がさらに低下する。乾燥粒子を適正な大きさの範囲で製造すると、肺投与のための乾燥粉末吸入器に直接使用することができる。
【０００４】
噴霧乾燥は、乾燥蛋白質粉末を製造するために現在利用できる方法である。噴霧乾燥技術では、ジェット・ネブライザーが小滴のプルーム(plume；柱）を形成するのに用いられる。一つのタイプのネブライザーでは、液体試料が高圧のガス流により小径チューブを通して吸い込まれる。ガスは、液体を微細な液滴に粉砕する。また、ガスは、小径チューブを直角に交差して流れて、同様の方法で液滴を形成することができる。超音波ネブライザーは、試料溶液に連結する超音波振動を用いて、溶液を小さな液滴に粉砕する。噴霧乾燥法の一つの不利な点は、ジェット・ネブライザーに存在する分子のプルームがそれほど濃くはないことである。これは、蛋白質の所望量を製造するのに遅い処理をもたらす。凍結乾燥は、乾燥蛋白質を製造するのに現在用いられている他の方法であり、そこでは、薬物の水性溶液が凍結され、そして、水分を昇華させるために真空下に置かれる。凍結乾燥法の一つの不利な点は、乾燥工程が非常に遅いことである。また、製造された粒子は、比較的大きく、製薬的に望ましい大きさとするために、追加の処理工程が必要とされる。
【０００５】
米国特許第６，０６３，１３８号（ハンナら、２０００年５月１６日発行）及び関連するＥＰ０７６７７０２号には、超臨界流体、第一ビヒクル中の物質の溶液または懸濁液、並びに第一ビヒクルと実質的に混和しかつ超臨界流体に実質的に可溶性である第二ビヒクルを、超臨界温度と圧力に維持した粒子形成容器中に一緒に導入することにより、物質の粒子を形成する方法が記載されている。
【０００６】
ＰＣＴ公開出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１９３０６（ＷＯ０１０５４１）（エドワードら）には、生物活性剤、リン脂質、及び有機溶媒若しくは有機−水性混合溶媒を混ぜ合わせて混合物を形成し、次いで、噴霧乾燥することにより、粒子を形成する方法が記載されている。
【０００７】
米国特許第５，６９５，７４１号（シャットら、１９９７年１２月９日発行）並びに関連米国特許第５，６３９，４４３号（シャットら、１９９７年６月１７日発行）及び５，７２０，９３８号（シャットら、１９９８年２月２４日発行）には、磁気共鳴結像及び超音波結像に有用な「マイクロバブル」が記載されている。該「マイクロバブル」は、液体調合物を噴霧乾燥してボイドを有するマイクロスフェアーを製造し、次いで、該マイクロスフェアーにフルオロカーボンガス浸透剤を浸透させることにより調製される。
【０００８】
米国特許第５，９２８，４６９号（フランクら、１９９９年７月２７日発行）には、材料を水溶性または水膨潤性の担体物質と混合し、得られた混合物を噴霧乾燥して、該材料と担体物質の両者を含み、担体物質が非晶（ガラス状またはゴム状）状態である粒子を形成することが記載されている。フランクは、１００〜３００℃のガス温度で噴霧乾燥すると述べている。
【０００９】
米国特許第６，００１，３３６号（ゴードンら、１９９９年１２月１４日発行）には、水性溶液中に溶解させた疎水性成分と親水性成分の懸濁液の噴霧乾燥が記載されている。
【００１０】
米国特許第５，８５１，４５３号（ハンナら、１９９８年１２月２２日発行）及び関連するＥＰ０７０６４２１号には、超臨界流体及び超臨界流体に可溶性のビヒクル中の物質の溶液または懸濁液を、制御された温度と圧力に維持された容器に導入して、粒状生成物を形成する方法と装置が記載されている。ＷＯ９５／０１３２４号（ヨークら、１９９５年１月１２日発行）には、この方法を用いたサルメテロール・キシナホエート(salmeterol xinafoate)粒子が記載されている。
【００１１】
ＷＯ９９／１６４１９号（タララら、１９９９年４月８日発行）には、液体を霧にして、形成された該液体の小滴を噴霧乾燥する「孔あき微細構造」の調製が記載されている。ＷＯ００／００２１５（ボトら、２０００年１月６日発行）には、「生物活性剤」を含有する「孔あき微細構造」の投与システムが記載されている。
【００１２】
ＷＯ９９／５９７１０号（ハンナら、１９９９年１２月２５日発行）には、第一の超臨界流体若しくは近臨界流体であるか、またはこれを含む第一のビヒクル中の物質を溶解若しくは懸濁し、そして、該溶液若しくは懸濁液を、第二の超臨界流体を含有する粒子形成容器に通すことによる物質の粒子形成方法及び装置が記載されている。該容器は、第二の超臨界流体が超臨界を維持するように温度と圧力が維持されている。
【００１３】
ＷＯ９８／３６８２５号（ハンナら、１９９８年８月２７日発行）には、一方が対象となる物質(substance of interest)を含有する２つの超臨界流体を加熱加圧室に導く粒子形成の方法と装置が記載されている。
【００１４】
乾燥形態で安定な若しくは薬学的に活性な蛋白質、及び乾燥形態で安定な若しくは薬学的に活性な蛋白質を製造する方法に対する要求がある。また、改良された薬学的活性を持つより小さな粒子を製造する必要がある。
【００１５】
発明の概要
この発明によれば、超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体またはこれらの混合物のいずれかに可溶性であるか、あるいは水性溶液に可溶性若しくは懸濁可能である一種以上の物質を含む、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）一種以上の物質と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを含有する組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させる
ことを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法が提供される。
【００１６】
好ましくは、バブル乾燥(bubble drying)は、調合薬の分解を最小限にするために、周囲温度超過で１００℃未満の温度で行うべきである。充分な滞留時間と希釈度が与えられるならば、乾燥ガスの流れは、外部加熱なしに微細な小滴を乾燥させる。加熱すれば、水の蒸気圧を増大させて乾燥を加速させる。該組成物は、水性溶媒を含有することもできる。
【００１７】
また、本発明によれば、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）一種以上の対象となる物質を含有する水性溶液と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを混合して組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させることを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法が提供される。
【００１８】
さらに、本発明によれば、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）対象となる物質の水性溶液と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを平衡させて、組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させる
ことを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法が提供される。
【００１９】
さらに、本発明によれば、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子を形成するための装置であって、
（ａ）第一の非ガス状超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体を含有する第一加圧室、
（ｂ）第二の非ガス状流体中の物質の溶液または懸濁液を含有する第二室、
（ｃ）導管により第一及び第二室と連結された、前記溶液または懸濁液と第一流体とを混合するための混合室、
（ｄ）第一流体を混合室に通過させるための第一室と混合室との間の導管に連結された第一流量制御手段、
（ｅ）第二液体を混合室に通過させるための第二室と混合室との間の導管に連結された第二流量制御手段、
（ｆ）混合室の中から出た組成物を超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体の圧力より小さな圧力を有する急速膨張領域に導いて該物質の微細粒子のディスパージョンを形成するために、混合室に連結されたリストリクター、
（ｇ）リストリクターに連結された乾燥室、
（ｈ）１つ以上の注入口で乾燥室に連結されたガス源、
（ｉ）乾燥室を通過した後に粒子を収集するための手段
を含むことを特徴とする微細乾燥粒子を形成するための装置が提供される。
【００２０】
該混合室は、低死容積(low dead volume)のＴ管継手(tee)状の混合室（以下、「Ｔ管継手」または「混合Ｔ管継手」ともいう。）であることが好ましい。
【００２１】
微細粒子は、約５μｍより小さな直径を持つものである。本発明の方法により形成された粒子は、約０．１μｍから約５μｍの間で直径が変動する。製造された粒子は、０．１μｍより小さくてもよいが、現在の検知方法は、低い粒度領域で粒度限界があり、かつ、小さい粒子は、質量の重要な画分を構成しない。粒子は、如何なる直径の分布であってもよい。ある種の用途、例えば吸入療法に対しては、殆どの粒子が、深い肺臓の肺胞に投与するために、呼吸可能な範囲内にあることが好ましい。好ましくは、粒子は、吸入用途のために１〜３μｍの粒度の範囲内にある。粒子は、他の用途に対しては、この技術分野で公知であるか、あるいは過度の実験なしに容易に決定できるように、異なる粒度であってもよい。吸入用途については、粒子は、平均粒度から小さな分散を有していることが好ましい。
【００２２】
ここで使用するように、「乾燥」または「乾燥した」とは、若干の水分、好ましくは５重量％以下の水分を含有する粒子を含む。乾燥粒子は、０．０００１〜１重量％の水分、１〜３重量％の水分、１〜５重量％の水分、５〜１０重量％の水分、及びこれらの範囲の組み合わせを含有する粒子を包含する。
【００２３】
種々の形状の粒子が本発明に包含される。例えば、粒子は、中空、即ち「バブル」（泡）であり得る。該バブルは、テニスボールやピンポン玉に類似の中空体であるが、テニスボールやピンポン球のような球形でなくてもよい。粒子の直径は、典型的には、外皮の厚みの約１０から１０，０００倍である。本発明の方法により形成される他の粒子は、中空ではない。中空粒子を形成するには、より高い乾燥温度（〜１００℃）が好ましいが、同じ物質をより低い温度でゆっくりと乾燥すれば、固体球となる。
【００２４】
「組成物」は、必ずしも全ての物質が互いに可溶性であることを意味しない。本発明の方法により粒子とされる物質は、超臨界流体若しくは近臨界流体またはこれらの混合物のいずれかに可溶性である物質、あるいは水性溶液に可溶性若しくは懸濁可能な物質を包含する。水性溶液は、各種助溶媒も含むが、有機溶媒の使用を避けると、環境上及び毒物学上の利益を得ることができる。粒子にすることができる幾つかの物質には、界面活性剤、インシュリン、アミノ酸、酵素、鎮痛薬、抗がん剤、抗菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、抗真菌性製薬、抗生物質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、免疫抑制剤、血栓溶解剤(thrombolytics)（以下、「血栓崩壊剤」ともいう）、抗凝血剤、中枢神経系統刺激剤、うっ血除去薬、利尿血管拡張薬、抗精神病薬、神経伝達物質、鎮静薬、ホルモン、麻酔薬、抗炎症薬、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン、ミネラル、及びその他の公知の生理活性材料からなる群より選ばれる一種以上の物質からなる生理活性組成物が包含される。モノクローナル抗体及びワクチンの粒子を製造することができる。塩化ナトリウムのような物質の粒子も製造することができる。幾つかの物質は、薬学的に活性である。「薬学的に活性な蛋白質」は、薬学的に使用するのに充分な活性を持っている蛋白質を指している。他の物質は、生理的または薬学的に活性でなくてもよい。
【００２５】
本発明の方法及び粒子において、種々の添加剤を使用することができる。これらの添加剤は、物質に添加することができ、あるいは工程で溶媒を使用することができる。添加剤は、形成後の粒子に直接添加することもできる。添加剤には、安定剤、付形剤、充てん剤、及び界面活性剤が含まれる。蛋白質製剤に安定剤を使用すると、乾燥での蛋白質活性の低下に対して保護する。安定剤としては、限定されないが、糖類、及び親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチル澱粉、デキストラン、その他）が包含される。安定剤は、糖類または異なる糖類の混合物であることが好ましい。使用することができる糖類には、マンニトール、ショ糖、乳糖、及びトレハロース、並びにその他のモノ−、ジ−、及びオリゴ糖が包含される。脱水前の蛋白質溶液に一種以上の安定剤を添加すると、酵素活性の低下に結びついていると考えられている蛋白質内における構造変化をかなり抑制する。一種以上の界面活性剤を、小滴／空気間のストレスを緩和し、かつ、乾燥時に起こる分解を減少させるために、添加することができる。界面活性剤は、乾燥時に起こる凝集または塊状化を緩和するために添加することができる。また、界面活性剤は、球形粒子の形成を助けると考えられる。使用される界面活性剤の具体例としては、ツイーン２０（商標権者Croda International PLC）、ツイーン４０（商標権者Croda International PLC）、ツイーン８０（商標権者Croda International PLC）及びツイーン８５（商標権者Croda International PLC）のようなポリオキシエチレン(20)ソルビタン系界面活性剤（ツイーン；Tweens：商標権者Croda International PLC)；ステアリン酸；myri（ＰＥＧモノステアレート）、スパン８５（ソルビタントリオレエート）、及びベックマンらの(2000)「ネイチャー」４０５：１６５で報告されているタイプのポリエーテル−カーボネートブロック共重合体が挙げられる。ホスホグリセリドを含むリン脂質を用いることができる。界面活性剤とグアニジン塩酸塩などの他の添加剤とは、加圧処理を伴う蛋白質の構造復元を容易にする（R. J. St. ジョンらの(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13029）。充てん剤及び付形剤は、不活性でも活性でもよい。
【００２６】
最終製剤の安定性が必要であれば、緩衝液を最初に添加することが好ましい。さらなる安定性が必要であれば、糖類を添加することができる。より一層の安定性が必要であれば、界面活性剤を添加することができる。ｐＨ緩衝物質は、高圧で二酸化炭素が分解して炭酸を形成することによりｐＨが急激に低下するのを相殺するのに有用である。
【００２７】
低力価の薬剤に対しては、粉末中の添加剤の画分は最小とすべきであり、高力価の薬剤に対しては、不活性な付形剤（希釈剤）は、ときには全量の９９％以上を構成する。添加剤は、組成物に対して有用な量で添加することができる。添加剤は、蛋白質を含む溶液に対して、典型的には、約０．００１〜０．５重量％の界面活性剤（好ましくは、約０．００１〜０．１重量％）、及び約０．０５〜２５重量％の安定剤（糖類を用いた場合には、約０．１〜２０重量％が好ましく、糖類の溶解性の限度で制限される）の濃度で用いられる。これらの百分率は、噴霧及び乾燥する前の水性溶液に対して表示される。乾燥粉末中での糖類の最終的な百分率は、９９．９％にまで高くなることができる。
【００２８】
該組成物は、疎水性化合物などの超臨界若しくは近臨界流体に溶解する物質を含有することができる。超臨界若しくは近臨界流体の混合物を用いることができる。また、組成物は、物質の水性溶液若しくは懸濁液及び超臨界若しくは近臨界流体（または流体類）を含有することができる。次いで、親水性物質などの超臨界若しくは近臨界流体に溶解しない物質の小滴が形成される。この方法の一つの態様では、溶解または懸濁した化合物を含有する水性溶液が低死容積のＴ管継手にポンプで送られるとともに、超臨界若しくは近臨界流体が該Ｔ管継手の他の脚の中にポンプで送られる。超臨界流体の臨界圧力に近いかそれ以上の圧力（二酸化炭素を使用するときは、約７０から約１００気圧）に加圧された生成エマルジョンまたは超臨界溶液は、フロー・リストリクター（restrictor；絞りまたは絞り弁）から大気圧に膨張させられ、溶解した薬剤種を含有する微細な小滴またはバブルを形成する。このエアロゾルは、乾燥室に導かれ、そこで、溶媒の蒸発と粒子形成が行なわれる。
【００２９】
この方法の第二の変形では、低死容積のＴ管継手なしにエアロゾルが形成される。この方法では、前駆体の水性溶液が最初に、静止吸収缶(static canister)または室中で、好ましくは撹拌若しくはかき混ぜながら、近臨界若しくは超臨界流体と平衡させられる。次いで、この組成物は、フロー・リストリクターから大気圧に膨張させられ、微細な小滴を形成する。これらの小滴は、乾燥室に導かれ、そこで、溶媒の蒸発と粒子形成が行なわれる。
【００３０】
超臨界流体中でも水性溶媒（または溶媒混合物）中でも、物質の初期濃度は、溶媒若しくは超臨界流体中での該物質の溶解度若しくは飽和点によってのみ制限される。典型的な出発濃度は、該溶液若しくは流体中の全個体の約１から約２５％w/ｗである。
【００３１】
超臨界流体としては、二酸化炭素が好ましい。何故ならば、二酸化炭素は、容易に得られる臨界圧力及び温度を有しているのみならず、内因的かつ相対的に非毒性であるからである。他の超臨界若しくは近臨界流体であっても、超臨界温度と圧力とを得ることができかつ有用であれば使用することができる。二酸化炭素は、現在、如何なる有機溶媒よりも費用がかからず、かつ、その使用は、ＶＯＣ放出を避ける。水に対する二酸化炭素の溶解度は、１００気圧、近環境温度で、約２％である。
【００３２】
小滴の流れと接触するガスは、不活性であることが好ましく、その好ましい具体例は窒素ガスであるが、乾燥過程で分子と反応するようにガスを選択することができる。試料の流れと接触するガスの流れは、試料の流れを取り巻く鞘（シース）を形成することが好ましいが、ガスの流れは、試料の流れと乱流混合のような他の手段で接触することができる。このガスは、粒子の乾燥を所望の水準とするのに充分で、かつ、粒子の生物活性を実質的に低下させない温度に加熱することが好ましい。ガスは、約２℃から約３００℃の間の温度、好ましくは１００℃未満の温度に加熱することができるが、乾燥する物質と組成物の成分に応じて、温度を調節することができる。乾燥温度の好ましい範囲は、約３５℃から約１００℃の間である。
【００３３】
ガスは、乾燥管のような乾燥室に入れることが好ましい。乾燥管は、粒子がその末端に到達する時間までに、所望水準の水分を有する粒子を製造するのに必要なだけ長い。乾燥管は、急速な膨張により形成された小滴プルーム（柱）の直径より大きいことが好ましい。乾燥管は、加熱することができるが、必要とするものではない。水を蒸発させるのに必要とされる熱の殆どは、乾燥室に入れる前に乾燥ガスを加熱することにより供給することが好ましい。乾燥管を加熱すると、該管表面での凝縮を防ぐのを助けることができる。乾燥管は、赤外線ランプなどのランプ手段で外部から加熱することができ、あるいは該管を構成する材料中に埋め込んだ加熱ワイヤなどの公知の手段により内部から加熱することができる。乾燥管は、それが受ける温度に耐えることができる適当な材料から作ることができる。乾燥管を作ることができる材料の例は、ステンレス鋼またはホウケイ酸塩ガラスである。所望の結果が得られるならば、その他の設計の乾燥管を使用することができる。乾燥管に代えて同じ機能を果す他の装置、例えばマイクロ波加熱炉を使用することができる。
【００３４】
組成物の圧力の急速な減少は、典型的には、フロー／圧力リストリクターを用いて行われる。リストリクターとしては、ステンレス鋼やセラミック材料などの熱伝導性材料の中空ニードル、あるいはかけられる圧力と熱に耐える他の材料の中空ニードルが挙げられる。リストリクターは、その代わりに、溶融シリカのフロー・リストリクター、あるいは他の箇所で詳述するようなセラミックキャピラリーのマルチチャンネル束であることができる。また、高圧焼結ステンレス鋼フィルターをエアロゾルを発生させるのに使用することができる。リストリクターの長さは、典型的には約２インチの長さであるが、この長さは、低い流速を生じさせたり、閉塞を引き起こすリストリクター中での充分な固体物質の沈殿を生じさせたりするほどに長くてはならない。リストリクターは、所望の粒度の粒子が形成され、かつ、ポンプが圧力を維持するのに充分な容量を有している限り、所望の大きさの直径をもつことができる。直径の下限は、リストリクターを通過させられる溶液の粘度によって決定される。該粘度が高すぎると、粒子が形成されない。
【００３５】
本発明はまた、マルチチャンネル・リストリクターを提供する。これらの開口は、互いにほぼ同じ距離に配置される。構造は、円筒形、六角形、あるいは使用される他の構成材と結合できる他の形状であることができる。開口は、円形や六角形のような適当な形状であることができる。そのような構造の一つの態様は、全直径が約２ｍｍで、約９００の非同心平行チャンネルを持っている。このマルチチャンネル・リストリクターは、所望の粒子形成を提供する全直径を持つことができる。各チャンネルは、約４０μｍから約１２５μｍの間の内径を持つことが好ましい。他のマルチチャンネル構造を使用することができ、また、開口は、同様の大きさにされていることが好ましいけれども、同様の大きさである必要はない。
【００３６】
リストリクター構造の出口先端は、平または実質的に平であるか、あるいは形づけられていてもよい。特に有用な一つの形状は、鉛筆に類似の延びた先端を形成するために、平な末端の側部から材料を除去することにより形成される。この変更は、１８０°の角度にわたって噴出する小滴のより分散した流れを与えて、粒子がバブル乾燥を受けるため、粒子の凝集を防止するのを助力することに役立つ。所望の結果に基いて、最良の結果を与える特定の幾何学的形状は、日常の実験作業により発見することができる。組成物への圧力を減少させるために入手可能な他の手段は、乾燥を加速させるために使用することができる。
【００３７】
組成物が通過する多数の開口により、システムを通過する流速を増大させることができ、システムのスループットが増大する。全体的なスループット速度は、主としてフロー・リストリクターの全内径によって制御される。また、単一チャンネルのリストリクターの各種内径を使用することができ、７５μｍ、１００μｍ、１７０μｍ、及び２００〜１０００μｍが含まれる。単一チャンネルのリストリクターに対するマルチチャンネル・リストリクターの他の利点は、一つのチャンネルが閉塞すると、残余のチャンネルが機能を残していることである。
【００３８】
この発明の方法は、現在手に入れることができるよりもより速い乾燥が望まれているプロセスに使用することができる。本発明の膨潤／破裂工程が乾燥のために大きな表面を与えるため、迅速な乾燥が生じるが、出願人は、この理論により制限されることを望んでいない。
【００３９】
本発明の方法により、対象となる蛋白質と、所望により、賦形剤、安定剤、充てん剤、及び界面活性剤からなる群より選ばれる一種以上の添加剤とを含有し、該添加剤が乾燥蛋白質の重量で測定して約０．００１％から約９９．９％の濃度で存在し、かつ、約０．１μｍから約１０μｍの直径を持つ粒子からなる、乾燥形体での薬学的に活性な蛋白質組成物を含む各種粒子が製造される。粒子は、関係する特定の物質及び粒子形成と乾燥が起こる条件に依存して、種々の嵩密度を持つことができる。例えば、約０．１と１．５ｇ／ｃｍ3との間の嵩密度を持つ粒子が形成される。嵩密度は、１ｇ／ｃｍ3未満、０．８ｇ／ｃｍ3未満、０．５ｇ／ｃｍ3未満、０．４ｇ／ｃｍ3未満、または他の範囲であることができる。粒子は、再水和(rehydration)の後、種々の活性を有することができる。例えば、再水和により、最初の活性の少なくとも９０％を持つ乾燥粒子が本発明に包含される。最初の活性の９０〜９５％、９０〜１００％、１００〜１２０％を持つ粒子もまた、これらの中でも本発明に包含される。
【００４０】
粒子は、形成と乾燥後には、袋や他の貯蔵器具内に置くことを含めて、簡便な方法で貯蔵することができ、あるいは貯蔵中にＰ4Ｏ10のような乾燥剤上で追加の乾燥を行なうことができる。
【００４１】
また、本発明は、現在入手できるシステムよりも低容量の試料を必要とする注入口を用いたネブライゼーション・システムが提供される。これは、例えば、高価な試料を用いた実験室規模での実験を行うときに好都合である。また、この注入口は、溶媒のみでネブライゼーション（噴霧）及び乾燥システムの平衡を可能とし、システムが平衡した後、蛋白質を含有する溶液の導入がなされる。これにより、蛋白質の損失が軽減される。この噴霧システムは、バブル乾燥システムに取り付けることができ、あるいは低温での速い乾燥を可能とするため、慣用の噴霧乾燥(spray drying)で用いられている機器に結合させることができる。
【００４２】
一種以上の物質の分量を水性または超臨界若しくは近臨界溶液を含む溶液の流れの中に、小容量の試料を流れの中に導入する手段を用いて注入し、生成した溶液を急速な圧力減少に付して小滴を形成する小滴の製造方法が提供される。好ましくは、導入手段は、ＨＰＬＣ用に使用されているような注入口(injection port)である。導入される容量は、好ましくは約０．０１ｍＬから約１０ｍＬである。
【００４３】
この発明の方法を用いて蛋白質または他の物質を乾燥し、水若しくは他の適当な物質で蛋白質を再構成し、そして、所望の手段により投与することを含む蛋白質または他の物質の投与方法が提供される。
【００４４】
また、安定及び／または薬学的に活性な粒子が提供される。「安定」とは、貯蔵、輸送、再構成、及び投与中での分解に対して耐性であることを意味する。
【００４５】
また、組成物が通過する低死容積のＴ管継手、及び該Ｔ管継手に固定された１つ以上の実質的に平行で非同心のチャンネルからなる組成物の急速膨張のための装置が提供される。低死容積のＴ管継手は、約０．２〜１０μｌの容積を有する混合Ｔ管継手である。該Ｔ管継手は、例えば、エポキシ樹脂や適当な管継手などの好適な手段によって、リストリクターに固定することができる。
【００４６】
本発明の乾燥技術は、汎用の乾燥技術に対して利点を有している。本発明の乾燥技術は、粒度または形態の重要な変更なしにスケールを変えることができる。また、該方法は、他の方法で製造された粒子よりも低い密度を有する粒子を提供する。これは、小さな空気力学的大きさを持つ粒子に導くが、一つの態様において、追加のガス状超臨界流体が形成され、そして、多孔若しくは中空構造の粒子を含む物質を残すため、大きな絶対粒子寸法に導く。これは、一つの用途において、そうでなければ可能な深い肺へ到達する低い運動量を持ったより大きな粒子を可能とする。
【００４７】
発明の実施の形態
乾燥蛋白質を形成するために現在用いられている技術に対する本発明の有利な点には、目下入手可能な技術を用いて乾燥するのには現在不適当な各種蛋白質及び他の材料の安定な製剤を形成する能力が含まれる。本発明は、乾燥中に物質に対して、低いストレスと少ない過酷な損傷を与える。また、この方法により形成された蛋白質を含む微細粉末の安定な製剤は、吸入可能な大きさの領域に直接製造され、乾燥製剤に追加のストレスとさらなる活性の低下を与えることになる追加の機械的な微細化の必要を取り除く。現発明の方法で用いられる温度は、好ましくは、慣用の乾燥プロセスのそれよりかなり低い。この乾燥温度の低下は、広範な熱分解を少なくする。現発明の方法により形成された粉末は、慣用の方法よりも調製された粉末中に少ない水分を保持することができ、追加の乾燥工程の必要を取り除く。本発明は、慣用のネブライゼーションで見られる変性量と生じる凝集を減少させる。
【００４８】
本発明の一つの特別に具体化された態様は、この発明の方法における流体の流れ、溶液、及び粒子を図示する図１に示されている。液体二酸化炭素を含有する二酸化炭素貯蔵容器１０（ガスシリンダーまたは他の貯蔵容器であり得る）が導管７０を経て二酸化炭素ポンプ１５（シリンジ・ポンプまたは他の適当なポンプであり得る）に連結されている。二酸化炭素ポンプ１５は、導管７１により混合Ｔ管継手２０に連結され、二酸化炭素が加熱された混合Ｔ管継手２０に到達した時、それを通って、二酸化炭素が超臨界若しくは近臨界流体となる条件下で汲み出される。水性溶媒貯蔵容器４０は、導管７２を経て流体ポンプ３２、好ましくは高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）ポンプに連結され、それは、導管７３を経て注入口３０に連結される。注入口３０は、蛋白質やその他の薬剤、緩衝液、充てん剤、賦形剤、安定剤及び／または界面活性剤の水性溶液を加えるために用いられる。注入口３０を通って注入された添加剤有りまたは無しの貯蔵容器４０からの水性溶媒の溶液と蛋白質溶液は、導管７４を経て混合Ｔ管継手２０に連結される。混合Ｔ管継手２０は、その中で超臨界二酸化炭素と水性溶液との緊密な混合物が形成されるように、例えば約１０μｌより小さい容積を有することが好ましい。混合Ｔ管継手２０には、混合Ｔ管継手内の背圧を維持するために圧力リストリクター２５が装着され、また、所望により、そこでの超臨界温度を維持するために加熱コイルを装着することができる。生じた混合物が混合Ｔ管継手２０から小直径の圧力リストリクター２５を通って通過すると、圧力リストリクター２５のオリフィスの出口で急な圧力の解放が起こり、溶液の小滴及び／またはバブルの非常に微細なエアロゾルが形成される（８０）。リストリクターは、単一の出口からなっていても、あるいは多数の出口からなっていてもよい。次いで、エアロゾル８０は、乾燥管４５の中心に導かれる。乾燥管４５は、長さ１メートルより短く、かつ、直径１０ｃｍより小さいことが好ましい。窒素貯蔵容器３４から窒素ガスが導管８５を経て、投入口３５を通って乾燥管４５に加えられる。好ましくは、複数の投入口３５が乾燥管４５の中心の回りに等間隔で配置される。ランプ９０を加熱乾燥管４５に用いることができる。また、窒素ガスは、図２に示すように加熱することができる。爆発の危険がなければ、加熱空気またはガス混合物を使用することができる。加熱は、乾燥工程を助け、かつ、水が管内壁及び濾紙上へ凝縮しないようにする。水が濾紙上に凝縮すると、詰まりを生じさせる。乾燥管４５の出口には、濾紙ホルダー５０が装着され、それは、適当なコネクター９１を通って真空ポンプ５５に連結されている。
【００４９】
運転中、液体二酸化炭素は、二酸化炭素貯蔵容器１０から超臨界二酸化炭素ポンプ１５により汲み出され、導管７０を経てポンプ１５へ、そして導管７１を経て、低容積（０．２〜１０μｌ）の混合Ｔ管継手２０に至り、そこで超臨界流体（既になっていない場合には）若しくは近臨界流体になる。ポンプ３２は、溶媒貯蔵容器４０から導管７２を経て水性溶媒を汲み出し、水性溶媒は、導管７３を経て注入口３０に送液され、そこで、対象となる蛋白質が水性溶液として加えられる。添加剤もまた、注入口３０からか、あるいは貯蔵容器４０内の溶媒に導入することができる。緩衝液を蛋白質溶液または貯蔵容器４０の水性溶媒中で用いて、蛋白質の変性の可能性への影響を減少し、また、さもなければ混合物への二酸化炭素の導入による非補償ｐＨ変化が原因となって起こるであろう凝集物の産出を減少させることができる。混合Ｔ管継手２０は、加熱コイルを用いて加熱することができ、及び／またはリストリクター２５は、二酸化炭素の臨界温度を超える温度を維持するために加熱することができる。二酸化炭素及び水性溶液の流量は、図１に示されていないバルブを用いて、それぞれ独立に調整される。流速は、ポンプ条件を変更することによっても制御することができる。混合Ｔ管継手２０内の混合物は、下流側に膨張して、水性溶液中に溶解若しくは懸濁した物質の微細な粒子からなるエアロゾル８０を形成する。粒子は、乾燥管４５の中心に導かれ、そこで乾燥され、そして濾紙ホルダー５０の濾紙上に集められる。あるいは、粒子は、例えば、粒度分布が適しておれば、サイクロン分離機または多段式インパクタを用いて収集することができる。
【００５０】
注入口３０を用いると、蛋白質及び／または添加剤を導入する前にシステムを平衡させることができる。システムの平衡は、熱電対で測定した乾燥管の温度が平衡し、かつ、水性溶液と二酸化炭素の流速が定常状態になった時に到達する。平衡後、既知の容量の蛋白質製剤が水性供給ラインへ、注入口３０を通って注入される。
【００５１】
供給段階において２つの分離した溶液ループが存在するように、６口注入バルブをネブライゼーション・システムでの使用のために適用することができる。溶媒がＨＰＬＣポンプから混合Ｔ管継手を通って一つのループに汲み出され、試料は、供給段階では溶媒ループに結合されていない試料ループ（例えば、３ｍｌ試料ループ）内に含有される。注入段階の間に、溶媒は、ＨＰＬＣポンプから試料ループを通って混合Ｔ管継手へと汲み出される。この変更は、蛋白質またはその他の対象となる物質をＨＰＬＣピストンを通って汲み出さないという利点を有しており、非常に少量の試料を注入する能力を与える。運転毎に必要とされる蛋白質の量及び全体の運転回数は、実質的に低減される。
【００５２】
試料注入バルブが用いられる時には、典型的なシステム・パラメータには、内径５０μｍで長さ５ｃｍの溶融シリカ・リストリクターを用いて、二酸化炭素圧１００ａｔｍ、二酸化炭素流量０．３ｍｌ／ｍｉｎ、水性流量０．３ｍｌ／ｍｉｎが含まれる。
【００５３】
図２には、乾燥管及び乾燥工程のより詳細な図面が示されている。混合Ｔ管継手２０からの溶液は、リストリクター先端７０を通って、注入口１００から乾燥管４５内へ通過させられ、そこで小滴が形成される。貯蔵容器３４からの窒素（または他のガス；不活性であるか、あるいはエアロゾル粒子と反応させることが望まれている物質を含むガス）は、導管８５を経てガス乾燥カラム６０を通過する。ガスは、次いで導管９５を経て加熱コイル６５を通過する。好ましい態様では、ガスは、約７０℃に加熱され、かつ、約１５Ｌ／ｍｉｎの流量で存在する。加熱ガスは、導管１００からガス注入口３５を経て乾燥管４５を通過する。好ましい態様において、乾燥管４５は、５個の注入口を持つガラス管であり、注入口の１つは中心にあってエアロゾルを加え、他の４つの注入口は、中心口の周りに配置される。また、ランプ９０が加熱乾燥管４５を外側から加熱するために使用される。乾燥管４５の出口では、粒子がホルダー５０に保持されている濾紙上に集められる。
【００５４】
他の構成の乾燥管４５を用いることができる。例えば、より多いか、あるいは少ない注入口３５を使用することができる。ガスは、管の中央に加えることもでき、そして、粒子は、ガスの周りに加えられる。ガスと粒子は、乾燥管の中で一緒に混合することもできる。管内での乾燥ガスと粒子の相互作用は、最終製品の特性に影響する。
【００５５】
好ましくは、全ての高圧部品は、ステンレス鋼から作られる。その他の不活性材料またはコーティングを使用することができる。好ましくは、濾紙ホルダー５０は、ステンレス鋼から作られる。リストリクターの長さは、好ましくは約２インチ（５ｃｍ）である。上記装置での水性溶液の流量は、約０．５ｍｌ／ｍｉｎから約３ｍｌ／ｍｉｎである。所望ならば、この工程は、同様の温度と圧力を維持しながら、寸法と流量を調節して、より大きいスケールまたはより小さいスケールで実施することができる。特定の具体的な態様において、二酸化炭素及び水性溶媒の流量は、５０μｍ内径のフロー・リストリクターを用いたとき、おおよそ０．３ｍＬ／ｍｉｎである。
【００５６】
注入口３０は、蛋白質製剤の幾つかの小容量のアリコート（約０．１から約１０ｍｌ）を、注入口なしのシステムにおいて１つの大容量（＞１０ｍｌ）により必要とされるのと同じ量の時間で導入することを可能とする。これは、種々の成分と濃度を持つ幾つかの蛋白質製剤を、各運転で用いられる少量の蛋白質で迅速に乾燥することを可能とする。これは、実験毎に１００ｍｌまでの蛋白質溶液を必要とする市販の研究室規模の噴霧乾燥に対して重要な利点である。しかし、本発明の方法は、より大きい容量の蛋白質とより大きい容量の乾燥が望まれている物質で実施することもできる。
【００５７】
リストリクターは、複数の平行チューブを有するマルチチャンネル・リストリクターであることができる。そのようなマルチチャンネル・リストリクターの一つは、ガラス・マルチチャンネル・カラム（アルテック社、イリノイ州）から作ることができる。このカラムは、おおよそ４０または５０μｍまたはそれ以上の内径を有する各ホールがカラム全長にわたって約９００ホール持っている１メートルまでの長さで購入することができる。このようなカラムの一片をマルチチャンネル・リストリクターとして用いることができる。このような製品の一つは、六角形の形状を有している（アルテック部品番号１７０５９）。他の製品は、丸胴形を有しており、六角形が同じ直径の円の中に配置されている。このようなリストリクターの端部の顕微鏡写真を図３に示す。丸胴形リストリクターは、はめ輪シール及びすえ込み取付金具で容易にポンプ及び吸収缶に取り付けることができ、また、ステンレス鋼チューブやＴ管継手に対して、ガラス若しくはセラミックチューブの外側にエポキシ・プレポリマー混合物を塗布し、それを少し大きい鋼チューブの中に滑り込ませることによっても、取り付けることができる。六角形のボイドは、ポリマーまたはエポキシで埋めることができる。これらのマルチチャンネル・リストリクターは、静的または動的プロセスの両方で使用することができる。動的プロセスでは、低死容積Ｔ管継手が、液体（近臨界）若しくは二酸化炭素のような超臨界流体の流れと、噴霧される水性溶液若しくは懸濁液とを緊密に混合するために用いられる。静的プロセスでは、対象となる物質の溶液が超臨界若しくは近臨界流体によって、その臨界温度に近い温度で、加圧される。これは、若干の超臨界若しくは近臨界流体（二酸化炭素が用いられる場合には、約１〜２モル％まで）を水に溶解させることを可能とする。溶液が平衡に達した時、混合しながら、水性溶液と超臨界若しくは近臨界流体とが圧力リストリクターを通って噴出されると、流体が加圧流体帰路から大気圧若しくはそれより低い圧力へと出て行くときエアロゾルが形成される。マルチチャンネル・リストリクターは、ガス逆溶媒法、及び粒子が望まれる如何なる他の方法においても使用することができる。
【００５８】
リストリクターは、形づくられているか、または実質的に平らな端部を有することができる。リストリクターの端部は、機械的に形づくることができる。例えば、研磨材を用いて、材料の一部分を除去することができる。若干の好適な研磨材には、ダイアモンド埋め込みニッケル合金パッド、例えば、３Ｍによって作られた大理石彫刻に用いられる種類のものが含まれる。非常に小さな（ミクロン大の）ダイアモンド結晶は、各チャンネルの周りの壁を研磨してしまう。ダイアモンドパッドで形づくった後の図３に示されるタイプのリストリクターは、図４に示されている。あるいは、微細なフリット・シリコンカーバイド「ウエット−ドライ」サンドペーパーを使用することができる。グラウトまたはタイル中のケイ酸塩は、リストリクターを研磨し、形づくることができる。ダイアモンドが好ましい。
【００５９】
リストリクターの層は、化学的に腐食し去ることができる。例えば、ガラス・リストリクターの選択的な層は、ＨＦにより腐食することができる。使用することができる１つの方法は、先端内にゆっくりと空気を圧入し、そして、リストリクターをフッ化水素酸（水溶液）中に深く深く浸漬させることである。これは、端部を鉛筆状の先端点にまで先細りにさせる。他の適当な化学薬品を使用することができる。例えば、リストリクターが金属である場合には、層を除去するために塩酸のような酸を使用することができる。機械的及び化学的腐食の組み合わせを使用することができる。
【００６０】
円錐形先端の角度は、非常な鋭角から非常なシャープまで変動させることができる（リストリクター本体の面から約５度からリストリクター本体の面から約８９度まで）。円錐形先端の角度は、その中で小滴が形成される容積を決定し、より鋭角の角度により、そこで小滴が形成される容積が増大する。角度がもっと鋭角であると、チャンネルの出口は、丸い穴であるよりも長い楕円形に見える。半球の領域から噴霧すると（単一の方向であるよりも）、少ない凝集で、小滴が乾燥ガス中に急速に分散する。
【００６１】
マルチチャンネル・リストリクターを使用する利点には、単一チャンネルリストリクターに比較して増大したスループットと、幾つかのチャンネルが閉塞したり詰まったりした時に粒子形成を継続する能力が含まれる。流体に対して長く延びた出口を使用することの利点には、１）形成後の粒子の凝集問題を回避するのを助けるより分散した（軸方向に）エアロゾルのプルーム、及び２）よりよく混合された流体が含まれる。
【００６２】
マルチチャンネル・リストリクターは、流体；溶融物；溶液；超臨界流体並びに超臨界流体及び水性及び／または有機溶媒の溶液若しくは懸濁液；エマルジョン；ミクロエマルジョン；ミセル；逆相ミセル及び固体（非晶性または結晶性）の微粒子を含有するエアロゾルになるその他の物質を含む種々の粒子を形成するのに使用することができる。これらのエアロゾルは、ここに述べた方法または公知の他の方法を用いて乾燥することができる。マルチチャンネル・リストリクターは、消火器として使用することもでき、そこでは、フリーラジカル捕獲剤が熱の除去と組み合わせて火を覆い消すのに使用される。ラジカル捕獲剤を含有する非常に微細に分割された水滴のエアロゾル雲は、ＣＯ 2 なしに慣用のスプレー・ノズルから調製された大きい水滴に比べて、より高い表面積と沈殿することのない小滴懸濁寿命を有している。
【００６３】
実施例
材料
結晶化（３回）され、水で透析され、凍結乾燥された微結晶卵白リゾチームをシグマ・ケミカル社から購入した（ロット＃５３Ｈ７１４５）。シグマ・ケミカル社（兎の筋肉から分離、Ｍ4アイソザイム、ロット＃９５Ｈ９５５０）及びベーリンガー−マンハイム（豚の心臓から分離、Ｍ4アイソザイム、バッチ＃８４８９５５２７）から購入した乳酸デヒドロゲナーゼをアンモニウム塩懸濁液から得た。ショ糖とマンニトールは、ファンスチール(Pfanstiehl)・ラボラトリーズから購入し、さらなる精製なしに用いた。ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(Tween20：商標権者Croda International PLC)及び緩衝塩は、アルドリッチ・ケミカルから購入し、さらなる精製なしに使用した。二酸化炭素（ＳＦＥグレード、サイホンタンク）は、スコット・スペシャリティ・ガスから購入した。
【００６４】
方法
酵素の調製。リゾチーム溶液は、固体と予め凍結乾燥した材料を加えて、所望の剤型にすることにより調製した。リゾチームは、かなり頑丈な蛋白質であるため、凍結乾燥や慣用の噴霧乾燥によって重大な損傷を受けることがない。凍結乾燥した粉末を、２及び８℃の間の温度で溶液中にゆっくりと拡散させた。ＬＤＨアンモニウムサルフェイト懸濁液を、２及び８℃の間の温度で１２〜２４時間、１００ｍＬのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）に対して透析させた。次いで、得られた溶液を水で１００ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度に希釈した。
【００６５】
ネブライゼーション及びバブル乾燥システム。超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションに用いられるシステムをここに要約する（図１のダイヤグラム）。水性流れ及び超臨界若しくは近臨界二酸化炭素（Ｔ＞３２℃、Ｐ＝１５００ｐｓｉ）の流れは、水性流れについてはＨＰＬＣ溶媒送出しポンプ（ウオーターズ・モデルＭ−６０００Ａ）を使用し、二酸化炭素についてはシリンジ・ポンプ（ＩＳＣＯモデル２６０Ｄ，１５００ｐｓｉの一定圧で配送）を使用して、各々低死空間の混合Ｔ管継手（Ｖａｌｃｏ）の２つの脚の中に、ほぼ０．３ｍｌ／ｍｉｎの一定流量で、それぞれ配送された。最初は室温の２つの流れは、混合Ｔ管継手に取付けた熱電対制御カートリッジ・ヒーターにより、丁度約３２℃に加熱された。混合Ｔ管継手の中に形成された生成エマルジョンは、内径５０μｍ、長さ５ｃｍの溶融シリカ圧力リストリクター（アルテック）を取付けたＴ管継手の第三オリフィスから膨張させた。圧力リストリクター出たときの超臨界流体の急速な減圧は、水性溶液からの溶解二酸化炭素の爆発的な解放を伴い、若干の残留溶解二酸化炭素を含有する非常に微細な水性小滴の生成を引き起こす。このエアロゾルは、次いで、３０ｃｍ×２ｃｍのホウケイ酸ガラスからなり、上部に４つのガス導入口と、コールド・トラップ及び底部に真空ポンプを伴う粉末濾過装置（ステンレス鋼・ミリポア・フィルター・ホルダー、孔径０．２μｍの酢酸セルロース濾紙）とを取付けた特注の乾燥管に導かれる。ほぼ１５Ｌ／ｍｉｎの流量の加熱した乾燥窒素が、乾燥管上部の４つのガス導入口からエアロゾルと同時に加えられた。さらに、該管は、乾燥工程を助け、かつ、該管内壁での水の凝縮を妨げるために、赤外ランプで外側から加熱された。乾燥管内の生成温度は、ネブライゼーションの間、７０℃未満に維持したが、それは、急速なバブル乾燥を引き起こすのに充分であった。
【００６６】
一度、１０〜１５分間、純水の噴霧及び乾燥によりシステムを平衡させ、水性蛋白質調合剤（２〜２０％ｗ／ｗの全固形分を含有）をＨＰＬＣ型注入口から水性供給ラインに注入した。このタイプの注入口は、水性蛋白質調合剤の極めて小容量のアリコート（０．５から５ｍＬの間）を噴霧、乾燥、及び収集することを可能とし、それは、限られた量の蛋白質で操作するときに特に有用である。このシステムの設計は、暖かい乾燥窒素の絶え間ないパージの下に乾燥粉末を収集することを可能とするが、これは、実験完了後にも、乾燥室から過剰の水蒸気を除去するために継続される。濾紙装置は、次にシステムから分離され、乾燥窒素でパージしたグローブ・バッグに移され、そこで、粉末は、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに移され、蓋をされ、そして、分析するまでの間、濃硫酸上のデシケータ内に貯蔵された。幾つかの実験では、大気圧より僅かに低い圧力（ボウルダーで６３０ｍｍＨｇ、１マイル高い高度でのＣＯ）でフィルターから水蒸気、二酸化炭素、及び窒素を吸引するために、真空ポンプを用いた。他の実験では、真空ポンプを省略して、環境より少し上の圧力で乾燥を行い、同等の結果が得られた（データは示していない）。
【００６７】
静的及び動的システムｐＨ測定
観察可能な静的システムでの低死空間の混合Ｔ管継手内での条件をシミュレーションするために、フィッシャーｐＨ指示液を混合した未緩衝及び緩衝溶液を、サファイア窓、圧力変換機、熱電対リレー制御加熱カートリッジ、及び磁気撹拌機構を備えた高圧室に充填した。セルの内容物は、撹拌し、かつ、ＣＯ2で１５００ｐｓｉに加圧しながら、３５℃で平衡させた。二酸化炭素での水性調合剤の加圧に起因する増加した酸性度の度合いを決定するために、緩衝及び未緩衝溶液について一連のｐＨ測定を行った。第二のより定量的なアプローチでは、緩衝及び未緩衝溶液が超臨界ＣＯ2システムで噴霧され、そして、湿潤エアロゾルとして、収集容器内の水性溶液の水準がｐＨプローブによる測定が可能となるまで集められた。
【００６８】
実験設計
粉末特性用試料を下記の水性リゾチーム調合剤から超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥により調製した：４ｍｇ／ｍＬのリゾチームと１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）とからなる「緩衝液のみ」、４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）、及び１０％ｗ／ｗのマンニトールからなる「１０％マンニトール」、４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）、及び１０％ｗ／ｗのショ糖からなる「１０％ショ糖」、並びに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０％ｗ／ｗのショ糖、及び０．０１％ｗ／ｗのＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）〔ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート〕からなる「１０％ショ糖ｗ／Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）」。ネブライゼーション前に、如何なる粒子をも取り除くために、全ての調合剤を０．２μｍのナイロン・シリンジ・フィルターで濾過した。ほぼ２ｍＬの各調合剤を各運転毎にネブライゼーション・システム内に注入したが、緩衝液のみの調合剤については、この調合剤の全溶質含量が低いために、運転毎に６ｍｌ容量を注入した（分析のために、運転毎に充分な粉末を集めようと努力して）。各調合剤を３回注入し、そして、システムの運転毎の一貫性を決定するために、各粉末バッチを分離して収集した。さらに、ＬＤＨ含有粉末を、０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ、及び１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、並びに下記の賦形剤からなる水性調合剤から調製した：１０％ｗ／ｗのマンニトール、１０％ｗ／ｗのショ糖、及び０．０１％ｗ／ｗのＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）と１０％ｗ／ｗのショ糖。これらの濃度は、バブル乾燥前の水性溶液中でのパーセントを指す：乾燥粉末中の濃度は、水分が除去されるにつれて、比例して大きくなる。
【００６９】
サイズ排除クロマトグラフィ
可溶性凝集物の存在は、２８０、ＧＰ４０勾配流体ポンプ及びスペクトラ・フィジックス・オートサンプラー付きモデルＡＤ２０ＵＶ検知器を装備したディオネックス(Dionex)ＨＰＬＣで、サイズ排除クロマトグラフィにより決定した。固定相は、孔径２５０Åの５ｍｍシリカ・ビードの３０ｍｍ×７．８ｍｍ(i.d.)TosoHaas TSK-Gel G3000SWX1カラムから成る。定組成移動相は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）から成る。注入前に、粉末試料を、脱イオン水により、予備脱水された最初の全固体重量対全溶液重量比に再水和した。再水和試料は、遠心分離し、そして、隔膜で蓋を付けたＨＰＬＣバイアルでオートサンプラー内に入れた。流量は、０．５ｍＬ／ｍｉｎに設定し、そして、ほぼ１０ｍＬの各試料をカラムに注入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ＢＳＡ、及びオボアルブミンが分子量標準物質として用いた。各試料は、３回注入し、各ピーク領域の平均を決定した。
【００７０】
走査型電子顕微鏡
粉末は、ＩＳＩ−ＳＸ−３０及びＪｅｏｌ ＪＩＭ−６４００走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、３０ｋＶの加速電圧で検査した。試料をカーボン・テープを用いてアルミニウム・スタブに固着し、分析前に金スパッタした。
【００７１】
熱分析
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、パーキン−エルマーＤＳＣ−７により実施した。粉末（５〜１０ｍｇ）を陽極化したアルミニウム皿に入れ、湿度制御雰囲気中（＜２％相対湿度）、窒素下で気密密閉した。各試料を−２０℃に急冷し、−２０℃で１０分間保持し、次いで、１０℃／ｍｉｎの加熱速度で２００℃に加熱した。Ｔｇは、ガラス転移温度（ガラス−液体）である。Ｔｍは、固体−液体の溶融温度である。
【００７２】
Ｘ線粉末回折
粉末Ｘ線回折は、４０ｋＶ、２５ｍＡのチューブ・ロードで作動するＣｕＫa源（ｌ＝１．５４０５６Å）を装備したシンターク(Sintag)ＰＡＤＶシステムにより実施した。超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥により調製された粉末中の結晶性の有無を決定するために、試料を０．０２°／ｍｉｎの走査速度で、５°から５０°までの２θの範囲にわたって走査した。
【００７３】
水分分析
カール・フィッシャー滴定をメトラー・カール・フィッシャー自動滴定器で実施した。分析用試料は、１％未満の相対湿度に維持し、窒素でパージしたグローブ・ボックス内で調製した。約１ｍＬの無水メタノールまたはホルムアミドを２５ｍｇの試料粉末に加えた。得られた懸濁液を数回にわたって超音波処理した。１００ｍＬの溶液を電量計内に注入し、粉末の水分含量を、粉末を懸濁させた溶液の背景水分含量を差し引いた後に決定した。各粉末試料の分析は、３回行った。
【００７４】
赤外分光学
ボーマン(Bomen)ＰＲＯＴＡ赤外分光光度計を用いて赤外スペクトルを得た。凍結乾燥粉末（約０．５ｍｇの蛋白質）を３００ｍｇの無水ＫＢｒと混合し、１３ｍｍの真空ダイで圧縮してペレットにした。ペレットを分光光度計の窒素でパージした試料室内に直接置いた。天然蛋白質の水性溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、６ｍｍのマイラー・スペーサーで分離されたＣａＦ2窓を含む試料セル内に載置した。平均１２８スキャンが、４０００〜９００ｃｍ-1の範囲内で４ｃｍ-1の分解能で集められ、フーリエ変換された。水性試料について、液体水及び水蒸気のスペクトルが、予め確定した判定基準に従って、蛋白質溶液の蛋白質スペクトルから差し引かれた〔Ａ．ドンらの(1990)「二次導関数アミドＩ赤外スペクトルからの水中での蛋白質二次構造」、Biochem. 29:3303-3308；Ａ．ドン及びＷ．Ｓ．コージーの(1994)「ヘモグロビン反応と構造研究の赤外法」、Methods Enzymol. 232:139-175；Ａ．ドンらの(1995)「凍結乾燥の赤外分光研究−及び温度−誘導された蛋白質凝集」、J. Pharm. Sci. 84;415-424〕。フーリエ変換されたスペクトルの二次導関数を計算し、そして、ありうる白色ノイズを減少させるために、データのSavitzky-Golay補整を７点繰り込みウインドウで適用した。
【００７５】
リゾチーム酵素活性アッセイ
ミクロコッカス（球菌）lysodeikticus（シグマ社、ロット＃３８Ｈ８６１９）のバクテリア懸濁液をリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．６）中の０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。リゾチーム溶液をリン酸塩緩衝液で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。反応混合物は、２．５ｍＬのセル懸濁液と０．１ｍＬの酵素希釈液から成る。酵素活性は、セル懸濁液の混濁度の減少度に比例したが、それは、４５０ｎｍで２分間の吸収での直線的な減少として分光測光的に測定された。
【００７６】
ＬＤＨ酵素活性アッセイ
ＬＤＨ活性は、２５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（トリス／トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのピルビン酸塩（シグマ社、ロット＃１２６Ｈ１０９８１）、及び０．１５ｍＭのＮＡＤＨ（シグマ社、ロット＃０２７Ｈ７８１９１）からなる２ｍＬの反応混合物中、２５℃で測定した。ＬＤＨ調合剤（１０ｍＬ）を反応混合物に添加し、キュベット（セル）を３回逆転させ、そして、３４０ｎｍでの吸収減少を分光光度計で測定した。超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションの直前と乾燥粉末の再水和の直後に活性を測定し、初期活性のパーセントとして報告した。図１２を見ると、ＬＤＨ活性は、幾つかの組成物において、当初の水性溶液の活性の１００％より大きくなっている。
【００７７】
緩衝液有りと無しとでの静的及び動的ｐＨ測定
ＣＯ2を水に溶解したとき酸性化が起こるか否かの問題が緩衝液の使用により回避できることを研究した。１５００ｐｓｉでの水中へのＣＯ2の溶解度（３５℃でほぼ２モル％）は、未緩衝溶液での酸性度の増加を引き起こす。緩衝液の不存在下で、酸性環境は、潜在的に蛋白質を変性させる。これらの理由により、緩衝なしの水性溶液の酸性度の増加の程度を観察するため、静的システムを混合Ｔ管継手内での状態をシミュレーションするために用いた。酸性度の変化を定性的にモニターするために、二酸化炭素で加圧する前の水性溶液に、ｐＨ感応指示染料を添加した。予期したように、ｐＨは、加圧するや否や指示薬の範囲未満（ｐＨ＜４）に急速に減少した。この影響を中和する能力は、下記緩衝塩について、この静的システムで評価した：一塩基／二塩基リン酸カリウム（ｐＨ７）、トリス／トリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、及び酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ５）。全ての溶液について緩衝能力を、指示薬染料の色の変化を邪魔する緩衝システムの能力として測定することによりテストしたが、ほぼ１００ｍＭの濃度で安定した（データは示されてない）。これらの観察をさらに定量化するために、静的システムで用いたのと同じ緩衝液を超臨界ＣＯ2システムで噴霧して、湿潤エアロゾルとして収集した。各溶液のｐＨは、二酸化炭素の泡立ちにより値が増大しつづけるため、収集直後に測定しなければならない。この実験の結果は、図５に示されており、１００ｍＭの緩衝液が溶解したＣＯ2の影響を適切に中和し、かつ、酸性化により損傷される蛋白質の損傷を回避するという静的観察と一致した。
【００７８】
微細粉末特性
本件発明の方法により製造された分子の表面特性を決定するために、硫酸アルブテロール(albuterol sulfate)、硫酸トブラマイシン、クロモリンナトリウム(cromolyn sodium)、ｒｈＤＮａｓｅ、乳糖、及び塩化ナトリウムの微粉末を上記で概説した方法を用いて調製した。小滴形成の条件は、ＣＯ2圧が１５００ｐｓｉ、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流量、ＣＯ2及びＨ2Ｏ濃度が約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、管入口〜７０℃、管出口〜５０℃、５０ｍｍ、５ｃｍの溶融シリカ・リストリクター、０．２ｍｍの酢酸セルロール濾紙であった。
【００７９】
図６は、この発明の方法を用いて調製された代表的な乾燥粉末の電子顕微鏡写真である。図６Ａは、２０％水性塩化ナトリウム試料を用いて、本発明の方法で調製された乾燥塩化ナトリウム粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）影像である。図６Ｂは、この発明の方法により乾燥した後の同じ塩化ナトリウム溶液の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）影像である。図６Ｃは、マンニトールのＴＥＭ影像である。図６Ｄ及び６Ｅは、１０％（全溶質の質量／容積）水性溶液について、この発明の方法により調製された硫酸トブロマイシン粒子（６Ｄ）及び乳糖粒子中の１％硫酸トブロマイシン（６Ｅ）を示す。図６Ｆは、この発明の方法により製造された硫酸アルブテロール粒子の影像である。図６Ｇは、本発明の方法により製造された硫酸クロモリン粒子の影像である。
【００８０】
乾燥粉末は、「材料」と「方法」で述べた水性リゾチーム調合剤からＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥により最初に調製される。見たところ、回収された試料は、運転から運転での粉末品質の変化が非常に小さく、すべてが非常に微細な白色粉末であった。全粉末は、湿潤空気中で吸湿性であったが、低湿環境中では、自由流動であり、取り扱いが容易であった。典型的な乾燥粉末蛋白質調合剤の電子顕微鏡写真を図７に示す。「緩衝液のみ」の粉末（Ａ）、１０％マンニトール（Ｂ）、１０％ショ糖（Ｃ）、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を有する１０％ショ糖（Ｄ）。Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）を用いた時（図７Ｄ参照）、凝集の少ない粒子で、より明確に球形で、個別の粒子を持つ粉末が形成されることに注目されたい。これは、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）の添加による直接的または間接的な効果である。何らかの特別の理論によって制限されることは望まないが、界面活性剤は、工程処理中で水和するのを助けると思われる。製造された全ての粉末は、粒子の相当部分が都合よく吸入可能な粒度範囲の直径１〜３ｍｍ内にある。緩衝液のみの調合剤及び１０％マンニトールを含有する調合剤から調製された粉末の形態は、ショ糖を含有する調合剤から調製された粉末よりも、かなりの程度、球形及び円滑ではないように見える。ショ糖溶液へのＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）の添加は、乾燥粒子の表面をさらになお円滑にする効果を有している。これは、一般に噴霧乾燥された粒子について、他の研究者により観察されており、水性調合剤への界面活性剤の添加は、水和工程での表面の乱れを減少させる効果を持っていると仮定される。
【００８１】
１０％マンニトール調合剤の顕微鏡写真（図７Ｂ）は、多面粒子として見られるように、より結晶性の材料を示している。
【００８２】
水分分析
本発明の方法により乾燥されたリゾチーム粉末のカール・フィッシャー水分分析も低い水分含有量を示している：１０％（初期水性溶液のパーセント）マンニトールを有する４ｍｇ／ｍＬリゾチーム試料の水分含有量は、０．６±０．０５％であり；１０％ショ糖を有する４ｍｇ／ｍＬリゾチーム粉末の水分含有量は、１．１８±０．０２％であり、そして、１０％ショ糖と０．０１％Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）を有する４ｍｇ／ｍＬリゾチーム粉末の水分含有量は、１．２５±０．０７％であった。
【００８３】
超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥により調製された各ＬＤＨ粉末について行われたカール・フィッシャー滴定は、この新しい方法について、かなり低い水分含有量を達成できることを示している：緩衝液のみの調合剤から調製された粉末の水分含有量は、０．８３±０．０６％ｗ／ｗであり、１０％マンニトール調合剤からは、１．３±０．０１％であり、１０％ショ糖調合剤からは、１．４±０．０８％であり、そして、１０％ショ糖と０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有する調合剤からは、３．２５±０．０３％であった。回収されたショ糖粉末は、非常に吸湿性であり、そして、乾燥窒素下、手袋をはめた袋(gloved bag)中で取り扱わなければならなかった。他の糖類粉末、例えばトレハロースは、吸湿性が少ない。
【００８４】
ＸＲＤ及びＤＳＣ
付形剤の結晶化は、固体の薬学的調合剤の可溶性及び安定性に劇的な効果を有することができるため、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションでの結晶性及び／または非晶性粉末を形成する能力を探究した。凍結乾燥中に結晶化し、かつ、噴霧乾燥で結晶粉末を形成するマンニトールの強い傾向は、よく知られている。したがって、結晶粉末を形成するネブライゼーション・システムの適応性を決定するために、モデル蛋白質を相当程度に安定化することは期待できないけれども、付形剤としてマンニトールを選択した。結晶性は、固体の調合薬に対する充てん剤として用いられる付形剤の望ましい特質であるが、工程処理中に結晶化の傾向がある付形剤は、再水和とその後の乾燥状態での貯蔵中、不安定な蛋白質薬剤に対して、極めて少ない保護しか提供しない。１０％マンニトール調合剤から調製されたリゾチーム試料の粉末回折データは、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションにより調製された試料について、図８に示されている。水性調合剤は、４ｍｇ／ｍＬリゾチーム、ｐＨ７の１００ｍＭリン酸塩緩衝液を含有し、１０％マンニトール（Ａ）または１０％ショ糖（Ｂ）と一緒に噴霧された。バブル乾燥粒子中の最終的な近似の固体重量パーセントは、４％の蛋白質、１６％の緩衝剤、及び８０％の糖類であった。１０％マンニトール溶液から調製された粉末の回折データは、試料内での良好な結晶性を示し、マンニトールのａ及びｂ多型体の混合物であるように見える。この回折パターンは、専門業者（示さず）から入手した純粋Ｄ−マンニトールについて得られた粉末回折パターンと一致している。
【００８５】
入手したマンニトール、リゾチームで噴霧乾燥したマンニトール、リゾチームで噴霧乾燥したショ糖、並びにショ糖及びリゾチームについてのＤＳＣは、示していない。入手したマンニトール試料のＤＳＣは、１５７．２５〜１７７．５６℃のピークを示した：立上り１５６．１０℃。Ｔｍは、１５９℃であった；３００．４７Ｊ／ｇ。４ｍｇ／ｍＬのリゾチームで噴霧乾燥したマンニトール試料のＤＳＣは、７７．６３〜１４６．４８℃のピーク立上りを示した。Ｔｍ＝１５４．７℃；１３４Ｊ／ｇ（逆修正）。４ｍｇ／ｍＬのリゾチームを有するショ糖試料のＤＳＣは、立上り４０．２５℃で２１．９３から４７．１２℃のＴｇを示した。Ｔｇ＝４３．０５℃及び１．５１Ｊ／ｇ度（逆修正）。Ｔｗｅｅｎ及び４ｍｇ／ｍＬのリゾチームを有するショ糖のＤＳＣは、２８．５７から５６．９９℃のＴｇを示した；立上り４５．３６℃；１．００Ｊ／ｇ度；Ｔｇ＝５０．９５℃。
【００８６】
ショ糖調合剤のＸ線粉末回折データ（図８、パターンＢ）は、ＤＳＣサーモグラム中に観察されるガラス転移により確認された、より非晶の性質を示している。ガラス転移温度未満で非晶のガラス状粉末を形成する能力は、最近、蛋白質の安定化とガラス化（ガラス形成）とが結びついているという重要な証拠が見出されているため、開示されたシステムの１つの重要な能力である〔Ｊ．Ｈ．クロウらの(1998)「無水生活でのガラス化の役割」、Annu. Rev. Physiol. 60:73〕。試料の示差走査熱量測定は、１５４．７℃での吸熱事象の存在を示しているが、それは、結晶Ｄ−マンニトールの融点（１６９℃）と一致している。低下したＴｍは、粉末中の水（カール・フィッシャー滴定により測定して約１％）の存在によるものであろう。
【００８７】
再水和溶液の特性
濾紙上に収集した粉末は、小さな不活性チューブに移され、蒸留、脱イオン水で、最初のｗｔ／ｗｔ％（全溶質の質量：全溶媒の質量）に再水和された。最初の溶液に対する再水和蛋白質溶液の活性アッセイは、噴霧した全ての溶液について、９０％を越える活性保持率（または回復率）を示した。ＨＰＬＣ（サイズ排除TosohaasカラムＴＳＫ３０００ＳＷXL、１００ｍＭのＫＰＯ4ｐＨ＝７．０溶出緩衝液）は、乾燥及び再水和後、ダイマー性凝集物に対するモノマー性蛋白質の比率が一定不変を維持していることを示した（ダイマー、トリマー、そして最後には不溶性の凝集物を作り出す凝集形成は、普通の蛋白質分解経路である）。ＨＰＬＣデータは、示されていない。凝集物：モノマー比率は、最初のリゾチーム調合剤及び全ての再水和粉末について、ほぼ０．２１％±０．０２％であると算出された。
【００８８】
研究者は、固体状態での蛋白質の安定化のための重要な方法の一つは、天然蛋白質の構造的コンホメーション(conformation；配座)を、再水和時に、少なくとも幾分か保持することができるマトリックスを蛋白質に提供することであると考えている〔Ｂ．Ｓ．チャンらの(1996)「凍結乾燥インターロイキン−１・レセプター・アンタゴニストの貯蔵安定性に影響する物理的ファクター：ガラス転移及び蛋白質コンホメーション」、Arch. Biochem. Biophys. 331:249；Ｄ．Ｓ．アリソンらの(1998)「アクチンの構造と機能に対する乾燥方法と添加剤の影響：再水和−誘導損傷とその抑制の機構」、Arch. Biochem. Biophys. 358:171〕。再水和−誘導構造遷移は、ショ糖のようなある種の安定剤を処理前の蛋白質溶液に添加することにより抑制できることが示されている〔Ｓ．Ｊ．プレストレルスキーらの(1993)「蛋白質における再水和−誘導配座遷移及びそれらの安定剤による抑制」、Biophys. J. 65:661〕。アミドＩ領域（１６００〜１７００ｃｍ-1）での二次導関数フーリエ変換赤外分光学〔Ｊ．Ｆ．カーペンターらの(1998)「安定な凍結乾燥蛋白質調合剤の開発への赤外分光学」、Eur. J. Pharm. Biopharm/ 45:231〕が乾燥リゾチーム粉末の配座構造(conformational structure)を探査するために用いられた。代表的な結果を図９に示す。（Ａ）天然水性状態のリゾチーム、（Ｂ）１０％ショ糖と０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有するリゾチーム、（Ｃ）１０％ショ糖を有するリゾチーム、（Ｄ）１０％マンニトールを有するリゾチーム、及び（Ｅ）緩衝液のみのリゾチームの試料を７０℃で乾燥した。アミドＩ領域は、二次構造の異なるタイプに対する特性Ｃ＝Ｏ伸張周波数を示している。興味深いことに、酵素活性が全ての粉末の再水和に際してほぼ完全に維持されているものの、乾燥リゾチーム粉末は、各調合剤において、著しく異なった蛋白質コンホメーションを示した。天然リゾチーム液体赤外スペクトルと比較した時、付形剤を含有しない調合剤は、天然コンホメーションからの最大の偏差(deviation)を示し、１０％マンニトール調合剤は、緩衝液のみの配合剤から幾分僅かの偏差を示し、一方、１０％ショ糖調合剤は、天然構造からのさらに少ない偏差を示した。１０％ショ糖プラスＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）調合剤は、全ての粉末について、最も天然類似構造を示した。これらの結果は、リゾチームは、本発明のネブライゼーション及びバブル乾燥により、不可逆的に損傷されないことを示している。しかし、蛋白質構造は、乾燥粉末中では、天然コンホメーションからの重大な偏差を示した。活性の回復は、再水和で天然コンホメーションを回復するリゾチームの能力を示しているように見える。乾燥工程で観察される配座遷移は、ショ糖のような二糖安定剤の添加により抑制することができる。
【００８９】
理論により制限されることを望まないが、糖類の水素が水分子に置き換わって蛋白質と結合し、それにより、再水和での蛋白質構造における配座変化が減少すると考えられる。界面活性剤は、蛋白質が受ける空気−水界面でのストレスの量を、有効空気−水界面領域を蛋白質と競合することにより減少させる。蛋白質調合剤に添加された界面活性剤は、蛋白質分子の凝集を防ぐと考えられる。
【００９０】
リゾチーム活性アッセイ
最初の全溶質％（ｗ／ｗ）に再水和されたリゾチーム粉末の酵素活性を再水和の直後に測定した。これらの結果（図１０）は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥の直前にそれぞれ独立に測定された初期活性のパーセントとして報告されている。結果は、少なくとも３回の測定の平均値であり、そして、誤差棒は、１つの標準偏差を示している。リゾチーム粉末の分析は、全ての調合剤について、初期活性の９０％を越える回復率を示している。観察された活性の回復率は、この蛋白質の脱水及び再水和での構造変化の可逆性を示している。したがって、リゾチームは、非晶性安定剤の不存在下での超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションの間、脱水により厳しく開かれる(unfolded)が、それは、再水和により容易に構造復元され、そして、それによって、最初の生物活性の多くを回復する。
【００９１】
ＬＤＨ活性アッセイ
ネブライゼーション法をさらに調べるために、相当に不安定な酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ、シグマ社、Ｌ−５７６２）を用いて研究を行った。データを図１１及び１２に示す。ＬＤＨは、通常の乾燥工程で損傷することが知られている〔Ｍ．アドラー及びＧ．リーの(1999)「噴霧乾燥トレハロース中での乳酸デヒドロゲナーゼの安定性と表面活性」、J. Pharm. Sci. 88:199〕。ＬＤＨをｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に対して、室温で少なくとも１２時間透析した。蛋白質濃度は、１００μｇ／ｍＬで一定不変に保持した。ＬＤＨ調合剤は、リゾチーム調合剤のバブル乾燥に使用されたのと同じ条件を用いて脱水した。ＬＤＨ溶液から調製された粉末は、見た目に、リゾチームを含有する粉末と同じであるように見えた（データは示していない）。
【００９２】
ＬＤＨを含有する乾燥粉末を、ＬＤＨ（１００μｇ／ｍＬ）及びリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．５）と一緒に、１０％マンニトール、１０％ショ糖、及び１０％ショ糖プラス０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有する調合剤から製造した。再水和粉末の活性を、ネブライゼーション及び乾燥前の初期調合剤と比較した。
【００９３】
４つの異なる調合剤を調製した：
緩衝液のみ
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１０％マンニトール
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１００ｍｇ／ｍＬのマンニトール
１０％ショ糖
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１００ｍｇ／ｍＬのショ糖
１０％ショ糖とＴｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１００ｍｇ／ｍＬのショ糖
０．１ｍｇ／ｍＬのＴｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）
【００９４】
これらの調合剤についてのＬＤＨ触媒活性回復率を図１２に示す。添加付形剤なしに噴霧及び脱水されたＬＤＨは、再水和後、その初期活性の僅か１５％を回復しているだけである。興味深いことに、湿潤エアロゾルとして収集された同じ溶液は、その初期酵素活性の８７％を維持している。この結果は、蛋白質がこうむる損傷の殆どが水性溶液／ＣＯ2エマルジョンがリストリクター先端から噴出された後の乾燥工程で起こることを示している。換言すれば、ＣＯ2補助ネブライゼーションは、７０℃で、窒素中での微細小滴及び微細バブルの乾燥のように厳しくはない。脱水工程でこうむる回復できない損傷は、マンニトールの添加により部分的に抑制され、ショ糖の添加により大きな程度で抑制される。ショ糖とＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）の添加により、活性低下が殆ど完全に抑制される。これらの結果は、より不安定な四量体酵素(tetrameric enzyme)のＬＤＨは、再水和でリゾチームと同じ構造復元能力を持つとは予期されなかったけれども、リゾチーム調合剤の構造分析から予期されるのと同じである。この結果、ＬＤＨがショ糖の存在下に乾燥された時、おそらく蛋白質の構造が保持されたために、活性がよりよく保持された。
【００９５】
図１２は、マンニトール、ショ糖及び〔ショ糖＋Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）（０．０１％）〕のパーセントを変化させて再水和した時の活性の回復率を比較している。初期活性のパーセント回復率は、調合剤中にＴｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）が使用された時、糖類の濃度によって最も劇的な変化を示していることに留意されたい。
【００９６】
一般に、これらの結果は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥の間にＬＤＨがこうむる損傷が、糖類安定剤の添加により抑制され、１０％ショ糖と０．０１％界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）との組み合わせにより、さらに抑制されることを示している。調合された蛋白質は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥の間に受ける脱水工程を通して成功裏に保護されているように思われる。
【００９７】
超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥の間にＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）がショ糖の存在下に保護を増大させる機構は、この時点で不確かである。Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）は、空気−液体界面での表面位置を飽和状態にし、それによって、表面の変性を防ぐことことにより蛋白質を保護している。空気−液体界面は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションにより高表面積の微細小滴が作られるために、この方法では重要であると予想される。さらに、界面活性剤は、凝集の潜在的な位置である蛋白質表面の疎水性位置を飽和することにより、保護を与えている。さらにまた、界面活性剤は、再水和の間に蛋白質の構造復元を促進している。Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）がネブライゼーションとバブル乾燥との間に、これらの機構の１つ以上によってＬＤＨを保護しているのか否かは、この時点では未決定である。この蛋白質の保護効果は、Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有するショ糖調合剤で言及した改良された粒子分離及び円滑性と組み合わさって、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥により乾燥される調合剤に、この界面活性剤を含有させる潜在的な利点を明瞭に証明している。酵素分析により指摘されているように、幾つかの実験において、ＣＯ2での圧縮、減圧、及びバブル乾燥後の水性リゾチームの酵素活性が、２０００ｐｓｉでの圧縮前の初期水性溶液よりも明らかに大きくなっていることも注目される（例えば、図１２の「１５％ショ糖＋Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）参照）。蛋白質の構造復元は、２０，０００ｐｓｉで水性溶液を加圧することにより促進されることが、Ｓｔ．ション、カーペンター、及びランドルフにより示されている〔「高濃度での凝集物からの高圧フォスター蛋白質の構造復元」、Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13029, 1999〕。この時点で、改良された活性の原因は、知られていない。出願には、理論によって制限されることを望まないが、界面活性剤とＣＯ2での圧縮により水性溶液を処理すると、界面活性剤、適度な圧力、二酸化炭素の存在、若しくは糖類に起因して、あるいは他の機構により、明らかに改良された活性が作り出される。
【００９８】
上記の記述は、多数の特性を含んでいるけれども、これらは、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、単に、この発明の目下の好ましい態様の幾つかの例示を提供していると解釈されるべきである。例えば、多数の異なる物質の多数の微細乾燥粒子が本発明の方法で使用することができる；他の超臨界若しくは近臨界流体を具体的に例示されたものよりほかに使用することができる；並びに具体的に例示されたもの以外の添加剤を使用することができる。本発明の範囲は、与えられた実施例によるよりも、付属の請求項及び法的均等物により決定されるべきである。
【００９９】
この開示で引用されている各引用例は、ここでの開示と不一致でない範囲で、参照のためにここに盛り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、超臨界流体補助ネブライゼーション及びバブル乾燥システムの説明図である。
【図２】 図２は、本発明で使用される乾燥管の図である。
【図３】 図３は、マルチチャンネル・フロー・リストリクター端部の電子顕微鏡写真である。
【図４】 図４は、形づけられたマルチチャンネル・フロー・リストリクターの電子顕微鏡写真である。
【図５】 図５は、一塩基／二塩基リン酸カリウム（◆、ｐＨ７）、トリス／トリスＨＣｌ（▲、ｐＨ７．２）、クエン酸／クエン酸ナトリウム（■、ｐＨ５．５）、及び酢酸／酢酸ナトリウム（●、ｐＨ５）の超臨界ＣＯ2によるネブライゼーションでの緩衝能力のグラフである。
【図６】 図６Ａ−６Ｇは、この発明の方法により製造された乾燥蛋白質粉末の電子顕微鏡写真である。
【図７】 図７は、付形剤有りと無しで、この発明の方法により製造されたリゾチーム粉末の電子顕微鏡写真である。
【図８】 図８は、４ｍｇ／ｍＬリゾチーム、ｐＨ７での１００ｍＭリン酸塩緩衝液、並びに１０％マンニトール（Ａ）及び１０％スクロース（Ｂ）（バブル乾燥粉末中で、４％蛋白質、１６％緩衝剤、及び８０％糖類の最終的な近似固体重量％をもっている）の超臨界流体ＣＯ2補助ネブライゼーションにより調製された試料のＸ線回折パターンを示す。
【図９】 図９は、付形剤有りと無しで、この発明の方法により製造されたリゾチーム粉末のＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図１０】 図１０は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥を用いて製造し、再水和した粉末のリゾチーム酵素活性を最初の製剤の活性と対比したグラフである。
【図１１】 図１１は、この発明の方法により製造した乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）粉末の再水和後の活性のグラフである。
【図１２】 図１２は、種々の付形剤を種々のパーセントで用いた再水和でのリゾチーム活性の回復のグラフである。
発明の背景
遺伝子治療及び組み替えＤＮＡ技術の発達に伴い、蛋白質調合薬が治療薬の中でも重要となっている。例えば、治療用ペプチド及び蛋白質の肺投与は、呼吸器疾患の処置のために、また、高分子物質の全身投与のための注射に対する魅力的な代替として、近年、かなりの注目を受けてきている。しかし、蛋白質調合薬の商業的な製造は、生物学的な不活性化に至る蛋白質の化学的及び物理的な分解によって厳しく制限されている〔M.Ｃ.マニングらの(1989)「蛋白質調合薬の安定性」、Pharm.Res.6:903-918;M.C．ライ及びE.M.トップの(1999)「蛋白質及びペプチドの固体状態化学的安定性」、J.Pharm.Sci.88:489-500〕。これらの分解過程の多くは、加水分解及び／または他の分解経路で水を使用している。したがって、多くの蛋白質調合薬は、製品の使用可能な保存期間及び製品の貯蔵安定性を引き延ばすために、固体状態で、乾燥粉末として製造されている。乾燥固体における蛋白質の変性により、即座の再水和作用で不可逆的に変性され、長期間の貯蔵安定性が著しく減少する。
【０００２】
超臨界流体は、臨界温度と圧力以上の温度と圧力での物質であり、ガスと液体との中間の密度、圧縮性及び粘度を有している。近臨界流体は、超臨界流体に類似しており、臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体として定義される。例えば、ＣＯ2の臨界温度は３１．６℃（３０４．６Ｋ）であり、かつ、臨界圧力は１０７３ｐｓｉであるから、２℃（２７５Ｋ）と９６６ｐｓｉ以上のＣＯ2は、近臨界である。超臨界流体は、調合薬の微粉末の製造に用いるために研究されてきたが、これらの技術は、調合薬が直接超臨界流体に溶解するか、またはジメチルスルホキシドのような非水性溶媒から超臨界流体により沈殿することを必要としている[超臨界流体核生成〔K.A.ラーソン及びM.L.キングの(1986)「製薬産業における超臨界流体抽出の評価」、Biotechnol. Prog. 2:73-82〕、超臨界液体の急膨張〔J.W.トム及びP.G.デベネデッティの(1991)「超臨界液体の急膨張による生侵食性マイクロスフィア及びマイクロ粒子の沈殿」、Biotechnol. Prog. 7:403-411〕、及びガス逆溶剤技術〔T.W.ランドルフらの(1993)「ガス逆溶剤噴霧沈殿法を経由するポリ（Ｌ−乳酸）のサブミクロンサイズの生分解性粒子」、Biotechnol. Prog. 9:429; J.D.マイヤーらの(1998)「骨髄炎の処置に適したゲンタマイシン浸透生分解性ビードの調製と体外特性」、J. Pharm. Sci. 87:1149;M.A.ウインターらの(1996)「超臨界二酸化炭素中での蛋白質の沈殿」、J. Pharm. Sci. 85:586; S.パラコダティらの(1998)「水性溶液からの材料の超臨界流体処理；モデル物質としてのラクトースへのＳＥＤＳの適用」、Pharm. Res. 15:1835〕］。米国特許第５，６３９，４４１号（R.E.シーバー及びU.カースト、１９９７年６月１７日発行）及び分割出願０８／８４７，３１０号に開示されているネブライザー（nebulizer；霧吹き瓶または噴霧器）システムによれば、超臨界流体に溶解しない物質を、水のような非混和性の液体と超臨界流体との混合物を用いて処理し、蒸気のエアロゾルを形成することを可能とする。したがって、米国特許第５，６３９，４４１号に開示されている方法と装置を用いることにより、超臨界流体及び／または有機溶媒に溶解する物質の相応の粒子よりもむしろ、水溶性蛋白質、賦形剤、安定剤、充てん剤、及び／または界面活性剤の粒子を形成することができる。この開示と不一致でない範囲内において、米国特許第５，６３９，４４１号を参照のためにここに組み込む。他の沈殿法（例えば、上記ＳＥＤＳ法及びＧＡＳ法）とは異なり、新しい方法では、有機溶媒を必要とせず、薬剤、水、及び超臨界流体または近臨界流体（例えば、二酸化炭素）のみを必要とする。
【０００３】
水溶性蛋白質及び他の水性製剤の粒子を調製することができるけれども、これらの蛋白質及び／または製剤の好適な乾燥粉末を形成する方法は、今日まで存在していなかった。噴霧乾燥、凍結乾燥、または超音波ネブライゼーション(nebulization；噴霧)のような乾燥蛋白質粉末を製造する既存の技術は、種々の問題をこうむる。一般に、乾燥蛋白質粉末は、従来技術の方法で製造した場合、これらの方法に伴う処理工程、これらの方法を用いて蛋白質を乾燥するのに必要とされる温度、及びこれらの方法での脱水処理が蛋白質の繊細な構造を損傷するため、多くの場合、取り消せないまで不活性化される。また、直接吸入用途での使用には、粉末は、効果的な肺投与を可能とするため、充分に小さくなければならない。肺経路を通しての薬物投与は、痛みを軽減したり、所望箇所への薬物投与をより迅速にするなどの理由により、注射などの他の投与経路より好ましい。乾燥工程で製造される粒子が所望より大きいと、ジェットミルするか機械的に粉砕しなければならない。これにより、分子に追加の物理的ストレスがもたらされ、蛋白質活性がさらに低下する。乾燥粒子を適正な大きさの範囲で製造すると、肺投与のための乾燥粉末吸入器に直接使用することができる。
【０００４】
噴霧乾燥は、乾燥蛋白質粉末を製造するために現在利用できる方法である。噴霧乾燥技術では、ジェット・ネブライザーが小滴のプルーム(plume；柱）を形成するのに用いられる。一つのタイプのネブライザーでは、液体試料が高圧のガス流により小径チューブを通して吸い込まれる。ガスは、液体を微細な液滴に粉砕する。また、ガスは、小径チューブを直角に交差して流れて、同様の方法で液滴を形成することができる。超音波ネブライザーは、試料溶液に連結する超音波振動を用いて、溶液を小さな液滴に粉砕する。噴霧乾燥法の一つの不利な点は、ジェット・ネブライザーに存在する分子のプルームがそれほど濃くはないことである。これは、蛋白質の所望量を製造するのに遅い処理をもたらす。凍結乾燥は、乾燥蛋白質を製造するのに現在用いられている他の方法であり、そこでは、薬物の水性溶液が凍結され、そして、水分を昇華させるために真空下に置かれる。凍結乾燥法の一つの不利な点は、乾燥工程が非常に遅いことである。また、製造された粒子は、比較的大きく、製薬的に望ましい大きさとするために、追加の処理工程が必要とされる。
【０００５】
米国特許第６，０６３，１３８号（ハンナら、２０００年５月１６日発行）及び関連するＥＰ０７６７７０２号には、超臨界流体、第一ビヒクル中の物質の溶液または懸濁液、並びに第一ビヒクルと実質的に混和しかつ超臨界流体に実質的に可溶性である第二ビヒクルを、超臨界温度と圧力に維持した粒子形成容器中に一緒に導入することにより、物質の粒子を形成する方法が記載されている。
【０００６】
ＰＣＴ公開出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１９３０６（ＷＯ０１０５４１）（エドワードら）には、生物活性剤、リン脂質、及び有機溶媒若しくは有機−水性混合溶媒を混ぜ合わせて混合物を形成し、次いで、噴霧乾燥することにより、粒子を形成する方法が記載されている。
【０００７】
米国特許第５，６９５，７４１号（シャットら、１９９７年１２月９日発行）並びに関連米国特許第５，６３９，４４３号（シャットら、１９９７年６月１７日発行）及び５，７２０，９３８号（シャットら、１９９８年２月２４日発行）には、磁気共鳴結像及び超音波結像に有用な「マイクロバブル」が記載されている。該「マイクロバブル」は、液体調合物を噴霧乾燥してボイドを有するマイクロスフェアーを製造し、次いで、該マイクロスフェアーにフルオロカーボンガス浸透剤を浸透させることにより調製される。
【０００８】
米国特許第５，９２８，４６９号（フランクら、１９９９年７月２７日発行）には、材料を水溶性または水膨潤性の担体物質と混合し、得られた混合物を噴霧乾燥して、該材料と担体物質の両者を含み、担体物質が非晶（ガラス状またはゴム状）状態である粒子を形成することが記載されている。フランクは、１００〜３００℃のガス温度で噴霧乾燥すると述べている。
【０００９】
米国特許第６，００１，３３６号（ゴードンら、１９９９年１２月１４日発行）には、水性溶液中に溶解させた疎水性成分と親水性成分の懸濁液の噴霧乾燥が記載されている。
【００１０】
米国特許第５，８５１，４５３号（ハンナら、１９９８年１２月２２日発行）及び関連するＥＰ０７０６４２１号には、超臨界流体及び超臨界流体に可溶性のビヒクル中の物質の溶液または懸濁液を、制御された温度と圧力に維持された容器に導入して、粒状生成物を形成する方法と装置が記載されている。ＷＯ９５／０１３２４号（ヨークら、１９９５年１月１２日発行）には、この方法を用いたサルメテロール・キシナホエート(salmeterol xinafoate)粒子が記載されている。
【００１１】
ＷＯ９９／１６４１９号（タララら、１９９９年４月８日発行）には、液体を霧にして、形成された該液体の小滴を噴霧乾燥する「孔あき微細構造」の調製が記載されている。ＷＯ００／００２１５（ボトら、２０００年１月６日発行）には、「生物活性剤」を含有する「孔あき微細構造」の投与システムが記載されている。
【００１２】
ＷＯ９９／５９７１０号（ハンナら、１９９９年１２月２５日発行）には、第一の超臨界流体若しくは近臨界流体であるか、またはこれを含む第一のビヒクル中の物質を溶解若しくは懸濁し、そして、該溶液若しくは懸濁液を、第二の超臨界流体を含有する粒子形成容器に通すことによる物質の粒子形成方法及び装置が記載されている。該容器は、第二の超臨界流体が超臨界を維持するように温度と圧力が維持されている。
【００１３】
ＷＯ９８／３６８２５号（ハンナら、１９９８年８月２７日発行）には、一方が対象となる物質(substance of interest)を含有する２つの超臨界流体を加熱加圧室に導く粒子形成の方法と装置が記載されている。
【００１４】
乾燥形態で安定な若しくは薬学的に活性な蛋白質、及び乾燥形態で安定な若しくは薬学的に活性な蛋白質を製造する方法に対する要求がある。また、改良された薬学的活性を持つより小さな粒子を製造する必要がある。
【００１５】
発明の概要
この発明によれば、超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体またはこれらの混合物のいずれかに可溶性であるか、あるいは水性溶液に可溶性若しくは懸濁可能である一種以上の物質を含む、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）一種以上の物質と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを含有する組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させる
ことを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法が提供される。
【００１６】
好ましくは、バブル乾燥(bubble drying)は、調合薬の分解を最小限にするために、周囲温度超過で１００℃未満の温度で行うべきである。充分な滞留時間と希釈度が与えられるならば、乾燥ガスの流れは、外部加熱なしに微細な小滴を乾燥させる。加熱すれば、水の蒸気圧を増大させて乾燥を加速させる。該組成物は、水性溶媒を含有することもできる。
【００１７】
また、本発明によれば、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）一種以上の対象となる物質を含有する水性溶液と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを混合して組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させることを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法が提供される。
【００１８】
さらに、本発明によれば、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）対象となる物質の水性溶液と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを平衡させて、組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させる
ことを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法が提供される。
【００１９】
さらに、本発明によれば、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子を形成するための装置であって、
（ａ）第一の非ガス状超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体を含有する第一加圧室、
（ｂ）第二の非ガス状流体中の物質の溶液または懸濁液を含有する第二室、
（ｃ）導管により第一及び第二室と連結された、前記溶液または懸濁液と第一流体とを混合するための混合室、
（ｄ）第一流体を混合室に通過させるための第一室と混合室との間の導管に連結された第一流量制御手段、
（ｅ）第二液体を混合室に通過させるための第二室と混合室との間の導管に連結された第二流量制御手段、
（ｆ）混合室の中から出た組成物を超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体の圧力より小さな圧力を有する急速膨張領域に導いて該物質の微細粒子のディスパージョンを形成するために、混合室に連結されたリストリクター、
（ｇ）リストリクターに連結された乾燥室、
（ｈ）１つ以上の注入口で乾燥室に連結されたガス源、
（ｉ）乾燥室を通過した後に粒子を収集するための手段
を含むことを特徴とする微細乾燥粒子を形成するための装置が提供される。
【００２０】
該混合室は、低死容積(low dead volume)のＴ管継手(tee)状の混合室（以下、「Ｔ管継手」または「混合Ｔ管継手」ともいう。）であることが好ましい。
【００２１】
微細粒子は、約５μｍより小さな直径を持つものである。本発明の方法により形成された粒子は、約０．１μｍから約５μｍの間で直径が変動する。製造された粒子は、０．１μｍより小さくてもよいが、現在の検知方法は、低い粒度領域で粒度限界があり、かつ、小さい粒子は、質量の重要な画分を構成しない。粒子は、如何なる直径の分布であってもよい。ある種の用途、例えば吸入療法に対しては、殆どの粒子が、深い肺臓の肺胞に投与するために、呼吸可能な範囲内にあることが好ましい。好ましくは、粒子は、吸入用途のために１〜３μｍの粒度の範囲内にある。粒子は、他の用途に対しては、この技術分野で公知であるか、あるいは過度の実験なしに容易に決定できるように、異なる粒度であってもよい。吸入用途については、粒子は、平均粒度から小さな分散を有していることが好ましい。
【００２２】
ここで使用するように、「乾燥」または「乾燥した」とは、若干の水分、好ましくは５重量％以下の水分を含有する粒子を含む。乾燥粒子は、０．０００１〜１重量％の水分、１〜３重量％の水分、１〜５重量％の水分、５〜１０重量％の水分、及びこれらの範囲の組み合わせを含有する粒子を包含する。
【００２３】
種々の形状の粒子が本発明に包含される。例えば、粒子は、中空、即ち「バブル」（泡）であり得る。該バブルは、テニスボールやピンポン玉に類似の中空体であるが、テニスボールやピンポン球のような球形でなくてもよい。粒子の直径は、典型的には、外皮の厚みの約１０から１０，０００倍である。本発明の方法により形成される他の粒子は、中空ではない。中空粒子を形成するには、より高い乾燥温度（〜１００℃）が好ましいが、同じ物質をより低い温度でゆっくりと乾燥すれば、固体球となる。
【００２４】
「組成物」は、必ずしも全ての物質が互いに可溶性であることを意味しない。本発明の方法により粒子とされる物質は、超臨界流体若しくは近臨界流体またはこれらの混合物のいずれかに可溶性である物質、あるいは水性溶液に可溶性若しくは懸濁可能な物質を包含する。水性溶液は、各種助溶媒も含むが、有機溶媒の使用を避けると、環境上及び毒物学上の利益を得ることができる。粒子にすることができる幾つかの物質には、界面活性剤、インシュリン、アミノ酸、酵素、鎮痛薬、抗がん剤、抗菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、抗真菌性製薬、抗生物質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、免疫抑制剤、血栓溶解剤(thrombolytics)（以下、「血栓崩壊剤」ともいう）、抗凝血剤、中枢神経系統刺激剤、うっ血除去薬、利尿血管拡張薬、抗精神病薬、神経伝達物質、鎮静薬、ホルモン、麻酔薬、抗炎症薬、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン、ミネラル、及びその他の公知の生理活性材料からなる群より選ばれる一種以上の物質からなる生理活性組成物が包含される。モノクローナル抗体及びワクチンの粒子を製造することができる。塩化ナトリウムのような物質の粒子も製造することができる。幾つかの物質は、薬学的に活性である。「薬学的に活性な蛋白質」は、薬学的に使用するのに充分な活性を持っている蛋白質を指している。他の物質は、生理的または薬学的に活性でなくてもよい。
【００２５】
本発明の方法及び粒子において、種々の添加剤を使用することができる。これらの添加剤は、物質に添加することができ、あるいは工程で溶媒を使用することができる。添加剤は、形成後の粒子に直接添加することもできる。添加剤には、安定剤、付形剤、充てん剤、及び界面活性剤が含まれる。蛋白質製剤に安定剤を使用すると、乾燥での蛋白質活性の低下に対して保護する。安定剤としては、限定されないが、糖類、及び親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチル澱粉、デキストラン、その他）が包含される。安定剤は、糖類または異なる糖類の混合物であることが好ましい。使用することができる糖類には、マンニトール、ショ糖、乳糖、及びトレハロース、並びにその他のモノ−、ジ−、及びオリゴ糖が包含される。脱水前の蛋白質溶液に一種以上の安定剤を添加すると、酵素活性の低下に結びついていると考えられている蛋白質内における構造変化をかなり抑制する。一種以上の界面活性剤を、小滴／空気間のストレスを緩和し、かつ、乾燥時に起こる分解を減少させるために、添加することができる。界面活性剤は、乾燥時に起こる凝集または塊状化を緩和するために添加することができる。また、界面活性剤は、球形粒子の形成を助けると考えられる。使用される界面活性剤の具体例としては、ツイーン２０（商標権者Croda International PLC）、ツイーン４０（商標権者Croda International PLC）、ツイーン８０（商標権者Croda International PLC）及びツイーン８５（商標権者Croda International PLC）のようなポリオキシエチレン(20)ソルビタン系界面活性剤（ツイーン；Tweens：商標権者Croda International PLC)；ステアリン酸；myri（ＰＥＧモノステアレート）、スパン８５（ソルビタントリオレエート）、及びベックマンらの(2000)「ネイチャー」４０５：１６５で報告されているタイプのポリエーテル−カーボネートブロック共重合体が挙げられる。ホスホグリセリドを含むリン脂質を用いることができる。界面活性剤とグアニジン塩酸塩などの他の添加剤とは、加圧処理を伴う蛋白質の構造復元を容易にする（R. J. St. ジョンらの(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13029）。充てん剤及び付形剤は、不活性でも活性でもよい。
【００２６】
最終製剤の安定性が必要であれば、緩衝液を最初に添加することが好ましい。さらなる安定性が必要であれば、糖類を添加することができる。より一層の安定性が必要であれば、界面活性剤を添加することができる。ｐＨ緩衝物質は、高圧で二酸化炭素が分解して炭酸を形成することによりｐＨが急激に低下するのを相殺するのに有用である。
【００２７】
低力価の薬剤に対しては、粉末中の添加剤の画分は最小とすべきであり、高力価の薬剤に対しては、不活性な付形剤（希釈剤）は、ときには全量の９９％以上を構成する。添加剤は、組成物に対して有用な量で添加することができる。添加剤は、蛋白質を含む溶液に対して、典型的には、約０．００１〜０．５重量％の界面活性剤（好ましくは、約０．００１〜０．１重量％）、及び約０．０５〜２５重量％の安定剤（糖類を用いた場合には、約０．１〜２０重量％が好ましく、糖類の溶解性の限度で制限される）の濃度で用いられる。これらの百分率は、噴霧及び乾燥する前の水性溶液に対して表示される。乾燥粉末中での糖類の最終的な百分率は、９９．９％にまで高くなることができる。
【００２８】
該組成物は、疎水性化合物などの超臨界若しくは近臨界流体に溶解する物質を含有することができる。超臨界若しくは近臨界流体の混合物を用いることができる。また、組成物は、物質の水性溶液若しくは懸濁液及び超臨界若しくは近臨界流体（または流体類）を含有することができる。次いで、親水性物質などの超臨界若しくは近臨界流体に溶解しない物質の小滴が形成される。この方法の一つの態様では、溶解または懸濁した化合物を含有する水性溶液が低死容積のＴ管継手にポンプで送られるとともに、超臨界若しくは近臨界流体が該Ｔ管継手の他の脚の中にポンプで送られる。超臨界流体の臨界圧力に近いかそれ以上の圧力（二酸化炭素を使用するときは、約７０から約１００気圧）に加圧された生成エマルジョンまたは超臨界溶液は、フロー・リストリクター（restrictor；絞りまたは絞り弁）から大気圧に膨張させられ、溶解した薬剤種を含有する微細な小滴またはバブルを形成する。このエアロゾルは、乾燥室に導かれ、そこで、溶媒の蒸発と粒子形成が行なわれる。
【００２９】
この方法の第二の変形では、低死容積のＴ管継手なしにエアロゾルが形成される。この方法では、前駆体の水性溶液が最初に、静止吸収缶(static canister)または室中で、好ましくは撹拌若しくはかき混ぜながら、近臨界若しくは超臨界流体と平衡させられる。次いで、この組成物は、フロー・リストリクターから大気圧に膨張させられ、微細な小滴を形成する。これらの小滴は、乾燥室に導かれ、そこで、溶媒の蒸発と粒子形成が行なわれる。
【００３０】
超臨界流体中でも水性溶媒（または溶媒混合物）中でも、物質の初期濃度は、溶媒若しくは超臨界流体中での該物質の溶解度若しくは飽和点によってのみ制限される。典型的な出発濃度は、該溶液若しくは流体中の全個体の約１から約２５％w/ｗである。
【００３１】
超臨界流体としては、二酸化炭素が好ましい。何故ならば、二酸化炭素は、容易に得られる臨界圧力及び温度を有しているのみならず、内因的かつ相対的に非毒性であるからである。他の超臨界若しくは近臨界流体であっても、超臨界温度と圧力とを得ることができかつ有用であれば使用することができる。二酸化炭素は、現在、如何なる有機溶媒よりも費用がかからず、かつ、その使用は、ＶＯＣ放出を避ける。水に対する二酸化炭素の溶解度は、１００気圧、近環境温度で、約２％である。
【００３２】
小滴の流れと接触するガスは、不活性であることが好ましく、その好ましい具体例は窒素ガスであるが、乾燥過程で分子と反応するようにガスを選択することができる。試料の流れと接触するガスの流れは、試料の流れを取り巻く鞘（シース）を形成することが好ましいが、ガスの流れは、試料の流れと乱流混合のような他の手段で接触することができる。このガスは、粒子の乾燥を所望の水準とするのに充分で、かつ、粒子の生物活性を実質的に低下させない温度に加熱することが好ましい。ガスは、約２℃から約３００℃の間の温度、好ましくは１００℃未満の温度に加熱することができるが、乾燥する物質と組成物の成分に応じて、温度を調節することができる。乾燥温度の好ましい範囲は、約３５℃から約１００℃の間である。
【００３３】
ガスは、乾燥管のような乾燥室に入れることが好ましい。乾燥管は、粒子がその末端に到達する時間までに、所望水準の水分を有する粒子を製造するのに必要なだけ長い。乾燥管は、急速な膨張により形成された小滴プルーム（柱）の直径より大きいことが好ましい。乾燥管は、加熱することができるが、必要とするものではない。水を蒸発させるのに必要とされる熱の殆どは、乾燥室に入れる前に乾燥ガスを加熱することにより供給することが好ましい。乾燥管を加熱すると、該管表面での凝縮を防ぐのを助けることができる。乾燥管は、赤外線ランプなどのランプ手段で外部から加熱することができ、あるいは該管を構成する材料中に埋め込んだ加熱ワイヤなどの公知の手段により内部から加熱することができる。乾燥管は、それが受ける温度に耐えることができる適当な材料から作ることができる。乾燥管を作ることができる材料の例は、ステンレス鋼またはホウケイ酸塩ガラスである。所望の結果が得られるならば、その他の設計の乾燥管を使用することができる。乾燥管に代えて同じ機能を果す他の装置、例えばマイクロ波加熱炉を使用することができる。
【００３４】
組成物の圧力の急速な減少は、典型的には、フロー／圧力リストリクターを用いて行われる。リストリクターとしては、ステンレス鋼やセラミック材料などの熱伝導性材料の中空ニードル、あるいはかけられる圧力と熱に耐える他の材料の中空ニードルが挙げられる。リストリクターは、その代わりに、溶融シリカのフロー・リストリクター、あるいは他の箇所で詳述するようなセラミックキャピラリーのマルチチャンネル束であることができる。また、高圧焼結ステンレス鋼フィルターをエアロゾルを発生させるのに使用することができる。リストリクターの長さは、典型的には約２インチの長さであるが、この長さは、低い流速を生じさせたり、閉塞を引き起こすリストリクター中での充分な固体物質の沈殿を生じさせたりするほどに長くてはならない。リストリクターは、所望の粒度の粒子が形成され、かつ、ポンプが圧力を維持するのに充分な容量を有している限り、所望の大きさの直径をもつことができる。直径の下限は、リストリクターを通過させられる溶液の粘度によって決定される。該粘度が高すぎると、粒子が形成されない。
【００３５】
本発明はまた、マルチチャンネル・リストリクターを提供する。これらの開口は、互いにほぼ同じ距離に配置される。構造は、円筒形、六角形、あるいは使用される他の構成材と結合できる他の形状であることができる。開口は、円形や六角形のような適当な形状であることができる。そのような構造の一つの態様は、全直径が約２ｍｍで、約９００の非同心平行チャンネルを持っている。このマルチチャンネル・リストリクターは、所望の粒子形成を提供する全直径を持つことができる。各チャンネルは、約４０μｍから約１２５μｍの間の内径を持つことが好ましい。他のマルチチャンネル構造を使用することができ、また、開口は、同様の大きさにされていることが好ましいけれども、同様の大きさである必要はない。
【００３６】
リストリクター構造の出口先端は、平または実質的に平であるか、あるいは形づけられていてもよい。特に有用な一つの形状は、鉛筆に類似の延びた先端を形成するために、平な末端の側部から材料を除去することにより形成される。この変更は、１８０°の角度にわたって噴出する小滴のより分散した流れを与えて、粒子がバブル乾燥を受けるため、粒子の凝集を防止するのを助力することに役立つ。所望の結果に基いて、最良の結果を与える特定の幾何学的形状は、日常の実験作業により発見することができる。組成物への圧力を減少させるために入手可能な他の手段は、乾燥を加速させるために使用することができる。
【００３７】
組成物が通過する多数の開口により、システムを通過する流速を増大させることができ、システムのスループットが増大する。全体的なスループット速度は、主としてフロー・リストリクターの全内径によって制御される。また、単一チャンネルのリストリクターの各種内径を使用することができ、７５μｍ、１００μｍ、１７０μｍ、及び２００〜１０００μｍが含まれる。単一チャンネルのリストリクターに対するマルチチャンネル・リストリクターの他の利点は、一つのチャンネルが閉塞すると、残余のチャンネルが機能を残していることである。
【００３８】
この発明の方法は、現在手に入れることができるよりもより速い乾燥が望まれているプロセスに使用することができる。本発明の膨潤／破裂工程が乾燥のために大きな表面を与えるため、迅速な乾燥が生じるが、出願人は、この理論により制限されることを望んでいない。
【００３９】
本発明の方法により、対象となる蛋白質と、所望により、賦形剤、安定剤、充てん剤、及び界面活性剤からなる群より選ばれる一種以上の添加剤とを含有し、該添加剤が乾燥蛋白質の重量で測定して約０．００１％から約９９．９％の濃度で存在し、かつ、約０．１μｍから約１０μｍの直径を持つ粒子からなる、乾燥形体での薬学的に活性な蛋白質組成物を含む各種粒子が製造される。粒子は、関係する特定の物質及び粒子形成と乾燥が起こる条件に依存して、種々の嵩密度を持つことができる。例えば、約０．１と１．５ｇ／ｃｍ3との間の嵩密度を持つ粒子が形成される。嵩密度は、１ｇ／ｃｍ3未満、０．８ｇ／ｃｍ3未満、０．５ｇ／ｃｍ3未満、０．４ｇ／ｃｍ3未満、または他の範囲であることができる。粒子は、再水和(rehydration)の後、種々の活性を有することができる。例えば、再水和により、最初の活性の少なくとも９０％を持つ乾燥粒子が本発明に包含される。最初の活性の９０〜９５％、９０〜１００％、１００〜１２０％を持つ粒子もまた、これらの中でも本発明に包含される。
【００４０】
粒子は、形成と乾燥後には、袋や他の貯蔵器具内に置くことを含めて、簡便な方法で貯蔵することができ、あるいは貯蔵中にＰ4Ｏ10のような乾燥剤上で追加の乾燥を行なうことができる。
【００４１】
また、本発明は、現在入手できるシステムよりも低容量の試料を必要とする注入口を用いたネブライゼーション・システムが提供される。これは、例えば、高価な試料を用いた実験室規模での実験を行うときに好都合である。また、この注入口は、溶媒のみでネブライゼーション（噴霧）及び乾燥システムの平衡を可能とし、システムが平衡した後、蛋白質を含有する溶液の導入がなされる。これにより、蛋白質の損失が軽減される。この噴霧システムは、バブル乾燥システムに取り付けることができ、あるいは低温での速い乾燥を可能とするため、慣用の噴霧乾燥(spray drying)で用いられている機器に結合させることができる。
【００４２】
一種以上の物質の分量を水性または超臨界若しくは近臨界溶液を含む溶液の流れの中に、小容量の試料を流れの中に導入する手段を用いて注入し、生成した溶液を急速な圧力減少に付して小滴を形成する小滴の製造方法が提供される。好ましくは、導入手段は、ＨＰＬＣ用に使用されているような注入口(injection port)である。導入される容量は、好ましくは約０．０１ｍＬから約１０ｍＬである。
【００４３】
この発明の方法を用いて蛋白質または他の物質を乾燥し、水若しくは他の適当な物質で蛋白質を再構成し、そして、所望の手段により投与することを含む蛋白質または他の物質の投与方法が提供される。
【００４４】
また、安定及び／または薬学的に活性な粒子が提供される。「安定」とは、貯蔵、輸送、再構成、及び投与中での分解に対して耐性であることを意味する。
【００４５】
また、組成物が通過する低死容積のＴ管継手、及び該Ｔ管継手に固定された１つ以上の実質的に平行で非同心のチャンネルからなる組成物の急速膨張のための装置が提供される。低死容積のＴ管継手は、約０．２〜１０μｌの容積を有する混合Ｔ管継手である。該Ｔ管継手は、例えば、エポキシ樹脂や適当な管継手などの好適な手段によって、リストリクターに固定することができる。
【００４６】
本発明の乾燥技術は、汎用の乾燥技術に対して利点を有している。本発明の乾燥技術は、粒度または形態の重要な変更なしにスケールを変えることができる。また、該方法は、他の方法で製造された粒子よりも低い密度を有する粒子を提供する。これは、小さな空気力学的大きさを持つ粒子に導くが、一つの態様において、追加のガス状超臨界流体が形成され、そして、多孔若しくは中空構造の粒子を含む物質を残すため、大きな絶対粒子寸法に導く。これは、一つの用途において、そうでなければ可能な深い肺へ到達する低い運動量を持ったより大きな粒子を可能とする。
【００４７】
発明の実施の形態
乾燥蛋白質を形成するために現在用いられている技術に対する本発明の有利な点には、目下入手可能な技術を用いて乾燥するのには現在不適当な各種蛋白質及び他の材料の安定な製剤を形成する能力が含まれる。本発明は、乾燥中に物質に対して、低いストレスと少ない過酷な損傷を与える。また、この方法により形成された蛋白質を含む微細粉末の安定な製剤は、吸入可能な大きさの領域に直接製造され、乾燥製剤に追加のストレスとさらなる活性の低下を与えることになる追加の機械的な微細化の必要を取り除く。現発明の方法で用いられる温度は、好ましくは、慣用の乾燥プロセスのそれよりかなり低い。この乾燥温度の低下は、広範な熱分解を少なくする。現発明の方法により形成された粉末は、慣用の方法よりも調製された粉末中に少ない水分を保持することができ、追加の乾燥工程の必要を取り除く。本発明は、慣用のネブライゼーションで見られる変性量と生じる凝集を減少させる。
【００４８】
本発明の一つの特別に具体化された態様は、この発明の方法における流体の流れ、溶液、及び粒子を図示する図１に示されている。液体二酸化炭素を含有する二酸化炭素貯蔵容器１０（ガスシリンダーまたは他の貯蔵容器であり得る）が導管７０を経て二酸化炭素ポンプ１５（シリンジ・ポンプまたは他の適当なポンプであり得る）に連結されている。二酸化炭素ポンプ１５は、導管７１により混合Ｔ管継手２０に連結され、二酸化炭素が加熱された混合Ｔ管継手２０に到達した時、それを通って、二酸化炭素が超臨界若しくは近臨界流体となる条件下で汲み出される。水性溶媒貯蔵容器４０は、導管７２を経て流体ポンプ３２、好ましくは高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）ポンプに連結され、それは、導管７３を経て注入口３０に連結される。注入口３０は、蛋白質やその他の薬剤、緩衝液、充てん剤、賦形剤、安定剤及び／または界面活性剤の水性溶液を加えるために用いられる。注入口３０を通って注入された添加剤有りまたは無しの貯蔵容器４０からの水性溶媒の溶液と蛋白質溶液は、導管７４を経て混合Ｔ管継手２０に連結される。混合Ｔ管継手２０は、その中で超臨界二酸化炭素と水性溶液との緊密な混合物が形成されるように、例えば約１０μｌより小さい容積を有することが好ましい。混合Ｔ管継手２０には、混合Ｔ管継手内の背圧を維持するために圧力リストリクター２５が装着され、また、所望により、そこでの超臨界温度を維持するために加熱コイルを装着することができる。生じた混合物が混合Ｔ管継手２０から小直径の圧力リストリクター２５を通って通過すると、圧力リストリクター２５のオリフィスの出口で急な圧力の解放が起こり、溶液の小滴及び／またはバブルの非常に微細なエアロゾルが形成される（８０）。リストリクターは、単一の出口からなっていても、あるいは多数の出口からなっていてもよい。次いで、エアロゾル８０は、乾燥管４５の中心に導かれる。乾燥管４５は、長さ１メートルより短く、かつ、直径１０ｃｍより小さいことが好ましい。窒素貯蔵容器３４から窒素ガスが導管８５を経て、投入口３５を通って乾燥管４５に加えられる。好ましくは、複数の投入口３５が乾燥管４５の中心の回りに等間隔で配置される。ランプ９０を加熱乾燥管４５に用いることができる。また、窒素ガスは、図２に示すように加熱することができる。爆発の危険がなければ、加熱空気またはガス混合物を使用することができる。加熱は、乾燥工程を助け、かつ、水が管内壁及び濾紙上へ凝縮しないようにする。水が濾紙上に凝縮すると、詰まりを生じさせる。乾燥管４５の出口には、濾紙ホルダー５０が装着され、それは、適当なコネクター９１を通って真空ポンプ５５に連結されている。
【００４９】
運転中、液体二酸化炭素は、二酸化炭素貯蔵容器１０から超臨界二酸化炭素ポンプ１５により汲み出され、導管７０を経てポンプ１５へ、そして導管７１を経て、低容積（０．２〜１０μｌ）の混合Ｔ管継手２０に至り、そこで超臨界流体（既になっていない場合には）若しくは近臨界流体になる。ポンプ３２は、溶媒貯蔵容器４０から導管７２を経て水性溶媒を汲み出し、水性溶媒は、導管７３を経て注入口３０に送液され、そこで、対象となる蛋白質が水性溶液として加えられる。添加剤もまた、注入口３０からか、あるいは貯蔵容器４０内の溶媒に導入することができる。緩衝液を蛋白質溶液または貯蔵容器４０の水性溶媒中で用いて、蛋白質の変性の可能性への影響を減少し、また、さもなければ混合物への二酸化炭素の導入による非補償ｐＨ変化が原因となって起こるであろう凝集物の産出を減少させることができる。混合Ｔ管継手２０は、加熱コイルを用いて加熱することができ、及び／またはリストリクター２５は、二酸化炭素の臨界温度を超える温度を維持するために加熱することができる。二酸化炭素及び水性溶液の流量は、図１に示されていないバルブを用いて、それぞれ独立に調整される。流速は、ポンプ条件を変更することによっても制御することができる。混合Ｔ管継手２０内の混合物は、下流側に膨張して、水性溶液中に溶解若しくは懸濁した物質の微細な粒子からなるエアロゾル８０を形成する。粒子は、乾燥管４５の中心に導かれ、そこで乾燥され、そして濾紙ホルダー５０の濾紙上に集められる。あるいは、粒子は、例えば、粒度分布が適しておれば、サイクロン分離機または多段式インパクタを用いて収集することができる。
【００５０】
注入口３０を用いると、蛋白質及び／または添加剤を導入する前にシステムを平衡させることができる。システムの平衡は、熱電対で測定した乾燥管の温度が平衡し、かつ、水性溶液と二酸化炭素の流速が定常状態になった時に到達する。平衡後、既知の容量の蛋白質製剤が水性供給ラインへ、注入口３０を通って注入される。
【００５１】
供給段階において２つの分離した溶液ループが存在するように、６口注入バルブをネブライゼーション・システムでの使用のために適用することができる。溶媒がＨＰＬＣポンプから混合Ｔ管継手を通って一つのループに汲み出され、試料は、供給段階では溶媒ループに結合されていない試料ループ（例えば、３ｍｌ試料ループ）内に含有される。注入段階の間に、溶媒は、ＨＰＬＣポンプから試料ループを通って混合Ｔ管継手へと汲み出される。この変更は、蛋白質またはその他の対象となる物質をＨＰＬＣピストンを通って汲み出さないという利点を有しており、非常に少量の試料を注入する能力を与える。運転毎に必要とされる蛋白質の量及び全体の運転回数は、実質的に低減される。
【００５２】
試料注入バルブが用いられる時には、典型的なシステム・パラメータには、内径５０μｍで長さ５ｃｍの溶融シリカ・リストリクターを用いて、二酸化炭素圧１００ａｔｍ、二酸化炭素流量０．３ｍｌ／ｍｉｎ、水性流量０．３ｍｌ／ｍｉｎが含まれる。
【００５３】
図２には、乾燥管及び乾燥工程のより詳細な図面が示されている。混合Ｔ管継手２０からの溶液は、リストリクター先端７０を通って、注入口１００から乾燥管４５内へ通過させられ、そこで小滴が形成される。貯蔵容器３４からの窒素（または他のガス；不活性であるか、あるいはエアロゾル粒子と反応させることが望まれている物質を含むガス）は、導管８５を経てガス乾燥カラム６０を通過する。ガスは、次いで導管９５を経て加熱コイル６５を通過する。好ましい態様では、ガスは、約７０℃に加熱され、かつ、約１５Ｌ／ｍｉｎの流量で存在する。加熱ガスは、導管１００からガス注入口３５を経て乾燥管４５を通過する。好ましい態様において、乾燥管４５は、５個の注入口を持つガラス管であり、注入口の１つは中心にあってエアロゾルを加え、他の４つの注入口は、中心口の周りに配置される。また、ランプ９０が加熱乾燥管４５を外側から加熱するために使用される。乾燥管４５の出口では、粒子がホルダー５０に保持されている濾紙上に集められる。
【００５４】
他の構成の乾燥管４５を用いることができる。例えば、より多いか、あるいは少ない注入口３５を使用することができる。ガスは、管の中央に加えることもでき、そして、粒子は、ガスの周りに加えられる。ガスと粒子は、乾燥管の中で一緒に混合することもできる。管内での乾燥ガスと粒子の相互作用は、最終製品の特性に影響する。
【００５５】
好ましくは、全ての高圧部品は、ステンレス鋼から作られる。その他の不活性材料またはコーティングを使用することができる。好ましくは、濾紙ホルダー５０は、ステンレス鋼から作られる。リストリクターの長さは、好ましくは約２インチ（５ｃｍ）である。上記装置での水性溶液の流量は、約０．５ｍｌ／ｍｉｎから約３ｍｌ／ｍｉｎである。所望ならば、この工程は、同様の温度と圧力を維持しながら、寸法と流量を調節して、より大きいスケールまたはより小さいスケールで実施することができる。特定の具体的な態様において、二酸化炭素及び水性溶媒の流量は、５０μｍ内径のフロー・リストリクターを用いたとき、おおよそ０．３ｍＬ／ｍｉｎである。
【００５６】
注入口３０は、蛋白質製剤の幾つかの小容量のアリコート（約０．１から約１０ｍｌ）を、注入口なしのシステムにおいて１つの大容量（＞１０ｍｌ）により必要とされるのと同じ量の時間で導入することを可能とする。これは、種々の成分と濃度を持つ幾つかの蛋白質製剤を、各運転で用いられる少量の蛋白質で迅速に乾燥することを可能とする。これは、実験毎に１００ｍｌまでの蛋白質溶液を必要とする市販の研究室規模の噴霧乾燥に対して重要な利点である。しかし、本発明の方法は、より大きい容量の蛋白質とより大きい容量の乾燥が望まれている物質で実施することもできる。
【００５７】
リストリクターは、複数の平行チューブを有するマルチチャンネル・リストリクターであることができる。そのようなマルチチャンネル・リストリクターの一つは、ガラス・マルチチャンネル・カラム（アルテック社、イリノイ州）から作ることができる。このカラムは、おおよそ４０または５０μｍまたはそれ以上の内径を有する各ホールがカラム全長にわたって約９００ホール持っている１メートルまでの長さで購入することができる。このようなカラムの一片をマルチチャンネル・リストリクターとして用いることができる。このような製品の一つは、六角形の形状を有している（アルテック部品番号１７０５９）。他の製品は、丸胴形を有しており、六角形が同じ直径の円の中に配置されている。このようなリストリクターの端部の顕微鏡写真を図３に示す。丸胴形リストリクターは、はめ輪シール及びすえ込み取付金具で容易にポンプ及び吸収缶に取り付けることができ、また、ステンレス鋼チューブやＴ管継手に対して、ガラス若しくはセラミックチューブの外側にエポキシ・プレポリマー混合物を塗布し、それを少し大きい鋼チューブの中に滑り込ませることによっても、取り付けることができる。六角形のボイドは、ポリマーまたはエポキシで埋めることができる。これらのマルチチャンネル・リストリクターは、静的または動的プロセスの両方で使用することができる。動的プロセスでは、低死容積Ｔ管継手が、液体（近臨界）若しくは二酸化炭素のような超臨界流体の流れと、噴霧される水性溶液若しくは懸濁液とを緊密に混合するために用いられる。静的プロセスでは、対象となる物質の溶液が超臨界若しくは近臨界流体によって、その臨界温度に近い温度で、加圧される。これは、若干の超臨界若しくは近臨界流体（二酸化炭素が用いられる場合には、約１〜２モル％まで）を水に溶解させることを可能とする。溶液が平衡に達した時、混合しながら、水性溶液と超臨界若しくは近臨界流体とが圧力リストリクターを通って噴出されると、流体が加圧流体帰路から大気圧若しくはそれより低い圧力へと出て行くときエアロゾルが形成される。マルチチャンネル・リストリクターは、ガス逆溶媒法、及び粒子が望まれる如何なる他の方法においても使用することができる。
【００５８】
リストリクターは、形づくられているか、または実質的に平らな端部を有することができる。リストリクターの端部は、機械的に形づくることができる。例えば、研磨材を用いて、材料の一部分を除去することができる。若干の好適な研磨材には、ダイアモンド埋め込みニッケル合金パッド、例えば、３Ｍによって作られた大理石彫刻に用いられる種類のものが含まれる。非常に小さな（ミクロン大の）ダイアモンド結晶は、各チャンネルの周りの壁を研磨してしまう。ダイアモンドパッドで形づくった後の図３に示されるタイプのリストリクターは、図４に示されている。あるいは、微細なフリット・シリコンカーバイド「ウエット−ドライ」サンドペーパーを使用することができる。グラウトまたはタイル中のケイ酸塩は、リストリクターを研磨し、形づくることができる。ダイアモンドが好ましい。
【００５９】
リストリクターの層は、化学的に腐食し去ることができる。例えば、ガラス・リストリクターの選択的な層は、ＨＦにより腐食することができる。使用することができる１つの方法は、先端内にゆっくりと空気を圧入し、そして、リストリクターをフッ化水素酸（水溶液）中に深く深く浸漬させることである。これは、端部を鉛筆状の先端点にまで先細りにさせる。他の適当な化学薬品を使用することができる。例えば、リストリクターが金属である場合には、層を除去するために塩酸のような酸を使用することができる。機械的及び化学的腐食の組み合わせを使用することができる。
【００６０】
円錐形先端の角度は、非常な鋭角から非常なシャープまで変動させることができる（リストリクター本体の面から約５度からリストリクター本体の面から約８９度まで）。円錐形先端の角度は、その中で小滴が形成される容積を決定し、より鋭角の角度により、そこで小滴が形成される容積が増大する。角度がもっと鋭角であると、チャンネルの出口は、丸い穴であるよりも長い楕円形に見える。半球の領域から噴霧すると（単一の方向であるよりも）、少ない凝集で、小滴が乾燥ガス中に急速に分散する。
【００６１】
マルチチャンネル・リストリクターを使用する利点には、単一チャンネルリストリクターに比較して増大したスループットと、幾つかのチャンネルが閉塞したり詰まったりした時に粒子形成を継続する能力が含まれる。流体に対して長く延びた出口を使用することの利点には、１）形成後の粒子の凝集問題を回避するのを助けるより分散した（軸方向に）エアロゾルのプルーム、及び２）よりよく混合された流体が含まれる。
【００６２】
マルチチャンネル・リストリクターは、流体；溶融物；溶液；超臨界流体並びに超臨界流体及び水性及び／または有機溶媒の溶液若しくは懸濁液；エマルジョン；ミクロエマルジョン；ミセル；逆相ミセル及び固体（非晶性または結晶性）の微粒子を含有するエアロゾルになるその他の物質を含む種々の粒子を形成するのに使用することができる。これらのエアロゾルは、ここに述べた方法または公知の他の方法を用いて乾燥することができる。マルチチャンネル・リストリクターは、消火器として使用することもでき、そこでは、フリーラジカル捕獲剤が熱の除去と組み合わせて火を覆い消すのに使用される。ラジカル捕獲剤を含有する非常に微細に分割された水滴のエアロゾル雲は、ＣＯ 2 なしに慣用のスプレー・ノズルから調製された大きい水滴に比べて、より高い表面積と沈殿することのない小滴懸濁寿命を有している。
【００６３】
実施例
材料
結晶化（３回）され、水で透析され、凍結乾燥された微結晶卵白リゾチームをシグマ・ケミカル社から購入した（ロット＃５３Ｈ７１４５）。シグマ・ケミカル社（兎の筋肉から分離、Ｍ4アイソザイム、ロット＃９５Ｈ９５５０）及びベーリンガー−マンハイム（豚の心臓から分離、Ｍ4アイソザイム、バッチ＃８４８９５５２７）から購入した乳酸デヒドロゲナーゼをアンモニウム塩懸濁液から得た。ショ糖とマンニトールは、ファンスチール(Pfanstiehl)・ラボラトリーズから購入し、さらなる精製なしに用いた。ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(Tween20：商標権者Croda International PLC)及び緩衝塩は、アルドリッチ・ケミカルから購入し、さらなる精製なしに使用した。二酸化炭素（ＳＦＥグレード、サイホンタンク）は、スコット・スペシャリティ・ガスから購入した。
【００６４】
方法
酵素の調製。リゾチーム溶液は、固体と予め凍結乾燥した材料を加えて、所望の剤型にすることにより調製した。リゾチームは、かなり頑丈な蛋白質であるため、凍結乾燥や慣用の噴霧乾燥によって重大な損傷を受けることがない。凍結乾燥した粉末を、２及び８℃の間の温度で溶液中にゆっくりと拡散させた。ＬＤＨアンモニウムサルフェイト懸濁液を、２及び８℃の間の温度で１２〜２４時間、１００ｍＬのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）に対して透析させた。次いで、得られた溶液を水で１００ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度に希釈した。
【００６５】
ネブライゼーション及びバブル乾燥システム。超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションに用いられるシステムをここに要約する（図１のダイヤグラム）。水性流れ及び超臨界若しくは近臨界二酸化炭素（Ｔ＞３２℃、Ｐ＝１５００ｐｓｉ）の流れは、水性流れについてはＨＰＬＣ溶媒送出しポンプ（ウオーターズ・モデルＭ−６０００Ａ）を使用し、二酸化炭素についてはシリンジ・ポンプ（ＩＳＣＯモデル２６０Ｄ，１５００ｐｓｉの一定圧で配送）を使用して、各々低死空間の混合Ｔ管継手（Ｖａｌｃｏ）の２つの脚の中に、ほぼ０．３ｍｌ／ｍｉｎの一定流量で、それぞれ配送された。最初は室温の２つの流れは、混合Ｔ管継手に取付けた熱電対制御カートリッジ・ヒーターにより、丁度約３２℃に加熱された。混合Ｔ管継手の中に形成された生成エマルジョンは、内径５０μｍ、長さ５ｃｍの溶融シリカ圧力リストリクター（アルテック）を取付けたＴ管継手の第三オリフィスから膨張させた。圧力リストリクター出たときの超臨界流体の急速な減圧は、水性溶液からの溶解二酸化炭素の爆発的な解放を伴い、若干の残留溶解二酸化炭素を含有する非常に微細な水性小滴の生成を引き起こす。このエアロゾルは、次いで、３０ｃｍ×２ｃｍのホウケイ酸ガラスからなり、上部に４つのガス導入口と、コールド・トラップ及び底部に真空ポンプを伴う粉末濾過装置（ステンレス鋼・ミリポア・フィルター・ホルダー、孔径０．２μｍの酢酸セルロース濾紙）とを取付けた特注の乾燥管に導かれる。ほぼ１５Ｌ／ｍｉｎの流量の加熱した乾燥窒素が、乾燥管上部の４つのガス導入口からエアロゾルと同時に加えられた。さらに、該管は、乾燥工程を助け、かつ、該管内壁での水の凝縮を妨げるために、赤外ランプで外側から加熱された。乾燥管内の生成温度は、ネブライゼーションの間、７０℃未満に維持したが、それは、急速なバブル乾燥を引き起こすのに充分であった。
【００６６】
一度、１０〜１５分間、純水の噴霧及び乾燥によりシステムを平衡させ、水性蛋白質調合剤（２〜２０％ｗ／ｗの全固形分を含有）をＨＰＬＣ型注入口から水性供給ラインに注入した。このタイプの注入口は、水性蛋白質調合剤の極めて小容量のアリコート（０．５から５ｍＬの間）を噴霧、乾燥、及び収集することを可能とし、それは、限られた量の蛋白質で操作するときに特に有用である。このシステムの設計は、暖かい乾燥窒素の絶え間ないパージの下に乾燥粉末を収集することを可能とするが、これは、実験完了後にも、乾燥室から過剰の水蒸気を除去するために継続される。濾紙装置は、次にシステムから分離され、乾燥窒素でパージしたグローブ・バッグに移され、そこで、粉末は、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに移され、蓋をされ、そして、分析するまでの間、濃硫酸上のデシケータ内に貯蔵された。幾つかの実験では、大気圧より僅かに低い圧力（ボウルダーで６３０ｍｍＨｇ、１マイル高い高度でのＣＯ）でフィルターから水蒸気、二酸化炭素、及び窒素を吸引するために、真空ポンプを用いた。他の実験では、真空ポンプを省略して、環境より少し上の圧力で乾燥を行い、同等の結果が得られた（データは示していない）。
【００６７】
静的及び動的システムｐＨ測定
観察可能な静的システムでの低死空間の混合Ｔ管継手内での条件をシミュレーションするために、フィッシャーｐＨ指示液を混合した未緩衝及び緩衝溶液を、サファイア窓、圧力変換機、熱電対リレー制御加熱カートリッジ、及び磁気撹拌機構を備えた高圧室に充填した。セルの内容物は、撹拌し、かつ、ＣＯ2で１５００ｐｓｉに加圧しながら、３５℃で平衡させた。二酸化炭素での水性調合剤の加圧に起因する増加した酸性度の度合いを決定するために、緩衝及び未緩衝溶液について一連のｐＨ測定を行った。第二のより定量的なアプローチでは、緩衝及び未緩衝溶液が超臨界ＣＯ2システムで噴霧され、そして、湿潤エアロゾルとして、収集容器内の水性溶液の水準がｐＨプローブによる測定が可能となるまで集められた。
【００６８】
実験設計
粉末特性用試料を下記の水性リゾチーム調合剤から超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥により調製した：４ｍｇ／ｍＬのリゾチームと１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）とからなる「緩衝液のみ」、４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）、及び１０％ｗ／ｗのマンニトールからなる「１０％マンニトール」、４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）、及び１０％ｗ／ｗのショ糖からなる「１０％ショ糖」、並びに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１００ｍＭのリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０％ｗ／ｗのショ糖、及び０．０１％ｗ／ｗのＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）〔ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート〕からなる「１０％ショ糖ｗ／Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）」。ネブライゼーション前に、如何なる粒子をも取り除くために、全ての調合剤を０．２μｍのナイロン・シリンジ・フィルターで濾過した。ほぼ２ｍＬの各調合剤を各運転毎にネブライゼーション・システム内に注入したが、緩衝液のみの調合剤については、この調合剤の全溶質含量が低いために、運転毎に６ｍｌ容量を注入した（分析のために、運転毎に充分な粉末を集めようと努力して）。各調合剤を３回注入し、そして、システムの運転毎の一貫性を決定するために、各粉末バッチを分離して収集した。さらに、ＬＤＨ含有粉末を、０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ、及び１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、並びに下記の賦形剤からなる水性調合剤から調製した：１０％ｗ／ｗのマンニトール、１０％ｗ／ｗのショ糖、及び０．０１％ｗ／ｗのＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）と１０％ｗ／ｗのショ糖。これらの濃度は、バブル乾燥前の水性溶液中でのパーセントを指す：乾燥粉末中の濃度は、水分が除去されるにつれて、比例して大きくなる。
【００６９】
サイズ排除クロマトグラフィ
可溶性凝集物の存在は、２８０、ＧＰ４０勾配流体ポンプ及びスペクトラ・フィジックス・オートサンプラー付きモデルＡＤ２０ＵＶ検知器を装備したディオネックス(Dionex)ＨＰＬＣで、サイズ排除クロマトグラフィにより決定した。固定相は、孔径２５０Åの５ｍｍシリカ・ビードの３０ｍｍ×７．８ｍｍ(i.d.)TosoHaas TSK-Gel G3000SWX1カラムから成る。定組成移動相は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）から成る。注入前に、粉末試料を、脱イオン水により、予備脱水された最初の全固体重量対全溶液重量比に再水和した。再水和試料は、遠心分離し、そして、隔膜で蓋を付けたＨＰＬＣバイアルでオートサンプラー内に入れた。流量は、０．５ｍＬ／ｍｉｎに設定し、そして、ほぼ１０ｍＬの各試料をカラムに注入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ＢＳＡ、及びオボアルブミンが分子量標準物質として用いた。各試料は、３回注入し、各ピーク領域の平均を決定した。
【００７０】
走査型電子顕微鏡
粉末は、ＩＳＩ−ＳＸ−３０及びＪｅｏｌ ＪＩＭ−６４００走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、３０ｋＶの加速電圧で検査した。試料をカーボン・テープを用いてアルミニウム・スタブに固着し、分析前に金スパッタした。
【００７１】
熱分析
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、パーキン−エルマーＤＳＣ−７により実施した。粉末（５〜１０ｍｇ）を陽極化したアルミニウム皿に入れ、湿度制御雰囲気中（＜２％相対湿度）、窒素下で気密密閉した。各試料を−２０℃に急冷し、−２０℃で１０分間保持し、次いで、１０℃／ｍｉｎの加熱速度で２００℃に加熱した。Ｔｇは、ガラス転移温度（ガラス−液体）である。Ｔｍは、固体−液体の溶融温度である。
【００７２】
Ｘ線粉末回折
粉末Ｘ線回折は、４０ｋＶ、２５ｍＡのチューブ・ロードで作動するＣｕＫa源（ｌ＝１．５４０５６Å）を装備したシンターク(Sintag)ＰＡＤＶシステムにより実施した。超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥により調製された粉末中の結晶性の有無を決定するために、試料を０．０２°／ｍｉｎの走査速度で、５°から５０°までの２θの範囲にわたって走査した。
【００７３】
水分分析
カール・フィッシャー滴定をメトラー・カール・フィッシャー自動滴定器で実施した。分析用試料は、１％未満の相対湿度に維持し、窒素でパージしたグローブ・ボックス内で調製した。約１ｍＬの無水メタノールまたはホルムアミドを２５ｍｇの試料粉末に加えた。得られた懸濁液を数回にわたって超音波処理した。１００ｍＬの溶液を電量計内に注入し、粉末の水分含量を、粉末を懸濁させた溶液の背景水分含量を差し引いた後に決定した。各粉末試料の分析は、３回行った。
【００７４】
赤外分光学
ボーマン(Bomen)ＰＲＯＴＡ赤外分光光度計を用いて赤外スペクトルを得た。凍結乾燥粉末（約０．５ｍｇの蛋白質）を３００ｍｇの無水ＫＢｒと混合し、１３ｍｍの真空ダイで圧縮してペレットにした。ペレットを分光光度計の窒素でパージした試料室内に直接置いた。天然蛋白質の水性溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、６ｍｍのマイラー・スペーサーで分離されたＣａＦ2窓を含む試料セル内に載置した。平均１２８スキャンが、４０００〜９００ｃｍ-1の範囲内で４ｃｍ-1の分解能で集められ、フーリエ変換された。水性試料について、液体水及び水蒸気のスペクトルが、予め確定した判定基準に従って、蛋白質溶液の蛋白質スペクトルから差し引かれた〔Ａ．ドンらの(1990)「二次導関数アミドＩ赤外スペクトルからの水中での蛋白質二次構造」、Biochem. 29:3303-3308；Ａ．ドン及びＷ．Ｓ．コージーの(1994)「ヘモグロビン反応と構造研究の赤外法」、Methods Enzymol. 232:139-175；Ａ．ドンらの(1995)「凍結乾燥の赤外分光研究−及び温度−誘導された蛋白質凝集」、J. Pharm. Sci. 84;415-424〕。フーリエ変換されたスペクトルの二次導関数を計算し、そして、ありうる白色ノイズを減少させるために、データのSavitzky-Golay補整を７点繰り込みウインドウで適用した。
【００７５】
リゾチーム酵素活性アッセイ
ミクロコッカス（球菌）lysodeikticus（シグマ社、ロット＃３８Ｈ８６１９）のバクテリア懸濁液をリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．６）中の０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。リゾチーム溶液をリン酸塩緩衝液で４ｍｇ／ｍＬに希釈した。反応混合物は、２．５ｍＬのセル懸濁液と０．１ｍＬの酵素希釈液から成る。酵素活性は、セル懸濁液の混濁度の減少度に比例したが、それは、４５０ｎｍで２分間の吸収での直線的な減少として分光測光的に測定された。
【００７６】
ＬＤＨ酵素活性アッセイ
ＬＤＨ活性は、２５ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（トリス／トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのピルビン酸塩（シグマ社、ロット＃１２６Ｈ１０９８１）、及び０．１５ｍＭのＮＡＤＨ（シグマ社、ロット＃０２７Ｈ７８１９１）からなる２ｍＬの反応混合物中、２５℃で測定した。ＬＤＨ調合剤（１０ｍＬ）を反応混合物に添加し、キュベット（セル）を３回逆転させ、そして、３４０ｎｍでの吸収減少を分光光度計で測定した。超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションの直前と乾燥粉末の再水和の直後に活性を測定し、初期活性のパーセントとして報告した。図１２を見ると、ＬＤＨ活性は、幾つかの組成物において、当初の水性溶液の活性の１００％より大きくなっている。
【００７７】
緩衝液有りと無しとでの静的及び動的ｐＨ測定
ＣＯ2を水に溶解したとき酸性化が起こるか否かの問題が緩衝液の使用により回避できることを研究した。１５００ｐｓｉでの水中へのＣＯ2の溶解度（３５℃でほぼ２モル％）は、未緩衝溶液での酸性度の増加を引き起こす。緩衝液の不存在下で、酸性環境は、潜在的に蛋白質を変性させる。これらの理由により、緩衝なしの水性溶液の酸性度の増加の程度を観察するため、静的システムを混合Ｔ管継手内での状態をシミュレーションするために用いた。酸性度の変化を定性的にモニターするために、二酸化炭素で加圧する前の水性溶液に、ｐＨ感応指示染料を添加した。予期したように、ｐＨは、加圧するや否や指示薬の範囲未満（ｐＨ＜４）に急速に減少した。この影響を中和する能力は、下記緩衝塩について、この静的システムで評価した：一塩基／二塩基リン酸カリウム（ｐＨ７）、トリス／トリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）、クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、及び酢酸／酢酸ナトリウム（ｐＨ５）。全ての溶液について緩衝能力を、指示薬染料の色の変化を邪魔する緩衝システムの能力として測定することによりテストしたが、ほぼ１００ｍＭの濃度で安定した（データは示されてない）。これらの観察をさらに定量化するために、静的システムで用いたのと同じ緩衝液を超臨界ＣＯ2システムで噴霧して、湿潤エアロゾルとして収集した。各溶液のｐＨは、二酸化炭素の泡立ちにより値が増大しつづけるため、収集直後に測定しなければならない。この実験の結果は、図５に示されており、１００ｍＭの緩衝液が溶解したＣＯ2の影響を適切に中和し、かつ、酸性化により損傷される蛋白質の損傷を回避するという静的観察と一致した。
【００７８】
微細粉末特性
本件発明の方法により製造された分子の表面特性を決定するために、硫酸アルブテロール(albuterol sulfate)、硫酸トブラマイシン、クロモリンナトリウム(cromolyn sodium)、ｒｈＤＮａｓｅ、乳糖、及び塩化ナトリウムの微粉末を上記で概説した方法を用いて調製した。小滴形成の条件は、ＣＯ2圧が１５００ｐｓｉ、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流量、ＣＯ2及びＨ2Ｏ濃度が約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、管入口〜７０℃、管出口〜５０℃、５０ｍｍ、５ｃｍの溶融シリカ・リストリクター、０．２ｍｍの酢酸セルロール濾紙であった。
【００７９】
図６は、この発明の方法を用いて調製された代表的な乾燥粉末の電子顕微鏡写真である。図６Ａは、２０％水性塩化ナトリウム試料を用いて、本発明の方法で調製された乾燥塩化ナトリウム粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）影像である。図６Ｂは、この発明の方法により乾燥した後の同じ塩化ナトリウム溶液の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）影像である。図６Ｃは、マンニトールのＴＥＭ影像である。図６Ｄ及び６Ｅは、１０％（全溶質の質量／容積）水性溶液について、この発明の方法により調製された硫酸トブロマイシン粒子（６Ｄ）及び乳糖粒子中の１％硫酸トブロマイシン（６Ｅ）を示す。図６Ｆは、この発明の方法により製造された硫酸アルブテロール粒子の影像である。図６Ｇは、本発明の方法により製造された硫酸クロモリン粒子の影像である。
【００８０】
乾燥粉末は、「材料」と「方法」で述べた水性リゾチーム調合剤からＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥により最初に調製される。見たところ、回収された試料は、運転から運転での粉末品質の変化が非常に小さく、すべてが非常に微細な白色粉末であった。全粉末は、湿潤空気中で吸湿性であったが、低湿環境中では、自由流動であり、取り扱いが容易であった。典型的な乾燥粉末蛋白質調合剤の電子顕微鏡写真を図７に示す。「緩衝液のみ」の粉末（Ａ）、１０％マンニトール（Ｂ）、１０％ショ糖（Ｃ）、及び０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を有する１０％ショ糖（Ｄ）。Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）を用いた時（図７Ｄ参照）、凝集の少ない粒子で、より明確に球形で、個別の粒子を持つ粉末が形成されることに注目されたい。これは、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）の添加による直接的または間接的な効果である。何らかの特別の理論によって制限されることは望まないが、界面活性剤は、工程処理中で水和するのを助けると思われる。製造された全ての粉末は、粒子の相当部分が都合よく吸入可能な粒度範囲の直径１〜３ｍｍ内にある。緩衝液のみの調合剤及び１０％マンニトールを含有する調合剤から調製された粉末の形態は、ショ糖を含有する調合剤から調製された粉末よりも、かなりの程度、球形及び円滑ではないように見える。ショ糖溶液へのＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）の添加は、乾燥粒子の表面をさらになお円滑にする効果を有している。これは、一般に噴霧乾燥された粒子について、他の研究者により観察されており、水性調合剤への界面活性剤の添加は、水和工程での表面の乱れを減少させる効果を持っていると仮定される。
【００８１】
１０％マンニトール調合剤の顕微鏡写真（図７Ｂ）は、多面粒子として見られるように、より結晶性の材料を示している。
【００８２】
水分分析
本発明の方法により乾燥されたリゾチーム粉末のカール・フィッシャー水分分析も低い水分含有量を示している：１０％（初期水性溶液のパーセント）マンニトールを有する４ｍｇ／ｍＬリゾチーム試料の水分含有量は、０．６±０．０５％であり；１０％ショ糖を有する４ｍｇ／ｍＬリゾチーム粉末の水分含有量は、１．１８±０．０２％であり、そして、１０％ショ糖と０．０１％Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）を有する４ｍｇ／ｍＬリゾチーム粉末の水分含有量は、１．２５±０．０７％であった。
【００８３】
超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥により調製された各ＬＤＨ粉末について行われたカール・フィッシャー滴定は、この新しい方法について、かなり低い水分含有量を達成できることを示している：緩衝液のみの調合剤から調製された粉末の水分含有量は、０．８３±０．０６％ｗ／ｗであり、１０％マンニトール調合剤からは、１．３±０．０１％であり、１０％ショ糖調合剤からは、１．４±０．０８％であり、そして、１０％ショ糖と０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有する調合剤からは、３．２５±０．０３％であった。回収されたショ糖粉末は、非常に吸湿性であり、そして、乾燥窒素下、手袋をはめた袋(gloved bag)中で取り扱わなければならなかった。他の糖類粉末、例えばトレハロースは、吸湿性が少ない。
【００８４】
ＸＲＤ及びＤＳＣ
付形剤の結晶化は、固体の薬学的調合剤の可溶性及び安定性に劇的な効果を有することができるため、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションでの結晶性及び／または非晶性粉末を形成する能力を探究した。凍結乾燥中に結晶化し、かつ、噴霧乾燥で結晶粉末を形成するマンニトールの強い傾向は、よく知られている。したがって、結晶粉末を形成するネブライゼーション・システムの適応性を決定するために、モデル蛋白質を相当程度に安定化することは期待できないけれども、付形剤としてマンニトールを選択した。結晶性は、固体の調合薬に対する充てん剤として用いられる付形剤の望ましい特質であるが、工程処理中に結晶化の傾向がある付形剤は、再水和とその後の乾燥状態での貯蔵中、不安定な蛋白質薬剤に対して、極めて少ない保護しか提供しない。１０％マンニトール調合剤から調製されたリゾチーム試料の粉末回折データは、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションにより調製された試料について、図８に示されている。水性調合剤は、４ｍｇ／ｍＬリゾチーム、ｐＨ７の１００ｍＭリン酸塩緩衝液を含有し、１０％マンニトール（Ａ）または１０％ショ糖（Ｂ）と一緒に噴霧された。バブル乾燥粒子中の最終的な近似の固体重量パーセントは、４％の蛋白質、１６％の緩衝剤、及び８０％の糖類であった。１０％マンニトール溶液から調製された粉末の回折データは、試料内での良好な結晶性を示し、マンニトールのａ及びｂ多型体の混合物であるように見える。この回折パターンは、専門業者（示さず）から入手した純粋Ｄ−マンニトールについて得られた粉末回折パターンと一致している。
【００８５】
入手したマンニトール、リゾチームで噴霧乾燥したマンニトール、リゾチームで噴霧乾燥したショ糖、並びにショ糖及びリゾチームについてのＤＳＣは、示していない。入手したマンニトール試料のＤＳＣは、１５７．２５〜１７７．５６℃のピークを示した：立上り１５６．１０℃。Ｔｍは、１５９℃であった；３００．４７Ｊ／ｇ。４ｍｇ／ｍＬのリゾチームで噴霧乾燥したマンニトール試料のＤＳＣは、７７．６３〜１４６．４８℃のピーク立上りを示した。Ｔｍ＝１５４．７℃；１３４Ｊ／ｇ（逆修正）。４ｍｇ／ｍＬのリゾチームを有するショ糖試料のＤＳＣは、立上り４０．２５℃で２１．９３から４７．１２℃のＴｇを示した。Ｔｇ＝４３．０５℃及び１．５１Ｊ／ｇ度（逆修正）。Ｔｗｅｅｎ及び４ｍｇ／ｍＬのリゾチームを有するショ糖のＤＳＣは、２８．５７から５６．９９℃のＴｇを示した；立上り４５．３６℃；１．００Ｊ／ｇ度；Ｔｇ＝５０．９５℃。
【００８６】
ショ糖調合剤のＸ線粉末回折データ（図８、パターンＢ）は、ＤＳＣサーモグラム中に観察されるガラス転移により確認された、より非晶の性質を示している。ガラス転移温度未満で非晶のガラス状粉末を形成する能力は、最近、蛋白質の安定化とガラス化（ガラス形成）とが結びついているという重要な証拠が見出されているため、開示されたシステムの１つの重要な能力である〔Ｊ．Ｈ．クロウらの(1998)「無水生活でのガラス化の役割」、Annu. Rev. Physiol. 60:73〕。試料の示差走査熱量測定は、１５４．７℃での吸熱事象の存在を示しているが、それは、結晶Ｄ−マンニトールの融点（１６９℃）と一致している。低下したＴｍは、粉末中の水（カール・フィッシャー滴定により測定して約１％）の存在によるものであろう。
【００８７】
再水和溶液の特性
濾紙上に収集した粉末は、小さな不活性チューブに移され、蒸留、脱イオン水で、最初のｗｔ／ｗｔ％（全溶質の質量：全溶媒の質量）に再水和された。最初の溶液に対する再水和蛋白質溶液の活性アッセイは、噴霧した全ての溶液について、９０％を越える活性保持率（または回復率）を示した。ＨＰＬＣ（サイズ排除TosohaasカラムＴＳＫ３０００ＳＷXL、１００ｍＭのＫＰＯ4ｐＨ＝７．０溶出緩衝液）は、乾燥及び再水和後、ダイマー性凝集物に対するモノマー性蛋白質の比率が一定不変を維持していることを示した（ダイマー、トリマー、そして最後には不溶性の凝集物を作り出す凝集形成は、普通の蛋白質分解経路である）。ＨＰＬＣデータは、示されていない。凝集物：モノマー比率は、最初のリゾチーム調合剤及び全ての再水和粉末について、ほぼ０．２１％±０．０２％であると算出された。
【００８８】
研究者は、固体状態での蛋白質の安定化のための重要な方法の一つは、天然蛋白質の構造的コンホメーション(conformation；配座)を、再水和時に、少なくとも幾分か保持することができるマトリックスを蛋白質に提供することであると考えている〔Ｂ．Ｓ．チャンらの(1996)「凍結乾燥インターロイキン−１・レセプター・アンタゴニストの貯蔵安定性に影響する物理的ファクター：ガラス転移及び蛋白質コンホメーション」、Arch. Biochem. Biophys. 331:249；Ｄ．Ｓ．アリソンらの(1998)「アクチンの構造と機能に対する乾燥方法と添加剤の影響：再水和−誘導損傷とその抑制の機構」、Arch. Biochem. Biophys. 358:171〕。再水和−誘導構造遷移は、ショ糖のようなある種の安定剤を処理前の蛋白質溶液に添加することにより抑制できることが示されている〔Ｓ．Ｊ．プレストレルスキーらの(1993)「蛋白質における再水和−誘導配座遷移及びそれらの安定剤による抑制」、Biophys. J. 65:661〕。アミドＩ領域（１６００〜１７００ｃｍ-1）での二次導関数フーリエ変換赤外分光学〔Ｊ．Ｆ．カーペンターらの(1998)「安定な凍結乾燥蛋白質調合剤の開発への赤外分光学」、Eur. J. Pharm. Biopharm/ 45:231〕が乾燥リゾチーム粉末の配座構造(conformational structure)を探査するために用いられた。代表的な結果を図９に示す。（Ａ）天然水性状態のリゾチーム、（Ｂ）１０％ショ糖と０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有するリゾチーム、（Ｃ）１０％ショ糖を有するリゾチーム、（Ｄ）１０％マンニトールを有するリゾチーム、及び（Ｅ）緩衝液のみのリゾチームの試料を７０℃で乾燥した。アミドＩ領域は、二次構造の異なるタイプに対する特性Ｃ＝Ｏ伸張周波数を示している。興味深いことに、酵素活性が全ての粉末の再水和に際してほぼ完全に維持されているものの、乾燥リゾチーム粉末は、各調合剤において、著しく異なった蛋白質コンホメーションを示した。天然リゾチーム液体赤外スペクトルと比較した時、付形剤を含有しない調合剤は、天然コンホメーションからの最大の偏差(deviation)を示し、１０％マンニトール調合剤は、緩衝液のみの配合剤から幾分僅かの偏差を示し、一方、１０％ショ糖調合剤は、天然構造からのさらに少ない偏差を示した。１０％ショ糖プラスＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）調合剤は、全ての粉末について、最も天然類似構造を示した。これらの結果は、リゾチームは、本発明のネブライゼーション及びバブル乾燥により、不可逆的に損傷されないことを示している。しかし、蛋白質構造は、乾燥粉末中では、天然コンホメーションからの重大な偏差を示した。活性の回復は、再水和で天然コンホメーションを回復するリゾチームの能力を示しているように見える。乾燥工程で観察される配座遷移は、ショ糖のような二糖安定剤の添加により抑制することができる。
【００８９】
理論により制限されることを望まないが、糖類の水素が水分子に置き換わって蛋白質と結合し、それにより、再水和での蛋白質構造における配座変化が減少すると考えられる。界面活性剤は、蛋白質が受ける空気−水界面でのストレスの量を、有効空気−水界面領域を蛋白質と競合することにより減少させる。蛋白質調合剤に添加された界面活性剤は、蛋白質分子の凝集を防ぐと考えられる。
【００９０】
リゾチーム活性アッセイ
最初の全溶質％（ｗ／ｗ）に再水和されたリゾチーム粉末の酵素活性を再水和の直後に測定した。これらの結果（図１０）は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥の直前にそれぞれ独立に測定された初期活性のパーセントとして報告されている。結果は、少なくとも３回の測定の平均値であり、そして、誤差棒は、１つの標準偏差を示している。リゾチーム粉末の分析は、全ての調合剤について、初期活性の９０％を越える回復率を示している。観察された活性の回復率は、この蛋白質の脱水及び再水和での構造変化の可逆性を示している。したがって、リゾチームは、非晶性安定剤の不存在下での超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションの間、脱水により厳しく開かれる(unfolded)が、それは、再水和により容易に構造復元され、そして、それによって、最初の生物活性の多くを回復する。
【００９１】
ＬＤＨ活性アッセイ
ネブライゼーション法をさらに調べるために、相当に不安定な酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ、シグマ社、Ｌ−５７６２）を用いて研究を行った。データを図１１及び１２に示す。ＬＤＨは、通常の乾燥工程で損傷することが知られている〔Ｍ．アドラー及びＧ．リーの(1999)「噴霧乾燥トレハロース中での乳酸デヒドロゲナーゼの安定性と表面活性」、J. Pharm. Sci. 88:199〕。ＬＤＨをｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に対して、室温で少なくとも１２時間透析した。蛋白質濃度は、１００μｇ／ｍＬで一定不変に保持した。ＬＤＨ調合剤は、リゾチーム調合剤のバブル乾燥に使用されたのと同じ条件を用いて脱水した。ＬＤＨ溶液から調製された粉末は、見た目に、リゾチームを含有する粉末と同じであるように見えた（データは示していない）。
【００９２】
ＬＤＨを含有する乾燥粉末を、ＬＤＨ（１００μｇ／ｍＬ）及びリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ＝７．５）と一緒に、１０％マンニトール、１０％ショ糖、及び１０％ショ糖プラス０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有する調合剤から製造した。再水和粉末の活性を、ネブライゼーション及び乾燥前の初期調合剤と比較した。
【００９３】
４つの異なる調合剤を調製した：
緩衝液のみ
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１０％マンニトール
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１００ｍｇ／ｍＬのマンニトール
１０％ショ糖
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１００ｍｇ／ｍＬのショ糖
１０％ショ糖とＴｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）
０．１ｍｇ／ｍＬのＬＤＨ
１００ｍＭのＫＰＯ4（ｐＨ７．５）
１００ｍｇ／ｍＬのショ糖
０．１ｍｇ／ｍＬのＴｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）
【００９４】
これらの調合剤についてのＬＤＨ触媒活性回復率を図１２に示す。添加付形剤なしに噴霧及び脱水されたＬＤＨは、再水和後、その初期活性の僅か１５％を回復しているだけである。興味深いことに、湿潤エアロゾルとして収集された同じ溶液は、その初期酵素活性の８７％を維持している。この結果は、蛋白質がこうむる損傷の殆どが水性溶液／ＣＯ2エマルジョンがリストリクター先端から噴出された後の乾燥工程で起こることを示している。換言すれば、ＣＯ2補助ネブライゼーションは、７０℃で、窒素中での微細小滴及び微細バブルの乾燥のように厳しくはない。脱水工程でこうむる回復できない損傷は、マンニトールの添加により部分的に抑制され、ショ糖の添加により大きな程度で抑制される。ショ糖とＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）の添加により、活性低下が殆ど完全に抑制される。これらの結果は、より不安定な四量体酵素(tetrameric enzyme)のＬＤＨは、再水和でリゾチームと同じ構造復元能力を持つとは予期されなかったけれども、リゾチーム調合剤の構造分析から予期されるのと同じである。この結果、ＬＤＨがショ糖の存在下に乾燥された時、おそらく蛋白質の構造が保持されたために、活性がよりよく保持された。
【００９５】
図１２は、マンニトール、ショ糖及び〔ショ糖＋Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）（０．０１％）〕のパーセントを変化させて再水和した時の活性の回復率を比較している。初期活性のパーセント回復率は、調合剤中にＴｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）が使用された時、糖類の濃度によって最も劇的な変化を示していることに留意されたい。
【００９６】
一般に、これらの結果は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥の間にＬＤＨがこうむる損傷が、糖類安定剤の添加により抑制され、１０％ショ糖と０．０１％界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）との組み合わせにより、さらに抑制されることを示している。調合された蛋白質は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥の間に受ける脱水工程を通して成功裏に保護されているように思われる。
【００９７】
超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥の間にＴｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）がショ糖の存在下に保護を増大させる機構は、この時点で不確かである。Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）は、空気−液体界面での表面位置を飽和状態にし、それによって、表面の変性を防ぐことことにより蛋白質を保護している。空気−液体界面は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションにより高表面積の微細小滴が作られるために、この方法では重要であると予想される。さらに、界面活性剤は、凝集の潜在的な位置である蛋白質表面の疎水性位置を飽和することにより、保護を与えている。さらにまた、界面活性剤は、再水和の間に蛋白質の構造復元を促進している。Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）がネブライゼーションとバブル乾燥との間に、これらの機構の１つ以上によってＬＤＨを保護しているのか否かは、この時点では未決定である。この蛋白質の保護効果は、Ｔｗｅｅｎ２０（商標権者Croda International PLC）を含有するショ糖調合剤で言及した改良された粒子分離及び円滑性と組み合わさって、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーションとバブル乾燥により乾燥される調合剤に、この界面活性剤を含有させる潜在的な利点を明瞭に証明している。酵素分析により指摘されているように、幾つかの実験において、ＣＯ2での圧縮、減圧、及びバブル乾燥後の水性リゾチームの酵素活性が、２０００ｐｓｉでの圧縮前の初期水性溶液よりも明らかに大きくなっていることも注目される（例えば、図１２の「１５％ショ糖＋Ｔｗｅｅｎ（商標権者Croda International PLC）参照）。蛋白質の構造復元は、２０，０００ｐｓｉで水性溶液を加圧することにより促進されることが、Ｓｔ．ション、カーペンター、及びランドルフにより示されている〔「高濃度での凝集物からの高圧フォスター蛋白質の構造復元」、Proc. Natl. Acad. Sci. 96:13029, 1999〕。この時点で、改良された活性の原因は、知られていない。出願には、理論によって制限されることを望まないが、界面活性剤とＣＯ2での圧縮により水性溶液を処理すると、界面活性剤、適度な圧力、二酸化炭素の存在、若しくは糖類に起因して、あるいは他の機構により、明らかに改良された活性が作り出される。
【００９８】
上記の記述は、多数の特性を含んでいるけれども、これらは、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、単に、この発明の目下の好ましい態様の幾つかの例示を提供していると解釈されるべきである。例えば、多数の異なる物質の多数の微細乾燥粒子が本発明の方法で使用することができる；他の超臨界若しくは近臨界流体を具体的に例示されたものよりほかに使用することができる；並びに具体的に例示されたもの以外の添加剤を使用することができる。本発明の範囲は、与えられた実施例によるよりも、付属の請求項及び法的均等物により決定されるべきである。
【００９９】
この開示で引用されている各引用例は、ここでの開示と不一致でない範囲で、参照のためにここに盛り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、超臨界流体補助ネブライゼーション及びバブル乾燥システムの説明図である。
【図２】 図２は、本発明で使用される乾燥管の図である。
【図３】 図３は、マルチチャンネル・フロー・リストリクター端部の電子顕微鏡写真である。
【図４】 図４は、形づけられたマルチチャンネル・フロー・リストリクターの電子顕微鏡写真である。
【図５】 図５は、一塩基／二塩基リン酸カリウム（◆、ｐＨ７）、トリス／トリスＨＣｌ（▲、ｐＨ７．２）、クエン酸／クエン酸ナトリウム（■、ｐＨ５．５）、及び酢酸／酢酸ナトリウム（●、ｐＨ５）の超臨界ＣＯ2によるネブライゼーションでの緩衝能力のグラフである。
【図６】 図６Ａ−６Ｇは、この発明の方法により製造された乾燥蛋白質粉末の電子顕微鏡写真である。
【図７】 図７は、付形剤有りと無しで、この発明の方法により製造されたリゾチーム粉末の電子顕微鏡写真である。
【図８】 図８は、４ｍｇ／ｍＬリゾチーム、ｐＨ７での１００ｍＭリン酸塩緩衝液、並びに１０％マンニトール（Ａ）及び１０％スクロース（Ｂ）（バブル乾燥粉末中で、４％蛋白質、１６％緩衝剤、及び８０％糖類の最終的な近似固体重量％をもっている）の超臨界流体ＣＯ2補助ネブライゼーションにより調製された試料のＸ線回折パターンを示す。
【図９】 図９は、付形剤有りと無しで、この発明の方法により製造されたリゾチーム粉末のＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図１０】 図１０は、超臨界ＣＯ2補助ネブライゼーション及びバブル乾燥を用いて製造し、再水和した粉末のリゾチーム酵素活性を最初の製剤の活性と対比したグラフである。
【図１１】 図１１は、この発明の方法により製造した乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）粉末の再水和後の活性のグラフである。
【図１２】 図１２は、種々の付形剤を種々のパーセントで用いた再水和でのリゾチーム活性の回復のグラフである。
Claims (38)
- 超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体またはこれらの混合物のいずれかに可溶性であるか、あるいは水性溶液に可溶性若しくは懸濁可能である一種以上の物質を含む、直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）一種以上の物質と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを含有する組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させる
ことを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法。 - 小滴が最初に前記ガスを通過する点でのガス温度が、１００℃未満である請求項１記載の方法。
- 物質が、該超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体に可溶性である請求項１記載の方法。
- 組成物が、水性溶媒をも含有する請求項１記載の方法。
- 物質が、該水性溶媒に可溶性である請求項４記載の方法。
- 組成物が、賦形剤、安定剤、充てん剤、及び界面活性剤からなる群より選ばれる一種以上の添加剤をも含有する請求項１記載の方法。
- 添加剤が、乾燥物質の重量の９９．９％未満を構成する請求項６記載の方法。
- 組成物が、ｐＨ緩衝物質をも含有する請求項１記載の方法。
- 超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体が、二酸化炭素である請求項１記載の方法。
- 前記ガスが、窒素である請求項１記載の方法。
- 前記ガスの流れが、乾燥室の中に入れられている請求項１記載の方法。
- 物質が、界面活性剤、インシュリン、アミノ酸、酵素、鎮痛薬、抗がん剤、抗菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、抗真菌性製薬、抗生物質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、免疫抑制剤、血栓溶解剤、抗凝血剤、中枢神経系統刺激剤、うっ血除去薬、利尿血管拡張薬、抗精神病薬、神経伝達物質、鎮静薬、ホルモン、麻酔薬、抗炎症薬、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン、ミネラル、及びその他の公知の生理的活性材料からなる群より選ばれる一種以上の物質からなる生理活性組成物である請求項１記載の方法。
- （ｄ）微細乾燥粒子を収集する
工程をさらに含む請求項１記載の方法。 - 直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）一種以上の対象となる物質を含有する水性溶液と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを混合して組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させることを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法。 - 小滴が最初に前記ガスを通過する点でのガス温度が、１００℃未満である請求項１４記載の方法。
- 組成物が、賦形剤、安定剤、充てん剤、及び界面活性剤からなる群より選ばれる一種以上の添加剤をも含有する請求項１４記載の方法。
- 添加剤が、乾燥物質の重量の９９．９％未満を構成する請求項１６記載の方法。
- 界面活性剤が、存在する場合には、０．００１〜０．５重量％の間の濃度で存在し、安定剤が、存在する場合には、０．０５〜２５重量％の間の濃度で存在する請求項１６記載の方法。
- 混合が、０．２〜１０μｌの容積のＴ管継手状の混合室の中で行われる請求項１４記載の方法。
- 物質が、界面活性剤、インシュリン、アミノ酸、酵素、鎮痛薬、抗がん剤、抗菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、抗真菌性製薬、抗生物質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、免疫抑制剤、血栓溶解剤、抗凝血剤、中枢神経系統刺激剤、うっ血除去薬、利尿血管拡張薬、抗精神病薬、神経伝達物質、鎮静薬、ホルモン、麻酔薬、抗炎症薬、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン、ミネラル、及びその他の公知の生理活性材料からなる群より選ばれる一種以上の物質からなる生理的に活性な組成物である請求項１４記載の方法。
- 前記ガスの流れが、乾燥室の中に入れられている請求項１４記載の方法。
- 直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の形成方法であって、
（ａ）対象となる物質の水性溶液と超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体とを平衡させて、組成物を形成し、
（ｂ）組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を３５℃から１００℃の間の温度に加熱された乾燥させるためのガスの流れの中を通過させる
ことを特徴とする微細乾燥粒子の形成方法。 - 小滴が最初に前記ガスを通過する点でのガス温度が、１００℃未満である請求項２２記載の方法。
- 組成物が、賦形剤、安定剤、充てん剤、及び界面活性剤からなる群より選ばれる一種以上の添加剤をも含有する請求項２２記載の方法。
- 添加剤が、乾燥物質の重量の９９．９％未満を構成する請求項２４記載の方法。
- 界面活性剤が、存在する場合には、０．００１〜０．５重量％の間の濃度で存在し、安定剤が、存在する場合には、０．０５〜２５重量％の間の濃度で存在する請求項２４記載の方法。
- 物質が、界面活性剤、インシュリン、アミノ酸、酵素、鎮痛薬、抗がん剤、抗菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、抗真菌性製薬、抗生物質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、免疫抑制剤、血栓溶解剤、抗凝血剤、中枢神経系統刺激剤、うっ血除去薬、利尿血管拡張薬、抗精神病薬、神経伝達物質、鎮静薬、ホルモン、麻酔薬、抗炎症薬、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン、ミネラル、及びその他の公知の生理活性材料からなる群より選ばれる一種以上の物質からなる生理活性組成物である請求項２２記載の方法。
- 前記ガスの流れが、乾燥室の中に入れられている請求項２２記載の方法。
- 直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子を形成するための装置であって、
（ａ）第一の非ガス状超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体を含有する第一加圧室、
（ｂ）第二の非ガス状流体中の物質の溶液または懸濁液を含有する第二室、
（ｃ）導管により第一及び第二室と連結された、前記溶液または懸濁液と第一流体とを混合するための混合室、
（ｄ）第一流体を混合室に通過させるための第一室と混合室との間の導管に連結された第一流量制御手段、
（ｅ）第二液体を混合室に通過させるための第二室と混合室との間の導管に連結された第二流量制御手段、
（ｆ）混合室の中から出た組成物を超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体の圧力より小さな圧力を有する急速膨張領域に導いて該物質の微細粒子のディスパージョンを形成するために、混合室に連結されたリストリクター、
（ｇ）リストリクターに連結された乾燥室、
（ｈ）１つ以上の注入口で乾燥室に連結されたガス源、
（ｉ）乾燥室を通過した後に粒子を収集するための手段
を含むことを特徴とする微細乾燥粒子を形成するための装置。 - 混合室が、０．２〜１０μｌの容積のＴ管継手状の混合室である請求項２９記載の装置。
- 第一流体が、超臨界二酸化炭素である請求項２９記載の装置。
- 第一流体が、臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体である請求項２９記載の装置。
- 第二流体が、水性である請求項２９記載の装置。
- 物質が、界面活性剤、インシュリン、アミノ酸、酵素、鎮痛薬、抗がん剤、抗菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、抗真菌性製薬、抗生物質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、アンチセンスｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、免疫抑制剤、血栓溶解剤、抗凝血剤、中枢神経系統刺激剤、うっ血除去薬、利尿血管拡張薬、抗精神病薬、神経伝達物質、鎮静薬、ホルモン、麻酔薬、抗炎症薬、抗酸化薬、抗ヒスタミン薬、ビタミン、ミネラル、及びその他の公知の生理活性材料からなる群より選ばれる一種以上の物質からなる生理活性組成物である請求項２９記載の装置。
- 請求項１記載の方法で形成された微細乾燥粒子が、薬学的に活性な蛋白質を含み、該粒子が、前記（ａ）工程前の蛋白質によって示される最初の薬学的活性の少なくとも９０％を有し、かつ、該粒子が、０．１と１０％の間の水分含有量、及び０．１と１．５ｇ／ｃｍ3の間の嵩密度を有する請求項１記載の方法。
- 粒子が、賦形剤、安定剤、充てん剤及び界面活性剤からなる群より選ばれる一種以上の構成材を、乾燥粒子の重量で測定して０．００１％から７５％の間の濃度でさらに含有する請求項３５記載の方法。
- ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の未乾燥水性溶液よりも再水和で改良された活性を有するＬＤＨの直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の製造方法であって、
（ａ）１ｍｇ／ｍｌ未満のＬＤＨ、５重量％超過の糖類、０．５重量％未満の界面活性剤、水、緩衝液、及び超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体を含有する組成物を形成し（ただし、パーセントは、乾燥前の水性溶液中でのものである）、
（ｂ）該組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を７０℃に加熱した乾燥させるためのガスの流れの中に通過させる
ことを特徴とするＬＤＨの微細乾燥粒子の製造方法。 - 物質の未乾燥水性溶液よりも再水和で改良された活性を有する１種以上の生物活性物質の直径０．１〜１０μｍの微細乾燥粒子の製造方法であって、
（ａ）一種若しくは複数種の物質、物質の未乾燥水性溶液よりも再水和で改良された活性を有する乾燥粒子をもたらすのに有効な量の糖類、水、及び超臨界流体若しくは臨界温度及び臨界圧力の１０％以内にある流体を含有する組成物を形成し、
（ｂ）該組成物への圧力を急速に減少させて、小滴を形成し、
（ｃ）小滴を乾燥させるためのガスの流れの中に通過させ、かつ、該乾燥させるためのガスが、３５℃から１００℃の間の温度に加熱されている
ことを特徴とする微細乾燥粒子の製造方法。
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