PT695547E

PT695547E - Imunomodulador inibidor da adesao celular e agente para tratamento e prevencao de doencas auto-imunes

Info

Publication number: PT695547E
Application number: PT94912070T
Authority: PT
Inventors: Chosaku Yoshida; Keiichi Tanaka; Shinji Makino; Ichiro Oshio; Tomoya Shimotori; Yukihiko Aikawa; Takihiro Inaba; Shuntaro Takano; Yoichi Taniguchi
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-04-07
Publication date: 2001-12-28
Also published as: EP0695547A1; AU698990B2; DK0695547T3; EP0695547B1; KR960701633A; JP3521145B2; NZ263620A; DE69427907D1; EP0695547A4; US5922755A; ATE203904T1; US6166068A; CA2159192A1; AU6437194A; CA2159192C; DE69427907T2; WO1994023714A1; GR3036738T3; ES2160626T3

Description

86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ

DESCRICÂO “Imunomodulador, inibidor da adesão celular e agente para tratamento e prevenção de doenças auto-imunes” O invento refere-se a um agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes.

Campo técnico O presente invento refere-se a um agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes contendo, como ingrediente activo, um derivado 4H-l-benzopiran-4-ona representado pela fórmula geral [1] ou um seu sal:

na qual R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou arilo não substituído ou substituído por halogéneo; R2 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou acilo; R3 é um átomo de hidrogénio ou halogéneo ou um grupo ciano, azido, carboxilo, hidroxilo, formilo ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, alcoxi, fenoxi, cicloalquilo, carbamoílo, amino ou fenilo substituído ou não substituído; R4 é um átomo de hidrogénio ou halogéneo, um grupo nitro, ciano, carboxilo, acilo, hidroxilo ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, alcoxi, alquiltio, feniltio, alcinilo, alcenilo, sulfamoílo, alcanossulfinilo, alcanossulfonilo, amidino, fenilo ou heterocíclico substituído ou não substituído ou um grupo da fórmula

Rft /

-N \ R7 ou R6 /

-CON \ R7 2 86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ na qual R6 é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, ciano ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, cicloalquilo, fenilo, amino, acilo, carbamoílo, alcanossulfonilo, iminometilo ou amidino substituído ou não substituído e R7 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcoxi, fenilo, cicloalquilo ou heterocíclico substituído ou não substituído, ou R6 e R7, quando tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um grupo heterocíclico de 3 a 7 membros, substituído ou não substituído; R5 é um grupo fenilo, tienilo, furilo ou piridilo substituído ou não substituído; Z é um átomo de oxigénio ou enxofre ou um grupo imino; e a linha a tracejado significa uma ligação siipples ou dupla.

Arte anterior O termo “doença auto-imune” como aqui utilizado inclui todas as doenças causadas por uma resposta imune tal como um auto-anticorpo ou imunidade mediada por células para um autoantigénio e semelhante. Exemplos das doenças acima descritas incluem, por exemplo, artrite reumatóide crónica, lúpus eritematoso sistémico, escleroderma, doença do tecido conjuntivo misto, poliartrite nodosa, polimiosite/dermatomiosite, síndroma de Sjõgren, doença de Behcet, esclerose múltipla, diabetes auto-imune, doença de Hashimoto, psoríase, mixedema primário, anemia perniciosa, miastenia grave, colite ulcerosa, hepatite crónica activa, anemia hemolítica auto-imune, púrpura trombocitopénica idiopática e semelhantes.

Em geral, para doenças auto-imunes, considera-se que a expressão dos mecanismos dos sintomas se baseia em factores hereditários ou factores ambientais. Isto é, o início da doença auto-imune é, por exemplo, uma infecção virai seguida por uma desordem imunitária que conduz a doenças auto-imunes. Até agora, tem sido principalmente empregue, o tratamento sintomático que utiliza fármacos anti-inflamatórios não esteróides como método de tratamento médico para as doenças acima indicadas, de forma a controlar os sintomas inflamatórios. No entanto, é presentemente impossível curar intrinsecamente, do ponto de vista dos efeitos secundários, a doença por tratamento sintomático que utiliza fármacos anti-inflamatórios não esteróides mesmo que o efeito do fármaco tenha sido favoravelmente avaliado. Sob tais circunstâncias, é desejável um método dc tratamento para melhorar intrinsecamente um sistema imune aberrante e intensificar a imunidade baseada na acção imunomoduladora e/ou acção inibidora da adesão celular.

Como medicamento que possui uma acção imunomoduladora, foi descrita, por exemplo, a D-penicilamina e Sulfasalazina nos Relatórios anuais de química médica (Annu. 86 298 ΕΡ Ο 695 547 /ΡΤ

Rep. Med. Chem.), Vol. 21, pp. 201-210 (1986). Espera-se também que um medicamento que inibe o aspecto das moléculas de adesão celular na superfície celular seja útil como agente para o tratamento de doenças auto-imunes. Ver, por exemplo, Arthritis and Rheumatism, Vol. 36, N° 2, pp. 147-157 (1993); e Clinicai Immunology, Vol. 26, N° 2, pp. 190-197(1994).

Conhece-se um derivado da 4H-l-beri7opiran-4-ona ou um seu sal, que é representado pela fórmula geral [1], e tem acção analgésica anti-inflamatória, antipirética, antiartrítica e antialérgica [Pedido de Patente Japonesa Kokai N° 2, (1990), 49778] e tem um efeito supressor na produção de interleucinas 1 e 6, que é útil para a prevenção e tratamento de doenças causadas pela produção anormal de interleucinas 1 e 6, Journal of Pharmacobio Dynamics (J. Pharmacobio-Dyn.), Vol. 15, pp. 649-655 (1992). No entanto, não se sabe se um derivado da 4H-l-benzopiran-4-ona ou um seu sal é capaz de aumentar a imunidade anormal ou intensificar aberrantemente a adesão de células com base numa acção imunomoduladora e/ou inibidora da adesão celular.

Em DE 3834204 AI descrevem-se derivados 4H-l-benzopiran-4-ona e seus sais.

Int. J. Immunother., Vol. 9, N° 2, pp. 69-78, 1993; Arzneim. Forsch., Vol. 42, N° 7, pp. 935-944, 1992; e Arzneim. Forsch., Vol. 42, N° 7, pp. 945-950, 1992 descrevem a 3-formilamino-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-1 -benzopiran-4-ona.

Até agora, a D-penicilamina, lobenzarit e semelhantes têm sido utilizados como agentes imunomoduladores ou agentes para doenças auto-imunes. No entanto há poucos agentes destes, e os efeitos contra a imunodeficiência não são suficientes. Quando estes fármacos forem utilizados em tratamentos a longo prazo, o efeito destas drogas pode ser diminuído. Estas drogas não satisfazem nunca como agentes imunomoduladores ou agentes para doenças auto-imunes. Os inibidores da adesão celular foram pesquisados para utilização como drogas clínicas [Drug News & Perspectives, Vol. 5, N° 6, pp. 331-337 (1992)]. Por conseguinte, espera-se que o desenvolvimento de um agente que tenha um efeito superior contra a imunodeficiência e um efeito supressor contra a intensificação aberrante das moléculas de adesão celular, luncione como uma droga para tratamento e prevenção de doenças auto-imunes. E um objectivo do presente invento proporcionar agentes específicos para tratamento e prevenção de doenças auto-imunes e a utilização de um derivado 4H-l-benzopiran-4-ona 4 86 298 ΕΡ Ο 695 547/ΡΤ ou de um seu sal como ingrediente activo para o fabrico de um medicamento para tratamento e prevenção de doenças auto-imunes.

Descrição do invento

Sob tais circunstâncias, os presentes inventores realizaram uma extensa pesquisa e verificaram que o derivado 4H-l-benzopiran-4-ona representado pela fórmula geral [1] ou um seu sal satisfaz o objectivo desejado acima descrito, pelo que completaram o presente invento. · >

Os compostos relacionados com o agente farmacêutico são explicados em detalhe a seguir.

Na presente descrição, a não ser que de outro modo especificado, os termos têm as definições seguintes: # O termo “grupo alquilo” significa, de preferência, um grupo alquilo(C,.8) tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo ou semelhante; o termo “grupo cicloalquilo” significa, de preferência, um grupo cicloalquilo(C3_8) tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo ou semelhantes; o termo “grupo alcenilo” significa, de preferência, um grupo alcenilo(C2_8) tal como vinilo, alilo, 1-propenilo, 1-butenilo ou semelhantes; o termo “grupo alcoxi” significa, de preferência, um grupo O-alquilo (o grupo alquilo tem o significado acima definido); o termo “grupo acilo” significa, de preferência, um grupo formilo, um grupo alcanoílo(C2.8) tal como acetilo, propionilo, butililo ou semelhantes; grupo alcoxioxalilo tal como metoxalilo, etoxalilo ou semelhantes; um grupo cicloalcano(C3.8)carbonilo tal como ciclo-hexanocarbonilo ou um grupo aroílo tal como benzoílo ou semelhantes; o termo “grupo alcoxicarbonilo” significa um grupo -COO-alquilo (o grupo alquilo tem o significado acima definido); o termo “grupo alcoxicarbonilamino” significa um grupo -NHCOO-alquilo (o grupo alquilo tem o significado acima definido); o termo “átomo de halogéneo” significa um átomo de flúor, um átomo de cloro, um átomo de bromo, um átomo de iodo ou semelhantes; 0 termo “grupo alquiltio” significa um grupo —S-alquilo (o grupo alquilo tem o significado acima definido); o termo “grupo alcanossulfinilo” significa, de preferência, um grupo alcano(C1.g)sulfinilo tal como metanossulfinilo, etanossulfinilo ou semelhantes; o termo “grupo alcanossulfonilo” significa, de preferência, um grupo alcano(C,.8)sulfonilo tal como metanossulfonilo, etanossulfonilo ou semelhantes; o termo “grupo arilo” significa, de preferência, um fenilo, naftilo ou semelhantes; o termo “grupo acilamino” significa um i

86 298 ΕΡ Ο 695 547 /ΡΤ grupo -NH-acilo (ο grupo acilo tem o significado acima definido); o termo “grupo alquilamino” significa um grupo NH-alquilo (o grupo alquilo tem o significado acima definido); o termo “grupo dialquilamino” significa um grupo -N(alquilo)2 (o grupo alquilo tem o significado acima definido); o termo “grupo haloalquilo” significa, de preferência, um grupo haloalquilo(C18) tal como clorometilo, fluorometilo, diclorometilo, trifluorometilo, dicloroetilo, tricloroetilo ou semelhantes; o termo “grupo alcinilo” significa, de preferência, um grupo alcinilo(C28) tal como etinilo, 2-propinilo ou semelhantes; o termo “grupo heterocíclico” significa, de preferência, um grupo cíclico de 4 a 6 membros contendo, pelo menos, um heteroátomo seleccionado a partir do grupo constituído por um átomo de oxigénio, átomo de azoto e átomo de enxofre como heteroátomo formador do anel ou um seu grupo cíclico condensado, tal como tienilo, fiirilo, pirrolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1.2.4- tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, tetrazolilo, piridilo, quinolilo, isoquinolilo, pirimidinilo, piperadinilo, pirazinilo, piridazinilo, 1.2.3.4- tetra-hidroquinolilo, 1,2,4-triazinilo, imidazo[l,2-b][l,2,4]triazinilo, pirrolidinilo, morfolinilo, quinoquidinilo ou semelhante. Além disso, na presente descrição, o termo “grupo alquilo inferior” significa um grupo alquilo inferior tendo 1 a 5 átomos de carbono. Na fórmula geral [1], quando R6 e R7 formam um grupo heterocíclico de 3 a 7 membros com o átomo de azoto ao qual estão ligados, o grupo heterocíclico inclui um grupo heterocíclico contendo azoto constituído por um anel de 3 a 7 membros contendo o átomo de azoto, tal como azetidin-l-ilo, pirrolidin-l-ilo, piperidin-l-ilo, pirrol-l-ilo e semelhantes.

Adicionalmente, o substituinte dos grupos alquilo, alcoxi, fenoxi, cicloalquilo, carbamoílo, amino e fenilo em R3; os grupos alquilo, alcoxi, alquiltio, feniltio, alcinilo, alcenilo, sulfamoílo, alcanossulfinilo, alcanossulfonilo, amidino, fenilo e heterocíclico em R4; os grupos alquilo, cicloalquilo, fenilo, amino, acilo, carbamoílo, alcanossulfonilo, iminometilo e amidino em R6; os grupos alquilo, alcoxi, fenilo, cicloalquilo e heterocíclico em R7; os grupos heterocíclicos de 3 a 7 membros que R6 e R7 formam com o átomo de azoto ao qual estão ligados e os grupos fenilo, tienilo, furilo e piridilo em R5 podem ser cada um substituído por, pelo menos, um substituinte seleccionado a partir do grupo constituído por átomos de halogéneo, grupos alcoxi, grupos alquiltio, grupo fenoxi, grupo carboxilo, grupos acilo, grupos alcoxicarbonilo, grupo carbamoílo, grupo sulfamoílu, grupo ciano, grupos alcanossulfonilo, grupo hidroxilo, grupo mercapto, grupos aciloamino, grupos alquilamino, grupos dialquilamino, grupos alquilo, grupos cicloalquilo, grupo oxo, grupo nitro, grupos haloalquilo, grupo amino, grupo fenilo, grupos alcoxicarbonilamino, grupo hidroxi-imino e grupos heterocíclicos.

86 298 ΕΡ Ο 695 547 /ΡΤ 6 Ο sal de um derivado 4H-l-benzopiran-4-ona da fórmula geral [1] inclui sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais com metais alcalinos tais como sódio, potássio e semelhantes; sais com metais alcalino-terrosos tais como cálcio, magnésio e semelhantes; sais de amónio; sais com aminas orgânicas tais como trietilamina, piridina e semelhantes; sais com aminoácidos tais como lisina, arginina, omitina e semelhantes; sais com ácidos minerais tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfurico e semelhantes; sais com ácidos carboxílicos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido maleico, ácido málico, ácido cítrico e semelhantes, e sais com ácidos sulfónicos tais como ácido metanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido naftalenodissulfónico e semelhantes. O derivado 4H-l-benzopiran-4-ona da fórmula geral [1] ou um seu sal inclui isómeros (incluindo isómeros geométricos e isómeros ópticos), hidratos, solvatos e formas cristalinas. O derivado 4H-l-benzopiran-4-ona da fórmula geral [1] ou um seu sal pode ser produzido, por exemplo, pelos processos descritos no Pedido de Patente Japonesa Kokai N° 2(1990)-249778.

Os compostos do presente invento podem ser administrados oral ou parentericamente de um modo convencional na forma de cápsulas, pós, grânulos, pílulas, comprimidos, suspensões, emulsões, soluções, unguentos, ampolas, xaropes ou supositórios. Adicionalmente, o método de administração, dose e número de administrações pode variar, adequadamente, dependendo da idade e sintoma do doente. Normalmente, o composto pode ser administrado em várias tomas ao dia numa dose de cerca de 5,0 a 1000 mg por adulto.

Entre os compostos de derivado de 4H-l-benzopiran-4-ona a serem utilizados como ingrediente activo para um medicamento, tal como um agente imunomodulador, um agente inibidor da adesão celular e um agente para tratamento e prevenção de doenças auto-imunes, preferem-se os compostos da fórmula geral [1] em que R' é um gmpo alquilo substituído por halogéneo ou não substituído; R2 é um átomo de hidrogénio; R3 é um átomo de hidrogénio ou um gmpo alquilo substituído ou não substituído; R4 é um álomu de hidrogénio, um grupo carboxilo, um gmpo alquiltio substituído ou não substituído, um gmpo acilamino substituído ou não substituído ou um gmpo carbamoílo; R5 é um gmpo fenilo substituído ou não substituído; Z é um átomo de oxigénio ou um gmpo imino; e a linha a tracejado significa uma ligação dupla. Mais preferidos são os compostos em que R1 é um gmpo alquilo; R2 é um átomo de hidrogénio; R3 é um átomo de hidrogénio; R4 é um gmpo acilamino substituído ou

I 86 298 ΕΡ Ο 695 547/ΡΤ 7 não substituído; R5 é um grupo fenilo substituído ou não substituído; Z é um átomo de oxigénio; e a linha a tracejado significa uma ligação dupla.

Entre os compostos do presente invento de um derivado 4H-l-benzopiran-4-ona a serem utilizados para o fabrico de um medicamento ou como ingrediente activo para um medicamento tal como um agente para tratamento e prevenção de doenças auto-imunes, os seus compostos representativos são os seguintes: 3-formilamino-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 6-(2,4-difluorofenoxi)-7-metilsulfonilamino-4H-l-benzopiran-4-ona. 3-carbamoíl-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 3-carbamoíl-2-metil-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 3-(N-formil-N-metil)amino-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 3-carboxi-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 3-metiltio-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 6-(2,4-difluorofenilamino)-3-formilamino-7-metilsulfonilamino-4H-l-benzopiran-4-ona 3-carbamoíl-6-(2,4-difluorofenilamino)-7-metilsulfonilamino-4H-l-benzopiran-4-ona. 2-metil-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 6-(2-fluorofenilamino)-3-formilamino-7-metilsulfonilamino-4H-l-benzopiran-4-ona.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

Em seguida, explicam-se por experiências as actividades farmacológicas dos compostos do presente invento a serem utilizados como agente ou como ingrediente activo para o fabrico de um medicamento para tratamento e prevenção de doenças auto-imunes. Os números de composto de teste utilizados nas experiências seguintes referem-se aos números de composto representativo acima indicados.

Experiência 1 - Efeito dos compostos de teste na hipersensibilidade de tino retardada A hipersensibilidade de tipo retardada potencializada em ratinhos por pré-tratamento com ciclofosfamida foi realizada de acordo com o método de P.H. Lagrange et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 139, pp. 1529-1539 (1974). Em resumo, os ratinhos macho Balb/c (8 semanas de idade, 6 a 8 ratinhos por grupo) foram pré-tratados com injecção intraperitoneal de 75 mg/kg de ciclofosfamida. Quatro dias após a injecção, foram intravenosamente sensibilizados com 0,2 ml de suspensão de EO (eritrócitos de ovelhas) (5x107 células/ml). Três dias após a sensibilização, as respostas de hipersensibilidade de tipo retardada foram induzidas com injecção intradérmica de 0,05 ml de suspensão EO (8xl09

86 29 8

EP 0 695 547 / PT 8 células/ml) na pata traseira esquerda. Após 24 horas, os ratinhos foram mortos e as duas patas traseiras removidas pelo tornozelo para determinar o peso da pata. O edema induzido por EO foi medido como a diferença entre os pesos das patas esquerda e direita. A percentagem inibidora do edema da pata produzida pelo tratamento com composto foi expressa relativamente ao edema do ratinho de controlo. Os compostos de teste foram suspensos em solução de carboximetilcelulose (CMC) a 0,5% e administrados p.o. uma vez por dia durante 5 dias desde 2 dias antes da sensibilização. Administrou-se aos ratinhos de controlo solução de CMC a 0,5% em vez dos compostos de teste.

Os resultados são apresentados na Tabela 1. TABELA 1 COMPOSTO DE TESTE DOSAGEM (mg/kg) INIBIÇÕES DO EDEMA DA PATA DE TIPO RETARDADO (%) composto N° 1 10 12 30 27 100 39 composto N° 2 100 17 composto N° 3 30 48 composto N° 4 100 41 composto N° 5 100 16 composto N° 6 100 17 composto N° 7 100 16 composto N° 8 100 21 composto N° 9 100 28 composto N° 10 100 20 D-PENICILAMINA 100 -3 SULFASALAZINA 100 5 PREDNISOLONA 10 44

Como mostrado na Tabela 1, os compostos de teste causam a supressão de uma resposta hipersensível de tipo retardada em ratinhos imuno-potenciados. A actividade supressora dos compostos de teste é igual à da prednisolona e superior à da D-penicilamina ou sulfasalazina.

Experiência 2 - Efeito dos compostos de teste na resposta das células formadoras de placa ÍCFP) hemolíticas

Os ratinhos macho BDF, (6 a 7 ratinhos por grupo) foram intravenosamente injectados com 2xl06 ou 2xl08 EO (eritrócitos de ovelha). Quatro dias após a injecção, os 9 86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ ratinhos foram mortos e os seus baços removidos. O número de células formadoras de placa (CFP) hemolíticas por baço foi determinado de acordo com o método de Cunningham et al, Immunology, Vol. 14, p. 559 (1968) com base no método de N.K. Jeme et al., Science, Vol. 140, p. 405 (1963). A percentagem de alteração no número de CFP produzidas pelos compostos de teste foi expressa relativamente ao número de CFP do grupo de controlo. Os compostos de teste foram suspensos em solução de CMC a 0,5%. Os compostos foram oralmente administrados durante. 3 dias desde o dia anterior à ínjecção. Administrou-se aos ratinhos de controlo solução de CMC a 0,5% em vez dos compostos de teste.

Os resultados são apresentados na Tabela 2. TABELA 2 TRATAMENTO DOSAGEM (mg/kg) N° de CFP/BAÇO a) xl03 PERCENTAGEM DO GRUPO DE CONTROLO Sensibilização de 2xl()8 células Grupo de controlo - 240+8 100 Composto N° 1 1 231±18 963 10 221+17 92 100 129+20 54 PREDNISOLONA 10 17+3 7 Sensibilização de 2x1 θ6 células Grupo de controlo . 4,87±0,53 100 Composto N° 1 1 7,06+1,17 145 10 7,13±0,52 146 PREDNISOLONA 100 10 5,40±0,49 3,97+0,78 111 81 a) Cada valor é a média ± D.P.

Como mostrado na Tabela 2, os compostos de teste apresentaram a diminuição óbvia nos números de CFP sob a dose óptima de EO e o aumento sob a dose sub-óptima. Estas descobertas indicam que os compostos de teste exibem ou supressão sob uma resposta imune aumentada anormal ou potenciação sob uma resposta imune baixa e que os compostos de teste têm actividade imunomoduladora.

86 298 ΕΡ Ο 695 547/ΡΤ

Experiência 3 - Efeito dos compostos de teste na encefalomielite alérgica experimental A encefalomielite alérgica experimental (EAE) é um protótipo para doenças auto-imunes mediadas por células e tem sido amplamente utilizada como um modelo animal de esclerose múltipla. De acordo com o método descrito por Deguchi et al, Brain and Nerve, Vol. 42, pp.. 391-397 (1990), a EAE foi induzida utilizando-se ratos fêmea Lewis (5 ratos por grupo). Em resumo, os ratos foram s.c. imunizados nas duas patas traseiras com 0,1 ml de emulsão composta por um homogeneizado de espinal-medula de cobria, a 50% e um volume igual de adjuvante de Freund completo. Os ratos foram observados diariamente desde o dia da imunização até ao dia 18 quanto aos sintomas clínicos de EAE e tendo-se utilizado o sistema de classificação seguinte: 0: sem sintomas 1: cauda flácida 2: paralisia incompleta do membro traseiro 3: paralisia completa do membro traseiro 4: quadriplegia ou morte O composto de teste suspenso em solução de CMC a 0,5% foi oralmente administrado uma vez ao dia desde o dia (dia 0) de imunização até ao dia 13 e os animais foram observados diariamente até ao dia 18 quanto aos sintomas clínicos de EAE.

Administrou-se aos ratos de controlo solução de CMC a 0,5% em vez do composto de teste. Obteve-se o índice cumulativo dos sintomas durante 18 dias e a percentagem inibidora do índice cumulativo produzida pelo grupo de composto de teste foi expressa relativamente ao índice cumulativo do grupo de controlo.

Os resultados são apresentados na Tabela 3. 11 86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ TABELA 3 COMPOSTO DE TESTE DOSAGEM (mg/kg) INIBIÇÃO (%) DO ÍNDICE CLÍNICO Composto N° 1 1 21 100 67 Composto N° 3 30 86 Composto N° 4 30 50 Composto N° 6 30 66 Composto N° 7 30 50 Composto N° 8 30 17 Composto N° 9 30 50 Composto N° 10 30 42 Composto N° 11 30 52 Composto N° 12 30 67 D-PENICILAMINA 100 -10 SULFASALAZINA 300 1 PREDNISOLONA 10 52

Como mostrado na Tabela 3, os compostos de teste causam a inibição do aspecto e da gravidade da EAE. Os compostos de teste são iguais à prednisolona e superiores à D-penicilamina ou sulfasalazina.

Experiência 4 - Efeito dos compostos na expressão de molécula de adesão celular fantigénio muito tardio-4 : VLA-4) em ratos EAE O VLA-4 é uma das moléculas de adesão celular que pode estar envolvida na migração dos linfócitos. Examinou-se o efeito dos compostos na expressão de VLA-4 em linfócitos de ratos EAE. De acordo com o método descrito na Experiência 3, os ratos (7 ratos por grupo) foram imunizados s.c. nas duas patas traseiras com 0,1 ml de emulsão composta por um homogeneizado de espinal medula de cobaia a 50% e um volume igual de adjuvante de Freund completo. Dez dias após a imunização, o sangue foi retirado pela veia cava inferior em heparina a partir dos ratos anestesiados com éter. A fracção de leucócitos foi isolada a partir de 5 ml do sangue por centrifugação com gradiente de densidade. Suspenderam-se 5x105 dos leucócitos em 0,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina do soro de bovino a 0,1% e depois fízeram-se reagir com 5 μΐ de anticorpo VLA-4 anti-rato de ratinho. Após incubação a 4°C durante 1 hora, as células foram feitas reagir com imunoglobulina anti-ratinho de ovelha conjugada com isotiocianato fluorescente durante mais 30 min. As células foram lavadas com PBS e analisadas em citometria de fluxo. A população de linfócitos foi isolada para contrair com base numa 12 86 298 ΕΡ Ο 695 547/ΡΤ dispersão anterior de luz a 90°. Os resultados foram expressos como percentagem do número de células positivas a VLA-4 para o número de linfócitos.

Os resultados são apresentados na Tabela 4. TABELA 4 TRATAMENTO DOSAGEM PERCENTAGEM DE CÉT.UT.AS (mg/kg) POSITIVAS A VLA-4 (MÉDIA) Grupo de controlo - 29,9 composto N° 1 100 12,0

Como mostrado na Tabela 4, o tratamento com o composto de teste produziu uma diminuição na percentagem de células positivas a VLA-4 quando comparado com o grupo de controlo.

Experiência 5 - Efeito dos compostos de teste na expressão aumentada da molécula de adesão celular CD 11b em HL-60 (linha de células de leucemia promielocítica humanai estimulada por acetato miristato de forbol (PMA) A CD 11b é a cadeia a da molécula de adesão celular Mac-1, que é expressa na activação de monócitos. Analisou-se o efeito dos compostos de teste na expressão de CDllb em monócitos, células HL-60. Em resumo, 5x105 células HL-60 foram suspensas em 2 ml de RPMI-1640 contendo soro de feto de bovino (SFB) a 10% em cada cavidade de uma multiplaca de 12 cavidades, e em seguida, adicionou-se ao meio PMA (concentração final de 3 mg/ml) e o composto de teste. Após incubação a 37°C durante 24 horas numa atmosfera contendo C02 a 5%, as células foram recolhidas e mantidas com PBS. 3x103 células HL-60 foram ressuspensas em 300 μΐ de PBS (contendo SFB a 1%) e incubadas com 5 μΐ de anticorpo CDllb anti-humano de ratinho conjugado com ficoeritrina. Após 1 hora de incubação a 4°C as células foram lavadas com PBS. As células foram analisadas em citometria de fluxo e os resultados foram expressos como a percentagem aumentada de células positivas a CD1 lb no grupo tratado relativamente ao grupo não tratado com PMA.

Os resultados são apresentados na Tabela 5

86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ 13 TABELA 5 COMPOSTO CONCENTRAÇÃO NÚMERO DE TAXA (%) DE EXPRESSÃO DE TESTE (με/mi) MEDIÇÃO AUMENTADA DE CD1 lb MÉDIA ±D.P. controlo - 6 82,2+4,9 composto N° 1 10 6 49,9+1,8

Como mostrado na Tabela 5, o composto de teste suprime a expressão aumentada de células positivas a CD1 lb por estimulação com PMA. Quando tomados em conjunto com o nosso estudo, os compostos de teste inibem a expressão e a expressão aumentada das moléculas de adesão. Estas descobertas mostram que os compostos têm a capacidade de inibir as moléculas de adesão celular.

Melhor modo de realizar o presente invento

Os exemplos seguintes servem para ilustrar e explicar a preparação farmacêutica do presente invento, mas a preparação ou as experiências do presente invento não devem estar limitadas a estas. Adicionalmente ao acima exposto, os números dos compostos utilizados nos exemplos a seguir apresentados estão de acordo com cada um dos números de composto de teste acima descritos.

Exemplo 1

De uma forma convencional, preparam-se as cápsulas de gelatina dura desejadas contendo os ingredientes seguintes.

Composto 1 (composto de teste número 1) 50 mg Lactose 114,5 mg Amido de milho 20 mg Hidroxipropilcelulose 2 mg Ácido silícico anidro leve 1,5 mg Carboximetilcelulose cálcica 10 mg Estearato de magnésio 2 mg

Total 200 mg 14 86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ

Exemplo 2

Por um método convencional, preparam-se os comprimidos desejados contendo os ingredientes seguintes.

Composto 1 (composto de teste número 1) 25 mg Lactose 49 mg Celulose microcristalina 36 mg Hidroxipropilcelulose 1 mg Carboximetilcelulose cálcica 6,6 mg Estearato de magnésio 1,2 mg Talco 1,2 mg

Total 120 mg

Exemplo 3

Composto 1 (composto dc teste número 1) 50 mg Lactose 74 mg Celulose microcristalina 55 mg Hidroxipropilcelulose 2 mg Carboximetilcelulose cálcica 15 mg Estearato de magnésio 2 mg Talco 2 mg

Total 200 mg

Exemplo 4

Composto 1 (composto de teste número 1) 100 mg Lactose 49 mg Celulose microcristalina 55 mg Hidroxipropilcelulose 2 mg Carboximetilcelulose cálcica 15 mg Estearato de magnésio 2 mg Talco 2 mg Total 225 mg 15 86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ

Exemplo 5

Composto 2 (composto de teste número 2) 200 mg Celulose microcristalina 100 mg Amidoglicolato de sódio 30 mg Estearato de magnésio 3 mg Total 333 mg

Aplicabilidade industrial O derivado 4H-l-benzopiran-4-ona da fórmula geral [1] ou um seu sal, exibe excelente efeito na imunomodulação e na inibição da adesão celular esperando-se ter adicionalmente o efeito de aliviar doenças auto-imunes a um nível comparável ao dos esteróides. Assim, o composto da fórmula geral [1] é útil no tratamento e prevenção de doenças auto-imunes fundamentalmente causadas por imunopatia ou não normalmente aceleradas por adesão celular, por exemplo, na artrite reumatóide crónica, lúpus eritematoso sistémico, escleroderma, doença do tecido conjuntivo misto, poliartrite nodosa, polimiosite/dermatomiosite, síndroma de Sjõgren, doença de Behcet, esclerose múltipla, diabetes auto-imune, doença de Hashimoto, psoríase, mixedema primário, anemia perniciosa, adinamia grave, colite ulcerosa, hepatite crónica activa, anemia hemolítica auto-imune e púrpura trombocitopénica idiopática.

Lisboa,

Por TOYAMA CHEMICAL CO., LTD. -O AGENTE OFICIAL-

f^ÀNTÓN IO JOÂol βΛ ΟΙΝΗΔ FFRRE1RA ' pA CUNHA íFER^IIRA Ag. (Oif. ,ΡγΓ, ilnçl. jR^ia das jFloree. 74.-4/ 1200-195 LISBOA

Claims

86 298 ΕΡ Ο 695 547/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um derivado 4H-l-benzopiran-4-ona representado pela fórmula geral seguinte ou de um seu sal:

na qual R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou arilo não substituído ou substituído por halogéneo; R2 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou acilo; R3 é um átomo de hidrogénio ou halogéneo ou um grupo ciano, azido, carboxilo, hidroxilo, formilo ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, alcoxi, fenoxi, cicloalquilo, carbamoílo, amino ou fenilo substituído ou não substituído; R4 é um átomo de hidrogénio ou halogéneo, um grupo nitro, ciano, carboxilo, acilo, hidroxilo ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, alcoxi, alquiltio, feniltio, alcinilo, alcenilo, sulfamoílo, alcanossulfinilo, alcanossulfonilo, amidino, fenilo ou heterocíclico substituído ou não substituído ou um grupo da fórmula R6 I -N \ R7 ou R6 / -CON \ R7 na qual R6 é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, ciano ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, cicloalquilo, fenilo, amino, acilo, carbamoílo, alcanossulfonilo, iminometilo ou amidino substituído ou não substituído, e R7 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcoxi, fenilo, cicloalquilo ou heterocíclico substituído ou não substituído, ou R6 e R7, quando tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um grupo heterocíclico de 3 a 7 membros, substituído ou não substituído; R5 é um grupo fenilo, tienilo, furilo ou piridilo substituído ou não substituído; Z é um átomo de oxigénio ou enxofre ou um grupo imino; e a linha a tracejado significa uma ligação simples ou dupla,

86 298 ΕΡ Ο 695 547/ΡΤ 2/4 como ingrediente activo para o fabrico de um medicamento para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes.
2. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que R1 é um grupo alquilo inferior, alcenilo inferior ou arilo não substituído ou substituído por halogéneo; R2 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou acilo; R1 é um átomo de hidrogénio ou halogéneo ou um grupo ciano, azido, carboxilo, hidroxilo, formilo ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, alcoxi, fenoxi, cicloalquilo, carbamoílo, amino ou fenilo substituído ou não substituído; R2 é um átomo de hidrogénio ou halogéneo, um grupo nitro, ciano, carboxilo, acilo, hidroxilo ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, alcoxi, alquiltio, feniltio, alcinilo inferior, alcenilo inferior, sulfamoílo, alcanossulfinilo inferior, alcanossulfonilo inferior, amidino, fenilo ou heterocíclico substituído ou não substituído ou um grupo da fórmula R3 / -N \ R4 ou R3 / -CON \ R4 na qual R3 é um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxilo, ciano ou alcoxicarbonilo ou um grupo alquilo, cicloalquilo, fenilo, amino, acilo, carbamoílo, alcanossulfonilo, iminometilo ou amidino substituído ou não substituído e R4 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, alcoxi, fenilo, cicloalquilo ou heterocíclico substituído ou não substituído, ou R3 e R4, quando tomados em conjunto com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um grupo heterocíclico de 3 a 7 membros, substituído ou não substituído; R5 é um grupo fenilo, tienilo, furilo ou piridilo substituído ou não substituído; Z é um átomo de oxigénio ou enxofre ou um grupo imino; e a linha a tracejado significa uma ligação simples ou dupla. 1 Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que R1 é um grupo alquilo não 2 substituído ou substituído por halogéneo; R2 é um átomo de hidrogénio; R1 é um átomo de 3 hidrogénio, um grupo carboxilo ou um grupo alquiltio ou acilamino substituído ou não 4 substituído ou um grupo carbamoílo; R5 é um grupo fenilo substituído ou não substituído; Z 5 hidrogénio ou um grupo alquilo substituído ou não substituído; R2 é um átomo de 86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ 3/4 é um átomo de oxigénio ou um grupo imino e a linha a tracejado significa uma ligação dupla.
4. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que R1 é um grupo alquilo inferior não substituído ou substituído por halogéneo; R2 é um átomo de hidrogénio; R3 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo substituído ou não substituído; R4 é um átomo de hidrogénio, um grupo carboxilo ou um grupo alquiltio ou acilamino substituído ou não substituído ou um grupo carbamoílo; R5 é um grupo fenilo substituído ou não substituído; Z é um átomo· de oxigénio ou um grupo imino; e a linha a tracejado significa, uma .ligação dupla.
5. Utilização de acordo com a Reivindicação 3 ou 4, em que R3 é um átomo de hidrogénio; R4 é um grupo acilamino substituído ou não substituído; Z é um átomo de oxigénio.
6. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o ingrediente é 3-formilamino-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-1 -benzopiran-4-ona.
7. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o ingrediente é 7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-1 -benzopiran-4-ona.
8. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende, como ingrediente activo, 6-(2,4-difluorofenoxi)-7-metilsulfonilamino-4H-l-benzopiran-4-ona.
9. Utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que o ingrediente é 3-carbamoíl-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona.
10. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende como ingrediente activo 3-carbamoíl-2-metil-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona.
11. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende como ingrediente activo 3-(N-formil-N-metil)amino-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona. 86 298 ΕΡ Ο 695 547 / ΡΤ 4/4
12. Agente para ο tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende, como ingrediente activo, 3-carboxi-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona.
13. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende, como ingrediente activo, 3-metiltio-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona.
14. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende, como ingrediente activo, 6-(2,4-difIuorofemIamino)-3-formilamino-7-metilsuIfonilamino-4H-1 -benzopiran-4-ona.
15. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende, como ingrediente activo, 3-carbamoíl-6-(2,4-difluorofenilamino)-7-metilsulfonilammo-4H-1 -benzopiran-4-ona.
16. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende, como ingrediente activo, 2-metil-7-metilsulfonilamino-6-fenoxi-4H-l-benzopiran-4-ona.
17. Agente para o tratamento e prevenção de doenças auto-imunes que compreende, como ingrediente activo, 6-(2-fiuorofenilamino)-3-formilamino-7-metilsulfonilamino-4H-l-benzopiran-4-ona.
18. Utilização de acordo com uma das Reivindicações 1 a 7 ou 9, em que as doenças auto-imunes são a artrite reumatóide crónica, lúpus eritematoso sistémico, escleroderma, doença do tecido conjuntivo misto, poliartrite nodosa, polimiosite/dermatomiosite, síndroma de Sjõgren, doença de Behcet, esclerose múltipla, diabetes auto-imune, doença de Hashimoto, psoríase, mixedema primário, anemia perniciosa, miastenia grave, colite ulcerosa, hepatite crónica activa, anemia hemolítica auto-imune e púrpura trombocitopénica idiopática. Lisboa, Por TOYAMA CHEMICAL CO„ LTD. - O AGENTE OFICIAL -

1200-195 LISBOA EngTIANTONIO JOAO DA CUNHA FERREIRA Ag. Ot. Pr. ind. Rua das Flores, 74-4.°