PT651765E

PT651765E - Analogos de pth e pthr sua sintese e utilizacao para o tratamento de osteoporose

Info

Publication number: PT651765E
Application number: PT93917060T
Authority: PT
Inventors: John J Nestor Jr; Brian H Vickery; John Leonard Krstenansky; Teresa L Ho; Chinh T Bach
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1992-07-14
Filing date: 1993-07-13
Publication date: 2001-11-30
Also published as: US5589452A; FI950169A; EP1094073A3; KR100461618B1; CA2140281C; CA2140281A1; US5840837A; KR950702578A; US5695955A; DE69330347T2; HU9500110D0; JP4106082B2; EP0651765A1; ATE202115T1; US5874086A; US5693616A; US5798225A; EP0651765B1; FI120586B; DK0651765T3

Description

% (q*5Á - 1 -

DESCRIÇÃO "ANÁLOGOS DE PTH E PTHR, SUA SÍNTESE E UTILIZAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE OSTEOPOROSE"

FUNDAMENTO DO INVENTO a) Campo do invento

Este invento está relacionado com novos análogos da hormona paratiróide e do peptídeo relacionado com a hormona paratiróide, sua síntese em fase sólida e por técnicas recombinantes, e sua utilização para aumentar a massa óssea em mamíferos. bl Descrição de trabalhos relacionados A osteoporose é a forma mais comum de doença metabólica dos ossos e pode ser considerada como a fase de ffactura, sintomática, da perda de osso (osteopenia). Se bem que a osteoporose possa ocorrer na sequência de uma série de doenças subjacentes, em 90% dos casos totais parece ser idiopática. As mulheres na pós-menopausa correm, particularmente, o risco de osteoporose idiopática (osteoporose pós-menopausa ou do Tipo I). Um outro grupo de risco elevado para a osteoporose idiopática é a velhice em ambos os sexos (osteoporose senil ou do Tipo II). A osteoporose tem sido também relacionada com a utilização de corticosteróides, imobilização ou permanência prolongada na cama, alcoolismo, diabetes, quimioterapia gonadotóxica, hiperprolactinemia, anorexia nervosa, amenorreia primária e secundária e ooforectomia. -2- «Ά

Nas várias formas de osteoporose ocorre, frequentemente, a fractura de ossos, que é o resultado da perda de osso que atingiu o ponto de falha mecânica. A osteoporose pós-menopausa é caracterizada por fracturas do pulso e coluna vertebral, enquanto as fracturas do colo do fémur parecem ser a característica dominante da osteoporose senil.

Pensa-se que o mecanismo pelo qual se perde osso nos osteoporóticos envolva um desequilíbrio no processo pelo qual o esqueleto se renova. Este processo tem sido designado remodelação óssea. Esta ocorre numa série de bolsas discretas de actividade. Estas bolsas aparecem, espontaneamente, dentro da matriz óssea numa dada superfície óssea, como um local de reabsorção de osso. Os osteoclastos (células de dissolução ou de reabsorção do osso) são responsáveis pela reabsorção de uma parte do osso, geralmente de dimensão constante. Este processo de reabsorção é seguido do aparecimento de osteoblastos (células formadoras de osso) que depois enchem com novo osso a cavidade deixada pelos osteoclastos.

Num indivíduo adulto saudável, a velocidade a que os osteoclastos e os osteoblastos são formados é tal que a formação de osso e a reabsorção de osso estão em equilíbrio. No entanto, nos osteopróticos desenvolve-se um desequilíbrio no processo de remodelação de osso que resulta na perda de osso a uma velocidade superior à de formação. Apesar deste desequilíbrio ocorrer, até certo ponto, na maior parte dos indivíduos à medida que envelhecem, é muito mais grave e ocorre mais cedo nos osteoporóticos na pós-menopausa ou após ooforectomia.

Tem havido muitas tentativas para tratar a osteoporose com o objectivo de retardar a perda de osso ou, mais desejável, produzir um aumento -3-global da massa óssea. Certos agentes, tais como estrogénios e bisfosfonatos, parecem retardar a perda de osso nos osteoporóticos. Os agentes que retardam a perda de osso, devido à diferença de duração da reabsorção e de formação de osso, podem parecer aumentar a massa óssea (na ordem de 3 a 7%). No entanto, este aumento aparente está limitado no tempo, não progressivo, e é devido a um decréscimo no “espaço de remodelação". Ainda, devido ao acoplamento estreito entre reabsorção e formação, os tratamentos que impedem a reabsorção óssea também acabam por impedir a formação de osso.

Tem sido sugerido que o tratamento com a hormona paratiróide (PTH) conduz a um aumento da reciclagem do osso e a um equilíbrio positivo do cálcio. No entanto, os ensaios clínicos no homem têm demonstrado que qualquer aumento no osso trabecular é compensado por um decréscimo do osso cortical, não havendo assim nenhum aumento global no osso total.

Hefti, et al., em Clinicai Science 62, 389-396 (1982) descreveram que doses subcutâneas diárias de bPTH (1-84) ou hPTH (1-34) aumentaram o cálcio de todo o corpo e o peso de cinzas dos ossos individuais em ratos fêmeas adultos normais e osteoporóticos.

Liu, et al., em J. Bone Miner. Res. 6:10, 1071-1080 (1991) observaram que a ovariectomia dos ratos fêmeas adultos induzem uma perda de 47% na percentagem de osso trabecular na metáfíse tibial proximal, acompanhada de um aumento significativo no número de osteoblastos e osteoclastos trabeculares. As injecções subcutâneas diárias de hPTH (1-34) reverteram completamente a perda de osso trabecular e resultaram em quantidades de osso trabecular que excedem as das testemunhas com operação simulada. O número de osteoblastos aumentou e o número de osteoclastos diminuiu. -4-

Hock et al., em J. Bone Min. Res. 7:1, 65-71 (1992) descreveram que as injecções subcutâneas diárias de hPTH (1-34) a ratos machos, adultos, saudáveis durante 12 dias aumentou o cálcio do osso trabecular e cortical e o peso seco. A massa total de osso, volume de osso trabecular, espessura e número trabeculares e superfícies osteoblásticas aumentaram.

As hormonas paratiróides de mamíferos, e.g. humana (hPTH), bovina (bPTH) e porcina (pPTH), são cadeias polipeptídicas simples de 84 resíduos de aminoácidos, com pesos moleculares de aproximadamente 9500. A actividade biológica está associada com a porção N-terminal, aparentemente sendo os resíduos (1-34) o mínimo necessário. O segmento N-terminal de PTH humana difere do segmento N-terminal das hormonas bovina e porcina, respectivamente em apenas em três e dois resíduos de aminoácidos: hPTH(l-34):

Ser Vai Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gli Lis His Leu 1 5 10 15

Asn Ser Met Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lis Lis Leu Gin Asp 20 25 30

Vai His Asn Fen (SEQIDNO:l); bPTH(l-34):

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Met His Asn Leu Gli Lis His Leu 10 15 1 5 —-*-1 -5-

Ser Ser Met Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lis Lis Leu Gin Asp 20 25 30

Vai His Asn Fen (SEQ ID NO:2); pPTH(l-34):

Ser Vai Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gli Lis His Leu 1 5 10 15

Ser Ser Leu Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lis Lis Leu Gin Asp 20 25 30

Vai His Asn Fen (SEQ ID NO:3); A principal função de PTH é induzir as alterações adaptativas que Λ . servem para manter uma concentração constante de Ca no fluído extracelular. PTH actua nos rins para aumentar a reabsorção tubular de Ca a partir da urina, assim como para estimular a conversão de calcifediol em calcitriol, que é responsável pela absorção Ca2+ nos intestinos. Um efeito proeminente é promover a mobilização de Ca do osso. PTH actua no osso para aumentar a velocidade de reabsorção de Ca2+ e fosfato. PTH estimula a velocidade de reabsorção de osso pelos osteoclastos, aumenta a velocidade de diferenciação das células do mesênquima para osteoclastos, e prolonga a semi-vida destas últimas células. Com a actuação prolongada de PTH o número de osteoblastos formadores de osso aumenta também; assim, a velocidade de reciclagem e remodelação de osso é aumentada. No entanto, os osteoblastos individuais parecem ser menos activos do que o normal. -6- C_Λ •Λ

Rosenblatt, et al., nas Patentes U.S. Nos. 4 423 037, 4 968 669 e 5 001 223 descreveram antagonistas de PTH, obtidos pela remoção dos aminoácidos N-terminais (1-6) e substituição selectiva de Fen7, Met8,18 e Gli12. Tir34-NH2 foi descrito como aumentando a actividade e estabilidade destes compostos. O peptídeo relacionado com a hormona paratiróide (PTHrp), uma proteína de 140+ aminoácidos, e seus fragmentos, reproduzem as principais acções biológicas de PTH. PTHrp é produzido por uma série de tumores humanos e de animais, e outros tecidos, e pode desempenhar um papel na hipercalcemia dos tumores. A sequência de hPTHrp (1-34) é a seguinte:

Vai Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Fen Fen Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30

Ile His Tre Ala (SEQ ID NO:4). A homologia de sequências entre hPTH e hTPHrp está essencialmente limitada aos 13 resíduos do extremo N, 8 dos quais são idênticos; apenas 1 de 10 aminoácidos na região de ligação ao receptor (25-34) de hPTH está conservada em hPTHrp. A semelhança conformacional pode estar na base da actividade comum. Cohen, et al., em J. Biol. Chem. 266:3, 1997-2004 (1991), sugeriram que grande parte da sequência de PTH (1-34) e PTHrp (1-34), em particular as regiões (5-18) e (21-34), assume uma configuração de hélice a, ao mesmo tempo observando que se questiona se esta configuração prevalece no extremo carboxilo nas condições fisiológicas. Tal estrutura secundária poderá ser importante para a interacção com lípidos, interacção com receptores, e/ou estabilização estrutural. e~ *gy»4> -7- EP-A-0451867 descreve derivados de peptídeos da seguinte fórmula geral (I): AAA BBB CCC DDD EEE FFF His GGG HHH Gli Lis Ser Ile Gin Asp Leu 1 5 10 1

Arg Arg Arg Fen Fen Leu III JJJ Leu Ile Ala Glu Ile His Tre Xaa 20 25 30 ...(I) em que AAA é deleção ou Ser, BBB é deleção ou Glu, CCC é deleção, Ile, Fen, Leu, ciclo-hexilalanina, D-ala ou Lis substituída na posição e por um grupo alquilcarbonilo Cô-Qs, DDD é Gli ou Gin, EEE é Leu, Nle ou Fen. FFF é Met, Leu ou Nle, GGG é Ala, Ser, Leu, Leu, Asn, Asp ou Gin, HHH é Leu, Glu ou Lis, III é His, Lis ou Arg, JJJ é His, Lis ou Arg, Xaa é Ala modificada no extremo carboxilo com um grupo amínico, desde que CCC e DDD possam, independentemente, ser modificados no extremo amínico por alquilcarbonilo Có-Cig, e que EEE não seja Leu quando FFF for Met. GGG é Asn, HHH é Leu, III e JJJ são His, e os seus sais, que apresentam uma forte actividade inibidora contra hPTH e são úteis como agente terapêutico para o tratamento de disbulia associada ao cálcio ou ácido fosfórico, como seja hipercalcemia, osteoporose, hiperparatiroidismo, osteodistrofia renal e similares e outras doenças relacionadas envolvendo PTH ou PTHrP.

Biochemistry, 1992, Vol. 31, N°7, páginas 2056-2063 descreve a avaliação da hormona paratiróide humana (hPTH) e várias análogos com deleções usando espectroscopia de dicroismo. EP-A-0477885 descreve peptídeos e seus sais representados pela seguinte fórmula geral: R1-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R2-His-Asn-R3-R4-R5-His-Leu-Asn-Ser-R6-R7-Arg-

Rs-Glu-RçrLeu-Rio-Rn-Rn-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Rn -8- Μ em que Ri representa Ser ou Aib; R2 representa Met ou um aminoácido hidrofóbico natural; R3 representa Leu, Ser, Lis ou um aminoácido aromático; R4 representa Gli ou um D-a-aminoácido; R5 representa Lis ou Leu; R^ representa Met ou um aminoácido hidrofóbico natural; R7 representa Glu ou um aminoácido básico; R§ representa Vai ou aminoácido básico; R9 representa Trp ou 2-(1,3-ditiolano-2-il)Trp; R10 representa Arg ou His; Rn representa Lis ou His; R12 representa Lis, Gin ou Leu; e R13 representa Fen ou Fen-NH2; excepto simultaneamente Rj consistir em Ser, R2 consistir em Met, R3 consistir em Leu, R4 consistir em Gli, D-Ala ou D-Pro, R5 consistir em Lis, consistir em Met, R7 consistir em Glu, R8 consistir em Vai, R9 consistir em Trp, Ri0 consistir em Arg, Rn consistir em Lis e R12 consistir em Lis.

Os análogos da hormona paratiróide (1-34) são úteis na terapia hormonal.

Sintetizámos análogos de PTH e de PTHrp com o objectivo de desenvolver melhores agentes terapêuticos para restaurar a massa óssea em mamíferos, incluindo os atingidos pela osteoporose.

SUMÁRIO DO INVENTO

Este invento proporciona um peptídeo relacionado com a hormona paratiróide (PTHrp) modificado, da fórmula:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7Leu His Xaa10 Xaa11 Gli Xaa13Ser Ile Gin Xaa17 Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22'31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Fim, em que: -9- c_d-*

Xaa1 está ausente ou é Ala;

Xaa2 está ausente ou é Vai Xaa3 está ausente ou é Ser;

Xaa4 está ausente ou é Glu ou Glu(OCH3);

Xaa5 está ausente ou é His ou Ala;

Xaa6 está ausente ou é Gin;

Xaa7 está ausente ou é Leu;

Xaa10 e Xaa17 são independentemente Asp ou Asp(OCH3);

Xaa13 é Lis, Arg, Tir, Cis, Leu, Cis(CH2CONH(CH2)2NH(biotiniI)), Lis(7-dimetilamino-2-oxo-2H-1 -benxopiran-4-acetil) ou Lis(di-hidrocinamoil);

Xaa20 é Arg ou Leu;

Xaa19 e Xaa21 são independentemente Lis, Ala ou Arg; 22 r t t

Xaa ' formam uma hélice α anfipática e é seleccionado do grupo consistindo em a) Xaa22 Xaa23 Leu, Xaa25 Xaa26 Leu Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 em que:

Xaa22 e Xaa25 são independentemente Glu, Glu(OCH3), His ou Fen;

Xaa é Leu ou Fen;

Xaa é Lis ou His;

Xaa28 e Xaa31 são independentemente Leu ou Ile;

Xaa29 é Ala, Arg ou Glu; e

Xaa30 é Lis ou Glu (SEQID NO:85); em que um composto, em que Xaa22 é Fen, Xaa23 é Fen, Xaa25 é His, Xaa26 é Lis ou His, Xaa28 é Ile, Xaa29 é Ala, Xaa30 é Glu e Xaa31 é Ile está excluído, b) Xaa22 Xaa23 Leu, Xaa25 Arg Leu Leu Xaa29 Arg Leu em que:

Xaa22 e Xaa25 são independentemente Glu, Glu(OCH3), His ou Fen; 23

Xaa é Leu ou Fen; -10-

Xaa29 é Glu, Lis, ou Lis(COCH2PEGX) e PEGX é um radical poli(éter metílico de etilenoglicol) de peso molecular 100 a 10 000 (SEQ ID NO:86); c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu (SEQ ID NO:28); 1 5 10 d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Ser Ser Leu (SEQ ID NO:29); 1 5 10 e) Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis Leu (SEQ ID NO:30); 1 5 10

Xaa32 é His, Pro ou Lis;

Xaa está ausente ou é Pro, Tre, Glu ou Ala

Xaa34 está ausente ou é Pro, Arg, Met, Ala, hSer, hSer lactona, Tir, Leu ou 2,4-diaminobutiril-lactama;

Xaa está ausente ou é Pro, Glu, Ser, Ala ou Gli;

Xaa está ausente ou é Ala, Arg ou Ile;

Xaa37 está ausente ou é Arg, Trp ou 3-(2-naftil)-L-alanina;

Xaa38 está ausente ou é Ala ou hSer ou Xaa38'42 é Tre Arg Ser Ala Trp; e Fim é OR ou NR2 onde cada R é independentemente H, alquilo (C1-C4) ou fenil-alquilo (C1-C4); e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Quando exemplos específicos da sequência Xaa são inseridos em PTH, PTHrp e nos análogos e homólogos truncados fisiologicamente activos de PTH e de PTHrp, como definido atrás, os polipeptídeos são agentes remodeladores de osso eficazes. -11 - fy. £-*-1 ^

Assim, num aspecto, este invento proporciona análogos de PTH, PTHrp e os análogos e homólogos truncados, fisiologicamente activos, de PTH e de PTHrp ou seus sais, conforme definido atrás, em que os resíduos de aminoácidos (22-31) formam uma hélice α anfipática, a sequência dos referidos resíduos (22-31) sendo seleccionada entre: a) Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Leu Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 em que 1 5 10

Xaa1 e Xaa4 são independentemente Glu, Glu(OCH3), His ou Fen; Xaa2 é Leu ou Fen; Xaa3 é Lis ou His; Xaa7 e Xaa10 são independentemente Leu ou Ile; Xaa8 é Ala, Arg ou Glu; e Xaa9 é Lis ou Glu (SEQ ID NO:85); de preferência

Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Xaa Lis Leu em que 1 5 10

Xaa é Glu ou Arg (SEQ ID NO:26); b) Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Arg Leu Leu Xaa8 Arg Leu em que 1 5 10

Xaa1 e Xaa4 são independentemente Glu, Glu(OCH3), His ou Fen; Xaa2 é Leu ou Fen; Xaa8 é Glu, Lis, ou Lis(COCH2PEGX) e PEGX é um radical poli(éter metílico de etilenoglicol) de peso molecular 100 a 10 000 (SEQ ID NO:86); de preferência,

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu em que 1 5 10

Xaa é Glu, Lis, ou Lis(COCH2PEGX) e PEGX é um radical poli(éter metílico de etilenoglicol) de peso molecular 100 a 10 000 (SEQ ID NO:27); c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu (SEQ ID NO:28); 1 5 10 -12-

— Λ. ί ‘'J d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu (SEQ ID NO:29); 1 5 10 e) Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis Leu (SEQ ID NO:30). 1 5 10

Num outro aspecto, este inwento proporciona análogos de PTH, PTHrp e dos homólogos e análogos truncados, fisiologicamente activos, de PTH e PTHrp, ou seus sais, em que os resíduos de aminoácidos (22-31) formam uma hélice α anfipática, a sequência dos referidos resíduos (22-31) sendo seleccionada entre: a) Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Xaa Lis Leu em que 1 5 10

Xaa é Glu ou Arg (SEQ ID NO;26); b) Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu em que 1 5 10

Xaa é Glu, Lis, ou Lis(COCH2PEGX) e PEGX é um radical poli(éter metílico de etilenoglicol) de peso molecular 100 a 10 000 (SEQ ID NO:27); c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu (SEQ ID NO:28); 1 5 10 d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu (SEQ ID NO:29); 1 5 10 e) Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis Leu (SEQ ID NO:30). 1 5 10 -13 - São igualmente proporcionadas composições farmacêuticas para a prevenção ou tratamento de estados caracterizados por decréscimo da massa óssea, compreendendo uma quantidade eficaz no aumento da massa óssea de um análogo polipeptídico da hormona paratiróide (PTH), peptídeo relacionado com a hormona paratiróide (PTHrp) e dos homólogos e análogos truncados, fisiologicamente activos, de PTH e PTHrp, conforme definidos atrás, e seus sais, misturados com um veículo farmaceuticamente aceitável. São igualmente proporcionados processos para a preparação de composições farmacêuticas que compreendem a mistura dos compostos atrás descritos com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os compostos deste invento podem ser usados em métodos para o tratamento de mamíferos em estados caracterizados pelo decréscimo da massa óssea, métodos esses que compreendem a administração, a um mamífero necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz no aumento da massa óssea dos referidos compostos.

Mais especificamente, os compostos deste invento podem ser usados em métodos para o tratamento de mamíferos em estados caracterizados pelo decréscimo da massa óssea, métodos esses que compreendem a administração, a um mamífero necessitado de tal tratamento, de uma quantidade eficaz no aumento da massa óssea de um análogo polipeptídico de PTH, PTHrp ou de um homólogo ou análogo de PTH ou PTHrp, de acordo com o invento, ou um seu sal, em que os resíduos de aminoácido (22-31) formam uma hélice α anfipática, a sequência dos referidos resíduos (22-31) sendo seleccionada entre: (SEQID NOS: 26,27,28, 29 e 30).

Este invento também engloba um processo para a síntese em fase sólida dos análogos polipeptídicos de PTH, pTHrp e de homólogos e análogos truncados fisiologicamente activos de PTH e PTHrp, de acordo com o invento, e - 14-seus sais, em que os resíduos de aminoácidos (22-31) formam uma hélice α anfipática, a sequência dos referidos resíduos (22-31) sendo seleccionada entre: (SEQ ID NOS: 26, 27, 28, 29 e 30); processos esses que compreendem o acoplamento sequenciado de aminoácidos protegidos num suporte de resina adequada, remoção dos grupos protectores das cadeias laterais e Ν“ e clivagem do polipeptídeo da resina.

Também estão incluídos processos de síntese recombinante dos análogos polipeptídicos de PTH, PTHrp e dos homólogos e análogos truncados fisiologicamente activos de PTH e PTHrp. O invento também inclui sequências de DNA, vectores e plasmídeos para a síntese recombinante de tais análogos polipeptídicos. Especificamente, o invento proporciona sequências de DNA, vectores e plasmídeos para a síntese recombinante de análogos polipeptídicos de PTH, PTHrp e dos homólogos e análogos truncados fisiologicamente activos de PTH e PTHrp, em que os resíduos de aminoácidos (22-31) formam uma hélice α anfipática, a sequência dos referidos resíduos (22-31) sendo seleccionada entre: (SEQ ID NOS: 26, 27,28, 29 e 30).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 apresenta a sequência de DNA e os locais de corte por enzimas de restrição de um gene sintético codificador de um análogo de PTHrp (1 -34) deste invento (amplificação por PCR de hPTH).

Figura 2 descreve a preparação de um plasmídeo incorporando um gene do análogo PTHrp (1-34) Construção (Trp LE 18 hPTHrp (1-34) 1. - 15-

Figura 3 descreve a preparação de um plasmídeo incorporando duas cópias de um gene do análogo PTHrp (1-34) Construção (Trp LE 18 hPTHrp (1-34) 2.

Figura 4 descreve a preparação de um plasmídeo incorporando quatro cópias do gene do análogo PTHrp (1-34) Construção (Trp LE 18 hPTHrp (1-34) 4.

DESCRICAO DETALHADA DO INVENTO

Abreviaturas e definições

As abreviaturas de uma e três letras para as várias bases nucleotídicas e aminoácidos comuns são conforme recomendado em Pure Appl. Chem., 31, 639-645 (1972) e 40, 277-290 (1974) e está de acordo com 37 CRF §1.822 (55 FR 18245, 1 de Maio, 1990) e com as regras PCT (WIPO Standard ST.23: Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications and in Published Patent Documents). As abreviaturas de uma e três letras são as seguintes:

Abreviaturas de aminoácidos

Aminoácido Símbolo de três letras Símbolo de uma letra

Alanina Ala Arginina Arg Asparagina Asn Acido aspártico Asp Asn + Asp Asx

A

R

N

D

B -16-

Cisteína Cis C Glutamina Gin Q f Acido glutâmico Glu E Gin + Glu Glx Z Glicina Gli G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lis K Metionina Met M Fenilalanina Fen F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Tre T Triptofano Trp w Tirosina Tir Y Valina Vai V Outro aminoácido Xaa X

As abreviaturas representam L-aminoácidos a menos que de outra forma sejam designados como D- ou D,L-. Certos aminoácidos, naturais e não naturais, são aquirais, e.g. glicina. Todas as sequências peptídicas estão apresentadas com o aminoácido N-terminal à esquerda e o aminoácido C-terminal à direita.

Outras abreviaturas para outros aminoácidos e compostos usados aquisao: - 17- C~ cl

HSer HSerlac Nle PEG2 PEG5000 PEGX

Homo-serina Lactona de homo-serina Norleucina

Radical do éter metílico de dietilenoglicol, a.k.a metoxidi(etilenoxi), CH30(CH2CH20)2-, (PM = 119)

Radical de poli(éter metílico de etilenoglicol), a.k.a metoxipoli(etilenoxi), CH30(CH2CH20)i 10-, (PM médio = 5000)

Radical de poli(éter metílico de etilenoglicol), a.k.a metoxipoli(etilenoxi), CH30(CH2CH20)n-, (PM médio =100 a 10 000) “Homólogo ou análogo truncado fisiologicamente activo de PTH ou de PTHrp" refere-se a um polipeptídeo tendo uma sequência não compreendendo a totalidade dos aminoácidos encontrados em PTH ou PTHrp, o qual, no entanto, induz uma resposta fisiológica semelhante. PTH ou PTHrp truncado não necessita de ser totalmente homólogo de PTH ou PTHrp para induzir uma resposta fisiológica semelhante. PTH(l-34) e PTHrp(l-34) são preferidos, mas não exclusivos, representantes deste grupo. “Hélice α anfipática" refere-se à estrutura secundária apresentada por certos polipeptídeos em que os aminoácidos assumem uma configuração de hélice α tendo faces polares e não polares opostas orientadas ao longo do eixo longo da hélice. A possibilidade de estrutura de hélice α no polipeptídeo com interesse pode ser explorada, até certo ponto, pela construção de uma “volta Schiffer-Edmundson'' (M. Schiffer e A.B. Edmundson, Biophys. J. 7, 121 (1967)), de passo de hélice adequado e notando a segregação dos resíduo hidrofílicos e lipofílicos nas faces opostas do cilindro circunscrevendo a hélice. Como alternativa, evidência empírica, como seja dados de dicroismo circular ou -18-de diffacção de raios X, podem estar disponíveis indicando a presença de uma região de hélice α num determinado polipeptídeo. Uma hélice α ideal tem 3,6 resíduos de aminoácidos por volta com cadeias laterais adjacentes separadas por 100°C de arco. Eisenberg et al. em Nature 299:371-374 (1982) e Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:140-144 (1984) combinaram uma escala de hidrofobicidade com a volta helicoidal para quantificar o conceito de hélices anfipáticas. O momento hidrofóbico médio é definido como a soma de vectores das hidrofobicidades dos aminoácidos componentes da hélice. As hidrofobicidades dos aminoácidos que se seguem são as descritas por Eisenberg (1984) como a escala de “consensus":

Ile 0,73; Fen 0,61; Vai 0,54; Leu 0,53; Trp 0,37; Met 0,26; Ala 0,25; Gli 0,16; Cis 0,04; Tir 0,02; Pro -0,07; Tre -0,18; Ser -0,26; His -0,40; Glu -0,62; Asn -0,64; Gin -0,69; Asp -0,72; Lis -1,10; Arg -1,76. O momento hidrofóbico, μΗ, para uma hélice α ideal tendo 3,6 resíduos por volta (ou um arco de 100° (= 36073,6) entre cadeia laterais), pode ser calculado a partir de: μΗ = [(Σ Hn senô (N-l))2 + Σ HN cosô (N-l))2 ]1/2, em que HN é o valor de hidrofobicidade do N-ésimo aminoácido e as somas são feitas relativamente aos N aminoácidos na sequência com uma periodicidade δ = 100°C. O momento hidrofóbico pode ser expresso como a média do momento hidrofóbico por resíduo, dividindo μΗ por N para obter <μΗ>· Um valor de <μΗ> a 100°C ±20° de cerca de 0,20 ou superior é sugestivo da formação de hélice antipática. Os valores de <μΗ> a 100° para hPTHrp (22-31) e hPTH (22-31) são 0,19 e 0,37, respectivamente. -19-

Comett, et ai, em J. Mol. Biol., 195:659-685 (1987) alargaram o estudo das hélices α antipáticas através da introdução do “índice antipático" como um indicador de anfipaticidade. Eles concluíram que aproximadamente metade de todas as hélices α conhecidas são antipáticas, e que a frequência dominante é de 97,5° em vez de 100°, com o número de resíduos por volta estando mais perto de 3,7 do que de 3,6. Se bem que tais refinamentos sejam cientificamente interessantes, a abordagem básica de Eisenberg, et al., é suficiente para classificar uma dada sequência como antipática, particularmente quando se está a projectar uma sequência ab initio para formar uma hélice α antipática.

Uma sequência de aminoácidos de hélice α antipática substituta pode não ter homologia com a sequência de um dado segmento de um polipeptídeo natural mas induzir uma estrutura secundária semelhante, i.e. uma hélice α tendo faces polares e não polares opostas, no ambiente fisiológico. A substituição da sequência de aminoácidos natural com uma sequência alternativa pode afectar beneficamente a actividade fisiológica, estabilidade ou outras propriedades do polipeptídeo parental alterado. Indicações sobre como projectar e seleccionar tais sequências são proporcionadas em J.L.Krstenansky, et ai, FEBS Letters 242:2, 409-413 (1989) e J.P. Segrest, et ai, Proteins:Structure and Genetics 8:103-117 (1990), entre outros. Um método conveniente para determinar se uma sequência é suficientemente antipática para ser uma sequência deste invento é calcular o momento hidrofóbico médio, conforme definido atrás. Se o momento médio do pico por resíduo, a 100° ±20°, exceder cerca de 0,20, então a sequência formará uma hélice antipática e é uma sequência deste invento.

Por exemplo, o momento hidrofóbico médio por resíduo a 100° para (SEQ ID NO:26), Xaa = Glu, é calculado como se segue: -20- A.A. Hn δ/Ν-η H sen δ ΓΝ-1) H cos δ ÍN- E -0,62 0 0 -0,62 L 0,53 100 0,52 -0,17 L 0,53 200 -0,18 -0,50 E -0,62 300 0,34 -0,31 K -U 400 -0,70 -0,85 L 0,53 500 0,34 -0,41 L 0,53 600 -0,46 -0,27 E -0,62 700 0,21 -0,58 K -1,1 800 -1,08 -1,19 L 0,53 900 0 -0.53 M II © 00 Σ = -4,43 μΗ = [(0,81)2 + (-4,43)2]172 = 4,50 <Mh> = 4,50/10 = 0,45

Para esta sequência, o momento hidrofóbico do pico médio ocorre a 92°C e tem um valor de 0,48.

Ao aplicar este conceito à hormona paratiróide e peptídeo relacionado com a hormona paratiróide, coloca-se a hipótese de que uma ou ambas as regiões (7-16) e (22-31) possam apresentar uma estrutura secundária em hélice α e possam ser substituídas com uma sequência não homóloga tendo tendências estruturais semelhantes, sem perda de actividade biológica ou indução de reacção imune. -21 -

Modelos de Realização Preferidos

Num aspecto, este invento proporciona análogos de PTH, PTHrp e análogos e homólogos truncados fisiologicamente activos, de acordo com o invento, ou seus sais, em que os resíduos de aminoácidos (22-31) formam uma hélice α anfipática, a sequência dos referidos resíduos (22-31) sendo seleccionados entre: a) Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Leu Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 em que 1 5 10

Xaa1 e Xaa4 são independentemente Glu, Glu(OCH3), His ou Fen; Xaa2 é Leu ou Fen; Xaa3 é Lis ou His; Xaa7 e Xaa10 são independentemente Leu ou Ile; Xaa8 é Ala, Arg ou Glu; e Xaa9 é Lis ou Glu (SEQ ID NO: 85) em que é excluído um composto em que Xaa1 é Fen, Xaa2 é Fen, Xaa4 é His, Xaa5 é Cis ou His, é Xaa7 é Ile, Xaa8 é Ala, Xaa9 é Glu e Xaa10 é Ile; de preferência

Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Xaa Lis Leu em que 1 5 10

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu em que 1 5 10 -22-

Xaa é Glu, Lis, ou Lis(COCH2PEGX) e PEGX é um radical poli(éter metílico de etilenoglicol) de peso molecular 100 a 10 000 (SEQID NO:27); c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu (SEQ ID NO:28); 1 5 10 d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu (SEQ ID NO:29); 1 5 10 e) Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis Leu (SEQ ID NO:30). 1 5 10

Num outro aspecto, este invento proporciona análogos de PTH, PTHrp e dos homólogos e análogos truncados fisiologicamente activos de PTH e PTHrp, ou seus sais, da fórmula:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Leu His Xaa10 Xaa11 Gli Xaa13 Ser Ile Gin Xaa17 Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22'31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Fim, em que:

Xaa1 está ausente ou é Ala;

Xaa2 está ausente ou é Vai Xaa3 está ausente ou é Ser;

Xaa4 está ausente ou é Glu ou Glu(OCH3);

Xaa5 está ausente ou é His ou Ala;

Xaa6 está ausente ou é Gin;

Xaa7 está ausente ou é Leu;

Xaa10 e Xaa17 são independentemente Asp ou Asp(OCH3); -23-

Cl—Λ ^

Xaa13 é Lis, Arg, Tir, Cis, Leu, Cis(CH2CONH(CH2)2NH(biotinil)), Lis(7-dimetilamino-2-oxo-2H-1 -benxopiran-4-acetil) ou Lis(di-hidrocinamoil);

Xaa20 é Arg ou Leu;

Xaa19 e Xaa21 são independentemente Lis, Ala ou Arg;

Xaa22'31 é seleccionado entre (SEQID NOS:26, 27, 28, 29 ou 30);

Xaa32 é His, Pro ou Lis; -3 ·}

Xaa está ausente ou é Pro, Tre, Glu ou Ala

Xaa35 está ausente ou é Pro, Glu, Ser, Ala ou Gli;

Xaa36 está ausente ou é Ala, Arg ou Ile;

Xaa37 está ausente ou é Arg, Trp ou 3-(2-naftil)-L-alanina;

Xaa38 está ausente ou é Ala ou hSer ou Xaa38·42 é Tre Arg Ser Ala Trp; e Fim é OR ou NR2 onde cada R é independentemente H, alquilo (C1-C4) ou fenil-alquilo (C1-C4); e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Ainda num outro aspecto este invento inclui análogos polipeptídicos dos homólogos truncados fisiologicamente activos de hPTHrp (1-34), como mostrado na Fórmula (I):

Ala Vai Ser Glu Xaa5 Gin Leu Leu His Asp Xaa11 Ser Gli Xaa13 Ser Ile Gin Asp Leu Xaa19 Arg Xaa22'31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Fim em que:

Xaa5 está ausente ou é His ou Ala;

Xaa11 e Xaa13 são independentemente Lis, Arg ou Leu;

Xaa19 e Xaa21 são independentemente Ala ou Arg;

Xaa ‘ é seleccionado entre a) Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Xaa Lis Leu em que 1 5 10

Xaa é Glu ou Arg (SEQ ID NO:26); -24- b) Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu em que 1 5 10

Xaa32 é His ou Lis;

Xaa33 é Tre, Glu ou Ala;

Xaa34 é Ala, hSer, Tir ou Leu; e Fim é Gli Arg Arg, lactama, OH ou NR2, onde cada R é independentemente H, alquilo (C1-C4); e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Um aspecto mais específico do invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:26), para o qual <μΗ> a 100° excede 0,45. Um aspecto ainda mais específico do invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:26); Xaa11 e Xaa13 são ambos Lis; e Xaa19 eXaa21 são ambos Arg.

Polipeptídeos representativos incluem, mas não estão limitados a: -25-

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 5 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Arg Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO:5);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO:6);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:7);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre hSer NH2 (SEQ ID NO:8);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre hSerlac NH2 (SEQ ID NO:9);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 -26-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Gli Arg Arg OD (SEQ ID NO: 10); e 35 Ála Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu Lis Glu Leu NH2 (SEQ ID NO: 11).

Um outro aspecto deste invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:26); Xaa11 e Xaa13 são ambos Lis; e um de Xaa19 e Xaa21 é Arg e o outro é Ala. Polipeptídeos representativos deste subgénero incluem, mas não estão limitados a:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ IDNO:12) e

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO: 13).

Num outro aspecto este invento inclui os polipeptídeos da Fórmula -27- tQA,Yfr

(I) ) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:26); Xaa11 e Xaa13 são ambos Lis; e um de Xaa19 e Xaa13 é Leu e o outro é Lis; Xaa19 e Xaa21 são ambos Arg. Polipeptídeos representativos deste subgénero incluem, mas não estão limitados a:

Ala Vai Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Ala Leu OH (SEQ ID NO: 14).

Num outro aspecto este invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22*31 é (SEQ ID NO:27), para os quais <μΗ> a 100° excede 0,50. Um outro aspecto deste invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:27); Xaa11 e Xaa13 são ambos Lis ou ambos Arg; e Xaa19 e Xaa são ambos Arg. Polipeptídeos representativos deste subgénero incluem, mas não estão limitados a:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 15);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 16);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 5 10 15

-28-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lis Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQID NO: 17);

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 25

Lis (COCH2PEG2) Arg Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 18); e 30

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 25

Lis (COCH2PEG5000) Arg Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 19). 30

Num outro aspecto este invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:28), para os quais <μΗ> a 100° é cerca de 0,25. Polipeptídeos representativos deste subgénero incluem, mas não estão limitados a:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:20).

Num outro aspecto este invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:29), para os quais <μΗ> a 100° é cerca de 0,28. -29-

Polipeptídeos representativos deste subgénero incluem, mas não estão limitados a:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQID NO:21).

Num outro aspecto este invento inclui os polipeptídeos da Fórmula (I) em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:30), para os quais <μΗ> a 100° é cerca de 0,29. Polipeptídeos representativos deste subgénero incluem, mas não estão limitados a:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:22).

Ainda um outro aspecto deste invento inclui polipeptídeos análogos do homólogo truncado fisiologicamente activo bPTH (1-34), como se mostra na Fórmula (II):

Xaa1 Vai Ser Glu Ile Gin Xaa7 Xaa8 His Asn Leu Gli Lis His Leu Xaa16 Ser Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22'31 His Asn Xaa34 Fim, em que:

Xaa1 é Ser ou Ala;

Xaa7 é Leu ou Fen;

Xaa8 é Met ou Nle; -30-

Xaa16 é Asn ou Ser;

Xaa18 é Leu, Met ou Nle;

Xaa19 é Glu ou Arg;

Xaa21 é Vai ou Arg;

Xaa22'31 é seleccionado entre (SEQID NO:26,27,28,29 e 30);

Xaa34 é Fen ou Tir;

Fim é OH ou NR2, em que cada R é H ou alquilo (C1-C4); e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Polipeptídeos representativos da Fórmula (II) incluem, mas não estão limitados a:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Asn Tir NH2 (SEQ ID NO:23) e

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Asn Tir NH2 (SEQ ID NO:24).

Ainda, num outro aspecto deste invento, surpreendentemente, encontrou-se que homólogos e análogos de PTHe PTHrp tendo menos de 34 aminoácidos são também agentes potentes da remodelação de osso. Estes compostos são da fórmula geral:

Ala Vai Ser Glu Xaa5 Gin Leu Leu His Asp Xaa11 Gli Xaa13 Ser Ile Gin Asp Leu Xaa19 Arg Xaa21 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22'31 Xaa34 Fim. -31 -

Polipeptídeos representativos incluem, mas não estão limitados a:

Composto 14: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2 (SEQ IDNO:55)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Pro NH2 (SEQ ID NO:55).

Dados Físicos p.f. 142,8-166,1°C [a]D25 -53,80 (c 0,38, H20) FAB (C173H295N55049): [M+H] 3929 AAA: Asx 2,0 (2) Glx 5,7 (6) Ser 1,8(2) His 3,0 (3) Gli 1,1(1) Ala 0,9 (1) Arg 2,8 (3) Vai 1,2(1) Ile 0,9 (1) Leu 7,4 (8) Lis 4,4 (4) Pro 0,9 (1)

Composto 42: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2 (SEQ ID NO:56)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu Pro NH2 (SEQ ID NO:56). -32-

Dados Físicos p.f. 61,0-177,0°C [a]D25 -61,97 (c 0,19, H20) FAB (C167H288N52048): [M+H] 3792,0 AAA: Asx 2,2 (2) Glx 5,9 (6) Ser 1,9(2) His 2,1 (2) Gli 1,1(1) Ala 1,0(1) Arg 3,0(3) Vai Μ (i) Ile 1,0(1) Leu 7,9 (8) Lis 4,3 (4) Pro 0,9 (1) Síntese clássica dos polipeptídeos

Os polipeptídeos do presente invento podem ser sintetizados por métodos tais como os descritos em J.M. Stewart e J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2aa ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984) e J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, Academic Press, New York, (1973) para a síntese em fase sólida e E. Schroder e K. Lubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press, New York, (1965) para a síntese em solução.

Em geral, estes métodos envolvem a adição sequenciada de aminoácidos protegidos a uma cadeia peptídica em crescimento. Normalmente, o grupo amínico ou carboxilo do primeiro aminoácido e qualquer grupo reactivo da cadeia lateral estão protegidos. Este aminoácido protegido é então ligado a um suporte sólido inerte, ou utilizado em solução, e o aminoácido seguinte da sequência, também adequadamente protegido, é adicionado nas condições adequadas à formação da ligação amida. Após todos os aminoácidos pretendidos terem sido ligados na sequência correcta, os grupos protectores e qualquer suporte sólido são removidos para se obter o polipeptídeo bruto. Remove-se o sal ao polipeptídeo e este é purificado, de preferência por cromatografia, para dar o produto final. -33-

Um método preferido de preparação dos análogos dos polipeptídeos truncados fisiologicamente activos, tendo menos de quarenta aminoácidos, envolve a síntese de peptídeos em fase sólida. Neste método as funções a-amínicas (N“) e quaisquer cadeias laterais reactivas são protegidas por grupos sensíveis às bases ou aos ácidos. O grupo protector deverá ser estável nas condições de formação da ligação peptídica, sendo ao mesmo tempo facilmente removível sem afectar a cadeia polipeptídica formada. Grupos protectores da função amínica α includem, mas não estão limitados a t-butoxicarbonilo (Boc), benziloxicarbonilo (Cbz), o-clorobenziloxicarbonilo, bifenilisopropiloxicarbo-nilo, t-amiloxicarbonilo (Amoc), isobomiloxicarbonilo, a,a-dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, 2-ciano-t-butoxicarbonilo, 9-fluorofenilmetoxicarbonilo (Fmoc) e similares, de preferência t-butoxicarbonilo (Boc). Grupos protectores de cadeias laterais adequados incluem, mas não estão limitados a: acetilo, benzilo (Bzl), benziloximetilo (Bom), o-bromobenzilo-xicarbonilo, t-butilo, t-butildimetilsililo, 2-clorobenzilo (Cl-z), 2,6-dicloroben-zilo, ciclo-hexilo, ciclopentilo, isopropilo, pivalilo, tetra-hidropiran-2-ilo, tosilo (Tos), trimetilsililo e tritilo. Na síntese em fase sólida, o aminoácido C-terminal é primeiro ligado a um suporte de resina adequado. Os suportes de resina adequados são os materiais inertes aos reagentes e condições de reacção das reacções sucessivas de condensação e desprotecção, assim como insolúveis nos meios usados. Exemplos de resinas comerciais incluem resinas de estireno/divi-nilbenzeno modificadas com um grupo reactivo, e.g., co-poli-(estireno-divinil-benzeno) clorometilado, co-poli-(estireno-divinilbenzeno) hidroximetilado e similares. Prefere-se a resina fenilacetamidometilo (PAM) hidroximetilada. Quando o extremo C do composto é uma amida, uma resina preferida é a resina p-metilbenzidrilamino-co-poli (estireno-divinil-benzeno). A ligação à resina PAM pode ser conseguida por reacção do -34- aminoácido N^protegido, de preferência o aminoácido Boc, como o seu sal de amónio, césio, trietilamónio, l,5-diazabiciclo-[5.4.0]undec-5-eno, tetrametilamó-nio, ou sal semelhante em etanol, acetonitrilo, Ν,Ν-dimetilformamida (DMF), e similares, de preferência o sal de césio em DMF, com a resina a uma temperatura elevada, por exemplo entre cerca de 40°C e 60°C, de preferência a cerca de 50°C, durante cerca de 12 a 72 horas, de preferência cerca de 48 horas. O N^Boc-aminoácido pode ser ligado à resina benzidrilamina por meio de, por exemplo, um acoplamento mediado por N,N-diisopropil-carbodiimida (DIC)/l-hidroxibenzotriazole (HOBt) durante cerca de 2 a cerca de 24 horas, de preferência cerca de 2 horas a uma temperatura entre cerca de 10° e 50°C num solvente como seja diclorometano ou dimetilformamida, de preferência diclorometano. O acoplamento sucessivo dos aminoácidos protegidos pode ser realizado por métodos conhecidos dos familiarizados com a matéria, tipicamente num sintetizador de peptídeos automático. Após neutralização com trietilamina ou base semelhante, cada uma dos aminoácidos protegidos é de preferência introduzido num excesso molar de aproximadamente 1,5 a 2,5 vezes e o acoplamento realizado num solvente polar não aquoso, inerte como seja diclorometano, DMF ou suas misturas, de preferência em diclorometano à temperatura ambiente. São agentes de acoplagem representativos N,N’-dicilo-hexilcar-bodiimida (DCC), Ν,Ν’-diisopropil-carbodiimida (DIC) ou outra carbodiimida, sozinha ou na presença de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt), O-acilureias, hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxitris(pirrolidino)fosfónio (PyBop), N-hidroxi-succinimida, outras N-hidroxi-imidas ou oximas. Como alternativa, podem ser usados os ésteres activos de aminoácidos protegidos (e.g. p-nitrofenilo, pentafluorofenilo e similares) ou anidridos simétricos.

-35-

No final da síntese em fase sólida o peptídeo totalmente protegido é removido da resina. Quando a ligação ao suporte de resina é do tipo éster benzílico, a clivagem pode ser efectuada por meio de aminólise com uma alquilamina ou fluoroalquilamina para os peptídeos com um extremo C alquil-amida, ou por aminólise com, por exemplo, amónia/metanol ou amónia/etanol para os peptídeos com um extremo C de amida não substituída, a uma temperatura entre cerca de -10° e 50°C, de preferência a cerca de 25°C, durante entre cerca de 12 e 24 horas, de preferência cerca de 18 horas. Os peptídeos com um extremo C hidroxilo podem ser clivados por HF ou com outro meio de desprotecção fortemente acídico ou por saponificação. Como alternativa, o peptídeo pode ser removido da resina por transesterificação, e.g., com metanol, seguido de aminólise ou saponificação. O peptídeo protegido pode ser purificado por cromatografia em gel de sílica.

Os grupos protectores das cadeias laterais podem ser removidos do peptídeo por tratamento do produto de aminólise com, por exemplo, fluoreto de hidrogénio líquido anidro na presença de anisol ou de outro captador do ião carbónio, tratamento com o complexo fluoreto de hidrogénio/piridina, tratamento com tris(trifluoroacetil)boro e ácido trifluoroacético, por redução com hidrogénio e paládio em carbono ou polivinilpirrolidona, ou por redução com sódio em amónia líquida, de preferência com fluoreto de hidrogénio líquido e anisol a uma temperatura entre cerca de -10°C e +10°C, de preferência a cerca de 0°C, durante entre cerca de 15 minutos e 2 horas, de preferência cerca de 1,5 horas.

Para os peptídeos na resina benzidrilamina, a clivagem da resina e os passos de desprotecção podem ser combinados num único passo utilizando fluoreto de hidrogénio líquido e anisol como descrito atrás. A solução pode ser dessalinizada (e.g. com resina de permuta

«-A -36- aniónica BioRad AG-3®) e o peptídeo purificado por uma sequência de passos cromatográficos empregando alguns ou todos os passos seguintes: permuta iónica numa resina fracamente básica na forma de acetato; cromatografia de adsorção hidrofóbica com co-poli(estireno-divinilbenzeno) não derivatizado, e.g. Amberlite® XAD; cromatografia de adsorção em gel de sílica; cromatografia de permuta iónica em carboximetilcelulose; cromatografia de partição, e.g. em Sephadex® G-25; distribuição de contracorrente; ou cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), especialmente HPLC de fase reversa em coluna de octil- ou octadecilsililsílica (ODS).

Assim, um outro aspecto do presente invento está relacionado com processo para a preparação de polipeptídeos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, processo esse que compreende sequenciadamente a condensação de aminoácidos protegidos num suporte de resina adequado, remoção dos grupos protectores e suporte de resina, e purificação do produto, para dar análogos dos homólogos e análogos truncados, fisiologicamente activos, de PTH e PTHrp, de preferência PTH (1-34) e PTHrp (1-34), em que os aminoácidos nas posições (22-31) formam uma sequência peptídica de hélice α antipática, como definido atrás. Síntese recombinante dos polipeptídeos

Como alternativa, os polipeptídeos deste invento podem ser preparados por clonagem e expressão de um gene codificador do polipeptídeo pretendido. Neste processo, um plasmídeo contendo a sequência de DNA pretendida é preparado e inserido num microrganismo hospedeiro adequado, tipicamente uma bactéria, como seja E. coli, ou uma levedura, como seja Saccharomyces cerevisiae, induzida a produção de múltiplas cópias do plasmídeo pelo microrganismo hospedeiro e, assim, do cDNA codificador dos análogos polipeptídicos deste invento. -37- Aí Sx.rt"' C—a

Primeiro, um gene sintético codificador do PTH ou PTHrp seleccionado é projectado com locais de restrição convenientes para facilitar subsequentes alterações. Para amplificar a sequência pode-se usar a reacção em cadeia com polimerase (PCR), seguindo os ensinamentos de Mullis nas Patentes U.S. Nos 4 683 195 e 4 683 202. O gene sintético amplificado pode ser isolado e ligado a um plasmídeo adequado, como seja o plasmídeo Trp LE, no qual podem ser inseridas quatro cópias do gene em tandem. A preparação do plasmídeo Trp LE está descrita na Patente U.S. N° 4 738 921 e na Publicação de Patente Europeia N° 0212532. Os plasmídeos Trp LE geralmente produzem 8-10 vezes mais proteína do que os plasmídeos Trp E. O gene multi-cópias pode ser então expresso num hospedeiro adequado, como seja E. coli ou S. cerevisiae. O vector de expressão específico usado aqui foi Trp LE 18 Prot (Ile ,Pro ) contendo os seguintes elementos: um fragmento de pBR322 (EcoRI-BamHI) contendo o gene de resistência à ampicilina e a origem de replicação do plasmídeo; um fragmento EcoRI-SacII contendo o promotor trp e o gene trpE; um fragmento do gene da protease (Ile3,Pro5) do HIV (SacII-HindIII); um fragmento do gene bGRF (HindIII-BamHI); e um terminador da transcrição do gene rpoc de E. coli. Os fragmentos do gene da protease do HIV e de bGRF não são críticos e, caso se pretenda, podem ser substituídos por outras sequências codificadoras.

As proteínas de fusão multiméricas expressas acumulam-se intracelularmente em corpos de inclusão instáveis e podem ser separadas do resto da proteína celular por centrifugação. A proteína de fusão isolada é convertida no análogo monomérico de PTH ou de PTHrp e pode ser purificada por permuta catiónica e/ou HPLC de fase reversa.

C—A -38- Métodos alternativos de clonagem, amplificação, expressão e purificação serão óbvios para os familiarizados com a matéria. Métodos representativos estão descritos em Maniatis, et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

Utilidade e administração

Os polipeptídeos deste invento são úteis na prevenção e tratamento de uma variedade de mamíferos com manifestações de perda da massa óssea. Em particular, os compostos deste invento são indicados para a profilaxia e tratamento terapêutico de osteoporose e osteopenia em humanos.

Em geral, os polipeptídeos deste invento, ou seus sais, são administrados em quantidades entre cerca de 0,002 e 1 μg/Kg de peso de corpo por dia, de preferência entre cerca de 0,04 e cerca de 0,2 pg/Kg de peso de corpo por dia. Para um indivíduo humano do sexo feminino de 50 Kg, a dose diária do ingrediente activo é entre cerca de 0,1 e cerca de 50 pg, de preferência entre cerca de 2,0 e cerca de 10 pg. Noutros mamíferos, tais como cavalos, cães e gado bovino, podem ser necessárias doses mais elevadas. Esta dosagem pode ser administrada numa composição farmacêutica convencional através de uma única administração, através de várias aplicações, ou via libertação controlada, conforme necessário para se conseguir os resultados mais eficazes, de preferência por injecção uma ou mais vezes ao dia. A selecção da dose e composição exactas e do regime de administração mais adequado será influenciado, inter alia, pelas propriedades farmacológicas do polipeptídeo seleccionado, pela natureza e gravidade do estado a ser tratado e da condição física e acuidade mental do recipiente.

Regimes de administração representativos incluem as vias oral, parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular e intravenosa), rectal, bucal (incluindo sublingual), pulmonar, transdérmica e intranasal.

Sais farmaceuticamente aceitáveis retêm a actividade biológica pretendida do polipeptídeo parental sem efeitos secundários tóxicos. São exemplos de tais sais (a) sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfurico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similares; e sais formados com ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fiimárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftalenossulfónico, ácidos naftaleno-dissulfónicos, ácido poligalacturónico e similares; (b) sais de adição de ácido formados com catiões de metais polivalentes tais como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e similares; ou com um catião orgânico formado a partir de Ν,Ν’-dibenziletilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b), e.g., um sal de tanato de zinco e similares.

Um outro aspecto do presente invento está relacionado com composições farmacêuticas compreendendo como ingrediente activo um polipeptídeo do presente invento ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, misturado com um veículo não tóxico farmaceuticamente aceitável. Conforme referido atrás, tais composições podem ser preparadas para administração parental (subcutânea, intramuscular ou intravenosa), particularmente na forma de soluções líquidas ou suspensões; para administração oral ou bucal, particularmente na forma de comprimidos ou cápsulas; para a administração -40-pulmonar ou intranasal, particularmente na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis; e para administração rectal ou transdérmica.

As composições podem ser convenientemente administradas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos em farmácia, por exemplo como descrito em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a ed. Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Formulações para administração parenteral podem conter como excipientes água estéril ou soro fisiológico, alquilenoglicóis tais como propilenoglicol, polialquilenoglicós tais como polietilenoglicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e similares. Para administração oral, a formulação pode ser aumentada pela adição de sais biliares ou acilcamitinas. As formulações para administração nasal podem ser sólidas e podem conter excipientes, por exemplo, lactose ou dextrano, ou podem ser soluções aquosas ou oleosas para usar na forma de gotas nasais ou de vaporizador com doseador. Para administração bucal típica os excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pregelatinado e similares.

Quando formulado para administração nasal, a absorção através da membrana da mucosa nasal pode ser aumentada por ácido tensioactivos, tais como por exemplo, ácido glicocólico, ácido eólico, ácido taurocólico, ácido etocólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desidrocólico, ácido glicodesoxicólico, ciclodextrinas e similares numa quantidade na gama entre cerca de 0,2 e cerca de 15 peso por cento, de preferência entre cerca de 0,5 e 4 peso por cento, mais preferencialmente cerca de 2 peso por cento. A administração dos compostos do presente invento durante períodos de tempo prolongados, por exemplo, durante períodos de uma semana a um ano, pode ser conseguida através de uma única administração de um sistema -41 -de libertação controlada contendo ingrediente activo suficiente para o período de libertação pretendido. Os vários sistemas de libertação controlada, tais como microcápsulas do tipo monolítico ou do tipo reservatório, implantes de depósitos, bombas osmóticas, vesículas, micelas, lipossomas, emplastros transdérmicos, dispositivos iontoforéticos e formas de dosagem injectáveis alternativas podem ser utilizados para este fim. A localização no local em que se pretende a libertação do ingrediente activo é uma característica adicional de alguns dispositivos de libertação controlada, o que poderá ser benéfico no tratamento de certas perturbações.

Uma forma de libertação controlada contem o polipeptídeo, ou o seu sal, disperso ou encapsulado num polímero não antigénico, não tóxico, de degradação lenta, como seja o ácido co-poli(lacti/glicólico), como descrito no trabalho pioneiro de Kent, Lewis, Sanderse Tice, U.S. 4 675 189. Os compostos ou, de preferência, os seus sais relativamente insolúveis, podem também ser formulados em colesterol ou noutros sedimentos de matrizes lipídicas, ou implantes de matriz de silastómeros. Outras formulações de libertação lenta, implante de depósitos ou injectáveis serão aparentes para os familiarizados com a matéria. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Released Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Mareei Dekker, Inc. New York, 1978 e R.W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Eiley & Sons, New York, 1987.

Os Exemplos específicos que se seguem destinam-se a ilustrar a síntese e testagem de compostos representativos do invento e não deverão ser considerados como limitantes do âmbito das reivindicações. Nos Exemplos, “p.f." é ponto de fusão, “[a]D25 é a actividade óptica a 25°C numa determinada concentração no solvente indicado, “FAB" é espectrometria de massa por bombardeamento de átomos rápidos e "AAA" é análise de aminoácidos, com os -42- Λh

valores esperados entre parêntesis a seguir aos valores observados. As análises de aminoácidos foram conduzidas num AminoQuant Analyzer Hewlett-Packard, seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante. Os aminoácidos primários foram derivatizados com o-ftalaldeído; os aminoácidos secundários com Fmoc. A detecção por fluorescência dos aminoácidos derivatizados foi usada para quantificação. Os aminoácidos protegidos foram adquiridos à Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA).

EXEMPLO I O composto 1 (SEQ ID NO:7) foi preparado numa escala de 0,5 mmol pelo método de fase sólida na resina 4-metilbenzidrilamina, usando um sintetizador automático Applied Biosystems Modelo 430A Os grupos a-amínicos foram protegidos com t-butoxicarbonilo (Boc). Os grupos protectores das cadeias laterais foram: benzilo (Bzl) para Asp, Glu e Ser; tosilo (Tos) para Arg; benziloximetilo (Bom) para His; e 2-clorobenzilo (Cl-z) para Lis. Os aminoácidos foram acoplados sequenciadamente usando N,N-dicilo-hexilcarbo-diimida/l-hidroxibenzotirazole (DCC/HOBt) segundo Stewart e Young {supra). Após acoplamento de cada um dos aminoácidos, o peptídeo foi acetilado usando uma mistura de anidrido acético e di-isopropiletilamina em N-metilpirrolidona. O peptídeo completo foi clivado da resina com desprotecção simultânea dos grupos protectores das cadeias laterais usando HF anidro (25 ml) na presença de anisol (2,5 ml) a -10°C durante 30 minutos e a 0°C durante 60 minutos. Após evaporação do HF in vacuo, o resíduo foi lavado com éter anidro e o peptídeo bruto extraído com ácido acético a 10%. A liofilização do extracto de ácido acético a 10% deu 900 mg de produto bruto. O peptídeo foi purificado por cromatografia em coluna de fase reversa ODS pressão média usando um gradiente de 22-45% de CH3CN em 0,1% de TF A. O produto eluiu em três fracções, as quais foram concentradas e liofilizadas para dar 130 mg de sólido branco de >98% de pureza.

-43-

Composto 1: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH, (SEP TD NO:71

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQID NO:7)

Dados Físicos: p.f. 150-159 °C [a]D25 -34,88 (c 0,16, H20) FAB (C175H3ooN5605i): [M+H] 4005,5 AAA: Asp, 1,9(2); Glu, 5,6(6); Ser, 1,6 (2); His, 2,7(3); Gli, 1,0(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,8(3); Vai, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,3(8); Lis, 4,0(4);

De forma semelhante, os Compostos 2, 5-18, 21-27, 29-36, 38-48, 50-54, 58-64 e 66-70 foram preparados e caracterizados, substituindo a resina PAM, conforme necessário, para a síntese dos polipeptídeos hidroxi-terminais.

Composto 2: AVSEHOLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH (SEP ID NO:61

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO:6); -44-

Dados Físicos: p.f. 154-170 °C [a]D25 -49,35 (c 0,46, H20) FAB (C175H301N5705o): [M+H] 4005,0 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 5,9(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 1,9(2); Arg, 3,0(3); Vai, 1,2(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,8(8); Lis, 4,2(4).

Composto 5: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLERLLERLHTA-OH ÍSEO ID NO: 151

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 15);

Dados Físicos: p.f. 147-165 °C [cc]D25 -49,17 (c 0,66, H20) FAB (C175H299N59O52)·' [M+H]+4061 AAA: Asp, 2,1(2); Gli, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 5,0(5); Vai, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,7(8); Lis, 1,9(2).

Composto 6: AVSEHOLLHDRGRSIODLRRRELLERLLERLHTA-OH (SEP ID NO: 16)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 16);

Dados Físicos: p.f. 150-170 °C [a]D25 -48,65° (c 0,54, H20) FAB (C175H299N63052): [M+H]+4118,0 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3); Gli, 1,2(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 6,9(7); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,7(8).

Composto 7: AV SEHOLLHDRGRSIODLRRRELLERLLKRLHT A-OH (SEP ID NO: 17)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lis Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 17);

Dados Físicos: p.f. 177-182 °C [a]D25 -46,17° (c 0,14, H20) FAB (C176H3o4N6405o): [M+H]+4117 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 4,8(5); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 6,7(7); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0 (1); Lis, 7,7(8); Lis, 0,9(1)

Composto 8: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLRKLHTA-OH ÍSEO ID NO:5)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 25 30

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Arg Lis 20

Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO:5);

Dados Físicos: p.f. 147-165 °C [a]D25 -49,17° (c 0,66, H20) FAB (C176H305N59O49): [M+H]+4033,0 AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 4,8(5); Ser, 1,8(2); His, 2,7(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,9(4); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,9(8); Lis, 4,0(4).

Composto 9: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTALGRR-OH LSF.Q [D NO-1Π)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Gli Arg Arg OH (SEQID NO: 10); 35

Dados Físicos: p.f. 158-160 °C [a]D25 -44,76° (c 0,1, H20) FAB (C189H326N64055): [M+H]+4375,0 AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 5,9(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3); Gli, 2,3(2); Tre, 1,0 (1); Ala, 1,9(2); Arg, 5,0(5); Vai, 1,2(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,8(8); Lis, 4,3(4).

Composto 10: AVSEAOLLHDLGKSIODLRRRELLEKLLEKLHAL-OH (SEP ID NO: 141

Ala Vai Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gli Lis Ser Ile 15 10 15 25 30

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20

Leu His Ala Leu OH (SEQ ID NO: 14); -47-

Dados Físicos: p.f. 170-175 °C [a]D25 -31,59o (c 0,54, H20) FAB (C174H3ooN5205i): [M+H]+3936,0 AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 6,0(6); Ser, 1,8(2); His, 2,0(2); Gli, 1,2(1); Ala, 3,0(3); Arg, 2,8(3); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,9(10); Lis, 3,0(3).

Composto 11: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLELLKEL-NH? ÍSEOID NO: 111

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu Lis Glu Leu NH2 (SEQ ID NO: 11);

Dados Físicos: p.f. 172-174 °C [oc]D25 -43,29° (c 0,2, H20) FAB (C179H3iiN55052): [M+H]+4065,8 AAA: Asp, 2,2(2); Glu, 7,7(7); Ser, 1,7(2); His, 2,0(2); Gli, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,3(9); Lis, 5,1(5).

Composto 12: AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH2 ÍSEO ID NO:23)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Asn Tir NH2 (SEQ ID NO: 11); -48-

Dados Físicos: p.f. 178 °C [a]D25 -36,88° (c 0,4, H20) FAB (C182H295N5o05i): [M+H]+4001,6 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,5(6); Ser, 2,7(3); His, 3,1(3); Gli, 1,1(1); Ala, 1,0(1); Arg, 1,0(1); Tir, 0,8(1); Vai, 2,0(2); Fen, 1,0(1); Ile, 0,9 (1); Leu+Nle 8,5(7+2); Lis, 3,1(3).

Composto 13: AVSEIOFXHNLGKHLSSXRRELLEKLLEKLHNY-NH-) tX=Ile SEP ÍD NO:24)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Asn Tir NH2 (SEQID NO:24);

Dados Físicos: p.f. 260 °C [a]D25 -37,02° (c 0,2, H20) FAB (Q84H304N56O49): [M+H]+4084 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 5,5(5); Ser, 2,6(3); His, 3,1(3); Ala, 1,0(1); Gli, 1,1(1); Arg, 3,2(3); Tir, 1,0(1); Vai, 1,0(1); Fen, 1,0(1); Ile, 1,0 (1); Leu 9,0(9); Lis, 3,0(3).

Composto 14: AVSEHOLLHDKGSIODLRRRAEALAHTA-NH, tSEO ID NO:20")

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 5 10 15 -49- Μ

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQID NO:20);

Dados Físicos: p.f. 190-225 °C [a]D25 -56,58° (c 0,36, H20) FAB (C161H272N54049): [M+H]+3747,0 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 4,9(5); Ser, 1,7(2); His, 2,6(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 7,6(7); Arg, 2,8(3); Vai, 1,2(1); Ile, 1,0 (1); Leu 6,6(6); Lis, 1,9(2).

Composto 15: AVSEHOLLHDKGKSIODLARRELLEKLLEKLHTA-NH? (SEP ID NO: 121

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu Lis Tre Ala NH2 (SEQ ID NO: 12);

Dados Físicos: p.f. 170-180 °C [a]D25 -48,19° (c 0,2, H20) FAB (C172H293N5305i): [M+H]+3919,0 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,7(2); His, 3,1(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1) Ala, 3,0(3); Arg, 2,1(2); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,0(8); Lis, 4,4(4).

Composto 16: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRAELLEKLLEKLHTA-NH, (SEP ID NO: 13)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 5 10 15 -50-

Gin Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu Lis Tre Ala NH2 (SEQID NO: 13);

Dados Físicos: p.f. 190-195 °C [a]D25 -50,50° (c 0,4, H20) FAB (Ci72H293N5305i): [M+H]+3919,0 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1) Ala, 3,0(3); Arg, 2,1(2); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,5(8); Lis, 4,2(4).

Composto 17:

AVSEHOLLHDKGKAIODLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH, (SEP ID NO:2H

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:21).

Dados Físicos: p.f. 195-204 °C [<x]D25 -67,11° (c 0,3, H20) FAB (C163H28oN5405o): [M+H]+3796,0 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 2,9(3); Ser, 6,8(7); His, 3,1(3); Gli, 1,2(1); Tre, 1,0(1) Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,2(8); Lis, 2,0(2).

Composto 18: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRAFYDKVAEKLHTA-ΝΠΤ, (SEP ID NO:22) 15 10

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 5 -51 - -51 -

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQID NO:22).

Dados Físicos: p.f. 200-207 °C [<x]D25 -60,26° (c 0,6, H20) FAB (C174H284N5605o): [M+H]+3960,0 AAA: Asp, 2,9(3); Glu, 3,5(4); Ser, 1,4(2); His, 2,6(3); Gli, 0,9(1); Tre, 1,0(1) Ala, 4,0(4); Arg, 3,0(3); Vai, 0,9(1); Ile, 1,9(2); Fen, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 3,6(4); Lis, 4,1(4).

Composto 21: AVSEIOFLHNLGKHLSSLRRRELLEKLLEKLHNY-NH2 (SEQ ID NO:35)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Leu His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Asn Tir NH2 (SEQ ID NO:35).

Dados Físicos: p.f. 148-155 °C Md25 -45,97° (c 0,26, H20) FAB (C184H304N56O49): [M+H]+4084 AAA: Asp, 2,1(2); Glx, 5,0(5); Ser, 2,7(3); His, 3,0(3); Gli, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,1(3); Tir, 0,9(1); Vai, 1,0(1); Fen, 0,9(1); Ile, 0,9(1); Leu, 9,3(9); Lis, 3,2(3). -52- C-cUl

Composto 24: AVSEHOLLHDKGKSIQDLKLKELLEKLLEKLHTA- ML (SEP ID NO:38^

Ala Yal Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Lis Leu Lis Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:38).

Dados Físicos: p.f. 175-182 °C Md25 -49,99° (c 0,47, H20) FAB (Ci75H299N4905i): [M+H]+3906,5 AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 6,5(6); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 9,1(9); Lis, 6,5(6).

Composto 25: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLERLLERLHTA-ML (SEQ ID NO:391

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:38).

Dados Físicos: p.f. 136,5-153,5 °C [a]D25 -32,57° (c 0,13, H20) FAB (C175H3ooN6o05i): [M+H]+4060,8 AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,2(6); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Arg, 5,2(5); Vai, 1,1(1); Ile, 1,1(1); Leu, 8,4 (8); Lis, 2,2(2). -53- 5^·

Composto 26: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLERLLERLHTAP-OH (SEP ID NQ:40!

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala Pro OH (SEQ ID NO:40).

Dados Físicos: p.f. 125,8-127,2 °C [a]D25 -54,62 (c 0,23, H20) FAB (C18oH3o6N6o053): [M+H]+4158,0 AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 6,2(6); Ser, 1,8(2); His, 2,9(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 5,1(5); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,0 (8); Lis, 2,1(2); Pro, 1,1(1).

Composto 27: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLERLLERLHTAGRR-OH (SEP ID NO-41Í

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala Gli Arg Arg OH (SEQ ID NO:41). 35

Dados Físicos: p.f. 106-137,3 °C [oi]d25 -39,55 (c 0,67, H20) FAB (C189H326N68055): [M+H]+4430,5 AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,6(2); His, 2,7(3); Gli, 2,2(2); Tre, 1,0(1); Ala, 1,8(2); Arg, 7,3(7); Vai, 0,8(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,1(8); Lis, 2,1(2).

-54-

Composto 29: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLERLLERLHTY-NHo (SEP ID NO:43)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Tir NH2 (SEQ ID NO:43).

Dados Físicos: p.f. 160-172 °C [cc]D25 -49,85 (c 0,34, H20) FAB (C181H304N56O52): [M+H]+4096,9 AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,6(6); Ser, 1,7(2); His, 3,1(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,0(3); Tir, 0,9(1); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,7 (8); Lis, 4,4(4).

Composto 30: AVSEHOLLHDKGYSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH, (SEQ ID NQ:44t

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Tir Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:44).

Dados Físicos: p.f. 130-171 °C [a]D25 -40,65 (c 0,34, H20) FAB (Ci78H297N55052): [M+H]+4039,4 -55- Μ ΑΑΑ: Asx, 2,0(2); Glx, 5,5(6); Ser, 1,8(2); His, 3,4(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 2,9(3); Tir, 0,8(1); Vai, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,9 (8); Lis, 3,4(3).

Composto 31: AVSEHOLLHDKGCSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH, (SEP 1D ΝΟ·4<;)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Cis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:45).

Dados Físicos: p.f. 140-160 °C [a]D25 -44,48 (c 0,25, H20) FAB (CmH^NssOsiSO: [M+H]+3979 AAA: Asx+Cis 3,0(2+1); Glx, 5,6(6); Ser, 1,7(2); His, 3,0(3); Gli, 1,0(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,5(3); Vai, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5 (8); Lis, 3,3(3).

Composto 32: AVSEHOLLHDKGXSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH? (SEP ID NO:4fi) (X = Cis (CHoCONHÍCHoLNHÍbiotinilol^

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Xaa Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2, (Xaa = Cis (CH2CONH(CH2)2NH(biotinilo))), (SEQ ID NO:46). -56-

* ")C

Dados Físicos: p.f. não determinado [a]D (não determinado) FAB (Cj86H316N59054S2): [M+H]+4306,6 AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,8(3); Gli, 1,0(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3); Vai, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,3 (8); Lis, 3,3(3).

Composto 33: AVSEHQLLHDKGXSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-fflL (SEP ID NO:46) (X - Lis (7-dimetilamino-2-oxo 2H- lbenxopiran-4-acetiloll

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Xaa Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2, (Xaa = Lis (7-dimetilamino-2-oxo 2H-lbenxopiran-4-acetilo) (SEQ ID NO:47).

Dados Físicos: p.f. 135-205°C [a]D25 -26,92 (c 0,104,50% HOAc aq.) FAB (C188H311N57054): [M+H]+4233 AAA: Asx, 1,9 (2); Glx, 6,3(6); Ser, 1,7(2); His, 3,2(3); Gli, 1,0(1); Tre, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,2(3); Vai, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,2 (8); Lis, 4,5(4).

Composto 34: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTAG-OH (SEP ID NO:481

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 10 15 -57-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala GliOH (SEQID NO:48). 35

Dados Físicos: p.f. 92,1-146,6°C [a]D25 -40,76 (c 0,34, H20) FAB (C177H302N56O53): [M+H]+ 4062,0 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,7(6); Ser, 1,8(2); His, 3,0(3); Gli, 2,2(2); Tre, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,8(3); Vai, 1,2(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5 (8); Lis, 4,2(4).

Composto 35: AVSXíHOLLHX,KGKSIOX2LRRRXiLLX,KLLX1KLHA-OH (SEP ID NO:49) (Xi= GIuíOCHt): Xo=Asp (OCH3V)

Ala Vai Ser Xaa, His Gin Leu Leu His Xaa2 Lis Gli Cis Ser Ile 15 10 15

Gin Xaa2Leu Arg Arg Arg Xaa! Leu Leu Xaa, Lis Leu Leu Xaa, Lis 20 25 30

Leu His Ala OH (Xaa, = Glu(OCH3); Xaa2=Asp (=CH3)) (SEQ ID NO:49).

Dados Físicos: p.f. não determinado [a]D25 -21,96 (c 0,132, H20) FAB (C18,H311N55052): [M+H]+4089,0 AAA: Asx 2,1(2); Glx, 6,3(6); Ser, 1,8(2); His, 3,3(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3); Vai, 1,1(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,0 (8); Lis, 4,2(4). -58- AMí-r*·'

C-— U

Composto 36: AVSX1HOLLHX2KGKSIOX2LRRRX,LLX,KLLXiKLHA-OCH, ÍSEO IT>NO:5ffl

(Xi= GluíOCHV): X2=Asp (OCH2H

Ala Vai Ser Xaai His Gin Leu Leu His Xaa2 Lis Gli Cis Ser Ile 15 10 15

Gin Xaa2 Leu Arg Arg Arg Xaaj Leu Leu Xaai Lis Leu Leu Xaaj Lis 20 25 30

Leu His Ala OH (Xaai = Glu(OCH3); Xaa2=Asp (=CH3)) (SEQID NO:50).

Dados Físicos: p.f. não determinado [a]D25 -46,80 (c 0,07, H20) FAB (C181H3i3N55052): [M+H]+4103 AAA: Asx 2,1(2); Glx, 6,2(6); Ser, 1,4(2); His, 3,0(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,1(1); Ala, 1,7 (2); Arg, 3,2(3); Vai, 0,6(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,0 (8); Lis, 4,1(4).

Composto 38: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTAP-OH rSEO ID NO:52)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Pro OH (SEQ ID NO:52). 35

Dados Físicos: p.f. 152,1-186,5°C [a]D25 -55,91 (c 0,33, H20) FAB (C180H306N56O53): [M+H]+ 4102,6 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,6(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,9(3); Vai, 1,2(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,7 (8); Lis, 4,3(4). -59-

Composto 39: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTP-OH (SEP ID NO:53t

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre ProOH (SEQ ID NO:53).

Dados Físicos: p.f. 120-148,2°C [<x]D25 -52,78 (c 0,47, H20) FAB (C177H3oiN55052): [M+H]+4031,0 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,5(6); Ser, 1,8(2); His, 2,9(3); Gli, 1,0(1); Tre, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 2,9(3); Vai, 1,2(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lis, 3,6(3); Pro, 0,9(1).

Composto 40: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTP-NH? tSEQ ID NO:543

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Pro NH2 (SEQ ID NO:54).

Dados Físicos: p.f. 133,9-155,1°C [a]D25 -54,22 (c 0,37, H20) FAB (C177H302N56O51): [M+H]+4030,7 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,5(6); Ser, 1,9(2); His, 2,9(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 0,9(1); Arg, 2,8(3); Vai, 1,2(1); Ile, 1,1(1); Leu, 7,8(8); Lis, 4,2(4); Pro, 0,9(1).

Composto 41: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHP-ML ÍSEQ TD NO:55t

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Pro NH2 (SEQID NO:55).

Dados Físicos: p.f. 142,8-166,1°C Md25 -53,80 (c 0,38, H20) FAB (C173H295N55049): [M+H]+3929 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,7(6); Ser, 1,8(2); His, 3,0(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 0,9(1); Arg, 2,8(3); Vai, 1,2(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,4(8); Lis, 4,4(4); Pro, 0,9(1).

Composto 42: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLP-NH, (SEP ID NO·56)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu Pro NH2 (SEQ ID NO:56). -61 -

Dados Físicos: p.f. 161,0-177,0°C [a]D25 -61,97 (c 0,19, H20) FAB (C167H288N52048): [M+H]+3792,0 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,9(2); His, 2,1(2); Gli, 1,1(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0 (3); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,9(8); Lis, 4,3(4); Pro, 0,9(1).

Composto 43: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTRSAW-OH ÍSEO TD NO:57t

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Arg Ser Ala Trp OH (SEQID NO:57). 35

Dados Físicos: p.f. 181-202°C [a]D25 -45,14 (c 0,19, H20) FAB (C195H326N62056): [M+H]+4435,2 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,8(6); Ser, 2,8(3); His, 2,8(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 3,7(4); Vai, 1,2(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,5(8); Lis, 4,3(4); Trp, 0,9(1).

Composto 44: AVSEHOLLHDRGRSIODLRRREI \ ERILERLHTAGRRTRSAW-QH (SEQ ID NO:58í

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30 -62-

Leu His Tre Arg Gli Arg Arg Tre Arg Ser Ala Trp OH (SEQID NO:58). 35 40

Dados Físicos: p.f. 130-132,2°C [a]D25 -46,66 (c 0,195, H20) FAB (C2i6H365N81062): [M+H]+ 5088,8 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 6,0(6); Ser, 2,7(3); His, 3,0(3); Gli, 2,2(2); Tre, 2,1(2); Ala, 3,0(3); Arg, 10,5(10); Vai, 0,9(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,2(8); Trp, 1,0(1).

Composto 45: AVSEHOLLHDRGRSIODLRRRELLERLLERLHTAGRRTRSAW-m (SEQ IDNO:59)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Arg Gli Arg Arg Tre Arg Ser Ala Trp NH2 (SEQ ID NO:58). 35 40

Dados Físicos: p.f. 158-174°C [a]D25 -43,57 (c 0,53, H20) FAB (C216H366N82061): [M+H]+ 5087,4 AAA: Asx 1,9(2); Glx, 5,6(6); Ser, 2,6(3); His, 3,3(3); Gli, 2,1(2); Tre, 2,0(2); Ala, 2,9(3); Arg, 10,1(10); Vai, 0,9(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,3(8); Trp, 1,1(1).

Composto 46: AVSEHOLLHDRGXSIODLRRRFLLERLIFRLHTAGRRTRSAW-OH ÍSEO ID NO:6Ql IX = Lis fdi-hidrocinamoílo) 10 15

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Xaa Ser Ile 1 5 L-* -63-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Arg Gli Arg Arg Tre Arg Ser Ala Trp OH (Xaa = Lis (di-35 40 hidrocinamoil), (SEQID NO:60).

Dados Físicos: p.f. 165,4-175,2°C [a]D25 -40,43 (c 0,20, H20) FAB (C225H374N8o062): [M+H]+ 5191 AAA: Asx 2,1(2); Glx, 6,3(6); Ser, 2,8(3); His, 3,2(3); Gli, 2,1(2); Tre, 2,0(2); Ala, 3,2(3); Arg, 9,9(9); Vai, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,6(8); Lis, 1,1(1); Trp, 1,1(1).

Composto 47: AVSEIOFXHNLGKHLSSXTRSAWLRKKLODVHNY-NH? (SEP ID NO:611 ÍX=norleucina)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Nle Tre Arg Ser Ala Trp Leu Arg Lis Lis Leu Gin Asp 20 25 30

Vai His Asn Tir NH2 (SEQ ID NO:61).

Dados Físicos: p.f. 140-160°C [oi]d25 -56,88 (c 0,16, H20) FAB (C18oH287N55058): [M+H]+3989,8 AAA: Asx 3,0(3); Glx, 2,9(3); Ser, 3,7(4); His, 2,8(3); Gli, 1,1(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,9(2); Arg, 2,0(2); Tir, 1,0(1); Vai, 1,7(2); Fen, 0,9(1); Ile, 0,9(1); Leu+Nle, 5,8(2+4); Lis, 3,4(3); Trp, 1,1(1). i *«·> -64-

Composto 48: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTMA-NH? fSEO ID NO:62t

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Met Ala NH2 (SEQ ID NO:62).

Dados Físicos: p.f. 140-210°C [a]D25 -47,75 (c 0,178, H20) FAB (QsoHsoçNstOszSj): [M+H]+4135,0 AAA: Asx 2,3(2); Glx, 6,6(6); Ser, 1,4(2); His, 3,2(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3); Vai, 0,9(1); Met 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,8 (8); Lis, 4,4(4).

Composto 50: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRFFLEKLLEKLHTA-NHo (SEP IDNO:641

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Fen Fen Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:64).

Dados Físicos: p.f. 136,5-156,8°C [a]D25 -49,89 (c 0,24, H20) FAB (Q82H300N56O49): [M+H]+4056,0 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 5,0(5); Ser, 1,9(2); His, 3,3(3); Gli, 1,0(1); Tre, 1,0(1); -65-

Ala, 2,1(2); Arg, 3,1(3); Vai, 1,0(1); Fen, 2,0(2); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,2 (7); Lis, 3,5(4).

Composto 51: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLHKLLEKLHTA-NFL (SEP ID NO:65)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu His Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:65).

Dados Físicos: p.f. 80,7-141,0°C [ct]D25 -55,38 (c 0,23, H20) FAB (C176H3ooN58049): [M+H]+ 4012,8 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 4,9(5); Ser, 1,8(2); His, 4,3(4); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,1(3); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,1 (8); Lis, 3,9(4).

Composto 52: AVSEHQLLHDKGKSIODLRRRELLEHLLEKLHTA-NH? (SEP ID NOrfifi)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:66).

[a]D25 -50,72 (c 0,45, H20)

Dados Físicos: p.f. 134,3-157,9°C -66- FAB (C175H295N5705,): [M+H]+ 4012,8 AAA: Asx 2,1(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,8(2); His, 4,2(4); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,0(3); Vai, 1,1(1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,1 (8); Lis, 3,1(3).

Composto 53: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLIAKLHTA-NFL tSF.O TD NO:67)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Ile Ala Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala NH2 (SEQID NO:67).

Dados Físicos: p.f. 142,7-159,8°C [a]D25 -54,01 (c 0,21, H20) FAB (C173H298N56049): [M+H]+ 3946,0 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 4,9(5); Ser, 1,8(2); His, 3,1(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 3,1(3); Arg, 3,1(3); Vai, 1,0(1); Ile, 1,9 (2); Leu, 7,0 (7); Lis, 4,3(4).

Composto 54: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEEIHTA-NH, (SEP ID ΝΟή^ι

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Glu 20 25 30

Ile His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:68). 25 -67-

Dados Físicos: p.f. 138-185°C [a]D25 -50,17 (c 0,14, H20) FAB (Ci74H295N55O53): [M+H]+ 4005 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 7,1(7); Ser, 1,7(2); His, 2,8(3); Gli, 1,0(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Arg, 3,1(3); Vai, 1,1(1); Ile, 1,7 (2); Leu, 7,1 (7); Lis, 2,7(3).

Composto 58: AVSEHQLLHDKGKSI0DLRRRELLEKLLEKLHTRSAW-NH2 rSEQ ID NO:721

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Arg Ser Ala Trp NH2 (SEQ ID NO:72). 35

Dados Físicos: p.f. 158-163°C [ct]D25 -46,06 (c 0,17, H20) FAB (C195H327N63055): [M+H]+ 4434,8 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,5(6); Ser, 2,7(3); His, 3,1(3); Gli, 1,0(1); Ala, 1,8(2); Arg, 4,0 (4); Tre, 0,9(1); Vai, 0,9(1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lis, 3,9(4); Trp, 1,0(1).

Composto 59: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTRSAX-OH (SEP ID NO:731 X = Nal (2) = 3-(2-naftilVL-alanina)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 C* ________ l ^ -68-

Leu His Tre Arg Ser Ala 3-(2-naftil)-L-alanina-OH (SEQ ID NO:72). 35

Dados Físicos: p.f. 156-162°C [a]D25 -44,44 (c 0,189, H20) FAB (C197H328N62055): [M+H]+ 4445,6 AAA: Asx 2,1(2); Glx, 5,5(6); Ser, 2,8(3); His, 2,9(3); Gli, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 4,0 (4); Tre, 0,9(1); Vai, 1,0(1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lis, 4,2(4); Nal, 1,1(1).

Composto 60: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTASAW-OH (SEP ID NO:74)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Ser Ala Trp OH (SEQ ID NO:74). 35

Dados Físicos: p.f. 159-164°C [a]D25 -50,94 (c 0,29, H20) FAB (C192H32oN6o055): [M+H]+ 4349,0 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,6(6); Ser, 2,7(3); His, 3,2(3); Gli, 1,0(1); Ala, 3,1(3); Arg, 2,8 (3); Tre, 1,0(1); Vai, 1,1(1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,6(8); Lis, 4,0(4); Trp, 1,0(1).

Composto 61: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTAEIRA-OH tSEO ID NO:75) 10 15

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 5 -69-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Glu Ile Arg Ala OH (SEQID NO:75). 35

Dados Físicos: p.f. 155-210°C [a]D25 -46,15 (c 0,12, H20) FAB (C195H334N62058): [M+H]+ 4475,8 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 6,9(7); Ser, 1,7(2); His, 3,2(3); Gli, 1,1(1); Ala, 3,1(3); Arg, 4,0(4); Tre, 0,9(1); Vai, 1,1(1); Ile, 1,9 (2); Leu, 8,1(8); Lis, 4,1(4).

Composto 62: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTAEIR-OH ÍSEO ID NO:76)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Glu Ile Arg OH (SEQ ID NO:76). 35

Dados Físicos: p.f. 186-218°C [a]D25 -52,73 (c 0,265, H20) FAB (C192H329N61O57): [M+H]+ 4404,4 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 6,6(7); Ser, 1,9(2); His, 3,4(3); Gli, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,8(4); Tre, 1,0(1); Vai, 1,1(1); Ile, 1,7(2); Leu, 7,9(8); Lis, 4,0(4).

Composto 63: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTAEI-OH tSEO ID NO:77)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 5 10 15 ο*·' -70-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Glu Ile OH (SEQID NO:77). 35

Dados Físicos: p.f. 169-205°C [a]D25 -50,78 (c 0,51, H20) FAB (C186H3i7N57056): [M+H]+ 4248,0 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 6,8(7); Ser, 1,8(2); His, 3,3(3); Gli, 1,0(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,0(3); Tre, 1,0(1); Vai, 1,0(1); Ile, 1,8(2); Leu, 7,8(8); Lis, 3,6(4).

Composto 64: AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTAE-OH (SEP ID NO-7R)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre Ala Glu OH (SEQ ID NO:78). 35

Dados Físicos: p.f. 199-205°C [a]D25 -52,47 (c 0,41, H20) FAB (C18oH3o6N56055): [M+H]+ 4135,0 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 6,6(7); Ser, 1,9(2); His, 3,3(3); Gli, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 2,9(3); Tre, 1,0(1); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,2(8); Lis, 3,8(4).

Composto 66: SEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH, (SEP ID NO-SO) Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile Gin Asp 1 5 10 15 -71- -71- >*WeA^ 1 Μ

Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis Leu His 20 25 30

Tre Ala NH2 (SEQID NO: 80).

Dados Físicos: p.f. 134,2°C [a]D25 -48,12 (c 0,36, H20) FAB (C167H286N54O49): [M+H]+ 3834,4 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 5,7(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3); Gli, 1,0(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,0(1); Arg, 2,8(3); Ile, 0,9(1); Leu, 7,4(8); Lis, 4,3(4).

Composto 67:

LLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH, (SEP ID NO:8D

Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15

Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis Leu His Tre Ala NH2 20 25 (SEQ IDNO:81).

Dados Físicos: p.f. 128,5-184,5°C [oc]d25 —6,53 (c 0,69, MeOH) FAB (Ci48H259N4704i): [M+H]+ 3353 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 4,1(4); Ser, 0,9(1); His, 2,1(2); Gli, 1,0(1); Tre, 0,9(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Ile, 1,0(1); Leu, 8,1(8); Lis, 4,2(4).

Composto 68: T T HDKCtKSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2 (SEP ID NO:82)

Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu 1 5 10 15 -72-

Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis Leu His Tre Ala NH2 20 25 (SEQ ID NO:82).

Dados Físicos: p.f. 165-210°C [afo25 -36,05 (c 0,12,) H20 FAB (C148H259N4704i): [M+H]+ 3239,0 AAA: Asx 2,0(2); Glx, 3,9(4); Ser, 0,9(1); His, 1,9(2); Gli, 1,0(1); Tre, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 2,9(3); Ile, 0,9 (1); Leu, 6,8(7); Lis, 4,2(4).

Composto 69: SEHOLLHDRGRSIODLRRRELLERLLERLHAGRRTRSAW-OH (SEP ID NO:831

Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile Gin Asp 15 10 15

Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Lis Leu His 20 25 ' 30

Leu His Arg Gli Arg Arg Tre Arg Ser AlaTrp OH (SEQ ID NO:83) 35 40

Dados Físicos: p.f. 150-210°C Md25 -18,0 (c 0,64, H20) FAB (C2o8H35iN7906o): [M+H]+4918,6 AAA: Asx 2,2(2); Glx, 6,2(6); Ser, 2,8(3); His, 3,1(3); Gli, 2,2(2); Tre, 2,2(2); Ala, 2,2(2); Arg, 10,4(10); Ile, 1,0(1); Leu, 8,0(8); Tip, 1,1(1).

Composto 70: LLHDRGRSIODLRRRELLERLLERLHAGRRTRSAW-OH (SF.O ID NO:84)

Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 -73-

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Lis Leu His Leu His Arg Gli 20 25 30

Arg Arg Tre Arg Ser Ala Trp OH (SEQID NO:83) 35

Dados Físicos: p.f. 150-210°C [a]D25 -41,70 (c 0,36, H20) FAB (CiÍ59H324N72O52): [M+H]+4437,14 AAA: Asx 2,1(2); Glx, 4,1(4); Ser, 1,9(2); His, 2,0(2); Gli, 2,1(2); Tre, 2,0(2); Ala, 2,1(2); Arg, 9,7(10); Ile, 0,9(1); Leu, 7,4(8). O análogo com a cadeia lateral cíclica (Composto 57) foi sintetizado como atrás excepto lS^-Boc-N-Fmoc-Lis e N“-Boc-N-Fmoc-Asp serem colocados nas posições 13 e 17, respectivamente. Após estar completa a síntese dos aminoácidos Boc, a resina foi tratada com 20% de piperidina em DMF à temperatura ambiente durante 30 minutos. A resina foi filtrada e lavada com DMF, MeOH e CH2C12. A resina (1,1 g) foi suspensa em 10 ml de DMF contendo 250 mg de PyBOP. O pH foi ajustado a 8-9 com DIEA e a resina agitada durante 1 hora. A resina foi filtrada, lavada com DMF e CH2C12, depois ressuspensa em DMF. A acoplagem foi repetida usando 125 mg de PyBOP. A resina foi filtrada, lavada com DMF, MeOH e CH2C12 e seca. A resina foi então tratada com HF e o peptídeo purificado conforme referido atrás.

Composto 57: (comparativo) AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTA-NH, (SEP ID NO:711

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

J -74-

Leu His Tre Ala NH2 (SEQ IDN0:71).

Dados Físicos: p.f. 142,5-163,5°C [<x]D25 -34,31 (c 0,17, H20) FAB (C175H298N56C>5o): [M+H]+ 3986,4 AAA: Asx 1,9(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,8(2); His, 3,2(3); Gli, 1,1(1); Ala, 2,0(2); Arg, 3,0 (3); Tre, 1,0(1); Vai, 1,1(1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lis, 4,0(4).

EXEMPLO II O Composto 1 [Met34, Ala35], AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRREL LEK-LLEKLHTMA-NH2, (SEQ ID NO:25), foi preparado e purificado seguindo os processos do Exemplo I. Este polipeptídeo foi convertido na homo-serina lactona como se segue. O peptídeo purificado (160 mg) foi dissolvido em ácido fórmico a 44% (4 ml). Esta solução foi combinada com uma solução previamente misturada de brometo de cianogénio (700 mg) e fenol (1,6 mg) em ácido fórmico a 44% (4 ml) a 0°C. A solução foi agitada a 0°C durante 2 horas e à temperatura ambiente durante 2 hr. A formação do produto foi controlada por HPLC (Vydac® C-18, 300 Â, 4,6 x 250 mm, fluxo de 1,2 ml/min, gradiente de 25-45% de acetonitrilo em 0,1% de TF A ao longo de 10 min). A reacção ficou completa ao fim de 4 hr. Metade da amostra foi concentrada e purificada por RP-HPLC (Vydac® C-18, 300 Â, 4,6 x 250 mm, gradiente de 25-45% de acetonitrilo em 0,1% de TF A). As fracções do peptídeo homo-serina lactona foram reunidas e liofilizadas para dar 28 mg de sólido branco de >95% de pureza, Composto 4.

Composto 4 AVSEHOLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTX (X = hSerlac. SEP ID NO:91

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 5 10 15 -75-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Tre hSerlac (SEQIDNO:9).

Dados Físicos: p.f. 138-142°C [a]D25 -50,66° (c 0,1, H20) FAB (C j 76H299N55O52) 1 [M+H]+ 4017,61 AAA: Asp 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,8(2); His, 3,0(3); Tre, 1,1(1); Ala, 1,1(1); Arg, 2,7(3); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,2(8); Lis, 3,8(4); Gli 1,09(1); hSer, 1,09(1).

De forma semelhante, o Composto 65 foi preparado de acordo com este processo.

Composto 65: (comparativo) AVSEIOFX1HNKGKHLSSXlERVEWLRKKLODVHNX2 (SEP ID NO:79") (X2= L-norleucina: X2= homo-serina lactona)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Lis Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lis Lis Leu Gin Asp 20 25 30

Leu His Tre hSerlac (SEQ ID NO:79).

Dados Físicos: p.f. 166-176°C [a]D25 -52,22° (c 0,25, H20) FAB (C180H288N5405o): [M+H]+ 4008,6 AAA: Asp 3,1(3); Glx, 4,8(5); Ser, 2,9(3); His, 2,9(3); Gli, 1,1(1); Ala, 1,1(1); Arg, 2,0(2); Vai, 2,7(3); Fen, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu+Nle 5,9 (4+2); Lis, 2,8(3). -76-

EXEMPLOIII

Para preparar a amida de homo-serina, o análogo bruto hSerlactona,

Composto 4, foi concentrado e tratado com 25 ml de NH3 saturado com metanol. A solução foi agitada a 0°C durante 2 horas e à temperatura ambiente durante 16 horas. A reacção foi controlada por HPLC (Vydac® C-18, 300 Â, 4,6 x 250 mm, fluxo de 1,2 ml/min, gradiente de 20-45% de acetonitrilo em 0,1% de TF A) e estava completa ao fim de 8 horas. A solução foi concentrada e purificada por RP-HPLC preparativa (Vydac® C-18, 300 Â, 4,6 x 250 mm, gradiente de 25-45% de acetonitrilo em 0,1% de TF A). As fracções contendo o peptídeo amida de homo-serina foram reunidas e liofilizadas para dar 30 mg de sólido branco de >98% de pureza, Composto 3.

Composto 3 AVSEHQLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTX-NH, (X = hSer. SEP ID NO:8) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 5 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 Leu His Tre hSer NH2 (SEQ ID NO:8). 25 30

Dados Físicos: p.f. 138-142°C [a]D25 -45,97° (c 0,25, H20) FAB (Ci76H302N56O52): [M+H]+ 4033,9 AAA: Asp 2,1(2); Glu, 6,1(6); Ser, 1,6(2); His, 2,8(3); Gli, 0,97(1); hSer, 0,97(1); Tir, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 2,9(3); Vai, 1,0(1); Ile, 1,0(1); Leu, 7,6(8); Lis, 3,9(4). -77- C.—'-l·'1

De forma semelhante, os Compostos 22, 23 e 28 foram preparados seguindo este processo.

Composto 22:

AVSEIOFLHNLGKHLSSLRRRELLEKLLEKLHNX-NH2 (SEP ID NO:36I (X = Homo-serinal

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Leu His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Asn hSer NH2 (SEQ ID NO:36).

Dados Físicos: p.f. 69,4-128°C [a]D25 -43,93° (c 0,15, H20) FAB (C179H302N56O49): [M+H]+ 4022,9 AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 4,9(5); Ser, 2,6(3); His, 2,8(3); Gli, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Vai, 1,0(1); Fen, 1,0(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,8(9); Lis, 3,4(3).

Composto 23: AVSEIOFLHNKGKHLSSLRRRELLEKLLEKLHNX-NH? ÍSEO ID NO:37) (X = Homo-serinal

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Leu His Asn Lis Gli Lis His Leu 15 10 15

Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30

Leu His Asn hSer NH2 (SEQ ID NO:37). -78- C._-Λ.Ι Vi

Dados Físicos: p.f. 87,1-142,1°C [a]D25 -52,14° (c 0,41, H20) FAB (C179H303N57O49 ): [M+H]+ 4038 AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 4,9(5); Ser, 2,7(3); His, 2,8(3); Gli, 1,0(1); hSer, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Vai, 1,1(1); Fen, 0,9(1); Ile, 0,9(1); Leu, 7,9(8); Lis, 3,7(4).

Composto 28 AVSEHOFLLHDKGKSIODLRRRELLERLLERLHTAGRRX-ML (SEP ID NO:42! (X - Homo-serina)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Tre Ala Gli Arg Arg hSer NH2 (SEQ ID NO:42). 35

Dados Físicos: p.f. 80°C [<x]D25 -48,64° (c 0,09, H20) FAB (C193H334N7o056): [M+H]+4530,0 AAA: Asx, 2,2(2); Glx, 6,1(6); Ser, 1,7(2); His, 3,0 (3); Gli, 1,9(2); hSer, 1,0(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,1(2); Arg, 7,2(7); Vai, 0,8(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,4(8); Lis, 2,1(2).

As alquilamidas de homo-serina foram preparadas de forma semelhante a partir da homo-serina lactona através da sua dissolução em DMF contendo um excesso da correspondente alquilamina. Após agitação à temperatura ambiente durante vários dias (a reacção foi controlada por HPLC analítica) a mistura foi evaporada até secagem e o peptídeo purificado por HPLC preparativa. Os compostos 55 e 56 são representativos de homo-serina alquilamidas.

Composto 55: AVSEHOFLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTX-NHCH^CH. (SEOIDNO:691 (X = Homo-serina)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 21 25 30

Leu His Tre hSer NHCH2CH3(SEQ ID NO:69)

Dados Físicos: p.f. (não determinado) [a]D25 (não determinado) FAB (C178H306N56O52): [M+H]+4063,0 AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,8(6); Ser, 1,7(2); His, 3,1(3); Gli, 0,9(l);Tre, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,0(3); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,4(8); Lis, 3,7(4); hSer, 0,9(1).

Composto 56: AVSEHOFLLHDKGKSIODLRRREri,EKLLEKLHIX-NHCH,CHzCfHfrSEQIDNQ:70) (X - Homo-serinal

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 22 25 30

Leu His Tre hSer NHCH2CH3C6H5 (SEQ ID NO:70) -80- Μ

Dados Físicos: p.f. (não determinado) [a]D25 (não determinado) FAB (C178H306N56O52): [M+H]+4138,8 AAA: Asx, 2,0(2); Glx, 5,9(6); Ser, 1,7(2); His, 2,9(3); Gli, 0,9(l);Tre, 1,0(1); Ala, 0,9(1); Arg, 3,0(3); Vai, 1,1(1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0(8); Lis, 4,1(2); hSer, 0,9(1).

EXEMPLO IV O sal de césio do ácido N“-Boc-NY-Fmoc-L-2,4-diaminobutírico foi ligado a resina Merrifield (DMF, 50°C, 48 horas) e usado numa síntese em fase sólida em lugar da resina Boc-Ala como no Exemplo I. Quando completada a síntese, o peptídeo foi tratado com 20% de piperidina em DMF à temperatura ambiente durante 30 minutos para remover o grupo protector da cadeia lateral Fmoc. O peptídeo protegido cicliza espontaneamente para dar a lactama, clivando-se a si próprio da resina. A solução foi filtrada da resina e evaporada sob vácuo para deixar um óleo. O resíduo foi tratado com HF líquido como no Exemplo I para dar o peptídeo bruto desprotegido. O peptídeo foi tratado e purificado como no Exemplo I.

Composto 49: AVSEHOFLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTX ÍSEO ID NO:631 (X = L-2.4-diaminobutiril lactama)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 23 25 30

Leu His Tre 1-2,4-diaminobutiril lactama (SEQ ID NO:63)

-81 -

Dados Físicos: p.f. 161-181°C [a]D25 48,38° (c 0,25, H20) FAB (CneHaooNseOsi): [M+H]+4016,8 AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 6,3(6); Ser, 1,7(2); His, 3,3(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,0(1); Ala, 2,1(1); Arg, 2,9(3); Vai, 0,9(1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0(8); Lis, 3,8(4).

EXEMPLO V

Uma solução aquosa do análogo homo-serina lactona do Exemplo II foi tratada com estearase de fígado de porco (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). A hidrólise da lactona para dar a homo-serina C-terminal foi controlada por HPLC analítica. Quando a hidrólise foi considerada completa, o material foi purificado por HPLC preparativa como no Exemplo I.

Composto 37:

AVSEHOFLLHDKGKSIODLRRRELLEKLLEKLHTX-OH (SEP ID NO:5U (X =homo-serina)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 24 25 30

Leu His Tre hSer OH (SEQ ID NO:51)

Dados Físicos: p.f. (não determinado) [a]D25 (não determinado) FAB (C176H3ooN55053): [M+H]+ 4035,1 AAA: Asx, 2,1(2); Glx, 5,9(6); Ser, 2,0(2); His, 3,1(3); Gli, 0,8(1); hSer, 0,8(1); Tre, 1,0(1); Ala, 1,0(1); Arg, 3,0(3); Vai, 1,3(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,1(8); Lis, 3,8(4).

-82-

EXEMPLO VI

Seguindo o Exemplo I, o complexo peptídeo protegido-resina BocAVS (Bzl) E (Obz) H (Bom)QLLHD (Obzl) R (Ts) GR (Ts) S (Bzl) IQD (Obz) - LR (Ts) E (Obzl) R (Ts) LLK (Fmoc) R (Ts) LH (Bom)9 T (Bzl) A- O-PAM foi sintetizado numa escala de 0,35 mmol. Todos os grupos Na foram protegidos com t-butoxicarbonilo (Boc); os grupos protectores da cadeia lateral são como indicados. Após completada a síntese, o peptídeo e resina foram tratados com 50 ml de piperidina a 20% em dimetilformamida (DMF), à temperatura ambiente, durante 30 minutos para remover o grupo protector fluorenilmetoxi-carbonilo (Fmoc) da lisina. A resina foi lavada sucessivamente com DMF, MeOH, CH2CI2 e seca para dar 1,6 g de peptídeo parcialmente protegido. 0,8 g (0,175 mmol) do peptídeo parcialmente protegido foi acilado na lisina com 0,44 g (0,3 mmol) do ácido metoxidi(etilenoxi)acético [PEG(2)CH2COOH] na presença de 0,16 g (0,3 mmol) de hexafluorofosfato de benzotriazoliloxi-tris(pirrolidino)fosfónio (PyBop) e 0,067 g (0,525 mmol) de diisopropiletilamina (DIEA) em 20 ml de DMF à temperatura ambiente durante 5 horas. Após 5 horas a resina foi filtrada e lavada com DMF, MeOH e CH2CI2. O passo de acilação foi repetido duas vezes até se obter um resultado de ninidrina negativo na resina.O peptídeo final foi clivado da resina com remoção dos grupos protectores das cadeias laterais e purificação como no Exemplo I; obteve-se 100 mg do Composto 19.

Composto 19 AVSEHOFLLHDRGRSIODLRRRELLERLLKRLHTA-OH (SEP ID NO: 181 CH30(CH2CH20)2CH2C=0 10 15

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 1 5 -83-

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 25

Lis(COCH2PEG2) Arg Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO; 18) 30

Dados Físicos: p.f. 145-195°C Md25 -44,60° (c 0,2, H20) FAB (C183H316N64054): [M+H]+ 4176,2 AAA: Asp, 2,1(2); Glu, 5,0(5); Ser, 1,6(2); His, 2,9(3); Gli, 0,9(1); Tre, 1,9(2); Arg, 7,1(7); Vai, 1,1(1); Ile, 1,0(1); Leu, 8,0(8); Lis, 0,9(1).

EXEMPLO VII

Sintetizou-se o peptídeo, clivou-se e purificou-se como no Exemplo IV excepto usar-se 2-metoxipoli(etilenoxi)acético [PEG(5000)CH2C02H] como agente de acilação. 0,8 g (0,175 mmol) de peptídeo parcialmente protegido deram 300 mg do Composto 20 puro.

Composto 20 AVSEHOFLLHDRGRSIODLRRRELLERLLKRLHTA-OH ÍSEO ID NO: 19) CH30(CH2CH20), 10ch2c=o

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 25

Lis(COCH2PEG5000) Arg Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO; 19) 30

Dados Físicos: p.f. 150°C [ot]o25 -22,95° (c 0,2, HO Ac 50% aq.) -84- \ AAA: Asp, 2,0(2); Glu, 4,8 (5); Ser, 1,6(2); His, 2,6(3); Gli, 1,1(1); Tre, 1,1(1); Arg, 7,3(7); Vai, 0,8(1); Ile, 0,9(1); Leu, 8,3(8); Lis, 1,1(1); Ala, 1,8(2).

EXEMPLO VIII Síntese do gene do análogo hPTHrpO-34)

Um gene sintético codificador do análogo hPTHrp (1-34) Composto 4 (SEQ ID NO:9) foi projectado tendo a sequência nucleotídica e os locais de enzimas de restricção mostrados na Figura 1. Os oligodesoxinucleótidos necessários foram preparados num sintetizador de DNA (Milligen/Biosearch) usando o processo de fosforamideto de Sinha, et al., Nucleic Acid Research 12, 4539-4557 (1984). Após desprotecção, os oligonucleótidos brutos foram purificados por electroforese em gel em géis preparativos de 15% de poliacrilamida. Os oligonucleótidos foram localizados com UV, removidos do gel, libertos do sal em cassetes Waters cl8 Sep-pak® e liofilizados. A amplificação via reacção em cadeia com polimerase (PCR) foi realizada num termociclador Perkin-Elmer Cetus, com 25 ciclos de: 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 2 minutos e 72°C durante 3 minutos, usando reagentes, incluindo polimerase Taq, do estojo de amplificação de DNA “GeneAmp" (Perkin-Elmer Cetus).

Dois oligonucleótidos sobreponíveis, um 88mero (2 pg), PTH3, (SEQ ID NO:31) CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC ATG GCT GTT TCT GAA CAT 42

Met Ala Vai Ser Glu His 1 CAG CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA TCG ATT CAA GAT CTG 81 -85-

Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile Gin Asp Leu 5 10 15 AGA CGT C 88 Arg Arg 20 e outro 90mero (2 pg) complementar da cadeia codificadora, PTH4, (SEQ ID NO:32): CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTAGA CAT AGT ATG CAG CTT 42

Met Tre His Leu Lis 30 TTC AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC 82 Glu Leu Leu Lis Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp 25 20 TTG AAT CG 90,

Gin Ile 15 foram preparados como sequência de DNA molde para o gene do análogo de hPTHrp (1-34). Utilizando as duas sequências iniciadoras flanqueantes, PTHPCR1: CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG (SEQ ID NO:33) e PTHPCR2: CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC (SEQ ID NO:34), a totalidade do gene foi amplificado por PCR. Os produtos de DNA amplificados foram purificados por electroforese em gel num gel de 4% de agarose NuSieve®. A banda contendo o gene sintético do análogo hPTHrp (1-34), aproximadamente 150 pares de bases de comprimento, foi removido do gel e aproximadamente 200 ng de DNA isolado por extracção do DNA do gel com vidro Elu-Quick® (Schleicher & Schuell, Keene, NH). -86-

EXEMPLO IX

Clonagem molecular de um gene análogo de hPTHrp (1-34)

Para subclonar o gene do análogo hPTHrp do Exemplo VI, isolou-se 200 ng do DNA amplificado e cortou-se com as enzimas de restrição HindIII e Sac II. Como se mostra na Figura 2, o DNA foi ligado a 2 pg de plasmídeo

<5 O

TrpLE 18 Prot (Ile , Pro ) previamente clivado com HindIII e SacII. O plasmídeo resultante, TrpLE 18 hPTHrp (1-34) 1, contendo uma cópia do análogo do gene hPTHrp (1-34) foi então usado para transformar células competentes E. coli HB 101 (CLONTECH, Paio Alto, CA). Os transformantes foram sujeitos a análise por PCR para verificar a inserção. As colónias de células transformadas foram seleccionadas e fervidas em 200 μΐ de água durante 5 minutos; 2 μΐ foram sujeitos a PCR com duas sequências iniciadoras flanqueando o inserto. O produto de PCR foi então analisado num gel de 1% de agarose para confirmar a presença de uma cópia do inserto do gene hPTHrp (1-34). A construção TrpLE 18 hPTHrp (1-34) 1 foi então verificada por sequenciação do DNA num sequenciador de DNA automático (Applied Biosystems Model 373a, Foster City, CA) usando o estojo comercial Dye Deoxy Terminator Sequencing.

EXEMPLO X

Construção de um vector Trp LE 18 contendo múltiplas cópias do gene do análogo hPTHrp (1-34)

Perto do começo e no final da sequência do gene do análogo hPTHrp (1-34) estão situados locais de restrição únicos Nhel e Xbal. Estes dois locais, que reconhecem sequências diferentes, mas que produzem extremos -87-coesivos de cadeia simples idênticos, permitem a construção de múltiplas cópias do gene hPTHrp (1-34) dentro do vector Trp LE 18. A estratégia para a construção de sequências repetidas de hPTHrp (1-34) em tandem está descrita na Figura 3. Em reacções separadas, 5 pg do plasmídeo Trp LE 18hPTHrp (1-34) contendo uma única cópia do gene foi clivado com BamHI + Nhel e Xbal + BamHI. A partir de cada uma das digestões, cerca de 300 ng do fragmento contendo o gene do análogo hPTHrp (1-34) foi isolado. Estes dois fragmentos foram misturados e ligados para formar o plasmídeo Trp LEI 8 hPTHrp (1-34) 2. Este plasmídeo foi usado para transformar células competentes E, coli HB 101. A análise dos produtos de PCR transformados num gel de 1% de agarose foi usada para determinar a presença de duas cópias do inserto do gene hPTHrp (1-34). TrpLE 18 hPTHrp(l-34)2 contendo duas cópias do gene foi então confirmada por sequenciação de DNA. A fusão correcta dos dois genes hPTHrp(l-34) resulta na eliminação dos locias Nhel e Xbal na junção. Isto toma únicos os restantes locais Xbal e Nhel que flanqueiam os genes em tandem.

Através da repetição deste processo foi construído o plasmídeo final TrpLE 18 hPTHrp( 1-34)4 contendo quatro cópias do gene hPTHrp(l-34), como se mostra na Figura 4. Encontrou-se que a sequência de TrpLE 18 hPTHrp (1-34)4 está correcta por análise da sequência do DNA.

EXEMPLO XI

Expressão e purificação de Trp LE 18 hPTHrp (1-3414

Indução do Trp LE 18 hPTHrp (1-34)4.

Uma cultura de partida de 50 ml de meio de cultura LE , J.H. -88-

Miller, “Experiments in Molecular Genetics" p.431 (1972), aqui incluído como referência, contendo 50 μί*/ιη1 de ampicilina e 100 pg/ml de triptofano, foi inoculada com células E. coli contendo o plasmídeo Trp LE 18 hPTHrp (1-34) 4 e crescida durante a noite a 37°C com agitação forte até uma A55o de aproximadamente 6. Dois litros de meio de cultura LB para a produção foram pré-aquecidos até 37°C e inoculados com 20 ml da cultura de partida para dar uma A550 de cerca de 0,06. A cultura foi então crescida com agitação forte para uma A55o entre 0,6 e 0,8, adicionando-se então 2 ml de uma solução a 10 mg/ml de ácido indolacrílico (IAA). O crescimento continuou com bom arejamento, durante cerca de 16 horas, até uma A550 de cerca de 6 (tipicamente, entre 4 e 10). As células foram concentradas por centrifugação e ressuspensas em 500 ml de solução tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM (tampão Tris). A suspensão foi sonicada usando um sonicador Heat Systems-Ultrasonics, Inc. modelo 220F (equipado com um cone de 3/4") manipulado a 50% da capacidade total para evitar sobre-aqueciamento.

Para determinar o grau de indução, as células totais foram analisadas por SDS-PAGE. Os produtos do gene derivados da construção TrpLE18 hPTHrp (1-34) 4 foram visualizados como uma banda forte com 0 PM previsto de aproximadamente 17 000. Isto corresponde a 10% da proteína celular total.

Isolamento da proteína de fusão. O lisado celular foi centrifugado durante 15 min., a cerca de 3600 x g, para sedimentar a proteína de fusão Trp LEI 8 hPTHrp (1-34); o sobrenadante foi rejeitado. O sedimento foi ressuspenso em 200 ml de tampão Tris (tipicamente 40-80 A55o/ml). -89-

EXEMPLO XII

Processamento da proteína de fusão e purificação do fltiáWn peptídico homo-Serlactona hPTHrp (1-34Ί ("composto 4) A clivagem com CNBr dos resíduos de metionina flaqueantes da proteína de fusão multimérica hPTHrp(l-34) liberta o polipeptídeo homo-Serlactona hPTHrp(l-34), o qual foi purificado como descrito abaixo.

Tratamento da proteína de fusão com CNBr. O sedimento lavado de TrpLE 18 hPTHrp (1-34) foi ressuspenso por agitação suave em 60 ml de ácido fórmico a 70% (cerca de 20 mg/ml de proteína total; tipicamente, material derivado de 1000 unidades de A550 das células é dissolvido em 3 ml). Adicionou-se algumas gotas de octanol e borbolhou-se N2 na solução, durante 20 minutos, antes da adição de 5,5 g de CNBr. Esta reacção decorreu durante 6 horas a 25°C antes de um volume igual de 50:50 MeOH:H20 ser misturado com a amostra e subsequentemente removido por evaporação rotativa. Após 2 a 4 repetições deste processo, o grosso do ácido fórmico e CNBr foi essencialmente removido. A amostra foi então evaporada até secagem, redissolvida em 200 ml de água e liofilizada para armazenamento.

Purificação de homo-Serlactona hPTHrp (1-34). O sobrenadante clivado com CNBr foi dialisado contra KH2PC>4 50 mM, pH 6,5 durante 24 horas com várias mudas. Durante a diálise, o pH foi mantidoa 6,5. Após diálise, os precipitados foramremovidos por centrifugação a alta velocidade. O sobrenadante foi clarificado através de um sistema de filtração Gelman 0,45 μ (Acrodisc 4184). -90- h*.Yfr

Cromatografia de permuta catiónica. A purificação inicial foi conseguida por cromatografia de permuta catiónica numa coluna de HPLC Bio-Gel TSK-SP-5PW (21,5 x 150 mm). As condições de cromatografia para um fluxo de 8 ml/min e um rendimento de aproximadamente 12 mg de peptídeo homo-Serlactona hPTHrp(l-34) altamente purificado foram: 1. Equilíbrio da coluna em KH2PO4 50 mM, pH 6,5. 2. Aplicação de 10 ml de sobrenadante purificado (aproxima damente 1,5 1 de caldo de cultura ou 2,4 g de inclusão). 3. Lavagem da coluna com KH2P04 50 mM, pH 6,5 contendo NaCl 50mM até a linha de base estar estabilizada. 4. Eluição da coluna com KH2PO4 50 mM, pH 6,5 contendo NaCl 90 mM. Colheita das fracções durante cerca de 45 minutos. 5. Análise das fracções com NaCl 90 mM relativamente ao conteúdo de homo-Serlactona hPTHrp (1-34) por HPLC em coluna C18 antes da reunião das fracções e do armazenamento.

Cromatografia de HPLC em fase reversa.

Usou-se uma coluna de fase reversa Poros R/H 4,6 x 100 mm (Perspective Biosystems, Cambridge, MA) para o passo de purificação final. As condições de cromatografia foram as seguintes:

Fase móvel A: 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA)/água

B: 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA)/CH3CN TEMPO FLUXO %B 0 min 4 ml/min 15 5,0 min 4 ml/min 40 5,2 min 4 ml/min 100 6,8 min 4 ml/min 100 7,0 min 4 ml/min 15 O tempo de retenção da homo-Serlactona hPTHrp (1-34), Composto 4, foi de aproximadamente 2,943 minutos. O peptídeo purificado estava aproximadamente 98% puro, conforme determinado por espectroscopia de massa.

EXEMPLO XIII

Os compostos deste invento foram avaliados relativamente ao seu efeito na massa óssea de ratos ovariectomizados, de um modo geral de acordo com os processo de Guness-Hey e Hock, Metab. Bone Dis. 5:177 181 (1984).

Ratos fêmeas Sprague Dawley foram aclimatizados, pesados em grupo (n = 9, 10 ou 12) e sujeitos a ovariectomia bilateral (OVX) ou simulação de cirurgia. O doseamento foi iniciado 17 dias após cirurgia e continuou durante 20 dias. O composto a testar foi administrado subcutaneamente uma vez ao dia num veículo de 2% de soro de rato/soro fisiológico. -92- CU-

Após 20 dias de dosagem, os ratos foram sacrificados e removidos os fémures direitos. Os fémures foram cortados ao meio e as metades femurais distais (DHF) foram ainda separadas em osso trabecular (TB) e osso cortical (CB) através de perfuração das trabéculas. Extraiu-se o cálcio e mediu-se num analisador de cálcio Calcette e expressou-se como Ca ósseo médio em mg/DHF/100 g de peso do corpo.

Usou-se o teste t de duas amostras para comparar os grupos OVX e testemunha. ANOVA de uma via foi usado para comparar os grupos OVX, seguido de comparação múltipla LSD de Fischer para comparar cada grupo de tratamento com o veículo. A ovariectomia induziu uma perda de osso substancial, principalmente de osso trabecular. O cálcio total do osso foi de 47 a 54% mais baixo do que para as testemunhas com simulação de cirúrgia. bPTH(l-34) e hPTHrp (1-34) a 80 pg/Kg/dia proporcionou aumentos estatisticamente significativos no cálcio ósseo total para os ratos OVX tratados, variando entre 53 e 95% e 18 e 40%, respectivamente; no entanto, não houve aumento significativo do cálcio ósseo cortical.

Os compostos deste invento, doseados a 80 pg/Kg/dia, aumentaram o cálcio ósseo total de 66% para 138% e o cálcio trabecular de 87 para 128%. O cálcio ósseo cortical, a espessura trabecular e o volume ósseo foram também significativamente aumentados relativamente às testemunhas OVX não tratadas.

Neste ensaio, foram testados os compostos que se seguem: -93- -93- Composto Número n (# de testes) Cálcio ósseo trabe-cular (% de aumento relativamente a OVX) Cálcio ósseo total (% de aumento relati-vamente a OVX)

Composto 1 6 101-128% 88-138% (SEQ ID NO:7)

Composto 2 3 87-102% 66-114% (SEQ ID NO:6)

Composto 4 3 - 88-114% (SEQ ID NO:9)

Em estudos semelhantes, ratos ovariectomizados foram doseados durante 5, 10 e 20 dias, a 40 pg/Kg/dia, com os seguintes resultados:

Composto n # de Dias (d) Cálcio ósseo total (% Número (# de testes) de dosagem de aumento relath vamente a OVX) Composto 1 3 20d 73-109% (SEQ ID NO:7) Composto 4 (SEQ ID NO:9) 5 20d 79-105% Composto 4 1 lOd 79% (SEQ ID NO:9) Composto 49 (SEQ ID NO:63) 1 lOd 93% Composto 4 1 5d 55% (SEQ ID NO:9) Composto 42 (SEQ ID NO:56) 1 5d 60%

EXEMPLO XIV

TOXICIDADE

No Exemplo XI atrás, não foram observados efeitos tóxicos com os compostos do invento.

Lisboa, 5 de Setembro de 2001 < &

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA V/ICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

-1 - REIVINDICAÇÕES 1. Um peptídeo relacionado com a hormona paratiróide (PTHrp), da fórmula: Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7Leu His Xaa10 Xaa11 Gli Xaa13 Ser Ile Gin Xaa17 Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22'31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Fim, em que: Xaa1 está ausente ou é Ala; Xaa está ausente ou é Vai Xaa3 está ausente ou é Ser; Xaa4 está ausente ou é Glu ou Glu(OCH3); Xaa5 está ausente ou é His ou Ala; Xaa6 está ausente ou é Gin; Xaa7 está ausente ou é Leu; Xaa10 e Xaa17 são independentemente Asp ou Asp(OCH3); Xaa13 é Lis, Arg, Tir, Cis, Leu, Cis(CH2CONH(CH2)2NH(biotinil)), Lis(7-dimetilamino-2-oxo-2H-1 -benxopiran-4-acetil) ou Lis(di-hidrocinamoil); Xaa20 é Arg ou Leu; Xaa19 e Xaa21 são independentemente Lis, Ala ou Arg; Xaa ' formam uma hélice α anfipática e é seleccionado do grupo consistindo em a) Xaa22 Xaa23 Leu, Xaa25 Xaa26 Leu Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 em que: Xaa e Xaa são independentemente Glu, Glu(OCH3), His ou Fen; Xaa23 é Leu ou Fen; Xaa26 é Lis ou His; Xaa28 e Xaa31 são independentemente Leu ou Ile; Xaa29 é Ala, Arg ou Glu; e Xaa30 é Lis ou Glu (SEQ ID NO:85); -2-

em que um composto, em que Xaa22 é Fen, Xaa23 é Fen, Xaa25 é His, Xaa26 é Lis ou His, Xaa28 é Ile, Xaa29 é Ala, Xaa30 é Glu e Xaa31 é Ile está excluído, b) Xaa22 Xaa23 Leu, Xaa25 Arg Leu Leu Xaa29 Arg Leu em que: Xaa22 e Xaa25 são independentemente Glu, Glu(OCH3), His ou Fen; Xaa23 é Leu ou Fen; Xaa29 é Glu, Lis, ou Lis(COCH2PEGX) e PEGX é um radical poli(éter metílico de etilenoglicol) de peso molecular 100 a 10 000 (SEQ ID NO:86); c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu (SEQ ID NO:28); 1 5 10 d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Leu Ser Ser Leu (SEQ ID NO:29); 1 5 10 e) Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis Leu (SEQ ID NO:30); 1 5 10 Xaa32 é His, Pro ou Lis; Xaa33 está ausente ou é Pro, Tre, Glu ou Ala Xaa34 está ausente ou é Pro, Arg, Met, Ala, hSer, hSer lactona, Tir, Leu ou 2,4-diaminobutiril lactama; Xaa35 está ausente ou é Pro, Glu, Ser, Ala ou Gli; Xaa36 está ausente ou é Ala, Arg ou Ile; Xaa está ausente ou é Arg, Trp ou 3-(2-naftil)-L-alanina; Xaa38 está ausente ou é Ala ou hSer ou Xaa38"42 é Tre Arg Ser Ala Trp; e Fim é OR ou NR2 onde cada R é independentemente H, alquilo (CrC4) ou fenil-alquilo (CrC4); e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. -3-
2. Um polipeptídeo da Reivindicação 1 em que Xaa22'31 é Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Xaa Lis Leu em que Xaa é Glu ou Arg /SEQ ID NO:26).
3. Um polipeptídeo da reivindicação 2 em que Xaa11 e Xaa13 são ambos Lis; e Xaa19 e Xaa21 são ambos Arg.
4. O polipeptídeo da reivindicação 3 que é: Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Arg Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO:5); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO:6); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:7); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 -4- Leu His Tre hSer NH2 (SEQ ID N0:8); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre hSerlactona NH2 (SEQ ID NO:9); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala Gli Arg Arg OH (SEQ ID NO: 10); ou 35 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu Lis Glu Leu NH2 (SEQ IDNO:ll); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu Pro NH2 (SEQ ID NO:56); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 -5- X V>, ϊ t, Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre 2,4-diaminobutiril lactama (SEQ ID NO:63).
5. Um polipeptídeo da Reivindicação 2 em que Xaa1 2 3 4 5 e Xaa6 são ambos Lis; e um de entre Xaa19 e Xaa21 é Arg e o outro é Ala.
6. O polipeptídeo da Reivindicação 5 que é: Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala NH2 (SEQ IDNO:12); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO: 13).
7. Um polipeptídeo da Reivindicação 2 em que um de Xaa4 e Xaa6 é Leu e o outro é Lis; e Xaa19 e Xaa21 são ambos Arg. 1 O polipeptídeo da Reivindicação 7 que é: 2 Ala Vai Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gli Lis Ser Ile 3 15 10 15 4 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 5 20 25 30 6 Leu His Ala Leu OH (SEQ ID NO: 14). -6- 22 31
9. Um polipeptídeo da Reivindicação 1 em que Xaa ' é (SEQ ID NO: 85)
10. O polipeptídeo da reivindicação 9 que é: Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:66).
11. Um polipeptídeo da Reivindicação 1 em que Xaa22'31 é Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu em que Xaa é Glu, Lis ou Lis (COCH2 PEGX) e PEGX é um radical poli(éter metílico de etilenoglicol) de peso molecular 100 a 10000 (SEQ ID NO:27).
12. Um polipeptídeo da Reivindicação 11 em que Xaa11 e Xaa13 são ambos Lis ou ambos Arg; e Xaa19e Xaa21 são ambos Arg.
13. O polipeptídeo da Reivindicação 12 que é: Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30 Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 15); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15 i-A -7- At.b-rt' Glu Arg 30 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 25 Leu His Tre Ala OH (SEQID NO: 16); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Lis Arg 20 25 30 Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 17); ou Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 25 Lis (COCH2PEG2) Arg Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 18); ou 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gli Arg Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 25 Lis (COCH2PEG5000) Arg Leu His Tre Ala OH (SEQ ID NO: 19). 30
14. Um polipeptídeo da Reivindicação 1 em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:28).
15. O polipeptídeo da Reivindicação 14 que é: 15 10 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 1 5 -8- Μ

f Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala 20 25 30 Leu His Tre Ala NH2 (SEQID NO:20).
16. Um polipeptídeo da Reivindicação 1 em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:29).
17. O polipeptídeo da Reivindicação 16 que é: Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Leu His Tre Ala NH2 (SEQ IDNO:21).
18. Um polipeptídeo da Reivindicação 1 em que Xaa22'31 é (SEQ ID NO:30).
19. Um polipeptídeo da Reivindicação 18 que é: Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lis Gli Lis Ser Ile 15 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Fen Tir Asp Lis Vai Ala Glu Lis 20 25 30 Leu His Tre Ala NH2 (SEQ ID NO:22).
20. Um polipeptídeo de hormona paratiróide (PTH) modificado da fórmula: Xaa1 Vai Ser Glu Ile Gin Xaa7 Xaa8 His Asn Leu Gli Lis His Leu Xaa16 Ser Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22'31 His Asn Xaa34 Fim, em que: Xaa1 é Ser ou Ala;

-9- Xaa7 é Leu ou Fen; Xaa8 éMetouNle; Xaa16 é Asn ou Ser; Xaa18 é Leu, Met ou Nle; Xaa19 é Glu ou Arg; Xaa21 é Vai ou Arg; Xaa22’31 é seleccionado entre (SEQID NO:26, 27, 28,29, 30, 85 e 86); Xaa34 é Fen ou Tir; Fim é OH ou NR2, em que cada R é H ou alquilo (C1-C4); e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
21. O polipeptídeo da Reivindicação 20 que é: Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Leu Gli Lis His Leu 1 5 10 15 Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Asn Tir NH2 (SEQ ID NO:23); ou Ala Vai Ser Glu Ile Gin Fen Nle His Asn Leu Gli Lis His Leu 15 10 15 Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lis Leu Leu Glu Lis 20 25 30 Leu His Asn Tir NH2 (SEQ ID NO:24).
22. Uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de estados caracterizados por decréscimo da massa óssea, compreendendo uma quantidade eficaz no aumento da massa óssea do polipeptídeo da Reivindicação 1 ou 20, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um veículo farmaceuticamente aceitável. -10-
23. Uma composição farmacêutica na forma de unidade de dosagem, para o tratamento de condições caracterizadas pelo decréscimo da massa óssea, compreendendo entre cerca de 0,002 e 1 pg/Kg de peso de corpo de um polipeptídeo da Reivindicação 1 ou 20, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
24. A utilização de um composto da Reivindicação 1 ou 20, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a produção de um medicamento para o tratamento de mamíferos em condições caracterizadas por um decréscimo da massa óssea, particularmente, para o tratamento da osteoporose.
25. Um processo para a síntese em fase sólida de um polipeptídeo da Reivindicação 1 ou 20 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, processo esse que compreende sequencialmente o acoplamento de aminoácidos protegidos num suporte de resina adequado, remoção da cadeia lateral e dos grupos protectores N01, e clivagem do polipeptídeo do suporte de resina.
26. Um processo para a preparação de um polipeptídeo da Reivindicação 1 ou 20, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, processo esse que compreende a expressão de um gene codificador do referido polipeptídeo. Lisboa, 5 de Setembro de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA