FI120586B - Menetelmä PTH:n ja PTHRP:n analogien valmistamiseksi, ja niiden käyttö osteoporoosin hoitoon - Google Patents

Description

MENETELMÄ PTH:N JA PTHRP:N ANALOGIEN VALMISTAMISEKSI, JA NIIDEN KÄYTTÖ OSTEOPOROOSIN HOITOON

KEKSINNÖN TAUSTAA

5 a) Keksinnön ala

Keksintö koskee menetelmiä uusien PTH:n ja PTHRP:n analogien valmistamiseksi syntetisoimalla niitä kiinteätaasi-10 ja yhdistelmätekniikoilla. Yhdisteitä voidaan käyttää luuaineksen lisäämiseksi nisäkkäillä.

b) Läheisen tekniikan kuvaus 15 Osteoporoosi on tavallisin aineenvaihdunnallisen luu- sairauden muoto ja sitä voidaan pitää luukadon (osteopenia) oireellisena murtumavaiheena. Vaikka osteoporoosi voi ilmetä useiden sairauksien sivuvaikutuksena, 90 % kaikista tapauksista näyttää olevan idiopaattisia. Naiset ovat 20 vaihdevuosien jälkeen erityisessä vaarassa sairastua idio-paattiseen osteoporoosiin (vaihdevuosien jälkeinen eli tyyppi I:n osteoporoosi). Toisen idiopaattisen osteoporoosin suuren riskiryhmän muodostavat molempien sukupuolten vanhukset (vanhuuteen liittyvä eli tyyppi II:n osteoporoo-25 si). Osteoporoosi on yhdistetty myös kortikosteroidien käyttöön, liikkumattomuuteen tai pitkään vuodelepoon, alkoholismiin, sokeritautiin, gonadotoksiseen kemoterapiaan, hyperprolaktinemiaan, anorexia nervosaan, primaariseen ja sekundaariseen amenorrheaan (kuukautisvuodon puuttuminen) 30 sekä munasarjojen poistoon.

Osteoporoosin eri muodoissa esiintyy usein luunmurtumia sellaisen luukadon seurauksena, joka on johtanut mekaaniseen heikentymiseen. Vaihdevuosien jälkeiselle osteopo-35 roosille ovat tunnusomaisia ranteen ja selkärangan murtumat, kun taas vanhuuteen liittyvän osteoporoosin pääpiirteenä näyttävät olevan reisiluun kaulan murtumat.

2

Luun häviämisen mekanismin uskotaan osteoporoosia sairastavilla liittyvän luurangon uudistumisprosessissa olevaan epätasapainoon. Tämä prosessi on nimetty luun uudismuodos-tumiseksi. Se tapahtuu sarjana erillisiä aktiivisuuskes-5 kuksia. Nämä keskukset ilmestyvät luumatriksin sisälle spontaanisti määrätyn luun pinnalle muodostaen luun re-sorptiopaikan. Osteoklastit (luuta hajottavat tai resor-boivat solut) vastaavat tavallisesti vakiokokoisen luuosan resorptiosta. Tätä resorptioprosessia seuraa osteoblastien 10 (luuta muodostavat solut) ilmestyminen, jotka sitten täyttävät uudelleen uudella luuaineksella osteoklastien jälkeensä jättämän onkalon.

Osteoklasteja ja osteoblasteja muodostuu terveellä aikui-15 sella sellaisessa suhteessa, että luun muodostuminen ja häviäminen ovat tasapainossa. Osteoporoosipotilailla luun uudismuodostumisprosessiin kehittyy epätasapaino, joka johtaa siihen, että luuta häviää nopeammin kuin sitä muodostuu. Vaikka tätä epätasapainoa esiintyy jossain määrin 20 useimmilla ihmisillä ikääntymisen myötä, vaihdevuosien jälkeisessä osteoporoosissa tai munasarjojen poistamisen jälkeen se esiintyy paljon vakavampana ja nuoremmalla iällä. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Osteoporoosin hoitamiseksi on tehty useita yrityksiä pää 2 määränä joko hidastaa luun lisähäviämistä tai mieluummin 3 aikaansaada nettolisäystä luuaineksessa. Tietyt aineet, 4 kuten estrogeeni ja bisfosfonaatit, näyttävät hidastavan 5 luun lisähäviämistä osteoporoosipotilailla. Aineet, jotka 6 hidastavat luun häviämistä, joka johtuu luuaineksen re 7 sorption ja muodostumisen eri kestoajöistä, saattavat 8 näyttää lisäävän luuainesta (3-7 %:n suuruusluokkaa). Tämä 9 näkyvä lisääntyminen on kuitenkin aikarajoitteista eikä 10 progressiivista, ja se johtuu "uudismuodostumistilan" 11 pienenemisestä. Lisäksi koska häviäminen ja muodostuminen ovat läheisesti toisiinsa kytkeytyneitä, hoidot, jotka es- tävät luun häviämistä, vaikuttavat viime kädessä estävästi myös luun muodostumiseen.

3

Lisäkilpirauhashormoni- eli paratyroidiini(PTH) -hoidon on 5 ehdotettu johtavan sekä kasvaneeseen luuaineksen vaihtu-misnopeuteen että positiiviseen kalsiumtasapainoon. Ihmisillä tehdyt kliiniset kokeet ovat kuitenkin osoittaneet, että mitä tahansa trabekulaarisen luuaineksen lisäystä vastaa väheneminen kortIkaalisessa luussa niin, että luun 10 kokonaismäärässä ei tapahdu nettolisäystä.

Hefti, et ai. ovat esittäneet artikkelissa Clinical Science 62, 389-396 (1982), että päivittäiset ihonalaiset annokset joko bPTH(1-84):ää tai hPTH(1-34):ää lisäsivät ke-15 hon kokonaiskalsiumin määrää ja yksittäisten luiden tuhka-painoa sekä normaaleilla että osteoporoottisilla aikuisilla naarasrotilla.

Liu, et ai. ovat havainneet artikkelissa J. Bone Miner.

20 Res. 6: 10, 1071-1080 (1991), että munasarjojen poisto ai kuisilta naarasrotilta aiheutti 47 %:n häviämisen trabe-kulaarisessa luuaineksessa proksimaalisessa sääriluun me-tafyysissä, minkä yhteydessä osteoblastien ja trabekulaa-risten osteoklastien määrä lisääntyi merkittävästi. Päi-25 vittäiset ihonalaiset hPTH(1-34)-injektiot lopettivat täydellisesti trabekulaarisen luun häviämisen ja johtivat trabekkeliluuainesmääriin, jotka ylittivät näennäisleikat-tujen kontrollien määrät. Osteoblastien määrä lisääntyi ja osteoklastien määrä väheni.

30

Hock et ai. ovat esittäneet artikkelissa J. Bone Min. Res. 7: 1, 65-71 (1992), että päivittäiset ihonalaiset hPTH(l-34)-injektiot terveille aikuisille urosrotille 12 päivän ajan lisäsivät trabekulaarisen ja kortikaalisen luun kal-35 siumpitoisuutta ja kuivapainoa. Kokonaisluuaines, trabek-keliluutilavuus, trabekkelipaksuus ja -lukumäärä sekä osteoblastiset pinnat lisääntyivät.

4

Nisäkkäiden paratyroidiinihormonit, esim. ihmisen (hPTH), naudan (bPTH) ja porsaan (pPTH), ovat yksittäisiä 84 aminohappotähteen polypeptidiketjuja, joiden molekyylipainot 5 ovat noin 9500. Biologinen aktiivisuus liittyy N-terminaa-liseen alueeseen, josta tarvitaan ilmeisesti vähintään tähteet (1-3 4) .

Ihmisen PTH:n N-terminaalinen osa eroaa naudan ja porsaan 10 hormonien N-terminaalisesta osasta vain vastaavasti kolmen ja kahden aminohappotähteen osalta: hPTH(1-34):

Ser Vai Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 15 1 5 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Phe (SEKV. ID NO:l); 30 20 bPTH(1-34):

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Met His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Met Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 25 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Phe (SEKV. ID NO:2); 30 pPTH(1-34): 30 Ser Vai Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 1 5 10

Leu Ser Ser Leu Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Phe (SEKV. ID NO:3).

35 30 5 PTH:n ensisijaisena tehtävänä on tuoda esiin adaptiivisia muutoksia, jotka auttavat ylläpitämään Ca2+-ionipitoisuu-den vakiona solunulkoisessa nesteessä. PTH toimii munuaisissa lisäämällä munuaistubuluksissa Ca2+:n takaisinimey-5 tyrnistä virtsasta sekä stimuloimalla kalsifidiolin muuntumista kalsitrioliksi, joka vastaa Ca2+:n imeytymisestä suolista. Eräs huomattava vaikutus on Ca2+:n liikkeellelähdön edistäminen luustosta. Luustossa PTH vaikuttaa nostamalla Ca2+:n ja fosfaatin imeytymisnopeutta. PTH stimu-10 loi osteoklastien suorittamaa luun resorptionopeutta, lisää mesenkyymisolujen erilaistumisnopeutta osteoklasteiksi ja pidentää jälkimmäisten solujen puoliintumisikää. Pitkitetyn PTH-vaikutuksen mukana myös luuta muodostavien os-teoblastien lukumäärä lisääntyy; siten luuaineksen vaihtu-15 vuus ja uudismuodostus nopeutuvat. Yksittäiset osteoblas-tit näyttävät kuitenkin olevan vähemmän aktiivisia kuin normaalisti.

Rosenblatt, et ai. ovat kuvanneet US-patenteissa 20 4,423,037, 4,968,669 ja 5,001,223 PTH-antagonisteja, jotka on saatu poistamalla N-terminaaliset (1-6) aminohapot ja korvaamalla ne valikoiden aminohapoilla Phe7, Met8'18 ja Gly12. Selostuksen mukaan Tyr34-NH2 lisäsi näiden yhdisteiden aktiivisuutta ja stabiilisuutta.

25

Paratyroidiiniin liittynyt peptidi (PTHRP), joka on 140+ aminohappoa sisältävä proteiini, ja sen fragmentit toistavat PTH:n pääasiallisia biologisia vaikutuksia. Useat ihmisten ja eläinten kasvaimet ja muut kudokset valmistavat 30 PTHRP:tä, ja sillä voi olla vaikutusta pahanlaatuisuuteen liittyvässä hyperkalsemiassa. hPTHRP(1-34):n sekvenssi on seuraavanlainen:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 35 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 15 20 25 6

Ala Glu Ile His Thr Ala (SEKV. ID N0:4).

30 hPTH:n ja hPTHRP:n välinen sekvenssihomologia on suureksi 5 osaksi rajoittunut 13:een N-terminaaliseen tähteeseen, joista 8 on identtisiä; hPTH:n reseptorin sitoutumiskohdasta (25-34) vain 1 aminohappo 10:stä on säilynyt hPTHRP:ssä. Yhteisen aktiivisuuden perustana saattaa olla rakenteen samankaltaisuus. Cohen, et ai. ovat ehdottaneet 10 artikkelissa J. Biol. Chem. 266: 3, 1997-2004 (1991), että suuri osa PTH(l-34):n ja PTHRP(1-34):n sekvenssistä, erityisesti alueet (5-18) ja (21-34), omaksuu a-helikaalisen konfiguraation, samalla he huomauttavat, että on jossain määrin kyseenalaista, onko tämä konfiguraatio vallitseva 15 karboksyyliterminaalisessa päässä fysiologisissa olosuhteissa. Sellainen sekundaarirakenne saattaa olla tärkeä lipidivuorovaikutuksessa, reseptorivuorovaikutuksessa ja/tai rakenteen stabiloinnissa. 1

Olemme syntetoineet PTH:n ja PTHRP:n analogeja tarkoituksena kehittää parannettuja terapeuttisia aineita luuainek-sen vahvistamiseksi nisäkkäillä, mukaan luettuna osteoporoosin vaivaamat nisäkkäät.

25 Keksinnön yhteenveto

Keksintö koskee menetelmää lisäkilpirauhashormonin kaltaisen peptidin (PTH), (PTHRP) ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten typistettyjen homologien ja analogien 30 synteettisten polypeptidianalogien sekä niiden suolojen valmistamiseksi, joissa aminohappotähteet (22-31) muodostavat amfipaattisen α-heliksin, jossa mainitut tähteet (22-31) hydrofiilisiä aminohappoja (Haa) tai lipofiilisiä aminohappoja (Laa), ja ovat järjestettyinä sekvenssiksi: 35 Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa.

7

Kun spesifiset tätä sekvessityyppiä selventävät ilmentymismuodot insertoidaan PTH:hon, PTHRP:hen ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisiin, typistettyihin analo-geihin ja homologeihin, ovat tuloksena saatavat polypepti-5 dit tehokkaita luuta uudismuodostavia aineita.

Eräs keksinnön näkökanta koskee menetelmää PTH:n, PTHRP:n ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten, typistettyjen analogien ja homologien analogien tai niiden suolo-10 jen valmistamiseksi, joissa aminohappotähteet (22-31) muodostavat amfipaattisen α-heliksin, jossa mainittujen tähteiden (22-31) muodostama sekvenssi on joko: a) Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Xaa5 Leu Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10, jossa 15 10 15 Xaa1 ja Xaa4 ovat toisistaan riippumatta Glu, Glu(OCH3),

His tai Phe; Xaa2 on Leu tai Phe; Xaa5 on Lys tai His; Xaa7 ja Xaa10 ovat toisistaan riippumatta Leu tai Ile; Xaa8 on Ala, Arg tai Glu; ja Xaa9 on Lys tai Glu (SEKV. ID NO:85); edullisesti 20 Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu, jossa 15 10

Xaa on Glu tai Arg (SEKV. ID NO:26); b) Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Arg Leu Leu Xaa8 Arg Leu, jossa 25 1 5 10

Xaa1 ja Xaa4 ovat toisistaan riippumatta Glu, Glu(OCH3),

His tai Phe; Xaa2 on Leu tai Phe; Xaa8 on Glu, Lys tai Lys(COCH2PEGX) ja PEGX on poly-(eteeniglykolimetyylieet-teri)radikaali, jonka molekyylipaino on 100 - 10 000 30 (SEKV. ID NO:86); edullisesti

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu, jossa 15 10

Xaa on Glu, Lys tai Lys(COCH2PEGX) ja PEGX on poly-(etee-niglykolimetyylieetteri)radikaali, jonka molekyylipaino on 35 100 - 10 000 (SEKV. ID NO:27); 8 c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 15 10 (SEKV. ID NO:28); 5 d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu 15 10 (SEKV. ID NO:29); e) Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu 15 10 10 (SEKV. ID NO :30) .

Toinen keksinnön näkökanta koskee menetelmää PTH:n, PTHRP:n ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten, typistettyjen homologien ja analogien analogien tai niiden 15 suolojen valmistamiseksi, joissa aminohappotähteet (22-31) muodostavat amfipaattisen α-heliksin, jossa mainittujen tähteiden (22-31) muodostama sekvenssi on joko: a) Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu, jossa 15 10 20 Xaa on Glu tai Arg (SEKV. ID NO:26); b) Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu, jossa 15 10

Xaa on Glu, Lys tai Lys(COCH2PEGX) ja PEGX on poly-(etee-25 niglykolimetyylieetteri)radikaali, jonka molekyylipaino on 100 - 10 000 (SEKV. ID NO:27); c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 15 10 30 (SEKV. ID NO:28) ; d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu 15 10 (SEKV. ID NO:29); 35 e) Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala Glu Lys Leu 15 10 9 (SEKV. ID NO :30) .

Näistä yhdisteistä voidaan valmistaa farmaseuttisia koostumuksia sellaisten tilojen ehkäisyyn tai hoitoon, joille 5 on tunnusomaista luuaineksen väheneminen, jotka koostumukset sisältävät luuaineksen lisääntymiseen vaikuttavan määrän PTH:n, PTHRP:n ja PTH:n ja PTHRPrn fysiologisesti aktiivisten typistettyjen homologien ja analogien polypep-tidianalogia sekä sen suoloja, joissa aminohappotähteet 10 (22-31) muodostavat amfipaattisen α-heliksin, jossa maini tut tähteet (22-31) ovat hydrofiilisiä aminohappoja (Haa) tai lipofiilisiä aminohappoja (Laa), ja ovat järjestettyinä sekvenssiksi:

Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa 15 sekoituksena farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Menetelmissä farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi sekoitetaan edellä kuvattuja yhdisteitä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

20 Keksinnön mukaisilla menetelmillä valmistettuja yhdisteitä voidaan käyttää sellaisten nisäkkäiden tilojen hoitamiseksi, joille on tunnusomaista luuaineksen häviäminen, jolloin hoidon tarpeessa olevalle nisäkkäälle annetaan luu-aineksen kasvuun vaikuttava määrä PTH:n, PTHRP:n tai PTH:n 25 tai PTHRP:n fysiologisesti aktiivisen typistetyn homologin tai analogin polypeptidianalogia tai sen suolaa, jossa aminohappotähteet (22-31) muodostavat amfipaattisen a-heliksin, jossa mainitut tähteet (22-31) ovat hydrofiili-siä aminohappoja (Haa) tai lipofiilisiä aminohappoja 30 (Laa), ja ovat järjestettyinä sekvenssiksi:

Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa.

Yksityiskohtaisemmin menetelmissä sellaisten nisäkkäiden tilojen hoitamiseksi, joille on tunnusomaista luuaineksen 35 häviäminen, hoidon tarpeessa olevalle nisäkkäälle annetaan luuaineksen kasvuun vaikuttava määrä PTH:n, PTHRP:n tai PTH:n tai PTHRP:n fysiologisesti aktiivisen typistetyn 10 homologin tai analogin polypeptidianalogia tai sen suolaa, jossa aminohappotähteet (22-31) muodostavat amfipaattisen a-heliksin, jossa mainitut tähteet (22-31) muodostavat joko sekvenssin SEKV. ID NO:26, 27, 28, 29 tai 30.

5 Tämä keksintö sisältää olennaisesti menetelmät PTH:n, PTHRP:n ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten typistettyjen homologien ja analogien polypeptidianalogien sekä niiden suolojen, joissa aminohappotähteet (22-31) 10 muodostavat amfipaattisen a-heliksin, jossa mainitut tähteet (22-31) ovat hydrofiilisiä aminohappoja (Haa) tai lipofiilisiä aminohappoja (Laa), ja ovat järjestettyinä sekvenssiksi:

Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa, 15 valmistamiseksi kiinteäfaasisynteesillä, joissa menetelmissä perättäisestä liitetään suojattuja aminohappoja sopivaan hartsikantajaan, poistetaan sivuketju- ja Na-suoja-ryhmät ja lohkaistaan polypeptidi hartsista. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Tämä keksintö sisältää myös menetelmät PTH:n, PTHRP:n ja 2 PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten typistettyjen 3 homologien ja analogien polypeptidianalogien sekä niiden 4 suolojen, joissa aminohappotähteet (22-31) muodostavat 5 amfipaattisen α-heliksin, jossa mainittujen tähteiden (22— 6 31) muodostama sekvenssi on joko SEKV. ID NO:26, 27, 28, 7 29 tai 30, valmistamiseksi kiinteäfaasisynteesillä, joissa 8 menetelmissä perättäisestä liitetään suojattuja aminohap 9 poja sopivaan hartsikantajaan, poistetaan sivuketju- ja 10 N“-suojaryhmät ja lohkaistaan polypeptidi hartsista.

11 12

Samoin keksintö sisältää menetelmät PTH:n, PTHRP:n ja 13 PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten typistettyjen 14 homologien ja analogien polypeptidianalogien sekä niiden 15 suolojen, joissa aminohappotähteet (22-31) muodostavat 16 amfipaattisen α-heliksin, jossa mainitut tähteet (22-31) ovat hydrofiilisiä aminohappoja (Haa) tai lipofiilisiä aminohappoja (Laa), ja ovat järjestettyinä sekvenssiksi: 11

Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa, valmistamiseksi rekombinanttisynteesillä.

Keksinnössä käytetään DNA-sekvenssejä, vektoreita ja plas-5 mideja mainittujen polypeptidianalogien rekombinanttisyn-teesiin. Erityisesti käytetään DNA-sekvenssejä, vektoreita ja plasmideja PTH:n, PTHRP:n ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten typistettyjen homologien ja analogien polypeptidianalogien sekä niiden suolojen, joissa amino-10 happotähteet (22-31) muodostavat amfipaattisen a-heliksin, jossa mainittujen tähteiden (22-31) muodostama sekvenssi on joko SEKV. ID NO:26, 27, 28, 29 tai 30, valmistamiseksi rekombinanttisynteesillä.

15 Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuva 1 esittää keksinnön mukaisesti valmistettua PTHRP(1-34)-analogia koodaavan synteettisen geenin DNA-sekvenssin ja restriktioentsyymikohdat (hPTH:n PCR-amplifikaatio).

20

Kuva 2 esittää sellaisen plasmidin valmistuksen pääkohdat, joka sisältää PTHRP(1-34)-analogin geenin (Trp LE 18 hPTHRP(l-34)1 -rakenne).

25 Kuva 3 esittää sellaisen plasmidin valmistuksen pääkohdat, joka sisältää kaksi PTHRP(1-34)-analogin geenikopiota (Trp LE 18 hPTHRP(1-34)2 -rakenne).

Kuva 4 esittää sellaisen plasmidin valmistuksen pääkohdat, 30 joka sisältää neljä PTHRP(1-34)-analogin geenikopiota (Trp LE 18 hPTHRP(1-34)4 -rakenne).

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 35 Lyhenteet ja määritelmät

Erilaisten tavallisten nukleotidiemästen ja aminohappojen yksi- ja kolmikirjaimiset lyhenteet ovat kuten on suosi- 12 teltu artikkeleissa Pure Appi. Chem. 31, 639-645 (1972) ja 40, 277-290 (1974), ja ne noudattavat sekä 37 CFR §1.822 (55 FR 18245, Toukokuu 1, 1990)- että PCT-sääntöjä (WIPO-standardi ST.23: Recommendation for the Presentation of 5 Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications and in Published Patent Documents). Yksi- ja kolmikirjaimiset lyhenteet ovat seuraavanlaisia: 10 Aminohappojen lyhenteet

Aminohappo Kolmikirjaiminen Yksikirjaiminen symboli symboli

Alaniini Ala A

Arginiini Arg R

15 Asparagiini Asn N

Asparagiinihappo Asp D

Asn + Asp Asx B

Kysteiini Cys C

Glutamiini Gin Q

20 Glutamiinihappo Glu E

Gin + Glu Glx Z

Glysiini Gly G

Histidiini His H

Isoleusiini Ile I

25 Leusiini Leu L

Lysiini Lys K

Metioniini Met M

Fenyylialaniini Phe F

Proliini Pro P

30 Seriini Ser S

Treoniini Thr T

Tryptofaani Trp W

Tyrosiini Tyr Y

Väliini Vai V

35 Muu aminohappo Xaa X

Lyhenteet tarkoittavat L-aminohappoja ellei D- tai D,L-muotoja ole erikseen merkitty. Tietyt sekä luonnolliset että ei-luonnolliset aminohapot ovat akiraalisia, esim.

40 glysiini. Kaikki peptidisekvenssit esitetään siten, että N-terminaalinen aminohappo on vasemmalla ja C-terminaali-nen aminohappo on oikealla.

13

Muita tässä käytettyjä muiden aminohappojen ja yhdisteiden lyhenteitä ovat: hSer homoseriini 5 hSerlac homoseriinilaktoni

Nle norleusiini PEG2 dieteeniglykolimetyylieetterin radikaali, a.k.a. metoksidi(eteenioksi), CH3O(CH2CH2O) 2-, (MP = 119) PEG5000 poly(eteeniglykolimetyylieetterin) radikaali, 10 a.k.a. metoksipoly(eteenioksi), CH30(CH2CH20) u0-, (keskim. MP = 5000) PEGX poly(eteeniglykolimetyylieetterin) radikaali, CH3O (CH2CH2O) n-/· n = 2-225, (keskim.

MP = 100 - 10 000) 15 "Hydrofiilinen aminohappo (Haa)" tarkoittaa aminohappoa, jossa on vähintään yksi hydrofiilinen funktionaalinen ryhmä niiden lisäksi, jotka tarvitaan peptidisidoksen muodostamiseen, kuten esim. arginiini, asparagiini, aspara-20 giinihappo, glutamiinihappo, glutamiini, histidiini, ly-siini, seriini, treoniini ja niiden homologit.

"Lipofiilinen aminohappo (Laa)" tarkoittaa varauksetonta, alifaattista tai aromaattista aminohappoa, joita ovat 25 esim. isoleusiini, leusiini, metioniini, fenyylialaniini, tryptofaani, tyrosiini, väliini ja niiden homologit.

Tämän keksinnön tarkoituksia varten alaniini luokitellaan "amfifiiliseksi", s.o. se pystyy toimimaan joko hydrofii-30 lisenä tai lipofiilisenä aminohappona.

"Fysiologisesti aktiivinen typistetty PTH:n tai PTHRP:n homologi tai analogi" tarkoittaa polypeptidiä, jonka sekvenssissä on vähemmän aminohappoja kuin PTH:ssa tai 35 PTHRP:ssä kokonaisuudessaan löytyy, joka kuitenkin saa esiin samanlaisen fysiologisen reaktion. Typistetyn PTH:n tai PTHRP:n ei tarvitse olla täysin homologinen PTH:n tai 14 PTHRP:n kanssa saadakseen esiin samanlaisen fysiologisen reaktion. PTH(l-34) ja PTHRP(l-34) ovat edullisia, mutta eivät ainoita tämän ryhmän edustajia.

5 "Amfipaattinen a-heliksi" tarkoittaa tiettyjen polypepti-dien osoittamaa sekundaarirakennetta, jossa aminohapot omaksuvat α-helikaalisen konfiguraation, jossa vastakkaiset polaariset ja ei-polaariset puolet ovat orientoituneet heliksin pituusakselia pitkin. α-Helikaalisen rakenteen 10 mahdollisuutta kiinnostavassa polypeptidissä voidaan jossain määrin tutkia rakentamalla sopivan välin (pitch) "Schiffer-Edmundsonin kierre (wheel)" (M. Schiffer ja A.B. Edmundson, Biophys. J. 7, 121 (1967)) ja huomioimalla hydrofiilisten ja lipofiilisten tähteiden jakautuminen 15 heliksiä kiertävän sylinterin vastakkaisille puolille.

Vaihtoehtoisesti saatavilla oleva empiirinen todistusaineisto, kuten esim. tiedot sirkulaarisesta dikroismista tai röntgensädediffraktiosta, saattaa osoittaa cx-helikaa-lisen alueen olemassaolon kyseisessä polypeptidissä. Ihan-20 teellisessä α-heliksissä on kierrettä kohti 3,6 aminohappotähdettä, joiden vierekkäiset sivuketjut eroavat toisistaan 100°:n kaarella. Eisenberg et ai. ovat yhdistäneet artikkeleissa Nature 299: 371-374 (1982) ja Proc. Nat. Acad. Sei. USA 81: 140-144 (1984) hydrofobisuusasteikon 25 helikaaliseen kierteeseen määrittääkseen kvantitatiivisesti amfipaattisten heliksien käsitteen. Keskimääräinen hydrof obisuusmomentti määritetään heliksin muodostavien aminohappojen hydrofobisuuksien vektorisummana. Seuraavat aminohappojen hydrofobisuudet ovat Eisenbergin (1984) 30 selostamia "yleiseksi" asteikoksi:

Ile 0,73; Phe 0,61; Vai 0,54; Leu 0,53; Trp 0,37; Met 0,26; Ala 0,25; Gly 0,16; Cys 0,04; Tyr 0,02; Pro -0,07; Thr -0,18; Ser -0,26; His -0,40; Glu -0,62; Asn -0,64; Gin -0,69; Asp -0,72; Lys -1,10; Arg -1,76.

35 15

Ihanteellisen α-heliksin, jossa on 3,6 aminohappotähdettä kierrettä kohti (tai sivuketjujen välillä on 100°:n kaari (= 360°/3,6)), hydrofobisuusmomentti, μΗ, voidaan laskea kaavasta: 5 μΗ = [ (Σ HNsino (N-l) )2 + (Σ H Ncoso (N-l) ) 2]1/2, jossa Hn on N:nen aminohapon hydrofobisuusarvo ja sekvenssissä olevien N:n aminohapon summat otetaan jaksollisuudella σ= 100°. Hydrofobisuusmomentti voidaan ilmaista keskimääräisenä hydrofobisuusmomenttina tähdettä kohti jaka-10 maila μΗ N:llä, jolloin saadaan <μΗ>. Kun <μΗ>:η arvo on 100° ± 20°:ssa noin 0,20 tai suurempi, se viittaa amfi-paattisen heliksin muodostukseen. <μΗ>:η arvot yhdisteille hPTHRP(22-31) ja hPTH(22-31) 100°:ssa ovat vastaavasti 0,19 ja 0,37.

15

Cornett, et ai. ovat artikkelissa J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987) laajentaneet amfipaattisten α-heliksien tutkimusta esittelemällä "amfipaattisen indeksin" amfipaatti-suuden ennustajana. He päättelivät, että noin puolet kai-20 kista tunnetuista α-helikseistä on amfipaattisia, ja että vallitseva taajuus on pikemminkin 97,5° kuin 100°, jolloin tähteiden määrä kierrettä kohti on lähempänä arvoa 3,7 kuin arvoa 3,6. Vaikka tällaiset hienoudet ovat tieteellisesti kiinnostavia, Eisenbergin ym. peruslähestymistapa on 25 riittävä luokittelemaan tietty sekvenssi amfipaattiseksi, erityisesti kun sekvenssi suunnitellaan alusta lähtien siten, että se muodostaa amfipaattisen a-heliksin.

Korvaavasta amfipaattisesta α-helikaalisesta aminohappo-30 sekvenssistä voi puuttua homologia luontaisesti esiintyvän polypeptidin tietyn osan kanssa, mutta se johtaa samanlaiseen sekundaarirakenteeseen, s.o. α-heliksiin, jossa polaariset ja ei-polaariset puolet ovat vastakkain, fysiologisessa ympäristössä. Luontaisesti esiintyvän aminohap-35 posekvenssin korvaaminen vaihtoehtoisella sekvenssillä voi 16 vaikuttaa edullisesti fysiologiseen aktiivisuuteen, sta-biilisuuteen tai muihin muunnetun lähtöpolypeptidin ominaisuuksiin. Sellaisten sekvenssien suunnitteluun ja valintaan saa opastusta muun muassa artikkeleista J. L.

5 Krstenansky, et ai. FEES Letters 242: 2, 409-413 (1989) ja J. P. Segrest, et ai. Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 103-117 (1990).

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavalla 10 aminohapon 10 amfipaattisella α-heliksillä on kaava:

Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa, jossa Haa-aminohapot ovat hydrofiilisiä aminohappoja ja Laa-aminohapot ovat lipofiilisiä aminohappoja, kuten edellä on määritelty. Kun oletetaan ihanteellinen a-heliksi, 15 täh-teet 1, 4, 5, 8 ja 9 jakautuvat heliksin toiselle sivulle (A) noin 140° kaaren alueelle, kun taas tähteet 2, 3, 6, 7 ja 10 sijaitsevat vastakkaisella 140°:n alueella heliksin toisella sivulla (B). Kaikki toisen sivun tähteet ovat edullisesti samaa polaarisuutta samalla kun toisen 20 sivun kaikki tähteet ovat vastakkaista polaarisuutta, s.o. jos sivu A on kokonaan hydrofiilinen, sivu B on kokonaan lipofiilinen ja päinvastoin. Alan asiantuntija huomaa, että vaikka tässä keksinnössä esitettyjä heliksejä kuvataan kaavalla 25 Haa (Laa Laa Haa Haa)2 Laa, niin vastakkainen sekvenssi

Laa (Haa Haa Laa Laa)2 Haa täyttää myös tähteiden jakaantumisvaatimuksen ja on siten vastaavanlainen tässä keksinnössä esitettyjen heliksien 30 kuvaaja.

Sekä hydrofiilinen että lipofiilinen aminohappo voidaan korvata alaniinilla, koska Ala voi helposti olla kummalla amfipaattisen α-heliksin sivulla tahansa, vaikkakaan Alaio 35 ei muodosta amfipaattista α-heliksiä. Tavallisesti ei käytetä proliinia, kysteiiniä eikä tyrosiiniä; niiden läsnä- 17 olo ja muut satunnaiset virheet sekvenssissä voidaan kuitenkin sietää, esim. hydrofiilinen tähde lipoiiilisellä sivulla, niin kauan kuin muut osan aminohapot olennaisilta osiltaan sopivat jakoon hydrofiilinen sivu - lipofiilinen 5 sivu. Sopiva keino sen määrittämiseksi, onko sekvenssi riittävän amfipaattinen ollakseen tässä keksinnössä esitetty sekvenssi, on keskimääräisen hydrofobisuusmomentin laskeminen, kuten edellä on kuvattu. Jos huippukeskimo-mentti tähdettä kohti 100° ± 20°:ssa ylittää noin arvon 10 0,20, sekvenssi muodostaa amfipaattisen heliksin ja on tässä keksinnössä esitetty sekvenssi.

Esimerkiksi sekvenssille ID NO:26 lasketaan keskimääräinen hydrofobisuusmomentti tähdettä kohti 100°:ssa, kun Xaa = 15 Glu, seuraavasti: A.A_Hn_σ (N—1) H sin σ(Ν-1) H cos σ(Ν-1) E -0,62 0 0 -0,62 L 0,53 100 0,52 -0,17 20 L 0,53 200 -0,18 -0,50 E -0,62 300 0,34 -0,31 K -1,1 400 -0,70 -0,85 L 0,53 500 0,34 -0,41 L 0,53 600 -0,46 -0,27 25 E -0,62 700 0,21 -0,58 K -1,1 800 -1,08 -0,19 L 0,53 900 0 -0,53 Σ= 0,81 Σ= -4,43 30 μΗ= [(0,81)2 + (-4, 43 ) 2 ] 1/2 = 4,50 <μΗ> = 4,50/10 = 0,45 35 Tämän sekvenssin keskimääräinen huippuhydrofobisuusmomentti esiintyy 92°:ssa ja sen arvo on 0,48.

18

Kun tätä käsitettä sovellettiin PTH:hon ja PTHRP:hen, oletettiin, että joko toisella tai molemmilla alueilla (7-16) ja (22-31) on οί-helikaalinen sekundaarirakenne ja ne voi-5 täisiin korvata ei-homologisella sekvenssillä, jolla on samanlaiset rakenneominaisuudet, ilman biologisen aktiivisuuden menetystä tai immunoreaktion induktiota.

Edulliset suoritustavat 10

Eräs keksinnön näkökanta koskee menetelmää PTH:n, PTHRPtn ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten, typistettyjen analogien ja homologien analogien tai niiden suolojen valmistamiseksi, joissa aminohappotähteet (22-31) 15 muodostavat amfipaattisen α-heliksin, jossa mainittujen tähteiden (22-31) muodostama sekvenssi on joko: a) Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Xaa5 Leu Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10, jossa 15 10

Xaa1 ja Xaa4 ovat toisistaan riippumatta Glu, Glu(0CH3), 20 His tai Phe; Xaa2 on Leu tai Phe; Xaa5 on Lys tai His; Xaa7 ja Xaa ovat toisistaan riippumatta Leu tai Ile; Xaa on Ala, Arg tai Glu; ja Xaa9 on Lys tai Glu (SEKV. ID NO:85); edullisesti

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu, jossa 25 1 5 10

Xaa on Glu tai Arg (SEKV. ID NO:26); b) Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Arg Leu Leu Xaa8 Arg Leu, jossa 15 10 30 Xaa1 ja Xaa4 ovat toisistaan riippumatta Glu, Glu(0CH3),

His tai Phe; Xaa2 on Leu tai Phe; Xaa8 on Glu, Lys tai Lys(COCH2PEGX) ja PEGX on poly-(eteeniglykolimetyylieette-ri)radikaali, jonka molekyylipaino on 100 - 10 000 (SEKV. ID NO:86); edullisesti 35 Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu, jossa 15 10 19

Xaa on Glu, Lys tai Lys(COCH2PEGX) ja PEGX on poly-(etee-niglykolimetyylieetteri) radikaali, jonka molekyylipaino on 100 - 10 000 (SEKV. ID NO:27); 5 c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 15 10 (SEKV. ID NO:28); 10 d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu 15 10 (SEKV. ID NO:29); e) Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu 15 1 5 10 (SEKV. ID NO :30) .

Toinen keksinnön näkökanta koskee menetelmää PTH:n, PTHRP:n ja PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten, 20 typistettyjen analogien ja homologien analogien tai niiden suolojen valmistamiseksi, joilla on kaava:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Leu His Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gin Xaa17 Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 loppu, jossa 25 Xaa1 on poissa tai se on Ala;

Xaa2 on poissa tai se on Vai;

Xaa3 on poissa tai se on Ser;

Xaa4 on poissa tai se on Glu tai Glu(OCH3);

Xaa5 on poissa tai se on His tai Ala; 30 Xaa6 on poissa tai se on Gin;

Xaa7 on poissa tai se on Leu;

Xaa10 ja Xaa17 ovat toisistaan riippumatta Asp tai Asp (OCH3) ;

Xaa11 on Lys, Arg tai Leu; 35 Xaa13 on Lys, Arg, Tyr, Cys, Leu, Cys (CH2CONH (CH2) 2NH (bio-tinyyli)), Lys(7-dimetyyliamino-2-okso-2H-l-benksopyraani- 4-asetyyli) tai Lys(dihydrokinnamoyyli); 20 on

Xaa on Arg tai Leu;

Xaa ja Xaa ovat toisistaan riippumatta Lys, Ala tai Arg; 5 Xaa22-31 on SEKV. ID NO:26, 27, 28, 29 tai 30; Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 on His,

Pro tai Lys;

Xaa14 on poissa tai se on Pro, Thr, Glu tai Ala; 34 * i

Xaa on poissa tai se on Pro, Arg, Met, Ala, hSer, hSer- laktoni, Tyr, Leu tai 1,4-diaminobutyryylilaktaami; 10 Xaa15 on poissa tai se on Pro, Glu, Ser, Ala tai Gly;

Xaa16 on poissa tai se on Ala, Arg tai Ile;

Xaa17 on poissa tai se on Arg, Trp tai 3-(-2-naftyyli)-L- alaniini;

Xaa on poissa tai se on Ala tai hSer tai Xaa on Thr 15 Arg Ser Ala Trp; ja loppu on -OR tai -NR2, jossa kumpikin R on toisistaan riippumatta H, (C1-C4)alkyyli tai fenyy-li (C1-C4)alkyyli; sekä niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

Vielä eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän fysio 2 logisesti aktiivisen typistetyn hPTHRP(1-34)-homologin 3 polypeptidianalogien, kuten esimerkiksi kaavassa (I) esi 4 tettyjen, valmistamiseksi: 5

Ala Vai Ser Glu Xaa5 Gin Leu Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13 6

Ser Ile Gin Asp Leu Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 Xaa13 Xaa14 Xaa18 7 loppu, jossa: 8

Xaa5 on His tai Ala; 9

Xaa11 ja Xaa13 ovat toisistaan riippumatta Lys, Arg tai 10

Leu; 11

Xaa19 ja Xaa21 ovat toisistaan riippumatta Ala tai Arg; 12

Xaa22-31 on joko 13 a) Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu, jossa 14 15 10 15 16 b) Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu, jossa 17 15 10 18

Xaa on Glu tai Arg (SEKV. ID NO:26); 21

Xaa on Glu, Lys tai Lys(COCH2PEGX) ja PEGX on poly-(etee-niglykolimetyylieetteri) radikaali, jonka molekyylipaino on 100 - 10 000 (SEKV. ID NO:27); 5 c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 15 10 (SEKV. ID NO:28); d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu 10 1 5 10 (SEKV. ID NO:29); e) Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu 15 10 15 (SEKV. ID NO:30) ;

Xaa32 on His tai Lys;

Xaa33 on Thr, Glu tai Ala;

Xaa34 on Ala, hSer, Tyr tai Leu; 20 ja loppu on Gly Arg Arg, laktoni, -OH tai -NR2, jossa kumpikin R on H tai (Ci-C4)alkyyli; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat. (Kaava I)

Vielä yksityiskohtaisempi keksinnön näkökanta sisältää 25 menetelmän kaavan (I) mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, joissa Xaa22”31 on SEKVENSSI ID NO: 26, joille <μΗ> ylittää arvon 0,45 100°:ssa. Vielä yksityiskohtaisempi keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan (I) mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, joissa Xaa22-31 on 30 SEKVENSSI ID NO: 26, Xaa11 ja Xaa13 ovat molemmat Lys; ja Xaa19 ja Xaa21 ovat molemmat Arg.

Tyypillisiä sellaisia polypeptidejä ovat muun muassa: 35 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 22

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Arg Lys Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:5); 30 5

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 10 Glu Lys Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:6); 30

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 15 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:7); 30 20 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr hSer NH2 (SEKV. ID NO:8); 25 30

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 30 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr hSerlac (SEKV. ID NO:9); 30

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 35 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH (SEKV. ID NO:10); 30 35 23 ja 5 Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 lie Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu Lys Glu Leu NH2 (SEKV. ID NO:ll).

10 30

Eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan (I) mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, joissa Xaa22~ 31 on SEKVENSSI ID NO: 26, Xaa11 ja Xaa13 ovat molemmat Lys; 15 ja toinen aminohapoista Xaa19 ja Xaa21 on Arg ja toinen on Ala. Tyypillisiä tämän alaryhmän polypeptidejä ovat muun muassa:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 20 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:12) ja 30 25 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:13).

30 30

Eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan . oo_g i (I) mukaisten polypeptidien, joissa Xaa on SEKVENSSI ID NO:26, toinen aminohapoista Xaa11 ja Xaa13 on Leu ja 35 toinen on Lys; ja Xaa19 ja Xaa21 ovat molemmat Arg. Tyypillinen tämän alaryhmän polypeptidi on muun muassa: 24

Ala Vai Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 5 Glu Lys Leu His Ala Leu OH (SEKV. ID NO:14).

30

Eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan (I) mukaisten polypeptidien, joissa Xaa22~31 on SEKVENSSI 10 ID NO:27, joilla <μΗ> 100°:ssa ylittää arvon 0,50. Edelleen keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan (I) mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, joissa Xaa22~ 31 on SEKVENSSI ID NO: 27, Xaa11 ja Xaa13 ovat molemmat Lys tai molemmat Arg; ja Xaa19 ja Xaa21 ovat molemmat Arg.

15 Tyypillisiä tämän alaryhmän polypeptidejä ovat muun muassa:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 20 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:15); 30 25 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:16); 30 30

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 35 15 20 25

Lys Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO :17) ; 30 25

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 5 1 5 10 lie Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Lys(COCH2PEG2) Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:18); ja 30 10

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10 lie Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 15 Lys(COCH2PEG5000) Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:19).

30

Eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan (I) mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, joissa Xaa22-20 31 on SEKVENSSI ID NO:28, joilla <μΗ> 100°:ssa on noin 0,25. Tyypillinen tämän alaryhmän polypeptidi on muun muassa:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 25 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala 15 20 25

Glu Ala Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:20).

30 30

Eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan (I) mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, joissa Xaa22~ 31 on SEKVENSSI ID NO:29, joilla <μΗ> 100°:ssa on noin 0,28. Tyypillinen tämän alaryhmän polypeptidi on muun 35 muassa: 26

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu 15 20 25 5 Ser Ser Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:21).

30

Eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän niiden kaavan (I) mukaisten polypeptidien valmistamiseksi, joissa Xaa22-10 31 on SEKVENSSI ID NO:30, joilla <μΗ> 100°:ssa on noin 0,29. Tyypillinen tämän alaryhmän polypeptidi on muun muassa:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:22).

30 20

Vielä eräs keksinnön näkökanta sisältää menetelmän fysiologisesti aktiivisen typistetyn bPTH(1-34)-homologin poly-peptidianalogien, kuten kaavassa (II) esitettyjen, valmistamiseksi : 25

Xaa1 Vai Ser Glu Ile Gin Xaa7 Xaa8 His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa16 Ser Xaaj8 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 His Asn Xaa34 loppu, jossa Xaa1 on Ser tai Ala; 30 Xaa7 on Leu tai Phe;

Xaa8 on Met tai Nle;

1 G

Xaa on Asn tai Ser;

Xaa18 on Leu, Met tai Nle;

Xaa19 on Glu tai Arg; 35 Xaa21 on Vai tai Arg;

Xaa22-31 on SEKV. ID NO:26, 27, 28, 29 tai 30; 27

Xaa34 on Phe tai Tyr; loppu on -OH tai -NR2, jossa jokainen R on H tai (Ci-C4)al-kyyli; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat. (Kaava II) Tyypillisiä sellaisia polypeptidejä ovat muun 5 muassa:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 10 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:23) ja 30

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His 15 10 15 Leu Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:24).

30 20 Vielä eräässä keksinnön näkökannassa on yllättäen havaittu, että myös sellaiset PTH:n ja PTHRP:n homologit ja analogit, joissa on vähemmän kuin 34 aminohappoa, ovat tehokkaita luuta uudismuodostavia aineita. Näillä yhdisteillä on yleiskaava: 25 Ala Vai Ser Glu Xaa5 Gin Leu Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13

Ser Ile Gin Asp Leu Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 loppu.

Tyypillisiä sellaisia polypeptidejä ovat muun muassa: 30

Yhdiste 41: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2 (SEKV. ID NO:55)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 35 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Pro NH2 (SEKV. ID NO:55).

30 28

Fysikaaliset tiedot 5 sp. 142, 8 - 166,1 °C [a]D25 = -53,80 (c 0,38, H20) FAB(C173H295N55049) · [M+H] + = 3929 AAA: Asx 2,0 (2) Glx 5,7 (6) Ser 1,8 (2)

His 3,0 (3) Gly 1,1 (1) Ala 0,9 (1)

Arg 2,8 (3) Val 1,2 (1) He 0,9 (1) 10 Leu 7,4 (8) Lys 4,4 (4) Pro 0,9 (1)

Yhdiste 42: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2 (SEKV. ID NO :56)

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 1 5 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu Pro NH2 (SEKV. ID NO:56).

30 20

Fysikaaliset tiedot sp. 161,0 - 177,0 °C [a]D25 = -61 , 9 7 (c 0,19, H20) F AB (C i6 7H28 8^52 048 ) : [M+H]+ = 3792,0 AAA: Asx 2,2 (2) Glx 5,9 (6) Ser 1,9 (2) 25 His 2,1 (2) Gly 1,1 (1) Ala 1,0 (1)

Arg 3,0 (3) Val 1,1 (1) He 1,0 (1)

Leu 7,9 (8) Lys 4,3 (4) Pro 0,9 (1)

Alan asiantuntija arvostaa sitä, että useita sellaisia 30 polypeptidianalogien muunnoksia voidaan syntetisoida, jotka sisältävät tässä kuvattuja haluttuja ominaisuuksia, edellyttäen että aminohapposekvenssi, jonka keskimääräinen hydrofobisuusmomentti tähdettä kohti 100° ± 20°:ssa on suurempi kuin noin 0,20, sijoitetaan asemiin (22-31).

35 29

Polypeptidien klassinen synteesi Tässä esitettyjä polypeptidejä voidaan valmistaa menetelmillä, joita on julkaistu teoksissa J.M. Stewart ja J.D.

5 Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. painos, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984) ja J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2., Academic Press, New York, (1973) koskien kiinteäfaasisynteesiä ja teoksessa E. Schroder ja K. Lubke, The Peptides, Voi. 1, Academic 10 Press, New York, (1965) koskien liuossynteesiä.

Tavallisesti näihin menetelmiin kuuluu suojattujen aminohappojen perättäinen liittäminen kasvavaan peptidiketjuun. Tavallisesti ensimmäisen aminohapon joko amino- tai kar-15 boksyyliryhmä ja kaikki reaktiiviset sivuketjuryhmät suojataan. Näin suojattu aminohappo kiinnitetään sitten joko inerttiin kiinteään kantajaan tai se käytetään liuoksessa, ja sekvenssin seuraava, myös sopivasti suojattu aminohappo, lisätään olosuhteissa, jotka suosivat amidisidoksen 20 muodostumista. Lopulta halutut aminohapot ovat sitoutuneet sopivassa sekvenssissä, suojaryhmät ja kaikki kiinteä kantaja-aines poistetaan ja saadaan raaka polypeptidi. Polypeptidistä poistetaan suolat ja se puhdistetaan, mieluiten kromatografisesti, jolloin saadaan lopputuote.

25

Kiinteäfaasipeptidisynteesi kuuluu edullisiin menetelmiin sellaisten fysiologisesti aktiivisten typistettyjen polypeptidien analogien valmistamiseksi, joissa on vähemmän kuin noin 40 aminohappoa. Tässä menetelmässä a-aminoryhmän 30 (Na) vaikutukset ja kaikki reaktiiviset sivuketjut suojataan happo- tai emäsherkillä ryhmillä. Suojaryhmän tulisi olla stabiili peptidisidoksen muodostumisolosuhteissa samalla kun sen tulee olla helposti poistettavissa niin, että sillä ei ole vaikutusta jäljellä olevaan polypeptidi-35 ketjuun. Sopiviin a-aminosuojaryhmiin kuuluvat muun muassa t-butoksikarbonyyli (Boc), bentsyylioksikarbonyyli (Cbz), o-klooribentsyylioksikarbonyyli, bifenyyli-isopropyyliok- 30 sikarbonyyli, t-amyylioksikarbonyyli (Amoc), isobornyyli-oksikarbonyyli, a,a-dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyylioksi-karbonyyli, o-nitrofenyylisulfenyyli, 2-syaani-t-butoksi-karbonyyli, 9-fluorenyylimetoksikarbonyyli (Fmoc) ja vas-5 taavat, edullisesti t-butoksikarbonyyli (Boc). Edullisiin sivuketjujen suojaryhmiin kuuluvat muun muassa asetyyli, bentsyyli (Bzl), bentsyylioksimetyyli (Born), o-bromibent-syylioksikarbonyyli, t-butyyli, t-butyylidimetyylisilyyli, 2-klooribentsyyli (Cl-z), 2,6-diklooribentsyyli, syklohek-10 syyli, syklopentyyli, isopropyyli, pivalyyli, tetrahydro-pyran-2-yyli, tosyyli (Tos), trimetyylisilyyli ja trife-nyylimetyyli.

Kiinteätaasisynteesissä C-terminaalinen aminohappo kiinni-15 tetään ensin sopivaan hartsikantajaan. Sopivia hartsikan-tajia ovat sellaiset materiaalit, jotka ovat inerttejä asteittaisessa kondensaatiossa ja suojaamisen poistamisessa käytettyjä reagensseja ja reaktio-olosuhteita kohtaan, samoin kuin ne ovat liukenemattomia käytetyissä väliaineis-20 sa. Esimerkkejä kaupallisesti saatavista hartseista ovat styreeni/divinyylibentseenihartsit, jotka on modifioitu reaktiivisella ryhmällä, esim. kloorimetyloitu kopoly-(styreeni-divinyylibentseeni), hydroksimetyloitu kopoly-(styreeni-divinyylibentseeni) ja vastaavat. Bentsyloitu, 25 hydroksimetyloitu fenyyliasetamidometyyli (PAM) -hartsi on edullinen. Kun yhdisteen C-terminaali on amidi, edullinen hartsi on p-metyylibentshydryyliamino-kopoly(styreeni-divinyylibent seeni)hartsi.

30 Kiinnittäminen PAM-hartsiin voidaan suorittaa Na-suojatun aminohapon, edullisesti Boc-aminohapon, reaktiolla sen ammonium-, cesium-, trietyyliammonium-, 1,5-diatsabisyklo-[5,4,0]undek-5-eeni-, tetrametyyliammonium- tai samankaltaisena suolana etanolissa, asetonitriilissä, N,N-dimetyy-35 liformamidissa (DMF) ja vastaavassa, edullisesti cesium-suolana DMF:s s ä hartsin kanssa kohotetussa lämpötilassa, esimerkiksi 40 °C:n ja 60 °C:n välillä, edullisesti noin 31 50 °C:ssa, noin 12-72 tunnin ajan, edullisesti noin 48 tunnin ajan.

Na-Boc-aminohappo voidaan sitoa bentshydryyliamiinihart-5 siin sellaisilla menetelmillä kuin esim. liittäminen N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidin (DIC) / 1-hydroksibentsotri-atsolin (HOBt) välityksellä noin 2-24 tunnin ajan, edullisesti noin 2 tunnin ajan 10 °C:n ja 50 °C:n välisessä lämpötilassa, edullisesti 25 °C:ssa sellaisessa liuotti-10 messa kuin esim. dikloorimetaani tai dimetyyliformamidi, edullisesti dikloorimetaani.

Suojattujen aminohappojen perättäinen liittäminen voidaan tehdä alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä, tyypillisesti 15 automaattisella peptidisyntetisaattorilla. Trietyyliamii-nilla tai samankaltaisella emäksellä tapahtuvan neutrali-saation jälkeen jokaista suojattua aminohappoa pannaan edullisesti noin 1,5 - 2,5 kertaa molaarista ylimäärää ja liittäminen tehdään inertissä, ei-vesi-, polaarisessa 20 liuottimessa, kuten esimerkiksi dikloorimetaanissa, DMF:ssä tai niiden seoksessa, edullisesti dikloorimetaanissa ympäristön lämpötilassa. Tyypillisiä kiinnitysai-neita ovat N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC), N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi (DIC) tai muu karbodi-imidi, 25 joko yksin tai 1-hydroksibentsotriatsolin (HOBt), O-asyy-likarbamidien, bentsotriatsol-l-yylioksitris(pyrrolidi-no)fosfoniumheksafluorifosfaatin (PyBop), N-hydroksisuk-kinimidin, muiden N-hydroksi-imidien tai oksiimien läsnäollessa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää suojattujen ami-30 nohappojen aktiivisia estereitä (esim. p-nitrofenyyli, pentafluorifenyyli ja vastaavat) tai symmetrisiä anhydride jä .

Kiinteätaasisynteesin lopussa täydellisesti suojattu pep-35 tidi irrotetaan hartsista. Kun sidos hartsikantajaan on bentsyyliesterityyppiä, lohkeamiseen voidaan vaikuttaa 32 aminolyysimenetelmillä alkyyliamiinin tai fluorialkyyli-amiinien kanssa peptideillä, joilla on C-terminaalissa al-kyyliamidi, tai ammoniakki/metanolin tai ammoniakki/etanolin kanssa peptideillä, joilla on C-terminaalissa subs-5 tituoimaton amidi, noin -10 °C:n ja 50 °C:n välisissä lämpötiloissa, edullisesti noin 25 °C:ssa, noin 12-24 tunnin ajan, edullisesti noin 18 tunnin ajan. Peptidit, joiden C-terminaalissa on hydroksyyliryhmä, voidaan lohkoa HF:llä tai jollain muulla voimakkaasti happamalla suojauksenpois-10 tomenetelmällä tai saippuoitumisella. Vaihtoehtoisesti peptidi voidaan poistaa hartsista vaihtoesteröimällä esim. metanolin kanssa, minkä jälkeen seuraa aminolyysi tai saippuoituminen. Suojattu peptidi voidaan puhdistaa sili-kageelikromatografiällä.

15

Sivuketjujen suojaryhmät voidaan poistaa peptidistä käsittelemällä aminolyysituotetta esim. vedettömällä nestemäisellä fluorivedyllä anisolin tai muun karboniumionin sieppaajan läsnäollessa, fluorivety/pyridiini-kompleksi-käsit-20 telyllä, käsittelyllä tris(trifluoriasetyyli)boorin ja trifluori-etikkahapon kanssa, pelkistämällä vedyn ja palladiumin kanssa hiilellä tai polyvinyylipyrrolidonilla tai pelkistämällä natriumin kanssa nestemäisessä ammoniakissa, edullisesti nestemäisen fluorivedyn ja anisolin kanssa 25 noin -10 °C:n ja +10 °C:n välisessä lämpötilassa, edullisesti noin 0 °C:ssa, noin 15 minuutin ja 2 tunnin välisen ajan, edullisesti noin 1,5 tunnin ajan.

Bentshydryyliamiinihartsilla oleville peptideille loh-30 kaiseminen hartsista ja suojauksenpoistovaiheet voidaan yhdistää yhdeksi vaiheeksi, jossa käytetään nestemäistä fluorivetyä ja anisolia edellä kuvatulla tavalla.

Liuoksesta voidaan poistaa suola (esim. BioRad AG-3® 35 -anioninvaihtohartsilla) ja peptidi voidaan puhdistaa sarjalla kromatografiavaiheita, jossa käytetään jotakin 33 tai kaikkia seuraavia tyyppejä: ioninvaihtoa heikosti emäksisellä hartsilla asetaattimuodossa; hydrofobista ad-sorptiokromatografiaa derivatisoitumattomalla kopoly(sty-reeni-divinyylibentseenillä), esim. Amberlite® XAD; sili-5 kageeliadsorptiokromatografiaa; ioninvaihtokromatografiaa karboksimetyyliselluloosalla; partitiokromatografiaa, esim. Sephadex® G-25:llä; vastavirtajakaantumista; tai korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC), erityisesti käänteisfaasi-HPLC:tä oktyyli- tai oktadekyylisilyyli-10 silika (ODS) -sidotulla faasilla pakatulla pylväällä.

Eräs keksinnön näkökanta koskee menetelmiä polypeptidien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, joissa perättäisesti kondensoidaan suojattuja 15 aminohappoja sopivalla hartsikantajalla, poistetaan suoja-ryhmät ja hartsikantaja ja puhdistetaan tuote, jolloin saadaan PTH:n ja PTHRP:n fysiologisesti aktiivisten typistettyjen homologien ja analogien analogeja, edullisesti PTH(l-34):n ja PTHRP(1-34):n, joissa aminohapot asemissa 20 (22-31) muodostavat amfipaattisen α-helikaalisen peptidi- sekvenssin kuten edellä on kuvattu.

Polypeptidien rekombinanttisynteesi 25 Vaihtoehtoisesti tässä esitettyjä polypeptidejä voidaan valmistaa kloonaamalla ja ilmentämällä haluttua polypepti-diä koodaava geeni. Tässä menetelmässä valmistetaan halutun DNA-sekvenssin sisältävä plasmidi ja insertoidaan se sopivaan isäntämikro-organismiin, tavallisesti bakteeriin, 30 esimerkiksi E. coliin, tai hiivaan, esimerkiksi Saccharo-myces cerevisiae -lajiin, indusoimaan isäntämikro-organis-mi tuottamaan plasmidista useita kopioita ja samoin keksinnön mukaisesti valmistettavia polypeptidianalogeja koodaavaa cDNA:ta.

35

Ensin suunnitellaan valittua PTH- tai PTHRP-analogia koodaava synteettinen geeni, jossa on sopivat restriktioent- 34 syymien pilkkomiskohdat, jotka helpottavat myöhempiä muutoksia. Sekvenssin monistamiseen voidaan käyttää polymeraasiketjureaktiota (PCR), kuten Mullis on opettanut US-patenteissa 4,683,195 ja 4,683,202.

5

Monistettu synteettinen geeni voidaan eristää ja liittää sopivaan plasmidiin, kuten esimerkiksi Trp LE -plasmidiin, johon voidaan insertoida neljä geenikopiota peräkkäin. Trp LE -plasmidien valmistus kuvataan US-patentissa 4,738,921 10 ja EP-patenttijulkaisussa 0212532. Trp LE -plasmidit tuottavat yleensä 8-10 kertaa enemmän proteiinia kuin Trp E -plasmidit. Monistettu geeni voidaan sitten ilmentää sopivassa isännässä, joita ovat esim. E. coli tai S. cerevi-siae.

15 Tässä käytetty spesifinen ilmentymisvektori oli Trp LE 18 Prot (Ile3, Pro5), joka sisältää seuraavat perusosat: pBR322-fragmentti (EcoRI-BamHI), joka sisältää ampisillii-niresistenssigeenin ja plasmidin replikaation alkukohdan; 20 EcoRI-SacII-fragmentti, joka sisältää trp-promoottorin ja trpE-geenin; HIV-proteaasi (Ile3, Pro5) -geenifragmentti (SacII-Hindlll); bGRF-geenifragmentti (Hindlll-BamHI); ja transkription terminaattori E. colin rpoc-geenistä. HIV-proteaasi- ja bGRF-geenifragmentit eivät ole ratkaisevia 25 ja ne voidaan haluttaessa korvata muilla koodaavilla sekvensseillä .

Ilmennetyt multimeeriset fuusioproteiinit kasaantuvat so-lunsisäisesti stabiileihin inkluusio-onteloihin ja ne voi-30 daan erottaa muista solun proteiineista sentrifugoimalla. Eristetty fuusioproteiini muutetaan monomeeriseksi PTH-tai PTHRP-analogiksi ja se voidaan puhdistaa kationin-vaihto- ja/tai käänteisfaasi-HPLC:llä.

35 Vaihtoehtoiset kloonaus-, monistus-, ilmentämis- ja puhdistusmenetelmät ovat selviä alan asiantuntijoille. Tyypillisiä sellaisia menetelmiä esitetään teoksessa Mania- 35 tis, et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, toinen painos, Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

Käyttökelpoisuus ja antomuoto 5

Keksinnön mukaisesti vamistetut polypeptidit ovat hyödyllisiä nisäkkäiden monien eri tilojen, joissa ilmenee luu-aineksen häviämistä, ehkäisyssä ja hoidossa. Erityisesti tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden on 10 osoitettu toimivan osteoporoosin ja osteopenian ennaltaehkäisyssä ja hoidossa ihmisillä.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja polypeptidejä tai niiden suoloja annetaan tavallisesti määrinä noin 0,002-1 pg 15 kehon painokiloa kohti vuorokaudessa, edullisesti noin 0,04-0,2 pg kehon painokiloa kohti vuorokaudessa. Aktiivisen aineosan päivittäinen annos 50 kg:n painoiselle naiselle on noin 0,1-50 pg, edullisesti noin 2,0-10 pg. Muut nisäkkäät, kuten hevoset, koirat ja nautakarja, saattavat 20 tarvita suurempia annoksia. Annos voidaan antaa tavanomaisessa farmaseuttisessa koostumuksessa yhdellä antotavalla, monenlaisilla antotavoilla tai säädellysti lääkeainetta vapauttavana valmisteena, mitä tarvitaan tehokkaimpien tulosten saavuttamiseksi, edullisesti yhden tai useamman 25 kerran päivässä injektiona.

Täsmällisen annoksen ja koostumuksen sekä sopivimman lääk-keenantotavan valintaan vaikuttavat muun muassa valitun polypeptidin farmakologiset ominaisuudet, hoidettavan ti-30 lan luonne ja ankaruus sekä vastaanottajan fyysinen kunto ja henkinen tila.

Tyypillisiä lääkkeenantotapoja ovat oraalinen, parenteraa-linen (sisältäen ihonalaisen, lihaksensisäisen ja laski-35 monsisäisen antotavan), rektaalinen, bukkaalinen (sisältäen kielen alla pidettävät lääkkeet), pulmonaalinen, trans-dermaalinen ja intranasaalinen anto.

36

Farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat säilyttävät lähtöpo-lypeptidin biologisen aktiivisuuden ilman toksisia sivuvaikutuksia. Sellaisia suoloja ovat esim. a) happoaddi-5 tiosuolat, jotka on muodostettu epäorgaanisten happojen, esim. kloorivetyhapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosfo-rihapon, typpihapon ja vastaavien, kanssa; ja suolat, jotka on muodostettu orgaanisten happojen, esim. etikkahapon, oksaalihapon, viinihapon, meripihkahapon, maleiinihapon, 10 fumaarihapon, glukonihapon, sitruunahapon, omenahapon, askorbiinihapon, bentsoehapon, parkkihapon, pamoiinihapon (pamoic acid), algiinihapon, polyglutamiinihapon, nafta-leenisulfonihappojen, naftaleenidisulfonihappojen, polyga-lakturonihapon ja vastaavien, kanssa; b) emäsadditiosuo-15 lat, jotka on muodostettu monivalenssisten metallikatio-nien, kuten esim. sinkin, kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin ja vastaavien, kanssa; tai orgaanisten kationien, jotka on muodostettu N,N'-dibentsyylieteenidiamiinista tai 20 eteenidiamiinista, kanssa; tai c) a)- ja b)-kohtien yhdistelmät, esim. sinkkitannaattisuola ja vastaavat.

Keksinnön mukaisesti valmistetuista polypeptideistä saadaan farmaseuttisia koostumuksia, joissa aktiivisena aine-25 osana on tällainen polypeptidi tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola sekoituksena farmaseuttisesti hyväksyttävän, myrkyttömän kantajan kanssa. Kuten edellä on mainittu, sellaiset koostumukset voidaan valmistaa parente-raalista (ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai laskimon-30 sisäisesti) antoa varten, erityisesti nestemäisten liuosten tai suspensioiden muodossa; oraalista tai bukkaalista antoa varten, erityisesti tablettien tai kapseleiden muodossa; pulmonaalista tai intranasaalista antoa varten, erityisesti jauheiden, nenätippojen tai aerosolien muodos-35 sa, sekä rektaalista tai transdermaalista antoa varten.

37

Koostumukset voidaan antaa sopivasti yksikköannosmuodossa ja ne voidaan valmistaa millä tahansa farmaseuttisen alan hyvin tuntemalla menetelmällä, esimerkiksi kuten on kuvattu teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. pai-5 nos, Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Paren-teraalisesti annettavat formulaatiot voivat sisältää täyteaineina steriiliä vettä tai suolaliuosta, alkeeniglyko-leja, kuten esim. propyleeniglykolia, polyalkeeniglykole-ja, kuten esim. polyeteeniglykolia, kasviperäisiä öljyjä, 10 hydrattuja naftaleeneja ja vastaavia. Oraalisesti annettavia formulaatioita voidaan kasvattaa lisäämällä sappisuoloja tai asyylikarnitiineja. Nenän kautta annettavat formulaatiot voivat olla kiinteitä ja ne voivat sisältää täyteaineita, esim. laktoosia tai dekstraania, tai ne 15 voivat olla nenätippoihin tai annostussumutteisiin käytettäviä vesi- tai öljyliuoksia. Bukkaaliselle antotavalle tyypillisiä täyteaineita ovat sokerit, kalsiumstearaatti, magnesiumstearaatti, esihyytelöity tärkkelys ja vastaavat.

20 Nenän kautta annettavassa formulaatiossa voidaan nenän limakalvon läpi tapahtuvaa imeytymistä lisätä pinta-aktii-visilla aineilla, kuten esim. glykokoolihapolla, kooliha-polla, taurokoolihapolla, ethokoolihapolla, deoksikooliha-polla, kenodeoksikoolihapolla, dehydrokoolihapolla, glyko-25 deoksikoolihapolla, syklodekstriineillä ja vastaavilla, noin 0,2-15 painoprosentin välisenä määränä, edullisesti noin 0,5-4 painoprosenttia ja edullisimmin noin 2 painoprosenttia .

30 Keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden anto kohteelle pidentyneen ajanjakson aikana, esim. yhdestä viikosta vuoteen, voidaan suorittaa yhtenä antona säädellystä vapauttavaa lääkeainetta, joka sisältää halutulle vapautu-misajalle riittävän määrän aktiivista aineosaa. Tähän tar-35 koitukseen voidaan käyttää erilaisia säädellystä vapauttavia järjestelmiä, kuten yksiosaisia tai varastotyyppisiä mikrokapseleita, depot-implantaatteja, osmoottisia pumppu- 38 ja, vesikkeleitä, misellejä, liposomeja, transdermaalisia laastareita, iontoforeettisiä välineitä ja vaihtoehtoisia injektoitavia annostelumuotoja. Joidenkin säädellysti vapauttavien lääkkeenantomekanismien lisäpiirteenä on sen 5 kohdan paikallistaminen, jonne aktiivinen aineosa halutaan toimittaa, mikä saattaa osoittautua hyödylliseksi tiettyjen sairauksien hoidossa.

Yksi säädellysti vapauttavan formulaation muoto sisältää 10 polypeptidiä tai sen suolaa dispergoituna tai koteloituna hitaasti hajoavassa myrkyttömässä, ei-antigeenisessa polymeerissä, kuten esim. kopoly(maitohappo/glykolihappo), kuten on kuvattu Kentin, Lewisin, Sandersin ja Ticen uraauurtavassa työssä US-patentissa 4,675,189. Yhdisteitä, tai 15 mieluummin niiden suhteellisen liukenemattomia suoloja, voidaan formuloida myös kolesterolissa tai muissa lipidi-matriksipelleteissä tai silastomeerimatriksi-implantteina. Muut hitaasti vapauttavat depot-implant- tai injektoitavat formulaatiot ovat selviä alan asiantuntijalle. Katso esim. 20 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, toim. J. R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 ja R. W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987.

25 Seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit on tarkoitettu valaisemaan synteesiä ja keksinnön mukaisesti valmistettavien tyyppiyhdisteiden testaamista, eikä niitä pidä tulkita patenttivaatimusten piiriä rajoittavina. Esimerkeissä "sp." on sulamispiste, "[a]D25" on optinen aktiivisuus 25 30 °C:ssa tietyssä konsentraatiossa osoitetussa liuottimessa, "FAB" on fast atom bombardment -massaspektrometria ja "AAA" on aminohappoanalyysi, jonka yhteydessä odotusarvot ilmoitetaan suluissa havaittujen arvojen jälkeen. Aminohappoanalyysi suoritettiin laitteella Hewlett-Packard 35 AminoQuant Analyzer valmistajan suosittelemia ohjeita noudattaen. Primaariset aminohapot derivatisoitiin o-ftaali- 39 aldehydin kanssa; sekundaariset aminohapot Fmoc:n kanssa. Fluoresenssidetektiota käytettiin derivatisoitujen aminohappojen kvantitatiiviseen määrittämiseen. Suojatut aminohapot saatiin yhtiöltä Applied Biosystems Inc. (Foster 5 City, CA).

ESIMERKKI I

Yhdiste 1 (SEKV. ID NO:7) valmistettiin 0,5 mmol:n mitta-10 kaavassa kiinteätaasimenetelmällä 4-metyylibentshydryyli-amiinihartsilla käyttämällä automaattista Applied Biosystems Model 430A -peptidisyntetisaattoria. a-Aminoryhmät suojattiin t-butoksikarbonyylillä (Boc). Sivuketjujen suo-jaryhmät olivat: bentsyyli (Bzl) tähteille Asp, Glu ja 15 Ser; tosyyli (Tos) tähteelle Arg; bentsyylioksimetyyli (Born) tähteelle His; ja 2-klooribentsyyli (Cl-z) tähteelle Lys. Aminohapot liitettiin perättäisesti käyttämällä N,N-disykloheksyylikarbodi-imidi/1-hydroksibentsotriatsoli (DCC/HOBt) -menetelmää Stewartin ja Youngin (yllä) mukaan. 20 Jokaisen aminohappoliitännän jälkeen peptidi asetyloitiin käyttämällä asetanhydridin ja di-isopropyylietyyliamiinin seosta IV-metyylipyrrolidonissa. Valmis peptidi lohkottiin hartsista poistamalla samanaikaisesti suojaus sivuketju-suo j aryhmistä käyttämällä vedetöntä HF:ää (25 ml) anisolin 25 läsnäollessa (2,5 ml) -10 °C:ssa 30 minuutin ajan ja 0 °C:ssa 60 minuutin ajan. Sen jälkeen kun HF oli haihdutettu tyhjiössä, jäännös pestiin vedettömällä eetterillä ja raakapeptidi uutettiin 10%:isella etikkahapolla. 10%:isen etikkahappouutteen lyofilisointi antoi 900 mg raakatuotet-30 ta. Peptidi puhdistettiin keskimääräisessä paineessa ODS-käänteisfaasipylväskromatografiällä käyttämällä 22-45%:is-ta CH3CN-gradienttia 0,l%:isessa TFA:ssa. Tuote eluoitui kolmessa fraktiossa, jotka konsentroitiin ja lyofilisoi-tiin, jolloin saatiin 130 mg valkeaa kiinteää ainetta > 98 35 %:n puhtaudella.

40

Yhdiste 1: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2 (SEKV. ID NO:7)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 5 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:7) 30 10 Fysikaaliset tiedot sp. 150 - 159 °C [ex] D25 = -34, 88° (c 0,16, H20) FAB(C175H3ooN5605i) : [M+H] + = 4005,5 AAA: Asp, 1,9 (2); Glu, 5,6 (6); Ser, 1,6 (2); His, 2,7 (3) ; Gly, 1,0 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 2,8 15 (3); Vai, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,3 (8); Lys, 4,0 (4) .

Samalla tavalla valmistettiin ja karakterisoitiin yhdisteet 2, 5-18, 21-27, 29-36, 38-48, 50-54, 58-64 ja 66-70 20 korvaamalla tarvittaessa PAM-hartsi hydroksi-terminaalis-ten polypeptidien synteesiin.

Yhdiste 2: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH (SEKV. ID NO:6) 25 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:6) 30 30

Fysikaaliset tiedot sp. 154 - 170 °C [ex] d25 = -49,35° (c 0,46, H20) FAB(C175H3oiN5705o) : [M+H] + = 4005,0 35 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 5,9 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 3,0 41 (3) ; Vai, 1,2 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,8 (8); Lys, 4,2 (4) .

Yhdiste 5: 5 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH (SEKV. ID NO:15) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 10 Glu Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:15) 30

Fysikaaliset tiedot sp. 147 - 165 °C [ex] d25 = -49, 17° (c 0,66, H20) 15 FAB (C175H299N59O52) : [M+H] + = 4061 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 5,0 (5) ; Vai, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,7 (8); Lys, 1,9 (2) .

20

Yhdiste 6: AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH (SEKV. ID NO:16) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10 25 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:16) 30 30 Fysikaaliset tiedot sp. 150 - 170 °C [ex] o25 = -48,65° (c 0,54, H20) FAB (C175H299N63O52 ) : [M+H] + = 4118,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,2 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 6,9 35 (7); Vai, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,8 (8).

42

Yhdiste 7: AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH (SEKV. ID NO:17)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10 5 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Lys Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:17) 30 10 Fysikaaliset tiedot sp. 177 - 182 °C [ex] D25 = -46,17° (c 0,14, H20) FAB (C176H304N64O50 ) : [M+H] + = 4117 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 4,8 (5); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 6,7 15 (7); Vai, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,7 (8); Lys, 0,9 (1) .

Yhdiste 8: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH (SEKV. ID NO:5) 20 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Arg Lys Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:5) 25 30

Fysikaaliset tiedot sp. 147 - 165 °C [ox] d25 = -49 , 1 7° (c 0,66, H20) FAB (Ci76H305N59O49) : [M+H]+ = 4033,0 30 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 4,8 (5); Ser, 1,8 (2); His, 2,7 (3) ; Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,9 (4) ; Vai, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,9 (8); Lys, 4,0 (4) .

35 Yhdiste 9: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OH (SEKV. ID NO:10) 43

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 5 Glu Lys Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH (SEKV. ID NO:10) 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 158 - 160 °C [of] d25 = -44, 76° (c 0,1, H20) 10 FAB (C189H326N64O55) : [M+H] + = 4375,0 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 5,9 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3) ; Gly, 2,3 (2); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 5,0 (5); Vai, 1,2 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,8 (8); Lys, 4,3 (4) .

15

Yhdiste 10: AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH (SEKV. ID NO:14) Ala Vai Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser 15 10 20 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Ala Leu OH (SEKV. ID NO:14) 30 25 Fysikaaliset tiedot sp. 170 - 175 °C [a] D25 = -31,59° (c 0,54, H20) FAB (Ci74H3ooN5205i) : [M+H] + = 3936,0 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 6,0 (6); Ser, 1,8 (2); His, 2,0 (2); Gly, 1,2 (1); Ala, 3,0 (3); Arg, 2,8 (3); Vai, 1,1 30 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,9 (10); Lys, 3,0 (3).

Yhdiste 11: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH2 (SEKV. ID NO:11) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 35 1 5 10 44

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu Lys Glu Leu NH2 (SEKV. ID NO:11) 30 5

Fysikaaliset tiedot sp. 172 - 174 °C [ex] D25 = -43,29° (c 0,2, H20) FAB (Ci79H311N55052 ) : [M+H] + = 4065,8 AAA: Asp, 2,2 (2); Glu, 7,7 (7); Ser, 1,7 (2); His, 2,0 10 (2); Gly, 1,0 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Vai, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,3 (9); Lys, 5,1 (5).

Yhdiste 12: AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH2 (X= Nle, SEKV. ID 15 NO:23)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 20 Glu Lys Leu His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:23) 30

Fysikaaliset tiedot sp. 178 °C [Of] d25 = -36,88° (c 0,4, H20) 25 FAB (Ci82H295N5o05i) : [M+H]+ = 4001,6 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,5 (6); Ser, 2,7 (3); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 1,0 (1); Tyr, 0,8 (1); Vai, 2,0 (2); Phe, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu + Nle, 8,5 (7 + 2); Lys, 3,1 (3).

30

Yhdiste 13: AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH2 (X=Nle, SEKV. ID NO:24)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His 35 1 5 10 45

Leu Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:24) 30 5

Fysikaaliset tiedot sp. 260 °C [a] D25 = -37, 02° (c 0,2, H20) FAB (C184H304N56O49) : [M+H] + = 4084 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 5,5 (5); Ser, 2,6 (3); His, 3,1 10 (3); Ala, 1,0 (1); Gly, 1,1 (1); Arg, 3,2 (3); Tyr, 1,0 (1) ; Val, 1,0 (1); Phe, 1,0 (1); He, 1,0 (1); Leu, 9,0 (9) ; Lys, 3, 0 (3) .

Yhdiste 14: 15 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH2 (SEKV. ID NO :20) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala 15 20 25 20 Glu Ala Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:20) 30

Fysikaaliset tiedot sp. 190 - 225 °C [Of] D25 = -56,58° (c 0,36, H20) 25 FAB (Ci6iH272N54049 ) : [M+H]+ = 3747,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 4,9 (5); Ser, 1,7 (2); His, 2,6 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 7,6 (7); Arg, 2,8 (3); Val, 1,2 (1); He, 1,0 (1); Leu, 6,6 (6); Lys, 1,9 (2) .

30

Yhdiste 15: AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH2 (SEKV. ID NO:12) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 35 He Gin Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 46

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:12) 30

Fysikaaliset tiedot 5 sp. 170 - 180 °C [a] D25 = -48,19° (c 0,2, H20) FAB (Ci72H293N5305i) : [M+H] + = 3919,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,1 (3) ; Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 3,0 (3); Arg, 2,1 (2); Val, 1,1 (1); He, 1,0 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 4,4 10 (4) .

Yhdiste 16: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH2 (SEKV. ID NO:13) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 1 5 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:13) 30 20

Fysikaaliset tiedot sp. 190 - 195 °C [a] d25 = -50,50° (c 0,4, H20) FAB (Ci72H293N5305i) : [M+H] + = 3919,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,0 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 25 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 3,0 (3); Arg, 2,1 (2); Val, 1,1 (1); He, 1,0 (1); Leu, 7,5 (8); Lys, 4,2 (4) .

Yhdiste 17: 30 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH2 (SEKV. ID NO :21) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu 15 20 25 35 Ser Ser Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:21) 30 47

Fysikaaliset tiedot sp. 195 - 204 °C [Oi] d25 = -6 7, 11° (c 0,3, H20) FAB (C163H280N54O50) : [M+H]+ = 3796,0 5 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 2,9 (3); Ser, 6,8 (7); His, 3,1 (3); Gly, 1,2 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,0 (3); Vai, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,2 (8); Lys, 2,0 (2) .

10 Yhdiste 18: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH2 (SEKV. ID NO:22)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala 15 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:22) 30

Fysikaaliset tiedot 20 sp. 200 - 207 °C [a]D25 = -60,26° (c 0,6, H20) FAB (C174H284N56O50) : [M+H] + = 3960,0 AAA: Asp, 2,9 (3); Glu, 3,5 (4); Ser, 1,4 (2); His, 2,6 (3); Gly, 0,9 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 4,0 (4); Arg, 3,0 (3); Tyr, 0,9 (1); Vai, 1,9 (2); Phe, 1,1 (1); Ile, 0,9 25 (1); Leu, 3,6 (4); Lys, 4,1 (4).

Yhdiste 21: AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH2 (SEKV. ID NO:35) Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His 30 1 5 10

Leu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:35) 30 35 48

Fysikaaliset tiedot sp. 148 - 155 °C [a] D25 = -45, 97° (c 0,26, H20) FAB (C184H304N56O49) : [M+H] + = 4084 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 5,0 (5); Ser, 2,7 (3); His, 3,0 5 (3); Gly, 1,0 (1); Ala, 0,9 (1); Arg, 3,1 (3); Tyr, 0,9 (1); Vai, 1,0 (1); Phe, 0,9 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 9,3 (9); Lys, 3,2 (3).

Yhdiste 24: 10 AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:38) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Lys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 15 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:38) 30

Fysikaaliset tiedot sp. 175 - 182 °C [a] d25 = -49 , 99° (c 0,47, H20) 20 FAB(Ci75H299N4905i) : [M+H]+ = 3906,5 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,5 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,1 (2); Vai, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,1 (9); Lys, 6,5 (6).

25 Yhdiste 25: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:39) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 30 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:39) 30

Fysikaaliset tiedot 35 sp. 136,5 - 153,5 °C [a]D25 = -32,57° (c 0,13, H20) FAB (C175H300N60O51) : [M+H] + = 4060,8 49 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,1 (2); Arg, 5,2 (5); Val, 1,1 (1); He, 1,1 (1); Leu, 8,4 (8); Lys, 2,2 (2) .

5

Yhdiste 26: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH (SEKV. ID NO:40) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 10 He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala Pro OH (SEKV. ID NO:40) 30 15 Fysikaaliset tiedot sp. 125, 8 - 127, 2 °C [a]D25 = -54, 62° (c 0,23, H20) FAB (C180H306N60O53 ) : [M+H]+ = 4158,0 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 1,8 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 5,1 2 0 (5); Val, 1,0 (1); He, 1,0 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 2,1 (2); Pro, 1,1 (1).

Yhdiste 27: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH (SEKV. ID 25 NO:41)

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 30 Glu Arg Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH (SEKV. ID NO :41) 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 106 - 137,3 °C [a]D25 = -39,55° (c 0,67, H20) 35 FAB (Ci89H326N68055) : [M+H] + = 4430,5 50 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,6 (2); His, 2,7 (3); Gly, 2,2 (2); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,8 (2); Arg, 7,3 (7) ; Val, 0,8 (1); He, 1,0 (1); Leu, 8,1 (8); Lys, 2,1 (2) .

5

Yhdiste 29: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH2 (SEKV. ID NO:43) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 10 He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Tyr NH2 (SEKV. ID NO:43) 30 15 Fysikaaliset tiedot sp. 160 - 172 °C [a] D25 = -49, 85° (c 0,34, H20) FAB (Ci8iH304N56O52 ) : [M+H]+ = 4096,9 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 0,9 (1); Arg 3,0 20 (3); Tyr, 0,9 (1); Val, 1,0 (1); He, 1,0 (1); Leu, 7,7 (8) ; Lys, 4, 4 (4) .

Yhdiste 30: AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:44) 25 Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Tyr Ser 15 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:44) 30 30

Fysikaaliset tiedot sp. 130 - 171 °C [a] d25 = -40,65° (c 0,34, H20) FAB (C178H297N55O52) : [M+H]+ = 4039,4 35 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,5 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,4 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 2,9 51 (3); Tyr, 0,8 (1); Vai, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,9 (8) ; Lys, 3, 4 (3) .

Yhdiste 31: 5 AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:45) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Cys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 10 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:45) 30

Fysikaaliset tiedot sp. 140 - 160 °C [oi] D25 = -44, 48° (c 0,25, H20) 15 FAB (Ci72H293N5505iSi) : [M+H]+ = 3979 AAA: Asx + Cys, 3,0 (2 + 1); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,0 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 2,5 (3); Vai, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lys, 3,3 (3).

20

Yhdiste 32: AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:46) (X= Cys (CH2CONH (CH2) 2NH (biotinyyli) ) )

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser 25 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2, 30 (Xaa= Cys (CH2CONH (CH2) 2NH (biotinyyli) )) , 30 (SEKV. ID NO:46)

Fysikaaliset tiedot sp. (ei määritetty) [of] D25 = (ei määritetty) FAB (Ci86H3i6N5g054S2) : [M+H] + = 4306,6 35 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,8 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,1 52 (3); Vai, 1,1 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,3 (3); Lys, 3,3 (3) .

Yhdiste 33: 5 AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:47) (X= Lys(7-dimetyyliamino-2-okso-2H-l-benksopyraani-4-ase-tyyli)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser 15 10 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2, 30 (Xaa= Lys(7-dimetyyliamino-2-okso-2H-l-benksopyraani-4-15 asetyyli), (SEKV. ID NO:47)

Fysikaaliset tiedot sp. 135 - 205 °C [a] D25 = -26,92° (c 0, 104, 50%:inen aq. HOAc) 20 FAB (C188H311N57O54) : [M+H]+ = 4233 AAA: Asx 1,9 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,1 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,2 (3) ; Vai, 1,1 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,2 (8); Lys, 4,5 (4) .

25

Yhdiste 34: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHIAG-OH (SEKV. ID NO:48) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 30 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Gly OH (SEKV. ID NO:48) 30 35 35 Fysikaaliset tiedot sp. 92, 1 - 146,6 °C [a]D25 = -40, 76° (c 0,34, H20) 53 FAB (C177H302N56O53 ) : [M+H] + = 4062,0 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,7 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,0 (3); Gly, 2,2 (2); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg 2,8 (3); Val, 1,2 (1); He, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lys, 4,2 5 (4) .

Yhdiste 35: AVSX1HQLLHX2 KGKSIQX2LRR RX1LLX1KLLX1K LHA-OH (SEKV. ID NO: 49) (Xi= Glu(OCH3); X2= Asp(OCH3)) 10 Ala Val Ser Xaai His Gin Leu Leu His Xaa2 Lys Gly Lys Ser 15 10

He Gin Xaa2 Leu Arg Arg Arg Xaai Leu Leu Xaai Lys Leu Leu 15 20 25

Xaai Lys Leu His Ala OH 15 30 (Xaa3= Glu(OCH3) ; Xaa2= Asp(OCH3)) (SEKV. ID NO:49) Fysikaaliset tiedot sp. (ei määritetty) [of] D25 = -21,96° (c 0,132, H20) 20 FAB(C181H3iiN55052 ) : [M+H ] + = 4 0 8 9 , 0 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,3 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,1 (3) ; Val, 1,1 (1); He, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 4,2 (4) .

25

Yhdiste 36: AVSX1HQLLHX2 KGKSIQX2LRR RXiLLX^LLXiK LHA-OCH3 (SEKV. ID NO: 50) (Χχ= Glu(0CH3); X2= Asp(0CH3))

Ala Val Ser Xaai His Gin Leu Leu His Xaa2 Lys Gly Lys Ser 30 1 5 10

He Gin Xaa2 Leu Arg Arg Arg Xaai Leu Leu Xaai Lys Leu Leu 15 20 25

Xaai Lys Leu His Ala OCH3 30 35 (Xaa3= Glu(OCH3); Xaa2= Asp(OCH3)) (SEKV. ID NO:50) 54

Fysikaaliset tiedot sp. (ei määritetty) [a]D25 = -46, 80° (c 0,07, H20) FAB (C182H313N55O52) : [M+H] + = 4103 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 1,4 (2); His, 3,0 5 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,1 (1); Ala, 1,7 (2); Arg 3,2 (3) ; Vai, 0,6 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 4,1 (4) .

Yhdiste 38: 10 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH (SEKV. ID NO:52) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 15 Glu Lys Leu His Thr Ala Pro OH (SEKV. ID NO:52) 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 152,1 - 186,5 °C [a]D25 = -55, 91° (c 0,33, H20) 20 FAB (C180H306N56O53) : [M+H]+ = 4102,6 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg 2,9 (3) ; Vai, 1,2 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,7 (8); Lys, 4,3 (4) .

25

Yhdiste 39: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH (SEKV. ID NO:53) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 30 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Pro OH (SEKV. ID NO:53) 30 35 Fysikaaliset tiedot sp. 120 - 148,2 °C [a]D25 = -52, 78° (c 0,47, H20) 55 FAB (C177H301N55O52) : [M+H] + = 4031,0 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,5 (6); Ser, 1,8 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 0,9 (1); Arg 2,9 (3); Val, 1,2 (1); He, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lys, 3,6 5 (3) ; Pro, 0, 9 (1) .

Yhdiste 40: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-NH2 (SEKV. ID NO:54) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 10 1 5 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Pro NH2 (SEKV. ID NO :54) 30 15

Fysikaaliset tiedot sp. 133,9 - 155, 1 °C [cx] D25 = -54, 22° (c 0,37, H20) FAB (Ci77H3o2N5605i) : [M+H] + = 4030,7 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,9 (2); His, 2,9 20 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 0,9 (1); Arg, 2,8 (3) ; Val, 1,2 (1); He, 1,1 (1); Leu, 7,8 (8); Lys, 4,2 (4) ; Pro, 0, 9 (1) .

Yhdiste 41: 25 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2 (SEKV. ID NO:55) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 30 Glu Lys Leu His Pro NH2 (SEKV. ID NO:55) 30

Fysikaaliset tiedot sp. 142, 8 - 166, 1 °C [of] D25 = -53,80° (c 0,38, H20) 35 FAB (Ci73H295N55049 ) : [M+H] + = 3929 56 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,7 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,0 (3); Gly, 1,1 (1); Ala, 0,9 (1); Arg 2,8 (3); Val, 1,2 (1) ; He, 0,9 (1); Leu, 7,4 (8); Lys, 4,4 (4); Pro, 0,9 (1) .

5

Yhdiste 42: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2 (SEKV. ID NO:56) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 10 He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu Pro NH2 (SEKV. ID NO :56) 30 15 Fysikaaliset tiedot sp. 161,0 - 177,0 °C [Of] D25 = -61 , 9 7° (c 0,19, H20) FAB (0ΐ67Η28δΝ52048 ) : [M+H]+ = 3792,0 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,9 (2); His, 2,1 (2) ; Gly, 1,1 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,1 20 (1); He, 1,0 (1); Leu, 7,9 (8); Lys, 4,3 (4); Pro, 0,9 (1) -

Yhdiste 43: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH 25 (SEKV. ID NO:57)

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 30 Glu Lys Leu His Thr Arg Ser Ala Trp OH (SEKV. ID NO :57) 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 181 - 202 °C [ex] d25 = -45, 14° (c 0,19, H20) 35 FAB (Ci95H326N62056) : [M+H]+ = 4435,2 57 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,8 (6); Ser, 2,8 (3); His, 2,8 (3) ; Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 3,7 (4) ; lie, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lys, 4,3 (4); Trp, 0,9 (1) .

5

Yhdiste 44: AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH (SEKV. ID NO :58)

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 10 1 5 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH 30 35 40 15 (SEKV. ID NO :58)

Fysikaaliset tiedot sp. 130 - 132,2 °C [a]D25 = -46,66° (c 0,195, H20) FAB (C216H365N81O62 ) · [M+H] + = 5088,8 20 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 6,0 (6); Ser, 2,7 (3); His, 3,0 (3); Gly, 2,2 (2); Thr, 2,1 (2); Ala, 3,0 (3); Arg 10,5 (10); Val, 0,9 (1); He, 1,0 (1); Leu, 8,2 (8); Trp, 1,0 (1) .

25 Yhdiste 45: AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH2 (SEKV. ID NO :59)

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 1 5 10 30 He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 Glu Arg Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala 30 35 40

Trp NH2 (SEKV. ID NO:59) 35 58

Fysikaaliset tiedot sp. 158 - 174 °C [a] D25 = -43,57° (c 0,53, H20) FAB (C216H366N82O61) : [M+H] + = 5087,4 AAA: Asx 1,9 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 2,6 (3); His, 3,3 5 (3); Gly, 2,1 (2); Thr, 2,0 (2); Ala, 2,9 (3); Arg 10,1 (10); Vai, 0,9 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,3 (8); Trp, 1,1 (1) .

Yhdiste 46: 10 AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH (SEKV. ID NO:60) (X= Lys(dihydrokinnamoyyli))

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Xaa Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH

30 35 40 (Xaa= Lys(dihydrokinnamoyyli)) (SEKV. ID NO:60) 20 Fysikaaliset tiedot sp. 165, 4 - 175,2 °C [a]D25 = -40,43° (c 0,20, H20) FAB (C225H374N8o062 ) : [M+H]+ = 5191 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 2,8 (3); His, 3,2 (3); Gly, 2,1 (2); Thr, 2,0 (2); Ala, 3,2 (3); Arg, 9,9 25 (9); Vai, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,6 (8); Lys, 1,1 (1); Trp, 1,1 (1).

Yhdiste 47: AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH2 (SEKV. ID NO:61) 30 (X= norleusiini)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Nle Thr Arg Ser Ala Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25 35 Gin Asp Vai His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:61) 30 59

Fysikaaliset tiedot sp. 140 - 160 °C [a] D25 = -56,88° (c 0,16, H20) FAB (C180H287N55O58) : [M+H] + = 3989,8 5 AAA: Asx 3,0 (3); Glx, 2,9 (3); Ser, 3,7 (4); His, 2,8 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 2,0 (2) ; Tyr, 1,0 (1); Vai, 1,7 (2); Phe, 0,9 (1); Ile, 0,9 (1); Leu + Nle 5,8 (2 + 4); Lys, 3,4 (3); Trp, 1,1 (1).

10 Yhdiste 48: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA-NH2 (SEKV. ID NO:62)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 15 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Met Ala NH2 (SEKV. ID NO:62) 30 35 20 Fysikaaliset tiedot sp. 140 - 210 °C [ex] d25 = -47, 75° (c 0,178, H20) FAB (Ci8oH309N57052Si) : [M+H]+ = 4135,0 AAA: Asx 2,3 (2); Glx, 6,6 (6); Ser, 1,4 (2); His, 3,2 (3) ; Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,1 25 (3); Vai, 0,9 (1); Met, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,8 (8) ; Lys, 4, 4 (4) .

Yhdiste 50: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:64) 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:64) 35 30 60

Fysikaaliset tiedot sp. 136,5 - 156,8 °C [a]D25 = -49,89° (c 0,24, H20) FAB (C182H300N56O49 ) : [M+H] + = 4056,0 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 5,0 (5); Ser, 1,9 (2); His, 3,3 5 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,1 (2); Arg, 3,1 (3) ; Vai, 1,0 (1); Phe, 2,0 (2); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,2 ( 7) ; Ly s, 3,5 ( 4) .

Yhdiste 51: 10 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:65) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu His Lys Leu Leu 15 20 25 15 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:65) 30

Fysikaaliset tiedot sp. 80,7 - 141,0 °C [a] d25 = -55,38° (c 0,23, H20) 20 FAB(Ci76H3ooN58049 ) : [M+H] + = 4012,8 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 4,9 (5); Ser, 1,8 (2); His, 4,3 (4) ; Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,1 (3) ; Vai, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,1 (8); Lys, 3,9 (4) .

25

Yhdiste 52: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:66) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 30 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:66) 30 35 Fysikaaliset tiedot sp. 134,3 - 157, 9 °C [a]D25 = -50, 72° (c 0,45, H20) 61 FAB (C175H295N57O51) : [M+H] + = 4012,8 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,8 (2); His, 4,2 (4); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,0 (3); Val, 1,1 (1); lie, 0,9 (1); Leu, 8,1 (8); Lys, 3,1 5 (3) .

Yhdiste 53: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:67) Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 10 1 5 10 lie Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu lie 15 20 25

Ala Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:67) 30 15 Fysikaaliset tiedot sp. 142, 7 - 159,8 °C [a]D25 = -54, 01° (c 0,21, H20) FAB (Ci73H29gN56049 ) : [M+H] + = 3946,0 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 4,9 (5); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 (3) ; Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 3,1 (3); Arg, 3,1 20 (3); Val, 1,0 (1); He, 1,9 (2); Leu, 7,0 (7); Lys, 4,3 (4) .

Yhdiste 54: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA-NH2 (SEKV. ID NO:68) 25 Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

He Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Glu He His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:68) 30 30

Fysikaaliset tiedot sp. 138 - 185 °C [a] d25 = -50,17° (c 0,14, H20) FAB (Ci74H295N55053 ) : [M+H] + = 4005 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 7,1 (7); Ser, 1,7 (2); His, 2,8 35 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,1 (2); Arg, 3,1 62 (3); Vai, 1,1 (1); Ile, 1,7 (2); Leu, 7,1 (7); Lys, 2,7 (3) .

Yhdiste 58: 5 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH2 (SEKV. ID NO:72)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 10 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Arg Ser Ala Trp NH2 (SEKV. ID NO:72) 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 158 - 163 °C [Oi] d25 = -46, 06° (c 0,17, H20) 15 FAB (Ci95H327N63055 ) : [M+H] + = 4434,8 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,5 (6); Ser, 2,7 (3); His, 3,1 (3) ; Gly, 1,0 (1); Ala, 1,8 (2); Arg, 4,0 (4); Thr, 0,9 (1); Vai, 0,9 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lys, 3,9 (4) ; Trp, 1, 0 (1) .

20

Yhdiste 59: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX-OH (SEKV. ID NO:73) (X= Nal(2)= 3-(2-naftyyli)-L-alaniini)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 25 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Arg Ser Ala 3-(2-naftyyli)-L-alaniini-30 35 OH (SEKV. ID

30 NO:73)

Fysikaaliset tiedot sp. 156 - 162 °C [ex] d25 = -44, 44° (c 0,189, H20) FAB (Ci97H32gN62055 ) : [M+H]+ = 4445,6 35 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 5,5 (6); Ser, 2,8 (3); His, 2,9 (3); Gly, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 4,0 (4); Thr, 0,9 63 (1); Vai, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lys, 4,2 (4) ; Nai, 1, 1 (1) .

Yhdiste 60: 5 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH (SEKV. ID NO:74)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 10 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Ser Ala Trp OH (SEKV. ID NO:74) 30 35

Fysikaaliset tiedot 15 sp. 159 - 164 °C [a]D25 = -50, 94° (c 0,29, H20) FAB (C192H320N60O55 ) : [M+H] + = 4349,0 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 2,7 (3); His, 3,2 (3); Gly, 1,0 (1); Ala, 3,1 (3); Arg, 2,8 (3); Thr, 1,0 (1); Vai, 1,1 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,6 (8); Lys, 4,0 20 (4) ; Trp, 1, 0 (1) .

Yhdiste 61: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH (SEKV. ID NO:75) 25 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Glu Ile Arg Ala OH 30 30 35 (SEKV. ID NO:75)

Fysikaaliset tiedot sp. 155 - 210 °C [a] d25 = -46,15° (c 0,12, H20) FAB (C195H334N62O58) : [M+H] + = 4475,8 35 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 6,9 (7); Ser, 1,7 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,1 (1); Ala, 3,1 (3); Arg, 4,0 (4); Thr, 0,9 6 4 (1); Vai, 1,1 (1); Ile, 1,9 (2); Leu, 8,1 (8); Lys, 4,1 (4) .

Yhdiste 62: 5 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH (SEKV. ID NO:76)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 10 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Glu Ile Arg OH (SEKV. ID NO:76) 30 35

Fysikaaliset tiedot 15 sp. 186 - 218 °C [a]D25 = -52, 73° (c 0,265, H20) FAB (C192H329N61O57) : [M+H] + = 4404,4 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 6,6 (7); Ser, 1,9 (2); His, 3,4 (3); Gly, 1,1 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,8 (4); Thr, 1,0 (1); Vai, 1,1 (1); Ile, 1,7 (2); Leu, 7,9 (8); Lys, 4,0 20 (4) .

Yhdiste 63: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH (SEKV. ID NO:77) 25 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Glu Ile OH (SEKV. ID NO:77) 30 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 169 - 205 °C [a] d25 = -50, 78° (c 0,51, H20) FAB (C186H317N57O56) : [M+H]+ = 4248,0 35 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 6,8 (7); Ser, 1,8 (2); His, 3,3 (3); Gly, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,0 (3); Thr, 1,0 65 (1); Vai, 1,0 (1); Ile, 1,8 (2); Leu, 7,8 (8); Lys, 3,6 (4) .

Yhdiste 64: 5 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH (SEKV. ID NO:78) Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 10 Glu Lys Leu His Thr Ala Glu OH (SEKV. ID NO:78) 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 199 - 205 °C [ex] d25 = -52, 47° (c 0,41, H20) 15 FAB (C180H306N56O55) : [M+H] + = 4135,0 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 6,6 (7); Ser, 1,9 (2); His, 3,3 (3) ; Gly, 1,1 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 2,9 (3); Thr, 1,0 (1); Vai, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,2 (8); Lys, 3,8 (4) .

20

Yhdiste 66: SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:80) Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10 25 Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 15 20 25

Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:80) 30 30 Fysikaaliset tiedot sp. 134,2 °C [a] D25 = -48 , 12° (c 0,36, H20) FAB (C167H286N54O49) : [M+H] + = 3834,4 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,7 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 2,8 35 (3); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,4 (8); Lys, 4,3 (4).

66

Yhdiste 67: LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:81)

Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg 15 10 5 Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr 15 20 25

Ala NH2 (SEKV. ID NO:81)

Fysikaaliset tiedot 10 sp. 128,5 - 184, 5 °C [a]D25 = -6,53° (c 0,69, MeOH) FAB (Ci48H259N4704i) : [M+H] + = 3353 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 4,1 (4); Ser, 0,9 (1); His, 2,1 (2) ; Gly, 1,0 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3) ; Ile, 1,0 (1); Leu, 8,1 (8); Lys, 4,2 (4).

15

Yhdiste 68: LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:82)

Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg 15 10 20 Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 15 20 25 (SEKV. ID NO:82)

Fysikaaliset tiedot 25 sp. 165 - 210 °C [of] 025 = -36,05° (c 0,12, H20) FAB(Ci42H248N4604o) : [M+H] + = 3239,0 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 3,9 (4); Ser, 0,9 (1); His, 1,9 (2) ; Gly, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 2,9 (3) ; Ile, 0,9 (1); Leu, 6,8 (7); Lys, 4,2 (4).

30

Yhdiste 69: SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW—OH (SEKV. ID NO:83)

Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gin 35 1 5 10 67

Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 15 20 25 Leu His Leu His Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH 30 35 40 5 (SEKV. ID NO:83)

Fysikaaliset tiedot sp. 150 - 210 °C [ex] d25 = -18,0° (c 0,64, H20) FAB (C208H351N79O60) : [M+H]+ = 4918,6 10 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 2,8 (3); His, 3,1 (3); Gly, 2,2 (2); Thr, 2,2 (2); Ala, 2,2 (2); Arg, 10,4 (10); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,0 (8); Trp, 1,1 (1).

Yhdiste 70: 15 LLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH (SEKV. ID NO:84) Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg 15 10

Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His Leu His 15 20 25 20 Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp OH (SEKV. ID NO:84) 30 35

Fysikaaliset tiedot sp. 150 - 210 °C [a]D25 = -41 , 70° (c 0,36, H20) 25 FAB (Ci89H324N72052 ) : [M+H]+ = 4437, 14 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 4,1 (4); Ser, 1,9 (2); His, 2,0 (2); Gly, 2,1 (2); Thr, 2,0 (2); Ala, 2,1 (2); Arg, 9,7 (10); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,4 (8).

30 Analogi (yhdiste 57), jonka sivuketju on syklisoitu, syntetisoitiin kuten edellä, paitsi että N“-Boc-Ne-Fmoc-Lys ja N“-Boc-NY—Fmoc-Asp sijoitettiin vastaavasti asemiin 13 ja 17. Boc-aminohapon synteesin loppuvaiheilla hartsi käsiteltiin 20%:isella piperidiinillä DMF:ssä huoneenlämpö-35 tilassa 30 minuutin ajan. Hartsi suodatettiin ja pestiin DMF:llä, MeOH:lla ja CH2Cl2:lla. Hartsi (1,1 g) suspendoi- 68 tiin 10 mlrssa DMF:ää, joka sisälsi 250 mg PyB0P:ia. pH säädettiin välille 8-9 DIEA:lla ja hartsia sekoitettiin 1 tunnin ajan. Hartsi suodatettiin, pestiin DMF:11ä ja CH2C12:11a ja resuspendoitiin sitten DMF:s s ä. Liittäminen 5 toistettiin käyttämällä 125 mg PyBOP:ia. Hartsi suodatettiin, pestiin DMF:11ä, MeOH:lla ja CH2Cl2:lla ja kuivattiin. Sitten hartsi käsiteltiin HF:llä ja peptidi puhdistettiin kuten edellä on mainittu.

10 Yhdiste 57: I-1 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2 (SEKV. ID NO:71) I-

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:71) 20 30

Fysikaaliset tiedot sp. 142,5 - 163,5 °C [Of] D25 = -34,31° (c 0,17, H20) FAB (Ci75H29gN56O50) : [M+H]+ = 3986,4 25 AAA: Asx 1,9 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3) ; Gly, 1,1 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,0 (3); Thr, 1,0 (1); Vai, 1,1 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 4,0 (4) .

30 ESIMERKKI II

[Met34, Ala35]-yhdiste 1, AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKL-HTMA-NH2, (SEKV. ID NO:25), valmistettiin ja puhdistettiin esimerkin 1 menettelyjä seuraten. Tämä polypeptidi muutet-35 tiin homoseriinilaktoniksi seuraavasti. Puhdistettu peptidi (160 mg) liuotettiin 44%:iseen muurahaishappoon (4 ml). Tämä liuos yhdistettiin etukäteen sekoitetun syaanibromi-din (700 mg) ja fenolin (1,6 mg) liuoksen kanssa 44%:ises- 69 sa muurahaishapossa (4 ml) 0 °C:ssa. Liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa 2 tunnin ajan ja huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan. Tuotteen muodostumista seurattiin HPLC:llä (Vydac® C-18, 300 Ä, 4,6 x 250 mm, virtaus 1,2 ml/min, 25-45%:inen 5 asetonitriiligradientti 0,l%:isessa TFA:ssa 10 minuuttia). Reaktio oli valmis 4 tunnin sisällä. Puolet näytteestä konsentroitiin ja puhdistettiin preparatiivisella RP-HPLCrllä (Vydac® C-18, 25-45%:inen asetonitriiligradientti 0,l%:isessa TFA:ssa). Homoseriinilaktonipeptidifraktiot 10 yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 28 mg valkeaa kiinteää ainetta > 95 %:n puhtaudella, yhdistettä 4.

Yhdiste 4: 15 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX (X= hSerlac, SEKV. ID NO: 9)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 20 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr hSerlac (SEKV. ID NO:9) 30

Fysikaaliset tiedot 25 sp. 138 - 142 °C [a]D25 = -50,66° (c 0,1, H20) FAB (C176H299N55O52) : [M+H] + = 4017,61 AAA: Asp 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,0 (3); Thr, 1,1 (1); Ala, 1,1 (1); Arg, 2,7 (3); Vai, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,2 (8); Lys, 3,8 (4); Gly, 1,09 30 (1); hSer, 1,09 (1).

Samalla tavoin tämän menettelyn mukaisesti valmistettiin yhdiste 65.

70

Yhdiste 65: AVSEIQFXiHN KGKHLSSXiER VEWLRKKLQD VHNX2 (SEKV. ID NO:79) (Xi= L-norleusiini; X2= homoseriinilaktoni)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Lys Gly Lys His 5 1 5 10

Leu Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn hSerlac (SEKV. ID NO:79) 30 10 Fysikaaliset tiedot sp. 166 - 176 °C [a] D25 = -52,22° (c 0,25, H20) FAB (Ci8oH2ggN5405o) : [M+H] + = 4008,6 AAA: Asx 3,1 (3); Glx, 4,8 (5); Ser, 2,9 (3); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Ala, 1,1 (1); Arg, 2,0 (2); Vai, 2,7 15 (3); Phe, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu + Nle 5,9 (4 + 2);

Lys, 2,8 (3) .

ESIMERKKI III

20 Homoseriiniamidin valmistamiseksi raaka homoseriinilakto-nianalogi, yhdiste 4, konsentroitiin ja käsiteltiin 25 ml:n kanssa kyllästettyä NH3 metanolissa. Liuosta sekoitettiin 0 °C:ssa 2 tunnin ajan ja huoneenlämpötilassa 16 tunnin ajan. Reaktiota seurattiin HPLC:llä (Vydac® C-18, 25 300 Ä, 4,6 x 250 mm, virtaus 1,2 ml/min, 20-45%:inen ase- tonitriiligradientti 0,l%:isessa TFA:ssa) ja se oli valmis 18 tunnin kuluessa. Liuos konsentroitiin ja puhdistettiin preparatiivisella RP-HPLC:llä (Vydac® C-18, 25-45%:inen asetonitriiligradientti 0,l%:isessa TFA:ssa). Homoseriini-30 amidipeptidifraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin, jol loin saatiin 30 mg valkeaa kiinteää ainetta > 98 %:n puhtaudella, yhdistettä 3.

Yhdiste 3: 35 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NHz (X= hSer, SEKV. ID NO: 8) 71

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 5 Glu Lys Leu His Thr hSer NH2 (SEKV. ID NO:8).

30

Fysikaaliset tiedot sp. 138 - 142 °C [a] D25 = -45, 97° (c 0,25, H20) 10 FAB(C176H3o2N56052) : [M+H] + = 4033,9 AAA: Asp 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,6 (2); His, 2,8 (3); Gly, 0,97 (1); hSer, 0,97 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 2,9 (3); Vai, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,6 (8) ; Lys, 3, 9 (4) .

15

Samalla tavoin tämän menettelyn mukaisesti valmistettiin yhdisteet 22, 23 ja 28.

Yhdiste 22: 20 AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2 (SEKV. ID NO:36) (X= homoseriini)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 25 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn hSer NH2 (SEKV. ID NO:36) 30

Fysikaaliset tiedot 30 sp. 69, 4 - 128 °C [of] D25 = -43,93° (c 0,15, H20) FAB (Ci79H3o2N56049 ) : [M+H]+ = 4022,9 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 4,9 (5); Ser, 2,6 (3); His, 2,8 (3); Gly, 1,0 (1); Ala, 1,0 (1); Arg 3,0 (3); Vai, 1,0 (1); Phe, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,8 (9); Lys, 3,4 35 (3); 72

Yhdiste 23: AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2 (SEKV. ID NO:37) (X= homoseriini)

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Lys Gly Lys His 5 1 5 10

Leu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn hSer NH2 (SEKV. ID NO:37) 30 10

Fysikaaliset tiedot sp. 87, 1 - 142, 1 °C [a]D25 = -52, 14° (c 0,41, H20) FAB (C179H303N57O49) : [M+H]+ = 4038 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 4,9 (5); Ser, 2,7 (3); His, 2,8 15 (3); Gly, 1,0 (1); hSer, 1,0 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Vai, 1,1 (1); Phe, 0,9 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,9 (8) ; Lys, 3, 7 (4) .

Yhdiste 28: 20 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH2 (SEKV. ID NO:42) (X= homoseriini)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 25 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala Gly Arg Arg hSer NH2 30 35 (SEKV. ID NO:42)

Fysikaaliset tiedot 30 sp. 80 °C [Of] o25 = -48,64° (c 0,09, H20) FAB (C193H334N70O56) : [M+H]+ = 4530,0 AAA: Asx 2,2 (2); Glx, 6,1 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,0 (3); Gly, 1,9 (2); hSer, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,1 (2); Arg, 7,2 (7); Vai, 0,8 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,4 35 (8); Lys, 2,1 (2) .

73

Homoseriinialkyyliamidit valmistettiin samalla tavoin homoseriinilaktonista liuottamalla sitä DMF:ssä, joka sisälsi ylimäärän vastaavaa alkyyliamiinia. Sen jälkeen kun oli sekoitettu huoneenlämpötilassa useita päiviä (reakti-5 ota seurattiin analyyttisellä HPLC:llä), seos haihdutettiin kuivaksi ja peptidi puhdistettiin preparatiivisella HPLC:llä. Yhdisteet 55 ja 56 ovat vastaavia homoseriinial-kyyliamideja.

10 Yhdiste 55: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH3 (SEKV. ID NO:69) (X= homoseriini)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 15 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr hSer NHCH2CH3 (SEKV. ID NO:69) 30 20 Fysikaaliset tiedot sp. (ei määritetty) [a]D25 = (ei määritetty) FAB (Ci78H306N56O52) : [M+H] + = 4063,0 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 5,8 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,1 (3) ; Gly, 0,9 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 0,9 (1); Arg, 3,0 25 (3); Vai, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,4 (8); Lys, 3,7 (4) ; hSer, 0,9 (1).

Yhdiste 56: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH2C6H5 (SEKV.

30 ID NO:70) (X= homoseriini)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 35 Glu Lys Leu His Thr hSer NHCH2CH2C6H5 (SEKV. ID NO:70) 30 74

Fysikaaliset tiedot 2 5 sp. (ei määritetty) [a]D = (ei määritetty) FAB (C184H310N56O52) : [M+H] + = 4138,8 AAA: Asx 2,0 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 5 (3); Gly, 0,9 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 0,9 (1); Arg 3,0 (3) ; Vai, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 4,1 (4) ; hSer, 0,9 (1).

ESIMERKKI IV

10 N“-Boc-NY-Fmoc-L-2,4-diaminobutaanihapon cesiumsuola sidottiin Merrifield-hartsiin (DMF, 50 °C, 48 tuntia) ja käytettiin kiinteätaasisynteesissä Boc-Ala-hartsin sijasta kuten esimerkissä I. Synteesin loppuvaiheessa peptidiä kä-15 siteltiin 20%:isella piperidiinillä DMF:s s ä huoneenlämpö-tilassa 30 minuutin ajan, jotta sivuketjun Fmoc-suojaryhmä poistui. Suojattu peptidi syklisoitui spontaanisti laktaa-miksi, jolloin se irrottautui hartsista. Liuos suodatettiin hartsista ja haihdutettiin tyhjiössä öljyksi. Jään-20 nöstä käsiteltiin nestemäisellä HF:llä kuten esimerkissä I, jolloin saatiin suojaamaton raaka peptidi. Peptidi käsiteltiin ja puhdistettiin kuten esimerkissä I.

Yhdiste 49: 25 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX (SEKV. ID NO:63) (X= L-2,4-diaminobutyryylilaktaami)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 30 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr L-2,4-diaminobutyryylilaktaami 30 (SEKV. ID NO:63)

Fysikaaliset tiedot 35 sp. 161 - 181 °C [a]D25 = -48,38 (c 0,25, H20) FAB(C176H3ooN5605i) : [M+H]+ = 4016,8 75 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,3 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,1 (2); Arg, 2,9 (3) ; Val, 0,9 (1); He, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 3,8 (4) .

5

ESIMERKKI V

Esimerkin II homoseriinilaktonianalogin vesiliuosta käsiteltiin porsaan maksan esteraasin (Sigma Chemical Company, 10 St. Louis, MO) kanssa. Laktonin hydrolyysiä C-terminaali-seksi homoseriiniksi seurattiin analyyttisellä HPLCrllä. Kun hydrolyysin arvioitiin päättyneen, aines puhdistettiin preparatiivisella HPLCrllä samoin kuin esimerkissä I.

15 Yhdiste 37: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH (SEKV. ID NO:51) (X= homoseriini)

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 20 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr hSer OH (SEKV. ID NO:51) 30 25 Fysikaaliset tiedot sp. (ei määritetty) [a]D25 = (ei määritetty) FAB (C176H301N55O53 ) : [M+H] + = 4035,1 AAA: Asx 2,1 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 2,0 (2); His, 3,1 (3); Gly, 0,8 (1); hSer, 0,8 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,0 30 (1); Arg, 3,0 (3); Vai, 1,3 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,1 (8) ; Lys, 3, 8 (4) .

ESIMERKKI VI

35 Suojattu peptidi-hartsi BocAVS(Bzl)E(OBz)H(Bom)QLLHD-(OBz1)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD(OBz)LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE-(OBzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM syntetisoi- 76 tiin esimerkin 1 mukaisesti 0,35 mmol:n mittakaavassa. Kaikki Na-ryhmät suojattiin t-butoksikarbonyylillä (Boc); sivuketjusuojaryhmät olivat kuten ne on osoitettu. Synteesin päättymisen jälkeen peptidi-hartsia käsiteltiin 50 5 ml:n kanssa 20%:ista piperidiiniä dimetyyliformamidissa (DMF) huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, jotta lysiinin suojaryhmä fluorenyylimetoksikarbonyyli (Fmoc) poistuisi. Hartsi pestiin peräkkäin DMF:n, MeOH:n ja CH2Cl2:n kanssa ja kuivattiin antamaan 1,6 g osittain suojattua peptidiä. 10 Osittain suojatusta peptidistä asyloitiin 0,8 g (0,175 mmol) lysiinillä 0,44 g:n (0,3 mmol) kanssa metoksidi-(eteenioksi)etikkahappoa [PEG (2)CH2COOH] 20 ml:ssa DMF:ää huoneenlämpötilassa 0,16 g:n (0,3 mmol) bentsotriatsolyy-lioksi-tris(pyrrolidino)fosfoniumheksafluorifosfaattia 15 (PyBop) ja 0,067 g:n (0,525 mmol) di-isopropyylietyyli-amiinia (DIAE) läsnäollessa 5 tunnin ajan. Kun 5 tuntia oli kulunut, hartsi suodatettiin ja pestiin peräkkäin DMF:n, MeOH:n ja CH2Cl2:n kanssa. Asylointivaihe toistettiin kahdesti kunnes hartsille saatiin negatiivinen nin-20 hydrin-tulos. Lopullinen peptidi lohkottiin hartsista, sivuketjusuojaryhmät poistettiin ja se puhdistettiin kuten esimerkissä I; yhdistettä 19 saatiin 100 mg.

Yhdiste 19: 25 AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH (SEKV. ID NO:18) CH30(CH2CH20)2ch2c=o

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 30 15 20 25

Lys(COCH2PEG2) Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:18) 30

Fysikaaliset tiedot 35 sp. 145 - 195 °C [Of] D25 = -44,60° (c 0,2, H20) FAB (C183H316N64O54) : [M+H]+ = 4276,2 77 AAA: Asp 2,1 (2); Glu, 5,0 (5); Ser, 1,6 (2); His, 2,9 (3); Gly, 0,9 (1); Thr, 1,9 (2); Arg, 7,1 (7); Val, 1,1 (1); He, 1,0 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 0,9 (1).

5 ESIMERKKI VII

Peptidi syntetisoitiin, lohkottiin ja puhdistettiin samalla tavalla kuin esimerkissä IV, paitsi että asylointiai-neena käytettiin 2-metoksipoly(eteenioksi)etikkahappoa 10 [PEG(5000)CH2C02H] . 0,8 g (0,175 mmol) osittain puhdistet tua peptidiä tuotti 300 mg puhdasta yhdistettä 20.

Yhdiste 20: AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH (SEKV. ID NO:19) 15 CH30(CH2CH20) hoCH2C=0

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 20 15 20 25

Lys(COCH2PEG5000) Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:19) 30

Fysikaaliset tiedot 25 sp. 105 °C [ex] d25 = -22,95° (c 0,11, 50%:inen aq. HOAc) AAA: Asp 2,0 (2); Glu, 4,8 (5); Ser, 1,6 (2); His, 2,6 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,1 (1); Arg 7,3 (7); Vai, 0,8 (1) ; Ile, 0,9 (1); Leu, 8,3 (8); Lys, 1,1 (1); Ala, 1,8 (2) .

30

ESIMERKKI VIII

hPTHRP(1-34)-analogin geenin synteesi hPTHRP(1-34)-analogiyhdistettä 4 (SEKV. ID NO:9) koodaava 35 synteettinen geeni suunniteltiin niin, että se sisälsi nukleotidisekvenssin ja entsyymirestriktiokohdat, jotka 78 esitetään kuvassa 1. Tarvittavat oligodeoksinukleotidit valmistettiin DNA-syntetisaattorilla (Milligen/Biosearch) käyttämällä Sinhan ym., artikkelissa Nucleic Acid Research 12, 4539-4557 (1984), esittämää fosforamidiittimenetelmää. 5 Suojauksenpoiston jälkeen raa'at oligonukleotidit puhdistettiin geeli-elektroforeesilla preparatiivisilla 15%:i-silla polyakryyliamidigeeleillä. Oligonukleotidit paikallistettiin UV:n avulla, poistettiin geelistä, niistä poistettiin suolat Waters cl8 Sep-pak® -patruunoilla (cartrid-10 ges) ja ne lyofilisoitiin.

Monistaminen polymeraasiketjureaktiota (PCR) käyttäen ajettiin laitteistolla Perkin-Elmer Cetus thermal cycler 25 syklillä, joilla oli vaiheet: 94 °C 1 minuutti, 50 °C 2 15 minuuttia ja 72 °C 3 minuuttia, käyttäen reagensseja, joihin kuului Taq-polymeraasi, pakkauksesta "GeneAmp" DNA-amplifiointikitti (Perkin-Elmer Cetus).

Valmistettiin kaksi päällekkäistä oligonukleotidiä, 88-20 meerinen (2 pg) , PTH3, (SEKV. ID NO:31): CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC ATG GCT GTT TCT GAA CAT CAG 45

Met Ala Vai Ser Glu His Gin 1 5 CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA TCG ATT CAA GAT CTG AGA CGT 87 25 Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg 10 15 20 C 88 ja anti-sense 90-meerinen (2 pg) , PTH4 (SEKV. ID NO:32): 30 CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTAGA CAT AGT ATG CAG CTT TTC 46

Met Thr His Leu Lys Glu 30 AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC TTG AAT 88

Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gin Ile 35 25 20 15 CG 90, 79 templaatti-DNA-sekvenssiksi hPTHRP(1-34)-analogin geenille. Kahta reunustavaa aluketta, PTHPCR1: CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG (SEKV. ID NO:33) ja PTHPCR2: CCTCGAAGCT 5 TATGCATCAT TATC (SEKV. ID NO:34), hyödyntäen monistettiin kokonainen geeni PCRrllä. Monistetut DNA-tuotteet puhdistettiin geelielektroforeesilla 4%:isella NuSieve®-agaroo-sigeelillä. Vyöhyke, joka sisälsi synteettisen hPTHRP(l-34)-analogin geenin, pituudeltaan noin 150 emästä, pois-10 tettiin geelistä ja noin 200 ng DNA:ta eristettiin Elu-Quik® -lasigeeli-DNA-ekstraktiolla (Schleicher & Schuell, Keene, NH).

ESIMERKKI IX

15 hPTHRP(1-34)1-analogin geenin molekyylikloonaus

Esimerkin VI hPTHRP(1-34)-analogin geenin alikloonaamisek-si 200 ng monistettua DNA:ta eristettiin ja sitä pilkottiin restriktioentsyymeillä HinD III ja Sac II. Kuten ku-20 vassa 2 nähdään, DNA liitettiin 2 pg:aan TrpLE 18 Prot (Ile3, Pro5) -plasmidia, joka oli aiemmin pilkottu Hind 111:11a ja Sac II:lla.

Tuloksena saatu plasmidi, TrpLE 18 hPTHRP(1-34)1, joka 25 sisälsi yhden kopion hPTHRP(1-34)-analogin geenistä, transformoitiin sitten kompetentteihin E. coli HB 101 -soluihin (CLONTECH, Palo Alto, CA). Transformanteille tehtiin PCR-analyysi insertion varmistamiseksi. Transformoidut solupesäkkeet valikoitiin ja keitettiin 200 pl:ssa 30 vettä 5 minuutin ajan; 2 pl:lle tehtiin PCR kahden insert-tiä reunustavan alukkeen kanssa. Sitten PCR-tuote analysoitiin l%:isella agaroosigeelillä, jotta varmistuttiin yhden hPTHRP(1-34)-geeni-insertin kopion läsnäolosta. Trp LE18 hPTHRP(1-34)1-rakenne varmistettiin sitten DNA-sek-35 vensoinnilla automaattisella DNA-sekvenaattorilla (Applied Biosystems Model 373A, Foster City, CA) käyttämällä myyjän Dye Deoxy Terminator Sequencing -kittiä.

80

ESIMERKKI X

Monia hPTHRP(1-34)-analogin geenikopioita sisältävän Trp LE 18 -vektorin rakentaminen 5

Ainoat Nhe I ja Xba I -restriktiokohdat sijaitsevat lähellä hPTHRP(1-34)-analogin geenisekvenssin alkua ja loppua. Nämä kaksi kohtaa, jotka tunnistavat erilaiset sekvenssit, mutta tuottavat identtiset yksijuosteiset kohesiiviset 10 päät, mahdollistavat monien hPTHRP(1-34)-geenikopioiden rakentamisen Trp LE 18 -vektorin sisällä.

Suunnitelma toistuvien hPTHRP(1-34)-sekvenssien peräkkäiseksi rakentamiseksi esitetään pääpiirteittäin kuvassa 3. 15 Erillisissä reaktioissa 5 pg plasmidia Trp LE 18 hPTHRP(l-34)1, joka sisälsi yhden geenikopion, pilkottiin restrik-tioentsyymeillä Bam HI + Nhe I ja Xba I + Bam HI. Kummankin pilkkomisen jälkeen eristettiin noin 300 ng fragmenttia, joka sisälsi hPTHRP(1-34)-analogin geeniä. Nämä kaksi 20 fragmenttia yhdistettiin ja liitettiin muodostamaan Trp LE 18 hPTHRP(1-34)2 -plasmidi. Tätä plasmidia käytettiin transformoimaan kompetentit E. coli HB 101 -solut. Kahden hPTHRP(1-34)-geeni-inserttikopion läsnäolon määrittämiseksi transformoidut PCR-tuotteet lajiteltiin koon mukaan 25 l%:isella agaroosigeelillä. TrpLE 18 hPTHRP(1-34)2, joka sisälsi kaksi geenikopiota, varmistettiin sitten DNA-sek-vensoinnilla. Kahden hPTHRP(1-34)-geenin oikean fuusion tuloksena kohdat Nhe I ja Xba I poistuvat liitoskohdassa. Tämän vuoksi jäljelle jäävät Xba I ja Nhe I -kohdat tan-30 dem-geenien reunoilla ovat ainutlaatuisia.

Toistamalla tämä prosessi rakennettiin lopullinen plasmidi Trp LE 18 hPTHRP(1-34)4, joka sisältää neljä kopiota hPTHRP(1-34)-geenistä, kuten nähdään kuvassa 4. Trp LE 18 35 hPTHRP(1-34)4 -plasmidin sekvenssi havaittiin oikeaksi DNA-sekvenssianalyysillä.

81

ESIMERKKI XI

Trp LE IS hPTHRP(1-34)4:n ilmentäminen ja puhdistus Trp LE 18 hPTHRP(1-34)4:n induktio 5 Aloitusviljelmään, joka käsitti 50 ml:sta LB-kasvuliuosta, J.H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics," s.431 (1972), joka sisällytetään tähän viitteenä, ja joka aloi-tusviljelmä sisälsi 50 pg/ml ampisilliinia ja 100 pg/ml tryptofaania, siirrostettiin E. coli -soluja, jotka sisäl-10 sivät Trp LE 18 hPTHRP(1-34)4 -plasmidia, ja kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa voimakkaasti ravistellen A55o-arvoon noin 6. Kaksi litraa LB-tuotantoliuosta esilämmitettiin 37 °C:seen ja siihen ympättiin 20 ml aloitusviljelmää, jotta päästiin A55o-arvoon noin 0,06. Sitten viljelmää kasvatet-15 tiin voimakkaasti ravistellen A55o-arvoon välille 0,6 ja 0,8, minkä jälkeen lisättiin 2 ml indoliakryylihappo (IAA) -liuosta, jonka pitoisuus oli 10 mg/ml. Kasvatusta jatkettiin hyvin ilmastaen noin 16 tuntia lopulliseen A55o-arvoon noin 6 (tavallisesti 4:n ja 10:n välille). Solut konsent-20 roitiin sentrifugoimalla ja resuspendoitiin 500 ml:ssa 50 mM Tris-HCl:ää, pH 7,5, 0,1 inM EDTA-puskuriliuosta (Tris- puskuri).

Suspensiota sonikoitiin käyttämällä sonikaattoria Heat 25 Systems-Ultrasonics, Inc. malli 220F (varustettu 3/4" sarvella (horn)) 50 %:n teholla täydestä kapasiteetista ylikuumenemisen välttämiseksi.

Induktion laajuuden määrittämiseksi kokonaiset solut ana-30 lysoitiin SDS-PAGE:11a. Trp LE 18 hPTHRP(1-34)4 -rakenteesta johdetut geenituotteet havaittiin päävyöhykkeenä, jonka ennustettu molekyylipaino oli noin 17 000. Tämä vastaa niin paljoa kuin 10 % solun kokonaisproteiinista.

82

Fuusioproteiinin eristäminen

Solulysaattia sentrifugoitiin 15 minuutin ajan kiihtyvyydellä noin 3600 x g Trp LE 18 hPTHRP(1-34)4 -fuusioprote-5 iinin pelletoimiseksi; supernatantti heitettiin pois. Pelletti resuspendoitiin 200 ml:ssa Tris-puskuria. (tavallisesti 40-80 A55o/ml).

ESIMERKKI XII

10 Fuusioproteiinin käsittely ja homoseriinilaktoni-hPTHRP(1-34)-peptidin puhdistus

Multimeeristä hPTHRP(1-34)-fuusioproteiinia reunustavien metioniinitähteiden poisto CNBr:llä vapauttaa halutun ho-15 moseriinilaktoni-hPTHRP(1-34)-polypeptidin, joka puhdistettiin kuten alla on kuvattu.

Fuusioproteiinin CNBr-käsittely 20 Pesty TrpLE 18 hPTHRP(1-34)4 -fuusioproteiinipelletti resuspendoit iin kevyesti sekoittaen 60 ml:ssa 70%:ista muurahaishappoa (noin 20 mg/ml kokonaisproteiinia; tavallisesti aines 1000 :sta A550-yksiköstä soluja liukenee 3 ml:ssa). Lisättiin muutama tippa oktanolia ja N2 kuplitet-25 tiin liuoksen läpi 20 minuutin ajan ennen kuin lisättiin 5,5 g CNBr. Reaktion annettiin edetä 6 tuntia 25 °C:ssa ennen kuin näytteen kanssa sekoitettiin yhtä suuri tilavuus 50:50 Me0H:H20 -liuosta ja sen jälkeen haihdutettiin kiertohaihdutuksella. Sen jälkeen kun tämä menetelmä oli 30 toistettu 2-4 kertaa, muurahaishappo- ja CNBr-aines pääasiallisesti poistettiin. Näyte haihdutettiin sitten kuiviin, liuotettiin uudelleen 200 ml:aan vettä ja lyofili-soitiin varastointia varten.

83

Homoseriinilaktoni-hPTHRP(1-34):n puhdistus CNBr-pilkottu supernatantti dialysoitiin 50 mM KH2PO4 vastaan pH:ssa 6,5 24 tuntia monilla vaihdoksilla. Dialyysin 5 aikana pH pidettiin arvossa 6,5. Dialyysin jälkeen sakat poistettiin high speed -sentrifugoinnilla. Supernatantti selkeytettiin 0,45 pm:n Gelman -suodatinlaitteiston läpi (Acrodisc 4184).

10 Kationinvaihtokromatografia

Ensimmäinen puhdistus suoritettiin kationinvaihtokromato-grafialla Bio-Gel TSK-SP-5PW HPLC -pylväällä (21,5 x 150 mm). Kromatografiaolosuhteet virtausnopeudelle 8 ml/min ja 15 saannolle, joka oli noin 12 mg hyvin puhdistettua homose-riinilaktoni-hPTHRP(1-34)-peptidiä, olivat: 1. Pylvään tasapainotus 50 mM KH2PC>4:ssa, pH 6,5.

2. Syötä 10 ml selkeytettyä supernatanttia (noin 1,5 1 20 viljelylientä tai 2,4 g siirrosta).

3. Pese pylväs 50 mM KH2P04:lla pH:ssa 6,5, joka sisältää 50 mM NaCl, kunnes perusviiva (base line) on stabiloitu.

4. Eluoi pylväs 50 mM K^PCdrlla pH 6,5, joka sisältää 90 mM NaCl. Kerää fraktiot noin 45 minuutiksi.

25 5. Analysoi 90 mM NaCl-fraktioista homoseriinilaktoni- hPTHRP(1-34)-pitoisuus C18 HPLCrllä ennen yhdistämistä ja varastointia.

Käänteisfaasi-HPLC-kromatografia 30

Lopulliseen puhdistusvaiheeseen käytettiin käänteisfaasi-pylvästä Poros R/H 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA). Kromatografiaolosuhteet olivat seuraavanlaiset : 84

Liikkuva faasi A: 0,l%:inen trifluorietikkahappo (TFA) / vesi B: 0,l%:inen trifluorietikkahappo (TFA) / CH3CN 5

Aika Virtaus % B

0 min 4 ml/min 15 5.0 min 4 ml/min 40 5,2 min 4 ml/min 100 10 6,8 min 4 ml/min 100 7.0 min 4 ml/min 15

Homoseriinilaktoni-hPTHRP(1-34):n, yhdisteen 4, viipymis-aika oli noin 2,943 minuuttia. Puhdistettu peptidi oli 15 noin 98%risesti puhdasta massaspektrometrialla määritettynä .

ESIMERKKI XIII

20 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden vaikutusta luuainekseen arvioitiin rotilla, joiden munasarjat oli poistettu, yleensä Gunness-Heyn ja Hoekin, Metab. Bone Dis. 5: 177-181 (1984), menettelyjen mukaisesti .

25

Aikuiset naaraspuoliset Sprague-Dawley-rotat sopeutettiin ympäristöönsä, ryhmiteltiin koon mukaan (n= 9, 10 tai 12) ja niille tehtiin molemminpuolinen munasarjojen poisto (OVX) tai näennäisleikkaus. Annostus aloitettiin 17 päivää 30 leikkauksen jälkeen ja sitä jatkettiin 20 päivää. Testiyh-distettä annettiin ihonalaisesti kerran päivässä 2%:isessa rotan seerumi/suolaliuosapuaineessa.

20 päivän annostuksen jälkeen rotat tapettiin ja niiden 35 oikeat reisiluut poistettiin. Reisiluut leikattiin puoliksi ja distaaliset reisiluun puolikkaat (DHF) eroteltiin edelleen trabekulaariseksi luuksi (TB) ja kortikaaliseksi 85 luuksi poraamalla pois sidekudoksinen säie. Kalsium uutettiin ja mitattiin Calcette-kalsiumanalysaattorilla ja ilmaistiin keskimääräisenä luun kalsiumina mg/DHF/100 g kehon paino.

5

Kahden otoksen t-testiä käytettiin OVX- ja valeryhmän vertailuun. OVX-ryhmiä vertailtiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), minkä jälkeen tehtiin Fisherin LSD -monivertailu kunkin käsittelyryhmän ja apuaineen vertai-10 lemiseksi.

Munasarjojen poisto aiheutti huomattavaa luuaineksen häviämistä, erityisesti trabekulaarisesta luusta. Luun koko-naiskalsium oli 47-54 % alhaisempi kuin näennäiskäsitel-15 lyillä kontrollieläimillä.

80 pg/kg/vrk:n annostus bPTH(1-34):ää ja hPTHRP(1-34):ää aikaansai tilastollisesti merkittävän luun kokonaiskal-siumin nousun käsitellyillä OVX-rotilla vaihdellen 53 20 %:sta 95 %:iin ja vastaavasti 18 %:sta 40 %:iin; kortikaa-lisen luun kalsiumissa ei kuitenkaan tapahtunut merkittävää lisääntymistä.

Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet, annostettuna 25 määränä 80 pg/kg/vrk, lisäsivät luun kokonaiskalsiumia 66 %:ista 138 %:iin ja trabekulaarisen luun kalsiumia 87 %:sta 128 %:iin. Myös kortikaalisen luun kalsium, trabek-kelipaksuus ja luutilavuus kasvoivat merkitsevästi käsittelemättömiin OVX-kontrolleihin nähden.

30 Tässä analyysissä testattiin seuraavat yhdisteet:

Yhdisteen n Trabekulaarisen Kokonaisluun numero (# koetta) luun kalsium kalsium (kasvu-% (kasvu-% 35 OVX:ään verrattuna) OVX:ään verrattuna)

Yhdiste 1 6 101-128 % 88-138 % 86 (SEKV. ID NO:7)

Yhdiste 2 3 87-102 % 66-114 % (SEKV. ID NO:6)

Yhdiste 4 3 88-114 % 5 (SEKV. ID NO:9)

Samanlaisissa tutkimuksissa rotille, joilta munasarjat oli poistettu, annosteltiin 5, 10 ja 20 päivän ajan 40 pg/kg/vrk, ja saatiin seuraavat tulokset: 10

Yhdisteen n Antopäivien Kokonaisluun numero (# koetta) määrä (d) kalsium (kasvu-% OVX:ään verr.) 15 Yhdiste 1 6 20d 73-109 % (SEKV. ID NO:7)

Yhdiste 4 5 20d 79-105 % (SEKV. ID NO:9)

Yhdiste 4 1 lOd 79 % 20 (SEKV. ID NO:9)

Yhdiste 49 1 lOd 93 % (SEKV. ID NO:63)

Yhdiste 4 1 5d 55 % (SEKV. ID NO:9) 25 Yhdiste 42 1 5d 60 % (SEKV. ID NO:56)

ESIMERKKI XIV TOKSISUUS

30

Edellä olevassa esimerkissä XI ei keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden yhteydessä havaittu toksisia vaikutuksia.

87 SEKVENS SILIS TAUS (1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA: (A) NIMI: Syntex (USA) Inc.

(B) KATU: 3401 Hillview Avenue (C) KAUPUNKI: Palo Aito (D) OSAVALTIO TAI MAAKUNTA: Kalifornia (E) MAA: Yhdysvallat (F) POSTINUMERO: 94303 (G) PUHELIN: 415-852-1356 (H) TELEFAKSI: 415-496-3529 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Menetelmä PTH:n ja PTHRP:n analogien valmistamiseksi, ja niiden käyttö osteoporoosin hoitoon (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 8 4 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, ver sio #1.25 (EPO) (v) TIEDOT NYKYISESTÄ HAKEMUKSESTA: (A) HAKEMUSNUMERO: (2) SEKVENSSIN ID NO:1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:1:

Ser Vai Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Asn Ser Met Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Phe 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: 88 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Met His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Met Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Phe 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3:

Ser Vai Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Leu Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Phe 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 89 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile 15 20 25

Ala Glu Ile His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Arg Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:6: 90

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa34= homoseriini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8: 91

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa34= homoseriinilakto-ni " (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:9:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10: 92

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Gly Arg Arg 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:ll TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:11:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu Lys Glu Leu 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:12:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 93

Ile Gin Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:13:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:14:

Ala Vai Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Ala Leu 30 (2) SEKVENSSIN ID N0:15 TIEDOT: 94 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:15:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:16 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:16:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:17 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 95 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:17:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Lys Arg Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:18 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 29 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa29= lysiini-(0CCH2(0CH2CH2)20CH3) " (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:18:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Xaa Arg Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 96 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 29 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa29= lysiini-(OCCH2 (OCH2CH2) 110OCH3) " (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:19:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Xaa Arg Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:20 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:20:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala 15 20 25

Glu Ala Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:21 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 97 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:21:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu 15 20 25

Ser Ser Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:22 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:22:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:23 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 98 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 8 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa8= norleusiini" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 18 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaal8= norleusiini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:23:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Xaa His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Xaa Glu Arg Vai Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Tyr 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:24 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 8 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa8= norleusiini" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 18 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaal8= norleusiini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:24:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Xaa His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Xaa Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 99

Glu Lys Leu His Asn Tyr 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:25 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:25:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Met Ala 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:26 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 8 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa8= glutamiinihappo tai arginiini" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Alue (B) SIJAINTI: 1..10 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Sekvenssi 26 sijaitsee sekvenssien 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ja 14 alueella asemasta 22 asemaan 31." (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:26: 100

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu 15 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:27 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 8 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa8= glutamiinihappo, lysiini tai lysiini-(OCCH2PEGX) " (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Alue (B) SIJAINTI: 1..10 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Sekvenssi 27 sijaitsee sekvenssien 15, 16, 17, 18 ja 19 alueella asemasta 22 asemaan 31." (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:27:

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu 15 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:28 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) SIJAINTI: 1..10 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Sekvenssi 28 sijaitsee sekvenssin 20 alueella asemasta 22 asemaan 31." (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:28: 101

Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 15 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:29 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) SIJAINTI: 1..10 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Sekvenssi 29 sijaitsee sekvenssin 21 alueella asemasta 22 asemaan 31." (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:29:

Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu 15 10 (2) SEKVENSSIN ID NO:30 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 10 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Peptidi (B) SIJAINTI: 1..10 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus^ "Sekvenssi 30 sijaitsee sekvenssin 22 alueella asemasta 22 asemaan 31." (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:30:

Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala Glu Lys Leu 15 10 (2) SEKVENSSIN ID NO :31 TIEDOT: 102 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 88 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:31: CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGCATGGCT GTTTCTGAAC ATCAGCTGCT 50 TCATGACAAA GGTAAATCGA TTCAAGATCT GAGACGTC 88 (2) SEKVENSSIN ID NO:32 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 90 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Kyllä (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:32: CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTAGACA TAGTATGCAG CTTTTCAAGC 50 AGTTTCTCCA GCAGCTCGCG ACGTCTCAGA TCTTGAATCG 90 (2) SEKVENSSIN ID NO:33 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 23 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Ei (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:33: 103 CCTCTAGATC TCCGCGCGCT AGC 23 (2) SEKVENSSIN ID NO:34 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 24 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA

(iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Kyllä (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:34: CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC 24 (2) SEKVENSSIN ID NO:35 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:35:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Tyr 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:36 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 104 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on homoseriini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:36:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:37 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on homoseriini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:37:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Lys Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Asn Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:38 TIEDOT: 105 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:38:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Lys Leu Lys Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:39 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:39:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:40 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 106 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:40:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala Pro 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:41 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:41:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala Gly Arg Arg 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:42 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 38 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen 107 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 38 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on homoseriini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:42:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala Gly Arg Arg Xaa 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:43 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:43:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Tyr 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:44 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei 108 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO :44:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Tyr Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:45 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:45:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Cys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:46 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 13 109 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on Cys (CH2CONH (CH2) 2NH (biotinyyli) ) (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:46:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:47 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 13 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on Lys(7- dimetyyliamino-2-okso-2H-l-benksopyraani-4-ase-tyyli)" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:47:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:48 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini 110 (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:48:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Gly 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:49 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 4 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa4 on Glu(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 10 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "XaalO on Asp(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 17 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaal7 on Asp(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 22 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa22 on Glu(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 25 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa25 on Glu(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE:

Ill (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 29 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa29 on Glu(OCH3)" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:49:

Ala Vai Ser Xaa His Gin Leu Leu His Xaa Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Xaa Leu Arg Arg Arg Xaa Leu Leu Xaa Lys Leu Leu 15 20 25

Xaa Lys Leu His Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:50 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 4 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa4 on Glu(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 10 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "XaalO on Asp(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 17 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaal7 on Asp(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 22 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa22 on Glu(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 25 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa25 on Glu(OCH3)" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta 112 (B) SIJAINTI: 29 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa29 on Glu(OCH3)" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:50:

Ala Vai Ser Xaa His Gin Leu Leu His Xaa Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Xaa Leu Arg Arg Arg Xaa Leu Leu Xaa Lys Leu Leu 15 20 25

Xaa Lys Leu His Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:51 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on homoseriini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:51:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:52 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei 113 (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO :52:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Pro 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:53 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:53:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Pro 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:54 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:54: 114

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Pro 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:55 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:55:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Pro 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:56 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:56:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 115

Glu Lys Leu Pro 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:57 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:57:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Arg Ser Ala Trp 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:58 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:58:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arq Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Ala Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp 30 35 40 (2) SEKVENSSIN ID NO:59 TIEDOT: 116 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:59:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp 30 35 40 (2) SEKVENSSIN ID NO:60 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 42 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu paikka (B) SIJAINTI: 13 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaal3 on Lys(dihydrokinnamoyyli)" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:60:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Xaa Ser 1 5 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25

Glu Arg Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp 30 35 40 (2) SEKVENSSIN ID N0:61 TIEDOT: 117 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu paikka (B) SIJAINTI: 8 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Leu8 on norleusiini" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu paikka (B) SIJAINTI: 18 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Leul8 on norleusiini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:61:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Leu Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Leu Thr Arg Ser Ala Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Tyr 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:62 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:62:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 118

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Met Ala 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:63 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 33 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 33 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on Thr-1,4-diaminobutyryylilaktaami" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:63:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:64 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:64:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 119

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:65 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:65:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu His Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:66 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:66:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO :67 TIEDOT: 120 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:67:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Ile 15 20 25

Ala Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:68 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:68:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Glu Ile His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:69 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo 121 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on homoseriini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:69:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:70 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on homoseriini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:70:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:71 TIEDOT: 122 (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: molemmat (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:71:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:72 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:72:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Arg Ser Ala Trp 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:73 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 123 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 36 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on Ala-3-(2-naftyyli)-L-alaniini" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:73:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Arg Ser Xaa 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:74 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:74:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Ser Ala Trp 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:75 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 38 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 124 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:75:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Glu Ile Arg Ala 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:76 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:76:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Glu Ile Arg 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:77 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 36 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:77: 125

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Glu Ile 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:78 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (lii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:78:

Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10

Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25

Glu Lys Leu His Thr Ala Glu 30 35 (2) SEKVENSSIN ID NO:79 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 34 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Peptidi (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: N-terminaalinen (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 8 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Leu8 on norleusiini" 126 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 18 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Leul8 on norleusiini" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: Modifioitu kohta (B) SIJAINTI: 34 (D) MUU INFORMAATIO: /huomautus= "Xaa on homo seriinilak töni" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:79:

Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Leu His Asn Lys Gly Lys His 15 10

Leu Ser Ser Leu Glu Arg Vai Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu 15 20 25

Gin Asp Vai His Asn Xaa 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:80 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 32 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:80:

Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin 15 10

Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 15 20 25

Leu His Thr Ala 30 (2) SEKVENSSIN ID NO:81 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 28 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini 127 (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:81:

Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg 15 10

Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala 15 20 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:82 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 27 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:82:

Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg 15 10

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu His Thr Ala 15 20 25 (2) SEKVENSSIN ID NO:83 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 41 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:83:

Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gin 15 10

Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 15 20 25 128

Leu His Leu His Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp 30 35 40 (2) SEKVENSSIN ID NO:84 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 35 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: Proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: Sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:84:

Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile Gin Asp Leu Arg Arg 15 10

Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg Leu His Ala Gly 15 20 25

Arg Arg Thr Arg Ser Ala Trp 30 35

Claims (21)

1. Menetelmä modifioidun lisäkilpirauhashormonin kaltaisen peptidin (PTHRP) tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, jolla on kaava Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa Xaa Xaa Xaa Leu His Xaa Xaa Gly Xaa13 Ser Ile Gin Xaa17 Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 "loppu", jossa Xaa1 on poissa tai se on Ala; Xaa2 on poissa tai se on Vai; Xaa3 on poissa tai se on Ser; Xaa4 on poissa tai se on Glu tai Glu(OCH3); Xaa5 on poissa tai se on His tai Ala; Xaa6 on poissa tai se on Gin; Xaa7 on poissa tai se on Leu; Xaa10 ja Xaa17 ovat toisistaan riippumatta Asp tai Asp(OCH3) ; Xaa11 on Lys, Arg tai Leu; Xaa13 on Lys, Arg, Tyr, Cys, Leu, Cys (CH2CONH (CH2) 2NH (bio-tinyyli)), Lys(7-dimetyyliamino-2-okso-2H-l-bentsopyraani- 4-asetyyli) tai Lys(dihydrokinnamoyyli); Xaa20 on Arg tai Leu; Xaa19 ja Xaa21 ovat toisistaan riippumatta Lys, Ala tai Arg; Xaa22-31 muodostaa amfipaattisen α-heliksin ja on: a) Xaa22 Xaa23 Leu Xaa25 Xaa26 Leu Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31, jossa Xaa22 ja Xaa25 ovat toisistaan riippumatta Glu, Glu(OCH3), His tai Phe; Xaa23 on Leu tai Phe; Xaa26 on Lys tai His; Xaa23 ja Xaa31 ovat toisistaan riippumatta Leu tai Ile; Xaa23 on Ala, Arg tai Glu; ja Xaa30 on Lys tai Glu (SEKV. ID NO:85); poislukien yhdiste, jossa Xaa on Phe, Xaa on Phe, Xaa25 on His, Xaa26 on Lys tai His, Xaa28 on Ile, Xaa29 on Ala, Xaa30 on Glu ja Xaa31 on Ile, poop pc p q b) Xaa Xaa Leu Xaa Arg Leu Leu Xaa Arg Leu, jossa

22. S I. Xaa ja Xaa ovat toisistaan riippumatta Glu, Glu(OCH3), His tai Phe; Xaa23 on Leu tai Phe; Xaa29 on Glu, Lys tai Lys (COCH2PEGX) ja PEGX on poly-(eteeniglykolimetyylieetteri) radikaali, jonka molekyyli-paino on 100 - 10 000 (SEKV. ID NO:86); c) Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu (SEKV. ID NO:28); d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu (SEKV. ID NO:29); e) Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu (SEKV. ID NO:30); Xaa32 on His, Pro tai Lys; Xaa33 on poissa tai se on Pro, Thr, Glu tai Ala; Xaa34 on poissa tai se on Pro, Arg, Met, Ala, hSer, hSer- laktoni, Tyr, Leu tai 1,4-diaminobutyryylilaktaami; Xaa35 on poissa tai se on Pro, Glu, Ser, Ala tai Gly; Xaa36 on poissa tai se on Ala, Arg tai Ile; Xaa37 on poissa tai se on Arg, Trp tai 3-(2-naftyyli)-L- alaniini; Xaa on poissa tai se on Ala tai hSer, tai Xaa on Thr Arg Ser Ala Trp; ja "loppu" on -OR tai -NR2, jossa kumpikin R on toisistaan riippumatta H, (Ci-C4)alkyyli tai fe-nyyli (Ci-C4) alkyyli, tunnettu siitä, että a) kiinteätaasisynteesimenetelmällä liitetään suojattuja aminohappoja perättäisesti sopivaan hartsikantajaan, poistetaan sivuketju- ja Nu-suojaryhmät ja lohkaistaan polypeptidi hartsikantajasta, tai b) rekom-binanttisynteesimenetelmällä kloonataan ja ekspressoidaan haluttua polypeptidiä koodaava geeni.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Xaa22”31 on Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu, jossa Xaa on Glu tai Arg (SEKV. ID NO:26).

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sitä että Xaa11 ja Xaa13 ovat molemmat Lys ja Xaa19 ja Xaa21 ovat molemmat Arg.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Arg Lys Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:5) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:6) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:7) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr hSer NH2 (SEKV. ID NO:8) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 _ 20 25 Glu Lys Leu His Thr hSerlaktoni (SEKV. ID NO:9) tai Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr Ala Gly Arg Arg OH (SEKV. ID NO:10) tai 30 35 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu Lys Glu Leu NH2 (SEKV. ID NO:11) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu Pro NH2 (SEKV. ID NO:56) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr 1,4-diaminobutyryylilaktaami 30 (SEKV. ID NO:63).

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Xaa11 ja Xaa13 ovat molemmat Lys ja toinen Xaa19:sta ja Xaa21:stä on Arg ja toinen on Ala.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Ala Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:12) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Ala Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:13). 30

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen Xaan:sta ja Xaa1 2:sta on Leu ja toinen on Lys, ja Xaa19 ja Xaa21 ovat molemmat Arg.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu Ala Gin Leu Leu His Asp Leu Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Ala Leu OH (SEKV. ID NO:14). 30

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Xaa22-31 on SEKV. ID NO: 85.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:66). 30

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu .. 00 — 7 1 siitä, että Xaa on Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu, jossa Xaa on Glu, Lys tai Lys(COCH2) PEGX ja PEGX on poly-(eteeniglykolimetyylieetteri)radikaali, jonka mole-kyylipaino on 100 - 10 000 (SEKV. ID N:0 27).

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Xaa11 ja Xaa1 ovat molemmat Lys tai Arg ja Xaa19 ja Xaa21 ovat molemmat Arg. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu 2 siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 Glu Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:15) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 Glu Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:16) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 1 5 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 Lys Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:17) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 Lys(COCH2PEG2) Arg Leu His Thr Ala OH (SEKV. ID NO:18) tai 30 Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu 15 20 25 Lys(COCH2PEG5000) Arg Leu His Thr Ala (SEKV. ID NO:19). 30

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Xaa22~31 on SEKV. ID NO: 28.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala 15 20 25 Glu Ala Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:20). 30

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sitä, että Xaa22”31 on SEKV. ID NO: 29.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu 15 20 25 Ser Ser Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:21). 30

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Xaa22-31 on SEKV. ID NO:30.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser 15 10 Ile Gin Asp Leu Arg Arg Arg Ala Phe Tyr Asp Lys Vai Ala 15 20 25 Glu Lys Leu His Thr Ala NH2 (SEKV. ID NO:22). 30

20. Menetelmä modifioidun lisäkilpirauhashormonipoly-peptidin (PTH) tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamiseksi, jolla on kaava Xaa1 Vai Ser Glu Ile Gin Xaa7 Xaa8 His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa16 Ser Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 His Asn Xaa34 "loppu", jossa Xaa1 on Ser tai Ala, Xaa7 on Leu tai Phe, Xaa8 on Met tai Nle, Xaa16 on Asn tai Ser, Xaa18 on Leu, Met tai Nle, Xaa19 on Glu tai Arg, Xaa21 on Vai tai Arg, Xaa22~31 on jokin sekvensseistä SEKV. ID NO:26, 27, 28, 29, 30, 85 tai 86, Xaa34 on Phe tai Tyr, "loppu" on OH tai NR2, jossa R on H tai (Ci-C4) -alkyyli, tunnettu siitä, että a) kiinteätaasisynteesimenetelmällä liitetään suojattuja aminohappoja perättäisesti sopivaan hartsikantajaan, poistetaan sivuketju- ja N“-suojaryhmät ja lohkaistaan polypeptidi hartsikantajasta, tai b) rekom-binanttisynteesimenetelmällä kloonataan ja ekspressoidaan haluttua polypeptidiä koodaava geeni.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polypeptidi on Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His 15 10 Leu Ser Ser Nle Glu Arg Vai Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:23) tai 30 Ala Vai Ser Glu Ile Gin Phe Nle His Asn Leu Gly Lys His 1 5 10 Leu Ser Ser Nle Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu 15 20 25 Glu Lys Leu His Asn Tyr NH2 (SEKV. ID NO:24). 30