KR20030097580A

KR20030097580A - 파라티로이드 호르몬 및 파라티로이드 호르몬 관련펩티드의 유사체를 포함하는 골다공증 치료용 약제학적조성물

Info

Publication number: KR20030097580A
Application number: KR1020027001830A
Authority: KR
Inventors: 존 엘. 크리스테난스키; 존 제이. 쥬니어. 네스토르; 테레사 엘. 호; 브라이언 에이취. 빅커리; 친 티. 바흐
Original assignee: 로쉐 팔로 알토 엘엘씨
Priority date: 1992-07-14
Filing date: 1993-07-13
Publication date: 2003-12-31
Also published as: HU9500110D0; HU211348A9; DE69330347T2; KR100404008B1; US5874086A; CA2140281C; HU217843B; EP1094073A2; CA2140281A1; US5807823A; JPH07509228A; EP1094073A3; FI120586B; US5798225A; ES2159293T3; US6051686A; KR100458350B1; KR100461618B1; US5695955A; FI950169A

Abstract

파라티로이드 호르몬(PTH), 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드 (PTHrp), 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 합성 폴리펩티드 유사체, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염(이때, Haa(Laa Laa Haa Haa)₂Laa 순서로 배열된 친지성 아미노산(Laa) 과 친수성 아미노산(Haa)으로부터 선택되는 아미노산 잔기(22-31)은 양쪽성 α-나선을 형성한다)은 포유동물의 골다공증의 치료 및 예방에 유용하다. 고체상 방법 및 재조합 방법으로 이 폴리펩티드를 제조하는 방법이 제공된다.

Description

파라티로이드 호르몬 및 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드의 유사체를 포함하는 골다공증 치료용 약제학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF OSTEOPOROSIS, COMPRISING ANALOGS OF PARATHYROID HORMONE AND PARATHYROID HORMONE RELATED PEPTIDE}

a) 발명의 분야

본 발명은 파라티로이드 호르몬 및 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드의 신규유사체, 고체상 제조 방법 및 재조합 방법을 이용한 이들의 합성 방법, 및 이들을 포함하는 포유 동물의 골 질량을 증가시키기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

b) 관련 기술 분야

골다공증은 대사성 골 질병의 가장 흔한 형태로 골 손실의 증상적인 골절 단계 (골감소증)로 여겨진다. 골다공증이 다수 주요 질환에 대해 2 차적으로 발생하지만, 전체 환자의 90% 는 특발적인 것으로 보인다. 폐경기 여성은 특히 특발성 골다공증의 위험이 크다(폐경기 또는 타입 I 골다공증). 특발성 골다공증의 다른 큰 위험군은 노년층 남녀이다 (노인성 또는 타입 II 골다공증). 또한 골다공증은 코르티코스테로이드 사용, 부동(不動) 또는 장기간의 침대 휴식, 알콜중독, 당뇨병, 생식선독성 화학요법, 과프롤락틴혈증, 신경성 식욕부진, 원발성 및 속발성 무월경, 및 난소적출과 관련되어 왔다.

다양한 형태의 골다공증에서, 기계적 불능의 시점에까지 이른 골 손실의 결과로서 흔히 골절이 일어난다. 대퇴경골절이 노인성 골다공증의 주요 형태이지만 폐경기 골다공증은 손목 및 척추의 골절을 특징으로 한다.

골다공증에서 골이 손실되는 기전은 골격이 자체적으로 재생되는 공정의 불균형과 관련되는 것으로 생각된다. 이 과정은 골 리모델링 (bone remodeling) 으로 불린다. 이 과정은 일련의 분리된 활성 포켓 (pocket)에서 일어난다. 이러한 포켓은 골 재흡수 부위인 골 표면상의 골 매트릭스내에 자발적으로 생긴다. 파골세포 (골 용해 또는 재흡수 세포)는 일반적으로 일정 치수의 골 일부의 재흡수에관여한다. 이 재흡수 과정은 조골세포 (골 형성 세포)의 출현을 수반하며 이는 그 다음 파골세포에 의해 남겨진 동공을 새로운 골로 재충전시킨다.

건강한 성인에게 파골세포와 조골세포의 생성 속도는 골 형성과 골 재흡수가 균형을 이루도록 하는 속도이다. 그러나, 골다공증에서 골 리모델링 과정의 불균형이 발생하며, 이로 인해 골이 형성되는 속도보다 더 빠른 속도로 골이 손실된다. 나이를 먹어갈수록 대부분의 각 개인에 있어서는 어느 정도 이와 같은 불균형이 일어나지만, 폐경기 골다공증 또는 난소적출 후의 젊은 연령층에서 훨씬 더 심각하게 일어난다.

골 손실은 지연시키거나 또는 더욱 바람직하게는 골 질량을 증가시킬 목적으로 골다공증을 치료하려는 노력이 경주되고 있다. 에스트로겐 및 비스포스포네이트와 같은 특정 제제는 골다공증의 골 손실을 한층 더 지연시키는 것으로 보인다. 골 재흡수와 골 형성간의 지속시간이 상이하기 때문에 골 손실을 지연시키는 제제도 골 질량을 증가시키는 것으로 보인다 (3 내지 7 % 정도). 그러나 이와 같은 뚜렷한 증가는 시간에 한시적이고 진행성이지 못하며, "리모델링 공간"의 감소가 원인이다. 또한 재흡수 및 형성사이의 밀접한 커플링으로 인하여 골 재흡수를 방해하는 치료는 또한 궁극적으로 골 형성을 방해한다.

파라티로이드 호르몬(PTH)로의 치료는 골 전환의 증가 및 양성 칼슘 균형 둘다를 유도하는 것으로 제안되었다. 그러나 사람의 임상 시험에서 골소주의 증가가 피질성 골의 감소에 의하여 파생되어 전체 골은 실질적으로 증가하지 않는 것으로 나타났다.

bPTH(1-84) 또는 hPTH(1-34)를 매일 피하 투여하면 정상 및 골다공증 성체 암컷 래트에서 개개 골의 전체 칼슘 및 회분 중량이 증가되는 것으로 보고되었다(헤프티 (Hefti) 등의 문헌[Clinical Science 62, 389-396 (1982)]).

성체 암컷 래트이 난소절제는 조골세포 및 소주 파골세포수를 상당히 증가시키면서, 근위 경골 골간단의 골소주의 47 % 손실을 유도하는 것으로 보고되었다(리우 (Liu) 등의 문헌[J. Bone Miner, Res. 6:10, 1071-1080 (1991)]). hPTH (1-34)를 매일 피하주사하면 골 소주의 손실을 완전히 역전시켰으며 샴(sham) 수술된 대조군의 양을 초과하는 양의 골소주를 형성하였다. 조골세포의 수는 증가하고 파골세포의 수는 감소하였다.

12 일동안 건강한 성체 수컷 래트에 hPTH(1-34) 를 매일 피하 주사하면 소주 및 경피 골 칼슘 및 건조 중량을 증가시키는 것으로 보고되었다(호크(Hock) 등의 문헌[J. Bone Min. Res, 7:1, 65-71 (1992)]). 총 골 질량, 소주 골 부피, 소주 두께와 수 및 조골세포 표면이 증가하였다.

예컨대, 사람(hPTH), 소(bPTH), 및 돼지(pPTH) 와 같은 포유동물 파라티로이드 호르몬은 분자량 약 9500 의 84 개 아미노산 잔기를 가지는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 생물학적 활성은 외관상 최소한으로 필요한 잔기(1-34) 를 가지는 N-말단부분과 관련된다.

사람 PTH 의 N-말단 단편은 소 및 돼지 호르몬의 N-말단 단편과 각각 단지 3개 및 2 개의 아미노산 잔기만이 상이하다 :

PTH 의 일차적 기능은 세포외액에서 Ca²⁺의 농도를 일정하게 유지하는 작용을 하는 적응 변화(the adaptive changes)를 일으키는 것이다. PTH 는 신장에서 뇨로부터 Ca²⁺의 세뇨관 재흡수를 증가시킬 뿐만 아니라 칼시페디올이 칼시트리올로 전환되는 것을 촉진하는 작용을 하며, 이는 장으로부터 Ca²⁺의 흡수를 일으킨다. 주요 효과중의 하나는 골로부터 Ca²⁺의 이동을 촉진하는 것이다. PTH 는 골에 작용하여 Ca²⁺및 인산염의 재흡수율을 증가시킨다. PTH 는 파골세포에 의한 골재흡수 속도를 촉진하며 간엽 세포가 파골세포로 분화되는 속도를 증가시키고 이들 세포의 반감기를 연장시킨다. PTH 의 작용이 연장됨에 따라 골형성 조골세포의 수도 증가하며, 따라서 골 전환 및 리모델링 속도도 증가한다. 그러나 각 조골세포는 정상 세포보다 활성이 적은 것으로 보인다.

로젠블라트 (Rosenblatt) 등에서 허여된 미합중국 특허 제 4,423,037 호, 제 4,968,669 호 및 제 5,001,223 호에서는 N-말단 (1-6) 아미노산의 결실 및 Phe⁷, Met^{8, 18}, 및 Gly¹²의 선택적 치환에 의하여 얻어진 PTH 길항제에 대하여 개시하고 있다. Tyr³⁴-NH₂는 이들 화합물의 활성 및 안정성을 증가시키는 것으로 보고되었다.

파라티로이드 호르몬-관련 펩티드 (PTHrp), 140+ 아미노산 단백질 및 이들의 단편은 PTH 의 주요 생물학적 작용을 재생시킨다. PTHrp 는 다수의 사람 및 동물의 종양, 및 기타 조직에 의해 생성되며 악성 과칼슘혈증에 중요한 기능을 할 수 있다. hPTHrp (1-34) 의 서열은 하기와 같다 :

hPTH 와 hPTHrp 사이의 서열상동성은 주로 13 N-말단 잔기에 한정되며 이중8 개 잔기는 동일하고 hPTH 의 (25-34) 수용체 결합 영역에서 10 개 아미노산중 오직 1 개만이 hPTHrp 에 보존된다. 구조적 유사성은 공통의 활성을 뒷받침할 수 있다. 코헨 (Cohen) 등의 문헌 [J. Biol. Chem. 266:3, 1997-2004 (1991)] 에서는 PTH(1-34) 와 PTHrp(1-34) 서열의 많은 부분, 특히 (5-18) 및 (21-34) 영역이 α- 나선 배열을 가짐이 제안되어 있는데, 이 배열이 생리학적 조건하의 카르복실 말단에도 효과가 있는지에 대해 다소 의문이 있음에 주의한다. 이와 같은 2 차 구조는 지방 상호작용, 수용체 상호작용 및/또는 구조적 안정성에 중요할 수 있다.

본 발명자들은 골다공증 환자를 포함한 포유동물의 골질량의 회복을 위한 개선된 치료제를 개발할 목적으로 PTH 및 PTHrp 의 유사체를 합성하였다.

제 1 도는 본 발명의 PTHrp(1-34) 유사체를 암호화하는 합성 유전자의 DNA 서열 및 제한 효소 부위를 도시한다(hPTH PCR 증폭).

제 2 도는 PTHrp(1-34) 유사체 유전자를 혼입하고 있는 플라스미드 (Trp LE 18 hPTHrp(1-34) 1 구조)의 제조 방법을 도시한다.

제 3 도는 PTHrp(1-34) 유사체 유전자 2 카피(copy)를 혼입하고 있는 플라스미드(Trp LE 18 hPTHrp(1-34) 2 구조)의 제조 방법을 도시한다.

제 4 도는 PTHrp(1-34) 유사체 유전자 4 카피를 혼입하고 있는 플라스미드(Trp LE 18 hPTHrp(1-34) 4 구조)의 제조 방법을 도시한다.

발명의 요약

본 발명은 파라티로이드 호르몬 (PTH), 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드 (PTHrp), 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 합성 폴리펩티드 유사체, 및 그의 염을 제공한다 (여기서, Haa (Laa Laa Haa Haa)₂Laa 순서로 배열된 친유성 아미노산 (Laa)과 친수성 아미노산(Haa) 중에서 선택되는 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 (amphipathic) α- 나선을 형성한다).

이와 같은 서열 유형의 특정 구체예를 PTH, PTHrp 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체에 삽입할 경우, 생성된 폴리펩티드는 골 리모델링제로서 유용하다.

한 태양에서, 본 발명은 PTH, PTHrp 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 유사체 및 동족체의 유사체 및 그의 염을 제공한다(여기서, 아미노산 잔기 (22-31) 는 양쪽성 α- 나선을 형성하며 이 아미노산 잔기 (22-31) 의 서열은 하기 a) 내지 e) 아미노산 서열중에서 선택된다 :

(이때, Xaa¹및 Xaa⁴는 독립적으로 Glu, Glu(OCH₃), His 또는 Phe 이고, Xaa²는 Leu 또는 Phe 이고, Xaa⁵는 Lys 또는 His 이고, Xaa⁷및 Xaa¹⁰은 독립적으로 Leu 또는 Ile 이고, Xaa⁸은 Ala, Arg 또는 Glu 이고, Xaa⁹는 Lys 또는 Glu 이다),

바람직하게는

(이때, Xaa 는 Glu 또는 Arg 이다) ;

(이때, Xaa¹및 Xaa⁴는 독립적으로 Glu, Glu(OCH₃), His 또는 Phe 이고, Xaa²는 Leu 또는 Phe 이고, Xaa⁸은 Glu, Lys 또는 Lys(COCH₂PEGX)이고, PEGX 는 분자량 100 내지 10,000 의 폴리-(에틸렌 글리콜 메틸 에테르) 라디칼이다),

바람직하게는

(이때, Xaa 는 Glu, Lys 또는 Lys (COCH₂PEGX)이고, PEGX 는 분자량 100 내지 10,000 의 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르) 라디칼이다) ;

다른 한 태양에서, 본 발명은 PTH, PTHrp, 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 유사체 및 그의 염을 제공한다 (여기서, 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 α-나선을 형성하며 이 아미노산 잔기 (22-31) 이 서열은 하기 a) 내지 e) 아미노산 서열중에서 선택된다.

(이때, Xaa 는 Glu 또는 Arg 이다) ;

(이때, Xaa 는 Glu, Lys 또는 Lys(COCH₂PEGX)이고, PEGX 는 분자량 100 내지10,000 의 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르) 라디칼이다);

또한, 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합된, 파리티로이드 호르몬 (PTH), 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드(PTHrp), 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 폴리펩티드 유사체, 및 그의 염(여기서, Haa (Laa Laa Haa Haa)₂Laa 순서로 배열된 친지성 아미노산(Laa)과 친수성 아미노산(Haa)으로부터 선택되는 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 α-나선을 형성한다)을 골 질량 증대 유효량으로 포함하는, 골 질량 감소를 특징으로 하는 질병 상태를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다. 또한 상기 화합물을 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합함을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법이 제공된다.

또한, 본 발명은 PTH, PTHrp, 또는 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 폴리펩티드 유사체 또는 그의 염(여기서, Haa (Laa Laa Haa Haa)₂Laa 순서로 배열된 친지성 아미노산(Laa)과 친수성 아미노산(Haa)으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (22-31) 은 양쪽 α-나선을 형성한다)을 골 질량 증대 유효량으로 골질량 감소의 치료가 필요한 포유 동물에 투여함을 포함하는, 골 질량 감소를 특징으로 하는 포유 동물의 질병 상태를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

더 구체적으로 본 발명은 PTH, PTHrp, 또는 PTH 및 PTHrp의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 폴리펩티드 유사체 또는 그의 염(여기서, 서열번호 26, 27, 28, 29 및 30 으로부터 선택되는 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 α-나선을 형성한다)을 골 질량 증대 유효량으로 골 질량 감소의 치료가 필요한 포유 동물에 투여함을 포함하는, 골 질량 감소를 특징으로 하는 포유 동물의 질병 상태를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 적당한 수지 지지체상에 보호된 아미노산을 순서에 따라 커플링시키고, 측쇄 및 N^α-보호 그룹을 제거하고, 수지로부터 폴리펩티드를 절단함을 포함하는, PTH, PTHrp, 또는 PTH 및 PTHrp의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 폴리펩티드 유사체 및 그의 염(여기서, Haa (Laa Laa Haa Haa)₂Laa 순서로 배열된 친지성 아미노산(Laa)과 친수성 아미노산(Haa)으로부터 선택되는 아미노산 잔기 (22-31) 은 양쪽 α-나선을 형성한다)의 고체상 합성 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 적당한 수지 지지체상에 보호된 아미노산을 순서에 따라 커플링시키고, 측쇄 및 N^α-보호 그룹을 제거하고, 수지로부터 폴리펩티드를 절단함을 포함하는, PTH, PTHrp, 또는 PTH 및 PTHrp의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 폴리펩티드 유사체 및 그의 염(여기서, 서열번호 26, 27, 28, 29 및 30 으로부터 선택되는 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 α-나선을 형성한다)의 고체상 합성 방법을 제공한다.

또한 PTH, PTHrp, 또는 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 폴리펩티드 유사체 또는 그의 염 (여기서, Haa (Laa Laa Haa Haa)₂Laa 순서로 배열된 친지성 아미노산(Laa)과 친수성 아미노산(Haa)으로부터 선택되는 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 α-나선을 형성한다)의 재조합 합성 방법을 포함한다.

또한 본 발명은 상기 폴리펩티드 유사체의 재조합 합성을 위한 DNA 서열, 벡터 및 플라스미드를 포함한다. 특히 본 발명은 PTH, PTHrp, 또는 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동촉체 및 유사체의 폴리펩티드 유사체 및 그의 염(여기서, 서열번호 26, 27, 28, 29 및 30 으로부터 선택되는 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 α-나선을 형성한다)의 재조합 합성을 위한 DNA 서열, 벡터 및 플라스미드를 제공한다.

약어 및 정의

다양한 공통의 뉴클레오티드 및 아미노산에 대한 일문자 및 삼문자 약어는 문헌 [Pure Appl. Chem. 31, 639-645 (1972) 및 40, 277-290 (1974)] 에 기술되어 있으며, PCT 규정[WIPO Standard ST.23; Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent Applications and Published Patent Documents] 및 37 CFR §1.822 (55 FR 18245, 1990년 5월 1일) 규정에 따른다. 일문자 및 삼문자 약어는 하기와 같다.

약어는 D- 또는 D, L- 와 같은 별도의 표기가 없는 한, L-아미노산을 나타낸다. 천연 및 비-천연의 특정 아미노산은 모두 비키랄성이고, 예컨대 글리신이다. 모든 펩티드 서열은 우측 C-말단 아미노산 및 좌측에 N-말단 아미노산으로 표시한다.

본 명세서에서 사용되는 기타 아미노산 및 화합물에 대한 약어는 하기와 같다:

hSer 호모세린

hSerlac 호모세린 락톤

Nle 노르류신

PEG2 디에틸렌 글리콜 메틸 에테르의 라디칼, 메톡시디(에틸렌옥시),

CH₃O(CH₂CH₂O)₂-(MW = 119)으로도 공지됨

PEG5000 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르)의 라디칼, 메톡시 폴리(에틸

렌옥시), CH₃O(CH₂CH₂O)₁₁₀-, (평균 분자량 = 5000)으로도 공지됨

PEGX 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르)의 라디칼, CH₃O(CH₂CH₂O)_n-,

n=2-225 (평균 분자량 = 100 내지 10,000)으로도 공지됨

"친수성 아미노산(Haa)" 은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 이들의 동족체와 같이, 펩티드 결합 형성에 필요한 그룹이외에 적어도 하나의 친수성 작용 그룹을 가지는 아미노산을 의미한다.

"친지성 아미노산(Laa)"은 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐 알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 이들의 동족체와 같이, 전하를 띠지 않는 지방족 또는 방향족 아미노산을 의미한다.

본 발명의 목적을 위하여, 알라닌은 양쪽성, 즉 친수성 또는 친지성으로 어느 쪽으로도 작용할 수 있는 그룹으로 분류한다.

"PTH 또는 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 또는 유사체" 는 PTH 또는 PTH 또는 PTHrp 에서 발견되는 아미노산의 완전한 상보성보다 덜한 상보성을 가지지만 유사한 생리학적 반응을 나타내는 서열을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 절단된 PTH 또는 PTHrp가 PTH 또는 PTHrp 와 유사한 생리학적 반응을 나타내기 위하여 PTH 또는 PTHrp 와 완전하게 상동일 필요는 없다. PTH(1-34) 및 PTHrp(1-34) 가 이러한 그룹의 바람직한 대표적인 예이지만 이에 한정되는 것은 아니다.

"양쪽성 α-나선" 은 아미노산이 나선의 장축을 따라 배향된 마주보는 극성 면과 무극성 면을 가지는 α-나선 배열을 갖는, 특정 폴리펩티드에 의해 나타나는 2 차 구조를 의미한다. 해당 폴리펩티드에서 α-나선 구조의 가능성은 적당한 피치의 "쉬퍼-에드문손휠"(Schiffer-Edmundson wheel; M. Schiffer & A. B. Edmundson, Biophys. J. 7,121 (1967)) 을 구성하고, 나선을 둘러싸는 원통의 대항면상에 친수성 및 친지성 잔기의 분리를 인지함으로써 어느 정도 탐구될 수 있다. 또 다르게는, 원형 이색성 또는 X-선 회절 자료 등과 같은 실험적 증거도 주어진 폴리펩티드에 α-나선 영역에 존재함을 나타내는데 유용할 수 있다. 이상적인 α-나선은 인접 측쇄로 1 회전당 3.6 아미노산 전기를 가지고, 인접 측쇄는 100。 의 원호로 분리된다. 아이젠버그 등은 양쪽성 나선 개념을 정량화하기 위하여 나선 휠과 소수성 스케일을 결합하였다(Eisenberg et al., Nature 299: 371-374 (1982) & Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 140-141 (1984)). 평균 소수성 모멘트는 나선을 구성하는 성분 아미노산의 소수성의 벡터 합으로 정의된다. 아미노산에 대한 하기 소수성은 "컨센서스 (consensus)" 스케일로서 아이젠버그(1984)가 제시한 것이다:

1회전당 3.6 잔기를 가지는 이상적인 α-나선 (또는 측쇄간 100。 원호(= 360。/3.6))의 소수성 모멘트(μ_H) 는 하기 식으로부터 계산 할 수 있다:

μ_H= [(ΣH_Nsinδ(N-1))²+ (ΣH_Ncosδ(N-1))²]^1/2

상기 식에서, H_N은 N 번째 아미노산의 소수성 값이고, 합은 δ= 100。의 주기를 갖는 서열에서의 N 번째 아미노산에 대한 합을 취하였다. 소수성 모멘트는 μ_H를 N 으로 나누어 <μ_H>을 얻음으로써 잔기 1개당 평균 소수성 모멘트로서 나타낼 수 있다. 100。 ±20。에서 <μ_H>값이 약 0.20 이상이면 양쪽성 나선을 형성가능하다. hPTHrp(22-31) 및 hPTH(22-31) 에 대한 100。 에서의 <μ_H> 값은 각각 0.19 및 0.37 이다.

또한 코르네트 등은 양쪽성의 예측자로서 "양쪽성 지수" 를 도입함으로써 양쪽성 α-나선에 대한 연구를 확대하였다[Cornett, et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)]. 이 연구자들은 모든 공지의 α-나선의 약 반이 양쪽성이며 우세한 빈도는 100。가 아니라 97.5。 이며, 1회전당 잔기의 수는 3.6 보다는 3.7 에 가깝다는 결론을 내렸다. 이와 같은 세심한 연구 결과는 특히 흥미롭지만 아이젠버그 등의 기본적 연구만으로도 특히 양쪽성 α-나선을 형성하는 임의의 서열을 설계할 경우 특정 서열을 양쪽성으로 분류하는데 충분하다.

치환되는 양쪽성 α-나선 아미노산 서열은 천연 폴리펩티드의 일정 단편의 서열과 상동성을 가지지 않을 수도 있으나 유사한 2 차 구조, 즉 생리학적 환경에서 마주보는 극성 및 비극성 면을 가지는 α-나선을 나타낼 수 있다. 대체 서열로 천연 아미노산 서열을 치환하면 생리학적 활성, 안정도 또는 변화된 모 폴리펩티드의 기타 성질에 바람직한 영향을 미칠 수 있다. 이와 같은 서열의 선택 및 설계에 관한 지침은 많은 가운데 다음 문헌에 제시되어 있다[J. L. Krstenansky, et al., FEBS Letters 242:2, 409-413 (1989) ; J. P. Segrest, et al., Proteins; Structure, Funcion, and Genetics 8: 103-117 (1990)].

본 발명의 10 개 아미노산 양쪽성 α-나선은 하기 서열을 가진다:

Haa (Laa Laa Haa Haa)₂Laa

상기 서열에서, 상기에서 정의한 바와 같이 Haa 는 친수성 아미노산 군으로부터 선택되고, Laa 는 소수성 아미노산 군으로부터 선택된다.

이상적인 α-나선이라고 한다면, 잔기 1, 4 ,5, 8 및 9 는 서로 약 140。 원호내에서 나선의 한 면 (A) 를 따라 분포되고, 잔기 2, 3, 6, 7 및 10 은 나선의 다른 면 (B) 상의 대향 140。 원호를 차지한다. 바람직하게는 한 면상의 모든 잔기는 동일한 극성을 가지며 다른 면상의 모든 잔기는 반대 극성을 가진다. 즉, 면 (A) 가 모두 친수성일 경우 면 (B) 는 모두 친지성이거나 또는 그 반대일 수 있다. 통상의 지식을 가진 기술자는 본 발명의 나선이 Haa (Laa Laa Haa Haa)₂Laa 로 기술될 지라도 그 역 서열 Laa (Haa Haa Laa Laa)₂Haa 도 잔기 분포 기준을 충족하며 본 발명의 나선을 동일하게 나타낸다는 사실을 인지할 것이다.

Ala₁₀은 양쪽성 α-나선을 형성할 수 없지만, Ala 은 양쪽성 α-나선의 각 면에 용이하게 존재할 수 있기 때문에 알라닌으로 친수성 또는 소수성 아미노산이 치환될 수 있다. 일반적으로 프롤린, 시스테인 및 티로신은 사용되지 않지만, 서열상의 이들의 존재 및 그 밖의 임의의 오차는 허용될 수 있다. 예컨대 단편에서 잔여 아미노산이 친수성-친지성 면 경계에 실질적으로 일치하는 한 친지성 면상에 친수성 잔기가 허용될 수 있다. 서열이 본 발명의 서열이 되기에 충분히 양쪽성인지를 결정하는 용이한 방법은 상기에서 정의한 바와 같이 평군 소수성 모멘트를 계산하는 것이다. 100。 ±20。에서 잔기 1개당 피크 평균 모멘트가 약 0.20 을 초과하면, 그 서열은 양쪽성 나선을 형성할 것이며, 본 발명의 서열이다. 예컨대, 서열번호 26, Xaa = Glu 에 대한 100。에서의 잔기 1개당 평균 소수성 모멘트는 하기와 같이 계산되었다:

이 서열에 있어서, 평균 피크 소수성 모멘트는 92。에서 일어나며 0.48 의 값을 가진다.

이 개념을 파라티로이드 호르몬 및 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드에 적용함에 있어서, 영역 (7-16) 및 (22-31) 둘다 또는 이들중 하나가 α-나선 2 차 구조를 나타내고, 면역 반응의 유도 또는 생물학적 활성의 손상없이 유사한 구조적 경향성을 가지는 비-상동성 서열로 대체 될 수 있다는 가설이 형성된다.

바람직한 구체예

한 태양에서, 본 발명은 PTH, PTHrp, 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 유사체 및 동족체의 유사체 또는 그의 염을 제공한다(여기서, 아미노산 잔기(22-31) 는 양쪽성 α-나선을 형성하며 이 아미노산 잔기 (22-31) 는 하기 a)내지 e) 아미노산 서열중에서 선택된다:

(이때, Xaa¹및 Xaa⁴는 독립적으로 Glu, Glu(OCH₃), His 또는, Phe 이고, Xaa²는 Leu 또는 Phe 이고, Xaa⁵는 Lys 또는 His 이고, Xaa⁷및 Xaa¹⁰은 독립적으로 Leu 또는 Ile 이고, Xaa⁸은 Ala, Arg 또는 Glu 이고, Xaa⁹는 Lys 또는 Glu 이다),

바람직하게는

(이때, Xaa 는 Glu 또는 Arg 이다);

(이때, Xaa¹및 Xaa⁴는 독립적으로 Glu, Glu(OCH₃), His 또는, Phe 이고, Xaa²는 Leu 또는 Phe 이고, Xaa⁸은 Glu, Lys 또는 Lys(COCH₂PEGX 이고, PEGX 는 분자량 100 내지 10,000 의 폴리-(에틸렌 글리콜 메틸 에테르) 라디칼이다),

바람직하게는

(이때, Xaa 는 Glu, Lys 또는 Lys(COCH₂PEGX) 이고, PEGX 는 분자량 100 내지 10,000 의 폴리-(에틸렌 글리콜 메틸 에테르)라디칼이다),

다른 한 태양에서, 본 발명은 하기 서열을 가지는, PTH 및 PTHrp, 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적으로 활성인 유사체 및 동족체의 유사체 및 그의 약학적 으로 허용가능한 염을 제공한다:

상기 서열에서,

Xaa¹은 존재하지 않거나 또는 Ala 이고;

Xaa²는 존재하지 않거나 또는 Vla 이고;

Xaa³은 존재하지 않거나 또는 Ser 이고;

Xaa⁴은 존재하지 않거나 또는 Glu 또는 Glu(OCH₃)이고;

Xaa⁵는 존재하지 않거나 또는 His 또는 Ala 이고;

Xaa⁶은 존재하지 않거나 또는 Gln 이고;

Xaa⁷존재하지 않거나 또는 Leu 이고;

Xaa¹⁰및 Xaa¹⁷은 독립적으로 Asp 또는 Asp(OCH₃) 이고;

Xaa¹¹은 Lys, Arg 또는 Leu 이고;

Xaa¹³은 Lys, Arg, Tyr, Cys, Leu, Cys(CH₂CONH(CH₂)₂NH(비오티닐)), Lys(7-디메틸아미노-2-옥소-2H-1-벤조피란-4-아세틸) 또는 Lys(디하이드록시신나모일) 이고;

Xaa²⁰은 Arg 또는 Leu 이고;

Xaa¹⁹및 Xaa²¹은 독립적으로 Lys, Ala 또는 Arg 이고;

Xaa^22-31은 서열번호 26, 27, 28, 29 또는 30 중에서 선택되고;

Xaa³²는 His, Pro 또는 Lys 이고;

Xaa³³은 존재하지 않거나 또는 Pro, Thr, Glu 또는 Ala 이고;

Xaa³⁴은 존재하지 않거나 또는 Pro, Arg, Met, Ala, hSer 락톤, Tyr, Leu 또는 1,4-디아미노부티릴 락탐이고;

Xaa³⁵는 존재하지 않거나 또는 Pro, Glu, Ser, Ala 또는 Gly 이고;

Xaa³⁶은 존재하지 않거나 또는 Ala, Arg 또는 Ile 이고;

Xaa³⁷은 존재하지 않거나 또는 Arg, Trp 또는 3-(2-나프틸)-L-알라닐 이고;

Xaa³⁸은 존재하지 않거나 Ala 또는 hSer 이거나;

Xaa^38-42는 Thr Arg Ser Ala Trp 이고;

Term 은 OR 또는 NR₂(이때, R 은 각각 독립적으로 H, (C₁-C₄) 알킬 또는 페닐 (C₁-C₄) 알킬이다)이다.

다른 한 태양에서, 본 발명은 하기 서열 (I) 에 나타낸 바와 같은 절단된 생리학적으로 활성인 동족체 hPTHrp(1-34) 의 폴리펩티드 유사체 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다:

상기 서열에서,

Xaa⁵는 His 또는 Ala 이고;

Xaa¹¹및 Xaa¹³은 독립적으로 Lys, Arg 또는 Leu 이고;

Xaa¹⁹및 Xaa²¹은 독립적으로 Ala 또는 Arg 이고;

Xaa^22-31은

(이때, Xaa 는 Glu 또는 Arg 이다);

(이때, Xaa 는 Glu, Lys 또는 Lys(COCH₂PEGX) 이고, PEGX 는 분자량이 100 내지 10,000 의 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르) 라디칼이다)이다);

중에 선택되고;

Xaa³²는 His 또는 Lys 이고; Xaa³³은 Thr, Glu 또는 Ala 이고; Xaa³⁴은 Ala, hSer, Tyr 또는 Leu 이고; Term 은 Gly Arg Arg, 락톤, OH 또는 NR₂(R 은 각각 H 또는 (C₁-C₄) 알킬 이다)이다.

본 발명의 더 구체적인 한 태양은, 예를 들어 100。 에서의 (μ_H) 가 0.45 인, Xaa^22-31이 서열번호 26 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 더 구체적인 한 태양은 Xaa^22-31이 서열번호 26 이고, Xaa¹¹및 Xaa¹³이 둘다 Lys 이고, Xaa¹⁹및 Xaa²¹이 둘다 Arg 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다.

대표적인 폴리펩티드로는 다음과 같은 것이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

본 발명의 다른 한 태양은 Xaa^22-31이 서열번호 26 이고, Xaa¹¹및 Xaa¹³이 둘다 Lys 이고, Xaa¹⁹및 Xaa²¹중의 하나가 Arg 이고 다른 하나가 Ala 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 하부류의 대표적인 폴리펩티드로는 다음과 같은 것이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

다른 한 태양에서 본 발명은 Xaa^22-31이 서열번호 26 이고, Xaa¹¹및 Xaa¹³중의 하나가 Leu 이고, 다른 하나가 Lys 이고; Xaa¹⁹및 Xaa²¹이 둘다 Arg 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 하부류의 대표적인 폴리펩티드로는 다음과 같은 것이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다:

본 발명은 다른 한 태양은 100。 에서의 <μ_H> 가 0.50을 초과하는, Xaa^22-31이 서열번호27 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 또 하나의 태양은 Xaa^22-31이 서열번호 27 이고, Xaa¹¹및 Xaa¹³이 둘다 Lys 또는 Arg 이고, Xaa¹⁹및 Xaa²¹이 둘다 Arg 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 하부류의 대표적인 폴리펩티드로는 다음과 같은 것이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

본 발명의 다른 한 태양은 100。 에서의 <μ_H> 가 약 0.25 인, Xaa^22-31이 서열번호 28 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 하부류의 대표적인 폴리펩티드로는 다음과 같은 것이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

본 발명의 다른 한 태양은 100。 에서의 <μ_H> 가 약 0.28 인, Xaa^22-31이 서열 번호 29 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 하부류의 대표적인 폴리펩티드로는 다음과 같은 것이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

본 발명의 다른 한 태양은 100。 에서의 <μ_H> 가 약 0.29 인, Xaa^22-31이 서열 번호 30 인 서열 (I) 의 폴리펩티드를 포함한다. 이와 같은 하부류의 대표적인 폴리펩티드로는 다음과 같은 것이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

본 발명의 또다른 한 태양은 서열 (II) 에 나타난 바와 같이 절단된 생리학적 활성 동족체 bPTH(1-34) 의 폴리펩티드 유사체 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다:

상기 서열에서,

Xaa¹은 Ser 또는 Ala 이고;

Xaa⁷은 Leu 또는 Phe 이고;

Xaa⁸은 Met 또는 Nle 이고;

Xaa¹⁶은 Asn 또는 Ser 이고;

Xaa¹⁸은 Leu, Met 또는 Nle 이고;

Xaa¹⁹는 Glu 또는 Arg 이고;

Xaa²¹은 Val 또는 Arg 이고;

Xaa^22-31은 서열번호 26, 27, 28, 29 및 30 으로부터 선택되고;

Xaa³⁴는 Phe 또는 Tyr 이고;

Term 은 OH 또는 NR₂(이때, R 은 각각 H 또는 (C₁-C₄) 알킬이다)이다.

본 발명의 또다른 한 태양에 있어서, 놀랍게도 34 개 미만의 아미노산을 가지는 PTH 및 PTHrp 의 동족체 및 유사체가 또한 강력한 골 리모델링제임이 밝혀졌다. 이들 화합물은 하기 서열을 갖는다:

대표적인 폴리펩티드는 다음과 같지만, 특히 이들에 한정되는 것은 아니다.

화합물 41:

물성 자료

화합물 42:

물성자료

당업자라면, 100。 ±20。에서 약 0.20 이상의 잔기당 평균 소수성 모멘트를 가지는 아미노산 서열이 위치 (22-31) 에 삽입된다면 상기한 바와 같이 원하는 특성을 가질 폴리펩티드 유사체의 다양한 변환체를 합성할 수 있음을 알 것이다.

폴리펩티드의 전통적인 합성

본 발명의 폴리펩티드는 다음과 같은 공지 문헌에 개시된 방법에 따라 합성 할 수 있다: 고체상 합성에 대해서는 문헌[J. M. Stewart and J.D. Young. Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois (1984); J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, Academic, New York, (1973)]; 용액 합성에 대해서는 문헌[E. Schroder & K. Lubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press, New York, (1965)]을 참조한다.

일반적으로 이들 방법은 보호된 아미노산을 순차적으로 성장 펩티드 사슬에 첨가하는 것을 수반한다. 정상적으로, 반응성 측쇄 그룹 및 제 1 아미노산의 아미노 또는 카복실 그룹을 보호한다. 그 다음 보호된 아미노산을 불활성 고체 지지체에 결합시키거나 또는 용액중에서 사용하고 역시 적당하게 보호된 서열의 다음 아미노산을 아미드 결합을 형성하게 하는 조건하에 첨가한다. 원하는 모든 아미노산이 적당한 서열에 결합된 후 보호 그룹 및 고체 지지체를 제거하여 조 폴리펩티드를 얻는다. 폴리펩티드를 탈염시키고 바람직하게는 크로마토그래피로 정제하여 최종 산물을 얻는다.

약 40 개 미만의 아미노산을 가지는 절단된 생리학적으로 활성인 폴리펩티드의 유사체를 제조하는 바람직한 방법은 고체상 펩티드 합성법이다. 이 방법에서, α-아미노 (N^α) 기능 및 임의의 반응성 측쇄는 산 또는 염기-감응성 그룹으로 보호된다. 보호 그룹은 펩티드 결합 형성조건에 안정하여야 하며, 현존하는 폴리펩티드 사슬에 영향을 미치지 않고 용이하게 제거될 수 있어야 한다. 적당한 α-아미노산 보호 그룹으로는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, t-부톡시카보닐 (Boc), 벤질옥시카보닐 (Cbz), o-클로로벤질옥시카보닐, 비페닐이소프로필옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐 (Amoc), 이소보닐옥시카보닐, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시-카보닐, o-니트로페닐설페닐, 2-시아노-t-부톡시카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 등을 들 수 있으며, t-부톡시카보닐 (Boc) 가 바람직하다. 적당한 측쇄 보호 그룹으로는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 아세틸, 벤질(Bzl), 벤질옥시메틸 (Bom), o-브로모벤질옥시카보닐, t-부틸, t-부틸디메틸실릴, 2-클로로벤질 (Cl-z), 2,6-디클로로벤질, 사이클로헥실, 사이클로펜틸, 이소프로필, 피발릴, 테트라하이드로피란-2-일, 토실 (Tos), 트리메틸실릴 및 트리틸을 들 수 있다.

고체상 합성에서, C-말단 아미노산을 먼저 적당한 수지 지지체에 결합시킨다. 적당한 수지 지지체는 사용되는 매질에 불용성일 뿐만 아니라, 단계적 축합 및 탈보호 반응의 반응 조건 및 시약에 불활성인 물질이다. 상업용 수지의 예로는 반응성 그룹으로 변형된 스티렌/디비닐벤젠 수지, 예컨대 클로로메틸화 코폴리(스티렌-디비닐벤젠, 하이드록시 메틸화 코폴리(스티렌-디베닐벤젠) 등을 들 수 있다. 벤질화 하이드록시메틸화 페닐아세트아미도메틸 (PAM) 수지가 바람직하다. 화합물의 C- 말단이 아미드일 경우, 바람직한 수지는 p-메틸벤즈하이드릴아미노- 코폴리(스티렌-디비닐-벤젠) 수지이다.

PAM 수지에의 결합은 에탄올, 아세토니트일, N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중의 그의 암모늄, 세슘, 트리에틸암모늄, 1,5-디아자비사이클로-[5.4.0]운데크-5-엔, 테트라메틸암모늄 또는 유사 염으로서, 바람직하게는 DMF 중의 세슘 염으로서 N^α-보호된 아미노산, 바람직하게는 Boc-아미노산을 수지와 고온, 예컨대 약 40 내지 60℃ , 바람직하게는 약 50℃에서 약 12 내지 72 시간, 바람직하게는 약 48 시간동안 반응시킴으로써 이루어질 수 있다.

N^α-Boc-아미노산은 디클로로메탄 또는 디메틸포름아미드, 바람직하게는 디클로로메탄과 같은 용매 중에서 약 10 내지 50 ℃, 바람직하게는 25℃ 에서 약 2 내지 약 24 시간, 바람직하게는 약 2 시간동안, 예컨대 N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC)/1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt) 매개된 커플링에 의해 벤즈히드릴아민 수지에 결합될 수 있다.

보호된 아미노산의 연속적인 커플링은 전형적으로 자동화 펩티드 합성기에서공지의 방법으로 실시할 수 있다. 트리에틸아민 또는 유사한 염기로 중화한 후, 각 보호된 아미노산은 약 1.5 내지 2.5 배 몰과량으로 도입하는 것이 바람직하며, 주위온도에서 디클로로메탄, DMF 또는 이들의 혼합물과 같은 불활성, 비수성, 극성 용매, 바람직하게는 디클로로메탄중에서 커플링을 실시한다. 대표적인 커플링제는 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC),N,N'-디이소프로필-카보디이미드 (DIC), 또는 기타 카보디이미드 등으로서 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt), O-아실 우레아, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBop), N-하이드록시숙신이미드, 기타 N- 하이드록시이미드 또는 옥심의 존재하에서 또는 이들 단독으로 사용된다. 다른 한편으로는 보호된 아미노산 활성 에스테르(예컨대, p-니트로페닐, 펜타블루오로페닐 등) 또는 대칭 무수물이 사용될 수 있다.

고체상 합성의 끝에, 완전하게 보호된 펩티드를 수지로부터 제거한다. 수지 지지체에의 결합이 벤질 에스테르 유형일 경우, 약 -10 내지 50℃, 바람직하게는 약 25 ℃ 의 온도에서 약 12 내지 24 시간, 바람직하게는 약 18 시간동안, 치환되지 않은 아미드 C- 말단을 가지는 펩티드에 대해서는 예컨대 암모니아/메탄올 또는 암모니아/에탄올로 아미노분해시키거나 또는 알킬아미드 C-단말을 가지는 펩티드에 대해서는 알킬아민 또는 플루오로알킬아민으로 아미노분해시킴으로써 절단이 수행될 수 있다. 하이드록시 C-말단을 가지는 펩티드는 HF 또는 기타 강한 산성의 탈보호 처리 또는 비누화반응에 의하여 절단될 수 있다. 또 다르게는, 예컨대 메탄올로 에스테르전이화 반응시킨다음 아미노분해 또는 비누화반응으로 수지로부터 펩티드를 제거할 수 있다. 보호된 펩티드는 실리카겔 크로마토그래피로 정제할 수 있다.

측쇄 보호 그룹은 아미노분해 반응 생성물을 아니졸 또는 기타 카보늄 이온 소거제의 존재하에, 예컨대 무수 액체 플루오로화수소으로 처리하고, 플루오로화수소/피리딘 착체로 처리하고, 트리스(트리플루오로아세틸)붕소 및 트리플루오로아세트산으로 처리하거나; 수소 및 탄소상 팔라듐 또는 폴리비닐피롤리돈으로 환원시키거나; 또는 약 -10 내지 +10 ℃, 바람직하게는 약 0 ℃의 온도에서 약 15 분 내지 2 시간, 바람직하게는 약 1.5 시간동안 액체 암모니아중의 나트륨으로, 바람직하게는 액체 플루오로화수소 및 아니졸로 환원시킴으로써 펩티드로부터 제거할 수 있다.

벤즈하이드릴아민 수지상의 펩티드에 대해서는, 상기한 바와 같은 액체 플루오로화수소 및 아니졸을 이용하여 단일 단계로 수지 절단 및 탈보호 단계를 결합하여 실시할 수 있다.

용액을 탈염시키고 (예컨대, 바이오래드 AG-3(BioRad AG-3) 음이온 교환수지) 하기 단계의 모두 또는 일부를 이용하는 일련의 크로마토그래피 단계로 펩티드를 정제한다: 아세트산염 형태의 약염기 수지상에서의 이온 교환, 유도체화되지 않은 코폴리(스티렌-디비닐벤젠). 예컨대 앰버라이트(Amberlite)XAD 에서의 소수성 흡착 크로마토그래피, 실리카겔 흡착 크로마토그래피, 카복시메틸셀룰오즈상에서의 이온 교환 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피(예컨대,세파덱스(Sephadex) G-25 에서), 역류 분포, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 특히 옥틸-또는 옥타데실-실릴실리카 (ODS) 결합 상 컬럼 팩킹상에서의 역상 HPLC.

따라서, 본 발명의 다른 한 태양은 적당한 수지 지지체상에 보호된 아미노산을 연속적으로 축합시키고, 보호 그룹 및 수지 지지체를 제거하고 생성물을 정제하여, PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 유사체, 바람직하게는 위치 (22-31) 의 아미노산은 상기에서 정의한 바와 같이 양쪽성 α-나선 펩티드 서열을 형성하는 PTH(1-34) 및 PTHrp(1-34)를 얻는 단계를 포함하는, 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 그의 염 제조 방법에 관한 것이다.

폴리펩티드의 재조합 합성

다른 한편으로는 본 발명의 폴리펩티드는 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 클로닝 및 발현에 의하여 제조될 수 있다. 이 방법에서, 원하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 제조하고 적당한 숙주 미생물, 발람직하게는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 세균, 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모에 삽입하고, 숙주 미생물로 하여금 다수개 카피의 플라스미드를 생성하게 하여 본 발명의 폴리펩티드 유사체를 암호화하는 다수개 카피의 cDNA 를 형성하도록 유도한다.

먼저, 선택된 PTH 또는 PTHrp 유사체를 암호화하는 합성 유전자에 후속 변화를 용이하게 하기에 편리한 제한 효소 절단 부위를 설계한다. 문헌 [Mullis, 미합중국 특허 제 4,683,195 호 및 제 4,683,202 호]에 개시된 바와 같은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 서열을 증폭시킬 수 있다.

증폭된 합성 유전자를 단리하고, 이를 Trp LE 플라스미드와 같은 적당한 플라스미드에 4 카피의 유전자가 일렬로 삽입될 수 있도록 연결한다. Trp LE 플라스미드의 제조에 관해서는 미합중국 특허 제 4,738,921 호 및 유럽 특허 공개 제 0212532 호에 기술되어 있다. Trp LE 플라스미드는 일반적으로 Trp E 플라스미드보다 8 내지 10 배 많은 단백질을 생산한다. 그 다음 다-카피 (multi-copy) 유전자를 적당한 숙주, 예컨대, 이. 콜라이 또는 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 특정 발현 벡터는 하기 요소를 함유하는 Trp LE 18 Prot (Ile³, Pro⁵) 이다: 암피실린 내성 유전자 및 플라스미드 복제 개시점을 함유하는 pBR322 단편(EcoRI-BamHI); trp 프로모터 및 trpE 유전자를 함유하는 EcoRI-SacII 단편; HIV 프로테아제 (Ile³, Pro⁵) 유전자 단편(SacII-HindIII); bGRF 유전자 단편 (HindIII-BamHI); 및 이. 콜라이 rpoc 유전자로부터의 전사 종결자. HIV 프로테아제 및 bGRF 유전자 단편은 결정적인 요소가 아니며 필요하다면 다른 암호와 서열로 대체될 수 있다.

발현된 다량체 융합 단백질은 안정한 봉입체내로 세포내 축적되고, 나머지 세포 단백질로부터 원심분리에 위해 분리될 수 있다. 단리된 융합 단백질은 단량체 PTH 또는 PTHrp 유사체로 전환되고, 양이온 교환 및/또는 역상 HPLC 에 의해 정제될 수 있다.

클로닝, 증폭, 발현 및 정제의 다른 방법도 본 기술분야의 당업자에게 자명하다. 대표적인 방법은 다음 문헌에 개시되어 있다[Maniatis, et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)].

유용성 및 투여

본 발명의 폴리펩티드는 골 질량의 손실이 나타나는 포유동물의 다양한 질병의 치료 및 예방에 유용하다. 특히 본 발명의 화합물은 사람에 있어서 골다공증 및 골감소증의 치료 및 예방에 유용하다.

일반적으로 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 염은 1 일 약 0.002 내지 1 ㎍/㎏ 체중, 바람직하게는 약 0.04 내지 약 0.2 ㎍/㎏ 체중 범위의 양으로 투여한다. 50 ㎏ 체중의 여성의 경우, 활성 성분의 1 일 투여량은 약 0.1 내지 약 50 ㎍, 바람직하게는 약 2.0 내지 약 10 ㎍ 범위이다. 말, 개 및 소 등과 같은 다른 포유 동물에 있어서, 더 높은 투여량이 필요할 수도 있다. 이러한 투여량은 가장 효과적인 결과를 얻기 위하여 필요한 바에 따라 단일 투여, 분할 투여 또는 서방형 방출 등에 의해, 바람직하게는 1일 일회 또는 수회 주사기로 기존의 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.

정확한 투여량과 조성의 선택 및 가장 적당한 투여 방법은 특히 선택된 폴리펩티드, 치료될 질명의 심각도 및 성질, 및 투여 대상의 신체적 상태 및 정신적 민감성에 의해 영향을 받는다.

대표적인 투여 방법은 경구, 비경구(피하, 근육내 및 정맥내), 직장, 구강(설하), 폐, 경피 및 비강내 투여 등을 들 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 염은 독성을 나타내는 부작용없이 모 폴리펩티드 (parent polypeptide)의 원하는 생물 활성을 가진다. 이와 같은 염의 예로는 (a) 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로 형성된 산 부가염; 및 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 나프탈렌 디설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 유기산으로 형성된 염; (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온으로부터 형성된 염기부가염; 또는 N,N'- 디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온으로부터 형성된 염기 부가염; 또는 (c) 예컨대 아연 탄닌염 등과 같은 (a)와 (b)의 조합물 등을 들 수 있다.

본 발명의 다른 한 태양은 약제학적으로 허용가능한 비독성 담체와 혼합된 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기한 바와 같이 이와 같은 조성물은 특히, 액체 용액 또는 현탁액 형태로의 비경구 투여용(피하, 근육내 또는 정맥내); 특히, 정제 또는 캡슐 형태로의 경구 또는 구강 투여용; 특히, 분말, 비강 드롭 또는 에어로졸의 형태로의 폐 또는 비강 투여용; 및 직장 또는 경피 투여용으로 제조할 수 있다.

조성물은 단위 투여 형태로 용이하게 투여될 수 있으며 제약 분야의 공지 기술, 예컨대 다음 문헌에 기술된 바와 같은 방법으로 제조 될 수 있다[Remington'sPharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton., PA (1985)]. 비경구 투여 제제는 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 프로필렌 글리콜과 같은 알킬렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성유, 수소화 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해서는, 담즙 염 또는 아실카니틴의 첨가에 의하여 제제가 향상될 수 있다. 비강 투여 제형은 고체일 수 있으며, 부형제, 예컨대, 락토즈 또는 덱스트란을 함유할 수 있거나, 또는 비강 드롭 또는 계량 스프레이 형태로 사용하기 위해 수용액 또는 오일상 용액일 수 있다. 구강 투여용으로 전형적인 부형제로는 당, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 예비젤라틴화 전분 등을 들 수 있다.

비강 투여용으로 제형화할 경우, 비강 점막을 통한 흡수는 예컨대, 글리코콜산, 콜산, 타우로콜산, 에토콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 디하이드로콜산, 글리코데옥시콜산, 사이클로덱스트린 등과 같은 계면활성제 산 약 0.2 내지 15 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 4 중량%, 가장 바람직하게는 약 2 중량%에 의해 증가될 수 있다.

본 발명의 화합물을 장시간, 예컨대 1 주 내지 1 년간 투여하는 것은 원하는 방출 기간동안 충분한 활성 성분을 함유하는 서방 시스템의 1회 투여에 의하여 달성될 수도 있다. 모노리식(monolithic) 또는 저장형 (reservior-type) 미세캡슐, 저장부 (depot) 이식편, 삼투압 펌프, 소포 (vesicle), 마이셀, 리포좀, 경피 패치, 이온삼투요법 장치와 같은 다양한 서방 시스템 및 대용주사 투여 형태도 이 목적으로 사용될 수 있다. 활성 성분이 투여되어지기를 원하는 부위로의 국소 투여는 특정 질환의 치료에 바람직한 것으로 밝혀진, 일부 조절 방출 장치의 또 다른 특징이다.

서방성 제제의 한 형태는 문헌[Kent, Lewis, Sanders & Tice, 미합중국 특허 제 4,675,189 호]에 기술된 바와 같이 코폴리(락트/글리콜)산과 같은 천천히 분해되는 비독성, 비항원성 중합체에 캡슐화되거나 또는 분산된 폴리펩티드 또는 그의 염을 함유한다. 또한 화합물 또는 바람직하게는 이들의 비교적 불용성인 염도 콜레스테롤 또는 기타 액체 매트릭스 펠렛에 배합되거나 또는 실라스토머 (silastomer) 매트릭스 이식편에 배합될 수 있다. 추가의 서방성 저장부 이식편 또는 주사 제제는 본 기술 분야의 당업자에 자명하다. 예컨대, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978; R. W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987] 을 참조한다.

하기의 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 대표적인 화합물의 합성 및 시험을 예시하고자 하며, 이들 실시예는 특허청구범위의 범위를 한정하는 것은 아니다. 실시예에서, "[]_D ²⁵" 는 지시된 용매중의 주어진 농도에서 25 ℃에서의 광학 활성을 나타내고, "FAB" 는 고속 원자 충격 질량 분광측정이고, "AAA" 는 아미노산 분석치로, 측정치 다음에 예상치를 괄호안에 표시하였다. 아미노산 분석은 제조자의 추천 공정에 따라 휴렛-팩커드 아미노퀸트 분석기(Hewlett-Packard AminoQuant Analyzer)상에서 실시하였다. 1 차 아미노산은 o- 프탈알데하이드로 유도체화하고, 2 차 아미노산은 Fmoc 로 유도체화하였다. 유도체화된 아미노산의 형광 검출을 이용하여 정량화하였다. 보호된 아미노산은 어플라이드 바이오시스템즈사 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) 로 부터 얻었다.

실시예 I

자동화된 어플라이드 바이오시스템즈 모델 430A (Applied Biosystems Model 430A) 펩티드 합성기를 이용하여 4-메틸벤즈하이드릴아민 수지상에서 고체상 방법에 의해 0.5 mmol 스케일로 화합물 1 (서열번호 7) 을 제조하였다. α-아미노 그룹을 t-부톡시카보닐 (Boc) 로 보호하였다. 측쇄 보호 그룹은 다음과 같다: Asp, Glu 및 Ser 에 대해 벤질(Bzl); Arg 에 대해 토실(Tos); His 에 대해 벤질옥시메틸(Bom); 및 Lys 에 대해 2-클로로벤질(Cl-z). 상기 문헌 [Stewart & Young] 에 따라 N,N-디사이클로로헥실카보디이미드 / 1-하이드록시벤조트리아졸 (DCC/HOBt) 을 이용하여 아미노산을 연속적으로 커플링시켰다. 각 아미노산의 커플링후 N-메틸피롤리디돈중의 디이소프로필에틸아민 및 무수 아세트산의 혼합물을 이용하여 펩티드를 아세틸화하였다. -10 ℃ 에서 30 분 및 0 ℃ 에서 60분 동안 아니졸(2.5 ㎖)의 존재하에 무수 HF(25㎖) 를 이용하여 측쇄 보호 그룹을 탈보호시키면서 동시에 수지로부터 완성된 펩티드를 절단하였다. 진공에서 HF 를 증발시킨후 잔사를 무수 에테르로 세척하고 조 펩티드를 10% 아세트산으로 추출하였다. 10% 아세트산 추출물을 동결건조시켜 조생성물 900 ㎎ 을 얻었다 0.1% TFA 중의 22 내지 45% CH₃CN 구배를 이용하는 중간 압력 ODS 역상 컬럼 크로마토그래피로 펩티드를 정제하였다. 생성물은 3 개 분획으로 용출되었으며 이를 농축하고 동결건조시켜 순도 98% 이상의 백색 고체 130 ㎎ 을 얻었다.

화합물 1:

물성 자료

유사하게, 하이드록시-말단 폴리펩티드의 합성에 필요한 PAM 수지를 치환하여, 화합물 2, 5-18, 21-27, 29-36, 38-48, 50-54, 58-64 및 66-70 을 제조하고 특성확인하였다.

화합물 2:

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화합물 5:

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화합물 6:

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화합물 7:

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화합물 8:

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화합물 9:

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화합물 10:

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화합물 11:

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화합물 12:

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화합물 13:

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화합물 14:

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화합물 15:

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화합물 16:

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화합물 17:

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화합물 18:

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화합물 21:

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화합물 24:

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화합물 25:

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화합물 26:

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화합물 27:

화합물 29:

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화합물 30:

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화합물 31:

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화합물 32:

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화합물 33:

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화합물 34:

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화합물 35:

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화합물 36:

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화합물 38:

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화합물 39:

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화합물 40:

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화합물 41:

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화합물 42:

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화합물 43:

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화합물 44:

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화합물 45:

화합물 46:

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화합물 47:

화합물 48:

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화합물 50:

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화합물 51:

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화합물 52:

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화합물 53:

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화합물 54:

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화합물 58:

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화합물 59:

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화합물 60:

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화합물 61:

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화합물 62:

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화합물 63:

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화합물 64:

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화합물 66:

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화합물 67:

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화합물 68:

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화합물 69

화합물 70

측쇄 고리화된 유사체(화합물 57) 를 상기와 같이 합성하였다. 단, N^α-Boc-N^ε-Fmoc-Lys 및 N^α-Boc-N^γ-Fmoc-Asp 는 각각 위치 13 및 17 에 위치한다. Boc 아미노산 합성이 완결될 때 실온에서 30 분 동안 DMF 중의 20% 피페리딘으로 수지를 처리하였다. 수지를 여과하고 DMF, MeOH 및 CH₂Cl₂로 세척하였다. 250 ㎎ PyBOP 를 함유하는 10 ㎖ DMF 에 수지(1.1 g) 를 현탁하였다. DIEA 로 pH 를 8 내지 9 로 조절하고 1 시간동안 수지를 교반하였다. 수지를 여과하고 DMF 및 CH₂Cl₂로 세척한 다음 DMF 에 재현탁하였다 PyBOP 125㎎을 사용하여 커플링을 반복하였다. 수지를 여과하고 DMF, MeOH 및 CH₂Cl₂로 세척하고 건조시켰다. 그 다음 수지를 HF 로 처리하고 상기와 같이 펩티드를 정제하였다.

화합물 57:

물성자료

실시예 II

실시예 I 의 공정에 따라 [Met³⁴, Ala³⁵] 화합물 1, AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTMA-NH (서열번호 25) 를 제조하고 정제하였다. 이 폴리펩티드를 하기와 같이 호모세린 락톤으로 전화시켰다. 정제된 펩티드(160㎎) 를 44% 포름산(4 ㎖) 에 용해하였다. 이 용액을 0℃ 에서 44% 포름산 (4㎖)중의 페놀(1.6 ㎎)과 브롬화 시아노겐 (700 ㎎) 의 예비혼합물 용액과 혼합하였다. 이 용액을 0℃ 에서 2시간, 실온에서 2시간 교반하였다. 생성물의 형성을 HPLC(Vydav) C-18, 300 Å, 4.6 ×250 mm, 유속: 1.2 ㎖/분, 10 분간에 걸쳐 0.1% TFA 중의 25 내지 45% 아세토니트릴 구배)로 모니터하였다. 반응은 4 시간내에 종결하였다. 시료의 반을 농축하고 제조용 RP-HPLC(VydacC-18, 0.1% TFA 중의 25 내지 45% 아세토니트릴 구배)로 정제하였다. 호모세린 락톤 펩티드 분획을 모으고 동결건조시켜 순도 95% 이상의 백색 고체의 화합물 4를 28 ㎎ 얻었다.

화합물 4:

물성 자료

유사하게, 화합물 65를 상기 공정에 따라 제조하였다.

화합물 65

실시예 III

호모세린 아미드를 제조하기 위하여, 조 hSer 락톤 유사체인 화합물 4 를 농축하고 메탄올내 25 ㎖ 포화 NH₃으로 처리하였다. 용액을 0 ℃ 에서 2 시간, 실온에서 16 시간 교반하였다. HPLC (VydacC-18, 300 Å, 4.6 ×250 mm, 유속: 1.2 ㎖/분, 0.1% TFA 중의 20 내지 45% 아세토니트릴 구배)로 반응을 모니터 하고 18 시간내에 반응을 종결시켰다. 용액을 농축하고 제조용 RP-HPLC (VydacC-18, 0.1% TFA 중의 25 내지 45% 아세토니트릴 구배)로 정제하였다. 호모세린 아미드 펩티드 분획을 모으고 동결건조시켜 순도 98% 이상의 백색 고체로 화합물 3을 30 ㎎ 얻었다.

화합물 3:

물성 자료

유사하게 화합물 22, 23 및 28 을 이 공정에 따라 제조하였다.

화합물 22:

물성 자료

화합물 23:

물성 자료

화합물 28:

물성자료

과량의 대응 알킬아민을 함유하는 DMF 에 호모세린 락톤을 용해함으로써 이로부터 유사하게 호모세린 알킬아미드를 제조하였다. 실온에서 수일간 교반한 후(분석 HPLC 로 반응을 모니터함) 혼합물을 건조 증발시키고 제조용 HPLC 로 펩티드를 정제하였다. 대표적인 호모세린 알킬아미드는 화합물 55 및 56 이다.

화합물 55:

물성 자료

화합물 56:

물성 자료

실시예 IV

N^α-Boc-γ-Fmoc-L-2,4-디아미노부티르산의 세슘 염을 메리필드 수지(DMF, 50℃, 48 시간)에 결합시키고 실시예 I 에서와 같이 Boc-Ala 수지 대신에 고체상 합성에 사용하였다. 합성이 종결된 후 실온에서 30 분간 DMF 중의 20% 피페리딘으로 펩티드를 처리하여 측쇄 ,Fmoc 보호 그룹을 제거하였다. 보호된 펩티드는 락탐으로 자연적으로 고리화되어 수지로부터 락탐 자제가 절단된다. 용액을 수지로부터 여과하고 진공에서 증발시켜 오일을 얻었다. 잔사를 실시예 I 에서와 같이 액체 HF 로 처리하여 조질의 탈보호된 펩티드를 얻었다. 펩티드를 실시예 I 에서와 같이 처리하고 정제하였다.

화합물 49:

물성 자료

실시예 V

실시예 II 로부터의 호모세린 락톤 유사체의 수용액을 돼지 간 에스테라제(Sigma Chemical company, St. Louis, MO)로 처리하였다. 락톤의 C-말단 호모세린으로의 가수분해는 분석 HPLC 로 모니터하였다. 가수분해가 완료된 것으로 밝혀졌을 때 실시예 I 에서와 같이 제조용 HPLC 로 물질을 정제하였다.

화합물 37:

물성 자료

실시예 VI

실시예 I 에 따라, 보호된 펩티드-수지 BocAVS(Bzl)E(OBz) H(Bom)QLLHD(OBzl)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD(OBz)-LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE(OBzl)R(Ts)LLK (Fomoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM 을 0.35 mmol 스케일로 합성하였다. 모든 N^α그룹을 t-부톡시카보닐(Boc) 로 보호하고; 측쇄 보호 그룹은 표시한 바와 같다. 합성이 종료된 후 실온에서 30 분간 디메틸포름아미드중의 20% 피페리딘 50 ㎖ 로 처리하여 리신상의 플루로레닐메톡시-카보닐(Fmoc) 보호 그룹을 제거하였다. 수지를 DMF, MeOH, CH₂Cl₂로 계속해서 세척하고 건조시켜 부분적으로 보호된 펩티드 1.6 g 을 얻었다. 부분적으로 보호된 펩테드 0.8 g(0.175 mmol) 을 DMF 20 ㎖ 중의 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 0.067 g(0.525 mmol) 및 벤조트리아졸릴옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사 플루오로포스페이트(PyBop) 0.16 g(0.3 mmol) 의 존재하에 메톡시디(에틸렌옥시)아세트산[PEG(2)CH₂COOH] 0.44 g(0.3 mmol)으로 실온에서 5 시간 동안 리신상에 아실화시켰다. 5 시간후 수지를 여과하고 DMF, MeOH 및 CH₂Cl₂로 연속적으로 세척하였다. 수지상에 음성 닌하이드린 결과가 얻어질 때까지 아실화 단계를 2 회 반복하였다. 실시예 I 에서와 같이 측쇄 보호 그룹을 제거하여 수지로부터 최종 펩티드를 절단하고 정제하여 화합물 19를 100 ㎎ 얻었다.

화합물 19:

물성 지료

실시예 VII

실시예 IV 에서와 동일한 방법으로 펩티드를 합성하고, 절단하고 정제하였다. 단 아실화제로서 2-메톡시폴리(에틸렌-옥시)아세트산 [PEG(5000)CH₂CO₂H] 을사용하였다. 부분적으로 보호된 펩티드 0.8 g (0.175 mmol) 으로부터 300 ㎎ 의 순수한 화합물 20 을 얻었다.

화합물 20:

물성 자료

실시예 VII

hPTHrp(1-34) 유사체 유전자의 합성

hPTHrp(1-34) 유사체 화합물 4 (서열번호 9) 를 암호화하는 합성 유전자를 제 1 도에 도시된 뉴클레오티드 서열 및 제한 효소 부위를 가지도록 설계하였다. 필요한 올리고데옥시뉴클레오티드는 문헌[Sinha, et al., Nucleic Acid Research 12, 4539-4557 (1984)] 에 기술된 포스포아미다이트 공정을 이용하여 DNA합성기(Milligen/Biosearch) 로 제조하였다. 탈보호 후, 조질의 올리고뉴클레오티드를 제조용 15% 폴리아크릴아미드 겔상에서 겔 전기영동하여 정제하였다. 올리고뉴클레오티드를 UV 상에 위치시키고 겔로부터 절단해 내고 워터스(Waters) C18 Sep-pak카드리지상에서 탈염시키고 동결건조시켰다.

중합효소 연쇄 반응(PCR) 을 통한 증폭은 "GeneAmp" DNA 증폭 킷트(Perkin-Elmer Cetus) 의 Taq 중합효소를 포함한 시약을 이용하여 94 ℃에서 1분, 50 ℃에서 2 분 및 72 ℃에서 3 분간 25 사이클로 퍼킨-엘머 세튜스(Perkin-Elmer Cetus) 열 사이클 시험기상에서 실시하였다.

hPTHrp(1-34) 유사체 유전자의 주형 DNA 서열로서 하기와 같은 2 개의 중첩올리고뉴클레오티드를 제조하였다:

2 개의 측위 (flanking) 프라이머 PTHPCR1: CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG (서열번호 33) 및 PTHPCR2: CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC (서열번호 34) 를 이용하여 PCR 로 전체 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA 생성물을 4% NuSieve아가로스겔상에서 겔 전기영동시켜 정제하였다. 약 150 염기 길이의 합성 hPTHrp(1-34) 유사체 유전자를 함유하는 밴드를 겔로부터 절단하고 DNA 약 200 ng 을 Elu-Quik유리 겔 DNA 추출로 단리하였다(Schleicher & Schuell, Keene, NH).

실시예 IX

hPTHrp(1-34)1 유사체 유전자의 분자 클로닝

실시예 VI 의 hPTHrp(1-34) 유사체 유전자를 서브클로닝 (Subcloning)하기 위하여, 증폭된 DNA 200 ng 을 단리하고 Hind III 및 Sac II 제한효소로 절단하였다. 제 2 도에 시도된 바와 같이, 이 DNA 를 Hind III 및 Sac II 로 미리 절단된 TrpLE 18 Prot (IIe³, Pro⁵) 플라스미드 2 ㎍ 에 연결하였다.

hPTHrp(1-34) 유사체 유전자 1 카피를 함유하는 얻어진 플라스미드 TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1 를 컴피던트(competent) 이. 콜라이 HB 101 세포(CLONTECH, Palo Alto, CA) 에 형질전환시켰다. 형질전환체를 PCR 분석하여 삽입을 확인하였다. 형질전환된 세포 콜로니를 선택하고 물 200 ㎕ 중에서 5분간 가열하고 2 ㎕ 을 삽입체에 측위하는 두 프라이머로 PCR 반응시켰다. 그 다음 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 분석하여 hPTHrp(1-34) 유전자 삽입체 1 카피가 존재함을 확인하였다. 그 다음 서열 결정 킷트 (Vendor's Dye Deoxy Terminator Sequencing kit)를 사용하여 자동화된 DNA 서열결정기 (Applied Biosystems Model 313A, Foster City, CA)에서 DNA 의 서열을 결정함으로써 TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1 구조를 밝혔다.

실시예 X

hPTHrp(1-34) 유사체 유전자 다수 카피를 함유하는 TrpLE 18 벡터의 작제

유일한 Nhe I 및 Xba I 제한효소 부위는 hPTHrp(1-34) 유사체 유전자 서열의 개시 및 종결부 근처에 위치한다. 이들 두 부위는 다른 서열을 인식하지만 동일한 단쇄 돌출 말단을 형성하는 Trp LE 18 벡터내에 다수개 카피의 hPTHrp(1-34) 유전자를 형성한다.

일렬로 hPTHrp(1-34) 반복 서열을 구성하는 방법은 제 3 도에 도시되어 있다. 별도의 반응에서, 단일 카피의 이 유전자를 함유하는 플라스미드 Trp LE 18 hPTHrp(1-34)1 5㎍ 을 Bam HI + Nhe I 및 Xba I + Bam HI 로 절단하였다. 각 분해물로부터 hPTHrp(1-34) 유사체 유전자를 함유하는 단편 약 300 ㎍ 을 단리하였다. 이들 두 단편을 혼합하고 연결시켜 Trp LE 18 hPTHrp(1-34)2 플라스미드를 형성하였다. 이 플라스미드를 사용하여 컴피턴트 이. 콜라이 HB101 세포를 형질전환시켰다. 1% 아가로스 겔상의 형질전환된 PCR 생성물의 사이징(sizing)을 사용하여 2 카피의 hPTHrp(1-34) 유전자 삽입체가 존재함을 확인하였다 이 2 카피의 유전자를 함유하는 Trp LE 18 hPTHrp(1-34)2 를 DNA 서열분석으로 확인하였다. 두 hPTHrp(1-34) 유전자가 올바르게 융합되면 접합 부위에서 Nhe I 및 Xba I 부위가 제거된다. 이는 일렬 유전자에 측위하는 잔류 Xba I 및 Nhe I 부위를 유일하게 만든다.

이 방법을 반복함으로써, 4 카피의 hPTHrp(1-34) 유전자를 함유하는 최종 플라스미드 Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4 를 제 4 도에 도시된 바와 같이 구성하였다. DNA 서열 분석으로 Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4 의 서열이 올바름이 확인되었다.

실시예 XI

Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4 의 발현 및 정제

50 ㎍/㎖ 암파실린 및 100 ㎍/㎖ 트립토판을 함유하는 LB 배양 배지(본 명세서에 참조로 인용되는 문헌[J. H. Miller, "Experiments in MolecularGenetics", p. 431 (1972)]참조) 50 ㎖ 의 스타터(starter) 배지에 Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 세포를 접종하고 격렬하게 진동시키면서 37℃ 에서 하룻밤동안 A₅₅₀가 약 6까지 되도록 증식시켰다. 생산을 위한 LB 배양 배지 2 리터를 37℃ 에서 예비 가온하고 스타터 배지 20 ㎖ 로 접종하여 A₅₅₀가 약 0.06이 되었다. 그 다음 배양물을 격렬하게 진동시키면서 0.6 내지 0.8 범위의 A₅₅₀까지 배양하고, 인돌 아크릴산 (IAA) 10㎎/㎖ 용액 2 ㎖ 을 첨가하였다. 최종 A₅₅₀이 약 6(전형적으로 4 내지 10)이 될 때까지 약 16 시간 양호한 통기 상태로 계속해서 증식시켰다. 세포를 원심분리에 위해 농축하고 50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 0.1 mM EDTA 완충 용액 (Tris 완충 용액) 500ml에 재현탁하였다.

과열을 피하기 위하여 최고 성능의 50 % 로 작동하는 초음파기 (Heat System- Ultrasonics, Inc. 모델 220F, 3/4" 혼(horn) 장착)를 사용하여 현탁액을 초음파 처리하였다.

유도 정도를 측정하기 위하여, 전체 세포를 SDS-PAGE 에 의해 분석하였다. Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4 구조체로부터 유도된 유전자 생성물은 약 17,000 의 예상 MW 의 주 밴드로 나타났다. 이는 총 세포 단백질의 적어도 10 % 에 해당한다.

<융합 단백질의 단리>

세포 용해물은 약 3600 ×g 에서 15 분동안 원심분리하여 Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4 융합 단백질을 펠렛화하고 상층액을 버렸다. 펠렛을 200 ㎖ Tris완충용액에 재현탁하였다. (전형적으로 40 내지 80 A₅₅₀/㎖).

실시예 XII

호모-세린락톤 hPTHrp(1-34) 펩티드의 정제 및 융합 단백질의 프로세싱

CNBr 로 hPTHrp(1-34) 다량체 융합 단백질에 측위하는 메티오닌 잔기를 절단함으로써 원하는 호모-시린락톤 hPTHrp(1-34) 폴리펩티드가 유리되며, 이는 하기와 같이 정제하였다.

<융합 단백질의 CNBr 처리>

TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4 융합 단백질의 세척된 펠렛을 70 % 포름산 60 ㎖ 에 천천히 교반함으로써 재현탁하였다 (약 20 ㎎/㎖ 총 단백질; 통상적으로 1000 A₅₅₀세포 유니트로부터의 물질을 3 ㎖ 에 용해함). 옥탄올 수 방울을 첨가하고 5.5 g CNBr 을 첨가하기 전에 20 분동안 용액에 N₂가스를 폭기시켰다. 동일 체적(50:50)의 MeOH 와 H₂O 를 시료와 혼합하기 전에 25 ℃ 에서 6 시간동안 반응을 진행시키고, 이어 회전 증발에 의해 제거하였다. 이 공정을 2 내지 4 회 반복하면, 다량의 포름산 및 CNBr 이 제거 되었다. 그 다음 시료를 건조 증발시키고 물 200 ㎖ 에 재용해하고 동결건조시켜 저장하였다.

<호모-시린락톤 hPTHrp(1-34) 의 정제>

CNBr 절단된 상층액을 여러번 변화를 주며 24 시간 동안 50 mM KH₂PO₄pH 6.5 에 대하여 투석시켰다. 투석동안, pH 를 6.5 로 조정하였다. 투석후 고속 원심분리로 침전물을 제거하였다. 여과기(Gelman 0.45 μ, Acrodisc 4184) 로 상층액을 여과하였다.

<양이온 교환 크로마토그래피>

Bio-Gel TSK-SP-5PW HPLC 컬럼(21.5 ×150 mm) 상의 양이온 교환 크로마토그래피로 초기 정제를 실시하였다. 고-정제된 호모-세린락톤 hPTHrp(1-34) 펩티드의 약 12 ㎎ 수득량 및 8 ㎖/분의 유속에 대한 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:

1. 50 mM KH₂PO₄pH 6.5 에서의 컬럼 평형;

2. 청징된 상청액 10 ㎖ (약 1.5 리터의 배양액 또는 2.4 g의 봉입체) 투입;

3. 기준선이 안정될 때까지 50mM NaCl을 함유하는 50mM KH₂PO₄(pH 6.5)로 컬럼 세척;

4. 90 mM NaCl 을 함유하는 50mM KH₂PO₄(pH 6.5)로 컬럼 용출, 약 45 분 동안 분획 수획;

5. 폴링(pooling) 및 저장전에 C18 HPLC 컬럼으로 호모세린락톤 hPTHrp(1-34) 함량에 대하여 90 mM NaCl 분획을 분석.

<역상 HPLC 크로마토그래피>

역상 Poros R/H 4.6 ×100 mm 컬럼(Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) 을 최종 정제 단계에 사용하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다:

이동상 A: 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)/물

B: 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)/CH₃CN

호모-세린락톤 hPTHrp(1-34), 화합물 4 의 체류 시간은 약 2.943 분이었다. 정제된 펩티드는 질량 스펙트럼으로 측정하여 약 98% 순도를 나타냈다.

실시예 XIII

문헌 [Gunness-Hey and Hock, Metab. Bone Dis. 5:177 181 (1984)] 의 공정에 따라 일반적으로 본 발명의 화합물이 난소적출된 래트의 골 질량에 미치는 영향을 평가하였다.

성체 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 암컷 래트를 환경에 적응시키고 중량별로 그룹짓고(n = 9,10 또는 12) 좌우 난소적축(OVX) 또는 샴수술을 실시하였다. 수술후 17 일째에 약물을 투여하기 시작하여 20 일동안 계속해서 투여하였다. 1일 1회 2% 래트 혈청/식염수중의 시험 화합물을 피하주사하였다.

투여 20 일후 래트를 죽이고 우측 대퇴골을 적출하였다. 대퇴골을 반으로 절단하고 소주를 절단함으로써 원위 반 대퇴골(DHF) 을 소주골(TB) 과 피질골(CB) 로 분리하였다. 칼슘을 추출하고 칼세트 칼슘 분석기 (Calcette calcium analyzer) 로 측정하고 ㎎/DHF/체중 100 g 단위의 평균 골 Ca 로서 나타냈다.

2 가지의 시료 t-테스트를 사용하여 OVX 와 샴 그룹을 비교하였다. 한 방향ANOVA 를 사용하여 OVX 그룹을 비교한 후 피셔(Fisher) LSD 다중 비교로 각 처리 그룹을 부형제 그룹과 비교하였다.

난소적출은 주로 소주골로부터 실질적인 전체 골 손실을 유도하였다. 전체 골 칼슘은 샴 수술 대조군에 대한 수지보다 47 내지 54% 낮았다.

80 ㎍/㎏/일의 bPTH(1-34) 및 hPTHrp(1-34) 는 처리된 OVX 래트에 대해 각각 53 내지 95% 및 18 내지 40 % 범위로 통계학적으로 유의적인 총 골 칼슘의 증가를 나타냈으나 피질 골 칼슘의 실질 증가는 나타나지 않았다.

80 ㎍/㎏/일 농도로 투여된 본 발명의 화합물은 총 골 칼슘을 66% 에서 138% 로, 소주 칼슘을 87% 에서 128% 로 증가시켰다. 또한 피질 골칼슘, 소주 두께 및 골 체적은 처리되지 않은 OVX 대조군에 비하여 상당히 증가되었다.

본 분석에서, 하기 화합물을 시험하였다:

유사한 연구에서, 난소적출된 래트에 40 ㎍/㎏/일 로 5, 10 및 20 일동안 투약하여 하기와 같은 결과를 얻었다:

실시예 XIV

독성

상기 실시예 XI 에서, 본 화합물에 대해서 어떠한 독성 효과도 나타나지 않았다.

파라티로이드 호르몬(PTH), 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드 (PTHrp), 및 PTH 및 PTHrp 의 절단된 생리학적 활성 동족체 및 유사체의 합성 폴리펩티드 유사체, 및 그의 약제학적으로 허용가능한 염(이때, Haa(Laa Laa Haa Haa)₂Laa 순서로 배열된 친지성 아미노산(Laa) 과 친수성 아미노산(Haa)으로부터 선택되는 아미노산 잔기(22-31)은 양쪽성 α-나선을 형성한다)은 포유동물의 골다공증의 치료 및 예방에 유용하다.

Claims

골 질량 증가에 유효량의 하기 서열의 변형된 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드(PTHrp) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 골 질량 감소를 특징로 하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 서열에서,

Xaa¹은 존재하지 않거나 또는 Ala 이고;

Xaa²는 존재하지 않거나 또는 Val 이고;

Xaa³은 존재하지 않거나 또는 Ser 이고;

Xaa⁴은 존재하지 않거나 또는 Glu 또는 Glu(OCH₃) 이고;

Xaa⁵는 존재하지 않거나 또는 His 또는 Ala 이고;

Xaa⁶은 존재하지 않거나 또는 Gln 이고;

Xaa⁷존재하지 않거나 또는 Leu 이고;

Xaa¹⁰및 Xaa¹⁷은 독립적으로 Asp 또는 Asp(OCH₃) 이고;

Xaa¹¹은 Lys, Arg 또는 Leu 이고;

Xaa¹³은 Lys, Arg, Tyr, Cys, Leu, Cys(CH₂CONH(CH₂)₂NH(비오티닐)), Lys(7-디메틸아미노-2-옥소-2H-1-벤조피란-4-아세틸) 또는 Lys(디하이드로신나모일) 이고;

Xaa²⁰은 Arg 또는 Leu 이고;

Xaa¹⁹및 Xaa²¹은 독립적으로 Lys, Ala 또는 Arg 이고;

Xaa^22-31은

(이때, Xaa²²및 Xaa²⁵는 독립적으로 Glu, Glu(OCH₃), His 또는 Phe 이고, Xaa²³은 Leu 또는 Phe 이고, Xaa²⁶은 Lys 또는 His 이고, Xaa²⁸및 Xaa³¹은 독립적으로 Leu 또는 Ile 이고, Xaa²⁹는 Ala, Arg 또는 Glu 이고, Xaa³⁰은 Lys 또는 Glu 이다),

바람직하게는

(이때, Xaa²⁹는 Glu 또는 Arg 이다);

(이때, Xaa²²및 Xaa²⁵는 독립적으로 Glu, Glu(OCH₃), His 또는 Phe 이고, Xaa²³은 Lue 또는 Phe 이고, Xaa²⁹는 Glu, Lys 또는 Lys(COCH₂PEGX)이고, PEGX 는 분자량 100 내지 10,000 의 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르)라디칼이다),

바람직하게는

(이때, Xaa²⁹는 Glu, Lys 또는 Lys(COCH₂PEGX)이고, PEGX 는 분자량 100 내지 10,000 의 폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르) 라디칼이다);

중에서 선택되고;

Xaa³²는 His, Pro 또는 Lys 이고;

Xaa³³은 존재하지 않거나 또는 Pro, Thr, Glu 또는 Ala 이고;

Xaa³⁴은 존재하지 않거나 또는 Pro, Arg, Met, Ala, hSer 락톤, Tyr, Leu 또는 1,4-디아미노부티릴 락탐이고;

Xaa³⁵는 존재하지 않거나 또는 Pro, Glu, Ser, Ala 또는 Gly 이고;

Xaa³⁶은 존재하지 않거나 또는 Ala, Arg 또는 Ile 이고;

Xaa³⁷은 존재하지 않거나 또는 Arg, Trp 또는 3-(2-나프틸)-L-알라닐 이고;

Xaa³⁸은 존재하지 않거나 Ala 또는 hSer 이거나;

Xaa^38-42는 Thr Arg Ser Ala Trp 이고;

Term 은 OR 또는 NR₂(이때, R 은 각각 독립적으로 H, (C₁-C₄) 알킬 또는 페닐 (C₁-C₄) 알킬이다)이다.
골 질량 증가에 유효량의 제 1 항의 변형된 파라티로이드 호르몬 관련 펩티드 (PTHrp) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 약 0.5 ㎍ 내지 약 50 ㎍ 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 골 질량 감소를 특징으로 하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 단위 투여형의 약제학적 조성물.