HU211348A9

HU211348A9 - Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis

Info

Publication number: HU211348A9
Application number: HU95P/P00281P
Authority: HU
Inventors: John J Nestor; John L Krstenansky; Brian H Vickery; Chinh T Bach; Teresa Leung Ho
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1992-07-14
Filing date: 1995-06-20
Publication date: 1995-11-28
Also published as: US5874086A; KR100461618B1; KR20030097580A; KR950702578A; NZ254554A; US5589452A; EP0651765A1; FI950169A; US5695955A; CA2140281A1; ATE202115T1; US5840837A; WO1994001460A1; AU4670593A; JP4106082B2; US6051686A; AU671851B2; DE69330347D1; DK0651765T3; MX9304226A

Description

A találmány a parathormon és a parathormonnal rokon pepiid új analógjaira, szilárd fázisú és rekombináns technikákkal történő szintézisükre, valamint emlősök csonttömegének gyarapításában való alkalmazásukra vonatkozik.

A csontritkulás (osteoporosis) az anyagcsere-eredetű csontbetegségek legáltalánosabb formája, s a csontleépülés (osteopenia) tüneti, töréses stádiumával jellemezhető. Bár a csontritkulás számos betegség következtében másodlagosan is előfordulhat, az esetek 90%ában elsődleges. A klimax utáni életszakaszban lévő nők az elsődleges csontritkulást (posztklimakteriális vagy I. típusú csontritkulás) illetően különösen veszélyeztelettek. Az elsődleges csontritkulást illetően veszélyeztetett másik csoportot - nemtől függetlenül - az idősek képezik (öregkori vagy Π. típusú csontritkulás). A csontritkulás kapcsolatban állhat a kortikoszteroidok alkalmazásával, mozgásképtelenséggel vagy hosszú ideig tartó ágyhoz kötöttséggel, alkoholizmussal, cukorbetegséggel. emelkedett prolaktinszinttel (hyperprolactinaemia), idegi eredetű étvágytalansággal, a menstruáció elsődleges vagy másodlagos elmaradásával (amenorrhoea) és a petefészek eltávolításával (oophorectomia).

A csontritkulás különöző formáiban a mechanikai gyengeséget eredményező csontleépülés miatt csonttörések gyakran előfordulnak. A posztklimakteriális csontritkulás a csukló és a gerinc töréseivel jellemezhető. míg az öregkori csontritkulás esetén a nyaktörés fordul elő leggyakrabban.

Úgy tartják, a csontritkulásban szenvedőkben a csontleépülés mechanizmusa a csontváz önmegújítási folyamatának egyensúlyzavarával áll kapcsolatban. Ezt a folyamatot csontátépítésnek nevezték el, amely több különálló, a működést hordozó üregben zajlik. Ezek az üregek a csont alapállományában egy adott felületen, a csontfelszívódás helyszíneként spontán jelennek meg. Az oszteoklasztok (csontfaló v. csontfelszívó sejtek) felelősek az időátlagban állandó alakú csont egyes részeinek felszívódásáért. Ezt a felszívódási folyamatot az oszteoblasztok (csontképző sejtek) megjelenése köveú, amelyek az oszteoklaszlok állal kialakított üregeket új csontszövettel töltik ki.

Egészséges felnőttben az oszteoklaszlok és oszteoblasztok oly módon alakulnak ki, hogy a csontképződés és a csontfelszívódás egyensúlyban marad. A csontritkulásban szenvedőkben a csontátépítés folyamatának egyensúlya eltolódik, ami azt eredményezi, hogy a csont gyorsabban szívódik fel, mint ahogy felépül. Annak ellenére, hogy ez az egyensúlyzavar az életkor előrehaladtával bizonyos mértékben a legtöbb embernél előfordul, a posztklimakterikus csontritkulásban szenvedőknél ez fiatalabb életkorban, és sokkal súlyosabb mértékben fordul elő.

A csontritkulás kezelésére számos kísérlet történt, amelyek egyrészt arra irányultak, hogy lassítsák a csont további leépülését, másrészt - ami sokkal kívánatosabb -, hogy a csont tömegének tiszta gyarapodását érjék el. Bizonyos anyagokról, mint az ösztrogén és a bifoszfonátok, úgy tűnik, lassítják a csontritkulásban szenvedő betegek csontjának további leépülését. A csontleépülést lassító anyagok a csontfelszívódás és a csontképződés eltérő időtartama miatt növelhetik a csont tömegét (3-7%-os nagyságrendben). Ez a látszólagos növekedés azonban időben korlátozott, nem előrehaladó, s az úgynevezett „csontátépítési tér csökkenéséhez vezet. Ráadásul, a felszívódás és a képződés közötti szoros kapcsoltság miatt, a csontfelszívódást gátló kezelések végeredményben a csontképződést is gátolják.

Felvetették azt a lehetőséget, hogy a parathormonnal (PTH) végzett kezelés a csontátépülési ciklus serkentését és pozitív kalciumegyensúlyt eredményezne. Humán klinikai kísérletekkel azonban kimutatták, hogy a trabekuláris csont mindenféle növekedését a kortikális (corticalis) réteg csökkenése követi, s így a teljes csontot tekintve nincs nettó gyarapodás.

Hefti és mtsi (Clinical Science, 62, 389-396, 1982) arról számoltak be, hogy akár a bPTH(l-84), akár a hPTH(l-34) naponkénti szubkután adagolása mind a normális, mind a csontritkulásban szenvedő nőstény patkányokban növelte az egyes csontok összes kálcium- és hamutömegét.

Liu és mtsi (J. Boné Miner. Rés., 6:10, 1071-1080, 1991) leírták, hogy kifejlett nőstény patkányok petefészkének eltávolítása a tibia proximális metafízisében a trabekuláris csontszövet arányának 47%-os csökkenését eredményezte, amit az oszteoblasztok és trabekuláris oszteoklaszlok számának jelentős gyarapodása követett. AhPTH(l-34) naponkénti szubkután injektálása a trabekuláris csont leépülését teljes mértékben megfordította, s olyan mértékű gyarapodást eredményezett, hogy a trabekuláris csont mennyisége meghaladta a látszatkezelt kontroliban tapasztalhatóét. Az oszteoblasztok száma nőtt, az oszteoklasztoké csökkent.

Hock és mtsi (J. Boné Miner. Rés., 7:1,65-71, 1992) leírták, hogy egészséges, kifejlett hím patkányokat 12 napig naponta hPTH(l-34) szubkután injektálással kezelve a trabekuláris és kortikális csont kalcium- és száraztömege nőtt. Növekedett a teljes csonttömeg, a trabekuláris csont térfogata, a gerendák (trabekulák) falvastagsága és száma, valamint az oszteoblasztos felületek nagysága.

Az emlős parathormonok, például a humán (hPTH), a szarvasmarha (bPTH) és a sertés (pPTH) parathormonok 84 aminosavból álló egyszálú polipeptid-láncok, melyeknek molekulatömege hozzávetőleg 9500. A biológiai aktivitás az N-terminális résszel, az 1-34. aminosavakkal kapcsolatos, melyekről úgy tűnik, az aktivitáshoz minimálisan szükséges szakaszt képviselik.

A humán PTH N-terminális szegmense a szarvasmarha és a sertés hormon N-terminális szegmensétől csak három, illetve két aminósavban különbözik:

hPTH (1-34) :

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu 15 10 15

HU 211 348 A9

Asn Val	Ser His	Met Asn	Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg	Lys	Lys	Leu	Gin	Asp 30
Phe	20 (1.	25 számú szekvencia);
bPTH(l-	34) :
Ala	Val	Ser	Glu	He	Gin Leu Met His Asn	Leu	Gly	Lys	His	Leu
1				5	10					15
Ser	Ser	Met	Glu	Arg	Val Glu Trp Leu Arg	Lys	Lys	Leu	Gin	Asp
				20	25					30
Val	His	Asn	Phe	(2.	számú szekvencia);

pPTH[l-34):

Ser	Val	Ser	Glu	He	Gin Leu Met His Asn	Leu	Gly	Lys	His	Leu
1				5	10					15
Ser	Ser	Leu	Glu	Arg	Val Glu Trp Leu Arg	Lys	Lys	Leu	Gin	Asp
				20	25					30
Val	His	Asn	Phe	(3.	számú szekvencia);

A ΡΤΉ elsődleges funkciója azoknak az adaptív változásoknak a kiváltása, amelyek arra szolgálnak, 20 hogy az extracelluláris folyadékban fenntartsák a Ca²⁺állandó koncentrációját. A PTH hat a vesére, növelve a Ca²⁺ vizeletből történő tubuláris reabszorpcióját, valamint serkentve a kalciferdiol kalcitriollá való átalakulását. amely a Ca²+ belekből történő abszorpciójáért 25 felelős. A PTH egyik kiemelkedő hatása a csontokból történő Ca²⁺-mobilizáció. A PTH növeli a csont kalcium- és foszfátion-visszaszívásának arányát, továbbá serkenti az oszteoklasztok által megvalósuló csontfelszívódás arányát, növeli a mezenchima-sejtek oszteok- 30 lasztokká differenciálódásának arányát, s meghosszabbítja ezen utóbbi sejtek felezési idejét. A PTH tartós működésével nő a csontképző oszteoblasztok száma is, így fokozódik a csontátépülés körfolyamatának mértéke. A különálló oszteoblasztok azonban kevésbé mutatkoznak aktívnak, mint a normálisak.

Rosenblatt és mtsi (4 423 037, 4 968 669 és 5 001 223 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírások) a PTH N-terminális (1-6) aminosavainak deléciójával, és a Phe ⁷, Met⁸· ¹⁸ és Gly¹²szelektív helyettesítésével előállított PTH-antagonistákat írtak le. A Try³⁴-NH₂ beépítése a leírás szerint növelte ezen vegyületek aktivitását és stabilitását.

A parathormon rokon peptid (PTHrp) - egy 140+ aminosavas peptid - valamint annak fragmensei a PTH fő biológiai működéseit mutatják. A PTHrp-t számos humán és állati tumor- és egyéb szövet feldolgozza, s szerepet játszhat a rosszindulatú hiperkalcémia (emelkedett vérkalcium szint) kialakulásában. AhPTHrp (134) szekvenciája a következő:

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser lle 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu lle Ala Glu

25 30 lle His Thr Ala (4. számú szekvencia);

A hPTH és a hPTH-rp közötti szekvencia-homológia nagyrészt a 13 N-termimális aminosavra korlátozódik, melyek közül 8 azonos; a hPTH 25-től 34. aminosavig terjedő receptorkötő régiójában 10 aminosav közül csak egy konzerválódik a hPTHrp-ben. A konformációbeli hasonlóság szolgálhat a közös aktivitás alapjául. Cohen és mtsi. (7. Bioi. Chem., 266:3, 1997-2004, 1991) arra következtettek, hogy a PTH(l-34) és PTHrp(l-34) szekvenciájának nagy része, különösen az 5-18. aminosavból, illetve a 21-34. aminosavból álló régiók alfahelikális konfigurációt vesznek fel. Megjegyezték, hogy vannak bizonyos problémák annak eldöntését illetően, hogy ez a konfiguráció fiziológiai körülmények között a karboxi-terminális végre jellemző-e. Az ilyen másodlagos szerkezet fontos lehet a lipid- és receptor-kölcsönhatásokban, és/vagy a szerkezet stabilizálásában.

PTH és PTHrp analógokat szintetizáltunk azzal a céllal, hogy tökéletesített gyógyszereket fejlesszünk ki a csont tömegének fenntartására emlősökben, beleértve a csontritkulásban szenvedőket is.

A találmány a parathormon (PTH), parathormonnal rokon peptid (PTHrp), valamint a PTH és PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjainak és analógjainak szintetikus polipeptid analógjaira, valamint azok sóira vonatkozik, melyben a 22-31. aminosav gyökök amfipatikus alfa-hélixet képeznek, s az említett 22-31. aminosavak hidrofil aminosavak (Haa) és lipofil aminosavak (Laa) közül valók, amelyek az alábbi sorrendben rendeződnek el:

Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa.

Ha e szekvencia specifikus, valóságos példáit inszertáljuk a PTH-ba, a PTHrp-be, valamint ezek fiziológiailag aktív, rövidített analógjaiba és homológjaiba, eredményül hatékony csontátépítési szerként alkalmazható polipeptideket kapunk.

Ilyenformán, egyik vonatkozásban a találmány tárgya a PTH és a PTHrp, valamint a PTH és a PTHrp

HU 211 348 A9 fiziológiailag aktív, rövidített analógjainak és homológjainak analógjai, melyekben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, s ezen aminosavak az alábbi szekvenciák szerint rendeződhetnek el:

a) Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷

5

Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰ ahol Xaa¹ és Xaa⁴ jelentése - egymástól függetlenül Glu, Glu(OCHj), His vagy Phe;

Xaa² jelentése Leu v. Phe;

Xaa⁵ jelentése Lys v. His;

Xaa⁷ és Xaa’°jelentése, egymástól függetlenül, Leu v. He;

Xaa⁸ jelentése Ala, Arg v. Glu; és

Xaa⁹ jelentése Lys v. Glu (85. számú szekvencia); előnyösen:

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu;

5 10, ahol

Xaa jelentése Glu vagy Arg (26. számú szekvencia); b) Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu

5

Xaa⁸ Arg Leu; ahol

10,

Xaa¹ és Xaa⁴ jelentése - egymástól függetlenül - Glu, Glu(OCHj), His vagy Phe;

Xaa² jelentése Leu v. Phe;

Xaa³ jelentése Glu, Lys v. Lys (COCHjPEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekulatömege 100-10 000] (86. számú szekvencia); előnyösen:

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu;

1 5 10 ahol

Xaa jelentése Glu, Lys v. Lys (COCHjPEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekulatömege 100-10 000] (27. szá20 mú szekvencia);

c)

Ala 1

Leu

Ala

Glu

Ala 5

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu 10

(28.

SZ .

szekv

d)

Ser 1

Leu

Ser

Ser 5

Leu

Ser

Leu 10

(29.

sz .

szekv

e)

Ala 1

Phe

Tyr

Asp

Lys 5

Val

Ala

Glu

Lys

Leu 10

(30.

sz.

szekv

A találmány másik tárgya a PTH és PTHrp, valamint a PTH és PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjainak és analógjainak analógjai, illetve azok sói. melyekben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa30 hélixet képeznek, s ezen aminosavak szekvenciáit az alábbi szekvenciák közül választjuk ki:

a) Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu; ahol

5 10

Xaa jelentése Glu v. Arg. (26. számú szekvencia);

b) Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu; ahol

10

Xaa jelentése Glu. Lys v. Lys (COCH₂PEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekulatömege 100-10 000] (27. számú szekvencia);

c)

Ala

Leu

Ala

Glu Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Leu

(28 .

SZ .

szekv

1

5

10

d)

Ser

Leu

Ser Ser

Leu

Ser

Leu

(29 .

sz.

szekv

1

5

10

e)

Ala

Phe

Tyr

Asp Lys

Val

Ala

Glu

Lys

Leu

(30.

sz.

szekv

1

5

10

A találmány további tárgya gyógyszerkészítmények a csont tömegének csökkenésével jellemezhető betegségek megelőzésére vagy kezelésére, melyek gyógyszerészetileg megfelelő hordozóval együtt a csontok tömegének növeléséhez hatásos mennyiségben tartalmazzák a parathormon (PTH), a parathormonnal rokon peptid (PTHrp), és a PTH és PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjainak és analógjainak polipeptid-analógját, valamint annak sóit, melyben a 22-31. aminosav gyökök amfipatikus alfa-hélixet képeznek, s a hidrofil aminosavak (Haa) és lipofil aminosavak (Laa) közül kiválasztott 22-31. aminosavak melyek az alábbi sorrendben rendeződnek el: Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa. A találmány további tárgyas eljárások gyógyszerkészítmények előállítására, melyek során a fentebb leírt vegyületeket gyógyszerészetileg megfelelő hordozóval elegyítjük.

A találmány további tárgya eljárások a csont tömegének csökkenésével jellemezhető emlős betegségek kezelésére, melyek során a rászoruló emlősnek a csont

HU 211 348 A9 tömegének növeléséhez hatásos mennyiségben a PTH, PTHrp, vagy a PTH, illetve PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjának vagy analógjának polipeptidanalógját vagy annak sóját adjuk, amelyben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezek az aminosavak hidrofil aminosavak (Haa) és a lipofil aminosavak (Laa) közül valók, melyek az alábbi sorrendben rendeződnek el: Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa.

A találmány tárgya közelebbről eljárások a csont tömegének csökkenésével jellemezhető emlős betegségek kezelésére, melyek során a rászoruló emlősnek a csont tömegének növeléséhez hatásos mennyiségben a PTH, PTHrp, vagy a PTH, illetve PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjának vagy analógjának polipeptidanalógját vagy annak sóját adjuk, amelyben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezen aminosavaknak megfelelő szekvenciát a 26., 27., 28., 29. és 30. számú szekvencia közül választjuk ki.

A találmány további tárgya eljárások a PTH, PTHrp, a PTH, illetve PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjainak vagy analógjainak polipeptid-analógjainak (melyekben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezek az aminosavak hidrofil aminosavak (Haa) és lipofil aminosavak (Laa) közül valók, melyek a Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa sorrendben rendeződnek el) és azok sóinak szilárd fázisú szintézisére, melyek során a védett (védőcsoportal ellátott) aminosavakat egymás után megfelelő gyanta hordozóhoz kapcsoljuk, az oldallánc: és N“-védőcsoportokat eltávolítjuk, s a peptidet lehasítjuk a gyantáról.

A találmány további tárgya eljárások a PTH, PTHrp, a PTH, illetve PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjainak vagy analógjainak polipeptidanalógjainak (amelyekben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezen aminosavaknak megfelelő szekvenciát a 26., 27., 28., 29. és 30. számú szekvencia közül választjuk ki) és azok sóinak szilárd fázisú szintézisére, melyek során a védett aminosavakat egymás után megfelelő gyanta hordozóhoz kapcsoljuk, az oldallánc- és N°-védőcsoportokat eltávolítjuk, s a peptidet lehasítjuk a gyantáról.

A találmány további tárgya eljárások a PTH, PTHrp, vagy a PTH, illetve PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjai vagy analógjai polipeptid-analógjainak (melyekben a 22-31. amiosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezek az aminosavak hidrofil aminosavak (Haa) és lipofil aminosavak (Laa) közül valók, melyek a Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa sorrendben rendeződnek el), és azok sóinak rekombináns szintézisére.

A találmány további tárgya az említett peptid-analógok rekombináns szintéziséhez alkalmazható DNS-szekvenciák, vektorok és plazmidok. Közelebbről, a találmány tárgya e vonatkozásban a PTH, PTHrp, vagy a PTH, illetve PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjainak vagy analógjainak polipeptid-analógjainak (amelyekben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezen aminosavaknak megfelelő szekvenciát a 26., 27., 28., 29. és 30. számú szekvencia közül választjuk ki) és azok sóinak rekombináns szintéziséhez alkalmazható DNS-szekvenciák, vektorok és plazmidok.

Az ábrák rövid leírása Az 1.

ábrán a találmány szerinti PTHrp(l-34) analógot kódoló szintetikus gén nukleotid-szekvenciáját és restrikciós enzimes hasítási helyeit mutatjuk be (hPTH PCR-amplikáció).

A 2. ábrán vázlatosan mutatjuk be a PTHrp(l-34)-analóg génjét magában foglaló plazmid [Trp LE 18 hPTHrp( 1-34)1 konstrukció] előállítását.

A 3. ábrán vázlatosan mutatjuk be a PTHrp(l-34)-analóg génjének két magában foglaló plazmid [Trp LE 18 hPTHrp(l-34)2 konstrukció] előállítását.

A 4. ábrán vázlatosan mutatjuk be a PTHrp(l-34)-analóg génjének négy példányát magában foglaló plazmid [Trp LE 18 hPTHrp(l-34)4 konstrukció] előállítását.

Találmányunk leírásában a különböző, általános nukleotidok és aminosavak- egy; és hárombetűs rövidítéseit a Pure Appl. Chem., 31, 639-645 (1972) és 40, 277-290 (1974) ajánlása szerint, valamint a 37 CFR 1.822 paragrafusnak (55 FR 18245, 1990. 05. 01.) és a PCT törvényeknek (W1P0 Standard ST. 23: Recommendationfor the Presentation of Nucleotide and Amino Arid Sequences in Patent Applications and in Published Patent Documents) elegei téve használjuk. Az egy- és hárombetűs rövidítések a következők:

Aminosav rövidítések

Aminosav	Hárombetűs	Egybetűs
Alanin	Alá	A
Arginin	Arg	R
Aszparagin	Asn	N
Aszparaginsav	Asp	D
Asn+Asp	Asx	B
Cisztein	cys	C
Glutamin	Gin	Q
Glutaminsav	Glu	E
Gln+Glu	Glx	Z
Glicin	Gly	G
Hisztidin	His	H
Izoleucin	Ile	I
Leucin	Leu	L
Lizin	Lys	K
Metionin	Met	M
Fenilalanin	Phe	F
Prolin	Pro	P
Szerin	Ser	s
Treonin	Thr	T
Triptofán	Trp	w
Tirozin	Tyr	Y
Valin	Val	V
Egyéb aminosav	Xaa	X

HU 211 348 A9

A rövidítések, ha másképpen nem jelöljük (pl. D- v. D, L-), L-aminosavakat jelölnek. Bizonyos természetes vagy nem természetes aminosavak akrilálisak, mint pl. a glicin. Valamennyi peptid szekvenciáját úgy mutatjuk be, hogy az N-terminális aminosavak a bal oldalon, a C-terminális aminosavak a jobb oldalon helyezkednek el.

A találmányban használt egyéb aminosavak és vegyületek rövidítései a következők: hSer homoszerin hSerlac homoszerin-lakton Nle norleucin

PEG2 dietilén-glikol-meíil-éter-győk; metoxi-di(etilénoxi)-CH₃O(CH₂CH₂O)₂-,(M= 119)

PEG5000 poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök; metoxipoli(etilénoxi)-CH₃O(CH₂CH₂O)i ₁₀-, (átlagos M = 5000);

PEGX poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök;

CH₃O(CH₂Cri₂O)„-, n = 2-225 (átl. M = 100-10 000) A „hidrofil aminosav (Haa)’’ kifejezés olyan aminosavra vonatkozik, amely a peptidkötés kialakításához szükséges csoportokon kívül legalább egy hidrofil funkciócsoporttal rendelkezik; ilyen az arginin, az aszparagin, az aszparaginsav, a glutaminsav, a glutamin, a hisztadin, a lizin, a szerin, a treonin és homológjaik.

A „lipofil aminosav (Laa)” kifejezés töltés nélküli, alifás vagy aromás aminosavra vonatkozik, mint amilyen az izoleucin, a leucin, a metionin, a fenilalanin, a triptofán, a tirozin, a valin és homológjaik.

A találmány céljait illetően az alanint „amfifil” aminosavként soroljuk be, azaz olyan aminosavként, amely hidrofil és lipofil módon is képes működni.

A „PTH vagy PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológja és analógja” kifejezés olyan polipeptidre vonatkozik, amely a PTH vagy PTHrp teljes szekvenciájában található aminosavak számának kevesebb aminosavból álló szekvenciát tartalmaz, miközben hasonló fiziológiai reakciót mutat. A rövidített PTH-nak vagy PTHrp-nek nem szükséges a PTH-val vagy a PTHrp-vel teljesen homológnak lenni ahhoz, hogy hasonló fiziológiai reakciót mutasson. E csoport előnyben részesített, de nem kizárólagos képviselője a PTH( 1 -34) és a PTHrp( 1 -34).

Az „amfipatikus alfa-hélix” kifejezés olyan, bizonyos polipeptidekre jellemző másodlagos szerkezetre vonatkozik, amelyben az aminosavak alfa-helikális konfigurációt vesznek fel, mely a hélix hosszanti tengelye mentén elhelyezkedő, egymással szemben álló poláris és apoláris oldalakkal rendelkezik. Egy adott polipeptidben az alfa-helikális szerkezet létezésének lehetősége bizonyos mértékig kimutatható a helix megfelelő magasságában ún. „Schiffer-Edmundson kerék” kialakításával (M. Schiffer és A. B. Edmundson, Biophys. J„ 7, 121, 1967), s a hélixet körülvevő henger szemközti oldalain a hidrofil és lipofil gyökök elkülönülésének megfigyelésével. Más módon, egy adott polipeptidben az alfa-helikális régió jelenlétére empirikus bizonyítékokat szerezhetünk, például cirkuláris dikroizmus vagy röntgensugárzás diffrakció adatok alapján. Az ideális alfa-hélix menetenként 3,6 aminosavból áll, s a szomszédos oldalláncok 100“-os körívenként különülnek el. Eisenberg és mtsi (Natúré. 299, 371-374, 1982; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 140-144, 1984) az amfipatikus hélixek kvantitatív jellemzéséhez a hidrofóbitási skálát a helikális körrel kombinálták. Az átlagos hidrofóbitási momentum (definíciója szerint): a hélixet felépítő aminosavak hidrofóbitásának vektorösszege. A következőkben Eisenberg (1984) által leírt aminosav hidrofóbitási értékeket adunk meg („konszenzus” skála).

Ile: 0,73; Phe: 0,61; Val: 0,54; Leu: 0,53; Trp: 0,37; Met: 0,26; Alá: 0,25; Gly: 0,16; Cys: 0,04; Tyr: 0,02; Pro: -0,07; Thr: -0,18; Ser: -0,26; His: -0,40; Glu: -0,62; Asn: -0,64; Gin: -0,69; Asp: -0,72; Lys: -1,10; Arg:-1,76.

A menetenként 3,6 gyököt (illetve az oldalláncok között 100‘-os körívet [36073,6]) tartalmazó ideális alfa-hélix hidrofóbitási momentuma (μ_Η) a következő összefüggés szerint számítható:

μ_Η = [(ZH_Nsin5(N-l))²+(ZHNcosö(N-l))²]^l/2melyben HN az N-edik aminosav hidrofóbitási értéke, az összegzések (Σ) pedig a hélix szekvenciájában az egymást 100-onként (delta szög) követő N számú aminosavakra vonatkoznak. A hidrofóbitási momentum az aminosav-gyökönkénti átlagos hidrofóbitási momentumként (<μ_Η>) is kifejezhető, Ebben az esetben <μ_Η> = Hh/N· l00°±20’ delta szögnél a 0,20 vagy annál nagyobb <Ph> értékből amfipatikus hélix kialakulására következtethetünk. A hPTHrp (22-31) és hPTH(22-31) esetében 100” delta szögnél a <μ_Η> értéke 0,19, illetve 0,37.

Comett és mtsi (J. Mól. Bioi., 195, 659-685,1987) az „amfipatikus index” bevezetésével - melyből következtetni lehet az amfipatikus tulajdonságra - kiterjesztették az amfipatikus alfa-hélixek vizsgálatát. Megállapították. hogy az ismert alfa-hélixeknek hozzávetőleg a fele amfipatikus, és az aminosavak ismétlődése inkább 97,5’-onként, mint 100“-onként tapasztalható, miközben az aminosav-gyökök menetenkénti száma közelebb van a 3,7-hez, mint a 3,6-hoz. Bár az ilyen pontosítások tudományosan érdekesek, Eisenberg és mtsi. alapul szolgáló megközelítése megfelelő egy adott szekvencia amfipatikus tulajdonságának eldöntéséhez, különösen, ha egy szekvenciából ab initio szándékozunk amfipatikus alfa-hélixet kialakítani.

Egy nem természetes, amfipatikus alfa-helikális aminosav-szekvencia nem feltétlenül homológ a természetesen előforduló polipeptid megfelelő szakaszával, de fiziológiai környezetben hasonló másodlagos szerkezettel (pl. poláris és apoláris szemközti oldalakkal rendelkező amfipatikus alfa-hélix) rendelkezik. A természetesen előforduló aminosav-szekvencia módosított szekvenciával történő helyettesítése előnyösen befolyásolhatja az eredeti polipeptid fiziológiai aktivitását, stabilitását vagy más tulajdonságát. Az ilyen szekvenciák tervezéséhez és kiválasztásához Krstenansky és mtsi (FEBS Letters, 242:2, 409-413, 1989) és J. P. Segrest és mtsi (Proteins: Structure, Function, and Genetics, 8, 103, 117, 1990) írtak le útmutatást.

A találmány szerinti, tíz aminosavból álló amfipatikus alfa-hélix a következő képlettel írható le:

HU 211 348 A9

Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa;

melyben a Haa aminosavak hidrofil aminosavak közül, az Laa aminosavak pedig lipofil aminosavak közül valók (amelyeket fentebb definiáltunk). Ideális alfa-hélixet feltételezve, az 1., 4., 5., 8. és 9. gyök a hélix ,,A” oldalán, 140’-os körív mentén helyezkedik el, míg a 2., 3., 6., 7. és 10. gyökök a hélix szemközti „B” oldalának 140°-os körívét foglalják el. Az egyik oldalon elhelyezkedő gyökök előnyösen egymással azonos polaritással rendelkeznek, míg a szemközti oldal gyökei ellentétes polaritásúak; azaz, ha az A oldal teljesen hidrofil, a B oldal teljesen lipofil, és fordítva. A szakemberek észre fogják venni, hogy a találmány szerinti hélixek leírására használt

Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa szekvenciával ellenkező aminosav-sorrendű Laa (Haa Haa Laa Laa)₂ Haa szekvencia szintén megfelel a gyökmegoszlás kritériumainak. s egyenértékű leírását adja a találmány szerinti alfa-hélixeknek.

Az alanin egyaránt helyettesítheti a hidrofil vagy a lipofil aminosavakat, mivel az amfipatikus alfa-hélix bármelyik oldalán elhelyezkedhet, bár az Ala|₀ nem képez amfipatikus alfa-hélixet. A prolint, ciszteint és a tirozint általában nem alkalmazzuk; ezen aminosavak és más véletlenszerű hibák (pl. hidrofil gyök a lipofil oldalon) előfordulása azonban megengedhető, mindaddig. míg a szegmensen belüli többi aminosav megfelelően alkalmazkodik a hidrofil oldal - lipofil oldal elrendeződéshez. A fentebb meghatározott hidrofóbitási momentum kiszámításával könnyen meghatározhatjuk, hogy egy szekvencia megfelelő mértékben amfipatikus-e ahhoz, hogy a találmány szerinti szekvenciának minősíthessük. Ha az aminosav-gyökönkénti maximális momentum 100‘±20° értéknél kb. 0,20 fölött van, úgy a szekvencia amfipatikus hélixet alakít ki, s megfelel a találmány céljainak.

Például, a 26. számú szekvencia (Xaa = Glu) gyökönkénti átlagos hidrofóbitási momentuma (]00°-nál) a következők szerint számítható ki:

Aminosav	— Η_Νδ(Ν-1)	H sin6 (N-l)	H cosö (N-l)
E	-0,62	0	0	-0,62
L	0,53	100	0,52	-0,17
L	0,53	200	-0,18	-0,50
E	-0,62	300	0,34	-0,31
K	-1,1	400	-0,70	-0,85
L	0,53	500	0,34	-0,41
L	0,53	600	-0,46	-0,27
E	-0,62	700	0,21	-0,58
K -1.1	800	-1,08	-0,19
L	0,53	900	0	-0,53
			Σ = 0,8Ι	Σ = 4,43

μ_Η = l(0.8Jr-h(-4.43)']^,z! =4,50 <μ_Η> = 4.5000 = 0.45

E szekvencia esetén a maximális átlagos hidrofóbitási momentum 92°-nál tapasztalható, s értéke 0,48.

Ennek az elméletnek a parathormon és a parathormonnal rokon peptid esetében való alkalmazását illetően, feltételeztük, hogy a (7-16) és (22-31) régió valamelyike (vagy mindkettő) alfa-helikális másodlagos szerkezettel rendelkezik, s hasonló szerkezeti tulajdonságokkal rendelkező, nem homológ szekvenciával helyettesítető anélkül, hogy a biológiai aktivitás, illetve immunreakciót indukáló képesség csökkenne.

A találmány egyik tárgya a ΡΊΉ, PTHrp, valamint a PTH és PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített analógjainak és homológjainak (vagy ezek sóinak) analógjai, melyekben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, s ezen aminosavak (22-31.) szekvenciáját a következő szekvenciák közül választjuk ki:

a) Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷

5

Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰ ahol 10,

Xaa¹ és Xaa⁴ jelentése - egymástól függetlenül - Glu,

Glu(OCH₃), His vagy Phe;

Xaa² jelentése Leu v. Phe;

Xaa⁵ jelentése Lys v. His;

Xaa⁷ és Xaa¹⁰ jelentése - egymástól függetlenül - Leu v. Ile;

Xaa⁸ jelentése Alá, Arg v. Glu;

és Xaa⁹ jelentése Lys v. Glu (85. számú szekvencia); előnyösen:

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu 1 5 10, ahol Xaa jelentése Glu vagy Arg (26. számú szekvencia);

b) Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu

5

Xaa⁸ Arg Leu; ahol 10,

Xaa¹ és Xaa⁴ jelentése - egymástól függetlenül - Glu,

Glu(OCH₃), His vagy Phe;

Xaa² jelentése Leu v. Phe;

Xaa³ jelentése Glu, Lys v. Lys (COCH₂PEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekulatömege 100-10 000] (86. számú szekvencia); előnyösen;

Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu; 15 10 ahol

Xaa jelentése Glu, Lys v. Lys (COCH₂PEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekulatömege 100-10 000] (27. számú szekvencia);

c) Alá Leu Alá Glu Alá Leu Alá Glu

5

Alá Leu (28. sz. szekv.);

d) Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Ser

5

Ser Leu (29. sz. szekv.);

HU 211 348 A9

e) Alá Phe Tyr Asp Lys Val Alá Glu 1 5

Lys Leu (30. sz. szekv.);

Egy másik vonatkozásban a találmány tárgya a PTH, PTHrp, valamint a ΡΤΉ, és PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített analógjainak és homológjainak, illetve ezek sóinak analógjai, melyek a következő képlettel írhatók le:

Xaa¹ Xaa² Xaa³ Xaa⁴ Xaa⁵ Xaa⁶ Xaa⁷ Leu His Xaa¹⁰ Xaa¹¹ Gly Xaa¹³ Ser Ile Gin Xaa¹⁷ Leu Xaa¹⁹Xaa²⁰ Xaa²¹ Xaa²²'³¹ Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴ Xaa³⁵ Xaa³⁶

Xaa·³⁷ Xaa³⁸ Term.; melyben Xaa¹: hiányzik vagy Alá;

Xaa²: hiányzik vagy Val;

Xaa³: hiányzik vagy Ser;

Xaa⁴: hiányzik vagy Glu v. Glu (OCH₃);

Xaa⁵: hiányzik vagy His v. Alá;

Xaa⁶: hiányzik vagy Gin;

Xaa⁷: hiányzik vagy Leu;

Xaa¹⁰ és Xaa¹⁷ (egymástól függetlenül): Asp v. Asp (OCH,);

Xaa¹¹: Lys, Arg v. Leu;

Xaa¹³: Lys, Arg, Tyr, Cys, Leu, [CH₂CONH(CH₂)₂NH(biotinil)j-Cys, (7-dimetil-amino-2-oxo-2H-l-ben- 25 zopirán-4-acetil)-Lys v. (dihidrocinnamoil)-Lys;

Xaa²⁰: Arg v. Leu;

Xaa¹⁹ és Xaa²¹ (egymástól függetlenül): Lys, Alá v.

Arg:

Xaa²²'³¹: a 26.. 27., 28., 29. v. 30. számú szekvencia 30 valamelyike;

Xaa³²: His, Pro v. Lys;

Xaa³³: hiányzik vagy Pro, Thr, Glu v. Alá;

Xaa³⁴: hiányzik vagy Pro, Arg. Met, Alá, hSer, hSerlakton, Tyr, Leu v. ] .4-diamino-butiril-laktám;

Xaa³⁵: hiányzik vagy Pro, Glu, Ser Alá v. Gly;

Xaa³⁶: hiányzik vagy Alá, Arg v. Ile;

Xaa³⁷: hiányzik vagy Arg. Trp v. 3(2-naftil)-L-alanin;

Xaa³⁸: hiányzik vagy Alá v. hSer; vagy Xaa³⁸ ⁴²: Thr, Arg, Ser, Alá, Trp; és

Term.: OR v. NR₂, melyekben R egymástól függetlenül lehet hidrogén, 1-4 szénatomos alkil- vagy fenil(Cj.₄) alkilcsoport; valamint ezek gyógyszerészetileg megfelelő sói.

A találmány egy további tárgya az alábbi I. képlet szerinti, fiziológiailag aktív, rövidített hPTHrp(l-34) homológ: Alá Val Ser Glu Xaa⁵ Gin Leu His Asp Xaa

Gly Xaa¹³ Ser He Gin Asp Leu Xaa¹⁹ Arg Xaa²¹ Xaa²²’ jelentése His v. Alá;

Xaa¹¹ és Xaa¹³: (egymástól függetlenül) Lys, Arg v. Leu;

Xaa¹⁹ és Xaa²¹: (egymástól függetlenül) Alav. Arg; Xaa^22-31 jelentése az alábbi szekvenciák valamelyike:

a) Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa

5

Lys Leu; ahol 10,

Xaa jelentése Glu vagy Arg (26. számú szekvencia);

b) Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa

5

Arg Leu; ahol 10

Xaa jelentése Glu, Lys v, Lys (COCH₂PEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekulatömege 100-10 000] (27. számú szekvencia);

c}	Alá Leu Alá Glu Alá	Leu Alá	Glu
1	5
Alá Leu	(28	. sz. szekv,	. ) ;
	10
d)	Ser	Leu	Leu Ser Ser	Leu	Leu	Ser
	1		5
Ser	Leu	(29	. sz. szekv,	.) ;
	10
e)	Alá	Phe	Tyr Asp Lys	Val	Alá	Glu
	1		5

Lys Leu (30. sz. szekv.);

továbbá Xaa³²: His v. Lys;

Xaa³³: Thr, Glu v. Alá;

Xaa³⁴: Alá, hSer, Tyr v. Leu; és Term.: Gly, Arg. Arg, lakton, OH vagy NR₂ (melyben 35 mindkét R lehet H vagy 1—4 szénatomos alkilcsoport), továbbá gyógyszerészetileg megfelelő sóik (I. képlet).

A találmány közelebbi tárgyát azok az I. képlet szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa²²'³¹40 szekvencia a 26. számú szekvencia, melynek átlagos hidrofóbitási momentuma (<μΗ>) 100”-nál több, mint 0,45. A találmány még specifikusabb tárgyát azok az I. képlet szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa^22-31 szekvencia a 26. számú szekvencia, és me45 lyekben Xaa¹¹ és Xaa¹³ jelentése egyaránt Lys; továbbá Xaa¹⁹ és Xaa²¹ jelentése egyaránt Arg.

A jellemző polipeptidek közé tartoznak (nem kizárólagosan) az alábbi szekvenciák:

³¹ Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴ Term., melyben Xaa⁵

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10					15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25					30
Leu	His	Thr	Alá	OH	(5. számú szekvencia)
Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10					15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25					30
Leu	His	Thr	Alá	OH	(6. számú szekvencia)

HU 211 348 A9

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

Alá

nh₂

(7.

számú szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

hSer NH₂

(8.

számú szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

hSer-lakton

(9.

számú szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

Alá

Gly

Arg

OH

(10.

számú szekvencia);

35

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

Lys

Glu

Leu

NH₂

(11.

számú szekvencia);

A találmány egy másik tárgyát azok az I. képlet szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa²²'³¹szekvencia a 26. számú szekvencia, és melyekben

Xaa¹⁹ és Xaa²¹ egyikének jelentése Arg, míg a másiké Alá. Ezé alcsoport jellemző polipeptidjei közé tartoznak (nem kizárólagosan) az alábbi szekvenci-

Xaa'	¹ és	Xaa¹·	¹ jelentése	egyaránt Lys; továbbá ák:
Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Alá	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	NH₂	(12. számú szekvencia);
Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Alá Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	NH₂	(13. számú szekvencia);

A találmány egy másik tárgyát azok az I. képlet szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa²²'³¹ 45 szekvencia a 26. számú szekvencia, és melyekben az Xaa¹¹ és az Xaa¹³ egyikének jelentése Leu, míg a

Alá	Val	Ser	Glu	Alá	Gin	Leu	Leu His Asp
1				5			10
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu
				20			25
Leu	His	Alá	Leu	OH	(14.	számú szekvencia

másik jelentése Lys; továbbá Xaa¹⁹ és Xaa²¹ jelentése egyaránt Arg. Ezen alcsoport jellemző polipeptidjei közé tartozik (nem kizárólagosan) az alábbi szekvencia:

Leu Gly Lys Ser Ile 15

Lys Leu Leu Glu Lys 30 ) ;

A találmány egy további tárgyát azok az I. képlet szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa²²'³¹szekvencia a 27. számú szekvencia, melynek átlagos hidrofóbitási momentuma (<μ_Η>) 100°-nál több, mint 0,50.

A találmány egy további tárgyát azok az I. képlet szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa²²'³¹szekvencia a 27. számú szekvencia, és melyekben Xaa és Xaa¹³ jelentése egyaránt Lys vagy egyaránt Arg; továbbá Xaa¹⁹ és Xaa²¹ jelentése egyaránt Arg. Ezen alcsoport jellemző polipeptidjei közé tartoznak (nem kizárólagosan) az alábbi szekvenciák:

HU 211 348 A9

Alá

Val

Ser Glu His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu Arg Arg

Arg

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

His

Thr Alá OH

(15.

számú szekvencia);

Alá

Val

Ser Glu His

Gin

Leu

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu Arg Arg

Arg

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

His

Thr Alá OH

(16.

számú szekvencia);

Alá

Val

Ser Glu His

Gin

Leu

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu Arg Arg

Arg

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu

Lys

Arg

20

25

30

Leu

His

Thr Alá OH

(17 .

számú szekvencia);

Alá

Val

Ser Glu His

Gin

Leu

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu Arg Arg

Arg

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu

20

25

Lys

(COCH₂PEG2) Arg ο n

Leu

His

Thr

Alá

OH (18.

számú szekvencia

Alá

Val

Ser Glu His

Gin

Leu

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu Arg Arg

Arg

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu

20

25

Lys

(CQCH₂PEG5000) Arg Leu His Thr Alá OH (19. számú

sze

:kven

A találmány egy további tárgyát azok az I. képlet hidrofóbitási momentuma (<μ_Η>) 100'-nál körülbelül szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa²²'³¹ 30 0,25. Ezen alcsoport jellemző polipeptidjei közé tartószekvencia a 28. számú szekvencia, melynek átlagos zik (nem kizárólagosan) az alábbi szekvencia:

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu Leu His

Asp

Lys

Gly

Arg

Ser

Ile

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Alá Leu Alá

Glu

Alá

Leu

Alá

Glu

Alá

20

25

30

Leu

His

Thr

Alá

NH₂

(20.

számú szekvenci

a) ;

A találmány egy további tárgyát azok az I. képlet hidrofóbitási momentuma (<μ_Η>) 100-nál körülbelül szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa^{22 ?l} 40 0,28. Ezen alcsoport jellemző polipeptidjei közé tartószekvencia a 29. számú szekvencia, melynek átlagos zik (nem kizárólagosan) az alábbi szekvencia:

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Ser Leu Leu Ser Ser	Leu	Leu	Ser	Ser
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(21. számú szekvencia);

A találmány egy további tárgyát azok az 1. képlet 50 hidrofóbitási momentuma (<μ_Η>) 100°-nál körülbelül szerinti polipeptidek képezik, melyekben az Xaa²²'³¹ 0.29. Ezen alcsoport jellemző polipeptidjei közé tartószekvencia a 30. számú szekvencia, melynek átlagos zik (nem kizárólagosan) az alábbi szekvencia:

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Alá Phe Tyr Asp Lys	Val	Alá	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(22. számú szekvencia);

HU 211 348 A9

A találmány további tárgyát képzeik a fiziológiailag aktív, rövidített bPTH(l-34) homológ II. képlet szerinti polipeptid analógjai:

Xaa¹ Val Ser Glu He Gin Xaa⁷ Xaa⁸ His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa¹⁶ Ser Xaa¹⁸ Xaa¹⁹ Arg Xaa²¹Xaa²²·^{25 * * * * * 31 *} His Asn Xaa³⁴ Term.; melyben

Xaa^! jelentése Ser v. Alá;

Xaa⁷ jelentése Leu v. Phe;

Xaa⁸ jelentése Met v. Nle;

Xaa¹⁶ jelentése Asn v. Ser;

Xaa¹⁸ jelentése Leu, Met v. Nle;

Alá	Val	Ser	Glu	Ile	Gin Phe Nle His	Asn	Leu	Gly	Lys	His	Leu
1				5		10					15
Ser	Ser	Nle	Glu	Arg	Val Glu Leu Leu	Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20		25					30
Leu	His	Asn	Tyr	nh₂	(23. számú szekvencia);	és
Alá	Val	Ser	Glu	Ile	Gin Phe Nle His	Asn	Leu	Gly	Lys	His	Leu
1				5		10					15
Ser	Ser	Nle	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu	Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20		25					30
Leu His Asn Tyr NH₂ (24.	számú szekvencia).		Glu Lys Leu Leu Glt

A találmány egy további tárgyaként, meglepő módon, azt találtuk, hogy a ΡΊΉ és PTHrp 34 aminosavnál kevesebb gyököt tartalmazó homológjai és analógjai szintén hatásos csontátépítési szerek. Ezek az alábbi általános képlettel írhatók le:

Alá Val Ser Glu Xaa⁵ Gin Leu Leu His Asp Xaa¹¹Gly Xaa¹³ Ser Ile Gin Asp Leu Xaa¹⁹ Arg Xaa²¹Xaa²²'³¹ Xaa³³ Xaa³⁴ Term.

41. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH₂ (55. számú szekvencia)

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu	His
1				5
Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
10					15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu	Leu
			20
Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys

30

Leu His Pro NH₂ (55.számú szekvencia); és

Fizikai adatok:

O.p.: 142,8-166,1 ’C [a]g = -53,80 (c = 0,38,

H₂O) FAB (C,₇,H₂₉jN55O₄₉): [M+H]⁺ = 3929

AAA: Asx 2,0 (2) Glx 5,7 (6) Ser 1,8 (2)

His 3,0 (3) Gly 1,1 (1) Alá 0,9(1)

Arg 2,8 (3) Val 1,2(1) Ile 0,9(1) Leu 7,4 (8) Lys 4,4 (4) Pro 0,9 (1)

42. vegyület AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR

RELLEKLLEK LP-NH₂ (56. számú szekvencia)

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu	His	55
1				5
Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
10					15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu	Leu
				20					60

Xaa¹⁹ jelentése Glu v. Arg;

Xaa²¹ jelentése Val v. Arg;

Xaa²²'³¹ jelentése a 26., 27., 28., 29. és 30. szekvenciák valamelyike;

Xaa³⁴ jelentése Phe ν. Tyr;

Term. jelentése OH v. NR₂ (melyben R jelentése H vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport); továbbá ezek gyógyszerészetileg megfelelő sói. (Π. képlet).

A jellemző polipeptidek közé tartoznak (nem kizá10 rólagosan) az alábbi szekvenciák:

25 30

Leu Pro NH₂ (56.számú szekvencia); és

Fizikai adatok:

O.p.: 161,0-177,0 C [cc]g = -61,97 (c = 0,19, H₂O) FAB (Ο,^Η^ΝηΟ^): [M+H]⁺ = 3792,0

AAA: Asx 2,2 (2) Glx 5,9 (6) Ser 1,9 (2)

His2,1 (2) Gly 1,1 (1) Alá 1,0(1) Arg 3,0 (3) Val 1,1 (1) Ile 1,0(1) Leu 7,9 (8) Lys 4,3 (4) Pro 0,9 (1)

A szakemberek számára nyilvánvaló lesz, hogy számos megváltoztatott aminosav-sorrendű polipeptid szintetizálható, amelyek a leírt, kívánt tulajdonságokkal rendelkeznek, azzal a kikötéssel, hogy a 22-31. aminosavaknak megfelelő helyen egy olyan aminosavszekvencia helyezkedik el, melynek aminosav-gyökön40 kénti átlagos hidrofóbitási momentuma 100°±20‘-nál nagyobb, mint kb. 0,20.

A polipeptidek klasszikus szintézise A találmányunk szerinti polipeptidek olyan eljárá45 sokkal szintetizálhatók, mint amilyeneket (a szilárd fázisú szintézissel kapcsolatban) J. M. Stewart és J. D. Young (Solid Phase Synthesis, 2. kiadás, Perce Chemical Co., Rockford, Illinois, 1984) és J. Meinhofer (Hormonal Proteins and Peptides, 2. kötet, Academic Press,

New York, 1973), illetve - az oldatban végzett szintézissel kapcsolatban - E. Schröder és K. Lubke (The Peptides, 1. kötet, Academic Press, New York, 1965) írtak le.

Ezek az eljárások általában a védett aminosavak növekvő peptidlánchoz való egymás utáni hozzáadását foglalják magukban. Rendszerint az első aminosav aminovagy karboxilcsoportja, illetve a reaktív oldallánc-csoportok védettek, ezt a védett aminosavat inért szilárd hordozóhoz kapcsolják, vagy oldatban alkalmazzák, s a

HU 211 348 A9 aminosavat az amidkötés kialakításához alkalmas körülmények között adják az előző aminosavhoz. Miután valamennyi kívánt aminosavat a helyes sorrendben összekapcsolták, a védőcsoportokat és a szilárd hordozót eltávolítják, miáltal a nyers polipeptidet kapják. A végtermék előállításához a polipeptidet sótalanítják és tisztítják - lehetőleg kromatográfiás úton.

A negyven aminosavnál kevesebbet tartalmazó, fiziológiailag aktív, rövidített polipeptidek analógjainak előnyben részesített előállítási módja a szilárd fázisú peptidszintézis. Ebben az eljárásban az alfa-amino (N“) funkcióscsoportokat és valamennyi reaktív oldalláncot sav- vagy bázisérzékeny védőcsoportoknak a peptidkötés kialakításának körülményei között stabilnak kell lenni, s a meglévő polipeptid-lánc befolyásolása nélkül könnyen eltávolíthatónak is kell lenni. Az alkalmas alfa-amino védőcsoportok közé tartoznak (nem kizárólagosan) a í-butoxi-karbonil- (Boc), a benzil-oxi-karbonil (Cbz), az o-klór-benzoil-oxi-karbonil-, a bifenil-izopropil-oxi-karbonil-, a í-amiloxi-karbonil(Amoc). az izobomil-oxi-karbonil-, az alfa, alfa-dimetil-3.5-(dimetoxi)-benzil-oxi-karbonil-, az o-nitrofenilszulfenil-, a 2-ciano-r-butoxi-karbonil-, a 9-fluorenilmetoxi-karbonil- (Fmoc), és hasonló védőcsoportok, melyek közül a ?-butoxi-karbonilcsoport az előnyben részesített. Az alkalmas oldallánc védőcsoportok közé tartoznak (nem kizálólagosan) az acetil-, benzil- (Bzl), benzil-oxi-metil (Bőm), o-bróm-benzil-oxi-karbonil-, f-butil-, Ζ-butil-dimetil-szilil-, 2-klór-benzil- (Cl-z), 2,6-diklór-benzil-, ciklohexil-, ciklopentil-, izopropil-, pivalil, letrahidropirán-2-il-, lozil- (Tos), trimetil-szililés tritil-csoportok.

A szilárd fázisú szintézis során a C-terminális aminosavat először megfelelő gyanta hordozóhoz kapcsoljuk. A megfelelő gyanta hordozók olyan anyagok, amelyek a reagensekkel és a lépésenkénti kondenzációs és védőcsoportok eltávolítási körülményekkel szemben mertek, és az alkalmazott oldószerben nem oldódnak. A kereskedelmileg beszerezhető gyanták közé tartoznak a reaktív csoporttal módosított sztirol/divinil-benzol kopolimer gyanták, például a klórmetilezelt sztiroldivinilbenzol kopolimer, a hidroximetilezett sztirol-divinilbenzol kopolimer és hasonlók. A benzilezett, hidroximetilezett fenil-acetamidometil (PAM) gyanta az előnyben részesített. Ha a vegyület C-terminálisa egy amid. úgy az előnyben részesített gyanta a p-metilbenzhidril-amino-(sztirol-divinil-benzol) kopolimer.

Az aminosav PAM gyantához való kapcsolását az N“-védett aminosav (lehetőleg a Boc-aminosav) ammónium-, cézium-, trietil-ammónium-, 1,5-diaza-biciklo-[5.4.0]-undec-5-én-, tetrametil-ammónium- vagy hasonló sójának etanolban, acetonitrilben, N,N-dimetil-formamidban (DMF) és hasonlókban a gyantával végzett reakciójával valósítjuk meg. Előnyösen a cézium-sót reagáltatjuk DMF-ben a gyantával, emelt hőmérsékleten; például 40-60 ’C-on, lehetőleg 50 ’C-on, kb. 12-72 órán keresztül, lehetőleg kb. 48 óráig.

Az N“-Boc-aminosav például N.N’-diizopropilkarbodiimid (DIC/l-hidroxi-benzo-triazol (HOBt) közvetett kapcsolással erősíthető a benzhidril-gyantához, mely reakciót kb. 2 órától kb. 24 óráig teijedő ideig, előnyösen kb. két órán keresztül kb. 10 ’C-tól kb. 50 °C-ig terjedő hőmérsékleten, előnyösen 25 C-on. diklór-metán vagy dimetil-formamid oldószerben (lehetőleg diklór-metánban) végezzük.

A védett aminosavak egymás utáni összekapcsolása a tudományban jól ismert eljárásokkal végezhető, jellemzően automatizált peptid-szintetizátorban. Trietilaminnal vagy más, hasonló bázissal végzett semlegesítés után a védett aminosavakat előnyösen kb. 1,5-2,5szeres moláris feleslegben adjuk, s az összekapcsolást inért, nem vizes, poláris oldószerben pl. diklór-metánban, DMF-ben vagy ezek elegyében, előnyösen diklórmetánban, környezeti hőmérsékleten végezzük. A jellemző összekapcsolási szerek az N,N -diciklohexil-karbodiimid (DCC), az Ν,Ν'-diizopropil karbodiimid (DIC) és más karbodiimidek, akár önmagukban, akár 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt), O-acil-karbamidok, benzotriazol-l-il-oxi-trisz-(pirrolidino)-foszfónium-h exa-fluoro-foszfát (PyBop), N-hidroxi-szukcinimid, egyéb N-hidroxi-imidek vagy oximok jelenlétében. Más lehetőség szerint a védett aminosav aktív észterei (pl. ρ-nitrofenil-, pentaíluor-fenil-észterek és hasonlók) vagy szimmetrikus anhidridek is alkalmazhatók.

A szilárd fázisú szintézis végén a teljesen védett peptidet eltávolítjuk a gyantáról. Ha a szilárd gyanta hordozóhoz való kötődés benzil-észter típusú, akkor az alkil-amid C-terminálissal rendelkező peptidek esetén a lehasítást alkil-aminnal vagy fluor-alkil-aminnal végzett aminolízissel, szubsztituálatlan amid C-terminálissal rendelkező peptidek esetében pedig ammónia/metanol vagy ammónia/etanol eleggyel végzett aminolízissel, körülbelül -10 °C és 50 ’C közötti hőmérsékleten (lehetőleg kb. 25 ’C-on), kb. 12-24 (lehetőleg kb. 18) órán keresztül hajtjuk végre. A hidroxi C-terminálissal rendelkező peptidek HF-dal vagy más erősen savas védőcsoport eltávolítóval vagy elszappanosítással hasíthatók le. Más módon, a peptidek például metanollal végzett transz-észteresítéssel, majd az azt követő aminolízissel vagy elszappanosítással is eltávolíthatók a gyantáról. A védett peptid szilikagél oszlopkromatográfiával tisztítható.

A peptidről az oldallánc védőcsoportok az aminolízissel nyert termék, például anizol vagy egyéb karbóniumion-eltávolíló anyag jelenlétében, vízmentes folyékony hidrogén-fluoriddal végzett kezelésével, hidrogén-fluorid/piridin komplexszel, trisz(trifluor-acetiljboronnal és tirfluor-ecetsavval végzett kezelésével, vagy folyékony ammóniában nátriummal végzett redukciójával távolítható el; előnyösen folyékony hidrogén-fluoriddal és anizollal kb. -10 ’C és +10 ’C közötti (lehetőleg 0 ’C) hőmérsékleten kb. 15 perc és 2 óra közötti (lehetőleg 1,5 óra) ideig végzett kezeléssel.

Benzhidril-amin gyantán lévő peptidek esetében a gyantáról való lehasítás és a védőcsoportok eltávolításának lépései a fent leírt folyékony hidrogén-fluorid és anizol alkalmazásával egy lépésben végezhetők.

Az oldatot sótalaníthatjuk (pl. BioRad AG-3^R anioncserélő gyantával), s a peptid kromatográfiás lépések sorozatával tisztítható, melynek során az alábbi mód12

HU 211 348 A9 szerek bármelyikét (vagy mindet) alkalmazhatjuk: ioncsere gyengén bázisos gyantán, acetát alakban; hidrofób adszorpciós kromatográfia szubsztituálatlan sztirol-divinil-benzol kopolimeren, pl. Amberlite^R XAD-n; szilikagél adszorpciós kromatográfia; karboxi-metilcellulózon végzett ioncserélő kromatográfia; megoszlásos kromatográfia, pl. Sephadex^R G-25 oszlopon; ellenáramú megoszlásos kromatográfia; illetve nagy teljesítményű folyadék-kromatográfia (HPLC), különösen oktil- vagy oktadecilszilil-szilikát (ODS) kötött fázisú oszlopon végzett reverz fázisú HPLC:

Fentieknek megfelelően a találmány egy további tárgya eljárások polipeptidek és gyógyszerészetileg megfelelő sóik előállítására, melynek során a védett aminosavakat egymást követően alkalmas gyanta hordozón kondenzáljuk, majd eltávolítjuk a védőcsoportokat és a gyanta hordozót, s a terméket tisztítjuk, miáltal a PTH és PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjainak és analógjainak [előnyösen a PTH(l-34) és PTHrp(]-34)] analógjait állítjuk elő, melyekben a 2231. helyen lévő aminosavak amfipatikus alfa-helikális peptid-szekvenciát képeznek (amit fentebb leírtunk).

Polipeptidek rekombináns szintézise

A találmány szerinti polpeptidek előállításának másik módja a kívánt polipeptidet kódoló gén klónozása és expresszálása. Ebben az eljárásban olyan plazmidot készítünk, amely a kívánt DNS-szekvenciát tartalmazza, és megfelelő mikroorganizmus gazdába, általában baktériumba, például E. co/i-ba vagy élesztőkbe, például Saccharomyces cerevisiae-be inszertáljuk, miáltal a mikroorganizmust a plazmid - s ilyenformán a találmány szerinti polipeptid analógokat kódoló cDNS másolatainak - termelésére indukáljuk.

Az eljárás során először - a későbbiek során végzett változtatások elősegítéséhez - restrikciós hasítási helyek alapján a kiválasztott PTH vagy PTHrp analógot kódoló szintetikus gént szerkesztünk. A szekvencia amplifikálásához polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmazhatunk (ld. Mullis, 4 683 195 és 4 683 202 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

Az amplifikált szintetikus gént izoláljuk és alkalmas plazmidba ligáljuk, pl. Trp LE plazmidba, melybe egymás után a gén négy példánya inszertálható. A Trp LE plazmidokoat a 4 738 921 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és a 0212532 számú európai közrebocsátási iratban írták le. A Trp LE plazmidok általában 8-10-szer több proteint termelnek, mint a Trp E plazmidok. A több példányú gén megfelelő gazdában, például E. co/i-ban vagy Saccharomyces cerevisiae-ben expresszálható.

Az alkalmazott expressziós vektor a Trp LE 18 Prot (Ile³, Pro⁵) volt, amely az ampicillin-rezisztencia gént és a plazmmid replikációs kezdőpontját tartalmazó pBR322 fragmensből (EcoRI-BamHI), a trppromotert és a trpE gént tartalmazó EcoRI-SacII fragmensből, HIV-proteáz (He³, Pro⁵) génfragmensből (SacII-HindlII), bGRF génfragmensből (HidlII-BamHI), és az E. coli rpoc génjéből származó transzkripciós terminátorból áll. A HIV-proteáz és a bGRF génfragmensek nem feltétlenül szükségesek, s szükség szerint egyéb kódoló szekvenciákkal helyettesíthetők.

Az expresszált multimer fúziós proteinek intracelI uráli san stabil befogadó testekben gyűlnek össze, s centrifugálással elkülöníthetők a többi celluláris proteintől. Az izolált fúziós proteint monomer PTH vagy PTHrp analóggá alakítjuk, és kationcserélő és/vagy reverz fázisú HPLC-vel tisztítjuk.

A klónozás, amplifikálás, expresszálás és tisztítás különböző módjai a szakemberek számára nyilvánvalóak. A jellemző eljárásokat Manietis és mtsi írták le (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Alkalmazhatóság és alkalmazás

A találmány szerinti polipeptidek a csont tömegének leépülésében megnyilvánuló számos emlős betegség megelőzéséhez és kezeléséhez alkalmasak. A találmány szerinti vegyületek különösen az oszteoporózis és az oszteopenia megelőző (profilaktikus) és terápiás kezeléséhez alkalmasak.

A találmány szerinti polipeptideket vagy sóikat rendszerint naponta kb. 0,002-1 gg/testtömegkilogramm mennyiségben, lehetőleg naponta kb. 0,04 gg/testtömegkilogramm mennyiségben alkalmazzuk. 50 kg testtömegű nő esetében az aktív összetevő napi adagja kb. 0,1 gg-tól kb. 50 gg-ig, lehetőleg kb. 2,0 gg-tól kb. 10 gg-ig teljed. Más emlősök, például lovak, kutyák, szarvasmarhák esetében nagyobb dózisokra lehet szükség. Ezek a dózisok hagyományos gyógyszerkészítményekben egyszeri, többszöri beadással vagy kontrollált kibocsátással vihetők be, attól függően, hogy melyikkel érhető el a legjobb eredmény. Az előnyben részesített beadási mód a napi egyszeri vagy kétszeri injektálás.

A pontos adagolás, a készítmény és a legmegfelelőbb beviteli rendszer kiválasztását befolyásolhatja többek között - a kiválasztott polipeptid gyógyszerészeti tulajdonságai, a kezelni kívánt betegség természete és súlyossága, valamint a kezelt páciens fizikai állapota és mentális fejlettsége.

A jellemző beadási rendszerek közé tartozik az orális, parenterális (beleértve a szubkután, intramuszkuláris és intravénás beadást), rektális, bukkális (beleértve a szublingvális beadást), pulmonáris, transzdermális és intranazális beadás.

A gyógyszerészetileg megfelelő sók toxikus mellékhatások nélkül megtartják az eredeti polipeptid biológiai aktivitását. Az ilyen sók példái (a) a szervetlen savakkal (pl. sósav, hidrogén-bromid, kénsav, foszforsav, salétromsav és hasonlók), valamint a szerves savakkal (pl. ecetsav, oxálsav, borkősav, borostyánkősav, maleinsav, fumársav, glükonsav, citromsav, almasav, aszkorbinsav, benzoesav, csersav, pamoinsav, alginsav, poliglutaminsav, naftalin-szulfonsavak, naftalin-diszulfonsavak, poligalakturonsav és hasonlók) készített savaddíciós sok;

(b) többértékű fém kationokkal (pl. cink-, kalcium-, bizmut-, bárium-, magnézium-, alumínium-, réz-, kobalt-, nikkel-, kadmiumionok és hasonlók) vagy N,N13

HU 211 348 A9 dibenzil-etilén-diaminból vagy etilén-diaminból képzett szerves kationnal kialakított bázis-addíciós sók; és (c) az (a) és (b) pontban felsorolt sók kombinációi, mint például a cink-tannát só és hasonlók.

A találmány további tárgya gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyek aktív alkotórészként a találmány szerinti polipeptidek valamelyikét vagy gyógyszerészetileg megfelelő sóját gyógyszerészetileg megfelelő, nem toxikus hordozóval keverve tartalmazzák. Amint fentebb említettük, az ilyen készítmények parenterális (szubkután, intramuszkuláris, intravénás) alkalmazáshoz (folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában), orális vagy bukkális alkalmazáshoz (elsősorban tabletták és kapszulák formájában) pulmonáris vagy intranazális alkalmazáshoz (elsősorban porok, orrcseppek és aeroszolok formájában), valamint rektális és transzdermális alkalmazáshoz alakíthatók ki.

A készítmények alkalmas módon egységdózis formában alkalmazhatók, s a gyógyszerészet-tudományban jól ismert, például a Remington ’s Pharmaceutical Sciencesben (Mack Publishing Company, Easton, PA. 17. kiadás, 1985) leírt eljárásokkal állíthatók elő. A parenterális alkalmazáshoz való készítmények kötőanyagként (excipiens) tartalmazhatnak steril vizet vagy sóoldatot, alkilénglikolokat (pl. propilén-glikolt), polialkilén-glikolokat (pl. polietilén-glikolt), növényi eredetű olajokat, hidrogénezett naftalinokat és hasonlókat. Az orális alkalmazáshoz való készítmények epesavas sók vagy acil-kamitinek hozzáadásával egészíthetők ki. A nazális alkalmazáshoz való készítmények lehetnek szilárdak, és tartalmazhatnak kötőanyagokat, például laktózt vagy dextránt, vagy orrcseppek, illetve pontos adagolású spray-k formájában való alkalmazáshoz lehetnek vizes vagy olajos oldatok. A bukkális alkalmazáshoz való jellemző kötőanyagok közé tartoznak a cukrok, a kalcium-sztearát, magnézium-sztearát, az előre zselatinezett keményítő és hasonlók.

Ha a készítményt nazális alkalmazáshoz alakítjuk ki. az orr-nyálkahártyán keresztül történő felszívódás felületaktív savakkal, mint például glikokólsavval, kólsavval. taurokőlsavval, etokólsavval, dezoxikólsavval. kenodezoxikólsavval, dehidrokólsavval, gliko-dezoxikólsavval, ciklodextrinekkel és hasonlókkal fokozható, amelyeket körülbelül 0,2-15 m/m%, lehetőleg kb. 0,5 és 4 m/m%, leginkább 2 m/m% arányban alkalmazunk.

A kezelt beteg találmány szerinti vegyületekkel hosszú időn keresztül, például egy héttől egy évig terjedő ideig tartó ellátása kontrollált kibocsátású, a kívánt kibocsátási időtartam biztosításához megfelelő mennyiségű aktív anyagot tartalmazó rendszer egyszeri alkalmazásával valósítható meg. E célból különféle kontrollált kibocsátású rendszerek, mint például egy részből álló vagy rezervoár-típusú mikrokapszulák, raktározó implantátumok, ozmotikus pumpák, vezikulák, micellák, liposzómák, bőrtapaszok, iontoforetikus eszközök, és más, injektálható dóziskészítmények alkalmazhatók. Néhány kontrollált gyógyszerkibocsátási eszköz az aktív összetevő megkívánt bejuttatás] helyén való elhelyezkedéssel is jellemezhető, amely hasznos bizonyos betegségek kezelésében.

A kontrollált kibocsátási készítmények egyik típusa a polipeptidet vagy sóját lassan lebomló, nem toxikus, nem antigén hatású polimerben diszpergálva vagy ilyen polimerből készített kapszulában tartalmazza. Ilyen polimer például a tejsav/glikolsav kopolimer, amelyet úttörő munkájukban Kent, Lewis, Sanders és Tice írtak le (4 675 189 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A találmány szerinti vegyületek, vagy méginkább, viszonylag oldhatatlan sóik koleszterin vagy más lipid kötőanyagú pirulákká, illetve szilasztomer kötőanyagú implantátumokká alakíthatók. A szakemberek számára egyéb lassú kibocsátású raktározó implantátumok vagy injektálható készítmények is ismertek (ld. például; Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, szerk.: J. R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978; és R. W. Baker, Controlled Release of Biologically Aclive Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987).

A következőkben leírt példákat a találmány szerinti vegyületek szintézisének és tesztelésének jellemzésére, és semmiképpen nem az igénypontok körének korlátozására szánjuk. A példákban „o.p.” jelentése olvadáspont, jelentése a feltüntetett oldószerben, adott koncentrációnál, 25 C-on mért optikia aktivitás, „FAB” jelentése gyors elektronbombázásos tömegspektrometria, és „AAA” jelentése aminosav-analízis (a mért értékek után zárójelben a várt értékek szerepelnek). Az aminosav-analízist a gyártó útmutatásai szerint Hewlett-Packard AminoQuant Analyzer-en végeztük. A primer aminosavakat o-ftálaldehiddel, a szekunder aminosavakat Fmoc-val származtattuk. A mennyiségi meghatározáshoz a leszármaztatott aminosavak fluoreszenciás detektálását alkalmaztuk. A védett aminosavakat az Applied Biosystem Inc.-tól (Foster City, CA) szereztük be.

I. példa

Az 1. vegyületet (7. számú szekvencia) automatizált Applied Biosystems Model 430A peptidszintetizátor alkalmazásával 4-metil-benzhidril-amin gyantán, szilárd fázisú eljárással 0,5 mmól nagyságrendben állítottuk elő. Az alfa-aminocsoportokat f-butoxikarbonilcsoporttal (Boc) védtük. Az oldalláncok védéséhez az Asp, Glu és Ser esetében benzilcsoportot (Bzl), az Arg esetében tozilcsoportot (Tos), a His esetében benzil-oxi-metilcsportot (Bőm), a Lys esetében pedig 2-klór-benzilcsoportot (Cl-z) alkalmaztunk. Az aminosavakat Stewart és Young (ld. fentebb) módszerével N.N-diciklohexil-karbodiimid/l-hidroxi-benzotriazol (DCC/HOBt) alkalmazásával egymás után kapcsoltuk össze. Miután valamennyi aminosavat összekapcsoltuk, a peptidet ecetsav-anhidrid és diizopropil-etil-amin elegyével N-metil-pirrolidonban acetileztük. Az elkészült peptidet az oldalláncok védőcsoportjainak egyidejű eltávolításával anizol (2,5 ml) jelenlétében vízmentes hidrogén-fluoriddal (25 ml) -10 ”C-on 30 percig, és 0 C-on 60 percig végzett kezeléssel hasítottuk le a gyantáról. A HF in vacuo elpárologtatása után a maradékot vízmentes éterrel mostuk, és nyers peptidet 10%-os ecetsavval

HU 211 348 A9 extraháltuk. A 10%-os ecetsavas extraktum liofilizálásával 900 mg nyers terméket kaptunk. A peptidet 0,1 %-os TFA-ban 22-45% CH₃CN gradiens alkalmazásával közegnyomásos ODS reverz fázisú oszlopkromatográfiával tiszítottuk. A tennék három frakcióban eluálódott, melyeket bekoncentráltunk és liofilizáltunk, miáltal 130 mg, 98%-osnál nagyobb tisztaságú fehér, szilárd anyagot kaptunk.

I. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH₂ (7. sz. szekvencia)

Alá Val	Ser	Glu His	Gin Leu Leu His	Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1		5		10					15
Gin Asp	Leu	Arg Arg	Arg Glu Leu Leu	Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
		20		25					30
Leu His	Thr	Alá NH₂	(7. számú szekvencia	) ;

Fizikai adatok::

o.p.: 150,0-159 ’C [a]g = -34,88’ (c = 0,16, H₂O) FAB (ΟπΛοοΝ^,): [M+H]⁺ = 4005,5 AAA: Asp, 1,9 (2); Glu, 5,6 (6); Ser, 1,6 (2); His, 2,7 (3); Gly, 1,0 (1);

Thr, 0,9 (1); Alá, 1,9 (2); Arg, 2,8 (3); Val, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu,

7,3 (8) ; Lys, 4,0 (4).

A 2., 5-18., 21., 24-27., 29-36., 38-48., 50-54., 58-64. és 66-70. vegyületeket hasonlóan állítottuk elő és jellemeztük, s a hidroxi-terminális polipeptidek szintéziséhez PAM gyantát alkalmaztunk.

2. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH (6. számú szekvencia):

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

Alá

OH

(6. :

számú

szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 154-150 ‘C [a]g = -49,35' (c = 0,46, H₂O) FAB (ε,,,Η,ο,Ν^Ο»): [M+H]⁺ = 4005,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 5,9 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 1,9 (2); Arg, 3,0 (3); Val, 1,2 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,8 {8); Lys, 4,2 (4) .

5. vegyület: AVSEHQLLHDKGKS1QDLRRRELLERLLERLHTA-OH (15. sz. szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu Arg

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

His

Thr

Alá

OH

(15.

számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 147-165 ’C [a]g = -49,17' (c = 0,66, H₂O) FAB (C,₇₅H₂₉₉N59O52): [M+H]+ = 4061 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 2,0 (2); Arg, 5,0 (5); Val, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu,

7,7 (8); Lys, 1,9 (2).

ó. vegyülei: AVSEHQLLHDRGRSIQLRRRELLERLLERLHTA-OH (16. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu His Asp Arg	Gly	Arg	Ser	Ile
1				5			10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu Arg	Leu	Leu	Glu	Arg
				20			25				30
Leu	His	Thr	Alá	OH	(16.	számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 150-170 ’C [<x]g = -48,65’ (c = 0,54, H₂O) FAB (C₁₇₃H₂₉₉N₆₃O₅₂): [M+H]⁺ = 4118,0

AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,2 (1);

Thr, 1,0 (1); Alá, 2,0 (2); Arg, 6,9 (7); Val, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu,

7,8 (8).

HU 211 348 A9

7. vegyület: AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH (17. sz. szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu Leu His Asp Arg	Gly	Arg	Ser	lle
1				5		10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu Leu Leu Glu Arg	Leu	Leu	Lys	Arg
				20		25				30
Leu	His	Thr	Ala	OH	(17.	számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 177-182 C [oc]g = -46,17 (c = 0,14, H₂O) FAB (C^H^N^Ojo): [M+H]+ = 4117 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 4,8 (5); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2): Arg, 6,7 (7); Val, 1,0 (1): lle, 1,0 (1); Leu,

7,7 ( 8 ) ; Lys, 0,9 (1 ) .

8. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH (5. sz. szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	lle
1				5	10					15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu	Lys	Leu	Leu	Arg	Lys
				20	25					30
Leu	His	Thr	Ala	OH	(5. számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 147-165 ”C [a]g = -49.17’ (c =0,66, H₂O) FAB (C₁₇₆H₃₀₅N₅₉O₄₉): [M+H]⁺ = 4033,0 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 4,8 (5); Ser, 1,8 (2); His, 2,7 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,9 (4); Val, 1,0 (1); lle, 1,0 (1); Leu, 7,9 ( 8) ; Lys, 4,0 (4 ) .

9. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OH (10. sz. szekvencia);

Ala

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys Ser

lle

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Len

Leu Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

Ala

Gly

Arg

OH

[10.

számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 158-160 C [ot]g = -44,76° (c = 0,1, H₂O) FAB (C,₈₉H_?26N₆₄O„): [M+H]⁺ = 4375,0 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 5,9 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 2,3 (2); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 5,0 (5); Val, 1,2 (1); lle, 1,0 (1); Leu,

7,8 (8 ) ; Lys, 4,3 < 4) .

10. vegyület: AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH (14. sz. szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	Ala	Gin	Leu Leu His Asp Leu	Gly	Lys	Ser	He
1				5		10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20		25				30
Leu	His	Ala	Leu	OH	(14.	számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 170-175 “C [Oí]g = -31,59 (c = 0,54, H₂O) FAB (C₁₇₄H₃₀₀N₅₂O₅,): [M+H]⁺ = 3936,0 AAA: Asp, 2,0 (2); Glu, 6,0 (6); Ser, 1,8 (2); His, 2,0 (2); Gly, 1,2 (1); Ala, 3,0 (3); Arg, 2,8 (3); Val, 1,1 (1); lle, 1,0 (1); Leu, 9,9 (10); Lys 3,0 (3) .

11. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH₂ (11. sz. szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	lle
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	Lys	Glu	Leu	nh₂	(11. számú szekvencia)

HU 211 348 A9

Fizikai adatok:

o.p.: 172-174 ’C [<x]g = -43,29’ (c = 0,2, H₂O) FAB (C„₉H₃₁,N₃jO₅₂): [M+H]⁺ = 4065,8 AAA: Asp, 2,2 (2); Glu, 7,7 (7); Ser, 1,7 (2); His, 2,0 (2); Gly, 1,0 (1); Alá, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,3 (9); Lys,

5,1 (5) .

12. vegyület: AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH₂ (X = Nle; 23. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	Ile	Gin Phe Nle His Asn Leu	Gly	Lys	His	Leu
1				5	10				15
Ser	Ser	Nle	Glu	Arg	Val Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Asn	Tyr	nh₂	(23. számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 178 ’C [<x]g = -36,38’ (c = 0,4, H₂O) FAB (C₁₈₂H ₂₉₃N₃₀O_3l): [M+Hf = 4001,6 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,5 (6); Ser, 2,7 (3); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Alá, 1,0 (1); Arg, 1,0 (1); Tyr, 0,8 (1); Val, 2,0 (2); Phe, 1,0 (1) Ile, 0,9 (1); Leu+Nle, 8,5 (7+2); Lys, 3,1 (3).

13. vegyület: AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH₂ (X = Nle; 24. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	Ile	Gin Phe	Nle His Asn Leu	Gly	Lys	His	Leu
1				5		10				15
Ser	Ser	Nle	Arg	Arg	Arg Glu	Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20		25				30
Leu	His	Asn	Tyr	nh₂	(24. számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 260 ’C [a]g = -37,02’ (c = 0,2, H₂O) FAB (C,μΗ^μΝ^Ο^): (M+H]⁺ = 4084 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 5,5 (5); Ser, 2,6 (3); His, 3,1 (3); Alá, 1,0 (1); Gly, 1,1 (1); Arg, 3,2 (3); Tyr, 1,0 (l);Val, 1,0 (1); Phe, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,0 (9) ; Lys, 3,0 (3).

14. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH₂ (20. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Alá Leu Alá Glu Alá	Leu	Alá	Glu	Alá
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(20. számú szekvencia);

Fizikai adatok:

o.p.: 190-225 ’C [ot]g = -56,58’ (c = 0,36 H₂O) FAB (C₁₆,H₂₇₂N₃₄O₄₉): [M+H]⁺ = 3747,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 4,9 (5); Ser, 1,7 (2); His, 2,6 (3); Gly, 1,1 (1);Thr, 1,0 (1); Alá, 7,6 (7); Arg, 2,8 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1) ; Leu, 6,6 (6) ; Lys,1,9(2).

15. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH₂ (12. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Alá	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(12. számú szekvencia);

Fizikai adatok:

o.p.: 170-180 ’C [a]g = -48,19“ (c = 0,2 H₂O) FAB (C₁₇₂H₂₉₃N₃₃O₅₎): [M+H]⁺ = 3919,0

AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1);

Thr, 1,0 (1); Alá, 3,0 (3); Arg, 2,1 (2); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu,

8,0 (8) ; Lys, 4,4 (4).

HU 211 348 A9

16. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH₂ (13. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Alá	Arg	Alá Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	NH₂	(13. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 190-195 ’C [a]g = -50,50’ (c = 0,4 H₂O) FAB (C_I72H₂₉₃N₅₃O_5I): [M+H]⁺ = 3919,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,0 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,0 {1) ; Thr, 1,0 (1); Alá, 3,0 (3); Arg, 2,1 (2); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1) Leu, 7,5 (8); Lys, 4,2 (4) .

77. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH₂ (21. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu	Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5		10				15
Gin	Asp	Leu	Alá	Arg	Arg Ser	Leu Leu Ser Ser	Leu	Leu	Ser	Ser
				20		25				30
Leu	His	Thr	Alá	NH₂	(21. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 195-204 ’C [a]g = -67,11’ (c = 0,3 H₂O) FAB (C|₆₃H₂₈₀N₅₄O₅₍₎): [M+H]⁺ = 3796,0 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 2,9 (3); Ser, 6,8 (7); His, 3,1 (3); Gly, 1,2 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 2,0 (2): Arg, 3,0 (3); Val, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu,

8,2 (8); Lys, 2,0 (2 ) .

18. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH₂ (22. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Alá Phe Tyr Asp Lys	Val	Alá	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(22. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 200-207 ’C [a]g = -60,26’ (c = 0,6 H₂O) FAB (C₁₇₄H_2g4N₅₆O₅₀): [M+H]⁺ = 3960,0 AAA: Asp, 2,9 (3); Glu, 3,5 (4); Ser, 1,4 (2); His, 2,6 (3); Gly, 0,9 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 4,0 (4); Arg, 3,0 (3); Tyr, 0,9 (1); Val, 1,9 (2); Phe,

1,1 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 3,6 (4); Lys, 4,1 (4).

27. vegyület: AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH, (35. sz. szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Phe

Leu

His

Asn Leu

Gly

Lys

His

Leu

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Asn

Tyr

nh₂

(35.

számú s

zekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 148-155 ’C [a]g = —45,97 (c = 0,26 H₂O) FAB (C₁₈₄H_3WN₅₆O₄₉): [M+H]⁺ = 4084 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 5,0 (5); Ser, 2,7 (3); His, 3,0 (3); Gly, 1,0 (1); Alá, 0,9 (1); Arg, 3,1 (3);Tyr, 0,9 (1); Val, 1,0 (1); Phe, 0,9 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 9,3 (9); Lys, 3,2 (3).

24. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH₂ (38. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly Lys	Ser	Ile
1				5	10			15
Gin	Asp	Leu	Lys	Leu	Lys Glu Leu Leu Glu Lys	Leu Leu	Glu	Lys
				20	25			30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(38. számú szekvencia).

HU 211 348 A9

Fizikai adatok:

o.p.: 175-182 ’C [a]§ = -49,99’ (c = 0,47 H₂O) FAB (C^H^N^Oj,): [M+H]⁺ = 3906,5 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,5 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 2,1 (2); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 9,1 (9); Lys, 6,5 (6) .

25. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH₂ (39. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Arg	Leu	Leu	Glu	Arg
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	NH₂	(39. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 136,5-153,5 ’C [a]g = -32,57 (c = 0,13 H₂O) FAB (CpsHjooN^Os,): [M+H]⁺ = 4060,8 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 2,1 (2); Arg, 5,2 (5); Val, 1,1 (1); Ile, 1,1 (1); Leu,

8,4 (8); Lys, 2,2 (2).

26. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-NH₂ (40. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu Leu	His Asp Lys Gly	Lys	Ser	Ile
1				5			10			15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu Leu	Leu Glu Arg Leu	Leu	Glu	Arg
				20			25			30
Leu	His	Thr	Alá	Pro	nh₂	(40. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 125.8-127,2 C [a]§ = -54,62’ (c = 0,23 H₂O) FAB (ει^^Ν^Ο;,): [M+H]⁺ = 4158,0 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 1,8 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 8,0 (8); Alá, 2,0 (2); Arg, 5,1 (5); Val, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 2,1 (2) Pro, 1,1 (1).

27. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH (41. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu	His	Asp Lys Gly Lys Ser	Ile
1				5					10	15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu	Leu	Glu Arg Leu Leu Glu	Arg
				20					25	30
Leu	His	Thr	Alá	Gly	Arg	Arg	OH	(41.	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 106-137,3 ’C [a]g = -39,55’ (c = 0,67 H₂O) FAB (C₁₈₉H₃₂₆N₅₈O_J5): [M+H]⁺ = 4430,5 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,6 (2); His, 2,7 (3); Gly, 2,2 (2); Thr, 1,0 (1); Alá, 1,8 (2); Arg, 7,3 (7); Val, 0,8 (1); Ile, 1,0 (1); Leu,

8,1 (8); Lys, 2,1 (2).

29. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH₂ (43. számú szekvencia);

Alá Val	Ser Glu	His	Gin	Leu	Leu His Asp Lys	Gly Lys	Ser	Ile
1				5			10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20			25				30
Leu	His	Thr	Tyr	nh₂	(43.	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 160-172 ’C [<x)g = -49,85’ (c = 0,34 H₂O) FAB (ΰ_Ι8]Η_3ΜΝ₅₆Ο₅₂): [M+H]⁺ = 4096,9

AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1);

Thr, 0,9 (1); Alá, 0,9 (1); Arg, 3,0 (3); Tyr, 0,9 (1): Val, 1,0 (1); Ile,

1,0 (1); Leu, 7,7 (8); Lys, 4,4 (4).

HU 211 348 A9

30. vegyület AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂ (44. számú szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly Tyr	Ser	lle
1				5	10			15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu Leu	Glu	Lys
				20	25			30
Leu	His	Thr	Ala	nh₂	(44. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 130-171 ’C [a]g = -40,65’ (c = 0,34 H₂O) FAB (CneH^NjsC^): [M+H]⁺ = 4039,4 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,5 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,4 (3); Gly, 1,1 (1);

Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 2,9 (3); Tyr, 0,8 (1); Val, 1,0 (1); Xle,

0,9 (1),- Leu, 7,9 (8); Lys, 3,4 (3).

31. vegyület: AVSEHQLLHD KGCSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂ (45. számú szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Cys	Ser	He
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu 1-5u Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Ala	NH₂	(45. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 140-160 ’C lotjg = -44.48’ (c = 0.25 H₂O)FAB (C^H^N^O^S,): [M+H]⁺ = 3979 AAA: Asx+Cys, 3,0 (2+1); Glx, 5,5 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,0 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 2,5 (3); Val, 1,0 (1); He, 0,9 (1) Leu, 7,5 (8 > ; Lys, 3,3 (3).

32. vegyület: AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH-, (46. számú szekvencia);

X = Cys[CH₂CONH(CH₂)₂NH(biotinil)]

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Xaa	Ser	He
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Ala	nh₂	(46. számú szekvencia);

(Xaa = [CH₂CONH(CH₂)₂NH(biotinil)]Cys)

Fizikai adatok:

o.p.: (nem meghatározott) ’C [a]§ = nem meghatározott) FAB (Ci₈₆H_?16N₅₉O5₄S2): [M+H]⁺ = 4306,6 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,8 (3); Gly, 1,0 (1);

Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,1 (3); Val, 1,1 (1); lle, 0,9 (1); Leu,

8,3 (8); Lys, 3,3 (3) 33. vegyület: AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂ (47. számú szekvencia); X = [7-(di metil-amino)-2-oxo-2H- l-benzo-pirán-4-acetil]-Lys

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Xaa Ser lle

10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30

Leu His Thr Ala NH₂ (47. számú szekvencia). (Xaa = X = [7-(dimetil-amino)-2-cxo-2H-l-benzo-pirán-4-acetil]-Lys)

Fizikai adatok:

o.p.: 135-205 ’C [a]g = -26,92’ (c = 0,104, 50% aq. HOAc) FAB (C₁₈₈H_3I]N₅₇O5₄): [M+H]⁺ = 4233 AAA: Asx, 1,9 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,1 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,2 !3); Val, 1,1 (1); lle, 0,9 (1); Leu,

8,2 [8); Lys, 4,5 (4).

34. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH (48. számú szekvencia);

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser lle 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

25 30

HU 211 348 A9

Leu His Thr Ala Gly (48. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 92,1-146,6 ’C [o.]g = -10,76’ (c = 0,34 H₂O) FAB (C₁₇₇H₃₀₂N₅₆O₅₃): [M+H]⁺ = 4062,0 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,7 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,0 (3); Gly, 2,2 (2); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 2,8 (3); Val, 1,2 (1); Ile, 0,9 (1); Leu,

7,5 (8); Lys, 4,2 (4).

35. vegyület: AVSX,HQLLHX₂ KGKSIQX₂LRR RX^LX.KLLXiK LHA-OH (49. számú szekvencia); X,

Glu (OCH₃); X₂ = Asp(OCH₃)

Ala	Val	Ser	Xaa₂	His	Gin Leu Leu His Xaa₂ Lys	Gly	Lys Ser Ile
1				5	10		15
Gin	Xaa₂	Leu	Arg	Arg	Arg Xaa, Leu Leu Xaa₂ Lys	Leu	Leu Xaa₂ Lys
				20	25		30
Leu	His	Ala	OH (	49.	számú szekvencia) Xaa₂ = Glu	(OCH₃) ;

Xaa₂ = Asp(OCH₃).

Fizikai adatok:

o.p.: (nem meghatározott) ’C [a]g = -21,96 (c = 0,132 H₂O) FAB (C₁₈₈H_3]1N55Oj₂): [M+H]⁺ = 4089,0 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 1,8* (2); His, 3,3 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 2,0 (2); Arg, 3,1 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 0,9 (1); Leu,

8,0 (8) ; Lys, 4,2 (4).

36. vegyület: AVSX,HQLLHX₂ KGKSIQX₂LRR RXjLLXjKLLXíK LHA-OCH₃ (50. számú szekvencia); X,

Glu (OCH₃); X₂ = Asp(OCH₃)

Ala	Val	Ser	Xaa_x	His	Gin	Leu Leu His Xaa₂ Lys	Gly	Lys Ser Ile
1				5		10		15
Gin	Xaa₂	Leu	Arg	Arg	Arg	Xaa₂ Leu Leu Xaa₂ Lys	Leu	Leu Xaa₂ Lys
				20		25		30
Leu	His	Ala	OHC₃	(50.	. számú szekvencia) Xaa₂ =	Glu	(OCH₃) ;

Xaa₂ = Asp(OCH₃).

Fizikai adatok:

o.p.: (nem meghatározott) ’C [a]o = -46,80’ (c = 0,07 H₂O) FAB (C|₈₂H₃]₃N₅₅O₅₂): [M+H]⁺ = 4103 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 1,4 (2); His, 3,0 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,1 (1); Ala, 1,7 (2); Arg, 3,2 (3); Val, 0,6 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 4,1 (4).

38. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH (52. számú szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5			10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20			25				30
Leu	His	Thr	Ala	Pro	OH	(52.	számú szekvencia).
				35

Fizikai adatok:

o.p.: 152,1-186,5 ’C [a]g = -55,91’ (c = 0,33 H₂O) FAB (C_l80H₃₀₆N₅₆O₅₃): [M+H]⁺ = 4102,6 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,9 (2); Arg, 2,9 (3); Val, 1,2 (1); Ile, 1,0 (1); Leu,

7,7 (8); Lys, 4,3 (4).

39. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH (53. számú szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5		10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20		25				30
Leu	His	Thr	Pro	OH	(53.	számú szekvencia).

HU 211 348 A9

Fizikai adatok:

o.p.: 120-148,2 ’C [Ct]g = -52,78’ (c = 0,47 H₂O) FAB (C|₇₇H₄₀,N₅5O₅₂): [M+H]⁺ = 4031,0 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,8 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 7,5 (8); Alá, 0,9 (1); Arg, 2,9 (3); Val, 1,2 (1); Ile, 0,9 (1); Leu,

7,5 (8); Lys, 3,6 (4); Pro, 0,9 (1).

40. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-NH₂ (54. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Pro	nh₂	(54. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 133,9-155,1 ’C [a]^ = -54,22' (c = 0,37 H₂O) FAB (Cp^jo^Oj,): [M+H]⁺ = 4030,7 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 1,9 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Alá, 0,9 (1); Arg, 2,8 (3); Val, 1,2 (1); Ile, 1,1 (1); Leu,

7,8 (8); Lys, 4,2 (4); Pro 0,9 (1).

41. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH, (55. számú szekvencia);

Alá Val

Ser Glu

His

Gin

Leu Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu Leu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Pro

nh₂

(55 .

számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 142,8-166,1 ’C [a]^ = -53,80’ (c = 0,38 H₂O) FAB (Ε,,,Η^^Οψ,): [M+H]⁺ = 3929 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,7 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,0 (3); Gly, 1,1 (1); Alá, 0,9 (1); Arg, 2,8 (3); Val, 1,2 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,4 (8); Lys,

4,4 (4); Pro, 0,9 (1).

42. vegyidet: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH₂ (56. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu His Gin Leu Leu His	Asp	Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1			5	10					15
Gin	Asp	Leu	Arg Arg Arg Glu Leu Leu	Glu	Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
			20	25					30
Leu	Pro	nh₂	(56. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 161,0-177,0 ’C [a]g = -61,97’ (c = 0,19 H₂O) FAB (C₁₆₇H₂₈₈N₅₂O₄₈): [M+H]⁺ = 3792,0 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,9 (2); His, 2,1 (2); Gly, 1,1 (1); Alá, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 7,9 (8); Lys,

4,3 (4); Pro, 0,9 {1) .

43. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH (57. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu	His	Asp Lys Gly Lys Ser	Ile
1				5					10	15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu	Leu	Glu Lys Leu Leu Glu	Lys
				20					25	30
Leu	His	Thr	Arg	Ser	Alá	Trp	OH	(57.	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 181-202 ’C [a]§ = -45,14 (c = 0,19 H,O) FAB (Ο,,,Η,^Ν^Ο^): [M+H]⁺= 4435,2 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,8 (6); Ser, 2,8 (3); His, 2,8 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Alá, 1,9 (2); Arg, 3,7 (4); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,5 (8); Lys,

4,3 (4) : Trp, 0,9 (1) .

HU 211 348 A9

44. vegyület: AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH (58. számú szekvencia)

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu
1				5
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg 20	Arg	Glu
Leu	His 35	Thr 40	Arg	Gly	Arg	Arg

Leu	His	Asp 10	Arg	Gly	Arg
Leu	Leu	Glu 25	Arg	Leu	Leu
Thr	Arg	Ser	Alá	Trp	OH

Ser Ile 15

Glu Arg 30 (58. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 130-132,2 ’C [a]g = -46,66 (c = 0,195 H₂O) FAB (C₂₁₆H₃₆₅N₈₁O₆₂): [M+H]* = 5088,8 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 6,0 (6); Ser, 2,7 (3); His, 3,0 (3); Gly, 2,2 (2);

Thr, 2,1 (1); Alá, 3,0 (3); Arg, 10,5 (10); Val, 0,9 (1); Ile, 1,0 (1); Leu,

8.2 (8) ; Trp, 1,0(1).

45. vegyület: AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH₂ (59. számú szekvencia);

Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser Ile

10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg

25 30

Leu His Thr Arg Gly Arg Arg Thr Arg Ser Alá Trp NH₂ (59. számú szekvencia).

40

Fizikai adatok:

o.p.: 158-174 C [<x]g = -43,57 (c = 0,53 H₂O) FAB (C₂₁₆H₃₆₈N₈₂O₆₁): [M+H]⁺ = 5087,4

AAA: Asx, 1,9 (2); Glx, 5,6 (6); Ser, 2,6 (3); His, 3,3 (3); Gly, 2,1 (2);

Thr, 2,0 (2); Alá, 2,9 (3); Arg, 10,1 (10); Val, 0,9 (1); Ile, 1,0 (1); Leu,

8.3 (8); Trp, 1,1 (1).

46. vegyület: AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTSAW-OH (60. számú szekvencia);

X = (dihidro-cinnamoil)Lys

Alá Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu His	Asp Arg	Gly Xaa	Ser	Ile
1			5				10			15
Gin Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu	Glu Arg	Leu Leu	Glu	Arg
			20				25			30
Leu His	Thr	Arg	Gly	Arg	Arg	Thr Arg	Ser Alá	Trp OH	(60.	számú
			35				40
[Xaa =	(dihidro-cinnamoil)Lys]

Fizikai adatok:

o.p : 165,4-175,2 ’C í«]g = -40,43* (c = 0,20 H₂O) FAB (C₂₂₅H₃₇₄N₈₀O₆₂): [M+H]⁺ = 5191 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 2,8 (3); His, 3,2 (3); Gly, 2,1 (2); Thr, 2,0 (2); Alá, 3,2 (3); Arg, 9,9 (9); Val, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu,

8,6 (8); Lys 1,1 (1); Trp, 1,1 (1).

47. vegyület: AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH₂ (61. számú szekvencia); (X = norleucin)

Alá	Val	Ser Glu	Ile	Gin	Phe Nle His Asn Leu	Gly Lys	His	Leu
1			5		10			15
Ser	Ser	Nle Thr	Arg	Ser	Alá Trp Leu Arg Lys	Lys Leu	Gin	Asp
			20		25			30
Val	His	Asn Tyr	nh₂	(61.	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 140-160 ’C [ot]g = -56,88’ (c = 0,16 H₂O) FAB (C|₈oH₂₈₇N₅₅05₈): [M+H]* = 3989,8 AAA: Asx, 3,0 (3); Glx, 2,9 (3); Ser, 3,7 (4); His, 2,8 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 0,9 (1); Alá, 1,9 (2); Arg, 2,0 (2); Tyr, 1,0 (1); Val, 1,7 (2); Phe 0,9 (1); Ile, 0,9 (1); Leu+Nle, 5,8 (2+4); Lys, 3,4 (3); Trp, 1,1 (1).

HU 211 348 A9

48. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTMA-NH₂ (62. számú szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu Leu	His Asp Lys Gly	Lys	Ser	Ile
1				5			10			15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu Leu	Leu Glu Lys Leu	Leu	Glu	Lys
				20			25			30
Leu	His	Thr	Met	Alá	nh₂	(62. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 140-210 C [tx]g = -47,75 (c = 0,178 H₂O) FAB (C₁₈₀H₃₀₉N₅₇O₅₂S\|): [M+H]⁺ = 4135,0
AAA:	Asx,	2,3 (2 ) ,- Glx,	5,6	(6); Ser, 1,4 (2);	His, 3,2 (3); Gly,	1,1
Thr,	1,0	(1); Alá, 2,0 (	2) ;	Arg, 3,1 (3); Val,	0,9 (1); Met, 1,1	(1) ;
1,0 (	1) ;	Leu, 8,8 (8) ; Lys,	4,4 (4) .

50. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NHj (64. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Phe Phe Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	NH₂	(64. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 136,5-156,8 ’C [ot]g = -49,89’ (c = 0,24 H₂O) FAB (C_l23H₃₀₀N₅₆O₄₉): [M+H]* = 4056,0 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 5,0 (5); Ser, 1,9 (2); His, 3,3 (3); Gly, 1,0 (1) Thr, 1,0 (1); Alá, 2,1 (2); Arg, 3,1 (3); Val, 1,0 (1); Phe, 2,0 (2); Ile C,9 (1); Leu, 7,2 (7); Lys, 3,5 (4),

51. vegyidet: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA-NH₂ (65. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu	Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5		10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu	Leu Leu His Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20		25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(65. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 80,7-141.0 ’C [a]g = -55,38’ (c = 0,23 H₂O)FAB (C,₇₆H_3fl0NjgO₄₉): [M+H]⁺ = 4012,8 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 4,9 (5); Ser, 1,8 (2); His, 4,3 (4); Gly, 1,1 (1) Thr, 1,0 (1); Alá, 2,0 (2); Arg, 3,1 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu

8,1 ( 8) ; Lys, 3,9 (4).

52. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA-NH₂ (66 sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu His	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(66. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 134,3-157,9 ’C [ot]g = -50,72’ (c = 0,45 H₂O) FAB (C,₇₅H_29JN₅₇Oj,): [M+H]⁺ = 4012,8 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,8 (2); His, 4,2 (4); Gly, 1,1 (1) Thr, 1,0 (1); Alá, 2,0 (2); Arg, 3,0 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 0,9 (1); Leu

8,1 (8) ; Lys, 3,1 (3) .

53. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH₂ (67. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Ile	Alá	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(67. számú szekvencia).

HU 211 348 A9

Fizikai adatok:

o.p.: 142,7-159,8 C [a]g = -54,01’ (c = 0,21 H₂O) FAB (C₁₇₃H₂₉₈N₅₆O₄₉): [M+H]⁺ = 3946,0 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 4,9 (5); Ser, 1,8 (2); His, 3,1 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 3,1 (3); Arg, 3,1 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 1,9 (2); Leu, 7,0 (7) ; Lys, 4,3 (4).

54. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE IHTA-NH₂ (68. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Glu
				20	25				30
Ile	His	Thr	Alá	nh₂	(68. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 138-185 ’C [ot]g = -50,17’ (c = 0,14 H₂O) FAB (C^HmjNjjOjj): [M+H]⁺ = 4005 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 7,1 (7); Ser, 1,7 (2); His, 2,8 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 2,1 (2); Arg, 3,1 P'; Val, 1,1 (1); Ile, 1,7 (2); Leu,

7,1 (7); Lys, 2,7 (3).

58. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH₂ (72. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu	His Asp	Lys Gly Lys Ser	Ile
1				5				10		15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu	Leu Glu	Lys Leu Leu Glu	Lys
				20				25		30
Leu	His	Thr	Arg	Ser	Alá	Trp	NH₂	(72. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 158-163 ’C («]§ = -46,06’ (c = 0,17 H₂O) FAB (Ο_Ι95Η₃₂₇Ν₆₃Ο_η): [M+H]⁺ = 4434,8

AAA: Asx,

2,0

(2); Glx,

5,5

(6); Ser,

2,7

(3) ;

His,

3,1

(3) ;

Gly,

1,0

(1) ;

Alá, 1,8

(2) ;

Arg, 4,0

(4) ;

Thr, 0,9

< 1) ;

Val,

0,9

(1) ;

Ile,

0,9

(1) ;

Leu,

7,5 ( 8);

Lys,

3,9 (4);

Trp,

1,0 (1) .

59. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX-OH (73. sz. szekvencia); [X = Nal(2) = 3-(2-naftil)-L-alanin]

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu Leu His	Asp	Lys Gly	Lys Ser Ile
1				5			10		15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu Leu Leu	Glu	Lys Leu	Leu Glu Lys
				20			25		30
Leu	His	Thr	Arg	Ser	Alá	3-(2-naftil)	-L-	alanin-OH	t (73. számú

szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.; 156-162 ’C [a]g = -44,44’ (c = 0,189 H₂O) FAB (C|₉₇H_32gN₆₂O₅5): [M+H]⁺ = 4445,6 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 5,5 (5); Ser, 2,8 (3); His, 2,9 (3); Gly, 1,0 (1); Alá, 2,0 (2); Arg, 4,0 (4); Thr 0,9 (1); Val, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1); Leu,

7,5 (8); Lys, 4,2 (4); Nal, 1,1 (1).

60. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH (74. sz. szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

Alá

Ser

Alá

Trp

OH

(74.

számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 159-164 ’C [a]§ = -50,94’ (c = 0,29 H₂O) FAB (¢,9^3^^,055): [M+H]⁺ = 4349,0

AAA: Asx, 2,0	(2); Glx, 5,6	(6) ;	Ser, 2,7 (3); His, 3,2 (3); Gly,	1,0	(1)
Alá, 3,1	(3) ;	Arg, 2,8	(3) ;	Thr	1,0 (1); Val, 1,1 (1); Ile, 0,90	(1) ;	Leu
7,6 (8) ;	Lys,	4,0 (4);	Trp,	1,0	(1) ·

HU 211 348 A9

61. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH (75. sz. szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly Lys

Ser Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu Leu

Glu Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

Alá

Glu

Ile

Arg

Alá

OH

(75.

számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 155-210 ’C [a]g = ^6,15' (c = 0,12 H₂O) FAB (C_I95H₃₃₄N₆₂O₅₈): [M+H]⁺ = 4475,8 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 5,9 (7); Ser, 1,7 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,1 (1) Alá, 3,1 (3); Arg, 4,0 (4); Thr, 0,9 (1); Val, 1,1 (1); Ile, 1,9 (2); Leu

8,1 (8) ; Lys, 4,1 (4) .

62. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH (76. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu	His	Asp Lys Gly Lys Ser	Ile
1				5					10	15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu	Leu	Glu Lys Leu Leu Glu	Lys
				20					25	30
Leu	His	Thr	Alá	Glu	Ile	Arg	OH	(76.	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 186-218 ’C [a]§ = -52,73° (c = 0,265 H₂O) FAB (C,₉₂H₃₂₉N₆₎O₅₇): [M+H]⁺ = 4404,4 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 6,5 (7); Ser, 1,9 (2); His, 3,4 (3); Gly, 1,1 (1) Alá, 2,0 (2); Arg, 3,8 (4); Thr, 1,0 (1); Val, 1,1 (1); Ile, 1,7 (2); Leu

7,9 (8); Lys, 4,0 (4) .

63. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH (77. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu	His Asp Lys Gly Lys	Ser	Ile
1				5				10		15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu	Leu Glu Lys Leu Leu	Glu	Lys
				20				25		30
Leu	His	Thr	Alá	Glu	Ile	OH	(77 .	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 169-205 ’C [a]g = -50,78’ (c = 0,51 H₂O) FAB (C|₈₆H„₇N₅₇O,₆): [M+H]⁺ = 4248,0

AAA :

Asx,

2,2

(2) ;

Glx,

6,8

(7) ;

Ser, 1,8

(2) ;

His, 3,3

(3) ;

Gly,

1,0

(1)

Alá,

2,0

(2) ;

Arg,

3,0

(3) ;

Thr,

1,0 (1) ;

Val,

1,0 (1);

Ile,

1,8

(2) ;

Leu

7,8 (8);

Lys,

3 , 6

(4) .

64. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH (78. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu His Asp Lys Gly	Lys	Ser	Ile
1				5			10			15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu Lys Leu	Leu	Glu	Lys
				20			25			30
Leu	His	Thr	Alá	Glu	OH	(78.	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 199-205 ’C [a]§ = -52,47 (c = 0,41 H₂O) FAB (C₁₈oH₃₀₆N,₆Oj₅): [M+Hf = 4135,0 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 6,6 (7); Ser, 1,9 (2); His, 3,3 (3); Gly, 1,1 (1) Alá, 2,0 (2); Arg, 2,9 (3); Thr, 1,0 (1); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu

8,2 (8); Lys, 3,8 (4).

66. vegyület: SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH, (80. sz szekvencia);

Ser	Glu	His	Gin	Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile	Gin	Asp
1				5	10					15
Leu	Arg	Arg	Arg	Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys	Leu	His
				20	25					30
Thr	Alá	NH-	(80 .	számú szekvencia).

HU 211 348 A9

Fizikai adatok:

o.p.: 134,2 ’C [oc]g = -48,12’ (c = 0,36 H₂O) FAB (CiA^O#): [M+H]⁺ = 3834,4 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,7 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 1,0 (1); Thr, 0,9 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 2,8 (3); Ile, 1,0 (1) Leu, 8,2 (8); Lys, 3,8 (4) .

67. vegyület: LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂ (81. sz. szekvencia);

Leu	Leu	His Asp Lys	Gly Lys	Ser	Ile	Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg
1		5				10					15
Glu	Leu	Leu Glu Lys	Leu Leu	Glu	Lys	Leu	His	Thr	Ala	nh₂
		20				25					30
(81.	. sz.	. szekvencia!	1 .

Fizikai adatok:

o.p.: 128,5-184,5 ’C [a]g = -6,53’ (c = 0,69 MeOH) FAB (C₁₄₈H₂₅₉N₄₇O₄,): [M+H]⁺ = 3353 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 4,1 (4); Ser, 0,9 (1); His, 2,1 (2); Gly, 1,0 (1); Thr 0,9 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Ile, 1,0 (1); Leu, 8.1 (8); Lys,

4,2 (4).

68. vegyület: LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂ (82. sz. szekvencia);

Leu His Asp Lys Gly	Lys	Ser	Ile	Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu
1 5					10				15
Leu Leu Glu Lys Leu	Leu	Glu	Lys	Leu	His	Thr	Ala	NH₂
20					25				30
(82. sz. szekvencia)	1 .

Fizikai adatok:

o.p.: 165-210 ’C [a]g = -36,05’ (c = 0,12 H₂O) FAB (C^H^N^O^): [M+H]⁺ = 3239,0 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 3,9 (4); Ser, 0,9 (1); His, 1,9 (2); Gly, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 2,9 (3); Ile, 0,9 (1); Leu, 6,8 (7); Lys,

4,2 (4) .

69. vegyület: SEHQLLHD RGRS1QDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH (83. sz. szekvencia);

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Ser

Ile

Gin

Asp

1

5

10

15

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Arg

Leu

Glu

Arg

Leu

His

20

25

30

Leu

His

Arg

Gly

Arg

Thr

Arg

Ser

Ala

Trp

OH

(83.

számú szekvencia)

Fizikai adatok:

o.p.: 150-210 ’C [a]g = -18,0 (c = 0,64 H₂O) FAB (^,Η,,,Ν,,Ο,»): [M+H]⁺ = 4918,6 AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 6,2 (6); Ser, 2,8 (3); His, 3,1 (3); Gly, 2,2 (2); Thr, 2,2 (2) Ala, 2,2 (2); Arg, 10,4 (10); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,0 (8); Trp,

1,1 (1).

70. vegyület: LLHD RGRS1QDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH (84. sz. szekvencia);

Leu	Leu	His	Asp	Arg	Gly	Arg	Ser Ile	Gin Asp Leu Arg Arg	Arg
1				5				10	15
Glu	Leu	Leu	Glu	Arg	Leu	Leu	Glu Arg	Leu His Leu His Arg	Gly
				20				25	30
Arg	Arg	Thr	Arg	Ser	Ala	Trp	OH (84.	számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 150-210 C [a]g = -41,70’ (c = 0,36 H₂O) FAB (C_I89H₃₂₄N₇₂O₅₂): [M+H]⁺ = 4437,14 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 4,1 (4); Ser, 1,9 (2); His, 2,0 (2); Gly, 2,1 (2) ; Thr, 2,0 (2); Ala, 2,1 (2); Arg, 9,7 (10); Ile, 0,9 (1); Leu, 7,4 (8).

HU 211 348 A9

Az oldalláncaival ciklizált analógot (57. vegyület) szintén a fentiek szerint szintetizáltuk, azzal a különbséggel, hogy a 13. és 17. helyre N“-Boc-N⁸Fmoc-Lys-t és N“-Boc-N⁸-Fmoc-Asp-t helyeztünk. A Boc aminosav szintézisének elvégzése után a gyantát szobahőmérsékleten 30 percig DMF-ben 20%-os piperidinnel kezeltük. A gyantát leszűrtük, DMF-fel, metanollal és diklór-metánnal (CH₂CI₂) mostuk. A gyantát (1,1 g) 250 mg PyBOP-t tartalmazó 10 ml

DMF-ben szuszpendáltuk. A pH-t DIEA-val 8-9 értékre állítottuk be, és a gyantát egy órán keresztül kevertük, majd leszűrtük, DMF-fel és diklór-metánnal mostuk, s DMF-ben reszuszpendáltuk. Az össze5 kapcsolást 125 mg ByBOP alkalmazásával megismételtük. A gyantát szűrtük, DMF-fel, metanollal és diklór-metánnal mostuk, majd szárítottuk. A gyantát végül hidrogén-fluoriddal kezeltük, s a peptidet a fentebb leírtak szerint tisztítottuk.

57. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂ (71. sz. szekvencia)

Alá	Val	Ser	Glu	His	Gin Leu Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg Glu Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	Alá	nh₂	(71. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 142,5-163,5 C [a]g =-34,31' (c = 0,17 H₂O) FAB (C₁75H₂₉₈N₅₆O₅₀): [M+H]⁺ = 3986,4 AAA: Asx, 1,9 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,2 (3); Gly, 1,1 (1); Alá, 2,0 (2); Arg, 3,0 (3); Thr 1,0 (1); Val, 1,1 (1); Ile, 0,9 (1) Leu, 8,0 (8); Lys, 4,0 (4).

2. példa

Az 1. vegyületet [Met³⁴, Alá³⁵] (AVSEHQLLH- 25 DKGKS1QDLRRRELLEKLLEKLHTMA-NH₂ (25. számú szekvencia) az 1. példa szerinti eljárással szintetizáltuk és tisztítottuk. Ezt a polipeptidet az alábbi eljárással homoszerin-laktonná alakítottuk. A tisztított peptidet (160 mg) 44%-os hangyasavban (4 ml) feloldottuk, majd ezt az 30 oldatot 0 °C-on 44%-os hangyasavban (4 ml) készített cián-bromid (700 mg) és fenol (1,6 mg) oldatával elegyítettük. A kapott oldatot 0 C-on két óráig, és szobahőmérsékleten szintén két óráig kevertük. A tennék kialakulását HPLC-vel ellenőriztük (Vydac* C-18, 300 Á, 4,6x250 mm, 1,2 ml/perc átfolyási sebesség, 0,1% TFA-ban 2545%-os acetonitril gradiens, 10 perces időtartam). A reakció négy órán belül lejátszódott. A minta felét bekoncentráltuk és preparatív RP-HPLC-n tisztítottuk (Vydax^R ΟΙ 8.0,1% TFA-ban 25-45%-os acetonitril gradiens). Ahomoszerin-lakton peptidffakciókat összegyűjtöttük és liofilizáltuk, miáltal 28 mg, 95%-osnál nagyobb tisztaságú fehér, szilárd terméket (4. vegyület) kaptunk.

4. vegyület: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLLHTX (X = hSerlac 9. számú szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

Leu His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

hSerlac

(9.

számú szekvencia

)

Fizikai adatok:

o.p.: 138-142 'C [a]g = -50,66 (c = 0,1 H₂O) FAB (C,₇₆H₂₉₉N₅₅O_S2): [M+H]⁺ = 4017,61 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,8 (2); His, 3,0 (3); Thr, 1,1 (1); Alá, 1,1 (1); Arg, 2,7 (3); Val, 1,0 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,2 (8); Lys,

3,8 (4); Gly, 1,09 (1); hSer, 1,09 (1).

A 65. vegyületet szintén a fenti eljárással állítottuk elő.

65. vegyület: AVSEIQFX,HN KGKHLSSX,ER VEWLRKKLQD VHNXj (79. számú szekvencia) (X, = Enorleucin; X₂ = homoszerin-lakton)

Alá	Val	Ser	Glu Ile	Gin Phe Nle His Asn Lys	Gly	Lys	His	Leu
1			5	10				15
Ser	Ser	Nle	Glu Arg	Val Glu Trp Leu Arg Lys	Lys	Leu	Gin	Asp
			20	25				30
Val	Hí s	Asn	hSerlac	(79. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 166-176 °C [a]g = -52,22 (c = 0,25 H₂O) FAB (C₁₈₀H₂₈₈N5405o): [M+H]⁺ = 4008,6 AAA: Asx, 3,1 (3); Glx, 4,8 (5); Ser, 2,9 (3); His, 2,9 (3); Gly, 1,1 (1); Alá, 1,1 (1); Arg, 2,0 (2); Val, 2,7 (3); Ile, 1,0 (1); Leu+Nle, 5,9 (4+2); Lys, 2,8 (3) ; Phe, 1,0 (1) .

HU 211 348 A9

3. példa

Homoszerin-amid előállításához a nyers homoszerinlakton analógot (4. vegyület) bekoncentráltuk, és metanolban 25 ml telített ammóniával kezeltük. Az oldatot 0 C-on két óráig, és szobahőmérséklten 16 óráig kever- 5 tűk. A reakciót HPLC-vel ellenőriztük (Vydac^R C-l 8,

300 Á, 4,6x250 mm, 1,2 ml/perc átfolyási sebesség,

0,1% TFA-ban 25-45%-os acetonitril gradiens), és 18 órán belül befejeztük. Az oldatot bekoncentráltuk és preparatív RP-HPLC-vel (Vydac^R C-l 8, 0,1% TFA-ban 25-45%-os acetonitril gradiens) tisztítottuk. A homoszerin-amid peptid frakciókat összegyűjtöttük és liofilizáltuk, miáltal 30 mg, 98%-osnál nagyobb tisztaságú fehér, szilárd terméket (3. vegyület) kaptunk.

3. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH₂ (X = hSer; 8. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	His Gin Leu	Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	Ile
1				5	10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg Arg Glu	Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20	25				30
Leu	His	Thr	hSer NH₂ (8. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 138-142 C [a]g = -45,97 (c = 0,25 H₂O) FAB (Ci₇₆H₃₀₂N_J6O₃₂): [M+H]⁺ = 4033,9 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 6,1 (6); Ser, 1,6 (2); His, 2,8 (3); Gly, 0,97 (1); hSer, 0,97 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 1,0 (1); Arg, 2,9 (3); Val, 1,0 (1 > ;

Ile, 1,0 (1); Leu, 7,6 (8); Lys, 3,9 (4).

A 22., 23. és 28. vegyületet hasonló módon, szintén a fenti eljárás szerint állítottuk elő.

22. vegyület: AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH₂ (X = homoszerin; 36. sz. szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Phe

Leu His Asn Leu Gly Lys

His

Leu

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Glu

Leu

Leu Glu Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Asn

hSer

NH₂

(36

. számú

szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 69,4-128 C [a]g = -43,93' (c = 0,15 H₂O) FAB (C,₇₉H₃₀₂N₃₆O₄₉): [M+H]⁺ = 4022,9 AAA: Asx, 2,0 (3); Glx, 4,9 (5); Ser, 2,6 (3); His, 2,8 (3); Gly, 1,0 (1):

Alá, 1,0; (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,0 (1); Phe, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1) Leu,

8,8 (9); Lys, 3,4 (3) .

23. vegyület: AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH₂ (X = homoszerin; 37. sz. szekvencia);

Alá	Val	Ser	Glu	Ile Gin	Phe Leu	His Asn Lys	Gly	Lys	His	Leu
1				5		10				15
Ser	Ser	Leu	Arg	Arg Arg	Glu Leu	Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20		25				30
Leu	His	Asn	hSer	NH₂ (37	. s zámú	szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 87,1-142,1 C [a]g = -52,14’ (c = 0,41 H₂O) FAB (C₁₇₉H₃₀₃N₃₇O₄₉): [M+H]⁺ = 4038 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 4,9 (5); Ser, 2,7 (3); His, 2,8 (3); Gly, 1,0 (1); hSer, 1,0 (1); Alá, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,1 (1); Phe, 0,9 (1); Ile, 0,9 {11; Leu, 7,9 (8); Lys, 3,7 (4).

28. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH₂ (X = homoszerin; 42. sz. szekvencia);

Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30

Leu His Thr Alá Gly Arg Arg hSer NH₂ (42. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 80 C [Ot]g = -48,64 (c = 0,09 H₂O) FAB (C₁₉₃H₃₃₄N₇₀O₅₆): [M+H]⁺ = 4530,0

AAA: Asx, 2,2 (2); Glx, 6,1 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,0 (3); Gly, 1,9 (2);

HU 211 348 A9 hSer, 1,0 (1); Thr, 1,0 (1); Alá,

2,1 (2); Arg, 7,2 (7); Val, 0,8 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,4 (8);

Lys, 2,1 (2).

A honoszerin-alkil-amidokat hasonlóan homoszerin-laktonből állítottuk elő, oly módon, hogy azt a megfelelő alkil-amin feleslegét tartalmazó DMF-ben oldottuk fel, és szobahőmérsékleten néhány napig végzett keverést követően (a reakciót analitikai HPLC-vel ellenőriztük) az elegyet szárazra pároltuk, majd a pep5 tidet preparatív HPLC-vel tiszítottuk. A jellemző homoszerin-alkil-amidok az 55. és 56. vegyületek.

55. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH₂CH₃ (X = homoszerin; 69. sz. szekvencia):

Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30

Leu His Thr hSer NHCH₂CH₃ (69. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: (nem meghatározott) ’C [a]ő = nem meghatározott) FAB (Ci7₈H₃o₆N₅₆0₅₂): [M+H]⁺ = 4063,0 .AAA: Asx, 2,± (2); Glx, 5,8 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,1 (3); Gly, 0,9 (1) ; Thr, 1,0 (1); Alá, 0,9 (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,1 (1); Ile, 1,0 (1); Leu, 8,4 (8); Lys, 3,7 (4); hSer 0,9 (1).

56. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH₂CH₂C₆H₅ (X = homoszerin; 70. sz. szekvencia);

Alá

Val

Ser

Glu

His

Gin

Leu

His

Asp

Lys

Gly

Lys

Ser

Ile

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

20

25

30

Leu

His

Thr

hSer

NHCH₂CH

₂C_eH₅

(70

. számú

szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: (nem meghatározott) [a]^ = nem meghatározott) FAB (Ο_]ΜΗ₃|₀Ν56θ52)^: [M+H]⁺ = 4138,8 AAA: Asx, 2,0 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 1,7 (2); His, 2,9 (3); Gly, 0,9 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 0,9 (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,0 (1); Ile, 0,9 (1) Leu, 8,0 (8); Lys, 4,1 (4); hSer 0,9 (1) .

4. példa

Az 1. példában alkalmazott Boc-Ala gyanta helyett Merrifield-gyantához (DMF-ben 50 ’C-on, 48 órás kezeléssel) kapcsolt N^a-Boc-Nc-Fmoc-L-2,4-diaminovajsav céziumsót használtunk. A szintézis befejezésével az Fmoc oldallánc-védőcsoport eltávolítása érdekében a peptidet 30 percig, szobahőmérsékleten, DMFben 20%-os piperidinnel kezeltük. A védeti peptid spontán laktámmá ciklizálódott, miáltal lehasadt a gyantáról. Az oldatot leszűrtük a gyantáról, és vákuum alatt bepároltuk, s így olaj maradt vissza. Ezt a maradékot az 1. példában leírtak szerint folyékony hidrogénfluoriddal kezeltük, miáltal védőcsoport nélküli nyers peptidet kaptunk. A peptidet az 1. példában leírt módon kezeltük és tisztítottuk.

49. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX (X = L-2,4-diamino-butiril-laktám; 63. sz.

szekvencia);

Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile

15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys

20 25 30

Leu His Thr L-2,4-diamino-butiril-laktam (63. számú szekvencia

Fizikai adatok:

o.p.: 161-181 ’C [oc]g = -48,38’ (c = 0,25 H₂O) FAB (C₁₇₆H₃₀oN₅₆0₅₁): [M+H]⁺ = 4016,8 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 6,3 (6); Ser, 1,7 (2); His, 3,3 (3); Gly, 1,1 (1); Thr, 1,0 (1); Alá, 2,1 (2); Arg, 2,9 (3); Val, 0,9 (1); Ile, 0,9 (1); Leu, 8,0 (8); Lys, 3,8 < 4) .

HU 211 348 A9

5. példa

A 2. példában előállított homoszerin-lakton analóg vizes oldatát sertésmáj észterázzal (Sigma Chemical Company, Sl. Louis, MO) kezeltük. A lakton C-terminális homoszerint eredményező hidrolízisét analitikai HPLC-vel ellenőriztük. Amikor úgy ítéltük, hogy a hidrolízis befejeződött, az anyagot az 1. példában leírtak szerint preparatív HPLC-vel tiszítottuk.

37. vegyület: AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH (X = homoszerin; 51. sz. szekvencia);

Ala	Val	Ser	Glu	His	Gin	Leu	Leu His Asp Lys	Gly	Lys	Ser	He
1				5			10				15
Gin	Asp	Leu	Arg	Arg	Arg	Glu	Leu Leu Glu Lys	Leu	Leu	Glu	Lys
				20			25				30
Leu	His	Thr	hSer OH	(51.	. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: (nem meghatározott [a]§ = (nem meghatározott) FAB (Ci₇₆H₃₀|N5₅Oj3): [M+H]⁺ = 4035,1 AAA: Asx, 2,1 (2); Glx, 5,9 (6); Ser, 2,0 (2); His, 3,1 (3); Gly, 0,8 (1); hSer, 0,8 (1); Thr, 1,0 (1); Ala, 1,0 (1); Arg, 3,0 (3); Val, 1,3 (1); lle, 1,0 (1); Leu, 8,1 (8); Lys, 3,8 (4).

6. példa

Az 1. példa szerint, 0,35 mmól mennyiségben a 20 BocAVS(Bzl)-E(OBz)H(Bom)QLLHD(OBzl)R(Ts) GR(Ts)S(Bzi)IQD(OBz)LR(Ts)R(Ts)-E(OBz)LLE(O Bzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM védett peplid-gyanta komplexumot szintetizáltuk. Valamennyi N“-csoportot t-butoxi-karbonil (Boc) védőcsoporttal védtük, az oldalláncok védőcsoportjait pedig feltüntettük. A szintézis befejezése után a peptid-gyanta komplexumot a lizin fluorenil-metoxi-karbonil védőcsoportja eltávolítása érdekében, szobahőmérsékleten 30 percig dimetil-formamidban (DMF) készített 50 30 ml 20%-os piperidinnel kezeltük. A lizint egymás után DMF-fel, metanollal, diklór-metánnal mostuk, majd szárítottuk, miáltal 1,6 g részletesen védett peptidet kaptunk. A részlegesen védett peptid 0,8 g-ját (0,175 mmól) (a lizin aminosavon) szobahőmérsékleten 5 órán keresztül 20 ml DMF-ben, 0,16 g (0,3 mmól) benzo-triazoloxi-trisz(pirrolidino)-foszfónium-hexafl uor-foszfát (PyBop) és 0,067 g (0,525 mmól) diizopropil-etil-amin (DIEA) jelenlétében 0,44 g (0,3 mmól 25 metoxi-di(etilén-oxi)-ecetsavval [PEG(2)CH₂COOH] acileztük. Öt óra elteltével a gyantát leszűrtük, és egymás után DMF-fel, metanollal, diklór-metánnal mostuk. Az acilezéses lépést kétszer ismételtük, még a gyantán negatív hinhidrid-reakciót nem kaptunk. A kész peptidet az 1. példában leírt módon az oldalláncvédőcsoportok eltávolításával és tisztítással hasítottuk le a gyantáról, s termékként a 19. vegyület 100 mg-ját kaptuk.

19. vegyület: AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH (18. sz. szekvencia); ___I

CH,O(CHjCH₂O)₂CH₂C = o

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser lle 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu

25 30

Lys (COCH₂PEG₂) Arg Leu His Thr Ala OH (18. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 145-195 ’C [a]§ = -44,60' (c = 0,2 H₂O) FAB (C^H^N^O.*): [M+H]⁺ = 4276,2 AAA: Asp, 2,1 (2); Glu, 5,0 (5); Ser, 1,6 (2); His, 2,9 (3); Gly, 0,9 (1); Thr, 1,9 (2); Arg, 7,1 (7); Val, 1,1 (1); lle, 1,0 (1) Leu, 8,0 (8); Lys, 0,9 (1).

7. példa

A peptidet a 4. példában leírt módon szintetizáltuk, hasítottuk és tisztítottuk, azzal a különbséggel, hogy acilezőszerként 2-metoxi-poli(etilén-oxi)ecetsavat [PEG(5000)CH₂C0₂H] alkalmaztunk. A részlegesen 50 védett peptid 0,8 g-jából (0,175 mmól) 300 mg tiszta peptidet (20. vegyület) állítottunk elő.

20. vegyület: AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH (19. sz. szekvencia); CH,O(CH₂CH₂O)„₀CH₂C = 0

Ala Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Arg Gly Arg Ser He 15 10 15

Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu

25 30

HU 211 348 A9

Lys (COCH₂PEG5000) Arg Leu His Thr Alá OH (19. számú szekvencia).

Fizikai adatok:

o.p.: 105 ’C [a]g = -22,95’ (c = 0,11 50%aq,HOAc)

AAA: Asp,	2,0	(2) ;	Glu,	4,8	(5) ;
Ser, 1,6	(2) ;	His,	2,6	(3) ;	Gly,
1,1 (1);	Thr,	1,1	(2) ;	Arg,	7,3
(7) Val,	0,8	(1) ;	Ile,	0,9	(1) ;
Leu, 8,3	(8) ;	Lys,	1,8	(2) ;	Alá,
1,8 (2) .

8. példa

A hPTHrpl 1-34) analóg génjének szintézise A hPTHrp(l-34) analógot (4. vegyület; 9. számú szekvencia) kódoló szintetikus gént szerkesztettünk, amely az 1. ábrán bemutatott nukleotid-szekvenciával és restrikciós enzimes hasítási helyekkel rendelkezik. A szükséges oligodezoxinukleotidokat Sinha és mtsi eljárásával (Nucleic Add Research, 12, 45394557, 1984) DNS-szintetizátoron (Milligen/Biosearch) készítettük. A védőcsoportok eltávolítása után a nyers oligonukleotidokat preparatív 15%-os poliakrilamid gélen gélelektroforézissel tisztítottuk. Az oligonukleotidok helyét UV-vel határoztuk meg; ezeket kivágtuk a gélből, majd Waters Cl8 Sep-pak^R tölteten sótalanítottuk és liofilizáltuk.

A polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett amplifikációt „GeneAmp” DNS amplifikációs kit (Perkin-Elmer Cetus) reagenseinek (köztük Taq-polimeráz) alkalmazásával Perkin-Elmer Cetus PCR-készüléken hajtottuk végre, 25 ciklussal (1 percig 90 ’C-on, 2 percig

50 ’C-on és 3 percig 72 ’C-on). A hPTHrp(l-34) analóg gén templát DNS-szekvenciájaként két átfedő oligonukleotidot állítottunk elő; az egyik egy 88mer (2 pg), a PTH3 (31. sz. szekvencia):

CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC	ATG	GCT	GTT	TCT	GAA	CAT	CAG	45
	Met	Alá	Val -1	Ser	Glu	His	Gin c
CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA	TCG	ATT	X CAA	GAT	CTG	AGA	X CGT	C 88
Leu Leu His Asp Lys Gly Lys	Ser	Ile	Gin	Asp	Leu	Arg	Arg
10		15					20
másik egy anti-szensz 90mer (2	pg) ,	a PTH4	(32 .	. sz.	szekvencia);
CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATCTTAGA	CAT	AGT	ATG	CAG	CTT	TTC	46
		Met	Thr	His	Leu	Lys	Glu

AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC TTG AAT CG 90 Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gin Ile

20 15

A két szegélyező primer, a PTHPCR1: CCTCTAGATC TCCGCGGCGC

TAG (33. sz. szekvencia) és PTHPCR2: CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC (34. sz. szekvencia) alkalmazásával PCR-rel teljes gént amplifikáltunk. Az amplifikált DNS-terméket 4%-os NuSieve^R agaróz gélen gélelektroforézissel tisztítottuk. A hozzávetőleg 150 bázis hosszúságú, szintetikus hPTHrp(l-34) analóg gént tartalmazó sávot kivágtuk a gélből, és Elu-Quick^R üveg gél DNS extrakcióval (Schleicher & Schuell, Keene, NH) hozzávetőleg 200 ng DNS-t izoláltunk.

9. példa:

a hPTHrpl 1-34)1 analóg gén molekuláris klónozása

A 6. példa szerinti hPTHrp(l-34) analóg gén szubklónozásához az amplifikált DNS 200 ng-ját izoláltuk és HindlII és SacI restrikciós enzimekkel hasítottuk. Amint a 2. ábrán látható, a DNS-t 2 pg, előzetesen HindlII-mal és SacII-vel hasított Trp LE 18 Prot (Ile³, Pro⁵) Plazmidhoz ligáltuk.

A kapott, hPTHrp(l-34) analóg gén egy példányát tartalmazó Trp LE 18 hpPTHrp( 1-34)1 plazmidot kompetens E. coli HB 101 sejtekbe (CLONTECH, Palo Alto, CA) transzformáltuk. A transzformánsokat az inszerció igazolása érdekében PCR-analízisnek vetettük alá. Kiválasztottuk a transzformált sejttelepeket, és azokat 5 percig 200 pl vízben forraltuk, ebből 2 pl-t az inszertet szegélyező két primerrel együtt PCR-nek vetettük alá. A PCR terméket ezután 1%-os agaróz gélen analizáltuk, hogy igazoljuk a hPTHrp(l-34) gén inszert egy példányának jelenlétét. A Trp LE 18 hPTHrp(l-34) plazmidot automatizált DNS-szekventoron (Applied Biosystems Model 373A, Foster City, CA), a forgalmazó Dye Deoxy Terminator Sequering kit-jének felhasználásával azonosítottuk.

10. példa:

A hPTHrpl 1-34) analóg gén több példányát tartalmazó Trp LE 18 vektor előállítása Az egyedüli Nhel és Xbal restrikciós hasítási helyek a hPTHrpí 1-34) analóg gén szekvenciájának kezdetéhez és végéhez közel helyezkednek el. Ez a kél restrikciós hely, amely különböző szekvenciákat ismer fel, de azonos egyszálú kohéziós terminálisokat képez, lehetővé teszi a Trp LE 18 vektoron belül a hPTHrp(l34) gén több példányának kialakítását.

Az egymás utáni ismételt hPTHrp(l-34) szekvenciák kialakításának folyamatát a 3. ábrán vázoljuk. A gén egy példányát tartalmazó Trp LE 18 hPTHrp(l34)1 plazmid 5 pg-ját külön reakciókban BamHI+Nhel, valamint Xbal+BamHI enzimekkel hasítottuk. Mindegyik emésztésből a hPTHrp(l-34) analóg gént tartalmazó fragmens kb. 300 ng-ját izoláltuk. A

HU 211 348 A9 két fragmenst összekevertük és ligáltuk, miáltal a Trp LE 18 hPTHrp(l-34)2 plazmidot hoztuk létre, amelyet kompetens E. coli HB 101 sejtek transzformálásához használtunk. A hPTHrp(l-34) gén inszert két példánya jelenlétének meghatározásához a transzformált PCRtermékek 1%-os agaróz gélen végzett méret-meghatározását alkalmaztuk. A gén két példányát tartalmazó Trp LE 18 hPTHrp(l-34)2 plazmidot DNS-szekvenálással igazoltuk. A két hPTHrp(l-34) gén helyes kapcsolódása a kapcsolódási helynél az Nhel és Xbal helyek megszűnését eredményezi, miáltal a megmaradó Nhel és Xbal helyek a két tandem (egymás utáni) gént szegélyezik.

Az eljárás ismétlésével a hPTHrp(l-34) gén négy példányát tartalmazó Trp LE 18 hPTHrp( 1-34)4 plazmidot állítottuk eló (4. ábra) DNS-szekvencia analízissel megállapítottuk, hogy a Trp LE 18 hPTHrp( 1-34)4 plazmid szekvenciája helyes.

ll. példa:

A Trp LE 18 hPTHrpí 1-34)4 plazmid expresszálása és tisztítása

A Trp LE 18 hPTHrpí 1-34)4 plazmid indukálása pg/ml ampicillint és 100 pg/ml triptofánt tartalmazó 50 ml LB tápközeg [J. H. Miller, „Experiments in Molecular Genetics”, 431, oldal (1972); amelyet hivatkozásul említettünk] indító tenyészetet Trp LE 18 hPTHrp( 1-34)4 plazmidot tartalmazó E. coli sejtekkel oltottuk be, és a tenyészetet élénk keveréssel 37 ’C-on, egy éjszakán keresztül, kb. 6-os A₅₅₀ érték eléréséig neveltük. Az előállításhoz az LB tápközeg két literét 37 ’C-ra előmelegítettük, majd 0,06-os A_5J0 érték eléréséhez 20 ml indító tenyészettel oltottuk be. A tenyészetet élénk keveréssel 0,6 és 0.8 közötti A₅₅₀ értékig neveltük, majd 2 ml 10 mg/ml indol-akrilsav (IAA) oldatot adtunk hozzá. A tenyésztést jó levegőztetéssel kb. 6-os A550 érték (jellemzően 4 és 10 között) eléréséig kb. 16 órán keresztül folytattuk. A sejteket centrifugálással koncentráltuk, és 50 mM Tris-HCI (pH = 7,5) és 0,1 mM EDTA puffer 500 ml oldatában (Tris puffer) reszuszpendáltuk.

A szuszpenziót (3/4 hangtölcsérrel felszerelt) Heat Systems-Ultrasonics, Inc. model 220P hangsugárzóval kezeltük, melyet a túlhevülés elkerülése érdekében 5%-os teljesítménnyel működtettünk.

Az indukció mértékének meghatározásához az ép sejteket SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. A Trp LE 18 hPTHrp( I -34)4 plazmidból származó géntermékek hozzávetőleg 17 000 molekulatömegű fő sávként voltak láthatók. Ez az összes celluláris protein 10%-ának felel meg.

A fúziós protein izolálása és tisztítása

A Trp LE 18 hPTHrp( 1-34)4 fúziós protein pelletezéséhez a sejtlizátumot 15 percig kb. 3600 g-vel centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és a pelletet 200 ml Tris pufferben reszuszpendáltuk (jellemzően 40-80 A_55O/mI koncentrációban).

12. példa: A fúziós protein kezelése, és a homoszerin-lakton hPTHrpí 1-34) peptid tisztítása A hPTHrp(l-34) multimer fúziós proteint szegélyező metionin gyökök CNBr-dal végzett lehasításával a kívánt homoszerin-lakton hPTHrp(l-34) polipeptidet szabadítottuk fel, amelyet az alábbiak szerint tisztítottunk.

A fúziós protein CNBr-os kezelése A Trp LE 18 hPTHrp( 1-34)4 fúziós protein mosott pelleteit óvatos keveréssel 60 ml 70%-os hangyasavban reszuszpendáltuk (kb. 20 mg/ml összes protein; jellemzően 1000 A₅₅₀ sejtegységből származó anyagot 3 ml-ben oldottuk). Az elegyhez néhány csepp oktanolt adtunk, az oldaton nitrogént buborékoltattunk át, majd 5,5 g CNBr-t adtunk hozzá. A reakciót 25 ’C-on 6 órán keresztül végeztük, majd egyenlő térfogatban 50:50 arányú metanol:víz elegyet kevertünk a mintával, amit ventilációs párologtatással távolítottunk el. Az eljárás 2-4-szeri ismétlése után a hangyasav és a cián-bromid zömét eltávolítottuk, majd a mintát szárazra pároltuk, 200 ml vízben újra feloldottuk, s a tárolhatóság érdekében liofilizáltuk.

A homoszerin-lakton hPTHrpi 1-34) tisztítása A cián-bromiddal kezelt felülúszót 24 órán keresztül 50 mM K.H2PO4 oldattal (pH = 6,5) szemben dializáltuk, többszöri változtatással. A dializálás során a kémhatást 6,5 pH-n tartottuk. A dialízis után a csapadékokat nagy sebességű centrifugálással távolítottuk el. A felülúszót Gelman 0,45μ szűrőkészüléken (Acrodisc 4184) szűrtük.

Kationcseréió kromatográfia A kezdeti tisztítást Βίο-Gel TSK-SP-5PW HPLC oszlopon (21,5xmm) végzett kationcserélő kromatográfiával egészítettük ki. A kromatografálást 8 ml/perc átfolyási sebességgel és hozzávetőleg 12 mg nagymértékben tiszított homoszerin-lakton hPTHrp(l-34) peptid hozammal a következők szerint végeztük:

1. Az oszlopot 50 mM KH₂PO₄ oldattal (pH - 6,5) ekvilibráltuk.

2. Az oszlopra 10 ml leszűrt felülúszót töltöttünk (hozzávetőleg 1,5 1 tenyészet tápközeg vagy 2,4 g benne lévő anyag).

3. Az oszlopot az alapszint állandósulásáig 50 mM NaCl oldatot tartalmazó 50 mM KH₂PO₄ oldattal (pH = 6,5) mostuk.

4. Az oszlopot 90 mM NaCl oldatot tartalmazó 50 mM KH₂PO₄ oldattal (pH = 6,5) eluáltuk. A frakciókat kb. 45 percen át gyűjtöttük.

5. A 90 mM NaCl-os frakciókat C18 HPLC-vel homoszerin-lakton hPTHrp(l-34) tartalomra vizsgáltuk, majd összegyűjtöttük és tároltuk azokat.

Reverz fázisú HPLC kromatográfia A végső tisztítási lépéshez reverz fázisú Poros R/H

4,6x100 mm-es oszlopot (Perseptive Biosystems, Cambridge. MA) használtunk. A kromatográfia körülményei a következők voltak.

HU 211 348 A9 „A” mozgó fázis: 0,1 %-os trifluor-ecetsav (TFA)/víz „B” mozgó fázis: 0,1 %-os trifluor-ecetsav (TFA)/CH₃CN a kezeletlen OVX kontrollokhoz képest szintén jelentősen növekedett.

A vizsgálat során az alábbi vegyületeket teszteltük:

Idő	Átfolyás	B%
0 perc	4 ml/perc	15
5,0 perc	4 ml/perc	40
5,2 perc	4 ml/perc	100
6,8 perc	4 ml/perc	100
7,0 perc	4 ml/perc	15

A kalcium %-os gyarapodása az OVX csoporthoz képest

Vegyület	Tesztek száma	Trabekuláris csont	Egész csont
1. (7. sz. sz.)	6	101-128%	88-138%
2. (6. sz. sz.)	3	87-102%	66-114%
4. (9. sz. sz.)	3	-	88-114%

A homoszerin-lakton hPTHrp(l-34) (4. vegyület) retencióideje hozzávetőleg 2,943 perc volt. A tisztított peptid 98%-os tisztaságú volt (amit tömegspektroszkópiával határoztunk meg).

13. példa

A találmány szerinti vegyületek eltávolított petefészkű patkányok csonttömegére gyakorolt hatását értékeltük, rendszerint Gunnes-Hey és Hock (Metab. Boné Dis., 5:177-181, 1984) eljárása szerint.

A felnőtt Sprague-Dawley nőstény patkányokat akklimatizáltuk, tömeg szerint csoportosítottuk (n = 9, 10 vagy 12), s kétoldali petefészek-eltávolítást (OVX) vagy látszat-műtétet végeztünk rajtuk. A vegyület adagolását a műtét után 17 nappal kezdtük, és 20 napon keresztül folytattuk. A tesztvegyületet naponta egyszer 2%-os patkány szérum/sóoldat vivőanyagban szubkután adtuk be.

napig végzett adagolás után a patkányokat leöltük, a jobb combcsontokat (femur) félbevágtuk, s a disztális combcsont feleket (DFH) a trabekulák (gerendák) átfúrásával tovább osztottuk trabekuláris csontra (TB) és kortikális csontra (CB). A kalciumot Calcette kalcium-analizátorral vontuk ki és mértük, és a csont átlagos kalciumtartalmát mg/DHF/100 g testtömeg értékben fejeztük ki.

Az OVX és a látszatkezelt csoportok összehasonlításához a kétmintás t-tesztet alkalmaztuk. Az OVX csoportok összehasonlításához az egyváltozós ANOVA tesztet használtuk, majd - a kezelt csoportok vivőanyaggal való összehasonlításához - Fisher-féle összetett LSD összehasonlítást végeztünk.

A petefészek-eltávolítás lényegében teljes csontleépülést okozott, elsősorban a trabekuláris csontban. Az egész csont kalcium-mennyisége a látszat-operáit kontrollokhoz képest 47-54%-kal kevesebb volt.

A bPTH(l-34) és a hPTHrp(l-34) 80 gg/kg/nap adagolásban a kezelt OVX patkányok esetében az egész csont kalciumtartalmát illetően statisztikusan jelentős növekedési eredményezett (53-95%-os, illetve 18-40%-os növekedés), a kortikális csont kalciumtartalmában azonban nem tapasztaltunk lényeges növekedést.

A találmány szerinti vegyületek 80 gg/kg/nap adagolásban az egész csont kalciumtartalmát 66-138%kal, a trabekuláris csont kalciumtartalmát pedig 87128%-kal növelték. A kortikális csont kalciumtartalma, a trabekulák (gerendák) vastagsága és a csont térfogata

Hasonló vizsgálatokban az eltávolított petefészkű patkányokat 5, 10 és 20 napon keresztül 40 gg/kg/nap adagolással kezeltük, az alábbi eredményekkel.

A kalcium %-os gyarapodása az OVX csoporthoz képest

Vegyület	Tesztek száma	Napok száma	Egész csont
1. (7. sz. sz.)	3	20	73-109%
4. (9. sz. sz.)	5	20	79-105%
4. (9. sz. sz.)	1	10	79%
49. (63. sz. sz.)	1	10	93%
4. (9. sz. sz.)	1	5	55%
42. (56. sz. sz.)	1	5	60%

14. példa

Toxicitás

A fenti 11. példában a találmány szerinti vegyületek esetében nem tapasztaltunk toxikus hatásokat.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. A parathormon (PTH), parathormonnal rokon peptid (PTHrp), illetve a parathormon vagy parathormonnal rokon peptid fiziológiailag aktív, rövidített homológjának vagy analógjának szintetikus polipeptid analógja vagy annak sója, melyben a 22-31. aminosav gyökök amfipatikus alfa-hélixet képeznek, s az említett 22-31. aminosavak hidrofil aminosavak (Haa) és lipofil aminosavak (Laa) közül valók, melyek az alábbi sorrendben rendeződnek el:

Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa.
2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid vagy sója, amelyben a 22-31. aminosavak amfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezen aminosavak szekvenciáját az alábbi szekvenciák közül választjuk ki:

a) Xaa¹ Xaa* Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷1 5

Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰10 ahol Xaa¹ és Xaa⁴ jelentése - egymástól függetlenül Glu, Glu(OCH₃), His vagy Phe; Xaa² jelentése Leu v. Phe; Xaa⁵ jelentése Lys v. His; Xaa⁷ és Xaa¹⁰ jelentése,

HU 211 348 A9 egymástól függetlenül, Leu v. Ile; Xaa⁸ jelentése Alá, Arg v. Glu; és Xaa⁹ jelentése Lys v. Glu (85. számú szekvencia); előnyösen:

Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Xaa Lys Leu; ahol 15 10

Xaa jelentése Glu vagy Arg (26. számú szekvencia); b) Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu

1 5

Xaa^s Arg Leu; ahol

10,

Xaa¹ és Xaa⁴ jelentése - egymástól függetlenül - Glu, Glu(OCH3), His vagy Phe; Xaa² jelentése Leu v. Phe; Xaa⁸ jelentése Glu, Lys v. Lys (COCH2PEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekulatö5 mege 100-10 000] (86. számú szekvencia); előnyösen: Glu Leu Leu Glu Arg Leu Leu Xaa Arg Leu; ahol 15 10

Xaa jelentése Glu, Lys v. Lys (COCH₂PEGX) [PEGX = poli(etilén-glikol-metil-éter)-gyök, melynek molekii10 latömege 100-10000] (27. számú szekvencia);

c) Alá 1 Leu Alá Glu Alá 5 Leu Alá Glu Alá d) Ser 1 Leu Leu Ser Ser 5 Leu Leu Ser Ser e> Alá Phe Tyr Asp Lys Val Alá Glu Lys

1 5

Leu (28. SZ . szekv 10 Leu 10 (29. sz . szekv Leu 10 (30. sz. szekv
3. A 2. igénypont szerinti polipeptid, amely az alábbi képlettel írható le:

Xaa¹ Xaa² Xaa³ Xaa⁴ Xaa⁵ Xaa⁶ Xaa⁷ Leu His Xaa^lfl Xaa¹¹ Gly Xaa¹³ Ser Ile Gin Xaa¹⁷ Leu Xaa” Xaa²⁰ Xaa²¹ Xaa²²'³¹ Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴ Xaa³⁵ Xaa³⁶Xaa³⁷ Xaa³⁸ Term.; melyben

Xaa¹: hiányzik vagy Alá;

Xaa²: hiányzik vagy Val;

Xaa³: hiányzik vagy Ser;

Xaa⁴: hiányzik vagy Glu v. Glu (OCH,);

Xaa⁵: hiányzik vagy His v. Alá;

Xaa⁶: hiányzik vagy Gin;

Xaa⁷: hiányzik vagy Leu;

Xaa¹⁰ és Xaa¹⁷ (egymástól függetlenül): Asp v. Asp (OCH,);

Xaa¹¹: Lys. Arg v. Leu;

Xaa¹³: Lys, Arg. Tyr, Cys, Leu, Cys, [CHjCONHíCHj^NHTbiotinil)], (7-dimetil-amino-2-oxo-2H-l-benzopirán-4-acetil)-Lys v. (dihidrocinnamoil)-Lys;

Xaa²⁰: Arg v. Leu;

Xaa” és Xaa²¹ (egymástól függetlenül): Lys, Alá v.

Arg;

Xaa²²'³¹: a 26., 27., 28., 29. v. 30. számú szekvencia valamelyike;

Xaa³²: His, Pro v. Lys;

Xaa³³: hiányzik vagy Pro, Thr, Glu v. Alá;

Xaa³⁴: hiányzik vagy Pro, Arg, Met, Alá, hSer, hSerlakton, Tyr, Leu v. 1,4-diamino-butiril-laktám;

Xaa³⁵: hiányzik vagy Pro, Glu, Ser Alá v. Gly;

Xaa³⁶: hiányzik vagy Alá, Arg v. Ile;

Xaa³⁷: hiányzik vagy Arg, Trp v. 3(2-naftil)-L-alanin;

Xaa³⁸: hiányzik vagy Alá v. hSer; vagy

Xaa³⁸ ⁴²: Thr, Arg, Ser, Alá, Trp; és

Term.: OR v. NR₂, melyekben R egymástól függetlenül lehet hidrogén, 1—4 szénatomos alkil- vagy fenil(C,_₄) alkilcsoport; valamint ezek gyógyszerészetileg megfelelő sói.
4. A 3. igénypont szerinti polipeptid, melyben Xaa²²'³¹ a 26. számú szekvencia, továbbá Xaa¹¹ és Xaa¹³ jelentése egyaránt Lys, és Xaa” és Xaa²¹ jelentése egyaránt Arg.

5. A 4. igénypont szerinti polipeptid, amely a 7. számú szekvencia:

Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 Leu His Thr Alá NH₂. 6. A 4. igénypont szerinti polipeptid, amely az 56. számú szekvencia: Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 Leu Pro NH₂. 7. A 4. igénypont szerinti polipeptid, amely a 63. számú szekvencia: Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 Leu His Thr 1,4-diamino- -bútiril-laktam.

HU 211 348 A9

8. A 4. igénypont szerinti polipeptid, amely a 9. számú szekvencia:

Alá Val Ser Glu His Gin Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gin Asp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys 20 25 30 Leu His Thr hSerlac
9. Gyógyszerkészítmény, amely az 1. igénypont szerinti polipeptidnek vagy sójának hatékony csonttömeg-növelő mennyiségét tartalmazza egy gyógyszeré- 10 szetileg elfogadható hordozóval együtt.
10. Egy anyag vagy készítmény a csont tömegének csökkenésével jellemezhető emlős betegségek kezelési eljárásában való alkalmazására, ahol a nevezett szubsztancia vagy készítmény tartalmazza a parathormon 15 (PTH), a parathormonnal rokon peptid (PTHrp) vagy a PTH és a PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológjának vagy analógjának egy szintetikus polipeptid analógját, valamint annak sóját, amelyben a 21-33. aminosav gyökök ampfipatikus alfa-hélixet képeznek, és ezek a 20 gyökök (22-31) a hidrofil aminosavak (Haa) és lipofil aminosavak (Laa) közül vannak kiválasztva, melyek az alábbi sorrendben rendeződnek el:

Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa, és amely eljárás magában foglalja az említett anyag 25 vagy készítmény hatékony csonttömeg-növelő menynyiségének a beadását egy rászoruló személynek.
11. Egy anyag vagy készítmény 10. igénypont szerinti alkalmazása egy kezelési eljárásban, amelyben a kezelt betegség oszteoporózis. 30
12. Eljárás a PTH, PTHrp polipeptid analógjának vagy a PTH, illetve PTHrp fiziológiailag aktív, rövidített homológja vagy analógja egy polipeptid analógjának vagy sójának szilárd fázisú szintézisére, ahol a 22-31. aminosav gyökök amfipatikus alfa-hélixet képeznek és ezek a gyökök (22-31) a hidrofil aminosavak (Haa) és a lipofil aminosavak (Laa) közül vannak kiválasztva, melyek az alábbi sorrendben rendeződnek el:

Haa (Laa Laa Haa Haa)₂ Laa, amely eljárás során a védett aminosavakat egy alkalmas gyanta hordozóval kapcsoljuk, az odallánc- és N“-védőcsoportokat eltávolítjuk és a peptidet a gyantáról lehasítjuk.
13. Egy 1. igénypont szerinti vegyület vagy egy gyógyszerészetileg elfogadható sójnak felhasználása a csont tömegének csökkenésével jellemezhető emlős betegségek, különösen oszteoporózis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.
14. Egy új polipeptid, lényegében amint itt leírtuk.
15. Egy új gyógyszerkészítmény, lényegében amint itt leírtuk.
16. Egy anyag vagy készítmény új alkalmazásra egy kezelési eljárásban, lényegében amint azt itt leírtuk.
17. Egy új eljárás a polipeptid szintézisére, lényegében amint azt leírtuk.
18. Egy 1. igénypont szerinti vegyület vagy gyógyszerészetileg elfogadható sójának új felhasználása, lényegében amint azt ismertettük.