PT2346864E - Novos compostos úteis para o tratamento de doenças degenerativas e inflamatórias - Google Patents

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PT2346864E
PT2346864E PT97810733T PT09781073T PT2346864E PT 2346864 E PT2346864 E PT 2346864E PT 97810733 T PT97810733 T PT 97810733T PT 09781073 T PT09781073 T PT 09781073T PT 2346864 E PT2346864 E PT 2346864E
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Christel Jeanne Marie Menet
Javier Blanc
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Galapagos Nv
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Description

DESCRIÇÃO "NOVOS COMPOSTOS ÚTEIS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DEGENERATIVAS E INFLAMATÓRIAS"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a compostos que são inibidores de JAK, uma família de tirosina-cinases que estão envolvidas na modulação da degradação de cartilagem, degenerescência da articulação e doenças que envolvem, tais como degradação e/ou inflamação. A presente invenção também proporciona métodos para a produção destes compostos, composições farmacêuticas compreendendo estes compostos, métodos para a prevenção e/ou tratamento de doenças que envolvem a degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, estados que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, estados patológicos impulsionados por endotoxinas, doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6, doenças proliferativas e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão); e/ ou métodos para a prevenção e/ou tratamento de doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de articulação e/ou inflamação através da administração de um composto da invenção.
As cinases janus (JAK) são tirosina-cinases citoplasmáticas que transformam a sinalização de citocina dos receptores de membrana em factores de transcrição STAT. Estão descritos quatro 1 membros da família JAK, JAKl, JAK2, JAK3 e TYK2. Após a ligação da citocina ao seu receptor, os membros da família JAK auto-e/ou transfosforilam-se mutuamente, seguida da fosforilação de STAT que migram, em seguida, para o núcleo para modular a transcrição. A transdução de sinal intracelular JAK-STAT serve os interferões, a maioria das interleucinas, bem como uma variedade de citocinas e factores endócrinos, tais como EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF, PRL Vainchenker W. et al. (2008) . A combinação da investigação de modelos genéticos e inibidores de JAK de molécula pequena revelou o potencial terapêutico de várias JAK. A JAK3 é validada pela genética de ratinho e humana como um alvo de imunossupressão (0'Shea J. et al. (2004)). Os inibidores de JAK3 foram transferidos com sucesso para o desenvolvimento clínico, inicialmente para a rejeição de transplante de órgão mas depois também para outras indicações imunoinflamatórias, tais como artrite reumatóide (RA), psoríase e doença de Crohn (http://clinicaltrials.gov/). A TYK2 é um alvo potencial para doenças imunoinflamatórias, tendo sido validada por genética humana e estudos em ratinho Knouck-out (Levy D. e Loomis C. (2007)). A JAKl é um alvo novo na área das doenças imunoinflamatórias. A JAKl heterodimeriza com as outras JAK para transduzir a sinalização pró-inflamatória impulsionada por citocinas. Por conseguinte, prevê-se que a inibição de JAKl e/ou outras JAK seja de benefício terapêutico para uma gama de estados inflamatórios, bem como para outras doenças impulsionadas pela transdução de sinal mediada por JAK. 2
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A cartilagem é um tecido avascular do qual os condrócitos são o principal componente celular. Os condrócitos na cartilagem articular normal ocupam aproximadamente 5% do volume de tecido, enquanto a matriz extracelular perfaz os restantes 95% do tecido. Os condrócitos segregam os componentes da matriz, principalmente proteoglicanos e colagénios, o que por sua vez proporciona aos condrócitos um ambiente adequado para a sua sobrevivência sob stress mecânico. Na cartilagem, o colagénio tipo II, em conjunto com o colagénio proteico de tipo IX, é organizado em estruturas de tipo fibrilar sólidas que conferem à cartilagem uma grande resistência mecânica. Os proteoglicanos podem absorver água e são responsáveis pelas propriedades de resiliência e absorção de choque da cartilagem.
Um dos papéis funcionais da cartilagem na articulação é para permitir que os ossos articulem uns com os outros de forma suave. Consequentemente, a perda de cartilagem articular faz com que os ossos friccionem uns contra os outros originando dor e perda de mobilidade. A degradação de cartilagem pode ter várias causas. Nas artrites inflamatórias, como, por exemplo, a artrite reumatóide, a degradação de cartilagem é provocada pela secreção de proteases (e. g., colagenases) por tecidos inflamados (por exemplo, sinóvia inflamada). A degradação de cartilagem pode também ser o resultado de uma lesão da cartilagem, devido a um acidente ou cirurgia, ou carga exagerada ou "desgaste". A aptidão do tecido da cartilagem para regenerar após tais insultos é limitada. Os condrócitos na cartilagem lesionada exibem frequentemente actividade de síntese (anabólica) de cartilagem reduzida e/ou actividade de degradação (catabólica) de cartilagem aumentada. 3 A degenerescência de cartilagem é o sinal de referência de várias doenças, entre as quais a artrite reumatóide e a osteoartrite são as mais proeminentes. A artrite reumatóide (RA) é uma doença degenerativa crónica da articulação, caracterizada por inflamação e destruição das estruturas da articulação. Quando a doença não está controlada, origina incapacidade considerável e dor devido a perda de funcionalidade da articulação e até mesmo a morte prematura. Por conseguinte, o objectivo de uma terapia de RA é, não só abrandar a doença, mas conseguir a sua remissão para parar a destruição de articulação. Além da gravidade do resultado da doença, a alta prevalência da RA (— 0,8 % dos adultos estão afectados no mundo inteiro) significa um grande impacto socioeconómico. (Para revisões sobre RA, a requerente remete para Smolen e Steiner (2003); Lee e Weinblatt (2001); Choy e Panayi (2001); 0'Dell (2004) e Firestein (2003)). A osteoartrite (também referida como OA, ou artrite de desgaste) é a forma mais comum de artrite e é caracterizada por perda de cartilagem articular, frequentemente associada a hipertrofia do osso e dor. A doença afecta principalmente as mãos e articulações que suportam peso, tais como joelhos, ancas e coluna vertebral. Este processo adelgaça a cartilagem. Quando a área superficial desaparece devido ao adelgaçamento, é atingida uma osteoartrite de grau I; quando a área superficial tangencial desaparece é atingida uma osteoartrite de grau II. Existem outros níveis de degenerescência e destruição, os quais afectam as camadas profundas e calcificadas da cartilagem que 4 fazem fronteira com o osso subcondral. Para uma revisão extensa sobre a osteoartrite, a requerente remete para Wieland et al., 2005.
As manifestações clínicas do desenvolvimento do estado de osteoartrite são: aumento de volume da articulação, dor, crepitação e incapacidade funcional que conduzem a dor e mobilidade reduzida das articulações. Quando a doença evolui mais surge a dor em repouso. Se a condição permanece sem correcção e/ou terapia, a articulação é destruída originando incapacidade. É então necessária cirurgia de substituição com prótese total.
Foram desenvolvidos métodos terapêuticos para a correcção das lesões da cartilagem articular que surgem durante a doença osteoartrítica, mas até agora nenhum deles foi capaz de mediar a regeneração da cartilagem articular in situ e in vivo. A osteoartrite é difícil de tratar. Presentemente, não se encontra disponível qualquer cura e o tratamento foca-se no alívio da dor e em prevenir que a articulação afectada fique deformada. Os tratamentos comuns incluem a utilização de fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAID). Embora suplementos alimentares, tais como condroitina e sulfato de glucosamina, sejam recomendados como opções seguras e eficazes para o tratamento de osteoartrite, um ensaio clínico recente revelou que ambos os tratamentos não reduzem a dor associada à osteoartrite. (Clegg et al., 2006). Em suma, não estão disponíveis quaisquer fármacos osteoartríticos modificadores da doença. 5
Em casos graves pode ser necessária substituição da articulação. Isto é especialmente verdade para ancas e joelhos. Se uma articulação é extremamente dolorosa e não pode ser substituída, esta pode ser fundida. Este procedimento pára a dor, mas resulta na perda permanente da função da articulação, tornando o caminhar e flexão difíceis.
Outro tratamento possível é o transplante de condrócitos autólogos cultivados. Neste caso, material celular cartilaginoso é retirado do doente, enviado para um laboratório onde é expandido. 0 material é, em seguida, implantado nos tecidos danificados para cobrir os defeitos do tecido.
Outro tratamento inclui a instilação intra-articular de Hylan G-F 20 (e. g., Synvisc®, Hyalgan®, Artz®) , uma substância que melhora temporariamente a reologia do líquido sinovial, produzindo uma sensação quase imediata de movimento livre e um redução acentuada da dor.
Outros métodos descritos incluem a aplicação de enxertos tendinosos, periostais, fasciais, musculares ou pericondrais; implantação de fibrina ou condrócitos cultivados; implantação de matrizes sintéticas, tais como colagénio, fibra de carbono; administração de campos electromagnéticos. Todos estes têm efeitos mínimos e incompletos descritos, resultando numa qualidade de tecido fraca que não pode suportar carga nem permite o restabelecimento de uma função articular com movimento normal. A estimulação dos processos anabólicos, bloqueio dos processos catabólicos ou uma associação destes dois, pode resultar na estabilização da cartilagem e, eventualmente, até 6 mesmo na reversão da lesão e, consequentemente, prevenir a progressão da doença. Vários estímulos podem desencadear a estimulação anabólica de condrócitos. 0 factor de crescimento análogo a insulina-I (IGF-I) é o factor de crescimento anabólico predominante no líquido sinovial e estimula a síntese de proteoglicanos e colagénio. Foi também demonstrado que os membros da família da proteína morfogénica do osso (BMP), particularmente BMP2, BMP4, BMP6 e BMP7, e os membros da família do factor de crescimento transformante-β humano (TGF-β) podem induzir a estimulação anabólica de condrócitos (Chubinskaya e Kuettner, 2003). Foi recentemente identificado um composto que induz a estimulação anabólica de condrócitos (documentos US 6500854; EP 1391211). No entanto, a maioria destes compostos apresenta efeitos secundários graves e, consequentemente, existe um forte necessidade de compostos que estimulam a diferenciação de condrócitos sem estes efeitos secundários.
Vandeghinste et ai. (documento WO 2005/124342) identificaram a JAK1 como um alvo cuja inibição pode ter relevância terapêutica para várias doenças incluindo OA. A JAK1 faz parte da família de cinases Janus (JAK) de tirosina-cinases citoplasmáticas, envolvidas na transdução de sinal intracelular mediada pelo receptor de citocinas. A família JAK consiste de 4 membros: JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2. As JAK são recrutadas para os receptores de citocinas, após a ligação da citocina, seguida de heterodimerização do receptor de citocinas e de uma subunidade de receptor partilhada (cadeia gama-c comum, gpl30). As JAK são, em seguida, activadas por auto- e/ou transfosforilação por outra JAK, resultando na fosforilação dos receptores e no recrutamento e fosforilação de membros dos transdutores de sinal e activadores de transcrição (STAT). As STAT fosforiladas dimerizam e deslocam-se para o núcleo onde se 7 ligam a regiões intensificadoras de genes sensíveis a citocinas. A anulação do gene de JAK1 em ratinhos demonstrou gue a JAK1 desempenha papéis essenciais e não redundantes durante o desenvolvimento: ratinhos JAK1-/- morreram em menos de 24 h após parto e o desenvolvimento de linfócitos foi gravemente enfraquecido. Além do mais, células JAK1 -/- não foram ou foram menos reactivas para citocinas que utilizam receptores de citocinas de classe II, receptores de citocinas que utilizam a subunidade gama-c para sinalização e a família de receptores de citocinas que utilizam a subunidade gpl30 para sinalização (Rodig et al., 1998).
Vários grupos implicaram a sinalização JAK-STAT na biologia de condrócitos. Li et al. (2001) mostraram que a Oncostatina M induz a expressão dos genes de MMP e TIMP3 em condrócitos primários por activação das vias de sinalização JAK/STAT e MAPK. Osaki et al. (2003) mostraram que a inibição mediada pelo interferão-gama do colagénio II em condrócitos envolve a sinalização JAK-STAT. A ILl-beta induz o catabolismo da cartilagem reduzindo a expressão de componentes da matriz e induzindo a expressão de colagenases e óxido nítrico-sintase indutível (NOS2), a qual medeia a produção de óxido nítrico (NO). Otero et al., (2005) mostraram que a leptina e ILl-beta induziram sinergicamente a produção de NO ou expressão de ARNm de NOS2 em condrócitos, e que aquela foi bloqueada por um inibidor de JAK. Legendre et al. (2003) mostraram que a IL6/Receptor de IL6 induziram a regulação negativa de genes da matriz específicos da cartilagem colagénio II, núcleo de agrecano e proteína de ligação em condrócitos articulares de bovino, e que isto era mediado pela sinalização JAK/STAT. Por conseguinte, estas observações sugerem um papel para a actividade da cinase JAK na homeostasia da cartilagem e oportunidades terapêuticas para os inibidores da cinase JAK.
Os membros da família JAK foram implicados em estados adicionais, incluindo distúrbios mieloproliferativos (0'Sullivan et al., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506), onde foram identificadas mutações na JAK2. Isto indica que os inibidores de JAK, em particular JAK2, podem também ser de utilidade no tratamento de distúrbios mieloproliferativos. Adicionalmente, a família JAK, em particular JAK1, JAK2 e JAK3, foram associados a cancros, em particular leucemias, e. g., leucemia mielóide aguda (0'Sullivan et al. , 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506; Xiang et al., 2008, "Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia" Blood First Edition Paper, pré-publicado na internet em 26 de Dezembro de 2007; DOI 10.1182/blood-2007-05-090308) e leucemia linfoblástica aguda (Mullighan et al., 2009) ou tumores sólidos, e. g., leiomiossarcoma uterino (Constantinescu et al., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-131), cancro da próstata (Tam et al., 2007, British Journal of Câncer, 97, 378 - 383) . Estes resultados indicam que os inibidores de JAK, em particular de JAK1 e/ou JAK2, também podem ter utilidade no tratamento de cancros (leucemias e tumores sólidos, e. g., leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata).
Além disso, a doença de Castleman, mieloma múltiplo, glomerulonefrite proliferativa mesangial, psoríase e sarcoma de Kaposi são provavelmente devidos a hipersecreção da citocina IL-6, cujos efeitos biológicos são mediados pela sinalização intracelular JAK-STAT (Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto e Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (supl. 3) :S233-S242) . 9
Este resultado mostra que o inibidor de JAK pode também encontrar utilidade no tratamento das referidas doenças.
Uma ligação com doenças auto-imunes foi estabelecida para as JAK3 e Tyk2. Mutações na JAK3 mas também nos componentes de sinalização a montante, cadeia de receptor gama-c e receptor de IL7, contribuem no seu todo para ~70% de casos de imunodeficiência combinada grave humana ('OShea et al., 2004). Refira-se que a JAK1 coopera com a JAK3 na transdução de sinais da cadeia de receptor gama-c. São observados polimorfismos de Tyk2 no lúpus eritematoso disseminado (SLE) (0'Sullivan et al., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506). Assim, a selecção da família JAK como alvo pode proporcionar uma oportunidade terapêutica na área da imuno-inflamação.
As terapias actuais não são satisfatórias e, por conseguinte, permanece uma necessidade de identificar outros compostos que possam ser úteis no tratamento de doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou condições que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., 10 doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão). 0 inibidores de JAK podem também encontrar aplicação no tratamento de doenças proliferativas. Em particular, os inibidores de JAK encontram aplicação no tratamento de cancros, especialmente leucemias e tumores sólidos (e. g., leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata). Por conseguinte, a presente invenção proporciona compostos, métodos para o seu fabrico e uma especialidade farmacêutica compreendendo um composto da invenção em conjunto com um veiculo farmacêutico adequado. A presente invenção também proporciona a utilização de um composto da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças articulares degenerativas. 0 documento WO 2008/025821 divulga [1,2,4]triazolo[1,5-ajpiridinas substituídas como inibidores de proteína-cinase para o tratamento de distúrbios imunológicos, inflamatórios, alérgicos ou outros. O documento WO 2007/009773 divulga pirazolo[1,5-a]pirimidinas substituídas como inibidores de proteína-cinase. O documento US 2005/222171 divulga pirazolo[1,5-a]pirimidinas substituídas como inibidores de proteína-cinase.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na identificação de que os inibidores de JAK são úteis para o tratamento de doenças que 11 envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou estados que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoriase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardiaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão). Os inibidores de JAK podem também encontrar aplicação no tratamento de doenças proliferativas. Em particular, os inibidores de JAK encontram aplicação no tratamento de cancros, especialmente leucemias e tumores sólidos (e. g., leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata). A presente invenção também proporciona métodos para a produção destes compostos, composições farmacêuticas compreendendo estes compostos e métodos de tratamento de doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de articulação e/ou inflamação através da administração de um composto da invenção.
Os inibidores de JAK incluem compostos de 1,2, 4-triazolo[1,5-a]piridina de Fórmula (I): 12
em que
Cyl é seleccionado de arilo e heteroarilo; LI é seleccionado de uma ligação simples, -0-, -C(0)-, -C [=N(R4a) ]-N(R4a)-, -CON (R4a) -S02N(R4a)-, -S(0)2-, -N(R4a)C0- ou -N (R4a) S02-; cada R1 é independentemente seleccionado de alquilo Ci-C6, alquilo C1-C6 substituído, acilo, acilo substituído, acilamino substituído ou não substituído, alcoxilo Ci-C6 substituído ou não substituído, amido substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, sulfinilo substituído, sulfonilo substituído, aminossulfonilo substituído ou não substituído, ácido sulfónico, éster do ácido sulfónico, carboxilo, ciano, cicloalquilo C3-C7 substituído ou não substituído, heterocicloalquilo de 4-7 membros substituído ou não substituído, halo e hidroxilo; cada R3a é independentemente seleccionado de alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 substituído, acilo, acilo substituído, acilamino substituído ou não substituído, alcoxilo C1-C6 substituído ou não substituído, amido substituído ou não substituído, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilo substituído, arilalquiloxilo, arilalquiloxilo substituído, amino substituído ou não 13 substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo, sulfanilo substituído, sulfinilo substituído, sulfonilo substituído, aminossulfonilo substituído ou não substituído, ácido sulfónico, éster do ácido sulfónico, azido, carboxilo, ciano, cicloalquilo C3-C7 substituído ou não substituído, heterocicloalquilo de 4-7 membros substituído ou não substituído, halo, heteroarilo substituído ou não substituído, hidroxilo, nitro e tiol; R2a é seleccionado de alquilo Ci-Cê substituído ou não substituído ou cicloalquilo C3-C7 substituído ou não substituído; R3b é independentemente seleccionado de arilo substituído ou não substituído, cicloalquilo C3-C7 substituído ou não substituído, heterocicloalquilo de 4-7 membros substituído ou não substituído, heteroarilo de 5-10 membros substituído ou não substituído; ou R3b é independentemente seleccionado de 0-R3c, CO-R3c e CON (R4a)-R3c; e R3c é independentemente seleccionado de arilo substituído ou não substituído, cicloalquilo C3-C7 substituído ou não substituído, heterocicloalquilo de 4-7 membros substituído ou não substituído, heteroarilo de 5-10 membros substituído ou não substituído; cada R4a, R4b e R4c é independentemente seleccionado de H, alquilo Ci-C6, alquilo Ci-C6 substituído, cicloalquilo C3-C7 ou cicloalquilo C3-C7 substituído; mléO, Iou2;m2é0, 1, 2ou3;enlé0, 1, 2, 3 ou 4; na condição de que 14 quando LI é -0-, -N(R4a)-, -C0N(R4a)- ou -S02N(R4a)-, e R3b é outro que não cicloalquilo, arilo ou heteroarilo de 5-10 membros, então nl é 1, 2, 3 ou 4; ou os seus sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis ou solvatos dos sais farmaceuticamente aceitáveis.
De acordo com a invenção é proporcionado um composto de acordo com a Fórmula Via:
Via ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente aceitável ou um solvato do sal farmaceuticamente aceitável.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção, e um veiculo, excipiente ou diluente farmacêutico. Neste aspecto da invenção, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais dos compostos aqui descritos. Além do mais, os compostos da presente invenção úteis nas composições farmacêuticas e métodos de tratamento aqui divulgados, são todos farmaceuticamente aceitáveis como preparados e utilizados. 15
Os compostos da invenção são úteis num método de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de um estado de entre aqueles aqui listados, e particularmente, tal estado que pode estar associada a actividade de JAK aberrante, por exemplo doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou condições que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica) , doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão). Os inibidores de JAK podem também encontrar aplicação no tratamento de doenças proliferativas. Em particular, os inibidores de JAK encontram aplicação no tratamento de cancros, especialmente leucemias e tumores sólidos (e. g.r leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata). Num particular, os compostos da invenção são úteis num método de tratamento de estados seleccionados de inflamação, tais como artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), doenças inflamatórias do intestino (e. g., doença de Crohn, colite), estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica) e rejeição de transplante de órgão; e degradação ou degenerescência de cartilagem, osso e/ou 16 articulação, tal como osteoartrite, método esse que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos.
Os compostos da invenção são úteis num método de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de distúrbios proliferativos, em particular, cancro, (e. g., tumores sólidos), leucemias, mieloma múltiplo ou psoríase, método esse que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento ou prevenção de um estado seleccionado daqueles aqui listados, particularmente tais estados que podem estar associados a actividade de JAK aberrante, tais como doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou estados que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão). Os inibidores de JAK podem também encontrar aplicação no tratamento de doenças proliferativas. Em 17 particular, os inibidores de JAK encontram aplicação no tratamento de cancros, especialmente leucemias e tumores sólidos (e. g., leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata). Numa forma de realização especifica, a condição é seleccionada de inflamação, tais como artrite reumatóide, artrite idiopática juvenil, psoriase, doença alérgica das vias aéreas (e. g.r asma, rinite), doenças inflamatórias do intestino (e. g., doença de Crohn, colite) , estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), e rejeição de transplante de órgão; e degradação ou degenerescência de cartilagem, osso e/ou articulação, tal como osteoartrite.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento ou prevenção de distúrbios proliferativos, em particular cancro, (e. g., tumores sólidos), leucemias, mieloma múltiplo ou psoriase.
Ainda noutro aspecto de método de tratamento, é divulgado um método de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de um estado que está causalmente relacionado com actividade de JAK anormal como aqui descrita e compreende administrar uma quantidade eficaz para tratar oa estado ou prevenir o estado de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos.
Num outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato 18 farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento ou prevenção de um estado que está causalmente relacionado com actividade de JAK anormal.
Em aspectos adicionais, esta invenção proporciona métodos para sintetizar um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, sendo os protocolos e vias de síntese representativos aqui divulgados mais adiante.
Por conseguinte, é um objectivo principal desta invenção proporcionar novos compostos, os quais podem modificar a actividade de JAK e prevenir ou tratar, desse modo, quaisquer doenças que podem estar causalmente relacionadas com aquela. É ainda um objectivo desta invenção proporcionar compostos que podem tratar ou aliviar doenças ou os seus sintomas, tais como degradação de cartilagem e/ou osso e inflamação relacionada, e doenças articulares, as quais podem estar causalmente relacionadas com a actividade de JAK.
Ainda um outro objectivo desta invenção é proporcionar composições farmacêuticas que podem ser utilizadas no tratamento ou prevenção de uma variedade de estados patológicos, incluindo as doenças associadas à actividade de JAK, tais como doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou estados que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia 19 de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos) , malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão). Os inibidores de JAK podem também encontrar aplicação no tratamento de doenças proliferativas. Em particular, os inibidores de JAK encontram aplicação no tratamento de cancros, especialmente leucemias e tumores sólidos (e. g., leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata). Numa forma de realização específica o estado é seleccionado de inflamação, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica) e rejeição de transplante de órgão; e degradação ou degenerescência de cartilagem, osso e/ou articulação, tais como osteoartrite ou cancros (e. g., tumores sólidos ou leucemias).
Outros objectivos e vantagens tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica a partir de uma análise da descrição detalhada que se segue. 20
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os termos que se seguem têm a intenção de ter os significados apresentados com os mesmos abaixo e são úteis para a compreensão da descrição e do âmbito pretendido da presente invenção.
Ao descrever a invenção, a qual pode incluir compostos, composições farmacêuticas contendo tais compostos e métodos de utilização de tais compostos e composições, os termos que se seguem, se estiverem presentes, têm os significados seguintes, salvo indicação em contrário. Os artigos "um" e "uma" podem ser aqui utilizados para referir um ou mais do que um (i. e., pelo menos um) dos objectos gramaticais do artigo. A titulo de exemplo "um análogo" significa um análogo ou mais do que um análogo. "Acilo" refere-se a um radical -C(0)R , em que R e hidrogénio, alquilo Ci-Cg, cicloalquilo C3-C10, cicloalquil C3-C10-metilo, heterocicloalquilo de 4-10 membros, arilo, arilalquilo, heteroarilo de 5-10 membros ou heteroarilalquilo como aqui definido. Os exemplos representativos incluem, mas não estão limitados a, formilo, acetilo, ciclo-hexilcarbonilo, ciclo-hexilmetilcarbonilo, benzoilo e benzilcarbonilo. Os grupos "acilo" ilustrativos são -C(0)H, -C(O)-alquilo Ci-Cg, -C (O) - (CH2) t (arilo C6-Ci0) , -C (O) - (CH2) t (heteroarilo de 5-10 membros), -C (O) - (CH2) t (cicloalquilo C3-C10) e -C (O) - (CH2) t (heterocicloalquilo de 4-10 membros), em que t é um número inteiro desde 0 a 4. "Alcoxicarbonilo" refere-se a um radical -C(0)-0R27 em que R27 representa um alquilo Ci-Cs, 21 cicloalquilo C3-C10, cicloalquil C3-Cio-alquilo, heterocicloalquil de 4-10 membros-alquilo, aralquilo ou heteroarilalquilo de 5-10 membros como aqui definidos. Os grupos "alcoxicarbonilo" ilustrativos são C (O) O-alquilo Ci-C8, -C (O) O- (CH2) t (arilo C6-Ci0), -C(O)O-(CH2) t (heteroarilo de 5-10 membros), -C(0)0- (CH2) t (cicloalquilo C3-C10) e -C (O) O- (CH2) t (heterocicloalquilo de 4-10 membros), em que t é um número inteiro desde 1 a 4. "Alquilo" significa hidrocarboneto alifático linear ou ramificado possuindo 1 a 20 átomos de carbono. O alquilo particular tem 1 a 12 átomos de carbono. Mais particular é o alquilo inferior, o qual tem 1 a 6 átomos de carbono. Um grupo mais particular tem 1 a 4 átomos de carbono. Os grupos ilustrativos de cadeia linear incluem metilo, etilo, n-propilo e n-butilo. Ramificado significa que um ou mais grupos alquilo inferior, tais como metilo, etilo, propilo ou butilo, estão ligados a uma cadeia alquilo linear, os grupos de cadeia ramificada ilustrativos incluem isopropilo, iso-butilo, t-butilo e isoamilo. "Amino" refere-se ao radical -NH2. "Arilalquilo" refere-se a um grupo alquilo, como definido acima, substituído com um ou mais grupos arilo, como definido acima. Os grupos aralquilo ou arilalquilo particulares são grupos alquilo substituídos com um grupo arilo. "Arilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto aromático monovalente obtido pela remoção de um átomo de hidrogénio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parental. Em particular, arilo refere-se a uma estrutura de anel aromático, monocíclica ou policíclica que inclui desde 5 a 12 22 membros endocíclicos, mais geralmente 6 a 10. Quando o grupo arilo é um sistema de anel monocíclico, este contém, de um modo preferido, 6 átomos de carbono. Os grupos arilo típicos incluem, mas não estão limitados a, grupos derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno e trinaftaleno. Particularmente, os grupos arilo incluem fenilo, naftilo, indenilo e tetra-hidronaftilo. "Arilo Substituído" refere-se a um grupo arilo substituído com um ou mais dos grupos aqui especificados na definição de "substituído" e, particularmente, refere-se a um grupo arilo que pode estar opcionalmente substituído com 1 ou mais substituintes, por exemplo desde 1 a 5 substituintes, particularmente 1 a 3 substituintes, em particular 1 substituinte. Particularmente, "Arilo Substituído" refere-se a um grupo arilo substituído com um ou mais dos grupos seleccionado de halo, alquilo Ci-C8, haloalquilo Ci-C8, haloalcoxilo Ci-C8, ciano, hidroxilo, alcoxilo Ci-Cg e amino.
Os exemplos de arilos substituídos representativos incluem os seguintes
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Nestas fórmulas um de R49 e R50 pode ser hidrogénio e pelo menos um de R49 e R50 é, cada, independentemente seleccionado de alquilo Ci-Cs, heterocicloalquilo de 4-10 membros, alcanoílo, alcoxilo Ci-Cs, hetero-O-arilo, alquilamino, arilamino, heteroarilamino, NR51COR52, NR51SOR52 NR51S02R52, COOalquilo, COOarilo, CONR51R52, CONR51OR52, NR51R52, S02NR51R52, S-alquilo, SOalquilo, S02alquilo, Sarilo, SOarilo, S02arilo; ou R49 e R50 podem ser ligados para formar um anel ciclico (saturado ou insaturado) desde 5 a 8 átomos, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomos seleccionados do grupo N, O ou S. R51 e R52 são independentemente hidrogénio, alquilo Ci-Cs, haloalquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo de 4-10 membros, arilo C6-C10, arilo substituído, heteroarilo de 5-10 membros. "Cicloalquilo" refere-se a grupos hidrocarbilo cíclicos não aromáticos possuindo desde 3 a 10 átomos de carbono. Tais grupos cicloalquilo incluem, a título de exemplo, estruturas de um anel, tais como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e ciclooctilo. "Ciano" refere-se ao radical -CN. "Halo" ou "halogéneo" refere-se a fluoro (F) , cloro (Cl), bromo (Br) e iodo (I). Os grupos halo particulares são fluoro ou cloro. heteroarilo "Hetero" quando utilizado para descrever um composto ou um grupo presente num composto significa que um ou mais átomos de carbono no composto ou grupo foram substituídos por um heteroátomo de azoto, oxigénio ou enxofre. Hetero pode ser aplicado a qualquer dos grupos hidrocarbilo descritos acima, tais como alquilo, e. g., heteroalquilo, cicloalquilo, e. g., heterocicloalquilo, arilo, e. g., heteroarilo, cicloalcenilo, e. g., ciclo-heteroalcenilo, e semelhantes possuindo desde 1 a 5, e particularmente desde 1 a 3 heteroátomos. "Heteroarilo" significa uma estrutura de anel aromático, monociclica ou policiclica, que inclui um ou mais heteroátomos e 5 a 12 membros endociclicos, mais geralmente 5 a 10 membros endociclicos. O grupo heteroarilo pode ser, por exemplo, um anel monociclico de cinco membros ou seis membros ou uma estrutura biciclica formada a partir de anéis de cinco e seis membros fundidos ou dois anéis de seis membros fundidos ou, a titulo de um outro exemplo, dois anéis de cinco membros fundidos. Cada anel pode conter até quatro heteroátomos tipicamente seleccionados de azoto, enxofre e oxigénio. Tipicamente, o anel heteroarilo conterá até 4 heteroátomos, mais tipicamente até 3 heteroátomos, mais geralmente até 2, por exemplo um único heteroátomo. Numa forma de realização, o anel heteroarilo contém pelo menos um átomo de azoto endociclico. Os átomos de azoto nos anéis heteroarilo podem ser básicos, como no caso de um imidazole ou piridina, ou essencialmente não básicos como no caso de um azoto de índole ou pirrole. Em geral, o número de átomos de azoto básicos presentes no grupo heteroarilo, incluindo quaisquer grupos amino substituintes do anel, será inferior a cinco. Os exemplos de grupos heteroarilo monocíclicos de cinco membros incluem mas não estão limitados aos grupos pirrole, furano, tiofeno, imidazole, furazano, oxazole, oxadiazole, oxatriazole, isoxazole, tiazole, isotiazole, pirazole, triazole e tetrazole. Os exemplos de grupos heteroarilo monocíclicos de seis membros incluem mas não estão limitados a piridina, pirazina, piridazina, pirimidina e triazina. Exemplos particulares de grupos heteroarilo bicíclicos contendo um anel de cinco membros fundido com outro anel de cinco membros incluem mas não estão limitados a imidazotiazole e 25 imidazoimidazole. Exemplos particulares de grupos heteroarilo bicíclicos contendo um anel de seis membros fundido com um anel de cinco membros incluem mas não estão limitados aos grupos benzofurano, benzotiofeno, benzimidazole, benzoxazole, isobenzoxazole, benzisoxazole, benzotiazole, benzisotiazole, isobenzofurano, indole, isoindole, isoindolone, indolizina, indolina, isoindolina, purina (e. g., adenina, guanina), indazole, pirazolopirimidina, triazolopirimidina, benzodioxole e pirazolopiridina. Os exemplos particulares de grupos heteroarilo biciclicos contendo dois anéis de seis membros fundidos incluem mas não estão limitados aos grupos quinolina, isoquinolina, cromano, tiocromano, cromeno, isocromeno, cromano, isocromano, benzodioxano, quinolizina, benzoxazina, benzodiazina, piridopiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, ftalazina, naftiridina e pteridina. Os grupos heteroarilo particulares são aqueles derivados de tiofeno, pirrole, benzotiofeno, benzofurano, indole, piridina, quinolina, imidazole, oxazole e pirazina.
Os exemplos de arilos representativos possuindo heteroátomos contendo substituição incluem os seguintes:
Γ > em que cada W é seleccionado de C(R54)2, NR54, 0 e S; e cada Y é seleccionado de carbonilo, NR54, 0 e S; e R54 é independentemente hidrogénio, alquilo Ci-C8, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo de 4-10 membros, arilo Οβ-Οιο e heteroarilo de 5-10 membros. 26
Os exemplos de heteroarilos representativos incluem os seguintes:
em que cada Y é seleccionado de carbonilo, N, NR55, 0 e S; e R55 é independentemente hidrogénio, alquilo Ch-Cs, cicloalquilo C3-Ci0, heterocicloalquilo de 4-10 membros, arilo C6-Ci0 e heteroarilo de 5-10 membros.
Como aqui utilizado, o termo "heterocicloalquilo" refere-se a um anel heterociclico não aromático estável de 4-10 membros e/ou incluindo anéis contendo um ou mais heteroátomos independentemente seleccionados de N, O e S, fundidos com o mesmo. Um sistema de anel heterociclico fundido pode incluir anéis carbociclicos e têm de incluir apenas um anel heterociclico. Os exemplos de anéis heterociclicos incluem, mas não estão limitados a, morfolina, piperidina (e. g., 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo e 4-piperidinilo), pirrolidina (e. g., 1-pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo (2H-pirano ou di-hidrofurano, e 3-pirrolidinilo), pirrolidona, pirano 4H-pirano), di-hidrotiofeno, di-hidropirano, di-hidrotiazole, tetra-hidrofurano, 27 tetra-hidrotiofeno, dioxano, tetra-hidropirano (e. g., 4-tetra-hidropiranilo), imidazolina, imidazolidinona, oxazolina, tiazolina, 2-pirazolina, pirazolidina, piperazina e N-alquilpiperazinas tal como N-metilpiperazina. Outros exemplos incluem a tiomorfolina e os seus S-óxido e S,S-dióxido (particularmente tiomorfolina). Ainda outros exemplos incluem azetidina, piperidona, piperazona e N-alquilpiperidinas, tal como N-metilpiperidina. Exemplos particulares de qrupos heterocicloalquilo são mostrados nos exemplos ilustrativos seguintes:
em que cada W é seleccionado de CR56, C(R56>2, NR56, 0 e S; e cada Y é seleccionado de NR56, 0 e S; e R56 é independentemente hidrogénio, alquilo Ci-Cs, cicloalquilo C3-C10, heterocicloalquilo de 4-10 membros, arilo C6-C10, heteroarilo de 5-10 membros, Estes anéis heterocicloalquilo podem estar opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados do grupo consistindo de acilo, acilamino, aciloxilo (-O-acilo ou -0C(0)R ), alcoxilo, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino (-NR -alcoxicarbonilo ou -NH-C(O)-OR27) , amino, amino substituído, aminocarbonilo (amido ou -C(0)-NR"2), aminocarbonilamino (-NR-C (O)-NR"2), aminocarboniloxilo (-0-C (O)-NR'^) , aminossulf onilo, sulfonilamino, arilo, -O-arilo, azido, carboxilo, ciano, cicloalquilo, halogéneo, hidroxilo, nitro, tiol, -S-alquilo, 28 -S-arilo, -S(0)-alquilo, -S(0)-arilo, -S (0)2~alquilo e -S (0)2-arilo. Os grupos substituintes incluem carbonilo ou tiocarbonilo, os quais proporcionam, por exemplo, derivados de lactama e ureia.
Um técnico médio na matéria de síntese orgânica reconhecerá que o número máximo de heteroátomos num anel heterocíclico quimicamente exequível, estável, seja aromático ou não aromático, é determinado pelo tamanho do anel, pelo grau de insaturação e pela valência dos heteroátomos. Em geral, um anel heterocíclico pode ter um a quatro heteroátomos desde que o anel heteroaromático seja quimicamente exequível e estável. "Farmaceuticamente aceitável" significa aprovado ou merecedor de aprovação por uma agência reguladora do governo Federal ou do governo de um estado ou pela agência correspondente noutros países que não os Estados Unidos, ou que está listado na Farmacopeia dos E.U.A. ou noutra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais e, mais particularmente, em humanos. "Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal de um composto da invenção que é farmaceuticamente aceitável e que possui a actividade farmacológica desejada do composto parental. Em particular, tais sais que são não tóxicos podem ser sais de adição de ácido inorgânico ou orgânico e sais de adição de base. Especificamente, tais sais incluem: (1) sais de adição de ácido, preparados com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes; ou preparados com ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanóico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, 29 ácido láctico, ácido malónico, ácido succinico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido 1,2-etano-dissulfónico, ácido 2-hidroxietanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido 4-clorobenzenossulfónico, ácido 2-naftalenossulfónico, ácido 4-toluenossulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-l-carboxílico, ácido gluco-heptónico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido butil terciário-acético, ácido laurilsulfúrico, ácido glucónico, ácido glutâmico, ácido hidroxinaftóico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico e semelhantes; ou (2) sais preparados quando um protão ácido presente no composto parental é substituído por um ião de metal, e. g., um ião de metal alcalino, um ião alcalino-terroso ou um ião de alumínio; ou coordena com uma base orgânica, tais como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina e semelhantes. Os sais incluem ainda, apenas a título de exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio, tetraalquilamónio e semelhantes; e quando o composto contém uma funcionalidade básica, sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos, tais como cloridrato, bromidrato, tartarato, mesilato, acetato, maleato, oxalato e semelhantes. A expressão "catião farmaceuticamente aceitável" refere-se a um contra-ião catiónico aceitável de um grupo funcional ácido. Tais catiões são exemplificados pelos catiões de sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio, tetraalquilamónio e semelhantes. "Veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou transportador com o qual é administrado um composto da invenção. 30 "Profármacos" refere-se a compostos, incluindo derivados dos compostos da invenção, os quais têm grupos dissociáveis e que se convertem por solvólise ou sob condições fisiológicas nos compostos da invenção que são farmaceuticamente activos in vivo. Tais exemplos incluem, mas não estão limitados a, derivados de éster de colina e semelhantes, ésteres de N-alquilmorfolina e semelhantes. "Solvato" refere-se a formas do composto que estão associadas a um solvente, geralmente por uma reacção de solvólise. Esta associação fisica inclui a ligação de hidrogénio. Os solventes convencionais incluem água, etanol, ácido acético e semelhantes. Os compostos da invenção podem ser preparados, e. g.r na forma cristalina e podem ser solvatados ou hidratados. Os solvatos adequados incluem solvatos farmaceuticamente aceitáveis, tais como os hidratos, e incluem ainda solvatos estequiométricos e solvatos não estequiométricos. Em determinados casos, o solvato poderá ser isolado, por exemplo quando uma ou mais moléculas de solvente são incorporadas na rede cristalina do sólido cristalino. "Solvato" abrange solvatos em solução e isoláveis. Os solvatos representativos incluem hidratos, etanolatos e metanolatos. "Indivíduo" inclui humanos. Os termos "humano", "doente" e "indivíduo" são aqui utilizados indistintamente. "Quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade de um composto que, quando administrada a um indivíduo para o tratamento de uma doença, é suficiente para efectuar esse tratamento da doença. A "quantidade terapeuticamente eficaz" 31 pode variar dependendo do composto, da doença e sua gravidade, e da idade, peso, etc., do indivíduo a ser tratado. "Prevenir" ou "prevenção" refere-se a uma redução no risco de adquirir ou desenvolver uma doença ou distúrbio (i. e., que faz com que pelo menos um dos sintomas clínicos da doença não se desenvolva num indivíduo que pode estar exposto a um agente causador de doença ou predisposto à doença antes do aparecimento da doença. 0 termo "profilaxia" está relacionado com " prevenção", e refere-se a uma medida ou procedimento cuja finalidade é prevenir, e não tratar ou curar uma doença. Os exemplos não limitativos de medidas profilácticas podem incluir a administração de vacinas; a administração de heparina de baixo peso molecular a doentes hospitalizados em risco de trombose devido, por exemplo, a imobilização; e a administração de um agente antimalárico tal como cloroquina, antes de uma visita a uma região geográfica em que a malária é endémica ou o risco de contrair malária é alto. "Tratar" ou "tratamento" de qualquer doença ou distúrbio refere-se, numa forma de realização, à melhoria da doença ou distúrbio (i. e., paragem da doença ou redução da manifestação, extensão ou gravidade de pelo menos um dos sintomas clínicos da mesma). Noutra forma de realização "tratar" ou "tratamento" refere-se à melhoria de pelo menos um parâmetro físico, o qual pode não ser discernível pelo indivíduo. Ainda noutra forma de realização, "tratar" ou "tratamento" refere-se à modulação da doença ou distúrbio, fisicamente, (e. g., estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente, (e. g., estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Numa outra forma de realização, 32 "tratar" ou "tratamento" refere-se ao abrandamento da progressão da doença.
Como aqui utilizado a expressão "estado(s) que envolve(m) inflamação" refere-se ao grupo de estados que incluem artrite reumatóide, osteoartrite, artrite idiopática juvenil, psoriase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), doenças inflamatórias do intestino (e. g., doença de Crohn, colite), estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica) e doenças relacionadas envolvendo cartilagem, tal como as das articulações. Particularmente, o termo refere-se a artrite reumatóide, osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma) e doenças inflamatórias do intestino.
Como aqui utilizado a expressão "estado(s) que envolve(m) uma resposta imunológica" ou "doenças auto-imunes" são utilizados indistintamente e referem-se ao grupo de doenças que incluem doença obstrutiva das vias aéreas, incluindo condições, tais como COPD, asma (e. g., asma intrínseca, asma extrínseca, asma causada por poeira, asma infantil) particularmente asma crónica ou inveterada (por exemplo, asma tardia e hipersensibilidade das vias aéreas), bronquite, incluindo asma brônquica, lúpus eritematoso disseminado (SLE), esclerose múltipla, diabetes mellitus de tipo I e complicações associadas à mesma, eczema atópico (dermatite atópica) , dermatite de contacto e outras dermatites eczematosas, doença inflamatória do intestino (e. g., doença de Crohn e colite ulcerosa), aterosclerose e esclerose lateral amiotrófica. Particularmente, 33 o termo refere-se a COPD, asma, lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de tipo I e doença inflamatória do intestino.
Como aqui utilizado, a expressão "rejeição de transplante" refere-se à rejeição aguda ou crónica de alo- ou xenoenxertos de células, tecido ou órgão sólido, e. g., de ilhéus pancreáticos, células pluripotentes, medula óssea, pele, músculo, tecido da córnea, tecido neuronal, coração, pulmão, coração-pulmão combinados, rim, fígado, intestino, pâncreas, traqueia ou esófago, ou doenças do enxerto contra o hospedeiro.
Como aqui utilizado a expressão "doença(s) proliferativa(s)" refere-se a estados, tais como cancro (e. g., leiomiossarcoma uterino ou cancro da próstata), distúrbios mieloproliferativos (e. g.f policitemia vera, trombocitose essencial e mielofibrose), leucemia (e. g., leucemia mielóide aguda e leucemia linfoblástica aguda), mieloma múltiplo, psoríase, restenose, esclerodermia ou fibrose. Em particular, o termo refere-se a cancro, leucemia, mieloma múltiplo e psoríase.
Como aqui utilizado, o termo "cancro" refere-se a um crescimento maligno ou benigno de células na pele ou em órgãos do corpo, por exemplo mas sem limitação, mama, próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago ou intestino. Um cancro tem tendência a infiltrar-se no tecido adjacente e a espalhar-se (metastizar) para órgãos distantes, por exemplo para o osso, fígado, pulmão ou cérebro. Como aqui utilizado, o termo cancro inclui os tipos de células tumorais metastáticas, tais como mas não está limitados a, melanoma, linfoma, leucemia, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e mastocitoma e tipos de carcinoma tecidular, tais como mas não está limitado a, cancro colorrectal, cancro da próstata, cancro das células pequenas do pulmão e cancro das 34 cancro células não pequenas do pulmão, cancro da mama, pancreático, cancro da bexiga, cancro renal, cancro gástrico, glioblastoma, cancro primária do fígado, cancro do ovário, cancro da próstata e leiomiossarcoma uterino.
Como aqui utilizado o termo "leucemia" refere-se a doenças neoplásicas do sangue e órgãos formadores de sangue. Tais doenças podem provocar disfunção da medula óssea e sistema imunitário, o que torna o hospedeiro extremamente susceptível a infecção e sangramento. Em particular, o termo "leucemia" refere-se a leucemia mielóide aguda (AML) e leucemia linfoblástica aguda (ALL).
Como aqui utilizado a expressão "doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem" e especificamente "doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos" inclui estados, tais como osteoartrite, artrite psoriática, artrite reumatóide juvenil, artrite gotosa, artrite séptica ou infecciosa, artrite reactiva, distrofia simpática reflexa, algodistrofia, síndrome de Tietze ou condrite costal, fibromialgia, osteocondrite, artrite neurogénica ou neuropática, artropatia, formas endémicas de artrite como osteoartrite deformante endémica, doença de Mseleni e doença de Handigodu; degenerescência resultante de fibromialgia, lúpus eritematoso disseminado, esclerodermia e espondilite anquilosante.
Como aqui utilizado a expressão "malformação/malformações congénita(s) da cartilagem" inclui estados, tais como condrólise hereditária, condrodisplasias e pseudocondrodisplasias, em particular, mas sem limitação, microtia, anotia, condrodisplasia metafisária e distúrbios relacionados. 35
Como aqui utilizado a expressão "doença(s) associada(s) a hipersecreção de IL6" inclui estados, tais como a doença de Castleman, mieloma múltiplo, psoríase, sarcoma de Kaposi e/ou glomerulonefrite proliferativa mesangial. "Composto(s) do invenção", e expressões equivalentes, destinam-se a abranger compostos da fórmula Via como descritos acima, expressão essa que inclui os sais farmaceuticamente aceitáveis e os solvatos, e. g., hidratos, e os solvatos dos sais farmaceuticamente aceitáveis quando o contexto assim o permitir. Analogamente, a referência a intermediários, sejam ou não eles mesmos reivindicados, destina-se a abranger os seus sais, e solvatos, quando o contexto assim o permite.
Quando são aqui referidas gamas, a citação de uma gama deve ser considerada uma representação de cada membro da referida gama.
Outros derivados dos compostos da invenção têm actividade nas suas formas de ácido e derivado de ácido, mas a forma sensível de ácido oferece frequentemente vantagens de solubilidade, compatibilidade com o tecido ou libertação retardada no organismo do mamífero (ver, Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Os profármacos incluem derivados de ácido bem conhecidos para os profissionais da técnica, tais como, por exemplo, os ésteres preparados por reacção do ácido parental com um álcool adequado ou as amidas preparadas por reacção do composto ácido parental com uma amina substituída ou não substituída, ou anidridos de ácido ou anidridos mistos. Os ésteres, amidas e anidridos alifáticos ou aromáticos simples derivados de grupos ácidos fixados nos compostos desta invenção são profármacos 36 particularmente úteis. Em alguns casos é desejável preparar profármacos de tipo éster duplo, tais como ésteres de (aciloxi)alquilo ou ésteres de ((alcoxicarbonil)oxi)alquilo. Em particular, esses profármacos são ésteres de alquilo Ci a Cg, alcenilo C2-Cg, arilo, arilo substituído C7-C12 e arilalquilo C7-C12 dos compostos da invenção.
Como aqui utilizado, a expressão "variante isotópica" refere-se a um composto que contém proporções não naturais de isótopos em um ou mais dos átomos que constituem esse composto. Por exemplo, uma "variante isotópica" de um composto pode conter um ou mais isótopos não radioactivos, tais como por exemplo, deutério (2H ou D), carbono-13 (13C), azoto-15 (15N) ou semelhantes. Entender-se-á que, num composto em que é feita essa substituição isotópica, os seguintes átomos, quando presentes, podem variar pelo que, por exemplo, qualquer hidrogénio pode ser 2H/D, qualquer carbono pode ser 13C ou qualquer azoto pode ser 15N, e que a presença e colocação desses átomos podem ser determinadas dentro do conhecimento na matéria. Do mesmo modo, a invenção pode incluir a preparação de variantes isotópicas com radioisótopos no caso de, por exemplo, os compostos resultantes poderem ser utilizados em estudos de distribuição de fármaco e/ou substrato no tecido. Os isótopos radioactivos trítio, i. e., 3H, e carbono-14, i. e., 14C, são particularmente úteis para esta finalidade, dada a sua facilidade de incorporação e meios de detecção disponíveis. Além disso podem ser preparados compostos que estão substituídos com isótopos emissores de positroes, tais como C, F, 0 e N, e seriam uteis em estudos de Topografia de Emissão de Positrões (PET) para analisar a ocupação do receptor pelo substrato. 37
Toadas as variantes isotópicas dos compostos aqui proporcionados, radioactivas ou não, destinam-se a estar incluídas no âmbito da invenção. É também para ser entendido que os compostos que têm a mesma fórmula molecular mas diferem na natureza ou sequência de ligação dos seus átomos ou no arranjo espacial dos seus átomos são designados "isómeros". Os isómeros que diferem no arranjo espacial dos seus átomos são designados "estereoisómeros".
Os estereoisómeros que não são imagens no espelho um do outro são designados "diastereómeros" e aqueles que são imagens no espelho não sobreponíveis um do outro são designados "enantiómeros". Quando um composto tem um centro assimétrico, por exemplo, está ligado a quatro grupos diferentes, é possível um par de enantiómeros. Um enantiómero pode ser caracterizado pela configuração absoluta do seu centro assimétrico e é descrito pela regras de sequenciação R e S de Cahn e Prelog, ou pelo modo como a molécula roda o plano da luz polarizada e designado como dextrógiro ou levógiro (i. e., como os isómeros ( + ) ou (-) , respectivamente) . Um composto quiral pode existir como enantiómeros individuais ou como uma sua mistura. Uma mistura contendo proporções iguais dos enantiómeros é chamada de uma "istura racémica". "Tautómeros" refere-se a compostos que são formas intermutáveis de uma estrutura de composto particular e que variam na substituição de átomos de hidrogénio e electrões. Assim, duas estruturas podem estar em equilíbrio através do movimento de electrões π e um átomo (geralmente H) . Por exemplo, os enóis e cetonas são tautómeros porque se interconvertem rapidamente por tratamento com ácido ou base. Outro exemplo de 38 tautomerismo é as formas aci e nitro do fenilnitrometano, os quais se formam igualmente por tratamento com ácido ou base.
As formas tautoméricas podem ser relevantes para se conseguir a reactividade química e actividade biológica óptimas de um composto de interesse.
Os compostos desta invenção podem possuir um ou mais centros assimétricos; por conseguinte, tais compostos podem ser produzidos como as estereoisómeros (R) ou (S) individuais ou como as suas misturas.
Salvo indicação em contrário, a descrição ou designação de um composto particular na descrição e reivindicações pretende incluir os enantiómeros individuais e as suas misturas, racémicas ou outras. Os métodos para a determinação da estereoquímica e para a separação dos estereoisómeros são bem conhecidos na técnica.
OS COMPOSTOS A presente invenção baseia-se na identificação que os inibidores de JAK são úteis para o tratamento de doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou condições que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos 39 impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão) . Os inibidores de JAK podem também encontrar aplicação no tratamento de doenças proliferativas. Em particular, os inibidores de JAK encontram aplicação no tratamento de cancros, especialmente leucemias e tumores sólidos (e. g., leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata). Em particular, doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação e/ou inflamação, por exemplo osteoartrite. A presente invenção também proporciona métodos para a produção destes compostos, composições farmacêuticas compreendendo estes compostos e métodos de tratamento de doenças que envolvem a degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação e/ou inflamação através da administração de um composto da invenção. Os compostos podem ser inibidores de um ou mais membros da família JAK; especificamente, estes podem inibir a actividade de uma ou mais de JAK1, JAK2, JAK3 e/ou TYK2.
Por conseguinte, num primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um composto de acordo com a Fórmula Via: 40
Via
Numa forma de realização o composto da invenção não é uma variante isotópica.
Numa forma de realização, em relação à Fórmula Via, o composto é o composto 176 do Quadro 1.
Em determinados aspectos, a presente invenção também proporciona profármacos e derivados dos compostos de acordo com a fórmula Via acima. Os profármacos são derivados dos compostos da invenção que têm grupos metabolicamente dissociáveis e que se convertem por solvólise ou sob estados fisiológicos nos compostos da invenção, os quais são farmaceuticamente activos, in vivo. Tais exemplos incluem, mas não estão limitados a, derivados de éster de colina e semelhantes, ésteres de N-alquilmorfolina e semelhantes.
Outros derivados dos compostos da invenção têm actividade nas suas formas de ácido e derivado de ácido, mas a forma sensível de ácido oferece frequentemente vantagens de solubilidade, compatibilidade com o tecido ou libertação retardada no organismo do mamífero (ver, Bundgard, H., Design of 41
Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Os profármacos incluem derivados de ácido bem conhecidos para os profissionais da técnica, tais como, por exemplo, os ésteres preparados por reacção do ácido parental com um álcool adequado ou as amidas preparadas por reacção do composto ácido parental com uma amina substituída ou não substituída, ou anidridos de ácido ou anidridos mistos. Os ésteres, amidas e anidridos alifáticos ou aromáticos simples derivados de grupos ácidos fixados nos compostos desta invenção são profármacos preferidos. Em alguns casos é desejável preparar profármacos de tipo éster duplo, tais como ésteres de (aciloxi)alquilo ou ésteres de ((alcoxicarbonil)oxi)alquilo . Particularmente úteis são os ésteres de alquilo Ci a Cg, alcenilo C2-C8, arilo, arilo substituído C7-C12 e arilalquilo C7-C12 dos compostos da invenção.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
Quando utilizados como fármacos, os compostos da invenção são tipicamente administrados na forma de uma composição farmacêutica. Tais composições podem ser preparadas de um modo bem conhecido na técnica farmacêutica e compreendem pelo menos um composto activo. Geralmente, os compostos desta invenção são administrados numa quantidade farmaceuticamente eficaz. A quantidade do composto efectivamente administrada será tipicamente determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo o estado a ser tratado, a via de administração escolhida, o composto real administrado, a idade, peso e resposta do doente particular, da gravidade dos sintomas do doente e semelhantes.
As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por uma variedade de vias incluindo oral, rectal, transdérmica, subcutânea, intra-articular, intravenosa, 42 intramuscular e intranasal. Dependendo da via de administração pretendida, os compostos desta invenção são de um modo preferido formulados como composições injectáveis ou orais ou como unguentos, como loções ou como adesivos, todos para administração transdérmica.
As composições para administração oral podem tomar a forma de soluções ou suspensões liquidas a granel, ou pós a granel. No entanto, mais comummente, as composições são apresentadas em formas de dosagem unitária para facilitar a administração exacta. A expressão "formas de dosagem unitária" refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e outro mamíferos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente, veiculo ou transportador farmacêutico adequado. As formas de dosagem unitária típicas incluem ampolas ou seringas pré-medidas, pré-cheias das composições líquidas ou pílulas, comprimidos, cápsulas ou semelhantes no caso de composições sólidas. Nestas composições, o composto activo é geralmente um componente menor (desde cerca de 0,1 até cerca de 50% em peso ou de um modo preferido desde cerca de 1 até cerca de 40% em peso) sendo o remanescente vários veículos ou transportadores e auxiliares de processamento úteis para preparar a forma de administração desejada.
As formas líquidas adequadas para administração oral podem incluir um veículo aquoso ou não aquoso adequado com tampões, agentes de suspensão e distribuição, corantes, aromas e semelhantes. As formas sólidas podem incluir, por exemplo, quaisquer dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza semelhante: um aglutinante, tais como celulose 43 microcristalina, goma de tragacanta ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um desintegrante, tais como ácido alginico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante tal como estearato de magnésio; um deslizante tal como dióxido de silício coloidal; um edulcorante, tais como sacarose ou sacarina; ou um aromatizante, tais como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aromatizante de laranja.
As composições injectáveis baseiam-se tipicamente em soro fisiológico estéril injectável ou soro fisiológico tamponado com fosfato ou outros transportadores injectáveis conhecidos na técnica. Como atrás, o composto activo nestas composições é tipicamente um componente menor, correspondendo frequentemente desde cerca de 0,05 a 10% em peso, sendo o remanescente o transportador injectável e semelhantes.
As composições transdérmicas são tipicamente formuladas como uma pomada ou creme tópico contendo o(s) ingrediente(s) activo(s), geralmente numa quantidade que varia desde cerca de 0,01 até cerca de 20% em peso, de um modo preferido desde cerca de 0,1 até cerca de 20% em peso, de um modo preferido desde cerca de 0,1 até cerca de 10% em peso e de um modo mais preferido desde cerca de 0,5 até cerca de 15% em peso. Quando formulados como uma pomada, os ingredientes activos serão tipicamente combinados com uma base de pomada parafínica ou miscível com água. Alternativamente, os ingredientes activos podem ser formulados num creme com, por exemplo uma base de creme de óleo-em-água. Tais formulações transdérmicas são bem conhecidas na técnica e incluem geralmente ingredientes adicionais para melhorar a penetração dérmica ou estabilidade dos ingredientes activos ou formulação. Todas estas formulações 44 e ingredientes transdérmicos conhecidos estão incluídos no âmbito desta invenção.
Os compostos da invenção também podem ser administrados por um dispositivo transdérmico. Por conseguinte, a administração transdérmica pode ser conseguida utilizando um adesivo de tipo reservatório ou membrana porosa, ou de uma variedade de matriz sólida.
Os componentes descritos acima para as composições administráveis por via oral, administráveis por via injectável ou tópica são meramente representativos. Outros materiais bem como técnicas de processamento e semelhantes são definidos na Parte 8 de Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edição, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsilvania, a qual é aqui incorporada por referência.
Os compostos desta invenção também podem ser administrados em formas de libertação prolongada ou a partir de sistemas de administração de fármacos de libertação prolongada. Uma descrição de materiais de libertação prolongada representativos pode ser encontrada em Remington's Pharmaceutical Sciences.
Os exemplos de formulação que se seguem ilustram composições farmacêuticas representativas que podem ser preparadas de acordo com esta invenção. No entanto, a presente invenção não está limitada às composições farmacêuticas seguintes.
Formulação 1 - Comprimidos 45
Um composto da invenção pode ser misturado como um pó seco com um aglutinante de gelatina seco numa proporção aproximada de 1:2 em peso. É adicionada uma quantidade mais pequena de estearato de magnésio como um lubrificante. A mistura é transformada em comprimidos de 240-270 mg (80-90 mg de composto amida activo por comprimido) numa prensa de comprimidos.
Formulação 2 - Cápsulas
Um composto da invenção pode ser misturado como um pó seco com um diluente de amido numa proporção aproximada de 1:1 em peso. A mistura pode ser introduzida em cápsulas de 250 mg (125 mg de composto amida activo por cápsula).
Formulação 3 - Líquido
Um composto da invenção (125 mg), pode ser misturado com sacarose (1,75 g) e goma de xantana (4 mg) e a mistura resultante pode ser combinada, feita passar através de um peneiro de malha n° 10 U.S. e, em seguida, misturada com uma solução previamente preparada de celulose microcristalina e carboximetilcelulose sódica (11:89, 50 mg) em água. Benzoato de sódio (10 mg), aroma e cor são diluídos com água e adicionados sob agitação. Em seguida, pode ser adicionada água suficiente sob agitação. Depois é adicionada água suficiente para produzir um volume total de 5 mL.
Formulação 4 - Comprimidos
Um composto da invenção pode ser misturado como um pó seco com um aglutinante de gelatina seco numa proporção aproximada de 46 1:2 em peso. É adicionada uma quantidade mais pequena de estearato de magnésio como um lubrificante A mistura é transformada em comprimidos de 450-900 mg (150- -300 mg de composto amida activo) numa prensa de comprimidos.
Formulação 5 - Injecção
Um composto da invenção pode ser dissolvido ou suspenso num meio aquoso injectável de soro fisiológico tamponado estéril a uma concentração de aproximadamente 5 mg/mL.
Formulação 6 - Tópica Álcool estearílico (250 g) e uma vaselina branca (250 g) são fundidos a cerca de 75°C e, em seguida, é adicionada uma mistura de um composto da invenção (50 g) metilparabeno (0,25 g), propilparabeno (0,15 g) , laurilsulfato de sódio (10 g) e propileno glicol (120 g) dissolvidos em água (cerca de 370 g) e a mistura resultante é agitada até espessar.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
Os compostos da invenção podem ser utilizados como agentes terapêuticos para o tratamento de estados em mamíferos que estão causalmente relacionadas ou são atribuíveis à actividade de JAK aberrante. Em particular, estados relacionados com a actividade aberrante de uma ou mais de JAK1, JAK2, JAK3 e/ou TYK2. Por conseguinte, o composto da invenção e as composições farmacêuticas desta invenção encontram utilização como agentes terapêuticos para prevenir e/ou tratar doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou condições que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão). Os inibidores de JAK podem também encontrar aplicação no tratamento de doenças proliferativas. Em particular, os inibidores de JAK encontram aplicação no tratamento de cancros, especialmente leucemias e tumores sólidos (e. g., leiomiossarcoma uterino, cancro da próstata). Em particular os estados são seleccionados de estados inflamatórios, estados relacionados com degradação de cartilagem e/ou articulação em mamíferos incluindo humanos. Noutra forma de realização, os compostos e composições farmacêuticas desta invenção encontram utilização como agentes terapêuticos para prevenir e/ou tratar distúrbios proliferativos em mamíferos, incluindo humanos. Numa forma de realização específica o composto da invenção e as suas composições farmacêuticas encontram utilização como agentes terapêuticos para prevenir e/ou tratar cancro em mamíferos incluindo humanos.
Em aspectos adicionais de métodos de tratamento são divulgados métodos de tratamento de um mamífero susceptível a ou 48 que sofre de um estado que envolve uma resposta imunológica ou uma doença auto-imune. Os métodos compreendem a administração de uma quantidade eficaz para tratar o estado ou prevenir o estado de uma ou mais das composições farmacêuticas ou composto da invenção aqui descritos. Numa forma de realização especifica, a doença auto-imune é seleccionada de COPD, asma, lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de tipo I e doença inflamatória do intestino.
Noutro aspecto a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de um estado que envolve uma resposta auto-imune ou uma doença auto-imune. Numa forma de realização especifica, a doença auto-imune é seleccionada de COPD, asma, lúpus eritematoso disseminado, diabetes mellitus de tipo I e doença inflamatória do intestino.
Num aspecto de método de tratamento é divulgado um método de tratamento, prevenção ou profilaxia de um mamífero susceptível a ou que sofre de doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., um estado associado a ou doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos) , por exemplo, osteoartrite, artrite psoriática, artrite reumatóide juvenil, artrite gotosa, artrite séptica ou infecciosa, artrite reactiva, distrofia simpática reflexa, algodistrofia, síndrome de Tietze ou condrite costal, fibromialgia, osteocondrite, artrite neurogénica ou neuropática, artropatia, formas endémicas de artrite como osteoartrite deformante endémica, doença de Mseleni e doença de Handigodu; degenerescência resultante de fibromialgia, lúpus eritematoso 49 disseminado, esclerodermia e espondilite anquilosante, método esse que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a invenção, ou uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos.
Noutro aspecto a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., um estado associado a ou doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), por exemplo, osteoartrite, artrite psoriática, artrite reumatóide juvenil, artrite gotosa, artrite séptica ou infecciosa, artrite reactiva, distrofia simpática reflexa, algodistrofia, sindrome de Tietze ou condrite costal, fibromialgia, osteocondrite, artrite neurogénica ou neuropática, artropatia, formas endémicas de artrite como osteoartrite deformante endémica, doença de Mseleni e doença de Handigodu; degenerescência resultante de fibromialgia, lúpus eritematoso disseminado, esclerodermia e espondilite anquilosante. É também descrito um método de tratamento de malformações congénitas da cartilagem, incluindo condrólise hereditária, condrodisplasias e pseudocondrodisplasias, em particular, mas sem limitação, microtia, anotia, condrodisplasia metafisária e distúrbios relacionados, método esse que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente 50 aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de malformações congénitas da cartilagem, incluindo condrólise hereditária, condrodisplasias e pseudocondrodisplasias, em particular, mas sem limitação, microtia, anotia, condrodisplasia metafisária e distúrbios relacionados.
Noutro aspecto, é divulgado um método de tratamento de um mamífero susceptível a ou gue sofre de um estado gue envolve inflamação. Em aspectos adicionais de métodos de tratamento, são divulgados métodos de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de doenças e distúrbios que são mediados ou resultam em inflamação tais como, por exemplo artrite reumatóide e osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), e doenças relacionadas envolvendo cartilagem, tal como as das articulações, método esse que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos. Num aspecto específico, a condição que envolve inflamação é seleccionada de artrite reumatóide, osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma) e doenças inflamatórias do intestino. Os métodos compreendem administrar um quantidade eficaz para tratar o estado ou prevenir o estado de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos.
Noutro aspecto, esta invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente 51 aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de uma estado que envolve inflamação. Noutro aspecto a presente invenção proporciona um composto da invenção para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças e distúrbios que são mediados ou resultam em inflamação tais como, por exemplo artrite reumatóide e osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g. , insuficiência cardíaca crónica), e doenças relacionadas envolvendo cartilagem, tal como as das articulações. Numa forma de realização específica, o estado que envolve inflamação é seleccionado de artrite reumatóide, osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma) e doenças inflamatórias do intestino.
Noutros aspectos de método de tratamento são divulgados métodos de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de uma doença proliferativa, em particular cancro (e. g., tumores sólidos, tais como leiomiossarcoma uterino ou cancro da próstata), leucemia (e. g., AML ou ALL), mieloma múltiplo e/ou psoríase, métodos esses que compreendem administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos. Noutros aspectos de método de tratamento são divulgados métodos de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de cancro (e. g., tumores sólidos, tais como leiomiossarcoma uterino ou cancro da próstata) e/ou leucemias. 52
Noutro aspecto a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato f armaceut icamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de uma doença proliferativa, em particular cancro (e. g., tumores sólidos, tais como leiomiossarcoma uterino ou cancro da próstata), leucemia (e. g., AML ou ALL), mieloma múltiplo e/ou psoriase. Noutro aspecto a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de cancro (e. g, tumores sólidos, tais como leiomiossarcoma uterino ou cancro da próstata) e/ou leucemias.
Noutros aspectos de método de tratamento são divulgados métodos de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de doenças associadas a hipersecreção de IL6, em particular doença de Castleman ou glomerulonefrite proliferativa mesangial, métodos esses que compreendem administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos.
Noutro aspecto a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato f armaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças associadas a hipersecreção de IL6, em particular doença de Castleman ou glomerulonefrite proliferativa mesangial.
Noutros aspectos de método de tratamento são divulgados métodos de tratamento de um mamífero susceptível a ou que sofre de rejeição de transplante, métodos esses que compreendem 53 administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos aqui descritos. Numa forma de realização especifica são divulgados métodos de tratamento de rejeição de transplante de órgão.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato f armaceut icamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de rejeição de transplante. Num aspecto especifico são divulgados métodos de tratamento de rejeição de transplante de órgão.
Como um outro aspecto da invenção é proporcionado um composto de fórmula Via, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, para ser utilizado como um fármaco especialmente no tratamento ou prevenção dos estados e doenças supramencionadas. É também aqui proporcionada a utilização de um composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um dos estados e doenças supramencionadas.
Um regime particular do presente método compreende a administração a um indivíduo que sofre de uma doença que envolve inflamação, de uma quantidade eficaz de um composto da invenção durante um intervalo de tempo suficiente para reduzir o nível de inflamação no doente e, de um modo preferido, terminar, os processos responsáveis pela referida inflamação. Uma forma de realização especial do método compreende administrar uma quantidade eficaz de um composto da invenção a um doente objecto 54 que sofre ou está susceptível ao desenvolvimento de artrite reumatóide, durante um intervalo de tempo suficiente para reduzir ou prevenir, respectivamente, a inflamação nas articulações do referido doente e, de um modo preferido, terminar, os processos responsáveis pela referida inflamação.
Um outro regime particular do presente método compreende a administração a um indivíduo que sofre de um estado patológico caracterizado por degradação de cartilagem ou articulação (e. g., osteoartrite) de uma quantidade eficaz de um composto da invenção durante um intervalo de tempo suficiente para reduzir e, de um modo preferido, terminar os processos auto-perpetuantes responsáveis pela referida degradação. Uma forma de realização especial do método compreende administrar uma quantidade eficaz de um composto da invenção a um doente objecto que sofre ou está susceptível ao desenvolvimento de osteoartrite, durante um intervalo de tempo suficiente para reduzir ou prevenir, respectivamente, a degradação de cartilagem nas articulações do referido doente e, de um modo preferido terminar, os processos auto-perpetuantes responsáveis pela referida degradação. Numa forma de realização particular os referidos compostos exibem propriedades anabólicas e/ou anticatabólicas de cartilagem.
Os níveis de dose de injecção variam desde cerca de 0,1 mg/kg/hora até pelo menos 10 mg/kg/hora, todos durante cerca de 1 até cerca de 120 horas e especialmente 24 a 96 horas. Pode também ser administrado um bolus de pré-condicionamento de cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg ou mais para conseguir níveis de estado estacionário adequados. Prevê-se que a dose total máxima não exceda cerca de 2 g/dia para um doente humano de 40 a 80 kg. 55
Para a prevenção e/ou tratamento de estados de longa duração, tais como estados degenerativos, o regime de tratamento estende-se geralmente ao longo de muitos meses ou anos, pelo que é preferida administração oral para conveniência e tolerância pelo doente. Na administração oral, uma até cinco e especialmente duas até quatro e tipicamente três doses orais por dia são regimes representativos. Ao utilizar estes padrões de administração, cada dose proporciona desde cerca de 0,01 até cerca de 20 mg/kg do composto da invenção, com doses particulares a proporcionar cada desde cerca de 0,1 até cerca de 10 mg/kg e especialmente cerca de 1 até cerca de 5 mg/kg.
As doses transdérmicas são geralmente seleccionadas para proporcionar níveis sanguíneos semelhantes ou inferiores aos que são conseguidos utilizando doses injectáveis.
Quando utilizados para prevenir o início de um estado inflamatória, os compostos desta invenção serão administrados a um doente em risco de desenvolver o estado, tipicamente a conselho e sob a supervisão de um médico, aos níveis de dosagem descritos acima. Os doentes em risco de desenvolver um estado particular incluem geralmente aqueles que têm um passado familiar do estado ou aqueles que foram identificados por ensaios genéticos ou rastreios como sendo particularmente susceptíveis a desenvolver a condição.
Os compostos desta invenção podem ser administrados como o único agente activo ou podem ser administrados em associação com outros agentes, incluindo outros compostos que exibem a mesma ou uma actividade terapêutica semelhante, e que se determina que são seguros e eficazes para essa administração associada. Numa forma de realização específica, a co-administração de dois (ou 56 mais) agentes permite doses significativamente menores de cada a ser utilizado, reduzindo desse modo os efeitos secundários observados.
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de uma doença que envolve inflamação; os agentes particulares incluem, mas não estão limitados a, agentes imunorreguladores, e. g., azatioprina, corticosteróides (e. g., prednisolona ou dexametasona), ciclofosfamida, ciclosporina A, tacrolimus, Micofenolato de Mofetil, muromonab-CD3 (0KT3, e. g., Orthocolone®) , ATG, aspirina, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno e piroxicam.
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de artrite (e. g., artrite reumatóide); os agentes particulares incluem mas não estão limitados a analgésicos, fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSSIDA), esteróides, DMARDS sintéticos (por exemplo, mas sem limitação, metotrexato, leflunomida, sulfassalazina, auranofina, aurotiomalato de sódio, penicilamina, cloroquina, hidroxicloroquina, azatioprina e ciclosporina) e DMARDS biológicos (por exemplo, mas sem limitação Infliximab, Etanorcept, Adatimumab, Rituximab e Abatacept).
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios proliferativos; os agentes particulares incluem mas não estão limitados a: metotrexato, leucovorina, adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, paclitaxel, docetaxel, vincristina, 57 vinblastina, vinorrelbina, doxorrubicina, tamoxifeno, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozole, goserrelina, anticorpo monoclonal anti-HER2 (e. g., Herceptin(TM)), capecitabina, cloridrato de raloxifeno, inibidores de EGFR (e. g., Iressa (R), Tarceva(TM), Erbitux(TM)), inibidores de VEGF (e. g.r Avastin(TM)), inibidores de proteassoma (e. g., Velcade(TM)), Glivec (R) ou inibidores de hsp90 (e. g., 17-AAG). Adicionalmente, um composto da invenção pode ser administrado em associação com outras terapias incluindo, mas não estando limitadas a, radioterapia ou cirurgia. Numa forma de realização especifica, o distúrbio proliferativo é seleccionado de cancro, doença mieloproliferativa ou leucemia.
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de doenças auto-imunes, os agentes particulares incluem mas não estão limitados a: glucocorticóides, agentes citostáticos (e. g., análogos de purina), agentes alquilantes, (e. g.f mostardas de azoto (ciclofosfamida), nitrosoureias, compostos de platina e outros), antimetabolitos (e. g., metotrexato, azatioprina e mercaptopurina), antibióticos citotóxicos (e. g., dactinomicina antraciclinas, mitomicina C, bleomicina e mitramicina), anticorpos (e. g., anticorpos monoclonais anti-CD20, anti-CD25 ou anti-CD3 (0TK3), Atgam® e Thymoglobulme ) , ciclosponna, tacrolimus, rapamicina (sirolimus), interferões (e. g., IFN-β), proteínas de ligação ao TNF (e. g., infliximab (Remicade), etanorcept (Enbrel) ou adalimumab (Humira)), micofenolato, Fingolimod, Miriocina.
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de rejeição de transplante, os agentes 58 particulares incluem mas não estão limitados a: inibidores de calcinourina (e. g., ciclosporina ou tacrolimus (FK506)), inibidores de mTOR (e. g., sirolimus, everolimus), antiproliferativos (e. g., azatioprina, ácido micofenólico), corticosteróides (e. g., prednisolona, hidrocortisona), Anticorpos (e. g., anticorpos monoclonais anti-receptor de IL-2Rcx, basiliximab, daclizumab) , anticorpos policlonais anti-células T (e. g., anti-globulina de timócitos (ATG), anti-globulina de linfócitos (ALG)).
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de Asma e/ou Rinite e/ou COPD, os agentes particulares incluem mas não estão limitados a: agonistas dos receptores adrenérgicos beta2 (e. g., salbutamol, levalbuterol, terbutalina e bitolterol), epinefrina (inalada ou comprimidos), anticolinérgicos (e. g., brometo de ipratrópio), glucocorticóides (orais ou inalados) agonistas de β2 de acção prolongada (e. g., salmeterol, formoterol, bambuterol e albuterol oral de libertação prolongada), associações de esteróides inalados e broncodilatadores de acção prolongada (e. g., fluticasona/salmeterol, budesonida/formoterol), antagonistas e inibidores de síntese de leucotrienos (e. g., montelucaste, zafirlucaste e zileuton), inibidores de libertação de mediador (e. g., cromoglicato e cetotifeno), reguladores biológicos da resposta de IgE (e. g., omalizumab) , anti-histamínicos (e. g., ceterizina, cinarizina, fexofenadina), vasoconstritores (e. g., oximetazolina, xilometazolina, nafazolina e tramazolina).
Adicionalmente, o composto da invenção pode ser administrado em associação com terapias de emergência para asma 59 e/ou COPD, tais terapias incluem administração de oxigénio ou heliox, salbutamol nebulizado ou terbutalina (opcionalmente combinada com um anticolinérgico (e. g., ipratrópio), esteróides sistémicos (orais ou intravenosos, e. g., prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona ou hidrocortisona), salbutamol intravenoso, beta-agonistas não específicos, injectados ou inalados (e. g., epinefrina, isoetarina, isoproterenol, metaproterenol), anticolinérgicos (IV ou nebulizados, e. g., glicopirrolato, atropina, ipratrópio), metilxantinas (teofilina, aminofilina, bamifilina), anestésicos por inalação gue têm um efeito broncodilatador (e. g., isoflurano, halotano, enflurano) , cetamina, sulfato de magnésio intravenoso.
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de IBD, os agentes particulares incluem mas não estão limitados a: glucocorticóides (e. g., prednisona, budesonida) agentes imunomoduladores sintéticos modificadores de doença (e. g., metotrexato, leflunomida, sulfassalazina, messalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina e ciclosporina) e agentes imunomoduladores biológicos modificadores de doença (infliximab, adalimumab, rituximab e abatacept).
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de SLE, os agentes particulares incluem mas não estão limitados a: fármacos anti-reumáticos modificadores de doença (DMARDs), tais como antimaláricos (e. g., plaguenil, hidroxicloroguina), imunossupressores (e. g., metotrexato e azatioprina), ciclofosfamida e ácido micofenólico; fármacos imunossupressores e analgésicos, tais como fármacos 60 opiáceos (e. g., (e. g., hidrocodona, adesivo transdérmico esteróides, anti-inflamatórios não esteróides, dextropropoxifeno e co-codamol), opióides oxicodona, MS Contin ou metadona) e o Duragesic de fentanilo.
Numa forma de realização, o composto da invenção é co-administrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou prevenção de psoríase, os agentes particulares incluem mas não estão limitados a: tratamentos tópicos, tais como soluções de banho, hidratantes, cremes e pomadas medicados contendo alcatrão de carvão, ditranol (antralina), corticosteróides como desoximetasona (Topicort), fluocinonida, análogos de vitamina D3 (por exemplo, calcipotriol), óleo e retinóides de Argão (etretinato, acitretina, tazaroteno), tratamentos sistémicos, tais como metotrexato, ciclosporina, retinóides, tioguanina, hidroxiureia, sulfassalazina, micofenolato de mofetil, azatioprina, tacrolimus, ésteres de ácido fumárico ou produtos biológicos, tais como Amevive, Enbrel, Humira, Remicade, Raptiva e ustecinumab (um bloqueador de IL-12 e IL-23). Adicionalmente, um composto da invenção pode ser administrado em associação com outras terapias incluindo, mas não estando limitadas a fototerapia ou fotoquimioterapia (e. g., psoraleno e fototerapia de ultravioleta A (PUVA)).
Por co-administração é incluído qualquer meio de administração de dois ou mais agentes terapêuticos ao doente como parte do mesmo regime de tratamento, como será evidente para o especialista. Apesar de os dois ou mais agentes poderem ser administrados simultaneamente numa única formulação, isto não é essencial. Os agentes podem ser administrados em formulações diferentes e em alturas diferentes. 61
PROCEDIMENTOS SINTÉTICOS GERAIS
Geral 0 composto de Fórmula Via, ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável ou um solvato do seu sal farmaceuticamente aceitável, pode ser preparado a partir de materiais de partida prontamente disponíveis utilizando os métodos e procedimentos gerais que se seguem. Entender-se-á que onde são dadas condições de processo típicas ou preferidas (i. e. temperaturas de reacção, tempos, proporções molares de reagentes, solventes, pressões, etc.) também podem ser utilizadas outras condições de processo, salvo indicação em contrário. As condições reaccionais óptimas podem variar com os reagentes particulares ou solvente utilizado, mas tais condições podem ser determinadas por um especialista na técnica através de procedimentos de optimização de rotina.
Adicionalmente, como será evidente para os especialistas na técnica, podem ser necessários grupos de protecção convencionais para impedir que certos grupos funcionais sofram reacções indesejadas. A escolha de um grupo de protecção adequado para um grupo funcional particular, bem como as condições adequadas para protecção e desprotecção são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, numerosos grupos de protecção, e a sua introdução e remoção, são descritos em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Segunda Edição, Wiley, Nova Iorque, 1991, e referências ali citadas.
Os métodos que se seguem são apresentados com detalhes no que se refere à preparação de biciclo-heteroarilos 62 representativos que foram listados acima. Os compostos da invenção podem ser preparados a partir de materiais de partida e reagentes conhecidos ou comercialmente disponíveis por um especialista na técnica de síntese orgânica.
Todos os reagentes foram de tipo comercial e foram utilizados como recebidos sem mais purificação, salvo indicação em contrário. Foram utilizados solventes anidros comercialmente disponíveis para as reacções realizadas sob atmosfera inerte. Foram utilizados solventes de tipo reagente em todos os outros casos, salvo indicação em contrário. A cromatografia em coluna foi realizada sobre sílica gel 60 (35-70 pm) . A cromatografia em camada fina foi realizada utilizando placas de sílica gel F-254 pré-revestidas (espessura 0,25 mm). Os espectros de RMN foram registados num espectrómetro de RMN Bruker DPX 400 (400 MHz). Os desvios químicos (δ) para os espectros de RMN de 1H são relatados em partes por milhão (ppm) relativamente ao tetrametilsilano (δ 0,00) ou ao pico de solvente residual apropriado, i. e. CHCI3 (δ 7,27), como referência interna. As multiplicidades são dadas como singleto (s), dupleto (d), tripleto (t), quarteto (q), multipleto (m) e largo (1). As constantes de acoplamento (J) são dadas em Hz. Os espectros de MS de electrosspray foram obtidos num espectrómetro de LC/MS Platform da Micromass. Coluna utilizada em todas as análises de LCMS: Waters Acquity UPLC BEH Cl8 1,7 pm, 2,1 mm ID X 50 mm L (N° de Consumível 186002350)). HPLC preparativa: Waters XBridge Prep C18 5 pm ODB 19 mm ID x 100 mm L (N° de Consumível 186002978). Todos os métodos utilizam gradientes de MeCN/H20. A H20 contém 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3.
Lista de abreviaturas utilizadas na secção experimental: 63 DCM Diclorometano DiPEA N, iV-diisopropiletilamina MeCN Acetonitrilo BOC terc-Butiloxi-carbonilo DMF N, iV-dimetilf ormamida TFA Ácido trifluoroacético THF Tetra-hidrofurano RMN Ressonância Magnética Nuclear DMSO Dimetilsulfóxido DPPA Azida de difenilfosforilo LC-MS Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa Ppm partes por milhão AcOEt acetato de etilo APCI ionização química à pressão atmosférica Tr tempo de retenção s singuleto s 1 singuleto largo m multipleto d dupleto PdCl2ppf [1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno] dicloropaládio(II) TEA Trietilamina
Preparação Sintética de Compostos de Fórmula I e Fórmula Via
Um composto de Fórmula I pode ser produzido de acordo com o esquema seguinte. 64 Método Geral de Síntese
Esquema 1
nh2oh.hci ;Pr2NEt EtOH/MeOH Δ
1.RC0CI, Et3N 2. NH3 / MeOH CH3CN, 20 °C 20 °C
2a 3b 4b em que Ar é Cyl-Ll-(CR4bR4c) ni-R3b; e Cyl, Ll, são como aqui descritos.
nl, R
R
R
e R 4c 65
Geral 1.1.1 l-(6-Bromo-piridin-2-il)-3-carboetoxi- tioureia (2)
Br' S OEt ΑΛ
Η H (2) A uma solução de 2-amino-6-bromopiridina (1) (253,8 g,
1,467 mol) em DCM (2,5 L) arrefecida até 5 °C é adicionado, gota a gota, isotiocianato de etoxicarbonilo (173,0 mL, 1,467 mol) ao longo de 15 min. A mistura reaccional é, em seguida, deixada aquecer até à temp. ambiente (20 °C) e agitada durante 16 h. A evaporação in vacuo dá um sólido que pode ser recolhido por filtração, exaustivamente lavado com éter de petróleo (3 x 600 mL) e seco ao ar para proporcionar (2). A tioureia pode ser utilizada tal e qual no passo seguinte sem qualquer purificação. ΤΗ (400 MHz, CDCI3) δ 12,03 (1H, s 1, NH), 8,81 (1H, d, J 7,8 Hz, H-3), 8,15 (1H, s 1, NH), 7,60 (1H, t, J 8,0 Hz, H-4), 7,32 (1H, dd, J 7,7 e 0,6 Hz, H-5), 4,31 (2H, q, J 7,1 Hz, CH2), 1,35 (3H, t, J 7,1 Hz, CH3). 66 1.1.2 ilamina (3) 5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1,5~a]piridin-2-
A uma suspensão de cloridrato de hidroxilamina (101,8 g, 1,465 mol) em EtOH/MeOH (1:1, 900 mL) é adicionada
NfN-diisopropiletilamina (145,3 mL, 0, 879 mol) e a mistura é agitada à temp. ambiente (20 °C) durante 1 h. Em seguida, pode ser adicionada 1-(6-bromo-piridin-2-il)-3-carboetoxi- tioureia (2) (89,0 g, 0, 293 mol) e a mistura lentamente aquecida até refluxo (Nota: é necessário um depurador de lixivia para desactivar o H2S libertado) . Após 3 h a refluxo, a mistura é deixada arrefecer e filtrada para recolher o sólido precipitado. Pode ser recolhido mais produto por evaporação in vacuo do filtrado, adição de H20 (250 mL) e filtração. Os sólidos combinados são sucessivamente lavados com H20 (250 mL) , EtOH/MeOH (1:1, 250 mL) e Et20 (250 mL) , em seguida, secos in vacuo para proporcionar o derivado de triazolopiridina (3) como um sólido. O composto pode ser utilizado tal e qual no passo seguinte sem qualquer purificação. 1R (400 MHz, DMSO-ch) δ 7,43-7,34 (2H, m, 2 x H aromático), 7,24 (1H, dd, J 6,8 e 1,8 Hz, H aromático), 6,30 (2H, 1, NH2); m/z 213/215 (1:1, M+H+, 100%). 67 1.1.3
Procedimento geral de mono-acilação para proporcionar intermediário (4):
Br A uma solução do 2-amino-triazolopiridina (3) (7,10 g, 33,3 mmol) em CH3CN seco (150 mL) a 5 °C é adicionada Et3N (11,6 mL, 83,3 mmol), seguida do cloreto de ácido apropriado (83,3 mmol). A mistura reaccional é, em seguida, deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada até ser consumido todo o material de partida (3) . Se necessário pode ser adicionada mais Et3N (4,64 mL, 33,3 mmol) e cloreto de ácido (33,3 mmol) para garantir reacção completa. Após evaporação do solvente in vacuo o resíduo resultante é tratado com solução metanólica de amónia 7 N (50 mL) e agitado à temp. ambiente (durante 1-16 h) para hidrolisar qualquer produto bis-acilado. O isolamento do produto é feito por remoção dos voláteis in vácuo, seguido de trituração com Et2O (50 mL). Os sólidos podem ser recolhidos por filtração, lavados com H20 (2x50 mL) , acetona (50 mL) e Et20 (50 mL) , em seguida, secos in vacuo para dar o intermediário acilo necessário (4) . Em alguns casos pode ser necessária cromatografia em coluna (éter de petróleo/AcOEt) para obter compostos puros. 68
Método A 1.1.4 Preparaçao de compostos de Fórmula I via acoplamento de Suzuki (5):
Um ácido borónico apropriado (2eq.) é adicionado a uma solução do intermediário bromo (4) em 1,4-dioxano/água (5:1). São adicionados K2CO3 (2 eq.) e PdCÍ2dppf (5%) à solução. A mistura resultante é, em seguida, aquecida num microondas a 140 °C durante 30 min (Esta reacção também pode ser realizada por aquecimento tradicional num banho de óleo a 90 °C durante 16 h sob N2) · É adicionada água e a solução é extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas são secas sobre MgS04 e evaporadas in vacuo. O composto final é obtido após purificação por cromatografia flash.
Método C ^ 4a t~v 4b em que R , R ,
R 4c R3b e nl sao como aqui descritos. 69
Reacçao de alquilaçao (Método Geral)
°^(CR4bR4c)n1-R3b A [5-(4-hidroxi-fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2-il]-amida do ácido ciclopropanocarboxílico (1,1 eq) obtida pelo Método A e K2CO3 (5 eq) (ou AgC03) são dissolvidos em DMF sob N2 e é adicionado, gota a gota, o agente alquilante apropriado (1,1 eq) . A suspensão resultante é aquecida a 50 °C durante 16 h. Após este tempo, a reacção está concluída. O composto é extraído com AcOEt e água, lavado com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e seco sobre MgS04. As camadas orgânicas são filtradas e evaporadas. O composto final é isolado por HPLC preparativa. HPLC preparativa: Waters XBridge Prep C18 5 pm ODB 19 mm ID x 100 mm L (N° de Consumível 186002978) . Todos os métodos utilizam gradientes de MeCN/H20. A H20 contém 0,1% de TFA ou 0,1 % de NH3. 70
Método E
em que R4a, R4b, R4c, R3b e nl sao como aqui descritos.
Aminação redutiva (Método Geral)
0 aldeído apropriado (2 eq.), o derivado de anilina (1 eq.) obtido pelo Método A e Ti(OPr)4 são misturados e agitados à temperatura ambiente durante 3 h. A mistura é diluída em etanol e foi adicionado Na(CN)BH3 (1 eq.). A solução resultante é agitada à temperatura ambiente durante 16 h. A mistura é diluída em água e filtrada. 0 filtrado é lavado com etanol. As fases de solvente combinadas são evaporadas sob vácuo. 0 composto final é isolado por HPLC preparativa. HPLC preparativa: Waters XBridge Prep C18 5 pm ODB 19 mm ID x lOOmm L (N° de Consumível 186002978). Todos os métodos utilizam gradientes de MeCN/H20. A H20 contém 0,1% de TFA ou 0,1 % de NH3. 71
Método F
em que Ar é Cyl-Ll-(CR4bR4c) m-R3b; e Cyl, Ll, como aqui descritos. N-(5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]piridin-2-il)-acetamida
A uma solução de 5-bromo-2-amino-triazolopiridina (1 eq.) em CH3CN seco a 5 °C é adicionada Et3N (2,5 eq.), seguida de cloreto de acetilo (2,5 eq.). A mistura reaccional é, em seguida, deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada até ser consumido todo o material de partida. Se necessário, são adicionados mais Et3N (1 eq.) e cloreto de ácido (1 eq.) para garantir reacção completa. Após evaporação do solvente in vacuo o resíduo resultante é tratado com solução metanólica de amónia 7 N e agitado à temp. ambiente (durante 16 h) para hidrolisar qualquer produto bis-acilado. 0 isolamento do produto é feito por remoção de voláteis in vacuo, seguido de adição de água e extracção com acetato de etilo. A fase orgânica é, em seguida, seca sobre MgS04 e evaporada in vacuo. 0 composto é utilizado sem mais purificação. 72
Reacção de Suzuki (Método Geral)
N 0 0 ácido borónico (2eq.) é adicionado a uma solução de N-(5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il)-acetamida em 1,4-dioxano/água (5:1). São adicionados K2CO3 (2 eq.) e
Pd(dppf)Cl2 (5%) (dppf = 1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno) à solução. A mistura resultante é, em seguida, aquecida num estufa de microondas (CEM discover) num tubo selado a 140 °C durante 30 min. É adicionada água e a solução é extraída com acetato de etilo. As camadas orgânicas são secas sobre MgS04 e evaporadas in vacuo. O composto final é obtido após purificação por HPLC preparativa. Analítica: Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 pm, 2,1 mm ID X 50 mm L (N° de Consumível 186002350). HPLC preparativa: Waters XBridge Prep C18 5pm ODB 19 mm ID x 100 mm L (N° de Consumível 186002978). Todos os métodos utilizam gradientes de MeCN/H20. A H20 contém 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3. 73
Método L
L.l Substituição nucleófila aromática (método geral)
R^R43 A {5-[4-(6-cloro-piridin-3-ilmetoxi)-fenil]- [1,2, 4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il}-amida do ácido ciclopropanocarboxílico preparado pelo método C (1 eq) , uma amina apropriada, (1,5 eq.) são misturados em DMSO num tubo selado. A reacção é aquecida a 100 °C durante 24 horas. Uma vez desaparecido todo o MP por LCMS, é adicionada água à mistura reaccional e os orgânicos são extraídos com acetato de etilo. A camada orgânica é seca sobre MgS04 e evaporada sob vácuo. 0 74 composto final é isolado por HPLC preparativa. Analítica: Waters Acquity UPLC BEH C18 1,7 pm, 2,1 mm ID X 50 mm L (N° de Consumível 186002350) HPLC preparativa: Waters XBridge Prep C18 5 pm ODB 19 mm ID x 100 mm L (N° de Consumível 186002978) . Todos os métodos utilizam gradientes de MeCN/H20. A H2O contém 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3.
Método N
OH ,Ο
O
Cl, Br
CN N.1 {5-[4-(Nitril-arilmetoxi)fenil]-[1,2, 4]triazolo[1, 5 a]piridin-2-il}-amida do ácido ciclopropanocarboxílico
.0 r
CN 75 É adicionado Pd(PPh3)4 (0,04 mmol) a solução desgaseifiçada de {5-[4-(haloaril-3-ilmetoxi)-fenil]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2-il}-amida do ácido ciclopropanocarboxilico preparado pelo método B (0,24 mmol) e Zn(CN)2 (0,24 mmol) em DMF (1 mL) . A mistura reaccional é exposta a radiação de microondas (W:150 W; T: 150 °C) durante 30 min. A mistura é diluída com acetato de etilo e lavada com água. A camada orgânica é seca sobre MgS04, filtrada e o solvente é removido sob vácuo. O composto é purificado por HPLC preparativa para proporcionar o produto (30% a 50%). Síntese de compostos representativos de Fórmula I e do composto de Fórmula Via
Composto de comparação 57: [5- (6-Benziloxi-piridin-3-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il]-amida do ácido ciclopropanocarboxilico
A 0 °C e sob atmosfera de N2, álcool benzílico (2 eq) numa solução de THF foi tratado com NaH a 60% em óleo mineral (4 eq) durante 30 min. Em seguida, foi adicionada [ 5-(6-cloro-piridin-3-il)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il]-amida do ácido 76 ciclopropanocarboxílico preparado pelo método A à solução e a mistura foi agitada a 70 °C durante 3 horas. A reacção foi concluída. A mistura reaccional foi desactivada com água e o composto foi extraído com AcOEt. O composto foi lavado com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seco sobre MgS04, filtrado e concentrado. O composto foi purificado por HPLC Prep.
Composto 176: N- (5- (4- ((6-cianopiridin-3-il)metoxi)fenil)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il)ciclopropanocarboxamida 176.1: Síntese de 5-[4-(4, 4, 5, 5-Tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenoximetil]-piridina-2-carbonitrilo
O. .0 B
A éster pinacolílico do ácido 4-hidroxifenilborónico (25 g; 0,llmol; 1,0 equiv.) em acetona (250 mL) à temperatura ambiente foram adicionados sob árgon 5-clorometil-piridina-2-carbonitrilo (19 g; 0,12 mol; 1,1 equiv.) e carbonato de césio (73,9 g, 0,22 mol; 2 equiv.). A mistura reaccional foi aquecida durante 4 horas a refluxo. A mistura foi então arrefecida até à temperatura ambiente, a acetona foi evaporada. Foi adicionada água (200 mL) e o produto foi extraído com AcOEt (3 x 200 mL). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada até à secura. O residuo resultante foi purificado por cromatografia sobre sílica gel (éter de petróleo: AcOEt 77 10:1) para proporcionar o boronato esperado como um sólido branco. 176.2: Síntese de {5-[4-(6-Ciano-piridin-3~ilmetoxi)-fenil]-[1, 2, 4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il}-arnida do ácido ciclopropanocarboxílico
Foi adicionado 5-[4-(4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenoximetil]-piridina-2-carbonitrilo (10 g, 0,03 mol, 1,1 equiv.) a uma solução de (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il)-amida do ácido ciclopropanocarboxílico (7,6 g, 0,027 mol) em 1,4-dioxano/água (4:1; 70 mL) . Foram adicionados K2CO3 (7, 45, 0, 054 mol, 2 eq. ) e
PdCl2dppf (5%) à solução. A mistura resultante foi então aquecida num banho de óleo a 90 °C sob N2 até à conclusão (seguida por LCMS) . O 1,4-dioxano foi removido sob vácuo e foram adicionadas água/AcOEt e o sólido foi filtrado. O sólido obtido foi dissolvido em metanol/DCM, seco sobre MgS04 e o composto final foi obtido após purificação por cromatografia flash, eluída com AcOEt puro como um sólido branco 78
Composto de comparação 192: Araida do ácido S-{4-[2- (ciclopropanocarbonil-amino)- [1,2, 4] triazolo [1, 5-a]piridin-5-il]-fenoximetil}-pirídína-2-carboxílico
A uma solução de { 5-[4-(6-ciano-piridin-3-ilmetoxi)-fenil]-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il}-amida do ácido ciclopropanocarboxílico (30 mg, 0,073 mmol, 1 equiv) e K2C03 (10 mg, 0,073 mmol, 1 equiv) em DMSO (0,2 mL) a 10 °C, foi adicionada, gota a gota, H202 a 30% (17 pL, 0,146 mmol, 2 equiv). Depois de agitar a mistura à temperatura ambiente durante 4 h, esta foi diluída com DMSO e filtrada. O filtrado foi submetido a purificação por HPLC preparativa: sistema de UPLC (coluna XBridge™ Prep C18, 5 pm, 19x100 mm); LC 8 min; caudal: 20 mL/min; gradiente: desde 30% a 70% acetonitrilo em água 0,1 % de TFA; isolando o produto final puro.
Os compostos de comparação ilustrativos e o composto de Fórmula Via (Composto 176) que foram ou podem ser preparados de acordo com os métodos de síntese aqui descritos são listados no Quadro I abaixo. Os dados espectrais de RMN de alguns compostos de comparação representativos e do composto de Fórmula Via (Composto 176) são dados no Quadro II. 79
Quadro I
Comp N2 Estrutura Nome Método PM MS Medido 12 1 />—N y'N y-<\ JL 0 ó; N-(5-(4-(benziloxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida A 384,44 385,10 14 m-N . y ~n y<\ 0 N-(5-(3-(benziloxi)fenil)-[1,2,4]triazob[1,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida A 384,44 385,20 15 r^W 1 /)—N yv ^ JL o 6' N-(5-(4-(benziloxi) -3-fluorofenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida A 402,43 403,10 16 C\ OH< °X) N-(5-(2-(benziloxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida A 384,44 385,20 36 XyV Yn'n/>_V<] JL o 6 N-(5-(4-(piridin-3-ilmetoxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida C 385,43 408,0 (M++Na) 80 (continuação)
Comp Nffi Estrutura Nome Método PM MS Medido 37 V'n^”V< jL o 6 N-(5-(4-(piridin-2-ilmetoxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida c 385,43 408,0 (M++Na) 38 V~N' >-<i Φ · x j6 f > N-(5-(4-(3- (trifluorometoxi)benziloxi lo )fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida C 468,44 469,00 46 1 o σ° N-(5-(4-fenoxifenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida A 370,41 371,00 57 W-y< A o Φ 6 N-(5-(6- (benziloxi)piridin-3-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida Descrito acima 385,43 386,00 72 W~v< 1 0 6 N-(5-(4- (benzilamino)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida E 383,46 384,00 81 (continuação)
Comp Nffi Estrutura Nome Método PM MS Medido 78 yn'n Vci V · /0 ή ψ' 'f N-(5-(4-((6- (trifluorometil)piridin-3-il)metoxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida c 453,43 454,00 92 ^VNv 1 /)—N V'N 1 o óo CbyN N-(5-(4-(4- acetamidobenziloxi)fenil) -[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida c 441,49 442,00 127 Y-n^Vo 1 o °^o N- (5-(4-(2-(piridin-3-il)etoxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida c 399,45 400,0 163 Wv J. 0 6 N-(5-(4-(benziloxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2-il)acetamida F 358,40 359,0 82 (continuação)
Comp Nffi Estrutura Nome Método PM MS Medido 165 Vn'n' Λ Ύ °) 0 N-(5-(4-( (6- morfolinopiridin-3- il)metoxi)fenil)- [l,2,4]triazolo[l,5- a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida L 470,53 471, 1 167 V~N >-<3 1 o 9 λ V ú N 1 N-(5-(4-((6-(4- metilpiperazin-1-il)piridin-3-il)metoxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida L 483,58 484,1 174 V'n 1 o ¢) '0 (!) N-(5-(4-((6-(pirrolidin-l- il)piridin-3- il)metoxi)fenil)- [l,2,4]triazolo[l,5- a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida L 454,53 455, 1 176 ^VNv_ W”V« ° λ kyN II N N-(5-(4-((6-cianopiridin-3-il)metoxi)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida Método descrito acima 410,44 411,0 83 (continuação)
Comp Nffi Estrutura Nome Método PM MS Medido 182 (fVV-N V'N y-< $ · 6 N- (5-(4-(piridin-3-ilmetilamino)fenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2- il)ciclopropanocarboxamida E 384,44 385, 0 190 .L 0 °Λ ϊ 0 ? 6-((4-(2- (ciclopropanocarboxamido)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]piridin-5- il)fenilciclopropano-carboxamido)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]piridin-5-il)- fenoxi)metil)nicotinato de metilo C 443,47 444, 0 192 4 o Λ n"o 5-((4-(2- (ciclopropanocarboxamido)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]piridin-5- il)fenilciclopropano-carboxamido)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]piridin-5-il)- fenoxi)metil)picolinamida Descrito acima 428,45 429, 1 197 fVVNH Yn'n 0 \ {5-[4-(6-Metil-piridin-3-ilmetoxi)-fenil]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]piridin-2-il}-amida do ácido ciclopropanocarboxilico c 399,45 400,1 84 (continuação)
Quadro II: Dados de RMN de Compostos de comparação Representativos e do composto de Fórmula Via
Comp N2
(δ) dados de RMN 12 15 36 (ΤΗ, CDC13) 8,70 (1H, 1, NH) , 7,97 (2H, d, ArH) , 7,60-7,30 (7H, m, ArH), 7,15 (2H, m, ArH), 7,07 (1H, m, ArH), 5,17 (2H, s, CH2) , 1,60 (1H, debaixo do pico da água, CH) , 1,21 (2H, m, CH2), 0,94 (2H, m, CH2) (ΧΗ, DMSO) 11, 04 (1H, ~r NH) , 8, 08 (1H, ArH) , 7, 88 (1H, d, ArH), 7,68 (2H, m, ArH), 7,51 (2H, d, ArH), 2,48- 7,30 (5H, m, ArH), 5,32 (2H, s, CH2) , 2,02 (1H, 1, CH) , 0,83 (4H, m, 2XCH2) (ΧΗ, DMSO) 11,03 (1H, ~r NH) , 8,62 (1H, irp ArH) , 8, 02 (2H, d, ArH), 7,89 (1H, m, ArH), 7,66 (2H, m, ArH), 7,58 (1H, d, ArH), 7,40 (1H, dd, ArH), 7,27 (1H, d, ArH), 7,21 (2H, d, ArH), 5,31 (2H, s, CH2), 2,02 (1H, 1, CH) , 0,83 (4H, m, 2XCH2) 85 (continuação)
Comp N2
(δ) dados de RMN 37 (2Η, DMSO) 11 ,01 (1H, 1, NH), 8 ,04 (2H, d, ArH), 7; 68 (2H, m, ArH) , 7,55 (2H, m, ArH), 7,50 (1H, s, ArH), 7,38 (1H, d, ArH) , 7,28 (1H, d, ArH), 7,20 (2H, d, ArH), 5,30 (2H, s, CH2) , 2,02 (1H, 1, CH), 0, 82 (4H, m, 2XCH2) ("H, DMSO) 11,01 (1H, 1, NH), 8,00 (2H, d, ArH) , 7,69 (2H, d, ArH) , 7,69 (1H, dd, ArH) 38 (1H, d, ArH) , 7,11 (2H, d, ArH) (1H, m, CH) , 2,2-1,8 (7H, m, 2XCH2) 57 (XH, DMSO) 11 ,18 (1H, 1, NH) , 8,01 (2H, d, ArH), 7,68 (2H, m, ArH), 7,26 (1H, d, ArH) , 7,09 (2H, d, ArH), 4, 12 (2H, t, CH2), 2,86 (2H, t, CH2) , 2,28 (6H, s, 2xCH3) , 2,02 (1H, 1, CH), 0,81 (4H, m, 2xCH2) (ΤΗ, DMSO) 10,95 (1H, 1, NH), 7, 85 (2H, d, ArH) , 7,61 (1H, dd, ArH), 7,51 (1H d, ArH) , 7,40 (4H, m, ArH) , 7,36 72 (1H, m, ArH), 7,24 (1H, d, ArH) , 7,09 (4H, m, ArH) , 6,88 (1H, m, ArH), 6,70 (2H, d, ArH) , 4,37 (2H, d, CH2) , 2,02 (1H, 1, CH), 0,81 (4H, m, 2xCH2) ('h, DMSO) 11,05 (1H, s, NH) , 8,09 (2H, d, ArH) , 8,02 (2H, d, ArH) , 7,3-7,56 (7H, m, ArH) , 7,36 (1H, m, ArH) , 73 4, 54 (1H, b, CH), 3,80 (2H, m, CH2) , 3,06 (1H, 1, CH) , 2, 02 -1,80 (4H, 1, 2xCH, CH2), 1, 58 (2H, m, CH2) , 0,81 (4H, m, 2XCH2) 86 (continuação)
Comp (δ) dados de RMN N2 (^, DMSO) 11,05 (1H, s, NH), 8,09 (2H, d, ArH) , 8,02 (2H, d, ArH), 7,3-7,56 (7H, m, ArH) , 7,36 (1H, m, AcH) , 78 4, 54 (1H, b, CH), 3,80 (2H, m, CH2), 3,06 (1H, 1, CH) , 2, 02 -1,80 (4H, 1, 2xCH, CH2), 1,58 (2H, m, CH2) , 0,81 (4H, m, 2XCH2) ('h, DMSO) 11,03 (1H, 1, NH) , 10,01 (1H, 1, NH) , 8,00 (2H, d, ArH), 7,65 (4H, m, ArH), 7,41 (2H, d, ArH) , 7,27 92 (1H, m, ArH), 7,17 (2H, d, ArH), 5,15 (2H, s, CH2) , 2,04 (4H, m, CH3, CH), 0,82 (4H, m, 2XCH2) . ('h, DMSO), 10,98 (1H, s, NH) , 8,63 (1H, s, ArH) , 8,51 (1H, m, ArH), 8,00 (2h, d, ArH), 7,91 (1H, d, ArH) , 7,64 127 (2H, m, ArH), 7,46 (1H, m, ArH), 7,24 (1H, m, ArH) , 7, 13 (2H, m, ArH), 4,36 (2H, t, CH2) , 3,14 (2H, t, CH2) , 2,04 (1H, 1, CH) , 0, 82 (4H, m, 2xCH2) . (XH, DMSO) 10,72 (1H, 1, NH) , 7,99 (2H, m, ArH) , 7,65 163 (2H, b, ArH), 7,48 (4H, b, ArH), 7,18 (2H, m, ArH) , 5,21 (2H, d, CH2), 2,12 (3H, 1, CH3) (XH, DMSO) 8,26 (1H, d, ArH), 8,01 (2H, d, ArH) , 7,68 (2H, m, ArH), 7,62 (1H, d, ArH), 7,26 (1H, d, ArH) , 7,17 165 (2H, d, ArH), 6,87 (1H, d, ArH), 5,10 (2H, s, CH2) , 3,69 (4H, t, 2XCH2), 3,46 (4H, t, 2XCH2) , 2,07 (1H, 1, CH) , 0, 81 (4H, m, 2XCH2) 87 (continuação)
Comp N2 167 (δ) dados de RMN (ΧΗ, DMSO) 11 O o (1H, 1, NH) , 10,03 (1H, 1 , NH) , 8, 31 (1H, d, ArH) , 8,03 (2H, d, ArH) , 7,76 (1H, d, , ArH), 7, 69 (1H, m, ArH) , 7,63 (1H, d, ArH) , 7,26 (1H, m, , ArH), 7, 18 (2H, m, ArH) , 7, 00 (1H, d, ArH) , 5,12 (2H, s , CH2), 4, 41 (2H, 1, CH2) , 3,49 (2H, 1, CH2) , 3,15 (4H, 1, 2XCH2) , 2, 84 (3H, s, CH3), 2,04 (1H, 1, CH), 0,82 (4H, m, 2XCH2) 174 ( H, DMSO) 11,02 (1H, 1, NH) , 8,14 (1H, s, ArH) , 8,03 (3H, m, ArH), 7,66 (2H, m, ArH), 7,27 (1H, d, ArH), 7,20 (2H, dd, ArH), 7,10 (1H, d, ArH), 5,17 (2H, s, CH2), 3,53 (4H, t, 2XCH2), 2,02 (5H, t, 2XCH2,CH), 0,82 (4H, m, 2XCH2) . 176 (ΧΗ, DMSO) 11, 0 (1H, 1, NH) , 8, 89 (1H, s, ArH), 8, 16 (1H, d, ArH), 8,09 (1H, d, ArH), 8,04 (2H, d, ArH), 7,67 (2H, m, ArH), 7,27 (1H, d, ArH), 7,23 (2H, d, ArH), 5,41 (2H, s, CH2), 2,04 (1H, 1, CH), 0,81 (4H, m, 2xCH2). (ΧΗ, DMSO) 10 ,94 (1H, b, NH) , 8 , 62 (1H, s, ArH) , 8, 46 (1H, d, ArH), 7, 86 (2H, d, ArH) , 7, 78 (1H, d, ArH) , 7,62 182 (1H, dd, ArH), 7,51 (1H, d, ArH) , 7,37 (1H, m, ArH), 6,89 (1H, m, NH) , 6,73 (2H, d, ArH) , 6,57 (1H, s, ArH) , 4, 42 (2H, d, CH2), 2,05 (1H, 1, CH), 0,81 (4H, m, 2xCH2) 190 s, ArH), 8,38 m, ArH), 7,22 s, ArH), 2,04 (1H, 1, CH), 0,81 (4H, m, 2xCH2). 88 (continuação)
Comp Na (δ) dados de RMN 192 ^H, DMSO) 11,07 (1H, b, NH) , 8,76 (1H, s, ArH) , 8,16 (1H, 1, ArH), 8,09 (2H, s, ArH), 8,03 (2H, d, ArH), 7,68 (3H, m, ArH), 7,28 (1H, d, ArH), 7,23 (2H, d, ArH), 5,38 (2H, s, CH2), 2,02 (1H, 1, CH), 0,81 (4H, m, 2XCH2). 197 (1H, DMSO) 10,99 (1H, b, NH), 8,57 (1H, d, ArH), 8,02 (2H, d, ArH), 7,79 (1H, dd, ArH), 7,69 (1H, dd, ArH), 7,63 (1H, dd, ArH), 7,29 (1H, d, ArH), 7,26 (1H, dd, ArH), 7,20 (2H, d, ArH), 5,22 (2H, s, CH2) , 2,50 (3H, s, CH3), 2,03 (1H, b, CH), 0,81 (4H, m, CH2) . 198 (1H, DMSO) 10,99 (1H, b, NH) , 8,56 (1H, m, ArH), 8,03 (2H, d, ArH), 7,99 (1H, dd, ArH), 7,69 (1H, dd, ArH), 7,63 (1H, dd, ArH), 7,58 (1H, d, ArH), 7,27 (1H, dd, ArH), 7,21 (2H, d, ArH), 5,29 (2H, s, CH2) , 2,04 (1H, b, CH) , 0, 81 (4H, m, CH2) .
Exemplos Biológicos
Exemplo 1 - ensaios in vitro
Exemplo 1.1 Ensaio de inibição de JAK1 0 domínio catalítico da JAKl recombinante humana (aminoácidos 850-1154; número de catálogo 08-144) foi adquirida de Cama Biosciences. Foi incubado 10 ng de JAKl com 12,5 yg de substrato poliGT (Sigma, número de catálogo P0275) em tampão de reacção de cinase (Tris-HCl 15 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, 0,01% de Tween-20, MgCl2 10 mM, ATP não radioactivo 2 μΜ, 0,25 yCi de 89 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentrações finais) com ou sem 5 pL contendo composto de ensaio ou veiculo (DMSO, 1% de concentração final), num volume total de 25 μύ, numa placa de 96 poços em polipropileno (Greiner, fundo em V) . Após 45 min a CO O o O as reacções foram paradas adicionando 25 pL/poço de ácido fosfórico 150 mM. A totalidade da reacção de cinase finalizada foi transferida para placas de filtração de 96 poços (Perkin Elmer, número de catálogo 6005177) pré-lavadas (ácido fosfórico 75 mM) utilizando um colector de células (Perkin Elmer). As placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de uma solução de ácido fosfórico 75 mM e o fundo das placas foi selado. Foram adicionados 40 pL/poço de Microscint-20, o cimo das placas foi selado e a leitura foi realizada utilizando o Topcount (Perkin Elmer). A actividade cinase foi calculada subtraindo as contagens por minuto (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controlo positivo (estaurosporina 10 pM) das cpm obtidas na presença de veiculo. A aptidão de um composto de ensaio para inibir esta actividade foi determinada como:
Percentagem inibição = ((cpm determinada para a amostra com composto de ensaio presente - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo) dividida por (cpm determinada na presença de veiculo - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo)) * 100%.
Foram preparadas séries de diluição de dose para os compostos que permitem a avaliação dos efeitos dose-resposta no ensaio de JAK1 e o cálculo da IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado à concentração de 20 μΜ seguida de uma diluição sucessiva para 1/3, 8 pontos (20 μΜ - 6,67 μΜ - 2,22 μΜ - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9nM) numa 90 concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série do composto aumentava, foram preparadas mais diluições e/ou a concentração máxima foi diminuída (e. g., 5 μΜ, 1 μΜ).
Pontuação semi-quantitativa:
* > 501 nM
** 101-500 nM
* * * 0,1-100 nM QUADRO III: Valores de IC50 dos Compostos para a JAKl
Comp N2 JAKl 12 k k k 14 k * 15 k k k 36 k k k 37 k k k 38 k k 57 k k k 72 k k k 78 k k k 92 k k k 127 k k G100833 G106233 Comp N2 JAKl 163 k k k 165 k k 167 k k 174 k 176 k k k 182 k k k 190 k k k 192 k k k 197 k k k 198 k k k
Exemplo 1.2 ensaio de inibição de JAK2 O domínio catalítico da JAK2 recombinante humana (aminoácidos 808-1132; número de catálogo PV4210) foi adquirido de Invitrogen. Foi incubada 0,025 mU de JAK2 com 2,5 μg de 91 substrato poliGT (Sigma, número de catálogo P0275) em tampão de reacção de cinase (MOPS 5 mM pH 7,5, MgAc 9 mM, EDTA 0,3mM, 0,06% de Brij e DTT 0,6 mM, ATP não radioactivo 1 μΜ, 0,25 pCi de 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentrações finais) com ou sem 5pL contendo composto de ensaio ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), num volume total de 25 pL, numa placa de 96 poços em polipropileno (Greiner, fundo em V) . Após 90 min a 30 °C, as reacções foram paradas adicionando 25 pL/poço de ácido fosfórico 150 mM. A totalidade da reacção de cinase finalizada foi transferida para placas de filtração de 96 poços (Perkin Elmer, número de catálogo 6005177) pré-lavadas (ácido fosfórico 75 mM) utilizando um colector de células (Perkin Elmer). As placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de uma solução de ácido fosfórico 75 mM e o fundo das placas foi selado. Foram adicionados 40 pL/poço de Microscint-2 0, o topo das placas foi selado e a leitura foi realizada utilizando o Topcount (Perkin Elmer). A actividade cinase foi calculada subtraindo as contagens por minuto (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controlo positivo (estaurosporina 10 μΜ) das cpm obtidas na presença de veículo. A aptidão de um composto de ensaio para inibir esta actividade foi determinada como:
Percentagem inibição = ((cpm determinada para a amostra com composto de ensaio presente - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo) dividida por (cpm determinada na presença de veículo - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo)) * 100%.
Foram preparadas séries de diluição de dose para os compostos que permitem a avaliação dos efeitos dose-resposta no ensaio da JAK2 e o cálculo da IC5o para cada composto. Cada 92 composto foi rotineiramente testado à concentração de 20 μΜ seguida de uma diluição sucessiva para 1/3, 8 pontos (20 μΜ - 6,67 μΜ - 2,22 μΜ - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) numa concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série do composto aumentava, foram preparadas mais diluições e/ou a concentração máxima foi diminuída (e. g., 5 μΜ, 1 μΜ).
Pontuação semi-quantitativa:
# > 501 nM ## 101-500 nM ### 1 - 100 nM QUADRO IV: Valores de IC5o dos Compostos para a JAK2
Comp N2 JAK2 12 ### 14 # 36 ### 37 ### 57 ### 72 ### 78 ### 92 ## 163 #### 176 ### 197 ### 198 ### 93
Exemplo 1.3
Ensaio de inibição de JAK3 0 domínio catalítico da JAK3 recombinante humana (aminoácidos 781-1124; número de catálogo PV3855) foi adquirida de Invitrogen. Foi incubada 0,025 mU de JAK3 com 2,5 pg de substrato poliGT (Sigma, número de catálogo P0275) em tampão de reacção de cinase (Tris 25 mM pH 7,5, EGTA 0,5 mM, Na3V04 0,5 mM, b-glicerolfosfato 5 mM, 0,01% de Triton X-100, ATP não radioactivo 1 μΜ, 0,25 pCi de 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentrações finais) com ou sem 5 pL contendo composto de ensaio ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), num volume total de 25 pL, numa placa de 96 poços em polipropileno (Greiner, fundo em V) . Após 105 min a 30 °C, as reacções foram paradas adicionando 25 pL/poço de ácido fosfórico 150 mM. A totalidade da reacção de cinase finalizada foi transferida para placas de filtração de 96 poços (Perkin Elmer, número de catálogo 6005177) pré-lavadas (ácido fosfórico 75 mM) utilizando um colector de células (Perkin Elmer). As placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de uma solução de ácido fosfórico 75 mM e o fundo das placas foi selado. Foram adicionados 40 pL/poço de Microscint-20, o cimo das placas foi selado e a leitura foi realizada utilizando o Topcount (Perkin Elmer). A actividade cinase foi calculada subtraindo as contagens por minuto (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controlo positivo (estaurosporina 10 μΜ) das cpm obtidas na presença de veículo. A aptidão de um composto de ensaio para inibir esta actividade foi determinada como:
Percentagem inibição = ((cpm determinada para a amostra com composto de ensaio presente - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo) dividida por (cpm determinada na 94 presença de veículo - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo)) * 100%.
Foram preparadas séries de diluição de dose para os compostos que permitem a avaliação dos efeitos dose-resposta no ensaio da JAK3 e o cálculo da IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado à concentração de 20 μΜ seguida de uma diluição sucessiva para 1/3, 8 pontos (20 μΜ -6,67 μΜ - 2,22 μΜ - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) numa concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série do composto aumentava, foram preparadas mais diluições e/ou a concentração máxima foi diminuída (e. g., 5 μΜ, 1 μΜ).
Pontuação semi-quantitativa: JAK 3
+ > 501 nM
++ 101-500 nM QUADRO V: Valores de IC50 dos Compostos para a JAK3
Comp Na JAK3 12 + + + 15 + + 36 + + 37 + 57 + 72 + 78 + + 163 + + 176 + + + 95
Exemplo 1.4 Ensaios de inibição de TYK2 0 domínio catalítico de TYK2 recombinante humana (aminoácidos 871-1187; número de catálogo 08-147) foi adquirida de Cama biosciences. Foi incubado 5 ng de TYK2 com 12,5 pg de substrato poliGT (Sigma, número de catálogo P0275) em tampão de reacção de cinase (Hepes 25 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, Na3V04 0,2 mM, 0,1% de NP-40, ATP não radioactivo 0,1 μΜ, 0,125 pCi de 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número de catálogo AH9968) concentrações finais) com ou sem 5pL contendo composto de ensaio ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), num volume total de 25 pL, numa placa de 96 poços em polipropileno (Greiner, fundo em V) . Após 90 min a 30 °C, as reacções foram paradas adicionando 25 pL/poço de ácido fosfórico 150 mM. A totalidade da reacção de cinase finalizada foi transferida para placas de filtração de 96 poços (Perkin Elmer, número de catálogo 6005177) pré-lavadas (ácido fosfórico 75 mM) utilizando um colector de células (Perkin Elmer). As placas foram lavadas 6 vezes com 300 pL por poço de uma solução de ácido fosfórico 75 mM e o fundo das placas foi selado, foram adicionados 40 pL/poço de Microscint-2 0, o cimo das placas foi selado e a leitura foi realizada utilizando o Topcount (Perkin Elmer). A actividade cinase foi calculada subtraindo as contagens por minuto (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controlo positivo (estaurosporina 10 pM) das cpm obtidas na presença de veículo. A aptidão de um composto de ensaio para inibir esta actividade foi determinada como:
Percentagem inibição = ((cpm determinada para a amostra com composto de ensaio presente - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo) dividida por (cpm determinada na 96 presença de veículo - cpm determinada para a amostra com inibidor de controlo positivo)) * 100%.
Foram preparadas séries de diluição de dose para os compostos que permitem a avaliação dos efeitos dose-resposta no ensaio da TYK2 e o cálculo da IC5o para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado à concentração de 20 μΜ seguida de uma diluição sucessiva para 1/3, 8 pontos (20 μΜ -6,67 μΜ - 2,22 μΜ - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) numa concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série do composto aumentava, foram preparadas mais diluições e/ou a concentração máxima foi diminuída (e. g., 5 μΜ, 1 μΜ).
Pontuação semi-quantitativa:
* > 1001 nM **501-1000 nM *** 101-500 nM **** 1 - 100 nM QUADRO VI: Valores de IC5o dos Compostos para a TYK2
Comp Na TYK2 15 * 36 ic ·*" *" 37 * * 57 * 72 * 92 * 163 * 176 ic ic ic ic 97
Exemplo 2.
Ensaios celulares
Exemplo 2.1 Ensaio de sinalização JAK-STAT: Células HeLa foram mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% soro fetal de vitelo termicamente inactivado, 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. As células HeLa foram utilizadas a 70% de confluência para transfecção. Foram transitoriamente transfectadas 20 000 células em 87 pL de meio de cultura de células com 40 ng do repórter pSTATl(2)-luciferase (Panomics), 8 ng de repórter LacZ como repórter de controlo interno e 52 ng de pBSK utilizando 0,32 pL de Jet-PEI (Polyplus) como reagente de transfecção por poço no formato de placa de 96 poços. Após incubação de um dia para o outro a 37 °C, 10% de CO2, o meio de transfecção foi removido. Foram adicionados 75 pL de DMEM + 1,5% de soro fetal de vitelo termicamente inactivado. Foram adicionados 15 pL de composto a concentração de 6, 7X durante 60 min e, em seguida, 10 pL de OSM humano (Peprotech) a 33 ng/mL de concentração final.
Todos os compostos foram testados em duplicado partindo de 20 pM seguida de uma diluição sucessiva para 1/3, 8 doses no total (20 pM - 6,6 pM - 2,2 pM - 740 nM - 250 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) numa concentração final de 0,2% de DMSO.
Após incubação de um dia para o outro a 37 °C, 10% de C02 as células foram lisadas em 100 pL de tampão de lise/poço (PBS, CaCl2 0,9 mM, MgCl2 0,5 mM, 5% de Trealose, 0,025% de Tergitol NP9, 0,15% de BSA). 98
Foram utilizados 40 pL de lisado celular para ler a actividade da β-galactosidase adicionando 180 pL de solução de βΘηΙ (30 pL de ONPG 4 mg/mL + 150 pL de tampão de β-Galactosidase (Na2HP04 0, 06 M, NaH2P04 0, 04 M, MgCl2 1 mM) ) durante 20 min. A reacção foi parada por adição de 50 pL de Na2C03 1 Μ. A absorvância foi lida a 405 nm. A actividade da luciferase foi medida utilizando 40 pL de lisado celular mais 40 pL de Steadilite® como descrito pelo fabricante (Perkin Elmer), no Envision (Perkin Elmer).
Foram utilizados 10 pM de um inibidor de pan-JAK como um controlo positivo (100% de inibição). Como controlo negativo foi utilizado DMSO a 0,5% (0% inibição). Os controlos positivo e negativo foram utilizados para calcular os valores de z' e "percentagem de inibição" (PIN).
Percentagem de inibição = ( (fluorescência determinada na presença de veiculo - fluorescência determinada para a amostra com o composto de ensaio presente) dividida por (fluorescência determinada na presença de veiculo - fluorescência determinada para a amostra sem estimulo)) * 100 %.
Os valores de PIN foram representados graficamente para os compostos testados na dose-resposta e foram derivados os valores de EC50. 99
QUADRO VII: Valores de ECsn da sinalização JAK-STAT
* > 1001 nM ** 501-1000 nM *** 101-500 nM **** 1-100 nM
Comp Ns EC5o (nM) 12 k k k 14 k 15 k 'k 'k 36 k k k 37 zk zk 57 zk 72 zk 78 k 92 k 163 k 176 k * * k 182 * 190 * 192 •k k k 197 k k k 198 k k k
Exemplo 2.2 Ensaio de sinalização OSM/IL-Ιβ
Foi demonstrado que o OSM e a IL-Ιβ regulam positivamente de forma sinérgica os níveis de MMP13 na linha de células de condrossarcoma humano SW1353. As células foram aplicadas em placas de 96 poços a 15 000 células/poço num volume de 120 pL 100 DMEM (Invitrogen) contendo 10% (v/v) de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen) incubadas a 37 °C, 5% de CO2. As células foram pré-incubadas com 15 pL de composto em meio M199 com 2% de DMSO, 1 h antes de estimular com de 15 pL de OSM e IL-1 β para alcançar 25 ng/mL de OSM e 1 ng/mL de IL-Ιβ, e os níveis de MMP13 foram medidos em meio condicionado 48 horas após a estimulação. A actividade de MMP13 foi medida utilizando um ensaio de actividade de captura de anticorpo. Para este efeito, placas de 384 poços (NUNC, 460518, MaxiSorb pretas) foram revestidas com 35 pL de uma solução 1,5 pg/mL de anticorpo anti-MMP13 humana (R&D Systems, MAB511) durante 24 horas a 4 °C. Depois de lavar os poços 2 vezes com PBS + 0,05% de Tween, os sítios de ligação remanescentes foram bloqueados com 100 pL de leite magro seco a 5% (Santa Cruz, sc-2325, Blotto) em PBS durante 24 horas a 4 °C. A seguir, os poços foram lavados 2 vezes com PBS + 0,05% de Tween e foram adicionados 35 pL de diluição a 1/10 do sobrenadante de cultura contendo MMP13 em tampão de bloqueio diluído 100 vezes e incubados durante 4 horas à temperatura ambiente. A seguir os poços foram lavados duas vezes com PBS + 0,05% de Tween, seguido de activação da MMP13 por adição de 35 pL de uma solução de Acetato 4-aminofenilmercúrico (ΑΡΜΑ) 1,5 mM (Sigma, A9563) e incubação a 37 °C durante 1 hora. Os poços foram novamente lavados com PBS + 0,05% de Tween e foram adicionados 35 pL de substrato de MMP13 (Biomol, P-126, substrato fluorogénico OmniMMP). Após incubação durante 24 horas a 37 °C, a fluorescência do substrato convertido foi medida num Perkin Elmer Wallac EnVision 2102 Multilabel Reader (comprimento de onda de excitação: 320 nm, comprimento de onda de emissão: 405 nm). 101
Percentagem inibição = ((fluorescência determinada na presença de veículo - fluorescência determinada para a amostra com composto de ensaio presente) dividida por (fluorescência determinada na presença de veículo - fluorescência determinada para amostra sem estímulo)) * 100%.
* > 1001 nM **501-1000 nM *** 1-500 nM QUADRO VIII: Valores de EC50 para MMP13
Comp Na EC50 (nM) 12 * 15 * 36 * * 37 * 57 * 72 * * 78 * * 163 * 176 k rk rk 182 k 192 k 197 * 198 k 102
Exemplo 2.3
Ensaio de Proliferação de PBL
Linfócitos de sangue periférico humano (PBL) foram estimulados com IL-2 e a proliferação medida utilizando um ensaio de incorporação de BrdU. Os PBL foram inicialmente estimulados durante 72 h com PHA para induzir o receptor de IL 2, mantidos em jejum durante 24 h para parar a proliferação celular, seguida de estimulação de IL-2 durante mais 72 h (incluindo 24 h de marcação com BrdU) . As células foram pré-incubadas com compostos de ensaio 1 h antes da adição de IL-2. As células foram cultivadas em RPMI 1640 contendo 10% (v/v) de FBS.
Exemplo 3. Modelos in vivo
Exemplo 3.1 Modelo CIA 3.1.1 Materials 0 adjuvante completo de Freund (CFA) e adjuvante incompleto de Freund (IFA) foram adquiridos de Difco. O colagénio de tipo II (CII) bovino, lipopolissacárido (LPS) e Enbrel foram obtidos de Chondrex (Isle d'Abeau, França); Sigma (P4252, L'Isle d'Abeau, France), Whyett (seringa injectável de 25 mg, França) Acros Organics (Paio Alto, CA), respectivamente. Todos os outros reagentes utilizados foram de tipo reagente e todos os solventes foram de tipo analítico. 103 3.1.2
Animais
Ratos Agouti escuros (masculinos, 7-8 semanas de idade) foram obtidos de Harlan Laboratories (Maison-Alfort, França) . Os ratos foram mantidos num ciclo de 12 horas de luz/escuro (0700 - 1900). A temperatura foi mantida a 22 °C, e a alimentação e água foram proporcionados ad libitum. 3.1.3 Artrite induzida por colagénio (CIA)
Um dia antes da experiência foi preparada solução de CII (2 mg/mL) com ácido acético 0,05 M e conservada a 4 °C. Imediatamente antes da imunização foram misturados volumes iguais de adjuvante (IFA) e CII com um homogeneizador numa garrafa de vidro pré-arrefecida num banho de água gelada. Pode ser necessário mais adjuvante e homogeneização prolongada se não se formar uma emulsão. Foram injectados 0,2 mL da emulsão por via intradérmica na base da cauda de cada rato no dia 1, uma segunda injecção intradérmica de reforço (solução de CII a 2 mg/mL em CFA 0, 1 mL de soro fisiológico) foi realizada no dia 9. Este método de imunização foi modificado a partir de métodos publicados (Sims et al., 2004; Jou et al., 2005). 3.1.4 Concepção do estudo
Os efeitos terapêuticos dos compostos de ensaio foram testados no modelo CIA em rato. Os ratos foram aleatoriamente divididos em grupos iguais e cada grupo continha 10 ratos. Todos os ratos foram imunizados no dia 1 e receberam um reforço no dia 9. A administração terapêutica durou desde o dia 16 até ao dia 104 30. O grupo de controlo negativo foi tratado com veiculo (MC 0,5%) e o grupo de controlo positivo com Enbrel (10 mg/kg, 3x semana., s.c.). Um composto de interesse foi tipicamente testado a 3 doses, e. g., 3, 10, 30 mg/kg, p.o. 3.1.5 Avaliação clínica da artrite A artrite foi classificada de acordo com o método de Khachigian 2006, Lin et al. 2007 e Nishida et ai. 2004) . A tumefação de cada das quatro patas foi classificada com a pontuação artrítica como se segue: 0-sem sintomas; 1-vermelhidão e tumefação ligeiras, mas definitivas de um tipo de articulação tais como o tornozelo ou pulso, ou vermelhidão e tumefação evidente limitada a dedos individuais, independentemente do número de dedos afectados; 2-vermelhidão e tumefação moderada de dois ou mais tipos de articulações; 3-vermelhidão e tumefação grave de toda a pata incluindo dedos; 4-membro com inflamação máxima e com envolvimento de várias articulações (pontuação de artrite clínica acumulativa máxima de 16 por animal) (Nishida et al., 2004) . 3.1.6 Alteração do peso corporal (%) após início da artrite
Clinicamente, a perda de peso corporal está associada a artrite (Shelton et al., 2005; Argiles et al., 1998; Rall, 2004; Walsmith et al., 2004) Assim, as alterações no peso corporal após início da artrite poderiam ser utilizadas como um critério não específico para avaliar o efeito de agentes terapêuticos no 105 modelo de rato. A alteração do peso corporal (%) após início da artrite foi calculada como se segue: P«se T1.nT $ — Feso Corper
Peso E&« á:¥ F*S0 — Peso€©r|:
Pmo Corpasml^, 3.1.7 Radiologia
Foram tiradas fotos de raios X das patas traseiras de cada animal individual. Foi atribuído um número de identidade cego aleatório a cada uma das fotos e a gravidade da erosão do osso foi classificada por dois classificadores independentes com o sistema de pontuação radiológica de Larsen como se segue: O-normal com contornos ósseos intactos e espaço articular normal; 1-ligeira anormalidade com qualquer um ou os dois ossos metatársicos exteriores a apresentar ligeira erosão óssea; 2- anormalidade precoce definitiva com quaisquer três a cinco dos ossos metatársicos exteriores a apresentar erosão óssea; 3- anormalidade destrutiva média com todos os ossos metatársicos exteriores bem como qualquer um ou dois dos ossos metatársicos interiores a apresentar erosões ósseas definitivas; 4- anormalidade destrutiva grave com todos os ossos metatársicos a apresentar erosão óssea definitiva e pelo menos uma das articulações metatársicas internas completamente erodidas deixando alguns contornos ósseos da articulação parcialmente conservados; 5-anormalidade mutilante sem contornos ósseos. Este sistema de classificação é uma modificação de Salvemini et al., 2001; Bush et al.r 2002; Sims et al., 2004; Jou et al., 2005. 106 3.1.8
Histologia
Após análise radiológica, as patas traseiras dos ratinhos foram fixadas em formalina tamponada com fosfato a 10% (pH 7,4), descalcifiçadas com descalcificante rápido de osso para histologia fina (Laboratories Eurobio) e embutidas em parafina. Para garantir uma avaliação extensa das articulações artríticas foram cortadas pelo menos quatro secções sucessivas (5 ym de espessura) e cada série de secções distavam 100 ym entre si. As secções foram reveladas com hematoxilina e eosina (H&E). Os exames histológicos relativamente à inflamação sinovial e deterioração de osso e cartilagem foram realizados com duplo cego. Em cada pata foram avaliados quatro parâmetros utilizando uma escala de quatro pontos. Os parâmetros foram a infiltração de células, gravidade do pannus, erosão da cartilagem e erosão óssea. A classificação foi realizada como se segue: 1-normal, 2-ligeira, 3-moderada, 4-acentuada. Estas quatro pontuações foram somadas em conjunto e representadas como uma pontuação adicional, nomeadamente a "pontuação total de AR". 3.1.9 Análise por micro-tomografia computorizada (μΟΤ) do calcâneo (osso do calcanhar): A degradação de osso observada na RA ocorre especialmente no osso cortical e pode ser revelado através de análise por yCT (Sims NA et al., 2004; Oste L et ai., ECTC Montreal 2007) . Após varrimento e reconstrução do volume 3D do calcâneo, a degradação óssea foi medida como o número de objectos discretos presentes por diapositivo, isolados in silico perpendiculares ao eixo longitudinal do osso. Quanto mais o osso tiver sido degradado, mais os objectos discretos que foram medidos. São analisadas 107 1000 fatias, uniformemente distribuídas ao longo do calcâneo (espaçadas por cerca de 10,8 pm). 3.1.10 Resultados O composto 176 foi eficaz em todas as leituras realizadas no estudo CIA em rato. A significância estatística é obtida para 3 mg/kg na pontuação clínica e leituras de tumefação da pata. Compostos seleccionados adicionais foram também testados no estudo CIA em rato, o Composto de comparação 36 foi activo a 30 mg/kg, o Composto de comparação 37 foi activo a 10 mg/kg.
Exemplo 3.2 Modelo de choque séptico A injecção de lipopolissacáridos (LPS) induz uma libertação rápida de factor de necrose tumoral solúvel (TNF-alfa) para a periferia. Este modelo é utilizado para analisar potenciais bloqueadores da libertação de TNF in vivo.
Seis ratinhos BALB/cJ fêmeas (20 g) por grupo foram tratados uma vez à dose pretendida, po. Trinta minutos depois foi injectado LPS (15 pg/kg; E. Coli serotipo 0111:B4) ip. Noventa minutos depois, os ratinhos foram sacrificados e o sangue foi recolhido. Os níveis de TNF-alfa circulante foram determinados utilizando kits ELISA comercialmente disponíveis. Foi utilizada dexametasona (5 pg/kg) como um composto anti-inflamatório de referência. Os compostos seleccionados são testados a uma dose ou doses múltiplas, e. g., 3 e/ou 10 e/ou 30 mg/kg, po. 108 0 composto 176 exibiu uma redução estatisticamente significativa na libertação de TNF (>50%) a 3, 10 e 30 mg/kg po.
Compostos seleccionados adicionais foram também testados no modelo de choque séptico, o Composto de comparação 36 foi activo a 30 mg/kg, os Compostos de comparação 37 e 197 foram activos a 3 mg/kg.
Exemplo 3.3 Modelo MAB O modelo MAB permite uma avaliação rápida da modulação de uma resposta inflamatória tipo RA pelos agentes terapêuticos (Kachigian LM. Nature Protocols (2006) 2512-2516: Collagen antibody-induced arthritis). Ratinhos DBA/J foram injectados i.v. com um cocktail de mAb dirigidos contra o colagénio II. Um dia depois foi iniciado o tratamento com composto (veiculo: 10% (v/v) HPβCD). Três dias depois, os ratinhos receberam uma injecção i.p. de LPS (50 pg/ratinho), resultando num inicio rápido da inflamação. O tratamento com composto continuou até 10 dias após a injecção de mAb. A inflamação foi lida medindo a tumefacção da pata e registando a pontuação clinica de cada pata. A pontuação de artrite clinica acumulativa dos quatro membros foi apresentada para mostrar a gravidade da inflamação. Um sistema de classificação é aplicado a cada membro utilizando um escala de 0-4, sendo 4 a inflamação mais grave. 0 Sem sintomas 1 Vermelhidão e tumefação suave, mas definitiva de um tipo de articulação, tais como o tornozelo ou pulso, ou vermelhidão e tumefacção evidentes limitadas a 109 dedos individuais, independentemente do número de dedos afectados 2 Vermelhidão e tumefação moderada de dois ou mais tipos de articulações 3 Vermelhidão e tumefação grave de toda a pata incluindo dos dedos 4 Membro com inflamação máxima e com envolvimento de várias articulações 0 composto 176, administrado p.o. a 10 e 30 mg/kg reduziu a pontuação clinica com significância estatística a 30 mg/kg e reduziu significativamente a inflamação às doses de 10 e 30 mg/kg.
Compostos de comparação seleccionados adicionais foram também testados no modelo MAB, os Compostos de comparação 36 e 37 foram activos a 30 mg/kg.
Exemplo 3.4 Modelos de oncologia
Os modelos in vivo para validar a eficácia de moléculas pequenas para doenças mieloproliferativas impulsionadas por JAK2 são descritas por Wernig et ai. Câncer Cell 13, 311, 2008 e
Geron et ai. Câncer Cell 13, 321, 2008.
Exemplo 3.5 Modelo de IBD em ratinho
Os modelos in vitro e in vivo para validar a eficácia de moléculas pequenas para a IBD são descritos por Wirtz et al. 2007. 110
Exemplo 3.6
Modelo de Asma em Ratinho
Os modelos in vitro e in vivo para validar a eficácia de moléculas pequenas para a asma são descritos por Nials et al., 2008; Ip et al. 2006; Pernis et al., 2002; Kudlacz et al., 2008.
Exemplo 4: Toxicidade, DMPK e Modelos de Segurança
Exemplo 4.1 Solubilidade termodinâmica
Uma solução de 1 mg/mL do composto de ensaio é preparada em tampão de fosfato 0,2 M, pH7, 4 ou em tampão de citrato 0,1 M, pH 3,0 à temperatura ambiente num frasco de vidro.
As amostras são feitas rodar numa unidade de rotor STR 4 (Stuart Scientific, Bibby) à velocidade 3,0, à temperatura ambiente durante 24 horas.
Após 24 horas, 800 pL da amostra são transferidos para um tubo eppendorf e centrif ugados 5 min a 14000 rpm. Em seguida, são transferidos 200 pL do sobrenadante da amostra para uma Placa de Solubilidade MultiscreenR (Millipore, MSSLBPC50) e o sobrenadante é filtrado (10-12" de Hg) com o auxílio de um distribuidor de vácuo para uma placa de 96 poços de fundo em V em polipropileno Greiner limpa (N° cat. 651201). São diluídos 5 pL do filtrado em 95 pL (F20) do mesmo tampão utilizado para incubar na placa que contém a curva de calibração (Greiner, N° cat. 651201). 111 A curva de calibração para o composto é preparada de fresco em DMSO partindo de uma solução-mãe 10 mM em DMSO diluída por um factor de 2 em DMSO (5000 μΜ) e, em seguida, sucessivamente diluída em DMSO até 19,5 μΜ. Em seguida, são transferidos 3pL da série de diluição a partir de 5000 μΜ para 97 pL de uma mistura de acetonitrilo-tampão (50/50). A gama de concentração final é de 2,5 a 150 μΜ. A placa é selada com tapetes selantes (MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk) e as amostras são medidas à temperatura ambiente por LCMS (ZQ 1525 da Waters) sob condições optimizadas utilizando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula.
As amostras são analisadas por LCMS com um caudal de lmL/min. 0 solvente A é amónia 15 mM e o solvente B é acetonitrilo. A amostra é corrida sob spray de iões positivos numa coluna XBridge C18 3,5 μΜ (2,1 x 30 mm), da Waters. O gradiente de solvente tem um tempo de corrida total de 2 minutos e varia desde 5% de B até 95% dB.
As áreas dos picos são analisadas com o auxílio do conjunto de software Masslynx e as áreas dos picos das amostras são representadas contra a curva de calibração para obter a solubilidade do composto.
Os valores de solubilidade são indicados em μΜ ou pg/mL. 112
Exemplo 4.2
Solubilidade aquosa
Partindo de uma solução-mãe de 10 mM em DMSO é preparada uma diluição sucessiva do composto em DMSO. A série de diluição é transferida para uma placa de fundo F 96 NUNC Maxisorb (N° de cat. 442404) e é adicionado tampão de fosfato 0,2 M, pH7,4 ou tampão de citrato 0,1 M, pH 3,0 à temperatura ambiente. A concentração final variou desde 200 μΜ até 2,5 μΜ em 5 passos de diluição iguais. A concentração final de DMSO não excedeu os 2%. É adicionado pireno 200 μΜ aos pontos dos cantos de cada placa de 96 poços e serve como um ponto de referência para calibração do eixo dos Z no microscópio.
As placas de ensaio são seladas e incubadas durante 1 hora a 37 °C, enquanto são agitadas a 230 rpm. As placas são em seguidas varridas sob um microscópio de luz branca, produzindo imagens individuais do precipitado por concentração. 0 precipitado é analisado e convertido num número que é representado num gráfico. A primeira concentração à qual o composto aparece completamente dissolvido é a concentração indicada, contudo a concentração verdadeira situa-se algures entre esta concentração e um passo de diluição acima.
Os valores de solubilidade são indicados em pg/mL
Exemplo 4.3 Ligação da Proteína do Plasma (Diálise de Equilíbrio)
Uma solução-mãe de 10 mM do composto em DMSO é diluida por um factor 5 em DMSO. Esta solução é ainda diluida em plasma 113 humano, de rato, ratinho ou cão (BioReclamation INC) descongelado de fresco até uma concentração final de ΙΟμΜ e uma concentração final de DMSO de 0,5% (5,5 pL em 1094, 5 pL de plasma num PP-Masterblock de 96 poços (Greiner, N° de cat. 780285))
Uma placa Red Device da Pierce com inserções (ThermoScientific, N° cat. 89809) é preparada e cheia com 750 pL de PBS na câmara do tampão e 500 pL de plasma fortificado na câmara do plasma. A placa é incubada durante 4 horas a 37 °C enquanto era agitada a 230 rpm. Após incubação, são transferidos 120pL de ambas as câmaras para 360pL de acetonitrilo numa placa de poços profundos em PP, com 96 poços de fundo redondo (Nunc, N° cat. 278743) e selada com uma tampa de folha de alumínio. As amostras são misturadas e colocadas sobre gelo durante 30 min. Esta placa é, em seguida, centrifugada 30 min a 1200 rcf a 4 °C e o sobrenadante é transferido para uma placa de 96 com fundo em V em PP (Greiner, 651201) para análise por LCMS. A placa é selada com tapetes selantes (MA96RD-04S) de www.kinesis.co.uk e as amostras são medidas à temperatura ambiente por LCMS (ZQ 1525 da Waters) sob condições optimizadas utilizando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula.
As amostras são analisadas por LCMS com um caudal de lmL/min. O solvente A foi amónia 15 mM e o solvente B foi acetonitrilo. A amostra foi corrida sob spray de iões positivos numa coluna XBridge C18 3,5 pM (2,1 x 30 mm), da Waters. O gradiente de solvente tem um tempo total de corrida de 2 minutos e varia desde 5% de B até 95% de B. 114
As áreas dos picos do composto na câmara de tampão e na câmara de plasma foram consideradas como sendo 100% de composto. A percentagem ligada ao plasma foi obtida a partir destes resultados e foi indicada para o LIMS como a percentagem ligada ao plasma. A solubilidade do composto na concentração final de ensaio em PBS foi inspeccionada por microscópio para verificar se era observada precipitação ou não.
Exemplo 4.4 Responsabilidade pelo prolongamento de QT O potencial para o prolongamento de QT foi avaliado no ensaio de contacto hermético de hERG. 4.4.1 Contacto hermético de célula inteira convencional
Os registos de contacto hermético de célula inteira foram realizados utilizando um amplificador EPC10 controlado pelo software Pulse v8.77 (HEKA). A resistência em série foi tipicamente inferior a 10 MQ e compensada em mais de 60%, a fuga não foi subtraída dos registos. Os eléctrodos foram fabricados a partir de pipeta vidro GC 150TF (Harvard) , a resistência foi entre 2 e 3 ΜΩ. A solução de banho externa continha: NaCl 135 mM, KC1 5 mM, CaCl2 1,8 mM, Glucose 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. 115 A solução da pipeta de contacto interna continha: gluconato de K 100 mM, KC1 20 mM, CaCl2 lmM, MgCl2 1 mM, Na2ATP 5 mM, Glutationa 2 mM, EGTA 11 mM, HEPES 10 mM, pH 7,2.
Os fármacos foram perfundidos utilizando um sistema de perfusão rápida MEV-9/EVH-9 da Biologic.
Todos os registos foram realizados em células HEK293 que expressam canais hERG de forma estável. As células foram cultivadas em lamelas redondas de 12 mm (vidro Alemão, Bellco) fixadas na câmara de registo utilizando dois bastonetes de platina (Goodfellow). As correntes de hERG foram suscitadas utilizando um impulso de activação de +40 mV durante 1000 ms seguida de um impulso de corrente de cauda de -50 mV durante 2000 ms, o potencial de manutenção foi de -80 mV. Os impulsos foram aplicados a cada 20 s e todas as experiências foram realizadas à temperatura ambiente. 4.4.2 Análise de Dados
Os valores de IC50 e IC20 foram calculados para cada composto testado. Foi calculado o número de vezes da diferença entre a IC20 e as concentrações Cmax do composto de ensaio não ligado obtidas a doses terapêuticas relevantes como determinadas pelos resultados obtidos a partir do modelo de CIA em rato.
Para as curvas concentração-resposta foi medida a amplitude da corrente de cauda máxima durante o passo de tensão até -50 mV. O ajuste da curva aos dados de concentração-resposta foi realizado utilizando a equação: 116 y = a + [(b -a)/ (1+ L0A ((logox) d)] em que a é a resposta mínima, b é a resposta máxima e d é o declive, esta equação pode ser utilizada para calcular a IC5o (em que y = 50 e c é o valor de IC50) e a IC20 (em que y = 20 e c é o valor de IC2o)· O software GraphPad® Prism® (Graphpad® Software Inc.) foi utilizado pata todos os ajustes de curva. O Quadro IX abaixo resume os resultados obtidos para os compostos seleccionados que foram testados.
QUADRO IX
Composto Dose Número de vezes de diferença 37 10 7 176 3 137 176 10 82
Uma diferença de 100 vezes ou mais indica um potencial baixo para prolongar o QT. Por conseguinte, pode observar-se que quando comparado com o Composto de comparação 37, o Composto 176 tem um potencial muito menor para prolongar o QT.
Exemplo 4.5 Estabilidade Microssomal
Uma solução-mãe lOmM de composto em DMSO foi diluída 1000 vezes em tampão de fosfato 182 mM, pH7,4 numa placa de 96 poços profundos (Greiner, N° cat. 780285) e pré-incubada a 37 °C. 117
Foram adicionados 40 pL de água desionizada a um poço de um tubo de armazenagem em polipropileno marcado com código de barras Matrix 2D (Thermo Scientific) e pré-incubados a 37 °C.
Foi preparada uma solução-mãe de trabalho de glucose-6-fosfato-desidrogenase (G6PDH) em tampão de fosfato 182 mM, pH 7, 4 e colocada sobre gelo antes da utilização. Um cofactor contendo MgCl2, glucose-6-fosfato e NADP+ foi preparado em água desionizada e colocado sobre gelo antes da utilização.
Uma solução de trabalho final contendo microssomas de fígado (Xenotech) de uma espécie de interesse (humano, ratinho, rato, cão), G6PDH anteriormente descrita e cofactores foi preparada e esta mistura foi incubada durante não mais do que 20 minutos à temperatura ambiente.
Foram adicionados 30 pL da diluição de composto pré-aquecida a 40 pL de água pré-aquecida nos tubos Matrix e foram adicionados 30 pL da mistura microssomal. As concentrações finais na reacção foram composto 3 pM, 1 mg de microssomas, 0,4 U/mL de GDPDH, MgCl2 3,3 mM, glucose-6-f osf ato 3,3 mM e NADP+ 1,3 mM.
Para medir a percentagem remanescente de composto ao tempo zero foi adicionado MeOH ou ACN (1:1) ao poço antes da adição da mistura microssomal. As placas foram seladas com Matrix Sepra sealsTM (Matrix, N° cat. 4464) e agitadas durante alguns segundos para garantir a mistura completa de todos os componentes. 118
As amostras que não foram paradas são incubadas a 3 7 °C, 300 rpm e após 1 hora de incubação a reacção foi parada com MeOH ou ACN (1:1) .
Depois de parar a reacção as amostras foram misturadas e colocadas sobre gelo durante 30 min para precipitar as proteínas. As placas foram, em seguida, centrifugadas 30 min a 1200 rcf a 4 °C e o sobrenadante foi transferido para uma placa 96 de fundo em V em PP (Greiner, 651201) para análise por LCMS.
Estas placas foram seladas com tapetes selantes (MA96RD-04S) de www.kinesis.co.uk e as amostras foram medidas à temperatura ambiente por LCMS (ZQ 1525 da Waters) sob condições optimizadas utilizando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula parental.
As amostras foram analisadas por LCMS com um caudal de 1 mL/min. O solvente A foi amónia 15 mM e o solvente B foi metanol ou acetonitrilo, dependendo da solução de paragem utilizada. As amostras foram corridas sob spray de iões positivos numa coluna XBridge C18 3,5 μΜ (2,1 x 30 mm), da Waters. 0 gradiente de solvente tinha um tempo total de corrida de 2 minutos e varia desde 5% de B até 95% de B. A área do pico do composto parental ao tempo 0 foi considerada como sendo 100% remanescente. A percentagem remanescente após 1 hora de incubação foi calculada a partir do tempo 0 e foi calculada como a percentagem remanescente. A solubilidade do composto na concentração de ensaio final no tampão é inspeccionada por microscópio e são indicados os resultados. 119
Os dados sobre a estabilidade microssomal são expressados como uma percentagem da quantidade total de composto remanescente após 60 minutos. QUADRO X - Estabilidade microssomal
Composto Na Humano (%) Rato (%) 12 70 94 14 15 43 14 36 11,65 72,41 37 70,98 79,47 38 57 42, 75 34, 5 72 4, 88 2,2 78 78,21 93,85 92 30,21 23,6 127 163 53,64 39, 78 165 167 174 176 157, 1 90,21 182 19,33 19,23 190 2,13 25,64 192 127,2 77,62 197 46,6 59,41 198 65, 8 72,45 120
Exemplo 4. 6
Permeabilidade de Caco2
Foram realizados ensaios Caco-2 bidireccionais como descrito a seguir. As células Caco-2 foram obtidas da Colecção Europeia de Culturas de Células (ECACC, cat 86010202) e utilizadas após uma cultura de células de 21 dias em placas de 24 poços Transwell (Fisher TKT-545-020B).
Foram aplicadas 2xl05 células/poço em meio de aplicação consistindo de DMEM + GlutaMAXI + 1% de NEAA + 10% de FBS (FetalClone II) + 1% de Pen/Estrep. O meio foi mudado a cada 2-3 dias.
Os compostos de ensaio e referência (propranolol e rodaminal23 ou vinblastina, todos adquiridos de Sigma) foram preparados em Solução Salina Equilibrada de Hanks contendo HEPES 25 mM (pH 7,4) e adicionados às câmaras apical (125 pL) ou basolateral (600 pL) da montagem da placa Transwell a uma concentração de 10 pM com uma concentração final de DMSO de 0,25%.
Foi adicionado Amarelo Lucifer 50pM (Sigma) ao tampão dador em todos os poços para avaliar a integridade das camadas de células seguindo a permeação do Amarelo Lucifer. Como o Amarelo Lucifer (LY) não consegue permear livremente barreiras lipófilas, um alto grau de transporte do LY indica uma fraca integridade da camada de células.
Após uma incubação de 1 hora a 3 7 °C enquanto se agitava num agitador orbital a 150 rpm, foram retiradas aliquotas de 70pL das câmaras apical (A) e basal (B) e adicionadas a lOOpL de 121 solução de acetonitrilo:água 50:50 contendo um padrao interno analítico (carbamazepina 0,5 μΜ) numa placa de 96 poços. 0 Amarelo Lucifer foi medido com um Spectramax Gemini XS (Ex 426nm e Em 538nm) numa placa de 96 poços limpa contendo 150pL de líquido dos lados basolateral e apical.
As concentrações de composto nas amostras foram medidas por cromatografia líquida de alta eficiência líquido/espectroscopia de massa (LC-MS/MS).
Os valores de permeabilidade aparente (Pap) foram calculados a partir da relação:
Pap [COmpOStO] final no aceitador X ^aceitador / ( [COHipOStO] inicial no dador X ^dador) / T±nc X Vdador / área superficial X 60 X 1CT6 cm/s V = volume da câmara
Tine = tempo de incubação. Área superficial = 0,33 cm2
As proporções de efluxo, como uma indicação do efluxo activo da superfície da célula apical, foram calculadas utilizando a proporção de Pap B>A/ Pap A>B.
Foram utilizados os seguintes critérios de aceitação para o ensaio:
Propranolol: valor de Pap (A>B) > 20(X10~6 cm/s)
Rodamina 123 ou Vinblastina: valor de Pap (A>B) < 5 (xl0~6 cm/s) com proporção de efluxo >5.
Permeabilidade do Amarelo Lucifer: <100 nm/s 122
Quadro XI - Taxa de efluxo de Caco2
Composto Ns Pap A>B (xlO-6 cm/s) Taxa de efluxo 12 23,3 0,82 15 25, 8 0,91 36 36,55 0,89 37 23 0,85 72 14, 93 1,31 78 2 1,5 163 13,4 0,85 176 10,6 0,8 192 12,5 2
Exemplo 4.7 Estudo de farmacocinética em roedores 4.7.1 Estudo de farmacocinética
Os compostos são formulados em misturas de PEG200/soro fisiológico ou PEG400/DMSO/soro fisiológico para a via intravenosa e em 0,5% de metilcelulose ou 10-30% de hidroxilpropil-p-ciclodextrina pH 3 ou pH 7,4 para a via oral. Os compostos de ensaio são administrados por via oral como uma única administração com sonda esofágica a 5-10 mg/kg e administrados por via intravenosa como um bolus através da veia caudal a 1 mg/kg. Cada grupo consiste de 3 ratos. Foram colhidas amostras de sangue através da veia jugular utilizando ratos canulados ou no seio retro-orbital com heparina de litio como anticoagulante aos pontos de tempo na gama seguinte: 0,05 a 8 horas (via intravenosa), e 0,25 a 6 ou 24 horas (via oral). As amostras de sangue completo são centrifugadas a 5000 rpm durante 123 10 min e as amostras de plasma resultantes são conservadas a -20 °C até à análise. 4.7.2 Quantificação dos níveis de composto no plasma
As concentrações de cada composto de ensaio no plasma são determinadas por um método de LC-MS/MS em que o espectrómetro de massa é operado no modo de electrosspray positiva. 4.7.3 Determinação dos parâmetros farmacocinéticos
Os parâmetros farmacocinéticos sao calculados utilizando Winnonlin® (Pharsight®, United
Exemplo 4.8 Estudo de toxicidade de 7 dias em ratos
Foi realizado um estudo de toxicidade oral de 7 dias com compostos de ensaio em ratos Sprague-Dawley machos para avaliar o seu potencial tóxico e a toxicocinética, a doses diárias de 100, 300 e 500 mg/kg/dia, por sonda esofágica, a um volume de administração constante de 5 mL/kg/dia.
Os compostos de ensaio foram formulados em ΗΡβΟϋ a 30% (v/v) em água purificada. Cada grupo incluiu 5 ratos machos principais bem como 3 animais satélites para toxicocinética. A um quarto grupo foi administrado ΗΡβϋϋ a 30% (v/v) apenas em água, à mesma frequência, volume de dosagem e pela mesma via de administração, e funcionou como o grupo de controlo de veiculo. 124 0 objectivo do estudo foi determinar a dose mais baixa que não resultava na identificação de quaisquer eventos desfavoráveis (nível de efeito desfavorável não observável -NOAEL) . 0 Composto de comparação 37 e o composto 176 foram testados neste protocolo.
Os níveis NOAEL para o Composto de comparação 3 7 e o composto 176 foram ambos estimados a 500 mg/kg.
Será entendido pelos especialistas na técnica que as descrições precedentes são de natureza ilustrativa e explicativa e, como indicado, destinadas a ilustrar a invenção e as suas formas de realização preferidas. Através de experiências de rotina, um técnico reconhecerá modificações e variações evidentes que podem ser feitas sem se sair do espírito da invenção. Assim, a invenção é definida não pela descrição acima, mas pelas reivindicações que se seguem e os seus equivalentes.
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Todas as publicações, incluindo mas não estando limitadas a patentes e pedidos de patente, citadas nesta descrição são aqui incorporadas por referência como se cada publicação individual fosse especifica e individualmente indicada para ser aqui incorporada por referência como se plenamente definida. A partir da descrição anterior serão evidentes para os especialistas na técnica várias modificações e alterações nas composições e métodos desta invenção. Todas essas modificações que fiquem no âmbito das reivindicações apensas destinam-se a estar incluídas nas mesmas.
Deve ser entendido que factores, tal como a capacidade de penetração celular diferencial dos vários compostos podem contribuir para discrepâncias entre a actividade dos compostos nos ensaios bioquímico e celular in vitro.
Pelo menos alguns dos nomes químicos dos compostos da invenção como indicados e definidos neste pedido, podem ter sido gerados numa base automatizada utilizando um programa de software de nomes químicos comercialmente disponível e não foram independentemente verificados. Os programas representativos que realizam esta função incluem a ferramenta de atribuição de nomes Lexichem vendida pela Open Eye Software, Inc. e a ferramenta de Software Autonom vendida pela MDL, Inc. Na eventualidade de o nome químico indicado e da estrutura representada diferirem, a estrutura representada terá precedência.
As estruturas químicas aqui mostradas foram preparadas utilizando ChemDraw® ou ISIS® /DRAW. Qualquer valência aberta que surja num átomo de carbono, oxigénio ou azoto nas estruturas aqui contidas indica a presença de um átomo de hidrogénio. 131
Quando há um centro quiral numa estrutura mas nao é mostrada quiral, sao associados à qualquer estereoquímica específica para o centro abrangidos pela estrutura ambos os enantiómeros estrutura quiral.
Lisboa, 28 de Março de 2013 132

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de acordo com a Fórmula Via:
    Via ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  2. 2. Composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1.
  3. 3. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 no fabrico de um medicamento.
  4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2 para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou estados que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoriase, doença 1 alérgica das vias aéreas (e. g.f asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g. , insuficiência cardíaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g, doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão).
  5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2 para ser utilizado no tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças proliferativas.
  6. 6. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 na preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou profilaxia de doenças que envolvem degradação de cartilagem, degradação de osso e/ou articulação, por exemplo osteoartrite; e/ou estados que envolvem inflamação ou respostas imunológicas, tais como doença de Crohn, artrite reumatóide, psoríase, doença alérgica das vias aéreas (e. g., asma, rinite), artrite idiopática juvenil, colite, doenças inflamatórias do intestino, estados patológicos impulsionados por endotoxinas (e. g., complicações após cirurgia de ponte coronária ou estados crónicos de endotoxinas que contribuem para, e. g., insuficiência cardíaca crónica), doenças que envolvem deficiência da renovação de cartilagem (e. g., doenças que envolvem a estimulação anabólica de condrócitos), 2 malformações congénitas da cartilagem, doenças associadas a hipersecreção de IL6 e rejeição de transplante (e. g., rejeição de transplante de órgão).
  7. 7. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1 na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças proliferativas.
  8. 8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2 compreendendo um ou mais outros agentes activos.
  9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 4 ou 5 para ser utilizado em associação com um ou mais outros agentes activos.
  10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 6 ou 7 em que o medicamento é para administração com um ou mais outros agentes activos.
  11. 11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, um composto de acordo com a reivindicação 9 ou a utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o um ou mais outros agentes activos são agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de uma doença que envolve inflamação, artrite, distúrbios proliferativos doenças auto-imunes, rejeição de transplante, asma e/ou rinite e/ou COPD, IBD, SLE ou psoríase.
  12. 12. Composição farmacêutica, composto ou utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o um ou mais outros agentes activos são agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de uma doença que envolve inflamação 3 seleccionados de agentes imunorreguladores e. g., azatioprina, corticosteróides (e. g., prednisolona ou dexametasona), ciclofosfamida, ciclosporina A, tacrolimus, Micofenolato de Mofetil, muromonab-CD3 (0KT3), ATG, aspirina, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno e piroxicam; agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de artrite seleccionados de analgésicos, fármacos anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDS), esteróides, DMARDS sintéticos (e. g., metotrexato, leflunomida, sulfassalazina, auranofina, aurotiomalato de sódio, penicilamina, cloroquina, hidroxicloroquina, azatioprina e ciclosporina), e DMARDS biológicos (e. g., Infliximab, Etanorcept, Adalimumab, Rituximab e Abatacept); agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios proliferativos seleccionados de metotrexato, leucovorina, adriamicina, prenisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorrelbina, doxorrubicina, tamoxifeno, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozole, goserrelina, anticorpo monoclonal anti-HER2, capecitabina, cloridrato de raloxifeno, inibidores de EGFR, inibidores de VEGF, inibidores de proteassoma e inibidores de hsp90 (e. g., 17-AAG); agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de doenças auto-imunes seleccionados de glucocorticóides, agentes citostáticos (e. g., análogos de purina), agentes alquilantes, (e. g., mostardas de azoto (ciclofosfamida), nitrosoureias e compostos de platina), antimetabolitos (e. g., metotrexato, azatioprina e mercaptopurina), antibióticos citotóxicos (e. g., dactinomicina antraciclinas, mitomicina C, bleomicina e mitramicina), anticorpos (e. g., anticorpos monoclonais anti-CD20, anti-CD25 ou anti-CD3 (0TK3)), ciclosporina, 4 interferoes (e. g., tacrolimus, rapamicina (sirolimus), IFN-β), proteínas de ligação ao TNF (e. g.r inflixima, etanorcept, ou adalimumab), micofenolato, Fingolimod e Miriocina; agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de rejeição de transplante seleccionados de inibidores de calcinourina (e. g., ciclosporina ou tacrolimus (FK506)), inibidores de mTOR (e. g., sirolimus, everolimus), antiproliferativos (e. g., azatioprina, ácido micofenólico), corticosteróides (e. g.r prednisolona, hidrocortisona), Anticorpos (e. g., anticorpos monoclonais anti-receptor de IL-2Roí, basiliximab, daclizumab) , e anticorpos policlonais anti-células T (e. g., anti-globulina de timócitos (ATG), anti-globulina de linfócitos (ALG)); agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de asma e/ou rinite e/ou COPD seleccionados de agonistas dos receptores adrenérgicos beta2 (e. g.r salbutamol, levalbuterol, terbutalina e bitolterol), epinefrina (inalada ou comprimidos), anticolinérgicos (e. g., brometo de ipratrópio), glucocorticóides (orais ou inalados) agonistas de β2 de acção prolongada (e. g. / salmeterol, formoterol, bambuterol e albuterol oral de libertação prolongada), associações de esteróides inalados e broncodilatadores de acçao prolongada (e. g. / fluticasona/salmeterol, budesonida/formoterol), antagonistas e inibidores de síntese de leucotrienos (e. g., montelucaste, zafirlucaste e zileuton), inibidores de libertação de mediador (e. g., cromoglicato e cetotifeno), reguladores biológicos da resposta de IgE (e. g., omalizumab), anti-histaminicos (e. g., ceterizina, cinarizina, fexofenadina) e vasoconstritores (e. g., oximetazolina, xilometazolina, nafazolina e tramazolina; agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de 5 IBD seleccionados de glucocorticóides (e. g., prednisona, budesonida) agentes imunomoduladores sintéticos modificadores de doença (e. g., metotrexato, leflunomida, sulfassalazina, messalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina e ciclosporina) e agentes imunomoduladores biológicos modificadores de doença (infliximab, adalimumab, rituximab e abatacept); agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de SLE seleccionados de fármacos anti-reumáticos modificadores de doença (DMARD), tais como antimaláricos (e. g., plaquenil, hidroxicloroquina), imunossupressores (e. g., metotrexato e azatioprina), ciclofosfamida e ácido micofenólico, fármacos imunossupressores e analgésicos, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteróides, opiáceos (e. g., dextropropoxifeno e co-codamol), opióides (e. g., hidrocodona, oxicodona ou metadona) e o adesivo transdérmico Duragesic de fentanilo; ou agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de psoríase seleccionados de tratamentos tópicos, tais como soluções de banho, hidratantes, cremes e pomadas medicados contendo alcatrão de carvão, ditranol (antralina), corticosteróides como desoximetasona, fluocinonida, análogos de vitamina D3 (e. g., calcipotriol), óleo e retinóides de Argão (etretinato, acitretina, tazaroteno), tratamentos sistémicos, tais como metotrexato, ciclosporina, retinóides, tioguanina, hidroxiureia, sulfassalazina, micofenolato de mofetil, azatioprina, tacrolimus, ésteres de ácido fumárico e produtos biológicos, tais como ustecinumab (um bloqueador de IL-12 e IL-23). Lisboa, 28 de Março de 2013 6
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