BR112016016732B1 - Derivados de benzimidazol, seus usos, e composições farmacêuticas para tratamento de distúrbios inflamatórios - Google Patents

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Abstract

DERIVADOS DE BENZIMIDAZOL, SEUS USOS, E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS INFLAMATÓRIOS. A presente invenção refere-se a compostos de acordo com a Fórmula (I), em que Cy, R1, L1, R3, R4, R5, La, e Ra são como definidos neste documento. Divulgam-se novos benzimidazóis de acordo com a Fórmula (I), capazes de inibir a JAK, estes compostos podem ser preparados como uma composição farmacêutica, e podem ser usados para a prevenção e o tratamento de uma variedade de condições em mamíferos, incluindo os seres humanos, incluindo, a título de exemplo não limitativo, as doenças alérgicas, as doenças inflamatórias, as doenças autoimunes, as doenças proliferativas, a rejeição ao transplante, as doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, as malformações congênitas da cartilagem, e/ou as doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se aos compostos que são inibidores de JAK, uma família de tirosina cinases que está envolvida em doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons. Em particular, os compostos da invenção inibem a JAK1 e/ou a TYK2. A presente invenção também proporciona métodos para a produção dos compostos da invenção, composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção, métodos para a prevenção e/ou o tratamento de doenças envolvendo doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proli- ferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecre- ção de interferons, por administração de um composto da invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] As cinases de Janus (JAKs) são tirosina cinases citoplás- micas que transduzem a sinalização das citocinas a partir de receptores das membranas para fatores de transcrição de STAT. São descritos quatro membros da família de JAK, JAK1, JAK2, JAK3 e TYK2. Com a ligação da citocina ao seu receptor, os membros da família de JAK auto e/ou transfosforilam um ao outro, seguido por fosforilação das STATs, que então migram para o núcleo para modular a transcrição. A transdução de sinal intracelular de JAK-STAT ajuda os interfe- rons, a maior parte das leucinas, bem como uma variedade de citoci- nas e fatores endócrinos, tais como EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF e PRL.(Vainchenker e col., 2008).
[003] A combinação de modelos genéticos e pesquisa por inibidores de JAK de pequenas moléculas revelou o potencial terapêutico de diversas JAKs. A JAK3 é validada, por genética de camundongo e humana, como um alvo de imunossupressão. (O'Shea e col., 2004) Os inibidores de JAK3 foram adotados com êxito no desenvolvimento clínico, inicialmente para a rejeição ao transplante de órgãos, porém, posteriormente, também em outras indicações imunoinflamatórias, tais como a artrite reumatoide (RA), a psoríase e a doença de Crohn (http://clinicaltrials.gov/).
[004] A TYK2 é um alvo potencial para as doenças imunoinflama- tórias, sendo validada por genética humana e estudos de nocaute em ratos. (Levy e Loomis, 2007).
[005] A JAK1 é um alvo na área de doenças imunoinflamatórias. A JAK1 heterodimeriza com as outras JAKs, para transduzir a sinalização pró-inflamatória conduzida por citocinas. Portanto, a inibição da JAK1 é de interesse para as doenças imunoinflamatórias com citoci- nas associadas à patologia que usam a sinalização de JAK1, tais como IL-6, IL-4, IL-5, IL-13, ou IFNgama, assim como para outras doenças conduzidas por transdução de sinal mediada por JAK.
[006] A degeneração da cartilagem é a característica de diversas doenças, entre as quais a artrite reumatoide e a osteoartrite são as mais notórias. A artrite reumatoide (RA) é uma doença degenerativa crônica da articulação, caracterizada por inflamação e destruição das estruturas das articulações. Quando a doença estiver descontrolada, ela leva a uma limitação e dor substanciais devidas à perda da funcionalidade da articulação e mesmo à morte prematura. O objetivo da terapia de RA, portanto, não somente é retardar a doença, como tam- bém obter a remissão para parar a destruição da articulação. Além da gravidade da consequência da doença, o alto predomínio de RA (~ 0,8% dos adultos é afetado no mundo todo) significa um alto impacto socioeconômico. (Choy e Panayi, 2001; Firestein, 2003; Lee e Wein- blatt, 2001; O'Dell, 2004; Smolen e Steiner, 2003).
[007] A JAK1 e a JAK2 estão envolvidas na transdução de sinal intracelular para muitas citocinas e hormônios. As patologias associadas com quaisquer destas citocinas e hormônios podem ser atenuadas por inibidores da JAK1 e da JAK2. Consequentemente, diversas condições alérgicas ou inflamatórias e doenças autoimunes poderiam beneficiar-se do tratamento com os compostos descritos neste invenção, incluindo a artrite reumatoide, o lúpus eritematoso sistêmico, a artrite idiopática juvenil, a asma, a doença pulmonar obstrutiva crônica COPD, a fibrose do tecido, a inflamação eosinofílica, a esofagite, as doenças inflamatórias do intestino (p.ex., de Crohn, colite ulcerativa), o transplante, a doença do enxerto versus hospedeiro, a psoríase, a mi- osite, a esclerose múltipla. (Kopf e col., 2010)
[008] A osteoartrite (também referida como OA, ou artrite do desgaste) é a forma mais comum de artrite e é caracterizada por perda de cartilagem articular, frequentemente associada com hipertrofia do osso e dor. (Wieland e col., 2005)
[009] A osteoartrite é difícil de tratar. No momento, não está disponível nenhuma cura e o tratamento concentra-se em aliviar a dor e evitar que a articulação afetada se torne deformada. Os tratamentos comuns incluem o uso de fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs). Embora os suplementos dietéticos, tais como a condroitina e o sulfato de glicosamina, tenham sido defendidos como opções seguras e eficazes para o tratamento de osteoartrite, um ensaio clínico recente revelou que ambos os tratamentos não reduziam a dor associada com a osteoartrite. (Clegg e col., 2006)
[0010] O estímulo dos processos anabólicos, o bloqueio dos processos catabólicos, ou uma combinação destes, pode resultar na estabilização da cartilagem e, talvez, até a reversão do dano e, portanto, impedir a progressão adicional da doença. Foram desenvolvidos métodos terapêuticos para a correção das lesões das cartilagens articulares que aparecem durante a doença osteoartrítica, porém, até agora, nenhum deles foi capaz de mediar a regeneração da cartilagem articular in situ e in vivo. Considerados juntos, nenhum fármaco modificador da doença está disponível.
[0011] Vandeghinste e col. (Vandeghinste e col., 2005) revelaram a JAK1 como um alvo cujo inibição poderia ter relevância terapêutica para diversas doenças, incluindo a OA. O nocaute do gene de JAK1 em camundongos demonstrou que a JAK1 desempenha papéis essenciais e não redundantes durante o desenvolvimento: os camundongos JAK1-/- morreram dentro de 24 h após o nascimento e o desenvolvimento dos linfócitos foi gravemente diminuído. Além disso, as células de JAK1 -/- não eram, ou eram menos, reativas à citocinas que usam os receptores de citocinas de classe II, aos receptores de citoci- nas que usam a subunidade de gama-c para a sinalização e à família de receptores de citocinas que usam a subunidade de gp130 para a sinalização.(Rodig e col., 1998)
[0012] Diversos grupos envolveram a sinalização de JAK-STAT na biologia dos condrócitos. Li e col. (Li e col., 2001) mostraram que a Oncostatina M induz a expressão de gene de MMP e TIMP3 em con- drócitos primários, por ativação das vias de sinalização de JAK/STAT e MAPK. Osaki e col. (Osaki e col., 2003) mostraram que a inibição mediada pelo interferon-gama do colágeno II nos condrócitos envolve a sinalização de JAK-STAT. A IL1-beta induz o catabolismo da cartilagem por redução da expressão dos componentes de matriz, e por indução da expressão das colagenases e da óxido nítrico sintase induzí- vel (NOS2), que media a produção de óxido nítrico (NO). Otero e col. (Otero e col., 2005) mostraram que a leptina e a IL1-beta induziram de modo sinérgico a produção de NO ou a expressão do mRNA de NOS2 nos condrócitos, e que isto foi bloqueado por um inibidor da JAK. Legendre e col. (Legendre e col., 2003) mostraram que o Receptor de IL6/IL6 induziu a infrarregulação dos genes de matriz específicos para a cartilagem colágeno II, núcleo de agrecano e proteína de ligação nos condrócitos articulares bovinos, e que isto foi mediado pela sinalização de JAK/STAT. Portanto, estas observações sugerem um papel para a atividade da cinase JAK na homeostasia da cartilagem e oportunidades terapêuticas para os inibidores da cinase JAK.
[0013] Os membros da família de JAK têm estado envolvidos em condições adicionais, incluindo os distúrbios mieloproliferativos (O'Sullivan e col., 2007), onde foram identificadas mutações na JAK2. Isto indica que os inibidores de JAK, em particular a JAK2, podem também ser de uso no tratamento de distúrbios mieloproliferativos. Adicionalmente, a família de JAK, em particular JAK1, JAK2 e JAK3, tem estado ligada aos cânceres, em particular as leucemias, p.ex., a leucemia mieloide aguda (O'Sullivan e col., 2007; Xiang e col., 2008), e a leucemia linfoblástica aguda (Mullighan e col., 2009), ou os tumores sólidos, p.ex., o leiomiossarcoma uterino (Constantinescu e col., 2008), o câncer da próstata (Tam e col., 2007). Estes resultados indicam que os inibidores de JAK, em particular de JAK1 e/ou JAK2, podem também ter utilidade no tratamento de cânceres (leucemias e tumores sólidos, p.ex., leiomiossarcoma uterino, câncer da próstata).
[0014] Além disso, a doença de Castleman, o mieloma múltiplo, a glomerulonefrite proliferativa mesangial, a psoríase, e o sarcoma de Kaposi são prováveis devido à hipersecreção da citocina IL-6, cujos efeitos biológicos são mediados por sinalização de JAK-STAT intracelular (Naka e col., 2002). Este resultado mostra que os inibidores de JAK podem também encontrar utilidade no tratamento das ditas doenças.
[0015] As terapias atuais não são satisfatórias e, portanto, permanece uma necessidade de identificar compostos adicionais que possam ser de uso no tratamento de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons. A presente invenção, portanto, proporciona compostos, métodos para a sua fabricação e composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção, juntamente com um veículo farmacêutico adequado. A presente invenção também proporciona o uso de um composto da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hi- persecreção de interferons.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0016] A presente invenção é baseada na descoberta que os compostos da invenção são capazes de atuar como inibidores de JAK e que eles são úteis para o tratamento de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons. Em um aspecto específico, os compostos da invenção são inibidores de JAK1 e/ou TYK2. A presente invenção também proporciona métodos para a produção destes compostos, composições farmacêuticas compreendendo estes compostos e métodos para tratar doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças prolifera- tivas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons por administração de um composto da invenção.
[0017] Consequentemente, em um primeiro aspecto da invenção, os compostos da invenção são proporcionados de acordo com a Fórmula (I):
Figure img0001
em que
[0018] R1 é H, ou Me;
[0019] L1 é -NR2-; -O-, ou -CH2-;
[0020] Cy é fenila, ou heteroarila monocíclica ou bicíclica fundida de 5-9 elementos compreendendo de 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S;
[0021] R2 é H, ou C1-4 alquila;
[0022] R3 é H, halogênio, C1-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais halo, ou C1-4 alcóxi opcionalmente substituído com um ou mais halo;
[0023] R4 é H, ou halo;
[0024] R5 é -CN, halo, ou é -L2-R6
[0025] -L2 está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, - SO2-, -SO2NR7-, ou -NR7SO2-;
[0026] R6 é H, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída com um ou mais grupos R8 independentemente selecionados;
[0027] R7 é H, ou C1-4 alquila;
[0028] R8 é OH, CN, halo, ou C1-4 alcóxi,
[0029] La está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)O-, ou -C(=O)NH-;
[0030] Ra é:
[0031] H,
[0032] C1-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais Rb independentemente selecionado,
[0033] C3-7 cicloalquila monocíclica opcionalmente substituída com um ou mais Rc independentemente selecionado, ou
[0034] heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S, ou
[0035] heteroarila monocíclica de 5-6 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S;
[0036] Rb é
[0037] halo,
[0038] CN,
[0039] OH,
[0040] C1-4 alcóxi,
[0041] C3-7 cicloalquila,
[0042] heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S (heterocicloalquila esta que é opcionalmente substituída com um ou mais halo, ou oxo independentemente selecionado),
[0043] -SO2-C1-4 alquila, ou
[0044] -C(=O)NRb1Rb2
[0045] Rc é
[0046] halo,
[0047] CN,
[0048] OH,
[0049] C1-4 alquila,
[0050] -C(=O)OH, ou
[0051] -C(=O)NRc1Rc2; e
[0052] cada Rb1, Rb2, Rc1 e Rc2 é independentemente selecionado a partir de H, e C1-4 alquila.
[0053] Em uma modalidade particular, os compostos da invenção são inibidores de JAK1 e/ou TYK2.
[0054] Surpreendentemente, foi agora verificado que os compostos da invenção podem exibir atividade in vitro melhorada, quando comparados com os análogos estreitamente relacionados.
[0055] Além disso, em um aspecto particular, os compostos da invenção podem exibir estabilidade melhorada in vitro, quando comparados com os análogos estreitamente relacionados. Essa melhora pode resultar in vivo em uma menor dosagem do fármaco que está sendo requerido e, com isso, pode resultar em toxicidade e/ou interação fármaco-fármaco diminuídas.
[0056] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem os compostos da invenção, e um veículo, excipiente ou diluente farmacêutico. Além disso, os compostos da invenção, úteis nas composições farmacêuticas e nos métodos de tratamento divulgados neste documento, são farma- ceuticamente aceitáveis como preparados e usados. Nesse aspecto da invenção, a composição farmacêutica pode adicionalmente compreender ingredientes ativos adicionais, adequados para o uso em combinação com os compostos da invenção.
[0057] Em um aspecto adicional, a invenção proporciona um composto da invenção ou uma composição farmacêutica que compreende um composto da invenção para uso como um medicamento. Em uma modalidade específica, a dita composição farmacêutica adicionalmente compreende um ingrediente ativo adicional.
[0058] Em um aspecto adicional da invenção, essa invenção proporciona um método de tratar um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, uma condição dentre aquelas listadas neste documento, e particularmente, tal condição conforme possa estar associada com a atividade de JAK anormal, p.ex., as doenças alérgicas, as doenças inflamatórias, as doenças autoimunes, as doenças proliferativas, a rejeição ao transplante, as doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, as malformações congênitas da cartilagem, e/ou as doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons, método este que compreende administrar uma quantidade eficaz da composição farmacêutica ou do composto da invenção como descrito neste documento. Em uma modalidade específica, a condição está associada com a atividade de JAK1 e/ou TYK2 anormal.
[0059] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um composto da invenção para o uso no tratamento ou na profilaxia de uma condição selecionada a partir daquelas listadas neste documento, particularmente tais condições conforme possam estar associadas com a atividade de JAK anormal, p.ex., as doenças alérgicas, as doenças inflamatórias, as doenças autoimunes, as doenças proliferati- vas, a rejeição ao transplante, as doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, as malformações congênitas da cartilagem, e/ou as doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hiperse- creção de interferons.
[0060] Ainda em outro aspecto de método de tratamento, essa invenção proporciona um método para tratar um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, uma condição que é causalmente relacionada à atividade de JAK anormal, como descrito neste documento, e compreende administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição, da composição farmacêutica ou de um composto da in- venção descrito neste documento. Em um aspecto específico, a condição é causalmente relacionada à atividade de JAK1 e/ou TYK2 anormal.
[0061] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica que compreende um composto da invenção, para uso como um medicamento.
[0062] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento ou na profilaxia de uma condição que é causalmente relacionada à atividade de JAK anormal.
[0063] Nos aspectos adicionais, essa invenção proporciona métodos para sintetizar os compostos da invenção, com os protocolos sintéticos representativos e as vias descritos posteriormente neste documento.
[0064] Consequentemente, é um objetivo principal dessa invenção proporcionar novos compostos, que possam modificar a atividade de JAK e, desse modo, prevenir ou tratar quaisquer condições que possam ser causalmente relacionadas à ela. Em um aspecto específico, os compostos da invenção modulam a atividade de JAK1 e/ou TYK2.
[0065] É um objetivo adicional dessa invenção proporcionar compostos que possam tratar ou aliviar as condições ou os sintomas das mesmas, tais como as doenças alérgicas, as doenças inflamatórias, as doenças autoimunes, as doenças proliferativas, a rejeição ao transplante, as doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, as malformações congênitas da cartilagem, e/ou as doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons, que possam ser causalmente relacionadas à atividade de JAK, em particular JAK1 e/ou TYK2.
[0066] Um objetivo ainda adicional dessa invenção é proporcionar uma composição farmacêutica que possa ser usada no tratamento ou na profilaxia de uma variedade de condições, incluindo as doenças associadas com a atividade de JAK, tais como as doenças alérgicas, as doenças inflamatórias, as doenças autoimunes, as doenças prolife- rativas, a rejeição ao transplante, as doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, as malformações congênitas da cartilagem, e/ou as doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons. Em uma modalidade específica, a doença está associada com a atividade de JAK1 e/ou TYK2.
[0067] Outros objetivos e vantagens tornar-se-ão evidentes para aqueles versados na técnica a partir de uma consideração da descrição detalhada subsequente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0068] Pretende-se que os termos a seguir tenham os significados apresentados imediatamente abaixo e sejam úteis no entendimento da descrição e do escopo pretendido da presente invenção.
[0069] Ao descrever a invenção, a qual pode incluir os compostos, as composições farmacêuticas que contêm tais compostos e os métodos de uso de tais compostos e composições, os termos a seguir, se presentes, têm os significados a seguir, salvo indicação ao contrário. Deve também ser entendido que, quando descritas neste documento, quaisquer das porções definidas adiante abaixo podem ser substituídas com uma variedade de substituintes, e que pretende-se que as respectivas definições incluam tais porções substituídas dentro do seu escopo, como demonstrado abaixo. Salvo indicação em contrário, o termo "substituído" é para ser definido como demonstrado abaixo. Deve ser adicionalmente entendido que os termos "grupos" e "radicais" podem ser considerados intercambiáveis, quando usados nesse documento.
[0070] Os artigos 'um' e 'uma' podem ser usados neste documento para referirem-se a um ou mais do que um (i.e., pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. A título de exemplo, 'um análogo' significa um análogo ou mais do que um análogo.
[0071] 'Alquila' significa o hidrocarboneto alifático reto ou ramificado com o número de átomos de carbono especificado. Os grupos alquila particulares têm 1 a 8 átomos de carbono. Mais particular é a alquila inferior que tem 1 a 6 átomos de carbono. Um grupo particular adicional tem 1 a 4 átomos de carbono. Os grupos de cadeias retas ilustrativos incluem a metila, a etila, a n-propila, e a n-butila. Ramificado significa que um ou mais grupos alquila inferior, tais como a metila, a etila, a propila ou a butila, estão unidos a uma cadeia de alquila linear, os grupos de cadeias ramificadas ilustrativos incluem a isopropila, a iso-butila, a t-butila e a isoamila.
[0072] 'Alcóxi' refere-se ao grupo -OR26, onde R26 é a alquila com o número de átomos de carbono especificado. Os grupos alcóxi particulares são o metóxi, o etóxi, o n-propóxi, o isopropóxi, o n-butóxi, o terc-butóxi, o sec-butóxi, o n-pentóxi, o n-hexóxi, e o 1,2-dimetilbutóxi. Os grupos alcóxi particulares são o alcóxi inferior, i.e., com entre 1 e 6 átomos de carbono. Os grupos alcóxi particulares adicionais têm entre 1 e 4 átomos de carbono.
[0073] 'Alquenila' refere-se aos grupos de hidrocarboneto olefini- camente (insaturado) monovalente com o número de átomos de carbono especificado. A alquenila particular tem 2 a 8 átomos de carbono, e mais particularmente, de 2 a 6 átomos de carbono, que pode ser de cadeia reta ou ramificada e tendo pelo menos 1 e particularmente de 1 a 2 locais de insaturação olefínica. Os grupos alquenila particulares incluem a etenila (-CH=CH2), a n-propenila (-CH2CH=CH2), a isopro- penila (-C(CH3)=CH2) e similares.
[0074] 'Amino' refere-se ao radical -NH2.
[0075] 'Arila' refere-se a um grupo de hidrocarboneto aromático monovalente derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático de origem. Em particular, a arila refere-se a uma estrutura de anel aromático, monocíclica ou policíclica fundida, com o número de átomos do anel especificado. Especificamente, o termo inclui os grupos que incluem de 6 a 10 elementos no anel. Onde o grupo arila for um sistema de anel monocíclico, ele preferencialmente contém 6 átomos de carbono. Particularmente, os grupos arila incluem a fenila, e a naftila.
[0076] 'Cicloalquila' refere-se a uma estrutura de anel de hidrocar- bila não aromática, monocíclica, policíclica fundida, policíclica ligada, ou espirocíclica, com o número de átomos do anel especificado. A ci- cloalquila pode ter de 3 a 12 átomos de carbono, em particular de 3 a 10, e mais particularmente, de 3 a 7 átomos de carbono. Tais grupos cicloalquila incluem, a título de exemplo, as estruturas de um único anel, tais como a ciclopropila, a ciclobutila, a ciclopentila, a ciclo-hexila, e a ciclo-heptila.
[0077] 'Ciano' refere-se ao radical -CN.
[0078] 'Halo' ou 'halogênio' refere-se ao flúor (F), cloro (Cl), bromo (Br) e iodo (I). Os grupos halo particulares são flúor ou cloro.
[0079] 'Hetero', quando usado para descrever um composto ou um grupo presente sobre um compostom significa que um ou mais átomos de carbono no composto ou grupo foram substituídos por um heteroá- tomo de nitrogênio, oxigênio, ou enxofre. Hetero pode ser aplicado a quaisquer dos grupos hidrocarbila descritos acima, tais como a alquila, p.ex., heteroalquila, a cicloalquila, p.ex., heterocicloalquila, a arila, p.ex., heteroarila, e similares tendo de 1 a 4, e particularmente, de 1 a 3 heteroátomos, mais tipicamente 1 ou 2 heteroátomos, por exemplo um único heteroátomo.
[0080] 'Heteroarila' significa uma estrutura de anel aromático, mo- nocíclica ou policíclica fundida, que inclui um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N e S e o número de átomos do anel especificado. Em particular, a estrutura de anel aromático pode ter de 5 a 9 elementos no anel. O grupo heteroarila pode ser, por exemplo, um anel monocíclico de cinco elementos ou de seis elementos ou uma estrutura bicíclica fundida formada a partir de anéis de cinco e seis elementos fundidos ou dois anéis de seis elementos fundidos ou, a título de um exemplo adicional, dois anéis de cinco elementos fundidos. Cada anel pode conter até quatro heteroátomos tipicamente selecionados a partir de nitrogênio, enxofre e oxigênio. Tipicamente, o anel de heteroarila conterá até 4 heteroátomos, mais tipicamente até 3 heteroátomos, mais usualmente até 2, por exemplo, um único heteroátomo. Em uma modalidade, o anel de heteroarila contém, pelo menos, um átomo de nitrogênio no anel. Os átomos de nitrogênio nos anéis de heteroarila podem ser básicos, como no caso de um imi- dazol ou piridina, ou essencialmente não básicos, como no caso de um nitrogênio de indol ou pirrol. Em geral, o número de átomos de nitrogênio básicos presentes no grupo heteroarila, incluindo quaisquer substituintes de grupo amino do anel, será menos do que cinco.
[0081] Os exemplos de grupos heteroarila monocíclica de cinco elementos incluem, mas não estão limitados aos grupos pirrolila, fura- nila, tiofenila, imidazolila, furazanila, oxazolila, oxadiazolila, oxatriazolila, isoxazolila, tiazolila, isotiazolila, pirazolila, triazolila e tetrazolila.
[0082] Os exemplos de grupos heteroarila monocíclica de seis elementos incluem, mas não estão limitados à piridinila, pirazinila, piri- dazinila, pirimidinila e triazinila. Os exemplos particulares de grupos heteroarila bicíclica contendo um anel de cinco elementos fundido a outro anel de cinco elementos incluem, mas não estão limitados à imi- dazotiazolila e imidazoimidazolila. Os exemplos particulares de grupos heteroarila bicíclica contendo um anel de seis elementos fundido a um anel de cinco elementos incluem, mas não estão limitados aos grupos benzfuranila, benztiofenila, benzimidazolila,benzoxazolila, isobenzoxa- zolila, benzisoxazolila, benzotiazolila, benzisotiazolila, isobenzofurani- la, indolila, isoindolila, indolizinila, purinila (p.ex., adenina, guanina), indazolila, pirazolopirimidinila, triazolopirimidinila, e pirazolopiridinila. Os exemplos particulares de grupos heteroarila bicíclica contendo dois anéis de seis elementos fundidos incluem, mas não estão limitados aos grupos quinolinila, isoquinolinila, piridopiridinila, quinoxalinila, qui- nazolinila, cinolinila, ftalazinila, naftiridinila, e pteridinila. Os grupos heteroarila particulares são aqueles derivados de tiofenila, pirrolila, benzotiofenila, benzofuranila, indolila, piridinila, quinolinila, imidazolila, oxazolila e pirazinila. Os exemplos de heteroarilas representativas incluem os seguintes:
Figure img0002
em que cada Y é selecionado a partir de >C(=O), NH, O e S.
[0083] 'Heterocicloalquila' significa uma estrutura de anel completamente saturado, não aromática, monocíclica, policíclica fundida, es- pirocíclica, ou policíclica ligada, que inclui um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N e S e o número de átomos do anel especificado. A estrutura de anel de heterocicloalquila pode ter de 4 a 12 elementos no anel, em particular de 4 a 10 elementos no anel e mais particularmente, de 4 a 7 elementos no anel. Cada anel pode conter até quatro heteroátomos tipicamente selecionados a partir de nitrogênio, enxofre e oxigênio. Tipicamente, o anel de hete- rocicloalquila conterá até 4 heteroátomos, mais tipicamente até 3 hete- roátomos, mais normalmente até 2, por exemplo, um único heteroáto- mo. Os exemplos de anéis heterocíclicos incluem, mas não estão limitados à azetidinila, oxetanila, tietanila, pirrolidinila (p.ex., a 1- pirrolidinila, a 2-pirrolidinila e a 3-pirrolidinila), morfolinila, tiomorfolinila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidrotiofenila, imidazolinila, oxazolinila, tiazoli- nila, piperidinila (p.ex., a 1-piperidinila, a 2-piperidinila, a 3-piperidinila e a 4-piperidinila), piranila, dioxanila, tetra-hidropiranila (p.ex., a 4- tetra-hidro piranila), 2-pirazolinila, pirazolidinila, ou piperazinila.
[0084] Os exemplos particulares de grupos heterocicloalquila mo- nocíclica são mostrados nos exemplos ilustrativos a seguir:
Figure img0003
em que cada W e Y é independentemente selecionado a partir de CH2, NH, O e S.
[0085] Os exemplos particulares de grupos heterocicloalquila bicí- clica fundida são mostrados nos exemplos ilustrativos a seguir: em que cada W e Y é independentemente selecionado a partir de CH2, NH, O e S.
Figure img0004
[0086] Os exemplos particulares de grupos heterocicloalquila bicí- clica ligada são mostrados nos exemplos ilustrativos a seguir:
Figure img0005
em que cada W e Y é independentemente selecionado a partir de CH2, NH, O e S, e Z é N ou CH.
[0087] Os exemplos particulares de grupos heterocicloalquila espi- rocíclica são mostrados nos exemplos ilustrativos a seguir:
Figure img0006
em que cada Y é selecionado a partir NH, O e S.
[0088] 'Hidroxila' refere-se ao radical -OH.
[0089] 'Oxo' refere-se ao radical =O.
[0090] 'Substituído' refere-se a um grupo em que um ou mais átomos de hidrogênio são, cada um, independentemente substituídos com (um) substituinte(s) igual(is) ou diferente(s).
[0091] 'Sulfo' ou 'ácido sulfônico' refere-se a um radical, tal como - SO3H.
[0092] 'Tiol' refere-se ao grupo -SH.
[0093] Como usado neste documento, o termo 'substituído com um ou mais' refere-se a um a quatro substituintes. Em uma modalidade, ele refere-se a um a três substituintes. Nas modalidades adicionais, ele refere-se a um ou dois substituintes. Ainda em uma modalidade adicional, ele refere-se a um substituinte.
[0094] 'Tioalcóxi' refere-se ao grupo -SR26, onde R26 tem o número de átomos de carbono especificado e, particularmente, C1-C8 alquila. Os grupos tioalcóxi particulares são o tiometóxi, o tioetóxi, o n- tiopropóxi, o isotiopropóxi, o n-tiobutóxi, o terc-tiobutóxi, o sec- tiobutóxi, o n-tiopentóxi, o n-tio-hexóxi, e o 1,2-dimetiltiobutóxi. Os grupos tioalcóxi particulares são o tioalcóxi inferior, i.e, com entre 1 e 6 átomos de carbono. Os grupos alcóxi particulares adicionais têm entre 1 e 4 átomos de carbono.
[0095] Alguém que tenha habilidade comum na técnica de síntese orgânica reconhecerá que o número máximo de heteroátomos em um anel heterocíclico quimicamente viável, estável, quer ele seja aromático, quer ele seja não aromático, é determinado pelo tamanho do anel, pelo grau de insaturação e pela valência dos heteroátomos. Em geral, um anel heterocíclico pode ter um a quatro heteroátomos, desde que o anel heteroaromático seja quimicamente viável e estável.
[0096] 'Farmaceuticamente aceitável' significa aprovado ou apro- vável por uma agência reguladora do governo Federal ou de um estado ou pela agência correspondente em países que não os Estados Unidos, ou que esteja listado na farmacopeia dos U.S. ou outra farmacopeia em geral reconhecida para o uso em animais, e mais particularmente, em seres humanos.
[0097] O 'sal farmaceuticamente aceitável' refere-se a um sal de um composto da invenção que seja farmaceuticamente aceitável e que possua a atividade farmacológica desejada do composto se origem. Em particular, tais sais são não tóxicos e podem ser sais de adição de ácidos inorgânicos ou orgânicos e sais de adição de bases. Especifi-camente, tais sais incluem: (1) sais de adição ácidos, formados com ácidos inorgânicos, tais como o ácido clorídrico, o ácido bromídrico, o ácido sulfúrico, o ácido nítrico, o ácido fosfórico, e similares; ou forma-dos com ácidos orgânicos, tais como o ácido acético, o ácido propiôni- co, o ácido hexanóico, o ácido ciclopentanopropiônico, o ácido glicóli- co, o ácido pirúvico, o ácido lático, o ácido malônico, o ácido succínico, o ácido málico, o ácido maléico, o ácido fumárico, o ácido tartárico, o ácido cítrico, o ácido benzóico, o ácido 3-(4-hidroxibenzoil) benzóico, o ácido cinâmico, o ácido mandélico, o ácido metanossulfônico, o ácido etanossulfônico, o ácido 1,2-etano-dissulfônico, o ácido 2- hidroxietanossulfônico, o ácido benzenossulfônico, o ácido 4- clorobenzenossulfônico, o ácido 2-naftalenossulfônico, o ácido 4- toluenossulfônico, o ácido canforassulfônico, o ácido 4- metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, o ácido glico-heptônico, o ácido 3-fenilpropiônico, o ácido trimetilacético, o ácido butilacético ter-ciário, o ácido lauril sulfúrico, o ácido glicônico, o ácido glutâmico, o ácido hidroxinaftóico, o ácido salicílico, o ácido esteárico, o ácido mu- cônico, e similares; ou (2) sais formados quando um próton ácido pre-sente no composto de origem for substituído por um íon de metal, p.ex., um íon de metal alcalino, um íon alcalinoterroso, ou um íon alumínio; ou coordenar-se com uma base orgânica, tal como a etanolami- na, a dietanolamina, a trietanolamina, a N-metilglucamina e similares. Os sais adicionais incluem, a título de exemplo somente, o sódio, o potássio, o cálcio, o magnésio, o amônio, o tetra-alquilamônio, e similares; e, quando o composto contiver uma funcionalidade básica, os sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos, tais como o clori- drato, o bromidrato, o tartarato, o mesilato, o acetato, o maleato, o oxalato e similares. O termo 'cátion farmaceuticamente aceitável' refere-se a um contraíon catiônico aceitável de um grupo funcional ácido. Tais cátions são exemplificados pelos cátions de sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônio, tetra-alquilamônio, e similares.
[0098] O 'veículo farmaceuticamente aceitável' refere-se a um di- luente, adjuvante, excipiente ou transportador com o qual um composto da invenção é administrado.
[0099] 'Profármacos' refere-se aos compostos, incluindo os derivados dos compostos da invenção, os quais têm grupos cliváveis e se tornam, por solvólise ou sob condições fisiológicas, os compostos da invenção, os quais são farmaceuticamente ativos in vivo. Tais exemplos incluem, porém não estão limitados aos, derivados de ésteres de colina e similares, ésteres de N-alquilmorfolina e similares.
[00100] 'Solvato' refere-se às formas do composto que estão associadas com um solvente, normalmente por uma reação de solvólise. Esta associação física inclui a ligação de hidrogênio. Os solventes convencionais incluem a água, o EtOH, o ácido acético e similares. Os compostos da invenção podem ser preparados, p.ex., na forma cristalina e podem ser solvatados ou hidratados. Os solvatos adequados incluem os solvatos farmaceuticamente aceitáveis, tais como os hidratos, e adicionalmente incluem tanto os solvatos estequiométricos quanto os solvatos não estequiométricos. Em certas situações, o sol- vato será capaz de isolamento, por exemplo, quando uma ou mais moléculas de solvente forem incorporadas na rede cristalina do sólido cristalino. O 'solvato' inclui os solvatos tanto de fase de solução quanto isoláveis. Os solvatos representativos incluem os hidratos, os eta- nolatos e os metanolatos.
[00101] O 'paciente' inclui os seres humanos. Os termos 'ser humano', 'paciente' e 'cobaia' são usados de modo intercambiável neste do-cumento.
[00102] A 'quantidade eficazeficaz' significa a quantidade de um composto da invenção que, quando administrada a um paciente para o tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar tal tratamento para a doença. A "quantidade eficaz" pode variar, dependendo do composto, da doença e de sua gravidade, e da idade, peso, etc., do paciente a ser tratado.
[00103] 'Prevenindo' ou 'prevenção' refere-se a uma redução no risco de adquirir ou desenvolver uma doença ou distúrbio (i.e., fazendo com que pelo menos um dos sintomas clínicos da doença não se desenvolva em um paciente que possa ser exposto a um agente causador de doença, ou estar predisposto à doença antes do início da doença).
[00104] O termo 'profilaxia' está relacionado à 'prevenção', e refere- se a uma medida ou procedimento cujo propósito é prevenir, em vez de tratar ou curar uma doença. Os exemplos não limitativos das medi- das profiláticas podem incluir a administração de vacinas; a adminis-tração de heparina de baixo peso molecular a pacientes em hospitais que corram o risco de trombose devida, por exemplo, à imobilização; e a administração de um agente antimalárico, tal como a cloroquina, antes de uma visita a uma região geográfica onde a malária seja endêmica ou o risco de contrair a malária seja alto.
[00105] 'Tratando' ou 'tratamento' de qualquer doença ou distúrbio refere-se, em uma modalidade, a melhorar a doença ou o distúrbio (i.e., parar a doença ou reduzir a manifestação, o grau ou a gravidade de pelo menos um dos seus sintomas clínicos). Em outra modalidade, 'tratando' ou 'tratamento' refere-se a melhorar pelo menos um parâmetro físico, o qual pode não ser perceptível pelo paciente. Ainda em outra modalidade, 'tratando' ou 'tratamento' refere-se a modular a doença ou o distúrbio, fisicamente (p.ex., estabilização de um sintoma perceptível), fisiologicamente (p.ex., estabilização de um parâmetro físico), ou ambos. Em uma modalidade adicional, "tratando" ou "tratamento" refere-se a retardar a progressão da doença.
[00106] Conforme usado neste documento, o termo 'doença(s) alér- gica(s)' refere-se ao grupo de condições caracterizado por um distúrbio de hipersensibilidade do sistema imune, incluindo a doença alérgica das vias aéreas (p.ex., a asma, a rinite), a sinusite, o eczema e as urti- cárias, assim como as alergias a alimentos ou as alergias ao veneno de inseto.
[00107] Conforme usado neste documento, o termo 'asma', conforme usado neste documento, refere-se a qualquer distúrbio dos pulmões caracterizado por variações no fluxo de gás pulmonar associadas com constrição das vias aéreas de qualquer causa (intrínseca, extrínseca, ou ambas; alérgica ou não alérgica). O termo asma pode ser usado com um ou mais adjetivos para indicar a causa.
[00108] Conforme usado neste documento, o termo 'doença(s) in- flamatória(s)' refere-se ao grupo de condições que inclui a artrite reu- matoide, a osteoartrite, a artrite idiopática juvenil, a psoríase, a artrite psoriática, a espondilite anquilosante, a doença alérgica das vias aéreas (p.ex., a asma, a rinite), a doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), as doenças inflamatórias do intestino (p.ex., a doença de Crohn, a colite ulcerativa), os estados de doenças promovidos por en- dotoxinas (p.ex., as complicações após uma operação de ponte de sa- fena ou os estados de endotoxinas crônicos que contribuem para, p.ex., a insuficiência cardíaca crônica), e as doenças relacionadas envolvendo a cartilagem, tais como aquela das articulações. Particularmente, o termo refere-se à artrite reumatoide, osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (p.ex., asma), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doenças inflamatórias do intestino. Mais particularmente, o termo refere-se à artrite reumatoide, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e doenças inflamatórias do intestino.
[00109] Conforme usado neste documento, o termo 'doença(s) au- toimune(s)' refere-se ao grupo de doenças que inclui a doença obstrutiva das vias aéreas, incluindo as condições tais como a COPD, a asma (por exemplo, a asma intrínseca, a asma extrínseca, a asma do pó, a asma infantil), particularmente a asma crônica ou inveterada (por exemplo, a asma tardia e a hipersensibilidade das vias aéreas), a bronquite, incluindo a asma bronquial, o lúpus eritematoso sistêmico (SLE), o lúpus eritematoso cutâneo, a nefrite por lúpus, a dermatomio- site, a síndrome de Sjogren, a esclerose múltipla, a psoríase, a doença do olho seco, o diabetes melito tipo I e as complicações associadas com ele, o eczema atópico (dermatite atópica), a tireoidite (tireoidite de Hashimoto e autoimune), a dermatite de contato e adicionalmente a dermatite eczematosa, a doença inflamatória do intestino (p.ex., a doença de Crohn e a colite ulcerativa), a aterosclerose e a esclerose lateral amiotrófica. Particularmente, o termo refere-se à COPD, asma, lú- pus eritematoso sistêmico, diabetes melito tipo I e doença inflamatória do intestino. Conforme usado neste documento, o termo 'doença(s) proliferativa(s)' refere-se a condições tais como o câncer (p.ex., leiomi- ossarcoma uterino ou câncer da próstata), os distúrbios mieloprolifera- tivos (p.ex., policitemia vera, trombocitose essencial e mielofibrose), a leucemia (p.ex., leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda e crônica), o mieloma múltiplo, a psoríase, a re-estenose, a esclero- dermia ou a fibrose. Em particular, o termo refere-se ao câncer, leu-cemia, mieloma múltiplo e psoríase.
[00110] Conforme usado neste documento, o termo 'câncer' refere- se a um crescimento maligno ou benigno de células na pele ou nos órgãos do corpo, por exemplo, porém sem limitação, mama, próstata, pulmão, rim, pâncreas, estômago ou intestino. Um câncer tende a infiltrar-se no tecido adjacente e espalhar-se (metástase) para órgãos distantes, por exemplo, para o osso, o fígado, o pulmão ou o cérebro. Conforme usado neste documento, o termo câncer inclui tanto os tipos de células de tumor metastáticas (tais como, porém não limitados ao, melanoma, linfoma, leucemia, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, e mastocitoma), quanto os tipos de carcinoma de tecido (tais como, porém não limitados ao, câncer colorretal, câncer da próstata, câncer de pulmão de pequenas células e câncer de pulmão que não de pequenas células, câncer de mama, câncer pancreático, câncer da bexiga, câncer renal, câncer gástrico, glioblastoma, câncer do fígado primário, câncer ovariano, câncer da próstata e leiomiossarcoma uterino). Em particular, o termo 'câncer' refere-se à leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, câncer anal, câncer do apêndice, astrocitomas, tumor teratoide/rabdoide atípico, carcinoma de células basais, câncer do duto biliar, câncer da bexiga, câncer do osso (osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno), glioma do tronco cerebral, tumores do cérebro, tumores do cérebro e medula es- pinhal, câncer de mama, tumores bronquiais, linfoma de Burkitt, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênica crônica, câncer do cólon, câncer colorretal, craniofaringioma, linfoma de Células T cutâneo, tumores embrionários, câncer endometrial, ependimo- blastoma, ependimoma, câncer esofágico, família de tumores de sar-coma de ewing, câncer do olho, retinoblastoma, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico (do estômago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST), tumor de células estromais gastrointestinal, tumor de células germinativas, glioma, leucemia das células pilosas, câncer da cabeça e pescoço, câncer hepatocelular (do fígado), linfoma de Hodgkin, câncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, tumores das células das ilhotas (pâncreas endócrinos), sarcoma de Kaposi, câncer do rim, histiocitose de células de Langerhans, câncer laríngeo, leucemia, Leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloi- de aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênica crônica, leucemia de células pilosas, câncer do fígado, câncer de pulmão que não de pequenas células, câncer de pulmão de pequenas células, lin- foma de Burkitt, linfoma de células T cutâneo, linfoma de Hodgkin, lin- foma não Hodgkin, linfoma, macroglobulinemia de Waldenstrom, me- duloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, mesotelioma, câncer da boca, leucemia mielogênica crônica, leucemia mieloide, mieloma múltiplo, câncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma não Hodgkin, câncer de pulmão que não de pequenas células, câncer oral, câncer oro- faríngeo, osteossarcoma, histiocitoma fibroso maligno do osso, câncer ovariano, câncer epitelial ovariano, tumor de células germinativas ova- riano, tumor de baixo potencial maligno ovariano, câncer pancreático, papilomatose, câncer da paratireoide, câncer peniano, câncer farín- geo, tumores parenquimais pineais de diferenciação intermediária, pi- neoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais , tumor pituitário, neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonar, linfoma do sistema nervoso central primário, câncer da próstata, câncer retal, câncer de células renais (do rim), re-tinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer da glândula salivar, sarcoma, família de tumores de sarcoma de Ewing, sarcoma, kaposi, síndrome de Sezary, câncer da pele, câncer de pulmão de pequenas células, câncer do intestino delgado, sarcoma de tecido mole, carcinoma de células escamosas, câncer do estômago (gástrico), tumores neuroec- todérmicos primitivos supratentoriais, câncer testicular, câncer da gar-ganta, timoma e carcinoma tímico, câncer da tireoide, câncer uretral, câncer uterino, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, macro- globulinemia de Waldenstrom, e tumor de Wilms. Em outra modalidade particular, o termo câncer refere-se ao câncer pancreático, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer da mama, ou câncer do cólon.
[00111] Conforme usado neste documento, o termo 'leucemia' refere-se às doenças neoplásticas do sangue e dos órgãos que formam o sangue. Tais doenças podem causar disfunção da medula óssea e do sistema imune, o que torna o hospedeiro altamente suscetível à infecção e ao sangramento. Em particular, o termo leucemia refere-se à leucemia mieloide aguda (AML), e leucemia linfoblástica aguda (ALL) e leucemia linfoblástica crônica (CLL). Em outra modalidade particular, o termo leucemia refere-se à leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), ou linfoma de células B grandes difuso (DLBCL).
[00112] Conforme usado neste documento, o termo 'rejeição ao transplante' refere-se à rejeição aguda ou crônica de células, tecidos ou alo- ou xenoenxertos de órgãos sólidos de, p.ex., ilhotas pancreáti- cas, células-tronco, medula óssea, pele, músculo, tecido corneal, tecido neuronal, coração, pulmão, coração-pulmão combinados, rim, fígado, intestino, pâncreas, traqueia ou esôfago, ou doenças do enxerto versus hospedeiro.
[00113] Conforme usado neste documento, o termo 'doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem' inclui as condições tais como a osteoartrite, a artrite psoriática, a artrite reumatoide juvenil, a artrite gotosa, a artrite séptica ou infecciosa, a artrite reativa, a distro- fia reflexa simpática, a algodistrofia, a síndrome de Tietze ou a condri- te costal, a fibromialgia, o lúpus eritematoso sistêmico, a escleroder- mia e a espondilite anquilosante.
[00114] Conforme usado neste documento, o termo 'malforma- ção(ões) congênita(s) das cartilagens' inclui as condições tais como a condrólise hereditária, as condrodisplasias e as pseudocondrodisplasi- as, em particular, porém sem limitação, a microtia, a anotia, a condro- displasia metafiseal, e os distúrbios relacionados.
[00115] Conforme usado neste documento, o termo 'doença(s) as- sociada(s) com a hipersecreção de IL6' inclui as condições tais como a doença de Castleman, o mieloma múltiplo, a psoríase, o sarcoma de Kaposi e/ou a glomerulonefrite proliferativa mesangial.
[00116] Conforme usado neste documento, o termo 'doença(s) as- sociada(s) com a hipersecreção de interferons' inclui as condições tais como o lúpus eritematoso sistêmico e cutâneo, a nefrite por lúpus, a dermatomiosite, a síndrome de Sjogren, a psoríase, a artrite reumatoi- de.
[00117] Pretende-se que o(s) 'composto(s) da invenção', e as expressão equivalentes, incluam os compostos da(s) Fórmula(s) como aqui descritos, expressão esta que inclui os sais farmaceuticamente aceitáveis, e os solvatos, p.ex., os hidratos, e os solvatos dos sais farmaceuticamente aceitáveis, onde o contexto assim o permitir. Simi-larmente, pretende-se que a referência aos intermediários, quer sejam eles próprios reivindicados, quer não sejam, inclua os seus sais, e os solvatos, onde o contexto assim o permitir.
[00118] Quando as faixas forem referidas neste documento, por exemplo, porém sem limitação, C1-8 alquila, a citação de uma faixa deve ser considerada uma representação de cada membro da dita faixa.
[00119] Outros derivados dos compostos desta invenção têm atividade em ambas as suas formas de ácidos e derivados de ácidos, porém na forma sensível ao ácido frequentemente oferece vantagens de solubilidade, compatibilidade com o tecido, ou liberação retardada no organismo do mamífero (Bundgaard, 1985). Os profármacos incluem os derivados de ácidos bem conhecidos para os profissionais da técnica, tais como, por exemplo, os ésteres preparados por reação do ácido de origem com um álcool adequado, ou as amidas preparadas por reação do composto ácido de origem com um uma amina substituída ou não substituída, ou os anidridos ácidos, ou os anidridos mistos. Os ésteres alifáticos ou aromáticos simples, as amidas e os anidridos derivados de grupos ácidos pendentes sobre os compostos desta invenção são profármacos particularmente úteis. Em alguns casos, é desejável preparar profármacos do tipo éster duplo, tais como os ésteres de (acilóxi)alquila ou os ésteres de ((alcoxicarbonil)óxi)alquila. Tais pro- fármacos particulares são os ésteres de C1-8 alquila, C2-8 alquenila, C610 arila opcionalmente substituída, e (C6-10 arila)-(C1-4 alquila) dos compostos da invenção.
[00120] Conforme usado neste documento, o termo 'variante isotó- pica' refere-se a um composto que contém proporções não naturais de isótopos em um ou mais dos átomos que constituem tal composto. Por exemplo, uma 'variante isotópica' de um composto pode conter um ou mais isótopos não radioativos, tais como, por exemplo, o deutério (2H ou D), o carbono-13 (13C), o nitro (15N), ou similar. Será entendido que, em um composto onde for feita tal substituição isotópica, os átomos seguintes, onde presentes, podem variar, de modo que, por exemplo, qualquer hidrogênio possa ser 2H/D, qualquer carbono possa ser 13C, ou qualquer nitrogênio possa ser 15N, e que a presença e a colocação de tais átomos podem ser determinadas dentro da habilidade da técnica. Também, a invenção pode incluir a preparação de variantes isotópicas com radioisótopos, na situação, por exemplo, onde os compostos resultantes possam ser usados para os estudos de distri-buição de fármaco e/ou substrato no tecido. Os isótopos radioativos trítio, i.e., 3H, e carbono-14, i.e., 14C, são particularmente úteis para este propósito, em vista de sua facilidade de incorporação e meios de detecção disponíveis. Ademais, podem ser preparados compostos que são substituídos com isótopos emissores de pósitrons, tais como 11C, 18F, 15O e 13N e seriam úteis nos estudos de Topografia por Emissão de Pósitrons (PET) para o exame da ocupação do receptor de substrato.
[00121] Pretende-se que todas as variantes isotópicas dos compostos proporcionados neste documento, radioativas ou não, sejam incluídas no escopo da invenção.
[00122] É também para ser entendido que os compostos que têm a mesma fórmula molecular, porém diferem na natureza ou na sequência de ligação dos seus átomos ou no arranjo de seus átomos no espaço, são chamados 'isômeros'. Os isômeros que diferem no arranjo de seus átomos no espaço são chamados 'estereoisômeros'.
[00123] Os estereoisômeros que não forem imagens especulares um do outro são chamados 'diastereoisômeros' e aqueles que forem imagens especulares um do outro não capazes de sobreposição são chamados 'enantiômeros'. Quando um composto tiver um centro assimétrico, por exemplo, ele for ligado a quatro grupos diferentes, um par de enantiômeros é possível. Um enantiômero pode ser caracterizado pela configuração absoluta de seu centro assimétrico e é descrito pelas regras de sequenciamento R e S de Cahn e Prelog, ou pela maneira na qual a molécula gira o plano de luz polarizada, e designado co mo dextrorrotatório ou levorrotatório (i.e., como isômeros (+) ou (-), respectivamente). Um composto quiral pode existir como enantiômero individual ou como uma mistura deles. Uma mistura contendo proporções iguais dos enantiômeros é chamada uma 'mistura racêmica'.
[00124] Os 'tautômeros' referem-se aos compostos que são formas intercambiáveis de uma estrutura de composto particular, e que variam no deslocamento dos átomos de hidrogênio e dos elétrons. Desse modo, duas estruturas podem estar em equilíbrio através do movimento dos elétrons π e um átomo (normalmente o H). Por exemplo, os enóis e as cetonas são tautômeros porque eles são rapidamente intercon- vertidos por tratamento com ácido ou base. Outro exemplo de tauto- merismo é as formas aci- e nitro- do fenilnitrometano, que são também formadas por tratamento com ácido ou base.
[00125] As formas tautoméricas podem ser relevantes para a obtenção da reatividade química e da atividade biológica ótimas de um composto de interesse.
[00126] Os compostos da invenção podem possuir um ou mais centros assimétricos; tais compostos podem, portanto, ser produzidos como estereoisômeros (R) ou (S) ou como suas misturas.
[00127] Salvo indicação ao contrário, pretende-se que a descrição ou a nomenclatura de um composto particular no relatório descritivo e nas reivindicações inclua tanto os enantiômeros individuais quanto as suas misturas, racêmicas ou de outro modo. Os métodos para a determinação da estereoquímica e a separação dos estereoisômeros são bastante conhecidos na técnica.
[00128] Será apreciado que os compostos da invenção podem ser metabolizados para produzir metabólitos biologicamente ativos.
A INVENÇÃO
[00129] A presente invenção é baseada na identificação que os compostos da invenção são inibidores de JAK e que eles são úteis pa- ra o tratamento de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com a hipersecre- ção de IL6 ou a hipersecreção de interferons. Em uma modalidade específica, os compostos da invenção são inibidores de JAK1 e/ou TYK2.
[00130] A presente invenção também proporciona os métodos para a produção dos compostos da invenção, as composições farmacêuticas compreendendo um composto da invenção e os métodos para tratar as doenças alérgicas, as doenças inflamatórias, as doenças autoi- munes, as doenças proliferativas, a rejeição ao transplante, as doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, as malformações congênitas da cartilagem, e/ou as doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons, pela adminis-tração de um composto da invenção. Em uma modalidade específica, os compostos da invenção são inibidores de JAK1 e/ou TYK2.
[00131] Consequentemente, em um primeiro aspecto da invenção, os compostos da invenção são proporcionados de acordo com a Fórmula (I):
Figure img0007
em que
[00132] R1 é H, ou Me;
[00133] L1 é -NR2-; -O-, ou -CH2-;
[00134] Cy é fenila, ou heteroarila monocíclica de 5-9 elementos ou bicíclica fundida compreendendo 1 a 4 heteroátomos independente- mente selecionados a partir de N, O, e S;
[00135] R2 é H, ou C1-4 alquila;
[00136] R3 é H, halo, C1-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais halo independentemente selecionado, ou C1-4 alcóxi opcionalmente substituído com um ou mais halo independentemente selecionado;
[00137] R4 é H, ou halo;
[00138] R5 é -CN, halo, ou é -L2-R6;
[00139] -L2 está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, - SO2-, -SO2NR7-, ou -NR7SO2-;
[00140] R6 é H, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída com um ou mais grupos R8 independentemente selecionados;
[00141] R7 é H, ou C1-4 alquila;
[00142] R8 é OH, CN, halo, ou C1-4 alcóxi;
[00143] La está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)O-, ou -C(=O)NH-;
[00144] Ra é:
[00145] H,
[00146] C1-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais Rb independentemente selecionado,
[00147] C3-7 cicloalquila monocíclica opcionalmente substituída com um ou mais Rc independentemente selecionado,
[00148] heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S, ou
[00149] heteroarila monocíclica de 5-6 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S;
[00150] Rb é
[00151] halo,
[00152] CN,
[00153] OH,
[00154] C1-4 alcóxi,
[00155] C3-7 cicloalquila,
[00156] heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S (heterocicloalquila esta que é opcionalmente substituída com um ou mais halo, ou oxo independentemente selecionado),
[00157] -SO2-C1-4 alquila, ou
[00158] -C(=O)NRb1Rb2;
[00159] Rc é
[00160] halo,
[00161] CN,
[00162] OH,
[00163] C1-4 alquila,
[00164] -C(=O)OH, ou
[00165] -C(=O)NRc1Rc2; e
[00166] cada Rb1, Rb2, Rc1 e Rc2 é independentemente selecionado a partir de H, e C1-4 alquila.
[00167] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde R1 é Me.
[00168] Em outra modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde Cy é fenila.
[00169] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde Cy é a heteroarila monocíclica ou bicíclica fundida de 5-9 elementos compreendendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S. Em outra modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde Cy é a heteroarila monocíclica ou bicíclica fundida de 5-9 elementos compreendendo 1 ou 2 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S. Em uma modalidade particular, Cy é a pira- zolila, a pirrolila, a imidazolila, a triazolila, a tiofenila, a tiazolila, a fura- nila, a piridila, a pirazinila, a pirimidila, a piridazinila, a benzofuranila, a benzotiofenila, a benzotiazolila, a benzotiadiazolila, a benzoxazolila, a indolila ou a indazolila.
[00170] Em outra modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde Cy é a heteroarila monocíclica de 5-6 elementos compreendendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S. Ainda em outra modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde Cy é a hete- roarila monocíclica de 5-6 elementos compreendendo 1 ou 2 heteroá- tomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S. Em uma modalidade particular, Cy é a pirazolila, a pirrolila, a imidazolila, a fura- nila, a tiofenila, a triazolila, a tetrazolila, a tiazolila, a oxazolila, a tiadi- azolila, ou a oxadiazolila. Em outra modalidade particular, Cy é a piri- dinila, a pirazinila, a pirimidinila, ou a piridazolila. Em uma modalidade mais particular, Cy é a piridila.
[00171] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula IIa, IIb, ou IIc: em que L1, R3, R4, La, Ra e R5 são como descritos em quaisquer das modalidades acima mencionadas.
Figure img0008
[00172] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula IIIa, IIIb, ou IIIc:
Figure img0009
em que L1, R3, R4, La, Ra e R5 são como descritos em quaisquer das modalidades acima mencionadas.
[00173] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-IIIc, onde L1 é -CH2-.
[00174] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer um das Fórmulas I-IIIc, onde L1 é -O-.
[00175] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-IIIc, onde L1 é -NR2-, e R2 é como descrito em quaisquer das modalidades acima mencionadas.
[00176] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-IIIc, onde L1 é -NR2-, onde R2 é H.
[00177] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-IIIc, onde L1 é -NR2-, onde R2 é C1-4 alquila. Em uma modalidade particular, R2 é Me, Et, ou iPr. Em uma modalidade mais particular, R2 é Me. Em outra modalidade mais particular, R2 é Et.
[00178] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula IVa, IVb, IVc, IVd, IVe ou IVf:
Figure img0010
que R3, R4, R5, La, e Ra são como descritos em quaisquer das modali- dades acima descritas.
[00179] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-IVf, onde La está ausente.
[00180] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-IVf, onde La é -C(=O)-, - C(=O)O-, ou -C(=O)NH-. Em uma modalidade particular, La é -C(=O)-.
[00181] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula Va, Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf:
Figure img0011
em que R3, R4, R5, e Ra são como descritos em quaisquer das modali- dades acima descritas.
[00182] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acor- do com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R4 é H, ou halo. Em uma modalidade particular, R4 é F, ou Cl. Em outra modalidade particular, R4 é H.
[00183] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R3 é H.
[00184] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R3 é halo. Em uma modalidade particular, R3 é F, ou Cl. Na modalidade mais particular, R3 é Cl.
[00185] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R3 é C1-4 alquila. Em uma modalidade particular, R3 é Me, Et, ou n-Pr. Na modalidade mais particular, R3 é Me ou Et. Em uma modalidade mais particular, R3 é Et. Em uma outra modalidade mais particular, R3 é Me.
[00186] Em outra modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R3 é C1-4 alquila substituída com um ou mais halo independentemente selecionado. Em uma modalidade particular, R3 é -CHF2, -CF3, -CH2-CHF2 ou -CH2- CF3. Na modalidade mais particular, R3 é -CF3, ou -CH2-CF3.
[00187] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R3 é C1-4 alcóxi. Em uma modalidade particular, R3 é -OMe, -OEt, ou -On-Pr. Na modalidade mais particular, R3 é -OMe ou -OEt.
[00188] Em outra modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R3 é C1-4 alcóxi substituído com um ou mais halo independentemente selecionado. Em uma modalidade particular, R3 é -OCHF2, -OCF3, ou -OCH2-CHF2. Na modalidade mais particular, R3 é -OCHF2.
[00189] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R5 é CN.
[00190] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R5 é halo. Em uma modalidade particular, R5 é F, ou Cl. Em uma modalidade mais particular, R5 é F.
[00191] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R5 é -L2-R6, R6 é como descrito acima, L2 é -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7-, ou -NR7SO2-, e R7 é como definido em quaisquer das modalidades precedentes. Em uma modalidade particular, R7 é H. Em outra modalidade particular, R7 é C1-4 alquila. Em uma modalidade mais particular, R7 é Me, ou Et. Em uma modalidade mais particular, R7 é Me.
[00192] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R5 é -L2-R6, L2 é como descrito acima, e R6 é H.
[00193] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R5 é -L2-R6, L2 é como descrito acima, e R6 é C1-6 alquila. Em uma modalidade particular, R6 é Me, Et, iPr, ou tBu. Em uma modalidade mais particular, R6 é Me, ou Et.
[00194] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R5 é -L2-R6, L2 é como descrito acima, e R6 é C1-6 alquila substituída com um ou mais grupos R8 independentemente selecionados. Em outra modalidade, R6 é Me, Et, iPr, ou tBu, cada um dos quais é substituído com um ou mais grupos R8 independentemente selecionados. Em uma modalidade particular, R6 é C1-6 alquila substituída com um, dois ou três grupos R8 inde-pendentemente selecionados. Em outra modalidade particular, R6 é Me, Et, iPr, ou tBu, cada um dos quais é substituído com um, dois ou três grupos R8 independentemente selecionados. Em uma modalidade mais particular, R6 é C1-6 alquila substituída com um grupo R8. Em ou- tra modalidade particular, R6 é Me, Et, iPr, ou tBu, cada um dos quais é substituído com um grupo R8.
[00195] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R8 é OH, CN, halo, ou C1-4 alcóxi. Em uma modalidade particular, R8 é OH, CN, F, Cl, -OMe, ou -OEt.
[00196] Em uma modalidade particular, R5 é -L2-R6, L2 é -C(=O)-,ou -SO2-, e R6 é C1-6 alquila. Em uma modalidade mais particular, R5 é - L2-R6, L2 é -C(=O)-,ou -SO2, e R6 é Me, Et, iPr, ou tBu. Em uma modalidade mais particular, R5 é -C(=O)Me, -C(=O)Et, -SO2Me ou -SO2Et.
[00197] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde R5 é -L2-R6, L2 é - C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7-, ou -NR7SO2-, R6 e R7 são como definidos em quaisquer das modalidades precedentes. Em uma modalidade particular, R7 é H, Me, ou Et, e R6 é como definido em quaisquer das modalidades precedentes. Em outra modalidade particular, R7 é como definido em quaisquer das modalidades precedentes, e R6 é H. Ainda em outra modalidade particular, R7 é como definido em quaisquer das modalidades precedentes, e R6 é C1-6 alquila opcionalmente substituída com um ou mais OH, CN, halo, ou C1-4 alcóxi independentemente selecionado. Em uma modalidade mais particular, R7 é H, Me, ou Et, e R6 é H. Em outra modalidade mais particular, R7 é H, Me, ou Et, e R6 é Me, Et, iPr ou tBu, cada um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais OH, CN, halo, ou C1-4 alcóxi independentemente selecionado. Ainda em outra mais particular modalidade, R7 é H, Me, ou Et, e R6 é Me, Et, iPr ou tBu, cada um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais OH, CN, F, Cl, OMe, ou OEt independentemente selecionado. Em uma modalidade mais particular, R5 é -C(=O)NH2, ou -SO2NH2.
[00198] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acor- do com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é H.
[00199] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é C1-4 alquila. Em uma modalidade particular, Ra é Me, Et, iPr, ou tBu. Em uma modalidade mais particular, Ra é Me, ou Et. Em uma modalidade mais particular, Ra é Me.
[00200] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é C1-4 alquila substituída com um ou mais Rb independentemente selecionado. Em outra modalidade, Ra é Me, Et, iPr, ou tBu, cada um dos quais é substituído com um ou mais Rb independentemente selecionado. Em uma modalidade particular, Ra é C1-4 alquila substituída com um, dois, ou três Rb independentemente selecionados. Em outra modalidade particular, Ra é Me, Et, iPr, ou tBu, cada um dos quais é substituído com um, dois, ou três Rb independentemente selecionados. Em uma modalidade mais particular, Ra é C1-4 alquila substituída com um Rb. Em outra modalidade mais particular, Ra é Me, Et, iPr, ou tBu, cada um dos quais é substituído com um Rb.
[00201] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rb é halo, CN, ou OH. Em uma modalidade particular, Rb é F, Cl, CN, ou OH.
[00202] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rb é C1-4 alcóxi. Em uma modalidade particular, Rb é OMe, OEt, ou OiPr. Em uma modalidade mais particular, Rb é OMe.
[00203] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rb é C3-7 cicloalquila. Em uma modalidade particular, Rb é a ciclopropila, a ciclobutila, a ci- clopentila, ou a ciclo-hexila. Em uma modalidade mais particular, Rb é a ciclopropila.
[00204] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rb é a heterocicloalqui- la monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroá- tomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S. Em uma modalidade particular, Rb é a oxetanila, a tetra-hidrofuranila, a tetra- hidropiranila, a azetidinila, a pirrolidinila, a piperidinila, a piperazinila, a morfolinila, ou a tiomorfolinila.
[00205] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rb é a heterocicloalqui- la monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroá- tomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S, substituída com um ou mais halo, ou oxo independentemente selecionado. Em uma modalidade particular, Rb é a oxetanila, a tetra-hidrofuranila, a te- tra-hidropiranila, a azetidinila, a pirrolidinila, a piperidinila, a piperazini- la, a morfolinila, ou a tiomorfolinila, cada uma das quais é substituída com um ou mais halo, ou oxo independentemente selecionado. Em outra modalidade particular, Rb é a heterocicloalquila monocíclica de 47 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S, substituída com um ou mais F, Cl, ou oxo independentemente selecionado. Em uma modalidade mais particular, Rb é a oxetanila, a tetra-hidrofuranila, a tetra- hidropiranila, a azetidinila, a pirrolidinila, a piperidinila, a piperazinila, a morfolinila, ou a tiomorfolinila, cada uma das quais é substituída com um ou mais F, Cl, ou oxo independentemente selecionado. Em uma modalidade mais particular, Rb é a heterocicloalquila monocíclica de 47 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S, substituída com um, dois ou três F, Cl, ou oxo independentemente selecionado. Em outra modalidade mais particular, Rb é a oxetanila, a tetra-hidrofuranila, a tetra- hidropiranila, a azetidinila, a pirrolidinila, a piperidinila, a piperazinila, a morfolinila, ou a tiomorfolinila, cada uma das quais é substituída com um, dois ou três F, Cl, ou oxo independentemente selecionado.
[00206] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rb é -SO2-C1-4 alquila. Em uma modalidade particular, Rb é -SO2CH3, ou -SO2CH2CH3.
[00207] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rb é -C(=O)NRb1Rb2, onde cada Rb1, ou Rb2 é independentemente selecionado a partir de H, e C1-4 alquila. Em uma modalidade particular, cada Rb1, ou Rb2 é independentemente selecionado a partir de H, -CH3, e -CH2CH3. Em uma modalidade mais particular, Rb é -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, ou - C(=O)NMe2.
[00208] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é C3-7 cicloalquila monocíclica. Em uma modalidade particular, Ra é a ciclopropila, a ci- clobutila, ou a ciclopentila. Em uma modalidade mais particular, Ra é a ciclopropila.
[00209] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é C3-7 cicloalquila monocíclica substituída com um ou mais grupos Rc independentemente selecionados. Em outra modalidade, Ra é a ciclopropila, a ciclobuti- la, ou a ciclopentila, cada uma das quais é substituída com um ou mais grupos Rc independentemente selecionados. Em uma modalidade particular, Ra é a C3-7 cicloalquila monocíclica substituída com um, dois ou três grupos Rc independentemente selecionados. Em outra modalidade particular, Ra é a ciclopropila, a ciclobutila, ou a ciclopentila, cada uma das quais é substituída com um, dois ou três grupos Rc independentemente selecionados. Em uma modalidade mais particular, Ra é a C3-7 cicloalquila monocíclica substituída com um grupo Rc. Em outra modalidade particular, Ra é a ciclopropila, a ciclobutila, ou a ciclopenti- la, cada uma das quais é substituída com um grupo Rc.
[00210] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rc é halo, CN, ou OH. Em uma modalidade particular, Rc é F, Cl, CN, ou OH. Em uma modalidade mais particular, Rc é F.
[00211] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rc é C1-4 alquila. Em uma modalidade particular, Rc é -Me, -Et, ou -iPr.
[00212] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rc é -C(=O)OH.
[00213] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Rc é -C(=O)NRc1Rc2 onde cada Rc1, ou Rc2 é independentemente selecionado a partir de H, e C1-4 alquila. Em uma modalidade particular, cada Rc1, ou Rc2 é independentemente selecionado a partir de H, -CH3, e -CH2CH3. Em uma modalidade mais particular, Rc é -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, ou - C(=O)NMe2.
[00214] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é:
Figure img0012
[00215] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acor- do com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é:
Figure img0013
[00216] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acor- do com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é a heterocicloalqui- la monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroá- tomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S. Em uma modalidade particular, Ra é a oxetanila, a tetra-hidrofuranila, a tetra- hidropiranila, a azetidinila, a pirrolidinila, a piperidinila, a piperazinila, a morfolinila, ou a tiomorfolinila.
[00217] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com qualquer uma das Fórmulas I-Vf, onde Ra é a heteroarila mo- nocíclica de 5-6 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S. Em uma mo-dalidade particular, Ra é a furanila, a tienila, a pirrolila, a oxazolila, a tiazolila, a imidazolila, a triazolila, a oxadiazolila, o tetrazol, a piridinila, a pirazinila, ou a pirimidinila.
[00218] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto é selecionado a partir de:
[00219] N-(6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida,
[00220] N-(6-(4-ciano-2-etil-6-fluorfenilamino)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida,
[00221] N-(6-((4-ciano-2-etil-6-fluorfenil)(metil)amino)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-4-il)ciclopropanocarboxamida,
[00222] 6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-4-ilcarbamato de metila,
[00223] 6-((4-ciano-2-etil-6-fluorfenil)(metil)amino)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-4-ilcarbamato de metila,
[00224] (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-etil-3-piridil)óxi]-1-metil- benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00225] mistura racêmica de (1S,2S)/(1R,2R) de N-(6-((4-ciano-2- etil-6-fluorfenil)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2- fluorciclopropanocarboxamida,
[00226] (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1- metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorciclopropanocarboxamida,
[00227] (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1- metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorciclopropanocarboxamida,
[00228] (1R,2R)-N-[6-(4-ciano-2-etil-fenóxi)-1-metil-benzimidazol-4- il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00229] (1R,2R)-N-[6-(2-cloro-4-ciano-6-flúor-N-metil-anilino)-1- metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00230] (1R,2R)-2-flúor-N-[6-[(6-flúor-4-metil-3-piridil)-metil-amino]- 1-metil-benzimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
[00231] (1R,2R)-N-[6-[(2,6-diflúor-3-piridil)-metil-amino]-1-metil- benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00232] (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-2-flúor-3-piridil)-metil-amino]-1-metil- benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00233] (1R,2R)-N-[6-(4-ciano-2-flúor-N-metil-anilino)-1-metil- benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00234] (1R,2R)-2-flúor-N-[6-(2-flúor-N,6-dimetil-4-metilsulfonil- anilino)-1-metil-benzimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
[00235] (1R,2R)-2-flúor-N-[6-(2-flúor-N-metil-4-metilsulfonil-anilino)- 1-metil-benzimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
[00236] N-[6-[(4-etil-6-metilsulfonil-3-piridil)-metil-amino]-1-metil- benzimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
[00237] N-[6-(2-flúor-N,6-dimetil-4-metilsulfonil-anilino)-1-metil- benzimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
[00238] (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil- benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00239] (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-2-flúor-4-metil-3-piridil)-metil-amino]- 1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00240] (1R,2R)-N-[6-[(2-ciano-3-flúor-5-metil-4-piridil)-metil-amino]- 1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00241] N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4- il]ciclopropanocarboxamida,
[00242] 5-((4-(ciclopropanocarboxamido)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-6-il)(metil)amino)-4-etilpicolinamida,
[00243] 4-etil-5-((4-((1R,2R)-2-fluorciclopropanocarboxamido)-1- metil-1H-benzo[d]imidazol-6-il)(metil)amino)picolinamida,
[00244] (1R,2R)-N-[6-(N,2-dimetil-4-metilsulfonil-anilino)-1-metil- benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00245] (1R,2R)-N-[6-(4-etilsulfonil-N,2-dimetil-anilino)-1-metil- benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida,
[00246] 5-(7-amino-3-metil-benzimidazol-5-il)óxi-4-metil-piridina-2- carbonitrila,
[00247] N-[6-[(4-etil-6-metilsulfonil-3-piridil)óxi]-1-metil- benzimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida,
[00248] N-[6-[4-(cianometil)anilino]-1-metil-benzimidazol-4- il]ciclopropanocarboxamida,
[00249] N-[6-(2,3-di-hidro-1,4-benzodioxin-6-ilamino)-1-metil- benzimidazol-4-il]ciclopropanocarboxamida, e
[00250] 5-[7-[[(1R,2R)-2-fluorciclopropanocarbonil]amino]-3-metil- benzimidazol-5-il]óxi-4-metil-piridina-2-carboxamida.
[00251] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto é selecionado a partir de
[00252] 1-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]- 3-isopropil-ureia,
[00253] 4-metil-5-[3-metil-7-(metilamino)benzimidazol-5-il]óxi- piridina-2-carbonitrila,
[00254] 5-[7-(dimetilamino)-3-metil-benzimidazol-5-il]óxi-4-metil- piridina-2-carbonitrila,
[00255] N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]- 3-hidróxi-azetidina-1-carboxamida,
[00256] N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4- il]morfolina-4-carboxamida, e
[00257] 1-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]- 3-isopropil-ureia.
[00258] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto é a N-[6-[(6-ciano-4-metil-3- piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida. Em uma modalidade mais particular, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto é a (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano- 4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida.
[00259] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto não é a N-[6-[(6-ciano-4-metil-3- piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor-ciclopropanocarboxamida. Em uma modalidade mais particular, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto não é a (1R,2R)-N-[6-[(6- ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida.
[00260] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto é a N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin- 3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2- fluorciclopropanocarboxamida. Em uma modalidade mais particular, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto é a (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1- metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorciclopropanocarboxamida.
[00261] Em uma modalidade, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o composto não é a N-(6-((6-ciano-4- metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2- fluorciclopropanocarboxamida. Em uma modalidade mais particular, um composto da invenção é de acordo com a Fórmula I, onde o com- posto não é a (1R,2R)-N-(6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1- metil-1H-benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorciclopropanocarboxamida.
[00262] Em uma modalidade um composto da invenção não é uma variante isotópica.
[00263] Em um aspecto, um composto da invenção, de acordo com qualquer uma das modalidades descritas neste documento, está presente como a base livre.
[00264] Em um aspecto, um composto da invenção, de acordo com qualquer uma das modalidades descritas neste documento, é um sal farmaceuticamente aceitável.
[00265] Em um aspecto, um composto da invenção, de acordo com qualquer uma das modalidades descritas neste documento, é um sol- vato do composto.
[00266] Em um aspecto, um composto da invenção, de acordo com qualquer uma das modalidades descritas neste documento, é um sol- vato de um sal farmaceuticamente aceitável de um composto.
[00267] Embora grupos especificados para cada modalidade tenham sido, em geral, listados acima separadamente, um composto da invenção inclui um no qual várias modalidades ou cada modalidade na Fórmula acima mencionada, assim como outras fórmulas apresentadas neste documento, é selecionada a partir de um ou mais dos elementos ou grupos particulares, designados, respectivamente, para cada variável. Portanto, pretende-se que esta invenção inclua todas as combinações de tais modalidades dentro do seu escopo.
[00268] Embora grupos especificados para cada modalidade tenham sido, em geral, listados acima separadamente, um composto da invenção pode ser um para o qual uma ou mais variáveis (por exemplo, grupos R) são selecionadas a partir de uma ou mais modalidades de acordo com quaisquer das Fórmulas listada(s) acima. Portanto, pretende-se que a presente invenção inclua todas as combinações de va- riáveis a partir de quaisquer das modalidades divulgadas dentro do seu escopo.
[00269] Alternativamente, a exclusão de uma ou mais das variáveis especificadas a partir de um grupo ou uma modalidade, ou de suas combinações, é também contemplada pela presente invenção.
[00270] Em certos aspectos, a presente invenção proporciona pro- fármacos e derivados dos compostos de acordo com as fórmulas acima mencionadas. Os profármacos são derivados dos compostos da invenção, que têm grupos cliváveis metabolicamente e tornam-se, por solvólise ou sob condições fisiológicas, os compostos da invenção, os quais são farmaceuticamente ativos, in vivo. Tais exemplos incluem, mas não são limitados aos derivados do éster de colina e similares, ésteres de N-alquilmorfolina e similares.
[00271] Os outros derivados dos compostos dessa invenção têm atividade em ambas as suas formas de ácido e de derivado de ácido, mas a forma sensível ao ácido muitas vezes oferece vantagens de so-lubilidade, compatibilidade com o tecido, ou liberação retardada no or-ganismo dos mamíferos. (Bundgard, H, 1985). Os profármacos incluem os derivados de ácidos, bem conhecidos pelos profissionais da técnica, tais como, por exemplo, os ésteres preparados pela reação do ácido de origem com um álcool adequado, ou as amidas preparadas pela reação do composto de ácido de origem com uma amina substituída ou não substituída, ou anidridos de ácidos, ou anidridos mistos. Os ésteres alifáticos ou aromáticos simples, as amidas e os anidridos derivados a partir de grupos ácidos pendentes sobre os compostos dessa invenção são profármacos preferidos. Em alguns casos, é desejável preparar profármacos do tipo éster duplo, tais como os ésteres de (acilóxi)alquila ou os ésteres de ((alcoxicarbonil)óxi)alquila. Particularmente úteis são os ésteres de C1 a C8 alquila, C2-C8 alquenila, arila, C7-C12 arila substituída, e C7-C12 arilalquila dos compostos da inven- ção.
CLÁUSULAS
[00272] 1) Um composto de acordo com a Fórmula I:
Figure img0014
em que
[00273] R1 é H, ou Me;
[00274] L1 é -NR2-; -O-, ou -CH2-;
[00275] Cy é fenila, ou heteroarila monocíclica ou bicíclica fundida de 5-9 elementos compreendendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S;
[00276] R2 é H, ou C1-4 alquila;
[00277] R3 é H, halo, C1-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais halo independentemente selecionado, ou C1-4 alcóxi opcionalmente substituído com um ou mais halo independentemente selecionado;
[00278] R4 é H, ou halo;
[00279] R5 é -CN, halo, ou é -L2-R6;
[00280] -L2 está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, - SO2-, -SO2NR7-, ou -NR7SO2-;
[00281] R6 é H, ou C1-6 alquila opcionalmente substituída com um ou mais grupos R8 independentemente selecionados;
[00282] R7 é H, ou C1-4 alquila;
[00283] R8 é OH, CN, halo, ou C1-4 alcóxi;
[00284] La está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)O-, ou -C(=O)NH-;
[00285] Ra é:
[00286] H,
[00287] C1-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais Rb independentemente selecionado,
[00288] C3-7 cicloalquila monocíclica opcionalmente substituída com um ou mais Rc independentemente selecionado,
[00289] heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S, ou
[00290] heteroarila monocíclica de 5-6 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S;
[00291] Rb é
[00292] halo,
[00293] CN,
[00294] OH,
[00295] C1-4 alcóxi,
[00296] C3-7 cicloalquila,
[00297] heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S (heterocicloalquila esta que é opcionalmente substituída com um ou mais halo, ou oxo independentemente selecionado),
[00298] -SO2-C1-4 alquila, ou
[00299] -C(=O)NRb1Rb2;
[00300] Rc é
[00301] halo,
[00302] CN,
[00303] OH,
[00304] C1-4 alquila,
[00305] -C(=O)OH, ou
[00306] -C(=O)NRc1Rc2; e
[00307] cada Rb1, Rb2, Rc1 e Rc2 é independentemente selecionado a partir de H, e C1-4 alquila;
[00308] ou um sal farmaceuticamente aceitável, ou um solvato, ou um solvato dos sais farmaceuticamente aceitáveis.
[00309] 2) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 1, onde R1 é Me.
[00310] 3) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-2, onde Cy é fenila.
[00311] 4) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável dele de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-2, onde Cy é heteroarila monocíclica ou bicíclica fundida de 5-9 elementos compreendendo 1 a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S.
[00312] 5) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável dele de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-2, onde a heteroarila monocíclica de 5-6 elementos compreendendo 1 a 4 heteroátomos in- dependentemente selecionados a partir de N, O, e S.
[00313] 6) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-2, onde Cy é piridila.
[00314] 7) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas acordo com a Fórmula IIa, IIb, ou IIc: onde L1, R3, R4, La, Ra e R5 são como descritos na cláusula 1.
Figure img0015
[00315] 8) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1, onde o composto é de acordo com a Fórmula IIIa, IIIb, ou IIIc:
Figure img0016
onde L1, R3, R4, La, Ra e R5 são como descritos na cláusula 1.
[00316] 9) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-8, onde L1 é -CH2-.
[00317] 10) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-8, onde L1 é O.
[00318] 11) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-8, onde L1 é -NR2-.
[00319] 12) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 11, onde R2 é H.
[00320] 13) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 11, onde R2 é C1-4 alquila.
[00321] 14) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 11, onde R2 é Me.
[00322] 15) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1, onde o composto é de acordo com a Fórmula IVa, IVb, IVc, IVd, IVe ou IVf: onde R3, R4, R5, La, e Ra são como descritos na cláusula 1.
Figure img0017
[00323] 16) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-15, onde La está ausente.
[00324] 17) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-15, onde La é -C(=O)-.
[00325] 18) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1, onde o composto é de acordo com a Fórmula Va, Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf: onde R3, R4, R5, La, e Ra são como descritos na cláusula 1.
Figure img0018
[00326] 19) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-18, onde R4 é H.
[00327] 20) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-18, onde R4 é F, ou Cl.
[00328] 21) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-18, onde R3 é H.
[00329] 22) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-18, onde R3 é C1-4 alquila.
[00330] 23) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 22, onde R3 é Me ou Et.
[00331] 24) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-23, onde R5 é CN.
[00332] 25) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-23, onde R5 é halo.
[00333] 26) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 25, onde R5 é F, ou Cl.
[00334] 27) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-23, onde R5 é -L2-R6, R6 é como descrito na cláusula 1, e L2 é -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, - SO2NR7-, ou -NR7SO2-.
[00335] 28) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 27, onde R7 é H.
[00336] 29) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-23, onde R5 é -L2-R6, L2 é como descrito na cláusula 1, e R6 é H.
[00337] 30) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-26, onde R5 é -L2-R6, L2 é como descrito na cláusula 1, e R6 é C1-6 alquila.
[00338] 31) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 30, onde R6 é Me.
[00339] 32) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-23, onde R5 é -L2-R6, L2 é como descrito na cláusula 1, e R6 é C1-6 alquila substituída com um ou mais grupos R8 independentemente selecionados.
[00340] 33) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 32, onde R6 é Me, Et, iPr, ou tBu, cada um dos quais é substituído com um ou mais grupos R8 independentemente se-lecionados.
[00341] 34) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 33, onde R8 é OH, CN, F, Cl, -OMe, ou -OEt.
[00342] 35) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-23, onde R5 é -L2-R6, onde L2 é -C(=O)-,ou -SO2-, e R6 é C1-6 alquila.
[00343] 36) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 35, onde R5 é -C(=O)Me, -C(=O)Et, -SO2Me ou -SO2Et.
[00344] 37) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-23, onde R5 é -L2-R6, onde L2 é -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7-, ou -NR7SO2-, onde R7 é H, Me, ou Et, e R6 é Me, Et, iPr ou tBu, cada um dos quais é opcionalmente substituída com um ou mais OH, CN, halo, ou C1-4 alcóxi inde-pendentemente selecionado.
[00345] 38) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 37, onde R5 é -C(=O)NH2, ou -SO2NH2.
[00346] 39) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-38, onde Ra é C1-4 alquila.
[00347] 40) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 39, onde Ra é Me, ou Et.
[00348] 41) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-38, onde Ra é C1-4 alquila substituída com um ou mais Rb independentemente selecionado.
[00349] 42) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41, onde Ra é Me, Et, iPr, ou tBu.
[00350] 43) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41 ou 42, onde Rb é F, Cl, CN, ou OH.
[00351] 44) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41 ou 42, onde Rb é OMe, OEt, ou OiPr.
[00352] 45) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41 ou 42, onde Rb é a ciclopropila, a ciclobutila, a ciclopentila, ou a ciclo-hexila.
[00353] 46) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41 ou 42, onde Rb é a oxetanila, a tetra- hidrofuranila, a tetra-hidropiranila, a azetidinila, a pirrolidinila, a piperi- dinila, a piperazinila, a morfolinila, ou a tiomorfolinila.
[00354] 47) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41 ou 42, onde Rb é a oxetanila, a tetra- hidrofuranila, a tetra-hidropiranila, a azetidinila, a pirrolidinila, a piperi- dinila, a piperazinila, a morfolinila, ou a tiomorfolinila, cada uma das quais é substituída com um ou mais halo, ou oxo independentemente selecionado.
[00355] 48) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41 ou 42, onde Rb é -SO2CH3, ou -SO2CH2CH3.
[00356] 49) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 41 ou 42, onde Rb é -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, ou -C(=O)NMe2.
[00357] 50) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-38, onde Ra é C3-7 cicloal- quila monocíclica.
[00358] 51) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-38, onde Ra é C3-7 cicloal- quila monocíclica substituída com um ou mais grupos Rc independen-temente selecionados.
[00359] 52) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 50, ou 51, onde Ra é a ciclopropila, a ciclobutila, ou a ciclopentila.
[00360] 53) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 51, onde Rc é F, Cl, CN, ou OH.
[00361] 54) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 51, onde Rc é -Me, -Et, ou -iPr.
[00362] 55) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 51, onde Rc é -C(=O)OH.
[00363] 56) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a cláusula 51, onde Rc é -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, ou - C(=O)NMe2.
[00364] 57) Um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-38, onde Ra é:
Figure img0019
[00365] 58) Um composto ou saI farmaceuticamente aceitáveI de acordo com quaIquer uma das cIáusuIas 1-38, onde Ra é:
Figure img0020
[00366] 59) Um composto ou saI farmaceuticamente aceitáveI de acordo com quaIquer uma das cIáusuIas 1-38, onde Ra é a heteroci- cIoaIquiIa monocícIica de 4-7 eIementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente seIecionados a partir de O, N, e S.
[00367] 60) Um composto ou saI farmaceuticamente aceitáveI de acordo com a cIáusuIa 59, onde Ra é a oxetaniIa, a tetra-hidrofuraniIa, a tetra-hidropiraniIa, a azetidiniIa, a pirroIidiniIa, a piperidiniIa, a pipera- ziniIa, a morfoIiniIa, ou a tiomorfoIiniIa.
[00368] 61) Um composto ou saI farmaceuticamente aceitáveI de acordo com quaIquer uma das cIáusuIas 1-38, onde Ra é a heteroariIa monocícIica de 5-6 eIementos compreendendo um ou mais heteroáto- mos independentemente seIecionados a partir de O, N, e S.
[00369] 62) Um composto ou saI farmaceuticamente aceitáveI de acordo com a cIáusuIa 61, onde Ra é a furaniIa, a tieniIa, a pirroIiIa, a oxazoIiIa, a tiazoIiIa, a imidazoIiIa, a triazoIiIa, a oxadiazoIiIa, o tetrazoI, a piridiniIa, a piraziniIa, ou a pirimidiniIa.
[00370] 63) Um composto, ou o seu sal farmaceuticamente aceitá vel, de acordo com a cláusula 1, onde o composto é selecionado a partir da Tabela I
[00371] 64) Um composto, ou o seu sal farmaceuticamente aceitá vel, de acordo com a cláusula 1, onde o composto é a (1R,2R)-N-[6- [(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida.
[00372] 65) Um composto, ou o seu sal farmaceuticamente aceitá vel, de acordo com a cláusula 1, onde o composto não é a (1R,2R)-N- [6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida.
[00373] 66) Um composto, ou o seu sal farmaceuticamente aceitá vel, de acordo com a cláusula 1, onde o composto é a (1R,2R)-N-(6- ((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol- 4-il)-2-fluorciclopropanocarboxamida.
[00374] 67) Um composto, ou o seu sal farmaceuticamente aceitá vel, de acordo com a cláusula 1, onde o composto não é a (1R,2R)-N- (6-((6-ciano-4-metilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H- benzo[d]imidazol-4-il)-2-fluorciclopropanocarboxamida.
[00375] 68) Uma composição farmacêutica compreendendo um ve ículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade farmaceutica- mente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-67.
[00376] 69) A composição farmacêutica de acordo com a cláusula 68 compreendendo um agente terapêutico adicional.
[00377] 70) O composto ou o seu sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-67, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas 68-69, para uso em medicamento.
[00378] 71) Um composto de acordo com qualquer uma das cláusu- las 1-67, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas 68-69, para uso no tratamento, ou profilaxia de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proli- ferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecre- ção de interferons.
[00379] 72) Um composto de acordo com qualquer uma das cláusu las 1-67, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas 68-69, para uso no tratamento, ou profilaxia de doenças proliferativas.
[00380] 73) Um composto de acordo com a cláusula 72, onde as doenças proliferativas são selecionadas a partir de mielofibrose, leu-cemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), mieloma múltiplo, leu-cemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), câncer pancreático, câncer do fígado, carcinoma hepatocelu- lar (HCC), câncer do pulmão, câncer da mama, e câncer do cólon.
[00381] 74) Um método para o tratamento, ou profilaxia de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proli- ferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecre- ção de interferons, compreendendo administrar uma quantidade do composto de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-67, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas 68-69, suficiente para efetuar o dito tratamento, ou profilaxia.
[00382] 75) Um método para o tratamento, ou profilaxia de doenças proliferativas, compreendendo administrar uma quantidade do composto de acordo com qualquer uma das cláusulas 1-67, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas 68-69, suficiente para efetuar o dito tratamento, ou profilaxia.
[00383] 76) Um método de tratamento de acordo com a cláusula 76, onde as doenças proliferativas são selecionadas a partir de mielofibro- se, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), câncer pancreático, câncer do fígado, carcinoma he- patocelular (HCC), câncer do pulmão, câncer da mama, e câncer do cólon.
[00384] 77) O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 75-77, onde o composto de acordo com qualquer uma das cláusulas 167, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das cláusulas 68-69 é administrada em combinação com um agente tera-pêutico adicional.
[00385] 78) A composição farmacêutica de acordo com a cláusula 69, ou o método de acordo com a cláusula 78, onde o agente terapêutico adicional é um agente terapêutico para o tratamento, ou profilaxia de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associada com hipersecreção de IL6 ou hi- persecreção de interferons.
[00386] 79) A composição farmacêutica de acordo com a cláusula 69, ou o método de acordo com a cláusula 78, onde o agente terapêutico adicional é um agente terapêutico para o tratamento, ou a profilaxia de mielofibrose, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), câncer pancreático, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do pulmão, câncer da mama, e câncer do cólon.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00387] Quando empregado como uma substância farmacêutica, um composto da invenção é tipicamente administrado na forma de uma composição farmacêutica. Tais composições podem ser preparadas em um modo bastante conhecido na técnica farmacêutica e compreendem pelo menos um composto ativo da invenção de acordo com a Fórmula I. Em geral, um composto da invenção é administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. A quantidade de composto da invenção de fato administrada tipicamente será determinada por um médico, considerando as circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a rota de administração escolhida, o composto efetivo da invenção administrado, a idade, o peso, e a resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente, e similares.
[00388] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por uma variedade de vias, incluindo a oral, a retal, a transdérmica, a subcutânea, a intra-articular, a intravenosa, a intra-muscular, e a intranasal. Dependendo da via de distribuição pretendida, um composto da invenção é preferivelmente formulado como com-posições injetáveis ou orais, ou como unguentos, como loções ou como emplastros, todos para a administração transdérmica.
[00389] As composições para a administração oral podem tomar a forma de soluções ou suspensões líquidas volumosas, ou pós volumosos. Mais comumente, entretanto, as composições são apresentadas nas formas de dosagens de unidades para facilitar a dosagem acurada. O termo 'formas de dosagens de unidades' refere-se às unidades fisicamente distintas, adequadas como dosagens unitárias para pacientes humanos ou outros mamíferos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente, veículo ou transportador farmacêutico adequado. As formas de dosagens de unidades típicas incluem as ampolas ou a seringas pré-enchidas, pré-medidas das composições líquidas ou as pílulas, os comprimidos, as cápsulas ou similares no caso de composições sólidas. Em tais composições, o composto da invenção de acordo com a Fórmula I é normalmente um componente secundário (de cerca de 0,1 a cerca de 50% em peso ou preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 40% em peso), com o restante sendo diversos veículos ou transportadores e auxiliares de processamento úteis para formar a forma de dosagem desejada.
[00390] As formas líquidas adequadas para a administração oral podem incluir um veículo aquoso ou não aquoso adequado com tampões, agentes de suspensão e dispersantes, corantes, essências e similares. As formas sólidas podem incluir, por exemplo, quaisquer dos ingredientes a seguir ou o composto da invenção de uma natureza si-milar: um aglutinante, tal como a celulose microcristalina, a goma tra- gacanto ou a gelatina; um excipiente, tal como o amido ou a lactose, um agente desintegrante, tal como o ácido algínico, o Primogel, ou o amido de milho; um lubrificante, tal como o estearato de magnésio; um agente de deslizamento, tal como o dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, tal como a sacarose ou a sacarina; ou um agente aromatizante, tal como a essência de hortelã-pimenta ou laranja.
[00391] As composições injetáveis são tipicamente baseadas em solução salina estéril ou solução salina tamponada com fosfato injetável ou outros veículos injetáveis conhecidos na técnica. Como antes, o composto ativo da invenção de acordo com a Fórmula I em tais composições é tipicamente um componente secundário, frequentemente sendo de cerca de 0,05 a 10% em peso, com o restante sendo o veículo injetável e similar.
[00392] As composições transdérmicas são tipicamente formuladas como um unguento ou creme tópico contendo o(s) ingrediente(s) ati- vo(s), geralmente em uma quantidade variando de cerca de 0,01 a cerca de 20% em peso, preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 20% em peso, preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 10% em peso, e mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 15% em peso. Quando formulados como um unguento, os ingredientes ativos tipicamente serão combinados com uma base de unguento parafínica ou uma miscível em água. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser formulados em um creme com, por exemplo, uma base de creme de óleo em água. Tais formulações transdérmicas são bastante conhecidas na técnica e, em geral, incluem ingredientes adicionais para aumentar a penetração dérmica de estabilidade dos ingredientes ativos ou da formulação. Todas as tais formulações transdérmicas e ingredientes conhecidos estão incluídos no escopo desta invenção.
[00393] Um composto da invenção pode também ser administrado por um dispositivo transdérmico. Consequentemente, a administração transdérmica pode ser efetuada usando um emplastro do tipo reservatório ou membrana porosa, ou de uma variedade de matriz sólida.
[00394] Os componentes acima descritos para as composições oralmente administráveis, injetáveis ou topicamente administráveis são meramente representativos. Outros materiais, assim como técnicas de processamento e similares, são apresentados na Parte 8 do Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edição, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, que é incorporado neste documento por referência.
[00395] Um composto da invenção pode também ser administrado em formas de liberação contínua ou a partir de sistemas de distribuição de fármacos de liberação contínua. Uma descrição dos materiais de liberação contínua representativos pode ser encontrada no Remington's Pharmaceutical Sciences.
[00396] Os exemplos de formulação a seguir ilustram as composições farmacêuticas representativas que podem ser preparadas de acordo com esta invenção. A presente invenção, entretanto, não está limitada às composições farmacêuticas que se seguem.
Formulação 1 - Comprimidos
[00397] Um composto da invenção de acordo com a Fórmula I pode ser misturado como um pó seco com um aglutinante de gelatina seco, em uma razão em peso aproximada de 1:2. Uma quantidade menor de estearato de magnésio pode ser adicionada como um lubrificante. A mistura pode ser formada em tabletes de 240-270 mg (80-90 mg do composto ativo da invenção de acordo com a Fórmula I por comprimido), em uma prensa de comprimidos.
Formulação 2 - Cápsulas
[00398] Um composto da invenção de acordo com a Fórmula I pode ser misturado como um pó seco com um diluente de amido, em uma razão em peso aproximada de 1:1. A mistura pode ser inserida em cápsulas de 250 mg (125 mg do composto ativo da invenção de acordo com a Fórmula I por cápsula).
Formulação 3 - Líquido
[00399] Um composto da invenção de acordo com a Fórmula I (125 mg) pode ser misturado com a sacarose (1,75 g) e a goma xantana (4 mg) e a mistura resultante pode ser misturada, passada através de uma peneira U.S. de malha No. 10, e então misturada com uma solução previamente preparada de celulose microcristalina e carboximetil celulose sódica (11:89, 50 mg) em água. O benzoato de sódio (10 mg), a essência, e o corante podem ser diluídos com a água e adicionados com agitação. Água suficiente pode então ser adicionada, com agitação. Mais água suficiente pode ser então adicionada para produzir um volume total de 5 mL.
Formulação 4 - Comprimidos
[00400] Um composto da invenção de acordo com a Fórmula I pode ser misturado como um pó seco com um aglutinante de gelatina seco, em uma razão em peso aproximada de 1:2. Uma quantidade menor de estearato de magnésio pode ser adicionada como um lubrificante. A mistura pode ser formada em tabletes de 450-900 mg (150-300 mg do composto ativo da invenção de acordo com a Fórmula I por comprimido), em uma prensa de comprimidos.
Formulação 5 - Injeção
[00401] Um composto da invenção de acordo com a Fórmula I pode ser dissolvido ou suspenso em um meio aquoso injetável de solução salina estéril tamponada, até uma concentração de aproximadamente 5 mg/mL.
Formulação 6 - Tópica
[00402] O álcool estearílico (250 g) e um petrolato (250 g) podem ser derretidos em torno de 75°C e então uma mistura de um composto da invenção de acordo com a Fórmula I (50 g) metilparaben (0,25 g), propilparaben (0,15 g), lauril sulfato de sódio (10 g), e propileno glicol (120 g), dissolvida em água (aproximadamente 370 g), pode ser adici-onada e a mistura resultante pode ser agitada até ela endurecer.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
[00403] Um composto da invenção pode ser usado como um agente terapêutico para o tratamento de condições em mamíferos que sejam relacionadas ou atribuíveis causalmente à atividade anormal da JAK, em particular, condições relacionadas à atividade anormal da JAK1 e/ou da TYK2. Consequentemente, os compostos e as composições farmacêuticas da invenção encontram uso como substâncias te-rapêuticas para prevenir e/ou tratar doenças alérgicas, doenças infla-matórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da carti-lagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças asso-ciadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons em mamíferos, incluindo os seres humanos.
[00404] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção, para uso como um medicamento.
[00405] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento.
[00406] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratar um mamífero tendo, ou correndo o risco de ter uma doença divulgada neste documento, o dito método compreendendo administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou que previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em um aspecto particular, a presente invenção proporciona um método de tratar um mamífero tendo, ou correndo o risco de ter doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons.
[00407] Nos aspectos de um método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, uma reação alérgica, o dito método compreendendo administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou que previne a condição de uma ou mais das composições far-macêuticas ou compostos da invenção como aqui descritos. Em uma modalidade específica, a reação alérgica é selecionada a partir de do-ença alérgica das vias aéreas, sinusite, eczema e urticárias, alergias a alimentos e alergias ao veneno de inseto.
[00408] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de uma reação alérgica. Em uma modalidade específica, a reação alérgica é selecionada a partir de doença alérgica das vias aéreas, sinusite, eczema e urticárias, alergias a alimentos e alergias ao veneno de inseto.
[00409] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de uma reação alérgica. Em uma modalidade específica, a reação alérgica é selecionada a partir de doença alérgica das vias aéreas, sinusite, eczema e urticá- rias, alergias a alimentos e alergias ao veneno de inseto.
[00410] Nos aspectos adicionais de método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, uma condição inflamatória. Os métodos compreendem administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção como aqui descritos. Em uma modalidade específica, a condição inflamatória é selecionada a partir de artrite reumatoide, osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (p.ex., asma) e doenças inflamatórias do intestino.
[00411] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de uma condição inflamatória. Em uma modalidade específica, a condição inflamatória é selecionada a partir de artrite reumatoide, osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (p.ex., asma) e doenças inflamatórias do intestino.
[00412] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona o composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compreen-dendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medi-camento para o tratamento e/ou a profilaxia de uma condição inflama- tória. Em uma modalidade específica, a condição inflamatória é sele-cionada a partir de artrite reumatoide, osteoartrite, doença alérgica das vias aéreas (p.ex., asma) e doenças inflamatórias do intestino.
[00413] Nos aspectos adicionais de método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, uma doença autoimune. Os métodos compreendem administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a doença autoimune é selecionada a partir de COPD, asma, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes melito tipo I e doença inflamatória do intestino.
[00414] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de uma doença autoimune. Em uma modalidade específica, a doença au- toimune é selecionada a partir de COPD, asma, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes melito tipo I e doença inflamatória do intestino. Em uma modalidade mais específica, a doença autoimune é o lúpus erite- matoso sistêmico.
[00415] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de uma doença au- toimune. Em uma modalidade específica, a doença autoimune é sele-cionada a partir de COPD, asma, lúpus eritematoso sistêmico, diabetes melito tipo I e doença inflamatória do intestino.
[00416] Nos aspectos adicionais de método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, uma doença proliferativa, os ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a doença proliferativa é selecionada a partir de câncer (p.ex., tumores sólidos, tais como leiomiossarcoma uterino ou câncer da próstata), leucemia (p.ex., AML, ALL ou CLL), mieloma múl-tiplo e psoríase. Em uma modalidade mais específica, a doença proli- ferativa é selecionada a partir de mielofibrose, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crô-nica (CLL), linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), câncer pan- creático, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do pulmão, câncer da mama, e câncer do cólon.
[00417] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de uma doença proliferativa. Em uma modalidade específica, a doença proliferativa é selecionada a partir de câncer (p.ex., tumores sólidos, tais como leiomiossarcoma uterino ou câncer da próstata), leucemia (p.ex., AML, ALL ou CLL), mieloma múltiplo e psoríase. Em uma modalidade mais específica, a doença proliferativa é selecionada a partir de mielofibrose, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), mi- eloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), câncer pancreático, câncer do fígado, carcinoma hepatocelular (HCC), câncer do pulmão, câncer da mama, e câncer do cólon.
[00418] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de uma doença proli- ferativa. Em uma modalidade específica, a doença proliferativa é sele-cionada a partir de câncer (p.ex., tumores sólidos, tais como leiomios- sarcoma uterino ou câncer da próstata), leucemia (p.ex., AML, ALL ou CLL), mieloma múltiplo e psoríase. Em uma modalidade mais específica, a doença proliferativa é selecionada a partir de mielofibrose, leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de células B grandes difuso (DLBCL), câncer pancreático, câncer do fígado, carcinoma hepatocelu- lar (HCC), câncer do pulmão, câncer da mama, e câncer do cólon.
[00419] Nos aspectos adicionais de método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, rejeição ao transplante, os ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a rejeição ao transplante é a rejeição ao transplante de órgãos.
[00420] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de rejeição ao transplante. Em uma modalidade específica, a rejeição ao transplante é a rejeição ao transplante de órgãos.
[00421] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de rejeição ao trans-plante. Em uma modalidade específica, a rejeição ao transplante é a rejeição ao transplante de órgãos.
[00422] Em um aspecto de método de tratamento, esta invenção proporciona um método de tratamento e/ou profilaxia em um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, método este que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção, ou uma ou mais das composições farmacêuticas aqui descritas.
[00423] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem.
[00424] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem.
[00425] A presente invenção também proporciona um método de tratamento e/ou profilaxia de malformações congênitas das cartilagens, método este que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos.
[00426] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de malformações congênitas das cartilagens.
[00427] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de malformações congênitas das cartilagens.
[00428] Nos aspectos adicionais de método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, doenças associadas com a hi- persecreção de IL6, os ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a doença associada com a hipersecreção de IL6 é selecionada a partir de doença de Castleman e glomerulonefrite proliferativa mesangial.
[00429] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção para uso no tratamento e/ou na profilaxia de doenças associadas com a hipersecreção de IL6. Em uma modalidade específica, a doença associada com a hipersecreção de IL6 é selecionada a partir de doença de Castleman e glomerulonefrite proliferativa mesangial.
[00430] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de doenças associadas com a hipersecreção de IL6. Em uma modalidade específica, a doença associada com a hipersecreção de IL6 é selecionada a partir de doença de Castleman e glomerulonefrite proliferativa mesangial.
[00431] Nos aspectos adicionais de método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, doenças associadas com a hi- persecreção de interferons, os ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a doença associada com a hipersecreção de interferons é selecionada a partir de lúpus eritematoso sistêmico e cutâneo, nefrite por lúpus, dermatomio- site, síndrome de Sjogren, psoríase, e artrite reumatoide.
[00432] Nos aspectos adicionais de método de tratamento, esta invenção proporciona métodos de tratamento e/ou profilaxia de um mamífero suscetível a, ou sofrendo com, doenças associadas com a hi- persecreção de interferons, os ditos métodos compreendendo administrar uma quantidade eficaz que trata a condição ou previne a condição de uma ou mais das composições farmacêuticas ou compostos da invenção aqui descritos. Em uma modalidade específica, a doença as- sociada com a hipersecreção de interferons é selecionada a partir de lúpus eritematoso sistêmico e cutâneo, nefrite por lúpus, dermatomio- site, síndrome de Sjogren, psoríase, e artrite reumatoide.
[00433] Ainda em outro aspecto, a presente invenção proporciona um composto da invenção, ou uma composição farmacêutica compre-endendo um composto da invenção, para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de doenças associadas com a hipersecreção de interferons. Em uma modalidade específica, a doença associada com a hipersecreção de interferons é selecionada a partir de lúpus eritematoso sistêmico e cutâneo, nefrite por lúpus, dermatomiosite, síndrome de Sjogren, psoríase, e artrite reuma- toide.
[00434] Como um aspecto adicional da invenção, proporciona-se um composto da invenção para uso como uma substância farmacêutica, especialmente no tratamento e/ou na profilaxia das condições e doenças anteriormente mencionadas. Proporciona-se também neste documento o uso dos presentes compostos na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou a profilaxia de uma das condições e doenças anteriormente mencionadas.
[00435] Um regime particular do presente método compreende a administração a um paciente que sofra de uma doença envolvendo a inflamação de uma quantidade eficaz de um composto da invenção, por um período de tempo suficiente para reduzir o nível de inflamação no paciente, e preferivelmente acabar com os processos responsáveis pela dita inflamação. Uma modalidade especial do método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um composto da invenção a um paciente sofrendo de, ou suscetível ao, desenvolvimento de artrite reumatoide, por um período de tempo suficiente para reduzir ou prevenir, respectivamente, a inflamação nas articulações do dito paciente, preferivelmente acabar com os processos responsáveis pela dita inflamação.
[00436] Um regime particular adicional do presente método compreende a administração a um paciente que sofre de uma condição de doença caracterizada por degradação da cartilagem ou da articulação (p.ex., artrite reumatoide e/ou osteoartrite) de uma quantidade eficaz de um composto da invenção, por um período de tempo suficiente para reduzir e preferivelmente acabar com os processos que se autoper- petuam, responsáveis pela dita degradação. Uma modalidade particular do método compreende a administração de uma quantidade eficaz de um composto da invenção a um paciente que sofre de, ou suscetível ao, desenvolvimento de osteoartrite, por um período de tempo suficiente para reduzir ou prevenir, respectivamente, a degradação da cartilagem nas articulações do dito paciente, e preferivelmente acabar com os processos que se autoperpetuam, responsáveis pela dita degradação. Em uma modalidade particular, o dito composto pode exibir propriedades anabólicas e/ou anticatabólicas da cartilagem.
[00437] Os níveis de doses de injeção variam de cerca de 0,1 mg/kg/h a pelo menos 10 mg/kg/h, todos por de cerca de 1 a cerca de 120 h e especialmente 24 a 96 h. Um bolo de pré-carga de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou mais pode também ser administrado para obter os níveis adequados do estado estacionário. A dose total máxima não é esperada exceder cerca de 2 g/dia para um paciente humano de 40 a 80 kg.
[00438] Para a profilaxia e/ou o tratamento de condições de longa duração, tais como as condições degenerativas, o regime para o tra-tamento normalmente se estende por muitos meses ou anos, de modo que a dosagem oral é preferida por conveniência e tolerância do paci-ente. Com a dosagem oral, uma a cinco e especialmente duas a quatro e tipicamente três doses orais por dia são regimes representativos. Usando estes padrões de dosagem, cada dose proporciona de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de um composto da invenção, com as doses particulares cada uma proporcionando de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg e especialmente cerca de 1 a cerca de 5 mg/kg.
[00439] As doses transdérmicas são, em geral, selecionadas para proporcionar níveis sanguíneos similares ou menores do que são obtidos usando as doses de injeção.
[00440] Quando usado para prevenir o início de uma condição, um composto da invenção será administrado a um paciente correndo o risco de desenvolver a condição, tipicamente sob o parecer e sob a supervisão de um médico, nos níveis de dosagens descritos acima. Os pacientes que correm o risco de desenvolver uma condição particular geralmente incluem aqueles que têm uma história na família da condição, ou aqueles que tenham sido identificados por teste ou exame genético serem particularmente suscetíveis ao desenvolvimento da condição.
[00441] Um composto da invenção pode ser administrado como o único agente ativo ou ele pode ser administrado em combinação com outros agentes terapêuticos, incluindo outros compostos que demonstrem uma atividade terapêutica igual ou uma similar e que forem determinados serem seguros e eficazes para tal administração combinada. Em uma modalidade específica, a coadministração de dois (ou mais) agentes permite que doses significativamente menores de cada um sejam usadas, com isso reduzindo os efeitos colaterais vistos.
[00442] Em uma modalidade, um composto da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção é administrada como um medicamento. Em uma modalidade específica, a dita composição farmacêutica adicionalmente compreende um ingrediente ativo adicional.
[00443] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profila- xia de uma doença envolvendo a inflamação; os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos, agentes imunorreguladores, p.ex., azatioprina, corticosteroides (p.ex., prednisolona ou dexameta- sona), ciclofosfamida, ciclosporina A, tacrolimus, Micofenolato Mofetil, muromonab-CD3 (OKT3, p.ex., Orthocolone®), ATG, aspirina, aceta-minofem, ibuprofeno, naproxem, e piroxicam.
[00444] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de artrite (p.ex., artrite reumatoide); os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos, analgésicos, fármacos anti- inflamatórios não esteroidais (NSAIDS), esteroides, DMARDS sintéticos (por exemplo, porém sem limitação, metotrexato, leflunomida, sul- fasalazina, auranofina, aurotiomalato de sódio, penicilamina, cloroqui- na, hidroxicloroquina, azatioprina, e ciclosporina), e DMARDS biológicos (por exemplo, porém sem limitação, Infliximab, Etanercept, Ada- limumab, Rituximab, e Abatacept).
[00445] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de distúrbios proliferativos; os agentes particulares incluem, porém não estão limitados ao: metotrexato, leucovorina, adriamicina, preniso- na, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluorouracil, paclitaxel, docetaxel, vin- cristina, vimblastina, vinorelbina, doxorrubicina, tamoxifeno, toremife- no, acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticorpo monoclonal anti-HER2 (p.ex., Herceptin®), capecitabina, cloridrato de raloxifeno, inibidores do EGFR (p.ex., lressa®, Tarceva®, Erbitux®), inibidores do VEGF (p.ex., Avastin®), inibidores do proteassoma (p.ex., Velcade®), Glivec® e inibidores de hsp90 (p.ex., 17-AAG). Adicionalmente, um composto da invenção pode ser administrado em combinação com outras terapias, incluindo, porém não limitadas à, radioterapia ou cirurgia. Em uma modalidade específica, o distúrbio proliferativo é selecionado a partir de câncer, doença mieloproliferativa e leucemia.
[00446] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de doenças autoimunes, os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos: glicocorticoides, agentes citostáticos (p.ex., análogos de purina), agentes alquilantes, (p.ex., mostardas nitrogena- das (ciclofosfamida), nitrosoureias, compostos de platina, e outros), antimetabólitos (p.ex., metotrexato, azatioprina e mercaptopurina), an-tibióticos citotóxicos (p.ex., antraciclinas de dactinomicina, mitomicina C, bleomicina, e mitramicina), anticorpos (p.ex., anticorpos monoclo- nais anti-CD20, anti-CD25 ou anti-CD3 (OTK3), Atgam® e Thymoglo- buline®), ciclosporina, tacrolimus, rapamicina (sirolimus), interferons (p.ex., IFN-β), proteínas de ligação ao TNF (p.ex., infliximab (Remicade®), etanercept (Enbrel®), ou adalimumab (Humira®)), micofenolato, Fingolimod e Miriocina.
[00447] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de rejeição ao transplante, os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos: inibidores da calcineurina (p.ex., ciclosporina ou tacrolimus (FK506)), inibidores de mTOR (p.ex., sirolimus, everoli- mus), antiproliferativos (p.ex., azatioprina, ácido micofenólico), corti- costeroides (p.ex., prednisolona, hidrocortisona), Anticorpos (p.ex., an-ticorpos monoclonais antirreceptor de IL-2Rα, basiliximab, daclizu- mab), anticorpos policlonais anticélulas T (p.ex., globulina antitimócitos (ATG), globulina antilinfóscito (ALG)).
[00448] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de asma e/ou rinite e/ou COPD, os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos: agonistas beta2-adrenorreceptores (p.ex., salbutamol, levalbuterol, terbutalina e bitolterol), epinefrina (ina- lada ou comprimidos), anticolinérgicos (p.ex., brometo de ipratrópio), glicocorticoides (orais ou inalados) agonistas β2 de longa atuação (p.ex., salmeterol, formoterol, bambuterol, e albuterol oral de liberação contínua), combinações de esteroides inalados e broncodilatadores de longa atuação (p.ex., fluticasona/salmeterol, budesonida/formoterol), antagonistas e inibidores da síntese de leucotrienos (p.ex., montelu- kast, zafirlukast e zileuton), inibidores da liberação de mediador (p.ex., cromoglicato e cetotifeno), reguladores biológicos da resposta de IgE (p.ex., omalizumab), anti-histaminas (p.ex., ceterizina, cinarizina, fexo- fenadina) e vasoconstritores (p.ex., oximetazolina, xilometazolina, na- fazolina e tramazolina).
[00449] Adicionalmente, um composto da invenção pode ser administrado em combinação com terapias de emergência para asma e/ou COPD, tais terapias incluem a administração de oxigênio ou heliox, salbutamol ou terbutalina nebulizada (opcionalmente combinada com um anticolinérgico (p.ex., ipratrópio), esteroides sistêmicos (orais ou intravenosos, p.ex., prednisona, prednisolona, metilprednisolona, de- xametasona, ou hidrocortisona), salbutamol intravenoso, beta- agonistas não específicos, injetados ou inalados (p.ex., epinefrina, iso- etarina, isoproterenol, metaproterenol), anticolinérgicos (IV ou nebuli- zados, p.ex., glicopirrolato, atropina, ipratrópio), metilxantinas (teofilina, aminofilina, bamifilina), anestésicos de inalação que tenham um efeito broncodilatador (p.ex., isoflurano, halotano, enflurano), cetamina e sulfato de magnésio intravenoso.
[00450] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de doença inflamatória do intestino (IBD), os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos: glicocorticoides (p.ex., pred- nisona, budesonida) agentes imunomoduladores, modificadores da doença, sintéticos (p.ex., metotrexato, leflunomida, sulfasalazina, me- salazina, azatioprina, 6-mercaptopurina e ciclosporina) e agentes imu- nomoduladores, modificadores da doença, biológicos (infliximab, ada- limumab, rituximab, e abatacept).
[00451] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de SLE, os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos: Fármacos antirreumáticos modificadores da doença (DMARDs), tais como antimaláricos (p.ex., plaquenil, hidroxicloroqui- na), imunossupressores (p.ex., metotrexato e azatioprina), ciclofosfa- mida e ácido micofenólico; fármacos e analgésicos imunossupresso- res, tais como fármacos anti-inflamatórios não esteroidais, opiatos (p.ex., dextropropoxifeno e co-codamol), opioides (p.ex., hidrocodona, oxicodona, MS Contina, ou metadona) e o emplastro transdérmico de fentanila duragesic.
[00452] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de psoríase, os agentes particulares incluem, porém não estão limitados aos: tratamentos tópicos, tais como soluções de banho, umidifi- cadores, cremes e unguentos medicinais contendo alcatrão de hulha, ditranol (antralina), corticosteroides como a desoximetasona (Topi- cort®), fluocinonida, análogos de vitamina D3 (por exemplo, calcipotri- ol), óleo de argânia e retinoides (etretinato, acitretina, tazaroteno), tratamentos sistêmicos, tais como metotrexato, ciclosporina, retinoides, tioguanina, hidroxiureia, sulfasalazina, micofenolato mofetil, azatiopri- na, tacrolimus, ésteres de ácido fumárico ou substâncias biológicas, tais como Amevive®, Enbrel®, Humira®, Remicade®, Raptiva® e usteki- numab (um bloqueador de IL-12 e IL-23). Adicionalmente, um composto da invenção pode ser administrado em combinação com outras terapias, incluindo, porém não limitadas à, fototerapia, ou fotoquimiote- rapia (p.ex., fototerapia de psoraleno e ultravioleta A (PUVA)).
[00453] Em uma modalidade, um composto da invenção é coadmi- nistrado com outro agente terapêutico para o tratamento e/ou a profilaxia de reação alérgica, os agentes particulares incluem, porém não estão limitados às: anti-histaminas (p.ex., cetirizina, difenidramina, fe- xofenadina, levocetirizina), glicocorticoides (p.ex., prednisona, betame- tasona, beclometasona, dexametasona), epinefrina, teofilina ou anti- leucotrienos (p.ex., montelukast ou zafirlukast), anticolinérgicos e des-congestionantes.
[00454] Por coadministração está incluído qualquer meio de liberar dois ou mais agentes terapêuticos para o paciente, como parte do mesmo regime de tratamento, conforme será aparente para a pessoa versada. Embora os dois ou mais agentes possam ser administrados simultaneamente, em uma única formulação, isto não é essencial. Os agentes podem ser administrados em diferentes formulações e em di-ferentes tempos.
PROCEDIMENTOS SINTÉTICOS QUÍMICOS Geral
[00455] Os compostos da invenção podem ser preparados a partir de materiais de partida prontamente disponíveis, usando os métodos e os procedimentos gerais a seguir. Será apreciado que onde forem dadas condições de processo típicas ou preferidas (i.e., temperaturas de reação, tempos, razões em mol de reagentes, solventes, pressões, etc), outras condições de processo podem também ser usadas, salvo indicação em contrário. As condições de reação ótimas podem variar com os reagentes ou o solvente particular usado, porém tais condições podem ser determinadas por alguém versado na técnica por procedi-mentos de otimização de rotina.
[00456] Adicionalmente, conforme será aparente para aqueles versados na técnica, grupos protetores convencionais podem ser necessários para impedir que certos grupos funcionais sofram reações inde- sejadas. A escolha de um grupo protetor adequado para um grupo funcional particular, assim como as condições adequadas para a pro-teção e a desproteção são bastante conhecidas na técnica (Greene, T W; Wuts, P G M;, 1991).
[00457] Os métodos a seguir são apresentados com detalhes quanto à preparação de um composto da invenção como definido acima e nos exemplos comparativos. Um composto da invenção pode ser preparado a partir de materiais de partida e reagentes conhecidos ou comercialmente disponíveis, por alguém versado na técnica de síntese orgânica.
[00458] Todos os reagentes eram de grau comercial e foram usados como recebidos, sem purificação adicional, salvo indicação em contrário. Os solventes anidros comercialmente disponíveis foram usados para as reações conduzidas sob atmosfera inerte. Os solventes de grau reagente foram usados em todos os outros casos, salvo especificação em contrário. A cromatografia em coluna foi efetuada sobre sílica-gel 60 (35-70 μm). A cromatografia em camada fina foi realizada usando placas pré-revestidas de sílica-gel F-254 (espessura 0,25 mm). Os espectros de RMN 1H foram registrados sobre um es- pectrômetro de RMN DPX da Bruker (400 MHz) ou um espectrômetro de RMN Advance 300 da Bruker (300 MHz). Os deslocamentos químicos (δ) para os espectros de RMN 1H são descritos em partes por milhão (ppm) em relação ao tetrametilsilano (δ 0,00) ou o pico de solvente residual apropriado, i.e., CHCl3 (δ 7,27), como referência interna. As multiplicidades são dadas como singlete (s), dublete (d), triplete (t), quarteto (q), quintuplete (quin), multiplete (m) e amplo (br). Os espectros de MS por eletropulverização foram obtidos sobre um espectrôme- tro de LC/MS de plataforma da Waters ou com a UPLC Acquity H- Class da Waters acoplada a um espectrômetro 3100 com Detector de massa da Waters. Colunas usadas: Acquity UPLC BEH C18 1,7 μm, 2,1 mm de DI x 50 mm de C da Waters, Acquity UPLC BEH C18 1,7 μm, 2,1 mm de DI x 30 mm de C da Waters, ou Xterra MS 5 μm C18, 100 x 4,6 mm da Waters. Os métodos são usando gradientes de MeCN/H2O (a H2O contém 0,1% de TFA ou 0,1% de NH3) ou gradientes de MeOH /H2O (a H2O contém 0,05% de TFA). O aquecimento com micro-ondas foi efetuado com um Iniciador da Biotage.
[00459] As purificações por HPLC preparativa foram efetuadas com um Sistema de autopurificação dirigido para a massa, acoplado com um espectrômetro de massa de quadrupolo individual ZQ. Todas as purificações por HPLC foram efetuadas com um gradiente de H2O (pHs diferentes)/MeCN. As separações por HPLC sob condições básicas foram normalmente efetuadas usando uma pré-coluna BEH XBrigde C18 (5 μm, 19x5 mm) e uma BEH XBrigde C18 (5 μm, 19x100 mm). As separações sob condições básicas foram normalmente efetuadas usando uma pré-coluna CSH Select C18 (5 μm, 19x5 mm) e uma CSH Select C18 (5 μm, 19x100 mm). O gradiente focado era a partir de x% até x+25% de acetonitrila em água, em 5 min, com um tempo de ciclo de 10 min. A vazão da coluna era 20 mL/min. O volume de injeção variou de 200 a 750 μL. Um separador capilar foi usado para desviar o fluxo, após a separação por coluna, para o espectrômetro de massa, que foi diluído por 1 mL/min de fluxo de reposição. O fluxo de reposição é 0,1% de ácido fórmico em metanol. Todas as amostras foram purificadas por uma coleta de fração dirigida para a massa da Waters. Tabela 1. Lista de abreviações usadas na seção experimental:
Figure img0021
Figure img0022
Figure img0023
PREPARAÇÃO SINTÉTICA DO COMPOSTO DA INVENÇÃO Exemplo 1. Síntese dos compostos intermediários da invenção 1.1. Síntese de bis-(4-metóxi-benzil)-amina (Int.1)
Figure img0024
[00460] O p-anisaldeído (411 mmol), a 4-metoxibenzilamina (411 mmol) e o tolueno (500 mL) foram combinados em um frasco de fundo redondo adaptado com um condensador e um sifão de Dean-Stark. A reação foi refluxada por 1 h, durante o que a água foi removida da mis- tura de reação. A reação foi resfriada e concentrada. O resíduo foi dis-solvido em MeOH (120 mL). A mistura foi resfriada até 5°C e o NaBH 4 (205 mmol) foi adicionado em porções por 45 min. A reação foi lenta- mente aquecida ao refluxo. Após 2 h ao refluxo, a reação foi resfriada até a temperatura ambiente e concentrada. O resíduo foi dissolvido em EtOAc. A camada orgânica foi lavada (3 x H2O e salmoura), secada (Na2SO4) e concentrada para produzir o produto desejado. 1.2. Síntese de (6-Bromo-1-metil-1H-benzoimidazol-4-il)-bis-(4-metóxi- benzil)-amina (Int.2)
Figure img0025
1.2.1. Etapa i: 5-Bromo-1,3-diflúor-2-nitro-benzeno
[00461] Uma solução de 4-bromo-2,6-difluoranilina (240 mmol) em AcOH (150 mL) foi adicionada gota a gota a uma suspensão de Na- BO3.4 H2O (325 mmol) em AcOH (450 mL) a 70°C durante 30 min . Outros 2080 mmol de NaBO3.4 H2O foram adicionados por 5 h à mistura. Durante esse período a mistura foi agitada a 70°C. A mistura foi vertida em água e extraída com Et2O. A camada orgânica foi combinada com outra solução de Et2O obtida a partir de outra reação usando as mesmas condições descritas acima. A mistura foi concentrada. Um precipitado foi formado e separado por filtração. O filtrado foi concentrado para fornecer o produto desejado após a cromatografia em coluna rápida (SiO2, éter de petróleo).
1.2.2. Etapa ii: (5-Bromo-3-flúor-2-nitro-fenil)-metil-amina
[00462] A MeNH2 2 M em THF (82 mL) foi adicionada gota a gota à uma solução de 5-bromo-1,3-diflúor-2-nitrobenzeno (164 mmol) e Cs2CO3 (197 mmol) em THF (1 L). A mistura de reação foi agitada a 0°C por 1 h e, em seguida, na temperatura ambiente por 1 h. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi dividido entre o EtOAc e a H2O. As duas fases foram separadas e a camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada para proporcionar o produto desejado.
1.2.3. Etapa iii: 5-Bromo-N,N-bis-(4-metóxi-benzil)-N'-metil-2-nitro- benzeno-1,3-diamina
[00463] Uma mistura de bis-(4-metóxi-benzil)-amina (346 mmol), 5- bromo-3-flúor-N-metil-2-nitroanilina (297 mmol) e Et3N (891 mmol) foi agitada a 120°C por 16 h. A mistura foi, em seguida , resfriada. O bruto foi combinado com um outro obtido seguindo o mesmo procedimento descrito acima. A mistura resultante foi diluída em EtOAc e lavada (2 x HCl 0,2 M, H2O e NaHCO3 sat.). A fase orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada para proporcionar o produto desejado.
1.2.4. Etapa iv: 5-Bromo-N,N-bis-(4-metóxi-benzil)-N''-metil-benzeno- 1,2,3-triamina
[00464] Uma mistura de 5-Bromo-N,N-bis-(4-metóxi-benzil)-N'-metil- 2-nitro-benzeno-1,3-diamina (170 mmol), NH4Cl (2038 mmol) e Zn (2034 mmol) em MeOH/THF 1:1 (1 L) foi agitada na temperatura ambiente por 1 h. A mistura foi resfriada até 0°C e o HCOOH (20 mL) foi lentamente adicionado. A mistura foi deixada atingir a temperatura ambiente e agitada por 1 h. A mistura foi filtrada e combinada com outra obtida seguindo o procedimento descrito acima. A mistura resultante foi concentrada. O resíduo foi dissolvido em DCM. A mistura orgânica foi lavada (NH4Cl sat.), secada (Na2SO4) e concentrada para proporcionar o produto desejado.
1.2.5. Etapa v: (6-Bromo-1-metil-1H-benzoimidazol-4-il)-bis-(4-metóxi- benzil)-amina
[00465] A 5-Bromo-N,N-bis-(4-metóxi-benzil)-N''-metil-benzeno- 1,2,3-triamina (170 mmol) foi dissolvida em uma mistura de HC(OEt)3 (100 mol) e MeCN (500 mL). A mistura foi agitada a 85°C por 0,5 h e, em seguida, na temperatura ambiente por aproximadamente 16 h. A mistura foi combinada com outra obtida seguindo o mesmo procedimento descrito acima. A mistura resultante foi concentrada e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/éter de petróleo 15:85 a 60:40) para obter o produto desejado. 1.3. Síntese de 5-{7-[Bis-(4-metóxi-benzil)-amino]-3-metil-3H- benzoimidazol-5-ilóxi}-4-metil-piridina-2-carbonitrila (Int.3).
Figure img0026
1.3.1. Etapa i: Bis-(4-metóxi-benzil)-[1-metil-6-(4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1H-benzoimidazol-4-il]-amina
[00466] Uma mistura de (6-bromo-1-metil-1H-benzoimidazol-4-il)- bis-(4-metóxi-benzil)-amina (54 mmol), bis(pinacolato)diboro (81 mmol), PdCl2(dppf).DCM (2,71 mmol) e KOAc (162,5 mmol) em DMF (150 mL) foi sonicada por 5 min sob uma corrente de nitrogênio. A mistura foi, em seguida, agitada a 110°C em um fras co de fundo redondo, equipado com um condensador por 1 h. A mistura foi filtrada através de um recheio de celite e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi dissolvido em EtOAc e a camada orgânica foi lavada (H2O), secada (Na2SO4) e concentrada para proporcionar o produto desejado. 1.3.2. Etapa ii: 5-{7-[Bis-(4-metóxi-benzil)-amino]-3-metil-3H- benzoimidazol-5-ilóxi}-4-metil-piridina-2-carbonitrila
[00467] A H2O2 30% em p. em H2O (20 mL) foi adicionada a uma solução de N,N-bis(4-metoxibenzil)-1-metil-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)-1H-benzo[d]imidazol-4-amina (58,5 mmol) em DMF (600 mL) e a mistura foi agitada por aproximadamente 16 h na tempe-ratura ambiente. A reação foi terminada com 5% de Na2SO3 aquoso. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada (H2O), secada (Na2SO4) e concentrada para proporcionar o produto desejado. 1.4. Método geral: iodação direcionada para orto
Figure img0027
[00468] em que W pode ser: -N=, -CH=, -C(Cl)=; Y pode ser: -N=, - C(CN)=
1.4.1. Método A1
[00469] Uma mistura do material de partida de amino aromático ou heteroaromático (1 eq), Ag2SO4 (1 eq) e I2 (1 eq) em EtOH é agitada em temperaturas variando da temperatura ambiente até 50°C por um período que pode variar de 1 h a aproximadamente 16 h. A mistura é filtrada, concentrada e diluída em um solvente orgânico. A mistura orgânica sofre a preparação aquosa. O solvente é removido sob pressão reduzida e o resíduo é purificado por cromatografia em coluna rápida para produzir o produto desejado. 1.4.2. Exemplo ilustrativo do método A1: síntese de 4-Amino-3-flúor-5- iodo-benzonitrila (Int.4).
Figure img0028
[00470] Uma mistura de 4-amino-3-fluorbenzonitrila (147 mmol), I2 (147 mmol) e Ag2SO4 (147 mmol) em EtOH (700 mL) foi agitada na temperatura ambiente por 1,5 h. A mistura foi filtrada e concentrada. O resíduo foi dissolvido em EtOAc e lavado (Na2S2O3 sat. x 3). A camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, ciclo-hexano/EtOAc 95:5 a 70:30) para produzir o produto desejado. 1.4.3. Método A2
[00471] Uma mistura do material de partida de amino aromático ou heteroaromático (1 eq), Ag2SO4 (3 a 4 eq) e I2 (3 a 4 eq) em EtOH é agitada a 70°C por 16 h. Mais equivalentes de I 2 e Ag2SO4 podem ser adicionados para aumentar a conversão. A mistura é filtrada e con-centrada. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna rápida para produzir o produto desejado. 1.5. Exemplo ilustrativo do método A2: síntese de 5-amino-6-flúor-4- iodo-piridina-2-carbonitrila (Int.5).
Figure img0029
[00472] Uma mistura do \nt.11 (3,62 mmol), \2 (14,5 mmol) e Ag2SO4 (14,5 mmol) em EtOH (200 mL) foi agitada a 70°C por 16 h. 5 equivalentes mais de \2 e Ag2SO4 foram adicionados e a reação foi agi-tada a 70°C por umas 72 h adicionais. A mistura fo i filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtO- Ac/ciclo-hexano 20:80 a 40:60) para produzir o produto desejado. 1.6. Método geral: introducão do grupo nitrila pela reação de Negishi RA RA X
Figure img0030
[00473] Onde RA pode ser arila ou heteroarila; e X pode ser Cl, Br ou \.
1.6.1. Método B
[00474] Uma mistura de halogeneto de arila/heteroarila (1 eq), cianeto de zinco (1 a 3 eq), Pd(PPh3)4 (0,1 a 0,2 eq) em DMF é aquecida para 150°C em um aparelho de micro-ondas por um per íodo variando de 5 min a 0,5 h. A mistura é filtrada e concentrada. O resíduo é diluído com um solvente orgânico. A mistura orgânica sofre a preparação aquosa e o solvente é removido sob pressão reduzida. O resíduo é triturado ou purificado por cromatografia em coluna rápida para produ- zir o produto desejado. 1.6.2. Exemplo ilustrativo do piridina-2-carbonitrila (Int.7).
Figure img0031
[00475] Um tubo de micro-ondas foi carregado com 2-cloro-5-flúor- 4-metilpiridina (5,5 mmol), Zn(CN)2 (16,6 mmol), Pd(PPh3)4 (1,1 mmol) em DMF (20 mL). A mistura foi agitada a 150°C por 5 min em um reator de microondas. A mistura foi combinada com outros brutos obtidos seguindo o procedimento descrito acima. A mistura resultante foi filtrada. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com EtOAc, lavado (NH4Cl sat.), secado (Na2SO4) e concentrado. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/éter de petróleo 5:95 a 15:85) para produzir o produto desejado. 1.7. Método geral: Suzuki com ácido metil borônico NH2 NH2
Figure img0032
[00476] Onde W pode ser: -N=, -CH=, -C(Cl)=; e Y pode ser: -N=, - C(CN)=; e x pode ser -I ou -Br
1.7.1. Método C
[00477] Uma mistura do halogeneto aromático/heteroaromático (1 eq), ácido metil borônico (1,3 a 3 eq), Pd(dppf)Cl2.DCM (0,11 a 0,2 eq) e Cs2CO3 (3 a 5 eq) em 1,4-dioxana é agitada a 100°C. A mi stura é diluída com um solvente orgânico. A mistura orgânica sofre a preparação aquosa e o solvente é removido sob pressão reduzida. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna rápida para produzir o produto desejado. 1.7.2. Exemplo ilustrativo do método C: síntese de 5-amino-6-flúor-4- metil-piridina-2-carbonitrila (Int.12).
Figure img0033
[00478] Uma mistura do Int.5 (3 mmol), ácido metil borônico (9,1 mmol), Pd(dppf)Cl2.DCM (0,32 mmol) e Cs2CO3 (15,2 mmol) em 1,4dioxana (8 mL) foi agitada a 105°C por 5 h. A mist ura foi diluída (EtO- Ac), lavada (NaHCO3 sat.), secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtO- Ac/éter de petróleo 10:90 a 50:50) para produzir o produto desejado. 1.8. Síntese de 6-bromo-2-flúor-piridin-3-ilamina (Int.15) NH2 NH2
Figure img0034
[00479] Uma mistura de 2-fluorpiridin-3-amina (44,6 mmol) e KOAc (44,6 mmol) em AcOH foi agitada na temperatura ambiente por 1 h. A mistura foi resfriada até 0 C e o Br2 (44,6 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada a 0°C por 15 min. A m istura foi concentrada e o resíduo foi dissolvido em EtOAc/MeOH. A solução orgânica foi lavada (NaHCO3 sat., Na2S2O3 sat.), secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, éter de petróleo/EtOAc 100:0 a 80:20) para produzir o produto desejado. 1.9. Síntese de 2-bromo-6-flúor-4-metanossulfonil-fenilamina (Int.16).
Figure img0035
[00480] Uma mistura de 2-flúor-4-metilsulfonil-anilina (22,76 mmol) e KOAc (22,7 mmol) em AcOH foi agitada na temperatura ambiente. A mistura foi resfriada até 0°C e o Br2 (22,7 mmol) foi adicionado gota a gota. A mistura foi agitada por 30 min a 0°C. A mi stura foi concentrada e o resíduo foi absorvido em EtOAc. A mistura orgânica foi lavada (NaHCO3 sat., Na2S2O3 sat.), secada (Na2SO4) e concentrada para produzir o produto desejado. 1.10. Síntese de 4-amino-3-etil-5-flúor-benzonitrila (Int.17).
Figure img0036
[00481] Uma mistura de Cs2CO3 (46 mmol) e Pd(dppf)Cl2.DCM (0,76 mmol) foi suspensa em DMF (35 mL) e degaseificada com nitrogênio. A H2O (400 μL), o Et3B 1 M em THF (11,5 mL) e uma solução do Int.4 (7,63 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados à mistura e a reação foi agitada a 60°C por 30 min. A mistura fo i concentrada e o resíduo foi absorvido em EtOAc, lavado (NaHCO3 sat., H2O), secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, éter de petróleo/EtOAc 100:0 a 95:5) para produzir o produto desejado. 1.11. Método geral: conversão de NH2 em iodeto
Figure img0037
[00482] em que R10 pode ser Me ou Et.
1.11.1. Método D
[00483] O HCl conc. (6 eq) é adicionado gota a gota a uma mistura do composto de amino aromático/heteroaromático (1 eq) em H2O a 0 C. Uma solução de NaNO2 (1,05 eq) em H2O é adicionada gota a gota. A mistura resultante é agitada a 0 C por 15 min. Uma solução de KI (1,05 eq) em H2O é adicionada gota a gota. A mistura é agitada a 0°C por 15 min e por 1 h na temperatura ambiente. A mistura é extraída com um solvente orgânico. Após a preparação aquosa e a remoção do solvente sob pressão reduzida, o resíduo pode ser submetido à trituração ou cromatografia para produzir o produto desejado. 1.11.2. Exemplo ilustrativo do método D: síntese de 5-iodo-4-metil- piridina-2-carbonitrila (Int.18).
Figure img0038
[00484] O HCl conc. (0,9 mL) foi adicionado gota a gota a uma mistura do Int.8 (1,88 mmol) em H2O (10 mL) a 0°C, seguido pela adição gota a gota de uma solução de NaNO2 (1,97 mmol) em H2O (0,5 mL). A mistura resultante foi agitada a 0 C por 15 min. Uma solução de KI (1,97 mmol) em H2O (1 mL) foi adicionada gota a gota. A mistura resultante foi agitada a 0°C por 15 min e por 1 h na tem peratura ambiente. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada (H2O), secada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, ciclo-hexano/EtOAc 100:0 a 75:25) para produzir o produto desejado. 1.12. Síntese de 6-bromo-4-metil-piridin-3-ilamina (Int.20)
Figure img0039
[00485] Uma mistura de NH4Cl (14,9 mmol) e pó de ferro (18,4 mmol) em H2O (5 mL) foi agitada a 90°C. A 2-b.omo-4-metil-5- nit.opi.idina (2,3 mmol) foi adicionada em po.ções. A mistu.a foi agitada a 90°C po. 1 h e 15 min. A .eação foi inte..ompi da e ext.aída com EtOAc. A camada o.gânica foi secada (Na2SO4) e concent.ada pa.a p.oduzi. o p.oduto desejado. 1.13. Síntese de 4-amino-3-cloro-5-flúor-benzonitrila (Int.21)
Figure img0040
[00486] Uma mistu.a de 4-amino-3-fluo.benzonit.ila (184 mmol) e NCS (276 mmol) em AcOH (300 mL) foi agitada a 70°C por aproxima-damente 16 h. A mistura foi concentrada. A H2O foi adicionada ao re-síduo e o produto sólido foi filtrado e lavado (NaHCO3 sat. e H2O). Para eliminar a H2O, o THF foi adicionado e removido sob pressão reduzida para produzir o produto desejado. 1.14. Síntese de 3-etil-4-hidróxi-benzonitrila (Int.22)
Figure img0041
[00487] O H2SO4 concentrado (3,4 mL) foi adicionado gota a gota a uma solução de 4-amino-3-etilbenzonitrila (6,84 mmol) em H2O (12 mL) a 0°C. Uma solução de NaNO 2 (7,52 mmol) em H2O (5 mL) foi adicionada gota a gota a 0°C à mistura resultante. A reação foi agitada a 0°C por 30 min e a 100°C por 2 h. A mistura foi r esfriada até a temperatura ambiente e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada (H2O), secada e concentrada para produzir o produto desejado. 1.15. Síntese de 2-cloro-3-flúor-piridin-4-ilamina (Int.23)
Figure img0042
1.15.1. Etapa i: N-(2-cloro-3-flúor-4-piridil)carbamato de terc-butila
[00488] A difenilfosforil azida (DPPA) (129 mmol) foi adicionada a uma mistura de ácido 2-cloro-3-flúor-piridina-4-carboxílico (85,7 mmol), Et3N (257 mmol) em terc-BuOH/tolueno 1:1 (200 mL). A mistura foi aquecida a 110°C por 4 h. A mistura foi diluída com H2O e extraída com DCM. A camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, DCM/EtOAc 100:0 a 80:20) para produzir o produto desejado N-(2- cloro-3-flúor-4-piridil)carbamato de terc-butila.
1.15.2. Etapa ii: 2-Cloro-3-flúor-piridin-4-ilamina
[00489] Uma solução de N-(2-cloro-3-flúor-4-piridil)carbamato de terc-butila (20,2 mmol) em TFA/DCM 1:2 (45 mL) foi agitada na tempe-ratura ambiente por 6 h. A mistura de reação foi concentrada e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, DCM/NH3 7N 100:0 a 90:10 em MeOH) para produzir o produto desejado. 1.16. Método geral: Ligação de Buchwald com a (6-Bromo-1-metil-1H- benzoimidazol-4-il)-bis-(4-metóxi-benzil)-amina (Int.2).
Figure img0043
[00490] em que RA pode ser a arila ou a heteroarila opcionalmente substituída.
1.16.1. Método E1
[00491] Uma mistura do Int.2 (1 eq), a anilina correspondente (1,1 eq), Cs2CO3 (2 eq) e XPhos (0,3 eq) em tolueno seco é purgada com um gás inerte antes do Pd(OAc)2 (0,1 a 0,15 eq) ser adicionado. A mistura é agitada a 110°C por aproximadamente 16 h. A mistura pode ser dividida entre um solvente orgânico e uma fase aquosa. As duas camadas são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. Alternativamente, a mistura de reação pode ser filtrada e concentrada. O resíduo pode ser mantido como tal ou purificado por cromato- grafia para produzir o produto desejado. 1.16.2. Exemplo ilustrativo do método E1: síntese de 5-{7-[Bis-(4- metóxi-benzil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-ilamino}-4-etil- piridina-2-carbonitrila (Int.24).
Figure img0044
[00492] Uma mistura do Int.2 (0,75 mmol), Int.10 (0,79 mmol), Cs2CO3 (1,5 mmol) e XPhos (0,225 mmol) em tolueno seco (6,3 mL) foi purgada com argônio antes do Pd(OAc)2 (0,075 mmol) ser adicionado. A mistura foi agitada a 110°C por aproximadam ente 16 h. A mistura foi diluída com H2O e extraída com DCM. A camada orgânica foi lavada (salmoura), secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, ciclo-hexano/EtOAc 100:0 a 50:50) para produzir o produto desejado.
1.16.3. Método E2
[00493] Uma mistura do Int.2 (1 eq), a anilina correspondente (1,1 eq), Cs2CO3 (4 a 5 eq) e XPhos (0,4 eq) em tolueno seco é purgada com um gás inerte antes do Pd(OAc)2 (0,2 a 0,3 eq) ser adicionado. A mistura é agitada a 110°C por um período variando d e 1 h a 24 h. A mistura pode ser dividida entre um solvente orgânico e uma fase aquosa. As duas camadas são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. Alternativamente, a mistura de reação pode ser filtrada e concentrada. O resíduo pode ser mantido como tal ou purificado por cromatografia para produzir o produto desejado. 1.16.4. Exemplo ilustrativo do método E2: síntese de 5-{7-[Bis-(4- metóxi-benzil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-ilamino}-4-metil- piridina-2-carbonitrila (Int.27).
Figure img0045
[00494] Uma mistura do Int.2 (4 mmol), Int.8 (4,3 mmol), Cs2CO3 (20 mmol) e XPhos (1,6 mmol) em tolueno seco (35 mL) foi purgada com argônio por 10 min antes do Pd(OAc)2 (1,2 mmol) ser adicionado. A mistura foi agitada a 110°C por aproximadamente 1 6 h. A mistura foi filtrada através de um recheio de celite e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, ciclo- hexano/EtOAc 98:2 a 25:75) para produzir o produto desejado.
1.16.5. Método E3
[00495] Uma mistura do Int.2 (1 eq), a anilina (1,1 eq), BINAP (0,3 eq), Cs2CO3 (4 eq) e Pd(OAc)2 (0,2 eq) em 1,4-dioxana seca é dega- seificada com um gás inerte. A reação é agitada por um período variando de 4 h a aproximadamente 16 h a 100-110°C. A m istura pode ser dividida entre um solvente orgânico e uma fase aquosa. As duas camadas são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. Alternativamente, a mistura de reação pode ser filtrada e concentrada. O resíduo pode ser mantido como tal ou purificado por cromatografia para produzir o produto desejado. 1.16.6. Exemplo ilustrativo do método E3: síntese de N6-(2-Flúor-4- metanossulfonil-fenil)-N4,N4-bis-(4-metóxi-benzil)-1-metil-1H- benzoimidazol-4,6-diamina (Int.34).
Figure img0046
[00496] Uma mistura de Int.2 (1,48 mmol), 2-flúor-4-metilsulfonil- anilina (1,58 mmol), BINAP (0,47 mmol), Cs2CO3 (6,32 mmol) e Pd(OAc)2 (0,32 mmol) em 1,4-dioxana seca (15 mL) foi degaseificada com nitrogênio. A reação foi agitada a 100°C por a proximadamente 16 h. A mistura foi diluída com EtOAc e a camada orgânica foi lavada (H2O), secada (Na2SO4) e concentrada para produzir o produto dese- jado.
1.16.7. Método E4
[00497] Uma mistura de Int.2 (1 eq), a anilina (1,1 eq), Brettphos (0,1 eq), Cs2CO3 (5 eq) e Pd(OAc)2 (0,05 eq) em 1,4-dioxana seca é degaseificada com um gás inerte. A reação é agitada por um período variando de 2 h a aproximadamente 8 h a 85-95°C. A mistura pode ser dividida entre um solvente orgânico e uma fase aquosa. As duas camadas são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. Alternativamente, a mistura de reação pode ser filtrada e concen- trada. O resíduo pode ser mantido como tal ou purificado por croma- tografia para produzir o produto desejado. 1.16.8. Exemplo ilustrativo do método E4: síntese de N6-(2,3-di-hidro- 1,4-benzodioxin-6-il)-N4,N4-bis[(4-metoxifenil)metil]-1-metil- benzimidazol-4,6-diamina (Int.78).
Figure img0047
[00498] Uma mistura de Int.2 (1,17 mmol), 2,3-di-hidro-1,4- benzodioxin-6-amina (1,29 mmol), Brettphos (0,117 mmol), Cs2CO3 (6,32 mmol) e Pd(OAc)2 (0,058 mmol) em 1,4-dioxana seca (15 mL) foi degaseificada com nitrogênio. A reação foi agitada a 90°C por aproximadamente 5 h. A mistura foi diluída com EtOAc e a camada orgânica foi lavada (H2O), secada (Na2SO4) e concentrada para produzir o produto desejado. 1.17. Método geral: metilação do produto de Buchwald
Figure img0048
[00499] em que RA pode ser a arila ou a heteroarila opcionalmente substituída.
1.17.1. Método F
[00500] O NaH (60% em óleo mineral, 1,1 a 3 eq) é adicionado a uma solução do intermediário obtido a partir da ligação de Buchwald (1 eq) em THF ou DMF a 0°C. A mistura é agitada a 0°C por 30 min. O MeI (1,1 a 3 eq) é adicionado e a mistura é agitada na temperatura ambiente por um período variando de 1 h a aproximadamente 16 h. A mistura é dividida entre um solvente orgânico e uma fase aquosa. As duas camadas são separadas e a camada orgânica é secada e con- centrada. O resíduo é purificado por cromatografia em sílica ou usado como tal sem purificação adicional. 1.17.2. Exemplo ilustrativo do método F: síntese de N6-(2-flúor-4- metanossulfonil-6-metil-fenil)-N4,N4-bis-(4-metóxi-benzil)-1,N6-dimetil- 1H-benzoimidazol-4,6-diamina (Int.37).
Figure img0049
[00501] O NaH (60% em óleo mineral, 6,76 mmol) foi adicionado a uma solução do Int.35 (2,25 mmol) em THF (10 mL) a 0°C. A mistura foi agitada a 0°C por 30 min. O MeI (6,76 mmol) foi adicionado e a mis- tura foi agitada na temperatura ambiente por aproximadamente 16 h. A mistura foi diluída com EtOAc e lavada com H2O. A camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/éter de petróleo 20:80 a 80:20) para produzir o produto desejado. 1.17.3. Exemplo ilustrativo do método F: síntese de N4,N4-bis[(4- metoxifenil)metil]-N6,1-dimetil-N6-(2-metil-4-metilsulfonil- fenil)benzimidazol-4,6-diamina (Int.49A) e N6-(4-etilsulfonil-2-metil- fenil)-N4,N4-bis[(4-metoxifenil)metil]-N6,1-dimetil-benzimidazol-4,6- diamina (Int.49B).
Figure img0050
[00502] O NaH (60% em óleo mineral, 4,86 mmol) foi adicionado a uma solução do Int.36 (1,62 mmol) em THF (10 mL) a 0°C. A mistura foi agitada a 0°C por 30 min. O MeI (4,86 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada na temperatura ambiente por 1 h. A mistura foi diluída com EtOAc e lavada com H2O. A camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. A cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/éter de petróleo 20:80 a 80:20) produziu uma mistura do produto desejado (Int.49A, produto principal) junto com um produto lateral (Int.49B, produto secundário). 1.18. Síntese de 4-{7-[Bis-(4-metóxi-benzil)-amino]-3-metil-3H- benzoimidazol-5-ilóxi}-3-etil-benzonitrila (Int.50).
Figure img0051
[00503] Uma mistura do Int.2 (0,4 mmol), Int.22 (0,4 mmol), CuI (0,06 mmol) e Cs2CO3 (1 mmol) em piridina (2 mL) foi inundada com argônio, vedada e aquecida em um reator de microondas por 3 h a 200°C. A mistura foi diluída com H 2O e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi secada e concentrada para produzir o produto desejado. 1.19. Método geral: Ligação de Ullmann entre a 5-{7-[bis-(4-metóxi- benzil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-ilóxi}-4-metil-piridina-2- carbonitrila (Int.3) e os halogenetos aromáticos ou heteroaromáticos
Figure img0052
[00504] em que RA pode ser a arila ou a heteroarila opcionalmente substituída.
1.19.1. Método G
[00505] Uma mistura de Int.3 (1 eq), halogeneto de arila (1,2 a 1,3 eq), CuI (0,1 a 0,2 eq), N,N-dimetil glicina (0,3 a 0,5 eq) e Cs2CO3 (3 eq) em DMF/1,4-dioxana 1:1 é inundada com um gás inerte e agitada a 110°C por um período variando de 4,5 h a 16 h. A mistura é filtrada, dividida entre um solvente orgânico e uma fase aquosa. As duas camadas são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia em sílica. 1.19.2. Exemplo ilustrativo do método G: síntese de 5-{7-[bis-(4- metóxi-benzil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-ilóxi}-4-metil- piridina-2-carbonitrila (Int.51).
Figure img0053
[00506] Uma mistura de Int.3 (0,39 mmol), Int.18 (0,47 mmol), CuI (0,08 mmol), N,N-dimetil glicina (0,2 mmol) e Cs2CO3 (1,17 mmol) em DMF/1,4-dioxana 1:1 (4 mL) foi inundada com argônio e agitada a 110°C por aproximadamente 16 h em um tubo vedado. A mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente e filtrada através de um recheio de celite. O filtrado foi concentrado. A água foi adicionada e a mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água, secada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatogra- fia em coluna rápida (SiO2, ciclo-hexano/EtOAc 100:0 a 40:60) para produzir o produto desejado. 1.20. Método geral: ligação de SNAr entre a 5-{7-[bis-(4-metóxi-benzil)- amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-ilóxi}-4-metil-piridina-2-carbonitrila (Int.3) e os halogenetos aromáticos ou heteroaromáticos
Figure img0054
[00507] em que RA pode ser a arila ou a heteroarila opcionalmente substituída.
1.20.1. Método H
[00508] Uma mistura do Int.3 (1 eq), o halogeneto de ari- la/heteroarila (1,2 a 1,5 eq) e K2CO3 (2 eq) em DMF é agitada a 100°C por um período variando de 3 h a aproximadamente 16 h. A mistura é diluída com EtOAc, lavada várias vezes com H2O, secada e concen- trada. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna rápida. 1.20.2. Exemplo ilustrativo do método H: síntese de 5-{7-[bis-(4- metóxi-benzil)-amino]-3-metil-3H-benzoimidazol-5-ilóxi}-4-metil- piridina-2-carbonitrila (Int.51).
Figure img0055
[00509] Uma mistura de Int.3 (58 mmol), Int.7 (70 mmol) e K2CO3 (116 mmol) em DMF (160 mL) foi agitada a 100°C. Ap ós 3 h, uns 7,35 mmol adicionais de Int.7 foram adicionados à reação e a mistura foi agitada por uma 1 h adicional a 100°C. A mistura resultante foi diluída com EtOAc, lavada várias vezes com H2O, secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/éter de petróleo 15:85 a 35:75) para produzir o produto desejado. 1.21. Método geral: desproteção de bis-PMB
Figure img0056
em que RA pode ser a arila ou a heteroarila opcionalmente substituída; e -L- pode ser: -NH-, -NMe- ou -O-.
1.21.1. Método I1
[00510] Uma mistura de bis-PMB amina protegida (1 eq) em TFA é agitada na temperatura ambiente por um período variando de 30 min a aproximadamente 16 h. A temperatura é aumentada para 50 ou 60°C e a mistura é adicionalmente agitada por um período variando de 0,5 a 3 h. A mistura sofre preparação usando uma solução aquosa básica e um solvente orgânico. As duas fases são separadas e a camada or-gânica é secada e concentrada. Alternativamente, a mistura de rea- ção pode ser primeiramente concentrada e depois o resíduo sofre a preparação descrita acima. O resíduo obtido a partir da preparação pode ser purificado por cromatografia em sílica ou pela resina de troca iônica ISOLUTE® SCX-3 (Biotage) ou mantido como tal. 1.21.2. Exemplo ilustrativo do método I1: síntese de N6-(2-Flúor-4- metanossulfonil-6-metil-fenil)-1,N6-dimetil-1H-benzoimidazol-4,6- diamina (Int.53).
Figure img0057
[00511] Uma mistura de Int.37 (0,33 mmol) em TFA (5 mL) foi agitada na temperatura ambiente por 1 h e a 50°C por 0 ,5 h. A mistura foi concentrada. O resíduo foi dividido entre o NaHCO3 sat. e o DCM. As duas fases foram separadas e a camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/éter de petróleo 20:80 a 100:0) para produzir o produto desejado. 1.21.3. Exemplo ilustrativo do método I1: síntese de N6,1-dimetil-N6- (2-metil-4-metilsulfonil-fenil)benzimidazol-4,6-diamina (Int.56A) e N6- (4-etilsulfonil-2-metil-fenil)-N6,1-dimetil-benzimidazol-4,6-diamina (Int.56B).
Figure img0058
[00512] Uma mistura dos Int.49A e 49B (cerca de 0,61 mmol no total) em TFA (5 mL) foi agitada na temperatura ambiente por aproxima- damente 16 h e a 50°C por 3 h. A mistura foi concen trada. O resíduo foi dividido entre o NaHCO3 sat. e o DCM. As duas fases foram separadas e a camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. A cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/éter de petróleo 20:80 a 100:0) produziu uma mistura do produto desejado (Int.56A, produto principal) junto com um produto lateral (Int.56B, produto secundário) derivando da desproteção do Int.49B.
1.21.4. Método I2
[00513] Uma mistura de bis-PMB amina protegida (1 eq) em DCM/TFA (razão 3:1 a 1:1) é agitada na temperatura ambiente por um período variando de 20 min a 3 h. A mistura sofre preparação usando uma solução aquosa básica e um solvente orgânico. As duas fases são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. Alterna-tivamente, a mistura de reação pode ser primeiramente concentrada e depois o resíduo sofre a preparação descrita acima. O resíduo obtido a partir da preparação pode ser purificado por cromatografia em sílica ou pela resina de troca iônica ISOLUTE® SCX-3 (Biotage) ou mantido como tal. 1.21.5. Exemplo ilustrativo do método I2: síntese de 5-(7-amino-3- metil-benzimidazol-5-il)óxi-4-metil-piridina-2-carbonitrila (Cpd 28).
Figure img0059
[00514] O TFA (55 mL) foi adicionado a uma solução do Int.51 (23,1 mmol) em DCM (55 mL) a 0°C. A mistura foi agitada n a temperatura ambiente por 20 min. O tolueno foi adicionado e a mistura foi concen-trada. O resíduo foi dividido entre o DCM e o NaHCO3 sat. As duas fases foram separadas e a camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/MeOH 100:0 a 95:5). O produto obtido a partir da coluna foi lavado com THF para produzir o produto desejado (Int 79).
1.21.6. Método I3
[00515] Uma mistura da bis-PMB amina protegida (1 eq) em TFA é agitada na temperatura ambiente por um período variando de 30 min a aproximadamente 16 h. A mistura é diluída em um solvente orgânico e lavada usando uma solução aquosa básica. As duas fases são sepa-radas e a camada orgânica é secada e concentrada. Alternativamente, antes da lavagem, a mistura de reação pode ser primeiramente con-centrada. A camada orgânica é depois concentrada, e o resíduo pode ser purificado por cromatografia em sílica ou pela resina de troca iôni- ca ISOLUTE® SCX-3 (Biotage) ou usado como tal, sem nenhuma purificação adicional. 1.21.7. Exemplo ilustrativo do método I3: síntese de 5-[(7-amino-3- metil-3H-benzoimidazol-5-il)-metil-amino]-4-metil-piridina-2-carbonitrila (Int.62).
Figure img0060
[00516] Uma solução do Int.41 (2,4 mmol) em TFA (10 mL) foi agi- tada na temperatura ambiente por 3 h. A mistura foi diluída (DCM), lavada com NaHCO3 sat. e depois com NaOH 5 N. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi adicionalmente extraída com DCM. As camadas orgânicas foram combinadas, secadas (filtração através de separador de fases) e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/MeOH 100:0 a 90:10) para produzir o produto desejado. 1.22. Síntese de 4-Etil-6-metanossulfonil-piridin-3-ilamina (Int.70).
Figure img0061
1.22.1. Etapa i: 4-etil-2-metilsulfonil-5-nitro-piridina
[00517] Uma mistura de 2-bromo-4-etil-5-nitro-piridina (4,35 mmol) e metanossulfinato de sódio (4,35 mmol) em DMSO (10 mL) foi agitada na temperatura ambiente por 1,5 h. A mistura foi vertida em água gelada e agitada até que gelo derretesse. A mistura foi filtrada e o sólido (o produto desejado) foi coletado.
1.22.2. Etapa ii: 4-etil-6-metilsulfonil-piridin-3-amina
[00518] Uma mistura de 4-etil-2-metilsulfonil-5-nitro-piridina (4,1 mmol), NH4Cl (26,65 mmol) e pó de ferro (33 mmol) em H2O (10 mL) foi agitada a 90°C por 1 h. A reação foi interromp ida, filtrada e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada para produzir o produto desejado. 1.23. Síntese de 4-etil-5-iodo-2-metilsulfonil-piridina (Int.74).
Figure img0062
[00519] Uma solução de KI (15 mmol) e NaNO2 (12 mmol) em H2O (1,8 mL) foi adicionada gota a gota a uma mistura do Int.70 (6 mmol) e p-TsOH • H2O (18 mmol) em MeCN (12 mL), mantendo a temperatura a 10 até 15°C. A mistura foi agitada por 10 min a 10 até 15°C e depois na temperatura ambiente por 1 h. A mistura foi resfriada até 0°C, neu-tralizada (NaHCO3 sat.) e extraída (DCM). A camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromato- grafia em coluna rápida (SiO2, éter de petróleo/EtOAc 70:30) para produzir o produto desejado. Exemplo 2. Síntese dos compostos da invenção 2.1. Método geral: acilação do intermediário de amina com um derivado de cloreto de carbonila para obter um composto final.
Figure img0063
[00520] em que RA pode ser a arila ou a heteroarila opcionalmente substituída; L pode ser NH, NMe ou O; e RB pode ser cicloalquila, OMe.
2.1.1. Método J1
[00521] O RBCOCl (1 eq) é adicionado a uma solução da amina in-termediária (1 eq) em DCM/piridina (razão de 2:1 a 5:1) a 0°C. A mis- tura é agitada por um período variando de 40 min a 2h. A mistura é dividida entre um solvente orgânico e uma solução aquosa. As duas fases são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. Alternativamente, a mistura de reação pode ser concentrada sem sofrer preparação. O resíduo pode ser purificado por cromatografia em sílica ou por HPLC preparativa ou por precipitação usando a mistura de solventes apropriada. 2.1.2. Exemplo ilustrativo do método J1: síntese de N-(6-((6- ciano-4-etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4- il)ciclopropanocarboxamida (Cpd 1).
Figure img0064
[00522] O cloreto de ciclopropanocarbonila (0,39 mmol) foi adicionado a uma solução do Int.63 (0,39 mmol) em piridina/DCM 1:2 (2,55 mL) a 0°C. A mistura foi agitada na temperatura am biente por 40 min. A mistura de reação foi concentrada e o resíduo foi purificado por cro- matografia em coluna rápida (SiO2, DCM/MeOH 100:0 a 97:3) para proporcionar o produto desejado.
2.1.3. Método J2
[00523] O RBC(=O)Cl (1,5 a 3 eq) é adicionado a uma solução da amina intermediária (1 eq) em DCM, seguido por piridina (1,5 a 3 eq). A mistura é agitada por um período variando de 2 h a aproximadamente 16 h. A mistura é dividida entre um solvente orgânico e uma solução aquosa. As duas fases são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. O resíduo pode ser purificado por cromatografia em sílica, por HPLC preparativa ou por precipitação usando a mistura de solventes apropriada. 2.1.4. Exemplo ilustrativo do método J2: síntese de 6-((6-ciano-4- etilpiridin-3-il)(metil)amino)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-4-ilcarbamato de metila (Cpd 4).
Figure img0065
[00524] O cloroformiato de metila (0,33 mmol) foi adicionado a uma solução do Int.63 (0,22 mmol) em DCM seco (2,2 mL), seguido por pi- ridina (0,33 mmol). A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 2 h. A mistura foi dividida entre a H2O e o DCM. As duas fases foram separadas e a camada orgânica foi lavada (NaHCO3 sat.), secada (Na2SO4) e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, DCM/MeOH 100:0 a 95:5) para produzir o produto desejado. 2.2. Método geral: acilação do intermediário de amina com um derivado do ácido carboxílico para obter um composto final.
Figure img0066
[00525] Onde RA pode ser a arila ou a heteroarila opcionalmente substituída; L pode ser: NH, NMe ou O; e RC pode ser: cicloalquila, ci- cloalquila substituída.
2.2.1. Método K1
[00526] O (COCl)2 (1,4 a 2 eq) é adicionado a uma solução do ácido carboxílico (1,5 a 2 eq) em DCM a 0°C. Uma quan tidade catalítica de DMF é adicionada e a reação é agitada a 0°C por um período variando de 30 min a 1 h. Uma solução da amina intermediária (1 eq) e piridina (2 a 4 eq) em DCM é adicionada à mistura. A mistura resultante é agitada na temperatura ambiente por um período variando de 30 min a 2 h. A mistura é dividida entre um solvente orgânico e uma solução aquosa. As duas fases são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. O resíduo pode ser purificado por cromatografia em sílica, por HPLC preparativa ou por precipitação usando a mistura de solventes apropriada. 2.2.2. Exemplo ilustrativo do método K1: síntese de (1R,2R)-N-[6- [(6-ciano-4-etil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida (Cpd 6).
Figure img0067
[00527] O (COCl)2 (0,186 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido ((1R,2R)-(-)-cis-2-flúor-ciclopropano carboxílico (ChemCollect, lot n. 1241399, 0,186 mmol) em DCM (1 mL) seguido por DMF (2 gotas). A mistura de reação foi deixada a agitar a 0°C por 1 h. Uma solução do Int.65 (0,093 mmol) e a piridina (0,186 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionada à mistura e a reação foi agitada por 2 h na temperatura ambiente. O NaHCO3 sat. foi adicionado e as duas fases foram separadas. A camada orgânica foi concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna rápida (SiO2, DCM/MeOH 100:0 a 95:5) para produzir o produto desejado. 2.2.3. Exemplo ilustrativo do método K1: Síntese de (1R,2R)-N-[6- (N,2-dimetil-4-metilsulfonil-anilino)-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida (Cpd 26) e (1R,2R)-N-[6-(4-etilsulfonil-N,2- dimetil-anilino)-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida (Cpd 27).
Figure img0068
[00528] O (COCl)2 (0,82 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido ((1R,2R)-(-)-cis-2-flúor-ciclopropanocarboxílico (ABCR, lote n. 1242863, 0,92 mmol) em DCM (1 mL), seguido por DMF (1 gota). A mistura de reação foi deixada agitar a 0°C por 45 m in. Uma solução de uma mistura dos Int.56A e Int.56B (aproximadamente 0,46 mmol no total) e piridina (1,85 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionada à mistura e a reação foi agitada por 2 h na temperatura ambiente. A mistura foi diluída com DCM, lavada (H2O) e as duas fases foram separadas. A camada orgânica foi secada (Na2SO4) e concentrada. A cromatografia em coluna rápida (SiO2, EtOAc/ éter de petróleo 20:80 até EtO- Ac/MeOH 90:10) produziu uma mistura de Composto 26 e Composto 27. Os dois componentes foram separados por HPLC prep.
2.2.4. Método K2
[00529] O (COCl)2 (1,35 a 2,5 eq) é adicionado a uma solução do ácido carboxílico (1,4 a 3 eq) em DCM a 0°C. Uma qu antidade catalítica de DMF é adicionada e a reação é agitada a 0°C p or um período variando de 30 min a 1 h. Uma solução da amina intermediária (1 eq) e piridina (1,7 a 4 eq) em NMP ou NMP/DCM é preparada separadamente, certificando-se que a amina intermediária seja totalmente dissolvida. Para auxiliar a dissolução, o aquecimento pode ser aplicado (temperaturas até 70°C). Esta solução é adicionada gota a gota à solução contendo o cloreto de acila recentemente formado a 0°C. A mistura resultante é deixada agitar na temperatura ambiente por um período variando de 1 a 2 h. A mistura é dividida entre um solvente orgânico e uma solução aquosa. As duas fases são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. O resíduo pode ser purificado por cromatografia em sílica, por HPLC preparativa ou por precipitação usando a mistura de solventes apropriada. 2.2.5. Exemplo ilustrativo do método K2: síntese de (1R,2R)-N-[6- [(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2-flúor- ciclopropanocarboxamida (Cpd 20).
Figure img0069
[00530] O (COCl)2 (16,6 mmol) foi adicionado a uma solução de ácido ((1R,2R)-(-)-cis-2-flúor-ciclopropanocarboxílico (ABCR, lote n. 1242863, 17,5 mmol) em DCM (70 mL), seguido por DMF (200 μL). A mistura de reação foi deixada agitar a 0°C por 45 m in. Uma solução de Composto 28 (12,5 mmol) e piridina (21,3 mmol) em NMP (15 mL) foi aquecida a 65°C, para auxiliar a dissolução, e deixada resfriar até a temperatura ambiente. A solução contendo o Composto 28 e a piridi- na foi adicionada à mistura contendo o derivado carboxílico ativado a 0°C e a reação foi agitada por 45 min na temperatura ambiente. A mistura foi dividida entre o EtOAc e o NaHCO3 sat. As duas fases foram separadas e a camada orgânica foi lavada adicionalmente (NaHCO3 sat., NH4Cl, H2O), secada (Na2SO4) e concentrada. O bruto foi purificado por precipitação a partir de DCM/iPrOH e o sólido resultante foi lavado com Et2O e secado sob vácuo para proporcionar o produto desejado. 2.3. Método geral: hidrólise de um grupo nitrila para obter um composto final
Figure img0070
[00531] Onde L é NH, NMe ou O; RC é cicloalquila, cicloalquila substituída; Z é N ou CH; e R10 é Me ou Et.
2.3.1. Método L
[00532] Uma solução do material de partida de nitrila (1 eq) é dissolvida em uma mistura de EtOH/DMSO 4:1. A solução orgânica resultante é misturada com 30% de H2O2/H2O e NaOH 1 N com as seguintes proporções, solução orgânica/H2O2/ NaOH 1N 10:2:1. A mistura é agitada a 50°C por 1 h. A mistura é dividida e ntre um solvente orgânico e uma solução aquosa. As duas fases são separadas e a camada orgânica é secada e concentrada. O resíduo pode ser purificado por cromatografia em sílica, por HPLC preparativa ou por precipitação usando a mistura de solventes apropriada. 2.3.2. Exemplo ilustrativo do método L: síntese da 5-((4- (ciclopropanocarboxamido)-1-metil-1H-benzo[d]imidazol-6- il)(metil)amino)-4-etilpicolinamida (Cpd 24).
Figure img0071
[00533] Uma solução do composto 1 (0,19 mmol) foi dissolvida em uma mistura de EtOH/DMSO 4:1 (2,3 mL). A solução orgânica resultante foi misturada com 30% de H2O2/H2O (0,4 mL) e NaOH 1 N (0,23 mL). A mistura foi agitada a 50°C por 1 h. A mistu ra de reação foi dividida entre o diclorometano e a água. As camadas foram separadas e a camada orgânica foi filtrada através de um separador de fases e concentrada. O resíduo foi purificado por HPLC preparativa para produzir o produto desejado. 2.3.3. Método M: Método geral de síntese da ureia
Figure img0072
[00534] O carbonilditriazol (1,5 eq.) é adicionado a uma mistura de Cpd 28 (1,0 eq.) e piridina (5 eq;) em DCM. A mistura é depois agitada a 50°C por 1 h. Sem nenhum tratamento adiciona l, a amina RaNH2 requerida é adicionada à solução a 50°C e deixada a agitar por outra 1 h. Após o término da reação por UPLC, a mistura de reação é resfriada até a temperatura ambiente e diluída com DCM, e a mistura é depois dividida em água. As duas fases são separadas e a camada orgânica é lavada com solução de HCl 0,25 M, solução de bicarbonato de sódio, secada e concentrada. O resíduo pode ser purificado por cromatografia em sílica, por HPLC preparativa ou por precipitação usando uma mistura de solventes apropriada. 2.3.4. Exemplo ilustrativo do método M: síntese de 1-[6-[(6-ciano- 4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-3-isopropil-ureia (Cpd 33)
[00535] O carbonilditriazol (1,07 mmol) foi adicionado a uma mistura de Cpd 28 (0,71 mmol) e piridina (3,55 mmol) em DCM (3 mL) e a mistura resultante foi agitada a 50°C. Um precipitado formou-se após 2 min e a mistura foi adicionalmente agitada por 1 h. A metil amina (solução 2M em THF) (2,84 mmol) foi depois adicionada à solução a 50°C e deixada agitar por outra 1 h. Após o término da reação por UPLC, a mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente e foi diluída com DCM e dividida em água. As duas fases foram separadas e a camada orgânica foi lavada com solução de HCl 0,25 M, solução de bicarbonato de sódio, secada e concentrada. O resíduo foi usado sem nenhuma purificação adicional. 2.4. Síntese de 5-[7-[[(1R,2R)-2- fluorciclopropanocarbonil]amino]-3-metil-benzimidazol-5-il]óxi-4-metil- piridina-2-carboxamida (Cpd 32).
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[00536] Uma mistura de Composto 20 (0,27 mmol) e DMSO (0,5 mL) em H2O (pH 13, 10 mL) foi agitada a 50°C por 72 h. A mi stura foi filtrada. O sólido foi coletado e purificado por HPLC preparativa para produzir o produto desejado. 2.5. Síntese de 4-metil-5-[3-metil-7-(metilamino)benzimidazol-5- il]óxi-piridina-2-carbonitrila (Cpd 34) e 5-[7-(dimetilamino)-3-metil- benzimidazol-5-il]óxi-4-metil-piridina-2-carbonitrila (Cpd 35)
[00537] O NaH foi adicionado a uma mistura do Cpd 28 (0,36 mmol) em THF (10 mL) a 0°C. Após 30 min, o MeI (0,36 mmol ) foi adicionado e a mistura de reação foi deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada até o término. Após o término monitorado por UPLC, a reação foi diluída em acetato de etila e lavada com água. A camada orgânica foi secada sobre Na2SO4, filtrada e evaporada. O Cpd 34 e o Cpd 35 foram isolados por HPLC preparativa.
[00538] Os compostos ilustrativos da invenção listados na Tabela III abaixo e os exemplos comparativos foram preparados de acordo com os métodos sintéticos descritos neste documento, usando os intermediários listados na Tabela II. O dado espectral de RMN dos compostos da invenção e de alguns dos exemplos comparativos é dado na Tabela IV. Tabela II. Intermediários ilustrativos em relação aos compostos da invenção
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Tabela III. Compostos ilustrativos da invenção No.
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Tabela IV. Dados de RMN dos compostos ilustrativos da invenção
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Exemplo 3. Compostos comparativos 3.1. Composto A 2-[4-[(3-metilbenzimidazol-5- il)amino]fenil]acetonitrila
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[00539] Uma mistura de Pd2(dba)3 (0,01 mmol) e Xantphos (0,01 mmol) em 1,4-dioxana (1 mL) foi sonicada e adicionada sob nitrogênio a uma mistura de 6-bromo-1-metil-benzimidazol (0,45 mmol), 2-(4- aminofenil)acetonitrila (0,58 mmol) e Cs2CO3 (0,62 mmol) em 1,4dioxana (2 mL). A mistura foi agitada a 110°C por 12 h. A mistura foi diluída (DCM), lavada (H2O), secada (separador de fases) e concentrada. O resíduo foi purificado por HPLC prep para produzir o produto desejado (Composto A).
[00540] PM: 262,3. MS Ms’d: 263,2.
[00541] RMN: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8,13 (1 H, s), 7,68 (1 H, dd), 7,60 (1 H, dd), 7,54 (1 H, d), 7,32 (1 H, d), 7,24 (1 H, t), 6,91 (1 H, dd), 3,77 (3 H, s), 3,39 (3 H, s).
Figure img0100
[00542] Uma mistura de Pd2(dba)3 (0,01 mmol) e Xantphos (0,01 mmol) em 1,4-dioxana (1 mL) foi sonicada e adicionada sob nitrogênio a uma mistura de 6-bromo-1-metil-benzimidazol (0,45 mmol), 2,3-di- hidro-1,4-benzodioxin-6-amina (0,58 mmol) e Cs2CO3 (0,62 mmol) em 1,4-dioxana (2 mL). A mistura foi agitada a 110°C por 12 h. A mistura foi diluída (DCM), lavada (H2O), secada (separador de fases) e concentrada. O resíduo foi purificado por HPLC prep para produzir o produto desejado (Composto B).
[00543] PM: 281,3. MS Ms’d: 282,1.
[00544] RMN: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7,94 (1 H, s), 7,80 (1 H, br s), 7,45 (1 H, d), 7,05 (1 H, d), 6,86 (1 H, dd), 6,73 (1 H, dd), 6,61-6,57 (2 H, m), 4,22-4,16 (4 H, m), 3,71 (3 H, s). 3.3 Composto C 3-flúor-4-[metil-(3-metilbenzimidazol-5- il)amino]benzonitrila
Figure img0101
3.3.1. Etapa i: 3-flúor-4-[(3-metilbenzimidazol-5- il)amino]benzonitrila
[00545] Uma mistura contendo 6-bromo-1-metil-benzimidazol (2,38 mmol), 4-amino-3-flúor-benzonitrila (3,57 mmol), XPhos (0,95 mmol), Cs2CO3 (7,14 mmol) e Pd(OAc)2 (0,71 mmol) em tolueno seco (8 mL) foi agitada a 110°C por aproximadamente 16 h. A mi stura foi diluída (EtOAc), lavada (H2O), secada (Na2SO4) e concentrada para produzir o produto desejado 3-flúor-4-[(3-metilbenzimidazol-5- il)amino]benzonitrila.
3.3.2. Etapa ii: 3-flúor-4-[metil-(3-metilbenzimidazol-5- il)amino]benzonitrila (Composto C)
[00546] O NaH (7,14 mmol) foi adicionado a uma solução de 3- flúor-4-[(3-metilbenzimidazol-5-il)amino]benzonitrila (2,38 mmol) em THF (10 mL) a 0°C. A mistura foi agitada por 30 min . O MeI (4,76 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 3 h. A mistura foi diluída (DCM), lavada (H2O) e concentrada. O resíduo foi purificado por HPLC prep para produzir o produto desejado (Composto C).
[00547] PM: 280,1. MS Ms’d: 281,0.
[00548] RMN: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8,13 (1 H, s), 7,68 (1 H, dd), 7,60 (1 H, dd), 7,54 (1 H, d), 7,32 (1 H, d), 7,24 (1 H, t), 6,91 (1 H, dd), 3,77 (3 H, s), 3,39 (3 H, s). 3.4. Composto D
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[00549] A síntese desse composto foi descrita no Pedi. Int. PCT (2013) WO 2013117645. (Menet et al., 2013).
EXEMPLOS BIOLÓGICOS Exemplo 4. Ensaios in vitro 4.1. Ensaio de inibição da JAK1 4.1.1. Substrato de polyGT do ensaio da JAK1
[00550] O domínio catalítico da JAK1 humana recombinante (ami- noácidos 850-1154; número do catálogo 08-144) foi adquirido da Car- na Biosciences. 10 ng de JAK1 são incubados com 12,5 μg de substrato de polyGT (Sigma, número do catálogo P0275) em tampão de reação de cinase (concentrações finais de 15 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de DTT, 0,01% de Tween-20, 10 mM de MgCl2, 2 μM de ATP não radioativo, 0,25 μCi de 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número do catálogo AH9968)), com ou sem 5 μL contendo composto de teste ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 μL, em uma placa de 96 poços de polipropileno (Greiner, fundo em V). Após 45 min a 30 °C, as reações são interrompidas p or adição de 25 μL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Toda a reação da cinase terminada é transferida para placas de filtro de 96 poços pré-lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer, número do catálogo 6005177) usando um coletor de células (Perkin Elmer). As placas são lavadas 6 vezes com 300 μL por poço de uma solução a 75 mM de ácido fosfórico e o fundo das placas é vedado. 40 μL/poço de Microscint-20 são adicionados, o topo das placas é vedado e a etapa de leitura é efetuada usando o Topcount (Perkin Elmer). A atividade da cinase é calcu- lada subtraindo-se as contagens por min (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controle positivo (10 μM de estaurosporina) das cpm ob-tidas na presença do veículo. A capacidade de um composto de teste de inibir esta atividade é determinada como: Porcentagem de inibição = ((RFU composto de teste - RFU contro- le)/(RFU veículo - RFU controle))*100 RFU composto de teste = RFU determinadas para a amostra com o composto de teste presente RFU controle = RFU determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo RFU veículo = RFU determinadas na presença de veículo
[00551] As series de diluições das doses são preparadas para os compostos, capacitando o teste dos efeitos das respostas às doses no ensaio da JAK1 e o cálculo da IC50 para cada composto. Cada composto é rotineiramente testado na concentração de 20 μM, seguida por uma diluição em série de 1/3, 8 pontos (20 μM - 6,67 μM - 2,22 μM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM), em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentou, mais diluições são preparadas e/ou a concentração de topo foi diminuída (p.ex., 5 μM, 1 μM).
4.1.2. Ensaio de JAK1 peptídeo Ulight-JAK1
[00552] A JAK1 humana recombinante (domínio catalítico, aminoá- cidos 866-1154; número do catálogo PV4774) foi adquirida da Invitro- gen. 1 ng de JAK1 foi incubado com 20 nM de peptídeo Ulight-JAK1 (tyr1023) (Perkin Elmer, número do catálogo TRF0121) no tampão de reação da cinase (25 mM de MOPS pH 6,8, 0,01% de Brij-35,5 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 7 μM de ATP), com ou sem 4 μL contendo composto de teste ou veículo (DMSO, concentração final de 1%), em um volume total de 20 μL, em uma placa 384 Opti branca (Perkin Elmer, número do catálogo 6007290). Após 60 min na temperatura ambiente, as reações foram interrompidas por adição de 20 μL/poço de mistura de detecção (1 x tampão de detecção (Perkin Elmer, número do catálogo CR97-100C), 0,5 nM de Európio-antifosfotirosina (PT66) (Perkin Elmer, número do catálogo AD0068), 10 mM de EDTA). A etapa de leitura é efetuada usando o Envision, com excitação a 320 nm, e medindo a emissão a 615 nm (Perkin Elmer). A atividade da cinase foi calculada por subtração das unidades de fluorescência relativas (RFU) obtidas na presença de um inibidor de controle positivo (10 μM de estau- rosporina) das RFU obtidas na presença de veículo. A capacidade de um composto de teste de inibir esta atividade foi determinada como:
[00553] Porcentagem de inibição = ((RFU determinadas para a amostra com o composto de teste presente - RFU determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo) dividido por (RFU determinadas na presença de veículo - RFU determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo)) * 100.
[00554] As séries de diluições das doses foram preparadas para os compostos, capacitando o teste dos efeitos das respostas às doses no ensaio de JAK1 e o cálculo da IC50 para o composto. Cada composto é rotineiramente testado na concentração de 20 μM, seguida por uma diluição em série de 1/5, 10 pontos, em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentar, mais diluições são preparadas e/ou a concentração de topo é diminuída (p.ex., 5 μM, 1 μM). Os dados são expressos como a IC50 média dos ensaios ± erro-padrão da média. Tabela V. Valores de IC50 da JAK1 dos Compostos Ilustrativos da in- venção * > 500 nM ** >100-500 nM *** >50-100 nM **** 0,1-50 nM
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Figure img0104
Tabela VI. Valores de IC50 da JAK1 dos Compostos Comparativos
Figure img0105
4.1.3. Ensaio de determinação de Ki de JAK1
[00555] Para a determinação de Ki, diferentes quantidades do composto são misturadas com a enzima e a reação enzimática é seguida como uma função da concentração de ATP. A Ki é determinada por meio de representação gráfica recíproca dupla de Km vs concentração de composto (gráfico de Lineweaver-Burk). 1 ng de JAK1 (Invitrogen, PV4774) é usado no ensaio. O substrato era 50 nM de Peptídeo Ulight-JAK-1 (Tyr1023) (Perkin Elmer, TRF0121). A reação é efetuada em 25 mM de MOPS pH 6,8, 0.01%, 2 mM de DTT, 5 mM de MgCl2 Brij-35, com concentrações variadas de ATP e composto. O substrato fosforilado é medido usando um anticorpo antifosfotirosina marcado com Eu PT66 (Perkin Elmer, AD0068), conforme descrito em 1.1.2. A etapa de leitura é efetuada sobre o envision (Perkin Elmer), com excitação a 320 nm e emissão seguida a 615 nm e 665 nm.
4.2. Ensaio de inibição da JAK2 4.2.1. Substrato de polyGT do ensaio da JAK2
[00556] O domínio catalítico de JAK2 humana recombinante (ami- noácidos 808-1132; número do catálogo PV4210) foi adquirido da Invi- trogen. 0,025 mU de JAK2 é incubado com 2,5 μg de substrato de polyGT (Sigma, número do catálogo P0275) em tampão de reação de cinase (concentrações finais de 5 mM de MOPS pH 7,5, 9 mM de MgAc, 0,3 mM de EDTA, 0,06% de Brij e 0,6 mM de DTT, 1 μM de ATP não radioativo, 0,25 μCi de 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número do catálogo AH9968)), com ou sem 5 μL contendo composto de teste ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 μL, em uma placa de 96 poços de polipropileno (Greiner, fundo em V). Após 90 min a 30°C, as reações são interrompidas po r adição de 25 μL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Toda a reação da cinase terminada é transferida para placas de filtro de 96 poços pré-lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer, número do catálogo 6005177) usando um coletor de células (Perkin Elmer). As placas são lavadas 6 vezes com 300 μL por poço de uma solução a 75 mM de ácido fosfórico e o fundo das placas é vedado. 40 μL/poço de Micros- cint-20 são adicionados, o topo das placas é vedado e a etapa de leitura é efetuada usando o Topcount (Perkin Elmer). A atividade da cinase é calculada subtraindo-se as contagens por min (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controle positivo (10 μM de estaurosporina) das cpm obtidas na presença do veículo. A capacidade de um composto de teste de inibir esta atividade é determinada como: Porcentagem de inibição = ((RFU composto de teste - RFU con- trole)/(RFU veículo - RFU controle))*100
[00557] RFU composto de teste = RFU determinadas para a amostra com o composto de teste presente
[00558] RFU controle = RFU determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo
[00559] RFU veículo = RFU determinadas na presença de veículo
[00560] As séries de diluições das doses são preparadas para os compostos, capacitando o teste dos efeitos das respostas às doses no ensaio da JAK2 e o cálculo da IC50 para cada composto. Cada composto é rotineiramente testado na concentração de 20 μM, seguida por uma diluição em série de 1/3, 8 pontos (20 μM - 6,67 μM - 2,22 μM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM), em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentou, mais diluições são preparadas e/ou a concentração de topo é diminuída (p.ex., 5 μM, 1 μM).
4.2.2. Ensaio de JAK2 peptídeo Ulight-JAK1
[00561] A JAK2 humana recombinante (domínio catalítico, aminoá- cidos 866-1154; número do catálogo PV4774) foi adquirida da Invitro- gen. 0,0125 mU de JAK2 foi incubado com 25 nM de peptídeo Ulight- JAK1 (tyr1023) (Perkin Elmer, número do catálogo TRF0121) no tampão de reação da cinase (25 mM de HEPES pH 7,0, 0,01% de Triton X-100, 7,5 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 7,5 μM de ATP), com ou sem 4 μL contendo composto de teste ou veículo (DMSO, concentração final de 1%), em um volume total de 20 μL, em uma placa 384 Opti branca (Perkin Elmer, número do catálogo 6007290). Após 60 min na temperatura ambiente, as reações foram interrompidas por adição de 20 μL/poço de mistura de detecção (1 x tampão de detecção (Perkin Elmer, número do catálogo CR97-100C), 0,5 nM de Európio- antifosfotirosina (PT66) (Perkin Elmer, número do catálogo AD0068), 10 mM de EDTA). A etapa de leitura é efetuada usando o Envision, com excitação a 320 nm, e medindo a emissão a 615 nm (Perkin Elmer). A atividade da cinase foi calculada por subtração das unidades de fluorescência relativas (RFU) obtidas na presença de um inibidor de controle positivo (10 μM de estaurosporina) das RFU obtidas na presença de veículo. A capacidade de um composto de teste de inibir esta atividade foi determinada como:
[00562] Porcentagem de inibição = ((RFU determinadas para a amostra com o composto de teste presente - RFU determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo) dividido por (RFU determinadas na presença de veículo - RFU determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo)) * 100.
[00563] As séries de diluições das doses são preparadas para os compostos, capacitando o teste dos efeitos das respostas às doses no ensaio de JAK2 e o cálculo da IC50 para o composto. Cada composto é rotineiramente testado na concentração de 20 μM, seguida por uma diluição em série de 1/5, 10 pontos, em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentar, mais diluições são preparadas e/ou a concentração de topo é diminuída (p.ex., 5 μM, 1 μM). Os dados são expressos como a IC50 média dos ensaios ± erro padrão da média.
[00564] Os seguintes compostos foram testados quanto à sua atividade contra a JAK2 e os valores de IC50, como determinados usando os ensaios descritos neste documento, são dados abaixo na Tabela VII. Tabela VII. Valores de IC50 da JAK2 dos Compostos Ilustrativos da in-venção * > 500 nM ** >100-500 nM *** >50-100 nM **** 0,1-50 nM
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Tabela VIII. Valores de IC50 da JAK2 dos Compostos Comparativos
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4.2.3. Ensaio de determinação de Kd de JAK2
[00565] A JAK2 (Invitrogen, PV4210) é usada em uma concentra- ção final de 5 nM. O experimento de ligação é efetuado em 50 mM de Hepes pH 7,5, 0,01% de Brij-35, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, usando 25 nM do traçador de cinase 236 (Invitrogen, PV5592) e 2 nM de Eu-anti-GST (Invitrogen, PV5594), com concentrações variadas de composto. A detecção do traçador é efetuada de acordo com o proce-dimento do fabricante.
4.3. Ensaio de inibição da JAK2 4.3.1. Ensaio de JAK3 peptídeo Ulight-JAK1
[00566] O domínio catalítico da JAK3 humana recombinante (ami- noácidos 781-1124; número do catálogo PV3855) foi adquirido da Invi- trogen. 0,5 ng de proteína JAK3 foi incubado com 2,5 μg de substrato de polyGT (Sigma, número do catálogo P0275) em tampão de reação de cinase (concentrações finais de 25 mM de Tris pH 7,5, 0,5 mM de EGTA, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de DTT, 0,5 mM de Na3VO4, 5 mM de b-glicerolfosfato, 0,01% de Triton X-100, 1 μM de ATP não radioativo, 0,25 μCi de 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número do catálogo AH9968)), com ou sem 5 μL contendo composto de teste ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 μL, em uma placa de 96 poços de polipropileno (Greiner, fundo em V). Após 45 min a 30 °C, as reações foram interrompidas por adição de 25 μL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Toda a reação da cinase terminada foi transferida para placas de filtro de 96 poços pré-lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer, número do catálogo 6005177) usando um coletor de células (Perkin Elmer). As placas são lavadas 6 vezes com 300 μL por poço de uma solução a 75 mM de ácido fosfórico e o fundo das placas foi vedado. 40 μL/poço de Microscint-20 foram adicionados, o topo das placas foi vedado e a etapa de leitura foi efetuada usando o Topcount (Perkin Elmer). A atividade da cinase foi calculada subtraindo-se as contagens por min (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controle positivo (10 μM de estaurosporina) das cpm obtidas na presença do veículo. A capacidade de um composto de teste de inibir esta atividade é determinada como: Porcentagem de inibição = ((RFU composto de teste - RFU contro- le)/(RFU veículo - RFU controle))*100 RFU composto de teste = RFU determinadas para a amostra com o composto de teste presente RFU controle = RFU determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo RFU veículo = RFU determinadas na presença de veículo
[00567] As séries de diluições das doses foram preparadas para os compostos, capacitando o teste dos efeitos das respostas às doses no ensaio de JAK3 e o cálculo da IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado na concentração de 20 μM, seguida por uma diluição em série de 1/5, 10 pontos, em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentou, mais diluições foram preparadas e/ou a concentração de topo foi diminuída (p.ex., 5 μM, 1 μM).
[00568] Os seguintes compostos foram testados quanto à sua atividade contra a JAK3 e os valores de IC50, como determinados usando os ensaios descritos neste documento, são dados abaixo na Tabela IX. Tabela IX. Valores de IC50 da JAK3 dos Compostos Ilustrativos da invenção * > 500 nM ** >100-500 nM *** >50-100 nM **** 0,1-50 nM
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Figure img0111
Tabela X. Valores de IC50 da JAK3 dos Compostos Comparativos
Figure img0112
4.3.2. Ensaio de determinação de Ki de JAK3
[00569] Para a determinação de Ki, diferentes quantidades do composto são misturadas com a enzima e a reação enzimática é seguida como uma função da concentração de ATP. A Ki é determinada por meio de representação gráfica recíproca dupla de Km vs concentração de composto (gráfico de Lineweaver-Burk). A JAK3 (Carna Biosciences, 09CBS-0625B) é usada em uma concentração final de 10 ng/mL. O substrato é o sal sódico de Poly(Glu,Tyr) (4:1) , PM 20 000 - 50 000 (Sigma, P0275). A reação é efetuada em 25 mM de Tris pH 7,5 , 0,01% de Triton X-100, 0,5 mM de EGTA, 2,5 mM de DTT, 0,5 mM de Na3VO4, 5 mM de b-glicerolfosfato, 10 mM de MgCl2, com concentrações variadas de ATP e composto, e interrompida por adição de 150 mM de ácido fosfórico. A medição do fosfato incorporado no substrato polyGT é feita carregando as amostras sobre uma placa de filtro (usando um coletor, Perkin Elmer) e lavagem subsequente. O 33P incorporado no polyGT é medido em um Contador de cintilação Topcount, após a adição do líquido de cintilação às placas de filtro (Perkin Elmer).
4.4. Ensaio de inibição da TYK2 4.4.1. Ensaio de TYK2 peptídeo Ulight-JAK1
[00570] O domínio catalítico da TYK2 humana recombinante (ami- noácidos 871-1187; número do catálogo 08-147) foi adquirido da Car- na biosciences. 5 ng de TYK2 foram incubados com 12,5 μg de substrato de polyGT (Sigma, número do catálogo P0275) no tampão de reação da cinase (concentrações finais de 25 mM de Hepes pH 7,2, 50 mM de NaCl, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 5 mM de MnCl2, 10 mM de MgCl2, 0,1% de Brij-35, 0,1 μM de ATP não radioativo, 0,125 μCi de 33P-gama-ATP (GE Healthcare, número do catálogo AH9968)), com ou sem 5 μL contendo composto de teste ou veículo (DMSO, 1% de concentração final), em um volume total de 25 μL, em uma placa de 96 poços de polipropileno (Greiner, fundo em V). Após 90 min a 30°C, as reações foram interrompidas por adição de 25 μL/poço de 150 mM de ácido fosfórico. Toda a reação da cinase terminada foi transferida para placas de filtro de 96 poços pré-lavadas (75 mM de ácido fosfórico) (Perkin Elmer, número do catálogo 6005177) usando um coletor de células (Perkin Elmer). As placas foram lavadas 6 vezes com 300 μL por poço de uma solução a 75 mM de ácido fosfórico e o fundo das placas foi vedado. 40 μL/poço de Microscint-20 foram adicionados, o topo das placas foi vedado e a etapa de leitura foi efetuada usando o Topcount (Perkin Elmer). A atividade da cinase foi calculada subtraindo-se as contagens por min (cpm) obtidas na presença de um inibidor de controle positivo (10 μM de estaurosporina) das cpm obtidas na presença do veículo. A capacidade de um composto de teste de inibir esta atividade foi determinada como:
[00571] Porcentagem de inibição = ((cpm determinadas para a amostra com o composto de teste presente - cpm determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo) dividido por (cpm determinadas na presença de veículo - cpm determinadas para a amostra com o inibidor de controle positivo)) * 100.
[00572] As series de diluições das doses foram preparadas para os compostos, capacitando o teste dos efeitos das respostas às doses no ensaio da TYK2 e o cálculo da IC50 para cada composto. Cada composto foi rotineiramente testado na concentração de 20 μM, seguida por uma diluição em série de 1/3, 8 pontos (20 μM - 6,67 μM - 2,22 μM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM), em uma concentração final de 1% de DMSO. Quando a potência da série de compostos aumentou, mais diluições foram preparadas e/ou a concentração de topo foi diminuída (p.ex., 5 μM, 1 μM).
[00573] Os seguintes compostos foram testados quanto à sua atividade contra a TYK2; e os valores de IC50, como determinados usando os ensaios descritos neste documento, são dados abaixo na Tabela XI. Tabela XI. Valores de IC50 da TYK2 dos Compostos Ilustrativos da invenção * > 500 nM ** >100-500 nM *** >50-100 nM **** 0,1-50 nM
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Tabela XII. Valores de IC50 da TYK2 dos Compostos Comparativos
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4.2.3. Ensaio de determinação de Kd de TYK2
[00574] A TYK2 (Carna Biosciences, 09CBS-0983D) é usada em uma concentração final de 5 nM. O experimento de ligação é efetuado em 50 mM de Hepes pH 7,5, 0,01% de Brij-35, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, usando 50 nM do traçador de cinase 236 (Invitrogen, PV5592) e 2 nM de Eu-anti-GST (Invitrogen, PV5594), com concentra-ções variadas de composto. A detecção do traçador é efetuada de acordo com o procedimento dos fabricantes.
Exemplo 5. Ensaios celulares: 5.1. Ensaios celulares de seletividade por JAK1, JAK2, e TYK2 5.1.1. Ensaio de células seletivas para JAK1, ativação de STAT1 pelo IFNα em PBMC
[00575] As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) são isoladas de camadas de células brancas, sob condições estéreis, por centrifugação com gradiente de densidade, usando o meio LymphoPrep® (Axis-Shield), seguido por 3 etapas de lavagem subsequentes em PBS sem Ca++ Mg++. As PBMC são suspensas novamente em meio RPMI 1640 simples contendo 10% (v/v) de FBS inativada por calor, 1% de Pen-Strep (100 U/mL de Penicílio e 100 μg/mL de Estrep- tomicina) e adicionalmente cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C, 5% de CO 2.
[00576] As PBMC são semeadas em placas de 24 poços, a 5,0 1006 células/poço, em um volume de 200 μL de RPMI 1640 (Invitrogen) contendo 10% (v/v) de FBS e 1% de Pen-Strep (Invitrogen).
[00577] As PBMC são tratadas com o composto de teste por 30 min, a 37°C, 5% de CO 2. 25 μL de 10x diluição de composto concentrada são adicionados ao meio. Após 30 min de pré-tratamento com composto de teste / veículo, as PBMC são estimuladas por 30 min, a 37°C, 5% de CO 2, com IFNα humano recombinante (PeproTech), na concentração final de 100 ng/mL, por adição de 25 μL de ativador de citocina (10x concentrado), para obter um volume final de 250 μL por poço.
[00578] Todos os compostos são testados em individual, começando a partir de 20 μM, seguido por uma diluição em série de 1/3, 8 doses no total (20 μM, 6,6 μM, 2,2 μM, 0,74 μM, 0,25 μM, 0,082 μM, 0,027 μM e 0,009 μM), em uma concentração final de 0,2% de DMSO.
[00579] Após 30 min de estímulo com citocinas, 250 μL da suspensão celular são transferidos para uma placa de 96 poços de fundo em V, centrifugados por 5 min a 1000 rpm até células em pelotas, seguido por remoção do sobrenadante. A pelota de células é reconstituída em 100 μL de 1x Tampão de lise suplementado com Coquetel de Inibidor de Protease sem EDTA (Roche Applied Sciences, Número do Produto 11836170001), seguido por congelamento da amostra e armazenagem a -80°C. O 1x Tampão de lise é proporcionado com o Kit de Elisa de Phospho-STAT1 e contém inibidores da fosfatase. Os níveis endógenos da STAT1 fosforilada são quantificados usando um Kit de ELISA de Encaixe de 96 poços de Phospho-STAT1 (Tyr701) PathScan® (Cell Signaling, Número do Produto #7234), de acordo com as instruções do fabricante.
[00580] A atividade da HRP (a HRP é conjugada ao anticorpo secundário) é medida por adição de 100 μL de substrato de luminol recentemente preparado (BM Chemiluminescence ELISA Substrate (POD), Roche, Número do Produto 11582950001), incubação por 5 min na temperatura ambiente, no escuro, e medida em um Luminôme- tro de Microplaca de Ascenção Luminoskan da Thermo Scientific (tempo de integração de 200 ms). 5.1.2. Ensaio de células seletivas para JAK1, ativação de STAT5 por GM-CSF em PBMC
[00581] As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) são isoladas de camadas de células brancas, sob condições estéreis, por centrifugação com gradiente de densidade, usando o meio LymphoPrep® (Axis-Shield), seguido por 3 etapas de lavagem subsequentes em PBS sem Ca++ Mg++. As PBMC são suspensas novamente em meio RPMI 1640 simples contendo 10% (v/v) de FBS inativada por calor, 1% de Pen-Strep (100 U/mL de Penicílio e 100 μg/mL de Estrep- tomicina) e adicionalmente cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C, 5% de CO 2.
[00582] As PBMC são semeadas em placas de 24 poços, a 5,0E06 células/poço, em um volume de 200 μL de RPMI 1640 (Invitrogen) contendo 10% (v/v) de FBS e 1% de Pen-Strep (Invitrogen).
[00583] As PBMC são tratadas com o composto de teste por adição de 25 μL de 10x diluição de composto concentrada ao meio e incubadas por 30 min, a 37°C, 5% de CO 2. Subsequentemente, as PBMC são estimuladas com o GM-CSF humano recombinante (PeproTech), em uma concentração final de 0,5 ng/mL, por adição de 25 μL de ati- vador de citocina (10x concentrado) por poço, para obter um volume final de 250 μL. As células são ativadas por 30 min, a 37°C, 5% de CO2.
[00584] Todos os compostos são testados em individual, começando a partir de 20 μM, seguido por uma diluição em série de 1/3, 8 doses no total (20 μM, 6,6 μM, 2,2 μM, 0,74 μM, 0,25 μM, 0,082 μM, 0,027 μM e 0,009 μM), em uma concentração final de 0,2% de DMSO.
[00585] Após 30 min de estímulo com citocinas, 250 μL da suspensão celular são transferidos para uma placa de 96 poços de fundo em V, após centrifugação por 5 min a 1000 rpm até células em pelotas. O sobrenadante de células é removido e a pelota é reconstituída em 100 μL de 1x Tampão de lise suplementado com Coquetel de Inibidor de Protease sem EDTA (Roche Applied Sciences, Número do Produto 11836170001), seguido por congelamento da amostra e armazenagem a -80°C. O 1x Tampão de lise é proporcionado com o Kit de Elisa de Phospho-STAT5 e contém inibidores da fosfatase. Os níveis endógenos dA STAT5 fosforiladA são quantificados usando um Kit de ELISA de Encaixe de 96 poços de Phospho-STAT5 (Tyr694) PathScan® (Cell Signaling, Número do Produto #7113), de acordo com as instruções do fabricante.
[00586] A atividade da HRP (a HRP é conjugada ao anticorpo secundário) é medida por adição de 100 μL de substrato de luminol recentemente preparado (BM Chemiluminescence ELISA Substrate (POD), Roche, Número do Produto 11582950001), incubação por 5 min na temperatura ambiente, no escuro, e medida em um Luminôme- tro de Microplaca de Ascenção Luminoskan da Thermo Scientific (tempo de integração de 200 ms).
5.1.3. Ensaio de células seletivas para TYK2, ativação de STAT4 pela IL-12 em células NK-92
[00587] Células NK-92 (linfoma não Hodgkin maligno humano, linhagem de Células Exterminadoras Naturais dependentes de interleu- cina-2 (IL-2), ATCC no. CRL-2407).
[00588] As células NK-92 são mantidas em Meio alfa Meio Essencial Mínimo (MEM) sem ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos, 2 mM de L-glutamina, 2,2 g/L de bicarbonato de sódio (Invitrogen, Número do Produto 22561-021) contendo 0,2 mM de mio-inositol, 0,1 mM de 2-mercapto-EtOH, 0,1 mM de ácido fólico, 12,5% de soro de cavalo inativado por calor (Invitrogen, Número do Produto 26050-088), 12,5% de FBS inativada por calor, 1% de Pen-Strep (100 U/mL de Penicílio e 100 μg/mL de Estreptomicina) e 10 ng/mL de IL-2 humana recombi- nante (R&D Systems). A IL-2 é adicionada recente ao meio com cada etapa de repouso do meio. As células são cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C, 5% de CO 2.
[00589] Uma fração subcultivada de células NK-92 é lavada uma vez em meio simples sem rhIL-2 e semeada em placas de 24 poços a 0,5E06 células/poço, em um volume de 400 μL de meio Alfa MEM simples sem rhIL-2 contendo 0,2 mM de mio-inositol, 0,1 mM de 2- mercaptoetanol, 0,1 mM de ácido fólico, 12,5% de soro de cavalo ina- tivado por calor (Invitrogen, Número do Produto 26050-088), 12,5% de FBS inativada por calor, 1% de Pen-Strep (Invitrogen).
[00590] As células NK-92 são tratadas com os compostos de teste por 30 min, antes do estímulo com a rhIL-12, por adição de 50 μL de 10x diluição de composto concentrada e incubação a 37°C, 5% de CO2. Após 30 min de pré-tratamento com composto / veículo, as células são estimuladas com IL-12 humana recombinante (R&D Systems, Número do Produto 219-IL), em concentração final de 25 ng/mL, por adição de 50 μL de ativador de citocina (10x concentrado), para obter um volume final de 500 μL por poço. As células NK-92 são ativadas com rhIL-12 por 30 min, a 37°C, 5% de CO 2.
[00591] Todos os compostos são testados em individual, começando a partir de 20 μM, seguido por uma diluição em série de 1/3, 8 doses no total (20 μM, 6,6 μM, 2,2 μM, 0,74 μM, 0,25 μM, 0,082 μM, 0,027 μM e 0,009 μM), em uma concentração final de 0,2% de DMSO.
[00592] Os níveis de phospho-STAT4 nas células NK-92 estimuladas com rhIL-12 são quantificados usando uma análise citométrica de fluxo sobre um citômetro de fluxo Gallios® (Beckman Coulter). Após 30 min de estimulação com a citocina, as células são fixadas por adição de 500 μL de Tampão de Fixação BD Cytofix preaquecido (BD Phosflow®, Número do Produto 554655) imediatamente aos poços (fixar as células imediatamente para manter o estado de fosforilação, em vez de girar as células, é recomendado fixar as células por adição de um volume igual de Tampão BD Cytofix preaquecido à suspensão de células). As células são incubadas por 10 min a 37°C. A fração de células fixadas é suspensa novamente (1 mL) e transferida para os tubos de FACS, seguido por uma etapa de centrifugação (300x g, 10 min) e remoção do sobrenadante. A pelota de células é misturada (redemoinho) e as células são permeabilizadas por adição de 1 mL de Tampão de Perm BD Phosflow III (BD Phosflow®, Número do Produto 558050), seguido por incubação sobre gelo por 30 min. Após a etapa de per- meabilização, as células são lavadas duas vezes em Tampão de Colo ração BD Pharmingen® (BD Pharmingen, Número do Produto 554656), com centrifugação intermediária a 300x g, por 10 min, e remoção do sobrenadante. A pelota (0,5E06 células) é suspensa novamente em 100 μL de Tampão de Coloração BD Pharmingen® e colorida por mistura de 20 μL de Anti-STAT4 de Camundongo PE (pY693) nas células (BD Phosflow®, Anti-STAT4 de Camundongo PE (pY693), Número do Produto 558249), então incubada por 30 min na temperatura ambiente, no escuro. As células coloridas são lavadas uma vez com 2 mL de Tampão de Coloração BD Pharmingen® e suspensas novamente em 500 μL de Tampão de Coloração BD Pharmingen® e analisadas sobre um citômetro de fluxo Gallios® (Beckman Coulter).
[00593] Para todas as análises, as células mortas e os fragmentos são excluídos por dispersão avançada (FSC) e dispersão lateral (SSC). As mudanças na fosforilação das proteínas STAT4 após o estímulo com as citocinas são aproximadas calculando-se a intensidade de fluorescência mediana de X ou média de X (MFI) por célula sobre 100% da fração de entrada para toda citocina estimulada, composto de teste e amostras não estimuladas.
5.1.4. Resultados dos ensaios de JAK1, JAK2 e TYK2:
[00594] As amostras não estimuladas (sem ativador/veículo (0,2% de DMSO)) são usadas como um controle positivo (100% de inibição). Como um controle negativo (0% de inibição), as amostras estimuladas (ativador/veículo (0,2% de DMSO)) são usadas. Os controles positivos e negativos são usados para calcular os valores de 'Z' e 'porcentagem de inibição (PIN)'.
[00595] A porcentagem de inibição é calculada a partir de Porcentagem de inibição = (RCLU(ativador/veíc) - RCLU(composto de teste))/(RCLU(ativador/veíc) - RCLU(sem ativador/veíc))*100 onde
[00596] RCLU(ativador/veíc): Sinal Quimioluminescente Relativo determinado na presença de veículo e ativador
[00597] RCLU(composto de teste): Sinal Quimioluminescente Relativo determinado na presença de compostos de teste)
[00598] RCLU(sem ativador/veíc): Sinal Quimioluminescente Relativo determinado na presença de veículo sem ativador.
[00599] Se o sinal da etapa de leitura for expresso como valores médios de X (análise citométrica de fluxo dos níveis de pSTAT4 nas células NK-92 estimuladas com citocinas), o RCLU é substituído pelo valor médio de X.
[00600] Os valores da PIN são representados em gráficos para os compostos testados em resposta à dose e os valores da EC50 são de-rivados usando o Software GraphPad aplicando a adaptação da curva de regressão não linear (sigmoide). 5.2. Mutações da JAK1 no ensaio de linhagens celulares de câncer de pulmão e carcinoma hepatocelular.
5.2.1. Sinalização constitutiva induzida por mutação da JAK1
[00601] As linhagens celulares de câncer com e sem mutações da JAK1 (Tabela 1 - Linhagens celulares de câncer de pulmão) são cultivadas com ou sem soro, por 4-6 h, estimuladas ou não com um coquetel de citocinas (INFY, IL2, IL4 e IL6), por 5, 10, 30 e 45 min. A fosfori- lação de JAK1, STAT1, STAT3 e STAT5 é avaliada por imunoblot (Anticorpos de Sinalização celular).
5.2.2. Alvejamento dos mutantes de JAK1 usando inibidores de JAK 5.2.2.1. Fosforilação da via de JAK-STAT:
[00602] As linhagens celulares de câncer com e sem mutações da JAK1 são cultivadas na presença ou na ausência de diferentes concentrações de inibidores da JAK. As células são analisadas em 24 e 48 h quanto à inibição da via de JAK-STAT eficaz por imunoblot. Tabela XIII. Tabela I: Linhagens celulares de câncer de pulmão ilustra-tivas
Figure img0116
*: truncamento
5.2.2.2. Viabilidade das células
[00603] Ensaio 2D: As linhagens celulares de câncer, com e sem mutações da JAK1, são cultivadas na presença ou na ausência de concentrações crescentes de inibidores da JAK. Após 48-72 h, a via-bilidade das células é medida usando o Ensaio de viabilidade celular luminescente Cell Titer-Glo (Promega) ou o ensaio de MTT. Alternati-vamente, as linhagens celulares de câncer em diferentes pontos de tempo de cultivo, com uma concentração fixa de inibidor da JAK, são analisadas quanto à viabilidade das células usando o Ensaio de viabi-lidade celular luminescente Cell Titer-Glo (Promega) ou o ensaio de MTT.
[00604] Ensaio 3D: As linhagens de células de câncer com e sem mutações da JAK1 são semeadas em meio de ágar semissólido. A formação de colônias multicelulares é medida determinando-se a viabi-lidade das células, usando o corante fluorescente em diferentes pontos de tempo de cultivo. A adição de inibidores potenciais após a semeadura das células permite as análises dos efeitos antitumorigênicos.
5.2.3. Investigação das mutações de JAK1 humana em células Ba/F3 de camundongo
[00605] (Conforme ilustrado em: Kan e col., 2013; Staerk e col., 2005; Zenatti e col., 2011)
[00606] Construção dos vetores de expressão de JAK1: As sequências de JAK1 humana do tipo selvagem e mutantes são clonadas em vetores retrovirais e os clones verificados por sequenciamento.
[00607] Infeção retroviral das células Ba/F3: as células Ba/F3 são infectadas com os sobrenadantes retrovirais produzidos nas células 293T.
[00608] As células Ba/F3 expressando a JAK1 WT ou mutada humana são cultivadas com ou sem IL-3, por 4 h, e a fosforilação da via de JAK-STAT avaliada por imunoblot.
[00609] O potencial de transformação das mutações de JAK1 é avaliado medindo-se a capacidade de cada mutação de induzir o crescimento autônomo quando expressa em células Ba/F3 dependentes de citocinas. O crescimento celular é avaliado na ausência da citocina IL-3.
[00610] As linhagens celulares Ba/F3 transduzidas por JAK1 mutante são avaliadas quanto à sua sensibilidade aos inibidores da JAK cultivando-as na presença ou na ausência de concentrações crescentes de inibidores da JAK. Após 48-72 h, a viabilidade das células é medida usando o Ensaio de viabilidade celular luminescente Cell Titer-Glo (Promega) ou o ensaio de MTT. Alternativamente, as linhagens celulares de câncer em diferentes pontos de tempo de cultivo com uma concentração fixa de inibidor da JAK são analisadas quanto à viabilidade das células usando o Ensaio de viabilidade celular luminescente Cell Titer-Glo (Promega) ou o ensaio de MTT.
5.2.4. Potencial tumorigênico in vivo das mutações da JAK1 5.2.4.1. Modelo do xenoenxerto:
[00611] As células que expressam a JAK1 mutante são injetadas de modo subcutâneo em camundongos CD1 nu/nu ou camundongos Rag1-/- e avaliadas quanto à progressão do tumor. As curvas de crescimento do volume do tumor subcutâneo são estabelecidas. A capacidade de transplantar dos tumores primários em animais receptores secundários é determinada.
5.2.4.2. Modelo de PDX.
[00612] Os Xenoenxertos Derivados de Pacientes (PDXs) são baseados na transferência de tumores primários (contendo mutações de JAK1) diretamente do paciente para um camundongo imunodeficiente. Para efetuar isto, os tumores dos pacientes devem ser obtidos frescos da cirurgia, em cujo ponto eles são mecânica ou quimicamente digeridos, com uma pequena porção colhida como um estoque primário e fixados em um camundongo NOD-SCID. Os modelos de PDX são mantidos fazendo passar as células diretamente de camundongo para camundongo assim que a carga de tumor tornar-se muito alta. Os tumores podem ser enxertados de modo heterotópico (implantando os tumores no flanco subcutâneo de um camundongo) ou de modo orto- tópico (implantação direta no órgão do camundongo de escolha).
[00613] A fosforilação de JAK1, STAT1, STAT3 e STAT5 em tumores primários e secundários é avaliada por imunoblot.
5.3. Ensaio de Proliferação de PBL
[00614] Os linfócitos sanguíneos periféricos (PBL) humanos são estimulados com IL-2 e a proliferação é medida usando um ensaio de incorporação de BrdU. Os PBL são primeiramente estimulados por 72 h com PHA, para induzir o receptor de IL-2, então eles sofrem jejum por 24 para interromper a proliferação das células, seguido por estímulo com IL-2 por outras 72 h (incluindo 24 h de marcação com BrdU). As células são pré-incubadas com os compostos de teste 1 h antes da adição de IL-2. As células são cultivadas em RPMI 1640 contendo 10% (v/v) de FBS.
5.4. Ensaio de sangue integral humano (hWBA) 5.4.1. Protocolo 1 5.4.1.1. Protocolo de estímulo com IL-6
[00615] Uma análise por citometria de fluxo é efetuada para estabelecer a seletividade do composto por JAK1 sobre JAK2 ex vivo, usando o sangue integral humano. Portanto, o sangue é obtido de voluntários humanos que deram consentimento informado. O sangue é então equilibrado por 30 min, a 37°C, sob agitação suave, então dividido em alíquotas em tubos de Eppendorf. O composto é adicionado em diferentes concentrações e incubado a 37°C, por 30 min, sob agitação suave, e subsequentemente estimulado por 20 min, a 37°C, sob agitação suave, com interleucina 6 (IL-6) para o estímulo da via dependente de JAK1 ou GM-CSF para o estímulo da via dependente de JAK2. A phospho-STAT1 e a phospho-STAT5 são então avaliadas usando análise por FACS.
5.4.1.2. Ensaios com Phospho-STAT1 5.4.1.2.1. Preparação dos reagentes
[00616] O tampão 5X Lyse/Fix (BD PhosFlow, Cat. no 558049) é diluído 5 vezes com água destilada e preaquecido a 37°C. O tampão Lyse/Fix restante diluído é descartado.
[00617] 10 μg de rhIL-6 (R&D Systems, Cat no 206-IL) são dissolvi dos em 1 mL de PBS 0,1% de BSA, para obter uma solução de estoque de 10 μg/mL. A solução de estoque é dividida em alíquotas e armazenada a -80°C.
[00618] Uma série de diluições de 3 vezes do composto é preparada em DMSO (10 mM de solução de estoque). As amostras tratadas com controle receberam DMSO em vez do composto. Todas as amostras são incubadas com uma concentração final de DMSO de 1%.
5.4.1.2.2. Incubação do sangue com o composto e estímulo com IL-6
[00619] O sangue humano é coletado em tubos heparinizados. O sangue é dividido em alíquotas de 148,5 μL. Então, 1,5 μL da diluição do composto de teste é adicionado a cada alíquota de sangue e as amostras de sangue são incubadas por 30 min, a 37°C , sob agitação suave. Um microlitro e meio de solução de estoque de IL-6 diluída 10 vezes é adicionado às amostras de sangue (concentração final 10 ng/mL) e as amostras são incubadas a 37°C, por 30 m in, sob agitação suave.
5.4.1.2.3. Preparação de leucócitos
[00620] No final do período de estímulo, 3 mL de tampão 1X Ly- se/Fix preaquecido são imediatamente adicionados às amostras de sangue, redemoinhados rapidamente e incubados por 15 min, a 37°C, em um banho de água, para lisar as hemácias e fixar os leucócitos.
[00621] Os tubos são centrifugados por 5 min, a 400xg, a 4°C. A pelota de células é lavada com 3 mL de 1X PBS gelada, e após a centrifugação, a pelota de células é suspensa novamente em 100 μL de 1X PBS gelada e 900 μL de 100% de MeOH gelado são adicionados. As células são então incubadas a 4°C, por 30 min, p ara a permeabili- zação.
[00622] As células permeabilizadas são então lavadas com 1X PBS contendo 3% de BSA e finalmente suspensas novamente em 80 μL de 1X PBX contendo 3% de BSA.
5.4.1.2.4. Marcação das células com anticorpos anti Phospho-STAT1 e anti-CD4
[00623] 20 μL de anti-STAT1 (pY701) de camundongo PE ou anti corpo de controle de isótipo de IgG2aK de camundongo PE (BD Bios-ciences, Cat. no 612564 e 559319, respectivamente) e anticorpo anti- CD4 conjugado a FITC ou anticorpo de isótipo conjugado a FITC de controle são adicionados e misturados, então incubados por 30 min a 4°C, no escuro.
[00624] As células são então lavadas uma vez com 1X PBS e anali- sadas sobre um citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences).
5.4.1.2.5. Análise da fluorescência sobre FACSCanto II
[00625] 50.000 eventos totais são contados e as células positivas para Phospho-STAT1 são medidas após canalização sobre as células CD4+, no canal de linfócitos. Os dados são analisados usando o software FACSDiva e a porcentagem de inibição do estímulo com IL-6 calculada a partir da porcentagem de células positivas para phospho- STAT1 sobre células CD4+.
5.4.1.3. Ensaio de Phospho-STAT5 Preparação dos reagentes
[00626] O tampão 5X Lyse/Fix (BD PhosFlow, Cat. no 558049) é diluído 5 vezes com água destilada e preaquecido a 37°C. O tampão Lyse/Fix restante diluído é descartado.
[00627] 10 μg de rhGM-CSF (AbCys S.A., Cat no P300-03) são dis solvidos em 100 μL de PBS 0,1% de BSA, para obter uma solução de estoque de 100 μg/mL. A solução de estoque é dividida em alíquotas e armazenada a -80°C.
[00628] Uma série de diluições de 3 vezes do composto é preparada em DMSO (10 mM de solução de estoque). As amostras tratadas com controle receberam DMSO sem o composto de teste. Todas as amostras são incubadas com uma concentração final de DMSO de 1%.
5.4.1.3.1. Incubação do sangue com o composto e estímulo com GM- CSF
[00629] O sangue humano é coletado em tubos heparinizados. O sangue é dividido em alíquotas de 148,5 μL. Então, 1,5 μL da diluição do composto é adicionado a cada alíquota e as amostras de sangue são incubadas por 30 min, a 37°C, sob agitação suav e. Uma diluição de 5.000 vezes da solução de estoque de GM-CSF (1,5 μL) é adicionada às amostras de sangue (concentração final 20 pg/mL) e as amostras são incubadas a 37°C por 30 min, sob agita ção suave.
5.4.1.3.2. Preparação de leucócitos
[00630] No final do período de estímulo, 3 mL de tampão 1X Ly- se/Fix preaquecido são imediatamente adicionados às amostras de sangue, redemoinhados rapidamente e incubados por 15 min, a 37°C, em um banho de água, para lisar as hemácias e fixar os leucócitos.
[00631] Os tubos são centrifugados por 5 min, a 400xg, a 4°C. A pelota de células é lavada com 3 mL de 1X PBS gelada, e após a centrifugação, a pelota de células é suspensa novamente em 100 μL de 1X PBS gelada e 900 μL de 100% de MeOH gelado são adicionados. As células são então incubadas a 4°C, por 30 min, p ara a permeabili- zação.
5.4.1.3.3. Marcação das células com anticorpos anti phospho-STAT5 e anti-CD33
[00632] 20 μL de anti-STAT5 (pY694) de camundongo PE ou anti corpo de controle de isótipo de IgGlK de camundongo PE (BD Biosci-ences, Cat. no 612567 e 554680, respectivamente) e anticorpo anti CD33 de camundongo APC (BD Biosciences no. 345800) ou anticorpo de isótipo de IgG1 de camundongo APC de controle (BD Biosciences no. 345818) são adicionados, misturados, então incubados por 30 min a 4°C, no escuro.
[00633] As células são então lavadas uma vez com 1X PBS e analisadas sobre um citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences).
5.4.1.3.4. Análise da fluorescência sobre FACSCanto II
[00634] 50.000 eventos totais são contados e as células positivas para Phospho-STAT5 são medidas após canalização sobre as células CD33+. Os dados são analisados usando o software FACSDiva e cor-respondem à porcentagem de inibição do estímulo com GM-CSF cal-culada a partir da porcentagem de células positivas para phosphor- STAT5 sobre células CD33+.
5.5. Protocolo 2 5.5.1. Protocolo de estímulo
[00635] Uma análise por citometria de fluxo é efetuada para estabelecer a seletividade do composto por JAK1 sobre JAK2 ex vivo, usando o sangue integral humano. Portanto, o sangue é obtido de voluntários humanos que deram consentimento informado. O sangue é então equilibrado por 30 min, a 37°C, sob agitação suave, então dividido em alíquotas em tubos de Eppendorf. O composto é adicionado em diferentes concentrações e incubado a 37°C, por 30 min, sob agitação suave, e subsequentemente estimulado por 20 min, a 37°C, sob agitação suave, com interleucina 6 (IL-6) para o estímulo da via dependente de JAK1, Interferon alfa (IFNα) para o estímulo da via de JAK1/TYK2, in- terleucina 2 (IL-2) para o estímulo da via de JAK1/JAK3 ou GM-CSF para o estímulo da via dependente de JAK2. Os níveis de phospho- STAT1 (para as células estimuladas com IL-6 e IFNα) e phospho- STAT5 (para as células estimuladas com IL-2 e GM-CSF) são então avaliados usando análise por FACS.
5.5.2. Ensaios com Phospho-STAT 5.5.2.1. Preparação dos reagentes
[00636] O tampão 5X Lyse/Fix (BD PhosFlow, Cat. no 558049) é diluído 5 vezes com água destilada e preaquecido a 37°C. O tampão Lyse/Fix restante diluído é descartado.
[00637] 10 μg de rhIL-6 (R&D Systems, Cat no 206-IL) são dissolvi dos em 1 mL de PBS + 0,1% de BSA, para obter uma solução de estoque de 10 μg/mL. A solução de estoque é dividida em alíquotas e armazenada a -80°C.
[00638] 10 μg de rhIL-2 (R&D Systems, Cat no 202-IL) são dissolvi dos em 1 mL de PBS + 0,1% de BSA, para obter uma solução de estoque de 10 μg/mL. A solução de estoque é dividida em alíquotas e armazenada a -80°C.
[00639] 5 μg de rhGM-CSF (AbCys S.A., Cat no P300-03) são dis solvidos em 12,5 mL de PBS + 0,1% de BSA, para obter uma solução de estoque de 400 ng/mL. A solução de estoque é dividida em alíquotas e armazenada a -80°C.
[00640] Uma série de diluições de 3 vezes do composto é preparada em DMSO (10 mM de solução de estoque). As amostras tratadas com controle receberam DMSO em vez do composto. Todas as amostras são incubadas com uma concentração final de DMSO de 1%.
5.5.2.2. Incubação do sangue com o composto e estímulo com ativa- dores
[00641] O sangue humano é coletado em tubos heparinizados. O sangue é dividido em alíquotas de 148,5 μL. Então, 1,5 μL da diluição do composto de teste é adicionado a cada alíquota de sangue e as amostras de sangue são incubadas por 30 min, a 37°C , sob agitação suave. Um microlitro e meio de solução de estoque de IL-6 diluída 10 vezes, 1,5 μL de solução de estoque de uIFNa (PBL Biomedical, Cat no 11200-1), 1,5 μL de solução de estoque de IL-2 diluída 25 vezes ou 1,5 μL de diluição de 200 vezes da solução de estoque de GM-CSF é adicionado às amostras de sangue e as amostras são incubadas a 37°C, por 20 min, sob agitação suave.
5.5.2.3. Preparação de leucócitos
[00642] No final do período de estímulo, 3 mL de tampão 1X Ly- se/Fix preaquecido são imediatamente adicionados às amostras de sangue, redemoinhados rapidamente e incubados por 15 min, a 37°C, em um banho de água, para lisar as hemácias e fixar os leucócitos.
[00643] Os tubos são centrifugados por 5 min, a 400xg, a 4°C. A pelota de células é lavada com 3 mL de 1X PBS gelada, e após a centrifugação, a pelota de células é suspensa novamente em 100 μL de 1X PBS gelada e 900 μL de 100% de MeOH gelado são adicionados. As células são então incubadas a 4°C, por 30 min, p ara a permeabili- zação.
[00644] As células permeabilizadas são então lavadas com 1X PBS contendo 3% de BSA e finalmente suspensas novamente em 80 μL de 1X PBX contendo 3% de BSA.
5.5.2.4. Marcação das células
[00645] 20 μL de anti-STAT1 (pY701) de camundongo PE ou anti corpo de controle de isótipo de IgG2aK de camundongo PE (BD Bios-ciences, Cat. no 612564 e 559319, respectivamente) e anticorpo anti- CD4 conjugado a APC ou anticorpo de isótipo conjugado a APC de controle (BD Biosciences, Cat. no 555349 e 555751, respectivamente) são adicionados aos tubos estimulados com IL-6 e IFNα e misturados, então incubados por 20 min a 4°C, no escuro.
[00646] 20 μL de anti-STAT5 (pY694) de camundongo PE ou anti corpo de controle de isótipo de IgGlK de camundongo PE (BD Biosci-ences, Cat. no 612567 e 554680, respectivamente) e anticorpo anti- CD4 conjugado a APC ou anticorpo de isótipo conjugado a APC de controle (BD Biosciences, Cat. no 555349 e 555751, respectivamente) são adicionados aos tubos estimulados com IL-2, misturados, então incubados por 20 min a 4°C, no escuro.
[00647] 20 μL de anti-STAT5 (pY694) de camundongo PE ou anti corpo de controle de isótipo de IgGlK de camundongo PE (BD Biosci-ences, Cat. no 612567 e 554680, respectivamente) e anticorpo anti CD33 de camundongo APC (BD Biosciences no. 345800) ou anticorpo de isótipo de IgG1 de camundongo APC de controle (BD Biosciences no. 345818) são adicionados aos tubos estimulados com GM-CSF, misturados, então incubados por 20 min, a 4°C, no e scuro.
[00648] As células são então lavadas uma vez com 1X PBS e analisadas sobre um citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences).
5.5.2.5. Análise da fluorescência sobre FACSCanto II
[00649] 50.000 eventos totais são contados e as células positivas para Phospho-STAT1 são medidas após canalização sobre as células CD4+, no canal de linfócitos para as células estimuladas com IL-6 e IFNα. As células positivas para Phospho-STAT5 são medidas após canalização sobre as células CD33+. Os dados são analisados usando o software FACSDiva e a porcentagem de inibição do estímulo com IL-6 ou IFNα calculada é a partir da porcentagem de células positivas para phospho-STAT1 sobre as células CD4+. Para as células estimuladas com GM-CSF, a porcentagem de inibição do estímulo com GM- CSF é calculada a partir da porcentagem de células positivas para phosphor-STAT5 sobre as células CD33+.
Exemplo 6. Modelos in vivo 6.1. Modelo de CIA 6.1.1. Materiais
[00650] O adjuvante de Freund completado (CFA) e o adjuvante de Freund incompleto (IFA) foram adquiridos da Difco. O colágeno bovino tipo II (CII), o lipopolissacarídeo (LPS), e o Enbrel foram obtidos da Chondrex (Isle d’Abeau, França); da Sigma (P4252, L’Isle d’Abeau, França), da Whyett (seringa injetável de 25 mg, França), da Acros Organics (Palo Alto, CA), respectivamente. Todos os outros reagentes usados eram de grau reagente e todos os solventes eram de grau analítico.
6.1.2. Animais
[00651] Os ratos pretos Agouti (machos, 7-8 semanas de idade) foram obtidos da Harlan Laboratories (Maison-Alfort, França). Os ratos foram mantidos sobre um ciclo de luz/escuridão de 12 h (0700 - 1900). A temperatura foi mantida a 22°C e o alimento e a água foram fornecidos ad libitum.
6.1.3. Artrite induzida por colágeno (CIA)
[00652] Um dia antes do experimento, a solução de CII (2 mg/mL) foi preparada com 0,05 M de ácido acético e armazenada a 4°C. Exa- tamente antes da imunização, volumes iguais de adjuvante (IFA) e CII foram misturados por um homogeneizador, em um frasco de vidro pré- esfriado, em um banho de água gelada. Adjuvante extra e uma homo-geneização prolongada podem ser requeridos se uma emulsão não for formada. 0,2 mL da emulsão foi injetado de modo intradérmico na base da cauda de cada rato no dia 1, uma segunda injeção intradérmica de reforço (solução de CII a 2 mg/mL em CFA 0,1 mL de solução salina) foi efetuada no dia 9. Este método de imunização foi modificado a partir dos métodos publicados (Jou e col., 2005; Sims e col., 2004).
6.1.4. Projeto de estudo
[00653] Os efeitos terapêuticos dos compostos foram testados no modelo de CIA de rato. Os ratos foram aleatoriamente divididos em grupos iguais e cada grupo continha 10 ratos. Todos os ratos foram imunizados no dia 1 e reforçados no dia 9. A dosagem terapêutica durou do dia 16 até o dia 30. O grupo de controle negativo foi tratado com veículo (MC 0,5%) e o grupo de controle positivo com Enbrel (10 mg/kg, 3x semana, s.c.). Um composto de interesse foi tipicamente testado em 3 doses, p.ex., 3, 10, 30 mg/kg, p.o.
6.1.5. Avaliação clínica da artrite
[00654] A artrite é pontuada de acordo com o método de (Khachigi- an, 2006; Lin e col., 2007; Nishida e col., 2004). O inchaço de cada uma das quatro patas é classificado com a pontuação artrítica que se segue: 0 - nenhum sintoma; 1 - brando, porém uma vermelhidão nítida e um inchaço de um tipo de articulação, tal como o tornozelo ou pulso, ou uma vermelhidão aparente e um inchaço limitados aos dedos individuais, independente do número de dedos afetados; 2 - vermelhidão moderada e inchaço de dois ou mais tipos de articulações; 3 - vermelhidão grave e inchado da pata inteira, incluindo os dedos; 4 - membro maximamente inflamado com envolvimento de múltiplas articulações (pontuação da artrite clínica cumulativa máxima 16 por animal) (Nishi- da e col., 2004).
[00655] Para permitir a meta-análise dos múltiplos estudos, os valores da pontuação clínica foram normalizados como se segue:
[00656] AUC da pontuação clínica (pontuação de AUC): A área sob a curva (AUC) do dia 1 até o dia 14 foi calculada para cada rato individual. A AUC de cada animal foi dividida pela AUC média obtida para o veículo no estudo a partir do qual o dado sobre este animal foi obtido e multiplicada por 100 (i.e., a AUC foi expressa como uma porcentagem da AUC média do veículo por estudo).
[00657] Aumento da pontuação clínica do dia 1 até o dia 14 (pontuação de ponto final): A diferença da pontuação clínica para cada animal foi dividida pela diferença da pontuação clínica média obtida para o veículo no estudo a partir do qual o dado sobre este animal foi obtido e multiplicada por 100 (i.e., a diferença foi expressa como uma porcentagem da diferença da pontuação clínica média para o veículo por estudo).
6.1.6. Mudança no peso do corpo (%) após o início da artrite
[00658] Clinicamente, a perda de peso do corpo está associada com a artrite (Rall e Roubenoff, 2004; Shelton e col., 2005; Walsmith e col., 2004). Consequentemente, as mudanças no peso do corpo após o início da artrite podem ser usadas como um ponto final não específico para avaliar o efeito das substâncias terapêuticas no modelo de rato. A mudança no peso do corpo (%) após o início da artrite foi calculada como se segue: Camundongos: Peso do Corpo(semana6) - Peso do Corpo(semana5) x 100% Peso do Corpo(semana5) Ratos: Peso do Corpo(semana4) - Peso do Corpo(semana3) x 100% Peso do Corpo(semana3)
6.1.7. Radiologia
[00659] As fotos de raios X foram obtidas das patas traseiras de cada animal individual. Um número de identidade aleatoriamente às cegas foi especificado para cada uma das fotos, e a gravidade do desgaste do osso foi classificada por dois pontuadores independentes, com o sistema de pontuação de Larsen radiológico como se segue: 0 - normal, com contornos ósseos intactos e espaço da articulação normal; 1 - anormalidade ligeira com qualquer um ou dois dos ossos me- tatársicos exteriores, mostrando ligeiro desgaste do osso; 2 - anormalidade inicial nítida com quaisquer 3 a 5 dos ossos metatársicos exteriores, mostrando desgaste do osso; 3 - anormalidade destrutiva mediana com todos os ossos metatársicos exteriores, bem como qualquer um ou dois dos ossos metatársicos interiores, mostrando desgastes dos ossos nítidos; 4 - anormalidade destrutiva grave, com todos os ossos metatársicos mostrando desgaste do osso nítido e pelo menos uma das articulações metatársicas internas completamente desgastada, deixando alguns contornos das articulações ósseas parcialmente conservados; 5 - anormalidade que mutila, sem contornos ósseos. Este sistema de pontuação é uma modificação de (Bush e col., 2002; Jou e col., 2005; Salvemini e col., 2001; Sims e col., 2004).
6.1.8. Histologia
[00660] Após a análise radiológica, as patas traseiras dos camundongos foram fixadas em 10% de formalina tamponada com fosfato (pH 7,4), descalcificadas com descalcificante ósseo rápido para a histologia refinada (Laboratories Eurobio) e incrustadas em parafina. Para garantir a ampla avaliação das articulações artríticas, pelo menos quatro seções em série (5 μm de espessura) foram cortadas e cada série de seções era 100 μm no meio. As seções foram coloridas com hematoxilina e eosina (H&E). Os exames histológicos quanto à inflamação sinovial e dano ao osso e à cartilagem foram efetuados duplo- cegos. Em cada pata, quatro parâmetros foram avaliados usando uma escala de quatro pontos. Os parâmetros eram a infiltração da célula, a gravidade do pano, o desgaste da cartilagem e o desgaste do osso. A pontuação foi efetuada de acordo como a seguir: 1 - normal, 2 - brando, 3 - moderado, 4 - acentuado. Estas quatro pontuações são somadas conjuntamente e representadas como uma pontuação adicional, a saber, a 'pontuação total de RA'.
6.1.9. Análise por tomografia microcomputadorizada (μCT) do calcâ- neo (osso do calcanhar):
[00661] A degradação do osso observada na RA ocorre especialmente no osso cortical e pode ser revelada através de análise por μCT (Oste e col., 2007; Sims e col., 2004). Após varredura e reconstrução do volume 3D do osso calcâneo, a degradação do osso é medida como o número de objetos distintos presentes por lâmina, isolados em ambiente virtual, perpendiculares ao eixo longitudinal do osso. Quanto mais o osso for degradado, mais objetos distintos são medidos. 1000 pedaços, uniformemente distribuídos ao longo do calcâneo (espaçados por cerca de 10,8 μm), são analisados.
6.1.10. PK em Estado Estacionário
[00662] No dia 7 ou 11, as amostras de sangue foram coletadas no seio retro-orbital, com a lítio heparina como anticoagulante, nos seguintes pontos de tempo: pré-dose, 1, 3 e 6 h. As amostras de sangue integral foram centrifugadas e as amostras de plasma resultantes foram armazenadas a -20°C pendendo análise. As concentrações plas- máticas de cada composto de teste foram determinadas por um método de LC-MS/MS, em que o espectrômetro de massa foi operado no modo de eletropulverização positiva. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados usando Winnonlin® (Pharsight®, Estados Unidos) e assumiu-se que os níveis plasmáticos da pré-dose eram iguais aos níveis plasmáticos de 24 h.
6.2. Modelos de oncologia
[00663] Os modelos in vivo para validar a eficácia das pequenas moléculas em relação às doenças mieloproliferativas promovidas por JAK2 são descritos (Geron e col., 2008; Wernig e col., 2008).
6.3. Modelo de IBD de camundongo
[00664] Os modelos in vitro e in vivo para validar a eficácia das pequenas moléculas em relação à IBD são descritos (Wirtz e Neurath, 2007).
6.4. Modelo de Asma de camundongo
[00665] Os modelos in vitro e in vivo para validar a eficácia das pequenas moléculas em relação à asma são descritos (Ip e col., 2006; Kudlacz e col., 2008; Nials e Uddin, 2008; Pernis e Rothman, 2002).
6.5. Modelo de camundongo de hiperplasia epidérmica do tipo psoriá- tica induzida por injeções intradérmicas de IL22 ou IL23 6.5.1. Materiais
[00666] A IL22 recombinante de camundongo (582-ML-CF), sem veículo, é proporcionada pela R&D systems. A IL23 recombinante de camundongo, sem veículo (14-8231, CF), é proporcionada pela e-Bioscience.
6.5.1. Animais
[00667] Os camundongos Balb/c (fêmeos, 18-20 g de peso do corpo) são obtidos da CERJ (França). Os camundongos são mantidos sobre um ciclo de luz/escuridão de 12 h (07:00 - 19:00). A temperatura é mantida a 22°C, o alimento e a água são proporcionados ad libitum.
6.5.2. Projeto do estudo
[00668] O projeto do estudo é adaptado de Rizzo e col., 2011.
[00669] No primeiro dia (D1), os camundongos foram raspados em torno das duas orelhas.
[00670] Por 4 dias consecutivos (D1 a D4), os camundongos receberam uma dose intradérmica diária de IL22 ou IL23 recombinante de camundongo (1 μg/20 μL em PBS/0,1% de BSA) na aurícula direita e 20 μL de PBS/0,1% de BSA na aurícula esquerda, sob anestesia induzida por inalação de isoflurano.
[00671] Do D1 até o D5, os camundongos foram dosados com o composto de teste (10, 30 ou 100 mg/kg, po, qd em MC 0,5%), 1 h após a injeção de IL23/IL22 ou com veículo.
6.5.3. Avaliação da doença
[00672] A espessura de ambas as orelhas é medida diariamente com um calibrador automático. O peso do corpo é avaliado no início e no sacrifício. No quinto dia, 2 h após a última dosagem, os camundongos são sacrificados. As aurículas da orelha são cortadas, excluindo a cartilagem. As aurículas são pesadas e então colocadas em frasco pequeno contendo 1 mL de solução de RNAlater ou em formaldeído.
[00673] No D4, as amostras de sangue são também coletadas do seio retro-orbital para o perfil PK, exatamente antes da dosagem (T0) e 1 h, 3 h, 6 h após a dosagem.
[00674] Existem 8 camundongos por grupo. Os resultados são expressos como média ± sem e a análise estatística é efetuada usando Anova unidirecional, seguida por teste de Dunnett post-hoc versus grupos de veículo de IL22 ou IL23.
6.5.4. Histologia
[00675] Após o sacrifício, as orelhas são coletadas e fixadas em 3,7% de formaldeído, antes da incrustação em parafina. Seções de dois μm de espessura são feitas e coloridas com hematoxilina e eosina. A espessura da epiderme da orelha é medida através de análise da imagem (software Sis'Ncom) com 6 imagens por orelha, capturadas em ampliação x20. Os dados são expressos como média ± sem e a análise estatística é efetuada usando Anova unidirecional, seguida por teste de Dunnett post-hoc versus grupos de veículo de IL22 ou IL23.
6.5.5. Extração de RNA, RT-PCR e PCR em tempo real
[00676] Os níveis de transcrito de IL-17a, IL-22, IL-1β, LCN2 e S100A9 no tecido da orelha são determinados usando PCR quantitativa em tempo real.
Exemplo 7. Ensaios Farmacocinéticos, de ADME e Toxicidade 7.1. Solubilidade termodinâmica
[00677] O composto de teste é adicionado a 0,2 M de tampão de fosfato pH 7,4 ou 0,1 M de tampão de citrato pH 3,0, em uma concentração de 1 mg/mL, em um frasco pequeno de vidro.
[00678] As amostras são giradas em um Acionamento de rotador STR 4 (Stuart Scientific, Bibby), em velocidade 3,0, na temperatura ambiente, por 24 h.
[00679] Após 24 h, 800 μL da amostra são transferidos para um tubo eppendorf e centrifugados 5 min, a 14000 rpm. 200 μL do sobre- nadante da amostra são então transferidos para uma Placa de Solubilidade MultiscreenR (Millipore, MSSLBPC50) e o sobrenadante é filtrado [254-304,8 mm de Hg (10-12" de Hg)] com o auxílio de um manifold a vácuo para uma placa de 96 poços de fundo em V de polipropileno Grenier limpa (Cat no. 651201). 5 μL do filtrado são diluídos em 95 μL (F20) do mesmo tampão usado para incubar na placa contendo a curva padrão (Greiner, Cat no. 651201).
[00680] A curva-padrão para o composto é preparada recentemente em DMSO, começando a partir de uma solução de estoque de DMSO a 10 mM, diluída fator 2 em DMSO (5000 μM), e então adicionalmente diluída em DMSO até 19,5 μM. 3 μL da série de diluições a partir de 5000 μM são então transferidos para uma mistura de acetonitrila- tampão de 97 μL (50/50). A faixa de concentrações finais é 2,5 a 150 μM.
[00681] A placa é vedada com emaranhamentos de vedação (MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk) e as amostras são medidas na temperatura ambiente, sobre LC-MS (ZQ 1525 da Waters), sob condições otimizadas, usando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula.
[00682] As amostras são analisadas sobre LC-MS com uma vazão de 1 mL/min. O solvente A é 15 mM de amônia e o solvente B é ace- tonitrila. A amostra é corrida sob pulverização de íons positiva sobre uma coluna XBridge C18 3,5 μM (2,1 x 30 mm), da Waters. O gradiente do solvente tem um tempo total de corrida de 2 min e varia de 5% de B até 95% de B.
[00683] As áreas de pico são analisadas com o auxílio do pacote de software Masslynx e as áreas de pico das amostras são plotadas contra a curva-padrão, para obter a solubilidade do composto.
[00684] Os valores da solubilidade são descritos em μM ou μg/mL.
7.2. Solubilidade Aquosa
[00685] Começando a partir de um estoque de 10 mM em DMSO, uma diluição em série do composto é preparada em DMSO. A série de diluições é transferida para uma placa 96 NUNC Maxisorb de fundo em F (Cat no. 442404) e 0,1 M de tampão de fosfato pH 7,4 ou 0,1 M de tampão de citrato pH 3,0, na temperatura ambiente, é adicionado.
[00686] A concentração final varia de 300 μM a 18,75 μM em 5 etapas de diluição iguais. A concentração final de DMSO não excede 3%. 200 μM de Pireno são adicionados aos pontos dos cantos de cada placa de 96 poços e servem como um ponto de referência para a cali- bração do eixo Z sobre o microscópio.
[00687] As placas de ensaio são vedadas e incubadas por 1 h, a 37°C, enquanto se agita a 230 rpm. As placas são e ntão escaneadas sob um microscópio de luz branca, produzindo imagens individuais do precipitado por concentração. O precipitado é analisado e convertido em um número com uma ferramenta de software que pode ser plotada sobre um gráfico. A primeira concentração na qual o composto aparece completamente dissolvido é a concentração descrita; entretanto, a concentração real situa-se em algum lugar entre esta concentração e uma etapa de diluição superior.
[00688] Os valores da solubilidade medidos de acordo com este protocolo são descritos em μg/mL.
7.3. Ligação da Proteína do Plasma (Diálise de Equilíbrio)
[00689] Uma solução de estoque a 10 mM do composto em DMSO é diluída com um fator 5 em DMSO. Esta solução é adicionalmente diluída em plasma humano, de rato, camundongo ou cão recentemente descongelado (BioReclamation INC), com uma concentração final de 5 μM e uma concentração final de DMSO de 0,5% (5,5 μL em 1094,5 μL de plasma em um PP-Masterblock 96 poços (Greiner, Cat no. 780285))
[00690] Uma placa Pierce Red Device com inserções (ThermoSci- entific, Cat no. 89809) é preparada e enchida com 750 μL de PBS na câmara de tampão e 500 μL do plasma introduzido na câmara de plasma. A placa é incubada por 4 h, a 37°C, enquanto se agita a 230 rpm. Após a incubação, 120 μL de ambas as câmaras são transferidos para 360 μL de acetonitrila, em uma placa de poço profundo de PP, de fundo redondo, de 96 poços (Nunc, Cat no. 278743), e vedados com uma tampa de folha de alumínio. As amostras são misturadas e colocadas sobre gelo, por 30 min. Esta placa é então centrifugada 30 min, a 1200 rcf, a 4°C, e o sobrenadante é transferido para uma placa de PP de fundo em v de 96 (Greiner, 651201) para a análise sobre LC- MS.
[00691] A placa é vedada com emaranhamentos de vedação (MA96RD-04S) de www.kinesis.co.uk, e as amostras são medidas na temperatura ambiente, sobre LC-MS (ZQ 1525 da Waters), sob condições otimizadas, usando Quanoptimize para determinar a massa apropriada da molécula.
[00692] As amostras são analisadas sobre LC-MS com uma vazão de 1 mL/min. O solvente A é 15 mM de amônia e o solvente B é ace- tonitrila. A amostra é corrida sob pulverização de íons positiva sobre uma coluna XBridge C18 3,5 μM (2,1 x 30 mm), da Waters. O gradiente do solvente tem um tempo total de corrida de 2 min e varia de 5% de B até 95% de B.
[00693] A área de pico do composto na câmara de tampão e na câmara de plasma é considerada ser 100% de composto. A porcentagem ligada ao plasma é derivada destes resultados e é descrita como porcentagem ligada ao plasma.
[00694] A solubilidade do composto na concentração final de teste em PBS é inspecionada por microscópio, para indicar se a precipitação é observada ou não.
7.4. Estabilidade da aldeído oxidase
[00695] Uma solução de estoque a 10 mM do composto de teste em DMSO é primeiramente diluída com água (5 vezes), para obter uma solução de trabalho a 50 μM. Um inibidor seletivo de aldeído oxidase (hidralazina) é preparado em água, como uma solução a 5 mM.
[00696] As misturas de incubação são preparadas por adição de 10 μL de suspensão de S9 de fígado (humano e rato, BD Bioscience Gentest, 20 mg/mL) a 86 μL de 50 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,4, a 37°C. 2 μL de 5 mM de hidralazina são adi cionados (para incubação com a adição de inibidor seletivo) ou 2 μL de água (para incubação sem a adição do inibidor).
[00697] Após 5 min de pré-aquecimento, a reação é iniciada pela adição de 2 μL de 50 μM de composto de teste às misturas de incubação. Após 0, 3, 6, 12, 18, e 30 min de incubação, a reação (100 μL) é terminada com 300 μL de MeCN : MeOH (2:1) com mistura de 1% de ácido acético contendo 10 ng/mL de warfarina como o padrão interno analítico.
[00698] As amostras são misturadas, centrifugadas, e o sobrena- dante analisado por LC-MS.
[00699] Os compostos de teste são considerados como um substrato de aldeído oxidase se a depuração por S9 for inibida pela hidralazi- na. A depuração específica para as espécies do composto de teste pode também indicar o metabolismo pela aldeído oxidase.
[00700] A ftalazina é incluída como um controle positivo.
[00701] As respostas dos instrumentos (razão de área de pico do composto de teste e o padrão interno) são referidas às amostras no ponto de tempo zero (consideradas como 100%), para determinar a porcentagem de composto restante. Os gráficos da porcentagem de compostos de teste restantes são usados para determinar a meia-vida (T1/2) e a depuração intrínseca nas incubações de S9, usando o software Graph Pad Prism. Para calcular a depuração intrínseca in vitro (CLint (μL/min/mg), a se- guinte fórmula é usada:
Figure img0117
7.5. Estabilidade microssômica do fígado
[00702] Uma solução de estoque de 10 mM do composto em DMSO é diluída até 6 μM em um tampão de fosfato a 105 mM, pH 7,4, em uma placa de 96 poços profundos (Greiner, Cat no. 780285), e preaquecida a 37°C.
[00703] Uma solução de estoque de trabalho de glicose-6-fosfato- desidrogenase (G6PDH, Roche, 10127671001) de 700 U/mL é diluída com um fator 1:700 em um tampão de fosfato a 105 mM, pH 7,4. Uma mistura de cofator contendo 0,528 M de MgCl2.6H2O (Sigma, M2670), 0,528 M de glicose-6-fosfato (Sigma, G-7879) e 0,208 M de NADP+ (Sigma,N-0505) é diluída com um fator 1:8 em um tampão de fosfato a 105 mM, pH 7,4.
[00704] Uma solução de trabalho é preparada contendo 1 mg/mL de microssomos do fígado (Xenotech) da espécie de interesse (humana, de camundongo, rato, cão ...), 0,8 U/mL de G6PDH e mistura de cofator (6,6 mM de MgCl2, 6.6 mM de glicose-6-fosfato, 2,6 mM de NADP+). Esta mistura é pré-incubada por 15 min, porém nunca mais do que 20 min, na temperatura ambiente.
[00705] Após pré-incubação, a diluição do composto e a mistura contendo os microssomos são adicionadas juntas, em quantidade igual, e incubadas por 30 min, a 300 rpm. Para o ponto de tempo de 0 min, dois volumes de MeOH são adicionados à diluição do composto, antes da mistura de microssomos ser adicionada. A concentração final durante a incubação é: 3 μM de composto de teste ou composto de controle, 0,5 mg/mL de microssomos, 0,4 U/mL de G6PDH, 3,3 mM de MgCl2, 3,3 mM de glicose-6-fosfato e 1,3 mM de NaDP+.
[00706] Após 30 min de incubação, a reação é interrompida com 2 volumes de MeOH.
[00707] De ambos os pontos de tempo, as amostras são misturadas, centrifugadas e o sobrenadante é coletado para análise sobre LC- MS/MS. As respostas dos instrumentos (i.e., alturas dos picos) são referidas às amostras no ponto de tempo zero (como 100%), para de-terminar a porcentagem de composto restante. Os compostos-padrão Propanolol e Verapamil são incluídos no projeto de ensaio.
[00708] Os dados sobre a estabilidade microssômica são expressos como uma porcentagem da quantidade total de composto restante após 30 min.
7.6. Estabilidade dos hepatócitos
[00709] Os modelos para avaliar a depuração metabólica no hepa- tócito são descritos por McGinnity e col. Drug Metabolism e Disposition 2008, 32, 11, 1247.
7.7. Permeabilidade de Caco2
[00710] Os ensaios de Caco-2 bidirecionais são efetuados conforme descrito abaixo. As células Caco-2 são obtidas da European Collection of Cell Cultures (ECACC, cat 86010202) e usadas após uma cultura de células de 21 dias em placas de 24 poços Transwell (Fisher TKT-545-020B).
[00711] 2x105 células/poço são semeadas em meio de preparação consistindo em DMEM + GlutaMAXI + 1% de NEAA + 10% de FBS (FetalClone II) + 1% de Pen/Strep. O meio é trocado a cada 2 - 3 dias.
[00712] Os compostos de teste e de referência (propranolol e ro- damina123 ou vimblastina, todos adquiridos da Sigma) são preparados em Solução de Sal Balanceada de Hanks contendo 25 mM de HEPES (pH 7,4) e adicionados às câmaras apicais (125 μL) ou basolaterais (600 μL) da unidade de placa Transwell, em uma concentração de 10 μM, com uma concentração final de DMSO de 0,25%.
[00713] 50 μM de Amarelo Lúcifer (Sigma) são adicionados ao tam pão doador em todos os poços, para avaliar a integridade das camadas de células por monitoramento da permeação do Amarelo Lúcifer. Visto que o Amarelo Lúcifer (LY) não pode permear livremente as barreiras lipofílicas, um alto grau de transporte do LY indica a fraca integridade da camada de células.
[00714] Após uma incubação de 1 h, a 37°C, enquanto se agita em um agitador orbital, a 150 rpm, alíquotas de 70 μL são obtidas de ambas as câmaras apicais (A) e basais (B) e adicionadas a 100 μL de uma solução a 50:50 de acetonitrila:água contendo o padrão interno analítico (0,5 μM de carbamazepina), em uma placa de 96 poços.
[00715] O Amarelo lúcifer é medido com um Spectramax Gemini XS (Ex 426 nm e Em 538 nm), em uma placa de 96 poços limpa contendo 150 μL de líquido a partir do lado basolateral e apical.
[00716] As concentrações do composto nas amostras são medidas por cromatografia líquida de alto desempenho/espectroscopia de massa (LC-MS/MS).
[00717] Os valores da permeabilidade aparente (Papp) são calcula- dos a partir da relação: Papp = [composto]receptor final x Vreceptor / ([composto]doador inicial x Vdoador) / Tinc x Vdoador / área de superfície x 60 x 10-6 cm/s
[00718] V = volume da câmara
[00719] Tinc = tempo de incubação.
[00720] Área de superfície = 0,33 cm2
[00721] As razões de efluxo, como uma indicação do efluxo ativo a partir da superfície celular apical, são calculadas usando a razão de Papp B>A/ Papp A>B.
[00722] São usados os seguintes critérios de aceitação do ensaio:
[00723] Propranolol: valor de Papp (A>B) 20(x10-6 cm/s)
[00724] Rodamina 123 ou Vimblastina: valor de Papp (A>B) < 5 (x10- 6 cm/s) com Razão de efluxo >5.
[00725] Permeabilidade do Amarelo lúcifer: <100 nm/s
7.8. Permeabilidade MDCKII-MDR1
[00726] As células MDCKII-MDR1 são células epiteliais dos rins caninos de Madin-Darby, superexpressando o gene da resistência a múltiplos fármacos humano (MDR1), codificando para a P-glicoproteína (P-gp). As células são obtidas do Netherlands Cancer Institute e usadas após uma cultura de células de 3-4 dias, em placas de inserções de cultura de células de 24 poços Millicel (Millipore, PSRP010R5). O ensaio de permeabilidade de MDCKII-MDR1 bidirecional é efetuado conforme descrito abaixo.
[00727] 3x105 células/mL (1,2x105 células/poço) são semeadas em meio de preparação consistindo em DMEM + 1% de Glutamax-100 + 1% de Antibiótico/Antimicótico + 10% de FBS (Biowest, S1810). As células são deixadas em incubadora de CO2 por 3-4 dias. O meio é trocado 24 h após a semeadura e no dia do experimento.
[00728] Os compostos de teste e de referência (amprenavir e propranolol) são preparados em solução salina com tampão de fosfato da Dulbecco (D-PBS, pH 7,4) e adicionados às câmaras apicais (400 μL) ou basolaterais (800μL) da unidade de placas de inserções de cultura de células Millicell, em uma concentração final de 10 μM (0,5 μM no caso do amprenavir), com uma concentração final de DMSO de 1%.
[00729] 100 μM de Amarelo Lúcifer (Sigma) são adicionados a to das as soluções de tampões doadores, para avaliar a integridade das monocamadas de células, monitorando-se a permeação do Amarelo Lúcifer. O Amarelo lúcifer é um marcador fluorescente para a via pa- racelular e é usado como um controle interno em cada monocamadas para verificar a integridade da articulação firme durante o ensaio.
[00730] Após uma incubação de 1 h a 37°C, enquanto se agita em um agitador orbital a 150 rpm, alíquotas de 75 μL são obtidas de ambas as câmaras apicais (A) e basais (B) e adicionadas a 225 μl de solução de acetonitrila:água (2:1) contendo padrão interno analítico (10 ng/mL de warfarina), em uma placa de 96 poços. A divisão em alíquotas é também efetuada no início do experimento a partir de soluções doadoras, para obter uma concentração inicial (Co).
[00731] A concentração do composto nas amostras é medida por cromatografia líquida de alto desempenho/espectroscopia de massa (LC-MS/MS).
[00732] O Amarelo lúcifer é medido com um Fluoroscan Ascent FL Thermo Scientific (Ex 485 nm e Em 530 nm), em uma placa de 96 poços contendo 150 μL de líquido de todos os poços recebedores (lado basolateral ou apical).
7.9. Estudo farmacocinético em roedores 7.9.1. Animais
[00733] Os ratos Sprague-Dawley (machos, 5-6 semanas de idade) são obtidos de Janvier (França). Os ratos são aclimatizados por pelo menos 7 dias antes do tratamento e são mantidos sobre um ciclo de luz/escuridão de 12 h (0700 - 1900). A temperatura é mantida em aproximadamente 22°C, e alimento e água são forneci dos ad libitum. Dois dias antes da administração dos compostos de teste, os ratos so-freram cirurgia para colocar um cateter na veia jugular, sob anestesia de isoflurano. Após a cirurgia, os ratos são alojados individualmente. Os ratos são privados de alimento por pelo menos 16 h antes da dosagem oral e 6 h depois. A água é fornecida ad libitum.
7.9.2. Estudo farmacocinético
[00734] Os compostos são formulados em PEG200/solução salina fisiológica (60/40) para a rota intravenosa e em 0,5% de metilcelulose e 10% de hidroxilpropil-β-ciclodextrina pH 3 para a rota oral. Os compostos de teste são dosados oralmente como uma única gavagem esofágica, a 5 mg/kg, sob um volume de dosagem de 5 mL/kg e dosados intravenosamente como um bolo por meio da veia caudal, a 1 mg/kg, sob um volume de dosagem de 5 mL/kg. Cada grupo consistia em 3 ratos. As amostras de sangue são coletadas por meio da veia jugular, com a lítio heparina como anticoagulante, nos pontos de tempo a seguir: 0,05, 0,25, 0,5, 1, 3, 5 e 8 h (rota intravenosa), e 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 8 e 24 h (rota oral). Alternativamente, as amostras de sangue são coletadas no seio retro-orbital, com a lítio heparina como anticoa- gulante, nos seguintes pontos de tempo 0,25, 1, 3 e 6 h (rota oral). As amostras de sangue integral são centrifugadas a 5000 rpm, por 10 min, e as amostras de plasma resultantes são armazenada a -20°C pendendo análise.
7.9.3. Quantificação dos níveis de composto no plasma
[00735] As concentrações no plasma de cada composto de teste são determinadas por um método de LC-MS/MS, em que o espectrô- metro de massa é operado no modo de eletropulverização positivo.
7.9.4. Determinação dos parâmetros farmacocinéticos
[00736] Os parâmetros farmacocinéticos são calculados usando Winnonlin® (Pharsight®, Estados Unidos).
7.10. Estudo da toxicidade em rato por 7 dias
[00737] Um estudo da toxicidade oral por 7 dias com os compostos de teste é efetuado em ratos machos Sprague-Dawley, para avaliar o seu potencial tóxico e a toxicocinética, em doses diárias de 100, 300 e 500 mg/kg/dia, por gavagem, no volume de dosagem constante de 5 mL/kg/dia.
[00738] Os compostos de teste são formulados em 30% (v/v) de HPβCD, em água purificada. Cada grupo incluía 5 ratos machos principais, assim como 3 animais satélites para a toxicocinética. Um quarto grupo recebe 30% (v/v) de HPβCD em água somente, na mesma frequência, volume de dosagem e pela mesma rota de administração, e atuou como o grupo de controle de veículo.
[00739] O objetivo do estudo é determinar a menor dose que resultasse em nenhum evento adverso sendo identificado (nenhum nível de efeito adverso observável - NOAEL).
7.11. Responsabilidade pelo prolongamento de QT
[00740] O potencial para o prolongamento de QT é avaliado no ensaio de fixação da membrana de hERG
[00741] Os registros da fixação da membrana da célula inteira são efetuados usando um amplificador EPC10 controlado pelo software Pulse v8.77 (HEKA). A resistência em série é tipicamente menos do que 10 MQ e compensada por mais do que 60%, os registros não são subtraídos da fuga. Os eletrodos são fabricados de vidro de pipeta GC150TF (Harvard).
[00742] A solução de banho externa continha: 135 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de Glicose, 10 mM de HEPES, pH 7,4.
[00743] A solução da pipeta da membrana interna continha: 100 mM de gliconato de K, 20 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de Na2ATP, 2 mM de Glutationa, 11 mM de EGTA, 10 mM de HEPES, pH 7,2.
[00744] Os fármacos são espalhados usando um Sistema de perfu- são rápida de MEV-9/EVH-9 da Biologic.
[00745] Todos os registros são efetuados sobre células HEK293 estavelmente expressando os canais de hERG. As células são cultivadas sobre lamínulas redondas de 12 mm (German glass, Bellco), fixadas na câmara de registro usando dois bastões de platina (Goodfellow). As correntes de hERG são despertadas usando um pulso ativa- dor até +40 mV por 1000 ms, seguido por um pulso de corrente de extremidade até -50 mV por 2000 ms, o potencial de retenção é -80 mV. Os pulsos são aplicados a cada 20 s e todos os experimentos são efetuados na temperatura ambiente.
OBSERVAÇÕES FINAIS
[00746] Será apreciado por aqueles versados na técnica que as descrições precedentes são de natureza ilustrativa e explanatória, e pretendidas para ilustrar a invenção e as suas modalidades preferidas. Através de experimentação de rotina, um técnico reconhecerá as mo-dificações e as variações aparentes que podem ser feitas, sem sair do espírito da invenção. Pretende-se que todas as tais modificações que fazem parte do escopo das reivindicações anexas sejam incluídas na mesma. Desse modo, pretende-se que a invenção seja definida não somente pela descrição acima mencionada, porém pelas reivindicações a seguir e os seus equivalentes.
[00747] Todas as publicações, incluindo, porém não limitadas às, patentes e pedidos de patentes, citadas neste relatório descritivo são incorporadas neste documento por referência, como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser in-corporada por referência neste documento como se totalmente apre-sentada.
[00748] Deve ser entendido que fatores, tais como a capacidade de penetração na célula diferencial dos diversos compostos, podem con-tribuir para as discrepâncias entre a atividade dos compostos nos ensaios bioquímicos e celulares in vitro.
[00749] Pelo menos alguns dos nomes químicos do composto da invenção, como dados e apresentados neste pedido, podem ter sido gerados sobre uma base automatizada, por uso de um programa de software de nomenclatura química comercialmente disponível, e não terem sido independentemente verificados. Os programas representativos que efetuam esta função incluem a ferramenta de nomenclatura Lexichem, vendida pela Open Eye Software, Inc., e a ferramenta Auto- nom Software, vendida pela MDL, Inc. Na situação onde o nome químico indicado e a estrutura representada diferirem, a estrutura representada comandará.
REFERÊNCIAS
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[00751] Bush, K.A., Farmer, K.M., Walker, J.S., Kirkham, B.W., 2002. Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein. Arthritis Rheum. 46, 802-805. doi:10.1002/art.10173
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Claims (16)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula I:
Figure img0118
na qual R1 é H, ou Me; Li é -NR2-; -O-, ou -CH2-; Cy é fenila, ou heteroarila monocíclica ou bicíclica fundida de 5-9 elementos compreendendo i a 4 heteroátomos independentemente selecionados a partir de N, O, e S; R2 é H, ou Ci-4 alquila; R3 é H, halogênio, Ci-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais halogênio, ou Ci-4 alcóxi opcionalmente substituído com um ou mais halogênio; R4 é H, ou halogênio; R5 é -CN, halogênio, ou é -L2-R6; - L2 está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, - SO2-, -SO2NR7-, ou -NR7SO2-; R6 é H, ou Ci-6 alquila opcionalmente substituída com um ou mais grupos R8 independentemente selecionados; R7 é H, ou Ci-4 alquila; R8 é OH, CN, halogênio, ou Ci-4 alcóxi, La está ausente, ou é -C(=O)-, -C(=O)O-, ou -C(=O)NH-; Ra é: - H, - Ci-4 alquila opcionalmente substituída com um ou mais Rb independentemente selecionado, - C3-7 cicloalquila monocíclica opcionalmente substituída com um ou mais Rc independentemente selecionado, ou - heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S, ou - heteroarila monocíclica de 5-6 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S; Rb é - halogênio, - CN, - OH, - C1-4 alcóxi, - C3-7 cicloalquila, - heterocicloalquila monocíclica de 4-7 elementos compreendendo um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de O, N, e S (heterocicloalquila esta que é opcionalmente substituída com um ou mais halogênio, ou oxo independentemente selecionado) - -SO2-C1-4 alquila, ou - -C(=O)NRb1Rb2 Rc é - halogênio, - CN, - OH, - C1-4 alquila, - -C(=O)OH, ou - -C(=O)NRc1Rc2; e cada Rb1, Rb2, Rc1 e Rc2 é independentemente selecionado a partir de H, e C1-4 alquila, ou um sal farmaceuticamente aceitável,.
2. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 é Me.
3. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é como definido na Fórmula IIa, IIb, ou IIc:
Figure img0119
nas quais L1, R3, R4, La, Ra e R5 são como definidos na reivindicação 1.
4. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é como definido na Fórmula IVa, IVb, IVc, IVd, IVe ou IVf:
Figure img0120
nas quais R3, R4, R5, La, e Ra são como definidos na reivindicação 1.
5. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é como definido na Fórmula Va, Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf:
Figure img0121
nas quais R3, R4, R5, La, e Ra são como definidos na reivindicação 1.
6. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que R4 é H, F, ou Cl.
7. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que R3 é H, Metila, ou Etila.
8. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que R5 é CN, F, Cl, -SO2Metila ou -SO2Etila.
9. Composto ou sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que Ra é:
Figure img0122
10. Composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é a (1R,2R)-N-[6-[(6-ciano-4-metil-3-piridil)óxi]-1-metil-benzimidazol-4-il]-2- flúor-ciclopropanocarboxamida.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade farmaceuticamente eficazeficaz de um composto, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende um agente terapêutico adicional.
13. Composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizados pelo fato de que são para uso em medicamento.
14. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizados pelo fato de que são para uso no tratamento, ou na profilaxia, de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um agente para o tratamento de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas da cartilagem, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons.
16. Uso de um composto, ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento, ou profilaxia de doenças alérgicas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças proliferativas, rejeição ao transplante, doenças envolvendo a deficiência da renovação da cartilagem, malformações congênitas das cartilagens, e/ou doenças associadas com a hipersecreção de IL6 ou a hipersecreção de interferons.
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