ES2228451T3 - Promotores de condrogenesis y derivados de indolin-2-ona. - Google Patents

Promotores de condrogenesis y derivados de indolin-2-ona.

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ES2228451T3 ES00901903T ES00901903T ES2228451T3 ES 2228451 T3 ES2228451 T3 ES 2228451T3 ES 00901903 T ES00901903 T ES 00901903T ES 00901903 T ES00901903 T ES 00901903T ES 2228451 T3 ES2228451 T3 ES 2228451T3
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Hidetomo Chugai Seiyaku K.K. KITAMURA
Atsuhiko Chugai Seiyaku K.K. Kato
Toru Chugai Seiyaku K.K. Esaki
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Abstract

Uso de un compuesto seleccionado de **fórmula** en donde R1 representa halógeno, alquilo C1-6, alcoxi C1-6, hidroxilo, nitro, trifluorometilo, alquiltio C1-6, acilo, carboxilo, mercapto o amino; R2 representa hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, alcoxi C1- 6, acilo, arilo o un grupo heterocíclico; R3 representa un grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, cicloalquilo C3-8, arilo o un grupo heterocíclico; R4 representa hidrógeno, un grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, arilo o un grupo heterocíclico, -OR5, -SR5, -NR6R7 en donde R5, R6 y R7 pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno, un grupo alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, cicloalquilo C3-8, arilo, alcoxi C1-6 o un grupo heterocíclico, amino, y R6 y R7 pueden juntos formar un grupo -(CH2)m- ó -(CH2)lNR8(CH2)k- en donde k, l y m cada uno representa un número entero de 1-8 y R8 representa hidrógeno o un grupo alquilo C1-6; o R4 es un grupo (4-(N, N-dimetilamino)fenil)amino; el grupo heterocíclico para cualquiera de R2-R7 se selecciona de piridilo, furilo, tienilo, imidazolilo, pirazinilo y pirimidilo, o una de sus sales para la fabricación de un medicamento eficaz como promotor de la condrogénesis, un agente de reparación de cartílago o un promotor de la reparación de fractura de huesos.

Description

Promotores de condrogénesis y derivados de indolin-2-ona.
Campo técnico
La presente invención se refiere a derivados de indolin-2-ona farmacéuticamente útiles o sus sales, y a promotores de condrogénesis, agentes de reparación de cartílago y reactivos de diagnóstico de cartílago que contienen derivados de indolin-2-ona o sus sales farmacéuticamente aceptables.
Antecedentes técnicos
El cartílago del cuerpo generalmente consiste en condrocitos y fibrocitos, que son células especializadas del tejido conjuntivo, y una matriz amorfa similar a gel en la cual están empotrados, y forma parte del tejido de soporte del cuerpo.
En los animales de sangre caliente, incluyendo los seres humanos, el cartílago forma el esqueleto, las articulaciones, la tráquea, el pabellón auricular, la nariz y similares. Es decir, realiza un papel central en funciones que son indispensables para la supervivencia de los animales de sangre caliente, incluyendo la acción como molde para el hueso durante el crecimiento (cartílago de crecimiento), y que contribuye al movimiento suave de las articulaciones (cartílago articular), la respiración (cartílago traqueal, cartílago nasal) y la audición (cartílago auricular). Por tanto, la degeneración o destrucción de estos tipos de cartílago causa diversos grados de perjuicio al cuerpo dependiendo del sitio y de la gravedad de la degeneración o la destrucción.
Por ejemplo, entre las funciones antes mencionadas en las que desempeña un papel importante el cartílago (crecimiento, articulaciones, respiración, audición, etc.), el movimiento suave de las articulaciones se ve particularmente perjudicado por la degeneración o destrucción del cartílago articular en estados tales como la artritis reumatoide crónica u osteoartritis. La degeneración o destrucción del cartílago articular se cree que es la causa principal de la dificultad de caminar que resulta de dichas enfermedades.
Las perspectivas de suprimir la degeneración o destrucción articular o de promover la condrogénesis ha dado lugar a un posible método de tratar estados tales como la artritis reumatoide crónica y la osteoartritis (J. Rheum. 22(1), Suppl. 43:136-139, 1995, Lab. Invest. 78(2):133-142).
Se sabe que diversas sustancias diferentes derivadas del organismo y otras sustancias de bajo peso molecular tienen efectos de promover la condrogénesis o de inducir la proliferación de condrocitos. Las sustancias que se han descrito que tienen efectos promotores de la condrogénesis incluyen factores de crecimiento, tal como TGF-\beta (factor de crecimiento transformante \beta), BMP-2 (J. Bone Joint Surg. 79-A(10):1452-1463, 1997), concanavalina A que es un tipo de lectina (J. Biol. Chem., 265:10125-10131, 1990), y osteogenina (BMP-7), así como sustancias de bajo peso molecular, tales como derivados de la vitamina D (1\alpha, 25-D_{3}) (Cancer Res., 49:5435-5442, 1989), derivados de vitamina A (ácido retinoico) (Dev. Biol., 130:767-773, 1988), vanadatos (J. Cell. Biol., 104:311-319, 1987), benzamidas (J. Embryol. Exp. Morphol., 85:163-175, 1985), bencil-\beta-D-xilósido (Biochem. J., 224:977-988, 1984), triyodotironinas (T_{3}) (Endocrinology, 111:462-468, 1982), derivados de prostaglandina (PGE_{2}, U44069) (Prostaglandin, 19:391-406, 1980), dbcAMP (J. Cell. Physiol., 100:63-76, 1979) y 8-Br-cAMP (J. Cell. Physiol., 100:63-76, 1979).
De estas sustancias derivadas del organismo y de sustancias de bajo peso molecular, el TGF-\beta sigue siendo el más prometedor como agente de tratamiento útil, y del TGF-\beta_{1}, que es una isoforma del TGF-\beta, se ha descrito que promueve la condrogénesis cuando se administra por vía intraarticular (Lab. Invest. 71(2):279-290, 1994). También, puesto que el TGF-\beta_{1} suprime la pérdida inducida por artritis de proteoglicanos en el cartílago articular, o dicho diferentemente, inhibe la destrucción del cartílago articular debido a su efecto anabólico sobre el cartílago articular cuando se administra por vía intraarticular en modelos de animales experimentales con la artritis inducida, se ha sugerido su posibilidad como agente de tratamiento útil para enfermedades articulares, tales como el reumatismo (Lab. Invest. 78(2):133-142, 1998).
Sin embargo, incluso se ha descrito que el TGF-\beta, que sigue siendo el agente de tratamiento útil más prometedor, provoca sinovitis, aún cuando promueve al mismo tiempo la condrogénesis, y por tanto esto plantea un problema importante para su uso como agente de tratamiento para las enfermedades articulares (Lab. Invest. 78(2):279-290, 1994), por cuya razón no se ha aplicado en la clínica como un agente de tratamiento para estos estados. En resumen, por tanto, no existe una terapia práctica con agente de tratamiento que esté basada en promover la condrogénesis.
Descripción de la invención
Es un objeto de la presente invención superar los inconvenientes antes mencionados de la técnica anterior proporcionando un agente promotor de la condrogénesis y de reparación del cartílago que sea capaz de promover la condrogénesis o inducir la proliferación de condrocitos.
Otro objeto de la invención es proporcionar un reactivo con acción promotora de la condrogénesis que sea útil en la investigación biológica, física o química referente al cartílago.
Incluso otro objeto de la invención es proporcionar derivados de indolin-2-ona que sean útiles como promotores de la condrogénesis.
Es incluso todavía otro objeto de la invención proporcionar derivados de indolin-2-ona que sean útiles como promotores de la reparación de fractura de huesos.
Como resultado de una investigación intensa dirigida a conseguir estos objetos los autores del presente invento han completado la presente invención con el descubrimiento de que los derivados de indolin-2-ona que tienen una estructura específica exhiben un efecto promotor de la condrogénesis.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un compuesto seleccionado de:
(A) compuestos de la fórmula (I)
1
en donde
R^{1}
representa halógeno, alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, hidroxilo, nitro, trifluorometilo, alquiltio C_{1-6}, acilo, carboxilo, mercapto o amino;
R^{2}
representa hidrógeno o alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, alquenilo C_{2-6}, alquinilo C_{2-6}, alcoxi C_{1-6}, acilo, arilo o un grupo heterocíclico;
R^{3}
representa un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, cicloalquilo C_{3-8}, arilo o un grupo heterocíclico;
R^{4}
representa hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, arilo o un grupo heterocíclico, -OR^{5}, -SR^{5}, -NR^{6}R^{7} en donde R^{5}, R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, cicloalquilo C_{3-8}, arilo, alcoxi C_{1-6} o un grupo heterocíclico, amino, y R^{6} y R^{7} pueden juntos formar un grupo -(CH_{2})_{m}- o -(CH_{2})_{l}NR^{8}(CH_{2})_{k}- en donde k, l y m cada uno representa un número entero de 1-8 y R^{8} representa hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}; o R^{4} es un grupo (4-(N,N-dimetilamino)-fenil)amino;
\quad
el grupo heterocíclico para cualquiera de R^{2}-R^{7} se selecciona de piridilo, furilo, tienilo, imidazolilo, pirazinilo y pirimidilo;
\quad
el sustituyente opcional se selecciona de halógeno, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-8}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con un átomo de halógeno, ariloxi, alquiltio C_{1-6}, un grupo heterocíclico tal como se ha definido anteriormente, formilo opcionalmente protegido en forma de un acetal, alquil C_{1-6}-carbonilo, arilcarbonilo, carboxilo, alcoxi C_{1-6}-carbonilo, amino, alquilamino C_{1-6}, imino, tioacetal, nitro, nitrilo y trifluorometilo.
X e Y
pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa -CH_{2}-, -NH- u -O-, y
n
es un número entero de 0-4; y
(B) compuestos de la fórmula (I), en la que X es -NH-, n es 0, y los sustituyentes restantes se definen como sigue:
2
o una de sus sales para la fabricación de un medicamento eficaz como promotor de la condrogénesis, un agente de reparación de cartílago o un promotor de la reparación de fractura de huesos.
De acuerdo con otro aspecto la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula (IV):
4
en donde R^{12} representa alquilo C_{1-6} sustituido en el mismo carbono con dos grupos alcoxi C_{1-6} cada uno sustituido con 1-5 átomos de halógeno, o una de sus sales.
Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un compuesto de la fórmula general (IV) anterior, o una de sus sales, así como el uso de un compuesto de fórmula (IV), o una de sus sales, para la fabricación de un medicamento eficaz como promotor de la condrogénesis, un agente de reparación de cartílago o un promotor de la reparación de fracturas de huesos.
Aún más, la presente invención proporciona un método para la producción ex-vivo de una composición que contiene condrocitos, que comprende cultivar condrocitos o células mesenquimales no diferenciadas en presencia de un compuesto de fórmula (I) o (IV), o una de sus sales.
Además, la presente invención proporciona una composición que contiene condrocitos obtenibles por este método.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido auricular doblemente teñido con hematoxilina/eosina, de una rata después de la administración oral repetida de un vehículo de control (goma arábiga al 3%) durante 4 semanas, y la Figura 1B es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido auricular doblemente teñido con hematoxilina/eosina, de una rata después de la administración oral repetida del compuesto A (2 g/kg) durante 4 semanas.
La Figura 2A es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de tráquea doblemente teñido con hematoxilina/eosina, de una rata después de la administración por vía oral repetida de un vehículo de control (goma arábiga al 3%) durante 4 semanas, y la Figura 2B es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de tráquea doblemente teñido con hematoxilina/eosina, de una rata después de la administración repetida por vía oral del compuesto A (2 g/kg) durante 4 semanas.
La Figura 3A es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de proceso xifoide del esternón doblemente teñido con hematoxilina/eosina de una rata, después de la administración repetida por vía oral de un vehículo de control (goma arábiga al 3%) durante 4 semanas, y la Figura 3B es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de proceso xifoide del esternón doblemente teñido con hematoxilina/eosina, de una rata después de la administración repetida por vía oral del compuesto A (2 g/kg) durante 4 semanas.
La Figura 4A es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de la articulación de la rodilla doblemente teñido con hematoxilina/eosina de una rata, después de la administración repetida por vía oral de un vehículo de control (goma arábiga al 3%) durante 4 semanas, y la Figura 4B es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de la articulación de la rodilla doblemente teñido con hematoxilina/eosina, de una rata después de la administración repetida por vía oral de un compuesto A (2 g/kg) durante 4 semanas.
La Figura 5A es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido (disco) de la espina lumbar doblemente teñido con hematoxilina/eosina,de una rata después de la administración repetida por vía oral de un vehículo de control (goma arábiga al 3%) durante 4 semanas, y la Figura 5B es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido (disco) de la espina lumbar doblemente teñido con hematoxilina/eosina de una rata, después de la administración repetida por vía oral de un compuesto A (2 g/kg) durante 4 semanas.
La Figura 6 es una gráfica de la anchura de la articulación femoral de la rodilla de una rata después de la administración repetida del compuesto A (1,0 mmol/L) de un vehículo de control (solución salina fisiológica en DMSO al 50%) a 50 \muL por día en la articulación de la rodilla durante 3 semanas.
La Figura 7A es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de la articulación femoral de la rodilla teñido con safranina O de una rata, después de la administración repetida por vía oral de un vehículo de control (solución salina fisiológica en DMSO al 50%) a 50 \muL por día en la articulación de la rodilla durante 3 semanas, y la Figura 7B es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido de la articulación femoral de la rodilla teñido con safranina O al 0,3% de una rata, después de la administración repetida del compuesto A (1,0 mmol/L) a 50 \muL por día en la articulación de la rodilla durante 3 semanas.
La Figura 8 es una gráfica que muestra la captación de ácido sulfúrico marcado con ^{35}S por glicosaminoglicanos en condrocitos articulares de cultivos primarios de ratas a los cuales se añadió el compuesto A o un vehículo de control (etanol a una concentración final del 1% en el medio).
La Figura 9 es una gráfica que muestra la captación de timidina marcada con ^{3}H en condrocitos articulares de cultivos primarios de ratas a los cuales se añadió el compuesto A o un vehículo de control (etanol al 1% de concentración final en el medio).
La Figura 10A es una fotomicrografía que presenta células CL-1 confluentes teñidas doblemente con azul alcian/aceite rojo O después de la adición de un vehículo de control (etanol al 1% de concentración final en el medio) y cultivo durante 7 días, y la Figura 10B es una fotomicrografía que presenta células CL-1 confluentes teñidas doblemente con azul alcian/aceite rojo O después de la adición del compuesto A (10 \mumol/L de concentración final en el medio) y cultivo durante 7 días.
La Figura 11 es una gráfica que presenta la captación de ácido sulfúrico marcado con ^{35}S en células CL-1 confluentes durante las 24 horas finales del cultivo de las células CL-1 durante 48 horas, en un medio que contenía los compuestos A y F a concentraciones finales de 1,5 y 10 \mumol/L, los compuestos B y E a una concentración final de 10 \mumol/L o un vehículo de control con una concentración final de etanol al 1%.
La Figura 12 es una gráfica que presenta la captación de ácido sulfúrico marcado con ^{35}S en células CL-1 confluentes durante las 24 horas finales del cultivo de las células CL-1 durante 48 horas, en un medio que contenía los compuestos A, C, D y G a concentraciones finales de 10 \mumol/L o un vehículo de control con una concentración final de etanol al 1%.
La Figura 13A y la Figura 13B son gráficas que presentan los resultados del examen histológico de reparación de cartílago en zonas deficientes de la superficie patelar femoral de ratas en las cuales fueron creadas las zonas deficientes que llegaban hasta la médula, y a las que se le administró repetidamente el compuesto A (1,0 mmol/L) o un vehículo de control (solución salina fisiológica en DMSO al 50%) a 50 \muL por día durante 3 semanas empezando el 7º día después de la operación. La Figura 13A muestra las puntuaciones de la morfología celular, la tinción de la matriz y el espesor del cartílago, y la Figura 13B muestra las puntuaciones totales.
La Figura 14A es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido teñido con safranina O al 0,3% de una zona deficiente creada en la superficie patelar femoral que alcanzaba hasta la médula de una rata, a la que se administró repetidamente por vía intraarticular un vehículo de control (solución salina fisiológica en DMSO al 50%) a 50 \muL por día durante 3 semanas comenzando el 7º día después de la operación, y la Figura 14B es una fotomicrografía que presenta una muestra de tejido teñido con safranina O al 0,3% de una zona deficiente creada en la superficie patelar femoral que alcanzaba hasta la médula de una rata, a la que se administró repetidamente por vía intraarticular el compuesto A (1,0 mmol/L) a 50 \muL por día durante 3 semanas comenzando el 7º día después de la operación.
La Figura 15A es un conjunto de fotomicrografías electrónicas de barrido que presentan conejos menisectomizados parcialmente a los que se administró repetidamente por vía intraarticular un vehículo de control (solución salina fisiológica en DMSO al 50%) a 500 \muL por día durante 3 semanas comenzando el 7º día después de la operación; y la Figura 15B es un conjunto de fotomicrografías electrónicas de barrido que muestran conejos parcialmente menisectomizados a los que se administró repetidamente por vía intraarticular el compuesto A (3,0 mmol/L) a 500 \muL por día durante 3 semanas comenzando el 7º día después de la operación. Las Figuras 15A y 15B ambas contienen fotomicrografías de 6 individuos.
Las Figuras 16A, 16B y 16C son gráficas que muestran la zona superficial del cartílago auricular dañada en fotomicrografías electrónicas de barrido de conejos parcialmente menisectomizados a los que se administró por vía intraarticular repetidamente el compuesto A (3,0 mmol/L) y un vehículo de control (solución salina fisiológica con DMSO al 50%) a 500 \muL por día, durante 3 semanas comenzando el 7º día después de la operación. La Figura 16A muestra el área media de las lesiones moderadas, la Figura 16B muestra el área media de las lesiones intermedias y la Figura 16C muestra el valor medio del área de la lesión total como la suma de las áreas de lesiones ligeras e intermedias.
Las Figuras 17A y 17B son gráficas que muestran los resultados del examen histológico de muestras teñidas con safranina O al 0,3% de lesiones en escisiones parciales en forma de medias lunas articulares de conejos a los que se administró repetidamente por vía intraarticular el compuesto A (3,0 mmol/L) y un vehículo de control (solución salina fisiológica en DMSO al 50%) a 500 \muL por día durante 3 semanas empezando el 7º día después de la operación. La Figura 17A muestra las puntuaciones para la pérdida de la capa superficial, la ulceración o erosión, la fibrilación y la formación de aglomeraciones, y la Figura 17B muestra la puntuación en la determinación global.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
La presente invención se explicará ahora con mayor detalle con referencia a los dibujos adjuntos cuando sea apropiado. Las cantidades indicadas como "partes" y "%" en las explicaciones siguientes se basan en el peso a menos que se especifique otra cosa.
Un promotor de la condrogénesis o un agente de reparación de cartílago de acuerdo con la invención comprende como ingrediente activo un compuesto representado por la fórmula general (I) antes mencionada o una de sus sales.
Los compuestos representados por la fórmula general (I) se describen en la Solicitud de Patente Internacional WO 94/19322 y la misma publicación de patente enseña que los compuestos son antagonistas del receptor de CCK-B/gastrina. Los autores del presente invento han encontrado que los compuestos representados por la fórmula general (I) tienen un inesperado efecto promotor de la condrogénesis, y la presente invención se ha completado sobre la base de este descubrimiento. Los compuestos representados por la fórmula general (I) se pueden obtener por el método descrito en la Publicación de Patente Internacional antes mencionada o por el método ilustrado a continuación en los ejemplos.
Un "átomo de halógeno" de acuerdo con esta invención es un átomo de flúor, un átomo de cloro, un átomo de bromo o un átomo de yodo.
Un "grupo alquilo C_{1-6}" de acuerdo con la invención es un grupo alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos, tal como un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n-propilo, un grupo i-propilo, un grupo n-butilo, un grupo s-butilo, un grupo t-butilo, un grupo pentilo o un grupo hexilo.
Un "grupo alquenilo C_{2-6}" es un grupo alquenilo lineal o ramificado de 2 a 6 carbonos, tal como un grupo vinilo, un grupo alilo, un grupo butenilo, un grupo pentenilo o un grupo hexenilo.
Un "grupo alquinilo C_{2-6}" es un grupo alquinilo lineal o ramificado de 2 a 6 carbonos, tal como un grupo etinilo, un grupo propinilo o un grupo butinilo.
Un "grupo alcoxi C_{1-6}" es un grupo alcoxi lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos, tal como un grupo metoxi, un grupo etoxi, un grupo n-propoxi, un grupo i-propoxi, un grupo n-butoxi, un grupo s-butoxi, un grupo t-butoxi o un grupo pentoxi o un grupo hexoxi.
Un grupo "acilo" es un grupo carbonilo sustituido con un átomo de hidrógeno o con un grupo alquilo con un sustituyente opcional, un grupo arilo con un sustituyente opcional, un grupo alcoxi con un sustituyente opcional o un grupo amino con un sustituyente opcional, por ejemplo, un grupo alquilcarbonilo tal como un grupo acetilo, un grupo propionilo, un grupo pivaloilo, un grupo ciclohexanocarbonilo o un grupo arilcarbonilo tal como un grupo benzoilo, naftoilo o un grupo toluilo.
Un "grupo arilo" es un grupo monovalente que es un hidrocarburo aromático menos un átomo de hidrógeno, tal como un grupo fenilo, un grupo tolilo, un grupo xililo, un grupo bifenilo, un grupo naftilo, un grupo antrilo o un grupo fenantrilo.
Un "grupo alquileno C_{1-6}" es un grupo alquileno lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos, tal como un grupo metileno, un grupo etileno, un grupo propileno, un grupo butileno, un grupo pentileno o un grupo hexileno.
Un "grupo cicloalquilo C_{3-8}" es un grupo hidrocarbonado saturado cíclico de 3 a 8 carbonos, tal como un grupo ciclopropilo, un grupo ciclobutilo, un grupo ciclopentilo, un grupo ciclohexilo o un grupo cicloheptilo. Y, los grupos cicloalquilo sustituidos incluyen un grupo mentilo, y un grupo adamantilo.
Un "grupo heterocíclico" es un grupo heterocíclico aromático con al menos un heteroátomo, tal como un grupo piridilo, un grupo furilo, un grupo tienilo, un grupo imidazolilo, un grupo pirazinilo o un grupo pirimidilo.
El grupo alquilo C_{1-6}, el grupo alquenilo C_{2-6}, el grupo alquinilo, el grupo alcoxi C_{1-6}, el grupo acilo, el grupo arilo, el grupo cicloalquilo C_{3-8} y el grupo heterocíclico antes mencionados pueden, si es necesario, estar sustituidos con uno o más sustituyentes. Como ejemplos dichos sustituyentes pueden ser un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo cicloalquilo C_{3-8}, un grupo arilo, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi C_{1-6} cuyo grupo alcoxi puede estar sustituido con un átomo de halógeno, un grupo ariloxi, un grupo alquiltio C_{1-6}, un grupo heterocíclico, un grupo formilo, el cual grupo formilo puede estar protegido en forma de un acetal, un grupo alquil C_{1-6}-carbonilo, un grupo arilcarbonilo, un grupo carboxilo, un grupo alcoxi C_{1-6}-carbonilo, un grupo amino, el cual grupo amino puede tener un grupo alquilo C_{1-6},
Un grupo imino, un grupo tioacetal, un grupo nitro, un grupo nitrilo o un grupo trifluorometilo.
Los compuestos que sirven como ingredientes activos en los promotores de la condrogénesis y los agentes de reparación de cartílago de la invención (derivados de indolin-2-ona representados por la fórmula general anterior (I)) se explicarán ahora con más detalle.
R^{1} representa un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo alcoxi C_{1-6}, un grupo hidroxilo, un grupo nitro, un grupo trifluorometilo, un grupo alquiltio C_{1-6}, un grupo acilo, un grupo carboxilo, un grupo mercapto o un grupo amino, y entre estos, R^{1} es preferiblemente un átomo de halógeno, un grupo alquilo C_{1-6}, un grupo alcoxi C_{1-6} o un grupo nitro.
El subíndice "n" representa un número entero de 0 a 4. Preferiblemente es 0 ó 1, y más preferiblemente 0.
R^{2} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional, un grupo alquenilo C_{2-6} con un sustituyente opcional, un grupo alquinilo C_{2-6} con un sustituyente opcional, un grupo alcoxi C_{1-6} con un sustituyente opcional, un grupo acilo con un sustituyente opcional, un grupo arilo con un sustituyente opcional o un grupo heterocíclico con un sustituyente opcional.
R^{2} es preferiblemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{2-6} con un sustituyente opcional, un grupo alquenilo C_{2-6} con un sustituyente opcional o un grupo arilo con un sustituyente opcional, y desde el punto de vista de la actividad como promotor de la condrogénesis o agente de reparación de cartílago es incluso más preferiblemente un grupo alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional que opcionalmente a su vez está sustituido con un átomo de halógeno.
Entre estos, R^{2} es aún más preferiblemente un grupo alquilo C_{1-6} sustituido en el mismo carbono con dos grupos alcoxi inferior que están opcionalmente sustituidos con 1-5 átomos de halógeno o el grupo -O-Z-O- en donde Z representa un grupo alquileno inferior opcionalmente sustituido con 1 a 10 átomos de halógeno, y aún más preferiblemente, un grupo representado por la fórmula general (II):
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5
en donde R^{10} y R^{11} pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa un grupo alquilo de C_{1-6} opcionalmente sustituido con 1-5 átomos de halógeno, siendo preferiblemente uno o ambos grupos alquilo C_{1-6} con 1-5 átomos de halógeno o la fórmula general (III)
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6
en donde Z representa un grupo alquileno C_{1-6} opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de halógeno.
R^{2} es más preferiblemente un grupo 2,2-dietoxietilo, un grupo 2,2-dimetoxietilo, un grupo 2,2-diisopropoxietilo, un grupo 2,2-bis(2-fluoroetoxi)etilo o un grupo 2,2-bis(2-cloroetoxi)etilo, entre los cuales son más preferidos un grupo 2,2-dietoxietilo y un grupo 2,2-bis(2-fluoroetoxi)etilo, y es particularmente preferido un grupo 2,2-dietoxietilo.
R^{3} representa un grupo alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional, un grupo cicloalquilo C_{3-8} con un sustituyente opcional, un grupo arilo con un sustituyente opcional, un grupo heterocíclico con un sustituyente opcional. R^{3} es preferiblemente un grupo alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional, un grupo cicloalquilo C_{3-8} con un sustituyente opcional o un grupo arilo con un sustituyente opcional, entre los cuales es particularmente preferido un grupo arilo con un sustituyente opcional. Preferido como sustituyente es un grupo alquilo C_{1-6} (preferiblemente un grupo metilo y un grupo etilo, y especialmente un grupo metilo) y un grupo amino que opcionalmente tiene un grupo alquilo C_{1-6} y es especialmente preferido para R^{3}un grupo 4-metilfenilo.
R^{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional, un grupo arilo con un sustituyente opcional, un grupo heterocíclico con un sustituyente opcional, -OR^{5}, -SR^{5} o -NR^{6}R^{7}. Aquí, R^{5}, R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno, o un grupo alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional, un grupo cicloalquilo C_{3-8} con un sustituyente opcional, un grupo arilo con un sustituyente opcional, un grupo heterocíclico con un sustituyente opcional, un grupo alcoxi C_{1-6} o un grupo amino, y R^{6} y R^{7} pueden formar juntos un grupo representado por -(CH_{2})_{m}- o -(CH_{x})_{l}NR^{8}(CH_{2})_{k}- en donde k, l y m representan un número entero de 1 a 8 y R^{8} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo.
R^{4} es preferiblemente un grupo alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional, un grupo arilo con un sustituyente opcional, un grupo heterocíclico con un sustituyente opcional o un grupo representado por -OR^{5} o -NR^{6}R^{7} en donde R^{5}, R^{6} y R^{7} son como se han definido previamente, y es más preferiblemente el grupo -NR^{6}R^{7} en donde R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo arilo con un sustituyente
opcional.
Entre estos, R^{4} es preferiblemente un grupo representado por -NR^{6}R^{7} en donde R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo arilo, el cual grupo arilo tiene un grupo alquilo C_{1-6} o un grupo amino el cual grupo amino opcionalmente tiene un grupo alquilo C_{1-6}, y es más preferiblemente un grupo representado por -NHR^{7} en donde R^{7} es un grupo 4-metilfenilo, un grupo 4-etilfenilo o un grupo 4-(N,N-dimetilamino)fenilo.
X e Y pueden ser iguales o diferentes y representan -CH_{2}-, -NH- u -O-, entre los cuales X es preferiblemente -CH_{2}-, -NH- u -O- e Y es preferiblemente -CH_{2}- o -NH-. Desde el punto de vista de la actividad como promotor de la condrogénesis o agente de reparación de cartílago, X e Y pueden ser iguales o diferentes y son preferiblemente -CH_{2}- o -NH-, y más preferiblemente, X es -NH- e Y es -CH_{2}-.
Los derivados de indolin-2-ona de la invención pueden emplearse en la forma de sales farmacéuticamente aceptables. Como ejemplos de dichas sales se pueden mencionar las sales inorgánicas, tales como las sales de ácido clorhídrico, sales de ácido bromhídrico, sales de ácido yodhídrico, sales de ácido sulfúrico y sales de ácido fosfórico; sales de ácidos orgánicos tales como sales de ácido succínico, sales de ácido malónico, sales de ácido acético, sales de ácido maleico, sales de ácido fumárico, sales de ácido cítrico, sales de ácido benzoico y sales de ácido salicílico; y sales metálicas tales como sales de sodio, sales de potasio y sales de magnesio.
Los derivados de indolin-2-ona de la invención pueden también ser formas ópticamente activas. Cuando se encuentran en formas ópticamente activas, la configuración absoluta en la posición 3 es preferiblemente la configuración R.
Como ejemplos de compuestos específicos que son derivados de indolin-2-ona de acuerdo con la invención se pueden mencionar los compuestos descritos en los ejemplos de la Solicitud de Patente Internacional WO 94/19322, así como los compuestos mencionados en los ejemplos de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349, concretamente, los compuestos números 1-201 enumerados en las Tablas siguientes (Tablas 1-9).
En las Tablas 1-9, R^{1}-R^{4}, X, Y y n tienen las mismas definiciones que para la fórmula general (I) anterior.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
7
TABLA 2
8
TABLA 3
9
TABLA 4
10
TABLA 5
11
TABLA 6
12
TABLA 7
13
TABLA 8
14
TABLA 9
15
Como ejemplos de compuestos específicos más adecuados como promotores de la condrogénesis y agentes de reparación de cartílagos de acuerdo con la invención se pueden mencionar los compuestos siguientes.
\newpage
(Compuesto A)
16
(Compuesto B)
17
(Compuesto C)
18
(Compuesto D)
19 
\newpage
(Compuesto E)
20
(Compuesto F)
21
(Compuesto G)
22
Como ejemplos de biometabolitos del compuesto A se pueden mencionar los compuestos H e I siguientes.
(Compuesto H)
23 
\newpage
(Compuesto I)
24
Los compuestos enumerados en las Tablas 1 a 9 pueden sintetizarse por el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349. De los compuestos A a G antes mencionados, los compuestos A a D pueden sintetizarse por el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349.
Los compuestos E, F y G se pueden sintetizar, por ejemplo, por la Ruta de Reacción A mostrada a continuación (correspondiente a la "Ruta de Reacción 6" de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349), empleando como material de partida el aldehído intermedio mencionado en los ejemplos de la presente solicitud, sintetizado de acuerdo con el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349.
(Ruta de reacción A)
25
El compuesto H mencionado anteriormente se puede sintetizar de acuerdo con la "Ruta de Reacción 7" en la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349. El compuesto I puede obtenerse por el procedimiento siguiente, bien sea en una forma racémica o en una forma ópticamente activa.
Específicamente, una forma racémica del compuesto I puede sintetizarse, por ejemplo, de acuerdo con la Ruta de Reacción B siguiente (correspondiente a la "Ruta de Reacción 5" en la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349), empleando un isocianato que tiene un grupo hidroxilo protegido con un grupo protector adecuado, (por ejemplo, un grupo sililo sustituido tal como un grupo trietilsililo, un grupo t-butildimetilsililo).
Una forma ópticamente activa del compuesto I puede sintetizarse, por ejemplo, de acuerdo con la Ruta de Reacción B (correspondiente a la "Ruta de Reacción 7" en la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349) empleando un isocianato que tiene un grupo hidroxilo protegido con un grupo protector adecuado (por ejemplo, un grupo sililo sustituido tal como un grupo trietilsililo o un grupo t-butildimetilsililo) o por separación óptica de una mezcla de estereoisómeros del compuesto I por un método bien conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, un método que emplea una columna ópticamente activa).
La identificación, la determinación de la estructura y la determinación de la pureza del compuesto obtenido puede conseguirse por métodos habituales (métodos espectroscópicos tales como RMN, IR, etc., y cromatografía de líquidos de alta resolución o similares).
(Ruta de reacción B)
26
Un promotor de la condrogénesis de acuerdo con la invención puede aplicarse para una variedad de usos sin ninguna restricción particular, en tanto que el efecto promotor de la condrogénesis pueda utilizarse eficazmente; es particularmente útil para el tratamiento de las condropatías que acompañan a las disfunciones del cartílago debido a degeneración o destrucción del cartílago, tratamiento del daño o ablación del cartílago debido a lesiones o cirugía, o tratamiento de hipoplasia o malformación congénitas del cartílago. Ejemplos de tales estados condropáticos incluyen osteoartritis, artritis reumatoide crónica, osteocondrosis diseccionante, daño del cartílago articular inducido por lesión y disco invertebral herniado. Ejemplos de hipoplasia o malformaciones congénitas del cartílago incluyen anotia y microtia.
Un agente que contiene un compuesto de acuerdo con la invención se puede administrar bien por vía oral o bien por vía parenteral, pero se prefiere la administración parenteral desde el punto de vista de evitar una promoción innecesaria de la condrogénesis fuera del sitio de administración, y desde el punto de vista del efecto. El agente puede formularse de un modo adecuado para el método de administración.
Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención como ingrediente activo puede formularse empleando la técnica habitual de formulación. La composición farmacéutica puede emplearse en diversas formas dependiendo del sitio de uso, tal como en forma de cápsulas, gránulos, crema, polvo, jarabe, comprimidos, inyección o pomada o bien en una forma sólida o líquida. El vehículo o excipiente utilizado para la formulación puede ser una sustancia sólida o líquida. Como ejemplos se pueden mencionar lactosa, estearato de magnesio, almidón, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, aceite de oliva, aceite de sésamo y etilenglicol, así como otras sustancias comúnmente utilizadas.
El contenido del compuesto de la invención en la formulación diferirá dependiendo de la forma de preparación, pero usualmente se prefiere una concentración de 0,00001-80% en peso. Una composición farmacéutica de un compuesto de la invención puede administrarse en diversas dosis dependiendo del tipo de animal de sangre caliente, tal como un ser humano, la gravedad de los síntomas y la diagnosis clínica. En la mayoría de los casos, sin embargo, la dosis oral diaria será de 0,01-2 g/kg y la dosis parenteral diaria será de 0,0000001-0,01 g/kg. Esta dosis se puede administrar de una sola vez o dividida en varias veces cada 1 a 7 días, con el ajuste apropiado dependiendo de la gravedad de los síntomas y el diagnóstico clínico.
Como se muestra en los ejemplos que se proporcionan más adelante, los agentes de acuerdo con la invención demostraron tener efectos promotores de la condrogénesis cuando se administraron por vía oral o parenteral a ratas. Esto indica la utilidad de estos agentes como agentes terapéuticos para enfermedades del cartílago.
También, los efectos promotores de la condrogénesis exhibidos por los compuestos representados por la fórmula general (I) en el cartílago traqueal, los discos intervertebrales, el cartílago auricular y el cartílago del esternón indican que los compuestos representados por la fórmula general (I) pueden constituir terapias útiles como agentes de reparación para enfermedades caracterizadas por defectos de cartílago y degeneración o destrucción de cartílago.
Además, el tratamiento de células mesenquimales no diferenciadas (CL-1) o condrocitos con promotores de condrogénesis representados por la fórmula general (I) puede proporcionar condrocitos (o condrocitos más abundantes si estos condrocitos son tratados) así como la matriz extracelular o tejido similar a cartílago. Los promotores de la condrogénesis descritos en la presente solicitud pueden emplearse para el análisis del metabolismo de la matriz extracelular de los condrocitos y el mecanismo de diferenciación en condrocitos (propiedades biológicas), el análisis de los componentes que constituyen la matriz extracelular (propiedades químicas) y el análisis de las propiedades tales como la viscoelasticidad (propiedades físicas).
Además, los derivados de indolin-2-ona representados por la fórmula general (I) que exhiben efectos promotores de la condrogénesis pueden, en algunos casos, promover la condrogénesis calcificada por el mismo efecto promotor de la condrogénesis, produciendo así, en dichos casos, un efecto promotor de la curación de las fracturas de huesos vía una osificación endocondrial final por los compuestos. Es decir, también se espera que estos compuestos sean útiles como promotores de la reparación de la fractura de huesos.
La presente invención se explicará en detalles más concretos por medio de los Ejemplos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo de síntesis 1
Los compuestos A, C y D se sintetizaron por el método siguiente.
Compuesto A
La síntesis se llevó a cabo por el método descrito en "el Ejemplo 174(2)" de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349. Una forma racémica del compuesto se sintetizó por el método descrito en el "Ejemplo 71" de la publicación de patente.
Compuesto C
La síntesis se llevó a cabo por el método descrito en "el Ejemplo 180" de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349.
Compuesto D
La síntesis se llevó a cabo por el método descrito en "el Ejemplo 100" de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349.
Ejemplo de síntesis 2
Los compuestos B, E, F y G se sintetizaron por el método siguiente.
Compuesto B
(3R)-1-(2,2-dietoxietil)-3-(4-etilfenil)aminocarbonilmetil-3-(N'-(4-metilfenil)ureido)indolin-2-ona
La (+)-1-(2,2-dietoxietil)-3-hidroxicarbonilmetil-3-(N'-(4-metilfenil)ureido) indolin-2-ona (compuesto descrito en "el Ejemplo 174(1)" de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349, 182 mg) se disolvió en diclorometano (10 mL), y luego se añadieron hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (96 mg) y para-etilanilina (61 mg). La mezcla resultante se agitó a 15-30ºC durante 15 horas.
La mezcla de reacción se lavó con ácido clorhídrico diluido 1N y luego con agua saturada con bicarbonato, y después de secado sobre sulfato sódico anhidro (15-30ºC), el disolvente se separó bajo presión reducida para concentración. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 3/1) para obtener 145 mg del compuesto del epígrafe en forma de un polvo blanco (rendimiento: 65%).
RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 8,48 (s ancho, 1H), 7,37-6,82 (m, 14H), 4,77 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 3,94 (dd, J = 5,8, 13,7 Hz, 1H), 3,80-3,42 (m, 5H), 3,00 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 2,66 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 2,53 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 2,17 (s, 3H), 1,20-1,05 (m, 9H).
Aldehído intermedio (3R)-1-(formilmetil)-3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)-3-(N'-(4-etilfenil)ureido)indolin-2-ona
Agua (10 mL) y ácido clorhídrico concentrado (3 mL) se añadieron a una solución en acetona (30 mL) de (+)-1-(2,2-dietoxietil) -3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)-3-(N'-(4-metilfenil)ureido)indolin-2-ona (compuesto descrito en "el Ejemplo 174(2)" de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-open nº 7-48349, 610 mg), y la mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas. Después de permitir que se enfriara la solución de reacción, el disolvente se separó bajo presión reducida para concentración. Se añadió diclorometano al residuo, y éste se lavó dos veces con solución salina. Después de secar la capa orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro (15-30ºC), se concentró bajo presión reducida para obtener 529 mg del compuesto del epígrafe en forma de un producto bruto.
RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 9,71 (s, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,38-6,90 (m, 11H), 6,65 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 18,7 Hz, 1H), 4,40 (d, J = 18,7 Hz, 1H), 2,98 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,55 (d, J = 14,5 Hz), 2,30 (s, 3H), 2,23 (s, 3H).
Compuesto E
(3R)-1-(2,2-diisopropoxietil)-3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)-3-(N'-(4-metilfenil)-ureido)indolin-2-ona
El aldehído intermedio obtenido anteriormente (60 mg) se disolvió en isopropanol (10 mL), se añadió ácido para-toluensulfónico (10 mg), y la mezcla se calentó a reflujo durante 4 horas. Después de dejar que la solución de reacción se enfriara, el disolvente se separó bajo presión reducida para concentración. El residuo se diluyó con diclorometano y se lavó con agua saturada con bicarbonato. Después de secar la capa orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro (15-30ºC), se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 1/1) para obtener 46 mg del compuesto del epígrafe (rendimiento: 62%).
RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 8,37 (s, 1H), 7,39-6,90 (m, 13H), 6,79 (s, 1H), 4,84 (dd, J = 4,9, 4,7 Hz, 1H), 3,94-3,73 (m, 4H), 3,00 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,58 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 1,18 (d, J = 6,3 Hz, 6H), 1,11-1,04 (m, 6H).
Compuesto F
(3R)-1-(2,2-bis(2-fluoroetoxi)etil)-3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)-3-(N'-(4-metilfenil)ureido)indolin-2-ona
El aldehído intermedio antes mencionado (50 mg) se disolvió en 2-fluoroetanol (1 mL), se añadió ácido alcanforsulfónico (5 mg), y la mezcla se calentó a reflujo durante 5 horas. Después de dejar que se enfriara la solución de reacción, se añadió tolueno y la mezcla se concentró bajo presión reducida al mismo tiempo que se separaba por destilación azeotrópica el exceso de 2-fluoroetanol. El residuo se diluyó con diclorometano y se lavó con agua saturada con bicarbonato. Después de secar la capa orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro (15-30ºC), se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 2/1) para obtener 25 mg del compuesto del epígrafe (rendimiento: 41%).
RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 7,79 (s, 1H), 7,32-6,93 (m, 13H), 6,76 (s, 1H), 5,01-4,96 (m, 1H), 4,62-4,53 (m, 2H), 4,45-4,35 (m, 2H), 4,11 (dd, J = 6,6, 14,3 Hz, 1H), 4,00-3,72 (m, 5H), 2,88 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,49 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,23 (s, 3H).
Compuesto G
(3R)-1-(2,2-bis(2-cloroetoxi)etil)-3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)-3-(N'-(4-metilfenil)-ureido)indolin-2-ona
El aldehído intermedio antes mencionado (50 mg) se disolvió en 2-cloroetanol (1 mL), se añadió ácido alcanforsulfónico (5 mg) y la mezcla se agitó a 90ºC durante 5 horas. Después de dejar que la solución de reacción se enfriara, se añadió tolueno y la mezcla se concentró bajo presión reducida al mismo tiempo que se separaba por destilación azeotrópica el exceso de 2-cloroetanol. El residuo se diluyó con diclorometano y se lavó con agua saturada con bicarbonato. Después de secar la capa orgánica sobre sulfato de magnesio anhidro (15-30ºC) se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/acetato de etilo = 2/1) para obtener 15 mg del compuesto del epígrafe (rendimiento: 23%).
RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 7,88 (s, 1H), 7,32-6,93 (m, 13H), 6,79 (s, 1H), 4,96-4,91 (m, 1H), 3,97-3,46 (m, 10H), 2,98 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,49 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,23 (s, 3H).
Ejemplo de síntesis 3
Las formas racémicas del compuesto H y el compuesto I, y una forma ópticamente activa del compuesto 1 se sintetizaron por el método siguiente.
\newpage
Compuesto H
(3R)-1-(2,2-dietoxietil)-3-(4-hidroximetilfenil)aminocarbonilmetil-3-(N'-4-metilfenil)-ureido)indolin-2-ona
La (+)-1-(2,2-dietoxietil)-3-hidroxicarbonilmetil-3-(N'-(4-metilfenil) ureido)-indolin-2-ona (compuesto descrito en "el Ejemplo 174(1)" de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-Open nº 7-48349, 300 mg) se disolvió en acetonitrilo (10 mL), y después de añadir alcohol p-aminobencílico (100 mg) e hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida (151 mg) en el orden indicado, la mezcla se agitó a 15-30ºC durante 18 horas. Se añadió agua a la solución de reacción, la extracción se realizó con acetato de etilo, la capa orgánica se secó con sulfato sódico anhidro y el disolvente se separó por destilación. La mezcla de reacción resultante se purificó por cromatografía en columna para obtener 324 mg del compuesto del epígrafe (rendimiento: 88%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 200 MHz)
\delta 8,83 (s, 1H), 7,40-6,84 (m, 14H), 4,78 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,51 (s, 2H), 3,99 (dd, J = 5,9 Hz, 14,2 Hz, 1H), 3,83-3,45 (m, 5H), 2,90 (d, J = 15,2, Hz, 1H), 2,67 (s ancho, 1H), 2,60 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 1,15 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,10 (t, J = 6,9 Hz, 3H).
IR (KBr, cm^{-1})
3330, 2980, 1708, 1671, 1610, 1533, 1478, 1464, 1412, 1375, 1310, 1248, 1209, 1125, 1059, 818, 751, 475.
EM (EI, 70 eV)
m/e = 560 (M^{+}), 514, 486, 453.
Urea intermedia 3-(N'-(4-t-butildimetilsililoximetilfenil)ureido)-1-(2,2-dietoxietil)indolin-2-ona
Una solución en diclorometano que contenía el éter p-aminobencil-t-butildimetilsilílico (1,63 g) se añadió lentamente gota a gota a una solución de diclorometano que contenía trifosgeno (681 mg) a 15-30ºC, y luego se añadió una solución de diclorometano que contenía trietilamina (1,92 mL) y la mezcla se agitó durante 1 hora para preparar una solución en diclorometano que contenía un compuesto de isocianato.
La 1-(2,2-dietoxietil)-3-(hidroxiimino)indolin-2-ona (compuesto mencionado como producto intermedio en el Ejemplo 28 de la Solicitud de Patente Japonesa Laid-Open nº 7-48349, 2,014 g) se disolvió en metanol, se añadió Pd al 10% sobre carbono y la mezcla se agitó durante 4 horas bajo una atmósfera de hidrógeno a 15-30ºC. Después de filtrar la mezcla de reacción para separar el Pd/carbono, se concentró el filtrado. El residuo se disolvió en diclorometano y luego se añadió sobre hielo a una solución ya preparada de diclorometano que contenía el compuesto de isocianato. Después de agitar a la misma temperatura durante 1 hora, se añadió agua a la solución de reacción, se realizó la extracción con diclorometano, se secó la capa orgánica con hidrogenosulfato de sodio anhidro y el disolvente se separó por destilación. La mezcla de reacción se purificó por cromatografía en columna para obtener 2,454 g del compuesto del epígrafe (rendimiento: 68%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 200 MHz)
\delta 7,58 (s ancho, 1H), 7,44-6,95 (m, 9H), 6,03 (d ancho, J = 5,7 Hz, 1H), 5,21 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,70 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 4,63 (s, 2H), 3,96 (dd, J = 5,1 Hz, 13,7 Hz, 1H), 3,83-3,42 (m, 5H), 1,15 (t, J = 6,9 Hz, 6H), 0,94 (s, 9H), 0,09 (s, 6H).
Amida intermedia 3-(N'-(4-t-butildimetilsililoximetilfenil)ureido)-1-(2,2-dietoxietil)-3-((4-metilfenil)amino-carbonilmetil)indolin-2-ona
La 3-(N'-(4-t-butildimetilsililoximetilfenil)ureido)-1-(2,2-dietoxietil)indolin-2-ona (1 g) se disolvió en dimetilformamida (15 mL), se añadió t-butóxido de potasio (237 mg) a 15-30ºC, y después de agitar la mezcla durante un minuto se añadió N-paratolil-2-bromoacetamida (460 mg). Después de agitar durante 15 minutos, se añadió agua, la extracción se realizó con acetato de etilo, la capa orgánica se secó con hidrogenosulfato sódico anhidro y el disolvente se separó por destilación. La mezcla de reacción se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para obtener 939 mg del compuesto del epígrafe (rendimiento: 73%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 200 MHz)
\delta 8,52 (s, 1H), 7,40-6,92 (m, 14H), 4,78 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 4,60 (s, 2H), 4,02 (dd, J = 5,7 Hz, 14,9 Hz, 1H), 3,87-3,46 (m, 5H), 3,00 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,67 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 1,17 (t, J = 7,4 HZ, 3H), 1,13 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 0,92 (s, 9H), 0,06 (s, 6H).
Compuesto I
(Forma racémica) 1-(2,2-dietoxietil)-3-(N'-(4-hidroximetilfenil)ureido)-3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)-indolin-2-ona
La 3-(N'-(4-t-butildimetilsililoximetilfenil)ureido)-1-(2,2-dietoxietil)-3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)indo-
lin-2-ona (308 mg) se disolvió en etanol (15 mL), se añadió ácido sulfúrico concentrado (10 mg), y la mezcla se agitó a 15-30ºC durante una hora. Se añadió agua a la solución de reacción, la extracción se realizó con acetato de etilo, la capa orgánica se secó con hidrogenosulfato de sodio anhidro y el disolvente se separó por destilación. La mezcla de reacción se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice para obtener 225 mg del compuesto del epígrafe (rendimiento: 88%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 8,13 (s, 1H), 7,37-6,90 (m, 14H), 4,79 (s ancho, 1H), 4,50 (s, 2H), 4,01 (dd, J = 5,9 Hz, 14,5 Hz, 1H), 3,86-3,46 (m, 6H), 2,96 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 2,53 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H), 1,16 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,11 (t, J = 6,9 Hz, 3H).
IR (KBr, cm^{-1})
3365, 3000, 1717, 1702, 1621, 1545, 1521, 1498, 1480, 1420, 1388, 1321, 1263, 1137, 1069, 831, 763, 515, 484.
EM(espectro de masas) IE (Electroionización), 70 eV)
m/e = 560 (M^{+}), 515, 392, 365, 306, 292.
Éster intermedio 1-(2,2-dietoxietil)-3-(N'-(4-t-butildimetilsililoximetilfenil)ureido)-3-((L-mentoxi)-carbonilmetil)indolin-2-ona
Una solución de hexano que contenía un equivalente de n-butil-litio (1,68 M, 1,0 mL) se añadió lentamente a una solución de tetrahidrofurano anhidro (20 mL) que contenía 3-(N'-(4-t-butildimetilsililoximetilfenil)ureido)-1-(2,2-dietoxietil)indolin-2-ona (936 mg), al mismo tiempo que se enfriaba sobre hielo bajo corriente de nitrógeno, y después de agitar la mezcla a la misma temperatura durante 10 minutos, se añadió gota a gota una solución de tetrahidrofurano anhidro (10 mL) que contenía bromoacetato de L-mentilo (542 mg). Después de agitar la mezcla a 0ºC durante 8 horas, se vertió en solución salina y la extracción se realizó con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y luego se concentró, y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (elución con hexano/acetato de etilo = 3/1) y se recristalizó en metanol/agua para obtener 357 mg del compuesto del epígrafe (rendimiento: 28%).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 7,30 - 6,97 (m, 8H), 6,81 (s ancho, 1H), 6,76 (brs, 1H), 4,74 (dd, J = 5,7 Hz, 4,9 Hz, 1H), 4,69-4,61 (m, 3H), 3,94 (dd, J = 6,9 Hz, 14,2 Hz, 1H), 3,86-3,49 (m, 5H), 2,99 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 2,59 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 1,921,90 (s ancho, 1H), 1,21-1,10 (m, 6H), 0,92 (s, 9H), 1, 36 - 0,65 (m, 18H), 0,065 (s, 6H).
Compuesto I
(Forma ópticamente activa) 1-(2,2-dietoxietil)-3-(N'-(4-hidroximetilfenil)ureido)-3-((4-metilfenil)aminocarbonilmetil)-indolin-2-ona
Una solución de hidróxido potásico acuoso (1 N, 1,36 mL) se añadió a una solución de etanol (8 mL) que contenía 1-(2,2-dietoxietil)-3-(N'-(4-t-butildimetilsililoxi-metilfenil)ureido)-3-((L-mentoxi)carbonilmetil)indolin-2-ona (293
mg) a 15-30ºC, y después de agitar la mezcla a 70ºC durante 4 horas se concentró. Después de añadir agua al residuo y lavar con cloroformo, se le añadió para acidificar ácido clorhídrico 2 N. La porción insoluble resultante se extrajo con acetato de etilo, y después de lavar la capa orgánica con solución salina, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para obtener 234 mg de 1-(2,2-dietoxietil)-3-hidroxicarbonilmetil-3-(N'-(4-hidroxi-metilfenil)ureido)indolin-2-ona (ácido carboxílico intermedio) en forma de un producto en bruto.
El ácido carboxílico intermedio (234 mg) se disolvió en diclorometano (10 mL), y se le añadieron hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (131 mg) y para-toluidina (73 mg) en el orden mencionado. La mezcla se agitó a 15-30ºC durante 18 horas y se concentró. Después de diluir el residuo con acetato de etilo y lavarlo con ácido clorhídrico diluido y agua saturada con bicarbonato, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (elución con hexano/acetato de etilo = 2/1) para obtener 204 mg de un polvo blanco (ee 90%, rendimiento 80% de éster intermedio).
Una porción de 140 mg de este polvo se purificó por cromatografía de líquidos de alta resolución empleando una columna ópticamente activa para obtener la forma R (117 mg, [\alpha]^{26}_{D} = 94º, c = 1,014/MeOH) y la forma S (7 mg).
Condiciones de separación
Columna: SUMICHIRAL OA-4800
diámetro 20 mm x longitud 25 cm
Longitud de onda de detección: UV 254 nm
Caudal: 20 mL/min
Disolvente: hexano/1,2-dicloroetano/metanol = 75/22/3
Tm de retención: forma S: 24 minutos, forma R: 40 minutos
Ejemplo 1 Efecto promotor de la condrogénesis por administración oral a ratas sanas
El "compuesto A" obtenido en el Ejemplo de síntesis 1 anterior se suspendió en una solución de goma arábiga al 3% y se administró por vía oral a ratas SD machos de 6 semanas (Nihon SLC Corp./Nihon Charles River Corp.) a una dosis de 2 g/kg/día durante 4 semanas.
Luego a cada rata se le hizo la autopsia, y el pabellón auricular, la tráquea, el esternón, la articulación de la rodilla femoral/crural y la apófisis espinal lumbar (disco) se sumergieron durante una semana en formol tamponado neutro al 20% (Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd.) y se fijó, el esternón, la articulación femoral/crural de la rodilla y la apófisis espinosa lumbar (disco) se desmineralizaron durante 2 semanas con solución de EDTA-4 Na al 20% (pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries), y se recortaron los sitios de observación con una cuchilla (Feather Co., Ltd.). Del pabellón auricular y la tráquea se recortaron los sitios de observación con una cuchilla sin desmineralización.
Cada una de las muestras de tejido recortadas se preparó en un bloque empotrado en parafina que empleaba un aparato de empotramiento automático (Sakura Corp.) y parafina (mezcla equivalente de productos de Kokusan Kagaku Corp. y Fisher Scientific Corp.). Aquí, se usó un centro de empotramiento de dispensación automática de parafina (Miles Scientific Corp.) para fijar cada bloque de parafina en una cajita de muestra de tejido (TISSUE-TEK Corp.).
El bloque de parafina se cortó en secciones de 2 \mum de espesor empleando un microtomo (Daiwa Optical Instruments Corp.) y una cuchilla de microtomo (Feather Co., Ltd.), y luego se unió a un portaobjetos de vidrio (Matsunami Glass Corp.) y se secó. Después de secar, las secciones se sumergieron en xileno para separar la parafina, y luego se sumergieron en una dilución por etapas en serie desde etanol a agua y luego se almacenaron en agua. Las secciones se tiñeron con hematoxilina al 0,2% y eosina al 0,1% (ambas de Merck Co., Ltd.), y luego se montaron con un agente de montaje (Takefuji Chemical Co., Ltd.) en un portaobjetos de vidrio (Matsunami Glass Corp.) y se observaron en un microscopio (lente de 10 aumentos, producto de Nihon Kogaku Corp.). La tira femoral se tiñó con safranina O al 0,3% (Merck Co., Ltd.) para análisis histoquímico de la formación promovida de cartílago de hialina, y se observó bajo un microscopio del mismo modo (lente de 10 aumentos). Los resultados se muestran en la fotomicrografía de la Figura 1A-5A y la Figura 1B-5B.
Puede verse claramente en estas fotomicrografías tomadas después de la tinción que no se encontró efecto promotor de la condrogénesis en el grupo con el vehículo de control (ratas a las que se había administrado por vía oral solamente goma arábiga al 3%) (Figuras 1A, 2A, 3A, 4A y 5A), pero todas las ratas pertenecientes al grupo al que se le había administrado el "compuesto A" tenían una formación acelerada de cartílago de hialina en todos los órganos (Figuras 1B, 2B, 3B, 4B y 5B).
Los resultados del experimento confirmaron que el compuesto A presentaba un efecto promotor de la condrogénesis in vivo.
Ejemplo 2 Efecto promotor de la condrogénesis por administración en articulaciones de rodillas de ratas
Se emplearon una aguja de inyección del calibre 27 y una jeringa de 1 ml (ambas de Terumo Corp.) para administrar 1 mmol/L del "compuesto A" (disuelto en solución salina fisiológica con dimetilsulfóxido (DMSO al 50%; DMSO de Junsei Chemical Corp., solución salina fisiológica de Otsuka Pharmaceutical Corp.) en la articulación de la rodilla derecha de ratas SD machos de 10 semanas (Nihon Charles River Corp.) a una dosis de 50 \muL por día durante 3 semanas.
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A otro grupo de ensayo se le administró solución salina fisiológica con DMSO al 50% (de Junsei Chemical Corp. y Otsuka Pharmaceutical Corp., respectivamente) del mismo modo que el vehículo de control.
Después de 3 semanas de administración diaria, a las ratas se les hizo la autopsia y se midió con calibres (Mitsutoyo Corp.) la distancia entre los sitios de unión lateral y medial del ligamento colateral del fémur derecho para determinar la anchura de la articulación femoral de la rodilla. A continuación, del mismo modo que en el Ejemplo 1, se prepararon muestras de tejidos y se tiñeron con safranina O al 0,3% (Merck Co., Ltd) y se observaron bajo un microscopio (lente de 10 aumentos, producto de Nihon Kogaku Corp.). Los resultados se muestran en las Figuras 6, 7A y 7B.
Como se muestra en la Figura 6, las anchuras de la articulación femoral de la rodilla fueron significativamente mayores en el grupo al que se le había administrado el compuesto A que en el grupo con vehículo de control. Como se muestra en las Figuras 7A y 7B, la observación histológica reveló la formación acelerada positiva a la safranina O de tejido de cartílago.
Los resultados del experimento confirmaron que el compuesto A exhibe un efecto promotor de la condrogénesis incluso con administración local, tal como inyección intraarticular.
Ejemplo 3 Efecto del compuesto A en condrocitos articulares de ratas en cultivo primario
Se recortaron condrocitos articulares de la articulación femoral de la rodilla de ratas machos SD de 6 semanas (Nihon SLC Corp.) empleando un escalpelo, y luego sometiéndolos a digestión en colagenasa al 0,3% (WORTHINGTON Corp.) y se cultivaron (Calcif. Tissue Int. 19:179-187, 1975).
Los condrocitos articulares aislados se emplearon para medir la síntesis de glicosaminoglicano en la matriz del cartílago por medida de la captación de ácido sulfúrico marcado con ^{35}S (Amersham Co., Ltd.) en glicosaminoglicano. Específicamente, los condrocitos articulares se cultivaron en una placa de 96 pocillos para cultivos de células (FALCON Corp.) hasta una densidad de células de 10.000 por pocillo. El medio usado fue una mezcla equivalente de medio esencial mínimo de Dulbecco que contenía suero de bovino fetal (concentración final: 10%), 100 U/ml de penicilina (Meiji Seika Co., Ltd.) y 100 \mug/mL de estreptomicina (Banyu Pharmaceutical Corp.), y medio Ham F-12 (ambos de GIBCO Corp.).
Cuando los condrocitos alcanzaron la confluencia, el medio se sometió a intercambio con uno que tenía una concentración de suero de 0,3% y el cultivo se llevó a cabo durante la noche, después de lo cual el medio se sometió a intercambio con el mismo tipo también que contenía 10 \mumol/L de compuesto A, y luego después de 3 horas, se añadió ácido sulfúrico marcado con ^{35}S (Amersham Co., Ltd.) a 0,5 \muCi por pocillo y el cultivo se llevó a cabo durante 24 horas. El medio se recogió luego en una placa de 24 pocillos y se conservó a 4ºC. La capa de células se digirió a 37ºC durante la noche (16 horas) mediante la adición de 0,1 ml de Actinase E de 2 mg/ml (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) por pocillo. Al día siguiente la capa de células digerida se combinó con el medio conservado, y después de la adición de 0,1 ml de sulfato de condroitina C (Sigma Corp.), 0,5 ml de MgSO_{4} de 2 mmol/L (Wako Pure Chemical Industries), 0,5 ml de Tris/HCl de 0,2 mol/L (Sigma Corp.) y 0,5 ml de cloruro de cetilpiridinio al 1% (disuelto en 20 mmol/L de solución de cloruro de sodio, de Wako Pure Chemical Industries), la mezcla se dejó reposar a 37ºC durante 2 horas. La muestra se filtró luego con papel de filtro de fibra de vidrio (Toyo Filter Paper Corp.), el papel de filtro se lavó 3 veces con 2 ml de cloruro de cetilpiridinio al 1% (20 mmol/L), se colocó en un vial de recuento por centelleo de líquidos (PACKARD Corp.), se vertieron en él 10 ml de agente de centelleo (Nacalai Tesque Corp.) y se midió la radioactividad con un contador de centelleo de líquidos (PACKARD Corp.).
Se midió la captación de timidina marcada con ^{3}H (Amersham Corp.) para determinar el crecimiento de las células. Para la medida, los condrocitos articulares aislados se cultivaron en una placa de cultivo de células de 96 pocillos (FALCON Corp.) hasta una densidad de células de 10.000 por pocillo. El medio usado era una mezcla equivalente de medio esencial mínimo de Dulbecco que contenía suero de bovino fetal (concentración final: 10%), 10 U/ml de penicilina (Meiji Seika Co., Ltd.) y 100 \mug/ml de estreptomicina (Banyu Pharmaceutical Corp.), y medio Ham F-12 (ambos de GIBCO Corp.). Después de que el 60-70% de las células alcanzaron la confluencia, el medio se intercambió con uno que tenía una concentración de suero bovino fetal de 0,3% y el cultivo se llevó a cabo durante la noche. Al día siguiente, el medio se intercambio con el mismo tipo que también contenía el compuesto A a una concentración final de 0,1, 1,0 ó 10 \mumol/L y suero de bovino fetal al 0,3%. Después de 24 horas, se añadió timidina marcada con ^{3}H (Amersham Co., Ltd.) a 1 \muCi por pocillo y el cultivo se llevó a cabo durante 4 horas, después de lo cual el medio se desechó y se usó un aparato de recogida de células (SKATRON Corp.) para recoger la capa de células en un papel de filtro de fibra de vidrio de un contador de centelleo (Wallac Corp.). El papel de filtro se impregnó con el agente de centelleo de plástico (Wallac Corp.) y se midió la radioactividad con un contador de centelleo (Wallac Corp.). Los resultados se muestran en las gráficas de las Figuras 8 y 9.
La captación de ácido sulfúrico marcado con ^{35}S aumentó significativamente mediante la adición de 0,01 mol/L del compuesto A, con respecto al etanol a una concentración final en el medio del 1%, como disolvente de control. La captación de timidina marcada con ^{3}H también aumentó significativamente mediante la adición de 10 \mumol/L de compuesto A con respecto al disolvente de control.
Estos resultados confirmaron que el compuesto A tiene un efecto de aumentar la síntesis de la matriz de cartílago y el crecimiento de condrocitos. Los promotores de condrogénesis representados por la fórmula general (I) también pueden usarse como agentes para promover la síntesis de la matriz extracelular y las propiedades de crecimiento de los condrocitos antes o después del transplante de condrocitos, tal como transplante autógeno de condrocitos.
Ejemplo 4 Efecto del compuesto A en la diferenciación en condrocitos de ratón común y de la línea celular de precursor de adipocitos (CL-1)
Condrocitos establecidos de ratones adultos normales y la línea de adipocitos CL-1 (Solicitud de Patente Internacional WO 98/39414) se cultivaron en un portaobjetos de cámara con 4 pocillos (Nunc Corp.) hasta una densidad de células de 5000/cm^{2}. El medio usado fue \alpha-MEM (GIBCO Corp.) que contenía 100 U/ml de penicilina (Meiji Seika Co., Ltd.), 100 \mug/ml de estreptomicina (Banyu Pharmaceutical Corp.) y suero bovino fetal al 10% (INTERGEN Corp.). Cuando las células CL-1 alcanzaron la confluencia, se añadió el compuesto A hasta una concentración final de 10 \mumol/L, con más adición cuando el medio se intercambió 3 veces en una semana durante el cultivo durante 7 días.
Se preparó un portaobjetos con etanol (Junsei Chemical Corp.) hasta una concentración final de 1% en el medio como vehículo de control. En el 7º día después de la confluencia, las placas se recogieron, la capa de células CL-1 se tiñó doblemente con azul alcian y aceite rojo O, y se observó la diferenciación en condrocitos o adipocitos. Después de que el cultivo se completó, la capa de células se fijó durante una hora a temperatura ambiente con una solución de paraformaldehído al 4% (Wako Pure Chemical Industries) y luego se lavó con ácido clorhídrico 0,1 N y se tiñó durante la noche con una solución acuosa (pH 1,0) de azul alcian al 1% (EM Science Corp.). Esto se lavó con ácido clorhídrico 0,1 N y agua destilada y luego se trató durante un minuto con una solución acuosa de propilenglicol al 85% (Nacalai Tesque Corp.), y se tiñó durante 30 minutos en una solución acuosa de propilenglicol que contenía 0,5% de aceite rojo O (Merck Co., Ltd.). El lavado subsiguiente con una solución acuosa de propilenglicol al 85% fue seguido por lavado con agua destilada. Los núcleos se tiñeron luego durante 5 minutos con una solución acuosa de Kernechtrot al 0,3% (Merck Co., Ltd.). Los resultados se muestran en las fotomicrografías de las Figuras 10A y 10B. La diferenciación de la línea CL-1 en condrocitos y adipocitos empieza después de que las células alcancen la confluencia, y en condiciones ordinarias de cultivo, se diferencian aproximadamente el 70% de las células, siendo los adipocitos positivos al aceite rojo O, mientras que se diferencian aproximadamente el 30% de las células, siendo los condrocitos positivos al azul alcian. En la Figura 10A y 10B los puntos oscuros representan gotitas de grasa en la grasa positiva al aceite rojo O, y las zonas gris oscuras representan la matriz de cartílago positiva al azul alcian.
Como puede verse en las fotomicrografías después de la tinción en la Figura 10B, el compuesto A promueve claramente la diferenciación del CL-1 en condrocitos y suprime la diferenciación en adipocitos, comparado con el vehículo de control (Figura 10A).
Ejemplo 5 Efectos de los compuestos A, B, C, D, E, F y G sobre la captación de ácido sulfúrico marcado con ^{35}S en el condrocito de ratón común y la línea celular precursora de adipocitos (CL-1)
La línea celular CL-1 antes mencionada se cultivó en una placa de cultivo de células de 96 pocillos (Wallac Corp.) para un contador de centelleo de líquido (Wallac Corp.) hasta una densidad de 1000 por pocillo. El medio empleado fue \alpha-MEM (GIBCO Corp.) que contenía 100 U/mL de penicilina (Meiji Seika Co., Ltd.), 100 \mug/ml de estreptomicina (Banyu Pharmaceutical Corp.) y suero de bovino fetal al 10% (INTERGEN Corp.). Cuando las células CL-1 alcanzaron la confluencia el medio se intercambió con uno que contenía 10 \mumol/L de los compuestos A, B, C, D, E, F y G, y después de 24 horas, se añadió ácido sulfúrico marcado con ^{35}S a 0,5 \muCi por pocillo y se continuó el cultivo. Para los compuestos A y F, también se preparó un medio con una concentración de 1 ó 5 \mumol/L. Después de 24 horas, el medio se desechó y la capa de células se fijó durante 2 horas a temperatura ambiente empleando 0,2 ml de paraformaldehído al 5% (solución tampón de fosfato de 0,1 mol/L (pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries), que contenía cloruro de cetilpiridinio al 0,4% (Wako Pure Chemical Industries). Después de desechar la solución de fijación se lavó una vez con la misma solución y se desechó la solución lavada. Después de añadir 0,1 ml de agente de centelleo (Wallac Corp.) a la capa celular y agitar, se midió la radioactividad con un contador de centelleo (Wallac Corp.). Los resultados se muestran en las Figuras 11 y 12.
Estos resultados indican que los compuestos A, B, C, D, E, F y G promueven claramente la diferenciación de CL-1 en condrocitos y suprimen claramente la diferenciación en adipocitos. Los resultados también muestran que los promotores de la condrogénesis representados por la fórmula general 1 pueden usarse como agentes para inducir la diferenciación de células mesenquimales no diferenciadas pluripotentes (por ejemplo, células con un estado de diferenciación similar a CL-1) en condrocitos, para el tratamiento de enfermedades del cartílago que implican transplante de condrocitos y similares.
Ejemplo 6 Efecto de la reparación de cartílago del compuesto A en modelos de ratas deficientes en cartílago de espesor completo
Un alambre de Kirschner con un diámetro de 2,4 mm (Mizuo Medical Instruments Corp.) se usó para crear una zona deficiente de 2,5 mm de profundidad en la superficie patelar femoral derecha, llegando hasta la médula, en ratas CD machos de 10 semanas (Nihon Charles River Co., Ltd.). Desde el séptimo día después de la operación, se administraron 50 \muL de una solución salina fisiológica con dimetilsulfóxido (DMSO) al 50% como disolvente (DMSO: Junsei Chemical Corp.; solución salina fisiológica: Otsuka Pharmaceutical Corp.), o de una solución del compuesto A de 1,0 mmol/L en la articulación de la rodilla derecha diariamente una vez al día durante 3 semanas. La dosis diaria del compuesto fue 81,7 \mug.
Al día siguiente del día de la administración final, se tomó el fémur derecho, y se fijó en formaldehído tamponado neutro al 20% (Wako Pure Chemical Industries) durante una semana, y luego se desmineralizó durante 2 semanas con una solución de EDTA-4Na al 20% (pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries), y la zona deficiente se recortó con una cuchilla (Feather Co., Ltd). La zona recortada se sometió a bloqueo con parafina empleando un aparato de empotramiento automático (Sakura Corp.) y parafina (mezcla equivalente de productos de Kokusan Kagaku Corp. y Fisher Scientific Corp.). Aquí, se usó un centro de empotramiento con dispensación automática de parafina (Miles Scientific Corp.) para fijar cada bloque de parafina en una cajita de muestra de tejido (TISSUE-TEK Corp.).
Cada bloque de parafina se cortó en secciones de 2 \mum de espesor empleando un microtomo (Daiwa Optical Instruments Corp.) y una cuchilla de microtomo (Feather Co., Ltd.), y luego se unió a un portaobjetos de vidrio (Matsunami Glass Corp.), y se secó. Después de secar, las secciones se sumergieron en xileno para eliminar la parafina y luego se sumergieron en una serie de diluciones por etapas de etanol a agua y luego se conservaron en agua. Las secciones se tiñeron con safranina O al 0,3% (Merck Co., Ltd.) y se observaron con un microscopio (lente de 10 aumentos), y se asignó una puntuación histológica de acuerdo con una modificación del método de Wakitani et al. (J. Bone Joint Surg. 76-A, 579-592, 1994).
Las puntuaciones histológicas del grupo del vehículo de control y el grupo administrado con el compuesto A se compararon basándose en los criterios mostrados en la Tabla 10 que figura más adelante. En el grupo al que se le administró sólo el compuesto A, hubo una disminución significativa en la morfología de las células y espesor del cartílago (Figura 13A) y en la puntuación total (Figura 13B) comparado con el grupo al que se le administró disolvente sólo. Como se muestra en las Figuras 14A y 14B, las zonas deficientes exhibieron reparación en el tejido cartilaginoso positivo a la safranina O. Estos resultados experimentales confirmaron que el compuesto A exhibe un efecto reparador del cartílago contra otros defectos o daños del cartílago articular.
TABLA 10
27
Ejemplo 7 Efecto supresor de la patología del compuesto A en el modelo de la osteoartritis del conejo
El modelo de la osteoartritis del conejo se preparó empleando conejos NZW machos de 12 semanas (Kitayama Labes Co., Ltd.), y realizando una menisectomía parcial en la rodilla derecha, y la extirpación del ligamento colateral lateral y el ligamento sesamoide, de acuerdo con el método de Colombo et al. (Arthritis Rheum. 26(7):875-886, 1983). Comenzando el 7º día después de la operación, 500 \mul de solución salina fisiológica con 50% de dimetilsulfóxido (DMSO) (DMSO: Junsei Chemical Corp., solución salina fisiológica: Otsuka Pharmaceutical Corp.) o 3,0 mmol/L de solución del compuesto A se administró intraarticularmente una vez al día en la articulación de la rodilla derecha durante un período de 3 semanas. La dosis diaria del compuesto A fue 816,8 \mug.
Al día siguiente del día final de la administración, se tomaron secciones proximales distales y crurales femorales derechas, y el fémur se sumergió en solución de fijación de paraformaldehído al 2%-glutaraldehído al 2,5% (ambas de Wako Pure Chemical Industries) para fijación, al mismo tiempo que el crus se sumergió durante una semana en formaldehído tamponado neutro al 20% (Wako Pure Chemical Industries) para fijación.
Después de la post-fijación de la sección distal femoral con solución de osmio al 1% (Wako Chemical Industries), se sumergió en una serie de etanol creciente para deshidrogenación, y luego se sustituyó con acetato de isoamilo y subsiguientemente se secó con un aparato de secado de punto crítico (Hitachi Co., Ltd.). La superficie seca del tejido se revistió con oro empleando un aparato de revestimiento por pulverización iónica (Eiko Corp.), y se observó la superficie del cartílago del condilo femoral empleando un microscopio electrónico de barrido (Hitachi Co. Ltd.) (Figuras 15A y 15B). El área de las secciones dañadas del cartílago articular en la fotomicrografía electrónica se midió empleando un programa de ordenador de análisis de imagen IPAP (Sumika Technoservice Co., Ltd.) y se juzgó en la escala mostrada en la Tabla 11 a continuación. Como se muestra en las Figuras 16A, 16B y 16C, el grupo al que se administró el compuesto A sólo presentó un área significativamente más pequeña de daño en el cartílago articular comparado con el grupo al que se le administró disolvente sólo, como se juzga por el área de la lesión del grado medio y el grado de lesión total.
TABLA 11
28
La región proximal de la tibia se recortó con una sierra de banda (EXAKT Corp.) y luego se desmineralizó durante 4 semanas con una solución de EDTA-4Na al 20% (pH 7,4, Wako Pure Chemical Industries). La sección recortada se preparó en un bloque de parafina empleando un aparato de empotramiento automático (Sakura Corp.) y parafina (mezcla equivalente de productos de Kokusan Kagaku Corp. y Fischer Scientific Corp.). Aquí, se usó un centro de empotramiento con dispensación automática de parafina (Miles Scientific Corp.) para fijar cada bloque de parafina en una cajita de muestra de tejido (TISSUE-TEK Corp.).
El bloque de parafina se cortó en secciones de 2 \mum de espesor empleando un microtomo (Daiwa Optical Instruments Corp.) y una cuchilla de microtomo (Feather Co., Ltd.), y luego se unió a un portaobjetos de vidrio (Matsunami Glass Corp.) y se secó. Después del secado, las secciones se sumergieron en xileno para eliminar la parafina, y luego se sumergieron en una serie de diluciones progresivas de etanol a agua y se conservó en agua. Las secciones se tiñeron con safranina O al 0,3% (Merck Co., Ltd.), y luego se observaron bajo un microscopio (lente de 10 aumentos) y se asignó una puntuación histológica de acuerdo con la Tabla 12 siguiente, que es una modificación del método de Kikuchi et al. (Osteoarthritis, Cartilage 4, 99-110, 1996).
TABLA 12
29
El grupo al que se le administró el compuesto A sólo tenía puntuaciones histológicas totales significativamente inferiores, excepto la pérdida de capa superficial comparado con el grupo al que se le administró el disolvente sólo (Figuras 17A y 17 B). Estos resultados experimentales confirmaron que el compuesto A exhibe un efecto supresor sobre la degeneración del cartílago en la osteoartritis y en estados similares.
Aplicabilidad industrial
Como se ha explicado anteriormente, la presente invención proporciona promotores de condrogénesis y agentes de reparación de cartílago que comprenden como ingredientes activos derivados de indolin-2-ona que tienen estructuras específicas, o sus sales. Estos promotores de la condrogénesis promueven la condrogénesis en animales de sangre caliente incluyendo los seres humanos, y, por lo tanto, se espera que sirvan como excelentes agentes terapéuticos para enfermedades del cartílago tales como la artritis reumatoide o la osteoartritis, o defectos del cartílago debido a un daño.
Además, los derivados de indolin-2-ona con un efecto promotor de la condrogénesis de acuerdo con la invención también son útiles como reactivos para investigación biológica, física o química sobre el cartílago.

Claims (20)

1. Uso de un compuesto seleccionado de:
(A) compuestos de la fórmula (I)
30
en donde
R^{1}
representa halógeno, alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6}, hidroxilo, nitro, trifluorometilo, alquiltio C_{1-6}, acilo, carboxilo, mercapto o amino;
R^{2}
representa hidrógeno o alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, alquenilo C_{2-6}, alquinilo C_{2-6}, alcoxi C_{1-6}, acilo, arilo o un grupo heterocíclico;
R^{3}
representa un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, cicloalquilo C_{3-8}, arilo o un grupo heterocíclico;
R^{4}
representa hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, arilo o un grupo heterocíclico, -OR^{5}, -SR^{5}, -NR^{6}R^{7} en donde R^{5}, R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno, un grupo alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, cicloalquilo C_{3-8}, arilo, alcoxi C_{1-6} o un grupo heterocíclico, amino, y R^{6} y R^{7} pueden juntos formar un grupo -(CH_{2})_{m}- o -(CH_{2})_{l}NR^{8}(CH_{2})_{k}- en donde k, l y m cada uno representa un número entero de 1-8 y R^{8} representa hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}; o R^{4} es un grupo (4-(N,N-dimetilamino)fenil)amino;
\quad
el grupo heterocíclico para cualquiera de R^{2}-R^{7} se selecciona de piridilo, furilo, tienilo, imidazolilo, pirazinilo y pirimidilo
\quad
el sustituyente opcional se selecciona de halógeno, alquilo C_{1-6}, cicloalquilo C_{3-8}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido con un átomo de halógeno, ariloxi, alquiltio C_{1}-_{6}, un grupo heterocíclico tal como se ha definido anteriormente, formilo opcionalmente protegido en forma de un acetal, alquil C_{1-6}-carbonilo, arilcarbonilo, carboxilo, alcoxi C_{1-6}-carbonilo, amino, alquilamino C_{1-6}, imino, tioacetal, nitro, nitrilo y trifluorometilo.
X e Y
pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa -CH_{2}-, -NH- u -O-, y
n
es un número entero de 0-4; y
(B) compuestos de la fórmula (I), en la que X es -NH-, n es 0, y los sustituyentes restantes se definen como sigue:
31
o una de sus sales para la fabricación de un medicamento eficaz como promotor de la condrogénesis, un agente de reparación de cartílago o un promotor de la reparación de fractura de huesos.
2. Uso de la reivindicación 1, en donde en la fórmula (I) R^{1} es halógeno, alquilo C_{1-6}, alcoxi C_{1-6} o nitro; R^{2} es hidrógeno o alquilo C_{1-6}opcionalmente sustituido, alquenilo C_{2-6} o arilo; R^{3} es alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, cicloalquilo C_{3-8} o arilo; R_{4} es alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, arilo un grupo heterocíclico; -OR^{5} o NR^{6}R^{7}, en donde R^{5}, R^{6} y R^{7} son como se han definido previamente; X es -CH_{2}-, -NH- o -O-; Y es -CH_{2}- o -NH-; y n es 0 ó 1.
3. Uso de la reivindicación 1, en donde en la fórmula (I) R^{2} es alquilo C_{1-6} con un sustituyente opcional que está opcionalmente sustituido con un átomo de halógeno; R^{3} es arilo opcionalmente sustituido; R_{4} es -NR^{6}R^{7}, en donde R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o arilo opcionalmente sustituido; X e Y pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa -CH_{2}- o -NH-; y n es 0.
4. Uso de la reivindicación 1, en donde R^{2} es alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido en el mismo carbono con dos grupos alcoxi C_{1-6}que están opcionalmente sustituidos con 1 a 5 átomos de halógeno o el grupo -O-Z-O-, en donde Z representa alquileno C_{1-6} opcionalmente sustituido con 1 a 10 átomos de halógeno; R^{3} es alquilo C_{1-6}-arilo, aminoarilo o alquilamino C_{1-6}-arilo; y; R_{4} es -NR^{6}R^{7} en donde R^{6} y R^{7} son iguales o diferentes y cada uno representa hidrógeno o un grupo como se ha definido para R_{3}.
5. Uso de la reivindicación 4, en donde R^{2} es un grupo de cualquiera de las fórmulas (II) o (III):
33
en donde R^{10} y R^{11} pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa un grupo alquilo de C_{1-6} opcionalmente sustituido con 1-5 átomos de halógeno,
34
en donde Z representa un grupo alquileno C_{1-6} opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de halógeno.
6. Uso de la reivindicación 5, en donde R^{10} y/o R^{11} son alquilo C_{1-6} con 1-5 átomos de halógeno.
7. Uso de la reivindicación 5, en donde R^{10} y R^{11} es la fórmula (II) son los mismos y se seleccionan de metilo, etilo, isopropilo, 2-fluoroetilo y 2-cloroetilo, y en la fórmula (I) X es -NH- e Y es -CH_{2}-.
8. Uso de la reivindicación 5, en donde R^{3} en la fórmula (I) es 4-metoxifenilo, X es -NH- e Y es -CH_{2}-.
9. Uso de la reivindicación 5, en donde R^{4} en la fórmula (I) es -NHR^{7}, en donde R^{7} es 4-metilfenilo, 4-etilfenilo o 4-(N,N-dimetilamino)fenilo, X es -NH- e Y es -CH_{2}-.
10. Uso de la reivindicación 5, en donde la combinación de R^{2}, R^{3} y R^{4} es cualquiera de las siguientes:
a)
R^{2} es 2,2-dietoxietilo, R^{3} es 4-metilfenilo y R^{4} es -NHR^{7}, en donde R^{7} se selecciona de 4-metilfenilo, 4-etilfenilo y 4-(N,N-dimetilamino)fenilo; o
b)
R^{2} se selecciona de 2,2-dimetoxietilo, 2,2-diisopropoxietilo, 2,2-bis(fluoroetoxi)etilo, y 2,2-bis(cloroetoxi)etilo, R^{3} es 4-metilfenilo y R^{4} es -NHR^{7}, en donde R^{7} es 4-metilfenilo.
11. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el compuesto de fórmula (I) o sus sal es ópticamente activo.
12. Compuesto de la fórmula (IV):
35
en donde R^{12} representa alquilo C_{1-6} sustituido en el mismo carbono con dos grupos alcoxi C_{1-6} cada uno sustituido con 1-5 átomos de halógeno, o una de sus sales.
13. Compuesto de la reivindicación 12, en donde R^{12} es un grupo de la fórmula (V):
36
en donde R^{13} y R^{14} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa alquilo C_{1-6} sustituido con 1-5 átomos de halógeno.
14. Compuesto de la reivindicación 13, en donde R^{13} y R^{14} pueden ser iguales o diferentes, y cada uno representa etilo sustituido con un átomo de halógeno.
15. Compuesto de la reivindicación 14, en donde R^{13} y R^{14} representan ambos 2-fluoroetilo o 2-cloroetilo.
16. Composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un compuesto de la fórmula general (IV), de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, o una de sus sales.
17. Uso de un compuesto de la fórmula (I) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o de la fórmula (IV) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 12-15 o una de sus sales para la fabricación de un medicamento eficaz como promotor de la condrogénesis.
18. Uso de un compuesto de la fórmula (I) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o de la fórmula (IV) como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 12-15, o una de sus sales para la fabricación de un medicamento eficaz como agente de reparación de cartílago o promotor de la reparación de fractura ósea.
19. Método para la producción ex-vivo de una composición que contiene condrocitos, que comprende cultivar condrocitos o células mesenquimales no diferenciadas en presencia de un compuesto de fórmula (I) como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o de fórmula (IV) como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12-15, o una de sus sales.
20. Composición que contiene condrocitos obtenible por un procedimiento como el definido en la reivindicación 19.
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