KR101419836B1

KR101419836B1 - Δ5-2-옥소피페라진 유도체를 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물

Info

Publication number: KR101419836B1
Application number: KR1020120049740A
Authority: KR
Inventors: 조재진; 박승범; 김종훈; 이동섭
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2012-05-10
Publication date: 2014-07-16
Also published as: KR20130126018A

Abstract

본 발명은 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체를 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 특이적으로 분화 유도하므로, 분화 유도된 연골세포를 이용하면 관절염, 연골 손상, 연골 결손 등의 연골 손상 질환 치료에 효과적일 수 있다.

Description

Δ5-2-옥소피페라진 유도체를 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물{Composition comprising Δ5-2-oxopiperazine derivative for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes}

본 발명은 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체를 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물에 관한 것이다.

연골은 뼈와 함께 골격을 구성하고 내부 기관들의 보호 역할을 하며, 연골 조직은 연골세포들과 그것을 둘러싼 연골 매트릭스로 이루어진다. 연골은 중간엽-유래의 연골아 세포에 의해 형성되는데, 연골아 세포는 세포 분화와 성장의 과정 동안 주변에 매트릭스를 만들어낸다. 연골 매트릭스의 주요 성분들은 프로테오글라이칸과 콜라겐이다(타입 II, 타입 IX 등). 프로테오글라이칸은 연골조직에 특유한 흡수(팽화) 특성에 관여하고, 콜라겐은 긴장과 전단력에 대항하여 연골의 단단함에 관여하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로 생체 내에서 재생이 되지 않는다. 이러한 관절의 연골조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되며, 만성화될 경우 치명적인 퇴행성관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다. 연골장애로 인한 알려진 병들의 예들은 변형성 관절증, 연골형성이상증, 퇴행성 추간판증 또는 반월판 손상을 포함한다.

지금까지 개발된 손상 연골의 치료법으로는 연골성형술(chondroplasty), 골연골이식술(osteochondraltransplantation), 자기유래연골세포 이식술(autolaugous chondrocyte transplantation) 등을 들 수 있다.

상기 연골성형술은 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 직접적인 관절 절개가 필요 없어 환자의 고통 및 부담을 줄일 수 있으며, 관절경을 통해 미세한 조직손상을 관찰 즉시 치료할 수 있다는 장점을 지닌다. 그러나 연골성형술에서는 실제의 관절에 필요한 초자연골(hyaline cartilage)이 아니라 섬유 연골(fibro-cartilage)이 주로 생성되기 때문에, 기능적인 측면에서 볼 때는 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다.

한편 골연골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 연골과 연골하골 부분을 함께 채취하여, 손상된 연골부 위에 적당한 구멍을 파고 이식하여 초자연골을 생성하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식(autolaugous transplantation)이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다.

최근 시행되기 시작한 자가 유래 연골세포 이식술은 환자의 정상부위에서 채취한 연골조직으로부터 연골세포를 얻어, 체외에서 필요한 수만큼 배양하고 증식한 후, 이를 연골 손상부위에 골막(periosteum)을 이용하여 공간을 확보하고 배지와 함께 주입하여, 이 세포들의 증식에 의해 손상된 연골 부분을 채우도록 하는 방법이다. 그러나 자가 유래 연골세포 이식술은 공여 조직이 제한되어 있고, 이식용 조직을 채취하기 위한 수술을 필요로 하기 때문에 시술 과정이 복잡하고 까다롭다.

상기 방법을 응용하여 자가 유래 골수(bone marrow), 근육, 피부 등의 중간엽 조직으로부터 연골세포(chondrocyte)의 전구모세포(precursor cell)인 중간엽세포(mesenchymal stem cell; MSC)를 얻고, 체외에서 분화시켜 고분자와 함께 관절연골손상 부위에 주입하는 방법이 보고 된 바 있다. 상기와 같이 성숙된 개체에서 얻은 중간엽세포를 이용하여 연골손상을 치료하는 방법은 자가 유래 연골세포 이식술에 비해, 보다 미분화된 세포를 얻어 체외 배양하므로 세포 증식력이 다소 높아지는 것으로 나타났다. 상기 중간엽세포에서 연골세포의 분화를 유도하는 인자들로는 BMP(bone mophogenetic protein), TGF-β(transforming growth factor β),FGF(fibroblast growth factor), IGF-I(insulin-like growth factor), 파라티로이드 호르몬 관련 펩타이드가 알려져 있다. 그러나 상기 분화인자들은 중간엽세포에서 연골세포로의 분화 유도시 원치 않는 다른 세포로의 분화를 유발하는 문제점을 가지고 있다. 즉, TGF-β의 경우 중간엽세포가 비대연골세포로 분화될 위험이 있으며, BMP의 경우 골증식체(osteophyte formation)로 분화될 위험이 있다.

따라서, 기존의 중간엽세포에서 연골세포의 분화를 유도하는 인자들에 비해 부작용이 적고, 효과적인 분화 유도용 물질에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화유도에 유용한 물질에 대해 탐색하던 중, Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체가 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도를 기존의 물질보다 효과적으로 유도함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체를 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체를 중간엽 줄기세포에 처리하여 연골세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화 유도된 연골세포를 포함하는 연골 손상 질환 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체를 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체를 중간엽 줄기세포에 처리하여 연골세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화 유도된 연골세포를 포함하는 연골 손상 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 Δ⁵-2-옥소피페라진 유도체는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 특이적으로 분화 유도하므로, 분화 유도된 연골세포를 이용하면 관절염, 연골 손상, 연골 결손 등의 연골 손상 질환 치료에 효과적일 수 있다.

도 1은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSCs)의 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)결과를 나타낸 도이다. 검은 선은 면역 글로불린 이소타입 대조군을 나타내며, 붉은 선은 다른 특정한 세포 표면 마커를 나타낸다.
도 2는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSCs)의 형태학적 분석을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 연골세포 볼(Chondrocyte ball)의 형태학적 분석을 나타낸 도이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 연골세포 볼의 GAG/DNA(㎍/㎍) 양을 나타낸 도이다. 14일과 28일 후에 측정한 값을 의미한다.
도 6은 본 발명의 연골세포 볼의 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 연골세포 볼의 RT-PCR의 결과를 나타낸 도이다. 4일과 14일 후에 측정한 값을 의미한다.

본 발명은 화학식 1의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다:

[화학식1]

상기 화학식 1에서,

R₁은C₁-C₁₀의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, R₃-(CH₂)_n-, 또는

이고,

여기서 R₃은 C₁-C₄의 알콕시, C₃-C₂₀의 시클로 알킬 또는 C₃-C₂₀의 헤테로 시클로 알킬이며,

R₄는 H, 할로겐 원자, C₁-C₄의 알콕시, 아민, 아세틸 또는 CF₃이고,

n, m 및 p는 각각 1 내지 5의 정수이고,

R₂는 C₁-C₁₀의 직쇄 또는 분지쇄의 알킬, 또는 -CH₂-C₆H₄-R₅이고,

여기서 R₅는 C₁-C₄의 알킬, C₁-C₄의 알콕시 또는 할로겐 원자로 치환 또는 비치환된 C₆-C₂₀의 아릴이다.

바람직하게는, 상기 화학식 1에서

R₁은 부틸, 이소부틸, 이소펜틸, R₃-(CH₂)_n- 또는

이며,

여기서 R₃는 메톡시, 시클로 헥실 또는 테트라 하이드로 퓨라닐이고,

R₄는 H, F, 메톡시 또는 CF₃이고,

n 및 m은 각각 1 내지 3의 정수이고,

p는 1 내지 5의 정수이고,

R₂는 이소프로필 또는 -CH₂-C₆H₄-R₅이고

여기서 R₅는 H, 메틸, 메톡시, OH 또는 Cl이다.

더욱 바람직하게는, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 표 1에 나타난 화학식 1-1의 화합물 내지 화학식 1-34의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다.

화학식 번호	구조식	화학식 번호	구조식
1-1		1-2
1-3		1-4
1-5		1-6
1-7		1-8
1-9		1-10
1-11		1-12
1-13		1-14
1-15		1-16
1-17		1-18
1-19		1-20
1-21		1-22
1-23		1-24
1-25		1-26
1-27		1-28
1-29		1-30
1-31		1-32
1-33		1-34

본 발명의 화학식 1의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 용매화물로 제조될 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 특별히 언급되지 않는 한, 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

상기 약학적으로 허용가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 석신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid),젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산 (gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 제조할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 중간엽 줄기세포에 처리하여 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 연골세포로의 분화 유도를 위해 사용되는 중간엽 줄기세포의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 중간엽 줄기세포가 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 모두 이용될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 상기 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 골수, 조직 등의 채취 대상의 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 연골세포로의 분화가 유도된 중간엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

상기 중간엽 줄기세포에 대해 화학식 1의 화합물을 처리하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 일정 시간 동안 화학식 1의 화합물과 중간엽 줄기세포를 접촉시켜 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화 유도될 수 있기만 하면 된다. 한 구체예에서, 화학식 1의 화합물의 처리는 중간엽 줄기세포를 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행할 수 있다.

중간엽 줄기세포에 처리되는 화학식 1의 화합물의 농도는 구체적인 화학식 1의 화합물의 종류나 중간엽 줄기세포에 처리되는 기간, 또는 연골세포로의 분화 요구 정도 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에서 화학식 1의 화합물의 농도는 10nM 내지 50μM, 바람직하게는 10μM로 사용될 수 있다.

중간엽 줄기세포에 대한 화학식 1의 화합물의 처리의 기간은 처리되는 화학식1의 화합물의 종류 또는 농도에 따라 달라질 수 있다. 중간엽 줄기세포의 분화 유도에 일반적으로 요구되는 시간을 고려할 때, 화학식 1의 화합물을 포함하는 배지에서의 배양은 5일 내지 15일 동안 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 "연골세포"는 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포 또는 연골세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다.

본 발명의 분화 유도용 조성물은 중배엽 줄기세포의 배양시 일반적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 이러한 배지로는 예컨대, MEM-alpha (Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 화학식 1의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도용 조성물은 중간엽 줄기세포와는 별도로 체내에 도입될 수도 있다. 즉, 중간엽 줄기세포의 투여 전이나 후, 또는 중간엽 줄기세포의 투여와 동시에 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물이 별도로 투여될 수도 있다. 이 경우 상기 조성물은 화학식 1의 화합물의 투여에 적합한 공지의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의한 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포를 포함하는 연골 손상 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 연골세포는 GAG/DNA 함량이 높고, 중간엽 줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도가 매우 잘 일어나므로, 연골 손상 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 연골 손상 질환으로는 관절염, 연골 손상, 연골 결손 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 약학 조성물은 줄기세포의 이식을 위해 당업계에서 사용되고 있는 공지의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 연골 세포의 투여량은 1×10⁴ 내지 1×10⁸세포/㎏일 수 있다. 그러나, 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 병변의 정도에 따라 적의 증감될 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예, 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제조예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 화학식 1-1의 화합물의 제조

1-1. 화학식 3의 화합물의 제조

0.1M의 DMF 내의 tert-부틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 용액(1당량)에 교반상태에서 화학식 2의 아미노산(1.1당량) 및 DIPEA(N,N-diisopropylethylamine)(2당량)을 가하고 50℃에서 교반하였다. 반응 완결을 TLC로 확인한 후, 혼합물을 감압 농축하고, 실리카겔 칼럼 그로마토그래피(Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제 화학식 3의 화합물(수율 : 85%)을 제조하였다.

화학식 3의 화합물의 NMR 데이터 및 Mass Spectrum 데이터는 다음과 같다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.84 (br s, 1H), 8.74 (br s, 1H), 8.60 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.09 (s, 4H), 6.65 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.49 (br s, 1H), 3.33-3.30 (m, 1H), 3.18-3.15 (m, 1H), 1.56 (s, 9H);

LRMS (ESI+) m/z calcd for C₂₁H₂₃N₂O₆ [M-H] ^-: 399.16;found 399.08

1-2. 화학식 4의 화합물의 제조

0.1M의 DCM 내의 4-메톡시벤질아민(1당량)에 물 내의 60%의 2,2-디메톡시아세트알데히드(2당량)용액을 교반상태에서 가한 후, 무수 Na₂SO₄를 가하고 실온에서 3시간동안 교반하였다. 이민의 형성을 TLC로 확인한 후, 반응 혼합물을 셀라이트로 여과한 다음 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 0.1M의 THF에 다시 용해하고, 0℃의 아르곤 기체 하에서 LiAlH₄(1.5당량)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 완료를 TLC로 확인한 후, 혼합물에 에틸 아세테이트를 가하여 반응을 종결시켰다. 생성 혼합물 용액을 여과한 다음 여과액을 감압 농축하였다. 잔류물을 DCM으로 희석하고, 포화 NaHCO₃ 수용액으로 세척하였다. 모아진 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과한 다음 여과액을 감압 농축하고, 실리카겔 칼럼 그로마토그래피(Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제 화학식 4의 화합물(수율 : 73%)을 제조하였다.

화학식 4의 화합물의 NMR 데이터 및 Mass Spectrum 데이터는 다음과 같다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.19 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.82 (d, J = 9 Hz, 2H), 4.45 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.70 (s, 2H), 3.32 (s, 6H), 2.69 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 1.81 (s, 1H);

¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 158.7, 132.2, 129.4, 113.8, 103.9, 55.2, 53.9, 53.3, 50.4;

LRMS (ESI+) m/z calcd for C₁₂H₂₀NO₃ [M+H]⁺: 226.14; found 226.00.

1-3. 화학식 1-1의 화합물의 제조

0.1M의 DMF 내의 화합물3(1.2당량)의 용액에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC·HCL)(3당량) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(0.3당량)을 교반상태에서 가하였다. 이후, 화합물 4(1당량)를 가하여, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 반응 완결 후, 혼합물을 감압 농축하였고, 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 포화 NaHCO₃ 수용액으로 세척하였다. 모아진 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과한 다음 여과액을 감압 농축하여 중간체 화합물 5를 얻었다. 이 중간체 화합물 5를 포름산에 용해시키고 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후에, 포름산을 감압하에서 톨루엔과 함께 공비 증발(azeotropic evaporation)에 의해 제거하였다. 혼합물을 실리카겔 칼럼 그로마토그래피(Silica gel column chromatography)로 정제하여 표제 화학식 1-1의 화합물(수율 : 86%)을 제조하였다.

화학식 1-1의 화합물의 NMR 데이터 및 Mass Spectrum 데이터는 다음과 같다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.94 (br s, 1H), 8.34 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 8.9, 2.0 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.07 (s, 4H), 6.91 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.12 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 5.39 (dd, J = 5.4, J = 1.8 Hz, 1H), 4.89 (d, ²J = 14.7 Hz, 1H), 4.76-4.71 (m, 1H), 4.59 (d, ²J = 14.7 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.09-3.03 (m, 2H), 2.32 (s, 3H);

¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 169.4, 163.9, 159.5, 141.8, 140.8, 137.4, 133.7, 133.1, 129.9, 129.6, 129.5, 128.7, 128.1, 122.0, 120.3, 116.0, 114.4, 111.2, 64.9, 55.5, 48.6, 34.4, 21.3;

HRMS (FAB+) m/z calcd for C₂₇H₂₅N₃O₆ [M+H]⁺: 488.1822; Found: 488.1824.

제조예 2 ~ 34. 화학식 1-2 내지 1-34의 화합물의 제조

상기 제조예 1에 기재된 제조방법과 유사한 제조방법으로, 화학식 1-2 내지 1-34의 화합물을 제조하였다. 제조된 화합물들의 구조식은 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

1-1. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(Human bone-marrow-derived MSCs, hBM-MSCs)의 분리와 배양

hBM-MSCs는 IBR에 의해 승인된(No.: SD-0090001) 서울대학교 병원의 어린이 심장 수술과정에서 얻었다. hBM-MSCs는 DMEM(high glucose Dulbecco's modified Eagles medium) (Welgene, Korea) 배지에서 배양되었다. 이 배지는 20%의 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)(Hyclon, USA)과 1%의 항생제-항진균제(Gibco, USA)를 포함한다. 세포는 70%까지 증식시켰으며, 8계대의 세포가 연골세포로의 분화를 위해 사용되었다.

1-2. FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting) 분석

여러가지 줄기세포 표면 마커의 발현상태를 시험하기 위해 FACS를 수행하였다. FACS의 수행 전, 세포를 2%의 FBS가 가해진 PBS에서 분리하고 세척하였다.

형광강도(fluorescence intensity)는 FACS Calibur^TM에 의해 측정되었고, 데이터 분석은 BD CellQuest Pro software(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 의해 수행되었다.

FACS에 다음의 항체들이 사용되었다. fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD14, CD31, CD44 and CD45; phycoerythrin (PE)-conjugated mouse anti-human CD29, CD73, and CD117; PE/Cy5-conjugated mouse anti-human CD90; allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD34; HLA-DR; PE-conjugated streptavidin; biotin-conjugated HLA class II (BD PharMingen, San Diego, CA, USA); APC-conjugated mouse anti-human CD105 (eBioscience, USA).

1.0×10⁵여개의 세포는 각각의 1차 항체와 함께 빙점조에서 30분간 배양되었다. 세척 후에 2차 항체를 가하여 빙점조에서 30분간 배양하였다. 이후, 세포를 4℃에서 4%의 파라포름알데히드에서 고정하였다.

FACs의 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, hBM-MSCs는 CD29 (98.23%), CD44 (94.76%), CD73 (52.74%), CD90 (0.74%), 및 CD105 (31.31%)와 같은 중간엽 줄기세포의 마커를 발현시켰다. 그 외에 몇몇 세포는 조혈모세포의 마커인 CD14 (0.21%), CD34 (0.28%), CD45 (0.24%), CD117 (0.13%), 및 HLA-DR (0.19%)를, 내피 세포의 마커인 CD31 (0.14%) 등도 발현시켰다. CD29(β1-integrin)와 CD44(hyaluronan receptor)의 높은 발현은 사용된 hBM-MSCs의 대부분이 중간엽 줄기세포임을 나타낸다. 또한, 조혈모세포 또는 내피 세포의 마커가 적게 발현된 것은 hBM-MSCs가 오염되지 않았음을 나타낸다. 또한, 중간엽 줄기세포의 특정한 마커인 CD105(endoglin)가 상대적으로 적게 발현된 것은 골형성 분화 과정이 존재한다는 것을 암시한다.

1-3. hBM-MSCs의 연골세포로의 분화

중간엽 줄기세포를 0.25%의 트립신으로 분리시켰고, 혈구계수기(hemocytometer)로 카운트하였다. 연골세포 볼(Chondrocyte ball) 2.5×10⁵여개의 세포가 원추형 튜브(conical polypropylene tubes)에 형성되었다. 구체적으로는, hBM-MSCs의 연골세포로의 분화에 대한 TGF-β3 및 화학식 1-1의 화합물의 효능을 알아보기 위해 중간엽 줄기 세포가 담긴 튜브를 500g 내지 1000g, 바람직하게는 500g로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 FBS를 포함하는 배지를, TGF-β3(10ng/mL) 또는 화학식 1-1의 화합물(10μM)이 각각 포함된 고농도의 포도당 함유 DMEM 합성배지 (100nM의 덱사메타손, 50㎍/mL의 아스코르베이트-2-인산염(ascorbate-2-phosphate), 100㎍/mL의 소듐 피루베이트, 40㎍/mL의 L-프롤린 및 1%의 ITS+Premix(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 포함)로 교체하고 배양하였다. 배양은 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 배양되었고, 배지는 3~4일마다 새로운 배지로 교체하였다.

인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSCs)와 연골세포 볼의 형태학적 분석 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 4계대의 hBM-MSCs의 표면은 전형적인 섬유아세포 유사 표현형(fibroblast-like phenotype)을 나타내었으며 균질하였다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, TGF-β3 또는 화학식 1-1의 화합물을 포함하는 합성배지에서 각각 형성된 연골세포 볼의 크기는 크게 차이가 없었다.

실험예 1. 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan, GAG)/DNA의 측정

본 발명의 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 연골세로 볼의 GAG/DNA 함량을 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

2가지의 다른 조건(TGF-β3 또는 화학식 1-1의 화합물)에서 형성된 연골세포 볼들의 GAG의 양을 Blyscan Sulfate Glycosaminoglycan Assay kit (biocolor, Belfast, Ireland)를 이용하여 측정하였다. 본 실험은 제조자의 지시에 따라서 수행되었다. 새로운 에펜도르프 튜브에 2개의 연골세포 볼을 각각 넣고, papain 버퍼 용액(0.2 M sodium phosphate buffer, 0.1 M sodium acetate, 10 nM EDTA, 5 mM L-cysteine HCl, 10 μL/mL papain (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), pH 6.4) 500μL를 가하였다. 이 튜브를 항온조에서 24시간 동안 60℃로 배양하였다. 튜브를 3300g로 5분간 원심분리한 뒤, 100μL의 상등액을 새 튜브에 옮겨 담고, 1mL의 Blyscan 염색 시료 용액을 튜브에 가하였다. 이 튜브를 실온에서 부드럽게 진탕하며(in gentle shaker) 30분동안 배양하였다. 이러는 동안 설페이티드 글리코사미노글리칸-염료 복합체(sulphated glycosaminoglycan-dye complex)가 형성되었다. 이 튜브를 10000g로 10분간 원심분리하였고, 상등액을 조심스럽게 제거한 뒤, 설페이티드 글리코사미노글리칸-염료 복합체 펠렛(pellet)을 종이 티슈에 놓고 실온에서 건조시켰다. 여기에 분리 시약(dissociation reagent) 1mL를 가한 뒤, 캡을 닫고, 볼텍싱 하였다. 10분 간의 혼합 후에, 656nm의 파장에서 이 용액의 흡광도를 측정하였다.

총 DNA의 양을 측정하기 위해, Pico-green dsDNA assay kit (Invitrogen, USA) 를 사용하였으며, 제조자의 지시에 따라서 수행하였다.

GAG의 양은 DNA의 양에 대하여 표준화되었다. 실험 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화학식1의 화합물이 포함된 배지에서 형성된 연골세포 볼의 GAG/DNA의 양이 TGF-β3에 비해 높게 나타남을 확인하였다.

실험예 2. 조직 염색 및 면역 조직 화학

파라핀 절편(paraffin section)을 위해, 2가지 조건(TGF-β3 또는 화학식 1-1의 화합물)에서 배양된 연골세포 볼들을 각각 4%의 포르말린으로 고정하였고, 파라핀에 임베딩(embedding)시켰다. 파라핀에 임베딩된 샘플들은 4㎛의 두께로 나뉘었고, 탈파라핀화 되었다. 프로테오글리칸(proteoglycan)을 관찰하기 위해 탈파라핀화 된 샘플을 헤마톡셀린&에오신(H&E) 및 Safranin O으로 염색하였으며, 칼슘의 침착 정도를 보기위해 Von Kossa 염색을 하였다. 또한 콜라겐 Ⅰ형과 Ⅱ형을 관찰하기 위해 ABC detection kit (Cap-plus detection Kit, Invitrogen)를 사용하였으며, 제조자의 지시에 따라서 수행하였다. 간단히, 샘플에 3%의 퍼옥시다아제를 가하여 10분간 보관한 뒤, PBS로 3차례 세척하고 펩신 용액을 가하였다. ABC detection kit의 차단 용액에 의해 비특이적인 결합이 최소화되었다. 1차 항체[(콜라겐 Ⅰ형에 대해 특이적인 래빗 다클론 항체)(Abcam, UK), (콜라겐 Ⅱ형에 대해 특이적인 마우스 단일클론 항체)(Calbiochem, Germany), 1:100 및 1:10으로 희석되었다.]를 가하고, 2차 항체(항-래빗 항체, 항-마우스 항체)를 가한 뒤, streptavidin-HRP (horse-radish peroxidase)를 가하였다. 면역 조직 화학 염색은 퍼옥시다아제의 활성에 따른 DAB(3,3'-diaminobenzidine)의 색 발현에 의해 시각화되었다. 염색 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1-1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양된 연골세포 볼은 중간엽 줄기세포로부터 매우 잘 분화 유도됨을 확인하였다.

실험예3. 연골세포 볼의 RT-PCR

RT-PCR을 위해, 각각 다른 배지에서 배양된 연골세포 볼을 4일과 14일에 수집하였다. 연골세포 볼은 액체질소 내에서 소화되었으며, 연골세포 볼로부터 모든 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen Life Technologies, USA)을 이용하여 추출하였다. PCR에서 사용될 주형(template)으로써 complementary DNA(cDNA)를 합성하기 위해, total RNA 1㎍을 cDNA Synthesis Kit (M-MLV RT, Invitrogen, USA)를 이용하여 역전사 하였다. PCR 동안, 총 반응 부피는 20μl이었으며, 이것은 1μl의 cDNA, 1μl의 프라이머(10pM), 1μl의 PCR premix(Accupower PCR premix, Bioneer, Korea), 17μl의 살균된 물로 이루어졌다. PCR은 Mastercycler gradient(Eppendorf, Germany)로 행해졌으며 PCR 조건은, 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초간 증폭, 각 프라이머에 적합한 온도(하기 표 2 참조)에서 30초간 어닐링, 72℃에서 20초간 확장하였으며, 총 30~40 사이클 행하였다. 마지막 확장은 72℃에서 5분간 행하였다. RT-PCR 프라이머 서열과 어닐링 온도는 표 2에 나타내었다. PCR 결과물에 대한 분석을 위해서, 0.01mg/mL의 브롬화 에티듐(ethidium bromide)이 가해진 1.2%의 아가로오스 젤에서 DNA 젤 전기영동을 행하였다. 그리고 Bio-profil X press zoom 2000 (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallee, France)로 정량화하였다.

실험 결과는 도 7에 나타내었다.

표적 유전자	서열	어닐링 온도	크기
GPADH	F: 5’ TGT TGC CAT CAA TGA CCC CTT 3’	55℃	202bp
	R: 5’ CTC CAC GAC GTA CTC AGC G 3’
Collagen X	F: 5` CCC TTT TTG CTG CTA GTA TCC 3`	58℃	468bp
	R: 5` CTG TTG TCC AGG TTT TCC TGG CAC 3`
SOX9	F: 5` ATC TGA AGA AGG AGA GCG AG 3`	60℃	264bp
	R: 5` TCA GAA GTC TCC AGA GCT TG 3`
Aggrecan	F: 5` TCC TCT CCG GTG GCA AAG AAG TTG 3’	60℃	271bp
	R: 5` CCA AGT TCC AGG GTC ACT GTT ACC G 3`

도 7에 나타난 바와 같이, Col X는 TGF-β3에만 발현되고, 화학식 1-1의 화합물에 대해서 발현되지 않은 것은, 화학식 1-1의 화합물이 중간엽 줄기세포를 연골세포에 대해서 더욱 특이하게 유도 분화 시키며, 골형성에는 기여하지 않았다는 것을 알 수 있다. 또한 화학식 1-1의 화합물에 대해 Sox 9과 Aggrecan이 발현된 것은 화학식 1-1의 화합물이 처리된 줄기세포가 연골세포로 제대로 분화되었음을 나타낸다.

Claims

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생체 외에서 화학식 1-1의 화합물에 분리된 중간엽 줄기세포를 처리하여 연골세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
[화학식1-1]
제5항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것임을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
제5항에 있어서, 상기 화학식 1-1의 화합물에 분리된 중간엽 줄기세포를 처리하는 단계는 중간엽 줄기세포를 화학식 1-1의 화합물을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
제7항에 있어서, 상기 배지는 MEM-알파 (Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
제7항에 있어서, 상기 배양은 5~15일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 방법.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 분화 유도된 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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