PT2107913E

PT2107913E - Uso de polissacarídeos tiolados para aumento de tecidos

Info

Publication number: PT2107913E
Application number: PT07855366T
Authority: PT
Inventors: Margit Hornof
Original assignee: Croma Pharma Ges M B H
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2012-05-10
Also published as: WO2008077172A2; DK2107913T3; JP5513893B2; SI2107913T1; EP2107913B1; CA2673323C; BRPI0722061A2; US9597277B2; BRPI0722061B8; ES2391862T3; AU2007336692B2; RU2009128235A; JP2010512859A; WO2008077172A3; CA2673323A1; EP2107913A2; BRPI0722061B1; CN101622017A; PL2107913T3; ATE545436T1

Description

ΡΕ2107913 1

DESCRIÇÃO "USO DE POLISSACARÍDEOS TIOLADOS PARA AUMENTO DE TECIDOS"

Para o aumento de tecidos, polímeros como, por exemplo, ácido hialurónico reticulado com compostos de éter e de éster (reticulados com divinilsulfona: WO 2006/056204; reticulação com aldeídos: US 4 713 448; reticulados com compostos epoxi multifuncionais: EP 0 161 887) são habitualmente usados. Depois da implantação no corpo humano, estes compostos podem conduzir a reacções inflamatórias, reacções alérgicas e reacções contra corpos estranhos (Parade et al. Skinmed. 4 (2005): 345-349; Lemperle et al. Plast. Reconstr. Surg. 118 (2006):92S-107S) . Esses processos inflamatórios podem conduzir ao desenvolvimento de compostos de oxigénio reactivo. A activação de oxigénio até compostos de oxigénio reactivo (espécies de radicais livres e de oxigénio não radical) faz parte dos processos metabólicos normais no enquadramento dos processos celulares, reacções de auto-oxidação e reacções enzimáticas. Outras causas para a formação de compostos de oxigénio reactivo são, por exemplo, processos inflamatórios, danos em tecidos e articulações assim como factores ambientais exogénicos, tais como radiação UV, fumo de cigarro, exposição à radiação e ao ozono. Normalmente, há um equilíbrio entre os 2 ΡΕ2107913 processos oxidantes e redutores. Se, contudo, as reacções oxidantes prevalecem, uma tensão oxidante (condição oxi-dante) irá desenvolver-se. Pelo ataque dos radicais livres, os lipidos, proteínas e ADN são danificados. Este dano é, i.a., provavelmente a causa de alterações relacionadas com a idade e com as doenças, por exemplo, do envelhecimento da pele, diabetes, doenças vasculares e doenças neurodene-gerativas.

Em muitos casos, os radicais livres, tais como os radicais de hidroxilo, são co-responsáveis por doenças inflamatórias, por exemplo, pelo desenvolvimento e perpetuação de doenças inflamatórias das articulações, tal como a artrite reumatóide. No início de uma artrose, os radicais livres provocarão a degradação do ácido hialurónico no fluido sinovial, conduzindo a uma diminuição na viscosidade e no efeito lubrificante do fluido sinovial (Lepperdinger et al. em Chemistry and Biology of Hyaluronan (2004):71-82) .

Normalmente, também o fluido lacrimal contém exterminadores dos radicais tais como, por exemplo, cisteína, ácido ascórbico e glutationa reduzida, e enzimas antioxidantes tais como, por exemplo, lactoferrina e lisozima, de maneira a proteger a superfície do olho contra os danos oxidativos dos radicais livres (radicais de hidroxilo, por exemplo) (Rose et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217 (1998):397-407). 3 ΡΕ2107913

Pela remoção dos radicais livres por meio dos exterminadores de radicais, podem ser inibidos os processos inflamatórios. As funções protectoras endógenas contra compostos de oxigénio reactivo são efectuadas por enzimas, tais como catalase, dismutase de superóxido (SOD) e peroxidase de glutationa (GPx), assim como glutationa reduzida (GSH) e proteínas formadoras de ferro e de cobre (por exemplo, ferritina, albumina, lactoferrina). Antioxi-dantes exógenos importantes são ácido ascórbico e derivados, tocoferol e retinóides. A maioria dos medicamentos anti-inflmatórios de baixo teor molecular, tais como, por exemplo, Diclofenac e Piroxicam, também têm propriedades exterminadoras de radicais (Aruoma e Halliwell, Xenobiotica 18 (1988) :459-470) . O ácido hialurónico, que é frequentemente usado para o aumento de tecidos, exibe, ele próprio, um efeito anti-inflamatório mínimo e é um fraco exterminador de radicais hidroxi. Para aumentar o efeito antioxidante do ácido hialurónico e para reduzir as reacções inflamatórias depois da injecção do ácido hialurónico, foi proposta a aplicação combinada do ácido hialurónico com manitol (WO 2004/073759). Contudo, este tipo de aplicação é desvantajoso porque o manitol pode difundir-se para fora do depósito de ácido hialurónico. Noutra abordagem, a enzima dimutase de superóxido foi conj ugada com o ácido hialurónico o que resultou num decréscimo da actividade enzimática de 30% (Sakurai et al . Glycocon. J. 14 (1997) : 723-728) . Embora ambas as propostas aumentem o efeito 4 ΡΕ2107913 antioxidante do ácido hialurónico, o efeito desejado dura um curto período de tempo porque a ressorção do ácido hialurónico não é retardada. 0 ácido hialurónico não modificado, isto é, ácido hialurónico não reticulado, é ressorvido dentro de um par de horas ou dias depois da sua implantação no corpo humano. 0 documento WO 00/16818 divulga o uso de ácidos hialurónicos quimicamente modificados que gelificam in situ. Contudo, no documento WO 00/16818 não restam grupos tiol depois da reacção de reticulação.

Portanto, é um objecto da presente invenção fornecer compostos para o aumento de tecidos que, por conta das suas propriedades exterminadoras de radicais e de complexação multivalente de iões de metal têm um efeito antioxidante e, simultaneamente, são caracterizados por um tempo de residência mais longo no ponto de aplicação.

Portanto, a presente invenção refere-se ao uso de um polímero contendo o grupo tiol para produzir um implante para o aumento e a estabilização de tecidos, onde o polímero é um polissacarídeo que é, preferivelmente, biodegradável. A aplicação dá-se, preferivelmente, via injecção subdérmica, intradérmica, subcutânea ou intramuscular.

Descobriu-se que os polímeros contendo o grupo tiol, isto é, os compostos poliméricos fisiologicamente toleráveis contendo o grupo tiol, são particularmente bem 5 ΡΕ2107913 apropriados para o aumento de tecidos, onde estes polímeros exibem, ao mesmo tempo, um efeito protector anti-inflamatório/antioxidante.

Os processos oxidantes desempenham um papel decisivo em grande número de doenças, visto esses processos conduzirem a um dano do ADN, das proteínas e dos lípidos. Os processos oxidantes podem ser induzidos por causas extrínsecas (por exemplo, por influências ambientais, tais como radiação (radiação UV, radiação de ionização), agentes de oxidação, etc.) e causas intrínsecas (por exemplo, por inflamações), respectivamente. A acoplagem directa de antioxidantes de tiol ao polímero tem a vantagem de manter o efeito protector antioxidante durante todo o tempo de residência do polímero e de a reticulação devida as funções de ligações de dissulfureto contribuem para a estabilidade do polímero. A melhoria das propriedades exterminadoras de hidroxi e antioxidantes do ácido hialurónico conseguidas para tiolação está exemplificada nas Fig. 2, Fig. 3 e Fig. 4.

De acordo com a presente invenção, o termo "implante" refere-se a um fluido injectável, preferivelmente estéril, do tipo gel ou preparação semi sólida, que irá essencialmente manter-se durante pelo menos várias semanas até um mês ou mesmo durante anos no ponto de aplicação ou na sua vizinhança, até o implante se degradar pelo menos parcialmente, preferivelmente substancialmente na sua totalidade. 6 ΡΕ2107913

De acordo com um modelo de realização preferido, o polímero contendo o grupo tiol tem uma massa molecular de pelo menos 10000 g/mole, preferivelmente de pelo menos 25000 g/mole, em particular pelo menos 50000 g/mole. A massa molecular do polímero inventivo contendo o grupo tiol é de particular relevância se for importante que, quando se usar o polímero, este se mantenha directamente no ponto activo ou na sua vizinhança imediata durante um período mais longo do que os antioxidantes conhecidos até agora que têm uma massa molecular substancialmente inferior. Isto é particularmente vantajoso se for importante controlar os processos de oxidação local ou interrompê-los, respectivamente, ou reduzi-los. Portanto, é preferido que o polímero contendo grupo tiol tenha pelo menos uma massa molecular de 10000 g/mole.

Os grupos tiol contidos no polímero formam preferivelmente ligações de dissulfureto inter- e/ou intra-moleculares. A capacidade do polímero inventivo contendo o grupo tiol para formar ligações de dissulfureto é necessária se for importante exercer propriedades antioxidantes no ponto activo ou na sua vizinhança. Como está ilustrado na Fig. 1, o polímero que contém o grupo tiol reduzido pode ser usado para reduzir o dissulfureto de glutationa que desempenha um papel decisivo na desintoxicação do peróxido 7 ΡΕ2107913 de hidrogénio. Devido às suas propriedades antioxidantes, os polímeros contendo o grupo tiol inibem ainda a esforço oxidativo directamente provocado pelos radicais de hidroxilo e, assim, podem prevenir danos do DNA, lípidos e proteínas. Além disso, os polímeros contendo o grupo tiol inibem a formação de radicais de hidroxilo pela complexação dos iões de ferro bivalentes. Desta forma, a reacção de Fenton do peróxido de hidrogénio até radicais de hidroxilo pode ser interrompida ou grandemente reduzida, respecti-vamente.

Depois da síntese doo polímero de acordo com a presente invenção, todos os seus grupos tiol estão preferivelmente disponíveis como grupos tiol, de maneira que o polímero é reticulado em grau reduzido ou até nem é reticulado de todo. Isto permite produzir soluções de fase aquosa únicas de polímeros que podem ser facilmente mais processados e permite introduzir nos referidos polímeros excipientes farmacêuticos de compostos farmaceuticamente activos. A ligação cruzada ocorre depois sob condições controladas, alterando o pH até valores de pH fisiológico entre pH 6-10,5 na presença de oxigénio. A adição de um agente de ligação cruzada não é necessária. Para a aplicação em aumento de tecidos, por razões medicinais e cosméticas, é preferida a ligação cruzada parcial dos polímeros via pontes de dissulfureto.

Também deveria mostrar-se que os polímeros compreendendo grupos tiol reticulados via pontes de dissul- 8 ΡΕ2107913 fureto para o aumento de tecidos exibem uma estabilidade muito superior comparados com os polímeros convencionais conhecidos na técnica. 0 polímero de acordo com a presente invenção pode ser usado cosmeticamente ou terapeuticamente pelo que, o tecido mole, em particular o tecido dérmico, o tecido muscular e o tecido conjuntivo, é preferivelmente aumentado. 0 aumento dérmico cosmético é preferivelmente usado para tratar cosmeticamente as rugas profundas na região da face, em particular nas pregas nasolabiais, pregas do lábio superior e pregas da testa, as pregas finas na região dos olhos e da face, pequenas irregularidades da pele e construção de bochechas em faces encovadas. A porção do grupo tiol do polímero é, preferivelmente, superior a 20 pmoles/g de polímero, preferivelmente mais de 50 pmoles/g, em particular mais do que 100 pmoles/g de polímero.

As propriedades antioxidantes dos polímeros inventivos contendo o grupo tiol são particularmente vantajosas se o polímero compreender pelo menos 50 pmoles de grupos tiol por grama de polímero.

De acordo com a invenção, os polímeros que são fisiologicamente toleráveis e que podem ser modificados por grupos tiol são apropriados. Polímeros de base são seleccionados a partir do grupo de polissacarídeos. Os 9 ΡΕ2107913 polímeros contendo o grupo tiol são preferivelmente seleccionados a partir do grupo consistindo em ácido hialurónico contendo o grupo tiol, chitosano e combinações destes polímeros contendo o grupo tiol provaram ser particularmente vantajosos para o uso de acordo com a invenção.

Alguns destes polímeros, tal como, por exemplo, o ácido hialurónico tiolado, já estão a ser usados como excipientes em medicamentos, por exemplo, de maneira a introduzir substâncias activas mais fácil e eficientemente em camadas de muco (cf, por exemplo, WO 00/25823) . Agora, descobriu-se contudo, surpreendentemente, que esses próprios compostos de polímero exibem um efeito farmacológico e podem ser usados como antioxidantes. Os grupos tiol dos polímeros são capazes de aumentar significativamente as propriedades antioxidantes possivelmente presentes em polímeros não tiolados, ou para conferir propriedades antioxidantes aos polímeros. O tempo de residência pode ser influenciado pela escolha do polímero. Os biopolímeros ácido hialurónico e chitosano são degradadas pela hialuronidase e lisozima, respectivamente, naturalmente presentes num mamífero, em particular num ser humano. Para a degradação dos polímeros sintéticos como o ácido poliacrílico ou a poliacrilamida não há enzimas presentes num corpo de mamífero o que tem como consequência que os referidos polímeros têm de ser removidos do corpo por cirurgia, pelo que os polímeros 10 ΡΕ2107913 biodegradáveis, num período de pelo menos 6, 12, 24 ou até 60 meses são degradados por enzimas e, consequentemente, removidos do corpo. O pelo menos um grupo tiol do polímero usado inventivamente é preferivelmente derivado de um composto tiol fisiologicamente tolerável, por exemplo, cisteína, cisteamina e N-acetil-cisteína, o que significa que estes compostos de tiol ou os seus derivados podem ser usados para tiolar polímeros.

De acordo com a invenção, a tiolação pode ser efectuada por todos os tipos de reacções químicas pelas quais os compostos de tiol estão ligados a polímeros, em particular a polímeros solúveis em água. Por várias razões, o uso de cisteína e de derivados de cisteína é aconselhável para a tiolação, visto a primeira ser fisiologicamente tolerável, por um lado, e fácil e barata de obter, por outro. A cisteína e os derivados de cisteína podem, preferivelmente, ser ligados ao polímero via uma ligação de amida. Por outro lado, o polímero inventivo pode também ser preparado pelo facto de, no decorrer da produção do polímero, pelo menos um monómero ser (co-)polimerizado com grupos tiol, o que tem grupos tiol livres no polímero, o que significa que os grupos tiol não são reagidos directamente na reacção de polimerização. Um polímero desses que contém pelo menos um monómero que tem grupos tiol livres no polímero também é preferido, de acordo com a invenção (cf., por exemplo, Bernkop-Schnurch, Adv. Drug Deliv. Rev. 57 (2005): 1569-1582). 11 ΡΕ2107913

Dependendo do ponto de aplicação ou ponto activo, o implante da invenção é fornecido numa formulação correspondente. As substâncias auxiliares ai necessárias dependerão, cada, da formulação e são suficientemente conhecidas pelos especialistas na técnica (cf., por exemplo, Sarfaraz Niazi "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", CRC Press (2004)).

Os polímeros contendo o grupo tiol de acordo com a invenção também podem ser usados subcutaneamente e intradermicamente para aumento dérmico. Em cosmética, polímeros tais como, por exemplo, ácido hialurónico, são conhecidos e agentes auxiliares frequentemente usados para aliviar sinais de envelhecimento da pele (rugas, secura, perda de elasticidade) que, i.a. estão associados com uma perda de ácido hialurónico por radicais livres no tecido (Agren et al., Free Radie. Biol. Med. 23 (1997):996-1001). Devido às propriedades antioxidantes dos polímeros inventivos contendo o grupo tiol, preferivelmente os grupos tiol contendo ácido hialurónico, a degradação, mediada por radicais, do ácido hialurónico contendo o grupo tiol abranda depois de uma aplicação intradérmica subcutânea.

Nas formulações para aplicação subcutânea ou intradérmica, o polímero contendo o grupo tiol pode estar presente numa concentração desde 0,001-20% (m/v), preferivelmente desde 0,01-10% (m/v). As formulações podem, além disso, conter excipientes adicionais que são normalmente 12 ΡΕ2107913 usados para preparações para aplicação subcutânea ou intradérmica, por exemplo, sais tampão, estabilizantes, excipientes para ajustar a desejada osmolalidade, exci-pientes para ajustar a desejada viscosidade e excipientes para potenciar a tolerância da formulação. A osmolalidade e o pH da formulação acabada estão, preferivelmente, na gama fisiológica. 0 implante é particularmente preferido formulado como uma preparação em gel ou aquosa, preferivelmente de fase única. 0 implante de acordo com a invenção que compreende pelo menos um polímero contendo o grupo tiol pode ser formulada numa pluralidade de formas de aplicação. Particularmente vantajoso é o fornecimento da formulação como solução/preparação aquosa. Se o implante for fornecido como uma solução aquosa, esta pode ser administrada de maneira simples subcutaneamente, intradermicamente ou intramuscularmente num local desejado. 0 uso de polímeros tendo a forma de geles e soluções aquosas pouco viscosas, ou na forma de preparações sólidas (também como inserções para libertação controlada da substância activa) como implantes no corpo humano podem causar reacções inflamatórias no tecido circundante. Pelo efeito exterminador de radicais e antioxidante que os polímeros inventivos contendo o grupo tiol exercem, estas reacções inflamatórias podem ser aliviadas ou inteiramente 13 ΡΕ2107913 eliminadas, respectivamente. Isto aplica-se, por exemplo, à aplicação intradérmica e subcutânea dos polímeros contendo o grupo tiol para injecção por baixo de rugas, ao uso de polímeros contendo o grupo tiol para aumento de esfíncteres e à implantação de preparações (semi-)sólidas baseadas em polímeros contendo o grupo tiol.

Revelou-se ser particularmente vantajoso usar o polímero de acordo com a presente invenção como uma preparação aquosa de fase única homogénea que pode ser distribuída depois da aplicação de maneira fácil e que pode ser igualmente degradada lentamente por enzimas presentes no ponto de aplicação. Com partículas de polímero reticulado como foi divulgado, por exemplo, no pedido WO 99/31167 apenas podem ser produzidas formulações de duas fases que consistem numa suspensão de partículas num meio de suporte líquido. Com essas formulações é difícil avaliar a quantidade necessária do implante para um aumento (por exemplo, injecções por baixo de rugas), porque o meio de suporte é absorvido bastante depressa pelo corpo e as partículas residuais têm um volume significativamente reduzido. Portanto, a aplicação tem de ser corrigida, o que torna difícil obter um resultado satisfatório.

De acordo com um modelo de realização preferido, o medicamento ou o implante ainda compreende, adicionalmente, pelo menos uma substância activa; para a aplicação em dermatologia, preferivelmente uma substância activa do grupo dos anestésicos locais (por exemplo, lidocaína, pri- 14 ΡΕ2107913 locaína, procaína, mepivacaína) antimicóticos (por exemplo, omoconazole, clotrimazole, bifonazole, miconazole, flocona-zole, itraconazole, oxiconazole, fenticonazole, terbina-fina, ciclopirox, amorolfina), anti-histamínicos, agentes anti-alérgicos, agentes anti-inflamatórios, antibióticos (por exemplo, tetraciclina e derivados, ácido fusidinico, cloranfenicol, neomicina, bacitracina, gentami-cina, tiro-tricina, mupirocina, virginiamicina, rifamixina e ami-cacina), agentes quimioterapêuticos, agentes anti-virais, emolientes, agentes protectores da pele, agentes para tratar feridas, agentes anti-acne tópicos e corticoste-róides, antiflogisticos não esteróides, agente para tratar as hemorroidas, antisépticos tópicos e agentes contendo iodo. Além disso, pelo menos um excipiente farmacêutico a partir do grupo dos sais tampão, agentes de preservação, excipientes para ajustar a osmolalidade pretendida, exci-pientes para ajustar a pretendida viscosidade, estabili-zantes, amaciadores, materiais de revestimento, agentes de fluxo, ligantes, lubrificantes, enchimentos, dessecantes, agentes de desintegração, solventes, solubilizantes e excipientes para aumentar a tolerância da formulação, podem estar contidos no implante.

Além dos polimeros inventivos contendo o grupo tiol e dos necessários excipientes possivelmente ai misturados ou vantajosos para formulações particulares, o medicamento, ou implante, pode compreender respectivamente outras substâncias activas. As substâncias activas que são preferivelmente misturadas ao polimero contendo o grupo 15 ΡΕ2107913 tiol podem, elas próprias, ter propriedades antioxidantes ou pode servir para aquecer, aliviar ou evitar a doença antioxidante ou a doença provocada por stress oxidativo, respectivamente. As substâncias anti-inflamatórias e as vitaminas com actividade antioxidante serão mencionadas, a titulo de exemplo, neste contexto.

De acordo com um modelo de realização preferido da presente invenção, o implante compreende, adicionalmente, pelo menos um polímero não modificado. Em implantes que compreendem tanto polímeros contendo o grupo tiol como também polímeros não modificados, a sua proporção de mistura relativa a cada um dos mesmos é variável. De acordo com a invenção, sob "polímeros não modificados" estão resumidos polímeros que estão inteiramente não modificados, ou que estão modificados e que não têm ainda qualquer grupo tiol, respectivamente.

De acordo com um modelo de realização preferido da presente invenção, o implante compreende o polímero contendo o grupo tiol a uma concentração de desde 0,001 até 100% em peso, preferivelmente desde 0,01 até 90% em peso, ainda mais preferido desde 0,05 até 80% em peso; onde a administração se dá mais preferivelmente a uma concentração de 0,1 até 20%, ou mesmo o mais preferivelmente de 0,1 até 10%. O implante de acordo com a invenção tanto pode consistir inteiramente de polímero contendo o grupo tiol 16 ΡΕ2107913 como pode ser misturado com excipientes, suportes e substâncias farmaceuticamente activas.

Devido aos grupos tiol contidos no polímero da invenção, o polímero tem propriedades antioxidantes.

De acordo com um modelo de realização preferido da presente invenção, o tecido a ser aumentado é selec-cionado a partir do grupo consistindo em tecido dérmico, tecido muscular e tecido conjuntivo.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um implante para aumento de tecidos compreendendo pelo menos um polímero contendo o grupo tiol como atrás definido.

Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para o tratamento cosmético da pele e para reduzir e/ou evitar o envelhecimento da pele, no qual um polimero contendo o grupo tiol como atrás definido é aplicado subcutaneamente e/ou intradermicamente.

Os polimeros contendo o grupo tiol podem ser usados para o tratamento cosmético da pele e para reduzir o envelhecimento da pele. Polimeros como, por exemplo, o ácido hialurónico, são agentes auxiliares bem conhecidos e frequentemente usados em cosméticos, por exemplo, para injecção por baixo de rugas e nos lábios. Para este efeito, usa-se, principalmente, um gel viscoso de moléculas de cadeia longa que é degradado muito lentamente pelo corpo. 17 ΡΕ2107913

Num outro processo, os polímeros são divididos com luz UV, massajados para penetrarem na pele e, subsequentemente, tratados com laser, pelo que os fragmentos de polímero massajado na pele reagem mais uma vez com as macromoléculas da pele. Esses polímeros são usados como uma alternativa ao colagénio. 0 uso cosmético de polímeros, particularmente do ácido hialurónico, pode resultar em efeitos secundários parcialmente pronunciados, tais como, por exemplo, irritações da pele e vermelhidão baseadas na tensão oxidativa. Descobriu-se agora que, quando se administram polímeros contendo o grupo tiol, esses efeitos colaterais podem ser inteiramente evitados, ou grandemente reduzidos, respecti-vamente. A invenção será agora explicada em mais pormenor por meio dos exemplos que se seguem e das figuras aos quais, é claro, não se restringe. A fig. 1 mostra uma representação esquemática do mecanismo activo antioxidante dos polímeros contendo o grupo tiol. A fig. 2 mostra a inibição do efeito oxidante do radical de hidroxilo por soluções aquosas de ácido hialurónico tiolado a 0,1% (m/v) em comparação com os polímeros não modificados (n>3; + SD) . 18 ΡΕ2107913 A fig. 4 mostra a inibição do efeito oxidante dos radicais de hidroxilo por soluções aquosas de ácido hialurónico tiolado a 0,1% (m/v), modificado até vários graus (200 μΜ de grupos tiol/g de polímero e 70 μΜ de grupos tiol/g de polímero) em comparação com o ácido hialurónico não modificado (n>4; _+ SD) . A fig. 5 mostra a inibição da oxidação de lípidos na córnea de porcinos in vitro por soluções aquosas de ácido hialurónico tiolado a 0,1% (m/v), em comparação com polímeros não modificados (n>3; + SD).

EXEMPLOS

Exemplo 1

Inibição do efeito oxidante dos radicais de hidroxilo pelos polímeros inventivos contendo o grupo tiol

As propriedades de exterminação dos radicais de hidroxilo dos polímeros inventivos contendo o grupo tiol foram avaliadas com o teste de desoxirribose (Halliwell et al., Food Chem. Toxicol. 33 (1995):601-617). Neste sistema de teste, os radicais de hidroxilo são gerados por iões de ferro que atacam a desoxirribose. Os resultantes produtos de degradação reagem com ácido tiobarbitúrico até um agente corante rosa cuja absorção é medida. Com este método são testados tanto o exterminador de radicais como também as propriedades de complexação dos polímeros inventivos contendo o grupo tiol. 19 ΡΕ2107913

As propriedades de exterminação dos radicais de hidroxilo e de complexaçao dos polímeros inventivos contendo o grupo tiol também foram avaliadas com o teste de desoxirribose dependendo da sua concentração e do seu grau de modificação. É importante que os polímeros inventivos contendo o grupo tiol ainda desdobrem a sua actividade antioxidante mesmo a concentrações reduzidas porque, desta maneira - em combinação com o tempo de residência prolongado destes polímeros contendo o grupo tiol - pode conseguir-se um efeito duradouro. Além disso, em preparações para aplicações oculares, intra-articulares, intradérmicas ou subscutâneas, os compostos poliméricos de elevado teor molecular só podem ser usados a concentrações iniciais relativamente baixas, porque, de outro modo, devido à sua alta viscosidade, já não é possível assegurar uma tolerância óptima.

Para este teste, as soluções de polímero foram preparadas de fresco por dissolução do polímero em tampão de fosfato, pH 7,4, de maneira que a concentração final do polímero em toda a solução de amostra fosse de 0,1% (m/v) . Se necessário, o pH da solução de amostra foi ajustado até 7,4 pela adição de NaOH. O tampão de fosfato, pH 7,4 sem polímero serviu como controlo. Até 0,6 ml da solução de amostra, adicionou-se primeiro 0,1 ml de uma solução de 2-desoxi-D-ribose 10 mM. 20 ΡΕ2107913

Imediatamente a seguir à adição de 0,1 ml de uma solução de FeS04 de 10 mM preparada de fresco, as amostras foram incubadas durante 120 min a 37°C. A reacção foi interrompida pela adição de 0,5 ml de ácido trifluoro-acético a 2,5% (v/v) . Depois da adição de 0,2 ml de 1% (m/v) de ácido tiobarbitúrico, as amostras foram incubadas durante 20 min a 95°C para desenvolvimento da cor. Então, as amostras foram arrefecidas até temperatura ambiente e centrifugadas durante 5 min. Uma alíquota da solução de amostra foi transferida para cuvetes microfotométricas e a absorção foi medida a 53,2 nm.

As propriedades antioxidantes do polímero inventivo foram calculadas na forma da inibição da oxidação de desoxirribose:

Inibição da oxidação em % = (1 - (As/Ac)) *100, onde As é a absorção da amostra e Ac é a absorção do controlo.

Os resultados estão ilustrados nas figs. 2 e 3.

No eixo y, em cada caso, está ilustrada a inibição do efeito de oxidação (em %) de radicais hidroxilo pelos polímeros. Os valores ilustrados são os valores médios de pelo menos 3 repetições do teste + desvio Standard. A fig. 2 mostra que pela ligação covalente dos compostos de tiol, o efeito antioxidante do ácido hialurónico podia ser 21 ΡΕ2107913 significativamente aumentado. A dependência do efeito antioxidante dos polímeros de acordo com a invenção sobre o grau de modificação com compostos tiol está ilustrada na fig. 3 a título de exemplo do ácido hialurónico tiolado. 0 ácido hialurónico tiolado com um grau de modificação de 200 μΜ de grupos tiol/g de polímero tem, assim, um efeito antioxidante superior ao do ácido hialurónico tiolado com um grau de modificação de 7 0 μΜ de grupos tiol/g de polímero.

Exemplo 2

Inibição da peroxidação de lipidos na pele pelos polímeros contendo o grupo tiol

Com um teste in vitro foi avaliado o potencial dos polímeros contendo o grupo tiol para inibirem a oxidação dos lipidos da derme. A peroxidação de lipidos intracelulares provocada, por exemplo, pela radiação UU? resulta em danos à pele/derme dos seres humanos.

Com este método, são testadas tanto as propriedades de exterminação de radicais como as de complexação dos polímeros contendo o grupo tiol (Halliwell et al. , Food Chem. Toxicol. 33 (1995): 601-617). Neste sistema de teste in vitro, a peroxidação dos lipidos é acelerada pela adição de iões de ferro e aquecimento. Os fragmentos de lipidos oxidados (TBARS; substâncias reactivas de ácido tiobarbitúrico) reagem com o ácido tiobarbitúrico a um agente de coloração rosa cuja absorção é medida. 22 ΡΕ2107913

Soluções de polímero são preparadas de fresco em tampão de fosfato isotónico de maneira que a concentração final do polímero em toda a solução de amostra seja de 0,05% (m/v). O pH das soluções de amostra foi ajustado até 7,4 pela adição de NaOH. O tampão de fosfato isotónico, de pH 7,4, serviu como controlo. A estas amostras, foram adicionados 100 mg de derme porcina. Depois da adição de 0,3 ml de uma solução de FeS04 de 2 0 mM preparada de fresco, as amostras foram incubadas a 95°C durante 60 min. A reacção foi interrompida pela adição de 0,3 ml de 20% (v/v) de ácido trifluoroacético. Depois da adição de 0,3 ml de 1% (m/v) de ácido tiobarbitúrico, as amostras foram incubadas durante mais 20 min a 95°C e, depois de arrefecerem até temperatura ambiente, foram centrifugadas. Uma alíquota foi transferida para cuvetes microfotométricas e a absorção foi medida a 532 nm. A inibição da peroxidaçao lipídica foi calculada de acordo com a seguinte equação: inibição da oxidação em % = (1- (As/Ac) ) *100, onde As é a adsorção da amostra e Ac é a absorção do controlo. assim,

Os resultados estão ilustrados na Fig. 5. No eixo y, a inibição da oxidação dos polímeros respectivos está marcada em %. Os valores indicados são os valores médios de 3 repetições de teste + desvio Standard. Destes estudos, é claramente evidente que, por conta das suas propriedades de exterminação de radicais, de complexação e, 23 ΡΕ2107913 antioxidantes, os polímeros contendo o grupo tiol são capazes de reduzir significativamente a oxidação dos lípidos provocada por processos inflamatórios.

Exemplo 3

Aplicação intradérmica dos polímeros contendo o grupo tiol de acordo com a presente invenção A seguinte preparação para aplicações intradér-micas foi produzida: dissolveu-se 2 g de ácido hialurónico contendo o grupo tiol em tampão de fosfato isótono estéril, agitou-se até formar um polímero parcialmente reticulado, colocou-se em seringas e esterilizou-se. Injectou-se 0,1 ml desta formulação intradermicamente na região das costas de coelhos. A aplicação produziu uma irritação local mínima que desapareceu passado um dia. O depósito formado pelo ácido hialurónico contendo o grupo tiol era detectável ao toque durante todo o período de exame de duas semanas.

Exemplo 4

Produção de uma preparação para uso subcutâneo e intradérmico para aumento dérmico

Uma preparação para uso subcutâneo e intradérmico foi fabricada como segue: 1 g de ácido hialurónico contendo o grupo tiol estéril foi dissolvido sob condições assépticas e na ausência de oxigénio num tampão de fosfato estéril de 100 ml de pH 7,4. A osmolalidade desta preparação foi ajustada por adição de NaCl para produzir uma osmolalidade 24 ΡΕ2107913 da solução entre 200 e 400 mosmol/kg. A solução foi metida em frascos e embalada impermeável aos gases.

Exemplo 5

Formulação para aumento de tecidos de cicatrizes

Uma preparação foi produzida como segue: dissolveu-se 3 g de ácido hialurónico contendo o grupo tiol, estéril, sob condições assépticas em 100 ml de tampão de fosfato estéril de pH 7,4 e foi parcialmente reticulado. Seguidamente, a osmolalidade para a sugerida adição de NaCl para resultar numa osmolalidade da solução entre 200 e 400 mosmol/kg. A solução foi colocada em frascos e fechada impermeável aos gases.

Exemplo 6

Formulação para aumento dos músculos dos esfíncteres anal e uretral

Os polímeros contendo o grupo tiol têm sido usados para aumentar o esfincter anal interno para evitar a incontinência anal pelo suporte das almofadas naturais no canal anal. A mesma formulação foi também usada para aumentar os músculos do esfincter uretral (ver também US 5 785 642). A incontinência é um problema frequente, em particular nas mulheres cujo pavimento pélvico é significativamente enfraquecido depois da gravidez. Se os músculos do pavimento pélvico não puderem ser forçados por métodos convencionais, a injecção de materiais para aumento da uretra é uma boa alternativa. 25 ΡΕ2107913

Uma formulação para o aumento do esfíncter foi produzida como segue: dissolveu-se, sob condições assépticas, 5 g de chitosano contendo o grupo tiol em 100 ml de tampão de borato estéril de pH 6,5 e parcialmente reticulado, sendo a osmolalidade ajustada por adição de NaCl até 200 a 400 mosmol/kg. A solução foi colocada em seringas .

Exemplo 7

Degradação enzimática de uma formulação de ácido hialurónico contendo o grupo tiol reticulado e uma formulação compreendendo uma particula de ácido hialurónico reticulado

Outras vantagens dos polímeros contendo o grupo tiol, em particular do ácido hialurónico contendo grupo tiol, está apresentado neste exemplo. O ácido hialurónico contendo o grupo tiol e as formulações disponíveis no comércio compreendendo partículas de ácido hialurónico têm sido digeridas com hialuronidase. Em ambos os casos o ácido hialurónico era degradado, pelo que a degradação era comparável com um ácido hialurónico não modificado, no caso do ácido hialurónico contendo o grupo tiol, e os fragmentos formados mostram um peso molecular muito mais elevado do que as partículas compreendendo ácido hialurónico reticulado. Isto resulta do facto de que as pontes de dissulfureto não são degradadas por uma enzima e, em segundo lugar, o grau de ligação cruzada é muito mais ele- 26 ΡΕ2107913 vado do que nas partículas de ácido hialurónico reticulado. Portanto, os ácidos hialurónicos contendo o grupo tiol reticulados de acordo com a presente invenção mantêm-se mais tempo no ponto de aplicação do que as partículas de ácido hialurónico reticulado.

Lisboa, 26 de Abril de 2012

Claims

ΡΕ2107913 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uso de um polímero contendo o grupo tiol para preparar um implante para aumento de tecidos, onde o polímero de base é um polissacarídeo.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero contendo o grupo tiol ter uma massa molecular de pelo menos 10.000 g/mol, preferivelmente pelo menos 25.000 g/mol, em particular pelo menos 50.000 g/mol.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por os grupos tiol contidos no polímero formarem ligações de dissulfureto inter- e/ou intramo-lecular.
4. Uso, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a porção do grupo tiol do polímero ser de mais de 20 pmol/g de polímero, preferivelmente mais de 50 pmol/g de polímero, em particular mais de 100 pmol/g de polímero.
5. O uso, de acordo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o polímero contendo o grupo tiol ser seleccionado a partir do grupo consistindo em ácido hialurónico contendo o grupo tiol, chitosano contendo o grupo tiol e combinações destes polímeros. 2 ΡΕ2107913 6. 0 uso, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o grupo tiol do polimero da invenção derivar, preferivelmente, de cisteina, cisteamina ou N-acetil-cisteina. 7. 0 uso, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o implante ser fornecido como um gel ou aquoso, preferivelmente, numa preparação de fase única. 8. 0 uso, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o implante compreender adicionalmente chitosano e/ou ácido hialurónico. 9. 0 uso, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o implante compreender ainda adicionalmente pelo menos uma substância activa, preferivelmente do grupo dos agentes antiflogísticos, agentes anti-reumático, analgésicos, agentes anti-infec-ciosos, agentes antivirais, antibióticos, antimicóticos, agentes antissépticos, agentes quimioterapêuticos, espas-molíticos, vitaminas, agentes citostáticos, anestésicos locais, agentes antialérgicos, anti-histamínicos, agentes anti-inflamatórios, agentes antivaricosos agentes para tratar as hemorroidas, agentes terapêuticos para tratar a pele, agentes ginecológicos, agentes oftálmicos, agentes urológicos, agentes rinológicos e agentes otológicos, e/ou pelo menos um excipiente farmacêutico, preferivelmente a 3 ΡΕ2107913 partir do grupo de sais tampão, agentes de preservação, excipientes para ajustar a osmolalidade pretendida, excipientes para ajustar a viscosidade pretendida, estabilizantes, amaciadores, materiais de revestimento, agentes de fluxo, ligantes, lubrificantes, enchimentos, dessecantes, agentes de desintegração, solventes, solubilizantes e excipientes para potenciar a compatibilidade da formulação.
10. Uso, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o implante compreender o polimero contendo o grupo tiol a uma concentração desde 0,001 até 100% em peso, preferivelmente desde 0,01 até 90% em peso, ainda mais preferido desde 0,05 até 80% em peso.
11. Uso, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o tecido a ser aumentado ser seleccionado a partir do grupo consistindo em tecido dérmico, tecido muscular e tecido conjuntivo.
12. Implante compreendendo pelo menos um polimero contendo o grupo tiol como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 9. Lisboa, 26 de Abril de 2012