PT1646720E

PT1646720E - Anticorpos contra o receptor 1 do factor de crescimento semelhante a insulina e as respectivas utilizações

Info

Publication number: PT1646720E
Application number: PT04763146T
Authority: PT
Inventors: Yvo Graus; Erhard Kopetzki; Klaus-Peter Kuenkele; Olaf Mundigl; Paul Parren; Frank Rebers; Ralf Schumacher; Jan Van De Winkel; Martine Van Vugt
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2003-07-10
Filing date: 2004-07-09
Publication date: 2008-12-26
Also published as: CA2532173A1; AU2008207635B2; PL1646720T3; MXPA06000270A; CY1116227T1; HK1094713A1; TW200513469A; US7579157B2; AU2008202949B2; ES2360454T9; EP2243835A2; PL2272873T3; ATE502959T1; EP1646720B1; RU2008126743A; BRPI0412478A; DK2272873T3; AU2008207635A1; ES2360454T3; AU2008202949A1

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPOS CONTRA O RECEPTOR 1 DO FACTOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE A INSULINA E AS KESPECTIVAS

UTILIZAÇÕES A presente invenção tem por objecto anticorpos contra o receptor 1 do factor de crescimento semelhante à insulina (Rl-FCI), processos para a sua produção, composições farmacêuticas que contêm os referidos anticorpos e as suas utilizações. 0 receptor- 1 do factor de crescimento semelhante à insulina (Rl-FCI, EC2.7.112, antigénio CD 221) pertence à família das proteínas da transmembrana - tirosina-cinase (LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; e

Adams, T.E, et al., Cell. Mol. Life Sei. 57 (2000) 1050-1063) . O Rl-FCI liga-se a FCI-I com uma elevada afinidade e inicia a resposta fisiológica a este ligando in vivo. Rl-FCI também se liga a FCI-II, contudo com uma afinidade ligeiramente menor. A sobre-éxpressão de Rl-FCI promove a transformação neoplásica das células e há evidências de que Rl-FCI está envolvido na transformação maligna das células e por isso é um alvo útil para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para o tratamento do cancro (Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sei. 57 (2000) 1050-1063).

Os anticorpos contra Rl-FCI são bem conhecidos no estado da técnica e foram investigados quanto aos seus efeitos anti-tumor in vitro e in vivo (Benini, S., et al, Clin. Câncer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., et al., Câncer Gene

Ther. 9 (2002.) 296-307; Scotlandi, K., et al., Int. J. Câncer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A., et al., Biochem. Biophys. 1

Res. Commun. 165 (1989} 212-218; Prigent, S.A., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L., et al., Câncer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252; Pessino, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K.H. , et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos M.A. , et al., J. Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963; Soos M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 5217-5221; 01Brien, R.M., et ah, EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R., et al., Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A., et al.,

Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S.L., et al., Biochem.

Biophys. Res. Cominun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P., et al., J. Mol, Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673; Kull, F.C.

Jr., et al. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D.O., e Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371;

Forsayeth, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E'.M., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A., et al., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A;., et. al, J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q.T., et al., Biochem Biophys. Res.

Comm. 149 (1987) 276-281; e Kalebic, T., et al., Câncer Res. Treatment 54 (1994) 5531-5534; e Hailey, J. , et al., Mol. Mol. Lite Sei. 57 (2000) 1050-1063; Drieu, A., et al.,

Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn, L., et al., Melanoma Res. 8(1998) 389-397; Li, S.L., et al, Câncer

Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252). Os anticorpos anti-Rl-FCI estão também descritos num grande número de outras publicações, por exemplo, Arteaga, C.L., et al., Breast Câncer Res. Treatment 22 (1992) 101-106; e Hailey, J., et al., Mol. Câncer Ther. 1 (2002) 1349-1353.

Em particular, o anticorpo monoclonal contra Rl-FCI designado por aIR3 é amplamente utilizado na investigação em 2 estudos de processos mediados por Rl-FCI tal como cancro. 0 alfa-IR-3 foi descrito por Kull, F.C., J. Biol. Chem. 258. (1983) 6561-6566. Entretanto, publicou-se cerca de uma centena de publicações tratando da investigação e da utilização terapêutica de aIR3 no que respeita ao seu efeito anti-tumor, isoladamente ou em conjunto com agentes citos-táticos tais como doxorubicina e vincristina. 0 0íIR3 é um anticorpo monoclonal de murino que é conhecido por inibir a ligação de FCI-I ao receptor de FCI mas não inibir a ligação de FCI-KEI a Rl-FCI. 0 aIR3 estimula, a concentrações elevadas, a proliferação das células do' tumor e a fosforilação de Rl-FCI (Bergmann, U., et al., Câncer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661). Existem outros anticorpos (por exemplo 1H7, Li, S.L. e tal·., Câncer Immunol. Immunother. , 49 (2000) 243-252) que inibem a ligação de FCI-II a Rl-FCI de uma forma mais potente do que a ligação .de FCI-1. Um resumo do estado da técnica dos anticorpos e das suas propriedades e caracteristicas está descrito por Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sei. 57 (2000) 1050-1063. A maior parte dos anticorpos descritos no estado da técnica tem origem em murganhos. Esses anticorpos não são úteis, como é bem sabido do estado da técnica, para a terapia de pacientes humanos sem alterações como a químerização ou a humanização. Com base nestas desvantagens, preferem-se claramente os anticorpos humanos como agentes terapêuticos no tratamento de pacientes humanos. Os anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M.A., e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). Com base nessa tecnologia, podem produzir-se anticorpos humanos contra uma grande variedade de alvos. Exemplos de anticorpos 3 humanos contra Rl-FCI estão descritos na patente WO 02/053596.

Contudo, há ainda uma necessidade de anticorpos contra Rl-FCI com benefícios convincentes para pacientes que necessitam de uma terapia anti-tumor. O benefício relevante para o paciente é, em termos simples, a redução do crescimento do tumor e um prolongamento significativo do tempo até à progressão, causado pelo tratamento com o agente antitumorigénico.

Sumário da invenção A presente invenção compreende um anticorpo de ligação ao Rl-FCI e a inibição da ligação de FCI-I e FCI-II a Rl-FCI, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo a) ser do isotipo de IgGl, b) mostrar uma relação entre os valores de CI50 de inibição da ligação de FCI-Γ a Rl-FCI e a inibição da ligação de FCI-II a Rl-FCI de 1:3 a 3:1, c) inibir pelo menos 80 %, preferencialmente pelo menos 90 %, a uma concentração de 5 nM, a fosforilação de Rl-FCI num ensaio de fosforilação celular utilizando células HT2 9 num meio contendo soro bovino fetal (SBF) a 0,5 % inactivado peio calor, guando comparado com esse ensaio sem o referido anticorpo e d) não exibir actividade de estimulação de Rl-FCI medida como a fosforilação de PKB a uma concentração de 10 μΜ num ensaio de fosforilação celular utilizando células 3T3 providenciando 400.000 a 600.000 molécula de Rl-FCI por células num meio contendo soro bovino fetal {SBF) a 0,5 % 4 inactivado pelo calor, quando comparado com esse ensaio sem o referido anticorpo.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção apresentam benefícios para os pacientes que necessitam de uma terapia antitumor e providenciam uma redução do crescimento do tumor e um prolongamento significativo . do tempo de progressão. Os anticorpos de acordo com a presente invenção têm novas e inventivas propriedades que causam um benefício para um paciente que sofra de uma doença 'associada a uma desregulaçâo de FCI, especialmente uma doença de tumor. Os anticorpos de acordo com a presente invenção são caracterizados pelas''- propriedades mencionadas antes. As propriedades são por isso especíalmente a ligação específica a Rl-FCI, a inibição da ligação de FCI-I e de FCI-II a Rl-FCI na relação mencionada antes/ sendo do isótopo de IgGl, e a não activação da sinalização de. Rl-FCI mesmo nas células que sobre-expressam a uma concentração 200 vezes superior ao seu valor de CI50- Os anticorpos que têm uma "actividade mimética de FCI-I" providenciam uma forte vantagem quando utilizados como agente terapêutico.

Preferencialmente, um anticorpo de acordo com a presente invenção induz adicionalmente a morte das células de 20 % ou mais células de uma preparação de células que expressam Rl-FCI passadas 24 horas a uma concentração do referido anticorpo de 100 nM por CCDA.

Preferencialmente, para além dos anticorpos de acordo com a presente invenção induz a morte das células de 20 % ou mais células de uma preparação de células que expressam Rl-FCI passadas 4 horas a uma concentração de 100 nM por CDC. 5

Preferencialmente, a uma concentração de 5 nM os anticorpos de acordo com a presente invenção inibem Gompletamente a transdução de sinal mediada por FCI-I de Rl- FCI em células de tumor. A presente invenção também compreende ácidos nucleicos. Os polipéptidos codificados são capazes de se unir com outra das cadeias do respectivo anticorpo definido a seguir: a) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo como RDCs RDCl (aa 31-35), RDC2 {aa 50-66) e RDC3 (aa 99-107) da SEQ ID NO:1 ou 3; b) uma cadeia leve de anticorpo compreendendo como RDCs RDCl (aa 24-34), RDC2 (aa 50-56) e RDC3 (aa 89-98) da SEQ NO: 2 ou 4. 0 anticorpo é preferencialmente um anticorpo monoclohal e, além disso, um anticorpo quimérico (cadeia humana constante) , um anticorpo._ humanizado e especial e preferencialmente um anticorpo .humano. 0 anticorpo liga-se a Rl-FCI ' humano (EC 2.7.1.112, SwissProt P08069) em concorrência com o anticorpo 18. O anticorpo é ainda caracterizado por uma afinidade de 10"8 M (Kp) ou menos, preferencíalmente de cerca de IO-9 a 10" 13 M. O anticorpo praticamente não mostra concentração detectável consoante a inibição da ligação de insulina ao receptor de insulina.

Preferencialmente, a presente invenção tem por objecto anticorpos que compreende como regiões de determinação de 6

I

I I I complementaridade as regiões (RDCs) com as sequências seguintes: a) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo como RDCs RDC1 (aa 31-35), RDC2 (aa 50-66) e RDC3 (aa 99-107) da SEQ ID NO: 1 ou 3; b) uma cadeia leve de anticorpo compreendendo como RDCs RDC1 (aa 24-34), RDC2 (aa 50-56) e DDCR3 (aa 89-98) da SEQ NO: 2 ou 4. 0 anticorpo é preferencialmente do tipo de IgGl e por isso providencia uma ligação do complemento Clq e induz CDC. O anticorpo é ainda caracterizado pela capacidade para ligar o receptortde IgGFc e para induzir a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA). O anticorpo, de acordo com a presente invenção, prolonga consideravelmente o tempo de progressão em modelos relevantes de tumores xeno-enxertados, em comparação com animais tratados com veículo e reduz o crescimento do tumor. 0 anticorpo inibe a ligação de FCI-I e de FCI-II ao Rl-FCI in vitro e in vivo, preferencialmente numa forma praticamente igual para FCI-I e FCI-II. A presente invenção tem ainda por objecto linhas de células de hibridoma . que produzem esses anticorpos monoclonais antagonísticos de acordo com a presente invenção.

As linhas de células de hibridoma preferidas, de acordo com a presente invenção, o clone 18 de <R1-FCI> HUMAB (anticorpo 18) e o clone 22 de <FCI-1 R> HUMAB (anticorpo 22) , foram depositadas no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zel-Ikulturen GmbH (DSMZ), Alemanha. 7

Linha de células N° de depósito Data de depósito CIGF-1 R> HUMAB-Clone 18 DSM ACC 2587 10.04.2003 <IGF-1 R> HUMAB-Clone 22 DSM ACC 2594 09.05.2003

Os anticorpos que se podem obter a partir das referidas linhas de células são os enquadramentos preferidos da presente invenção. A presente invenção ainda tem por objecto ácidos nucleicos que codificam esses anticorpos, vectores de expressão que contêm os referidos ácidos nucleicos, e células hospedeiras para a produção recombinante desses anticorpos. A presente invenção ainda tem por objecto processos para a produção recombinante desses anticorpos. A presente invenção ainda tem por objecto processos para o tratamento de cancro, compreendendo a administração a um paciente diagnosticado como tendo cancro (e que por isso tem necessidade de uma terapia antitumor) de uma quantidade efectiva .de um anticorpo antagonlstico contra Rl-FCI de acordo com a presente invenção. O anticorpo pode ser administrado isoladamente, numà composição farmacêutica ou, alternativamente, em combinação com um tratamento citotóxico tal como radioterapia ou um agente citotóxico ou um seu pró-fármaco. A presente invenção ainda tem por objecto a utilização de um anticorpo de acordo com a presente invenção para o tratamento de cancro e para o fabrico de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção e além disso a presente invenção compreende um processo o fabrico de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção. 8 A presente invenção ainda tem por objecto uma composição farmacêutica que contém um anticorpo de acordo com a presente invenção para com uma quantidade efectiva sob o ponto de vista farmacêutico, eventualmente em conjunto com um tampão e/ou um adjuvante útil para a formulação de anticorpos com fins terapêuticos. Ã presente invenção ainda tem por objecto composições farmacêuticas que contém esses anticorpos num veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Num enquadramento, a composição farmacêutica pode estar incluída num artigo fabricado ou num kit. A presente invenção ainda tem por objecto um vector contendo um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, capaz de expressar o referido ácido nucleico numa célula hospedeira procarlótica ou eucariótica. A presente invenção ainda tem por objecto uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica compreendendo um vector de acordo com a presente invenção. A presente invenção ainda tem por objecto um processo para a produção de um anticorpo humano recombinante de acordo com a presente invenção, caracterizado por expressar um ácido nucleico de acordo com a presente invenção numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica recuperando o referido anticorpo a partir da referida célula. A presente invenção ainda tem por objecto o anticorpo que se pode obter por meio desse processo recombinante. 9 A presente invenção ainda tem por objecto um processo para a selecção de um anticorpo contra Rl-FCI a partir de uma pluralidade de anticorpos contra Rl-FCI caracterizado pelo facto de se realizar, com os referidos anticorpos, um ensaio de fosforilação celular utilizando células 3T3 originando 400.000 a 600.000 moléculas de Rl-FCI por célula num meio contendo soro de bovino fetal (SBF) a 0,5 %, inactivado pelo calor e o referido anticorpo se seleccionar de tal modo que não exibe actividade de estimulação de Rl-FCI medida como a fosforilação de PKB numa concentração de 10 μΜ quando comparado com um desses ensaios sem o referido anticorpo. Preferencialmente, o anticorpo tem uma ou mais das propriedades adicionars mencionadas. A presente invenção a„inda tem por objecto um processo para a preparação de ‘ uma composição farmacêutica caracterizado pelo facto de se seleccionar um anticorpo contra Rl-FCI, a partir de uma pluralidade de anticorpos contra Rl-FCI, realizando, com os referidos anticorpos, um ensaio de fosforilação celular utilizando células 3T3 originando 400.000 a 600.000 moléculas de Rl-FCI por célula num meio contendo soro de bovino fetal (SBF) a 0,5 %, inactivado pelo calor, e seleccionando o referido anticorpo de tal modo que não exibe actividade de estimulação de Rl-FCI medida como a fosforilação de PKB numa concentração de 10 μΜ quando comparado com um desses ensaios sem o referido anticorpo, produzindo o referido por meio da expressão recombinante, recuperando-se o referido anticorpo e combinando-se o referido anticorpo com um tampão e (ou um adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Preferencialmente, o anticorpo tem uma ou mais das propriedades adicionais mencionadas antes. 10

Descrição detalhada da invenção 0 termo "anticorpo" engloba as várias formas de anticorpos incluindo, mas não se limitando a anticorpos completos, fragmentos de anticorpos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos transformados por engenharia genética desde que as propriedades características, de acordo com a presente invenção, se mantenham. "Fragmentos de anticorpos" compreende uma porção de um anticorpo de comprimento completo, geralmente pelo menos a porção dè ligação do antigénio ou a sua região variável. Exemplos de·, fragmentos de anticorpos incluem diabodies, moléculas de cadeia linear de anticorpos, imunotoxinas e anticorpos multi-especificos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Além disso, os fragmentos de anticorpos compreendem polipéptidos de cadeia linear com as características de uma cadeia VP, nomeadamente capaz de juntar, em conjunto com uma cadeia VL ou uma ligação de uma cadeia VL com o Rl-FCI, sendo capaz, nomeadamente, de juntar, em conjunto, uma cadeia VP com uma bolsa funcional de ligação do antigénio, conferindo assim a propriedade de inibir a ligação de FCI-1 e IGF-II a Rl-FCI. "Fragmentos de anticorpos" também compreendem os fragmentos que per se não são capazes de providenciar funções efectoras (CCDA/CDC) mas providenciam esta função de uma maneira de acordo com a presente invenção depois de serem combinados com domínio(s) constantes de anticorpos.

As expressões "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" tal como se utiliza aqui, refere-se a 11 uma preparação de moléculas de anticorpo de uma composição com um único aminoácido. De acordo com isto, a expressão "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma única especificidade de ligação que tem regiões variáveis e constantes de sequências da imunoglobulina de uma linha germinativa humana. Num enquadramento, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgénico, por exemplo, um murganho transgénico, com um genoma que compreende um transgene humano de cadeia pesada e um transgene humano de cadeia leve fundido com uma célula imortalizada. A expressão "anticorpo quimérico"· refere-se a um anticorpo monoclonal que compreende uma região variável, isto é, uma região de ligação de uma fonte ou espécies e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécies diferentes normalmente preparadas por técnicas de ADN recombinante. Os anticorpos quiméricos que compreendem uma região variável de murino e uma região constante humana são especialmente preferidos. Esses anticorpos quiméricos de murino /humanos são o produto dos genes de imunoglobulina expressos que compreendem segmentos de AND que codificam regiões variáveis *de imunoglobulina de murino e segmentos de ADN que codificam regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos quiméricos" englobadas pela presente invenção1 são aquelas em que a classe ou a subclasse tenha sido modificada ou alterada a partir do anticorpo original. Esses anticorpos "quiméricos" são também referidos como "anticorpos com mudança de classe." Os processos para a produção de anticorpos quiméricos envolvem técnicas convencionais de ADN recombinante e de transfecção de genes que são agora bem conhecidas ha técnica. 12

Ver, por exemplo, Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; patentes US Nos. 5.202.238 e 5.204.244. A expressão "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos em que a estrutura ou as "regiões de determinação de complementaridade" (RDC) tinham sido modificadas para compreender a RDC de uma imunoglobulina de especificidade diferente quando comparado com a da imunoglobulina parental. Num enquadramento preferido, enxerta-se uma RDC de murino na região estrutural de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado." Ver, por exemplo, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. As RDCs particularmente preferidas correspondem às sequências que representam o reconhecimento dos antigénios assinalados antes para os anticorpos quiméricos e bifuncionais. A expressão "anticorpo humano" tal com se utiliza aqui pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas das sequências da imunoglobulina de uma linha germinativa humana. A cadeia pesada variável deriva preferencialmente da sequência da linha germinativa DP-50 (GenBank L06618) e a cadeia leve variável deriva preferencialmente da sequência da linha germinativa L6 (GenBank X01668). As regiões constantes do anticorpo são regiões constantes do tipo da IgGl humana. Essas regiões podem ser alotipicas e estão descritas, por exemplo, por Johnson, G., e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 e as bases de dados ai referenciadas são úteis desde que retenham as propriedades de indução de CCDA e preferencialmente CDC de acordo com a presente invenção. 13 A expressão "anticorpo humano recombinante ", tal como é utilizado aqui, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tal como anticorpos isolados de células hospedeiras tais como SP2-0, NSO ou células de OHC ou de um animal (por exemplo um murganho) que é transgénico para os genes de imunoglobulina humana ou anticorpos expressos utilizando um vector de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira. Esses anticorpos humanos recombinantes têm regiões constantes e variáveis derivadas das sequências de imunoglobulinas de linhas germinativas humanas numa forma re-arranjada.. Os anticorpos humanos b recombinantes, "de acordo com a presente invenção, têm sido submetidos a uma hipermutação somática in vivo. Assim, as sequências de aminoácidos das regiões VP e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, quando derivadas de sequências de VP e VL de linhas germinativas humanas, podem não existir naturalmente in vivo dentro do repertório da linha germinativa de anticorpos humanos.

Tal como se utiliza aqui, "ligação" refere-se a uma ligação de anticorpo a Rl-FCI com uma afinidade de cerca de IO"13 a IO"8 M (KD) , preferencialmente de cerca de IO-13 a 10“9 M. A expressão "molécula de ácido nucleico", tal como se utiliza aqui, supões a inclusão de moléculas de ADN e de moléculas de ARN. A molécula de ácido nucleico", pode ser de filamento simples ou de filamento duplo, mas preferencialmente é um ADN de filamento duplo.

Os "domínios constantes" não estão directamente envolvidos na ligação do anticorpo a um antigénio mas estão 14 envolvidos nas funções efectoras (CCDA, ligação do complemento, e CDC). 0 domínio constante de um’anticorpo de acordo com a presente invenção é do tipo de IgGl. Os domínios constantes humanos que têm estas características estão descritos em detalhe por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), e por Bruggemann, M., et al·., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Nas sequências SEO ID NOS: 5 a 8 mostram-se exemplos. Outros domínios constantes preferidos são os domínios constantes dos anticorpos que se podem obter de linhas de células de hibridoma depositadas no DSMZ para esta invenção. Os domínios constantes úteis na presente invenção providenciam a ligação do complemento. A CCDA e eventualmente CDC são dadas pela combinação de domínios variáveis e constantes. A "região variável" (região variável de uma cadeia leve (VL) , região variável de· uma cadeia pesada (VP)) tal como se utiliza aqui, indica cada um dos pares de cadeias leve e pesada que ' está directamente envolvido na ligação do. anticorpo ao antigénio. Os domínios de cadeias humanas variáveis, leves e pesadas têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões estruturais (FR) cujas sequências estão muito bem conservadas, ligadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões de determinação da complementaridade, RDCs). As regiões estruturais adoptam uma conformação em folhas β e as RDCs podem formar ansas que ligam a estrutura das folhas β. As RDCs em cada cadeia são sustentadas na sua estrutura tridimensional pelas regiões estruturais e foram, em conjunto com as RDCs de outra cadeia, o sítio de ligação do antigénio. As regiões RDC3 de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo desempenham um papel 15 particularmente importante na especificidade/afinidade da ligação dos anticorpos de acordo com a presente invenção e por isso constituem mais um objecto da presente invenção.

As expressões "região hipervariável" ou "porção de ligação do antigénio de um anticorpo" quando utilizadas aqui, referem-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação do antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos das "regiões de determinação de complementaridad" ou "RDCs". Regiões da "estrutura" ou "ES" são as regiões de domínios variáveis diferentes dos resíduos das regiões hipervariáveis tal como se definiu aqui. Por isso, as cadeias, leve e pesada, de um anticorpo compreendem, desde os terminais N aos C, os domínios ESI, RDC1, ES2, RDC2, ES3, RDC3, e ES4. Especialmente, a RDC3 de cadeia pesada é a região que contribui mais para a ligação do antigénio. As regiões RDC e ES são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)} e/ou tos residuos de uma "ansa hipervariável". A expressão "ligação a Rl-FCI", tal como utilizada aqui, significa a ligação do anticorpo a Rl-FCI num ensaio in vitro, preferencialmente num ensaio de ligação em que o anticorpo está ligado a uma superfície e a ligação de Rl-FCI mede-se por ressonância plasmónica da superfície (RPS). Ligação significa uma afinidade de' ligação (KD) de IO"8 M ou menos, preferencialmente 10"13 a 10“9 M.

A ligação a Rl-FCI pode ser investigada por meio de um ensaio BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia). A 16 afinidade da ligação é definida pelos termos de ka (taxa constante para a associação do anticorpo do complexo anticorpo/antigénio), kd (constante de dissociação), e KD (kd/ka). Os anticorpos de acordo com a presente invenção exibem uma KD de IO-10 M ou menos. A ligação de FCI-I e FCI-ΪΙ a Rl-FCI também é inibida pelos anticorpos de acordo com a presente invenção. A inibição é medida como a CI50 num ensaio para a ligação de FCI-I/FCI-II a Rl-FCI nas células do tumor. Esse ensaio está descrito no exemplo 7. Nesse ensaio, a quantidade de FCI-I ou FCI-II radiomarcado ou os fragmentos de ligação de Rl-FCI ligam-se por isso ao Rl-FCI das referidas células de tumor (por exemplo HT29) são medidos sem e com concentrações crescentes do anticorpo. Os valores de CI50 dos anticorpos de acordo com a presente invenção para a ligação de FCI-I e FCI-II a Rl-FCI não ultrapassam 2 nM e a relação dos valores de CI50 para a ligação de FCI-I/FCI-II a Rl-FCI é de cerca de 1:3 a 3: 1. Os valores de CI50 medem-se como os valores médios ou medianas de pelo menos três medições independentes. Valores simples de CI50 podem estar fora do objectivo. A expressão "inibição da ligação de FCI-I e de FCI-II a Rl-FCI tal como se utiliza aqui, refere-se à inibição da ligação de FCI-I ou FCI-II marcados com 125I a Rl-FCI presente na superfície das células de tumor HT29 (ATCC HTB-38) num ensaio in vitro. Inibição significa um valor de CI50 de 2 nM ou inferior. A expressão "células de expressão de Rl-FCI" refere-se às células que sobre-expressam o receptor de FCI-I receptor até cerca de pelo menos 20.000 receptores/célula. Essas células são, por exemplo, linhas de células de tumor tal como 17 NCI H322M ou HT2 9, ou uma linha de células (por exemplo, 3T3 ATCC CRL1658) que sobre-expressam Rl-FCI depois da tr.ans-fecção com o vector de expressão para o Rl-FCI. A quantidade de receptores por célula mede-se de acordo com Lamrners, R., et al., EMBO J. 8 (1989) 1369-1375. A expressão "inibição da fosforilação de Rl-FCI" refere-se a um ensaio de fosforilação celular utilizando células 3T3 que providenciam 400.000 a 600.000 moléculas de Rl-FCI por célula num meio contendo soro bovino fetal (SBF) a 0,5 % inactivado pelo calor, quando comparado com o mesmo ensaio sem o referido anticorpo. A fosforilação detecta-se por "Western blotting” utilizando um anticorpo especifico para as proteínas fosforiladas da tirosina. Esse ensaio está descrito no exemplo 11. A inactivação pelo calor do SBF é realizada por meio de um aquecimento de curto prazo até 56° C para a inactivação do sistema do complemento. A expressão "inibição da fosforilação de PKB" refere-se a um ensaio dé fosforilação celular utilizando células 3T3 que providenciam 400.000 a 600.000 moléculas de Rl-FCI por célula num meio contendo soro bovino fetal (SBF) a 0,5% inactivado pelo calor, quando comparado com o mesmo ensaio sem o referido anticorpo. A fosforilação detecta-se por "Western blotting" utilizando um anticorpo especifico para PKB na serina 473 de PKB (Akt 1, Swiss Prot Acc. No. P31749) . Esse ensaio está descrito no exemplo 11. A expressão "citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA)" refere-se à lise de células alvo de tumor humano por meio de um anticorpo de acordo com a presente invenção na presença de células efectoras. CCDA mede-se preferencialmente por meio do tratamento de uma preparação de 18 células que expressam Rl-FCI com um anticorpo de acordo com a presente invenção, na presença de células efectoras tal como PBMC recentemente isolado ou células efectoras purificadas a partir de camadas de células brancas ou células efectoras purificadas a partir de camadas de células brancas, como monócitos ou células NK (células assassinas naturais). Verifica-se CCDA se o anticorpo induz, a uma concentração de 100 nM, a lise (morte da célula) de 20 % ou mais das células do tumor passadas 24 horas. Verificou-se que a CCDA é mais pronunciada às 4 h do que às 24 h, depois realiza-se a medição às 4 h. O ensaio realiza-se preferencialmente com células de tumor marcadas com 51Cr ou Eu e a medição de 51Cr ou Eu especificamente libertados. Os controlos incluem a incubação de células-alvo do tumor com células efectoras mas sem o anticorpo. A expressão "citotoxicidade dependente do complemento (CDC)" refere-se à lise de células alvo de tumor humano por meio do anticorpo de acordo com a presente invenção na presença do complemento. Mede-se CDC preferencialmente por meio do tratamento de uma preparação de Rl-FCI que expressa as células com um anticorpo de acordo com a presente invenção na presença do complemento. Verifica-se CCDA se o anticorpo induz, a uma concentração de 100 nM, a lise (morte da célula) de 20 % ou mais das células do tumor passadas 4 horas. 0 ensaio realiza-se preferencialmente com células de tumor marcadas com 51Cr ou Eu e mede-se 51Cr ou Eu libertados. Os controlos incluem a incubação de células-alvo do tumor com o complemento mas sem o anticorpo. A expressão "inibição completa da transdução do sinal mediada por FCI-I" refere-se à inibição de FCI-I mediada por 19 fosforilação de Rl-FCI. Para esse ensaio, as células que expressam Rl-FCI, preferencialmente as células H322M, são estimuladas com FCI-1 e tratadas com um anticorpo de acordo com a presente invenção (é útil uma concentração de anticorpo de 5 nM ou superior). Em seguida, realiza-se uma EGPA-SDS (electroforese em gel de poliacrilamida e sulfato de dodecilo) e mede-se a fosforilação de Rl-FCI por análise de "Western blotting" com um anticorpo especifico para a tirosina fosforilada. A inibição completa da transdução de sinal verifica-se a na " Western blot" não se pode detectar visivelmente nenhuma banda que se refira ao Rl-FCI fosforilado.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção mostram uma ligação ao mesmo epítopo de Rl-FCI como o anticorpo 18 ou estão inibidos na ligação a Rl-FCI devido à articulação estérica da ligação por meio do anticorpo 18. A inibição da ligação pode ser detectada por um ensaio de RPS utilizando o anticorpo 18 imobilizado e Rl-FCI numa concentração de 20-50 nM e o anticorpo a ser detectado numa concentração de 100 nM. Uma redução do sinal de 50 % ou mais mostra que o anticorpo concorre com o anticorpo 18. Esse ensaio pode ser realizado da mesma maneira utilizando o anticorpo 22 como um anticorpo imobilizado. 0 termo "epítope" significa um determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epitopes consistem normalmente em agrupamentos de moléculas de superfícies quimicamente activas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e normalmente têm estruturas a três dimensões características, assim como cargas específicas características. Os epitopes conformacionais e não conforma-cionais distinguem-se pelo facto de a ligação com o primeiro, 20 mas nao com o último, se perder na presença de dissolventes de desnaturação.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção incluem, além disso, os anticorpos que têm "modificações conservadoras das sequências", modificações de sequências de nucleótidos e de aitiinoácidos que não afectam nem alteram as caracteristicas mencionadas antes do anticorpo de acordo com a presente invenção. As modificações podem ser introduzidas por técnicas normalizadas conhecidas na técnica, tal como a mutagénese dirigida ao sitio e a mutagénese mediada por RCP. As substituições conservadoras de aminoácidos incluem aqueles que o resíduo de aminoácido está substituído por resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos têm cadeias laterais similares definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártíco, ácido glutâmico}, cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo glícina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não essencial previsto num anticorpo humano anti-Rl-FCI pode ser substituído, preferencialmente, por um outro resíduo· de aminoácido da mesma família de cadeias laterais.

As substituições de aminoácidos podem ser realizadas por mutagénese com base na modelação molecular tal como descrito 21 por Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327 e Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86, (1989) 10029-10033).

Num enquadramento preferido da presente invenção, os anticorpos de acordo com a presente invenção são ainda caracterizados por uma ou mais das caracteristicas seleccionadas a partir do grupo seleccionado de parâmetros de ligação ka, kd e KD, ligação do mesmo epitope ao qual se ligam os anticorpos 18 e 22, valores de CI50 para a inibição da ligação de FCI-I e FCI-II a Rl-FCI nas células de tumor, e os valores de CI50 para a inibição da fosforilação de Rl-FCI após estimulação de FCI-1 nas células de tumor. A inibição da fosforilação de Rl-FCI leva à inibição da fosforilação dos elementos a jusante tal como PKB, à desregulação de Rl-FCI nas células de tumor e a influência no crescimento tridimensional das células de tumor in vitro. Os anticorpos são ainda caracterizados, preferencialmente,, pelos seus valores farmacocinéticos e farmacodinâmicos e pela reactividade cruzada para outras espécies.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção inibem a fosforilação de Rl-FCI de tirosina e, preferencialmente, também a fosforilação de PKB de tirosina com uma dimensão similar.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção preferencialmente desregulam o nível de proteínas de Rl-FCI em células de tumores e em tumores, por exemplo, tumores de xeno-enxertos.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção inibem preferencialmente o crescimento tridimensional de células de 22 tumores num ensaio de formação de colónias assim como a proliferação da expressão de células de Rl-FCI (por exemplo, células NIH 3T3).

Os anticorpos de acordo com a presente invenção preferencialmente não inibem a ligação da insulina a um receptor de insulina num ensaio de concorrência da ligação no receptor de insulina que sobre-expressa células 3T3 utilizando o anticorpo numa concentração de 200 nmole/1. Os anticorpos de acordo com a presente invenção são produzidos, preferencialmente, por meios recombinantes. Esses processos são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem a expressão de proteínas em células procarióticas e eucarióticas com o subsequente isolamento do polipéptido do anticorpo e a purificação usual até a uma pureza aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Para a expressão das proteínas, inserem-se os ácidos nucleicos que codificam cadeias leves e pesadas ou os seus fragmentos nos vectores de expressão por processos normalizados. A expressão realiza-se em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas apropriadas como células de OHC, células de NSO, células ΞΡ210, células de HEK293, células de COS, leveduras ou células de E.coli, e recupera-se o anticorpo a partir de células (sobrenadante ou células após a lise). A produção recombinante dos anticorpos é bem conhecida no estado da técnica e está descrita, por exemplo, nos artigos de revisão de Makridos, S.C., Protein Expr. Purif, 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880. 23

Os anticorpos podem estar presentes em todas as células, num produto de lise de células ou numa forma parcialmente purificada ou praticamente pura. A purificação realiza-se de modo a eliminar outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por meio de técnicas normalizadas, incluindo tratamentos com substâncias alcalinas/SDS, ligação de CsCl, cromatografia em coluna, electroforese em gel de agarose e outros bem conhecidos na técnica. Ver Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, New York (1987). A expressão em células NSO está descrita, por exemplo, por Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; e Barnes, L.M., et al., Bíotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. A expressão transiente está descrita, por exemplo, por Durocher, Y-, et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. A clonagem de domínios variáveis está descrita, por Orlandi, R, et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3833-3837; Cárter, P., et al., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 89 (1992) 4285-4289; e Norclerhaug, L., et al., J. Immunol. Methods' 204 (1997) 77-87. Um sistema de expressão transiente preferido (HEK 293) está descrito, por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., em Cytotechnology 30 (1999) 71-83 e por Schlaeger, E.-J., em J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

As sequências de controlo que são apropriadas para os procariotos, por exemplo, incluem um promotor, eventualmente uma sequência de operadores e um sítio de ligação do ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, melhoradores e sinais de poliadenilação. 24 0 ácido nucleico está "operacionalmente ligado" quando é colocado numa relação' fxtncional' com 'outra- sequência- der-ácidos nucleicos. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou para uma sequência lider secretora está operacionalmente ligado ao AND para um polipéptido se é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou um melhorador a promotor ou melhorador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se afecta a transcrição da sequência; ou um sitio de ligação do ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de tal modo que facilite a tradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que as sequências de ADN que vão ser ligadas são contíguas e, no caso de uma sequência líder secretora, ser contígua no quadro de leitura. Contudo, os melhoradores não têm que ser contíguos. A ligação consegue-se pela ligação nos sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, os adaptadores ou os ligantes de oligonucleótidos sintéticos são utilizados de acordo com práticas convencionais.

Os anticorpos monoclonais são separados de forma apropriada a partir do meio de cultura por processos convencionais de purificação da imunoglobulina tal como, por exemplo, A-sefarose da proteína, uma cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise, ou cromatograf ia por afinidade. 0 ADN e o ARN que codificam os anticorpos monoclonais são facilmente isolados e sequenciados utilizando processos convencionais. As células de hibridoma podem servis como uma fonte desse ADN e ARN. Uma vez isolado, o ADN pode ser inserido em vectores de expressão, que são ainda transfectados em células hospedeiras tal como células HEK 293, células de OHC, ou células de mieloma que de outra forma não produzem proteínas de imunoglobulina, para se obter 25 a síntese de anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

As variantes das sequências de aminoácidos do anticorpo humano do Rl-FCI são preparadas pela introdução de alterações apropriadas dos nucleótidos no ADN do anticorpo ou por síntese do péptido. Essas modificações podem ser realizadas, contudo, apenas num intervalo muito limitado, por exemplo, como descrito antes. Por exemplo, as modificações não alteram as características de anticorpo mencionadas antes tais como o isótipo de IgG e a ligação do epítope, mas podem melhorar o rendimento da produção recombinante, a estabilidade da proteína ou facilitar a purificação.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo anti-Rl-FCI também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidante da molécula e prevenir a reticulação aberrante. Inversamente, podem adicionar-se ligações de cisteína aos anticorpos para melhorar a sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo um fragmento de Fv).

Outra variante do tipo do aminoácido do anticorpo altera o modelo de glicosilação original do anticorpo. Por alteração deve entender-se eliminação de uma ou mais partes de hidratos de carbono encontradas no anticorpo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação dos anticorpos está normalmente ligada a N. Ligado a N refere-se à ligação da parte de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências dos tripéptidos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X representa qualquer aminoácido excepto prolina, são 26 as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da parte de hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma das sequências destes tripéptidos num polipéptido cria um potencial sítio de glicosilação. A adição dos sítios de glicosilação ao anticorpo consegue-se de uma forma conveniente por alteração da sequência de aminoácidos de tal modo que ela contenha uma ou mais das sequências de tripéptidos descritas antes (para os sítios de glicosilação ligados a N).

As moléculas de ácidos nucleicos que codificam variantes de sequências de aminoácidos do anticorpo anti-Rl-FCI são preparadas por meio de uma variedade de processos conhecidos na técnica. Estes processos incluem, mas não se limitam a isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequências de aminoácidos de ocorrência . natural) ou preparação por meio de mutagénese mediada por oligonu-cleótidos (ou dirigida ao sítio), mutagénse por RCP, e mutagénse de cassete de uma variante preparada antes ou de uma versão não variante do anticorpo humanizado anti-Rl-FCI. A presente invenção também tem por objecto imuno-conjugados que compreendem o anticorpo de acordo com a presente invenção conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico, uma toxina (por exemplo, uma toxina ou bactéria activas sob o ponto de vista enzimático, fungos, de origem em plantas ou animais, ou os seus fragmentos), um isótopo radioactivo (isto é, um radiocon-jugado) ou um pró-fármaco de um agente citotóxico. Os agentes úteis na geração desses imunoconjugados já foram discutidos antes. As toxinas activas sob o ponto de vista enzimático e os seus fragmentos que podem ser utilizados incluem a cadeia A de difteria, fragmentos activos da toxina de difteria que 27 não se ligam, cadeia A de exotoxina (da Pseudomonas aeruglnosa}, cadeia A de ricina A, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleuritesfordiir proteínas de diantina, proteínas americanas de Phytolaca {PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gefonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

Preparam-se conjugados do anticorpo e do agente citotóxico utilizando uma variedade de agentes de acoplamento da proteína bifuncional tal como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (PSPD) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres; (tal como adipimidato de dimitilo HC1), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldeídos (tal como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tal como bis-(p-azidobenzoil) hexano-diamina), derivados de bis-diazónio (tal como bis- (p-diazoniibenzoil)-etilenodiamina) , di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato de tolieno), e compostos bi-activos de flúor (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode-se preparar uma imunotoxina de ricina tal como descrito em Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104). O ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietileno-triaminepenta-acético marcado com carbono 14 . (MX-DTPA) é um exemplo de um agente quelante para a conjugação de radionucleótidos com o anticorpo. Ver WO 94/11026.

Dm outro tipo de modificação covalente envolve glicósidos que se vão acoplar quimicamente ou enzimaticamente com o anticorpo. Estes processos são vantajosos pelo facto de não exigirem a produção do anticorpo numa célula hospedeira que tem capacidades de glicosilação para a glicosilação 28 ligada a N- ou a 0-. Consoante o modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar(es) podem ligar-se a (a) arginina e a histidina, (b) grupos carboxilo livres, (c) grupos sulfidrilo livres tal como de cisteína, (d) grupos hidroxilo livres tais como os de serina, treonina, os hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tal como os de fenilalanina, tirosina, ou triptofano ou (f) o grupo amida da glutamina. Estes processos estão descritos em WO 87/05330, e em Aplin, J.D., e Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306. A eliminação de qualquer uma das partes de hidrato de carbono presentes no anticorpo podem ser conseguidas quimicamente ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer a exposição do anticorpo ao composto de ácido trifluorometano-sulfónico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maior parte ou de todos os açúcares excepto o açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetilgalacto-samina), deixando o anticorpo intacto. A desglicosilação química está descrita por Sojahr, H.T., e Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 e por Edge, A.S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. A clivagem enzimática das partes de hidratos de carbono nos anticorpos poder ser conseguida por meio da utilização de uma variedade de endo- e exo-glicosidases tal como descrito por Thotakura, N.R., e Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

Um outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno-glicol, polipropileno-glicol ou polioxialquilenos, da forma estabelecida nas patentes US Nos. 4.640.835; 4,496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337. 29

Ainda num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto células B isoladas de um animal transgénico não humano, por exemplo, um murganho transgénico, que expressa os anticorpos anti Rl-FCI humanos, de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, as células B isoladas obtém-se de um animal transgénico não humano, por exemplo, um murganho transgénico, que tenha sido imunizado com uma preparação de purificada ou enriquecida de um antigénio de Rl-FCI e/ou células que expressam Rl-FCI. Preferencialmente, o animal transgénico não humano, por exemplo, um murganho transgénico, tem um genoma que compreende transgenes humanos de cadeias pesadas e um transgene humano de cadeia leve codificando toda ou uma porção de um anticorpo da presente invenção. As células B isoladas são então imortalizadas para providenciar uma fonte (por exemplo um hibridoma) de anticorpos anti-Rl-FCI humanos. De acordo com isto, a presente invenção também tem por objecto um hibridoma capaz de produzir anticorpos monoclonais humanos de acordo com a presente invenção. Num enquadramento, o hibridoma inclui uma célula B obtida de um animal transgénico não humano, por exemplo, um murganho transgénico, com um genoma que compreende transgenes humanos de cadeias pesadas e um transgene humano de cadeia leve codificando toda ou uma porção de um anticorpo da presente invenção, fundido com uma célula imortalizada.

Num enquadramento particular, o animal transgénico não humano, é um murganho transgénico, com um genoma que compreende um transgene humano de cadeia pesada e um transgene humano de cadeia leve codificando toda ou uma porção de um anticorpo da presente invenção. O animal transgénico não humano pode ser imunizado com uma preparação purificada ou enriquecida do antigénio de Rl-FCI e/ou células que expressam Rl-FCI. Preferencialmente, o animal transgénico 30 não humano, por exemplo o murganho transgénico, é capaz de produzir isdtipós de IgGT de anticorpos monoclonais humanos contra Rl-FCI.

Os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por imunização de um animal transgénico não humano, por exemplo, um murganho transgénico com um genoma que compreende um transgene humano de cadeia pesada e um transgene humano de cadeia leve codificando toda ou uma porção de um anticorpo da presente invenção, com uma preparação purificada ou enriquecida do antigénio de Rl-FCI e/ou células que expressam Rl-FCI. As células B (por exemplo, células B esplénicas) do animal são então obtidas e fundidas com células de mieloma para formar células imortais de hibridoma que segregam anticorpos monoclonais humanos contra Rl-FCI.

Num enquadramento preferido, anticorpos monoclonais humanos contra Rl-FCI podem ser gerados utilizando ratos transgénicos que comportam partes do sistema imunitário humano em vez do sistema do murganho. Estes murganhos transgénicos, referidos aqui como ratos "HuMAb", contém um mini-local do gene de imunoglobulina humana que codifica os genes de imunoglobulina humana não rearranjados que incluem a cadeia pesada (μ e γ) e uma cadeia leve κ (genes de região constante), em conjunto com mutações-alvo que inactivam os locais endógenos de cadeias μ e κ (Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859). De acordo com isto, os murganhos exibiram uma expressão reduzida da IgM ou K de murganho e em resposta à imunização, os transgenes humanos de cadeia pesada e de cadeia leve sofrem uma mudança de classe e uma mutação somática para gerar anticorpos monoclonais humanos de IgG de alta afinidade (Lonberg, N., et al., Nature.368 (1994) 856- 31 859; revisto em Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N., e Huszar, D.,

Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; e Harding, F. , e

Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sei 764 (1995) 536-546). A preparação dos murganhos HuMAb está descrita em Taylor, L., et al.,Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., et al. , International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon, N., et al, Proc. Natl. Acad. Sei USA 90 (1993) 3720-3724;

Choi, T.K., et al., Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830; Tuaillon, N., et al,

Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental

Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor, L., et al., Int.

Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonberg, N., e Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 2 5 (1995) 65-93; Harding, F., e Lonberg, N.,

Ann. N. Acad. Sei 764 (1995) 536-546; Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851. Ver também as patentes US Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.545.807; 5.770.429; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; e WO 92/03918.

Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanos ' com Rl-FCI, podem imunizar-se ratos HuMAb com uma preparação purificada ou enriquecida do antigénio de Rl-FCI e/ou células que expressam Rl-FCI de acordo com um processo geral, como descrito por Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859;

Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 e WO 98124884. Preferencialmente, o rato terá 6-16 semanas de idade na altura da primeira imunização. Por exemplo, pode-se utilizar uma preparação purificada ou enriquecida do antigénio de Rl-FCI solúvel (por exemplo, purificado a partir das células que expressam Rl-FCI) para imunizar 32 intraperitonealmente os ratos HuMAb. No caso das imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida do antigénio de Rl-FCI não resultarem em anticorpos, os ratos podem também ser imunizados com células que expressam Rl-FCI, por exemplo, urna linha de células de tumor, para promover respostas imunitárias. A experiência cumulativa com vários antígénios tem mostrado que os ratos transgénicos HuMAb respondem melhor quando imunizados inicialmente intraperitonealmente (i.p.) com antigénio em adjuvante de Freund completo, seguido de imunizações i.p. em cada uma das semanas que se seguem (por exemplo, até a um total de 6) com antigénio em adjuvante de Freund incompleto. A resposta imunitária pode ser monitorizada ao longo de todo o protocolo de imunização, obtendo-se as amostras de plasma por meio de hemorragias retro-orbitais. 0 plasma pode ser rastreado por ELISA, e os ratos com um titulo suficiente de imunoglobulina humana anti-Rl-FCI podem ser utilizados para a imortalização das correspondentes células B. Os ratos podem levar um reforço intravenosamente com antigénio 3 a 4 dias antes de serem sacrificados e de se lhes retirar o baço e os nódulos linfáticos. Espera-se que se precisa de realizar 2-3 fusões por cada antigénio. Vários ratos serão imunizados para cada antigénio, por exemplo, pode-se imunizar um total de doze ratos HuMAb das estirpes HCo7 e HCol2.

Os ratos HCo7 têm uma interrupção JKD na sua cadeia leve endógena (kapa) (como descrito em Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), uma interrupção CMD nos seus genes endógenos de cadeia pesada (como descrito no exemplo 1 da patente WO 01/14424), um transgene KCo5 humano de cadeia leve kapa (como descrito em Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), e um transgene humano de 33 cadeia pesada HCo7 (como descrito na patente US No. 5.770.429).

Os ratos HCo7 têm uma interrupção JKD nos genes da sua cadeia leve endógena (kapa) (como descrito em Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), uma interrupção CMD nos seus genes endógenos de cadeia pesada (como descrito no exemplo 1 da patente WO 01/14424), um transgene KCo5 humano de cadeia leve kapa (como descrito em Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), e um transgene humano de cadeia pesada HCol2 (como descrito no exemplo 12 da patente WO 01/14424).

Os linfócitos do rato podem ser isolados e fundidos com uma linha de células de mieloma utilizando um PEG, com base nos protocolos normalizados para gerar hibridomas. Os hibridomas resultantes são então rastreados quanto à produção de anticorpos específicos do antigénio. Por exemplo, as suspensões de células isoladas de linfócitos esplénicos e derivados de nódulos linfáticos a partir de ratos imunizados foram fundidas com um sexto do número de células de mieloma de ratos que não segregam SP 210 (ATCC, CRL 1581) com PEG a 50 %. As células são colocadas em placa a aproximadamente 2 x 105 numa placa microtituladora de fundo plano, seguido de cerca de duas semanas de incubação em meio selectivo.

As cavidades individuais foram então rastreadas por meio de ELISA para detectar os anticorpos monoclonais humanos de IgM anti-Rl-FCI e anticorpos de IgG. Quando ocorre um grande crescimento do hibridoma, analisa-se o meio, normalmente passados 10-14 dias. Os anticorpos que segregam hibridomas são novamente colocados em placa, rastreou-se novamente e se ainda for positivo para os anticorpos monoclonais humanos de 34

IgG, anti-Rl-FCI, podem ser sub-clonadoa pelo menos duas vezes limitando a diluição. Os sub-clones estáveis são então postos em cultura ín vitro para produzir o anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

Porque as sequências de RDC são responsáveis pelas interacções de anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes de acordo com a presente invenção por meio da construção de vectores de expressão que incluem as sequências de RDC de acordo com a presente invenção nas sequências da estrutura de um anticorpo humano diferente (ver, por exemplo, Riechmann, L., et al. , Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., et al., Nature 321 (1986) 522-525; ed Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86 (1989) 10029-10033).. Essas sequências da estrutura podem obter-se a partir de bases de dados públicas de ADN que incluem sequências de genes de anticorpo humano de uma linha germinativa. Estas sequências de linhas' germinativas irão diferir das sequências de genes de anticorpos maduros porque não incluirão genes variáveis completamente ligados, que são formados pela maturação das células B durante a junção de V(D)J. As sequências dos genes das linhas germinativas irão também diferir das sequências de um anticorpo de repertório com uma elevada afinidade secundária de uma forma individual ao longo da região variável. A presente invenção compreende, preferencialmente, um fragmento de ácido nucleico que codifica um polipéptido que se liga a Rl-FCI, ao mesmo tempo que o referido polipéptido inibe a ligação de FCI-I e FCI-II a Rl-FCI, seleccionado no grupo que consiste em 35 a) uma cadeia pesada de anticorpo que compreendem as RDCs RDCl (aa 31-35), RDC2 (aa 50-66) e RDC3 (aa 99-107) da SEQ ID NO: 1 ou 3; b) uma cadeia leve de anticorpo que compreendem as RDCs RDCl (aa 24-34}, RDC2 (aa 50-56) e RDC3 (aa 89-98) da SEQ ID NO: 2 ou 4.

Combinam-se as regiões variáveis de cadeias pesadas e leves reconstruídas com as sequências de promotor, inicia-se a tradução, a região constante, 3' não traduzida, poliadenilação e terminação da transcrição para formar estruturas de vector de expressão. As estruturas de expressão de cadeia pesada e de cadeia leve podem combinar-se num único vector, são co-transfectadas, transfectadas em série, ou transfectadas separadamente em células hospedeiras que se fundem então para formar uma única célula hospedeira que expressa ambas as cadeias.

De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um processo para a produção de um anticorpo humano recombinante de acordo com a presente invenção, caracterizado pelo facto de expressar um ácido nucleico que codifica a) uma cadeia pesada de anticorpo que compreende as RDCs RDCl (aa 31-35), RDC2 (aa 50-66) e RDC3 {aa 99-107) da SEQ ID NO:l ou 3; b) uma cadeias leve de anticorpo que compreende as RDCs RDCl (aa 24-34), RDC2 (aa 50-56) e RDC3 (aa 89-98) da SEQ ID NO:2 ou 4; A presente invenção ainda tem por objecto a utilização de um anticorpo de acordo com a presente invenção para o diagnóstico de Rl-FCI in vitro, preferencialmente por meio de 36 um ensaio imunológico que determina a ligação entre Rl-FCI de uma amostra de o anticorpo de acordo com a presente invenção.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica. Contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais humanos ou a sua porção de ligação do antigénio da presente invenção, formulada em conjunto com um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composição da presente invenção com pelo menos um agente anti-tumor ou outra terapia convencional.

Um "agente quimíoterapêutico" é um composto químico útil no tratamento do cancro. Exemplos de agentes quimio-terapêutícos· incluem Adriamicina, Doxorubicina, 5-fluoro-uracilo, arabinósido de citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamido, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Gemcitabina, Citoxina, Taxol, Metotrexato,. Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatina, Teni-pósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactino-micina, Mitomicina, Esperamicina (ver patente US No. 4.675.187), Melfalan e outras mostardas de azoto relacionadas . A expressão "agente citotóxico", tal como se utiliza aqui, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/ou causa a destruição das células. 37

Entenda-se que a expressão inclui isótopos radioactivos, agentes quimioterapêuticos e toxinas, tal como toxinas activas sob o ponto de vista enzimático de origem em bactérias, fungos, plantas ou animais ou os seus fragmentos. 0 termo "pró-fármaco" tal como se utiliza neste pedido de patente refere-se a uma forma precursora ou derivado de uma substância activa sob o ponto de vista farmacêutico que é menos citotóxica para as células de tumor comparada com o fármaco que lhe deu origem e é capaz de ser activada ou convertida, sob o ponto de vista enzimático noutras formas parentais mais activas. Ver, por exemplo, Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615° Meeting Belfast (1986), e Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos da presente invenção incluem, mas não se limitam a pró-fármacos contendo fosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato, pró-fármacos contendo péptidos, pró-fármacos contendo D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacosdo anel de β-lactam, eventualmente pró-fármacos contendo fenoxiacetamidas substituídas ou pró-fármacos contendo fenilacetamidas substituídas, pró-fármacos de 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5-fluorouridina que podem ser convertidos em fármacos livres mais activos sob o ponto de vista citotóxico. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem servir numa forma de pró-fármaco para serem utilizados na presente invenção incluem, mas não se limitam aos agentes quimioterapêuticos descritos antes.

Tal como se utiliza aqui, "veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" inclui qualquer um ou todos os 38 dissolventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e anti-fúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção que sejam compatíveis sob o ponto de vista fisiológico. Preferencialmente, o veiculo é apropriado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo por injecçao ou infusão}.

Um "sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" refere-se a um sal que retém a actividade biológica desejada do anticorpo e não comporta quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (ver por exemplo Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sei. 66 (1977) 1-19). Esses sais estão incluídos na presente invenção. Exemplos desses sais incluem sais de adição de ácidos e sais de adição de bases. Os sais de adição de ácidos incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tal como sais de cloridrato..

Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de processos conhecidos na técnica. Como será evidente para especialistas na matéria, a via e/ou o modo de administração variará consoantes os resultados desej ados.

Para administrar um composto da presente invenção por meio de algumas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto com um material para prevenir a sua inactivação. Por exemplo, pode ser administrado a um indivíduo num veiculo apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Diluentes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem, soluções salinas e de tampões aquosos. 39

Os veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem soluções ou disperses aquosas esterilizadas e pós esterilizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões esterilizadas injectáveis. A utilização desses meios e agentes para substâncias activas sob o ponto de vista farmacêutico é conhecida na técnica.

As frases "administração parentérica" e "administrado parentericamente" tal como se utiliza aqui, significa modos de administração para além da administração entérica e tópica, normalmente por injecção e inclui, sem limitação, injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intra-cardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, epidural e intraesternal.

Estas composições podem também conter adjuvantes tal como conservantes, agentes de molhagem, agentes de emulsão e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto pelos processos de esterilização, supra como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, paraben, clorobutanol, fenol, ácido sórbico. Também pode ser desejável incluir agentes isotónicos·, tal como açúcares, cloreto de sódio, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser conseguida pela inclusão de agentes que retardam a absorção tal como mono-estearato de alumínio e gelatina.

Independentemente da via de administração seleccionada, os compostos da presente invenção, que podem ser utilizados numa forma hidratada apropriada e/ou sob a forma . de 40 composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formas posológicas aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico por processos convencionais conhecidos dos especialistas na matéria.

Os actuais níveis de dosagem dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para se obter uma quantidade de ingrediente activo que é eficaz para se atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, para uma composição, e para o modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. 0 nivel de dosagem seleccionado Vai depender de uma variedade de factores farmacocinéticos incluindo a actividade das composições particulares da presente invenção utilizadas, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção de um composto particular a ser utilizado, da duração do tratamento, de outros fármacos compostos e/ou materiais utilizados em combinação com as composições particulares utilizadas, a idade, o sexo, o peso, do estado clínico, do estado geral de saúde e da história clínica anterior do paciente a ser tratado, e factores semelhantes bem conhecidos nas técnicas da medicina. A composição deve ser esterilizada e fluida na medida em que a composição pode ser administrada por meio de uma seringa. Para além de água, o veiculo preferencialmente é uma solução salina isotónica tamponada.

Pode-se manter a fluidez apropriada, por exemplo, por meio da utilização, por exemplo, pela utilização de revestimento tal como lecitina, mantendo a dimensão de partícula desejada no caso de dispersão e por meio da utilização de tensioactivos. Em muitos casos, é preferível 41 incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoois tal manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição.

Descrigão da listagem de sequências SEQ ID NO: 1-4 Sequências de nucleótidos e aminoácidos dos domínios variáveis leves e pesados dos anticorpos 18 e 22 SEQ ID NO: 5 e 6 Sequências de nucleótidos e aminoácidos dos domínios de regiões constantes humanas

Descrigão das figuras

Figura 1

Expressão na superfície de Rl-FCI em culturas de células de alta e baixa densidade.

Figura 2 Ensaio de WST (células NCI H322M) para a inibição da proliferação em culturas a 3D.

Figura 3 Ensaio de formação de colónias para a inibição da proliferação em culturas a 3D (imagem microscópica).

Figura 4 Ensaio de formação de colónias para a inibição da proliferação em culturas a 3D (quantificação) . Ctr =c ontrolo; Cl 18 = anticorpo 18.

Figura 5 Inibição da ligação de I125-FCI-I a células HT29 por meio dos anticorpos 18 e 22 (valores de CI50) · 42

Figura 6

Figura 7 Figura 8

Figura 9

Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 5 Figura 15 Exemplo 1

Inibição da ligação de I125-FCI-II a células HT29 por meio dos anticorpos 18.

Inibição da ligação de I125-FCI-II a células HT2 9 por meio dos anticorpos oíIR3 .

Bloqueio da fosforilação induzida por FCI-I tanto a Rl-FCI como a Akt/PkB.

Inibição da ligação de I125-insulina a células 3T3 por meio dos anticorpos anti-Rl-FCIh. {MAX w/o Ac: Ligação máxima de I125-insulina; MIN: Ligação mínima depois da concorrência com insulina 1 pm)

Sem actividades de estimulação de AK18 em células 3T3 que sobre-expressam Rl-FCI.

Sem actividades de estimulação de AK18 em células humanas de tumor (HT29)

Desregulação.de Rl-FCI exposto na superfície das células H322N +por meio do anticorpo 18 ín vi t r o.

Tratamento com AK18, volume do tumor primário Tratamento com AKl8, com ou sem gemcitabina Tratamento com AKl8, volume do tumor primário 43

Geração de una linha de célula de hibridoma que produz anticorpos 20 anti-Rl-FCI

Cultura de hibridomas

Os hibridomas HuMAb gerados foram postos em cultura em meio que expressa hibridomas (PAA Laboratories GmbH, Áustria) complementados com L-glutamina 2 mM (BioWhittaker) e factor de clonagem de Origen a 4 % (Igen, França) a 37 °C e C02 a 5 %.

Processo de imunização de ratos transgénicos

Dez ratos transgénicos HCo7 (4 machos e 6 fêmeas), da estirpe GG2201 (Medarex, San José, CA, EUA) foram imunizados, alternativamente com lxlO5 células NlH 3T3, transfectadas com um vector de expressão para Rl-FCI, e 20 pg do domínio extracelular solúvel de Rl-FCI. Realizaram-se seis imunizações no total, três imunizações intraperitoneais (IP) com as células que expressam Rl-FCI e três imunizações subcutâneas (SC) nessa base com a proteína recombinante. Para a primeira imunização, misturou-se 100 μΐ de lxlO6 células de NIH 3T3 Rl-FCI com 100 μΐ de adjuvante completo de Freund (CFA; Difco Laboratories, Detroit, EUA). Para todas as outras imunizações, utilizou-se 100 μΐ de células em SBF ou misturou-se proteína recombinante com 100 μΐ de adjuvante completo de Freund (ICFA; Difco). ELISA especifico do antigénio

Determinaram-se os títulos anti-Rl-FCI nos soros de ratos imunizados por meio de ELISA especifico do antigénio. Revestiu-se, durante a noite, o domínio extracelular solúvel 44 de Rl-FCI a uma concentração de 1 pg/ml em SBF, a 4 °C, ou durante duas horas a 37 °C, com placas de 96 cavidades. Depois, bloquearam-se as cavidades com SBFTC (SBF complementado com Tween®-20 a 0,05 % e soro de galinha a 2 % (Gibco BRL)) durante 1 hora (h) à temperatura ambiente. Diluiu-se a primeira tampa de soro a 1/50 em SBFTC, os soros de outras tampas foram diluídos a 1/100 em SBFTC e diluiu-se em série até 1/6400. Adicionaram-se os soros diluídos às cavidades durante 1 h a 37 °C. O soro pré-recolha foi utilizado como um controlo negativo. Utilizou-se 200 ng/ml de Rl-FCI anti-humano de cabra (100 pg/ml) como controlo positivo. Em seguida, lavaram-se as placas duas vezes com SBFT e incubou-se com peroxidase de rábano (PRB) conjugada com IgG F(ab')2 anti-humana de rato (DAKO), diluída a 1/2000 em SBFTC durante 1 h a '37 °C. Lavàram-se as cavidades duas vezes com SBFT e desenvolveram-se ensaios com uma solução de ABTS® recentemente preparada (1 mg/ml) (ABTS: 2,2'-azino bis (ácido 3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico) durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA) no escuro. Mediu-se a absorvência a 405 nm.

Análise por SCAF {saída de células activada por fluorescência)

Para além da determinação dos títulos anti-Rl-FCI nos soros de ratos imunizados, por meio de ELISA específico do antigénio, também se determinaram por análises por SCAF. Incubaram-se células de Rl-FCI de NIH 3T3 e as células de Rl-FCI de NIH 3T3 não transfectadas com soro diluído durante 30 minutos a 4 °C. Utilizou-se como controlo negativo o soro antes da colheita. Utilizou-se inicialmente 200 ng/ml de Rl-FCI anti-humano de cabra como controlo positivo. Lavaram-se as células três vezes em SBF complementado com albumina de 45 soro bovino a 1 % e azida a 0,01 %. Em seguida, incubaram-se as células com isotiocianato de fluoresceina (ITCF) conjugadas com fragmentos de ligação do antigénio (fragmentos de F(ab')2) de IgG anti-humana de rato diluída a 1/100 em tampão de SCAF, durante 30 minutos a 4 °C. Lavaram-se as células duas vezes em tampão de SCAF e analisaram-se as amostras num FACSCalibur (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Bélgica).

Reforço dado aos ratos

Quando se verifica que os títulos de anti-Rl-FCI no soro são suficientes, dá-se mais um reforço aos ratos, por duas vezes, intravenosamente (i.v.), com 15 pg de domínio extracelular de Rl-FCI em 200 μΐ de SBF, 4 e 3 dias antes da fusão.

Geração do hibridoma

Sacrif icaram-se os ratos e recolheu-se o baço e os nódulos linfáticos que flanqueiam a aorta abdominal e a vaia cava. A fusão dos esplenócitos e das células dos nódulos linfáticos com o parceiro de fusão SP 2.0 foi realizada de acordo com procedimentos de operação normalizados.

K-ELISA

Para determinar se os hibridomas que resultaram da fusão geram anticorpos humanos, realizou-se um ensaio de k-ELISA. Revestiram-se as placas de ELISA com o anticorpo de cadeia leve κ de IgG anti-humana de rato (DAKO) diluído a 1/10000 em SBF por meio de uma incubação durante a noite a 4°C. Depois de se esvaziarem as cavidades, bloquearam-se as placas por 46 incubação em SBFTC durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois, incubaram-se as cavidades da placa com sobrenadante da cultura de hibridoma, diluiu-se a 1/2 em SBFTC. Utilizou-se o meio de cultura diluído a 1/2 em SBFTC como controlo negativo, e o soro de rato positivo para κ-leve diluído a 1/100 em SBFTC serviu como controlo positivo. Em seguida, lavaram-se as cavidades das placas três vezes e incubou-se com PRB conjugada com IgG F(ab')2 anti-humana de rato (DAKO), diluída a 1/2000 em SBFTC durante 1 h a 37 °C. Lavaram-se as cavidades três vezes e desenvolveram-se ensaios com uma solução de ABTS® recentemente preparada (1 mg/ml) durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA) no escuro. Mediu-se a absorvência a 405 nm num leitor de placas de ELISA.

Prepararam-se os anticorpos monoclonais 18 e 22.

Exemplo 2

Determinação da afinidade de anticorpos anti-Rl-FCI em relação a R1-FC1

Instrumento: BIACORE® 3000

Chip; CMS

Acoplamento: acoplamento de aminas

Tampão: HBS (HEPES, NaCl), pH 7,4, 25 °C

Para as medições de afinidade, os anticorpos FCy anti-humano (de coelho) foram acoplados à superfície do chip para o aparecimento do anticorpo contra Rl-FCI. Adicionou-se o domínio extracelular de Rl-FCI, em várias concentrações, em solução. Mediu-se a associação por meio de uma injecção de Rl-FCI de 3 minutos; mediu-se a dissociação por lavagem da superfície do chip com tampão durante 5 minutos. Os dados de 47 afinidade para os anticorpos 18 e 22 estão ilustrados no quadro 1.

Quadro 1

Dados de afinidade medidos porSPR (BIACORE® 3000) Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) 18 1,49x10* l,03xl0'7 6, 95xl0~13 22 1,47 x 10b fi 1 O 1—1 XI crT 6,56 x IO-10

Exemplo 3

Crescimento tridimensional de células de tumor e a sobre-expressão do receptor de FCI-I no contacto célula-célula (cultura a 3D)

Materiais e processos:

As células de NCI H322M foram postas em cultura em meio RPMI em lâminas cobertas com um vidro de grau óptico, tanto a baixa densidade como superconfluente para estudar os efeitos da expressão na superfície de Rl-FCI. Em paralelo, o tecido xeno-enxertado de H322M isolado do grupo do controlo (ratos não tratados) sofreu um choque térmico de frio em isopentano e criaram-se crio-secções com uma espessura de 5pm. Realizou-se a marcação por imunofluoresência utilizando um anticorpo monoclonal anti Rl-FCI de rato (aIR3, 5pg/ml) ou um anticorpo de acordo com a presente invenção, seguido de um anticorpo anti-rato de cabra ou um anticorpo anti-rato de cabra marcado com Cy3 (Amersham Biosciences, GB) ou Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes, Inc., EUA). Os especímens foram visualizados num microscópio confocal Leica SP2 ou foram analisados por SGAF. 48

Resultados :

Quando se visualizaram as células H322M, em cultura de alta densidade, por meio de um microscópio confocal, torna-se evidente que os Rl-FCI se agruparam especificamente nos sitios do contacto célula-célula. Quando se comparada com as células H322M, que cresceram in vivo, isto é, com o tecido xeno-enxertado, nota-se que há uma semelhança impressionante com as culturas ín vitro densamente posicionadas desde que esteja envolvida a organização dos receptores de FCI-I da superfície. A sobre-regulação do receptor da FCI-I da superfície em culturas superconfluentes de células H322M foi também quantificada por SCAF. A expressão na superfície do receptor de FCI-I aumentou mais do que 10 vezes quando as células cresceram em condições de alta densidade comparadas com a baixa densidade sem contactos significativos de célula-célula .

Outras células de tumor tal como HT29, MDA231 e MCF-7 mostraram um comportamento semelhante, indicando que a sobre-regulação dos receptores de FCI-I na superfície das células após o estabelecimento dos sitios de contacto célula-célula não é uma característica única das células H322M mas parece ser uma propriedade geral de uma organização mais semelhante a tecido que também não se encontra in vivo (Fig. 1).

Exemplo 4

Inibição do crescimento de células de tumor K322M que expressam Rl-FCI em cultura em 3D sob o tratamento com o anticorpo 18 (ensaio WST) 49

Fez-se uma cultura de células H322M em meio RPMI a 1640/0,5 % FCS em pratos revestidos com poli-HEMA (poli(2-hidroxietilmetacrilato)) para prevenir a aderência à superfície de plástico. Nestas condições, as células H322M formam esferóides densos que crescem tridimensionalmente (uma propriedade que é designada por independência de ancoragem). Estes esferóides parecem-se muito com a histo-arquitectura tridimensional e com a organização dos tumores sólidos in situ. Incubaram-se as culturas de esferóides durante 5 dias na presença de quantidades crescentes de anticorpos de 0-240 nM. 0 ensaio de conversão WST foi utilizado para medir a inibição do crescimento. Quando se trataram as culturas de esferóides de H322M com diferentes concentrações de anticorpo 18 (1-2 4 0 nM) , podia observar-se uma inibição do crescimento dependente da dose (Fig. 2).

Exemplo 5

Inibição do crescimento de células de tumor H322M que expressam Rl-FCI em cultura em 3D (ensaio de formação de colónias)

Fez-se uma cultura de células H322M em meio RPMI a 1640/10 % NCS em pratos revestidos com poli-HEMA para prevenir a aderência à superfície de plástico. Nestas condições, as células H322M formam esferóides densos que crescem tridimensionalmente (uma propriedade que é designada por independência de ancoragem). Estes esferóides representam a histo-arquitectura tridimensional e com a organização dos tumores sólidos in situ. Incubaram-se as culturas de esferóides durante 5-10 dias na presença de quantidades crescentes de anticorpos de 0-7,5 pg/ml. Utilizou-se o anticorpo monoclonal <HBV> como controlo negativo. 50

Visualizaram-se as colónias num microscópio invertido (Zeiss Axiovert) utilizando contraste de fase e para a contagem utilizou-se um sistema de visualização automático (MetaMorph). Quando se trataram as culturas de esferóides de H322M com diferentes concentrações de anticorpo 18 (0,5-7,5 pg/ml), podia observar-se uma inibição do crescimento dependente da dose, enquanto o anticorpo de controlo <HBV> tinha pouco ou nenhum efeito. Tanto o número como a dimensão das colónias estavam claramente reduzidos nas culturas tratadas com 7,5 pg/ml de anticorpo 18 (Fig. 3). A análise quantitativa das colónias com diâmetros maiores do que 100 pm revelou que o número de colónias foi reduzido de cerca de 66 % nas culturas tratadas com 0,5 pg/ml de anticorpo 18 (Fig. 4).

Exemplo 6

Inibição da ligação de FCI-I e de FCI-II a células de tumor que expressam Rl-FCI

Para determinar a capacidade do anticorpo da presente invenção para bloquear a ligação dos ligandos FCI-I e FCI-II ao receptor de FCI-I (Rl-FCI), realizaram-se experiências comparativas com péptidos de ligandos marcados radio-activamente.

Colocaram-se em placas células de tumor humano (HT29, NCI H322M, 0,5 a 1 x 105/ml) em meio RPMI 1640 (PAA, Cat. No. E15-039) complementado com L-Glutamina 2 mM, lx aminoácidos não essenciais (Gibco, Cat. No. 11140-035), piruvato de sódio 1 mM (Gibco, Cat. No. 11360-039) e SBF a 10 % inactivado pelo calor (PAA, Cat. No. A15-771). Inocularam-se seis frascos com 51 o formato Τ175 com 20 ml de células no meio respectivo para cada experiência e fez-se uma cultura durante dois dias a 37 °C e em CO2 a 5 % para se obter mono-camadas de células confluentes.

Para recolher as células individuais, adicionou-se 2 ml de lx Tripsina/EDTA (Gibco, No. de cat. 25300-054) por cada frasco T175 e monitorizou-se o destacamento das células com um microscópio Axiovert25 da Zeiss. Recolheram-se as células e o meio com SBF a 10 % tal como se descreveu antes até a um volume total de 50 ml. Isolaram-se novamente as células por centrifugação durante 10 minutos a 1000 rpm (Heraeus sepatech, Omnifuge 2.0 RS) e suspenderam-se novamente em 50 ml de tampão de ligação (NaCl 120 mM, KC1 5mM,. MgS04 1,2 mM, EDTA 1 mM, D ( + ) glicose 10 mM, NaAc 15 mM, Hepes 100 mM a pH 7,6, ASB a 1 %). Contaram-se as células, Isolaram-se novamente por centrifugação e ajustou-se com tampão de ligação até 1 x 106 células/ml.

Diluíram-se os péptidos FCI-I e FCI-II marcados com 125I (Amersham, ~2000 Ci/mmole, n° de Cat. IM172 e IM238), solubilizados em CH3COOH a 0,1 %, em tampão de ligação até a uma actividade final de 4 x 105 contagens/ (minuto x ml) . Adicionou-se 75 μΐ de anticorpo nas concentrações especificadas em conjunto com 25 pl de péptidos FCI-I ou FCI-II pré-diluídos e marcados com 125I, a 200 μΐ da suspensão de células e incubou-se durante 3,5 h a 4°C. Isolaram-se novamente as células por centrifugação durante 5 minutos a 2000 rpm (Eppendorf, 5415C) e eliminou-se o sobrenadante. Depois de se lavar duas vezes em 1 ml de tampão de ligação, suspenderam-se novamente as células em 1 ml de tampão de ev transferiram-se para tubos de cintilação. Mediu-se a 52 quantidade de ligação radioactiva dos péptidos aos receptores da superfície das células num contador de cintilação.

As curvas de CI50 resultantes demonstraram a capacidade do anticorpo para inibir a ligação dos péptidos FCI-I e FCI-II ao receptor de CI50 para o anticorpo 18 é de 0,3 nM. Os resultados para o anticorpo oíIR3 estão ilustrados na Fig. 7. Não se observou inibição detectável para a ligação de FCI-II.

Exemplo 7

Ensaio de comparação de anticorpos para a ligação do Rl-FCX

Para um mapeamento de um epitope de anticorpos monoclonais anti-Rl-FCI, seleccionou-se um formato similar ao da medição da afinidade (Exemplo 2), mas o Rl-FCI foi pré-incubado durante pelo menos 0,5 hours à TA com o anticorpo em solução. Injectou-se esta mistura e detectou-se a ligação de Rl-FCI (ou a inibição). Este ensaio permite a medição da actividade inibidora recíproca de anticorpos monoclonais da ligação de Rl-FCI. Verificou-se que os anticorpos da presente inveção concorrem, na ligação Rl-FCI comh aIR3, um anticorpo que é conhecido por se ligar aos aa 217-274 (Gustafson, T.A., e Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667).

Exemplo 8

Inibição da fosforilação mediada por FCI-I de Rl-FCI e de Akt/PKB

Para determinar a capacidade do anticorpo da presente invenção para inibir a activação e a fosforilação do receptor de FCI-I (Rl-FCI), realizaram-se experiências comparativas 53 com o péptido FCI-I e subsequentes análises de "Western blotting" com anticorpos específicos para a tirosina fosforilada.

Colocaram-se em placa células de tumor humano (HT29, NCI H322M, 5 x lOVml) em meio RPMI 1640 (PAA, No.de Cat. EI 5-039) complementado com L-Glutamina 2 mH, lx aminoácidos não essenciais (Gibco, No.de Cat. 11140-035), piruvato de sódio 1 mM (Gibco, No. de Cat. 11360-039) e SBF a 0,5 % inactivado pelo calor (PAA., No.de Cat. A15-771) . Para a determinação dos valores de CI50, inocularam-se 12 cavidades das placas com 1 ml de células no respectivo meio para cada experiência e fez-se a cultura durante dois dias a 37 °C e CO2 a 5 %.

Passadas 48 horas de cultura com meio pouco sérico, êliminou-se cuidadosamente o meio e substituiu-se por concentrações diferentes de anticorpo diluído no respectivo meio. Passados 5 minutos de incubação a 37 °C e CO2 a 5 %, adicionou-se o péptido FCI-I numa concentração final de 2 nM e as células foram novamente incubadas durante 10 minutos nas condições mencionadas antes. 0 meio foi cuidadosamente eliminado por aspiração e adicionou-se 100 μΐ de tampão de lise frio, por cada cavidade (Hepes 50mM a pH 7,2, NaCl 150 mH, EGTA 1 mM, glicerol a 10 %, Triton®-X100 a 1 %, NaF lOOmM, Na4P207 10 mM,inibídor de protease Complete®). As células foram destacadas utilizando um raspador de células (Corning, No. de Cat. 3010) e transferiram-se os conteúdos das cavidades para tubos de reacção de Eppendorf. Os fragmentos de células foram eliminados por centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4 °C e adicionou-se metade do sobrenadante a 2x tampão de amostra de Laemmli numa relação de 1:1 (v/v) . Para a imunoprecipitação de Rl-FCI, o sobrenadante remanescente dos produtos da lise sofreram uma 54 centrifugação para purificação (10 minutos a 13000 rpm e 4 °C) imediatamente antes de se adicionar 1 μΐ de um anticorpo policlonal contra Rl-FCIp (C-20, Santa Cruz Biotechnologies} ou um anticorpo monoclonal de murino (IgGl)' que reconhece um epitope dentro dos aminoácidos 440-586 do domínio extracelular (cadeia a) do receptor humano do tipo FCI (Acm 24-55, GroPep). Passadas 2 horas de incubação a 4°C num tubo de reacção de Eppendorf em rotação, adicionou-se 25 μΐ de pérolas de Proteína G Sepharose® (Amersham Biosciences, No. de Cat. 17-0618-01) seguido de outra etapa de incubação de 1 hora a 4°C. Isolaram-se, por centrifugação, as pérolas com complexos de anticorpo-proteína ligados (1 minuto a 2000 rpm e 4°C) e lavaram-se três vezes com tampão de lavagem (tampão de lise apenas com Triton®-Xl00 a 0,1 %) . Depois de se levarem as pérolas à ebulição em tampão de amostra de Laemmli, separaram-se as proteínas celulares por EGPA-SDS e transferiram-se para uma membrana de nitrocelulose (PROTRAN® BA 85, Schleicher&Schuell) por, meio de "Western blotting" semi-anidro.

Utilizou-se um anticorpo específico de fosfotirosina (Upstate, clone 4G10, No.de Cat. 05-321) para determinar o estado de fosforilação de Rl-FCI imuno-purifiçado. Para a detecção de Akt/PKB fosforilado, aplicou-se um anticorpo com especificidade para Ser473 fosforilada (Cell Signalling, No. de Cat. 9271). O bloqueio observado da fosforilação induzida por FCI-I tanto de Rl-FCI e Akt/PKB está ilustrado na Fig. 8.

Exemplo 9

Indução da desrugalação mediada pelos antiocorpos de Rl-FCI In-vitro 55

De modo a detectar os efeitos do anticorpo da presente invenção e a quantiadde do receptor de FCI-I (Rl-FCI) em células de tumor, realizaram-se experiências ao longo do tempo e as subsequentes análises de "western-blotting" com anticorpos específicos de Rl-FCI.

Colocaram-se em placa células de tumor humano (HT29, 5 x lOVml) em meio RPMI 1640 (PAA, No.de Cat. E 15-039) complementado com L-Glutamina 2 mM, lx aminoácidos não essenciais (Gibco, No.de Cat. 11140-035), piruvato de sódio 1 mM (Gibco, No. de Cat. 11360-039) e SBF a 10% inactivado pelo calor (PAA, No.de Cat. A15-771). Para cada período de incubação, inoculou-se uma placa de 12 cavidades com 1 ml de células no respectivo meio para cada experiência e fez-se a cultura durante 24 horas a 37 °C e em C02 a 5 %.

Eliminou-se cuidadosamente o meio e substituiu-se por concentrações diferentes de anticorpo diluído no respectivo meio. Em duas das cavidades de controlo substituiu-se o meio quer por um meio sem anticorpo ou por um meio com um anticorpo de controlo (AB-1, Oncogene, No. de Cat. GR.11) . Incubaram-se as células a 37 °C e em CO2 a 5 % e retiraram-se placas individuais para um posterior tratamento passados 15 minutos, 24 horas e 48 horas. 0 meio foi cuidadosamente eliminado por aspiração e adicionou-se 100 μΐ de tampão de lise frio, por cada cavidade (Hepes 50mM a pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10 %, Triton®-X10Q a 1 %, NaF lOQmM, Na^Cb 10 mM, inibidor de protease Complete®) . As células foram destacadas utilizando um raspador de células (Corning, No. de Cat. 3010) e transferiram-se os conteúdos das cavidades para tubos de reacção de Eppendorf. Os fragmentos de células foram 1 56 eliminados por centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4 °C e adicionou-se metade do sobrenadante a 2x tampão de amostra de Laemmli numa relação de 1:1 (v/v). Separaram-se as proteínas celulares por EGPA-SDS e transferiram-se para uma membrana de nitrocelulose (PROTRAN® BA 85, Schleicher&Schuell, n° de cat. 10 401196) por, meio de "Western blotting" semi-anidro.

Utilizou-se um anticorpo específico de para Rl-FCI (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat. No. sc-713) para determinar os níveis de proteína de Rl-FCI.

Observou-se desregulação de Rl-FCI induzida pelo anticorpo da presente invenção depois de menos do que 24 horas depois da adição do anticorpo.

Exemplo 10

Inibição da ligação de insulina a células 3T3 que expressam o receptor de insulina humana.

Para determinar se o anticorpo da presente invenção também bloqueia a ligação da insulina ao receptor de insulina (RI), realizaram-se experiências comparativas com um péptido do ligando marcado radioactivamente.

Colocaram-se em placa células 3T3 (1 x 105/ml) que expressam de uma forma recombinante números altos (> 10 ) de RI em meio MEM Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glicose (PAA, No.de Cat. E15-039) complementado com L-Glutamina 2 mM, (Gibco, No.de Cat. 25030-024), e SBF a 10% inactivado pelo calor (PAA, No.de Cat. A15-771). Inocularam-se seis frascos no formato T175 com 20 ml de células no respectivo meio para 57 cada experiência e fez-se a cultura durante dois dias a 37 °C e em C02 a 5 % para se obter monocamadas de células confluentes.

Para recolher as células individuais, adicionou-se 2 ml de lx Tripsina/EDTA (Gibco, No. de cat. 25300-054) por cada frasco T175 e monitorizou-se o destacamento das células com um microscópio. Recolheram-se as células eo meio com SBF a 10% como se descreveu antes de se adicionar até a um volume total de 50 ml. Isolaram-se novamente as células por centrifugação durante 10 minutos a 1000 rpm e fez-se uma nova suspensão em 50 ml de tampão de ligação (NaCl 120 mM, KC1 5mM, MgS04 1,2 mM, EDTA 1 mM, D ( + ) glicose 10 mM, NaAc 15 mM, Hepes 100 mM a pH 7,6, ASB a 1 %). Contaram-se as células por centrifugação e ajustou-se com tampão de ligação até 1 x 1Q6 células/ml.

Diluíram-se os péptidos de insulina marcados com 125I (Amersham, ~2000 Ci/mmole, n° de Cat. IM166), solubilizados em CH3COOH a 0,1 %, em tampão de ligação até a uma actividade final de 4*x 105 contagens/ (minuto*ml) . Adicionou-se 75 μΐ de anticorpo em conjunto com 25 μΐ de péptido de insulina marcado com 125I pré-diluído, a 200 μΐ da suspensão de células (concentração final de anticorpo 200 nM) e incubou-se durante 3,5 h a 4°C. Isolaram-se novamente as células por centrifugação durante 5 minutos a 2000 rpm e eliminou-se o sobrenadante. Depois de se lavar duas vezes em 1 ml de tampão de ligação, fez-se novamente uma suspensão das células e transferiram-se para tubos de cintilação. Mediu-se a quantidade de péptido radioactivo ligado aos receptores da superfície das células num contador de cintilação.

I 58

Os resultados demonstram que o anticorpo da presente invenção não interfere com a ligação do ligando de insulina ao receptor de insulina (Fig. 9).

Exemplo 11

Sem estimulação da fosforilação de Rl-FCI e Akt/PKB

Para excluir as actividades de estimulação de Rl-FCI do anticorpo da presente invenção, determinou-se a fosforilação de Rl-FCI na ausência do ligando de FCI-I mas na presença do anticorpo· da presente invenção e de um anticorpo de referência (aIR3, Oncogene, Alemanha) . Realizou-se isto por meio de uma análise de "western-blotting" com anticorpos específicos do estado de fosforilação. Colocaram-se em placa células 3T3 (ATCC CRL 1658) transfectadas com Rl-FCI (5*104célula/ml, Pietrzkowski, Z., et al., Cell Growth Differ. 4 (1992) 199-205) em meio MEM Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glicose (PAA, No. de Cat E15-009) complementado com L-Glutamina 2 mM (Gibco, No.de Cat. 25030-024) e SBF a 0,5% inactivado pelo calor (PAA, No. de Cat A15-771) ou células de tumor humana (HT29, NCI H322M, 5*104/ml) em meio RPMI 1640 (PAA, No. de Cat E15-039) complementado com L-Glutamina 2 mM, 1 x aminoácidos não essenciais (Gibco, No.de Cat. 11140-035), piruvato de sódio 1 mM (Gibco, No. de Cat 11360-039) e SBF a 0,5% inactivado pelo calor (PAA, No. de Cat A15-771) . Para a determinação dos valores de CI50 Inocularam-se placas de 12 cavidades com 1 ml de células no meio respectivo para cada experiência e fez-se uma cultura durante dois dias a 37 °C e em CO2 a 5 %.

Passadas 48 horas de cultura em meio pouco sérico, o meio foi cuidadosamente retirado e substituído por 59 concentrações diferentes de anticorpo diluído no respectivo meio. Fez-se a incubação das células durante 15 minutos nas condições mencionadas antes. 0 meio foi cuidadosamente retirado por aspiração e adicionou-se, por cada cavidade, 100 μΐ de tampão de lise frio (Hepes 50 mM a pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10 %, Triton-XlOO a 1 %, NaF 100 mM, Na4P207 10 mM, inibidor de protease Complete™) . Destacaram-se as células utilizando um raspador de células (Corning, No. de Cat. 3010) e transferiu-se o conteúdo das cavidades para tubos de reacção de Eppendorf. Retiraram-se os fragmentos de células por centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4 °C (centrifugadora de Eppendorf 54158) e adicionou-se metade do sobrenadante a 2x tampão de amostra de Laemmli numa relação de 1:1 (v/v) . Para a imunoprecipitação de Rl-FCI, o sobrenadante remanescente dos lisados de células sofreram uma centrifugação para purificação (10 minutos a 13000 rpm o 4 °C) exactamente antes de se adicionar 1 μΐ de um anticorpo contra Rl-FCI (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, No. de cat.sc-713 ou Acm 24-55, GroPep, No. de cat. MADl). Passadas 2 horas de incubação a 4 °C num tubo de reacção de Eppendorf em rotação, adicionou-se 25 μΐ de pérolas de Proteína G e Sepharose™ (Amersham Biosciences, No. de cat. 17-0618-01) seguida de outra etapa de incubação de 1 hora a 4 °C. Isolaram-se as pérolas ligadas aos complexos de anticorpo e proteína por centrifugação (1 minuto a 2000 rpm e 4 °C) e lavou-se três vezes com tampão de lavagem (tampão de lise apenas com Triton-XlOO a 0.1 %) . Depois de se levar as pérolas à ebulição em tampão de amostra Laemmli, separaram-se as proteínas celulares por EGPA-SDS e transferiu-se para uma membrana de nitrocelulose (PROTRAN BA 85, Schleicher&Schuell, No. de Cat. 10 401196) por "western-blotting" semi-anidro. 60 fosfotirosina

Utilizou-se um anticorpo específico de (Upstate, clone 4G10, No.de . Cat 05-321, reconhecendo proteínas fosforiladas de tirosina} para determinar o estado de fosforilação do Rl-FCI imunopurifiçado. Para a detecção de Akt/PKB fosforilada aplicou-se um anticorpo contra Aktl com especificidade para a Ser473 fosforilada (Cell Signalling, No. de Cat. 9271).

Observou-se que a cínase Akt/PKB a jusante da via de sinalização de Rl-FCI estava significativamente activada pelo anticorpo de referência a concentrações mais elevadas do que 5 nM mas não pelo anticorpo da presente invenção a concentrações até 10.000 nM. Os resultados estão ilustrados nas figs. 10 e 11 (HM= meio pouco sérico com SBF a 0,5 %, HM+IGFI= meio pouco sérico com SBF a 0,5 % e FCI-Ih 10 nM ).

Exemplo 12

Indução da desregulação do receptor em modelos xeno-enxertados de H322M

Induziram-se os tumores em ratos pelados e trataram-se uma vez com diferentes concentrações do anticorpo da presente invenção. 24 horas depois do tratamento extraíram-se os tumores e homogeneizaram-se em azoto líquido. Adicionou-se tampão de lise frio (Hepes 50 mM a pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 10 %, Triton-X100 a 1 %, NaF 100 mM, Na3V04 1 mM, Na4P207 10 mM, inibidor de protease Complete™, PMSF 1 mM) numa relação de volume de tampão para peso do tumor de 3:1 e misturou-se cuidadosamente com o homogeneizado do tumor descongelado. Depois de se solubilizar o tecido durante 15 minutos em gelo, retiraram-se os fragmentos insolúveis por centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4 °C 61 (centrifugadora de Eppendorf 5415R). A concentração da proteína nas amostras foi determinada com os reagentes Micro BCATM (Pierce) e adicionou-se tampão de lise para ajustar para concentrações iguais. Adicionou-se parte do sobrenadante a 2x tampão de amostra de Laemmli numa relação de 1:1 (v/v). Separaram-se as proteínas celulares por EGPA-SDS e transferiram-se para uma membrana de nitrocelulose (PROTRAN BA 85, Schleicher&Schuell, No. de Cat. 10401196} por "western-blotting" semi-anidra. Utilizou-se um anticorpo específico de Rl-FCI (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, No. de cat. sc-713) para detectar Rl-FCI.

Após tratamento com o anticorpo da presente invenção, os requerentes observaram uma concentração dependente da diminuição dos níveis de Rl-FCI com uma CE5o de 0,6 mg/kg (Figura 12).

Exemplo 13 ELISA da ligação de Clq Introdução

Para determinar a capacidade dos anticorpos de acordo com a presente invenção para fixar Clq, utilizou-se uma abordagem por ELISA. Clq faz parte do sistema imunitário adaptativo e, depois da ligação aos complexos imunitários, provoca a activação sequencial de vários zimogenes. As enzimas, por sua vez, causam a clivagem das moléculas de C3, que podem resultar no desencadear de reacções inflamatórias, opsonização de partículas estranhas ou aberrantes e lise das membranas das células. 62

Em princípio, a placa de ELISA é revestida com o anticorpo num intervalo de concentração, ao qual se adiciona Clq humana. Detecta-se a ligação de Clq por meio de um anticorpo dirigido contra Clq humana seguida de um conjugado marcado com peroxidase.

Materiais e processos

Analisaram-se os anticorpos 18, 8 e 23 e os anticorpos de controlo em concentrações de 10, 5, 1 e 0,5 pg/ml. O quadro 1 mostra as especificidades das amostras ensaiadas. Como controlo negativo utilizou-se uma IgG4 humana (CLB, concentração de 0,5 que se liga muito fracamente a Clq. Incorporou-se IgGl humana como controlo positivo. Utilizou-se uma solução de reserva de Clq humana com uma concentração de 2 pg/ml. Para a detecção de Clq utilizou-se um anticorpo de coelho dirigido contra Clq (Dako) e um anticorpo de IgG anti-coelho, conjugado com peroxidase de rábano (Sigma). Cálculos e ajustamento da curva

Os cálculos respeitantes à ligação máxima (Lmax) do Acmh analisado foram determinados utilizando o ajustamento da curva de regressão não linear (um sítio de ligação) utilizando o software Graphpad Prism.

Resultados

Os anticorpos de acordo com a presente invenção mostram uma ligação dependente da dose da proteína humana Clq. A densidade óptica a 405 nm (DO 405 nm) foi desenhada num gráfico em função das concentrações de Acmhu e ajustaram-se as curvas utilizando a regressão não linear. Os valores que 63 melhor se ajustam para a ligação máxima (Lmax) estão listados no quadro 2, como o coeficiente de correlação da curva (R2) e o desvio padrão para cada valor. 0 coeficiente de correlação mais baixo tinha um valor de 0,950 (IgG4). Com uma ligação máxima de 0,279, a IgG4 humana (controlo negativo) mostra a ligação mínima de Clq. Os controlos positivos IgGl e IgG3 ligam-se ambos a Clq, tal como se mostra pela ligação máxima de 1,729 e 2,223, respectivamente.

Quadro 2

Ligação máxima (Lmax) do Acmhu ensaiado na ligação de Clq ELISA (n=3) Valores que melhor se ajustam Lmax Desvio padrão de Lmax Bondade de ajustado Desvio padrão de R* IgGl 1,729 0,166 0, 983 0,010 IgG3 2,223 0, 947 0, 995 0,005 IgG4 0,279 0,280 0, 950 0,041 Anticorpo 18 1, 670 0, 601 0, 988 0,005 0 coeficiente de correlação (R2) e o desvio padrão estão também listados.

Comparando a ligação de Clq da IgG4 humana (controlo negativo, com uma D.O. de 0,279), todos os anticorpos ensaiados eram igualmente capazes de fixar Clq.

Exemplo 14

Determinação das funções efectoras mediadas por anticorpos por meio de AcmsHu anti-Rl-FCI

Para determinar a capacidade dos anticorpos AcmsHu gerados para provocar mecanismos efectores imunitários, realizaram-se estudos de citotoxicidade dependente do 64 complemento (CDC) e de citotoxicidade das células dependente do anticorpo (CCDA).

Para estudar a CDC (National Câncer Institute, linha de células de adenocarcinoma do pulmão), marcaram-se as células H322M, H460 e NIH 3T3 (2-6 x 106) com 100 μ Ci51Cr durante 45-120 minutos (Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJSll). Depois da marcação as células foram lavadas duas vezes com 40 ml de SBF e centrifugaram-se durante 3 minutos a 1500 rpm. Colocaram-se então as células em placas, 5.000 por cavidade numa placa de fundo redondo, num volume de 50 μΐ. Adicionaram-se anticorpos numa concentração final variando de 25-0,1 pg/ml num volume de 50 μΐ de meio de cultura de células a 50 μΐ de suspensão de células e incubou-se durante 30-60 minutos. Depois da incubação, eliminou-se o excesso de anticorpo por uma lavagem duas vezes com SBF. Adicionou-se 100 μΐ de soro humano activo ou inactivo (30 minutos a 56 °C) reunido, soro de cobaias, coelhos ou ratos pelados diluído entre 1/3-1/30, e incubaram-se as células durante 3 horas, depois do que se centrifugaram as células a 1500 rpm durante 3 minutos. Recolheu-se 100 μΐ do sobrenadante, transferiu-se para tubos de polipropileno e contou-se num contador γ.

Para estudar os efeitos dos anticorpos na CCDA, marcou-se H322M, H4 60 e NIH 3T3 ou outras células apropriadas que expressam Rl-FCI (2-6 x 106) com 100 pCi 51Cr durante 45-120 minutos (Amershar Pharmacia Biotech, UK, Cat CJSI 1), lavou-se duas vezes com 40 ml de SBF e centrifugou-se durante 3 minutos a 1500 rpm. Colocaram-se as células em placas à razão de 5.000 por cavidade numa placa de fundo redondo, num volume de 50 μΐ. Adicionaram-se anticorpos AcmHu numa concentração final variando de 25-0,1 pg/ml num volume de 50 μΐ de meio de cultura de células, a 50 μΐ de uma suspensão de células e 65 incubou-se durante 15 minutos. Em seguida, adicionou-se 50 μΐ de células efectoras, PBMC recentemente isolado ou células efectoras purificadas a partir de camadas de células brancas, numa relação de E:T no intervalo de 100:1 a 5:1. Centrifugaram-se as placas durante 2 minutos a 500-700 rpm, e incubou-se durante a noite a 37 °C. Depois da incubação, centrifugaram-se as células durante 3 minutos a 1500 rpm e colheu-se 100 μΐ de sobrenadante, transferiu-se para tubos de polipropileno e contou-se num contador γ. A amplitude da lise das células feita por CDC ou por CCDA é expressa como uma % da libertação máxima de radioactividade a partir de células-alvo que sofreram a lise por meio de detergente, corrigida pela libertação espontânea de radioactividade a partir de células-alvo.

Exemplo 15

Inibição do crescimento de tumores de H322M

Os efeitos do anticorpo 18 in vivo foram investigados induzindo tumores em ratos pelados atímicos de acordo com processos estabelecidos. As células humanas H322M NSCLC foram co-injectadas subcutaneamente, em conjunto com Matrigel, em ratos pelados atimicos (nu/nu) com 6-7 semanas de idade. Com este ' fim, concentrou-se 5 x 106 células H322M em 100 μΐ de meio de cultura e misturou-se com 100 μΐ de Matrigel. Injectaram-se 200 μΐ desta mistura nos flancos direitos de ratos. Calculou-se o volume do tumor medindo os diâmetros dos tumores com calibradores de Vernier, duas vezes por semana, de acordo com a fórmula que foi publicada pela primeira vez por Geran et al. ("Protocols for screening Chemical agents and natural products against animal tumors and other 66 biological systems", Câncer Chemother. Rep. 11.301, 1972) em que o volume do tumor [mg] = (comprimento x (largura)2). 0 anticorpo foi administrado intraperitonealmente (i.p.) a 10 ml/kg. 0 tratamento iniciou-se com doses duplas do anticorpo administrado em volumes duplos. Os tumores foram induzidos em ratos pelados tal como se descreveu antes. Depois de os tumores terem crescido até a um volume de 160 mg, os ratos foram tratados intraperitonealmente seis vezes, uma vez por semana, com 6, 0,6 e 0,06 mg/kg de anticorpo sob a forma de doses consecutivas iniciando-se com 12, 1,2 e 0,12 mg/kg tal como a dose de carga dada uma vez no primeiro dia de tratamento. Ά figura 13 mostra os volumes de tumor medidos durante o tratamento até ao 67° dia, ocasião em que os animais foram sacrificados e a experiência terminou. A experiência demonstra que o bloqueio do eixo de Rl-FCI por meio do Acm 18 anti-Rl-FCI rhu resulta numa eficácia anti-tumoral quando administrado como agente único a 6 e 0,6 mg/kg. Pelo contrário, 0,06 mg/kg não tem efeito no crescimento do tumor.

Além disso, ensaiou-se o anticorpo 18 em combinação com gemcitabina no mesmo modelo. Os tumores foram induzidos tal como se descreveu antes e iniciaram-se os tratamentos quando os tumores estiverem estabelecidos e cresçam até a uma média de 17 0 mm3 em todos os grupos. O anticorpo foi administrado uma vez por semana i.p. a 6 e 0,6 mg/kg e em combinação com 62 mg/kg de gemcitabina a 0,6 mg. Administrou-se a gemcitabina num ciclo, isto é, de três em três dias por quatro vezes no total. Novamente, iniciou-se o tratamento por administração de doses duplas do anticorpo. A figura 14 mostra a dimensão do tumor relacionada com os vários tratamentos ao longo do tempo. A experiência demonstrou que o tratamento com anticorpo 18 administrado uma vez de sete em 67 sete dias inibe o próprio crescimento do tumor e aumenta a eficácia da gemcitabina, um composto antimetabólico conhecido.

Exemplo 16

Inibição do crescimento de tumores de 3T3

Os tumores foram induzidos em ratos pelados tal como descrito no exemplo 15 excepto no facto de se utilizarem fibroblastos de 3T3 de murino que sobre-expressarem o Rl-FCI humano. Tratou-se, intraperitonealmente, os ratos com tumores estabelecidos de aproximadamente 180, uma vez por semana, durante sete vezes com 18, 6 ou 0,6 mg/kg de anticorpo 18.

Novamente, o tratamento iniciou-se com doses duplas de anticorpo dado como a dose de carga (36, 12 e 1,2 mg/kg). A experiência demonstra que por meio do tratamento com o anticorpo, o crescimento do tumor pode ser atrasado quando administrado a 18 e 6 mg/kg uma vez por semana (figura 15).

Lista de referências

Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sei. 57 (2000) 1050-1063 Aplin, J.D., and Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306

Arteaga, Cl., et al., Breast Câncer Res. Treatment 22 (1992) 101-106

Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)

Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270

Barnes, L.M., et al., Cytotochnology 32 (2000) 109-123 68

Benini, S., et ai, Clin. Câncer Res. 7 (2001) 1790-1797

Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sei. 66 (1977) 1-19 Bergmann, U., et al., Câncer Res. 55 (1995) 2007-2011 Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 Brunetti, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218 Cárter, P., et al., Proc. Nat] . Acad. Soi. USA 89 (1992) 4285-4289 Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830 Chen, J., et al., International Immunology 5 (1993) 647-656

Delafontaine, P., et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673 Drieu, A., et al·., Glycobiology 9 (1999) 571-579

Durocher, Y., et al. , Nucf. Acids. Res. 30 (2002) E9 Edge, A.S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137 Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 Forsayeth, J.R., et al., Proc. Nat!. Acad. Sei, USA 84 (1987) 3448-3451

Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif, 8 (1996) 271-282 Gustafson, T.A., and Rutter, W.J., J. Biot. Chem. 265 (1990) 18663-18667

Halley, J., et al., Mol. Câncer Ther. 1 (2002) 1349-1353 Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sei 764 (1995) 536-546

Hoyne, P.A., et al., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60 Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res, 28 (2000) 214-218 Jones, P., et al., Nature 321 (1986) 522-525

Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ah Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)

Kalebic, T., et al., Câncer Res. 54 (1994) 5531-5534 Kanter-Lewensohn, L., et al., Melanoma Res. 8 (1998) 389-397

Kato, H., et al. , J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661 Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 Kuil, F.C. Jr., et al. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566 Lammers, R., 69 et al., EMBO J. 8 (1989) 1369-1375 LeRoith, D., et al., 'Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163

Li, S.L., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98 Li, S.L., et al., Câncer Imraunol, Immunother, 49 (2000) 243-252 Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93 Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994) 856-859 Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101

Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527

Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 Morgan, D.O., e Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371 Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855

Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270

Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 0'Brien, R.M., et al., EMBO J. 6 (1987) 4003-4010 Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3833-3837 Pessino, A., et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243

Pietrzkowski, Z., et al., Celi Growth Differ. 4 (1992) 199- 205 Prigent, S.A., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977

Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989)10029-10033

Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327

Rohlik, Q.T., et al., Biochem, Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281

Schaeter, E.M., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 1 3248-1 3253

Schlaeger, E-J., and Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83

Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 Scotiandi, K., et al., Câncer Gene Ther. 9 (2002) 296-307 70

Scotlandi, K., et al., Int. J. Câncer 101 (2002) 11-16 Sojahr, H.T., and Bah], O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57

Soos, M.A., et al., Biochem. J. 235 (1986) 199-208 Soos, M.A., et al·., J. Biol. Chem. 267 (1992) 12955-12963 Soos, M.A., et al-, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 5217-5221

Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)

Surinya, K.H., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725 i5 Taylor, L, et al., Int. Intmunol. 6 (1994) 579-591Choi, T.K., et ai., Nature Genetics 4 (1993) 117-123 Taylor, L., et aL, Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295 Taylor, R., et al., Biochem. J. 242 (1987) 123-129

Thotakura , N. R. , and Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 350-359 Tuaillon, N., et al., Immunol. 152 (1994) 2912-2920 Tuaillon, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 90 3720-3724 Tulloch, P.A. , et al., J. Struct. Biot. 125 (1999) 11- US Patent No. 4,179,337 US Patent No. 4,301,144 US Patent No. 4,487,603 US Patent No. 4,496,689 US Patent No. 4,640,835 US Patent No. 4,670,417 US Patent No. 4,675,187 US Patent No. 4,791,192 US Patent No. 5,202,238 US Patent No. 5,204,244 US Patent No. 5,545,806 US Patent No. 5,545,807 US Patent No. 5,569,825 71

US Patent No. US Patent No. US Patent No. US Patent No. US Patent No. US Patent No. US Patent No. US Patent No. van Dijk, M.A 5,625,126 5,633,425 5,661,016 5,770,429 5, 789, 650 5,814,318 5,874,299 5,877,397 , e van de Winkel, J. G. t

Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374

Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104 Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880

Wilman, "Prodrugs in Câncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) WO 01/14424 WO 02/053596 WO 87/05330 WO 92/03918 WO 92/22645 WO 9311227 WO 94/11026 WO 94/25585 WO 98/24884 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> F. Hoffmann-La Roche <120> Anticorpos contra o factor I de crescimento semelhante à insulina e as suas utilizações <130> 21695 72 <150> EP 03015526 <151> 2003-07-10 <160> 8 <170> Patentin versão 3.2 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Gin Vai. Glu Leu Vai Glu Ser Gli Gli Gli Vai Vai Gin Pro Gli Arg 15 10 15

Ser Gin Arg Leu Ser Cis Ala Ala Ser Gli Fen Tre Fen Ser Ser Tir 20 25 30 Gli Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gli Lis Gli Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Fen Asp Gli Ser Ser Tre Tir Tir Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Arg Gli Arg Fen Tre Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lis Asn Tre Leu Tir 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Tre Ala Vai Tir Fen Cis 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gli Arg Arg Tir Fen Asp Leu Trp Gli Arg Gli Tre 100 105 110 73

Leu Vai Ser Vai Ser Ser 115

<210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 2

Glu Ile Vai Leu Tre Gin Ber Pro Ala Tre Leu Ser Leu Ser Pro Gli 15 10 15

Glu Arg Ala Tre Leu Ser Cis Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tir 20 25 30

Leu Ala Trp Tir Gin Gin Lis Pro Gli Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45

Tir Asp Ala Ser Lis Arg Ala Tre Gli lie Pro Ala Arg Fen Ser Gli 50 55 60

Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Tre Leu Tre Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Fen Ala Vai Tir Tir Cis Gin Gin Arg Ber Lis Trp Pro Pro 85 90 95

Trp Tre Fen Gli Gin Gli Tbr Lis Vai Glu Ser Lis 100 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens 74 <400> 3

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ber Gli Gli Gli Vai Vai Gin Pro Gli Arg 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cis Ala Ala Ser Gli Fen Tre Fen Ser Ser Tir 20 25 30

Gli Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gli Lis Gli Leu Glu Trp Met 35 40 45

Ala Ile Ile Trp Fen Asp Gli Ser Ser Lis Tir Tir Gli Asp Ser Vai 50 55 60

Lis Gli Arg Fen Tre Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lis Asn Tre Leu Tir 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Tre Ala Vai Tir Tir cis 85 90 95

Ala Arg Glu Leu Gli Arg Arg Tir Fen Asp Leu Trp Gli Arg Gli Tre 100 105 110

Leu Vai Tre Vai Ser Ser 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Glu Ile Vai Leu Tre Gin Ser Pro Ala Tre Leu Ser Leu Ser Pro Gli 15 10 15 75

Glu Arg Ala Tre Leu Ser Cis Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tir 20 25 30

Leu Ala Trp Tir Gin Gin Lis Pro Glí Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45

Tir Asp Ala Ser Asn Arg Ala Tre Gli Ile Pro Ala Arg Fen Ser Gli 50 55 60

Ser Gli Ser Gli Tre Asp Fen Tre Leu Tre Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80

Glu Asp Fen Ala Vai Tir Tir Cis Gin Gin Arg Ser Lis Trp Pro Pro 85 90 95

Trp Tre Fen Gli Gin Gli Tre Lis Vai Glu Ile Lis 100 105

<210> 5 <211> 990 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1) . . (990) <400> 5 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48

Ala Ser Tre Lis Gli Pro Ser Vai Fen Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lis 2 5 10 15 age acc tet ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96

Ser Tre Ser Gli Gli Tre Ala Ala Leu Gli Cis Leu Vai Lis Asp Tir 20 25 30 76

I I ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg teg tgg aac tea ggc gee ctg acc age 144 Fen Pro Glu Pro Vai Tre Vai Ser Trp Asn Ber Gli Ala Leu Tre Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc et a cag tee tea gga etc tac tcc 192 Gli Vai His Tre Fen Pro Ala Vai Leu Gin Ber Ser Gli Leu Tir Ser 50 55 60 ctc age age gtg gtg acc gtg ccc tcc age age ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Vai Vai Tre Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gli Tre Gin Tre 65 70 75 80 tac ate tgc aac gtg aat cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag 288 Tir Ile Cis Asn Vai Asn His Lis Pro Ser Asn Tre Lis Vai Asp Lis 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336 Lis Vai Glu Pro Lis Ser Cis Asp Lis Tre His Tre Cis Pro Pro Cis 100 105 110 cca gea cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gli Gli Pro Ser Vai Fen Leu Fen Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cet gag gtc aca tgc 432 Lis Pro Lis Asp Tre Leu Met Ile Ser Arg Tre Pro Glu Vai Tre Cis 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lis Fen Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gee aag aca aag ccg cgg gag 528 Tir Vai Asp Gli Vai Glu Vai His Asn Ala Lis Tre Lis Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc aga gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gin Tir Asn Ser Tre Tir Arg Vai Vai Ser Vai Leu Tre Vai Leu 180 185 190 77 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tee aac 624 His Gin Asp Trp Leu Asn Gli Lis Glu Tir Lis Cis Lis Val Ser Asn - 195 200 205 aaa gcc etc cca gcc ccc ate gag aaa ace ate tee aaa gcc aaa ggg 672 Lis Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lis Tre Ile Ser Lis Ala Lis Gli 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tee cgg gat gag 720 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tir Tre Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 7 68 Leu Tre Lis Asn Gin Vai Ser Leu Tre Cis Leu Vai Lis Gli Fen Tir 245 250 255 ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 'gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gli Gin Pro Glu Asn 260 265 270 aac taC aag acc acg cet ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tir Lis Tre Tre Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gli Ser Fen Fen 275 280 285 ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tir Ser Lis Leu Tre Vai Asp Lis Ser Arg Trp Gin Gin Gli Asn 290 295 300 gtc ttc tea tgc tee gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Vai Fen Ser Cis Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tir Tre 305 310 315 320 cag aag age etc tcc ctg tet ccg ggt aaa 990 Gin Lis Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gli Lis 325 330

<210> 6 <211> 330 <212> PRT 78 <213> Ηοχηο sapiens <400> 6

Ala Ser Tre Lis Gli Pro Ser Vai Fen Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lis 15 10 15

Ser Tre Ser Gli Gli Tre Ala Ala Leu Gli Cis Leu Vai Lis Asp Tir 20 25 30 Fen Pro Glu Pro Vai Tre Vai Ser Trp Asn Ser Gli Ala Leu Tre Ser 35 40 45 Gli Vai His Tre Fen Pro Ala Vai Leu Glu Ser Ser Gli Leu Tir Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Vai Vai Tre Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gli Tre Gin Tre 65 70 75 80 Tir Ile Cis Asn Vai Asn His Lis Pro Ser Asn Tre Lis Vai Asp Lis 85 90 95

Lis Vai Glu Pro Lis Ser Cis Asp Lis Tre Hic Tre Cis Pro Pro cis 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gli Gli Pro Ser Vai Fen Leu Fen Pro Pro 115 120 125 Lis Pro Lis Asp Tre Leu Met Ile Ser Arg Tre Pro Glu Vai Tre Cis 130 135 140

Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lis Fen Asn Trp 145 150 155 160

Tir Vai Asp Gli Vai Glu Vai His Asn Ala Lis Tre Lis Pro Arg Glu 165 170 175 ! 79

Glu Gin Tir Asn Ser Tre Tír Arg Vai Vai Ser Vai. Leu Tre Vai Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gli Lis Glu Tir Lis Cis Lis Vai Ser Asn 195 200 205

Lis Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lis Tre Ile Ser Lis Ala Lis Gli 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tir Tre Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Leu Tre Lis Asn Gin Vai Ser Leu Tre Cis Leu Vai Lis Gli Fen Tir 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gli Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tir Lis Tre Tre Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gli Ser Fen Fen 275 280 285

Leu Tir Ser Lis Leu Tre Vai Asp Lis Ser Arg Trp Gin Gin Gli Asn 290 295 300

Vai Fen Ser Cis Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tir Tre 305 310 315 320

Gin Lis Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gli Lis 325 330

<210> 7 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS 80 <222> (1)..(321) <4 Ο 0> 7 cga act gtg gct gea cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca tet gat gag 48 Arg Tre Vai Ala Ala Pro Ser Vai Fen Ile Fen Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tet gga act gee tet gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gin Leu Lis Ser Gli Tre Ala Sez Vai Vai Cis Leu Leu Asn Asn Fen 20 25 30 tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gee etc caa 144 Tir Pro Arg Glu Ala Lis Vai Gin Trp Lis Vai Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45 tcg ggt aac tea cag gag age gtc aca gag cag gac age aag gac age 192 Ser Gli Asn Ser Gin Glu Ser Vai Tre Glu Gin Asp Ser Lis Asp Ser 50 55 60 acc tac age etc age age acc ctg a cg ctg age aaa gea gac tac gag 240 Tre Tir Ber Leu Ser Ser Tre Leu Tre Leu Ser Lis Ala Asp Tir Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age tcg 288 Lis His Lis Vai Tir Ala Cis Glu Vai Tre His Gin Gli Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt 321 Pro Vai Tre Lis Ser Fen Asn Arg Gli Glu Cis 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 81

Arg Tre Vai. Ala Ala Pro Ser Vai Fen Ile Fen Pro Pro Ser Asp Glu 15 10 15

Gin Leu Lis Ser Gli Tre Ala Ser Vai Vai Cis Leu Leu Asn Asn Fen 20 25 30

Tir Pro Arg Glu Ala Lis Vai Gin Trp Lis Vai Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gli Asn Ser Gin Glu Ser Vai Tre Glu Gin Asp Ser Lis Asp Ser 50 55 60

Tre Tir Ser Leu Ser Ser Tre Leu Tre Leu Ser Lis Ala Asp Tir Glu 65 70 ' 75 80

Lis His Lis Vai Tir Ala Cis Glu Vai Tre His Gin Gli Leu Ser Ser 85 90 95

Pro Vai Tre Lis Ser Fen Asn Arg Gli Glu Cis 100 105

Lisboa, 15 de Dezembro de 2008 82

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a selecção de um anticorpo contra Rl-FCI a partir de uma pluralidade de anticorpos contra Rl-FCI caracterizado pelo facto de se realizar um ensaio de fosforilação celular utilizando células 3T3 que originam 400.000 a 600.000 moléculas de Rl-FCI por célula num meio contendo soro bovino fetal (SBF) a 0,5 % inactivado pelo calor, com os referidos anticorpos e o referido anticorpo a serem escolhidos de modo a não apresentarem nenhuma actividade de estimulação de Rl-FCI, medida como fosforilação de PKB, a uma concentração de 10 μΜ, quando comparado com este tipo de ensaio sem o referido anticorpo. Lisboa, 15 de Dezembro de 2008 1 providenciam 400.000 a 600.000 moléculas de Rl-FCI por célula num meio contendo soro bovino fetal (SBF) a 0,5 % inactivado pelo calor, quando comparado com um desses ensaios sem que o referido anticorpo tenha melhorado as propriedades na terapia anti-tumor. Lisboa, 15 de Dezembro de 2008