BRPI0412478B1 - anticorpo que se liga ao igf-ir, composição farmacêutica e seu método de fabricação, linhagens celulares de hibridoma, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, 5 e métodos para a produção de um polipeptídeo que se liga ao igf-ir e inibe a ligação de igf-i e igf-ii ao igf-ir, e para a seleção de um anticorpo anti-igf-ir a partir de uma pluralidade de anticorpos anti-igf-ir - Google Patents

Abstract

"anticorpos contra receptor de fator de crescimento i semelhante à insulina e usos dos mesmos". a presente invenção refere-se a um anticorpo ligando ao igf-ir e inibindo a ligação de igf-i e igf-ii ao igf-ir que é caracterizado em que o dito anticorpo é a) é de isótipo de igg1, b) mostra uma razão de valores de ic~ 50~ de inibição da ligação de igf-i ao igf-ir para a inibição de ligação de igf-ii ao igf-ir de 1:3 a 3:1, c) inibe em pelo menos 80 % em uma concentração de 5 nm de fosforilação de igf-ir em um ensaio de fosforilação celular usando células de 3t3 fornecendo 400.000 a 600.000 moléculas de igf-ir por célula em um meio contendo 0,5 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (fcs) quando comparado a um tal ensaio sem o dito anticorpo, e d) não mostra nenhuma atividade estimulante de igf-ir medida conforme fosforilação de igf-ir a uma concentração de 10 <109>m em um ensaio de fosforilação celular usando células de 3t3 fornecendo 400.000 a 600.000 moléculas de igf-ir por célula em um meio contendo 0,5 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (fcs) quando comparado a um tal ensaio sem o dito anticorpo tem propriedades melhoradas em terapia de antitumor.

Description

FARMACÊUTICA E SEU MÉTODO DE FABRICAÇÃO, LINHAGENS CELULARES DE HIBRIDOMA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO QUE SE LIGA AO IGF-IR E INIBE A LIGAÇÃO DE IGF-I E IGF-II AO IGF-IR, E PARA A SELEÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-IGF-IR A PARTIR DE UMA PLURALIDADE DE ANTICORPOS ANTI-IGF-IR.

A presente invenção diz respeito aos anticorpos contra receptor de fator de crescimento I semelhante à insulina (IGF-IR), métodos para sua produção, composições farmacêuticas contendo os ditos anticorpos e usos destes.

Receptor de fator de crescimento I semelhante à insulina (IGFIR, EC 2.7.112, antígeno de CD 221) pertence à família de proteína de transmembrana tirosina cinases (LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; e Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). IGF-IR liga ao IGF-I com afinidade alta e inicia a resposta fisiológica a este ligando in vivo. IGF-IR também liga ao IGF-II, porém com afinidade ligeiramente inferior. Sobre-expressão de IGF-IR promove a transformação neoplástica de células e existe evidência que IGF-IR está envolvido em transformação maligna de células e é portanto um alvo útil para o desenvolvimento de agentes terapêuticos para o tratamento de câncer (Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063).

Anticorpos contra IGF-IR são bem conhecidos no estado da técnica e investigados por seus efeitos antitumorais in vitro e in vivo (Benini,

S., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., et al., Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., et al., Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212218; Prigent, S. A., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S. L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252; Pessino, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K. H., et Segue-se folha 1a

Petição 870190062877, de 05/07/2019, pág. 9/20 (1994) 1659-1673; Kull, F. C. Jr, et al. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D. O„ e Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E. M., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T. A., e Rutter, W.

J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P. A., et al., FEBS Lett.

469 (2000) 57-60; Tulloch, P. A., et al., J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q. T., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281; e Kalebic, T., et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063; Dricu, A., et al., Glycobiology 9 (1999)

571-579; Kanter-Lewensohn, L., et al., Melanoma Res. 8 (1998) 389-397; Li,

S. L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252). Anticorpos contra IGF-IR são também descritos em muitas outras publicações, por exemplo, Arteaga, C. L., et al., Breast Cancer Res. Tratamento 22 (1992) 101106; e Hailey, J., et al., Mol. Cancer Then 1 (2002) 1349-1353.

^{15 Em} Particular, o anticorpo monoclonal contra IGF-IR denominado alR3 é extensamente usado na investigação de estudar processos mediados por IGF-IR e doenças mediadas por IGF-I como câncer. alfa-IR-3 foi descrito por Kull, F. C., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566. Enquanto isso, cerca de cem publicações foram publicadas tratando da investigação e uso 20 terapêutico de alR3 com respeito a seu efeito antitumoral, sozinho e junto com agentes citoestáticos como doxorrubicina e vincristina. alR3 é um anticorpo monoclonal murino que é conhecido inibir ligação de IGF-I ao receptor de IGF mas não ligação de IGF-II ao IGF-IR. alR3 estimula em concentrações altas a proliferação de célula tumoral e fosforilação de IGF-IR (Berg25 mann, U., et al., Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H., et al., J. Biol.

Chem. 268 (1993) 2655-2661). Existem outros anticorpos (por exemplo, 1H7, Li, S. L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252) que inibe ligação de IGF-II ao IGF-IR mais potentemente que ligação de IGF-I. Um sumário do estado da técnica de anticorpos e suas propriedades e ca30 racterísticas é descrito por Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063.

A maioria dos anticorpos descritos no estado da técnica é de origem de camundongo. Tais anticorpos, como é bem conhecido no estado da técnica, não são úteis para a terapia de pacientes humanos sem outras alterações como quimerização ou humanização. Com base nestes inconvenientes, anticorpos humanos são claramente preferidos como agentes terapêuticos no tratamento de pacientes humanos. Anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, M. A. e van de Wtnkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). Com base em tal tecnologia, anticorpos humanos podem ser produzidos contra uma grande variedade de alvos. Exemplos de anticorpos humanos contra IGF-IR são descritos em WO 02/053596.

Porém, ainda há uma necessidade por anticorpos contra IGF-IR com benefícios convincentes para pacientes em necessidade de terapia de antitumor. O benefício relevante para o paciente é, em termos simples, redução no crescimento de tumor e uma prolongação significativa de tempo à progressão causada pelo tratamento com o agente antitumorigênico. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção compreende um anticorpo ligando ao IGF-IR e inibindo a ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR, caracterizado em que o dito anticorpo,

a) é do isótipo de IgG 1,

b) mostra uma razão de valores de IC50 de inibição da ligação de IGF-I ao IGF-IR para a inibição de ligação de IGF-II ao IGF-IR de 1:3 a 3:1,

c) inibe em pelo menos 80 %, preferivelmente pelo menos 90 %, em uma concentração de 5 nM fosforilação de IGF-IR em um ensaio de fosforilação celular usando células de HT29 um meio contendo 0,5 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (FCS) quando comparado a um tal ensaio sem o dito anticorpo, e

d) não mostra nenhuma atividade estimulante de IGF-IR medida conforme fosforilação de PKB em uma concentração de 10 μΜ em um ensaio de fosforilação celular usando células de 3T3 fornecendo 400.000 a 600.000 moléculas de IGF-IR por célula em um meio contendo 0,5 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (FCS) quando comparado a um tal |l< ,. > r· w. ,:, II. -J, „ 'll * S Í- III -:l!; .

•R· ·;· < :h ΙΛ ΐ ir 1=. - κ Γ.·· ·:.·* · •ft ? t.. Í Hl Ο ΐ ·;·· * -h * I·! * Il * Ί¹ * I» il'I·’

Λ ÍJ :i! V H .> :, 'H · ii' 1 !'· * H' '·il ensaio sem o dito anticorpo.. l\')

Anticorpos de acordo com a invenção mostram benefícios para pacientes em necessidade de terapia de antitumor e fornecem redução de crescimento de tumor e uma prolongação significativa do tempo à progres5 são. Os anticorpos de acordo com a invenção têm propriedades novas e in-í ventivas que causam um benefício para um paciente sofrendo de uma doença associada a uma desregulação de IGF, especialmente uma doença de tumor. Os anticorpos de acordo com a invenção são caracterizados pelasί propriedades acima mencionadas. As propriedades são portanto ligação es10 pecialmente específica ao IGF-IR, inibindo a ligação de IGF-I e IGF-II aoj

I

IGF-IR na razão acima mencionada, sendo de isótipo de lgG1, e não ativan-| í do a sinalização de IGF mesmo em células de sobre-expressão de IGF-IR| em uma concentração de 200 vezes de seu valor de IC₅o· Anticorpos não| tendo nenhuma atividade mimética de IGF-I fornecem uma vantagem forteI quando usados como um agente terapêutico.I

Preferivelmente, além disso, um anticorpo de acordo com a invenção induz morte celular de 20 % ou mais células de uma preparação de?

células de expressão de IGF-IR após 24 horas em uma concentração do dito anticorpo de 100 nM por ADCC.j|

Além disso, preferivelmente os anticorpos de acordo com a in-J venção induzem morte celular de 20 % ou mais células de uma preparação de células de expressão de IGF-IR após 4 h em uma concentração de anticorpo de 100 nM por CDC.

í

Preferivelmente, em uma concentração de 5 nM os anticorpos] de acordo com a invenção completamente inibem transdução de sinal medi-j ada por IGF-I de IGF-IR em células tumorais.

A invenção também compreende ácidos nucléicos. Os polipeptí-;

deos codificados são capazes de se reajuntar com a respectiva outra cadeia de anticorpo definida abaixo:

a) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo como CDRs

CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) e CDR3 (aa 99-107) da SEQ ID NO: 1 ou 3;

:· -J;. : ·7& · Jir anticorpo compreendendo como CDRs e CDR3 (aa 89-98) da SEQ ID NO: 2 ou

b) uma cadeia leve de

CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56)

4.

O anticorpo é preferivelmente um anticorpo monoclonal e, alem disso, um anticorpo quimérico (cadeia constante humana), um anticorpo hu manizado e especialmente de preferência um anticorpo humano.

O anticorpo liga ao IGF-IR humano (EC 2.7.1.112, SwissProt P08069) em competição com o anticorpo 18.

O anticorpo é também caracterizado por uma afinidade de 10 ⁸ M 10 (KD) ou menos, preferivelmente de cerca de 10 a 10 M.

O anticorpo mostra preferivelmente nenhuma inibição dependente de concentração detectável de ligação de insulina ao receptor de insulina.

Preferivelmente, a invenção fornece anticorpos compreendendo como regiões de determinação de complementaridade (CDRs) tendo as se15 qüências a seguir:

a) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo como CDRs CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) e CDR3 (aa 99-107) da SEQ ID NO: 1 ou 3;

b) uma cadeia leve de anticorpo compreendendo como CDRs 20 CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) e CDR3 (aa 89-98) da SEQ ID NO: 2 ou

4.

O anticorpo é preferivelmente do tipo lgG1 e portanto fornece ligação de complemento de C1q e induz CDC. O anticorpo é também caracterizado pela capacidade de ligar receptor de IgGFc e induzir citotoxidade 25 celular dependente de anticorpo (ADCC).

O anticorpo de acordo com a invenção consideravelmente prolonga o tempo à progressão em modelos de tumor de xenoenxerto relevantes comparado com animais tratados com veículo e reduz crescimento de tumor. O anticorpo inibe a ligação de IGF-I e IGF-ll ao IGF-IR in vitro e in 30 vivo, preferivelmente em cerca de uma maneira igual ao IGF-I e IGF-ll.

A invenção também fornece linhagens celulares de hibridoma que produzem tais anticorpos monodonais antagonisticos de acordo com a ii lb c invenção.

As linhagens celulares de hibridoma preferidas de acordo com invenção <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 (anticorpo 18) e <IGF-1R> HUMABClone 22 (anticorpo 22), foram depositadas com Deutsche Sammiung von und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha.-------_

Data de depósito______

10Ό42003

09.05.2003

Mikroorganismen

Deposição No.

DSMACC2587

DSM ACC 2594

Linhagem celular <IGF-1 R> HUMAB-clone 18 <IGF-1R> HUMAB-clone 22 ^_ Os anticorpos obteníveis das ditas linhagens celulares são modalidades preferidas da invenção.

A invenção também fornece ácidos nucleicos que co i anticorpos, vetores de expressão contendo os ditos ácidos nucleicos, e celu las hospedeiras para a produção recombinante de tais anticorpos.

A invenção também fornece métodos para a produção recombinante de tais anticorpos. _A

A invenção também fornece métodos para tratar cancer, compreendendo administrar a um paciente diagnosticado como tendo cancer (e .st.ndo portanto .m nac.ssid.de de uma t.rapla d. antitumor) uma ,υ.ηζ dade .ãcas d. um anticorpo an.agonisbco contra IGF-.R de acordo » invenção. O anãcorpo pode se, administrado sozinho, .m uma eompe.çao farmacêutica, ou .«omaíivament. em combinação cem um tratamen o tóxico como radioterapia ou agente citotóxloo ou um pm-medicam.«o d.stes.

A invenção também compreende o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para tratamento de câncer e para a fabncaçao de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção. Além d.sso, a invenção compreende um método para a fabricação de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção. _ _Allti__a

A invenção também cempmendo uma oompo.içao termaceutrca comendo um anticorpo da acordo com a invenção com uma ,uan«ade l.rmaceulicamente eircaz. opcionaim.nte junto com um tampão e/ou urn adjuvant. ú«l/(o,s) pata . formulação d, anticorpos para propósito, tarm.cuut,7 cos.

A invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos em um veículo farmaceutícamente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser incluída em um artigo de fabricação ou kit.

A invenção também compreende um vetor contendo um ácido nucléico de acordo com a invenção, capaz de expressar o dito ácido nucléico em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica.

A invenção também compreende uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica compreendendo um vetor de acordo com a invenção.

A invenção também compreende um método para a produção de um anticorpo humano recombinante de acordo com a invenção, caracterizado em expressar um ácido nucléico de acordo com a invenção em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica e restabelecer o dito anticorpo da dita célula. A invenção também compreende o anticorpo obtenível por um tal método recombinante.

A invenção também compreende um método para a seleção de um anticorpo contra IGF-IR de uma pluralidade de anticorpos contra IGF-IR caracterizado em que um ensaio de fosforilação celular usando células de 3T3 fornecendo 400.000 a 600.000 moléculas de IGF-IR por célula em um meio contendo 0,5 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (FCS) é executado com os ditos anticorpos e o dito anticorpo é selecionado que não mostra nenhuma atividade estimulante de IGF-IR medida conforme fosforilação de PKB a uma concentração de 10 μΜ quando comparado a um tal ensaio sem o dito anticorpo. Preferivelmente o anticorpo tem uma ou mais das propriedades adicionais supracitadas.

A invenção também compreende um método para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado em selecionar um anticorpo contra IGF-IR de uma pluralidade de anticorpos contra IGF-IR executando um ensaio de fosforilação celular usando células de 3T3 fornecendo 400.000 a 600.000 moléculas de IGF-IR por célula em um meio contendo 0,5 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (FCS) com os ditos anticorpos e se lecionar o dito anticorpo que não mostra nenhuma atividade estimulante de IGF-IR medida conforme fosforilação de PKB em uma concentração 10 μΜ quando comparado a um tal ensaio sem o dito anticorpo, produzir o dito anticorpo por meio de expressão recombinante, restabelecer o dito anticorpo e combinar o dito anticorpo com um tampão e/ou adjuvante aceitável farma cêutico. Preferivelmente o anticorpo tem uma ou mais das propriedades adicionais supracitadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O termo anticorpo abrange as várias formas de anticorpos incluindo mas não sendo limitados a anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos geneticamente criados contanto que as propriedades características de acordo com a invenção sejam mantidas.

Fragmentos de anticorpo compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, em geral pelo menos a porção de ligaçao de antigeno ou a região variável deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia simples, imunotoxmas e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Além disso, os fragmentos de anticorpo compreendem polipeptideos de cadeia simples tendo as características de uma cadeia de VH, isto é sendo capaz de ajuntar com uma cadeia de VL ou de uma cadeia de VL que liga ao IGFIR, isto é sendo capaz de ajuntar com uma cadeia de VH para uma bolsa de ligação de antigeno funcional e assim fornecendo a propriedade de inibir a ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR.

Fragmentos de anticorpo também compreendem tais fragmentos que per se não podem fornecer funções efetoras (ADCC/CDC) mas fornecem esta função de uma maneira de acordo com a invenção apos serem combinados com domínio(s) constante(s) de anticorpo apropriado(s).

Os termos anticorpo monoclonal ou composição de anticorpo monoclonal como aqui usados referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma composição de aminoácido simples. Consequentemente, o termo anticorpo monoclonal humano refere-se aos anticorpos que e9 # i|!

-^h-na._Emumamo~-/'

Produzidos por _{um hibn}._doma PPo-humano transgênico, por ^{Um 9enoma} compreendendo oma transgene humano de ^X'^{bem uma} especificidade de liqacao < , constantes derivadas das seoüên^. .^va™veis ou

- 'munoglobulina de linhagem germios anticorpos monoclonais humanos são exeX^ ^{Um a}-^a<

⁰ termo ^Cé'^U,a -ortaüzadV _{10 f} ^C°^mP^readendo uma região variável is ' ™^η°' onte ou espécie e pelo menos uma porção d ° θ’ ^{de Uma a} θ ^{Uma fonte} ou espécie diferente usual ^deriva°NA X “Ç™· por _{tocas d}.

murina e „_{ma ragBa} «PntPmend.ndo uma „_g,_fc r™ anticorpos purmédcos _mufing “° ’«“«««Λ, p«.«_O8,

-oOtebuita ,_xpreS8(js ° Pnxtoio _{genes dg} “^m »»».1= d. imunoglow, “ °^NA « “· «xttam osgiões _co„s_t.„_tes ,_Je , ”^a ’ “9™nlos d. DNA ,ue ««oorpos ,„_m4r,_ras. »“» _OuPas ^,l ’ *— “ ΜΛΜΜο de c„ss<, θ™⁰ ““í» «o ap«i.s eo, ortgina, _{Ta|s Mcwi} fodfapa _{ou g} anticorpos de _P(Ím„,_a<los ,_m ^c“ '·®όο> _{Wenaos como} doiméncos ,_éMcas ' ’>«“ «- Ptodozir

-™p·. e de peno _{agora bn} ° ’ «^ο _Λ ONA •on. S. L, _{Proe Nat}, _ΛΜ V.C por exemplo, Mor.

^{JS N}°⁸- S Í0Z23S o 5,204 2« ' ⁶⁸⁵'«iK,· P._t.„_les o«omm mod_{feda(5) para} “ » ™p_femen_ta,_ldade. _(CDR) ο₈ρ.ο,«ο_Μωβ d,,._re„_{te gdand0} enoom. Em u_{ma mMa},_ideda ™ _da te».ão de estrutura de „„ .nfcorpo hum ™^ΠίΙ ‘ θ™’’

Vac Pm exemp.c, “/ ° Pu’ ^{f a}'- ^NattJre 332 (1988) 32310 « dl Hl ·.. HI Ji, ,

J -i f Í, ' ' 8! 327; e Neuberger, M. S., et al M=>t ^larrnente preferidas correspondem . θ /^{4 (1985) 268}'²⁷⁰· CDRs particu^rec°nhecem os antigenos obse^adaT sequências que θ bifuncionais. θ ^aC'^{ma para os} anticorpos quiméricos incluir anticorpos tendo^regfô^™⁰' “^Sad°' ^é intencionado

Bendas de ímunoglobulina de linhagem'^{8 θ das se}' vanavel é preferivelmente derivada da se^' ^{A pesada} 50 (GenBank LO6618) e a cadeia i ^{quencia de} linhagem germinal DP ^de sequência de linhagem germinai ^d-Vada tantes do anticorpo são regiões constante^ ^{As re9iões c}°nsões podem ser alotípicas e descritas ^§ ° ^humana' ^Ta's regi^{T Acids Nucl}^ Res. 28 (2000) 214^8^1'°’ θ ^Wu’ ^T' ^renciadas e são úteis contanto que as “ ^{nísso refe CDC Sejam} Preferivelmente mantidas deT^o^ ^ADCC θ

O termo anticorpo humano rec κ intencionado incluir todos o^anricoZl ^{Como a}^i usado, é

O-™»., o«_{os Oü} ,_SMMoí ζ J’™” >» _{Mo prepaMos ex} “»0.» de „_ma célula hosp.del,ζ™ ^c»° - de um animal _{(K>r e} ™ »’ NS0 ou de genes de imunoglobulina humana ou ™ ^{CamUndOn9o) que é} transgênico aos - «o moomemame Ζ.Ζ'Ζ^ anticorpos humanos recombinantes têm rea ^ ^h°^Spedeíra- ^Tais vadas das sequências de imunoglobulina de Th ^θ'⁸ θ ^C°^{nStantes deri Uma fo}rma rearranjada. Os anticorpos hu ^{hUmana em} com a invenção foram submetidos â h' ^°^{8 reCOrnbÍnantes de} acordo as seqúências de arZ^do«^a vivo. Desse recombinantes são sequências que / ^VH θ ^{VL dos} anticorpos sequências de VH e VL de linhagem θ ^relaci°nadas às ³⁰ cimente dentro do repertório de ^eXÍStir no in vivo. linhagem germinal de anticorpo huma^c°mo aqui usado, ligando” refere-se ao «nf ^{se ao} anticorpo que liga ao

IGF-IR com uma afinidade de cerca de 10¹³ a 10~⁸ M (KD), preferivelmente de cerca de 10~¹³ a 10 ⁹ M.

o termo molécula de ácido nucléico, como aqui usado, é mtencionado incluir molécula. de ONA . molécula» de RNA. Um. molécula de 5 ácido nucléico pode ... unHIameniada ou Mamentada, ma. pmlen.elmente é DNA bi-filamentado.

Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação do anticorpo a um antigeno mas estão envolvidos nas funções efetoras (ADCC, ligação de complemento e CDC). O dominio constante de um 10 anticorpo de acordo com a invenção é do tipo lgG1. Domínios constantes humanos que têm estas características são descritos em detalhes por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5* Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), e por Bruggemann, M„ et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T. W„ et al. Me15 thods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Exemplos são mostrados na SEQ ID NOS: 5 a 8. Outros domínios constantes úteis e preferidos são os domínios constantes dos anticorpos obteníveis das linhagens celulares de hibridoma depositadas com DSMZ para esta invenção. Os domínios constantes ute.s na invenção fornecem ligação de complemento. ADCC e opcionalmente 20 CDC são fornecidos pela combinação de domínios variáveis e constantes.

A região variável (região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)) como aqui usado denota cada um do par de cadeias leves e pesadas que estão diretamente envolvidas na ligação do anticorpo ao antigeno. Os domínios de cadeias humanas vanaveis 25 leves e pesadas têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FR) cujas seqüências são amplamente conservadas, conectadas por três regiões hipervariáveis (ou regiões de determ.nação de complementaridade, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação de β-folha e as CDRs podem formar alças que conectam a es30 trutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são presas na sua estrutura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam juntamente com as CDRs da outra cadeia o sitio de ligação de antigeno. As regiões de CDR3 de ca12 J Ί:ΎΊ: _L ϊ — ^{: ;|: ;}· d. ·ΙΙ· ||| ,ψ ’L deia pesada e leve de anticorpo representam um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo 7 i com a invenção e portanto fornecem um outro objetivo da invenção.

Os termos região hipervariável ou porção de ligação de antigeno de um anticorpo quando aqui usados referem-se aos resíduos de ammoacido de um anticorpo que são responsáveis em ligar antigeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido das regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. Regiões de estrutura ou FR sao aquelas regiões de domínio variável diferentes dos resíduos de 10 região hipervariável como aqui definidos. Portanto, as cadeia leves e pesadas de um anticorpo compreendem do término N ao C os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Especialmente, CDR3 da cadeia pesada é a região que contribui para maior parte de ligação de antigeno. Regiões de CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Ϊ

Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a Ed. Publicj

Health Sen/ice, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) θ/_ου aqueles resíduos de uma alça hipervariável.

O termo ligação ao IGF-IR como aqui usado significa a ligaçãoI do anticorpo ao IGF-IR em um ensaio in vitro, preferivelmente em um ensaio!

de ligação em que o anticorpo está ligado a uma superfície e a ligação aoj

F IR é medida através de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR).í

Ligação significa uma afinidade de ligação (K_D) de 10'⁸ M ou menos, preferi-í velmente 10'¹³ a 10'⁹ M.

Ligação ao IGF-IR pode ser investigada por um ensaio de BIA-| core (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia). A afinidade da ligação é| definida em termos de ka (constante de taxa para a associação do anticorpo| do complexo de anticorpo/antígeno), kd (constante de dissociação) e KDí (kd/ka). Os anticorpos de acordo com a invenção mostram um KD de 10’¹⁰ Mí ou menos.j í ⁵⁰ A ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR é também inibida pelosj anticorpos de acordo com a invenção. A inibição é medida como IC₅₀ em um ensaio para ligação de IGF-I/IGF-II ao IGF-IR em células tumorais Um talí ensaio é descrito no Exemplo 7 Em um tal ^tos Hgação radiorrotulados de IGF-I _ou^ fornecidos na superfície das d '^Rao

HT29) é medida sem e com cone _t ^(por ^mplo ^l0res IC50 dos anticorpos de ^d° ^anticorP°· Os va('^GF-' θ '^GF-‘' ^a° ΌΡ-IR são não mais queθ ^C5° ^para Hgação de IGF-I/IGF-II ao igf id - θ θ ^d°^{S Valores de} IC50 são medidos como média ou valo θ ⁰θ ^{1 3 a 3; 1} ’ ^Va,°res de ^d*- independentes. Vaio de cO formo inibindo a *»«= em _Wt* _a ,_{isaçâo de} ° ^IGF- “ '«=-« « ao IGF-IR apresentada na superfíci d °“ ^IGF' ^{marcado com} I¹²⁵

HTB-38) em um ensaio in vitro in^bi a ^HT29 ^CC inferior. ^Ç ° ^S'^{9r flca} um valor de IC₅₀ de 2 nM ou

-«„._to° ^w”-“^a “ 20.000 receptores/célula. Tais células - θ^{01 Ρβ}'° ^menos '^aa tumorais como _NCI H322M ou ΗτΓ θ^'θ' ^⁹^ ^{de Cél}xemplo 3T3 ATCC CRL1658) snh ’ °“ ^Celular (P°^r e-

- ™ ™ de ,,,Χχ- — .Pd. _t^e célula é medida de acordo com Lamm i ^{PUant,dade d}e receptores por

O termo ·ΊηΧ de 1J ' θ ¹³⁶⁹^Z5.

saio de fosforilação celular usand °^Π3?3° ^{a um e}‘

600.000 moléculas de IGF-IR _por “ ^{3T3 f}°^{meCe d}° ^0.000 a

- ^da —o feta! inatX calor^FcsT ensaio sem o dito anticorpo. Fosforilar- ^C°^{mparado a} tal usando um anticorpo específico para 7 θ ^P°^{r Wes}‘em blotting tal ensaio é descrito no Exempt ^{U da} recendo a curto prazo i ^{FCS é} — ³⁰ plemento. ^{ra lna}t^,vação do sistema de com° termo inibição de fosforilação de PKB mf fosfonlação celular usando células de 3T3 f ° ³ ^³¹⁰ de 3T3 fornecendo 400.000 a 600 000 moléculas de IGF-IR por célula em um meio contendo 0,5 % de soro de bezerro fetal inativado por calor (FCS) quando comparado a um tal ensaio sem o dito anticorpo, A fosforilação é detectada por Western blotting usando um anfcorpo específico para PKB fosforilado na serina 473 de PKB (Akt 1 Swiss Prot Acc. No. P31749). Um tal ensaio é descrito no Exemplo 11.

O termo citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)” refere-se à lise de células alvos tumorais humanas por um anticorpo de acordo com a invenção na presença de células efetoras. ADCC é medida preferivelmente pelo tratamento de uma preparação de células de expressão de IGF-IR com um anticorpo de acordo com a invenção na presença e células efetoras como células efetoras de PBMC recentemente isoladas ou purificadas de revestimentos tamponantes, como monócitos ou células de NK. ADCC é encontrada se o anticorpo induzir em uma concentração de 100 nM a Use (morte celular) de 20 % ou mais das células tumorais após 24 horas. Se ADCC for encontrada estar mais pronunciada em 4 h que em 24 h então medição é executada em 4 h. O ensaio é executado preferivelmente com células tumorais marcadas com ⁵¹Cr ou Eu e medição de -Cr ou Eu especrficamente liberada. Controles incluem a incubação das células alvos tumorais com células efetoras mas sem o anticorpo.

O termo citotoxicidade dependente de complemento (CDC) refere-se à lise das células alvos tumorais humanas pelo anticorpo de acordo com a invenção na presença de complemento. CDC é medida preferivelmente pelo tratamento de uma preparação de céíulas de expressão de IGFIR com um anticorpo de acordo com a invenção na presença de complemeno. Ce encontrada se o anticorpo induzir em uma concentração de 100 nM a Use (morte celular) de 20 % _ou mais das células tumorais após 4 horas O ensaio é executado preferivelmente com células tumorais marcadas com Cr ou Eu e a medição de -Cr ou Eu liberado. Controles inciuem a incubação das celulas-alvo tumorais com complemento mas sem o anticorpo.

O termo inibição completa de transdução de sinal mediada por IGF-I refere-se á inibição de fosforilação mediada por IGF-I de IGF-IR. Para um tal ensaio, as células de expressão de IGF-IR, preferivelmente células de

H322M, são estimuladas com IGF-I e tratadas com um anticorpo de acordo 7 r com a invenção (uma concentração de anticorpo de 5 nM ou mais alto e util).

Subseqüentemente, uma SDS PAGE é executada e a fosforilação de IGF-IR é medida pela análise de Western blotting com um anticorpo específico para .

tirosina fosforilada. Inibição completa da transdução de sinal é observada se na Western blot visivelmente nenhuma banda pôde ser detectada que se refere ao IGF-IR fosforilado.

Os anticorpos de acordo com a invenção mostram uma ligação ao mesmo epitopo de IGF-IR como anticorpo 18 ou são inibidos ligando ao

IGF-IR devido ao obstáculo esférico de ligar através do anticorpo 18. Inibição de ligação pode ser detectada por um ensaio de SPR usando anticorpo imo-j bilizado 18 e IGF-IR em uma concentração de 20-50 nM e o anticorpo a serí detectado em uma concentração de 100 nM. Uma redução de sinal de 50 %J ou mais mostra que o anticorpo compete com o anticorpo 18. Um tal ensaio| pode ser executado da mesma maneira usando anticorpo 22 como um anti-| corpo imobilizado.|

O termo epitopo significa um determinante de proteína capaz de ligação específica a um anticorpo. Epitopos usualmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como ammo-| ácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm três característicasj estruturais dimensionais específicas, como também características de carga especificas. Epitopos conformacionais e não-conformacionais são distingui-I dos em que a ligação ao último mas não ao penúltimo é perdido na presença de solventes de desnaturação.

Os anticorpos de acordo com a invenção incluem, além disso, tais anticorpos tendo modificações de sequência conservadora, modificações de seqüência de nucleotídeo e de aminoácido que não afetam ou alteram as características supracitadas do anticorpo de acordo com a invenção. Modificações podem ser introduzidas por técnicas padrão conhecidas na técnica, como mutagênese dirigida e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservadoras de aminoácido incluem as em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia sX X_{d f} ^{de aro}“^{ado qu}·^,,m »«·

X Z k ^E,,“ “^te “-θ'-» tat.™, _M,to (po, exempte, _ar„_inma ζ:„Γ” ^,κγ “·*~ -3 .Ze ZZT ^{polares (p}°'“^empto *‘™·«”™· to., .to,™. tto,„_a. c,™,™. taptatapd). _{cadeias IMS are5} ninafradeiasTr³’ ^isoleucina· Ρ^Γ0|ί™. fenilalanina, metiona). cade,as lato.s b.ta-mmi.Cdd.s _{(ppr axempto} ’ _h“^d’“ <«' .irosina, _fe„||,tapi„.

toetapp. o..s. ode. „_m toto d. «cdo d_isp.„Z pragposticado dm „m _an,„,_p„ _{de anttleF}._IR mente substituído com outro resíchin Ho cadeia ta,._ral. '«Ita d.

- ^{S t}’^S,“^ÇÕeS * Ptoosa», podem sar executadas atavés de Z„„LZZTT ™^de'·³™ to «toto. L-. e. al, Na.ure 332 (WM) 32M27 „ θ Acad. Sei. USA 86 (1989) 10029-10033.

acordo comT- °^{S anticor}P°^a características ^‘θ^⁰⁸ P°^r ou mais das ka kd e KD I' ^¹°^^{98 d}° ^9rUP° ^selecionado de parâmetros de ligação

D, hgando ao mesmo epitopo ao qual os anticorpos que 18 e 22 em ^m-M ^Val°^{reS de ICs}° ^{Para inib}'Ç^{ã0 de} ügação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR IGF IR^Uem θ7°7'^S’ θ °^{S Va}'^{OreS ICS}° ^{Ρ3Γ9 inÍbiÇã}° ^{de fosfori}'aÇão de de IGF R leVa T - ^fosfori^°

GF IR leva a .mb.çao de fosforilação dos elementos a jusante como PKB a su reguíação de IGF-IR _em câiuias tumorais, e a inJncia no Zimen o tridimensional de céiu.as tumorais in vitro. Os anticorpos são tambZ pre fenveimente caracterizados por seus valores farmacocinéticos e farmacod.’ ₃θ namicos, e a reatividade cruzada com outras espécies.

IGF IR de °^Sant'^{COrPOS de acordo com a} invenção inibem fosforilação de tirosma e preferivelmente também fosforilação de PKB de tirosina a uma extensão similar. ^a

Os anticorpos de acordo com a invenção preferivelmente subregulam o nível de proteína de IGF-IR em células tumorais e em tumores, por exemplo tumores de xenoenxerto.

Os anticorpos de acordo com a invenção inibem preferivelmente o crescimento tridimensional de células tumorais em um ensaio de formação de colônia como também proliferação de células de expressão de IGF-IR (por exemplo células de 3T3 de NIH).

Os anticorpos de acordo com a invenção preferivelmente não inibem a ligação de insulina ao receptor de insulina em um ensaio de competição de ligação em receptor de insulina que sobre-expressa células de 3T3 usando o anticorpo em uma concentração de 200 nmol/l.

Os anticorpos de acordo com a invenção são preferivelmente produzidos através de meios recombinantes. Tais métodos são extensamente conhecidos no estado da técnica e compreendem expressão de proteína em células procarióticas e eucarióticas com isolamento subsequente do polipeptídeo de anticorpo e usualmente purificação para uma pureza farmaceuticamente aceitável. Para a expressão de proteína, ácidos nucléicos que codificam cadeia leves e pesadas ou fragmentos destes são insendos em vetores de expressão através de métodos padrão. Expressão é executada em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas como células de CHO, células de NS0, células de SP2/0, células de HEK293, células de COS, levedura ou células de E. coli, e o anticorpo restabelece das células (sobrenadante ou células após lise).

Produção recombinante dos anticorpos é bem conhecida no estado da técnica e descrita, por exemplo, nos artigos de revisão de Makrides,

S. C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161, Werner, R. G., Drog Res. 48 (1998) 870-880.

Os anticorpos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado de célula ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. A purificação é executada para eliminar outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo outros ácidos nucléicos ce18

Expressão em células de NSO é descrita rw nes, L M et ai r.rf * u uescnta por, por exemplo, Bar et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123- _o r

Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261 270 F - ' ^M θ* ^al’ exemplo, Durocher Y et al n , ’ ^³° ^{transiente é} Escrita por, por P, ^urocher· ^Y-· θί al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 rinn domínios variávis é descrita por Orlandi R _{Pt al} p ^de (1989) 3833-3837- Carter P _et al P ” ’ ^USA

4285-4289; e Norderhaug, L et al J 77^' U- sistema de expressão _{transiente p}^^Z Z hlaeger, E -J e Chn=fo . ^{( EK 293) e descrit}o por Sc^; 30 (1999) 71-83 e porScTaeg_er'e ™ °^^η°'θ9^γ

191-199. ’ ^emJ· ^lrnmunol. Methods 194 (1996)

Por exemptoTcZZZr ^Pr°^Ms’ θ um :„_o — —^d“ ^u“X:z::r ^in,~“ >—xx“’^et em uma relação funcional Zm “'θ^θ xemplo, DNA para uma nM. θ ^nUCléic°· ^Por θ' te ligado ao DNA para ⁵θ^εΓθ^ί0Γ'° ^está °P^eravelmenPmteína que par^^δθ ™ - Pficador está operavelmente ligado a υπ^θ^⁰ °^{U intens|}· afeta a transcrição da sem - ^{de cod}^ação se ele oPe—mente «gado a um^ncia Γοο^^ ~ :^cas;^{de um ,íder} —.contíguos.

restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligadores de oligonucleotideos sintéticos são usados de acordo com prática convencional.

Os anticorpos monoclonais são adequadamente separados do meio de cultura através de procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, ou cromatografia por afinidade. O DNA e RNA que codificam os anticorpos monoclonais são facilmente isolados e seqüenciados usando procedimentos convencionais. As células de 10 hibndoma podem servir como uma fonte de tal DNA e RNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser inserido nos vetores de expressão que são depois transfeccionados em células hospedeiras como células de HEK 293, células de CHO ou células de mieloma que do contrário não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais recombinan15 tes nas células hospedeiras.

Variantes de sequência de aminoácido de anticorpo de IGF-IR humano são preparadas introduzindo alterações de nucleotídeo apropriadas no DNA de anticorpo, ou através de síntese de peptídeo. Porém, tais modificações podem ser executadas apenas em uma faixa muito limitada, por e20 xemplo como descrito acima. Por exemplo, as modificações não alteram as características de anticorpo acima mencionadas como a ligação de isótipo de IgG e de epitopo, mas podem melhorar o rendimento da produção recombinante, estabilidade da proteína ou facilitar a purificação.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter a con25 formação apropriada do anticorpo de anti-IGF-IR também pode ser substituído, em geral com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir reticulação aberrante. Inversamente, a(s) ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo for um fragmento de anticorpo como um frag30 mento de Fv).

Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrao de glicosilação original do anticorpo. Alterar significa excluir uma ou

IS porçoes de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adicionar um ou ^ma'^{S Slt}'os te glicosilação que não estão presentes no anticorpo. Glicosilaçao de anticorpos é tipicamente ligada a N. Ligada a N refere-se à ligação da porção de carbodrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. A asparagina-X-senna das seqüências de tripeptideo e asparagina-X-treonina onde X e qualquer aminoácido exceto prolina, é as seqüências de reconhecimento Para hgaçao enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desse modo, a presença de qualquer uma destas seqüências de tripeptideo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Adição / de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada alterando a sequence de aminoácido de modo que ele contenha uma ou mais ligado^a N)⁰¹³⁸ °^S ^°⁵ θ ^{9 COsila}?^go

Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes de seqüência de am.noac.do de anticorpo de anti-IGF-IR são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não sao bmuados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de sequence de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese med.ada por oligonucleotídeo (ou loco-dirigida), mutagênese de POR e mutagenese de cassete de uma variante preparada mais precoce ou uma versão de não-variante de anticorpo de anti-IGF-IR humanizado.

A invenção também diz respeito aos ii-----endendo o anticorpo de acordo com a ir citotoxico como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo xma enz.maticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou fragmentos da mesma), um isótopo radioativo (isto é ou um pró-fármaco de um agente citotóxico. Agentes úteis tais imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente vas e fragmentos das mesmas que podem ser usadas incluem cadeia diftena A, fragmentos ativos de não-ligação de toxina de difteria, cadeia exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia a nna A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuritesfordii, — imunoconjugados comprea invenção conjugado com um agente >, uma toou animal, é, um radioconjugado) ------! na geração de atide de de proteínas de diatina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAPS), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

Os conjugados do anticorpo e do agente citotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotíolano (ISTO), derivados bifuncionais de imidoésteres; (como adipimidato de dimetil HCL), ésteres ativos (como suberato de disuccinimidila), aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bisazido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazônio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolieno), e compostos de flúor bisativo (como 1,5-dÍfluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta, E. S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104). Ácido triaminopentaacético de carbono-1isotiocianatobenzil-3-metildietileno 14-marcado (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo para o anticorpo. Ver WO 94/11026.

Outro tipo de modificação covalente envolve acoplar química ou enzimaticamente glicosídeos ao anticorpo. Estes procedimentos são vantajosos em que eles não requerem produção do anticorpo em uma célula hospedeira tendo capacidades de glicosilação por glicosilação ligada a N ou O. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode(m) ser ligado(s) (a) à arginina e histidina, (b) aos grupos carboxila livres, (c) aos grupos de sulfhidrila livres como aqueles de cisteína, (d) aos grupos hidroxila livres como aqueles de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano, ou (f) o grupo de amida de g luta mina. Estes métodos são descritos em WO 87/05330, e em Aplin, J. D. e Wriston, J. C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306.

Remoção de qualquer porção de carboidrato presente no anticorpo pode ser realizada quimicamente ou de forma enzimática. Desglicosilação química requer exposição do anticorpo ao composto ácido trifluorome tanossulfôníco, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na divagem da maior parte ou todos os açúcares exceto o açúcar ligador (Nacetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), deixando o anticorpo intacto. Desglicosilação química é descrita por Sojahr, Η. T. e Bahl, O. P„ Are, Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 e por Borda, A. S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. Clivagem enzimática das porções de carboidrato em anticorpos pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo- e exoglicosidases como descritas por Thotakura, N. R. e Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende ligar o anticorpo a um de uma variedade de polímeros não-proteináceos, eg., polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira exposta nas Patentes US N°s 4.640.835; 4.496.689; 4.301. 144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece células B isoladas de um animal não-humano transgênico, por exemplo um camundongo transgênico que expressa para os anticorpos de IGF-IR anti-humano de acordo com a invenção. Preferivelmente, as células B isoladas são obtidas de um animal não-humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico que foi imunizado com uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno de IGF-IR e/ou células que expressam IGF-IR. Preferivelmente, o animal não-humano transgênico, por exemplo um camundongo transgênico, tem um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humano que codifica todo ou uma porção de um anticorpo da invenção. As células B isoladas são depois imortalizadas para fornecer uma fonte (por exemplo um hibridoma) de anticorpos de anti-IGF-IR humano. Consequentemente, a presente invenção também fornece um hibridoma capaz de produzir anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o hibridoma inclui uma célula B obtida de um animal não-humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico tendo um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humano que codificam todo ou uma porção de um anticorpo da invenção. transgêni_Em uma modalidade part.cu ar. _compreendendo um co é um camundongo transgem _tranSqene de cadeia leve humatransgene humano de cadeia pesada ζθ _{da invençâ0}. _o ani_no que codificam todo ou uma porção _puri.

mal não-humano transgenic _células que expressam — .mn^ce, por —o o ,_gf.,r. Pmfed.elmeme, o _|56«ρο. _d, _{lgG1 de} ant.eorcamundongo transgemco, e capaz pos monoclonais humanos para IGF-IR. _{com a inve}nção

Os anticorpos monoconai _human0 transgênico, por podem ser produzidos imunizando um amma nao ^θθ^θ exemplo um camundongo transgemco, _{de cadeia le}ve um transgene humano de cadeia pes _anticorpo , humano que codificam todo ou u P _de IGF-IR e/ou com uma preparação Χ^ρ.ο _células B esp.ênicas) células que expressam células de mieloma para for_d0 animal são depois obtidas e fun ' ^as monoclonais mar céluias de hibridoma imorta.s que segrega humanos contra IGF-IR. _antiCorpos monoclonais humanos _Em um. —. ’”'^en X“u8^Panó0 cmundengcs «uns· _d,_reoB»do. »^M ₉ ,™„ «o a- «·* gênicos que carregam p „_n=_nénicos referidos aqui como cade camundongo. Estes camundongos r ’ _de imunoglobulina mundongos de HuMAb, contêm um mm _não._arranjados que humano que codifica genes ^^{e ,rn}^_{eia te}ve K (genes de região constanIncluem a cadeia pesada (μ . os loci de cadela μ e K encom mau,».. ·χ'ζΧ«,₆₉₎. cen.eo— dógenos (Lenb.ç>, N.. at ar > “ _oa„_undo„₀o laM eu K_te, os camundongo. e»bem P _e numae em resp»<· » imun.zaçao. _garar „os introduzidcs »«.m P«muta d. classe mental Pharmacology 113 (1994)

Rev. I......

anlicorpos monoclonal. de i»G de «* * —- X- - Í ol 25 (1995) 65-93; e Harding, F„ e Lonberg, N., Ann. N. Acad Immunol. 25 (1990) oo ^nnn« de HuMAb é desSci 764 (1995) 536-546). A preparação de camun ₆₂₈₇._6295; crila em Τ.ν«. L . « * “ X ^Lon. N . e.

Chan, d . a· — “”ΧΧ₇₂Χ. »- « al·. »·» _a|„ Proc. Nail. Acad. Sa USA 90 (19 ₁₂ (1903) 321-630.

— < N.. « al.. NateTuaillon, N., et al., Immuno . Fvnerimental Pharmacom 333 (,994) 330-30=1 L»6e.. N.- ₅₇,₅₉,_{; logy} 113 (1994)_Rev ,_mmunol. _{25 (199}5) 65-93; Harding, Lonberg, N„ e Husza , ., ₅₃6-546; _Fishwi|_d. _D. _M„ _F„ N-. Ano -2„,._Moe « _w, — _et al., Nat. Biotechnol. 14 (199 θ _também. _Patentes US Nos.

rados por referencia em su _{5 789 650;} 5.877.397;

5.545.806; 5.569.825; 5.625.1 , θ ’ _WO 98/24884;

5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.545.807^ ^WO94/2558p;_ra^Oge-² —comp.etamente humanos para IGF-IR, camundongos de HuMAb podem ser —-—- t expressam IGF-IR ae acoi _t ( _Nat Bioteoea MQ94) 856-859; Fishwild, D.M.,eiai..

“’’/,Α (’,990) . «Ο 98/24804. Pre..—·. .» — chnol. 14 (1996) 8 •mimiracão Por exemplo, uma

e.*, M0 — de idade na P-» — θ θ.

P—. Ponocada on —Ida - „„ „,_{ada pm} xemplo purificado de eé««j^^^lmeo». No e.eo» m» imunizar os camundongo ~ _Trafi_{a ou} enriquecida de anti_as camundongos podem tamgeno de IGF-IR nao resuu exemplo, uma ’em se. Imunizados com cé.ul» oue ^{IGF IB}· ‘Tn I” ·Κ· .:· ·φ τΐ; HI S. !|! ^l!? ''I¹ *' '^?l * ^{ilr K} f nr- 5· 3 S I al ^L Ih *, ?O ,. , . _t ....... i.=

II· ί 1 .:. « 11' 'i linhagem de célula tumoral, para promover respostas imunes. Experiência cumulativa com vários antígenos mostraram que os camundongos transgênícos de HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (i.p.) com antígeno em adjuvante de Freunds completo, segui5 do por imunizações i.p. a cada duas semanas (por exemplo, até um total de

6) com antígeno em adjuvante de Freunds incompleto. A resposta imune pode ser monitorada no curso do protocolo de imunização com amostras de plasma que são obtidas através de sangramento retroorbital. O plasma pode | ser triado por ELISA, e os camundongos com titulações suficientes de imu10 noglobulina anti-IGF-IR humana podem ser usados para imortalização dej células B correspondentes. Os camundongos podem ser impulsionados in-| trave η o sa mente com antígeno 3 a 4 dias antes do sacrifício e remoção do| baço e linfonodos. É esperado que 2-3 fusões para cada antígeno possam| necessitar ser executadas. Vários camundongos serão imunizados para ca-| da antígeno. Por exemplo, um total de doze camundongos de HuMAb das| cepas de HCo7 e HCo12 pode ser imunizado.|

Os camundongos de HCo7 têm um rompimento de JKD em seusf genes de cadeia leve endógena (capa) (como descrito em Chen, J., et al.,|

EMBO J. 12 (1993) 821-830), um rompimento de CMD em seus genes de| cadeia pesadas endógena (como descrito no Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene humano de KCo5 capa de cadeia leve (como descrito em Fishwild, D. M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), e um transgene de J

I

HCo7 humano de cadeia pesada (como descrito na Patente US No.|

5.770.429).I

Os camundongos de HCo12 têm um rompimento de JKD em| seus genes de cadeia leve endógena (capa) (como descrito em Chen, J.₍ et| al., EMBO J. 12 (1993) 821-830), um rompimento de CMD em seus genes de cadeia pesada endógena (como descrito no Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene humano de KCo5 capa de cadeia leve (como des-| crito em Fishwild, D. M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851) e um transgene humano de HCo12 de cadeia pesada (como descrito no Exemplo 2 de WO 01/14424).í

o. !««<» PEG =>> «“ _uma — * X. o. —₀X =»- txjx—- χΧ:

exlrradar™’’ due. „ ,SA p«B —^Λ ;ςχ- - *,* Xx— :

“X-1x -- xx ^,5 χχχ·* —^β _Mrto o» 3 ««*> “«“Ã ;„„_çS0 sobre as s«»~« « _de CDR de acordo com ,θ Riechmann, ., anticorpo humano diferente (ver,^ ₅₂₂332 (1998) 323-327, Jones, . θ θ θθ ^₉₈₉)10029 ₅₂₅. , αο..ο. C · «< « Ρ«· « _οΚΒ„ ees bases d. bobo.

X ™. s.,»o». de esborora pod - _hum>no de dê ONA p®c» - ’^WU _d ,„b. ern ,·*«' *«“ _de DNA p seqüêncras de Imnag _genes linhagem gen™ⁿ ' anticorpo porque elas .==-=^ durante a maturaçao das ^ce “ _{das se}quêncras de um germinal também diferirão unrform

Ç°^es de i— seqüencias trutura de uni et at, Nature de repertório secundário de afinidade alta no indivíduo ao longo da região variável.

A invenção preferivelmente compreende um fragmento de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que liga ao IGF-IR, onde o dito poli-ί peptídeo inibe a ligação de IGF-I e IGF-II ao IGF-IR, selecionado do grupo que consiste em::

a) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo como CDRs

CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) e CDR3 (aa 99-107) da SEQ ID NO: 1 ou 3;I

b) uma cadeia leve de anticorpo compreendendo como CDRs

CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) e CDR3 (aa 89-98) da SEQ ID NO: 2 ouj

4.í

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruídas que| são combinadas com as seqüências de promotor, iniciação de translação,| região constante, 3' não-transladada, poliadenilação e terminação de trans-b crição para formar as construções de vetor de expressão. As construções de| expressão de cadeia pesada e leve podem ser combinadas em um vetor simples, co-transfeccionadas, serialmente transfeccionadas ou separadamente transfeccionadas em células hospedeiras que são depois fundidas j para formar uma célula hospedeira simples que expressa ambas as cadeias.

Consequentemente, a invenção fornece um método para a produção de um anticorpo humano recombinante de acordo com a invenção,| caracterizado em expressar um ácido nucléico codificando:|

a) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo como CDRs|

CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) e CDR3 (aa 99-107) da SEQ ID NO: 1j ou 3;J

b) uma cadeia leve de anticorpo compreendendo como CDRs£

CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) e CDR3 (aa 89-98) da SEQ ID NO: 2 ou i _Aí-

4-|

A invenção também compreende o uso de um anticorpo de a-| cordo com a invenção para a diagnose de IGF-IR in vitro, preferivelmente| por um ensaio imunológico que determina a ligação entre IGF-IR de uma

amostra e o anticorpo de acordo com a invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, por exemplo uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais humanos, ou a porção de ligação a antí5 geno dos mesmos, da presente invenção, formulada juntamente com um portador farmaceuticamente aceitável.

Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma composi10 ção da presente invenção com pelo menos um agente de antitumor ou outra terapia convencional.

Um agente quimioterapêutico é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem Adriamicína, Doxorrubicina, 5-Fluorouracila, Citosina arabinosídeo (Ara-C), 15 Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere (docetaxel), Busulfan, Gencitabina, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etoposida, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatina, Teniposida, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (ver Patente US No. 4.675.187), Melfalan e 20 outras mostardas de nitrogênio relacionadas.

O termo agente citotóxico como aqui usado refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa a destruição das células. É intencionado que o termo inclua isótopos radioativos, agentes quimioterapêuticos e toxinas como toxinas enzimaticamente ativas de 25 origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas.

O termo pró-medicamento como usado neste pedido de patente refere-se a um precursor ou forma de derivado de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica às células tumorais comparada à droga de origem e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na 30 forma de origem mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615° Meeting Belfast (1986), e Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to

T.WM Drug OrW. 0»» ΟοΙΙνθΡ/· “ ^aL ζ 247-267, Hum.» Pr»= (1665)- ^p-^p»“^P “”¹⁸ '^m“'“ ’ „_!0 .,o limifados =, Pro-»·».» ““^do fosfato. pro-drogas conlendo suKaio. pro-dragas conierrdo ^pep dragas modificado, em aminoáddo D, p»-draga. gli»s«os, P~^’ de aoel d. p-laclam, pró-droga. eenl.odo tonoxiaeelamMa ope»n.lm.nf. .„0.«. ou pro-dragas — —a »P— — da 5-fiuorocilosloa a ou.ros gro-droga. de 5-fluorouadiea qu. «*. « «do. aa droga I» =«.«e mals a,,». Exempt do dmgas ... que podem »r submefida. á denvallzaçaa em uma tomia medicamento para ο·» ».1« ™^S ™° “““ ’ aqueles agentes quimioterapêuticos descritos acima.

Como aqui usado, veículo farmaceuticamente aceitavel qualquer . (odo. os «es. — de dispersão, re.e.dm.n». .=·«« «nos . anbtonglco.. -«“* >‘ sooção . ou«o. que sao .siotogiemeole «»»- veículo é adequado para admíni.fr.qão «...nos., In.ramu.eutor. subou»nea, paronferal. «1 » =^p«™= <^p°' -“ são).

Um sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do anticorpo e não dá efeito toxicolog.co indesejado (ver por exemplo Berge, S. M„ et al., d. Pham. Sc. 66 (1977) „9, Tais sais são incluídos na invenção. Exemplos de tais sa.s mcluem incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não-tox.cos, como clondncos. _{presente jnvenção pode} ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica.

pelo artesão versado, a rota e/ou modo de administração vanara, depend do dos resultados desejados.

Para administrar um composto da invenção por certas rotas administração, pode ser necessário revestir o composto, ou co-administrar o composto, com um material composto pode ser _Diluentes farmaceuticamente aceipor exemplo, üpossomas, ou um d _aquOsas.

táveis incluem solução sahna e so ço _{so|uções ou dts}Veículos farmaceuticamente aceita _extemporânea

;... · — de soluções injetáveis estere _{ivas é con}hecido na técnica.

para substâncias farmaceuticam θ „_adrnini_Strado paren eAs frases admimstraçao P _administração diferentes ralmente como aqui usadas si^^ θ de administração enteral e top _intra__arterial, intratecal, mtrac p _na, subcutânea, subcut.cula , _intra._esternal e infusão.

,^=.,-r: rz . _Pr.«nç30 d. p..»®·Pd.® * ⁸“^bt. ”· · °

Êjçuoar , farmacêutica

Estas composições podem conservantes, agentes persantes. _da tanto por procedimentos de vários agentes antibacterianos butanol, fenol, ácido sórbrco e _os agentes isotônicos, como

ΧΧο^Ρ monoestearato de alumínio e’ selecionada, os composIndependente da rota de adm. adetos da presente invençáo podem sermenção sã0 { u. —- ^as “TX— ^{acertáveis por} ladas em formas de ados na técnica, convencionais conhecidos aqueies .θ^ _nas composNíveis de dosagem atua.s do _{para obter}

Ha oresente invenção P ções farmacêuticas da p uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem serem tóxicos ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a 5 atividade das composições particulares da presente invenção empregada, ou o éster, sal ou amida dos mesmos, da rota de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular sendo empregado, da duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, da 10 idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e também dos fatores conhecidos nas técnicas médicas.

A composição deve ser estéril e fluida ao ponto que a composição seja liberável por seringa. Além de água, o veículo pode ser uma solução salina isotônica tamponada.

¹⁵ Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferível incluir os agentes isotônícos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição.

Os exemplos a seguir, referências, listagem de seqüência e figuras são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro escopo desta é exposto nas reivindicações em anexo. É entendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos expostos sem divergir do espírito da invenção.

DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ (D NO: 1-4 Seqüências de nucleotídeo e amina de domínios de região variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos 18e22

SEQ ID NO: 5 E 6 Seqüências de nucleotídeo e amina de domínio de re³⁰ gião constante humano

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIGURA 1 - Expressão de superfície de IGF-IR em cultura de célula de densidade baixa e alta.

FIGURA 2 - Ensaio de WST (células de H322M de NCI) para inibição de proliferação em cultura 3D.

FIGURA 3 - Ensaio de formação de colônia para inibição de proliferação em cultura 3D (figura microscópica).

FIGURA 4 - Ensaio de formação de colônia para inibição de proliferação em cultura 3D (quantificação), ctr = controle; Cl 18 = anticorpo 18.

FIGURA 5 - Inibição de ligação de l¹²⁵-IGF-l às células de HT29 através dos anticorpos 18 e 22 (valores de IC50).

FIGURA 6 - Inibição de ligação de l¹²⁵-IGF-lI às células de HT29 através do anticorpo 18.

FIGURA 7 - Inibição de ligação de l¹²⁵-IGF-ll às células de HT29 através do anticorpo alR3.

FIGURA 8 - Bloqueio de fosforilação induzida por IGF-I tanto de IGF-IR quanto de Akt/PkB.

FIGURA 9 - Nenhuma inibição de ligação de l¹²⁵-insulina às células de 3T3-IR através dos anticorpos de anti-hlGF-1R. (MAX w/o Ab: ligação máxima de l¹²⁵-insulina; MIN: ligação mínima após competição com 1 μΜ de insulina)

FIGURA 10 - Nenhuma atividade estimulante de AK18 em células de 3T3 de sobre-expressão de IGF-IR.

FIGURA 11 - Nenhuma atividade estimulante de AK18 em células tumorais humanas (HT29).

FIGURA 12 - Sub-regulação de IGF-IR exposto em célula superfície de H322N através do anticorpo 18 in vitro.

FIGURA 13 - Tratamento com AK18, volume de tumor primário

FIGURA 14 - Tratamento com AK18 com ou sem gencitabina

FIGURA 15 - Tratamento com AK18, volume de tumor primário EXEMPLO 1

GERAÇÃO DE UMA LINHAGEM CELULAR DE HIBRIDOMA PRODUZINDO ANTICORPOS DE ANTI-IGF-IR

CULTURA DE HIBRIDOMAS

; ^; :« R “ z ¹ - z ; ^: _: ^::» ?

Hibridomas de HuMAb gerados foram cultivados em Hybridoma

Express Medium (PAA Laboratories GmbH, Áustria) suplementado com 2 mM L-glutamina (BioWhittaker) e 4 % Origen Cloning Factor (Igen, França) a 37° C e 5 % CO₂.

PROCEDIMENTO DE IMUNIZAÇÃO DEJÇAMUNDONGOSJTRANSGÊNIr

COS

Dez camundongos transgênicos de HCo7 (4 machos e 6 fêmeas), cepa GG2201 (Medarex, San José, CA, USA) foram alternadamente imunizados com 1x10⁶ células de 3T3 de NIH, transfeccionadas com urn ve-| tor de expressão para IGF-IR, e 20 pg de domínio extracelular solúvel de|

IGF-IR. Seis imunizações foram executadas no total, três imunizações intra-| peritoneais (IP) com as células de expressão de IGF-IR e três imunizações| subcutâneas (SC) na base de cauda com a proteína recombinante. Para aÍ primeira imunização, 100 pl de 1x10⁶ células de 3T3 de NIH de IGF-IR foramr misturadas com 100 μΙ adjuvante completo de Freunds (CFA; Laboratórios| de Difco, Detroit, USA). Para todas as outras imunizações, 100 μΙ de célulasϊ em PBS foram usadas ou proteína recombinante foi misturada com 100 μΙ de adjuvante incompleto de Freunds (ICFA; Difco).j

ELISA ESPECÍFICO PARA ANTÍGENOí

Titulações de anti-IGF-IR em soros de camundongos imunizados| foram determinadas através de ELISA específico para antígeno. Domínioj

I extracelular de IGF-IR solúvel em uma concentração de 1 pg/ml em PBS foi| revestido durante a noite a 4^o C, ou durante duas horas a 37° C, em 96 pia-* cas de poços. Depois disso, os poços foram bloqueados com PBSTC (PBS!i suplementado com 0,05 % Tween®20 e 2 % soro de galinha (Gibco BRL))| durante 1 hora (h) em temperatura ambiente. Primeiro, soros de punção foram diluídos 1/50 em PBSTC, soros de todas as outras punções foram pre-í diluídos 1/100 em PBSTC e serialmente diluídos até 1/6400. Os soros diluí-ϊ dos foram adicionados aos poços e incubados por 1 h a 37 C. Soro de pré-1 punção foi usado como controle negativo. 200 ng/ml de IGF-IR anti-humano de cabra (100 pg/ml) foram usados como controle positivo. Subseqüentemente, as placas foram lavadas duas vezes com PBST e incubadas com,

I ιμ J.

$ π· &

& ·>

F(ab’)₂ de IgG anti-humana de rato conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP) (DAKO), diluídas 1/2000 em PBSTC por 1 h a 37° C. Os poços foram lavados duas vezes com PBST e ensaios foram desenvolvidos com solução de ABTS® recentemente preparada (1 mg/ml) (ABTS: ácido 2,2'-azino bis (3-etilbenztiazolina-6-sulfônico) durante 30 minutos em temperatura ambiente (RT) na escuridão. Absorbância foi medida a 405 nm.

ANÁLISE DE FACS

Além da determinação através de ELISA específico para antígeno, as titulações de anti-IGF-IR em soros de camundongos imunizados foram também determinadas por análises de FACS. Células de 3T3 de NIH de IGF-IR e células de IGF-IR de 3T3 de NIH não-transfeccionadas foram incubadas com soros diluídos durante 30 minutos a 4° C. Soro de pré-punção foi usado como controle negativo. Inicialmente, 200 ng/ml de IGF-IR antihumano de cabra foram usados como controle positivo. As células foram lavadas três vezes em PBS suplementado com 1 % albumina de soro bovino e 0,01 % azida. Subsequentemente, as células foram incubadas com fragmentos de ligação de antígeno conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (fragmentos de F(ab')2) de IgG humana anti-humana de rato diluída 1/100 em tampão de FACS, durante 30 minutos a 4^o C. As células foram lavadas duas vezes em tampão de FACS e as amostras foram analisadas em um FACSCalibur (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Bélgica).

REFORÇO DE CAMUNDONGOS

Quando as titulações de soro de anti-IGF-IR foram observadas ser suficientes, os camundongos foram adicionalmente reforçados duas vezes com 15 pg de domínio extracelular de IGF-IR em 200 pl de PBS intravenosamente (i.v.) 4 e 3 dias antes da fusão.

GERAÇÃO DE HIBRIDOMA

Os camundongos foram sacrificados e o baço e os linfonodos flanqueando a aorta abdominal e veia cava foram colhidos. Fusão de esplenócitos e células de linfonodo com as células de SP 2.0 do par de fusão foi executada de acordo com os procedimentos operacionais padrão.

k-ELISA

Para determinar se os hibridomas que resultaram da fusão geram anticorpos humanos, um κ-ELISA foi executado. As placas de ELISA / z foram revestidas com anticorpo de cadeia κ-leve de IgG anti-humana de rato (DAKO) diluído 1/10000 em PBS por incubação durante a noite a 4^o C. Após 5 descartar os poços, as placas foram bloqueadas através de incubação com

PBSTC durante 1 hora em temperatura ambiente. Depois disso, os poços com sobrenadante de cultura de hibridoma foram incubados, 1/2 diluídos em PBSTC. Meio de cultura 1/2 diluído em PBSTC foi usado como controle negativo, soro de camundongo positivo κ-leve 1/100 diluído em PBSTC serviu 10 como controle positivo. Subsequentemente, os poços foram lavados três vezes e incubados com F(ab’)₂ de IgG anti-humana de rato conjugado com HRP (DAKO), diluído 1/2000 em PBSTC por 1 h a 37° C. Os poços foram í lavados três vezes e ensaios desenvolvidos com solução de ABTS recente-j mente preparada (1 mg/ml) durante 30 minutos em temperatura ambiente (RT) na escuridão. Absorbância foi medida a 405 nm em uma leitura de pia-| ca de ELISA.|

Os anticorpos monoclonais 18 e 22 foram preparados.I'

EXEMPLO 2I

DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DE ANTICORPOS DE ANTI-IGF-IR AO

IGF-IRj

Instrumento; BIACORE® 3000f í

Fatia:CM5

Acoplamento: acoplamento de amina

Tampão: HBS (HEPES, NaCI), pH 7,4,25° CÍ ^{25 Para} afinidade, medições de anticorpos de FCy humano (de coe-í

Iho) foram acopladas à superfície da fatia para apresentação do anticorpo| contra IGF-IR. Domínio extracelular de IGF-IR foi adicionado em várias con-í centrações na solução. Associação foi medida por uma injeção de IGF-IR de| minutos; dissociação foi medida lavando a superfície da fatia com tampão!

durante 5 minutos. Os dados de afinidade para os anticorpos são mostrados} e 22 na Tabela 1.I ilf

TABELA 1: DADOS DE AFINIDADE MEDIDOS POR SPR (BIACORE®

3000)

Anticorpo	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD(M)
18	1,49 x 105	1,03 x 10 7	6,95 x 10 13
22	1,47 x105	9,64 x 10'5	j 6,56x10'10

EXEMPLO 3

CRESCIMENTO TRIDIMENSIONAL DAS CÉLULAS TUMORAIS .E SOBREEXPRESSÁO DE RECEPTOR DE IGF-I EM CONTATO DE CÉLULAr CÉLULA- (CULTURA 3D) MATERIAIS E MÉTODOS:

Células de H322M de NCI foram cultivadas em meios de RPMI em lâminas de cobertura de vidro do tipo óptica ou em baixa densidade ou superconfluente para estudar os efeitos na expressão de superfície de IGFIR. Em paralelo, tecido de xenoenxerto de H322M isolado do grupo de controle (camundongos sem tratar) foi congelado a choque em isopentano e criosseções foram cortadas em espessura de 5 pm. Marcação com imunofluorescência foi executada usando um anticorpo monoclonal de IGF-IR de anti-camundongo (alR3, 5 pg/ml) ou um anticorpo de acordo com a invenção, seguido por um anticorpo de anti-camundongo de cabra ou um anticorpo de anticamundongo de cabra marcado com Cy3 (Amersham Biosciences, GB) ou Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes, Inc., USA). Espécimes foram imageadas em um microscópio confocal de SP2 de Leica ou analisadas por FACS.

RESULTADOS:

Quando as células de H322M cultivadas em densidade alta foram imageadas através de microscopia confocal ficou evidente que IGF-IR especificamente agrupou-se nos sítios de contato de célula-célula. Quando comparadas às células de H322M crescidas in vivo, isto é tecido de xenoenxerto, havia uma similaridade notável às culturas densamente acondicionadas in vitro até onde a organização dos receptores de IGF-I de superfície estava relacionada.

A sobre-regulação de receptor de IGF-I de superfície em culturas superconfluentes de células de H322M foi também quantificada por FACS.

Expressão de superfície de receptor de ICF I

Quando _as céíulas foram crescidas sob /- ^{mais de 10 vez}^ radas aos contatos de célula célula ^dens'^{dade alta c}°mpaOutras cél ^d® ^bai*^a Cidade, células tumorais corno HT29 Μπδοή ram um comportamento similar, indicando que a sobre r I ms de IGF-I na superfície ri_a c - > . sobre-regulaçao de receptocálula-célula não é uma'a cZ °^S ** ^da rece ser uma propriedade geral de ^{H322M mas pa cid}° que é também encontrado in 1) ‘θ’

EXEMPLO4 Vigural).

-~--Ç^AQ-QiLÇRESCIMFN~rn _{DF Γ}±. , ^PQja^ENSAIOWST) % de FCS em* θ¹^³⁸ ®^{m meios de} RPMI1640/0,5 ^roxietümetacrüato)) _para ímpediXX tas condições as células de H322M r ^P θ ^P'^ástica- ^{Sob es}‘ ^mensiona.mente (uma proprieda“ θ ancoradouro). Estes esferói^ cnamada independência de ‘ura tridimensional e organiza^T^'^ ^ΡΓ0Χ™° ^{à histoar}qui‘e—e f_oram inoubZ -uras de centes de anticorpos de 0-240 nM _O Z_a para medir a inibição de cm ° θ ^C°^{nVersao de W}ST foi usado

H322M foram tratadas com conceba ^{eSferóides da} nM) uma inibição dependente de dos^ ^d® ^antícorP° 18 (1-240 (Figura 2). θ' ^crescimen‘o pôde ser observada

EXEMPLO 5 ^^^^-BÊ-CRESCIMENTO DE CÉI I li ac t ³⁰ LÒNIA) ^^^^^Aío^formacão DE CO20 ^%Ncsem:z~ perfícíe plástica. Sob estas condições, as células de H322M formam esferóides densos que cultivam tridimensionalmente (uma propriedade que é chamada independência de ancoradouro). Estes esferóides representam a histoarquitetura tridimensional e organização de tumores sólidos in situ. As culturas de esferóide foram incubadas durante 5-10 dias na presença de quantidades crescentes de anticorpos de 0-7,5 pg/ml. Anticorpo monoclonal de <HBV> foi usado como controle neg. As colônias foram imageadas em um microscópio invertido (Zeiss Axiovert) usando contraste de fase e contadas usando um sistema de imageamento automatizado (MetaMorph). Quando as culturas de esferóide de H322M foram tratadas com concentrações diferentes (0,5-7,5 pg/ml) de anticorpo 18, uma inibição dependente de dose em crescimento pôde ser observada, enquanto o anticorpo de controle <HBV> teve pequeno ou nenhum efeito. O número e o tamanho de colônias foram claramente reduzidos em culturas tratadas com 7,5 pg/ml de anticorpo 18 (Figura 3).

Análise quantitativa de colônias maiores que 100 pm em diâmetro revelado que o número de colônias foi reduzida aproximadamente 66 % em culturas tratadas com 0,5 pg/ml de anticorpo 18 (Figura 4).

EXEMPLO 6

INIBIÇÃO DE LIGAÇÃO DE IGF-I E IGF-II ÀS CÉLULAS TUMORAIS QUE EXPRESSAM IGF-IR

Para determinar a capacidade do anticorpo da invenção de bloquear a ligação dos ligandos IGF-I e IGF-II ao receptor de IGF-I (IGF-IR), experimentos de competição com peptídeos de ligando radioativamente marcados foram executados.

Células tumorais humanas (HT29, NCI H322M, 0,5 a 1 x 10⁵/ml) foram banhadas em meio de RPMI 1640 (PAA, Cat. No. E15-039) suplementado com 2 mM L-Glutamin, 1x aminoácidos dispensáveis (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM piruvato de sódio (Gibco, Cat. No. 11360-039) e 10 % FCS inativado por calor (PAA, Cat. No. A15-771). Seis garrafas no formato de T175 foram inoculadas com 20 ml de células no respectivo meio para cada experimento e cultivadas durante dois dias a 37° C e 5 % CO2 para obter monocamadas de células confluentes.

Para colher células individuais, 2 ml de 1 x Tripsina/EDTA (Gibco, (J Cat. No. 25300-054) por frasco de T175 foram adicionados e separação de células monitorada com um microscópio Zeiss Axiovert25. As células foram 5 colhidas e meio com 10 % FCS como descrito antes foi adicionado a um volume total de 50 ml. Células foram re-isoladas através de centnfugação durante 10 minutos a 1000 rpm (Heraeus sepatech, Omnifuge 2.0 RS) e resuspensas em 50 ml de tampão de ligação (120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,2 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 10 mM D(+)glicose, 15 mM NaAc, 100 mM Hepes 10 pH 7,6, 1 % BSA). As células foram contadas, reisoladas através de centnfugação e ajustadas com tampão de ligação a 1 x 10® celulas/ml.

Peptideos de IGF-I e IGF-II l¹²⁵-marcados (Amersham, -2000 Ci/mmol, Cat. No. IM172 e IM238), solubilizados em 0,1 % de CH₃COOH, foram diluídos em tampão de ligação a uma atividade final de 4 x 10⁵ con15 tas/(minuto x ml). 75 μΙ de anticorpo em concentrações especificadas junto com 25 μΙ de peptideo de IGF-I ou IGF-II marcado com I¹²⁵ pré-diluído foram adicionados aos 200 μΙ de suspensão de célula e incubados por 3,5 h a 4 C. Células foram re-isoladas através de centrifugação durante 5 minutos a 2000 rpm (Eppendorf, 5415C) e sobrenadante removido. Após lavar duas 20 vezes em 1 ml de tampão de ligação, as células foram ressuspensas em 1 ml de tampão de ligação e transferidas para tubos de cintilação. A quantidade de peptideo radioativo ligado aos receptores de superfície de célula foi medida em um contador de cintilação.

As curvas de IC50 resultantes demonstrando a capacidade do 25 anticorpo de inibir ligação de peptideo de IGF-I e IGF-II ao receptor de IGF-I são mostradas nas Figuras 5 e 6. O valor de IC₅₀ médio para o anticorpo de 18 é 0,3 nM. Os resultados para anticorpo alR3 estão mostrados na Figura

7. Nenhuma inibição detectável para ligação de IGF-II pôde ser observada.

EXEMPLO 7

ENSAIO DE COMPETIÇÃO DEANTICORPOPARALIGAgÃODElGEdB

Para um mapeamento de epitopo de anticorpos monoclonais de anti-IGF-IR um formato similar que para medição de afinidade (Exemplo 2) foi selecionado, mas IGF-IR foi pré-incubado por pelo menos 0,5 hora em TA com o anticorpo na solução. Esta mistura foi injetada e ligação de IGF-IR (ou inibição) foi detectada. Este ensaio permite medir a atividade inibidora recíproca dos anticorpos monoclonais por ligação de IGF-IR. Foi observado que 5 os anticorpos da invenção competem para ligar ao IGF-IR com alR3, um anticorpo que é conhecido ligar aos aa 217-274 (Gustafson, T A. e Rutter, W.

J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667).

EXEMPLO 8

INIBIÇÃO DE FOSFORILAÇÃO MEDIADA POR IGF-I DE IGF-IR E Akt/PKB

Para determinar a capacidade do anticorpo da invenção em inibir ativação e fosforilação do receptor de IGF-I (IGF-IR), experimentos de competição foram executados com peptídeo de IGF-I e a análise de Western blot subsequente com anticorpos específicos para tirosina fosforilada.

Células tumorais humanas (HT29, H322M de NCI, 5 x 10⁴/ml) foram banhadas em meio de RPMI 1640 (PAA, Cat. No. E15-039) suplementado com 2 mM L-Glutamin, 1x aminoácidos dispensáveis (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco, Cat. No. 11360-039) e 0,5 % de FCS inativado por calor (PAA, Cat. No. A15-771). Para determinação dos valores de IC50, placas de 12 cavidades foram inoculadas com 1 ml de célu20 Ias no respectivo meio para cada experimento e cultivadas durante dois dias a 37° C e 5 % de CO₂.

Após 48 horas de cultivo com meio de soro baixo, o meio foi cuidadosamente removido e substituído por concentrações diferentes de anticorpo diluídas no respectivo meio. Após 5 minutos de incubação a 37° C e 5 25 % de CO₂, peptídeo de IGF-I foi adicionado em uma concentração final de 2 nM e células foram incubadas novamente durante 10 minutos sob as condições mencionadas acima. O meio foi cuidadosamente removido por aspiração e 100 pl de tampão de lise frio foram adicionados por cavidade (50 mM de Hepes pH 7,2, 150 mM de NaCI, 1mM de EGTA, 10 % de glicerol, 1 % de 30 Triton®-X100, 100 mM de NaF, 10 mM de Na₄P2O₇, inibidor de protease Complete®). As células foram destacadas usando um raspador de célula (Coming, Cat. No. 3010) e os conteúdos das cavidades transferidos para tubos de reação de Eppendorf. Fragmentos de célula foram removidos através de centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4» C e metade do sobrenadante foi adicionada em 2x tampão de amostra de Laemmli em uma razão de 1:1 (v/v). Para imunoprecipitação de IGF-IR, o sobrenadante restante dos lisados de célula sofreram um ciclo de clarificação (10 minutos a 13000 rpm e 4’ C) logo antes de 1 pl de um anticorpo policlonal contra IGFIRB (C-20, Santa Cruz Biotechnologies) ou um anticorpo monoclonal murino (lgG1) que reconhece um epitopo dentro dos aminoácidos 440-586 do domínio extracelular (cadeia a) do Receptor do Tipo 1 de IGF humano ter sido adicionado (mAb 24-55, GroPep). Após 2 horas de incubação a 4° C em um tubo giratório de reação de Eppendorf, 25 pi de contas de Protein G Sepharose (Amersham Biosciences, Cat. No. 17-0618-01) foram adicionados seguido por outra etapa de incubação de 1 hora a 4° C. As contas com complexos de anticorpo-proteína ligados foram isoladas através de centrifugaçao (1 minuto a 2000 rpm e 4“ C) e lavadas três vezes com tampão de lavagem (tampão de Use com apenas 0,1 % de Triton® X100). Após ebulição, as contas em proteínas celulares de tampão de amostra de Laemmli foram separadas através de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de mtrocelulose (PROTRAN BA 85, Schleicher&SchuelI) por Western blot semi-seca.

Um anticorpo específico para fosfotirosina (Upstate, clone 4G10, Cat No. 05-321) foi usado para determinar o estado de fosforilação de IGFIR imunopurificado. Para a detecção de Akt/PKB fosforilado um anticorpo com especificidade para Ser473 fosforilado (Cell Signalling, Cat. No. 9271) foi aplicado.

O bloqueio observado de fosforilação induzida por IGF-I tanto de IGF-IR quanto de Akt/PKB é mostrado na Figura 8.

EXEMPLO 9

INDUÇÃO DE SUB-REGULAÇÃO MEDIADA POR ANTICORPO DE IGF-IR IN VITRO

Para detectar os efeitos do anticorpo da invenção na quantidade de receptor de IGF-I (IGF-IR) em células tumorais, experimentos tempocurso e análise western blot subsequente com anticorpos específicos para ^! z: .

Ι· ·ί · H ή ιι- -¾ 1.. |L .,: 'i ,:· .. 0

Ί· í d, t- t -I ·> ?.

IGF-IR foram executados.

Células tumorais humanas (HT29, 5 x 10⁴ células/ml) em meio de RPMI 1640 (PAA, Cat. No. E15-039) suplementado com 2 mM de LGlutamina, 1x aminoácidos dispensáveis (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM piruvato de sódio (Gibco, Cat. No. 11360-039) e 10 % de FCS inativado por calor (PAA, Cat. No. A15-771). Durante cada período de incubação uma placa de 12 cavidades foi inoculada com 1 ml de células no respectivo meio para cada experimento e cultivada durante 24 horas a 37° C e 5 % de CO₂.

O meio foi cuidadosamente removido e substituído por concentrações diferentes de anticorpo diluídas no respectivo meio. Em duas cavidades de controle, o meio foi substituído por qualquer meio sem anticorpo ou meio com um anticorpo de controle (AB-1, Oncogene, Cat. No. GR11). As células foram incubadas a 37° C e 5 % de CO₂ e as placas individuais foram tiradas para outro processamento após 15 minutos, 24 horas e 48 horas.

O meio foi cuidadosamente removido por aspiração e 100 pl de tampão de lise frio foram adicionados por cavidade (50 mM de Hepes pH 7.2, 150 mM de NaCI, 1 mM de EGTA, 10 % glicerol, 1 % de Triton® X100, 100 mM de NaF, 10 mM de Na4P2O?, Complete® (inibidor de protease). As células foram destacadas usando um raspador de célula (Corning, Cat. No. 3010) e os conteúdos das cavidades transferidos para tubos de reação de Eppendorf. Fragmentos de célula foram removidos através de centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4^o C e o sobrenadante foi adicionado ao tampão de amostra de Laemmli 2x em uma razão de 1:1 (v/v). Proteínas celulares foram separadas através de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (PROTRAN® BA 85, Schleicher&Schuell, Cat. No. 10 401196) por western blot semi-seca.

Um anticorpo específico para IGF-IR (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat. No. sc-713) foi usado para determinar os níveis de proteína de IGF-IR.

Sub-regulação de IGF-IR induzida pelo anticorpo da invenção após menos de 24 horas após adição do anticorpo foi observada. EXEMPLO 10 'igação de insulina _{ao recep(or jn} - .... _{uluqueia a} foram ex_{ecutados com} ^λ «Penmentos de competição

C^as de 3T3 T ⁽ ° ^/m,) θ^ΧρΓ™° recombinantemente

-J de MEM ^c°m 2 mM inativado por no formato de Para cada experimento e culpara obter monocamadas de rr/l^^'^^^^^vame.

números altos (>10=) _{IR humaao é} (DMEM) com glicose alta (PAA Cat ^Dulbecco <fo L-Glutamina (Gibco Cat m °' ^E15'⁰⁰⁹⁾ suplementado ^cafor(PAA, Cat. No A15 ₇₇₁₎ s θ ¹° ^{% de} i.

tÜasT ^{20 m}' ^Cé'^U'^aS -XXo^{ram Ín}°^CUladaS cXX^{doisdÍasa37P}-^5%-o2 (Gfoco, CatXX75^S4;^é'^U'^{aS índÍVÍdUaÍS}· ração das células monitorada^om^{3800 adÍCionador} ‘ ^d- e meio com 10 »/o de FCS X d fome total de 50 ml. Células foram · ™ ^{adicionado a} um vorante 10 minutos a 1000 rpm e ressuspe ™^nMfu9a&° ^d“Ção (120 mM de NaCI, 5 mM de KCI 1 2 T ^{de li9a}‘ ™ ^de D(+)glicose, 15 m_M de NaA ¹ ™ ^de ^A, 10

As células foram contadas, re-isoladas at ^?’⁶’ ^{1 % BSA}>

^C°^{m tamdâ0} ligação a 1 x ₁₀e _célulX^{eS ά}θ ^CenWu9^° θ ajustadas Peptídeo de insulina l¹²⁵ _?2000 Ci/mmol), soíubilizado em ò 1 '^6, ''9açao a uma atividade final de 4‘1_O® com ^f°' ^{d uído tam}P^ã° de

P. de peptideo dZiZ ‘θ ^c-°nados a 200 p| de suspensão de célula ícZ ^adi'

200 nM) e incubados por 3 5 h a 4’ c n ^ncentra?^ao de anticorpo final ³⁰ «««w, _{duranle 5 m|nutos a 2000} ’ “ «Λ, _{através d},

Apos lavar duas vezes em 1 ml de tam - θ ^{renadan,e foi} removido.

ml de 1x Tripsina/EDTA —>s e sepa20 ££JGF4R E AKT/PKR

--1R do anticorpo da na ausência de ligando de invenção e um anticorpo de referêni executado por uma análise de wespara estado de fosforilação. Células de ^{J com} IGF-IR (5*10« células/ml, Pietrz►-205) foram banhadas em ..j (PAA, Cat No. E15-009) ’ Cat No. 25030-024) e 0,5 ) ou células tumorais em meio de RPMI 1640 (PAA,

X ^PW“^d“ ^radi“”“ “ d. supertlde celula fo. med.da _{em um contador de} θ,^.θ terfere com a '.^ϊ^^{08 dem}°^nStram ° anticorpo da invenção não in5 9). ^a° ° ^{l9and0 de lnsullna a}° receptor de insulina (Figura

EXEMPLO 11 ^Maestim^

Para excluir atividades estimulantes de IGF

-nvençao, fosforilação de IGF-IR foi determinada IGF-I mas na presença do anticorpo da ir da (alR3, Oncogene, Alemanha). Isto foi tern blot com anticorpos específicos _r— ³T3 (ATCC CRL 1658) transfectadas c___________ owski, Z., et al., Cell Growth Differ. 4 (1992) 199. meio de Dulbecco MEM (DMEM) com glicose alta suplementado com 2mM de L-Glutamina (Gibco, ' % de FCS inativado por calor (PAA, Cat No A15-771) humanas (HT29, H322M de NCI, 5‘10«/ml) Cat No. E15-039) suplementado com 2 mM de L ri, , dispensáveis (Gibco, Cat No 11140-035) i mM d Cat No. 11360-039) e 0 5 % de FCS ’ 7 771). Para deta ^CS '^natlvado por calor (PAA, Cat No. A15inoculadas com TrnMe^lul ™ ^foram cultivadas durante dois dias a^FTsTZcT θ

ΓΧΤ “™·⁰ ™'° “ raspador de célula (Corning, Cat No. 3010) e conteúdos das cavidades transferidos para os tubos de reação de Eppendorf. Fragmentos de célula foram removidos através de centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4° C (centrífuga de Eppendorf 5415R) e a metade do sobrenadante foi adi5 cionada ao tampão de amostra de Laemmli 2x em uma razão de 1:1 (v/v). Para imunoprecipitação de IGF-IR, o sobrenadante restante dos lisados de célula sofreu um ciclo de clareamento (10 minutos a 13000 rpm e 4° C) logo antes de 1 pl de um anticorpo contra IGF-IR ter sido adicionado (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat No. sc-713 ou mAb 24-55, GroPep, Cat No.

MAD1). Após incubação de 2 horas a 4° C em um tubo de reação giratório de Eppendorf, 25 pl de contas de Protein G Sepharose® (Amersham Biosciences, Cat No. 17-0618-01) foram adicionados seguido por outra etapa de incubação de 1 hora a 4^o C. As contas com complexos de anticorpo-proteina ligados foram isoladas através de centrifugação (1 minuto a 2000 rpm e 4

C) e lavadas três vezes com tampão de lavagem (tampão de Use com apenas 0,1 % de Triton® X100). Após ebulir as contas em tampão de amostra de Laemmli, as proteínas celulares foram separadas através de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (PROTRAN BA 85, Schleicher & Schuell, Cat No. 10 401196) por western blot semi-seca.

Um anticorpo específico para fosfotirosina (Upstate, clone 4G10,

Cat No. 05-321, reconhecendo proteínas fosforiladas por tirosina) foi usado para determinar o estado de fosforilação de IGF-IR imunopunficado. Para a detecção de Akt/PKB fosforilado um anticorpo contra Akt1 com especificidade para Ser473 fosforilado (Cell Signalling, Cat No. 9271) foi aplicado.

Foi observado que a cinase de Akt/PKB foi ativada a jusante na via de sinalização de IGF-IR significativamente pelo anticorpo de referencia em concentrações mais altas que 5 nM mas não pelo anticorpo da invenção em concentrações até 10.000 nM. Os resultados estão mostrados nas Figuras 10 e 11 (HM = meio de soro baixo com 0,5 % FCS, HM+IGFI = meio de soro baixo com 0,5 % de FCS e 10 nM de hIGF-l).

EXEMPLO 12

INDUÇÃO DE SUB-REGULAÇÃO_DF RECEPTOR EM MODELOS DE XENOENXERTO DE H322M

Os tumores foram induzidos em camundongos nús e tratados uma vez com concentrações diferentes do anticorpo da invenção. 24 horas após tratamento os tumores foram extraídos e homogeneizados sob nitrogê5 nio líquido. Tampão de lise frio foi adicionado (50 mM de Hepes pH 7,2, 150 mM de NaCI, 1 mM de EGTA, 10 % de glicerol, 1 % de Triton® X100, 100 mM de NaF, 1 mM de Na₃V0₄₁ 10 mM de Na₄P₂O₇, (inibidor de protease Complete®, 1mM de PMSF) em uma razão de volume de tampão para peso de tumor de 3.1 e completamente misturado com o homogeneizado de tumor 10 de descongelação. Fragmentos insolúveis foram removidos através de centrifugação durante 10 minutos a 13000 rpm e 4^o C solubilizando o tecido durante 15 minutos em gelo (centrífuga de Eppendorf 5415R). A concentração de proteína das amostras foi determinada com o Micro BCA® Reagents (Pierce) e tampão de lise foi adicionado para ajustar concentrações iguais. Par15 te do sobrenadante foi adicionada ao tampão de amostra de Laemmli 2x em uma razão de 1:1 (v/v). Proteínas celulares foram separadas através de SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (PROTRAN BA 85, Schleicher & Schuell, Cat No. 10 401196) por western blot semi-seca. Um anticorpo específico para IGF-IR (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat 20 No. sc-713) foi usado para detectar IGF-IR.

Sob tratamento com o anticorpo da invenção, foi observada uma diminuição dependente da concentração dos níveis de IGF-IR com um EC50 estimado em 0,6 mg/kg (Figura 12).

EXEMPLO 13

ELISA DE LIGAÇÃO DE C1a

INTRODUÇÃO

Para determinar a capacidade dos anticorpos de acordo com a invenção de fixar C1q um método de ELISA foi usado. C1q faz parte do sistema imune adaptável e, ao ligar aos complexos imunes, desencadeia a ati30 vação sequencial de vários zimogênios. As enzimas por sua vez, levam à clívagem de moléculas de C3, que podem resultar no princípio das reações inflamatórias, opsonização de partículas estranhas ou aberrantes e lise de membranas de célula.

ZZZ «cZ^ELISA ‘ ”^esMa ™ '*“ * »«««, _{w dm Mco};_o ;zxz^nad0· ^{de c}”^{é 5} “jogado marcado com peroxidase. umano seguido por um

MATERIAIS E MÉTODOS ._m : χ· ^d- '°™— a», .™_etra, ,.^_da,' _Oomd ™'^{M Tabe,a} ’ ._specBcide.

’» (CLB. maténa-p,,™ „ ₅ , ™ “°^al™ “™ '»« >™na xx;::—“

Prima de C1q humana mm ^Ça° ^{de matéria}«aeç.0 a.CZ .Ζ™7'^,“^η,Γ”³° “ ² “ ““^da- o™ ^a um anlicorpo da i_aG de anlZ ^<'’^C'’^a<to “^{nw C1}“ <t>ako) e silvestre (Sigma) foram usados. ^peroxidase de rábano ^£AL£ÜLQ§-£AJUSTE DE Curva

- .mm :ζ:ζ:ζ::^,Β™^χ’ ^d°^HuMAb zxr^a,b) “·^μ° -^fc*“ i

il

-«Cr::::::^a —»«·» (OD 405 nm) foj representada θ ^{405 nm}

MAb e valores como é _ac θ'^{11 9ráfe0 versus as} concentrações de Hu

- curvas foram fornecidas usando regressão não-.inear Me.Z

JUS e por hgaçao máxima (Bmax) estão listados na Tabela 2 cada valor.Tcoefciente de^7 θ ° (^4). Com uma ligação máx^dX^X vo) mostra íígação mínima de _C1q. Controles positivos |gG T lgG3 T ligam C1q, como mostra ^{9U1 gG3 ambos} mo mostrado por uma ligação máxima de 1 729 e 2 22·, pectivamente. ’ ^v ® <²²³· resíii:

!

TABELA 2

LIGAÇÃO MÁXIMA (BMAX) DO HUMAB TESTADO NO ELISA DE LIGAÇÃO DEC1Q(N=3)

| Melhores valores de ajuste	Bmax	Desviopadrão Bmax	Bondade de ajuste R2	Desviopadrão R2
lgG1	1,729	0,166	0,983	0,010 ;
lgG3	2,223	0,947	0,995	0,005
lgG4	0,279	0,280	0,950	0,041
Anticorpo 18	1,670	0,601	0,988	0,005

O coeficiente de correlação (R²) e desvio-padrão são também listados.

Comparado à ligação de C1q de lgG4 humana (controle negativo, com uma O.D. de 0,279), todos os anticorpos testados são igualmente capazes de fixar C1q.

EXEMPLO 14

DETERMINAÇÃO DE FUNÇÕES EFETORAS MEDIADAS POR ANTICORPO POR HUMABS DE ANTI-IGF-IR

Para determinar a capacidade dos anticorpos de HuMAb gerados para suscitar mecanismos efetores imunes, citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e citotoxicidade de célula dependente de anticorpo (ADCC), os estudos foram executados.

Para estudar CDC (National Cancer Institute, linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar), células de H322M, H460 e de 3T3 de NIH (26 x 10⁶) foram marcadas com 100 pCi ⁵¹Cr durante 45-120 minutos (Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJS11). Após marcação, as células foram lavadas duas vezes com 40 ml de PBS e giradas durante 3 minutos a 1500 rpm. As células foram depois banhadas 5.000 por cavidade em uma placa de fundo redondo, em um volume de 50 pl. Os anticorpos foram adicionados em uma concentração final que varia de 25-0,1 pg/ml em um volume de 50 μΙ de meio de cultura de célula a 50 μΙ de suspensão de célula e incubados durante 30-60 minutos. Após incubação, o anticorpo de excesso foi removido lavando duas vezes com PBS. 100 μΙ de soro humano em fundo comum ati49 vo ou inativo (30 minutos a 56» C), soro de cobaia, coelho ou de camundongos nús diluídos em 1/3-1/30 foram adicionados, e as células foram incubadas durante 3 horas após as quais as células foram giradas a 1500 rpm durante 3 minutos. 100 μΙ do sobrenadante foram revestidos, transferidos para 5 tubos de polipropileno e contados em uma contadora y.

Para estudar os efeitos dos anticorpos em ADCC, células de H322M, H460 e de 3T3 de NIH ou outras de expressão de IGF-IR adequadas (2-6 x 10⁶) foram marcadas com 100 pCi ⁵¹Cr durante 45-120 minutos (Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJS11), lavadas duas vezes com 10 40 ml de PBS e giradas durante 3 minutos a 1500 rpm. As células foram colocadas em placas 5.000 por cavidade em uma placa de fundo redondo, em um volume de 50 μΙ. Os anticorpos de HuMAb foram adicionados em uma concentração final que varia de 25-0,1 pg/ml em um volume de 50 μΙ de meio de cultura de célula a 50 μΙ de suspensão de célula e incubadas duran15 te 15 minutos. Subseqüentemente, 50 μΙ de células efetoras, PBMC recentemente isolado ou células efetoras purificadas de coberturas tamponadas, foram adicionados a uma razão de E:T na faixa de 100:1 a 5:1. As placas foram centrifugadas durante 2 minutos a 500-700 rpm, e incubadas durante a noite a 37° C. Após incubação as células foram giradas durante 3 minutos 20 a 1500 rpm e 100 μΙ de sobrenadante foram colhidos, transferidos para tubos de polipropileno e contados em uma contadora y.

A magnitude de lise de célula por CDC ou ADCC é expressada como % da liberação máxima de radioatividade das células alvo lisadas por detergente corrigido para liberação espontânea de radioatividade das res25 pectivas células alvo.

EXEMPLO 15

INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO DE TUMORES DE H322M

Os efeitos de anticorpo 18 in vivo foram investigados induzindo tumores em camundongos nús atímicos de acordo com os métodos estabe30 lecidos. Células de NSCLC de H322M humanas foram co-injetadas juntamente com Matrigel subcutaneamente em camundongos nús atímicos de 6-7 semanas de idade (nu/nu). Para cujo propósito, 5x10® células de H322M u· ·.' 'h ·:ι ψ ·=' ^........

^._rJ .U · i. i|| .·, I · I» -'· t f 'll f: Ψ Ψ 'I' ^l! * ' ⁴ foram concentradas em 100 μΙ de meio de cuítura e misturadas com 100 μΙ de Matrigel. 200 μΙ desta misture forem injetados nos flancos direitos dos camundongos. Volume de tumor foi calculado medindo os diâmetros de tumor com compassos de calibre de Vernier duas vezes por semana de acordo com a fórmula primeiro publicada por Geran et al. (Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems, Cancer Chemother. Rep. 11.301, 1972) onde o volume de tumor [mg] = (comprimento x (largura)²). Anticorpo foi administrado intraperitonea I mente (i.p.) a 10 ml / kg. Tratamento foi iniciado com doses dobradas do anticorpo administrado em volumes dobrados. Tumores foram induzidos em camundongos nús como descritos acima. Após tumores terem sido crescidos a um volume médio de 160 mg, os camundongos intraperitonealmente foram tratados seis vezes uma vez uma semana com 6, 0,6 e 0,06 mg / kg de anticorpo como doses sucessivas iniciando com 12, 1,2 e 0,12 mg / kg como dose de carga dada uma vez no primeiro dia de tratamento. Figura 13 representa os volumes de tumor medidos durante o tratamento até dia 67, quando os animais foram sacrificados e o experimento foi terminado. O experimento demonstra que bloqueio do eixo de IGF-IR por mAb de antiIGF-IR de rhu 18 resulta em eficácia antitumoral quando administrado como um agente simples a 6 e 0,6 mg/kg. Em contraste, 0,06 mg/kg não teve nenhum efeito no crescimento de tumor.

Além disso, o anticorpo 18 foi testado em combinação com gencitabina no mesmo modelo. Os tumores foram induzidos como descrito acima e o tratamento foi iniciado quando os tumores tinham estabelecidos e crescidos para média de 170 mm³ em todos os grupos. Anticorpo foi administrado uma vez uma semana i.p. a 6 e 0,6 mg/kg e em combinação com 62 mg / kg de gencitabina a 0,6 mg. Gencitabina foi administrada um ciclo, isto é, a cada terceiro dia durante quatro vezes no total. Novamente, o tratamento foi iniciado administrando doses dobradas do anticorpo. Figura 14 mostra o tamanho de tumor versus tempo em relação aos vários tratamentos. O experimento demonstrou que o tratamento com o anticorpo 18 administrado uma vez a cada sete dias inibe crescimento de tumor por si só e intensifica a eficácia de gencitabina, um composto antimetabólico conhecido.

EXEMPLO 16

INIBIÇÃO DE CRESCIMENTODETUMQRESDE3T3

Os tumores foram induzidos em camundongos nus essenaalmente como descrito no Exemplo 15 exceto que fibroNastos de 3T3 murinos que sobreexpressam o IGF-IR humano foram usados. Camundongos com tumores estabelecidos de aproximadamente 180 mg foram tratados ,n rap° θ tonealmente uma vez semanalmente durante sete vezes com , θ mg/kg de anticorpo 18. Novamente, tratamento foi oc.ado com do es do X d. anticorpo d.d.s con. do., d. car,. (». « · ' perímento d— ,u. d. —>

to de tumor pode ser tardado quando administrado a 18 e semanalmente (Figura 15).

^ULSJAJ2XÜTZet al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) ¹⁰⁵°-¹⁰⁶³

Aplin, J. D„ e Wriston, J. C. Jr., CRC Grit. Rev. B.ochem. (198 ) ^{259 306} Arteaga, C. L„ et al., Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) ¹⁰¹¹⁰⁶ Ausubel, F„ et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, Nova Iorque (¹⁹⁸⁷ζ

Barnes, L. M„ et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-2 Barnes, L. M„ et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123 Benini, S. et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797 Berge, S. M„ et al., J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19 Bergmann, U. et al., Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011 Brüggemann, M. etal. J. Exp. Med. 166 (1987)¹³⁵¹'¹³⁶¹ Brunetti, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) ^212-218 Carter, P. et a., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) 42854289

Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830 * ‘ * » ή '> : ·. < _S1 ‘I:

r^,s : : :.....r :: :

Chen, J., et al., International Immunology 5 (1993) 647-656

Delafontaine, P., et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659- /|

1673?

Dricu, A., et al., Glycobiology 9 (1999) 571-579j:

Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9f

Edge, A.S., et al. Anal. Biochem 118 (1981) 131-137

Fishwild, D. M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851

Forsayeth, J. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987)

3448-3451?

¹⁰ Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282

Gustafson, T. A., e Rutter, W. J,, J. Biol. Chem. 265 (1990)|

18663-18667|

M

Hailey, J., et al., Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353|

Harding, F., e Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-I ^{15 546}f

Hoyne, P. A., et al., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60I

Johnson, G., e Wu, T. T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218J

Jones, P„ et al., Nature 321 (1986) 522-525!

Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^aJ

Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.j (1991)

Kalebic, T., et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534

Kanter-Lewensohn, L., et al., Melanoma Res. 8 (1998) 389-397

Kato, H., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661 ²⁵ Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161

Kull, F. C. Jr., et al. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566

Lammers, R„ etal., EMBO J. 8 (1989) 1369-1375

LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163

Li, S. L., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 9230 98

Li, S. L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252

Lonberg, N., e Huszar, D„ Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93 ”^{3 b4} (1994) 49-101

Love,T ^{S C Ρ}”'“κ T bX» »<’»> ^13β4~”^{71 D}Z « X H* “ ^{USA l}”⁸⁴⁾ Morrison, S. L., er au,

6855
10	O'Brioo. R. M„ et *. S“B° J ® '^““sA 86 < 1 «»> 383''’
3837	BWW.«··· “™”· ’Kl’989> pessino, A-, er ai.,

1236-1243

Ρ,ο.,ζ— Z.. e> -.«' ζ“* XZXX ^ρή·^ΛΓΧΧΧ^

Queen, C., ^{eT dl}”

10033 20	Rlechmto. L. « Λ. 3“ ’ZX- ’® <’987) RohliK, Q-8.al 'BiOChem· Bl°Phy R
276-281	scMa«=r. K '
25 71-83	E j J Immunol Melbod· IM I’986'W’·’99 ™-9 l2M2) 2 Scotland,, K., etai., /on02) 11-16 StoonOi. K. »1 al- J C’“' „ B«* ^59 <WB7> Sojahr, Η. T . e BaW· O P·'Ar^'B 8
30 52-57	I 235 (1930) 190-208 Soos.M.A..«ial.Biocho . · 12955-12963 Soos. M A . «.I· 3 ®'· C,”m· 267 119 ’

Soos, M. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 52175221

Stella et aL, Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985)

Surinya, K. H., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725

Taylor, L, et al., Int. Immunol. 6 (1994) 579-591Choi, T. K., et al., Nature Genetics 4 (1993) 117-123

Taylor, L., et al., Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295

Taylor, R., etal., Biochem. J. 242 (1987) 123-129

Thotakura, N. R_, e Bahl, Ο. P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350359

Tuaillon, N., etal., Immunol. 152(1994) 2912-2920

Tuaillon, N., et aL, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993) 37203724

Tulloch, P. A., etal., J. Struct Biol. 125 (1999) 11-18

Patente US No. 4.179.337

Patente US No. 4.301.144

Patente US No. 4.487.603

Patente US No. 4.496.689

Patente US No. 4.640.835

Patente US No. 4.670.417

Patente US No. 4.675.187

Patente US No. 4.791.192

Patente US No. 5.202.238

Patente US No. 5.204.244

Patente US No. 5.545.806

Patente US No. 5.545.807

Patente US No. 5.569.825

Patente US No. 5.625.126

Patente US No. 5.633.425

Patente US No. 5.661.016

5	Patente US No. 5.770.429 Patente US No. 5.789.650 U Patente US No. 5.814.318 ' Patente US No. 5.874.299 Patente US No. 5.877.397 »a„ t*. Μ A., . vão de W* J G- C PMm”
10	(2M1) 388-374 E s 0, Scie„ce 238 (1987) 1098-1104 Werner, R. G-. Drug Res. 48 (1998) 870-880 -Ρ®ι«. Cancer Cn.d»<h.n.p,- Soer- ety Transactions, 14, págs. 375-382, 615° Meeting Belfast (1986) [ WO 01/14424 1 WO 02/053596 | WO 87/05330 |
15	WO 92/03918 j WO 92/22645 WO 93/1227 WO 94/11026 WO 94/25585

WO 98/24884

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo que se liga ao IGF-IR, caracterizado pelo fato de que compreende:

   uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de SEQ ID NO: 2.
2. 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humano ou humanizado.
3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de cerca de 10^-13 a 10^-9 M (KD).
4. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtenível de linhagem celular de hibridoma <IGF-1R> HUMABClone 18 (apresentando número de depósito DSM ACC 2587).
5. 5. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica.
6. 6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que contém um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

   4.
7. 7. Linhagens celulares de hibridoma, caracterizadas pelo fato de que são <IGF-1R> HUMAB-Clone 18 (apresentando número de depósito DSM ACC 2587).
8. 8. Método para a fabricação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
9. 9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método de terapia.
10. 10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que é para ser administrado em combinação com um agente citotóxico, um pró-fármaco do mesmo ou uma radioterapia citotóxica.
11. 11. Método para a seleção de um anticorpo anti-IGF-IR a partir de uma pluralidade de anticorpos anti-IGF-IR, caracterizado pelo fato de que um ensaio de fosforilação celular usando células de 3T3 fornecendo 400.000 a

    Petição 870200013587, de 29/01/2020, pág. 4/10

    600.000 moléculas de IGF-IR por célula em um meio contendo 0,5 % de soro fetal de bezerro inativado por calor (FCS) é executado com os ditos anticorpos e o dito anticorpo é selecionado que não mostra nenhuma atividade estimulante de IGF-IR medida conforme fosforilação de PKB em uma 5 concentração de 10 μΜ quando comparado a um tal ensaio sem o dito anticorpo.