KR20060054296A - 인슐린-유사 성장 인자 ⅰ 수용체에 대한 항체 및 그의용도 - Google Patents

Abstract

IGF-IR 에 결합하고, IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제하며, 하기 a), b), c) 및 d) 를 특징으로 하는 항체:

a) IgG1 동종형(isotype)의 것이고,

b) IGF-IR 에 대한 IGF-I 의 결합의 억제 대 IGF-IR 에 대한 IGF-II 의 결합의 억제의 IC₅₀ 값의 비를 1:3 내지 3:1 로 나타내고,

c) 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 HT29 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이(assay) 에서, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 5 nM 의 농도에서 IGF-IR 인산화를 80% 이상 억제하고,

d) 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이에서, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 10 μM 의 농도에서 IGF-IR 인산화로 측정된 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않음.

Description

인슐린-유사 성장 인자 Ⅰ 수용체에 대한 항체 및 그의 용도 {ANTIBODIES AGAINST INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR I RECEPTOR AND USES THEREOF}

본 발명은 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-IR) 에 대한 항체, 그의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약제학적 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-IR, EC 2.7.112, CD 221 항원) 는 막투과 단백질 티로신 키나아제의 족에 속한다 (LeRoith, D., 등, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; 및 Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). IGF-IR 은 IGF-I 에 높은 친화성으로 결합하고, 생체내 상기 리간드에 대한 생리학적 반응을 개시한다. IGF-IR 은 또한 IGF-II 와 결합하나, 친화성은 약간 더 낮다. IGF-IR 과발현은 세포의 신생(neoplastic) 형질전환을 촉진하고, IGF-IR 이 세포의 악성 형질전환에 관련이 있다는 증거가 존재하며, 그러므로 암의 치료를 위한 치료제의 개발에 유용한 표적이다 (Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063).

IGF-IR 에 대한 항체는 당업계에 잘 공지되어 있고, 시험관 내 및 생체내 그의 항종양 효과에 대해 연구되고 있다 (Benini, S., 등, Clin. Cancer Res. 7 (2001) 1790-1797; Scotlandi, K., 등, Cancer Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., 등, Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti, A., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989) 212-218; Prigent, S.A., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252; Pessino, A., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya, K.H., 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 16718-16725; Soos, M.A., 등, J. Biol. Chem., 267 (1992) 12955-12963; Soos, M.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 5217-5221; O'Brien, R.M., 등, EMBO J. 6 (1987) 4003-4010; Taylor, R., 등, Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A., 등, Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S.L., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993) 92-98; Delafontaine, P., 등, J. Mol. Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673; Kull, F.C. Jr., 등. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566; Morgan, D.O., 및 Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986) 1364-1371; Forsayeth, J.R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer, E.M., 등, J. Biol. Chem. 265 (1990) 13248-13253; Gustafson, T.A., 및 Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A., 등, FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch, P.A., 등, J. Struct. Biol. 125 (1999) 11-18; Rohlik, Q.T., 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281; 및 Kalebic, T., 등, Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534; Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063; Dricu, A., 등, Glycobiology 9 (1999) 571-579; Kanter-Lewensohn, L., 등, Melanoma Res. 8 (1998) 389-397; Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252). IGF-IR 에 대한 항체는 또한 예를 들어, Arteaga, C.L., 등, Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992) 101-106; 및 Hailey, J., 등, Mol. Cancer Ther. 1 (2002) 1349-1353 과 같이 많은 출판물에 기재되어 있다.

특히, αIR3 이라고 불리는 IGF-IR 에 대한 단일클론 항체는 IGF-IR 매개된 진행 및 암과 같은 IGF-I 매개된 질병을 연구하는데 널리 사용된다. 알파-IR-3 은 Kull, F.C., J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566 에서 기재하고 있다. 그 사이, 약 백여 개의 출판물이 αIR3 의 항종양 효과에 관해, 단독으로, 그리고 독소루비신(doxorubicin) 및 빈크리스틴(vincristine) 과 같은 세포증식 억제제와 함께 사용시, αIR3 의 연구 및 치료학적 용도를 다루며 출판되고 있다. αIR3 은, IGF-I 이 IGF 수용체에 결합하는 것을 억제하나, IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제하지 않는 것으로 공지된 쥣과 단일클론 항체이다. αIR3 은 고농도에서 종양 세포 증식 및 IGF-IR 인산화를 자극한다 (Bergmann, U., 등, Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011; Kato, H., 등, J. Biol. Chem. 268 (1993) 2655-2661). IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을, IGF-I 이 결합하는 것보다 더욱 강하게 억제하는 기타 항체 (예, 1H7, Li, S.L., 등, Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000) 243-252) 가 존재한다. 항체 및 그의 특성 및 특징에 대한 당업계의 개요가 Adams, T.E., 등, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063 에 의해 기재되고 있다.

당업계에 기재되고 있는 대부분의 항체는 마우스 기원이다. 당업계에 잘 공지되어 있는 이러한 항체는, 키메라화 또는 인간화와 같은 추가 변형 없이는 인간 환자의 치료에 유용하지 않다. 상기 단점에 기초하여, 인간 항체는 인간 환자의 치료에 있어 치료제로서 확실히 바람직하다. 인간 항체는 당업계에 잘 공지되어 있다 (van Dijk, M.A., 및 van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). 이러한 기재에 기초하여, 매우 다양한 표적에 대한 인간 항체를 제조할 수 있다. IGF-IR 에 대한 인간 항체의 예는 WO 02/053596 에 기재되어 있다.

그러나, 여전히 항종양 치료법을 필요로 하는 환자에게 납득할 만한 이점이 있는 IGF-IR 에 대한 항체에 대한 요구가 있다. 환자를 위한 적절한 이점은, 간단히, 항종양제 치료에 의해 야기되는 종양 성장의 감소 및 진행 시간의 뚜렷한 연장이다.

본 발명의 개요

본 발명은 IGF-IR 에 결합하고, IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제하는 항체를 포함하며, 상기 항체는 하기 a), b), c) 및 d) 를 특징으로 한다:

a) IgG1 동종형(isotype)의 것이고,

b) IGF-IR 에 대한 IGF-I 의 결합의 억제 대 IGF-IR 에 대한 IGF-II 의 결합의 억제의 IC₅₀ 값의 비를 1:3 내지 3:1 로 나타내고,

c) 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 HT29 세포를 사 용하는 세포 인산화 어세이(assay) 에서, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 5 nM 의 농도에서 IGF-IR 인산화를 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 억제하고,

d) 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이에서, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로 측정된 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않는다.

본 발명에 따른 항체는 항종양 치료를 필요로 하는 환자에게 이점을 나타내고, 종양 성장 감소 및 진행 시간의 뚜렷한 연장을 제공한다. 본 발명에 따른 항체는 IGF 탈조절(deregulation)과 관련된 질병, 특히 종양 질병으로 고통받는 환자에게 이점을 주는 신규성 및 발명성을 갖는다. 본 발명에 따른 항체는 상기 언급한 특성을 특징으로 한다. 그러므로, 특성은 특히 IGF-IR 에 특이적으로 결합하고, 상기 언급한 비율로 IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합을 억제하고, IgG1 동종형의 것이며, 심지어 IGF-IR 과발현 세포에서 그의 IC₅₀ 값의 200 배 농도에서도 IGF-IR 신호를 활성화시키지 않는 것이다. "IGF-I 모방 활성(mimetic activity)" 을 갖지 않는 항체는 치료제로서 사용할 경우, 강력한 이점을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 부가적으로 ADCC 에 의해 100 nM 의 상기 항체의 농도에서 24 시간 후 IGF-IR 발현 세포 표본의 20% 이상의 세포 사멸 을 유도한다.

바람직하게는, 게다가, 본 발명에 따른 항체는 CDC 에 의해 100 nM 의 항체 농도에서 4 시간 후 IGF-IR 발현 세포 표본의 20% 이상의 세포 사멸을 유도한다.

바람직하게는, 5 nM 의 농도에서 본 발명에 따른 항체는 종양 세포에서 IGF-IR 의 IGF-I 매개된 신호 전달을 완전히 억제한다.

본 발명은 또한 핵산을 포함한다. 코딩된 폴리펩티드는 하기 a) 및 b) 에 정의된 각각의 기타 항체 쇄와 함께 어셈블리(assembly)할 수 있다:

a) 서열 목록 번호 : 1 또는 3 의 CDR CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

b) 서열 목록 번호 : 2 또는 4 의 CDR CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.

본 항체는 바람직하게는 단일클론 항체 및, 게다가, 키메라성 항체 (인간 불변쇄), 인간화 항체 및 특히 바람직하게는 인간 항체이다.

본 항체는 항체 18 과 경쟁하여 IGF-IR 인간 (EC 2.7.1.112, SwissProt P08069) 에 결합한다.

본 항체는 추가로 10^-8 M (K_D) 이하, 바람직하게는 약 10^-9 내지 10^-13 M 의 친화성을 특징으로 한다.

본 항체는 바람직하게는 인슐린 수용체에 결합하는 인슐린의 검출가능한 농도 의존성 억제를 나타내지 않는다.

바람직하게는, 본 발명은 하기 a) 및 b) 서열을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR) 을 포함하는 항체를 제공한다:

a) 서열 목록 번호 : 1 또는 3 의 CDR CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

b) 서열 목록 번호 : 2 또는 4 의 CDR CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.

본 항체는 바람직하게는 IgG1 유형의 것이고, 그러므로 C1q 보체 결합을 제공하고, CDC 를 유도한다. 본 항체는 추가로 IgGFc 수용체에 결합하여, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 을 유도하는 능력을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 적절한 이종이식 (xenograft) 종양 모델에서 비히클 처리 동물과 비교하여, 진행 시간을 상당히 연장하고, 종양 성장을 감소시킨다. 본 항체는 시험관 내 및 생체내 IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합을, 바람직하게는 IGF-I 및 IGF-II 에 대해 거의 동등한 방식으로 억제한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 이러한 길항 단일클론 항체를 제조하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

본 발명에 따른 바람직한 하이브리도마 세포주인 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (항체 18) 및 <IGF-1R> HUMAB Clone 22 (항체 22) 는, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Germany 에 기탁되었다.

세포주	기탁 번호	기탁 일
<IGF-1R> HUMAB-Clone 18	DSM ACC 2587	10.04.2003
<IGF-1R> HUMAB-Clone 22	DSM ACC 2594	09.05.2003

상기 세포주로부터 수득가능한 항체는 본 발명의 바람직한 구현예이다.

본 발명은 추가로 이러한 항체를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터 및 이러한 항체의 재조합체 제조를 위한 숙주 세포를 제공한다.

본 발명은 추가로 이러한 항체의 재조합체 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 암을 가진 것으로 진단된 환자 (그러므로 항종양 치료를 필요로 하는) 에게 유효량의 본 발명에 따른 IGF-IR 에 대한 길항 항체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 본 항체는 단독으로, 약제학적 조성물내에서, 또는 대안적으로는 방사능치료 또는 세포 독성제 또는 그의 프로드러그와 같은 세포 독성 치료와 병용해서 투여할 수 있다.

본 발명은 추가로 암 치료 및 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다. 게다가, 본 발명은 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제조 방법을 포함한다.

본 발명은 추가로 약제학적 목적을 위해 항체의 제형화에 유용한 완충제 및/또는 보조제를 임의로 함께, 약제학적 유효량의 본 발명에 따른 항체를 함유하는 약제학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 이러한 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 약제학적 조성물을 제조품 또는 키트 중에 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현할 수 있는, 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 벡터를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다.

본 발명은 추가로 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산을 발현하고, 상기 세포로부터 상기 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 재조합 인간 항체의 제조 방법을 포함한다. 본 발명은 추가로 이러한 재조합 방법에 의해 수득할 수 있는 항체를 포함한다.

본 발명은 추가로 IGF-IR 에 대한 대다수의 항체로부터 IGF-IR 에 대한 하나의 항체의 선별 방법을 포함하며, 상기 방법은 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이는 상기 항체로 수행하고, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로 측정되는 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않는 항체를 선별하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 항체는 하나 이상의 상기 언급한 추가 특성을 갖는다.

본 발명은 추가로 약제학적 조성물의 제조 방법을 포함하며, 상기 방법은 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이를 상기 항체로 수행하여, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로 측정된 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않는 상기 항체를 선별하여, IGF-IR 에 대한 대다수의 항체로부터 IGF-IR 에 대한 하나의 항체를 선별하고, 재조합 발현에 의해 상기 항체를 제조하고, 상기 항체를 회수하고, 약제학 적으로 허용가능한 완충제 및/또는 보조제와 상기 항체를 병용하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 항체는 하나 이상의 상기 언급한 추가 특성을 갖는다.

용어 "항체" 는 본 발명에 따른 특성을 유지하기만 한다면, 전체 항체, 항체 절편, 인간 항체, 인간화 항체 및 유전 공학 항체를 포함하는 다양한 형태의 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"항체 절편" 은 전장 항체의 일부, 일반적으로 적어도 항원 결합 부분 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 절편의 예는 디아체(diabody), 단일-쇄 항체 분자, 면역독소 및 항체 절편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다. 게다가, 항체 절편은 VH 쇄의 특징, 즉 VL 쇄 또는 IGF-IR 에 결합하는 VL 쇄와 함께 어셈블리할 수 있는, 즉 기능적 항원 결합 포켓 (pocket) 에 VH 쇄와 함께 어셈블리할 수 있는 특징을 갖고, 그러므로, IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제하는 특성을 제공하는 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.

"항체 절편" 은 또한 그 자체로 효과기 기능 (ADCC/CDC) 을 제공할 수 없으나, 적절한 항체 불변 도메인(들)과 조합된 후, 본 발명에 따른 방식으로 상기 기능을 제공하는 이러한 절편을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조물을 언급한다. 따라서, 용어 "인간 단일클론 항체" 는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 언급한다. 한 구현예에서, 인간 단일클론 항체는 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들어, 불멸 세포에 융합된 인간 중쇄 형질전환 유전자(transgene) 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자도입 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조된다.

용어 "키메라성 항체" 는, 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 가변 영역, 즉, 한 공급원 또는 종으로부터의 결합 영역, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 단일클론 항체를 언급한다. 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라성 항체가 특히 바람직하다. 이러한 쥣과/인간 키메라성 항체는, 쥣과 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 단편 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 포함되는 기타 형태의 "키메라성 항체" 는 본래 항체의 것으로부터 개질되거나 변경된 분류 또는 하위 분류인 것들이다. 이러한 "키메라성" 항체는 또한 "분류-전환된 항체" 로서 언급된다. 키메라성 항체 제조 방법은 이제 당업계에 잘 공지된 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술을 포함한다. 예를 들어, Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; 미국 특허 번호 제 5,202,238 호 및 제 5,204,244 호 참조.

용어 "인간화 항체" 는 골격 또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 이 모체 면역글로불린의 것과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 개질된 항체를 언급한다. 바람직한 구현예에서, 쥣과 CDR 을 인간 항체의 골격 영역 내에 이식하여 "인간화 항체" 를 제조하였다. 예를 들어, Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268-270 참조. 특히 바람직한 CDR 은 키메라성 및 이작용성 항체에 대해 상기 명시된 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것들에 상응한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체" 는, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 가변 중쇄는 바람직하게는 생식선 서열 DP-50 (GenBank L06618) 으로부터 유도되고, 가변 경쇄는 바람직하게는 생식선 서열 L6 (GenBank X01668) 으로부터 유도된다. 항체의 불변 영역은 인간 IgG1 유형의 불변 영역이다. 이러한 영역은 알로타입 (allotypic) 이 될 수 있고, 예를 들어, Johnson, G., 및 Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 에 기재되고, 본 발명에 따른 ADCC 및 바람직하게는 CDC 의 유도 특성이 유지되는 한, 그곳에 참조된 데이타베이스는 유용하다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 인간 항체" 는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 제작 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대, SP2-0, NSO 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 또는 숙주 세포내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대해 유전자도입된 동물 (예를 들어, 마우스) 로부터 단리된 항체를 포함하는 것을 의도한다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과돌연변이에 영향을 받는다. 그러므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유도되고, 이와 관련된 반면, 생체내 인간 항체 생식선 레파토아(repertoire) 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

본원에 사용된 바와 같이 "결합" 은, 항체가 IGF-IR 에 약 10^-13 내지 10^-8 M (K_D) 의 친화성, 바람직하게는 약 10^-13 내지 10^-9 M 의 친화성으로 결합하는 것을 언급한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "핵산 분자" 는, DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것을 의도한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중-가닥 DNA 이다.

"불변 도메인" 은, 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 관련되지 않으나, 효과기 기능 (ADCC, 보체 결합, 및 CDC) 에 관련된다. 본 발명에 따른 항체의 불변 도메인은 IgG1 유형의 것이다. 상기 특징을 갖는 인간 불변 도메인은 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), 및 Brueggemann, M., 등, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., 등, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527 에 의해 상세하게 기재되고 있다. 예는 서열 목록 번호: 5 내지 8 에 제시되어 있다. 기타 유용하고 바람직한 불변 도메인은 본 발명을 위해 DSMZ 로 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 수득가능한 항체의 불변 도메인이다. 본 발명에서 유용한 불변 도메인은 보체 결합을 제공한다. ADCC 및 임의로 CDC 는 가변 및 불변 도메인의 조합에 의해 제공된다.

본원에 사용된 바와 같이 "가변 영역" (경쇄 (VL) 의 가변 영역, 중쇄 (VH) 의 가변 영역) 은, 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 관련되는 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍을 표시한다. 인간 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며, 각 도메인은 그 서열이 널리 보존되고, 3개의 "과가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결된 4개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-쉬트 배열을 취하고, CDR 은 β-쉬트 구조를 연결하는 루프(loop)를 형성할 수 있다. 각 사슬내의 CDR 은 골격 영역에 의해 그들의 3차 구조 내에 유지되어 있고, 다른 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 추가 목적을 제공한다.

용어 "과가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분" 은 본원에 사용될 경우, 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 언급한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 과가변 영역 잔기를 제외한 가변 도메인 영역의 것들이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 대부분 항원 결합에 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 5 판. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 의 표준 정의 및/또는 "과가변 루프" 로부터의 잔기들에 따라 결정된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "IGF-IR 에 결합" 은, 시험관 내 어세이, 바람직하게는 항체가 표면에 결합하고, IGF-IR 의 결합을 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance: SPR) 에 의해 측정하는 결합 어세이에서 IGF-IR 에 대한 항체의 결합을 의미한다. 결합은 10^-8 M 이하, 바람직하게는 10^-13 내지 10^-9 M 의 결합 친화성 (K_D)을 의미한다.

IGF-IR 에 대한 결합을 BIAcore 어세이 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에 의해 연구할 수 있다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체/항원 복합체로부터 항체의 회합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수), 및 K_D (kd/ka) 에 의해 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 10^-10 M 이하의 K_D 를 나타낸다.

IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합은 또한 본 발명에 따른 항체에 의해 억제된다. 억제는 종양 세포 상의 IGF-IR 에 대한 IGF-I/IGF-II 의 결합에 대한 어세이에서 IC₅₀ 으로 측정된다. 이러한 어세이는 실시예 7 에서 기재된다. 이러한 어세이에서, 상기 종양 세포 (예를 들어, HT29) 의 표면에 제공되는 IGF-IR 에 결합된, 방사성동위원소 표지된 IGF-I 또는 IGF-II 또는 그의 IGF-IR 결합 단편의 양을 항체 농도의 증가와 함께, 그리고 증가 없이 측정한다. IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합에 대한 본 발명에 따른 항체의 IC₅₀ 값은 2 nM 이하이고, IGF-IR 에 대한 IGF-I/IGF-II 의 결합에 대한 IC₅₀ 값의 비는 약 1:3 내지 3:1 이다. IC₅₀ 값은 적어도 3 번의 독립된 측정의 평균 또는 중앙값으로 측정된다. 단일 IC₅₀ 값은 범주에서 제외될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합을 억제" 는, 시험관 내 어세이에서 HT29 (ATCC HTB-38) 종양 세포의 표면 상에 제시되는 IGF-IR 에 대한 I¹²⁵-표지된 IGF-I 또는 IGF-II 의 결합을 억제하는 것을 언급한다. 억제는 2 nM 이하의 IC₅₀ 값을 의미한다.

용어 "IGF-IR 발현 세포" 는 IGF-I 수용체를 약 적어도 20,000 수용체/세포까지 과발현하는 이러한 세포를 언급한다. 이러한 세포는, 예를 들면, NCI H322M 또는 HT29 와 같은 종양 세포주, 또는 IGF-IR 에 대한 발현 벡터를 트랜스펙션시킨 후 IGF-IR 을 과발현하는 세포주 (예를 들어, 3T3 ATCC CRL1658) 이다. 세포 당 수용체의 양은 Lammers, R., 등, EMBO J. 8 (1989) 1369-1375 에 따라 측정된다.

용어 "IGF-IR 인산화의 억제" 는, 항체 없는 세포 인산화 어세이와 비교하는 경우, 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이를 언급한다. 인산화는 티로신-인산화된 단백질에 특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 에 의해 검출된다. 이러한 어세이는 실시예 11 에서 기재된다. FCS 의 열 비활성화는 보체계의 비활성화를 위해 56 ℃ 로 단시간 가열하여 수행된다.

용어 "PKB 인산화의 억제" 는, 항체 없는 세포 인산화 어세이와 비교하는 경우, 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이를 언급한다. 인산화는 PKB 의 세린 473 에서 인산화된 PKB 에 특이적 항체 (Akt 1, Swiss Prot Acc. No. P31749) 를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된다. 이러한 어세이는 실시예 11 에서 기재된다.

용어 "항체-의존성 세포독성 (ADCC)" 은, 효과기 세포의 존재하에서 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 용해를 언급한다. ADCC 를 신선하게 단리된 PBMC 와 같은 효과기 세포 또는 단핵구 또는 NK 세포와 같은 연막으로부터 정제된 효과기 세포의 존재하에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체로 IGF-IR 발현 세포의 제조물을 처리하여 측정한다. ADCC 는, 항체가 100 nM 의 농도에서 24 시간 후에 20% 이상의 종양 세포의 용해 (세포 사멸) 를 유도하는 경우 발견된다. ADCC 가 24 h 보다 4 h 에서 더욱 두드러지게 발견된다면, 4 h 에서 측정을 수행한다. 어세이는 바람직하게는 ⁵¹Cr 또는 Eu 표지된 종양 세포로, 특이적으로 방출된 ⁵¹Cr 또는 Eu 를 측정하여 수행한다. 대조군은 종양 표적 세포를 효과기 세포와 함께, 그러나 항체 없이 인큐베이션하는 것을 포함한다.

용어 "보체-의존성 세포독성 (CDC)" 은, 보체의 존재하에서 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 용해를 언급한다. CDC 는 바람직하게는 보체의 존재하에서 본 발명에 따른 항체로 IGF-IR 발현 세포의 표본에 처리하여 측정한다. CDC 는, 항체가 100 nM 의 농도에서 4 시간 후에 20% 이상의 종양 세포의 용해 (세포 사멸) 를 유도하는 경우 발견된다. 어세이는 바람직하게는 ⁵¹Cr 또는 Eu 표지된 종양 세포로, 특이적으로 방출된 ⁵¹Cr 또는 Eu 를 측정하여 수행한다. 대조군은 종양 표적 세포를 보체와 함께, 그러나 항체 없이 인큐베이션하는 것을 포함한다.

용어 "IGF-I 매개된 신호 전달의 완전한 억제" 는 IGF-I-매개된 IGF-IR 의 인산화의 억제를 언급한다. 이러한 어세이를 위해, IGF-IR 발현 세포, 바람직하게는 H322M 세포를, IGF-I 로 자극시키고, 본 발명에 따른 항체 (5 nM 이상의 항체 농도가 유용함) 를 처리한다. 이어서, SDS PAGE 를 수행하고, 인산화된 티로신에 특이적 항체로 웨스턴 블롯팅 분석하여 IGF-IR 의 인산화를 측정한다. 웨스턴 블롯 상에 인산화된 IGF-IR 로 언급되는 밴드가 가시적으로 검출되지 않는 경우, 신호 전달의 완전한 억제가 발견된다.

본 발명에 따른 항체는 항체 18 로서 IGF-IR 의 동일한 에피토프(epitope)에 대한 결합을 나타내거나, 또는 항체 18 에 의한 결합의 입체 장애 때문에 IGF-IR 에 대한 결합을 억제한다. 결합 억제는 20-50 nM 의 농도에서 고정화 항체 18 과 IGF-IR 및 100 nM 의 농도에서 검출되는 항체를 사용하는 SPR 어세이에 의해 검출할 수 있다. 50% 이상의 신호 감소는 항체가 항체 18 과 경쟁한다는 것을 나타낸다. 이러한 어세이는 고정화 항체로서 항체 22 를 사용하여 동일한 방법으로 수행할 수 있다.

용어 "에피토프" 는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정소를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지고, 통상적으로 특이적인 3차원 구조 특징뿐 아니라, 특이적 전하 특징을 갖는다. 배열 및 비배열 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 후자를 제외하고, 전자에 대한 결합을 잃는 것으로 구별된다.

본 발명에 따른 항체는, 게다가, "보존성 서열 개질" 을 갖는 이러한 항체, 본 발명에 따른 항체의 상기 언급한 특징에 영향을 주지 않거나, 또는 변경하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 개질을 포함한다. 개질은 특정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 아미노산 잔기를, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 족은 당업계에 정의되어 있다. 상기 족은 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 를 갖는 아미노산을 포함한다. 그러므로, 인간 항-IGF-IR 항체에서 선결된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 족으로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.

아미노산 치환은 Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327 및 Queen, C., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033 에 의해 기재되는 바와 같은 분자 모델링에 기초한 돌연변이 유발에 의해 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 결합 파라미터 ka, kd 및 K_D, 항체 18 및 22 가 결합하는 동일한 에피토프에 대한 결합, 종양 세포 상의 IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합의 억제에 대한 IC₅₀ 값, 및 종양 세포에서 IGF-I 의 자극에 의한 IGF-IR 의 인산화의 억제에 대한 IC₅₀ 값으로부터 선택되는 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 특징에 의해 추가로 특징지워진다. IGF-IR 의 인산화의 억제는, PKB 와 같은 하류 원소의 인산화의 억제, 종양 세포에서 IGF-IR 의 하향-조절, 및 시험관 내 종양 세포의 3차원 성장상에 영향을 야기한다. 항체는 바람직하게는 그의 약동학 및 약역학 값, 및 기타 종에 대한 교차-반응성(cross-reactivity) 에 의해 추가로 특징지워진다.

본 발명에 따른 항체는 IGF-IR 의 티로신의 인산화 및 바람직하게는 또한 PKB 의 티로신의 인산화를 유사한 정도로 억제한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 종양 세포 및 종양, 예를 들어, 이종 이식 종양에서, IGF-IR 단백질 농도를 하향조절한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 콜로니 형성 어세이에서 종양 세포의 3차원 성장뿐 아니라, IGF-IR 발현 세포 (예를 들어, NIH 3T3 세포) 의 증식을 억제한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 200 nmol/l 의 농도로 항체를 사용하는 인슐린 수용체 과발현 3T3 세포 상의 결합 경쟁 어세이에서, 인슐린 수용체에 대한 인슐린의 결합을 억제하지는 않는다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합 수단에 의해 제조된다. 이러한 방법은 당업계에 널리 공지되고, 원핵 및 진핵 세포에서 단백질 발현과 함께, 항체 폴리펩티드의 연이은 단리 및 통상적으로 약제학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터로 삽입한다. CHO 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모 또는 E. coli 세포와 같은 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현을 수행하고, 세포 (용해 후 상층액 또는 세포) 로부터 항체를 회수한다.

항체의 재조합 제조는 당업계에 잘 공지되고, 예를 들어, Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse, S., 등, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 의 리뷰 문헌에서 기재되고 있다.

항체는 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태내에 존재할 수 있다. 다른 세포 성분 또는 다른 오염원, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해, 알칼린/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 젤 전기영동, 및 기타 당업계에 잘 공지된 기술을 포함하는 표준 기술에 의해 정제를 수행한다. Ausubel, F., 등, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 및 Wiley Interscience, New York (1987) 참조.

NSO 세포내에서의 발현은, 예를 들어, Barnes, L.M., 등, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; 및 Barnes, L.M., 등, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 에 의해 기재되어 있다. 일시적 발현은, 예를 들어, Durocher, Y., 등, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 에 의해 기재되어 있다. 다양한 도메인의 클로닝은 Orlandi, R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Norderhaug, L., 등, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 에 의해 기재되고 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 은 Schlaeger, E.-J., 및 Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 및 Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 에 의해 기재되고 있다.

원핵 생물에 적합한 대조 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우, "작동가능하게 연결" 된다. 예를 들어, 예비서열 또는 분비 선도에 대한 DNA 는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 예비단백질로 발현되는 경우, 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미칠 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결" 은 연결되는 DNA 서열이 접촉하고, 분비 선도의 경우에서, 해독 프레임에서 접촉하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉해서는 안된다. 편리한 제한효소 부위에서 라이게이션(ligation)에 의해 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker) 를 통상적인 실행에 따라 사용한다.

단일클론 항체는 예를 들어, 단백질 A-Sepharose, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리된다. 단일클론 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA 는 통상적인 과정을 사용하여 쉽게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA 의 공급원으로 사용될 수 있다. 일단 단리되면, DNA 는 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 다음 이것은 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포와 같은, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 제조하지 않는 숙주 세포 내로 트랜스펙션되어, 숙주 세포에서 재조합 단일클론 항체의 합성을 수득한다.

인간 IGF-IR 항체의 아미노산 서열 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변경을 항체 DNA 내로 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러나, 이러한 개질은 예를 들어, 상기 기재한 바와 같이 단지 매우 제한된 범위에서만 수행될 수 있다. 예를 들어, 개질은 IgG 동종형 및 에피토프 결합과 같은 상기한 항체 특징을 바꾸지는 않지만, 재조합 제조, 단백질 안정성의 수율을 향상시키거나 또는 정제를 용이하게 할 수 있다.

항-IGF-IR 항체의 적합한 배열을 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 또한, 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 향상시키고, 비정상 교차 결합을 억제할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합은 항체에 첨가되어 그의 안정성을 향상시킬 수 있다 (특히 본 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

항체의 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 본래 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 변경시킨다는 것은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분을 삭제하고/하거나 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미한다. 항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 부분의 부착을 언급한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌은 (여기서, X 는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임), 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 부분의 효소 부착을 위한 인지 서열이다. 그러므로, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열 중의 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 만든다. 본 항체에 글리코실화 부위를 첨가하는 것은, 하나 이상의 상기 기재한 트리펩티드 서열 (N-연결된 글리코실화 부위에 대한) 을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 수행된다.

항-IGF-IR 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 상기 방법은 천연 공급원 (자연적으로 발생한 아미노산 서열 변이의 경우) 으로부터의 단리 또는 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 특정 부위) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 인간화 항-IGF-IR 항체의 이전에 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 카세트(cassette) 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 화학치료제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성컨쥬게이트) 또는 세포독성제의 프로드러그(Prodrug) 와 같은 세포독성제와 접합된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트에 적합하다. 이러한 면역컨쥬게이트의 발생에 유용한 제제는 상기에 기재되어 있다. 사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 으로부터), 리신(ricin) A 쇄, 아브린(abrin) A 쇄, 모데신(modeccin) A 쇄, 알파-사르신(sarcin), 와니스 나무(Aleuritesfordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curtin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌(gelonin), 미토젤린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecene)을 포함한다.

항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2작용성 유도체; (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아트닌), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 와 같은 다양한 2작용성 단백질 커플링제를 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신(ricin) 면역독소는 Vitetta, E.S., 등, Science 238 (1987) 1098-1104 에서 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 이 항체에 대한 방사성뉴클레오티드의 공액을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026 참조.

공유적 개질의 또 다른 유형은 항체에 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 커플링하는 것을 포함한다. 상기 과정은 N- 또는 O-연결된 글리코실화를 위한 글리코실화능을 갖는 숙주 세포에서 항체의 제조가 필요하지 않아 유익하다. 사용되는 커플링 방식에 따라, 당은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 술프히드릴기, (d) 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것들과 같은 유리 히드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것들과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 상기 방법은 WO 87/05330, 및 Aplin, J.D., 및 Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981) 259-306 에서 기재되고 있다.

항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 부분의 제거를 화학적 또는 효소적으로 수행할 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 항체를 화합물 트리플루오로메탄술폰산, 또는 당량 화합물에 노출시키는 것을 필요로 한다. 상기 처리는 항체를 손상시키지 않으면서, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민) 을 제외하고 대부분 또는 모든 당을 절단한다. 화학적 탈글리코실화는 Sojahr, H.T., 및 Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 및 Edge, A.S., 등 Anal. Biochem 118 (1981) 131-137 에 의해 기재된다. 항체 상의 탄수화물 부분의 효소적 절단은, Thotakura, N.R., 및 Bahl, O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359 에 의해 기재되는 바와 같이 다양한 내- 및 외-글리코시다아제의 사용에 의해 수행할 수 있다.

항체의 공유적 개질의 또 다른 유형은 미국 특허 번호 제 4,640,835 호; 제 4,496,689 호; 제 4,301,144 호; 제 4,670,417 호; 제 4,791,192 호 또는 제 4,179,337 호에 언급된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌의 하나에 항체를 연결하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들어, 본 발명에 따른 인간 항 IGF-IR 항체를 발현하는 유전자도입 마우스로부터 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 단리된 B 세포는 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들어, IGF-IR 항원의 정제 또는 농축된 제조물 및/또는 IGF-IR 을 발현하는 세포로 면역화된 유전자도입 마우스로부터 수득된다. 바람직하게는, 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들어, 유전자도입 마우스는 본 발명의 모든 또는 일부 항체를 코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 그 다음, 단리된 B-세포는 불멸화되어, 인간 항-IGF-IR 항체의 공급원 (예를 들어, 하이브리도마) 을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 제조할 수 있는 하이브리도마를 제공한다. 한 구현예에서, 하이브리도마는 불멸 세포에 융합된 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들어, 본 발명의 모든 또는 일부 항체를 코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자도입 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함한다.

한 특정 구현예에서, 유전자도입 비-인간 동물은 본 발명의 모든 또는 일부 항체를 코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자도입 마우스이다. 유전자도입 비-인간 동물은 IGF-IR 항원의 정제 또는 농축된 제조물 및/또는 IGF-IR 을 발현하는 세포로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들어, 유전자도입 마우스는 IGF-IR 에 대한 인간 단일클론 항체의 IgG1 동종형을 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는 유전자도입 비-인간 동물, 예를 들어, 본 발명의 모든 또는 일부 항체를 코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자도입 마우스를, IGF-IR 항원의 정제 또는 농축된 제조물 및/또는 IGF-IR 을 발현하는 세포로 면역화하여 제조할 수 있다. 그 다음, 동물의 B 세포 (예를 들어, 비장 B 세포) 를 수득하고, 골수종 세포와 융합하여 IGF-IR 에 대한 인간 단일클론 항체를 분비하는 불멸, 하이브리도마 세포를 형성한다.

바람직한 구현예에서, IGF-IR 에 대한 인간 단일클론 항체는 마우스 면역계보다 인간 면역계의 부분을 갖는 유전자도입 마우스를 사용하여 발생될 수 있다. 본원에 "HuMAb" 마우스라고 언급되는 상기 유전자도입 마우스는, 내생 μ 및 κ 쇄 유전자좌(loci)를 비활성시키는 표적된 돌연변이와 함께, 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 (불변 영역 유전자) 를 포함하는 비재배열된 인간 면역글로불린 유전자를 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 소형유전자좌를 함유한다 (Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K 의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응해서, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 유전자도입은 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 겪어, 높은 친화성의 인간 IgG 단일클론 항체를 발생시킨다 (Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859; reviewed in Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Lonberg, N., 및 Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; 및 Harding, F., 및 Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546). HuMAb 마우스의 제조는, 그의 전문이 본원에 참조로써 모든 내용이 인용되는 Taylor, L., 등, Nucleic Acids Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., 등, International Immunology 5 (1993) 647-656; Tuaillon, N., 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993) 3720-3724; Choi, T.K., 등, Nature Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830; Tuaillon, N., 등, Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101; Taylor, L., 등, Int. Immunol. 6 (1994) 579-591; Lonberg, N., 및 Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; Harding, F., 및 Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546; Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 에서 기재되고 있다. 추가로, 미국 특허 번호 제 5,545,806 호; 제 5,569,825 호; 제 5,625,126 호; 제 5,633,425 호; 제 5,789,650 호; 제 5,877,397 호; 제 5,661,016 호; 제 5,814,318 호; 제 5,874,299 호; 제 5,545,807 호; 제 5,770,429 호; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; 및 WO 92/03918 참조.

IGF-IR 에 대한 완전한 인간 단일클론 항체를 발생시키기 위해, HuMAb 마우스를 Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 및 WO 98/24884 에 의해 기재되는 바와 같은 일반적인 방법에 따라, IGF-IR 항원의 정제 또는 농축된 제조물 및/또는 IGF-IR 을 발현하는 세포로 면역시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1차 면역에서 6-16 주 연령일 것이다. 예를 들어, 가용성 IGF-IR 항원의 정제 또는 농축된 제조물 (예를 들어, IGF-IR-발현 세포로부터 정제됨) 은 HuMAb 마우스에 복강 내로 면역화시키는데 사용할 수 있다. IGF-IR 항원의 정제 또는 농축된 제조물을 사용하는 면역이 항체를 야기하지 않는 경우, 마우스는 또한 IGF-IR 를 발현하는 세포, 예를 들어, 종양 세포주로 면역화되어 면역 반응을 촉진시킬 수 있다. 다양한 항원으로 누적된 실험은, 처음에 프로인드 완전 면역반응 항진제 중의 항원으로 복강내로 (i.p.) 면역시킨 후, 이어서 프로인드 불완전 면역반응 항진제 중의 항원으로 격주로 i.p. 면역 (예를 들어, 총 6 주 이하) 시킨 경우, HuMAb 유전자도입 마우스가 가장 잘 반응한 것을 나타낸다. 면역 반응은 면역 프로토콜 과정이 지난 후, 후안와 혈액에 의해 수득되는 혈장 샘플로 모니터링할 수 있다. 혈장은 ELISA 에 의해 스크리닝할 수 있고, 충분한 적정농도의 항-IGF-IR 인간 면역글로불린을 갖는 마우스를 상응하는 B 세포의 불멸화를 위해 사용할 수 있다. 마우스를 희생시키고, 비장 및 림프절을 제거하기 3 내지 4 일 전에, 마우스를 항원으로 정맥내 증강시킬 수 있다. 각 항원에 대한 2-3 개의 융합이 수행하기 위해 필요할 것으로 예상된다. 다수의 마우스가 각 항원에 대해 면역화될 것이다. 예를 들어, HCo7 및 HCo12 계통의 총 12 마리 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다.

HCo7 마우스는, 그의 내생 경쇄 (카파) 유전자 중의 JKD 붕괴 (Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830 에서 기재되는 바와 같은), 그의 내생 중쇄 유전자 중의 CMD 붕괴 (WO 01/14424 의 실시예 1 에서 기재되는 바와 같은), KCo5 인간 카파 경쇄 형질전환 유전자 (Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 에서 기재되는 바와 같은), 및 HCo7 인간 중쇄 형질전환 유전자 (미국 특허 번호 제 5,770,429 호에서 기재되는 바와 같은) 를 갖는다.

HCo12 마우스는, 내생 경쇄 (카파) 유전자 중의 JKD 붕괴 (Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830 에서 기재되는 바와 같은), 그의 내생 중쇄 유전자 중의 CMD 붕괴 (WO 01/14424 의 실시예 1 에서 기재되는 바와 같은), KCo5 인간 카파 경쇄 형질전환 유전자 (Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 에서 기재되는 바와 같은), 및 HCo12 인간 중쇄 형질전환 유전자 (WO 01/14424 의 실시예 2 에서 기재되는 바와 같은) 를 갖는다.

마우스 림프구는 표준 프로토콜에 기초하여 PEG 를 사용하여 단리되고, 마우스 골수종 세포주와 융합되어, 하이브리도마를 발생할 수 있다. 그 다음, 생성 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 제조를 위해 스크리닝한다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 및 림프절-유도된 림프구의 단일 세포 현탁액을 SP 2/0 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581) 의 1/6 수에 50% PEG 로 융합시킨다. 세포를 평바닥 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 에 대략 2 x 10⁵ 으로 평판배양시킨 후, 선별 배지에서 약 2주 인큐베이션한다.

그 다음, 개별 웰(well)을 인간 항-IGF-IR 단일클론 IgM 및 IgG 항체에 대한 ELISA 에 의해 스크리닝한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10-14 일 후, 배지를 분석한다. 항체 분비 하이브리도마를 재평판배양시키고, 다시 스크리닝하고, 여전히 인간 IgG 에 대해 양성인 경우, 항-IGF-IR 단일클론 항체를, 제한 희석에 의해 적어도 2번 서브클로닝 할 수 있다. 그 다음, 안정적인 서브클론을 시험관 내 배양시켜, 특징화를 위해 조직 배양 배지에서 항체를 제조한다.

CDR 서열이 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 인간 항체로부터의 골격 서열상에 본 발명에 따른 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써 본 발명에 따른 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, Riechmann, L., 등, Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., 등, Nature 321 (1986) 522-525; 및 Queen, C., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989) 10029-10033 참조). 이러한 골격 서열은 생식선 인간 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 테이타베이스로부터 수득될 수 있다. 상기 생식선 서열은 완전하게 어셈블리된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문에, 성숙한 항체 유전자 서열과 상이할 것이며, 이것들은 B 세포 성숙 동안 V(D)J 조이닝(joining)에 의해 형성된다. 생식선 유전자 서열은 또한 각각의 가변 영역을 고르게 가로지른 곳에서 높은 친화성의 2차 레파토리 항체의 서열과 상이할 것이다.

본 발명은 바람직하게는 IGF-IR 에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 단편을 포함하고, 상기 폴리펩티드는, 하기 a) 및 b) 로 이루어진 군으로부터 선택되는, IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합을 억제한다:

a) 서열 목록 번호 : 1 또는 3 의 CDR CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

b) 서열 목록 번호 : 2 또는 4 의 CDR CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.

재건된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화, 및 전사 종결의 서열과 조합하여, 발현 벡터 구성체를 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구성체를 단일 벡터내로 조합하고, 그 다음 융합된 숙주 세포내로 공동-트랜스펙션, 일련의 트랜스펙션, 또는 개별 트랜스펙션시켜, 두개의 모든 쇄를 발현하는 단일 숙주 세포를 형성한다.

따라서, 본 발명은, 하기 a) 및 b) 를 코딩하는 핵산을 발현하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 재조합 인간 항체의 제조 방법을 제공한다:

a) 서열 목록 번호 : 1 또는 3 의 CDR CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

b) 서열 목록 번호 : 2 또는 4 의 CDR CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.

본 발명은 바람직하게는 샘플의 IGF-IR 과 본 발명에 따른 항체 사이의 결합을 측정하는 면역학적 어세이에 의한, 시험관 내 IGF-IR 의 진단을 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형된, 본 발명의 인간 단일클론 항체의 하나 또는 조합물, 또는 그의 항원-결합 부분을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 병용 요법으로, 즉, 기타 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 병용 요법은 본 발명의 조성물을 하나 이상의 항종양제 또는 기타 통상적인 요법과 함께 포함할 수 있다 .

"화학치료제" 는 암치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예로는 아드리아마이신(Adriamycin), 독소루비신(Doxorubicin), 5-플루오로우라실(Fluorouracil), 사이토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 티오테파(Thiotepa), 택소테레(Taxotere: 도세택셀(docetaxel)), 부술판(Busulfan), 젬시타빈(Gemcitabine), 시톡신(Cytoxin), 택솔(Taxol), 메토트레세이트(Methotrexate), 시스플라틴(Cisplatin), 멜팔란(Melphalan), 빈블라스틴(Vinblastine), 블레오마이신(Bleomycin), 에토포시드(Etoposide), 이포스파미드(Ifosfamide), 마이토마이신(Mitomycin) C, 마이토잔트론(Mitoxantrone), 빈크레이스틴(Vincreistine), 비노렐빈(Vinorelbine), 카르보플라틴(Carboplatin), 테니포시드(Teniposide), 다우노마이신(Daunomycin), 카르미노마이신(Carminomycin), 아미노프테린(Aminopterin), 닥티노마이신(Dactinomycin), 마이토마이신(Mitomycins), 에스페라미신(Esperamicins) (미국 특허 번호 제 4,675,187 호 참조), 멜팔란 및 기타 관련된 질소 겨자를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "세포독성제" 는, 세포의 기능을 억제 또는 예방하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 성분을 언급한다. 상기 용어는 방사성 동위원소, 화학치료제, 및 박테리아 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편과 같은 독소를 포함하는 것으로 의도된다.

본 출원에 사용된 바와 같이 용어 "프로드러그" 는, 모약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고, 보다 활성인 모 형태로 효소적으로 활성화 또는 전환될 수 있는, 약제학적 활성 성분의 전구체 또는 유도체 형태를 언급한다. 예를 들어, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, 페이지 375-382, 제 615 판 Meeting Belfast (1986), 및 Stella 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 등, (ed.), 페이지 247-267, Humana Press (1985) 참조. 본 발명의 프로드러그는, 더욱 활성인 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트-함유 프로드러그, 티오포스페이트-함유 프로드러그, 술페이트-함유 프로드러그, 펩티드-함유 프로드러그, D-아미노산-개질된 프로드러그, 글리코실화 프로드러그, (β-락탐 고리 프로드러그, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드러그 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드러그, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드러그를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위해 프로드러그 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는, 상기 기재된 화학치료제들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체" 는 생리학적으로 융화성인, 임의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아제 및 항곰팡이제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해) 에 적합하다.

"약제학적으로 허용가능한 염" 은 항체의 바람직한 생물 활성을 유지하고, 임의의 바람직하지 않은 독소 효과를 부여하지 않는 염을 언급한다 (예를 들어, Berge, S.M., 등, J. Pharm. Sci. 66 (1977) 1-19 참조). 이러한 염이 본 발명에 포함된다. 이러한 염의 예는 산 첨가염 및 염기 첨가염을 포함한다. 산 첨가염은 염산염과 같은 비독성 무기산으로부터 유도된 것들을 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 당업자에 의해 평가된 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 다양할 것이다.

본 발명의 화합물을 특정 투여 경로에 의해 투여하기 위해서는, 그의 비활성화를 예방하기 위한 물질로 화합물을 코팅하거나, 또는 화합물과 함께 공동-투여하는 것이 필수적일 것이다. 예를 들어, 화합물을 적절한 담체, 예를 들어, 리포좀, 또는 희석제 내에서 환자에게 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 수용성 완충액을 포함한다.

약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한, 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 성분을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이 구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여됨" 은, 장 및 국소 투여가 아닌, 통상 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 제한없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 초내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지, 피하, 표피하, 관절내, 관절낭하, 거미 망막하, 척수강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.

상기 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재 방지는 상기 멸균 과정 및, 다양한 항박테리아제 및 항곰팡이제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 함유물 모두에 의해 확실해질 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 주사가능한 약제학적 형태의 지연된 흡수를, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제의 함유에 의해 야기할 수 있다.

선택된 투여 경로에 관계 없이, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물은, 당업자에 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용가능한 투약 형태로 제형된다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 성분의 실제 투약 농도는, 환자에 대해 독성 없이, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 바람직한 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 다양화될 수 있다. 선택되는 투약 농도는, 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 병용으로 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반 건강상태 및 이전 병력, 등 의약 업계에 잘 공지된 요소를 포함하는 다양한 약동학적 요소에 따를 것이다.

조성물은, 조성물을 주사기로 전달가능한 정도로 멸균되고 유동적이어야만 한다. 물 외에, 담체는 바람직하게는 등장 식염수 완충액이다.

적합한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 조성물 내에 등장제, 예를 들어, 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 폴리알콜, 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다.

하기 실시예, 참조, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 이의 참 범위는 첨부된 청구항에서 언급된다. 변경은 본 발명의 정신으로부터 벗어나지 않으면서 언급되는 과정으로 행해질 수 있는 것으로 이해된다.

서열 목록의 간단한 설명

서열 목록 번호: 1 내지 4 항체 18 및 22 의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노 서열

서열 목록 번호: 5 및 6 인간 불변 영역 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노 서열

도 1 저밀도 및 고밀도 세포 배양에서의 IGF-IR 표면 발현.

도 2 3D 배양에서 증식 억제에 대한 WST 어세이 (NCI H322M 세포).

도 3 3D 배양에서 증식 억제에 대한 콜로니 형성 어세이 (현미경 사진).

도 4 3D 배양에서 증식 억제에 대한 콜로니 형성 어세이 (정량화). ctr = 대조군; Cl 18 = 항체 18.

도 5 항체 18 및 22 에 의한 HT29 세포에 대한 I¹²⁵-IGF-I 결합의 억제 (IC₅₀ 값).

도 6 항체 18 에 의한 HT29 세포에 대한 I¹²⁵-IGF-II 결합의 억제.

도 7 항체 αIR3 에 의한 HT29 세포에 대한 I¹²⁵-IGF-II 결합의 억제.

도 8 IGF-I 유도된 IGF-IR 및 Akt/PkB 모두의 인산화의 차단.

도 9 항-hIGF-1R 항체에 의해 3T3-IR 세포에 대한 I¹²⁵-인슐린 결합이 억제되지 않음. (MAX w/o Ab: I¹²⁵-인슐린의 최대 결합; MIN: 1 μM 인슐린과 경쟁 후 최소 결합)

도 10 IGF-IR 과발현 3T3 세포 상에서 AK18 의 활성을 자극하지 않음.

도 11 인간 종양 세포 (HT29) 상에서 AK18 의 활성을 자극하지 않음.

도 12 시험관 내 항체 18 에 의한 H322N 세포 표면 상에 노출된 IGF-IR 의 하향조절.

도 13 AK18 로 처리, 제 1 기 종양 부피

도 14 젬시타빈과 함께 또는 없이 AK18 로 처리

도 15 AK18 로 처리, 제 1 기 종양 부피

실시예 1

항- IGF - IR 항체를 제조하는 하이브리도마 세포주의 발생

하이브리도마의 배양

발생된 HuMAb 하이브리도마를 37℃, 5% CO₂ 에서, 2 mM L-글루타민 (BioWhittaker) 및 4% Origen Cloning Factor (Igen, France) 가 보충된 Hybridoma Express Medium (PAA Laboratories GmbH, Austria) 중에서 배양하였다.

유전자도입 마우스의 면역 과정

10 마리의 HCo7 유전자도입 마우스 (수컷 4 마리 및 암컷 6 마리), 계통 GG2201 (Medarex, San Jose, CA, USA) 를, IGF-IR 에 대한 발현 벡터로 트랜스펙션시킨 1 x 10⁶ NIH 3T3 세포와, 20 ㎍ 의 IGF-IR 의 가용성 세포외부 도메인으로 교대 면역화시켰다. IGF-IR 발현 세포로 3번의 복강내 (IP) 면역 및 재조합 단백질로 꼬리 바닥에서 3번의 피하 (SC) 면역, 총 6번의 면역을 수행하였다. 제1차 면역을 위해, 100 ㎕ 의 1 x 10⁶ NIH 3T3 IGF-IR 세포를 100 ㎕ 프로인드 완전 면역반응 항진제 (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA) 와 혼합하였다. 모든 기타 면역을 위해, PBS 중의 100 ㎕ 의 세포를 사용하거나, 또는 재조합 단백질을 100 ㎕ 프로인드 불완전 면역반응 항진제 (ICFA; Difco) 와 혼합하였다.

항원 특이적 ELISA

면역화 마우스의 혈청 중의 항-IGF-IR 적정 농도를 항원 특이적 ELISA 에 의해 측정하였다. PBS 중의 1 ㎍/ml 의 농도로 IGF-IR 가용성 세포외부 도메인을, 96 웰 플레이트에 4℃ 에서 밤새, 또는 37℃ 에서 2시간 동안 코팅하였다. 그 후에, 웰을 PBSTC (0.05% Tween^®-20 및 2% 닭 혈청 (Gibco BRL) 이 보충된 PBS) 로 실온에서 1 시간 동안 차단하였다. 첫번째 탭(tap) 혈청을 PBSTC 중에서 1/50 로 희석하였고, 모든 다른 탭으로부터의 혈청을 PBSTC 중에서 1/100 으로 예비희석하고, 1/6400 이하로 단계 희석하였다. 희석된 혈청을 웰에 첨가하고, 37℃ 에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 예비-탭 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 200 ng/ml 염소 항-인간 IGF-IR (100 ㎍/ml) 을 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 플레이트를 PBST 로 두번 세척하고, PBSTC 중에서 1/2000 로 희석된 호스래디쉬 퍼록시다아제(horse radish peroxidase: HRP)-공액된 래트 항-인간 IgG F(ab')₂ (DAKO) 로, 37℃ 에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 PBST 로 2번 세척하고, 신선하게 제조된 ABTS^® 용액 (1 mg/ml) (ABTS: 2,2'-아지노 비스 (3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) 으로 어둠속에서 30분 동안 실온에서 (RT) 어세이를 현상하였다. 흡광도를 405 nm 에서 측정하였다.

FACS 분석

항원 특이적 ELISA 에 의한 측정외에, 면역된 마우스의 혈청 중의 항-IGF-IR 적정 농도를 또한 FACS 분석에 의해 측정하였다. NIH 3T3 IGF-IR 세포 및 트랜스펙션되지 않은 NIH 3T3 IGF-IR 세포를, 4℃ 에서 30분 동안 희석된 혈청과 함께 인큐베이션시켰다. 예비-탭 혈청을 음성 대조군으로 사용하였다. 처음에, 200 ng/ml 염소 항-인간 IGF-IR 을 양성 대조군으로 사용하였다. 세포를 1% 소 혈청 알부민 및 0.01% 아자이드로 보충된 PBS 중에서 3번 세척하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액 중에서 1/100 로 희석된 래트 항-인간 인간 IgG 의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-공액된 항원 결합 단편 (F(ab')₂ 단편) 과 함께, 4℃ 에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충액 중에서 2번 세척하고, 샘플을 FACSCalibur (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium) 상에서 분석 하였다.

마우스의 증강

항-IGF-IR 의 혈청 적정 농도가 충분하다고 발견될 경우, 마우스를 부가적으로 융합하기 4 및 3 일 전에 200 ㎕ PBS 중의 15 ㎍ 의 IGF-IR 세포외부 도메인으로 정맥내로 (i.v.) 2번 증강시켰다.

하이브리도마 발생

마우스를 희생시키고, 복부 대동맥 및 대정맥의 측면에 위치하는 비장 및 림프절을 수집하였다. 비장 세포와 림프절 세포 및 융합 파트너 SP 2.0 세포의 융합을, 표준 조작 과정에 따라 수행하였다.

κ- ELISA

융합으로부터 생성된 하이브리도마가 인간 항체를 발생시키는지를 측정하기 위해, κ-ELISA 를 수행하였다. ELISA 플레이트를 PBS 중에서 1/10000 로 희석된 래트 항-인간 IgG κ-경쇄 항체 (DAKO) 로 4℃ 에서 밤새 인큐베이션하여 코팅하였다. 웰의 내용물을 폐기한 후, 플레이트를 PBSTC 로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 차단하였다. 그 후에, 웰을 PBSTC 중에서 1/2 로 희석된 하이브리도마 배양 상층액으로 인큐베이션시켰다. PBSTC 중에서 1/2 로 희석된 배양 배지를 음성 대조군으로 사용하고, PBSTC 중에서 1/100 로 희석된 κ-경쇄 양성 마우스 혈청을 양성 대조군으로 사용하였다. 이어서, 웰을 3번 세척하고, PBSTC 중에서 1/2000 로 희석된 HRP-공액된 래트 항-인간 IgG F(ab')₂ (DAKO) 로 37 ℃ 에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 3번 세척하고, 신선하게 제조된 ABTS^® 용액 (1 mg/ml) 으로 어둠속에서 30분 동안 실온에서 (RT) 어세이를 현상하였다. 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기에서 405 nm 에서 측정하였다.

단일클론 항체 18 및 22 를 제조하였다.

실시예 2

IGF - IR 에 대한 항- IGF - IR 항체의 친화성의 측정

기구: BIACORE^® 3000

칩: CM5

커플링: 아민 커플링

완충액: HBS (HEPES, NaCI), pH 7.4, 25℃

친화성 측정을 위해, 항 인간 FCγ 항체 (토끼로부터) 를 IGF-IR 에 대한 항체의 제시를 위해 칩 표면에 커플링하였다. IGF-IR 세포외부 도메인을 용액중에 다양한 농도로 첨가하였다. 3 분의 IGF-IR-주사에 의해 회합을 측정하였고; 5 분 동안 칩 표면을 완충액으로 세척하여 해리를 측정하였다. 항체 18 및 22 에 대한 친화성 데이타를 표 1 에 제시하였다.

표 1 :

SPR (BIACORE^® 3000) 에 의해 측정된 친화성 데이타

항체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
18	1.49 x 105	1.03 x 10-7	6.95 x 10-13
22	1.47 x 105	9.64 x 10-5	6.56 x 10-10

실시예 3

세포-세포-접촉 (3D 배양) 에서 종양 세포의 3차원 성장 및 IGF -I 수용체의 과발현

재료 및 방법:

IGF-IR 표면 발현에 대한 효과를 연구하기 위해 NCI H322M 세포를 RPMI 배지중에서, 광학 등급 유리 커버 슬라이드 상에서 저밀도 또는 초과융합으로 배양하였다. 동시에, 대조군 (미처리 마우스) 으로부터 단리된 H322M 이종 이식 조직을 이소펜탄 중에 동결시켜 충격을 가하고, 크리오섹션(kryosection)을 5 ㎛ 두께로 절단하였다. 면역 형광 표지를, 마우스-항 IGF-IR 단일클론 항체 (αIR3, 5 ㎍/ml) 또는 본 발명에 따른 항체를 사용한 후, 이어서 Cy3 (Amersham Biosciences, GB) 또는 Alexa Fluor^® 488 (Molecular Probes, Inc., USA) 로 표지된 염소 항-마우스-항체 또는 염소 항-마우스 항체를 사용하여 수행하였다. 표본을 Leica SP2 공초점 현미경 상에서 영상화하거나, 또는 FACS 에 의해 분석하였다.

결과:

고밀도로 배양된 H322M 세포를 공초점 현미경에 의해 영상화할 경우, IGF-IR 이 특히 세포-세포 접촉의 부위에서 무리를 이룬다는 것이 명백해졌다. 생체내, 즉, 이종 이식 조직에서 성장한 H322M 세포와 비교할 경우, 표면 IGF-I 수용체의 기관과 관계되는 한, 밀도있게 빽빽한 시험관 내 배양과 현저한 유사점이 있었 다.

H322M 세포의 초과융합 배양에서 표면 IGF-I 수용체의 상향조절을 또한 FACS 에 의해 정량화하였다. 세포가 고밀도 조건하에서 성장할 경우, 뚜렷한 세포-세포 접촉이 없는 저밀도와 비교하면, IGF-I 수용체 표면 발현이 10 배 초과 증가하였다.

HT29, MDA231 및 MCF-7 과 같은 기타 종양 세포는 유사한 행동 양식을 나타내었으며, 이는 세포-세포 접촉 부위를 만드는 세포 표면 상의 IGF-I 수용체의 상향조절이 H322M 세포의 특이적 특징이 아니라, 생체내에서도 발견되는 기관과 같은 더 많은 조직의 일반적인 특성임을 나타내었다 (도 1).

실시예 4

항체 18 로 처리시 3D 배양에서 IGF - IR 를 발현하는 H322M 종양 세포의 성장 억제 ( WST - 어세이 )

플라스틱 표면에 부착하는 것을 방지하기 위해 폴리-HEMA (폴리(2-히드록시에틸메타크릴레이트)) 코팅된 디쉬 상에서 RPMI1640/0.5% FCS 배지 중에서 H322M 세포를 배양하였다. 상기 조건하에서 H322M 세포는 3차원으로 성장하는 밀도있는 스페로이드(spheroid)를 형성하였다 (고정 독립성(anchorage independence)이라고 불리는 특성). 상기 스페로이드는 그 자리에서의 고형 종양의 3차원 조직학구조(histoarchitecture) 및 기관과 밀접하게 닮았다. 0-240 nM 로 증가하는 양의 항체의 존재하에서 스페로이드 배양물을 5 일간 인큐베이션시켰다. WST 전환 어세이를 사용하여 성장 억제를 측정하였다. H322M 스페로이드 배양물을 상이한 농도의 항체 18 (1-240 nM) 로 처리한 경우, 투여량 의존적 성장 억제를 관찰할 수 있었다 (도 2).

실시예 5

3D 배양에서 IGF - IR 을 발현하는 H322M 종양 세포의 성장 억제 ( 콜로니 형성 어세이)

플라스틱 표면에 부착하는 것을 방지하기 위해 폴리-HEMA 코팅된 디쉬 상에서 RPMI1640/10% NCS 배지 중에서 H322M 세포를 배양하였다. 상기 조건하에서 H322M 세포는 3차원으로 성장하는 밀도있는 스페로이드를 형성하였다 (고정 독립성이라고 불리는 특성). 상기 스페로이드는 그 자리에서의 고형 종양의 3차원 조직학구조 및 기관을 나타낸다. 0-7.5 ㎍/ml 로 증가하는 양의 항체의 존재하에서 스페로이드 배양을 5-10 일간 인큐베이션시켰다. <HBV> 단일클론 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 위상차를 이용하는 역위현미경 (Zeiss Axiovert) 상에서 콜로니를 영상화하였고, 자동화 이미지 시스템 (MetaMorph) 을 사용하여 수를 셌다. H322M 스페로이드 배양물을 상이한 농도 (0.5-7.5 ㎍/ml) 의 항체 18 로 처리한 경우, 투여량 의존적 성장 억제를 관찰할 수 있었으며, 반면 대조군 항체 <HBV> 는 효과가 거의 없거나 또는 아예 없었다. 콜로니의 수 및 크기 모두가 7.5 ㎍/ml 의 항체 18 로 처리한 배양물에서 명백하게 감소하였다 (도 3).

직경 100 ㎛ 초과의 콜로니의 정량 분석은, 콜로니의 수가 0.5 ㎍/ml 의 항체 18 로 처리한 배양물에서 약 66% 감소하였음을 나타내었다 (도 4).

실시예 6

IGF - IR 을 발현하는 종양 세포에 대한 IGF -I 및 IGF - II 의 결합의 억제

본 발명의 항체의 IGF-I 수용체 (IGF-IR) 에 대한 리간드 IGF-I 및 IGF-II 의 결합 차단 능력을 측정하기 위해, 방사성 표지된 리간드 펩티드로 경쟁 실험을 수행하였다.

인간 종양 세포 (HT29, NCI H322M, 0.5 내지 1 x 10⁵/ml) 를, 2 mM L-Glutamin, 1x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 나트륨 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 10% 열 비활성화 FCS (PAA, Cat. No. A15- 771) 로 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 중에서 평판배양하였다. 각 실험에 대해 각 배지 내의 20 ml 세포를 T175 형의 6 개의 용기에 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 에서 2 일간 배양하여 융합 세포 단층을 수득하였다.

각각의 세포를 수집하기 위해, T175 플라스크 당 2 ml 의 1x Trypsin/EDTA (Gibco, Cat. No. 25300-054) 를 첨가하고, 세포의 탈착을 Zeiss Axiovert25 현미경으로 모니터링하였다. 세포를 수집하고, 상기 기재한 바와 같은 10% FCS 의 배지를 총 부피 50 ml 로 첨가하였다. 세포를 1000 rpm (Heraeus sepatech, Omnifuge 2.0 RS) 에서 10 분간 원심분리하여 재단리시키고, 50 ml 의 결합 완충액에 (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgS0₄, 1 mM EDTA, 10 mM D(+)글루코스, 15 mM NaAc, 100 mM Hepes pH 7.6, 1% BSA) 재현탁시켰다. 세포를 세어, 원심분리로 재단리시키고, 결합 완충액으로 1 x 10⁶ 세포/ml 로 조정하였다.

I¹²⁵-표지된 IGF-I 및 IGF-II 펩티드를 (Amersham, ~2000 Ci/mmol, Cat. No. IM172 및 IM238), 0.1% CH₃COOH 중에 용해시키고, 4 x 10⁵ 갯수/(분 x ml) 의 최종 활성으로 결합 완충액 중에서 희석시켰다. 특정 농도에 있는 75 ㎕ 의 항체를 25 ㎕ 의 예비희석된 I¹²⁵-표지된 IGF-I 또는 IGF-II 펩티드와 함께 200 ㎕ 의 세포 현탁액에 첨가하고, 4 ℃에서 3.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2000 rpm (Eppendorf, 5415C) 에서 5 분간 원심분리하여 재단리하고, 상층액을 제거하였다. 1 ml 결합 완충액 중에서 2번 세척한 후, 세포를 1 ml 결합 완충액 중에 재현탁시키고, 섬광 튜브에 옮기겼다. 세포 표면 수용체에 결합된 방사성 펩티드의 양을 섬광 카운터로 측정하였다.

IGF-I 수용체에 대한 IGF-I 및 IGF-II 펩티드의 결합을 억제하는 항체의 능력을 나타내는, 결과 IC₅₀ 곡선을 도 5 및 도 6 에 제시하였다. 항체 18 에 대한 평균 IC₅₀ 값은 0.3 nM 이다. 항체 αIR3 에 대한 결과를 도 7 에 나타내었다. IGF-II 결합에 대한 검출가능한 억제를 관찰할 수 없었다.

실시예 7

IGF - IR 결합에 대한 항체 경쟁 어세이

항-IGF-IR 단일클론 항체의 에피토프 맵핑을 위해, 친화성 측정 (실시예 2) 에 대한 것과 유사한 형식을 선택하였으나, IGF-IR 를 실온 (RT) 에서 용액 중의 항체로 0.5 시간 이상 예비-인큐베이션시켰다. 혼합물을 주사하고, IGF-IR 결 합 (또는 억제) 을 검출하였다. 상기 어세이는 IGF-IR 결합에 대한 단일클론 항체의 상호 억제 활성을 측정할 수 있다. 본 발명의 항체가 IGF-IR 에 대한 결합에 대해, aa 217-274 에 결합한다고 공지된 항체, αIR3 과 경쟁한다는 것을 발견하였다 (Gustafson, T.A., 및 Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667).

실시예 8

IGF -I 매개된 IGF - IR 및 Akt / PKB 인산화의 억제

본 발명의 항체가 IGF-I 수용체 (IGF-IR) 의 활성화 및 인산화를 억제하는 능력을 측정하기 위해, 결쟁 실험을 IGF-I 펩티드로 수행하고, 그 다음 인산화된 티로신에 특이적 항체로 웨스턴 블롯팅 분석을 하였다.

인간 종양 세포 (HT29, NCI H322M, 5 x 10⁴/ml) 를, 2 mM L-Glutamin, 1x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 나트륨 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 0.5% 열 비활성화 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 로 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 중에서 평판배양하였다. IC₅₀ 값의 측정을 위해, 각 실험에 대해 12 웰 플레이트를 개별 배지 중에서 1 ml 세포로 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 에서 2 일간 배양하였다.

저농도 혈청 배지로 48 시간의 배양 후, 배지를 조심스럽게 제거하고, 개별 매질 중에 상이한 농도의 희석된 항체로 교체하였다. 37℃, 5% CO₂ 에서 5분 인큐베이션시킨 후, IGF-I 펩티드를 최종 농도 2 nM 로 첨가하고, 세포를 상기 언급 한 조건하에서, 10 분간 다시 인큐베이션시켰다. 배지를 흡인에 의해 조심스럽게 제거하고, 웰 당 100 ㎕ 의 냉각 용해 완충액을 첨가하였다 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% Triton^®-X100, 100 mM NaF, 10 mM Na₄P₂0₇, Complete^® 프로티아제 억제제). 세포를 세포 스크래퍼(scraper) (Corning, Cat. No. 3010) 를 사용하여 박리시키고, 웰 내용물을 에펜도르프(Eppendorf) 반응 튜브에 옮겼다. 4℃, 13000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 세포 단편을 제거하고, 상층액의 절반을 1:1 (v/v) 비율로 2x Laemmli 샘플 완충액에 첨가하였다. IGF-IR 의 면역침강을 위해, 1 ㎕ 의 IGF-IRβ 에 대한 폴리클론 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies) 또는 인간 IGF Type 1 수용체의 세포외부 도메인 (α-쇄) 의 아미노산 440-586 내의 에피토프를 인지하는 쥣과 단일클론 항체 (IgG1) 를 (mAb 24-55, GroPep) 첨가하기 바로 전에, 세포 용해물의 잔여 상층액을 정화 스핀 (4℃, 13000 rpm 에서 10 분) 시켰다. 4℃, 회전 에펜도르프 반응 튜브에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 25 ㎕ Protein G Sepharose^® 비드 (Amersham Biosciences, Cat. No. 17-0618-01) 를 첨가한 후, 4℃ 에서 1 시간의 추가 단계의 인큐베이션을 시켰다. 결합된 항체-단백질-복합체와 함께 비드를 원심분리에 의해 단리하고 (4℃, 2000 rpm 에서 1분), 세척 완충액 (오직 0.1% Triton^®-X100 의 용해 완충액) 으로 3번 세척하였다. Laemmli 샘플 완충액 중의 비드를 끓인 후, 세포 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 반건조 웨스턴 블롯팅에 의해 니트로셀룰로오스 막 (PROTRAN^®BA 85, Schleicher&Schuell) 으로 옮겼다.

포스포티로신 특이적 항체 (Upstate, clone 4G10, Cat. No. 05-321) 를 사용하여 면역 정제된 IGF-IR 의 인산화 상태를 측정하였다. 인산화된 Akt/PKB 의 검출을 위해, 인산화된 Ser473 에 대해 특이성을 갖는 항체 (Cell Signalling, Cat. No. 9271) 를 사용하였다.

IGF-IR 및 Akt/PKB 모두의 IGF-I 유도된 인산화의 차단을 관찰한 것을 도 8 에 제시하였다.

실시예 9

시험관 내 IGF - IR 의 항체 매개된 하향조절의 유도

종양 세포에서 IGF-I 수용체 (IGF-IR) 의 양에 대한 본 발명의 항체의 효과를 측정하기 위해, IGF-IR 특이적 항체로 시간 경과 실험 및 연이은 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다.

인간 종양 세포 (HT29, 5 x 10⁴/ml) 를, 2 mM L-Glutamin, 1x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 나트륨 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 10% 열 비활성화 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 로 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 중에서 평판배양하였다. 각 인큐베이션 기간 동안, 각 실험에 대해 12 웰 플레이트를 개별 배지 중에서 1 ml 세포로 인큐베이션하고, 37℃, 5% CO₂ 에서 2 일간 배양하였다.

배지를 조심스럽게 제거하고, 각 배지 중에 희석된 상이한 농도의 항체로 교체하였다. 2개 대조군 웰에, 배지를 항체 없는 배지 또는 대조군 항체 (AB-1, Oncogene, Cat. No. GR11) 가 있는 배지로 교체하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂ 에서 인큐베이션하고, 개개의 플레이트를 15 분, 24 시간 및 48 시간 후에 추가 과정을 위해 꺼냈다.

배지를 흡인에 의해 조심스럽게 제거하고, 웰 당 100 ㎕ 의 냉각 용해 완충액을 첨가하였다 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1 % Triton^®-X100, 100 mM NaF, 10 mM Na₄P₂0₇, Complete^® 프로티아제 억제제). 세포를 세포 스크래퍼 (Corning, Cat. No. 3010) 를 사용하여 박리시키고, 웰 내용물을 에펜도르프 반응 튜브에 옮겼다. 4℃, 13000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리에 의해 세포 단편을 제거하고, 상층액을 1:1 (v/v) 비율로 2x Laemmli 샘플 완충액에 첨가하였다. 세포 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 반건조 웨스턴 블롯팅에 의해 니트로셀룰로오스 막 (PROTRAN^®BA 85, Schleicher&Schuell, CatNo. 10 401196) 으로 옮겼다.

IGF-IR 에 특이적인 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Cat. No. sc- 713) 를 사용하여, IGF-IR 의 단백질 농도를 측정하였다.

항체 첨가 후 24 시간 미만 후에 본 발명의 항체에 의해 유도된 IGF-IR 의 하향조절을 관찰하였다.

실시예 10

인간 인슐린 수용체를 발현하는 3 T3 -세포에 대한 인슐린 결합의 억제

본 발명의 항체가 또한 인슐린 수용체 (IR) 에 대한 인슐린의 결합을 차단하는 지를 측정하기 위해서, 방사성 표지된 리간드 펩티드로 경쟁 실험을 수행하였다.

재조합으로 많은 수의 (>10⁵) 인간 IR 을 발현하는 3T3 세포 (1 x 10⁵/ml) 를 2mM L-Glutamin (Gibco, Cat. No. 25030-024) 및 10% 열 비활성화 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 로 보충된 고농도 글루코스 (PAA, Cat. No. E15-009) 의 MEM Dulbecco 배지 (DMEM) 중에서 평판배양하였다. 각 실험에 대해 각 배지 내의 20 ml 세포를 T175 형의 6 개의 용기에 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 에서 2 일간 배양하여 융합 세포 단층을 수득하였다.

개별 세포를 수집하기 위해, T175 플라스크 당 2 ml 의 1x Trypsin/EDTA (Gibco, Cat. No. 25300-054) 를 첨가하고, 세포의 탈착을 현미경으로 모니터링하였다. 세포를 수집하고, 상기 기재한 바와 같은 10% FCS 의 배지를 총 부피 50 ml 로 첨가하였다. 세포를 1000 rpm 에서 10 분간 원심분리하여 재단리시키고, 50 ml 의 결합 완충액에 (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgS0₄, 1 mM EDTA, 10 mM D(+)글루코스, 15 mM NaAc, 100 mM Hepes pH 7.6, 1% BSA) 재현탁시켰다. 세포를 세어, 원심분리로 재단리시키고, 결합 완충액으로 1 x 10⁶ 세포/ml 로 조정하였 다.

I¹²⁵-표지된 인슐린 펩티드를 (Amersham, Cat. No. IM166, ~2000 Ci/mmol), 0.1% CH₃COOH 중에 용해시키고, 4 x 10⁵ 갯수/(분 x ml) 의 최종 활성으로 결합 완충액 중에서 희석하였다. 75 ㎕ 의 항체를, 25 ㎕ 의 예비희석된 I¹²⁵-표지된 인슐린 펩티드와 함께 200 ㎕ 의 세포 현탁액에 첨가하고 (최종 항체 농도 200 nM), 4 ℃에서 3, 5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여 재단리하고, 상층액을 제거하였다. 1 ml 결합 완충액 중에서 2번 세척한 후, 세포를 1 ml 결합 완충액 중에 재현탁시키고, 섬광 튜브에 옮기겼다. 세포 표면 수용체에 결합된 방사성 펩티드의 양을 섬광 카운터로 측정하였다.

결과는 본 발명의 항체가 인슐린 수용체에 대한 인슐린 리간드의 결합을 간섭하지 않는다는 것을 나타낸다 (도 9).

실시예 11

IGF - IR 및 Akt / PKB 인산화를 자극하지 않음

본 발명의 항체의 IGF-IR 자극 활성을 배제하기 위해서, IGF-I 리간드의 부재에서, 그러나 본 발명의 항체 및 참조 항체 (αIR3, Oncogene, Germany) 의 존재하에 IGF-IR 의 인산화를 측정하였다. 이는 인산화-상태 특이적 항체로 웨스턴-블롯팅 분석하여 수행하였다. IGF-IR 로 트랜스펙션된 3T3 세포 (ATCC CRL 1658) (5 x 10⁴ 세포/ml, Pietrzkowski, Z., 등, Cell Growth Differ. 4 (1992) 199-205) 를 2mM L-Glutamin (Gibco, Cat. No. 25030-024) 및 0.5% 열 비활성화 FCS (PAA, Cat. No. A15-771) 로 보충된 고농도 글루코스 (PAA, Cat. No. E15-009) 의 MEM Dulbecco 배지 (DMEM) 중에 또는 인간 종양 세포 (HT29, NCI H322M, 5 x 10⁴/ml) 를, 2 mM L-Glutamin, 1x 비필수 아미노산 (Gibco, Cat. No. 11140-035), 1 mM 나트륨 피루베이트 (Gibco, Cat. No. 11360-039) 및 0.5% 열 비활성화 FCS (PAA, Cat. No. A15- 771) 로 보충된 RPMI 1640 배지 (PAA, Cat. No. E15-039) 중에서 평판배양하였다. IC₅₀ 값의 측정을 위해, 각 실험에 대해 개별 배지 내의 1 ml 세포를 12 웰 플레이트에 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 에서 2 일간 배양하였다.

저농도 혈청 배지로 48 시간의 배양 후, 배지를 조심스럽게 제거하고, 개별 배지 중에서 희석된 상이한 농도의 항체로 교체시켰다. 세포를 상기 언급한 조건하에서 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 흡인에 의해 조심스럽게 제거하고, 웰 당 100 ㎕ 의 냉각 용해 완충액을 첨가하였다 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1 % Triton-X100, 100 mM NaF, 10 mM Na₄P₂0₇, Complete™ 프로티아제 억제제). 세포를 세포 스크래퍼 (Corning, Cat. No. 3010) 를 사용하여 박리시키고, 웰 내용물을 에펜도르프 반응 튜브에 옮겼다. 4℃, 13000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리 (Eppendorf centrifuge 5415R) 에 의해 세포 단편을 제거하고, 상층액의 절반을 1:1 (v/v) 비율로 2x Laemmli 샘플 완충액 에 첨가하였다. IGF-IR 의 면역침강을 위해, 1 ㎕ 의 IGF-IR 에 대한 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, CatNo. sc-713 또는 mAb 24-55, GroPep, CatNo. MAD1) 를 첨가하기 바로 전에, 세포 용해물의 잔여 상층액을 정화 스핀 (4℃, 13000 rpm 에서 10 분) 시켰다. 4℃, 회전 에펜도르프 반응 튜브에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 25 ㎕ Protein G Sepharose™ 비드 (Amersham Biosciences, Cat. No. 17-0618-01) 를 첨가한 후, 4℃ 에서 1 시간의 추가 단계의 인큐베이션을 시켰다. 결합된 항체-단백질-복합체와 함께 비드를 원심분리에 의해 단리하고 (4℃, 2000 rpm 에서 1분), 세척 완충액 (오직 0.1% Triton^®-X100 의 용해 완충액) 으로 3번 세척하였다. Laemmli 샘플 완충액 중의 비드를 끓인 후, 세포 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 반건조 웨스턴 블롯팅에 의해 니트로셀룰로오스 막 (PROTRAN^®BA 85, Schleicher&Schuell, CatNo. 10 401196) 으로 옮겼다.

포스포티로신 특이적 항체 (Upstate, clone 4G10, CatNo. 05-321, 티로신-인산화된 단백질을 인지함) 를 사용하여 면역 정제된 IGF-IR 의 인산화 상태를 측정하였다. 인산화된 Akt/PKB 의 검출을 위해, 인산화된 Ser473 에 대해 특이성을 가진 Akt1 에 대한 항체 (Cell Signalling, Cat. No. 9271) 를 사용하였다.

IGF-IR 의 신호 경로에서 Akt/PKB 키나아제 하류가, 5 nM 초과의 농도에서 참조 항체에 의해 명백하게 활성화되었지만, 10,000 nM 이하의 농도에서 본 발명의 항체에 의해서 활성화되지 않는 것을 관찰하였다. 결과를 도 10 및 도 11 에 제시하였다 (HM= 0.5% FCS 의 저농도 혈청 배지, HM+IGFI= 0.5% FCS 및 10 nM hIGF-I 의 저농도 혈청 배지).

실시예 12

H322M 이종 이식 모델에서 수용체 하향-조절의 유도

누드 마우스에 종양을 유도하고, 상이한 농도의 본 발명의 항체를 한번 처리하였다. 처리 24 시간 후, 종양을 추출하고, 액체 질소하에서 균질화시켰다. 냉각 용해 완충액을, 완충액-부피 대 종양-중량비를 3:1 로 첨가하고 (50 mM Hepes pH 7.2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% 글리세롤, 1% Triton-X100, 100 mM NaF, 1 mM Na₃V0₄, 10 mM Na₄P₂0₇, Complete™ 프로티아제 억제제, 1mM PMSF), 해동 종양 균질화제 (thawing tumor homogenate)와 완전히 혼합하였다. 빙상에서 15 분 동안 조직을 용해시킨 후, 4℃, 13000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리 (Eppendorf centrifuge 5415R) 에 의해 불용성 단편을 제거하였다. 샘플의 단백질 농도를 Micro BCA™ Reagents (Pierce) 로 측정하고, 용해 완충액을 첨가하여 동일한 농도로 조정하였다. 상층액의 일부를 1:1 (v/v) 비율로 2x Laemmli 샘플 완충액에 첨가하였다. 세포 단백질을 SDS-PAGE 에 의해 분리시키고, 반건조 웨스턴 블롯팅에 의해 니트로셀룰로오스 막 (PROTRAN BA 85, Schleicher&Schuell, CatNo. 10 401196) 으로 옮겼다. IGF-IR 특이적 항체 (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, CatNo. sc-713) 를 사용하여, IGF-IR 를 검출하였다.

본 발명의 항체로 처리시, 0.6 mg/kg 에서 평가된 EC50 으로 IGF-IR 농도의 의존성 감소를 관찰하였다 (도 12).

실시예 13

C1q 결합 ELISA

서론

본 발명에 따른 항체의 C1q 에 고정하는 능력을 측정하기 위해, ELISA 접근법을 사용하였다. C1q 는 적응성 면역계의 일부이고, 면역 복합체에 결합하여, 여러 치모겐 (zymogen) 의 일련의 활성화를 유발시킨다. 효소는 차례로, 염증 반응, 외부 또는 비정상 입자의 옵소닌현상(opsonization) 및 세포막의 용해의 개시할 수 있는 C3 분자의 분할을 야기한다.

원칙적으로, 항체의 농도 범위로 코팅된 ELISA 플레이트에 인간 C1q 를 첨가한다. C1q 결합을 인간 C1q 에 대한 항체 및, 이어서 퍼록시다아제-표지된 컨쥬게이트에 의해 검출한다.

재료 및 방법

항체 18, 8 및 23 과, 대조군 항체를, 10, 5, 1 및 0.5 ㎍/ml 의 농도로 시험하였다. 표 1 은 시험된 샘플의 특이성을 나타낸다. 음성 대조군으로, C1q 에 매우 약하게 결합하는 인간 IgG4 (CLB, 스탁 0.5 ㎍/ml) 를 사용하였다. 인간 IgG1 을 양성 대조군으로 혼입하였다. 2 ㎍/ml 의 농도의 인간 C1q 스탁 용액을 사용하였다. C1q 의 검출을 위해, C1q 에 대한 토끼 항체 (Dako) 및 호스래디쉬 퍼록시다아제 (Sigma) 와 공액된 항-토끼 IgG 항체를 사용하였다.

계산 및 곡선 피팅

시험된 HuMAb 의 최대 결합 (Bmax) 에 관련된 계산을 Graphpad Prism 소프트 웨어를 사용하는 비선형 회귀 곡선 피팅 (1 부위 결합) 을 사용하여 측정하였다.

결과

본 발명에 따른 항체는 인간 C1q 단백질의 용량 의존성 결합을 나타낸다. 405 nm (OD 405 nm) 에서의 광학 밀도를 HuMAb 농도에 대해 플롯시키고, 비선형 회귀를 사용하여 곡선을 피팅시켰다. 각 값에 대해 곡선의 상관 계수 (R2) 및 표준 편차와 함께, 최대 결합 (Bmax) 에 대한 가장 적합한 값을 표 2 에 열거하였다. 최저 상관 계수는 0.950 (IgG4) 의 값을 가졌다. 최대 결합이 0.279 로, 인간 IgG4 (음성 대조군) 는 C1q 의 최소 결합을 나타낸다. 각각 1.729 및 2.223 의 최대 결합을 보이는 바와 같이, 양성 대조군 IgG1 및 IgG3 모두는 C1q 에 결합하였다.

표 2

C1q 결합 ELISA (n=3) 에서 시험된 HuMAb 의 최대 결합 ( Bmax )

가장 적합한 값	Bmax	표준 편차 Bmax	적합의 양호성 R2	표준 편차 R2
IgG1	1.729	0.166	0.983	0.010
IgG3	2.223	0.947	0.995	0.005
IgG4	0.279	0.280	0.950	0.041
항체 18	1.670	0.601	0.988	0.005

상관 계수 (R2) 및 표준 편차를 또한 열거하였다.

인간 IgG4 (O.D. 가 0.279 인 음성 대조군) 의 C1q 결합과 비교하여, 시험된 모든 항체는 C1q 를 동등하게 고정시킬 수 있다.

실시예 14

항- IGF - IR HuMAb 에 의한 항체 매개된 효과기 기능의 측정

발생된 HuMAb 항체의 면역 효과기 메카니즘을 유도하는 역량을 측정하기 위해, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 연구를 수행하였다.

CDC (National Cancer Institute, 폐 선암 세포주) 를 연구하기 위해, H322M, H460 및 NIH 3T3 세포 (2-6 x 10⁶) 를 45-120 분 동안 100 μCi ⁵¹Cr (Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJS11) 으로 표지하였다. 표지한 후, 세포를 40 ml PBS 로 2번 세척하고, 1500 rpm 에서 3분간 스핀시켰다. 그 다음 세포를 50 ㎕ 의 부피로 둥근 바닥 플레이트에 웰 당 5,000 개로 평판배양하였다. 항체를 50 ㎕ 세포 배양 배지의 부피에서 25-0.1 ㎍/ml 에 이르는 범위의 최종 농도로 50 ㎕ 세포 현탁액에 첨가하고, 30-60 분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, PBS 로 2번 세척하여 여분의 항체를 제거하였다. 1/3 내지 1/30 로 희석된 100 ㎕ 의 활성 또는 비활성 (56℃ 에서 30 분) 울혈된 인간 혈청, 기니아 피그, 토끼 또는 누드 마우스 혈청을 첨가하고, 세포를 3 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 1500 rpm 에서 3 분 동안 스핀시켰다. 100 ㎕ 의 상층액을 모아서, 폴리프로필렌 튜브에 옮기고, γ-카운터로 수치를 측정하였다.

ADCC 에서 항체의 효과를 측정하기 위해, H322M, H460 및 NIH 3T3 또는 기타 적합한 IGF-IR 발현 세포 (2-6 x 10⁶) 를 100 μCi ⁵¹Cr 으로 45-120 분 동안 표지하고 (Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJS11), 40 ml 의 PBS 로 2번 세척하 고, 1500 rpm 에서 3분 동안 스핀시켰다. 세포를 50 ㎕ 의 부피로, 둥근 바닥 플레이트에 웰 당 5,000 개로 평판배양하였다. HuMAb 항체를 50 ㎕ 세포 배양 배지의 부피에서 25-0.1 ㎍/ml 에 이르는 범위의 최종 농도로 50 ㎕ 세포 현탁액에 첨가하고, 15 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 50 ㎕ 의 효과기 세포, 연막으로부터 신선하게 단리된 PBMC 또는 정제된 효과기 세포를, E:T 비율을 100: 1 내지 5:1 범위로 첨가하였다. 플레이트를 500-700 rpm 에서 2분간 원심분리시키고, 37℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 1500 rpm 에서 3 분간 스핀 다운시키고, 100 ㎕ 의 상층액을 수거하여, 폴리프로필렌 튜브에 옮기기고 γ-카운터로 수치를 측정하였다.

CDC 또는 ADCC 에 의한 세포 용해물의 정도를, 각 표적 세포로부터 방사성의 자발적 방출에 대해 보정된, 세제에 의해 용해된 표적 세포로부터 방사성의 최고 방출 % 로서 표현한다.

실시예 15

H322M 종양의 성장 억제

확립된 방법에 따라 흉선이 없는 누드 마우스에서 종양을 유도하여 생체내 항체 18 의 효과를 연구하였다. 인간 H322M NSCLC 세포를 6-7 주-연령의 흉선이 없는 누드 마우스 (nu/nu) 에 Matrigel 과 함께 피하로 공동주사하였다. 본 목적을 위해, 5 x 10⁶ H322M 세포를 100 ㎕ 의 배양 배지 중에 농축시키고, 100 ㎕ Matrigel 과 혼합하였다. 200 ㎕ 의 상기 혼합물을 마우스의 오른쪽 옆구리에 주사하였다. 종양 부피를 Geran 등 ("Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems", Cancer Chemother. Rep. 11.301, 1972) 에 의해 처음 공개된 공식인, 종양 부피 [mg] = (길이 x (넓이)²) 에 따라, Vernier 캘리퍼스(caliper)로 1주일에 2번씩 종양 직경을 측정하여 계산하였다. 항체를 10 ml/kg 으로 복강내로 (i.p.) 투여하였다. 2배된 부피에 2배 용량의 항체를 투여하여 치료를 시작하였다. 상기 기재한 방법과 같이 누드 마우스에 종양을 유도하였다. 종양이 평균 부피 160 mg 까지 자란 후, 마우스를 치료 제 1 일에 한번 제공된 적재 용량으로 12, 1.2 및 0.12 mg/kg 으로 시작하는 연속적인 용량으로 일주일에 한 번씩 6번 6, 0.6 및 0.06 mg/kg 의 항체를 복강내로 처리하였다. 도 13 은 동물을 희생시키고, 실험을 종료한 제 67 일까지의 치료 동안 측정된 종양 부피를 그림으로 나타낸 것이다. 실험은 루(rhu) 항-IGF-IR mAb 18 에 의한 IGF-IR 축의 차단이, 단독 제제를 6 및 0.6 mg/kg 로 투여한 경우, 항종양 효과를 야기한다는 것을 나타낸다. 반대로, 0.06 mg/kg 은 종양 성장에 효과가 없었다.

게다가 항체 18 을 동일한 모델에서 젬시타빈과 병용하여 시험하였다. 종양을 상기 기재한 바와 같이 유도하고, 모든 군에서 종양이 평균 170 mm³ 까지 구축되고, 자란 경우 치료를 개시하였다. 항체를 일주일에 한 번, 6 및 0.6 mg/kg, 및 0.6 mg 에서 62 mg/ kg 의 젬시타빈과 병용으로 i.p. 투여하였다. 젬시타빈을 한 주기, 즉, 3일 마다 한 번씩, 총 4번 투여하였다. 다시, 항체의 2배된 용량을 투여하여 치료를 시작하였다. 도 14 는 시간의 경과에 따른 다양한 치료와 관련된 종양 크기를 나타낸다. 실험은 7일 마다 한 번 투여된 항체 18 의 치료는, 스스로 종양 성장을 억제하고, 공지된 항대사 화합물인 젬시타빈의 효과를 증가시키는 것을 나타내었다.

실시예 16

3 T3 종양의 성장 억제

인간 IGF-IR 를 발현하는 쥣과 3T3 섬유아세포를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 15 에서 기재한 바와 같이 누드 마우스에 필수적으로 종양을 유도하였다. 대략 180 mg 의 종양이 구축된 마우스를 18, 6 또는 0.6 mg/kg 의 항체 18 로 일주일에 한 번씩 7 회, 복강내로 처리하였다. 다시, 적재 용량 (36, 12 및 1.2 mg/kg) 으로 제공된 항체의 2배된 용량으로 치료를 시작하였다. 실험은 항체의 처리에 의해, 1주에 한번 18 및 6 mg/kg 로 투여한 경우 종양 성장을 지연시킬 수 있다는 것을 나타낸다 (도 15).

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Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <400> 5 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 990 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 6 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 7 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tca cag gag agc gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 321 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (19)

1. IGF-IR 에 결합하고, IGF-I 및 IGF-II 가 IGF-IR 에 결합하는 것을 억제하며, 하기 a), b), c) 및 d) 를 특징으로 하는 항체:

   a) IgG1 동종형(isotype)의 것이고,

   b) IGF-IR 에 대한 IGF-I 의 결합의 억제 대 IGF-IR 에 대한 IGF-II 의 결합의 억제의 IC₅₀ 값의 비를 1:3 내지 3:1 로 나타내고,

   c) 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 HT29 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이(assay) 에서, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 5 nM 의 농도에서 IGF-IR 인산화를 80% 이상 억제하고,

   d) 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이에서, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 10 μM 의 농도에서 IGF-IR 인산화로 측정된 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않음.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 ADCC 에 의해 100 nM 의 상기 항체의 농도에서 24 시간 후 IGF-IR 발현 세포 표본의 20% 이상의 세포의 세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 항체가 CDC 에 의해 100 nM 의 상기 항체의 항체 농도에서 4 시간 후 IGF-IR 발현 세포 표본의 20% 이상의 세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항체.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10^-13 내지 10^-9 M (K_D) 의 친화성을 특징으로 하는 항체.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열 a) 및 b) 를 갖는 상보성 결정 영역 (CDR) 을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:

   a) 서열 목록 번호 : 1 또는 3 의 CDR CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

   b) 서열 목록 번호 : 2 또는 4 의 CDR CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리도마 세포주 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 또는 <IGF-1R> HUMAB Clone 22 (DSM ACC 2594) 로부터 수득될 수 있는 항체.
8. 약제학적 조성물의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 약제학적 유효량으로 함유하는 약제학적 조성물.
10. 하이브리도마 세포주 <IGF-1R> HUMAB Clone 18 (DSM ACC 2587) 및 <IGF-1R> HUMAB Clone 22 (DSM ACC 2594).
11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법.
12. 하기 a) 또는 b) 에 정의된 각각의 기타 항체 쇄와 함께 어셈블리할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (상기 폴리펩티드는 a) 또는 b) 중 어느 한쪽임):

    a) 서열 목록 번호 : 1 또는 3 의 CDR CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa 50-66) 및 CDR3 (aa 99-107) 을 포함하는 항체 중쇄;

    b) 서열 목록 번호 : 2 또는 4 의 CDR CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa 50-56) 및 CDR3 (aa 89-98) 을 포함하는 항체 경쇄.
13. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 12 항에 따른 핵산을 발현할 수 있는, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터.
14. 제 13 항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
15. IGF-IR 에 결합하고, IGF-IR 에 대한 IGF-I 및 IGF-II 의 결합을 억제하는 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제 11 항에 따른 중쇄를 코딩하는 핵산 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 발현시키고, 상기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
16. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 치료 유효량의 항체를 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 항종양 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 항체를 세포독성제, 그의 프로드러그 또는 세포독성 방사성요법과 병용으로 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. IGF-IR 에 대한 대다수의 항체로부터 IGF-IR 에 대한 하나의 항체의 선별 방법으로서, 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세 이를 상기 대다수의 항체로 수행하고, 상기 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로 측정된 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않는 항체를 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 0.5% 열 비활성화 우태혈청 (FCS) 을 함유하는 배지 중의 세포 당 IGF-IR 400,000 내지 600,000 분자를 제공하는 3T3 세포를 사용하는 세포 인산화 어세이를 대다수의 항체로 수행하고, 항체 없이 수행하는 이러한 어세이와 비교하는 경우, 10 μM 의 농도에서 PKB 인산화로 측정된 IGF-IR 자극 활성을 나타내지 않는 항체를 선별하여, IGF-IR 에 대한 대다수의 항체로부터 IGF-IR 에 대한 하나의 항체를 선별하고, 재조합 발현에 의해 상기 항체를 제조하고, 상기 항체를 회수하고, 약제학적으로 허용가능한 항진제 및/또는 보조제와 상기 항체를 병용하는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물의 제조 방법.

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