PL85201B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jeat sposób wytwarza¬ nia czystej i krystalicznej kalikreiny, stanowiacej mieszanine skladajaca sie ze skladników kalikre¬ iny A i B.

Dzialajac na wystepujacy w organizmie kinino- gen kalikreina uwalnia kininy, dzialajace na krazenie. Preparaty kalikreiny sitosuje sie wiec w terapii rózniorodnych zaburzen w ulkrwieniu (E. K. Frey, H. Krawt, B. Werle, Das Kallitorein- -Kinin^System und seine Inhibitoren, F. Enke, Stutltgart 19.08,, str. im.

Dotychczas stosowano w tym celu czesciowo oczyszczone preparaty kalikreiny z trzustki, sli¬ nianki podszczejkowej lub moczu.

Wiadomo, ze mozna wytworzyc preparaty kali¬ kreiny z trzustki, slinianki podszczekowej lub mo¬ czu. Znanych jest szereg sposobów wytwarzania czesciowo oczyszczonej kalikreiny, na przyklad Wedlug opisu patentowego RFN nr S&OiOT mozna poddac tenmolizie zaiwierajace kalikireine gruczo¬ ly w wodnej zawiesinie, w temperaturze 38^65°C i oddzielic warstwy wodne, zawierajace kalikre- ine, od nierozpuszczalnych skladników. Oelem wy¬ tworzenia czesciowo oczyszczonej kalikreiny moz¬ na równiez wedluig opisu patentowego RFN nir 910 51810 mocz oraz auitolizaty trzustki lub sli¬ nianki podszczejkowej wytracac wodnymi roztwo¬ rami soli olowiu lub cynku, oddzielic wytracony osad, rozpuscic go w roztworach buforu fosforano¬ wego, zwlaszcza w roztworach kwasnego fosfora- nu dwuanionowego, poddac roztwory dializie, za- tezyc dializat i wytracic substancje czynna z kon¬ centratów organicznymi rozpiiszczalnikaimi^ na przyklad etanolem lub acetonem.

Zanieczyszczone jeszcze preparaty kalikreiny mozna oczysdic dalej na przyklad wedlug opisu patentowego RFN nr 11!02 07B, adsorfoujac kali- kreline przy wartosciach pH = 3-^iiO, zwlaszcza 6^)(—7^5 na celulozie z zasadowymi podstawnikami, oddzielajac zasadowo podstawione celulozy i wy¬ mywajac nieczynne substancje towarzyszace silnie rozcienczonym roztworem buforu.

Substancje czynna mozna desorboWac z cel/ulo- zy z zasadowymi podstawnikami 1—6P/o rozitowora- mii elektrolitów. Otrzymuje sie preparaty, zawie¬ rajace okolo 50—100 KE/mg proteiny (KE = jed¬ nostka 'kalikreiny). {Oznaczanie jednostki kalikre¬ iny za pomoca pomiaru spadku, cisnienia krwi u psa — E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kalikre- in-Klinin-System und seine InMbitoren, F. Enke- -Verlaig Stuttgart 1968, strona lii).

Bardzo jeszcze zanieczyszczone preparaty' kali¬ kreiny mozna równiez wedlug opisu patentowego RFN nr 113411817 celem dalszego oczyszczenia, poddac elektrodializie, stosujac membrany z wy¬ mieniaczy. Wytwarza sie w ten sposób preparaty o 50 KE/mg.

Tak oczyszczone preparaty kalikreiny nadaja sie jedynie warunkowo do stosowania pozajelito¬ wego. Zawartosc obcych protein moze w jednym 85 201EE* pnzytpaidku prowadzic do uczulenia imimunologicz- |t'. nego i przy wielokrotnym stosowaniu do zagraza- V-- jacego zyciu wstrzasu anaifilaktycznego. Poza tym < trudno bylo za pomoca dotychczasowych sposo¬ bów oczyszczania uzyskac preparaty dostatecznie wolne od oial, wywolujacych goraczke. Nie bylo równiez mozliwe usuniejcia cial wywolujacych go¬ raczke, droga saczenia pnzez warstwy saczace, da¬ jace klarowne i jalowe przesacze, poniewaz tego rodzaju materialy adsorlbuja w anacznym stopniu sama kaHkreima.

Wiadomo tez, ze mozna wyHJworayc niewielkie iloM kaliltereiny o wyisokaLm stopniu czystosci róz¬ nymi sposobami Wedfruig H. Fritza i wspólpra- cowtników [Hoppe Seytte^s Z. Physflol. Chem. 348, ia\20^U3£ (Ii9l©7)] otrzymuje sie preparat o czyn- noM wlasciwej 1151116 KEyfang proteiny, chromato¬ grafujac jedno do trzykrotnie w ukladzie hydro- ksytoapatyt — celuloza produkt wstepnie oazysz- czony wedlug opisu ipatemtowego RFN nr 9U0 5i8O Konieczne jednak jest w tym przypadku oznacze¬ nie dla kazdej próbki kaililkreimy optymalnego ste¬ zenia buforu eHuujaoego i sprawdzanie w próbach wstepnych kazdej nowej partii ukladu hydroksy- loapatyt^celuloza. Sposób ten z tego powodu nie daje sie realizowac w tecWnlice.

Wedlug innego projekltu (H. Moriya i wspólpra¬ cownicy, Biochem. Pharm-acol lfi, 940—5<5(2 (1068)) wytwarza sie elektrotforetycznie czysta kalikreine z G%—S°/o wydajnoscia, wychodzac z autolizowej miazgi trzustkowej, stosujac kolejno DEAE-celu- loze, wytracanie mleczanem 2-eftofc6y-6bG-idwuami- no-akrydyniowym, ekstraktóje osadu roztworem siarczanu amonowego, wytracanie acetonem, chro- matograifie na hydToksyloapaltycie i chromatogra¬ fie na Sephadiex G 100. Równiez i ten sposób nie nadaje sie do stosowania w teclmice ze wzgledu na niska wydajnosc i wieloetapowosc.

Kalikireina, wytworzona sposobem w skaM labo¬ ratoryjnej, jest mieszanina dwóch izoenzymów. Za pomoca elektroforezy lub chromatografii na wy- mfieniaiazach anionowych mozna rozdizielic kalikre¬ ine na skladniki A i B (E. Habermann, Hoppe- -Seylert Z. Physiol. Chemie 328 16^-23; F. Fie¬ dler i E. Wenie, ibid. 348, Ii09r7-H1K)69 (H907)). Nie wiadomo jeszcze, czy nieznaczne róznice w struk¬ turze wystepuja w sekwencji aminokwasów, czy tez w czesci weglowodanowej glikoprotemy ka- liifcreiny. Obydwóch skladników nie mozna odróz¬ nic na podstawie czynnosci biologicznej.

Nie wytworzono dotychczas krystalicznej kali- krekiy, jak równiez krystalicznych skladników ka- Mkreiny A i B.

Rrizekimfiotem wynalazku jest prosty sposób wy¬ twarzania czystej, ewentualnie krystalicznej kali- kreiny, jak równiez rozdzial kalilkreiny w celu otrzymania czystych, ewentualnie krystalicznych skladników A i B.

Stwierdzono, ze mozna wytworzyc czysta kali- kireine, odsalajac wedlug opiisu patentowego RFN nr 910580 elusat, uzyskany z osadu przez wytrace¬ nie sola olowiu lub cynku, chromatografujac od- solony roztwór na odpowiednim makroporowatym wymieniaczu anionowym, na przyklad na DEAE- -celulozde lub DEAE-Sephadex R, zadajac tak 201 4 ' otrzymany roztwór czesciowo oczyszczonej kadi- kreiny odpowiednim malkro:porowatym wymienia¬ czem kationowym takim, jak GM-Sephadex lub SEHSephad!ex i ewentualnie wykrystalizowuijac ka- likreine. Tak wytworzona krystaliczna kalikreina przewyzsza czynnoscia wlasciwa wszystkie znane dotychczas preparaty i nie zawiera obcych pro¬ tein., dzialajacych jak przeciwciala, oraz substancji wywolujacych goraczke.

Stwierdzono ponadto, ze mozna wytworzyc czy¬ ste skladniki A i B kalilkreiny, odsalajac eluat, wytworzony wedlug opisu patentowego RFN nr 9105SO z osadu, uzyskanego droga stracania za pomoca soli olowiu lub cynku, chromadiografujac lf odsolony rozrtrwór na odpowiednim niakiroporowa- tytm wymieniaczu anionowym, na przyklad na DEAE-celulozie lub DEAE^Sepbadex R, zadajac tak wytiworzony roztwór czesciowo oczyszczonej kalilkreiny odpowiednim makroporowatym wymie- niaczem kationowym, takim jak, GM-3ephadex lulb SE-Sephajdex, rozdzielajac kalikreine znany¬ mi sposobami na skladniki A i B i krystalizujac je przez dodanie siarczanu amonowego.

Tak wykrystalizowane skladniki kalikreimy przewyzszaja czynnoscia wlasciwa wszystklie do¬ tychczas znane preparaty i sa Wolne od obcych protein, dzialajacych jako przeciwciala, oraz sub¬ stancji wywolujacych goraczke. wym firmy Pharmacia AG, Upssala).

Oznaczanie czynnosci enzymatycznej kalikreiny prowadzi sie droga pomiaru hydrolizy estru ety¬ lowego N^benzoiloargiininy (E. Werle i B. Kaiuf- mann-Bretsch, Naturwissenschaften 46, (5@9) (1069)) w postaci testu miareczkowego, którego sposób, prowaidzenia zostal sltandairdyzowany przez F.I.P.

(Federation Inteinationale Phammaceutiaue) (pu¬ blikacja z roku lfifflz w J. mond. Pharm.). Dla przeliczenia jednostek enzymatycznych na biolo- 40 liczne jednostki kalilkreiny (KE), oznaczone przez pomiar obnizenia cisnienia krwi u psa (E. Frey, H. Kraut, E. Werle, Das Kallitorein-Kinin-System und seine InhlbtftoiPein, F. Enke, Stuttgart 1968, strona 11) stosuje sie wspólczynnik 1 KE = 6,37 45 jednostek F.IJP. Zawafirtosc protein w roztworach czystej kafóikreiny oznacza sie za pomoca eks¬ tynkcji przy 280 ram, przy czym za podstawe i o/ przyjmuje sie wspólczynnik ekstrakcji E 28 50 = 1©,3 (= ekstynkcji IV© roztworu kolikrekiy przy wartosci pH 7,0).

Stwierdzono, ze odsalantie eluatu wytworzonego wedlug opisu .patentowego RFN ar aitOSGO mozna prowadzic droga dializy lub saczenia przez zel. Do 55 nastepujacej potem dhromatogratfii na mafcropo- rowatych wymtenfiaczach anionowych stosuje sie wedlug wynalazku zwlaszcza zasadowo podstawio¬ ne celulozy lub zasaidowo podstawione zele o od¬ powiedniej wielboswi oporów. •o Ten etap oczyszczania prowadzi sie zwlaszcza na kolumnach z DEAE-Seiphaidex. Adsorpcje pro¬ wadzi sie przy wafftosci pH = 4#—6,0, zwlaszcza ^S—e^O. Eluowanie prowadzi sie praez podwyzsze¬ nie stezenia soli przy stalej wartosci pH lubprzez 65 obnizenie wartosci pH przy stalym stezeniu soli85 f za pomoca kombinacji obu sposobów. Zmiana pH i stezenia soli moze nastepowac w sposób ciagly jako eluowainie gradientem lub stopniowo. Mozna stosowac wszystkie znane sole buforowe, zwlasz¬ cza jednak stosuje sie lotne sole buforowe, na przyklad mrówczan amonowy, octan amonowy, proptionian amonowy lub odpowiednie sole alkilo- amoniowe, na przyklad mrówczan tirójetyloamo- niowy. i Korzystnie adsorbuje sie kalikreine z 0,2 m octa¬ nu amonowego przy wartosci pH = 5,;0 na ko¬ lumnie, wypelnionej DEAE^Sephadex, wymywa nieczynna proteine za pomoca 0.25 m oatanu amo¬ nowego przy wartosci pH = 5,|0 i nastepnlie elu- uje wzbogacona kalikreine za pomoca 0,3 m octa¬ nu amonowego parzy wairtosdi pH = 4,5.

Chromatografia na malkroporowatych wymie¬ niaczach anionowych stanowi istotne usprawnie¬ nie sposobu wedlug opisu patentowego RFN nr 1 Ii02073, przewyzszajac go w sposób istotny wy¬ dajnoscia i prostota wykonania w skali technicz¬ nej.

Tak wzbogacona kalikrdine oczyszcza sie dalej przez traktowanie 'makroporowatymi wymienia¬ czami kationowymi. Uzyskuje sie w ten sposób preparaty o czystosci okolo 90:i)/o. Jako makropo- rowate wymieniacze kationowe mozna stoswac zwlaszcza celulze z krwaisnyimi podstawnikami lub zele z kwasnymi podstawnikami,, na przyklad z poprzecznie usieciowanych dekstranów lub poli- akryloiamidu o dostatecznej wielkosci porów. Roz¬ twór wzbogaconej kalikreiny »mozna traktowac wymieniaczem kationowym przez wymieszanie roztworu z wymieniaczem lub pnzez saczenie roz¬ tworu przez warstwy wymieniacza.

Przy stosowaniu kolumn korzystne jest zateze- nie roztworu wzbogaconej kalikreiny z poprzed¬ niego etapu i jego odsolenie. Podczas mieszania lub podczas procesu saczenia zele zatrzymuja sub¬ stancje towarzyszace, podczas gdy kaliktreiina bez przeszkód przechodzi przez warstwe saczaca.

Makrdporowalte wymieniacze kationowe, stoso¬ wane do saczenia lub do mieszania z roztworem kalikreiny, poddaje sie obróbce wstepnej wedlug znanych sposobów. Do saczenia miesza sie je z rozcienczonymi roztworami buforów i na przy¬ klad napelnia nimi kolumny. Stosunek dlugosci kolumny do srednicy kolumny ma dla procesu saczenia drugorzedne znaczenie. Do wytwarzania roztworów buforowych stosuje sie znane sole bu¬ forowe, zwlaszcza jednak lotne sole buforowe, na przyklad mirówczan amonowy, octan amonowy, propionian aimonowy lub odpowiednie sole alkilo- amoniowe, na przyklad mrówczan trójetyloamo- niowy. Wartosc pH roztworów buforowych moze wynosic 4,i5—'8,5, .zwlaszcza 5,0—7JO Celem wytworzenia krystalicznej kalikreiny wy- >krystalizowuje sie kalikreine o wysokim stotpniu czystosci przez dodatek siarczanu amonowego w postaci stalej lub w .postaci stezanego roztworu przy wartosci pH = 4,0—<8,,0. Krystalizacja naste¬ puje przy okolo 45i°/o nasyceniu siarczanem amo¬ nowym w ciagu kilku dni, korzystnie w tempera¬ turze li5—i2l5°C. Krysztaly posiadaja ksztalt cien¬ kich igiel, skupiajacych sie w peczki. Krysztaly 201; . ¦ . ¦¦ / ¦¦ ¦'¦.¦..¦¦.>¦- ¦-'¦ ¦¦_.-¦¦ • ^ , ¦ ....-s- . 6 .-.: ¦ ¦ .••-^: •.>..', mozna oddzielic od lugu macierzystego pr^ez d<£.

Wirowanie lub odsaczenie, nastepnte pEZficnyya sie je 5S0i°/o nasyconym roztworem siarczanu amono¬ wego i rozpuszcza w rozcienczonych roiztwoir^ch soli lub w wodzie.

Krysztaly skladaja sie z czystej kallpreiny.

Czynnosci wlasdiwej, wynoszacej okolo 160^ KE/ mg proteiny, nie mozna dalej podwyzszyc nawet; za pomoca kilkakrotnej krystalizacji. t " Oelem wytworzenia, ewentualnie krystaflician^ch skladników kalikreiny, rozdziela sie oczyszczona kalikreine znanym sposobem droga chromatografii na DEAE^celulozie lub DEAE-Sephiadex na sklad¬ niki A i B. Rozldzial na skladniki tym sposobem: mozna przeprowadzic juz we wczesniejszych eta¬ pach oczyszczania i dalej oczyszczac juz oddziel¬ nie rozdzielone skladniki.

Skladniki kalikreiny o wysokim stopniu czy¬ stosci rozdziela sie przez dodatek siarczanu amQ- nowego w postaci stalej lub w postaci stezonego roztworu przy wartosci pH 4,'0-^8,'tO. Krystalizacja parzy nasyceniu siarczanem amonowym wynosza¬ cym okolo 45%, nastepuje w ciaigu kilku dmi, zwlaszcza w temperaturze 15—125°€. Krysztaly pp- siadaja ksztalt cienkich igiel, skupiajacych sie w peczki. Krysztaly mozna oddzielic od lugu macie¬ rzystego przez odwirowanie lub saczenie, naste¬ pnie przemywa sie je 50°/o nasyconym roztworem siarczanu amonowego i rozpuszcza w rozcienozo- so nych roztworach sold lub w wodzie.

Krysztaly skladaja sie z czystej, elekibrofore- tycznie jednorodnej kalikreiny A lub B. fig. 1 przedstawia wynik próby elektroforezy.

Stosowano bufor z soli sodowej weronalu (pH 8,6). Sila jonowa wynosila 0^0715, napiecie 10OV; czas przebiegu 20 minut. W czasie 0 nanoszono na wysokosci linii kreskowanej. Przy 1 wprowadza¬ no kalikreine, przy 2 skladnik A, a przy 3 sklad¬ nik B. Czynnosci wlasciwej okolo 1'6>0!0 KE/mg 40 proteiny nie mozna dalej podwyzszyc nawet przez kilkakrotna krystalizacje.

Sposobem wedlug wynalazku udaje sie nieocze¬ kiwanie oddzielic w bardzo prosty sposób i bez stosowania klopotliwych sposobów eluowania cze- 45 sciowo oczyszczona kalikreine od substancji towa¬ rzyszacych i obcych enzymów. Nie mozna bylo przewidziec, ze ciala towarzyszace i obce enzymy, lecz nie kalikrelina, zostana zatrzymane przez ma- kroporowate wymienliacze kationowe i ze pozo- 50 stajaca w roztworze kalikreine otrzyma sie z bar¬ dzo dobra wydajnoscia i o wysokiej czystosci.

Droga krystalizacji obydwu skladników kalikreiny A i B oddziela sie prawie zupelmlie dajace sie z trudem usunac substancje, wywolujace goracz- 55 ke. Prostota sposobu wedlug wynalazku umozli¬ wia jego prowadzenie równiez w skali technicz- . nej. Sposób wedlug wynalazku stanowi wiec po¬ step techniczny.

Roztwór krysztalów kalikreiny, jiafc równiez 60 sklafdników kalikreiny charakteryzuje widmo w nadfiolecie przy wartosci pH = 7 z m&lksinium pirzy 2182 mm, z minimum przy 25(1 mm, dwoma przegieciami przy 277 i 290 mim i stosunkiem eks¬ tynkcji przy 28'0 i 200 mm o wartosci 1,78, (fig. 2, 65 nieprzerywana krzywa).85 201 8 W 0^1 n roztworze NaOH widmo w nadfiolecie wykazuje dwa maksima przy 280 i 289 mm (fig. 2 krzywa przerywana).

Krystaliczna kalikreine, jak równiez krystalicz¬ ne skladn'iki A i B kalikreiny, mozna stosowac jako czynne skladniki srodków leczniczych. Dzieki dzialaniu rozszerzajacemu naczynia stosuje sde z powodzeniem srodki lecznicze, zawierajace kali¬ kreine zwlaszcza w obwodowych zaburzeniach ukiwienia, na przyklad w Endangiitis obliterans, Arteriosclerosis obliterans, Morbus Raynaud, przy zaburzeniach w gojeniu sie zlaman i ran, na przy¬ klad w zespole Sudecka, w oparzeniach i w star¬ czych zaburzeniach krazenia.

Stosowanie moze nastepowac doustnie w po¬ staci tabletek lub drazetek, zawierajacych kry¬ staliczna kalikreine lub jej skladniki w miesza¬ ninie z obojetnymi, nietoksycznymi, farmaceutycz¬ nie dopuszczalnymi nosnikami lub pozajelitowo w postaci domiesniowych lub dozylnych, zastrzyków wddnego roztworu krystalicznej kalikreiny lub jej skladników. Krystaliczna kalilkreima zwlaszcza do stosowania pozajelitowego, odznacza sie w porów¬ naniu z mniej czystymi preparatami zaleta, pole¬ gajaca na znacznie mniejszym niebezpieczenstwie wystapienia niepozadanych dzialan ubocznych i od¬ czynów alergicznych.

Przez dodatek wysokoczasteczkowych koloidów wedlug opisu patentowego RFN nr 941686, na przyklad poliwinyloptirolidonu lub dekstranu, lub tez przez wytwarzanie kompleksu z inhibitorem kalikrekiy Trasylolem R wedlug opisu patento¬ wego RFN nr 1000 566, mozna wytworzyc z kry¬ stalicznej kalikreiny preparaty imjekcyjne o prze¬ dluzonym dzialaniu.

KaliHarekie do celów injekcyjnych mozna wy- , tworzyc zarówno jako izotonicany, gotowy do uzy¬ cia roatwór, jak równiez w postaci stalej za po¬ moca liofilizacji mieszaniny krytstaHicznej kalikre¬ iny lub krystalicznych skladników kalikreiny z adipowiednimi nosnikami, na przyklad z dekstra¬ nem, malnniltem, laktoza, zelatyna, przy czymptrzez rozpuszczenie w odpowieddim rozpuszczaindku wytwarza sie bezposrednio przed stosowaniem go¬ towy do uzytku roztwór.

Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób we-" dlug wynalazku.

Przyklad I. 200 litrów wytworzonego we¬ dlug opfcu patentowego RFN nr 91140 51810 z trzust¬ ki wieprzowej i dializowanego eluatu z osadu, straconego sola olowiu, zawierajacego i<0j8 g mi¬ lionów KE, zageszcza sie w wyiparce cienkowar¬ stwowej do objetosci 15 litrów i nastepnie od¬ sala droga saczenia przez zel w kolumnie, wy¬ pelnionej Sephadex G-25. Odsottony roztwór na¬ stawia sie za poimoca kwasu octowego na wartosc pH = 5,0 i odsacza wytworzony przy tym nie- wielM osad. Nastepnie dodaje sie stalego octanu aimonowego do uzyskania przewodnictwa wlasci¬ wego 12 mS. Roztwór ten nanosi sie na kolumne 210 X 66 cm (20 litrów) z DEAE-Sephadex A-90, zrównowazona za pomoca 0,2 m octanu amono¬ wego przy wartosci pH = 5y0, przy czym kali- kreina ulega adsorpcji ,30 40 45 50 55 65 Nastepnie eluuje sie kolumne okolo 40 litrami 0,26 m octanu amonowego o wartosci pH — 5i,0 i nastepnie 0,3 m octanu amonowym o wartosci pH = 4,5. Kalikreina pojawia sie w eluacie wkrótce po sptadlku .wartosci pH do okolo 4,5 (fig. 3). Frakcje czynne zawieraja okolo 9,315 mi¬ lionów KE (&6j5Plo). Roztwór zatezasie pod zmniej¬ szonym cisnieniem i odsala, przepuszczajac przez kolumne z Sephadex G-25. Liofilizowana próbka wykazuje czynnosc wlasciwa 414 KE/mg odwazki.

Wyjasnienia do fig. 3.

Jednositfci na osi rzednych: 0 — 8O0: jednostki kalikreiny (KE) na ml roztworu lOio—ao: transmisja w nadfiolecie w procentach (dlugosc fali 280 mm) 4,^2—^5^0: wartosci pH Jeidnostki na osd odcietych: numer frakcji Meprzerywana krzywa miedzy frakcjami 5 i 45 wykazuje przebieg absorpcji w nadfiolecie pod¬ czas procesu eluowania, krzywa przerywana od¬ powiada przebiegowi wartosci pH. Dinia, laczaca trójkaty odpowiada przebiegowi czynnosci podczas eluowania, dane w KE/ml.

Przyklad II. Odsolony roztwór o objetosci 300 ml saczy sie przez kolumne 10 X 13© cm (10 litrów, wyipelniona CM-Se(phadex C-50, zrówno¬ wazona 0,i01 m octanem amonowym o wartosci pH = 5,0. W eluacie pojawia sie najpierw kali¬ kreina,, po czym pojawiaja sie nieczynne zanie¬ czyszczenia (fig. 4). Frakcja kalikreinowa (3fl'ml) zawiera 5,5 milionów KE (dOfi/o). Liofilizowana próbka wykazala czynnosc wlasciwa l)OeO< KE/mg odwazki, wzglednie 1220 KE/mg protein. Dziala¬ nie goraczkotwórcze wynosi wedlug DAB 1,86 (^(ZlT)2 z 3 zwierzat).

Wyjasnienia do fig. 4: Jednostki na osi rzednych: 0^800: KE na ml roztworu 1O0i—^0: transmisja w nadfiolecie w procentach (dlugosc fali 280 mm) Jednostki na osi odcietych: numer frakcji Linia, laczaca trójkaty, odjpowiada przebiegowi czynnosci w eluacie, podanym w KE/ml. Druga krzywa wskazuje przebieg absorpcji w nadfiolecie.

Przyklad III. Wytwarzanie krystalicznej ka¬ likreiny.

Czesc roztworu, zawierajaca Ii5.'0i0i0' KE, zagesz¬ cza sie do 5 ml i zadaje nasyconym roztworem siarczanu amonowego do 49°/o nasycenia. Po uply¬ wie 6 dni w temiperaturze 20M2l5^C nastepuje kry¬ stalizacja. Po 3 tygodniach odwirowuje sie krysz¬ taly, przemywa raz 5 ml 50°/o nasyconego roz¬ tworu siarczanu amonowego i rozpuszcza w 0^05 m butforze fosforanowym o wartosci pH = 7,0. Czyn¬ nosc wlasciwa kallikreiny w tym roztworze wy¬ nosi 15160 KE/mg proteiny. Wydajnosc wynosi 7Wo, dzialanie gorajczkoitwórcze wedlug DAB 0,32.

Przyklad IV. Wytwarzanie krystalicznego skladnika B kalikreiny. 442 milionów KE z roz¬ tworu kalikreiny o wysokim stopniu czystosci wy-85 201 tworzonego wedlug przykladu II, aidsorbuje? sie na kolumnie 5XHdO cm, wypelnionej DEAE Sephadex AJ5(>, zrównowazonej 0£ m octanem amonowym o wairtosci pH=6,7. Muuje sie wyjpuklyim gradien¬ tem 0;2—K)|,55 m octanu amonowego o wairtosci pH=i6,7r wytworzonym w 2Jlitrowym mieszalniku.

W eluacie pojawiaja sie dwa lekko nakladajace sie na siebie maksima czynnosci kalikreiny, z któ¬ rych pierwsze zostaje zidentyfikowane elektrofo- retycznie jako skladnik B kalikreiny, drugie jako skladnik A kalikreiny.

Frakcje, zawierajace czysta kaBkreine A lub B, laczy sie. Otrzymuje sie 2,1 miliona KE skladnika B kalikreiny (47,5%), 1„25 miliona KE skladnika A kalikirelny (28^/o) i 0„32 miliona KE mieszaniny skladników A i B kalikreiny z obszaru nakladania sie na siebie maksimów (7,2°/o, razem 8*3%.

Czesc roztworu, zawierajacego sklaidlnik B kali¬ kreiny, zagesizieza sie do stezenia okolo 20.OHM) KE/ml i zadaje nasyconym roztworem siarczanu amonowe¬ go do 4)5% nasycenia. Po uiplywie 6 dni utrzymy¬ wania w temperaturze 201—i25°C rozpoczyna sie kry¬ stalizacja. Po 4 tygodniach odwirowuje sie kryszta¬ ly, przemywa SO^/o nasyconym roztworem siairczanu amonowego i rozpuszcza w OjOI5 m buforze fosforo¬ wym o wartosci ph=7^0. Czynnosc wlasciwa wy¬ nosi 16I&0 kE/mg proteiny, a wydajnosc 64%.

Przyklad V. Wytwarzanie krystalicznego 30 skladnika A kalikreiny.

Sposobem, opisianym w przykladzie IV, wyikry- stalizowuje sie równiez kalikreine A. Pod mikro- skopem kali&reina A i kalikreina B nie róznia sie pod wzgledem wygladu krysztalów.

Claims (2)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania czystej i kryBtoaliaznej ka¬ likireiny, znamienny tym, ze osad, uzyskany z or¬ ganów w znany sposób przez wytracenie solami metali, eluuje sie, eluait odsala, chromiatogradSuj^ na makroporowatyim wymieniaczu aminowym takim, jak DEAE — celuloza i DEAE — poprzecznie usie¬ ciowany dekstran, mastepnie traktuje wymienia¬ czem kationowym takim, jak GM — poprzecznie usieciowany dekstran, SE—poprzecznie usieciowa- ny dekstran i CM — celuloza, i czysta kalikreine ewentualnie wykrystalizowuje z tak wytworzonego roztworu przez dodanie srodka wytracajacego ta¬ kiego, jak siarczan amonu.

2. Siposób wytwarzanie czystej i krystalicznej ka¬ likreiny, znamienny tym, ze osad, uzyskany z orga¬ nów w znany siposób przez wytracanie solami me¬ tali, eluuje sie, eluat odsala, chromatoigrafiLje na makroporowatym wymiendaczu anionowym takim,, jak DEAE — celuloza i DEAE — poprzecznie usie¬ ciowany dekstran,, nastepnie traktuje wymieniaczem kationowym takim, jak CM- poprzecznie usiecio- waany dekstran, SE- poprzecznie usieciowany dek¬ stran i CM- celuloza, tak wytworzony roztwór kaUdkireiny o wysokim stopniu czystosci rozdziela w znany sposób na skladniki A i B, i rozdzielone skladniki wykrystalizowuje z roztworu przez doda¬ nie srodka wytracajacego takiego, jak siarczan amonu. 300 X nm F/G.285 201 r~ = ¦ Q © c — .._ -J. cm rS -7 -5 -5 -.? -2 ¦-/ 2 3 FIG 1 KE/m/ %Tzbo 800 20 600 40\ 400 60- 200 80 O 100 5 W 15 20 25 30 35 40 45 FIG.3 KE/ml %T280 800 20- 600 40] 400 60- 200 80- O 100 60 70 DN-7 — Zam. 2536/76 Cena 10 zl