DE910580C

DE910580C - Verfahren zur Gewinnung des Kreislaufhormons Kallikrein

Info

Publication number: DE910580C
Application number: DEF9770A
Authority: DE
Inventors: Dr Fritz Schultz
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1952-08-26
Filing date: 1952-08-26
Publication date: 1954-05-03

Description

Verfahren zur Gewinnung des Kreislaufhormons Kallikrein Es wurde gefunden, daß man das Kreislaufhormon Kallikrsin aus Harn sowie aus Thermolvsaten (gemäß Patent 890857) oder Autolysaten der Bauchspeicheldrüse durch Zusatz wäßriger Lösungen von Blei- oder Zinksalzen niederschlagen und dadurch von der Hauptmenge der biologisch unwirksamen Begleitstoffe abtrennen kann, Es entstehen wasserunlösliche Adsorbate, aus denen sich das Kallikrein durch Elutionsmittel wieder in Freiheit setzen läßt.
Die so gewonnenen Hormonpräparate sind von großer Reinheit, so daß sie nach Dialyse ohne weiteres für Injektionszwecke in der Therapie Verwendung finden können. Die Ausbeuten betragen bis zu iooo/o.
Die Lösungen können gegebenenfalls nach bekannten Verfahren weitergereinigt werden. So lassen sich, gegebenenfalls nach Dialyse, daraus haltbare Trockenpräparate durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Alkohol oder Mischungen derartiger organischer Lösungsmittel gewinnen.
Die Adsorption des Wirkstoffes an die Blei-.und Zinkfällungen ist eine weitgehend spezifische und war nicht vorauszusehen. Die Fällung bzw. Adsorption tritt nicht ein bei Verwendung von Salzen der folgenden Metalle: Mg, Ca, Sr, Ba, Cd, Hg, Cu, Fe", Fe"' und Mn.
Das Auftreten der Fällungen ist weitgehend unabhängig vom pH. Beispielsweise wurden aus der gleichen Lösung durch Bleifällung bei PH 4,2 bzw. 7 nach Elution mit Diammonphosphatlösung 228oo bzw. i86oo Einheiten gewonnen.
Die Wahl der Elutionsmittel bestimmt in hohem Maße Ausbeute und Reinheit. Gute Ergebnisse werden beispielsweise erzielt mit Phosphatpufferlösungen, Soda, Bicarbonat oder verdünntem Ammoniak. Aber auch andere aus der Fermentchemie bekannte Eluentien sind brauchbar.
Das Verfahren gemäß der Erfindung hat gegenüber den bekannten Reinigungsverfahren für Kallikrein große technische Vorteile. Die Durchführung ist sehr einfach und der Reinigungseffekt sehr groß. Bei Harn und Kallikrein ist der Reinigungseffekt ioofach, bei Pankreasthermolysaten 8o- bis 9ofach; die Ausbeute liegt zwischen 6o und ioo%. Das ursprünglich in großer Verdünnung anfallende Kallikrein wird ohne Verwendung einer Vakuum-Destillation auf ein kleines Volumen konzentriert. Das Verfahren läßt sich sowohl für Harnkallikrein als auch für Pankreaskallikrein durchführen und verzichtet auf die Verwendung des teuren und schwer zu beschaffenden Uranylacetates als Fällungsmittel.
Man hat schon mehrfach versucht, Blei- und Zinksalze zur Reinigung von Kallikrein zu benutzen. F. Bischof f und A. J. E 11 i o t (Journ. of Biol.
Chem.109, q.23 [1935]) setzten harnkallikreinhaltigen Lösungen bei einem pH zwischen 7,4 und 9,2 fertige Suspensionen von Zinkhydroxyd zu. Das Kallikrein wird bei den bis zu viermal hintereinander durchgeführten Adsorptionsversuchen gewöhnlich nicht wesentlich durch Zinkhydroxyd adsorbiert. Die erhaltenen Produkte sind meist unstabil, während die erfindungsgemäß hergestellten Lösungen wochenlang unverändert haltbar sind. Der grundsätzliche Unterschied der beiden Verfahren besteht darin, daß Elliot Begleitstoffe oder Wirkstoffe an suspendiertes Zinkhydroxyd adsorbiert, während erfindungsgemäß durch Zusatz löslicher oder gelöster Zinksalze in der Kallikrein-Iösung eine Zink-Eiweiß-Fällung erzeugt wird, die ihrerseits den Wirkstoff adsorptiv bindet.
H. Kraut, E. K. Frey, E. Bauer und F. Schultz (Zeitschr. physiol. Chem. 2o5, 99 [1932]) erzeugten in Lösungen von Harnkallikrein Niederschläge von Bleiphosphat, um daran entweder Kallikrein oder seine Begleitstoffe zu adsorbieren. Die schwierig durchzuführenden Operationen (s. S. io6) erwiesen sich als technisch nicht brauchbar. Die bekannte Arbeitsweise ist gemäß der Erfindung entgegengesetzt. Hier wird der Wirkstoff nicht durch Bleiphosphat gebunden, sondern mit Bleisalzlösungen gefällt und durch Phosphat daraus wieder in Freiheit gesetzt.
Beispiel i 251 frischer Menschenharn vom pH 6,5 werden mit 4 1 io%iger Bleiacetatlösung gefällt. - Der Niederschlag wird abgetrennt und mit 3 1 destilliertem Wasser gewaschen. Dann rührt man den Niederschlag mit 1,3 1 Wasser an und läßt unter ständigem Rühren allmählich 1,3 1 einer ro%igen Diammonsphosphatlösung langsam einfließen. Das pH beträgt 7,2. Nach halbstündigem Rühren wird der Niederschlag abzentrifugiert und die Lösung 48 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert.
Die Ausbeute beträgt 5ooo Einheiten= ioo%, der Reinheitsgrad goo y pro Einheit. Beispiel 2 go 1 Pankreasthermolysat (gemäß Patent 890 857), enthaltend goo ooo Einheiten Kallikrein, werden unter Rühren mit 12,61 einer roo/oigen Bleiacetatlösung gefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit 5 1 Wasser gewaschen und wiederum abgetrennt. Dann rührt man den Rückstand mit 3 1 destilliertem Wasser an und läßt unter weiterem Rühren 2,5 1 einer i6?/oigen Diammonphosphatlösung zufließen. Nach i Stunde wird zentrifugiert und die klare Lösung 72 Stunden lang gegen fließendes Wasser dialysiert.
Ausbeute 720 000 Einheiten, Reinheitsgrad i Einheit = 6o y.
Das so gewonnene Dialysat wird im Vakuum bei 45° Außentemperatur auf r 1 konzentriert, der ausgeschiedene Rückstand abgesaugt und die Lösung bei -V- 3° mit 5 1 einer 5o/5o%igen Alkohol-Aceton-Mischung gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit 1/z 1 Aceton angerührt und auf einer Nutsche abgesaugt. Man wäscht mit Aceton, dann mit Äther nach und trocknet den bröckligen Rückstand einige Stunden an der Luft, dann im ev akui-erten P205 Exsikkator.
Ausbeute 23,22 g = 540 000 Einheiten = 75'10, i Einheit = 43 y.
Beispiel 3 78o ccm PankreasthermoIysat, enthaltend 7300 Einheiten, werden mit Zoo ccm ioo/oiger Zinkacetatlösung gefällt, der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt und mit ioo ccm destilliertem Wasser gewaschen. Nach Abtrennung des Waschwassers rührt man den Rücksand abermals mit ioo ccm destilliertem Wasser an und läßt zu dieser Suspension unter Rühren 55 ccm einer io%igen Natriumbicarbonatlösung zutropfen. Nach i Stunde wird der unlösliche Rückstand abgetrennt, die Lösung neutralisiert und 48 Stunden lang gegen fließendes Wasser dialysiert.
Ausbeute 510o Einheiten, Reinheit i Einheit = 43 y. Beispiel 4 11 eines Pankreastotalautolysats, gewonnen durch 72stündige Autolyse bei 37°, enthaltend 2o ooo Einheiten Kallikrein, wird mit ioo ccm ioo/oiger Zinkacetatlösung gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit ioo ccm destilliertem Wasser gewaschen und nach abermaligem Zentrifugieren- mit 6o ccm Wasser angerührt. Dann läßt man 2o ccm io%ige Diammonphosphatlösung zufließen und trennt nach einstündigem Rühren das Unlösliche ab. Die Lösung, die nunmehr das Kallikrein enthält, wird neutralisiert und 4o Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert.
Ausbeute 12300 Einheiten, Reinheitsgrad i Einheit= 70 y.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Gewinnung des Kreislaufhormons Kallikrein, dadurch gekennzeichnet, daß man den Wirkstoff aus Harn oder Harnkallikrein enthaltenden Lösungen oder aus Pankreasthermolysaten oder -autolysaten durch Zusatz wasserlöslicher Blei- oder Zinksalze niederschlägt und aus diesen Adsorbaten durch Elutionsmittel wieder in Freiheit setzt.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man die so gewonnenen Lösungen einer Dialyse oder anderen für Kallikrein bekannten Reinigungsverfahren unterwirft.
3. Verfahren nach Anspruch i und z, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kallikrein aus den so gewonnenen Lösungen durch Aceton oder organische Lösungsmittel, wie Alkohol, oder durch Mischungen derartiger organischer Lösungsmittel ausfällt und den erhaltenen Niederschlag trocknet.