PL209757B1 - Sprzężone związki wankomycyno-cefalosporynowe, sposób ich wytwarzania, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, ich zastosowanie medyczne oraz związki pośrednie do ich wytwarzania - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe sprzężone związki wankomycyno-cefalosporynowe, które są użyteczne jako antybiotyki, sposób ich wytwarzania, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna, ich zastosowanie medyczne oraz związki pośrednie do ich wytwarzania.

Znane są różne klasy związków antybiotykowych, w tym, na przykład antybiotyki β-laktamowe, takie jak cefalosporyny, i antybiotyki glikopeptydowe, takie jak wankomycyna. Znane są także sprzężone związki antybiotykowe, jak na przykład te ujawnione w opisie patentowym USA nr 5693791, udzielonego na rzecz W. L. Truett i zatytułowanego „Antibiotics and Process for Preparation”; oraz w publikacji WO 99/64049 A1, opublikowanej 16 grudnia 1999 i zatytułowanej „Novel Antibacterial Agents”.

Mimo tych związków istnieje potrzeba nowych antybiotyków mających ulepszone właściwości, w tym, przykładowo zwiększoną siłę działania przeciwko bakteriom gram-dodatnim. W szczególności potrzebne są nowe antybiotyki, które mają wysoką skuteczność przeciwko opornym na antybiotyki szczepom bakterii, takim jak oporne na metycylinę Staphylococci aureus (MRSA) i oporne na metycylinę Staphylococci epidermitis (MRSE).

Niniejszy wynalazek dostarcza nowych sprzężonych związków wankomycyno-cefalosporynowych, które są użyteczne jako antybiotyki. Stwierdzono, że poza innymi właściwościami związki według niniejszego wynalazku posiadają zaskakującą i nieoczekiwaną siłę działania przeciwko bakteriom gram-dodatnim, w tym, opornym na metycylinę Staphylococci aureus (MRSA) i opornym na metycylinę Staphylococci epidermitis (MRSE).

Związki wankomycyno-cefalosporynowe według wynalazku przedstawione są wzorem I:

i obejmują też ich dopuszczalne farmaceutycznie sole. We wzorze I:

X¹ i X^{2 *} oznaczają chlor;

R¹ oznacza -Y^a-(W)n-Y^b-;

W jest wybrany spośród -O- i fenylenu;

Y^a i Y^b niezależnie oznaczają C1-5 alkilen, albo gdy W oznacza fenylen, Y^a i Y^b są niezależnie wybrane z grupy składającej się z wiązania kowalencyjnego i C1-5 alkilenu;

R² oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza hydroksyl, a R⁵ oznacza wodór;

PL 209 757 B1

R⁶ oznacza wodór, a R⁷ oznacza metyl;

R⁸ oznacza wodór; m jest równe 0, a n jest równe 0 lub 1.

Niniejszy wynalazek dostarcza nowych związków wankomycyno-cefalosporynowych o wzorze I lub ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli. Związki te mają wiele centrów chiralnych i pod tym względem związki mają taką stereochemię jak pokazana we wzorze. W szczególności, glikopeptydowa część związku ma stereochemię odpowiadającego naturalnie występującego glikopeptydu (to jest wankomycyny). Cefalosporynowa część cząsteczki ma stereochemię znanych związków cefalosporynowych. Jednakże dla fachowców będzie zrozumiałe, że w kompozycjach według wynalazku mogą być obecne niewielkie ilości izomerów mających stereochemię inną niż pokazana, o ile obecność takich izomerów nie powoduje, że użyteczność kompozycji jako całości nie jest w znaczącym stopniu zmniejszona.

Dodatkowo, część wiążąca związków według niniejszego wynalazku (to jest R¹) może zawierać jedno lub więcej centrów chiralnych. Typowo ta część cząsteczki będzie wytwarzana jako mieszanina racemiczna. Jednak w razie potrzeby mogą być stosowane czyste stereoizomery (to jest pojedyncze enancjomery lub diastereomery) lub mieszanina wzbogacona w stereoizomer.

Ponadto, związki według niniejszego wynalazku zawierają kilka grup kwasowych (to jest grup karboksylowych) i kilka grup zasadowych (to jest pierwszorzędowych i drugorzędowych grup aminowych) i zatem związki o wzorze I mogą istnieć w formach różnych soli.

Ponieważ związki o wzorze I zawierają pierścień pirydyniowy, może być również obecny anionowy przeciwjon dla grupy pirydyniowej, w tym, nieograniczająco, halogenki, takie jak chlorek, karboksylany, takie jak octan, i podobne.

Ponadto, dla fachowców będzie zrozumiałe, że związki labilne i chemicznie nietrwałe, które ze względu na swoją nietrwałość nie mają żadnej użyteczności, nie są objęte zakresem wynalazku. Na przykład, korzystne związki o wzorze I zawierają co najmniej dwa atomy węgla między atomami tlenu (-O-), azotu (-N-) lub siarki (-S-) w ugrupowaniu -O-R¹-N(R²)-, ponieważ kiedy atomy te są rozdzielone przez jeden atom węgla, uzyskany związek (to jest związek zawierający grupę acetalową, hemiacetalową, ketalową, hemiketalową, aminalową, hemiamialową lub tioketalową i podobne) mogą być nietrwałe hydrolitycznie w warunkach kwasowych.

W korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dotyczy zwi ą zków o wzorze la:

PL 209 757 B1 lub ich dopuszczalnych farmaceutycznie soli, w którym to wzorze R¹, R², R³ i m mają znaczenia jak określone powyżej.

W korzystnym wykonaniu R¹ oznacza -Y^a-Y^b-, gdy n oznacza 0. W tym wykonaniui Y^a i Y^b oznaczają niezależnie grupy C1-5 alkilenowe.

Korzystnie, Y^a i Y^b są niezależnie wybrane spośród grup C1-3 alkilenowych, a bardziej korzystnie C1-2 alkilenowych. Bardziej korzystnie, Y^a i Y^b są połączone razem tworząc grupę -(CH2)2-8-.

Jeszcze bardziej korzystnie, Y^a i Y^b są połączone razem, tworząc grupę -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5- lub -(CH2)6-.

W szczególnie korzystnym wykonaniu, i Y^a i Y^b są połączone razem, tworząc grupę -(CH2)3-.

W innym korzystnym wykonaniu R¹ oznacza -Y^a-W-Y^b-, gdy n jest równe 1. W tym wykonaniu,

Y^a i Y^b niezależnie oznaczają C1-5 alkilen, albo gdy W oznacza fenylen, Y^a i Y^b są niezależnie wybrane z grupy składającej się z wiązania kowalencyjnego i C1-5 alkilenu. Gdy Y^a lub Y^b oznacza grupę alkilenową, korzystnie jest to grupa C1-3 alkilenowa, bardziej korzystnie grupa C1-2 alkilenowa, jeszcze bardziej korzystnie grupa -(CH2)2-.

W szczególnie korzystnym wykonaniu, Y^a i Y^b oba oznaczaj ą -CH2-, a W oznacza fenylen.

W innym korzystnym wykonaniu, oba Y^a i Y^b oznaczają -CH2CH2-, a W oznacza -O-.

Korzystną grupą związków o wzorze I są te związki o wzorze la, w których R¹ oznacza -Y^a-(W)n-Y^b-, gdzie n jest równe 0, a Y^a i Y^b są połączone razem, tworząc grupę -(CH2)2-8- lub ich dopuszczalne farmaceutycznie sole. W tym wykonaniu, R¹ (to jest Y^a i Y^b- wzięte razem) korzystnie oznacza grupę -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, (CH2)5- lub grupę -(CH2)6-; bardziej korzystnie -(CH2)3-.

Inną korzystną grupą związków o wzorze I są te związki o wzorze la, w których R¹ i R², są takie jak zdefiniowano w tabeli I, lub ich dopuszczalne farmaceutycznie sole.

T a b e l a I

Nr Przykładu	R1	R2
Ya	W	Yb	Π
1	-CH2CH2-	---	-CH2-	0	-H
2	-(CH2)3-	---	-(CH2)3-	0	-H
3	-CH2CH2-	-O-	-CH2CH2-	1	-H
4	-CH2-	1,4-(-Ph-)2	-CH2-	1	-H

¹ Ph = fenyl.

² 1,4-(-Ph-) = 1,4-fenylen.

W zakres wynalazku wchodzą też związki pośrednie o wzorze II oraz ich sole, w którym to wzorze: P¹ i P² oznaczają wodór;

₃

P³ oznacza wodór;

Q oznacza grupę o wzorze:

X w którym:

R¹ oznacza -Y^a-(W)n-Y^b-;

W jest wybrany z grupy składają cej się z -O- i fenylenu;

Y^a i Y^b niezależnie oznaczają C1-5 alkilen, albo gdy W oznacza fenylen, Y^a i Y^b są niezależnie wybrane z grupy składającej się z wiązania kowalencyjnego i C1-5 alkilenu;

R2 oznacza wodór;

X^- oznacza ewentualnie obecny anion; m jest równe 0; n jest równe 0 lub 1.

PL 209 757 B1

Wynalazek obejmuje też kompozycję farmaceutyczną zawierającą substancję czynną i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik, która jako substancję czynną zawiera skuteczną terapeutycznie ilość związku o wzorze I według wynalazku. W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie związków o wzorze I do wytwarzania leku do leczenia infekcji bakteryjnych.

Stosowane w opisie terminy mają niżej podane znaczenia, chyba że wskazano inaczej.

Termin „alkilen” odnosi się do dwuwartościowej nasyconej grupy węglowodorowej, która może być liniowa lub rozgałęziona.

Jeśli nie zdefiniowano inaczej, takie grupy alkilenowe typowo zawierają od 1 do 8 atomów węgla. Reprezentatywne grupy alkilenowe obejmują przykładowo metylen, etano-1,2-diyl („etylen”), propano-1,2-diyl, propano-1,3-diyl, butano-1,4-diyl, pentano-1,5-diyl i podobne.

Termin „cefalosporyna” stosowany jest w swoim znaczeniu uznawanym w tej dziedzinie i odnosi się do β-laktamowego układu pierścienia mającego następujący wzór ogólny i układ numeracji:

R'

O OH

Termin „wankomycyna” jest stosowany w swoim uznawanym w dziedzinie znaczeniu i odnosi się do antybiotyku glikopeptydowego znanego jako wankomycyna. W związkach według wynalazku punkt przyłączenia ugrupowania łączącego jest na końcu C wankomycyny.

Termin „dopuszczalna farmaceutycznie sól” odnosi się do soli, która jest dopuszczalna do podawania pacjentowi, takiemu jak ssak (np. soli mającej dopuszczalne bezpieczeństwo u ssaków dla danego zakresu dawkowania). Takie sole można otrzymać z dopuszczalnych farmaceutycznie nieorganicznych lub organicznych zasad i dopuszczalnych farmaceutycznie nieorganicznych lub organicznych kwasów. Sole pochodzące od dopuszczalnych farmaceutycznie zasad nieorganicznych obejmują sole glinu, sole amonowe, sole wapnia, miedzi, żelazawe, żelazowe, litu, magnezu, manganowe, manganowe, potasu, sodu, cynku i podobne. Szczególnie korzystne są sole amonowe, wapnia, magnezu, potasu i sodu. Sole pochodzące od dopuszczalnych farmaceutycznie zasad organicznych obejmują sole amin pierwszorzędowych, drugorzędowych i trzeciorzędowych, w tym podstawionych amin, amin cyklicznych, amin występujących w naturze, i podobnych, takich jak arginina, betaina, kofeina, cholina, N,N'-dibenzyloetylenodiamina, dietyloamina, 2-dietyloaminoetanol, 2-dimetyloaminoetanol, etanoloamina, etylenodiamina, N-etylomorfolina, N-etylopiperydyna, glukamina, glukozamina, histydyna, hydrabamina, izopropyloamina, lizyna, metyloglukamina, morfolina, piperazyna, piperydyna, żywice poliaminowe, prokaina, puryny, teobromina, trietyloamina, trimetyloamina, tripropyloamina, trometamina i podobne. Sole pochodzące od dopuszczalnych farmaceutycznie kwasów obejmują sole kwasów octowego, askorbinowego, benzenesulfonowego, benzoesowego, kamforosulfonowego, cytrynowego, etanosulfonowego, fumarowego, glukonowego, glukuronowego, glutaminowego, hipurowego, bromowodorowego, chlorowodorowego, izetionowego, mlekowego, laktobionowego, maleinowego, jabłkowego, migdałowego, metanosulfonowego, śluzowego, naftalenosulfonowego, nikotynowego, azotowego, pamoesowego, pantotenowego, fosforowego, bursztynowego, siarkowego, winowego, p-toluenosulfonowego i podobne.

Szczególnie korzystne są kwasy cytrynowy, bromowodorowy, chlorowodorowy, maleinowy, fosforowy, siarkowy i winowy.

Termin „jego sól” odnosi się do związku utworzonego przez zastąpienie wodoru kwasowego kationem takim jak kation metalu lub kation organiczny i podobne (np. kation NH4⁺ i podobne).

Korzystnie, solą jest sól dopuszczalna farmaceutycznie, chociaż to nie jest wymagane dla soli związków pośrednich, które nie są przeznaczone do podawania pacjentowi.

Termin „ilość skuteczna terapeutycznie” odnosi się do ilości skutecznej do wywołania efektu leczenia, gdy jest podawana pacjentowi potrzebującemu leczenia.

Termin „leczenie” odnosi się tu do leczenia choroby lub stanu medycznego (takiego jak infekcja bakteryjna) u pacjenta, takiego jak ssak (w szczególności człowiek lub zwierzę domowe), który obejmuje:

PL 209 757 B1 (a) zapobieganie wystąpieniu choroby lub stanu medycznego, to jest medyczne postępowanie profilaktyczne z pacjentem;

(b) polepszenie w chorobie lub stanie medycznym, to jest wyeliminowanie choroby lub stanu medycznego lub spowodowanie cofnięcia się choroby lub stanu medycznego u pacjenta;

(c) stłumienie choroby lub stanu medycznego, to jest spowolnienie lub zatrzymanie rozwoju choroby lub stanu medycznego u pacjenta; lub (d) łagodzenie objawów choroby lub stanu medycznego u pacjenta.

Termin „ilość hamująca wzrost” odnosi się do ilości wystarczającej do hamowania wzrostu lub reprodukcji mikroorganizmów lub wystarczającej do spowodowania śmierci lub lizy mikroorganizmów, w tym bakterii gram-dodatnich.

Termin „ilość hamująca biosyntezę ściany komórkowej” odnosi się do ilości wystarczającej do hamowania biosyntezy ściany komórkowej w mikroorganizmach, włączając bakterie gram-dodatnie.

Termin „grupa opuszczająca” odnosi się do grupy funkcyjnej lub atomu, które mogą być zastąpione inną grupą funkcyjną lub atomem w reakcji podstawienia, takiej jak reakcja podstawienia nukleofilowego.

Przykładowe, reprezentatywne grupy opuszczające to grupy chlorkowe, bromkowe i jodkowe; grupy estrów sulfonowych, takich jak mesylan, tosylan, brosylan, nosylan i podobne, aktywowane grupy estrowe, takie jak 7-azabenzotriazol-1-oksyl i podobne; grupy acyloksylowe, takie jak acetoksyl, trifluoroacetoksyl i podobne.

Termin „ich zabezpieczone pochodne” odnosi się do pochodnej wymienionego związku, w której jedna lub więcej grup funkcjonalnych jest zabezpieczonych przed niepożądanymi reakcjami grupą zabezpieczającą lub blokującą.

Do grup funkcyjnych, które mogą być zabezpieczone, należą przykładowo grupy karboksylowe, grupy aminowe, grupy hydroksylowe, grupy tiolowe, grupy karbonylowe i podobne.

Reprezentatywne grupy zabezpieczające dla grup karboksylowych obejmują estry (takie jak ester ρ-metoksybenzylowy), amidy i hydrazydy; dla grup aminowych karbaminiany (takie jak tert-butoksykarbonyl) i amidy; dla grup hydroksylowych etery i estry; dla grup tiolowych tioetery i tioestry; dla grup karbonylowych acetale i ketale; i podobne.

Takie grupy zabezpieczające są dobrze znane fachowcom i są opisane na przykład w T. W. Greene i G. M. Wuts, Protecting Groups in Organie Synthesis, Wyd. trzecie, Wiley, New York, 1999, i cytowane tam odnośniki.

Termin „grupa zabezpieczająca grupę aminową” odnosi się do grupy zabezpieczającej odpowiedniej dla zapobiegania niepożądanym reakcjom grupy aminowej. Reprezentatywnymi grupami zabezpieczającymi grupy aminowe są, nieograniczająco, tert-butoksykarbonyl (BOC), trityl (Tr), benzyloksykarbonyl (Cbz), 9-fluorenylometoksykarbonyl (Fmoc), formyl, trimetylosilil (TMS), tert-butylodimetylosilil (TBS), i podobne.

Termin „grupa zabezpieczająca grupę karboksylową” odnosi się do zabezpieczającej odpowiedniej dla zapobiegania niepożądanym reakcjom grupy karboksylowej. Reprezentatywnymi grupami zabezpieczającymi grupy karboksylowe są, nieograniczająco, estry, takie jak metylowy, etylowy, tertbutylowy, benzylowy (Bn), β-metoksybenzylowy (PMB), 9-fluorenylometylowy (Fm), trimetylosililowy (TMS), tert-butylodimetylosililowy (TBS), difenylometylowy (benzhydrylowy, DPM) i podobne.

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania sprzężonych związków wankomycyno-cefalosporynowych według niniejszego wynalazku, który polega na reakcji glikopeptydu o wzorze 1:

PL 209 757 B1

w którym R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ R⁸, X¹ i X² są takie jak okreś lone dla wzoru I, lub jego soli, ze zwią zkiem o wzorze 2:

123 w którym R¹, R², R³ i m są takie jak okreś lone dla wzoru I, lub jego sol ą lub zabezpieczoną pochodną, z wytworzeniem związku o wzorze I, lub jego soli lub zabezpieczonej pochodnej.

Typowo, reakcję tę prowadzi się przez sprzęganie glikopeptydu 1, lub jego soli, z około 0,5 do około 1,5 równoważnika, korzystnie około 0,9 do około 1,1 równoważnika, związku o wzorze 2 w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak DMF, stosując typowy reagent do sprzęgania kwasu karboksylowego z aminą (z peptydem). W reakcji tej glikopeptyd 1, lub jego sól typowo kontaktuje się najpierw z reagentem sprzęgającym w obecności nadmiaru, korzystnie około 1,8 do około 2,2 równoważ ników, aminy, takiej jak diizopropyloetyloamina, w temperaturze w zakresie od około -20°C do około 25°C, korzystnie w temperaturze pokojowej, przez około 0,25 do około 3 godzin. Korzystnie, następnie dodaje się nadmiar kwasu trifluorooctowego (typowo około 2 równoważników), tak aby wytworzyć z nadmiarem diizopropyloetyloaminy sól TPA. Następnie mieszaninę zwykle ochładza się do temperatury od około -20°C do około 10°C, korzystnie do około 0°C, i dodaje się związek pośredni 2, a następnie nadmiar 2,4,6-kolidyny. Typowo reakcję tę utrzymuje się w temperaturze około 0°C przez około 1 do około 6 godzin, albo do zakończenia reakcji.

Korzystnym reagentem sprzęgającym do stosowania w tej reakcji jest około 0,5 do około 1,5 równoważnika, korzystnie około 0,9 do około 1,1 równoważnika, heksafluorofosforanu benzotriazol-1-iloksytris-pirolidynofosfoniowego (PyBOP) i około 0,5 do około 1,5 równoważnika, korzystnie około 0,9 do około 1,1 równoważnika, 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT) lub 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAT). Inne odpowiednie reagenty sprzęgające obejmują heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (HATU); chlorek bis(2-okso-3-oksazolidynylo)fosfinowy (BOP-C1); azydek difenylofosforylu (DPPA); chlorek difenylofosfinowy; chlorofosforan difenylu (DPCP) i HOAT; difenylofosfinian pentafluorofenylu i podobne.

PL 209 757 B1

Po zakończeniu reakcji sprzęgania wszelkie grupy zabezpieczające obecne w produkcie usuwa się, stosując znane procedury i reagenty. Po zakończeniu tej reakcji, produkt reakcji, czyli związek o wzorze I, wydziela się i oczyszcza stosują c znane procedury, takie jak chromatografia kolumnowa, HPLC, rekrystalizacja i podobne.

Glikopeptydy o wzorze 1, odpowiednie do stosowania w powyższej procedurze są albo dostępne w handlu albo można je wytworzyć przez fermentację odpowiedniego organizmu produkującego glikopeptyd, następnie wydzielenie glikopeptydu z uzyskanej brzeczki fermentacyjnej przy zastosowaniu znanych procedur i aparatury.

Cefalosporynowy związek pośredni 2 stosowany w powyższej procedurze jest łatwy do wytworzenia z substratów i reagentów dostępnych w handlu i przy zastosowaniu znanych procedur.

Przykładowo, półprodukt 2 można wytworzyć tak jak pokazano na schemacie A:

Jak zilustrowano na schemacie A, tiazolowy półprodukt 3 (w którym R⁹ jest grupą zabezpiecza10 jącą dla grupy aminowej, taką jak grupa tritylowa, a R¹⁰ jest grupą zabezpieczającą dla grupy karboksylowej, taką jak grupa etylowa) poddaje się najpierw reakcji z ω-funkcjonalizowaną aminą o wzorze 4 (w którym R¹ i R² mają znaczenia jak tu zdefiniowano, R¹¹ oznacza grupę zabezpieczającą dla grupy aminowej, taką jak grupa tert-butoksykarbonylowa (BOC), a Z¹ oznacza grupę opuszczającą, taką jak chlor, brom, jod, mesylan, tosylan i podobne), otrzymując po usunięciu grupy zabezpieczającej grupę karboksylową (to jest R¹⁰), półprodukt o wzorze 5a.

Tę reakcję typowo prowadzi się najpierw kontaktując związek 3 z około 1,0 do około 1,1 równoważnika, korzystnie około 1,02 do około 1,06 równoważnika, związku o wzorze 4 w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak DMF, w temperaturze w zakresie od około 0 do około 50°C, korzystnie w temperaturze pokojowej, przez około 0,5 do około 6 godzin, lub aż do zasadniczego zakończenia reakcji.

PL 209 757 B1

Tę reakcję typowo prowadzi się w obecności nadmiaru, korzystnie około 1,1 do około 5 równoważników, zasady, takiej jak węglan cezu.

Dodatkowo, gdy Z¹ oznacza chlor lub brom, można ewentualnie dodać katalityczną ilość, korzystnie około 0,2 do około 0,5 równoważnika, jodku trialkiloamoniowego, takiego jak jodek tetrabutyloamoniowy, dla ułatwienia reakcji przez wytworzenie pochodnej jodowej związku 4 in situ.

Usunięcie grupy zabezpieczającej grupę karboksylową (to jest R¹⁰) pozwala następnie otrzymać związek pośredni 5a. Przykładowo, gdy grupą zabezpieczającą grupę karboksylową jest ester alkilowy, taki jak etylowy, ester łatwo hydrolizuje do kwasu karboksylowego przez kontaktowanie estru z nadmiarem, korzystnie okoł o 1,1 do okoł o 2,5 równoważ ników, wodorotlenku metalu alkalicznego, takiego jak wodorotlenek sodu lub wodorotlenek potasu. Reakcję tę typowo prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak etanol, w temperaturze w zakresie od około 0°C do około 100°C przez 0,5 do około 6 godzin, lub aż do zasadniczego zakończenia reakcji, otrzymując związek pośredni 5a.

Związki tiazolowe o wzorze 3 są dostępne w handlu, na przykład z firmy Aldrich, Milwaukee, Wl, lub można je wytworzyć z dostępnych w handlu substratów i reagentów, stosując znane procedury.

Podobnie, ω-funkcjonalizowane aminy o wzorze 4 wytwarza się łatwo z dostępnych w handlu substratów i reagentów, stosując znane procedury.

Korzystne związki o wzorze 4 obejmują, dla ilustracji, N-BOC-3-bromopropyloaminę; N-BOC-6-jodoheksyloaminę; N-BOC-2-(2-jodoetoksy)etyloaminę; N-BOC-4-(jodometylo)benzyloaminę; i podobne.

Związki te wytwarza się łatwo z dostępnych w handlu substratów, stosując dobrze znane reagenty i warunki reakcji.

Następnie związek pośredni 5a chloruje się, otrzymując związek pośredni 5b. Reakcję tę typowo prowadzi się przez kontaktowanie związku 5a z około 1,0 do około 1,2 równoważnika środka chlorującego, takiego jak N-chlorosukcynoimid w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak chloroform lub DMF, w temperaturze pokojowej przez około 6 do około 24 godzin, lub aż do zasadniczego zakończenia reakcji.

Związek pośredni 5-chloro-1,3-tiazol 5b sprzęga się następnie ze związkiem pośrednim 6 (w którym R¹² oznacza atom wodoru lub odpowiednią grupę zabezpieczającą grupę karboksylową, taką jak grupa ρ-metoksybenzylowa), z wytworzeniem związku pośredniego 7. Gdy R¹² jest grupą ρ-metoksybenzylową, związek pośredni 6 jest dostępny w handlu z firmy Otsuka, Japonia. Typowo, reakcję tę prowadzi się przez kontaktowanie związku 5b z około 0,8 do około 1 równoważnika związku 6 w obecności reagenta sprzęgającego w typowych warunkach sprzęgania.

Korzystnym reagentem sprzęgającym dla tej reakcji jest tlenochlorek fosforu (typowo około 1,1 do około 1,2 równoważnika) i nadmiar aminy, takiej jak 2,4,6-kolidyna lub diizopropyloetyloamina. Reakcję sprzęgania typowo prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak THF, w temperaturze w zakresie od około -50°C do około 25°C przez około 0,5 do około 6 godzin, albo do zasadniczego zakończenia reakcji, otrzymując związek pośredni 7. Dla uniknięcia izomeryzacji, reakcję tę korzystnie prowadzi się w temperaturze -35°C, stosując 2,4,6-kolidynę jako zasadę.

Następnie związek pośredni 7 poddaje się reakcji z pirydyną lub podstawioną pirydyną, otrzymując związek pośredni 8, w którym R³ i n, są takie jak tu zdefiniowano. Tę reakcję typowo prowadzi się przez przeprowadzenie najpierw wymiany chloru w związku 7 na jod przez kontaktowanie związku 7 z około jednym równoważnikiem jodku sodu w acetonie (reakcja Finkelstein'a) lub DMF w temperaturze pokojowej przez około 0,25 do około 2 godzin. Uzyskanego pośredniego jodozwiązku typowo nie wydziela się, ale poddaje go reakcji in situ z około 1,1 do około 1,6 równoważnika pirydyny lub podstawionej pirydyny, otrzymując związek 8. Typowo, reakcję tę prowadzi się w temperaturze pokojowej przez około 1 do około 12 godzin, lub aż do zasadniczego zakończenia reakcji. Pirydyna lub podstawione pirydyny stosowane w tej reakcji są dostępne w handlu albo można je wytworzyć z dostępnych w handlu substratów i reagentów, stosując znane procedury. Reprezentatywne pochodne pirydyny do stosowania w tej reakcji obejmują: pirydynę, 2-pikolinę, 3-pikolinę, 4-pikolinę, 2-metoksypiiydynę, 3-metoksypirydynę, 4-metoksypirydynę, 2-tiometoksypirydynę, 3-tiometoksypirydynę, 4-tiometoksypirydynę, 4-karboksytiometoksypirydynę, 2-fluoropirydynę, 3-fluoropirydynę, 4-fluoropirydynę, 2-chloropirydynę, 3-chloropirydynę, 4-chloropirydynę, 2-fenylopirydynę, 3-fenylopirydynę, 4-fenylopiiydynę, 4-cyklopropylopirydynę, kwas nikotynowy, kwas izonikotynowy, nikotynamid, izonikotynamid, 2,3-lutydynę, 3,4-lutydynę, 3,5-lutydynę, 3,4-dimetoksypirydynę, 4-metoksy-3-metylopirydynę, 4-fluoro-3-metoksypirydynę, 2,3-cyklopentenopirydynę, 2,3-cykloheksenopirydynę i podobne.

PL 209 757 B1

Alternatywnie, związek pośredni 5b można sprzęgać ze związkiem o wzorze 9:

12 w którym R³, R¹² i m są takie jak tu zdefiniowano, otrzymując związek pośredni 8. Tę reakcję typowo prowadzi się przez kontaktowanie związku 5b z około 0,9 do około 1,1 równoważnika związku pośredniego 9, lub jego soli, w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak DMF, w obecności reagenta sprzęgającego, takiego jak 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimid (EDC); PyBOP i HOAT lub HOBT; HATU; BOP-C1; DPPA; DPCP i HOAT; i podobne. Na ogół reakcję sprzęgania prowadzi się w temperaturze w zakresie od około -40°C do około 25°C przez około 1 do około 12 godzin, lub do zasadniczego zakończenia reakcji. Związki o wzorze 9 wytwarza się łatwo ze związku pośredniego 6 przez reakcję związku 6 z pirydyną lub podstawioną pirydyną w warunkach reakcji podobnych do opisanych powyżej.

Usunięcie grup zabezpieczających ze związku pośredniego 8 za pomocą znanych procedur i reagentów daje cefalosporynowy związek poś redni 2.

11 12

Na przykład, gdy R⁹ oznacza trityl, R¹¹ oznacza tert-butoksykarbonyl, a R¹² oznacza para-metoksybenzyl, grupy zabezpieczające dogodnie usuwa się przez działanie na związek 8 nadmiarem kwasu trifluorooctowego i nadmiarem anizolu lub trietylosilanu w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak dichlorometan lub heptan, w temperaturze pokojowej przez około 1 do około 12 godzin, lub do zakończenia reakcji. Uzyskaną odbezpieczoną cefalosporynę 2 typowo wydziela się i oczyszcza, stosując znane procedury, takie jak wytrącanie, liofilizacja i HPLC w układzie faz odwróconych.

Alternatywnie, związki o wzorze I można wytworzyć przez reakcję pochodnej glikopeptydu o wzorze 10:

lub jego soli, w którym R¹, R², R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ z pochodną cefalosporyny o wzorze 11:

R⁸, X¹ i X² mają znaczenia jak tu zdefiniowane,

PL 209 757 B1

₃ lub jej solą lub zabezpieczoną pochodną (w której R³ i m mają znaczenia jak tu zdefiniowane), otrzymując związek o wzorze I, lub jego sól.

Tę reakcję typowo prowadzi się przez kontaktowanie związku 10 z około 1 do około 1,5 równoważnika związku 11 w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak woda, metanol lub ich mieszaniny, w pH w zakresie od około 4 do około 6,5. Tę reakcję na ogół prowadzi się w temperaturze w zakresie od około -20°C do około 40°C przez około 1 do około 6 godzin, lub do zasadniczego zakończenia reakcji.

Stosowane w tej reakcji pochodne wankomycyny o wzorze 10 wytwarza się łatwo przez sprzęganie wankomycyny lub jej soli z pochodną ftalimidową o wzorze:

₁ w którym R ma znaczenie jak tu zdefiniowane, w typowych warunkach sprzę gania. Przykł adowo, tę reakcję typowo prowadzi się przez kontaktowanie wankomycyny z około 1,1 do około 1,2 równoważników związku ftalimidowego w obecności reagenta sprzęgającego, takiego jak PyBOP i HOAT i podobne, i odpowiedniej zasady, takiej jak diizopropyloetyloamina. Na ogół, reakcję prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak DMF, w temperaturze w zakresie od około -20°C do około 40°C przez około 0,5 do około 6 godzin, lub do zasadniczego zakończenia reakcji. Stosowane w tej reakcji związki ftalimidowe łatwo wytwarza się stosując zwykłe procedury i reagenty.

Pochodne cefalosporyny o wzorze 11 można wytworzyć przykładowo przez sprzęganie związku o powyższym wzorze 9 ze związkiem tiazolowym o wzorze 12:

lub jego solą, w którym R¹³ oznacza atom wodoru lub grupę zabezpieczającą dla grupy aminowej (taką jak grupa formyIowa lub tritylowa). Tę reakcję sprzęgania typowo prowadzi się przez kontaktowanie związku 9 z około 0,9 do około 1,1 równoważnika związku 12 w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak DMF, w obecności reagenta sprzęgającego, takiego jak EDC i HOAT, i odpowiedniej zasady, takiej jak 2,4,6-kolidyna. Na ogół, tę reakcję prowadzi się w temperaturze w zakresie od około -20°C do około 20°C przez około 0,5 do około 6 godzin, lub do zasadniczego zakończenia reakcji.

PL 209 757 B1

Dodatkowo, związki o wzorze I można wytworzyć przez reakcję pochodnej glikopeptydowej o wzorze 13:

lub jej soli, w którym R¹, R², R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, X¹ i X² mają znaczenia jak tu zdefiniowane, ze związkiem o powyższym wzorze 9 z wytworzeniem związku o wzorze 1, lub jego soli.

Tę reakcję sprzęgania typowo prowadzi się przez kontaktowanie związku 13 z reagentem sprzęgającym, takim jak DIPC i HOAT, i około 0,5 do około 2 równoważników związku 9 w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak DMF, w obecności odpowiedniej zasady, takiej jak 2,4,6-kolidyna. Generalnie, tę reakcję prowadzi się w temperaturze w zakresie od około -20°C do około 40°C przez około 1 do około 6 godzin, lub do zasadniczego zakończenia reakcji.

Stosowany w tej reakcji związek o wzorze 13 wytwarza się łatwo przez sprzęganie wankomycyny ze związkiem pośrednim o powyższym wzorze 5b, stosując zwykłe, opisane tu procedury sprzęgania.

Dalsze szczegóły dotyczące warunków szczególnych reakcji i procedur do wytwarzania reprezentatywnych związków według wynalazku lub ich związków pośrednich są opisane w przykładach przedstawionych poniżej.

Sprzężone związki wankomycyno-cefalosporynowe według wynalazku typowo podaje się pacjentowi w formie kompozycji farmaceutycznej, która także jest przedmiotem wynalazku.

W kompozycjach według wynalazku może być zastosowany dowolny znany noś nik lub substancja pomocnicza. Wybór konkretnego nośnika lub substancji pomocniczej lub kombinacji nośników lub substancji pomocniczych będzie zależeć od sposobu podawania stosowanego do leczenia konkretnego pacjenta lub typu infekcji bakteryjnej. Pod tym względem, wytwarzanie odpowiedniej kompozycji farmaceutycznej dla konkretnego sposobu podawania, takiego jak podawanie doustne, miejscowe, wziewne, lub pozajelitowe, leży w zakresie umiejętności fachowców w dziedzinie technik farmaceutycznych. Dodatkowo, składniki dla takich kompozycji są dostępne w handlu, na przykład, z firmy Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. Dla celów dalszej ilustracji, zwykłe techniki formulacji są opisane w Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA, wyd. 17 (1985) i „Modern Pharmaceutics”, Marcel Dekker, Inc. Wyd. 3. (G.S. Banker C.T. Rhodes, Eds.).

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają skuteczną terapeutycznie ilość związku o wzorze I lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli. Typowo, takie kompozycje farmaceutyczne będą zawierać od około 0,1 do około 90% wagowych składnika czynnego, a bardziej ogólnie od około 10 do około 30% składnika czynnego.

PL 209 757 B1

Korzystnymi kompozycjami farmaceutycznymi według wynalazku są te kompozycje, które są odpowiednie do podawania pozajelitowego, szczególnie podawania dożylnego. Takie kompozycje farmaceutyczne typowo zawierają jałowy, dopuszczalny fizjologicznie roztwór wodny, zawierający skuteczną terapeutycznie ilość związku o wzorze I lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli.

Dopuszczalne fizjologicznie wodne roztwory, które stanowią nośnik, odpowiednie do podawania dożylnego składników czynnych, są dobrze znane w sztuce. Takimi roztworami wodnymi są, przykładowo, 5% roztwór dekstrozy, roztwory Ringer'a (mleczanowy roztwór Ringer'a do iniekcji, mleczanowy roztwór Ringer'a do iniekcji plus 5% dekstrozy, acylowany roztwór Ringer'a do iniekcji), Normosol-M, Isolyte E, i podobne.

Takie roztwory wodne mogą ewentualnie zawierać korozpuszczalnik, na przykład glikol polietylenowy; środek chelatujący, na przykład kwas etylenodiaminotetraoctowy; środek solubilizujący, na przykład cyklodekstrynę, antyutleniacz, na przykład pirosiarczyn sodu, i podobne.

W razie potrzeby, wodne kompozycje farmaceutyczne wedł ug wynalazku moż na liofilizować i następnie odtwarzać w odpowiednim nośniku przed podawaniem. W korzystnym wykonaniu, kompozycją farmaceutyczną jest kompozycja liofilizowana, zawierająca dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i skuteczną terapeutycznie ilość związku o wzorze I, lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli. Korzystnie, nośnikiem w tej kompozycji jest sacharoza, mannitol, dekstroza, dekstran, laktoza lub ich kombinacje. Bardziej korzystnie, nośnikiem jest sacharoza, mannitol lub ich kombinacje.

W jednym wykonaniu, kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają cyklodekstrynę. Gdy w kompozycjach według wynalazku jest stosowana cyklodekstryna, korzystnie jest to hydroksypropylo-e-cyklodekstryna lub eter sulfobutylowy β-cyklodekstryny. W takich formulacjach cyklodekstryna będzie stanowić około 1 do 25 procent wagowych, korzystnie około 2 do 10 procent wagowych formulacji. Dodatkowo, stosunek wagowy cyklodekstryny do składnika czynnego będzie typowo zawarty w zakresie od około 1:1 do około 10:1.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są korzystnie pakowane w jednostkowej postaci dawkowania.

Termin „jednostkowa postać dawkowania” odnosi się do fizycznie odrębnej jednostki odpowiedniej do dawkowania pacjentowi, to jest, każda jednostka zawiera określoną ilość składnika czynnego obliczoną dla wywołania żądanego efektu terapeutycznego, sama albo w kombinacji z jedną lub większą liczbą dodatkowych jednostek. Przykładowo, takie jednostkowe postaci dawkowania mogą być pakowane w jałowych, hermetycznie zamkniętych ampułkach i podobnych opakowaniach.

Poniżej przedstawiono formulacje ilustrujące reprezentatywne kompozycje farmaceutyczne według niniejszego wynalazku:

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i A

Zamrożony roztwór, odpowiedni do wytwarzania roztworu do iniekcji, wytwarza się następująco:

Składniki	Ilość
Związek czynny	10 do 1000 mg
Substancje pomocnicze (np. dekstroza)	0 do 50 g
Woda do iniekcji	10 do 100 ml

Reprezentatywna procedura: Substancje pomocnicze, jeśli obecne, rozpuszcza się w około 80% wody do iniekcji oraz dodaje się i rozpuszcza związek czynny. Ustawia się pH 1M wodorotlenkiem sodu do 3 do 4,5 oraz uzupełnia się objętość do 95% objętości końcowej wodą do iniekcji. Sprawdza się i w razie potrzeby reguluje pH, i ustawia objętość do objętości końcowej wodą do iniekcji.

Następnie formulację wyjaławia się przez sączenie przez filtr 0,22 mikrona i umieszcza się w jałowej ampułce w warunkach aseptycznych. Fiolkę zamyka się, oznakowuje i przechowuje zamrożoną.

PL 209 757 B1

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i B

Liofilizowany proszek, odpowiedni do wytwarzania roztworu do iniekcji, wytwarza się następująco:

Składniki	Ilość
Związek czynny	10 do 1000 mg
Substancje pomocnicze (np. mannitol i/lub sacharoza)	0 do 50 g
Środek buforujący (np. cytrynian)	0 do 500 mg
Woda do iniekcji	10 do 100 ml

Reprezentatywna procedura: Substancje pomocnicze i/lub środki buforujące, jeśli obecne, rozpuszcza się w około 60% wody do iniekcji. Dodaje się i rozpuszcza związek czynny i ustawia się pH 1M wodorotlenkiem sodu na 3 do 4,5 oraz uzupełnia objętość do 95% objętości końcowej wodą do iniekcji. Sprawdza się i w razie potrzeby reguluje pH, i ustawia objętość do objętości końcowej wodą do iniekcji. Następnie formulację liofilizuje się przez sączenie przez filtr 0,22 mikrometra i umieszcza w jałowej ampułce w warunkach aseptycznych. Następnie formulację wyjaławia się, stosując odpowiedni cykl liofilizacyjny. Fiolkę zamyka się (ewentualnie pod częściową próżnią lub suchym azotem), oznakowuje i przechowuje w chłodziarce.

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i C

Roztwór do iniekcji do podawania dożylnego pacjentowi wytwarza się z powyższego przykładu formulacji B, jak następuje:

Reprezentatywna procedura: Liofilizowany proszek formulacji z przykładu B (to jest zawierający 10 do 1000 mg składnika czynnego) rekonstytuuje się 20 ml jałowej wody i uzyskany roztwór rozcieńcza się jeszcze 80 ml jałowej solanki w worku infuzyjnym o pojemności 100 ml. Rozcieńczony roztwór podaje się następnie dożylnie pacjentowi w czasie 30 do 120 minut.

Sprzężone związki wankomycyno-cefalosporynowe według wynalazku są użyteczne jako antybiotyki. Na przykład, związki według wynalazku są użyteczne do leczenia lub zapobiegania infekcjom bakteryjnym i innym związanym z bakteriami stanom medycznym u ssaków, u ludzi i ich zwierząt domowych (to jest psów, kotów, itd.), które są spowodowane przez mikroorganizmy podatne na związki według wynalazku.

Sposób leczenia infekcji bakteryjnej u ssaka obejmuje podawanie ssakowi potrzebującemu takiego leczenia kompozycji farmaceutycznej zawierającej skuteczną terapeutycznie ilość związku o wzorze I lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli.

Dla ilustracji, związki według niniejszego wynalazku są szczególnie użyteczne do leczenia lub profilaktyki w infekcjach powodowanych przez bakterie Gram-dodatnie i pokrewne mikroorganizmy. Przykładowo, związki według niniejszego wynalazku są skuteczne w leczeniu lub profilaktyce infekcji powodowanych przez pewne Enterococcus spp.; Staphylococcus spp., włączając gronkowce koagulazo-ujemne (CNS); Streptococcus spp.; Listeria spp.; Clostridium ssp.; Bacillus spp.; i podobne. Nieograniczające przykłady gatunków bakterii, które skutecznie są zwalczane związkami według wynalazku, obejmują oporne na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA); podatne na metycylinę Staphylococcus aureus (MSSA); Staphylococcus aureus (GISA) o umiarkowanej podatności na glikopeptydy; oporne na metycylinę Staphylococcus epidermitis (MRSE); wrażliwe na metycylinę Staphylococcus epidermitis (MSSE); wrażliwe na wankomycynę Enterococcus faecalis (EFSVS); wrażliwe na wankomycynę Enterococcus faecium (EFMVS); oporne na penicylinę Streptococcus pneumoniae (PRSP); Streptococcus pyogenes; i podobne. Związki według niniejszego wynalazku są mniej skuteczne lub nie są skuteczne w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom powodowanym przez szczepy bakteryjne oporne zarówno na wankomycynę jak i cefalosporyny.

Reprezentatywne typy infekcji lub związanych z bakteriami stanów medycznych, w których leczeniu lub profilaktyce mogą być stosowane związki według niniejszego wynalazku, obejmują, ale bez ograniczeń, infekcje skóry i struktur skóry, infekcje układu moczowego, zapalenie płuc, zapalenie mięśnia sercowego, infekcje krwi związane ze stosowaniem kateterów, zapalenie szpiku, i podobne. W leczeniu takich stanów pacjent może być już zainfekowany mikroorganizmem, albo może być jedynie narażony na infekcję, w którym to przypadku środek czynny podaje się profilaktycznie.

PL 209 757 B1

Związki według wynalazku typowo podaje się w skutecznej terapeutycznie ilości dowolną dopuszczalną drogą podawania. Korzystnie, związki podaje się pozajelitowe. Związki mogą być podawane w jednej dawce dziennej lub w wielu dawkach dziennych. Schemat leczenia może wymagać podawania przez dłuższy czas, na przykład, przez kilka dni lub przez jeden do sześciu tygodni albo dłużej. Ilość składnika czynnego podawanego na dawkę lub łączna podawana ilość będzie zwykle ustalana przez lekarza prowadzącego pacjenta i będzie zależeć od takich czynników jak rodzaj i ciężkość infekcji, wiek i ogólny stan zdrowia pacjenta, tolerancja pacjenta na składnik czynny, mikroorganizm(y) powodujące infekcję, droga podawania, itp.

Generalnie, odpowiednie dawki będą zawarte w zakresie od około 0,25 do około 10,0 mg/kg/dzień składnika czynnego, korzystnie od około 0,5 do około 2 mg/kg/dzień. Dla człowieka o średniej wadze 70 kg będzie to się równać od około 15 do około 700 mg składnika czynnego dziennie, lub korzystnie około 35 do około 150 mg dziennie.

Dodatkowo, związki według niniejszego wynalazku są skuteczne w hamowaniu wzrostu bakterii. W tym wykonaniu, bakterie kontaktuje się in vitro lub in vivo z hamującą wzrost ilością związku o wzorze I lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli. Typowo, ilość hamująca wzrost jest zawarta w zakresie od około 0,008 μg/ml do około 50 μg/ml; korzystnie od około 0,008 μg/ml do około 25 μg/ml; a bardziej korzystnie, od około 0,008 μg/ml do około 10 μg/ml. Dowodem na hamowanie wzrostu bakterii, typowo jest spadek lub brak rozmnażania bakterii i/lub bakterii, to jest spadek jednostek tworzących kolonie w danej objętości (np. na ml) w danym czasie (np. na godzinę) w porównaniu z bakteriami nietraktowanymi.

Związki według wynalazku są również skuteczne do hamowania biosyntezy bakteryjnej ściany komórkowej. W takim zastosowaniu bakterie kontaktuje się in vitro lub in vivo z hamującą biosyntezę bakteryjnej ściany komórkowej ilością związku o wzorze I lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli. Typowo, ilość hamująca biosyntezę bakteryjnej ściany komórkowej będzie zawarta w zakresie od około 0,04 |ag/ml do około 50 μg/ml; korzystnie od około 0,04 μg/ml do około 25 μg/ml; a bardziej korzystnie, od około 0,04 μg/ml do około 10 μg/ml.

Dowodem na hamowanie biosyntezy bakteryjnej ściany komórkowej typowo jest spadek lub brak rozmnażania bakterii, w tym liza bakterii.

Stwierdzono, że poza zaskakującymi i nieoczekiwanymi właściwościami antybakteryjnymi, związki według wynalazku posiadają również dopuszczalny poziom bezpieczeństwa u ssaków i akceptowalną rozpuszczalność w wodzie. Ponadto, stwierdzono że związki według wynalazku mają zaskakujące i nieoczekiwane szybkie właściwości bójcze przeciwko pewnym bakteriom, w tym przeciwko opornym na metycylinę Staphylococci aureus (MRSA) i opornym na metycylinę Staphylococci epidermitis (MRSE). Właściwości te, oraz użyteczność antybiotyczną związków według wynalazku, można wykazać stosując różne testy in vitro i in vivo dobrze znane fachowcom. Przykładowe, reprezentatywne testy są opisane bardziej szczegółowo w poniższych przykładach.

P r z y k ł a d y

Poniższe przykłady syntetyczne i biologiczne przedstawiono dla zilustrowania wynalazku. Skróty zastosowane w poniższych przykładach mają znaczenia podane poniżej, chyba że wskazano inaczej. Skróty niezdefiniowane mają ogólnie akceptowane znaczenia.

BOC	tert-butoksykarbonyl
CFU	jednostki tworzące kolonie
DCM	dichlorometan
DIPEA	diizopropyloetyloamina
DMF	N,N-dimetyloformamid
DMSO	dimetylosulfo tlenek
EtOAc	octan etylu
HOAT	1-hydroksy-7-azabenzotriazol
HPLC	wysokosprawna chromatografia cieczowa
MIC	minimalne stężenie hamujące
MS	spektrometria masowa
PMB	ρ-metoksybenzyl
PyBOP	heksafluoro fosforan benzotriazol-1-iloksytripirolidynofosfoniowy
THF	tetrahydrofuran
TLC	chromatografia cienkowarstwowa
TFA	kwas trifluorooctowy

PL 209 757 B1

Wszystkie temperatury podane w poniższych przykładach są w stopniach Celsjusza (°C), jeśli nie wskazano inaczej. Również jeśli nie wskazano inaczej, reagenty, substraty i rozpuszczalniki nabyto od dostawców handlowych (takich jak Aldrich, Fluka, Sigma i podobni) i stosowano je bez dalszego oczyszczania. Semihydrat chlorowodorku wankomycyny zakupiono w firmie Alpharma, Inc., Fort Lee, NJ 07024 (Alpharma AS, Oslo, Norwegia).

HPLC w odwróconym układzie faz prowadzono stosując kolumnę C18 i układ (A) 98% wody, 2% acetonitrylu, 0,1 % TFA, z gradientem wstępującym (to jest 0 do około 70%) (B) 10% wody, 90% acetonitrylu, 0,1% TFA, jeśli nie wskazano inaczej.

P r z y k ł a d A

Synteza bis-soli z kwasem trifluorooctowym (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(3-aminopropoksyimino)acetamido]-3-[(1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-karboksylanu

Poniższą syntezę zilustrowano częściowo na przedstawionym wcześniej schemacie A.

Etap 1 - Wytwarzanie M-(fe/Y-butoksykarbonylo)-3-bromopropyloaminy (to jest związku 4, w którym R¹ oznacza -(CH2L·-, R² oznacza wodór, R¹¹ oznacza BOC, Z¹ oznacza brom)

Bromowodorek 3-bromopropyloaminy (100 g, 457 mmol) zawieszono w 1,6 l bezwodnego THF. Mieszaninę tę ochłodzono do 0°C w łaźni lodowo-wodnej i mieszając energicznie dodano 190 ml trietyloaminy. Do tej mieszaniny wkroplono bezwodnik te/t-butoksykarbonylu (112,6 g, 516 mmoli) w 200 ml THF. Łaźnię lodową pozostawiono do ogrzania do temperatury pokojowej i mieszaninę mieszano do następnego dnia, kiedy TLC wykazała zakończenie reakcji. Następnie mieszaninę przesączono i przesącz zatężono pod próżnią. Pozostały olej rozcieńczono 1500 ml heksanu i przechowywano w temperaturze -20°C przez 3 dni. Następnie mieszaninę zdekantowano i pozostały osad wysuszono pod próżnią otrzymując 101 g (wydajność 94%) tytułowego związku pośredniego jako krystaliczny biały osad.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 1,35-1,39 (s, 9H), 1,91-1,95 (m, 2H), 2,99-3,04 (t, 2H), 3,43-3,52 (t, 2H), 6,95-6,99 (t, 1H).

Etap 2 - Wytwarzanie (ZAA-trifenylometyloaminotiazolAiloAA-A-BOC-aminopropoksyimino)octanu etylu (to jest estru etylowego związku 5a, w którym R¹ oznacza -(CH₂)3-, R² oznacza wodór, R⁹ oznacza trifenylometyl, R¹¹ oznacza BOC, A oznacza wodór)

Chlorowodorek (Z)-2-(2-trifenylometyloamino)tiazol-4-ilo)-2-(hydroksyimino)octanu etylu (100 g, 202,4 mmol) rozpuszczono w 700 ml bezwodnego DMF. Do tej mieszanej mieszaniny dodano węglanu cezu (230,8 g, 708,5 mmol) i następnie bromku tetrabutyloamoniowego (18,7 g, 50,6 mmol). Następnie w ciągu 30 minut wkroplono N-BOC-3-bromopropyloaminę (50,6 g, 212,5 mmol) w DMF (100 ml). Mieszaninę mieszano przez 2 godziny, po czym HPLC wykazała zakończenie reakcji. Następnie mieszaninę przesączono i placek filtracyjny przemyto 200 ml DMF. Przesącz rozpuszczono w 2 l octanu etylu i przemyto 700 ml 1N HCl, następnie 700 ml nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu i na koniec 500 ml solanki. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod próżnią. Pozostały olej rozpuszczono w 250 ml wrzącego etanolu i wylano do zlewki. Po całkowitym ochłodzeniu pozostały glino-podobny osad umieszczono na leku Bϋchnera i przemyto 50 ml etanolu uprzednio ochłodzonego do -20°C (uwaga: produkt jest umiarkowanie rozpuszczalny w etanolu i stosowanie większych ilości zmniejsza wydajność całkowitą produktu końcowego). Po wysuszeniu na powietrzu pozostały osad rozdrobniono na drobny proszek w moździerzu i wysuszono pod próżnią, otrzymując 117 g (wydajność 94%) tytułowego półproduktu w postaci białawego proszku.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 1,01-1,1 (t, 3H), 1,31 (s, 9H), 1,60-1,70 (t, 2H), 2,94-2,99 (m, 2H), 3,95-4,04 (m, 4H), 6,77-6,81 (t, 1H), 6,95 (s, 1H), 7,16-7,38 (m, 15H), 8,80 (s, 1H).

MS m/z: 615,4 [M+H]⁺.

Etap 3 - Wytwarzanie iZ)-2-(2-trifenylometyloaminotiazol-4-ilo)-2-(3-M-BOC-aminopropoksy-imino)-octanu (to jest związku 5a, w którym R¹ oznacza -(CH2L·-, R² oznacza wodór, R⁹ oznacza trifenylometyl, R¹¹ oznacza BOC, i A oznacza wodór)

Ester etylowy z powyższego etapu 2 (84,2 g, 137 mmol) zawieszono w 400 ml bezwodnego etanolu i mieszając ogrzewano w łaźni olejowej do temperatury 80°C. Po rozpuszczeniu całości materiału do roztworu wkroplono w ciągu 20 minut roztwór wodorotlenku potasu (23,1 g, 411 mmoli) w 150 ml etanolu. 10 minut po zakończeniu dodawania zasady zaczął powstawać osad, a w ciągu następnych 10 minut mieszanina zestaliła się. Mieszaninę usunięto z łaźni olejowej i ochłodzono w łaźni lodowej. Do ochłodzonej mieszaniny dodano octanu etylu i wody i następnie wylano do rozdzielacza. Mieszaninę przemyto 1N kwasem fosforowym, co spowodowało powstanie białego osadu (UWAGA: przemywanie produktu silniejszym kwasem, takim jak 1N HCl, powoduje rozkład produktu). Do rozdzielacza

PL 209 757 B1 dodano wody w celu rozpuszczenia tego osadu i następnie warstwę organiczną przemyto nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu i solanką. Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod próżnią, otrzymując tytułowy półprodukt (80 g, wydajność 99%) w postaci ciemnobrązowego osadu.

Etap 4 - Wytwarzanie fZ)-2-(2-trifenylometyloamino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(3-M-BOC-aminopropoksyimino]octanu (to jest związku 5b, w którym R¹ oznacza -(CH₂)₃-, R² oznacza wodór, R⁹ oznacza trifenylometyl, R¹¹ oznacza BOC, a A oznacza chlor)

Półprodukt z powyższego etapu 3 (10 g, 17,04 mmol) rozpuszczono w 70 ml chloroformu i mieszano, dodając stały N-chlorosukcynoimid (2,28 g, 17,04 mmol) (UWAGA: eksperymenty sugerują, że nadmiar NCS może prowadzić do niepożądanych produktów ubocznych). Mieszaninę mieszano do następnego dnia (minimum 15 godzin), kiedy to HPLC wykazała zakończenie reakcji. Następnie mieszaninę zatężono pod próżnią i pozostałość rozpuszczono w minimalnej ilości DMF. Tę mieszaninę dodano do energicznie mieszanej wody, otrzymując strącony osad, który następnie zebrano przez filtrację. Osad wysuszono na powietrzu, otrzymując 9,5 g (wydajność 90%) półproduktu w postaci brązowego osadu. ¹H NMR wykazała jedynie minimalną ilość pozostałego sukcynoimidu (UWAGA: wydzielenie chlorowanego produktu nie jest konieczne dla przeprowadzenia sprzęgania w następnym etapie, ale eksperymenty sugerują, że pozostałości sukcynoimidu mogą wpływać na późniejsze podstawienie pirydyny).

Alternatywnie, po zakończeniu reakcji chlorowania mieszaninę reakcyjną przemyto wodą (3x), solanką, i następnie wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu. Następnie roztwór ten przesączono i zatężono pod próżnią, otrzymując tytułowy półprodukt (90%) w postaci brązowego osadu.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 1,37 (s, 9H), 1,53-1,74 (t, 2H), 2,94-2,99 (m, 2H), 3,97-4,05 (t, 2H), 5,80-6,85 (t, 1H), 7,18-7,41 (m, 15H), 8,97 (s, 1H).

MS m/z 621,3 [M+H]⁺.

Etap 5 - Wytwarzanie (7R)-7-[fZ)-2-(2-trifenylometyloamino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(3-M-BOC-aminopropoksyimino)acetamido]-3-chlorometylo-3-cefemo-4-karboksylanu ρ-metoksybenzylu (to jest związku 7, w którym R¹ oznacza -(CH₂)₃-, R² oznacza wodór, R⁹ oznacza trifenylometyl, R¹¹ oznacza BOC, a R¹² oznacza ρ-metoksybenzyl)

Półprodukt z etapu 4 (0,62 g, 1 mmol) rozpuszczono w 6 ml 15 bezwodnego THF, i do tej mieszaniny dodano 0,34 g (0,83 mmol) chlorowodorku estru ρ-metoksybenzylowego kwasu 7-amino12

-3-chlorometylocefalosporanowego (to jest związku 6, w którym R¹² oznacza PMB; otrzymany z firmy Otsuka, Japonia) w 4 ml bezwodnego THF. Uzyskaną mieszaninę mieszano w atmosferze azotu i ochłodzono do temperatury -35°C. Do tej ochłodzonej mieszaniny dodano diizopropyloetyloaminy (0,52 ml, 3 mmol) i potem tlenochlorku fosforu (0,11 ml, 1,2 mmol). Mieszaninę tę mieszano w temperaturze -20°C przez 30 minut i następnie zatrzymano reakcję mokrym THF i rozcieńczono octanem etylu. Mieszaninę tę przemyto wodą, 1N HCl, solanką, wysuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono otrzymując 0,88 g (wydajność 100%) tytułowego półproduktu w postaci brązowo-czerwonego osadu.

¹H NMR wykazała brak niepożądanej izomeryzacji oraz brak pozostałości sukcynoimidu.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 1,37 (s, 9H), 1,63-1,74 (t, 2H), 2,94-2,99 (m, 2H), 3,4-3,74 (q, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,97-4,05 (t, 2H), 4,40-4,59 (q, 2H), 5,11-5,25 (m, 3H), 5,49-5,54 (m, 1H), 6,75-6,81 (t, 1H), 6,90-6,96 (d, 2H), 7,18-7,41 (m, 17H), 8,97 (s, 1H), 9,41-9,44 (d, 1H).

MS m/z 972,0 [M+H]⁺.

(UWAGA: Eksperymenty sugerują, że DIPEA powoduje izomeryzację, gdy powyższą reakcję prowadzi się w większej skali. Zmodyfikowanie procedury z zastosowaniem 2,4,6-kolidyny jako zasady i utrzymywaniem temperatury na poziomie -35°C przez cały czas trwania reakcji - około 10 minut pozwała uniknąć tego problemu).

Etap 6 - Wytwarzanie (7R)-7-[(Z)-2-(2-trifenylometyIoamino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(3-M-BOCaminopropoksyimino)acetamido]-3-[(1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-karboksylanu ρ-metoksybenzylu (to jest związku 8, w którym R¹ oznacza -(CH₂)₂-, R² oznacza wodór, R⁹ oznacza trifenylometyl,

R¹¹ oznacza BOC, R¹² oznacza ρ-metoksybenzyl i m jest równe 0)

Półprodukt z etapu 5 (500 mg, 0,514 mmol) rozpuszczono w 2 ml bezwodnego acetonu i zabezpieczono przed dostępem światła za pomocą folii. Roztwór mieszano w atmosferze azotu i dodano 77 mg (0,514 mmol) jodku sodu i uzyskaną mieszaninę mieszano przez 1 godzinę. Dodano pirydynę (63 gl, 0,772 mmol) a po 90 minutach mieszaninę dodano do 25 ml eteru etylowego. Mieszaninę tę odwirowano i uzyskaną paletkę przemyto eterem etylowym i wirowano ponownie. Eter zdekantowano

PL 209 757 B1 i peletkę wysuszono pod próżnią, otrzymując z wydajnością ilościową tytułowy związek pośredni w postaci brązowego osadu, którego użyto bez dalszego oczyszczania.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 1,37 (s, 9H), 1,63-1,74 (t, 2H), 20 2,94-2,99 (m, 2H), 3,3-3,50 (q, 2H), 3,4-3,74 (q, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,97-4,05 (t, 2H), 5,10-5,12 (d, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,50-5,55 (m, 1H), 5,6 (s, 2H), 6,75-6,81 (t, 1H), 6,90-6,96 (d, 2H), 7,18-7,41 (m, 17H), 8,16-8,21 (t, 2H), 8,61-8,70 (t, 1H), 8,96 (s, 1H), 8,98-9,02 (d, 2H), 9,41-9,44 (d, 1H).

MS m/z 1014,2 [M+H]⁺.

Etap 7 - Wytwarzanie bis-soli kwasu trifluorooctowego (7R)-7-(Z)-2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(3-aminopropoksyimino)acetamido]-3-[(1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-karboksylanu (to jest związku 2, w którym R¹ oznacza -(CH^b-, R² oznacza wodór i m ma wartość 0)

Półprodukt z etapu 6 (14,4 g) rozpuszczono w mieszaninie 1:1 kwasu trifluorooctowego i dichlorometanu (120 ml). Do tej mieszaniny dodano podczas mieszania 6,2 ml anizolu i uzyskaną mieszaninę mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę zatężono i pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i ekstrahowano wodą. Warstwy wodne liofilizowano i uzyskany proszek rozpuszczono w wodzie i oczyszczono, stosując HPLC z odwróconym układem faz. Następnie uzyskany oczyszczony roztwór wodny liofilizowano, otrzymując 3,3 g (wydajność 30%) tytułowego związku pośredniego.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 1,80-1,97 (t, 2H), 2,79-2,92 (m, 2H), 3,29-3,57 (q, 2H), 4,02-4,15 (t, 2H), 5,15-5,19 (d, 1H), 5,41-5,63 (q, 5 2H), 5,83-5,92 (m, 1H), 7,39 (s, 2H), 7,77 (s, 3H), 8,17-8,22 (t, 2H), 8,60-8,70 (t, 1H), 9,0-9,08 (d, 2H), 9,59-9,62 (d, 1H).

MS m/z 553,1 [M+H]+.

(UWAGA: powyższą reakcję można również prowadzić stosując trietylosilan zamiast anizolu. Dodatkowo, produkt można wydzielić stosując rozcieranie z eterem etylowym).

P r z y k ł a d B

Synteza bis-soli kwasu trifluorooctowego (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(3-aminopropoksyimino)acetamido]-3-[(2,3-cyklopenteno-1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-kar -boksylanu

Stosując procedurę opisaną w przykładzie A i zastępując pirydynę w etapie 6 2,3-cyklopentenopirydyną (otrzymaną z firmy Koei, Japonia), otrzymano tytułowy półprodukt.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 1,82-1,947 (t, 2H), 2,18-2,29 (m, 2H), 2,40-2,58 (m, 2H), 2,81-2,95 (m, 2H), 3,09-3,17 (t, 2H), 3,21-3,30 (t, 20 2H), 4,10-4,19 (t, 2H), 5,15-5,19 (d, 1H), 5,40-5,61 (q, 2H), 5,83-5,92 (m, 1H), 7,39 (s, 2H), 7,77 (s, 3H), 7,89-7,96 (t, 2H), 8,42-8,48 (d, 1H), 8,62-8,69 (d, 1H), 9,60-9,63 (d, 1H).

MS m/z 592,5 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d C

Synteza bis-soli kwasu trifluorooctowego (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(6-aminoheksoksyimino)acetamido]-3-[(1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-karboksylanu

Stosując procedurę opisaną w przykładzie A i zastępując w etapie 2 N-BOC-3-bromopropyloaminę N-BOC-6-jodoheksyloaminą (i eliminując jodek tetrabutyloamoniowy), otrzymano tytułowy półprodukt.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ 1,2 ppm (bs, 4H), 1,3 ppm (m, 2H), 1,5 ppm (m, 2H), 2,7 ppm (m, 2H), 3,3 ppm (dd, 2H), 4,0 ppm (t, 3H), 5,1 ppm (d, 1H), 5,5 ppm (dd, 2H), 5,8 ppm (dd, 1H), 7,25 ppm (bs, 2H), 7,6 ppm (bs, 3H), 8,2 ppm (dd, 2H), 8,6 ppm (dd, 1H), 9 ppm (dd, 2H), 9,5 35 ppm (d, 1H).

MS m/z 594,3 (M⁺).

P r z y k ł a d D

Synteza bis-soli kwasu trifluorooctowego (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(2-(2-aminoetoksy)etoksyimino)acetamido]-3-[(1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-karboksylanu

Zastosowano procedurę z przykładu A, z wyjątkiem etapu 2, w którym zastosowano następującą procedurę:

Etap 2 - Wytwarzanie tZ)-2-(2-trifenylometyloaminotiazol-4-ilo)-2-[2-(2W-BOC-aminoetylo)etoksyimino]octanu etylu (to jest estru etylowego związku 5a, w którym R¹ oznacza -(CHY-O-(CHY-,

R² oznacza wodór, R⁹ oznacza trifenylometyl, R¹¹ oznacza BOC i A oznacza wodór)

Półprodukt z etapu 1 w przykładzie A (42,5 g, 86 mmol) dodano do mieszanej zawiesiny N-BOC-2-(2-jodoetoksy)etyloaminy (28,5 g, 90 mmol) (wytworzonej w trzech etapach z 2-(2-hydroksyetoksy)etanolu, to jest (i) BOC2O, KOH, (ii) MsCl, Et3N i (iii) Nal) i węglanu cezu (84,1 g, 258 mmol) w DMF (300 ml). Zawiesinę mieszano przez 16 h w temperaturze pokojowej, kiedy HPLC

PL 209 757 B1 wskazała na zakończenie reakcji. Następnie mieszaninę reakcyjną przesączono i placek filtracyjny przemyto DMF (100 ml). Przesącz rozcieńczono octanem etylu (1 l) i przemyto wodą (300 ml), 1N HCl (200 ml), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (200 ml) i solanką (200 ml). Warstwę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszczono przez chromatografię kolumnową typu flash (octan etylu:heksan, 1:1), otrzymując 49,7 g (wydajność 90%) tytułowego półproduktu w postaci brudno-białego osadu.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 2,96 (s, szeroki, 2H), 3,20-3,55 (q, 2H), 3,59 (t, 2H), 3,70 (t, 2H), 4,19 (t, 2H), 5,13 (d, 1H), 5,31-5,64 (q, 2H), 5,80 (dd, 1H), 7,40 (s, 2H), 7,87 (s, szeroki, 3H), 8,20 (t, 2H), 8,64 (t, 1H), 9,23 (d, 2H), 9,55 (d, 1H).

MS m/z 503,1 [M-pirydyna]⁺.

P r z y k ł a d E

Synteza bis-soli kwasu trifluorooctowego (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(4-aminometylobenzyloksyimino)acetamido]-3-[(1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-karboksylanu

Stosując procedurę opisaną w przykładzie A i etapie 2 z przykładu D i zastępując w etapie 2 bromowodorek N-BOC-2-(2-jodoetoksy)-etyloamino-3-bromopropyloaminy N-BOC-4-(jodometylo)benzyloaminą (wytworzoną w czterech etapach z kwasu 4-(aminometylo)benzoesowego, to jest (i) BOC2O, KOH, (ii) LiA1H4, (iii) MsCl, Et3N i (iv) Nal), otrzymano tytułowy półprodukt.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 3,18-3,59 (q, 2H), 4,00 (s, 5 szeroki, 2H), 5,13 (s, 2H), 5,15 (d, 2H), 5,40-5,64 (q, 2H), 5,85 (dd, 1H), 7,38-7,43 (m, 6H), 8,19-8,23 (m, 4H), 8,64 (t, 1H), 9,17 (d, 2H), 9,71 (d, 1H).

MS m/z 614,1 [M+H]+, 535,1 [M-pirydyna]⁺.

P r z y k ł a d F (porównawczy)

Synteza bis-soli kwasu trifluorooctowego (7R)-7-[(Z)-2-(2-aminotiazol-4-ilo)-2-(3-aminopropoksyimino)acetamido]-3-[(1-pirydynio)metylo]-3-cefemo-4-karboksylanu

Eliminując etap 4 w powyższym przykładzie A, wytworzono pochodną des-chloro półproduktu z przykł adu A.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MRz): δ = 1,75-1,82 (t, 2H), 2,67-2,82 (m, 2H), 3,25-3,61 (q, 2H), 3,98-4,09 (t, 2H), 5,13-5,17 (d, 1H), 5,38-5,58 (q, 2H), 5,79-5,85 (m, 1H), 6,62 (s, 1H) 7,15-7,25 (s, szeroki, 2H), 7,60-7,75 (s, szeroki, 3H), 8,16-8,19 (t, 2H), 8,58-8,63 (t, 1H), 8,95-9,01 (d, 2H), 9,57-9,60 (d, 1H).

MS m/z 518,6 [M+R]⁺.

P r z y k ł a d G

Synteza 3-(aminooksy)propyloamidu wankomycyny

Etap 1 - Wytwarzanie M-(3-aminopropoksy)ftalimidu

W-(ferf-Butoksykarbonylo)-3-bromopropyloaminę (z etapu 1 w powyższym przykładzie A) (9,58 g, 40,23 mmol) i N-hydroksyftalimid (6,36 g, 39 mmol) rozpuszczono w 70 ml bezwodnego DMF. Do tego roztworu dodano diizopropyloetyloaminy (7,01 ml, 40,23 mmol), uzyskując głęboko czerwony kolor. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, po czym mieszaninę wylano do 500 ml eteru dietylowego. Wytrącony biały osad odsączono i odrzucono. Roztwór organiczny przemyto 2x 200 ml nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu i 2x 200 ml wody. Roztwór organiczny wysuszono nad bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono i zatężono, otrzymując biały osad. Osad ten następnie rozpuszczono w 50 ml DCM i 50 ml TFA.

Mieszano przez 1 godzinę, po czym roztwór ten wylano do 300 ml eteru dietylowego. Wytrącony osad odsączono, przemyto eterem dietylowym i wysuszono pod próżnią, otrzymując tytułowy półprodukt jako jego sól kwasu trifluorooctowego.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 1,90 (2H, qn), 2,95 (2H, t), 4,18 (2H, t), 7,79 (4H, s), 7,92 (3H, szeroki s).

Etap 2 - Wytwarzanie 3-(ftalimidooksy)propyloamidu wankomycyny

Chlorowodorek wankomycyny (10,0 g, 6,74 mmol) i półprodukt z etapu 1 (2,70 g, 8,09 mmol) zawieszono w 100 ml bezwodnego DMF. Dodano diizopropyloetyloaminy (4,70 ml, 26,98 mmol) i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie dodano roztworu PyBOP (5,61 g, 10,78 mmol) i HOAt (1,65 g, 10,78 mmol) w DMF (20 ml), i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej. Po 1 godzinie mieszaninę reakcyjną dodano do eteru dietylowego (500 ml). Wytrącony osad przesączono, przemyto eterem dietylowym i wysuszono pod próżnią, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci białawego osadu.

MS m/z = 1651,8 (M+H)⁺.

PL 209 757 B1

Etap 3 - Wytwarzanie 3-(aminooksy)propyloamidu wankomycyny

Półprodukt z etapu 2 (11,2 g, 6,74 mmol) zawieszono w 80 ml bezwodnego DMF i dodano monohydratu hydrazyny (0,65 ml, 13,48 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 4,5 godziny i następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 1 ml kwasu triflluorooctowego, po czym 300 ml eteru dietylowego. Po energicznym wymieszaniu wytrącony osad przesączono, przemyto eterem dietylowym i wysuszono pod próżnią. Związek tytułowy oczyszczono przez HPLC w odwróconym układzie faz, stosując gradient układu woda/metanol, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci liofilizowanego proszku.

MS m/z = 1522,9 (M+H)⁺.

P r z y k ł a d H

Synteza bis-trifluorooctanu (7R)-7-[2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-oksoacetamido]-3-(1-pirydynio)metylo-3-cefemo-4-karboksylanu

Etap 1 - Wytwarzanie 2-(2-formyloamino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-oksooctanu etylu

2-(Formyloaminotiazol-4-ilo)-2-oksooctanu etylu (9,1 g, 39,87 mmol) (otrzymany z firmy Aldrich, Milwaukee, Wl) zawieszono w 50 ml bezwodnego DMF. Dodano stałego N-chlorosukcynoimidu (5,6 g, 41,86 mmol) i zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej. Po 18 godzinach mieszaninę reakcyjną wylano do 500 ml wody. Uzyskany biały osad odsączono, przemyto wodą i wysuszono na powietrzu, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci białego osadu.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 1,2 (t, 3H), 4,3 (q, 2H), 8,55 (s, 1H).

Etap 2 - Wytwarzanie kwasu 2-(2-formyloamino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-oksooctowego

Do półproduktu z etapu 1 (3,6 g, 13,7 mmol) dodano 1M NaOH (30 ml, 30 mmoli). Uzyskaną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny (kiedy roztwór stał się klarowny) i dodano 1M HCl (30ml, 30 mmoli), a następnie 100 ml wody. Po energicznym wymieszaniu uzyskany osad przesączono, przemyto minimalną ilością zimnej wody i wysuszono na powietrzu, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci białawego osadu.

¹H NMR (DMSO-d6, 300 MHz): δ = 8,5 (s, 1H).

Etap 3 - Wytwarzanie estru ρ-metoksybenzylowego (7R)-7-[2-(2-formyloamino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-oksoacetamido]-3-chlorometylo-3-cefemo-4-karboksylanu

Półprodukt z etapu 2 (1,03 g, 4,37 mmol), chlorowodorek estru ρ-metoksybenzylowego kwasu 7-amino-3-chlorometylocefalosporanowego (1,95 g, 4,81 mmol) i HOAt (0,74 g, 4,81 mmol) zawieszono w 15 ml bezwodnego DMF. Naczynie reakcyjne przedmuchano azotem i następnie ochłodzono do 0°C za pomocą zewnętrznej łaźni lodowej. Do zimnej mieszaniny reakcyjnej dodano chlorowodorku 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (0,92 g, 4,81 mmol), następnie 2,4,6-kolidynę (0,64 ml, 4,81 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze 0°C i następnie wylano do 200 ml 0,5M HCl. Uzyskany osad przesączono, przemyto wodą i wysuszono na powietrzu, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci czerwonego osadu. Związek stosowano bez dalszego oczyszczania.

MS m/z = 607 (M+Na)⁺.

Etap 4 - Wytwarzanie estru ρ-metoksybenzylowego (7R)-7-[2-(2-formyloamino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-oksoacetamido]-3-(1-pirydynio)metylo-3-cefemo-4-karboksylanu

Półprodukt z etapu 3 (2,5 g, 4,27 mmol) i jodek sodu (0,64 g, 4,27 mmol) rozpuszczono w acetonie i osłonięto przed światłem za pomocą folii. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 10 minut i następnie dodano pirydyny (0,42 ml, 5,12 mmol). Następnie mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i dodano 300 ml wody. Uzyskany osad przesączono, przemyto wodą i wysuszono na powietrzu, otrzymując czerwony osad. Osad ten oczyszczono za pomocą HPLC w odwróconym układzie faz i liofilizowano, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci liofilizowanego proszku.

MS m/z = 628,1 (M)⁺.

Etap 5 - Wytwarzanie bis-trifluorooctanu (7R)-7-[2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-oksoacetamido]-3-(1-pirydynio)metylo-3-cefemo-4-karboksylanu

Półprodukt z etapu 4 (0,11 g, 0,18 mmol) rozpuszczono w 5 ml metanolu i dodano stężonego kwasu solnego (0,5 ml). Uzyskany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Metanol usunięto pod próżnią i dodano acetonitrylu (10 ml). Następnie roztwór zatężono pod próżnią i do pozostałości dodano DCM (2 ml) i TFA (2 ml) i uzyskaną mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Następnie dodano eteru dietylowego (50 ml) i tytułowy półprodukt wydzielono przez odwirowanie. Półprodukt ten stosowano bez dalszego oczyszczania.

MS m/z = 479,9 (M)⁺.

PL 209 757 B1

P r z y k ł a d I

Synteza związku 13, w którym R¹ oznacza -(CH2)3-, R², R⁵, R⁶, R⁸ oznaczają wodory, R⁴ oznacza hydroksyl, R⁷ oznacza metyl, X¹ i X² oznaczają chlory, i m jest liczbą 0

Etap 1 - Wytwarzanie fZ)-2-(2-amino-5-chlorotiazol-4-ilo)-2-(3-aminopropoksyimino)octanu

Półprodukt z etapu 4 przykładu A (0,75 g, 1,21 mmoli) rozpuszczono w 5 ml DCM i 5 ml kwasu trifluorooctowego. Po 1 godzinie mieszania w temperaturze pokojowej dodano 100 ml eteru dietylowego. Uzyskany osad odsączono, przemyto eterem dietylowym i wysuszono pod próżnią, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci brązowego osadu.

Etap 2 - Wytwarzanie związku 13, w którym R¹ oznacza -(CH₂)₂-, R², R⁵, R⁶, R⁸ oznaczają wodory, R⁴ oznacza hydroksyl, R⁷ oznacza metyl, X¹ i X² oznaczają chlory, i m jest liczbą 0

Chlorowodorek wankomycyny (1,3 g, 0,88 mmol) i HOAt (0,14 g, 088 mmoli) zawieszono w 3,5 ml bezwodnego DMSO. Dodano roztworu PyBOP (0,46 g, 0,88 mmol) w 3,5 ml bezwodnego DMF, następnie DIPEA (154 gl, 0,88 mmol). Mieszano przez 20 minut, dodano roztwór półproduktu z etapu 1 (0,22 g, 0,44 mmol) w 1 ml DMF, po czym szybko dodano DIEA (0,54 ml, 3,08 mmol). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, następnie dodano 0,5 ml kwasu trifluorooctowego, po czym szybko dodano 100 ml Et20. Uzyskany osad przesączono, przemyto Et20 i wysuszono pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono przez HPLC w odwróconym układzie faz i uzyskany roztwór wodny liofilizowano, otrzymując tytułowy półprodukt w postaci liofilizowanego proszku.

MS m/z = 1711,0 (M+H)⁺.

P r z y k ł a d 1

Synteza związku o wzorze I, w którym R¹ oznacza -(CH2)3-, R², R⁵, R⁶, R⁸ oznaczają H, R⁴ oznacza hydroksyl, R⁷ oznacza metyl, X¹ i X² oznaczają chlor, i m jest równe 0 (związek 1 w tabeli I)

Chlorowodorek wankomycyny (4,2 g, 2,8 mmol) rozpuszczono w 40 ml DMSO. Do tego roztworu dodano roztworu PyBOP (1,3 g, 2,6 mmol) i HOAT (0,35 g, 2,6 mmol) w 40 ml DMF, po czym 0,98 ml (5,68 mmol) diizopropyloetyloaminy. Tę mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut i następnie zatrzymano reakcję za pomocą 0,44 ml (5,7 mmoli) kwasu trifluorooctowego. Następnie mieszaninę ochłodzono do 0°C i dodano roztworu półproduktu z powyższego przykładu A (1,3 g, 2,6 mmol) w 20 ml DMF w temperaturze 0°C, i następnie 1,5 ml (11,4 mmol) 2,4,6-kolidyny. Mieszaninę utrzymywano w temperaturze 0°C przez cztery godziny i następnie zatrzymano reakcję przez dodanie 1,1 ml kwasu trifluorooctowego. Następnie mieszaninę tę dodano do eteru etylowego, otrzymując osad, który odwirowano, przemyto eterem, zdekantowano i wysuszono pod próżnią. Uzyskany proszek rozpuszczono w wodzie i oczyszczono, stosując preparatywną HPLC.

Frakcje zawierające żądany produkt liofilizowano, otrzymując tri-sól kwasu trifluorooctowego tytułowego związku. Następnie przeprowadzono wymianę anionu soli, stosując żywicę Amberlyte, otrzymując sól trichlorowodorek związku tytułowego (1,4 g, wydajność 27%) w postaci białego proszku.

MS m/z 953,3 [[M+H]⁺-pirydyna]/2; 992,0 [M+H]⁺/2.

P r z y k ł a d 2

Synteza związku o wzorze I, w którym R¹ oznacza -(CH2)6-, R², R⁵, R⁶, R⁸ oznaczają H, R⁴ oznacza hydroksyl, R⁷ oznacza metyl, X¹ i X² oznaczają chlor, m jest równe 0 (związek 2 w tabeli I)

Stosując procedurę z przykładu 1 i zastępując związek pośredni z przykładu A związkiem pośrednim z przykładu C, wytworzono związek tytułowy.

MS m/z 2026,5 (M⁺).

P r z y k ł a d 3

Synteza związku o wzorze I, w którym R1 oznacza -(CH2)2-O -(CH2)2-, R², R⁵, R⁶, R⁸ oznaczają H, R⁴ oznacza hydroksyl, R⁷ oznacza metyl, X¹ i X² oznaczają chlor, m jest równe 0 (związek 3 w tabeli I)

Stosując procedurę z przykładu 1 i zastępując związek pośredni z przykładu A związkiem pośrednim z przykładu D, wytworzono związek tytułowy.

MS m/z 967,9 [(M-pirydyna)/2]⁺.

PL 209 757 B1

P r z y k ł a d 4

Synteza związku o wzorze I, w którym R¹ oznacza -CH2-1,4-Ph -CH2-, R², R⁵, R⁶, R⁸ oznaczają H, R⁴ oznacza hydroksyl, R⁷ oznacza metyl, X¹ i X² oznaczają chlor, m jest równe 0 (związek 4 w tabeli I)

Stosując procedurę z przykładu 1 i zastępując związek pośredni z przykładu E związkiem pośrednim z przykładu A, wytworzono związek tytułowy.

MS m/z 1967,0 [M+H]⁺, 984,2 [(M-pirydyna)/2]⁺.

P r z y k ł a d 5 (porównawczy)

Synteza związku des-chloro o wzorze I, w którym R¹ oznacza -(CH2)3-, R², R⁵, R⁶, R⁸ oznaczają H, R⁴ jest równe 0 (związek 5)

Stosując procedurę z przykładu 1 i zastępując des-chlorocefalosporynowy związek pośredni z przykładu A związkiem pośrednim z przykładu F, wytworzono związek tytułowy.

MS m/z 935,3 [[M+H]⁺-pirydyna]/2; 974,9 [M+H]⁺/2.

P r z y k ł a d 6

Oznaczanie minimalnych stężeń hamujących (MIC)

Testy minimalnego stężenia hamującego (MIC) przeprowadzano stosując metodę mikrorozcieńczeń brzeczki przedstawioną w zaleceniach NCCLS (zobacz NCCLS. 2000. Metods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard - Fifth Ed., Vol. 20, No. 2). Szczepy bakteryjne otrzymano z American Type Tissue Culture Collection (ATCC), Stanford University Hospital (SU), Kaiser Permanente Regional Laboratory w Berkeley (KPB), Massachusetts General Hospital (MGH), Centers for Disease Control (CDC), San Francisco Veterans' Administration Hospital (SFVA) lub University of California San Francisco Hospital (UCSF). Oporne na wankomycynę bakterie jelitowe fenotypowano jako Van A lub Van B w oparciu o ich wrażliwość na teikoplaninę. Z kliniki Mayo otrzymano także pewne oporne na wankomycynę bakterie jelitowe genotypowane jako Van A, Van B, Van C1 lub Van C2.

W teście tym przechowywane w niskiej temperaturze kultury bakteryjne szczepów referencyjnych i klinicznych rozprowadzono w celu izolacji na odpowiednim podłożu agarowym (np. Trypticase Soy Agar, Trypticase Soy Agar z defibrynowanymi erytrocytami owczymi. Brain Hart Infusin Agar, agar czekoladowy). Po inkubowaniu w celu umożliwienia tworzenia kolonii płytki te uszczelniono filmem parafinowym i przechowywano w lodówce przez okres do dwóch tygodni. Dla wytworzenia inokulum testowego i zapewnienia niskiej zmienności, kilka kolonii z izolatów bakteryjnych hodowanych na płytkach agarowych nakłuto pętlą inokulacyjną i aspetycznie przeniesiono do pożywki Mueller-Hinton Broth (suplementowanej kationami dwuwartościowymi do wymaganych poziomów w oparciu o certyfikaty producenta). Brzeczkę hodowlaną hodowano do następnego dnia w temperaturze 35°C, rozcieńczano w świeżej, wcześniej ogrzanej pożywce i namnażano do fazy logarytmicznej; jest to równoważne 0,5 wzorca MacFarlanda lub 1 x 10⁸ jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml). Nie wszystkie zawiesiny bakterii, ze względu na zmienność gatunkową, zawierały 1 x 10⁸ CFU/ml, kiedy zmętnienie jest równoważne wzorcowi MacFarlanda, zatem poczyniono dopuszczalne skorygowanie (w oparciu o zalecenia NCCLS) rozcieńczeń różnych szczepów bakteryjnych. Inokulum rozcieńczono tak, że 100 μl tej hodowli w pożywce Mueller-Hinton Broth, suplementowanej Mueller-Hinton Broth, lub pożywce do testu Haemophilus, po nałożeniu warstwy na 2-krotne seryjne rozcieńczenia stężeń antybiotyków również w 100 μl odpowiadającej pożywki, w 96-studzienkowej płytce mikrotitracyjnej uzyskiwano wyjściowe stężenie bakterii 5 x 10⁵ CFU/ml. Następnie płytki inkubowano przez 18-24 godzin w temperaturze 35°C. MIC odczytywano przy najniższym stężeniu, przy którym wyraźny był brak wzrostu bakterii. Wzrost bakterii definiowano jako więcej niż trzy kolonie wielkości łebka od szpilki, krążek strąconych komórek o średnicy większej niż 2 mm lub oczywiste zmętnienie.

Szczepy rutynowo testowane w początkowym teście obejmowały wrażliwe na metycylinę Staphylococcus aureus (MSSA), oporne na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA), wytwarzające penicylinazę Staphylococcus aureus, wrażliwe na metycylinę Staphylococcus epidermidis (MSSE), oporne na metycylinę Staphylococcus epidermidis (MRSE), wrażliwe na wankomycynę Enterococcus faecium (EFMVS), wrażliwe na wankomycynę Enterococcus faecalis (EFSVS), oporne na wankomycynę również oporne na teikoplaninę Enterococcus faecium (EFMVR Van A), oporne na wankomycynę Enterococcus faecium wrażliwe na teikoplaninę (EFMVR Van B), oporne na wankomycynę Enterococcus faecalis również oporne na teikoplaninę (EFSVR Van A), oporne na wankomycynę Enterococcus faecalis wrażliwe na teikoplaninę (EFSVR Van B), wrażliwe na penicylinę Streptococcus pneumoniae (PSSP) i wrażliwe na penicylinę Streptococcus pneumoniae (PSRP). Ponieważ PSSP i PSRP

PL 209 757 B1 nie mogły dobrze rosnąć w pożywce Mueller-Hinton, MIC dla tych szczepów oznaczono stosując albo brzeczkę TS suplementowaną defibrynowaną krwią lub pożywkę do testu Haemophilus.

Związki testowane mające znaczącą czynność przeciwko wymienionym wyżej szczepom badano następnie pod względem wartości MIC na większym zestawie izolatów klinicznych, włącznie z gatunkami wymienionymi powyżej oraz nieokreślonymi gatunkowo koagulazonegatywnymi Staphylococcus zarówno wrażliwymi jak i opornymi na metycylinę (MS-CNS i MR-CNS). Dodatkowo, te testowane związki badano również pod względem MIC przeciwko mikroorganizmom gram-ujemnym, takim jak

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii, Haemophilius influenzae i Moraxella catarrhalis.

Tabela II przedstawia dane MIC90 dla związku według wynalazku przeciwko opornym na metycylinę S. aureus (MRSA) i opornym na metycylinę S. epidermitis (MRSE) w porównaniu ze znanym antybiotykiem, wankomycyną.

T a b e l a II

Minimalne stężenia hamujące (MIC)

Mikroorganizm	T estowany związek	MIC902 (μg/ml)
Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA) (n = 53)1	Związek 1	< 0,1
wankomycyna	3
Oporny na metycylinę S. epidermitis (MRSE) i inne koagulazo-negatywne paciorkowce (n = 34)	Związek 1	< 0,1
wankomycyna	4

¹ liczba testowanych szczepów.

² minimalne stężenie hamujące dla 90% testowanych szczepów.

Dodatkowo, jak pokazano w tabeli III, związki według niniejszego wynalazku miały również zaskakujące i nieoczekiwane MIC przeciwko różnym opornym na metycylinę szczepom S. aureus w porównaniu z pokrewną pochodną des-chloro (to jest związkiem 5).

T a b e l a III

Minimalne stężenia hamujące

Mikroorganizm	MIC ^g/ml)
związek 1	związek 5
MRSA 33591	< 0,1	0,17
MRSA MED-103	< 0,1	0,20
MRSA MED-104	0,10	0,58
MRSA MED-107	< 0,1	0,34
MRSA MED-110	0,20	0,49
MRSA MED-572	< 0,1	< 0,1

Mikroorganizm	MIC ^g/ml)
związek 1	związek 5
MRSA MED-84	< 0,1	0,29
MRSA MED-85	< 0,1	0,32
MRSA MED-86	< 0,1	0,29
MRSA MED-87	< 0,1	0,49
MRSA MED-88	< 0,1	0,34
MRSA MED-89	< 0,1	0,18

PL 209 757 B1

P r z y k ł a d 7

Test czas-zabijanie „time-kill”

Test „time-kill” jest metodą mierzenia działania bakteriobójczego testowanego związku w czasie. Procedury te są podobne do testów opisanych w V. Lorian, „Antibiotics in Laboratory Medicine”, wyd. czwarte, Williams and Wilkins (1996), strony 104-105. Szybkie działanie w czasie jest pożądane dla szybkiego zapobieżenia kolonizacji bakteryjnej i zmniejszenia uszkodzeń tkanek gospodarza.

Inokulum bakteryjne sporządzono jak opisano w przykładzie 35 dla oznaczania MIC. Bakterie rozcieńczono w uprzednio ogrzanej pożywce w wytrząsanych kolbach i inkubowano z wytrząsaniem (200 rpm, 35°C). Po 0, 1, 4, i 24 godzinach z kolb pobierano próbki i zliczano bakterie na płytkach. Po wstępnym pobraniu próbek do kultur w wytrząsanych kolbach dodawano testowany związek. Zliczenia z płytek w tych odstępach czasowych przed i po dodaniu związku wyrażono w postaci graficznej na krzywej czas-zabijanie. Czynność przeciwbakteryjną zdefiniowano jako > 3 log spadek (zmniejszenie do 99,9% lub więcej) liczby komórek bakteryjnych po 24 godzinach.

W teście tym związek o wzorze I, to jest związek 1, działał bakteriobójczo przeciwko MSSA 13709 i MRSA 33591 w stężeniu < 1 gg/ml w ciągu 4 godzin. Dla porównania, wankomycyna była czynna bakteriobójczo przeciwko MSSA 13709 i MRSA 33591 w stężeniu 4 gg/ml przez 24 godziny.

P r z y k ł a d 8

Badania skuteczności in vivo na myszach z neutropenią

Zwierzęta (myszy samce CD-1, 20-30 g) nabyto w firmie Charles Rivers Laboratories (Gilroy, CA) i udostępniono pożywienie i wodę ad libitum. Neutropenię indukowano za pomocą dootrzewnowej (IP) iniekcji 200 mg/kg cyklofosfamidu na cztery i dwa dni przed inokulowaniem bakterii.

Zastosowanym organizmem był podatny albo oporny szczep mających znaczenie klinicznie patogenów gram-dodatnich, taki jak podatny na metycylinę Staphylococcus aureus (MSSA 13709) i oporny na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA 33591). Stężenie inokulum bakteryjnego wynosiło ~10⁶ CFU/ml. Zwierzęta lekko znieczulono izofluranem i wstrzyknięto w tylne udo 50 ml inokulum bakteryjnego. W godzinę po inokulacji zwierzętom podawano dożylnie wehikulum albo odpowiednią dawkę testowanego związku. Po 0 godzin i 24 godzinach zwierzęta poddawano eutanazji (przez uduszenie CO2) i pobierano aseptycznie udo przednie i tylne. Udo umieszczano w 10 ml jałowej solanki i homogenizowano. Rozcieńczenia homogenatu wysiewano na płytki z Triptic Soy Agar, które inkubowano do następnego dnia. Liczbę kolonii bakteryjnych na danej płytce mnożono przez współczynnik rozcieńczenia, dzielono przez wagę uda (w gramach) i wyrażano jako log CFU/g. Dla każdego testowanego związku oznaczano ED50 (dawkę wymaganą do uzyskania 50% maksymalnego zmniejszenia miana w udzie).

W teście tym, stosując MRSA 33591, uzyskano dla związku o wzorze I, to jest związku 1, ED50 < 0,20 mg/kg, iv, w porównaniu z ED50 9 mg/kg, iv, dla wankomycyny.

P r z y k ł a d 9

Oznaczanie rozpuszczalności w wodzie

Rozpuszczalność związku według wynalazku w wodzie oznaczano stosując następującą procedurę. Sporządzano bufor dekstrozowy o stężeniu 5% wagowych i pH 2,2 przez dodanie 1 ml 1N kwasu chlorowodorowego (Aldrich) do 99 ml wodnego roztworu dekstrozy o stężeniu 5% wagowych (Baxter).

Następnie sporządzano roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml dla wzorców do kalibracji przez rozpuszczenie 1 mg testowanego związku w 1 ml DMSO. Roztwór ten wirowano przez 30 sekund i następnie sonikowano przez 10 minut. Roztwór podstawowy rozcieńczano następnie wodą w celu sporządzenia wzorców kalibracyjnych o następujących stężeniach: 50, 125, 250, 375 i 500 gg/ml.

Każdy testowany związek (30 mg) odważano do niesterylizowanych jednostek filtracyjnych Millipore, Ultrafree-MC 0,1 gm (Millipore UFC30VVOO) i do każdej jednostki wkładano mieszadełko magnetyczne. Następnie do każdej jednostki dodawano roztwór buforu dekstrozowego o stężeniu 5% wagowych (750 gl i mieszaniny te wirowano przez 5 minut. Jednostki filtracyjne umieszczano następnie w stojaku na probówki Eppendorf i stojak z probówkami umieszczano na mieszadle magnetycznym. Następnie pH w każdej jednostce ustawiano na pH 3, stosując 1N NaOH (VWR) i uzyskane roztwory wirowano przy 7000 obr./min. przez 5 minut. Następnie każdą jednostkę rozcieńczano 200-krotnie 5% roztworem buforu dekstrozowego i rozcieńczone próbki przenoszono do analizy do fiolek autosamplera.

PL 209 757 B1

Wzorce kalibracyjne i próbki testowe analizowano za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych, stosując następujące warunki:

Kolumna:

Faza ruchoma: Metoda:

Objętość nastrzyku: Długość fali:

Luna 150 x 4,6 mm; C18; 5 μ A = 5/95, B = 95/5, oba = MeCN/H2O; 0,1% TFA 10 m Lido 100 (0-100% B w 6 minut) μl

214 nm

Rozpuszczalność każdej z testowanych próbek obliczano przez porównanie pola pod pikiem próbki testowanej do krzywej kalibracyjnej i pomnożenie przez współczynnik rozcieńczenia. Stosując powyższą procedurę na podwójnych preparatach próbek stwierdzono, że związek 1 ma rozpuszczal-

Claims (12)

1. Sprzężone związki wankomycyno-cefalosporynowe o wzorze I:

lub ich dopuszczalne farmaceutycznie sole, w którym:

X¹ i X² oznaczają chlor;

R¹ oznacza -Y^a-(W)n-Y^b-;

W jest wybrany spośród -O- i fenylenu;

Y^a i Y^b niezależnie oznaczają C1-5 alkilen, albo gdy W oznacza fenylen, Y^a i Y^b są niezależnie wybrane z grupy składającej się z wiązania kowalencyjnego i C1-5 alkilenu;

R² oznacza atom wodoru;

R⁴ oznacza hydroksyl, a R⁵ oznacza wodór;

R⁶ oznacza wodór, a R⁷ oznacza metyl;

R⁸ oznacza wodór;

m jest równe 0, a n jest równe 0 lub 1.

PL 209 757 B1

2. Związek według zastrz. 1, w którym n jest równe 0, a Y^a i Y^b niezależnie oznaczają grupę C1-5 alkilenową.

3. Związek według zastrz. 1, w którym n jest równe 0, a Y^a i Y^b są połączone razem, tworząc grupę -(CH2)2-8-.

4. Związek według zastrz. 3, w którym n jest równe 0, a Y^a i Y^b są połączone razem, tworząc grupę -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5- lub -(CH2)6-.

5. Związek według zastrz. 4, w którym n jest równe 0, a Y^a i Y^b są połączone razem, tworząc grupę -(CH2)3-.

6. Związek według zastrz. 1, w którym n jest równe 1, a Y^a i Y^b są takie same lub różne i każdy jest wybrany z grupy składającej się z wiązania kowalencyjnego i C1-5 alkilenu.

7. Związek według zastrz. 5, w którym W oznacza fenylen.

8. Związek według zastrz. 1, w którym n jest równe 1, oba Y^a i Y^b oznaczają -CH2-, a W oznacza fenylen.

9. Związek według zastrz. 1, w którym n jest równe 1, Y^a i Y^b oba oznaczają -CH2CH2-, a W oznacza -O-.

10. Związek według zastrz. 1, w którym R¹ oznacza -Y^a-(W)n-Y^b-, gdzie n jest równe 0 a Y^a i Y^b są połączone razem, tworząc grupę -(CH2)3-.

11. Związek według zastrz. 1, w którym:

(i) Y^a oznacza -CH2CH2-, Y^b oznacza -CH2-, a n jest równe 0;

(ii) Y^b oznacza -(CH2)3-, Y^b oznacza -(CH2)3-, a n jest równe 0;

(iii) Y^a oznacza -CH2CH2-, W oznacza -O-, Y^b oznacza -CH2CH2-, a n jest równe 1 lub (iv) Y^a oznacza -CH2-, W oznacza 1,4-fenylen, Y^b oznacza -CH2-, a n jest równe 1.

12. Związek pośredni o wzorze II: