ES2335013T3 - Antibioticos de glucopeptido-cefalosporina reticulados. - Google Patents

Antibioticos de glucopeptido-cefalosporina reticulados. Download PDF

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ES2335013T3 ES04752930T ES04752930T ES2335013T3 ES 2335013 T3 ES2335013 T3 ES 2335013T3 ES 04752930 T ES04752930 T ES 04752930T ES 04752930 T ES04752930 T ES 04752930T ES 2335013 T3 ES2335013 T3 ES 2335013T3
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Martin S. Linsell
Daniel Marquess
Daniel D. Long
Jason P. Chinn
Matthew B. Nodwell
Edmund J. Moran
James B. Aggen
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Abstract

Compuesto de fórmula I: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que: cada X1 y X2 es independientemente hidrógeno o cloro; W se selecciona de entre N y CCl; R2 es hidrógeno o alquilo C1-6; uno de entre R4 y R5 es hidroxi y el otro es hidrógeno; cada R6 y R7 es independientemente hidrógeno o metilo; R8 es hidrógeno o un grupo de fórmula: **(Ver fórmula)** R9 se selecciona de entre hidrógeno, alquilo, C1-6, y cicloalquilo C3-6, en la que alquilo y cicloalquilo pueden estar sustituidos con -COOH o 1 a 3 átomos de flúor; cada R3 se selecciona independientemente de entre alquilo C1-6, -OR, halo, -SR, -S(O)R, -S(O)2R, y -S(O)2OR, en las que cada R es independientemente alquilo C1-6, que puede estar sustituido con COOH o 1 a 3 átomos de flúor; n es 0, 1, 2 ó 3; x es 0, 1 ó 2; y es 0, 1 ó 2; Rª es -Y-R''''-, en la que R'''' se selecciona de entre alquileno C1-12, alquenileno C2-12, alquinileno C2-12, cicloalquileno C3-6, arileno C6-10, heteroarileno C2-9, heterociclo C3-6, y combinaciones de los mismos, y está opcionalmente sustituido con 1 ó 2 grupos seleccionados de entre Z, en la que Z consiste en -OR'', -SR'', -F, -Cl, -N(R'')2, -OC(O)R'', -C(O)OR'', -NHC(O)R'', -C(O)N(R'')2, -CF3, y -OCF3, y cadenas laterales de aminoácidos naturales, en la que cada R'' es independientemente hidrógeno o alquilo C1-4; y R'''' contiene a lo sumo 20 átomos de no hidrógeno; Y, que une R'''' al anillo de piridinio en la posición meta o para, se selecciona de entre un enlace directo, NR'', O, S, C(O) NR''(CO), y C(O)NR'', excluyendo los enlaces directos entre heteroátomos en Y y R'''', cada Rb y Rd se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6 y alquinilo C2-6; cada Rc es independientemente -Y-R''''-Y''-, en la que cada Y'' se selecciona independientemente de entre un enlace directo, O y NR'', excluyendo los enlaces directos entre heteroátomos en Y'' y R''''; y cada Re se selecciona independientemente de entre R''''.

Description

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Antibióticos de glucopéptido-cefalosporina reticulados.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos compuestos reticulados de vancomicina-cefalosporina que resultan útiles como antibióticos. La presente invención se refiere asimismo a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos; a los procedimientos de utilización de dichos compuestos como agentes antibacterianos; y a los procedimientos y compuestos intermedios para preparar dichos compuestos.
Estado de la técnica
Resultan conocidas varias clases de compuestos antibióticos en la técnica que incluyen, por ejemplo, antibióticos de \beta-lactama, tales como las cefalosporinas, y antibióticos glucopeptídicos, tal como la vancomicina. Resultan asimismo conocidos compuestos antibióticos reticulados en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.693.791, publicada por W.L. Truett y titulada "Antibiotics and Process for Preparation"; documento WO 99/64049 A1 publicado el 16 de diciembre de 1999, y titulado "Novel Antibacterial Agents". Además, el documento WO 03/031449 A2, publicado el 17 de abril de 2003 y titulado "Cross-Linked Glycopeptide-Cephalosporin Antibiotics" da a conocer compuestos con un grupo glucopeptídico unido por enlace covalente al resto oxima de un grupo de cefalosporina.
Debido a las posibilidades de que las bacterias desarrollen resistencia a los antibióticos, sin embargo, existe una necesidad de nuevos antibióticos con estructuras químicas exclusivas. Además, existe una necesidad de nuevos antibióticos con propiedades antibacterianas mejoradas que incluyan, a título de ejemplo, aumento de potencia frente a las bacterias Gram-positivas. En particular, existe una necesidad de nuevos antibióticos que sean muy eficaces contra cepas de bacterias resistentes a antibióticos, tales como Staphylococci aureus resistentes a la meticilina (MRSA).
Sumario de la invención
La presente invención proporciona nuevos compuestos reticulados de glucopéptido-cefalosporina que son útiles como antibióticos. Los compuestos de la presente invención poseen una nueva estructura química única en la que un grupo glucopéptido está unido por enlace covalente a un resto de piridinio de un grupo de cefalosporina. Entre otras propiedades, los compuestos de la presente invención se ha descubierto que poseen potencia sorprendente e inesperada frente a las bacterias Gram-positivas incluyendo los Staphylococci aureus resistentes a la meticilina (MRSA).
Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I:
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o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que
cada X^{1} y X^{2} es independientemente hidrógeno o cloro;
W se selecciona de entre el grupo constituido por N y CCl;
R^{2} es hidrógeno o alquilo C_{1-6};
uno de entre R^{4} y R^{5} es hidroxi y el otro es hidrógeno;
cada R^{6} y R^{7} es independientemente hidrógeno o metilo;
R^{8} es hidrógeno o un grupo de fórmula:
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2 
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R^{9} se selecciona de entre hidrógeno, alquilo, C_{1-6}, y cicloalquilo C_{3-6}, en la que alquilo y cicloalquilo pueden estar sustituidos con -COOH o 1 a 3 átomos de flúor;
cada R^{3} se selecciona independientemente de entre alquilo C_{1-6}, -OR, halo, -SR, -S(O)R, -S(O)_{2}R, y -S(O)_{2}OR, en las que cada R es independientemente alquilo C_{1-6}, que puede estar sustituido con COOH o 1 a 3 átomo de flúor;
n es 0, 1, 2 ó 3;
x es 0, 1 ó 2;
y es 0, 1 ó 2;
Rª es -Y-R''-, en la que
R'' se selecciona de entre alquileno C_{1-12}, alquenileno C_{2-12}, alquinileno C_{2-12}, cicloalquileno C_{3-6}, arileno C_{6-10}, heteroarileno C_{2-9}, heterociclo C_{3-6}, y combinaciones de los mismos, y está opcionalmente sustituidas con 1 ó 2 grupos seleccionados de entre Z, en el que Z consiste en -OR', -SR', -F, -Cl, -N(R')_{2}, -OC(O)R', -C(O)OR', -NHC(O)R', -C(O)N(R')_{2}, -CF_{3}, y -OCF_{3}, y cadenas laterales de aminoácidos naturales, en las que cada R' independientemente es hidrógeno o alquilo C_{1-4}; y R'' contiene por los menos 20 átomos que no son de hidrógeno;
Y, que une R'' al anillo de piridinio en la posición meta o para, se selecciona de entre un enlace directo, NR', O (éter), S (sulfuro), C(O) (carbonilo), NR'(CO), y (CO)NR', excluyendo los enlaces directos entre heteroátomos en Y y R'',
cada R^{b} y R^{d} se seleccionan independientemente de entre un grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1-6}, alquenilo C_{2-6} y alquinilo C_{2-6};
cada R^{c} es independientemente -Y-R''-Y'-, en la que cada Y' se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por un enlace directo, O (éter) y NR', excluyendo los enlaces directos entre heteroátomos en Y' y R''; y
cada R^{e} se selecciona independientemente de entre el grupo definido por R'' anteriormente.
\newpage
En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula II:
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o una sal farmacéuticamente aceptable; en la que
W se selecciona de entre el grupo de N y CCl;
R^{9} se selecciona de hidrógeno, alquilo C_{1-6}, y cicloalquilo C_{3-6}, en las que alquilo y cicloalquilo pueden estar sustituidos por -COOH o 1 a 3 átomos de flúor.;
el anillo de piridinio tiene sustitución en meta o para;
R^{10} es hidrógeno o alquilo C_{1-6}; y
R^{1}^{1} es alquileno C_{1-12}.
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En otros aspectos de su composición, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I o fórmula II, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, incluyendo cualquiera de las formas de realización específicas expuestas en la presente memoria.
La presente invención se refiere también a procedimientos para preparar compuestos de fórmula I o II o una sal de los mismos. Por consiguiente, en otro de sus aspectos del procedimiento, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo; comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un compuesto de fórmula 1 o una sal, derivado activado, o derivado protegido del mismo, con un compuesto de fórmula 3 ó 4 o una sal, derivado activado o derivado protegido del mismo; para proporcionar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo; en la que los compuestos de fórmula 1, 3 y 4 son como se definen en la presente memoria.
Además, en otro de sus aspectos del procedimiento, la presente invención se refiere también a procedimientos para preparar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo; comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar un compuesto de fórmula 2 o una sal, derivado activado, o derivado protegido del mismo; con un compuesto de fórmula 5 o una sal, derivado activado o derivado protegido del mismo; para proporcionar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo; en la que los compuestos de fórmula 2 y 5 son como se definen en la presente memoria.
En una forma de realización, estos procedimientos comprenden además la etapa que consiste en la formación de una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula I. La presente invención se refiere también al producto preparado por cualquiera de estos procedimientos.
La presente invención se refiere también a un compuesto de fórmula I o II, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su utilización en terapia. Además, la presente invención se refiere a la utilización de un compuesto de fórmula I o II, o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento, incluyendo un medicamento para tratar una infección bacteriana en un mamífero.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 presenta ejemplos de antibióticos de glucopéptido-cefalosporina reticulados según las formas de realización seleccionadas de la invención.
La figura 2 presenta un esquema de síntesis para preparar compuestos intermedios de cefalosporina que son útiles para preparar antibióticos de glucopéptido-cefalosporina reticulados.
Las figuras 3 a 6 presentan esquemas de síntesis para preparar antibióticos de glucopéptido-cefalosporina reticulados representativos, denominados en la presente memoria Ia, Ib, Id y Ie, respectivamente.
Las figuras 7 y 8 presentan esquemas de síntesis para preparar análogos con cloro de antibióticos de glucopéptido-cefalosporina reticulados.
Las figuras 9 y 10 presentan esquemas de síntesis para preparar más antibióticos de glucopéptido-cefalosporina reticulados representativos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona nuevos compuestos de glucopéptido-cefalosporina de fórmula I o II, o de sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Estos compuestos presentan múltiples centros quirales y, a este respecto, se pretende que los compuestos presenten la estereoquímica mostrada. En particular, la parte de glucopéptido del compuesto se pretende que tenga la estereoquímica del glucopéptido natural correspondiente (es decir, vancomicina, cloroorienticina A y similares). La parte de cefalosporina de la molécula se pretende que tenga la estereoquímica de los compuestos conocidos de cefalosporina. Sin embargo, los expertos en la materia podrán apreciar que cantidades menores de isómeros tienen una estereoquímica diferente de la mostrada pueden estar presentes en las composiciones de la presente invención siempre que la utilidad de la composición en conjunto no disminuya de manera significativa por la presencia de dichos isómeros.
Además, la parte que se une de los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más centros quirales por lo general, esta parte de la molécula se preparará en forma de mezcla racémica. Si se desea, sin embargo, pueden utilizarse estereoisómeros puros (es decir, enantiómeros o diastereómeros individuales) o puede emplearse una mezcla enriquecida en estereoisómeros. Todos los dichos estereoisómeros y las mezclas enriquecidas están incluidos dentro del alcance de la presente invención.
Además, los compuestos de la presente invención contienen varios grupos ácidos (es decir, grupos de ácido carboxílico) y varios grupos básicos (es decir, grupos de amina primaria y secundaria) y por consiguiente, los compuestos de fórmula I pueden existir en varias formas salinas. Todas las formas salinas mencionadas se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Asimismo, como los compuestos de fórmula I contienen un anillo de piridinio, un contraión aniónico para el grupo piridinio puede estar presente opcionalmente, incluyendo, pero sin limitarse a, haluros, tal como cloruro; carboxilatos, tal como acetato; y similares.
Definiciones
La siguiente terminología, tal como se utiliza en la presente memoria, tiene los significados siguientes, a menos que se indique de otra manera:
El término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado monovalente que puede ser lineal o ramificado. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos alquilo contienen por lo general de 1 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo representativos incluyen, a título de ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo y similares.
El término "alquileno" se refiere a un grupo hidrocarbonado saturado divalente que puede ser lineal o ramificado. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos alquileno contienen por lo general de 1 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquileno representativos incluyen, a título de ejemplo, metileno, etano-1-2-diilo ("etileno"), propano-1,2-diilo, propano-1,3-diilo, butano-1,4-diilo, pentano-1,5-diilo y similares.
El término "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado insaturado monovalente que puede ser lineal o ramificado y que tiene por lo menos, y por lo general 1, 2 ó 3, dobles enlace carbono-carbono. A menos que se defina de otra manera dichos grupos alquenilo contienen por lo general de 2 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquenilo representativos incluyen, a título de ejemplo, etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-but-2-enilo, n-hex-3-enilo y similares.
El término "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado insaturado monovalente que puede ser lineal o ramificado y que tiene por lo menos, y por lo general 1, 2 ó 3, triples enlace carbono-carbono. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos alquinilo contienen por lo general de 2 a 10 átomos de carbono. Los grupos alquinilo representativos incluyen, a título de ejemplo, etinilo, n-propinilo, n-but-2-inilo, n-hex-3-inilo y similares.
El término "arilo" se refiere a un hidrocarburo aromático monovalente que tiene un solo anillo (es decir, fenilo) o anillos fusionados (es decir, naftaleno). A menos que se defina de otra manera, dichos grupos arilo por lo general contienen de 6 a 10 átomos en el anillo de carbono. Grupos arilo representativos incluyen, a título de ejemplo, fenilo y naftalen-1-ilo, naftalen-2-ilo y similares.
El término "arileno" se refiere a un hidrocarburo aromático divalente con un solo anillo (es decir, fenileno) o anillos fusionados (es decir, naftalenodiilo). A menos que se defina de otra manera, dichos grupos arileno contienen por lo general de 6 a 10 átomos en el anillo de carbono. Los grupos arileno representativos incluyen, a título de ejemplo, 1,2-fenileno, 1-3-fenileno, 1,4-fenileno, naftaleno-1,5-diilo, naftaleno-2,7-diilo y similares.
El término "cicloalquilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado carbocíclico saturado monovalente. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos cicloalquilo contienen por lo general de 3 a 10 átomos en el anillo de carbono. Los grupos cicloalquilo representativos incluyen, a título de ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares.
El término "cicloalquileno" se refiere a un hidrocarbonado carbocíclico saturado divalente. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos cicloalquileno contienen por lo general de 3 a 10 átomos de carbono. Los grupos cicloalquileno representativos incluyen, a título de ejemplo, ciclopropano-1,2-diilo, ciclobutil-1,2-diilo, ciclobutil-1,3-diilo, ciclopentilo-1,2-diilo, ciclopentilo-1,3-diilo, ciclohexilo-1,2-diilo, ciclohexilo-1,3-diilo, ciclohexil-1,4-diilo y similares.
El término "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "heteroarilo" se refiere a un grupo aromático monovalente con un solo anillo o dos anillos fusionados y que contiene en el anillo por lo menos un heteroátomo (por lo general 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de entre nitrógeno, oxígeno o azufre. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos heteroarilo contienen por lo general de 5 a 10 átomos en total en el anillo. Los grupos heteroarilo representativos incluyen, a título de ejemplo, especies monovalentes de pirrol, imidazol, tiazol, oxazol, furano, tiofeno, triazol, pirazol, isoxazol, isotiazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, triazina, indol, benzofurano, benzotiofeno, bencimidazol, benzotiazol, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina y similares, donde el punto de acoplamiento es en cualquier átomo del anillo de carbono o nitrógeno disponible.
El término "heteroarileno" se refiere a un grupo aromático divalente con un solo anillo o dos anillos fusionados y que contiene por lo menos un heteroátomo (por lo general 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de entre nitrógeno, oxígeno o azufre en el anillo. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos heteroarileno contienen por lo general de 5 a 10 átomos en total en el anillo. Los grupos heteroarileno representativos incluyen, a título de ejemplo, especies divalentes de pirrol, imidazol, tiazol, oxazol, furano, tiofeno, triazol, pirazol, isoxazol, isotiazol, piridina, pirazina, piridazina, pirimidina, triazina, indol, benzofurano, benzotiofeno, bencimidazol, benzotiazol, quinolina, isoquinolina, quinazolina, quinoxalina y similares, donde el punto de acoplamiento es en cualquier átomo del anillo de carbono o nitrógeno disponible.
El término "heterociclilo" o "heterocíclico" se refiere a un grupo (no aromático) monovalente o divalente, saturado o insaturado, que tiene un solo anillo o múltiples anillos condensados y que contiene en el anillo por lo menos un heteroátomo (por lo general de 1 a 3 heteroátomos) seleccionados de entre nitrógeno, oxígeno o azufre. A menos que se defina de otra manera, dichos grupos heterocíclicos por lo general contienen de 2 a 9 átomos en total en el anillo. Los grupos heterocíclicos representativos incluyen, a título de ejemplo, especies monovalentes de pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, piperidina, 1,4-dioxano, morfolina, tiomorfolina, piperazina, 3-pirrolidina y similares, donde el punto de acoplamiento es en cualquier átomo de carbono o nitrógeno del anillo disponible.
El término "cefalosporina" se utiliza en la presente memoria en su manera reconocida en la técnica para referirse a un sistema con anillo de \beta-lactama que tiene la fórmula general y el sistema de numeración siguientes:
4
en la que R^{x} y R^{y} representan la parte restante de la cefalosporina.
La expresión "antibiótico glucopeptídico" o "grupo péptido" se utiliza en la presente memoria en la forma reconocida por la técnica para referirse a la clase de antibióticos conocidos como glupopéptidos o dalbahpéptidos. Véase, por ejemplo, R. Nagarajan, "Glycopeptide Antibiotics", Marcel Dekker, Inc. (1994) y las referencias citadas en la misma. Los glucopéptidos representativos incluyen vancomicina, A82846A (eremomicina), A82846B (cloroorienticina A), A82846C, PA-42867-A (orienticina A), PA-42867-C, PA-42867-D y similares.
El término "vancomicina" se utiliza en la presente memoria de la manera reconocida en la técnica para referirse al antibiótico glucopeptídico conocido como vancomicina. En los compuestos de la presente invención, el punto de acoplamiento del resto de unión está en el "terminal C" de la vancomicina.
La expresión "antibióticos de glucopéptido-cefalosporina reticulados" se refiere a la conjugación covalente de un componente glucopeptídico con un componente de cefalosporina.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a la sal que es aceptable para la administración a un paciente, tal como un mamífero (por ejemplo, sales que tienen seguridad aceptable para mamífero para un régimen de dosificación dado). Dichas sales pueden proceder de bases inorgánicas u orgánicas farmacéuticamente aceptables y de ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. Las sales derivadas de bases inorgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen aluminio, amonio, calcio, cobre, férrica, ferrosa, litio, magnesio, mangánica, manganosa, potasio, sodio, zinc y similares. Resultan particularmente preferidas las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio. Las sales procedentes de bases orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, incluyendo las aminas sustituidas, aminas cíclicas, aminas naturales y similares, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares. Las sales derivadas de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen de los ácidos acético, ascórbico, bencensulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etansulfónico, fumárico, glucónico, glucurónico, glutámico, hipúrico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, lactobiónico, maleico, málico, mandélico, metansulfónico, múcico, naftalensulfónico, nicotínico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluensulfónico y similares. Resultan particularmente preferidos los ácidos cítrico, bromhídrico, clorhídrico, maleico, fosfórico, sulfúrico y tartárico.
La expresión "sal del mismo" se refiere a un compuesto formado cuando el hidrógeno de un ácido se sustituye por un catión, tal como un catión metálico o un catión orgánico y similares (por ejemplo, un catión NH_{4}^{+} y similares). Preferentemente, la sal es una sal farmacéuticamente aceptable, aunque esto no se requiere para las sales de los compuestos intermedios que no se desean para la administración a un paciente.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento cuando se administra a un paciente necesitado de tratamiento.
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El término "tratamiento" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al tratamiento de una enfermedad o afección (tal como una infección bacteriana) en un paciente, tal como un mamífero (particularmente un ser humano o un animal de compañía) que incluye:
(a)
impedir que ocurra la enfermedad o afección, es decir, tratamiento profiláctico de un paciente;
(b)
mejorar la enfermedad o afección, es decir, eliminar o producir la regresión de la enfermedad o de la afección en un paciente;
(c)
suprimir la enfermedad o afección, es decir, disminuir o detener el desarrollo de la enfermedad o afección en un paciente; o
(d)
aliviar los síntomas de la enfermedad o afección en un paciente.
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La expresión "cantidad inhibidora de crecimiento" se refiere a una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento o la reproducción de un microorganismo o suficiente para producir la muerte o crisis del microorganismo incluyendo las bacterias gram-positivas.
La expresión "cantidad inhibidora de biosíntesis de la pared celular" se refiere a una cantidad suficiente para inhibir la biosíntesis de la pared celular en un microorganismo incluyendo las bacterias gram-positivas.
La expresión "grupo saliente" se refiere a un grupo funcional o átomo que puede ser desplazado por otro grupo funcional o átomo en una reacción de sustitución, tal como una reacción de sustitución nucleófila. A título de ejemplo, los grupos salientes representativos incluyen grupos de cloro, bromo y yodo; y grupos de éster-sulfónico, tales como mesilato, tosilado, brosilato, nosilato y similares; grupos de éster activado, tales como 7-azabenzo-triazol-1-oxi y similares; grupos aciloxi, tales como acetoxi, trifluorocitoxi y similares.
La expresión "derivados protegidos de los mismos" se refiere a un derivado del compuesto especificado en el que uno o más grupos funcionales del compuesto están protegidos de reacciones no deseadas con un grupo protector o de bloqueo. Los grupos funcionales que pueden ser protegidos incluyen, a título de ejemplo, grupos de ácido carboxílico, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos tiol, grupos carbonilo y similares. Los grupos protectores representativos para los ácidos carboxílicos incluyen éster (tal como un éster de p-metoxibencilo), amidas e hidrazidas; para grupos amino, carbamatos (tal como terc-butoxicarbonilo) y amidas; para grupos hidroxilo, éteres y ésteres; para grupos tiol, tioéteres y tioésteres; para grupos carbonilo, acetales y cetales; y similares. Dichos grupos protectores son muy conocidos por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en T. W. Greene y G.M. Wuts, Protecting Groups in Organcis Synthesis, tercera edición, Wiley, Nueva York, 1999, y las referencias citadas en la presente memoria.
La expresión "grupo protector de amino" se refiere a un grupo protector adecuado para evitar reacciones no deseadas en un grupo amino. Los grupos protectores de amino representativos incluyen, pero no se limitan a, terc-butoxicarbonilo (BOC), tritilo (Tr), benciloxicarbonilo (Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), formilo, trimetilsililo (TMS), terc-butildimetilsililo (TBS), y similares.
La expresión "grupo protector de carboxi" se refiere a un grupo protector adecuado para impedir reacciones no deseadas en el grupo carboxi. Los grupos protectores de carboxi representativos incluyen, pero no se limitan a, ésteres, tales como de metilo, etilo, terc-butilo, bencilo (Bn), p-metoxibencilo (PMB), 9-fluorenilmetilo (Fm), trimetilsililo (TMS), terc-butildimetilsililo (TBS), difenilmetilo (benzhidrilo, DMP) y similares.
Un "derivado activado", con respecto a un ácido carboxílico o un derivado protegido del mismo, se refiere al producto, por lo general un éster reactivo, resultante de la reacción del ácido carboxílico o derivado con un agente de activación (acoplamiento), tales como, por ejemplo, 1-hidroxibenzotriazol (HOBT), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) u otros descritos a continuación o conocidos de otra manera en la técnica.
Una "cadena lateral de un aminoácido natural" se refiere al grupo R en la fórmula HOOC-CHR-NH_{2}, en la que esta fórmula representa un aminoácido seleccionado de entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina, y seleccionado preferentemente de entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, serina, treonina y valina.
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Formas de realización representativas de los compuestos de la invención
Los sustituyentes y valores siguientes se pretende que proporcionen ejemplos representativos y formas de realización de varios aspectos de la presente invención. Estos valores representativos se pretende que definan además dichos aspectos y formas de realización y no se pretende que excluyan otras formas de realización o limiten el alcance de la presente invención. A este respecto, la representación que un valor o sustituyente determinado se prefiere no se pretende de ninguna manera que excluya otros valores o sustituyentes de la presente invención a menos que se indique específicamente.
En los compuestos de fórmula I, cualquier grupo heteroarileno o heterocíclico presente en R'' preferentemente tiene 5 ó 6, por lo general 6, átomos totales en el anillo, y cada grupo arilo tiene 6 átomos totales en el anillo. El grupo R'' es preferentemente una cadena de alquileno y preferentemente es lineal.
Cada grupo R^{3}, cuando está presente, se selecciona preferentemente independientemente de entre alquilo C_{1-4} y sustituido alcoxi C_{1-4}, fluoro y cloro. En una forma de realización, n es 1 ó 2 y cada R^{3} se selecciona independientemente de entre metilo, metoxi, fluoro y cloro. En otra forma de realización, n es cero, de modo que ningún grupo R^{3} está presente.
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En una forma de realización preferida, R^{8} es hidrógeno. En otra forma de realización preferida, R^{8} es un grupo de fórmula:
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En las formas de realización seleccionadas, R^{9} es hidrógeno o alquilo C_{1-4}, incluyendo hidrógeno o metilo. En otra forma de realización R^{9} es hidrógeno. En otra forma de realización, R^{9} es metilo.
En otra forma de realización, W es CCl. En otra forma de realización, W es N.
Las formas de realización seleccionadas de otras variables de fórmula I incluyen, independientemente una de la otra: para X^{1} y X^{2}, cloro; para R^{2}, hidrógeno o alquilo C_{1-4}; para R^{4} y R^{5}, hidroxilo e hidrógeno, respectivamente; para R^{6} y R^{7}, hidrógeno y metilo, respectivamente; y para R^{8}, hidrógeno.
En otras formas de realización seleccionadas, R^{a} es -Y-R'', en la que R'' es alquileno C_{1-6}, alquenileno C_{2-6}, o alquinileno C_{2-6} e Y se seleccionada de entre un enlace directo, NR', O, S, C(O), NR'(CO) y (CO)NR', en las que R' es hidrógeno o metilo. En una forma de realización, Y es un enlace directo. En otras formas de realización del grupo R^{a}, R'' es alquileno C_{1-6} o, más preferentemente alquileno C_{1-4}, por ejemplo, metileno, etileno, propileno o butileno.
Preferentemente, en el grupo R^{a}, Y es un enlace directo, y R'' es alquileno C_{1-6} o, más preferentemente, alquileno C_{1-4}, por ejemplo, metileno.
El anillo de piridinio en la formula I está por lo general sustituido en meta o para, más generalmente sustituido en para.
Preferentemente la variable x es 0 ó 1. Cuando x no es 0, el grupo R^{b} se selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1-4} o alquenilo C_{2-4}. En una forma de realización, R^{b} es hidrógeno o alquilo C_{1-4}.
El grupo R^{c}, cuando x no es 0, es preferentemente -Y'-R''-Y'-, en la que cada Y' se selecciona independientemente de entre un enlace directo, O, y NR', en la que R' es hidrógeno o metilo, y R'' se selecciona de entre alquileno C_{1-12}, alquenileno C_{2-12}, y alquinileno C_{2-12}, en la que los grupos alquileno, alquenileno o alquinileno están opcionalmente sustituidos con 1 ó 2 grupos seleccionados de entre Z o la cadena lateral de un aminoácido natural. Preferentemente, en el grupo R^{c}, cada Y' es un enlace directo, y R'' es alquileno C_{1-12} o alquenileno C_{2-12}, que pueden estar sustituidos con 1 ó 2 grupos seleccionados de entre Z y la cadena lateral de un aminoácido natural. En otra forma de realización del grupo R^{c}, R'' es alquileno C_{1-12}, incluyendo alquileno C_{1-6}, y está insustituido o sustituido con un grupo -COOH.
Preferentemente, la variable y es 0 ó 1. Cuando y no es 0, el grupo R^{d} se selecciona preferentemente de entre el grupo constituido por hidrógeno y alquilo C_{1-4}, y, en las formas de realización seleccionadas, hidrógeno y metilo. En una forma de realización, R^{d} es H. El grupo R^{e}, cuando y no es 0, se selecciona preferentemente de entre alquileno C_{1-12}, alquenileno C_{2-12}, y alquinileno C_{2-12}. En una forma de realización, R^{e} es alquileno C_{1-12}. Más preferentemente, R^{e} se selecciona de entre alquileno C_{1-6}, alquenileno C_{2-6} y alquinileno C_{2-6}, y aún más preferentemente de entre alquenileno C_{2-4} y alquileno C_{1-4}.
El grupo R^{2}, en las formas de realización seleccionadas, es hidrógeno o alquilo C_{1-4}. En formas de realización adicionales, R^{2} es hidrógeno o metilo; en una forma de realización, R^{2} es hidrógeno.
En las formas de realización seleccionadas, x e y se seleccionan independientemente de entre 0 y 1.
Por consiguiente, las formas de realización preferidas incluyen compuestos en los que x + y = 0, compuestos en los que x + y = 1, y compuestos en los que x + y = 2. Alternativamente, las formas de realización preferidas incluyen compuestos en los que la estructura "enlazadora", representada por "L" en la figura 1, incluye no más de aproximadamente 30 átomos de carbono, excluyendo el anillo de piridinio.
Un ejemplo de un compuesto de la invención en el que x = y = 1 es el compuesto denominado en la presente memoria Ia. Los ejemplos de los compuestos de la invención en los que x = 1 e y = 0 incluyen los denominados en la presente memoria Ib, Ic, y Ie. Los ejemplos de compuestos de la invención en los que x = y = 0 incluyen los denominados en la presente memoria Id y If (véase la figura 1).
Una clase ilustrativa de compuestos de estructura I es aquella en la que: x es 0 ó 1; y es 0 ó 1; R^{a} es metileno; R^{b} (cuando x es 1) es hidrógeno, metilo o etilo; R^{c} (cuando x es 1) es alquileno C_{1-12}, preferentemente alquileno C_{1-6}, por ejemplo, etileno o n-pentileno (-(CH_{2})_{5}-), que puede estar sustituido con -COOH; R^{d} (cuando y es 1) es hidrógeno; y R^{e} (cuando y es 1) es etileno (-CH_{2}CH_{2}-). Las formas de realización específicas de esta clase de estructura I incluyen los compuestos denominados en la presente memoria Ia, Ib, Ic, Id, Ie e If. En una forma de realización de esta clase, x es 1; y es 0; R^{a} es metileno; R^{b} es hidrógeno, metilo o etilo; y R^{c} es alquileno C_{2-6}, por ejemplo, etileno o n-pentileno (-(CH_{2})_{5}-). Las formas de realización específicas de esta clase de estructura I incluyen los compuestos denominados en la presente memoria Ib e Ic.
Un subconjunto de compuestos de la invención de fórmula I pueden también estar definidos por la formula II. En las formas de realización seleccionadas de fórmula II, W es CCl. En otras formas de realización seleccionadas, R^{9} es hidrógeno o alquilo C_{1-4}, incluyendo hidrógeno o metilo.
R^{10} es hidrógeno o alquilo C_{1-6}, preferentemente hidrógeno o alquilo C_{1-4}, incluyendo hidrógeno, metilo o etilo. En otra forma de realización, R^{10} es etilo.
En más formas de realización seleccionadas, R^{11} es alquileno C_{1-10}, preferentemente R^{11} es alquileno C_{2-10}, y más preferentemente alquileno C_{2-6}, por ejemplo, -(CH_{2})_{2}- o -(CH_{2})_{5}-.
En cuanto a la fórmula I anterior, el anillo de piridinio en la fórmula II está por lo general sustituido en meta o para, más generalmente sustituido en para.
Los ejemplos de compuestos de la invención según la fórmula II incluyen los denominados en la presente memoria Ib y Ic (véase la figura 1).
Si bien no se pretende estar limitado por la teoría, los compuestos de fórmulas I y II se cree que inhiben la biosíntesis de la pared celular bacteriana, inhibiendo de este modo el crecimiento de las bacterias o produciendo la lisis de las bacterias. Por consiguiente, son útiles como antibióticos.
Entre otras propiedades, los compuestos de la invención se ha descubierto que poseen potencia sorprendente e inesperada frente a las bacterias gram-positivas, incluyendo el Staphylococci aureus resistente a la meticilina (MRSA) y el Staphylococci epidermitis resistente a la meticilina (MRSE), como se describe con más detalle a continuación.
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Procedimientos generales de síntesis
Los compuestos de glucopéptido-cefalosporina reticulados de la presente invención pueden prepararse a partir de materiales de partida fácilmente disponibles, preferentemente mediante los compuestos intermedios 1 a 5 descritos en la presente memoria. Se apreciará que cuando se proporcionan las condiciones del proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, reacciones molares de los reactivos, disolventes, presiones, etc.) se proporcionan, pueden utilizarse también otras condiciones de proceso, determinadas por cualquier experto en la materia, a menos que se indique de otra manera. Las condiciones óptimas de reacción pueden variar con los reactivos o disolventes específicos utilizados, pero dichas condiciones pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la materia mediante procedimientos rutinarios de optimización.
Además, como resultará evidente para los expertos en la materia, los grupos protectores convencionales pueden ser necesarios o deseados para impedir que determinados grupos funcionales experimenten reacciones indeseadas. Los grupos protectores adecuados para un grupo funcional específico, así como las condiciones adecuadas para la protección y desprotección de dichos grupos funcionales, son bien conocidos en la técnica. Los grupos protectores a parte de los ilustrados en los procedimientos descritos en la presente memoria pueden utilizarse, si se desean. Por ejemplo, numerosos grupos protectores y medios para su introducción y separación, se describen en T. W. Greene y G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, tercera edición, Wiley, Nueva York, 1999, y las referencias mencionadas en la presente memoria.
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En un procedimiento de síntesis preferido, los compuestos de fórmula I en los que y es 0, o, en las formas de realización seleccionadas, los compuestos de fórmula II, se preparan haciendo reaccionar un glucopéptido de fórmula 1:
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en la que R^{4}-R^{8}, X^{1} y X^{2} son como se definen en la presente memoria, o una sal, o un derivado de carboxilo en el terminal C activado y/o un derivado protegido en amino de la misma, con un compuesto de fórmula 3 ó 4:
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en la que W, R^{2}, R^{3}, R^{9}, R^{a-e}, n, x e y son tal como se definen en la presente memoria, o una sal o derivado protegido en carboxi de la misma; para proporcionar un compuesto de la formula I o II, o una sal o derivado protegido de la misma. Las formas de realización preferidas 1, 3 y 4 son como se definieron anteriormente.
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En la preparación de los compuestos de fórmula II, las variables en las estructuras 1, 3 y/o 4 se definen de la manera siguiente: n es 0; x es 1; y es 0, R^{a} es CH_{2}; R^{b} es hidrógeno o alquilo C_{1-6} (como se ha definido para R^{10} anteriormente); R^{c} es alquileno C_{1-12} (como se ha definido para R^{11} anteriormente); R^{2}, R^{5} y R^{6} son hidrógeno; R^{7} es CH_{3}; R^{9} es tal como se define en la presente memoria; R^{4} es OH; y X^{1} y X^{2} son Cl.
Por lo general, la reacción se lleva a cabo acoplando el glucopéptido 1, o una sal del mismo, con aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5 equivalentes, preferentemente de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,1 equivalentes, de un compuesto de fórmula 3 ó 4, en un diluyente inerte, tal como DMF, utilizando un reactivo de acoplamiento de ácido carboxílico-amina (péptido) convencional, como se expone con más detalle a continuación. En esta reacción, el glucopéptido 1, o una sal del mismo, se pone en primer lugar en contacto por lo general con el reactivo de acoplamiento en presencia de un exceso, preferentemente de aproximadamente 1,8 a aproximadamente 2,2 equivalentes, de una amina, tal como la disopropiletilamina a una temperatura que oscila entre aproximadamente -20ºC a aproximadamente 25ºC, preferentemente a temperatura ambiente, durante aproximadamente 0,25 a aproximadamente 3 horas. Preferentemente el exceso de ácido trifluoroacético (por lo general de aproximadamente 2 equivalentes) se añade a continuación para formar una sal de TFA de algún exceso disopropiletilamina. La reacción se enfría a continuación generalmente a una temperatura entre aproximadamente -20ºC a aproximadamente 10ºC, preferentemente a 0ºC, y se añade el compuesto intermedio 3 ó 4, seguido de 2,4,6-colidina en exceso. Esta reacción por lo general se mantiene a aproximadamente 0ºC durante aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas, o hasta que la reacción esté sustancialmente completa.
Alternativamente, para preparar los compuestos de fórmula I en los que y no es 0, un derivado glucopeptídico de fórmula 2, en la que R^{2}, R^{4}-R^{8}, R^{d-e}, X^{1} y X^{2} son como se definen en la presente memoria, o una sal o derivado protegido de la misma, pueden hacerse reaccionar con una compuesto intermedio de fórmula 5, en la que W, R^{3}, R^{9}, R^{a-c}, n y x son como se definen en la presente memoria, o una sal o derivado activado o protegido de la misma. Las formas de realización preferidas de 2 y 5 son como se describieron anteriormente.
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Por lo general, dicha reacción de acoplamiento se realiza haciendo reaccionar una sal del compuesto intermedio 2, tal como una sal de trifluoroacetato, con aproximadamente 0,5 a 1,5 equivalentes de un éster activado del compuesto intermedio 5, en presencia de una base, tal como colidina. Preferentemente R^{d} es hidrógeno en este caso, de modo que la reacción está favorecida en la amina primaria con terminal C. Véase, por ejemplo, la preparación de Ia ilustrada en la figura 3 y descrita con mayor detalle en el Ejemplo 4.
Para la preparación de los compuestos de fórmula I en la que y>1, puede seguirse una estrategia similar, en la que una o más adiciones de un aminoácido, por ejemplo, de estructura HNR^{d}-R^{e}-COOH, para el grupo -NHR^{d} con terminal C del compuesto intermedio 2 precede la reacción con el compuesto intermedio 5.
Los reactivos de acoplamiento preferidos, o reactivos de activación, para su utilización en estas reacciones incluyen el hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxi tripirrolidino-fosfonio (PyBOP), utilizado preferentemente en la cantidad de aproximadamente 0,5 a 1,5 equivalentes, preferentemente aproximadamente 0,9 a 1,1 equivalentes, en combinación con aproximadamente 0,5 a 1,5 equivalentes, preferentemente aproximadamente 0,9 a 1,1 equivalentes, de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt). Otros reactivos de acoplamiento adecuados incluyen hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-y)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU); cloruro de bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfórico (BOP-Cl); difenilfosforil azida (DPPA); cloruro difenilfosfírico; clorofosfato de dicenilo (DPCP) y HOAt; hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDAC); difenilfosfinato de pentafluorofenilo, y similares.
Una vez completada la reacción de acoplamiento, algunos grupos protectores presentes en el producto se eliminan a continuación utilizando procedimientos y reactivos convencionales. Por ejemplo, la desprotección de N-tritilo, N-BOC (N-terc-butoxicarbonilo) y/o COO-PMB (éster para-metoxibencílico) pueden efectuarse mediante tratamiento con ácido trifluoroacético en exceso y anisol en exceso o trietilsilano en un diluyente inerte, tal como diclorometano o heptano, a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a aproximadamente 12 horas, o hasta que se termine la reacción. El producto desprotegido puede purificarse utilizando procedimientos convencionales, tales como cromatografía en columna, HPLC, recristalización y similares.
Los glucopéptidos de fórmula 1 adecuados para su utilización en el procedimiento anterior están comercializados o pueden prepararse por fermentación del organismo productor de glucopéptidos apropiado, seguido del aislamiento del glucopéptido a partir del caldo de fermentación resultante utilizando procedimientos y equipo reconocidos en la técnica. El derivado 2 se prepara fácilmente por reacción de 1 con una diamina, tal como se describe, por ejemplo, en ejemplo 3.
Los compuestos intermedios 3 y 4 de cefalosporina utilizados en los procedimientos anteriores se preparan fácilmente a partir de materiales de partida y reactivos comercializados utilizando procedimientos convencionales. A título de ejemplo, un compuesto intermedio de fórmula 4 puede prepararse como se muestra en la figura 2 y se describe en los ejemplos 1 y 2. En resumen, el ácido 2-amino-5-cloro-\alpha-metoxiimino-4-triazol (6) se hizo reaccionar con el éster amino cefalosporínico 7, catalizado con EDAC, que forma un enlace amida. Este producto (8) se trató a continuación con TFA y anisol para escindir el éster de PMB, seguido por desplazamiento del cloruro primario con un derivado de piridina. El derivado de piridina contiene sustituyentes -Rª-NHR^{2} y opcionalmente sustituyente(s) R^{3}, como se muestra en la estructura 4 anterior. En la preparación mostrada en la figura 2, se emplea el compuesto 4-(N-t-BOC-N-etil) aminometil piridina (9), de modo que Rª es metileno y R^{2} es etilo. Esta reacción proporciona el compuesto intermedio (10) en forma protegida; la desprotección con TFA proporciona el compuesto intermedio 4a (compuesto intermedio 4 en el que W es CCl, R^{9} es Me, n es 0, Rª es CH_{2}, y R^{2} es Et).
En un procedimiento alternativo, el producto 8 se hizo reaccionar con yoduro de sodio en acetona, seguido de la reacción con 9. La reacción con TFA/anisol se utilizó a continuación para eliminar tanto los grupos protegidos Boc como PMB.
Varias piridinas sustituidas para su utilización en las reacciones anteriores están comercializadas o pueden prepararse con materiales de partida y reactivos comercializados utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, varias piridinas sustituidas con aminoalquilo están comercializadas, por ejemplo aminometil piridinas, en las que Rª es metileno, y aminoetil piridinas, en las que Rª es etileno, o puede ser preparado utilizando procedimientos convencionales de síntesis orgánica. Los derivados de piridina sustituidos representativos para su utilización de esta reacción incluyen aquellos en los que R^{3} se selecciona de entre metilo, metoxi, tiometoxi, carboxitiometoxi, fluoro, cloro, fenilo, ciclopropilo, ácido carboxílico, carboxiamida y combinaciones de los mismos. Para la preparación de compuestos en los que Y, que une R'' al anillo de piridinio, se selecciona de entre NR', O (éter), S (sulfuro), C(O) (carbonilo), NR'(CO) y (CO)NR'), compuestos de piridina de partida están comercializados o pueden prepararse por procedimientos muy conocidos. Por ejemplo, 3-hidroxipiridina, 4-hidroxipiridina, 3-aminopiridina, 4-aminopiridina, 4-mercaptopiridina, ácido nicotínico y ácido isonicotínico están comercializados por Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI.
El compuesto intermedio 4 puede sustituirse más para formar compuestos intermedios de fórmula 3. Por ejemplo, figura 4 presenta la reacción de un compuesto intermedio de fórmula 4 con N-(t-BOC)-\beta-alanina (véase el ejemplo 5, preparación de Ib) y con ácido aspártico (véase el ejemplo 8, preparación de Ie) para formar compuestos intermedios de fórmula 3, en la que x es 1, tras de la desprotección. La adición o adiciones adicionales de \beta-alanina o compuestos similares, tales como otros aminoácidos, podría emplearse para formar intermedios de fórmula 3, en la que x>1.
La reacción del intermedio 4 con un diácido, por ejemplo de la estructura HOOC-R^{c}-COOH, puede emplearse (con reactivos adecuados de activación y/o protección) para formar los compuestos intermedios de fórmula 5, en los que x es 1 (véase la figura 3; Ejemplo 4; preparación de Ia). Para formar los compuestos intermedios de fórmula 5 en los que x > 1, el compuesto intermedio 4 se haría reaccionar en primer lugar con uno o más moles de un aminoácido (por ejemplo, de estructura HOOC-R^{c}-NHR^{b}).
Al preparar los compuestos en los que, en el grupo R^{c}, Y' se selecciona de entre O (éter) y NR' (en lugar de un enlace directo), los restos enlazadores incluyendo R^{c} incluirán uno o más enlaces de carbamato o urea, en lugar de enlaces amida. Dichos enlaces pueden formarse por procedimientos convencionales. Por ejemplo, una amina (tal como -NHR^{2} en el compuesto intermedio 3 ó 4) pueden reaccionar con un isocianato o un cloroformato para formar, respectivamente, un enlace urea o carbamato.
En los ejemplos publicados a continuación se describen más detalles con respecto a las condiciones de reacción específicas y a los procedimientos para preparar compuestos representativos de la presente invención o intermedios para éstos.
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Composiciones farmacéuticas
Los compuestos de glucopéptido-cefalosporina reticulados de la presente invención se administran por lo general a un paciente en forma de composición farmacéutica. Por consiguiente, en uno de sus aspectos de la composición, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I o II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Cualquier portador o excipiente convencional puede utilizarse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. La elección de un portador o excipiente determinado, o las combinaciones de portadores o excipientes, dependerá del modo de administración que se utilice para tratar un paciente determinado o tipo de infección bacteriana. A este respecto, la preparación de una composición farmacéutica adecuada para un modo concreto de administración, tal como la administración oral, tópica, inhalada o parenteral, está comprendida dentro del alcance de los expertos en materias farmacéuticas. Además, los ingredientes para dichas composiciones están comercializados por, por ejemplo, Sigma, P.O. Box 14508, San Luis, MO 63178. En aras de ilustración adicional, se describen técnicas de formulación convencionales en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17ª Ed. (1985) y "Modern Pharmaceutics", Marcel Dekker, Inc. 3ª Ed. (G.S. Banker & C.T. Rhodes, Eds.).
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención contendrán por lo general una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de formula I o II o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por lo general, dichas composiciones farmacéuticas contendrán entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 90% en peso del agente activo, y más generalmente de 10 a aproximadamente 30% de agente activo.
Las composiciones farmacéuticas preferidas de la presente invención son las adecuadas para administración parenteral, particularmente la administración intravenosa. Dichas composiciones farmacéuticas por lo general comprenden una solución acuosa estéril, fisiológicamente aceptable que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I o II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Las soluciones en portador acuoso fisiológicamente aceptables adecuadas para la administración intravenosa de agentes activos son muy conocidas en la técnica. Dichas soluciones acuosas incluyen, a título de ejemplo, dextrosa al 5%, soluciones de Ringer (inyección lacteada de Ringer, Ringer lacteada más inyección de dextrosa al 5%, inyección de Ringer acilada), Normosol-M, Isolite E, y similares.
Opcionalmente, dichas soluciones acuosas pueden contener un cosolvente, por ejemplo, polietilenglicol; un agente quelante, por ejemplo, ácido etilendiamin-tetraacético; un agente disolvente, por ejemplo, una ciclodextrina; un antioxidante, por ejemplo metabisulfito sódico; y similares.
Si se desea, las composiciones farmacéuticas acuosas de la presente invención pueden liofilizarse y posteriormente redisolverse con un portador adecuado antes de la administración. En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica es una composición liofilizada que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de formula I o II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferentemente, el portador en esta composición comprende sacarosa, manitol, dextrosa, dextrano, lactosa o una combinación de los mismos. Más preferentemente, el portador comprende sacarosa, manitol o una combinación de los mismos.
En una forma de realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen ciclodextrina. Cuando se utilizan en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, la ciclodextrina es preferentemente hidroxipropil-\beta-ciclodextrina o éter sulfobutílico de \beta-ciclodextrina. En dichas formulaciones, la ciclodextrina comprenderá aproximadamente del 1 al 25 por ciento en peso; preferentemente, aproximadamente del 2 al 10 por ciento en peso de la formulación. Además, la relación ponderal de cliclodextrina a agente activo por lo general estará comprendida entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 10:1.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se acondicionan preferentemente en una forma farmacéutica unitaria. La expresión "forma farmacéutica unitaria" se refiere a una unidad físicamente discreta adecuada para dosificar a un paciente, es decir, cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de agente activo se calcula para producir el efecto terapéutico deseado solo o en combinación con una o más unidades adicionales. Por ejemplo, dichas formas farmacéuticas unitarias pueden estar envasadas en ampollas estériles, herméticamente selladas y similares.
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Las siguientes formulaciones ilustran composiciones farmacéuticas representativas de la presente invención:
Ejemplo A de formulación
Se prepara una solución congelada adecuada para preparar una solución inyectable de la forma siguiente:
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Procedimiento representativo: Los excipientes, si existen, se disuelven en aproximadamente 80% del agua para inyectables y el compuesto activo se añade y se disuelve. El pH se ajusta con hidróxido de sodio 1 M entre 3 y 4,5 y el volumen se ajusta a continuación al 95% del volumen final con agua para inyectables. El pH se comprueba y se ajusta, si es necesario, y el volumen se ajusta al volumen final con agua para inyectables. La formulación se filtra estéril a continuación a través de un filtro de 0,22 micras y se coloca en un vial estéril en condiciones asépticas. Se tapa el vial se etiqueta y se almacena congelado.
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Ejemplo B de formulación
Se prepara un polvo liofilizado adecuado para preparar una solución inyectable de la forma siguiente:
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Procedimiento representativo: Los excipientes y/o agentes tamponantes, si existen, se disuelven en aproximadamente 60% del agua para inyectables. El compuesto activo se añade y se disuelve y el pH se ajusta con hidróxido de sodio 1 M entre 3 y 4,5 y el volumen se ajusta al 95% del volumen final con agua para inyectables. El pH se comprueba y se ajusta, si es necesario, y el volumen se ajusta al volumen final con agua para inyectables. La formulación se filtra estéril a continuación a través de un filtro de 0,22 micras y se coloca en un vial estéril en condiciones asépticas. La formulación se liofiliza a continuación utilizando un ciclo de liofilización apropiado. Se tapa el vial (opcionalmente a vacío parcial o nitrógeno anhidro), se etiqueta y se almacena bajo refrigeración.
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Ejemplo C de formulación
Se prepara una solución inyectable para administración intravenosa a un paciente a partir del ejemplo B de formulación anterior de las formas siguientes:
Procedimiento representativo: El polvo liofilizado del Ejemplo B de formulación (por ejemplo, que contiene 10 a 1.000 mg de compuesto activo) se redisuelve con 20 ml de agua esterilizada y la solución resultante se diluye más con 80 ml de solución salina esterilizada en una bolsa de infusión de 100 ml. La solución diluida se administra a continuación al paciente por vía intravenosa durante 30 a 120 minutos.
Utilidad
Los compuestos de glucopéptido-cefalosporina reticulados de la invención son útiles como antibióticos. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención son útiles para tratar o prevenir infecciones bacterianas y otras enfermedades relacionadas con bacterias en mamíferos, incluyendo los seres humanos y sus animales de compañía (es decir, perros, gatos, etc.) que son producidas por microorganismos sensibles a los compuestos de la presente invención.
A título de ilustración, los compuestos de la presente invención son particularmente útiles para tratar o prevenir infecciones originadas por bacterias Gram-positivas y relacionadas con microorganismos. Por ejemplo, los compuestos de la presente invención son eficaces para tratar o prevenir infecciones originadas por determinados Enterococcus spp.; Staphylococcus spp., incluyendo los estafilococos negativos a la coagulasa (CNS); Streptococcus spp.; Listeria spp.; Clostridium ssp.; Bacillus spp.; y similares. Los ejemplos de especies bacterianas tratadas de manera eficaz con los compuestos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), Staphylococcus aureus sensible a la meticilina (MSSA), Staphylococcus aureus sensible al glucopéptido intermedio (GISA); Staphylococcus epidermitis resistente a la meticilina (MRSE); Staphylococcus epidermitis sensible a la meticilina (MSSE); Enterococcus faecalis sensible a la vancomicina (EFSVS); Enterococcus faecium sensible a la vancomicina (EFMVS); Streptococcus pneumoniae resistente a la penicilina (PRSP); Streptococcus pyogenes; y similares.
Como se muestra en la Tabla 2 del Ejemplo 16 a continuación, varios ejemplos de la invención, Ia-f, Im e In, fueron más eficaces que la vancomicina contra el Staphylococcus aureus sensible a la meticilina y el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, por un factor de 10 o más. Los compuestos fueron también significativamente más activos que sus análogos des-cloro Ig, Ij, y Ik, aunque estos compuestos eran también más activos que la vancomicina. En un ensayo "inactivador en el tiempo" como se describe en el Ejemplo 17, un compuesto de fórmula I, es decir el compuesto Ib, fue bactericida contra MRSA a una concentración \leq 1,0 \mug/ml en 4 horas. Comparativamente, la vancomicina era bactericida contra a MRSA a una concentración de 4 \mug/ml en 24 horas. En un ensayo in vivo en ratones neutrocitopénicos, como se describe en el Ejemplo 18, un compuesto de fórmula I, es decir el compuesto Ib, tenía una ED_{50} de <0,1 mg/kg, iv, en comparación una ED_{50} de 9 mg/kg, iv, para la vancomicina.
En general, resultan preferidos los compuestos de la invención para tratar o prevenir infecciones producidas por cepas de bacterias que son sensibles a glucopéptidos o cefalosporinas.
Los tipos representativos de infecciones o afecciones médicas relacionadas con bacterias que pueden tratarse o prevenirse con los compuestos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la piel e infecciones de la estructura de la piel, infecciones del aparato urinario, neumonía, endocarditis, infecciones del torrente sanguíneo relacionadas con el catéter, osteomielitis y similares. Al tratar dichas enfermedades, el paciente puede ya estar infectado con el microorganismo que debe tratarse o meramente ser sensible a la infección en cuyo caso el agente activo se administra profilácticamente.
Los compuestos de la presente invención se administran por lo general en una cantidad terapéuticamente eficaz por cualquier vía de administración aceptable. Preferentemente, los compuestos se administran por vía parenteral. Los compuestos pueden administrarse en una sola dosis diaria o en múltiples dosis al día. El régimen del tratamiento puede necesitar administración durante periodos prolongados de tiempo, por ejemplo, durante varios días o durante una a seis semanas o más. La cantidad de agente activo administrado por dosis o la cantidad total administrada por lo general será determinada por el médico del paciente y dependerá de factores tales como la naturaleza y la gravedad de la infección, la edad y la salud general del paciente, la tolerancia del paciente al agente activo, el/los microorganismo(s) que produce la infección, la vía de administración y similares.
En general, las dosis adecuadas estarán comprendidas entre aproximadamente 0,25 y aproximadamente 10,0 mg/kg/día de agente activo, preferentemente entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 2 mg/kg/día. Para un media humana de 70 kg esto ascendería desde aproximadamente 15 a aproximadamente 700 mg al día de agente activo, o preferentemente desde aproximadamente 35 a aproximadamente 150 mg al día.
Además, los compuestos de la presente invención son eficaces para inhibir el crecimiento de bacterias. En esta forma de realización, las bacterias se ponen en contacto in vitro o in vivo con una cantidad inhibidora del crecimiento de un compuesto de fórmula I o II o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por lo general, una cantidad inhibidora de crecimiento estará comprendida entre aproximadamente 0,008 \mug/ml y aproximadamente 50 \mug/ml; preferentemente entre aproximadamente 0,008 \mug/ml y aproximadamente 25 \mug/ml; y más preferentemente entre 0,008 \mug/ml y aproximadamente 10 \mug/ml. La inhibición del crecimiento bacteriano se pone por lo general de manifiesto por una disminución o carencia de reproducción por las bacterias i/o por lisis de las bacterias, es decir, por una disminución en las unidades formadoras de colonias en un volumen dado (es decir, por ml) durante un periodo de tiempo dado (es decir, por hora) en comparación con las bacterias sin tratar.
Los compuestos de la presente invención son también eficaces para inhibir el crecimiento de bacterias. En esta forma de realización, las bacterias se ponen en contacto in vitro o in vivo con una cantidad inhibidora de la biosíntesis de la pared celular de un compuesto de fórmula I o II o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Por lo general, una cantidad inhibidora de la biosíntesis estará comprendida entre aproximadamente 0,04 \mug/ml y aproximadamente 50 \mug/ml; preferentemente entre aproximadamente 0,04 \mug/ml y aproximadamente 25 \mug/ml; y más preferentemente entre 0,04 \mug/ml y aproximadamente 10 \mug/ml. La inhibición de la biosíntesis de la pared celular por lo general se pone de manifiesto por una disminución o falta de crecimiento de las bacterias incluyendo la lisis de las bacterias.
Además, los compuestos de la presente invención se ha descubierto que presentan una mortalidad celular sorprendente e inesperadamente rápida frente a determinadas bacterias, incluyendo los Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (MRSA) y los Staphylococci epidermitis resistentes a la meticilina (MRSE). Estas propiedades así como la utilidad antibiótica de los compuestos de la presente invención, puede demostrarse utilizando varios ensayos in vitro e in vivo bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se describen con mayor detalle ensayos representativos en los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Los ejemplos de síntesis y biológicos siguientes se proporcionan a título ilustrativo de la presente invención y no limitativo del alcance de la presente invención.
En los ejemplos a continuación, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados a menos que se indique de otra manera. Las abreviaturas no definidas a continuación tienen su significado generalmente aceptado.
BOC = terc-butoxicarbonilo
UFC = unidades formadoras de colonia
DCM = diclorometano
DIPEA = diisopropiletilamina
DMF = N,N-dimetilformamida
DMSO = sulfóxido de dimetilo
EtOAc = acetato de etilo
HOBT = 1-hidroxi-benzotriazol
HOAt = 1-hidroxi-7-azabenzotriazol
HPLC = cromatografía líquida de alta resolución
MIC = concentración mínima inhibidora
MS = espectrometría de masas
PMB = p-metoxibencilo
PyBOP = hexafluorosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidinfosfonio
THF = tetrahidrofurano
TLC = cromatografía en capa fina
TFA = ácido trifluoroacético
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Todas las temperaturas indicadas en los ejemplos siguientes están en grados Celsius (ºC) a menos que se indique de otra manera. Así, a menos que se indique de otra manera, los reactivos, materiales de partida y disolventes se adquirieron en proveedores comerciales (tales como Aldrich, Fluka, Sigma y similares) y se utilizaron sin purificación adicional. El hidrocloruro de vancomicina semihidratado se adquirió en Alpharma, Inc. Fort Lee, NJ 07024 (Alpharma AS, Osla, Noruega).
La HPLC en fase inversa se realizó por lo general utilizando una columna con C_{18} y (A) 98% de agua, 2% de acetonitrilo, 0,1% de TFA, con un gradiente creciente (por ejemplo, 0 a aproximadamente 70%) de (B) 10% de agua, 90% de acetonitrilo, 0,1% de TFA, a menos que se indique de otra manera.
En las síntesis descritas a continuación, los compuestos intermedios 4a-4g se definen de la manera siguiente. En cada uno de estos compuestos n es 0 y R^{a} es -CH_{2}-.
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Ejemplo 1 Preparación de 4a: sal (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-5-clorotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetamido]-3-[((4-(etilamino)metil)-1-piridinio)metil]-3-cefem-4-carboxilato del ácido bis-trifluoroacético (Véanse las figuras 2 y 3) A. Preparación del ácido 2-amino-5-cloro-\alpha-(metoxiimino)-4-tiazolacético (6)
A 500 ml de ácido acético se le añadieron 40,0 g (0,20 moles) de ácido 2-amino-\alpha-(metoxiiimino)-4-tiazoleacético (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI) y 27,9 g (0,21 moles) de N-clorosuccinimida. Se calentó la mezcla en un baño a 70ºC. Se disolvieron los sólidos en 30 minutos y tras 45 minutos se completó la reacción por MS. La solución oscura se dejó enfriar a temperatura ambiente y se concentró al vacío para proporcionar un sólido oscuro, que se utilizó sin purificación.
B. Preparación del derivado de cefalosporina (8)
A 47,5 g (0,20 moles) de (6) en 700 ml de DMF se le añadieron 81,1 g (0,20 moles) del éster aminocefaloesporónico (7) (Otsuka, Osaka, JP) y 27,0 g (0,20 moles) de HOAt. La mezcla se enfrió a 0ºC, y se añadieron 26,7 g (0,22 moles) de 2,4,6-colidina. A esta solución se le añadieron 42,2 g (0,22 moles) de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodimida (EDAC). Tras cinco horas, la solución se dividió entre EtOAc/éter 1:1 y agua, y se separaron las fases. La solución acuosa se extrajo a la oscuridad dos veces con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron una vez cada una con ácido cítrico 0,5 M, agua, NaHCO_{3} saturado al 50%, agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se concentró al vacío. Se disolvió el residuo en un volumen mínimo de cloruro de metileno y el producto se precipitó vertiendo la solución en éter. Los sólidos se aislaron por filtración para dar 48 g del compuesto (8).
Datos analíticos: MS m/z calc, 586,04, obs, 586,2 (M+1); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): d 9,60 (d, 1H), 7,35 (m, 3H), 6,91 (d, 2H), 5,82 (m, 1H), 5,17 (m, 3H), 4,56 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,62 (m, 2H).
C. Acoplamiento al resto de piridinio
A 48,5 g (82,7 moles) del éster de clorometilcefalosporina 8 y 40 ml de anisol en 400 ml de 1,2-dicloroetano se le añadieron 300 ml de TFA. Después de 40 minutos, se concentró la solución a ½ del volumen al vacío, y se precipitó el producto vertiendo el concentrado en 1 l de éter. Los sólidos se aislaron por filtración, se enjuagaron con éter, y se secaron para dar 42,5 g de ácido libre en bruto. Este material (25,0 g, 53,6 mmoles) se disolvió en 200 ml de acetonitrilo/DMF 1:1. A esta solución se le añadieron 10,1 g (83,3 mmoles) de 2,4,6-colidina y 15,2 g (64,5 mmoles) de 4-(N-t-butoxicarbonil)-etilaminometil piridina (9) (preparada por procedimientos convencionales a partir de 4-etilaminometilpiridina, que está comercializado por Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI). Después de 3,5 horas, se precipitó el producto vertiendo la solución en 1 l de éter. Los sólidos se aislaron por filtración, se lavaron con éter, y se secaron al vacío para dar 26 g de material en bruto. El producto se purificó por HPLC en fase inversa de preparación para dar el compuesto 10 como un polvo blanco desvaído.
Datos analíticos: MS m/z calc, 666,12, obs, 666,2 (M+1); ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): d 9,36 (d, 1H), 8,91 (d, 2H), 7,95 (d, 2H), 7,24 (b, 1H), 5,83 (m, 1H), 5,50 (m, 2H), 5,17 (d, 1H), 4,66 (s, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,52 (d, 1H), 3,30 (m, 3H), 1,37 (s, 9H), 1,08 (t, 3H).
D. Desprotección de 10
A 610 mg (0,78 mmoles) del compuesto 10 y 1 ml de anisol se le añadieron 8 ml de ácido trifluoroacético. Después de 20 minutos se precipitó el producto vertiendo la reacción en 100 ml de éter. Se aislaron los sólidos por filtración, se lavaron con éter y se secaron al vacío para dar 4a como un sólido amarillo claro.
Datos analíticos: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): d 9,56 (d, 1H), 9,44 (br, 1H), 9,10 (d, 2H), 8,21 (d, 2H), 7,38 (b, 1H), 5,86 (m, 1H), 5,54 (m, 2H), 5,15 (d, 1H), 4,51 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,40 (m, 2H), 3,30 (m, 2H), 1,22 (t, 3H).
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Ejemplo 2 Preparación de 4b: sal (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-5-clorotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetamido]-3-[(4-(aminometil)-1-piridinio)metil]-3-cefem-4-carboxilato del ácido bis-trifluoroacético A. Preparación del ácido 2-amino-5-cloro-\alpha-(metoxiimino)-4-tiazolacético (6)
A 500 ml de DMF se le añadieron 50,0 g (250 mmoles) de ácido 2-amino-\alpha-(metoxiiimino)-4-tiazoleacético y 35 g (260 mmoles) de N-clorosuccinimida. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche, tras cuyo periodo el análisis espectral de masas no demostró que estuviera presente más material de partida. La solución marrón clara se utilizó sin manipulación adicional.
B. Preparación del derivado de cefalosporina (8)
A la solución del ácido 6 en DMF (101,5 g, 250 mmoles) de la etapa (a) se le añadió el éster aminocefaloesporónico (7) (34 g, 250 mmoles). La mezcla se enfrió a 0ºC, y se añadieron 33,5 ml (250 mmoles) de 2,4,6-colidina. A esta solución se le añadieron 53 g (275 mmoles) de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Después de 2 horas, se precipitó la solución en 3 l de agua y se filtró. Se lavaron los sólidos con agua (2 x 1 l) bicarbonato sódico saturado (500 ml) y agua (4 x 500 ml) y se secó al vacío. Los sólidos secos se extrajeron en 500 ml de cloruro de metileno a temperatura ambiente, y la solución se agitó lentamente, formando un precipitado. Los cristales se recogieron por filtración, se lavaron con cloruro de metileno hasta que los lavados ya no eran marrones, y se secaron al vacío para dar la amida 8 (74 g).
C. Acoplamiento al resto de piridinio
Se añadió acetona (250 ml) a una mezcla de 50 g (85 mmoles) de éster de clorometilcefalosporina 8 y 13 g (85 mmoles) de yoduro sódico, bajo nitrógeno en la oscuridad. Después de agitar durante 30 minutos, se añadieron 27 g (130 mmoles) de 4-(N-terc-butoxicarbonil)aminometil piridina y 30 ml de acetona. Después de agitar 2 horas más, se añadieron 1,4 l de HCl 0,1 N, produciendo un precipitado gomoso. Se decantó la fracción del disolvente, y el residuo gomoso se trató con 800 ml de agua para dar un sólido. Se decantó el agua, y el sólido se disolvió en 1 l de acetato de etilo/etanol 4:1. Se lavó la solución con 500 ml de salmuera saturada, se secó sobre sulfato de magnesio y se evaporó a sequedad para dar 70 g (79 mmoles, 93%) del producto (análogo a 10, con -NHBOC sustituido por -NEtBOC) se obtuvo, con una pureza del 78% determinada por HPLC (254 nm).
Este material se desprotegió, sin más purificación, de la forma siguiente. Se disolvió el producto en bruto (70 g, 79 mmoles) en 500 ml de cloruro de metileno bajo nitrógeno y 35 ml (320 mmoles) de anisol se añadieron, seguido de 150 ml de ácido trifluoroacético. Después de 2 horas, se concentró la mezcla al vacío. El producto precipitó en la adición 1 l de éter dietílico. Los sólidos se aislaron por filtración, se lavaron con éter, se agitó en 200 ml de agua y se filtró. El filtrado se liofilizó a sequedad y se purificó por HPLC en fase inversa, proporcionando 30 g (aprox. 50%) de 4b.
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Ejemplo 3 Preparación de 2a: C-Aminoetliamida Vancomicina (Estructura 2 en la que R^{2}, R^{5}, R^{6}, R^{8}, son H; R^{4} es OH; R^{7} es Me; X^{1}, X^{2} son Cl; R^{d} es H; R^{e} es -CH_{2}CH_{2}-)
A una solución de hidrocloruro de vancomicina monohidratado (7,3 g, 4,7 mmoles) en 75 ml de DMSO se le añadieron, a temperatura ambiente, 4,1 ml (23,5 mmoles) de DIPEA, seguido de 1,8 g (5,6 mmoles) de hidrocloruro de N-(2-aminoetil) carbamato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH_{3}Cl) (véase la figura 3). Una solución de PyBOP (2,7 g, 5,2 mmoles) y HOBT (0,63 g, 4,7 mmoles) en 75 ml de N,N'-dimetilpropilenurea (DMPU) se añadió a continuación gota a gota rápidamente. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, a continuación se vertió en 800 ml de éter dietílico para dar una goma. El éter se decantó y la goma se lavó con éter adicional para dar [C]-(2-Fmoc-aminoetil) vancomicina en bruto.
Este producto (Fmoc-2a) se absorbió en 40 ml de DMF y se añadieron 10 ml de piperidina, y la solución se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos, a continuación se añadió gota a gota a 450 ml de acetonitrilo, formando un precipitado. La mezcla se centrifugó, se decantó el acetonitrilo y se lavó dos veces el residuo con 450 ml de acetonitrilo y una vez con 450 ml de éter dietílico y a continuación se secó con aire. El residuo se absorbió a continuación en agua, se acidificó a pH <5 con HCl 3 N, y se purificó por HPLC en fase inversa, utilizando un gradiente de 2 a 30% de acetonitrilo en agua que contiene ácido trifluoroacético al 0,1%. Esto dio el producto 2a en forma de sal de tri (TFA).
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Ejemplo 4 Preparación del compuesto Ia
El bis-trifluoroacetato de piridinio lactama 4a (2,4 g), preparado como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se disolvió en N,N-dimetilformamida (DMF, 40 ml) bajo nitrógeno y se enfrió a 0ºC. Se añadió éster bis-1-hidroxi-7-azatriazol del ácido dodecanodioico (7,0 g) (11), seguido de 2,4,6-colidina (1,2 ml), y la mezcla se agitó durante 65 minutos, a continuación se añadió a acetato de etilo (50 ml) y esta mezcla precipitó en éter dietílico (400 ml). La lactama de éster 5a activada se recogió por filtración y se secó al vacío, y una parte (14 mg) se disolvió en DMF (122 \mul) y se añadió a 0ºC a una mezcla de trifluoroacetato de C-aminoetilamida vancomicina, 2a (50 mg), preparado como se describe en el Ejemplo 3, y 2,4,6-colidina (5,4 \mul) en DMF (500 \mul). La mezcla se mantuvo a 0ºC durante 20 minutos, a continuación se añadió ácido trifluoroacético (7,3 \mul). Se mantuvo la mezcla a -20ºC durante la noche, a continuación se purificó por HPLC en fase inversa para dar el producto Ia.
Datos analíticos: MS m/z obs. 2252,8, calc. 2252,7.
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Ejemplo 5 Preparación del compuesto Ib
A temperatura ambiente bajo nitrógeno, hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida (740 mg), 1-hidroxi-7-azatriazol (520 mg) y N-(terc-butoxicarbonil)-\beta-alanina (660 mg) se agitaron en DMF (10 ml) durante 7 horas, a continuación se enfrió a 0ºC. Se añadió bis-trifluoroacetato de piridinio lactama 4a (2 g) (Véase el Ejemplo 1) y se agitó hasta que se hubo disuelto completamente, a continuación se añadió 2,4,6-colidina (700 \mul) y la mezcla se agitó a 0ºC durante 100 minutos. Se añadieron ácido trifluoroacético (700 \mul) y agua (30 ml) y el producto se purificó por HPLC en fase inversa. Tras la liofilización, se trató el producto con 20 ml de ácido trifluoroacético/diclorometano al 50% durante 40 minutos. La amina lactama 3a (Véase la figura 4) se recuperó en forma de su sal bis-trifluoroacetato en la precipitación en éter dietílico, y se secó al vacío.
Se disolvió hidrocloruro de vancomicina monohidratado, 1a (900 mg) (Estructura 1 en la que R^{5}, R^{6}, R^{8} son H; R^{4} es OH; R^{7} es Me; X^{1}, X^{2} son Cl; también denominado en las figura s "vancomicina") en sulfóxido de dimetilo (5 ml) bajo nitrógeno a temperatura ambiente y se añadió 1-hidroxi-7-azatriazol (80 mg), seguido de PyBOP (300 mg) en DMF (5 ml) y N,N-diisopropyletilamina (100 \mul). Se agitó la mezcla durante 20 minutos, se añadió ácido trifluroacético (45 \mul) y la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió piridinio lactama amina 3a (250 mg) seguido de 2,4,6-colidina (270 \mul), y la mezcla se agitó a 0ºC durante 30 minutos, a continuación se precipitó en acetonitrilo. Se recogió el producto en bruto por centrifugación y se purificó por HPLC en fase inversa para proporcionar Ib.
Datos analíticos: MS m/z obs. 2069,7, calc. 2069,4.
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Ejemplo 6 Preparación del compuesto Ic
Este compuesto se preparó según el procedimiento descrito en el ejemplo 5, sustituyendo el ácido 6-(N-BOC) aminohexanoico por N-BOC-\beta-alanina.
Datos analíticos: MS m/z obs. 2110,5, calc. 2111,5.
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Ejemplo 7 Preparación del compuesto Id
El hidrocloruro de vancomicina monohidratado, 1a (900 mg), se disolvió en sulfóxido de dimetilo (5 ml) bajo nitrógeno a temperatura ambiente y se añadió 1-hidroxi-7-azatriazol (80 mg), seguido de PyBOP (300 mg) en DMF (5 ml) y N,N-diisopropiletilamina (100 \mul). La mezcla se agitó durante 20 minutos, se añadió ácido trifluoroacético (45 \mul) y la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió bis-trifluoroacetato de piridinio lactama 4c (250 mg) (idéntico a 4b con la excepción de la sustitución meta en la piridina; véase la figura 5), seguida de 2,4,6-colidina (270 \mul) y la mezcla se agitó a 0ºC durante 30 minutos, a continuación se precipitó en acetonitrilo. Se recogió el producto en bruto por centrifugación y se purificó HPLC en fase inversa para proporcionar el producto Id.
Datos analíticos: MS m/z obs. 1970,9, calc. 1970,3.
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Ejemplo 8 Preparación del compuesto Ie A. Preparación de 3b (estructura 3 en la que W es Cl, R^{9} es Me, n es 0, R^{a} es CH_{2}, R^{b} es hidrógeno, R^{c} es -CH_{2}CH(COOH), R^{2} es hidrógeno, y x es 1)
Se disolvieron HOAt (56 mg, 0,2 mmoles), PyBOP (208 mg, 0,2 mmoles) y éster \alpha-terc-butílico del ácido N-BOC aspártico en DMF (500 \mul). Se añadió a continuación DIPEA (70 \mul, 0,2 mmoles) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 20 minutos. La reacción se enfrió a continuación a -10ºC y se añadió TFA (32 \mul, 0,2 mmoles). Se añadió a la reacción C3-piridinio cefalosporina 4b (306 mg, 0,2 mmoles) como solución de DMF (500 \mul). Se añadió colidina (160 \mul, 0,6 mmoles) y la reacción se agitó durante 1 h a -10ºC. La mezcla de reacción se concentró al vacío, a continuación se purificó utilizando HPLC en fase inversa (gradiente de 10 a 90% durante 60 minutos) para proporcionar, en lipofilización, la sal TFA del derivado del ácido aspártico de cefalosporina protegido en forma de un polvo blanco amorfo (193 mg). Este producto (162 mg) se disolvió en TFA (10 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se concentró la reacción al vacío, y el residuo se disolvió en CH_{3}CN/H_{2}O (1:1; TFA al 0,1%) y se liofilizó para proporcionar la sal deseada de TFA del derivado del ácido aspártico de cefalosporina (3b) desprotegida en forma de un sólido blanco (92 mg).
Datos analíticos: MS m/z 652,9 (MH^{+}).
B. Reacción de 3b con vancomicina
Se disolvió hidrocloruro de vancomicina, 1a (0,32 g, 0,21 mmoles), en 3 ml de DMSO. Se añadieron 0,5 ml de solución de PyBOP (0,11 g, 0,21 mmoles) y HOAt (0,03 g, 0,21 mmoles) en DMF, seguido de DIPEA (0,04 ml, 0,21 mmoles). La reacción se agitó durante 30 minutos, a continuación se añadió TFA (0,02 ml, 0,21 mmoles) y la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió a continuación una solución de 3b (0,15 g, 0,17 mmoles) (Véase la figura 6) en DMF (1 ml), seguido de colidina (0,08 ml, 0,63 mmoles). La reacción se agitó a 4ºC y a continuación se precipitó en EtOAc, se centrifugó y el sólido resultante se lavó con MeCN. El compuesto deseado se purificó por HPLC (2-30% de MeCN) para dar 0,3 g de Ie en forma de un sólido blanco.
Datos analíticos: MS m/z 1042,6 [M+2H)/2)]^{2+}.
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Ejemplo 9 Preparación del compuesto If
A una solución de 0,6 ml DMSO que contiene hidrocloruro de vancomicina, 1a (134,0 mg, 0,09 mmoles) y HOAt (12,3 mg, 0,09 mmoles) se le añadió una solución de PyBOP (46,9 mg, 0,09 mmoles) en 0,6 ml de DMF, seguido de adición de diisopropiletilamina (31,4 \mul, 0,2 mmoles). Tras la agitación a temperatura ambiente durante 20 min, la mezcla de reacción se trató con TFA (13,9 \mul, 0,2 mmoles) mientras que se enfría a 0ºC. A este éster activado de vancomicina se añadieron 69 mg (0,09 mmoles) de piridinio lactama 4a y colidina (51,3 \mul, 0,4 mmoles). La mezcla final se dejó agitar a temperatura ambiente durante 3 h, antes de enfriar con TFA (33,4 \mul, 0,40 mmoles). El producto en bruto se precipitó de la mezcla de reacción añadiendo acetato de etilo. Se recogió el sólido por centrifugación, se secó y se purificó por HPLC de preparación. El producto If deseado se obtuvo en forma de un sólido blanco esponjoso (89 mg).
Datos analíticos: Tiempo de retención (anal. HPLC: 10 a 70% MeCN/H2O durante 6 min) = 2,00 min. MS m/z calc. 1970,27 (C_{86}H_{94}Cl_{3}N_{16}O_{28}S_{2}); obs. 985,7 [(M+2H)/2]^{2+}.
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Ejemplo 10 Preparación del compuesto Ik (análogo des-cloro del compuesto If)
Se añadió yoduro sódico (0,271 g, 1,81 mmoles) a una solución de cefalosporin-\beta-lactama 12 (0,999 g, 1,81 mmoles) (véase la figura 7) disuelta en acetona (25 ml), se protegió de la luz y se agitó bajo nitrógeno. Después de 25 minutos, se añadió 4-(N-BOC-aminometil)piridina (0,390 g, 1,87 mmoles), y la reacción se agitó durante 2 horas. Se precipitó el producto con un gran exceso de acetato de etilo y se recuperó por filtración.
El producto (0,353 g, 0,488 mmoles) se disolvió en DCM (2,5 ml) y se añadieron anisol (0,21 ml, 1,93 mmoles) y TFA (1,5 ml, 19,47 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a continuación durante 45 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se precipitó el producto utilizando éter dietílico, se centrifugó, y el sedimento se lavó dos veces con éter dietílico y se secó. El producto se disolvió en agua y se filtraron los insolubles. El material acuoso se liofilizó para proporcionar 0,166 g de la sal TFA de 4d en forma de un sólido anaranjado (idéntico a 4b con la excepción de que W=CH).
Datos analíticos: MS m/z 504,1 (M+1); HPLC (2-30 acetonitrilo/agua, 254 nm) tiempo de retención = 0,270 min.
Se añadió HOAt (0,0626 g, 0,460 mmoles) a una solución de hidrocloruro de vancomicina (0,7078 g, 0,455 mmoles) en DMSO (3,5 ml). Se añadieron PyBOP (0,2338 g, 0,449 mmoles) disuelto en DMF (3,5 ml) y DIPEA (79,0 \mul, 0,453 mmoles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 20 minutos, seguido de TFA (35,0 \mul, 0,454 mmoles). La reacción se enfrió a continuación en un baño con hielo. Se añadió lactama amina 4d (0,166 g, 0,227 mmoles), y se añadió durante la disolución de colidina (180,0 \mul, 1,365 mmoles). Después de 50 minutos de agitación, se añadió TFA (125,0 \mul, 1,62 mmoles) y el producto se precipitó con acetonitrilo y se centrifugó. Se redisolvió el sedimento en una cantidad mínima de DMF y se reprecipitó con acetonitrilo tres veces. A continuación se secó al vacío para dar 0,8 g del producto en bruto. El producto en bruto se purificó por HPLC de preparación (2-35 acetonitrilo/agua) y se recogieron las fracciones que contenían el compuesto Ik y se liofilizaron.
Datos analíticos: MS m/z 1539,6 (fragmento), HPLC: (2-30 acetonitrilo/agua, 254 nm) tiempo de retención = 2,92 min.
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Ejemplo 11 Preparación del compuesto Ig (análogo des-cloro del compuesto Ib) A. Preparación de N-Etil-N-(4-piridilmetil)-3-(N-BOC)-amino propanamida (13)
A una solución de N-t-BOC-\beta-alanina (4,678 g, 24,7 mmoles) en DCM (50 ml) se le añadió diisopropilcarbodimida (3,87 g, 24,7 mmoles). La mezcla se enfrió en un baño con hielo y se añadió 4-(etilaminometil)piridina (3,37 g). La mezcla de reacción se agitó a continuación durante 3,5 horas. El sólido se separó por filtración, y el filtrado se lavó con agua y se secó al vacío para dar 5,34 g del compuesto intermedio del título.
Datos analíticos: MS m/z 308,1 (M+1).
B. Preparación del compuesto Ig
Se añadió yoduro sódico (0,485 g, 3,22 mmoles) a una solución de cefalosporin-\beta-lactama 12 (2,031 g, 3,22 mmoles) (véase la figura 8) disuelta en acetona (50 ml), se protegió de la luz y se agitó bajo nitrógeno. Después de 20 minutos, se añadió 13, preparado como se describió anteriormente, (1,29 g, 3,40 mmoles) en acetona (10 ml) y la reacción se agitó durante 6 horas. Se precipitó el producto con un gran exceso de acetato de etilo y se recuperó por filtración. Este producto (1,70 g, 1,90 mmoles) se disolvió en DCM (5 ml) y se le añadieron anisol (0,825 ml, 7,6 mmoles) y TFA (5 ml, 64,9 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a continuación durante 1 hora a temperatura ambiente en nitrógeno. Se precipitó el producto utilizando éter dietílico, se centrifugó, y el sedimento se lavó dos veces con éter dietílico y se secó, para proporcionar 1,7 g de la sal TFA de 3c (idéntico a 3a con la excepción de que W es CH).
Datos analíticos: MS m/z 603,3, (M+1); HPLC (2-90 acetonitrilo/agua, 254 nm) tiempo de retención = 3,42 min.
Se añadió HOAt (0,560 g, 4,11 mmoles) a una solución de hidrocloruro de vancomicina (6,350 g, 4,08 mmoles) en DMSO (30 ml). Se añadieron PyBOP (2,127 g, 4,09 mmoles) disuelto en DMF (30 ml) y DIPEA (0,711 ml, 4,08 mmoles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 20 minutos, seguido de TFA (0,314 ml, 4,08 mmoles). La reacción se enfrió a continuación en un baño con hielo. Se añadió lactama amina 3c (1,7 g, 2,04 mmoles) disuelta en DMSO (25 ml) y DMF (10 ml), y se añadió durante la disolución de colidina (1,89 ml, 14,3 mmoles). La reacción se agitó durante 50 minutos, se añadió TFA (1,26 ml, 16,3 mmoles) y el producto se precipitó con acetonitrilo y se centrifugó. Se redisolvió el sedimento en una cantidad mínima de DMF y se reprecipitó con acetonitrilo tres veces, a continuación se secó al vacío para proporcionar 7,4 g del producto en bruto. El producto en bruto se purificó por HPLC de preparación (2-35 acetonitrilo/agua) y se recogieron las fracciones que contenían el producto, Ik, y se liofilizaron.
Datos analíticos: MS m/z 1639,5 (fragmento); HPLC: (2-30 acetonitrilo/agua, 254 nm) tiempo de retención = 3,76 min.
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Ejemplo 12 Preparación del compuesto Ij (análogo des-cloro del compuesto id)
Se añadió yoduro sódico (1,4 g, 9,1 mmoles) a (7R)-7-[(Z)-2-(2-amino-tiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetamido]-3-(clorometil)-3-cefem-4-carboxilato (5 g, 9,1 mmoles) en 35 ml de acetona. El vaso de reacción se envolvió en papel de aluminio y se agitó la mezcla durante 1 hora. Se añadió una solución de 3-aminometilpiridina (2,8 g, 13,8 mmoles) en 5 ml de acetona, y la reacción se agitó durante 70 minutos y a continuación se precipitó en éter para dar 5,4 g en rendimiento en bruto de 4e (idéntico a 4c con la excepción de que W es CH). Este sólido (4,4 g) se puso en suspensión en 20 ml de DCM, y se añadieron 20 ml de TFA. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 90 minutos y a continuación se concentró. El aceite resultante se precipitó en éter y se purificó por HPLC de preparación (2 a 10% MeCN) para dar 0,6 g de la sal TFA de 4e, en forma de un sólido blanco esponjoso.
Datos analíticos: R_{t} = 0.8 min (10-70% MeCN). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 3,25 (dd, 2H), 3,8 (s, 3H), 4,2 (bs, 2H), 5,05 (d, 1H), 5,45 (dd, 2H), 5,8 (dd, 1H), 7,05 (s, 1H), 8,2 (m, 1H), 8,45 (bs, 2H), 8,6 (d, 1H), 9,0 (d, 1H), 9,05 (s, 1H), 9,4 (dd, 1H).
Se disolvió hidrocloruro de vancomicina (0,73 g, 0,49 mmoles), en 2,5 ml de DMSO. Se añadió una solución de PyBOP (0,23 g, 0,45 mmoles) y HOAt (0,06 g, 0,45 mmoles) en 2 ml de DMF, seguido de DIPEA (0,16 ml, 0,82 mmoles). La reacción se agitó durante 25 minutos, a continuación se añadió TFA (0,07 ml, 8,2 mmoles) y la mezcla se enfrió a 0ºC. Se añadió colidina (0,22 ml, 1,6 mmoles), seguido por una solución del lactamo 4e anterior en 2 ml de DMF. La reacción se agitó durante 2 h, a continuación se precipitó en éter y se centrifugó. El producto se purificó por HPLC y a continuación se liofilizó para dar 0,23 g del producto, Ij.
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Ejemplo 13 Preparación del compuesto Im
El ácido 2-amino-\alpha-(metoxiimino)-4-tiadiazolacético (15) (4,0 g, 19,8 mmoles), preparado según J. Antibiotics 53(10):1061 (2000), se combinó con el derivado de cefalosporina 14, preparado según Bull. Chem. Soc. Jpn. 43:2925-33 (1970) (8,42 g, 20,79 mmoles) (Véase la figura 9) y HOAt (3,33 g, 21,78 mmoles) en 50 ml de DMF. Se purgó la solución con nitrógeno y se enfrió a 0ºC, y se añadió 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,99 g, 20,79 mmoles), seguido de 1,3,5-colidina (2,75 ml, 20,79 mmoles). La solución se agitó a 0ºC durante 2 horas, a continuación la mezcla de reacción se vertió en 300 ml de agua. Se filtró el sólido resultante, se disgregó con NaHCO_{3}, acuoso saturado, se volvió a filtrar, se lavó dos veces con agua y se secó con aire durante la noche para proporcionar el compuesto intermedio de cefalosporina 16 en forma de un polvo blanco desvaído. Este compuesto se utilizó sin purificación adicional.
Datos analíticos: MS m/z calc. 553,01; observ. 553,0 (M^{+}, ^{35}Cl), 555,0 (M^{+}, ^{37}Cl).
Se colocó en un matraz el compuesto de cloro 16 (4,0 g, 7,23 mmoles) con 4-t-BOC-aminometilpiridina (2,26 g, 10,85 mmoles) y yoduro sódico (1,08 g, 7,23 mmoles) y se purgó con N_{2}. Se añadió acetona (60 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, a continuación se vertió en 300 ml de HCl 0,2 M, dando como resultado la formación de una goma roja en los lados del matraz. Se decantó la acetona y se secó la goma al vacío. Una vez seco, el residuo se disolvió en 20 ml de DCM, y se añadió TFA (20 ml). La reacción se agitó durante una hora tras la cual el análisis LC/MS indicó que la desprotección era completa. Esta solución se vertió a continuación en 200 ml de Et_{2}O y se filtró el precipitado resultante, se lavó con Et_{2}O y se secó al vacío. Una vez seco, el sólido bruto se disgregó en 100 ml de agua durante 3 horas. Se filtró la solución y se liofilizó el producto para dar el compuesto 4f en bruto (idéntico a 4b con la excepción de que W es N) como una sal de bis-TFA. El compuesto se utilizó sin purificación adicional.
Datos analíticos: MS m/z calc. 491,0; observ. 491,5.
Se disolvieron hidrocloruro de vancomicina (0,2 g, 0,135 mmoles) y HOAt (20,0 mg, 0,135 mmoles) en 2 ml de DMSO. A esta solución se le añadió una solución de PyBOP (70,2 mg, 0,0135 mmoles) en 2 ml de DMF. Se añadió DIPEA (23,5 \mul, 0,135 mmoles) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. Tras este periodo, se añadió una solución de 4f (49 mg, 0,0675 mmoles) en 1 ml de DMF, y se enfrió la solución a 0ºC. Se añadió a continuación 1,3,5-colidina (62,5 \mul, 0,473 mmoles) y la solución se agitó a 0ºC durante 45 min. Se añadió a continuación TFA (150 \mul) y la solución se vertió en 70 ml de Et_{2}O. Se filtró el precipitado resultante, se lavó con Et_{2}O y se secó al vacío. Se purificó el producto por HPLC en fase inversa y se aisló por liofilización para proporcionar Im en forma de sal de tri-TFA.
Datos analíticos: MS m/z calc. 1937,8; observ, 1937,6.
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Ejemplo 14 Preparación del compuesto In
A una solución agitada de ácido 2-amino-\alpha-(tritiloxiimino)-4-tiazol (17) (15,60 g, 36,3 mmoles) (preparado por tritilación de 2-amino-\alpha-(hidroxiimino)-4-tiazolacetato de etilo, seguido de hidrólisis) en DMF (100 ml) se añadieron 4,85 g (36,3 mmoles) de N-cloro-succinimida (véase la figura 10). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 h, a continuación se vertió en agua (500 ml) y el sólido precipitado se filtró y se secó para dar el compuesto de 5-cloro (15,11 g, 90%) en forma de un sólido blanco desvaído.
Datos analíticos: ^{1}H RMN (DMSO-d, 300 MHz): \delta 7,18-7,33 (m, 15H); MS m/z observ. 486,4 [M+Na]^{+}.
A una solución agitada de este compuesto (28,0 g, 60 mmoles) en 250 ml de DMF se le añadieron 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (12,7 g, 66 mmoles), HOBT (9,0 g, 66 mmoles) y 2,4,6-colidina (8,8 ml, 66 mmoles). La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC, y después de 5 minutos se añadió 14 (véase el Ejemplo 13; figura 9) (24,4 g, 60 mmoles). Después de 3,5 h se diluyó la mezcla de reacción con acetato de etilo (1.200 ml) y se lavó con HCl 1,0 M (250 ml), bicarbonato sódico acuoso saturado (250 ml) y salmuera (250ml). Se secó (MgSO_{4}) la capa orgánica, se filtró y se concentró al vacío para dar el compuesto intermedio de cefalosporina 18 (43,2 g, 88%) en forma de un sólido blanco desvaído, que se utilizó sin más purificación.
Datos analíticos: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): \delta 3,65 (q, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,54 (q, 2H), 5,24 (s, 2H), 5,27 (d, 1H), 6,03 (q, 1H), 6,95 (d, 2H), 7,18-7,41 (m, 19H), 9,90 (s, 1H).
Se añadieron yoduro sódico (920 mg, 61 mmoles) y N-t-BOC-4-(aminometil)piridina (1,8 g, 86 mmoles) a una solución agitada de 18 (5 g) en acetona (20 ml) en la oscuridad (matraz envuelto con papel de aluminio). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 h, a continuación se añadió en porciones a éter dietílico (200 ml) y el sólido resultante se recogió por filtración. Una solución del sólido en bruto (5,9 g) en TFA/DCM (40 ml, 1:1) se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, a continuación se añadió en porciones a éter dietílico (300 ml). El sólido resultante se recogió por filtración para proporcionar un residuo sólido que se purificó por HPLC de preparación para dar las sales de TFA de dos estereoisómeros de hidroxiimino (240 mg y 120 mg, respectivamente) de 4g (idéntico a 4b con la excepción de que R^{9} es hidrógeno), cada uno en forma de sólido blanco.
Datos analíticos:
Estereoisómero principal de 4 g: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): \delta 3,40 (q, 2H), 4,45 (s, 2H), 5,18 (d, 1H), 5,54 (q, 2H), 5,87 (q, 1H), 7,31 (bs, 2H), 8,18 (d, 2H), 8,71 (bs, 3H), 9,09 (d, 2H), 9,39 (d, 1H), 11,73 (s, 1H); MS m/z obs. 524,2 [M+H]+.
Estereoisómero secundario de 4 g: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}, 300 MHz): \delta 3,50 (q, 2H), 4,45 (s, 2H), 5,19 (d, 1H), 5,58 (q, 2H), 5,83 (q, 1H), 7,27 (bs, 2H), 8,20 (d, 2H), 8,77 (bs, 3H), 8,81 (d, 1H), 9,10 (d, 2H), 12,51 (s, 1H); MS m/z obs. 524,2 [M+H]+.
Una solución de PyBOP (170 mg, 0,33 mmoles) y HOAt (44 mg, 0,33 mmoles) en DMF (1 ml) se añadió a una solución agitada de hidrocloruro de vancomicina (485 mg, 0,33 mmoles) en DMSO/DMF (6 ml, 3:1). Se añadió sucesivamente DIPEA (0,057 ml, 0,33 mmoles), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se añadió TFA (0,026 ml, 0,33 mmoles) a la mezcla de reacción, que se enfrió a continuación a 0ºC, y se añadieron a continuación colidina (0,097 ml, 0,73 mmoles) y una solución de 4g (123 mg, 0,16 mmoles) en DMF (1 ml). La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 4 h, a continuación se añadió en porciones a acetato de etilo (50 ml), y el sólido resultante se recogió por filtración y se purificó por HPLC de preparación para dar la sal de TFA del producto In (174 mg, 46%) en forma de un sólido blanco.
Datos analíticos: MS m/z observ. 979,4 [(M-piridina)/2]^{+}.
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Ejemplo 15 Determinación de la solubilidad acuosa
La solubilidad acuosa de los compuestos de la invención se determinó utilizando el procedimiento siguiente. Se preparó una solución de tampón dextrosa al 5% en peso a pH 2,2 añadiendo 1 ml de ácido clorhídrico 1 N (Aldrich) a 99 ml de una solución acuosa de dextrosa al 5% en peso (Baxter). Se preparó a continuación una solución madre de 1 mg/ml para patrones de calibración disolviendo 1 mg del compuesto de ensayo en 1 ml de DMSO. Esta solución se agitó intensamente durante 30 segundos y a continuación se sometió a ultrasonidos durante 10 minutos. La solución madre se diluyó a continuación con agua para preparar patrones de calibración con las concentraciones siguientes: 50, 125, 250, 375 y 500 \mug/ml.
Se pesó cada compuesto de ensayo (30 mg) en una unidad de filtración de 0,1 \mum Ultrafree-MC, no esterilizada de Millipore (Millipore UFC30VVOO) y se añadió una barra de agitador magnético a cada unidad. Se añadió a continuación a cada unidad la solución del tampón de dextrosa al 5% en peso (750 \mul) y estas mezclas se agitaron intensamente durante 5 minutos. Las unidades filtrantes se colocaron a continuación en una rejilla de tubos Eppendorf y la rejilla de tubos se colocó en la parte superior de un agitador magnético. Cada unidad se valoró a continuación a pH 3 utilizando NaOH 1 N (VWR) y las soluciones resultantes se centrifugaron a 7.000 rpm durante 5 minutos. Cada unidad se diluyó a continuación 200 veces con solución de tampón dextrosa al 5% y las muestras diluidas se transfirieron a viales de muestreador automático para su análisis.
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Los patrones de calibración y las muestras de ensayo se analizaron por HPLC en fase inversa utilizando las siguientes condiciones:
Columna: Luna 150 x 4,6 mm; C18; 5 \mu
Fase móvil: A = 5/95, B = 95/5, ambos = MeCN/H_{2}O; TFA al 0,1%
Procedimiento: 10 m Lido 100 (0-100% B en 6 min.)
Volumen de inyección: 20 \mul
Longitud de onda: 214 nm
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La solubilidad de cada muestra de ensayo se calculó comparando el área del pico de la muestra de ensayo con la curva de calibración y multiplicando por el factor de dilución.
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TABLA 1 Solubilidad (mg/ml) en tampón de dextrosa acuoso al 5%
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Ejemplo 16 Determinación de las concentraciones mínimas inhibidoras (MIC)
Se realizaron ensayos de concentración mínima inhibidora (MIC) utilizando el método de microdilución del caldo de cultivo publicado en las normas NCCLS (véase, NCCLS. 2000. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Norma aprobada - Quinta Ed., Vol. 20, nº 2). Se adquirieron cepas bacterianas de la American Type Tissue Culture Collection (ATCC), Stanford University Hospital (SU), Kaiser Permanente Regional Laboratory en Berkeley (KPB), Massachusetts General Hospital (MGH), los Centers for Disease Control (CDC), el San Francisco Veterans' Administration Hospital (SFVA) de la University of California San Francisco Hospital (UCSF). Se fenotiparon enterococos resistentes a vancomicina como Van A o Van B basándose en su sensibilidad a la teicoplanina. Algunos enterococos resistentes a vancomicina que se habían genotipado como Van A, Van B, Van C1 y Van C2 se adquirieron también en la clínica Mayo.
En este ensayo, se rayaron cultivos bacterianos conservados en frío de referencia y cepas clínicas para su aislamiento en medio de agar-agar apropiado (es decir, agar-agar con tripticasa soja, agar-agar con tripticasa soja con eritrocitos de oveja desfibrinados, agar-agar en infusión de cerebro corazón, agar-agar con chocolate). Después de incubación para permitir la formación de colonias, estas placas se sellaron con Parafilm® y se almacenaron refrigeradas durante hasta dos semanas. Para la preparación de los inóculos del ensayo y para garantizar la baja variabilidad, varias colonias de una cepa bacteriana cultivadas en placas de agar-agar se seleccionaron con una asa de inoculación y se transfirieron asépticamente a caldo de cultivo Mueller-Hinton (enriquecido con cationes divalentes hasta las concentraciones requeridas basadas en la certificación del fabricante). El caldo de cultivo se cultivó durante la noche a 35ºC, se diluyó en caldo reciente precalentado y se cultivó hasta la fase logarítmica; esto es equivalente a un patrón MacFarland 0,5 ó 1 x 10^{8} unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml). No todas las suspensiones celulares, debido a la variabilidad de las especies, contenían 1 x 10^{8} UFC/ml cuando la turbidez es equivalente al patrón MacFarland, por consiguiente se hicieron ajustes aceptables (basados en las normas NCCLS) en diluciones de diferentes cepas bacterianas. El inóculo se diluyó de modo que 100 \mul de este cultivo en el caldo de Mueller-Hinton, caldo Mueller-Hinton enriquecido o medio de ensayo de Haemophilus, cuando se colocaron capas en una serie diluida 2 veces en serie de concentraciones de antibiótico también en 100 \mul del medio correspondiente, en una placa de microvaloración de 96 pocillos dio como resultado una concentración bacteriana de partida de 5 x 10^{5} UFC/ml. Las placas se incubarona continuación 18 a 24 horas a 35ºC. La MIC se leyó a simple vista a la concentración más baja bien sin cultivo bacteriano. Cultivo bacteriano se define como más de tres colonias identificadas, un fondo de células precipitadas mayor de 2 mm de diámetro, o turbidez obvia.
Las cepas ensayadas rutinariamente en el cribado inicial incluían Staphylococcus aureus sensibles a meticilina (MSSA), Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA), Staphylococcus aureus productor de penicilinasa, Staphylococcus epidemidis sensible a meticilina (MSSE), Staphylococcus epidemidis resistente a meticilina (MRSE), Enterococcus faecium sensible a vancomicina (EFSMV), Enterococcus faecalis sensible a vancomicina (EFSVS), Enterococcus faecium resistente a vancomicina también resistente a teicoplanina (EFMVR Van A), Enterococcus faecium resistente a vancomicina sensible a teicoplanina (EFMVR Van B), Enterococcus faecalis resistente a vancomicina resistente también a teicoplanina (EFSVR Van A), Enterococcus faecalis sensible a teicoplanina resistente a vancomicina (EFSVR Van B), Streptococcus pneumoniae sensible a la penicilina (PSSP) y Streptococcus pneumoniae resistente a la penicilina (PSRP). Debido a la incapacidad de PSSP y PSRP para desarrollarse bien en el caldo de Mueller-Hinton, las MIC con estas cepas se determinaron utilizando caldo TS enriquecido con sangre desfibrinada o medio de ensayo de Haemophilus.
Los compuestos de ensayo que tienen actividad significativa frente a las cepas mencionadas anteriormente se ensayaron a continuación para los valores de MIC en un panel mayor de cepas clínicas que incluye las especies mencionadas anteriormente así como caldo de Staphylococcus negativo a coagulasa no especificado tanto sensible como resistente a la meticilina (MS-CNS y MR-CNS). Además, estos compuestos de ensayo se ensayaron también para microorganismos gram-negativos frente a MIC, tales como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii, Haemophilius influenzae y Moraxella catarrhalis.
La Tabla 2 presenta los datos de CIM_{90} para un compuesto de la presente invención contra S. auerus resistente a meticilina (MRSA) y S. aureus sensible a meticilina (MSSA) en comparación con el antibiótico conocido, vancomicina.
TABLA 2 Concentraciones mínimas inhibidoras (MIC) en \mug/ml
16
Los datos en la Tabla 2 demuestran que los compuestos de la presente invención (es decir, Ia, Ib, Ic, Id, Ie, If, Im e In) presentaban una sorprendente e inesperada actividad bacteriana frente a MRSA 33591 en comparación de unos de los análogos de des-cloro Ig, Ij e Ik o vancomicina; y que los compuestos de la presente invención presentaban una sorprendente e inesperada actividad bacteriana frente a MSSA 13709 en comparación con vancomicina.
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Ejemplo 17 Ensayo de tiempo de inactivación
Este ensayo de tiempo de inactivación es un procedimiento para medir la tasa de actividad bacteriana de un compuesto de ensayo. Estos procedimientos son similares a los descritos en V. Lorian "Antibiotics in Laboratory Medicine", cuarta edición, Williams y Wilkins (1996), páginas 104-105. Un tiempo de inactivación rápido es deseable para impedir rápidamente la colonización bacteriana y reducir el daño en el tejido del hospedador.
Los inóculos bacterianos se prepararon como se describe en Ejemplo 16 para la determinación de las MIC. Se diluyeron las bacterias en medio precalentado en matraces agitados y se incubaron con agitación (200 rpm, 35ºC). A 0, 1, 4 y 24 horas las muestras se retiraron de los matraces y las bacterias se enumeraron por recuento de placa. Después del muestreo inicial, un compuesto que debe ensayarse se añadió al cultivo del matraz en agitación. Los recuentos de placas en estos intervalos previos y siguientes a la adición del compuesto se expresaron gráficamente en una curva tiempo-inactivación. La actividad bactericida se define como una disminución de \geq3 log (reducción mayor o igual a 99,9%) en el número de células bacterianas en 24 horas.
En este ensayo, un compuesto de fórmula I, es decir el compuesto Ib, fue bactericida frente a MRSA 33591 a una concentración \leq 1,0 \mug/ml en 4 horas. En comparación, la vancomicina fue bactericida frente a MRSA 33591 a una concentración de 4 \mug/ml en 24 horas.
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Ejemplo 18 Estudios de eficacia in vivo en ratones neutrocitopénicos
Se adquirieron animales (ratones CD-1 machos, de 20 a 30 g) en Charles Rivers Laboratories (Gilroy, CA) y se les permitió acceso a alimentos y agua a voluntad. Se provocó neutrocitopenia por inyección intraperitonial (IP) de 200 mg/kg de ciclofosfamida dejando de cuatro a dos días antes de la inoculación de las bacterias.
El organismo utilizado fue una cepa susceptible o resistente de patógenos Gram-positivos clínicamente relevantes, tal como Staphylococcus aureus sensibles a la meticilina (MSSA 13709) y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA 33591). La concentración del inóculo bacteriano fue \sim10^{6} UFC/ml. Los animales se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se inyectaron 50 ml del inóculo bacteriano en el muslo anterior. Una hora después de la inoculación, se dosificó portador a los animales por vía intravenosa o la dosis apropiada del compuesto de ensayo. A las 0 horas y a las 24 horas después del tratamiento, se practicó la eutanasia a los animales (asfixia con CO_{2}) y se recogió el muslo anterior y posterior de manera aséptica. El muslo se colocó en 10 ml de solución salina esterilizada y se homogeneizó. Las diluciones del homogeneizado se colocaron en placas trípticas de agar-agar con soja que se incubaron durante la noche. El número de colonias bacterianas en una placa dada se multiplicó por el factor de dilución, se dividió por el peso de la extremidad (en gramos) y se expresó como log UFC/g. ED_{50} (dosis requerida para producir el 50% de la reducción máxima en el valor de la extremidad) se estimó para cada compuesto de ensayo.
En este ensayo, un compuesto de fórmula I, es decir el compuesto Ib, presentó una ED_{50} < 0,1 mg/kg, iv., en comparación con una ED_{50} de 9 mg/kg, iv., para la vancomicina.

Claims (33)

1. Compuesto de fórmula I:
17 
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que:
cada X^{1} y X^{2} es independientemente hidrógeno o cloro;
W se selecciona de entre N y CCl;
R^{2} es hidrógeno o alquilo C_{1-6};
uno de entre R^{4} y R^{5} es hidroxi y el otro es hidrógeno;
cada R^{6} y R^{7} es independientemente hidrógeno o metilo;
R^{8} es hidrógeno o un grupo de fórmula:
18
R^{9} se selecciona de entre hidrógeno, alquilo, C_{1-6}, y cicloalquilo C_{3-6}, en la que alquilo y cicloalquilo pueden estar sustituidos con -COOH o 1 a 3 átomos de flúor;
cada R^{3} se selecciona independientemente de entre alquilo C_{1-6}, -OR, halo, -SR, -S(O)R, -S(O)_{2}R, y -S(O)_{2}OR, en las que cada R es independientemente alquilo C_{1-6}, que puede estar sustituido con COOH o 1 a 3 átomos de flúor;
n es 0, 1, 2 ó 3;
x es 0, 1 ó 2;
y es 0, 1 ó 2;
Rª es -Y-R''-, en la que
R'' se selecciona de entre alquileno C_{1-12}, alquenileno C_{2-12}, alquinileno C_{2-12}, cicloalquileno C_{3-6}, arileno C_{6-10}, heteroarileno C_{2-9}, heterociclo C_{3-6}, y combinaciones de los mismos, y está opcionalmente sustituido con 1 ó 2 grupos seleccionados de entre Z, en la que Z consiste en -OR', -SR', -F, -Cl, -N(R')_{2}, -OC(O)R', -C(O)OR', -NHC(O)R', -C(O)N(R')_{2}, -CF_{3}, y -OCF_{3}, y cadenas laterales de aminoácidos naturales, en la que cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo C_{1-4}; y R'' contiene a lo sumo 20 átomos de no hidrógeno;
Y, que une R'' al anillo de piridinio en la posición meta o para, se selecciona de entre un enlace directo, NR', O, S, C(O) NR'(CO), y C(O)NR', excluyendo los enlaces directos entre heteroátomos en Y y R'',
cada R^{b} y R^{d} se seleccionan independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1-6}, alquenilo C_{2-6} y alquinilo C_{2-6};
cada R^{c} es independientemente -Y-R''-Y'-, en la que cada Y' se selecciona independientemente de entre un enlace directo, O y NR', excluyendo los enlaces directos entre heteroátomos en Y' y R''; y
cada R^{e} se selecciona independientemente de entre R''.
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2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{9} es hidrógeno o alquilo C_{1-4}.
3. Compuesto según la reivindicación 2, en el que R^{9} es hidrógeno o metilo.
4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que W es CCl.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que W es N.
6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que cada R^{3} se selecciona independientemente de entre alquilo C_{1-4} insustituido, alcoxi C_{1-4} insustituido, fluoro y cloro.
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que n es 0.
8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que x es 1 e y es 0.
9. Compuesto según la reivindicación 8, en el que R^{a} es -Y-R''-; Y es un enlace directo; y R'' es alquileno C_{1-6}.
10. Compuesto según la reivindicación 8 ó 9, en el que R^{c} es -Y'-R''-Y'; en el que cada Y' es un enlace directo; y R'' es alquileno C_{1-12} opcionalmente sustituido con un grupo -COOH.
11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que R^{b} es hidrógeno o alquilo C_{1-4}.
12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que x es 1 e y es 1.
13. Compuesto según la reivindicación 12, en el que R^{a} es -Y-R''-; Y es un enlace directo; y R'' es alquileno C_{1-6}.
14. Compuesto según la reivindicación 12 ó 13, en el que R^{c} es -Y'-R''-Y'; en el que cada Y' es un enlace directo; y R'' es alquileno C_{1-12} opcionalmente sustituido con un grupo -COOH.
15. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que R^{e} es alquileno C_{1-12}.
16. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que R^{b} y R^{d} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1-4}.
17. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que x es 0 e y es 0.
18. Compuesto según la reivindicación 17, en el que R^{a} es -Y-R''-; Y es un enlace directo; y R'' es alquileno C_{1-6}.
19. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que R^{2} es hidrógeno.
20. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es de fórmula II:
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19 
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en el que
el anillo de piridinio presenta sustitución en meta o para;
R^{10} es hidrógeno o alquilo C_{1-6}; y
R^{1}^{1} es alquileno C_{1-12}.
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21. Compuesto según la reivindicación 20, en el que R^{9} es hidrógeno.
22. Compuesto según la reivindicación 20, en el que R^{9} es metilo.
23. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el anillo de piridinio está sustituido en para.
24. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que R^{10} es hidrógeno o alquilo C_{1-4}.
25. Compuesto según la reivindicación 24, en el que R^{10} es hidrógeno, metilo o etilo.
26. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en el que R^{11} es alquileno C_{1-10}.
27. Compuesto según la reivindicación 26, en el que R^{11} es -(CH_{2})_{2}- o -(CH_{2})_{5}-.
28. Compuesto según la reivindicación 20, en el que W es CCl; R^{9} es metilo, R^{10} es etilo, R^{11} es -(CH_{2})_{2}-; y el anillo de piridinio está sustituido en para.
29. Composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
30. Procedimiento para preparar un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28; comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar un compuesto de fórmula 1:
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20 
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o una sal o derivado activado o protegido del mismo, con un compuesto de fórmula 3 ó 4:
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21 
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22 
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o una sal o derivado activado o protegido del mismo, para proporcionar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo.
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31. Procedimiento para preparar un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28; comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar un compuesto de fórmula 5:
23
o una sal o derivado activado o protegido del mismo; con un compuesto de fórmula 2:
24
o una sal o derivado activado o protegido del mismo; para proporcionar un compuesto de fórmula I o una sal del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
32. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para su utilización en terapia.
33. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero.
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