PL176387B1

PL176387B1 - Bezpolisacharydowy wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu i wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu nadający się do liofilizacji

Info

Publication number: PL176387B1
Application number: PL94313084A
Authority: PL
Inventors: Victoria M. Knepp; Deborah M. Lidgate; Richard Maskiewicz; Leo Gu
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1993-08-20
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 1999-05-31
Also published as: NO317627B1; HU228152B1; LT96011A; BG62951B1; JP4592830B2; IL110725A0; NO960651D0; IL124941A; IL124941A0; LV11279B; CN1133012A; LT4051B; SK284064B6; JPH10508000A; US20010007662A1; BG100371A; CA2169834A1; FI113241B; US7074763B2; HU9600371D0

Abstract

1. Bezpolisacharydowy wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu (NGF), znamienny tym, ze zawiera, w przeliczeniu na wodny preparat, (a) czynnik wzrostu nerwu w ilosci 0,0001 - 0,125% wagowych; (b) biologicznie dopuszczalna sól, zawierajaca izotonicznosc w ilosci 0,5 -1,0% wagowych; (c) biologicznie dopuszczalny, rozpuszczalny w wodzie proteinowy nosnik w ilosci 0,1 -1,25% wagowych; (d) bufor w ilosci wystarczajacej do utrzymania pH preparatu w zakresie 4,5 - 6,0; i (e) wode. 5. Wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu (NGF), nadajacy sie do liofilizacji, znamienny tym, ze zawiera: (a) 1 -1250 µg /ml czynnika wzrostu nerwu; (b) 30 - 90 mg/ml biologicznie dopuszczalnego srodka speczniajacego; (c) 1 -12,5 mg/ml biologicznie dopuszczalnego, rozpuszczalnego w wodzie protei- nowego nosnika; (d) bufor w ilosci wystarczajacej do utrzymania pH preparatu od 5,5 do 6,5; i (e) wode. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest bezpolisacharydowy wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu i wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu nadający się do liofilizacji. Preparaty te znajdują zastosowanie w leczeniu dysfunkcji neuronowej u ludzi, np. choroby Alzheimera.

Liczne polipeptydy i proteiny regulują wzrost lub przeżycie komórek; takie cząsteczki są zwane czynnikami wzrostu. Przykłady czynników wzrostu obejmują: czynnik wzrostu naskórka (EGF), kwasowy i zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (aFGF oraz bFGF), czynnik wzrostu pochodzący z płytek krwi (PDGF),' neurotroficzny czynnik rzęskowy (CNTF) oraz czynnik wzrostu nerwu (NGF). Spośród powyższych NGF był pierwszym,

176 387 który zidentyfikowano i scharakteryzowano (Levi-Montalcini R., i in., J. Exp. Zool., 116:321,1951).

NGF sprzyja przeżyciu i aktywności pewnych typów komórek neuronowych. Ponadto, NGF sprzyja różnicowaniu niedojrzałych komórek neuronowych na dojrzałe neurony post-mitotyczne.

Oczyszczanie NGF z gruczołu ślinowego myszy dało w wyniku identyfikację kompleksu obejmującego trzy podjednostki, α, β i y. Przyjmuje się, że całość aktywności neurotroficznej jest usytuowane w podjednostce β, proteinie złożonej ze 118 aminokwasów o ciężarze cząsteczkowym około 13000 (Varon S. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57:1782 -1789,1967; Greene L.A., i in., Neurobiol., 1:37-48,1971). W roztworze, podjednostki/? tworzą dimery o ciężarze cząsteczkowym około 26500.

Pojawiła się sugestia, że NGF może być efektywny w leczeniu pewnych chorób degeneracyjnych układu nerwowego, zarówno obwodowego jak i ośrodkowego. Zasugerowano, że podawanie NGF może być korzystne w leczeniu chorób, w których niedobór NGF, anomalie jego receptora lub zmiany w jego transporcie lub przetwarzaniu międzykomórkowym prowadzą do obniżenia funkcji neuronów, atrofii lub nawet do śmierci komórki. Takie choroby obejmują dziedziczne neuropatie czuciowe i ruchowe, dziedziczną i sporadycznie występującą degenerację układu, amyotroficzne stwardnienie boczne, chorobę Parkinsona i chorobę Alzheimera (Goedert M. i in., Mol. Brain Res., 1:85-92,1986; Mobley, W.C., i in., Soc. Neurosci. Abstr. 13:186,1987; Mobley W.C., i in., Soc. Neurosci. Abstr., 4: 02,1988; Hefti, F. i in., Ann. Neurol., 20:275-281,1986). Uważa się również, że NGF zmniejsza zjawisko śmierci komórki neuronu po wystawieniu na działanie niektórych toksyn, takich jak 6-hydroksydopamina (Aloe L., Arch. Ital. Biol. 113:326-353, 1975), winblastyna i kolchicyna (Menesini-Chen M.G. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5559-5563, 1977; Johnson E.M., Brain Res., 141:105-118, 1978) oraz kapsaicyna (Otten U., Nature, 301:515-577, 1983).

Wysoka ekspresja mRNA NGF konika morskiego, obszaru związanego z pamięcią i uczeniem się, sugeruje że zastosowanie kliniczne NGF może być skuteczne w leczeniu demenqi (Kaisho Y. i in., Biochem. Biophys. Res. Comm., 174:379-385,1991). Doniesiono, że wewnątrzkomorowe podawanie NGF zapobiega śmierci podstawowych cholinergicznych neuronów przodomózgowia po aksotomii, sugerując że NGF może być skuteczny w sprzyjaniu przeżyciu komórek po urazie. (Hefti F., J. Neurosci., 6:2155-2162, 1986; Wiliams L., i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:9231-9235, 1986; Kromer L., Science, 235:214-216,1987).

Stosowanie NGF w terapii stwarza istotne problemy. Problemy te są związane z 1) utrzymywaniem bioaktywności NGF, którą można zmienić podczas wytwarzania, oczyszczania lub przechowywania; oraz 2) podawaniem NGF, stosunkowo dużej cząsteczki hydrofitowej, tak by osiągnęła ona miejsce aktywne w ilościach wystarczających dla skutecznego działania. Bioaktywność NGF, podobnie jak innych protein jest zależna od struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej. Podjednostka β NGF ma trzy wewnętrzne wiązania dwusiarczkowe, które uważa się za ważne z punktu widzenia bioaktywności (Kanaya, E., i in., Gene, 83, 65-74, 1989; Iwane M i in., Biochem. Biophys. Res. Comm., 171:116-122, 1990; Hy G. -L. i Neet K.E., Gene, 70:57-65,1988). Ponadto, w stopniu, w jakim którakolwiek z protein jest denaturowana, skuteczna ilość biologicznie aktywnego NGF ulega zmniejszeniu. Zatem musi być utrzymywana integralność proteiny podczas wytwarzania i przechowywania, jak również podczas podawania. Proteiny są częściowo podatne na degradację w podwyższonych temperaturach.

Niższe temperatury zasadniczo zmniejszają degradację proteiny. Jednak bardziej ekonomiczne jest przechowywanie proteiny w temperaturze pokojowej tzn. około 25°C niż w temperaturach około 4°C uzyskiwanych przez chłodzenie. Zatem jest pożądana trwałość formulacji dla przechowywania w temperaturze pokojowej lub w temperaturach około 4°C uzyskiwanych przez chłodzenie.

176 387

Oprócz problemów występujących z trwałością, NGF podobnie jak wiele innych protein wiąże się niespecyficznie do powierzchni. Takie niespecyficzne wiązanie może występować w przypadku szeregu materiałów, włączając w to szkło i tworzywo sztuczne, np. polietylen lub polipropylen. Materiały takie mogą być w postaci fiolek, rurek, strzykawek, implantowalnych urządzeń infuzyjnych lub jakiejkolwiek innej powierzchni, która może wejść w kontakt z NGF podczas jego wytwarzania, przechowywania lub podawania.

Inne problemy związane z podawaniem protein, takich jak NGF, jako substancji leczniczych to: słaba absorpcja przez organizm oraz degradacja przez kwasy żołądkowe. Zatem podawanie doustne jest zasadniczo nieodpowiednie. Iniekcje i infuzja takich protein mogą być niezbędne, by pokonać takie bariery dla absorpcji.

Iniekcja jest przydatna, w przypadku gdy miejsce leczenia jest łatwo dostępne. Jednak, gdy miejsce to jest stosunkowo niedostępne, takie jak w przypadku ośrodkowego układu nerwowego, z punktu widzenia długoterminowego podawania praktyczniejsza może być ciągła infuzja. Takie podawanie było niepraktyczne wskutek różnych komplikacji. Np. ciągłą infuzję można osiągnąć przez implantowanie pomp NGF do mózgu, lecz długotrwałe wystawienie proteiny na działanie temperatury ciała często powoduje degradację proteiny. Mogą także wystąpić dodatkowe straty wskutek degradacji proteiny do komory pompy wraz z upływem czasu.

Oprócz problemów związanych z podawaniem NGF, występują również problemy związane z długookresowym przechowywaniem od wytwarzania do podawania. Jedną z metod długookresowego przechowywania protein biologicznych, hamującą degradację, agregację i/lub niespecyficzną adsorpcję, jest liofilizacja. Jednak sam proces liofilizacji stwarza trudności. W miarę zmniejszania się objętości cieczy podczas procesu zamrażania, efektywne stężenie soli gwałtownie się zwiększa, co może spowodować denaturację proteiny, zmniejszając skuteczną aktywność terapeutyczną po rekonstytucji. Ponadto tworzenie kryształów lodu podczas procesu zamrażania może spowodować denaturację również zmniejszając skuteczną ilość dostępnego bioaktywnego NGF. Preparat musi zatem być taki, by zapobiec fluktuacjom stężenia soli i zminimalizować tworzenie kryształów lodu.

Jednym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie wodnych preparatów NGF, zachowujących bioaktywność co najmniej przez jeden miesiąc w zakresie temperatur od około 4°C do około 40°C.

Innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie preparatów NGF, w których bioaktywność jest utrzymywana po liofilizacji i rekonstytucji.

Jeszcze innym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobów przechowywania aktywnego biologicznie NGF w roztworze.

Niniejszy wynalazek zapewnia trwałe preparaty czytnika wzrostu nerwu, zdolne do tego, by je przechowywać w temperaturach poniżej temperatury otoczenia, w temperaturze otoczenia i w podwyższonych temperaturach bez zasadniczych strat w ilości lub aktywności proteiny.

Bezpolisacharydowy wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu (NGF), według wynalazku zawiera, w przeliczeniu na wodny preparat;

(a) czynnik wzrostu nerwu w ilości 0,0001 - 0,125% wagowych;

(b) biologicznie dopuszczalną sól w ilości 0,5 - 1,0% wagowych;

(c) biologicznie dopuszczalny, rozpuszczalny w wodzie proteinowy nośnik w ilości 0,1 - 1,25% wagowych;

(d) bufor w ilości wystarczającej do utrzymania pH preparatu w zakresie 4,5 - 6,0; i (d) wodę.

Korzystnie, pH preparatu według wynalazku wynosi od 5,0 do 5,4.

Preparat według wynalazku, korzystnie jako nośnik zawiera albuminę surowicy ludzkiej (HSA).

Preparat według wynalazku, korzystnie zawiera 10 - 500 μ g NGF, 5 mg/ml HSA, 8,7 mg/ml NaCl, 2,1 mg/ml kwasu cytrynowego i wodę, a pH preparatu jest doprowadzone do 5,2.

176 387

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza farmaceutyczne preparaty NGF nadające się do liofilizacji.

Wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu (NGF), nadający się do liofilizacji, według wynalazku zawiera:

(a) 1 - 1250 μ g/ml czynnika wzrostu nerwu;

(b) 30 - 90 mg/ml biologicznie dopuszczalnego środka spęczniającego;

(c) 1 - 12,5 mg/ml biologicznie dopuszczalnego, rozpuszczalnego w wodzie proteinowego nośnika;

(d) bufor w ilości wystarczającej do utrzymania pH preparatu od 5,5 do 6,5; i (e) wodę.

Preparat według wynalazku jako środek spęczniający, korzystnie, zawiera cukier, szczególnie korzystnie mieszaninę sacharozy i mannitu, a jako bufor zawiera cytrynian, przy pH preparatu wynosi 5,8 - 6,2.

Preparat ten korzystnie, jako nośnik zawiera albuminę surowicy ludzkiej (HSA).

Preparat według wynalazku korzystnie jest liofilizowany dla zmniejszenia zawartości wilgoci do mniej niż 2%.

Liofilizowana kompozycja farmaceutyczna czynnika wzrostu, zawiera 0,001 do 1,25 części czynnika wzrostu nerwu, 30 do 90 części cukru i mniej niż 1 część wody.

Po rekonstytucji przy użyciu zaróbki rekonstytuującej, ewentualnie włączając w to biologicznie dopuszczalny nośnik, liofilizowane kompozycje nadają się do podawania pacjentom potrzebującym terapii.

Niniejszy wynalazek zapewnia więc sposób przechowywania NGF w postaci wodnych preparatów w temperaturach od około 4°C do około 40°C.

Nowe preparaty znajdują zastosowanie w leczeniu dysfunkcji neuronowej u ludzi, przy czym leczenie to polega na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości preparatu NGF według wynalazku.

Preparat według wynalazku, korzystnie jest sporządzony w postaci nadającej się do infuzji wewnątrzmózgowej i w takiej postaci znajduje zastosowanie do leczenia choroby Alzheimera.

Opracowanie trwałych form dawek parenteralnych NGF wymaga oceny szeregu czynników, włączając w to drogę podawania, oddziaływania adsorpcyjne oraz zgodność z aparaturą do przetwarzania i potencjalnymi urządzeniami podawania. Dalszym zagadnieniem jest trwałość NGF w bezsacharydowych preparatach wodnych w temperaturach poniżej temperatury otoczenia, w temperaturze otoczenia i w podwyższonych temperaturach. Jednym wykonaniem niniejszego wynalazku jest preparat nGf w roztworze wodnym, który wykazuje trwałość w określonym przedziale temperaturowym, a w szczególności w podwyższonych (co najmniej około 40°C) temperaturach. Preparat ten obejmuje roztwór wodny NGF, soli i buforu, o pH od około 4,5 do około 6,0. Preparat ten zawiera również proteinowy nośnik. To połączenie składników nieoczekiwanie nadaje roztworowi bardzo korzystne cechy, w szczególności w odniesieniu do trwałości w podwyższonych temperaturach. Ponadto zapewniony jest preparat NGF nadający się do liofilizacji. Niniejszy wynalazek zapewnia więc sposób przechowywania NGF.

Określenie biologicznie dopuszczalny” stosowane w niniejszym tekście odnosi się do materiałów charakteryzujących się brakiem niekorzystnego wpływu biologicznego in vivo. Temperatura pokojowa wynosi między około 22°C do około 25°C. Temperatura ciała wynosi między około 36°C do około 40°C. Wodny preparat farmaceutyczny NGF odnosi się do wodnego preparatu NGF, który można liofilizować do zawartości wilgoci mniejszej niż około 2% i która zachowuje co najmniej około 70% początkowej bioaktywności NGF po rekonstytucji. Izotoniczny odnosi się do roztworu o w przybliżeniu tym samym ciśnieniu osmotycznym co surowica krwi, około 300 miłimoli na litr. Nośnik jest biologicznie dopuszczalnym rozpuszczalnym w wodzie proteinowym nośnikiem, korzystnie albuminą surowicy ludzkiej, która zmniejsza adsorpcję NGF do powierzchni.

176 387 oznacza jakąkolwiek formę czynnika wzrostu nerwu, korzystnie podjednostki β czynnika wzrostu nerwu, wykazującej aktywność biologiczną i która wiąże się do receptora NGF. Określenie NGF obejmuje również hybrydyzowane i modyfikowane formy NGF, które wiążą się do receptora NGF i zachowują bioaktywność NGF. Modyfikowane formy NGF mogą obejmować proteiny fuzyjne, takie jak opisane w: Iwai S. i in. Chem. Pharm. Buli. 34:4724-4730, 1986 i Kanaya E. i in., Gene, 83: 65-74, 1989, oraz fragmenty NGF i hybrydy, w których pewne aminokwasy usunięto lub zastąpiono przy równoczesnym utrzymaniu wystarczającej bioaktywności NGF oraz wiązania do receptora, by zapewnić aktywność terapeutyczną.

Korzystną formą NGF jest ludzki NGF (hNGF). Najbardziej korzystną formą hNGF jest rekombinacyjny (hNGF). Najbardziej korzystną formą hNGF jest rekombinacyjny hNGF (rhNGF). Sposoby otrzymywania NGF odpowiednie do stosowania w preparatach według niniejszego wynalazku są znane specjalistom z dziedziny techniki. Np. odpowiednie rhNGF można wytworzyć przez układ ekspresji bakulowirusa (Bamett J. i in., Exp. Neurol., 110:11-24, 1990; EPO 370,171), układ ekspresji drożdży (Kanaya E. i in., Gene 83:65-74, 1989), układ ekspresji komórek ssaków (CH) (Iwane M., i in., Biochem. Biophys. Res. Comm., 171:116-122,1990), lub układ ekspresji COS (Bruce G. i in., Neurobiol. Aging, 10:89-94, 1989). NGF powinno być czyste w co najmniej 65%; korzystnie czyste w co najmniej 85%; jeszcze korzystniej czyste w co najmniej 95%; a najkorzystniej czyste w co najmniej 98%. Czystość izolowanego NGF dla stosowania w preparatach można określić za pomocą SDS-PAGE z wybarwieniem za pomocą srebra lub za pomocą innych sposobów znanych specjalistom z dziedziny techniki.

W nowych wodnych preparatach NGF, NGF jest obecny w ilościach skutecznych terapeutycznie. Korzystnie NGF jest zawarty w ilości 0,0001 - 0,125% wagowych kompozycji wodnej, co odpowiada 1 -1250μ g/ml. Korzystniej NGF jest zawarty w ilości 0,001 - 0,10% wagowych (10 do 1000μ g/ml) wodnego preparatu. Jeszcze korzystniej NGF jest zawarty w ilości 0,01 - 0,10% (100 do 1000 μ g/ml) wagowych wodnego preparatu. Najkorzystniej NGF jest zawarty w ilości 0,01 - 0,05% (100 do 500 «g/ml) wagowych wodnego preparatu.

Nowe wodne preparaty NGF zawierają nośnik. Obecność nośnika w preparacie zmniejsza lub zapobiega adsorpcji NGF do różnych powierzchni. Potrzeba nośnika zależy od stężenia NGF w kompozycji wodnej. Przy wystarczająco wysokich (większych niż 500 «g/ml) stężeniach NGF, dostateczna ilość NGF pozostaje w roztworze, by zrównoważyć straty na skutek adsorpcji do powierzchni. Odpowiednim nośnikiem jest biologicznie dopuszczalny, rozpuszczalny w wodzie proteinowej nośnik, a szczególnie korzystnym nośnikiem jest albumina surowicy ludzkiej (HSA). Stosunek wagowy NGF do nośnika wynosi od 0,0001:1 do 1:1. Bardziej korzystny stosunek wagowy wynosi od 0,01:1 do 1:1. Najbardziej korzystny stosunek wagowy NGF do nośnika wynosi od 0,01:1 do 0,5:1. Stosownie do tego, gdy stosuje się HSA jako nośnik, korzystne stężenie HSA wynosi od 0,1 do 1,25% wagowych (tzn. 1 do 12,5 mg/ml) kompozycji wodnej. Korzystny preparat zawiera HSA w ilości około od 0,3 do 0,7% wagowych wodnego preparatu, bardziej korzystny preparat zawiera HSA w ilości około 0,4 do 0,6% wagowych wodnego preparatu. Najbardziej korzystny preparat zawiera HSA w ilości około 0,5% (tzn. 5 mg/ml) wagowych kompozycji wodnej.

Preparat NGF zawiera także wystarczającą ilość biologicznie dopuszczalnej soli, by utrzymać toniczność płynu. Sól działa również na rzecz utrzymania NGF w roztworze. Korzystnie, preparat NGF zawiera dostateczną ilość soli, by zachować izotoniczność, w granicach dopuszczalnych fizjologicznie, z krwią ludzką lub płynem mózgowo-rdzeniowym. Korzystną solą jest chlorek sodu, lecz mogą być użyte również inne sole biologicznie dopuszczalne, takie jak chlorek potasu (KCl), chlorek wapnia (CaCE) i chlorek magnezu (MgCh). Sól może być jedną solą lub kombinacją soli. Korzystny preparat zawiera sól w ilości 0,5 do 1,0% (tzn. 5 do 10 mg/ml) wagowych kompozycji wodnej. Bardziej korzystny preparat zawiera sól w ilości 0,6 do 0,9% wagowych preparatu. Korzystniej, preparat zawiera sól w ilości 0,7 do 0,9% wagowych wodnego preparatu. Najbardziej korzystny preparat zawiera sól w ilości 0,87% (tzn. 8,7 mg/ml) wagowych preparatu wodnego.

176 387

Preparat NGF zawiera ponadto biologicznie dopuszczalny bufor, by utrzymać pH podczas przechowywania. Ustalono, że NGF jest bardziej trwałe przy niskim pH. Korzystny trwały preparat NGF jest buforowany biologicznie dopuszczalnym buforem do pH 4,5 - 6,0, a bardziej korzystnie pH 5,0 - 5,4. Najbardziej korzystne pH preparatu wynosi 5,2. Korzystnym buforem jest kwas cytrynowy, lecz bierze się pod uwagę również inne bufory zdolne do utrzymywania pH w żądanym zakresie. Inne odpowiednie bufory obejmują kwas octowy/octan i kwas maleinowy/maleinian. Korzystna ilość buforu będzie się zmieniać w zależności od rodzaju użytego buforu i jego pojemności buforowania. Bufor powinien być obecny w preparacie w ilości wystarczającej do utrzymania końcowego pH preparatu w korzystnym zakresie pH. Korzystne stężenie buforu dla trwałych preparatów NGF wynosi 0,01 - 0,3% wagowych wodnego preparatu (0,1 do 3,0 mg/ml), bardziej korzystne stężenie buforu wynosi 0,1 - 0,25% wagowych preparatu wodnego (1,0 do 2,5 mg/ml), a najbardziej korzystne stężenie buforu wynosi 0,2% wagowych wodnego preparatu (2,0 mg/ml).

Preparat zawiera wodę w ilości wystarczającej do uzyskania odpowiedniego stężenia jego składników.

Korzystne trwałe preparaty wodne NGF zawierają 1 -1250 μg/ml NGF, 1 -12,5 mg/ml HSA, 5 - 10 mg/ml NaCl, 0,2 - 3,0 mg/ml kwasu cytrynowego oraz wodę, przy czym pH preparatu jest nastawione na 4,5 - 6,0, bardziej korzystnie na 5,0 - 5,4. Najbardziej korzystne trwałe preparaty NGF zawierają 10 - 500 μ g/ml NGF, 5 mg/ml HSA, 8,7 mg/ml NaCl, 2,1 mg/ml kwasu cytrynowego oraz wodę, przy czym pH formulacji jest nastawione na 5,2.

Wytworzone z wodnych preparatów NGF liofilizowane kompozycje są szczególnie przydatne dla zapewnienia długoterminowego przechowywania NGF, zwłaszcza przy podwyższonych temperaturach. Liofilizowalne kompozycje zawierają NGF, biologicznie dopuszczalny środek spęczniający, bufor dla utrzymania pH kompozycji w zakresie 5,5 - 6,5, biologicznie dopuszczalny rozpuszczalny w wodzie proteinowy nośnik, ewentualnie, biologicznie dopuszczalną sól oraz wodę.

NGF jest obecny w liofilizowalnych kompozycjach w tym samym zakresie stężeń jak w wodnych preparatach. Środek spęczniający zasadniczo daje podłoże mechaniczne przez umożliwienie, by matryca utrzymywała swoją konformację podczas oraz po procesie liofilizacji. Jako środka spęczniającego można użyć jeden lub wiele cukrów. Odpowiednie cukry obejmują, lecz nie są ograniczone do nich, monosacharydy, oligosacharydy i polisacharydy. Przykłady odpowiednich cukrów obejmują, lecz nie są ograniczone do wymienionych pozycji, fruktozę, glukozę, mannozę, sorbozę, ksylozę, maltozę, laktozę, sacharozę i dekstran. Określenie cukru obejmuje również alkohole cukrowe, takie jak mannit, sorbit, inozyt, dulcyt, ksylit i arabit. Mieszaniny cukrów mogą być również użyte zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Korzystny środek spęczniający zawiera kombinację cukrów. Korzystny środek spęczniający jest kombinacją sacharozy i mannitu. Uważa się, że sacharoza tworzy po krzepnięciu i następnie liofilizacji, bezpostaciowe szkło, umożliwiając potencjalnie zwiększenie trwałości proteiny (np. zapobieżenie agregacji) przez tworzenie dyspersji molekularnej NGF w sztywnym szkle. Trwałość można również poprawić dzięki cukrowi działającemu jako zastępstwo wody utraconej po liofilizacji. Cząsteczki cukńi prędzej niż cząsteczki wody ulegają związaniu do proteiny za pomocą wiązań wodorowych. Mannit w przypadku zmieszania w stosunku masowym 1:1 z sacharozą (o temperaturze zeszklenia -36°C) podwyższa temperaturę zeszklenia preparatu o 5°C do -31°C. To znacząco skraca pierwotny czas suszenia preparatu podczas liofilizacji, przy równoczesnym umożliwianiu tworzenia amorficznej, szklistej matrycy preparatu, i jest to uważane za korzyść przy ustawianiu wytwarzania w dużej skali. W miejsce jednego lub obydwu z tych cukrów można podstawić inne środki spęczniające, które również wykazują takie cechy.

Preparaty według wynalazku, które mają być liofilizowane, mają korzystnie wyższe pH niż preparaty, które nie są liofilizowane lub które są rekonstytuowane. Środki spęczniające (cukry) obecne w liofilizowanych preparatach są zasadniczo trwalsze przy wyższych pH. Korzystnie pH preparatu przed liofilizacją wynosi 5,5 - 6,5. Bardziej korzystnie pH

176 387 liofilizowalnego preparatu NGF wynosi 5,8 - 6,2. pH najbardziej korzystnej liofilizowalnego preparatu NGF wynosi 6,0. Gdy środkiem spęczniającym jest sacharoza, korzystne pH liofihzowalnego preparatu wynosi 6,0 ponieważ przy kwasowym pH, sacharoza, nieredukujący disacharyd, hydrolizuje do redukujących cukrów D-fruktozy i D-glukozy. Cytrynian jest najbardziej korzystnym buforem dla liofilizowalnych preparatów NGF, lecz można również zastosować inne biologicznie dopuszczalne bufory, takie jak maleinian. Bufory inne niż octan są korzystne ze względu na skłonność kwasu octowego do ulatniania się podczas liofilizacji. Należy uznać, że może być niezbędne nastawienie końcowego pH przy użyciu kwasu lub zasady. Jakąkolwiek stratę w długookresowej trwałości wodnego NGF wskutek wyższego pH około 6,0 można prawdopodobnie skompensować przez zwiększenie trwałości związanej z liofilizowanym NGF.

W idealnym przypadku, przy wyborze buforu bierze się pod uwagę potencjalne przesunięcia pH podczas liofilizacji spowodowane przez sekwencyjną krystalizację składników buforu. Np. w przypadku buforów fosforanowych, składnik zasadowy ma wyższy punkt eutektyczny niż składnik kwasowy, a zatem wykrystalizowuje najpierw i pH spada. Bufor cytrynianowy jest korzystny, ponieważ uważa się, że obydwa składniki buforowe mają mniej więcej ten sam punkt eutektyczny, dający w wyniku bardzo małą fluktuację pH przy spadku temperatury. Innymi odpowiednimi buforami byłyby składniki z tymi samymi lub podobnymi punktami eutektycznymi.

Kompozycje liofilizowalne mogą ewentualnie obejmować biologicznie dopuszczalną sól zapewniając izotoniczność. Sól, którą można wybrać spośród tych samych soli przydatnych w wodnych preparatach, jest obecna w liofilizowalnym preparacie przy tych samych lub obniżonych stężeniach jak te w preparatach wodnych. Ponieważ stężenie soli może się zwiększyć podczas liofilizacji, może być pożądane obniżenie stężenia soli obecnego w liofilizowalnych preparatach, by zapobiec denaturacji proteiny. Obniżenie stężenia soli w liofilizowalnym preparacie można skompensować podczas rekonstytucji, tak by zapewnić końcowy preparat wystarczająco izotoniczny, by był on odpowiedni dla podawania osobnikowi.

Liofilizowalne kompozycje zawierają biologicznie dopuszczalny, rozpuszczalny w wodzie proteinowy nośnik. Nośniki i stężenia nośników, które można użyć w liofilizowalnych kompozycjach według wynalazku są takie same, jak te, które są odpowiednie do stosowania w wodnych preparatach według wynalazku.

Korzystne kompozycje liofilizowalne zawierają 1 - 1250 μ g/ml NGF, 15 - 45 mg/ml sacharozy, 15 - 45 mg/ml mannitu, ewentualnie 7 - 9 mg/ml NaCl oraz 0,1 - 0,7 mg/ml kwasu cytrynowego przy pH wynoszącym 5,5 - 6,5. Najbardziej korzystne liofilizowalne formulacje NGF zawierają 100 -1250 μg/ml NGF, 30 mg/ml sacharozy, 30 mg/ml mannitu, 5 mg/ml albuminy surowicy ludzkiej, ewentualnie 8,7 mg/ml NaCl, oraz 0,3 mg/ml kwasu cytrynowego. Najbardziej korzystne pH liofilizowalnej formulacji wynosi 6,0.

Liofilizowalne kompozycje są liofilizowane do resztkowej zawartości wilgoci mniejszej niż 2%; jednakże kompozycje, zachowują aktywność biologiczną NGF przy wyższych lub niższych ilościach zawartości wilgoci.

Korzystna liofilizowana kompozycja zawiera 0,001 - 1,25 części czynnika wzrostu nerwu, 30 - 90 części cukru, 1,0 -12,5 części proteinowego nośnika oraz mniej niż 1 część wody.

Liofili^<^’w^;na kompozycja NGF jest rekonstytuowana przy użyciu rozcieńczalnika zawierającego bufor, takiego jak kwas cytrynowy, i sól, taką jak chlorek sodowy, ponieważ może być wymagane, by uzyskiwany rekonstytuowany preparat był podobny do ciekłego preparatu wodnego, tzn. o zawartości 1 -1250 /z g/ml NGF, 1 -12,5 mg/ml HSA, 5-10 mg/ml NaCl, 0,2 - 3,0 mg/ml kwasu cytrynowego, 1,5 - 30 mg/ml sacharozy oraz 1,5 - 30 mg/ml mannitu i pH 5,2.

Liofilizowana kompozycja NGF jest również przydatna jako składnik zestawu, aby zapewnić dogodny i ekonomiczny sposób dostarczenia trwałego liofilizowanego NGF w postaci, która może być szybko i łatwo rekonstytuowana w odpowiedniej zaróbce dla podawania pacjentowi potrzebującemu leczenia. Oprócz liofilizowanej kompozycji NGF,

176 387 zestawy zawierają również zaróbkę rekonstytuującą. Rekonstytuująca zaróbka zawiera sterylną wodę i wystarczającą ilość soli, by końcowy rekonstytuowany preparat zasadniczo był izotoniczny. Rekonstytuująca zaróbka może ponadto zawierać dodatkowy bufor. Całkowita objętość rekonstruującej zarobki obecnej w zestawie powinna być wystarczająca, by osiągnąć końcowe stężenie NGF odpowiednie do podawania osobnikowi wymagającemu leczenia. Korzystnie, zestaw zawiera dwie fiolki. Jedna fiołka zawiera sterylną liofilizowaną kompozycję NGF, natomiast druga fiolka zawiera sterylną rekonstytuującą zaróbkę. Aby stosować zestaw, odpowiednią ilość rekonstytuującej zarobki przenosi się do fiolki zawierającej liofilizowaną kompozycję NGF. Po rozpuszczeniu liofilizowanej kompozycji, rekonstytuowany preparat może być bezpośrednio podawany pacjentowi.

Ze względu na długookresową trwałość rekonstytuowanego preparatu jest również możliwe sporządzenie dostatecznej ilości rekonstytuowanego preparatu, by zapewnić dawki wielokrotne.

Preparaty według wynalazku są przydatne w leczeniu osobników o stanach reagujących na terapię NGF. W typowym przypadku, takie preparaty są sterylne, i są odpowiednie do podawania dożylnego, domięśniowego, parenteralnego lub wewnątrznaczyniowomózgowego. Taka terapia może być przydatna w leczeniu dysfunkcji neuronowych wiążących się z urazem neuronowym lub degeneracją neuronów wrażliwych na NGF. NGF może być zwłaszcza przydatne w leczeniu choroby wynikającej ze straty centralnych neuronów cholinergicznych, takich jak choroba Alzheimera. NGF w leczeniu choroby Alzheimera i innych postaci demencji opisano w EP 0 370171.

Preparaty według niniejszego wynalazku jako terapię demencji można podawać dowolną z rozmaitych dróg w zależności od specyficznego zastosowania końcowego. Najbardziej odpowiednia droga będzie zależeć od zastosowania i konkretnego leczonego osobnika.

Aby przezwyciężyć trudności stwarzane przez baterię krew-mózg, NGF można podawać do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) bezpośrednimi iniekcjami wewnątrzkomorowymi lub przez nasycone lekiem implanty (wszczepy) lub pompy. Inną drogą podawania jest ciągła infuzja przez urządzenie z kaniulą wewnątrznaczyniowomózgową. Alternatywnie, by przemknąć barierę krew-mózg może być niezbędna koniugacja NGF z cząsteczkami nośnika, takiego jak transferyna.

Spodziewana terapeutycznie skuteczna ilość NGF wynosi 0,001 - 0,5 mg dziennie, korzystnie 0,01 - 0,10 mg dziennie, najkorzystniej 0,02 - 0,06 mg dziennie. Dokładna dawka i tryb podawania będzie zależeć od wielu czynników, takich jak droga podawania i stopień choroby osobnika poddawanego leczeniu.

Sposoby postępowania podczas prób. Identyfikacja i znaczenie ilościowe NGF przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami.

NGF zidentyfikowano i oznaczono ilościowo przez analizę 100μΐ próbek przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami (chromatograf cieczowy Hewlett Packard HP 1090) wyposażonego w kolumnę analityczną z odwróconymi fazami Dynamax (Rainin Instrument Co., Wobum, MA, USA; parametry: 4 - 6 mm x 25 cm L, 300 angstr., 5 μm) z kolumną zabezpieczającą Dynamax (parametry: 4,6 mm x 1,5 cm, 300 angstr., 5 μm) oraz zestawem detektora UV z układem diod przy 220 nm. Fazami ruchomymi były: (A) 0,1% kwas trifluorooctowy w wodzie oraz (B) 0,1% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu, przy czym gradienty zmieniały się od 25% (B) do 60% (B) w 45 minut przy szybkości przepływu 0,5 ml/min przy ciśnieniu 11,7 -13,8 MPa w temperaturze otoczenia.

Identyfikację NGF przeprowadzono przez porównanie jego czasu retencji w próbce z odpowiednim czasem retencji świeżo przygotowanych kalibrowanych roztworów standardowych NGF wykonanych z NGF z tej samej próbki. Ilość NGF w próbkach obliczono przez porównanie z krzywą standardową otrzymaną przy serii rozcieńczeń znanych stężeń.

176 387

Oznaczenie stężenia NGF (μ g/ml) za pomocą testu ELISA

Stężenia NGF określono również za pomocą testu ELISA. Zarówno standardy jak i próbki zbadano trzykrotnie. Każda płytka zawierała pełną krzywą standardową NGF i ślepe próby odniesienia bez NGF.

Po dodaniu 100 μ l przeciwciał powlekających (24C1 monoklonalne z organizmu myszy wywołane wobec rhNGF) do każdego z zagłębień płytki z 96 zagłębieniami, płytki otoczono w otoczce Sarana przy użyciu wilgotnego ręcznika papierowego i inkubowano przez noc w lodówce w 2 - 8°C. Zagłębienia opróżniono, przemyto 3 razy przy użyciu zestawu strzykawki samonapelnianej Wheaton, by dostarczyć 250 μΜ zagłębienie buforu przemywającego (zawierającego 500 mM Tris, 2 M chlorku sodu, buforowane do pH 7) i wytarto do sucha. Następnie 200 μΐ buforu blokującego (1% roztwór albuminy surowicy bydlęcej) dodano do każdego zagłębienia, by zablokować miejsca niespecyficzne, 50 μΐ próbki dodano do każdego zagłębienia i płytki inkubowano przez minimum 1 godz. w temperaturze pokojowej równocześnie mieszając na wytrząsarce pomostowej. Zagłębienia ponownie opróżniono, wytarto do sucha, i dodano 50 μ l roztworów standardu i próbki. Następnie próbki pokryto i inkubowano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Z kolei zagłębienia na płytce ponownie opróżniono, czterokrotnie przemyto buforem i wytarto do sucha. Pięćdziesiąt (50) μΐ biotynylowanego przeciwciała (8Cl monoklonalne z organizmu myszy wywołane wobec rhNGF) dodano do każdego zagłębienia, płytki pokryto i inkubowano przez dwie godziny. Zagłębienia płytek opróżniono, przemyto i osuszono, jak opisano powyżej i do każdego zagłębienia dodano 50 μΐ skoniugowanej z peroksydazą streptawidyny z chrzanu. Płytki pokryto i inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej mieszając na wytrząsarce pomostowej. Następnie płytki pięciokrotnie przemyto buforem przemywającym. Po dodaniu 50 μΐ bufora substratu orto-fenylenodiaminy (OPD) do każdego zagłębienia, płytki pokryto i inkubowano w ciemności przez 1 godz. Dla oznaczenia absorbancji każdego zagłębienia zastosowano czytnik Vmax Kinetic Microplate (Molecular Devices, Mountain View). W przypadku każdego zagłębienia absorbancję tła przy 650 nm odjęto od adsorbancji piku przy 450 nm uzyskując absorbancję netto. Stężenie NGF w próbkach oznaczono przez porównanie ze standardową krzywą NGF.

Oznaczenie aktywności NGF

Bioaktywność NGF oznaczono za pomocą biopróby PC-12. Biopróba PC-12 jest oparta na zwiększonej aktywności metabolicznej komórek feochromocytomy PC-12 (Greene, Trends Neurosci. 7:91 1986) po wystawieniu na działanie NGF. Aktywność metaboliczną komórek PC-12 zmierzono przez komórkowy wychwyt bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ilo]-2,5-difenyloterazol.iowego (C1eH16N5Br) (MTT), który jest przeprowadzany za pomocą dehydrogenazy komórkowej w nierozpuszczalne, śródkomórkowe niebieskie kryształy).

Każde zagłębienie płytki o 96 zagłębieniach zawierało około 30000 komórek PC-12 w 50 μΐ ośrodka RPMI-1640 (Sigma). Seryjne rozcieńczenia każdej próbki i standardy sporządzono wytwarzając roztwory od 0,006 do 400 ng rhNGF na ml w RPMI-1640 z 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Pięćdziesiąt mikrolitrów każdego roztworu dodano następnie do każdego zagłębienia uzyskując stężenia od 0,003 do 200 ng NGF na ml i każde stężenie poddano próbie trzykrotnie. Po utrzymywaniu płytek przez 2 dni w 5% CO2 w 37°C, do każdego zagłębienia dodano 10 μg MTT, a płytki inkubowano przez dodatkowe 4 godziny. Następnie dodano jedną objętość 20% SDS w 50% dimetyloformamidu (DMF), pH 4,7, płytki otoczono celofanem, zapieczętowano wewnątrz worków plastykowych i inkubowano przez noc w 37°C. Płytki odczytano następnego dnia przy użyciu zestawu czytnika płytek Vmax przy 575 nm. Stosunek ED50 krzywej próbki do ED50 standardowej krzywej NGF stanowi miarę względnych mocy dwóch preparatów.

176 387

Przykład 1. Preparat NGF.

Sporządzono wodne preparaty zawierające 1, 10,100 i 1000 /zg/ml rhNGF, 5 mg/ml HSA, 8,7 mg/ml chlorku sodu i 2,1 mg/ml kwasu cytrynowego oraz ilość wody wystarczającą, by wytworzyć 10 ml preparatu buforowanego do pH 5,2. Po rozpuszczeniu kwasu cytrynowego i soli w około 70% całkowitej objętości, pH nastawiono przy użyciu NaOH/HCl, i dodano HSA i NGF łagodnie mieszając oraz wodę dla uzyskania objętości i preparat przesączono przez filtr 0,2 μΐ Millipore Millex-GV.

rhNGF użyty do sporządzenia preparatu poddano ekspresji w komórkach owada przy użyciu wektora ekspresji bakulowirusowej i oczyszczono za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami i jonowymiennej, jak opisano w: Barnett J., i in., Exp. Neurol., 110:11-24,1990.

Przykład 2. Trwałość preparatu NGF w 5°C i 25°C.

250 μ 1 próbki preparatu 100 μ g/ml NGF z przykładu 1 przechowywano w 5°C i 25°C (temperatura pokojowa) w polietylenowych fiolkach z zakończeniem do wkraplania przez okres do 6 miesięcy. Analizy RP-HPLC, ELISA i biopróby (opisane powyżej) tych próbek, wskazały na brak strat proteiny przez 6 miesięcy (tabela 1).

Tabela 1

Trwałość NGF w 5°C i 25°C zmierzone za pomocą RP-HPLC, ELISA i biopróby

Temp. przechowywania (°C)	RP-HPLC %LS⁺ 1 tydz.	RP-HPLC %LS⁺ 2tyg·	RP-HPLC %LS+ 3 mies.	RP-HPLC %LS+ 4 mies.	ELISA %LS⁺ 6 mies.	RP-HPLC %LS+ 6 mies.	Biopróba Wzgl. moc 6 mies.
5°C	99 ± 2	99 ± 6	96 ± 4	100 ±3	101 ±3	100 ±6	106 ± 14
temp. pokojowa (22 - 25°C)	99 ± 2	91 ±5	95 ±5	103 ±3	99 ± 5	104 ± 13	123 ±3

+) %LS = % moc znacznika = [NGF]próba/[NGF]kontrolne % względnej mocy = próba aktywności/kontrola aktywności (Liczby RP-HPLC oznaczają wartość średnią ± odchylenie standardowe z 2 - 4 powtórzeń. Liczby biopróby oznaczają wartość średnią ± granice ufności 95% z 3 oznaczeń)

Przykład 3. Trwałość różnych preparatów NGF w cewnikach polietylenowych w 37°C.

Próbki 250 μΐ preparatów NGF zawierające od 1 do 1000 μ g/ml rhNGF otrzymane jak opisano w przykładzie 1, przechowywano w cewnikach polietylenowych przepuszczalnych dla promieni rentgenowskich (średnica wewnętrzna 0,76 mm i średnica zewnętrzna 1,22 mm) w 37°C przez okres do 4 tygodni. Wyniki, jak podano w tabeli 2, nie wskazały znaczącej straty zawartości proteiny (jak zmierzono za pomocą RP-HPLC) lub aktywności NGF (jak zmierzono za pomocą biopróby PC-12).

176 387

Tabela 2

Trwałość preparatów NGF w cewnikach polietylenowych w 37°C zmierzona za pomocą RP-HPLC i biopróby pC-12

[NGF]	rp-hplc %ls+	rp-hplc %ls⁺	rp-hplc %ls+	Biopróba PC-12
początkowe				% Wzgl. mocy
(wg/ml)	1 tydz.	2tyg.	4 mies.	4 tyg.
1,0	104 ± 3	87 ±6	85 ±3	101 ± 34
10,0	94±14	92 ± 4	100 ± 1	118 ± 45
100,0	102 ± 4	95 ±6	95 ±2	129 ± 34
1000,0	K0±2	92 ± 4	86 ± 3	108 ± 33

+) %LS = % moc znacznika = [NGF]próba/[NGF]kontrolne % względnej mocy = próba aktywności/kontrola aktywności (Liczby RP-HPLC oznaczają wartość Średnią ± odchylenie standardowe z 2 - 4 powtórzeń. Liczby biopróby oznaczają wartość średnią ± granice ufności 95% z 3 oznaczeń).

Przykład 4. Trwałość preparatów w różnych urządzeniach do podawania.

Próbki preparatu 100 μ g/ml NGF z przykładu 1 umieszczono w implantowalnej pompie infuzyjnej Infusaid Model 600 (Shiley-Infusaid Inc., Norwood, MA), implantowalnej pompie infuzyjnej Medtronics Synchromed (Medtronics Inc., Minneapolis, MN) albo miniosmotycznej pompie infuzyjnej Alzet Model 2ML 4 (Alza Corp., Pało Alto, CA). Pompy umieszczono w łaźni wodnej w 37°C i zapoczątkowano wypływ preparatu z pompy. Tygodniowe próbki zbierano przez okres 4-tygodniowy i zbadano na zawartość i aktywtość proteiny za pomocą RP-HPLC, testu ELISA oraz biopróby PC-12.

Dane w tabeli 3 pokazują, że nie zaobserwowano znaczącego zmniejszenia aktywności lub stężenia NGF.

Tabela 3

Trwałość preparatu NGF w różnych urządzeniach do podawania w 37°C przez 1 miesiąc

Układ podawania	rp-hplc %LS+ 1 tydz.	RP-HPLC LS+ 2 tyg.	RP-HPLC LS+ ^{4 t}yg.	ELISA LS+ ⁴ tyg·	Biopróba % Wzgl. mocy ⁴ tyg.
pompa implantowalna Infusaid Model 600	91 ±3	101 ±3	112 ±4	90 ± 11	100 ±36
pompa implantowalna Medtronics Synchromed	109 ±2	92 ± 2	91 ±3	94 ±4	90 ± 6
minipompa osmotyczna Alzet 2ML4	96 ±3	95 ±7	90 ± 5	nie oznaczono	nie oznaczono

+) %LS = % moc znacznika = [NGF]próba/[NGF]kontroIne % względnej mocy = próba aktywności/kontrola aktywności (Liczby RP-HPLC oznaczają wartość średnią ± odchylenie standardowe z 2 - 4 powtórzeń. Liczby biopróby oznaczają wartość średnią ± granicie ufności 95% z 3 oznaczeń).

176 387

Przykład 5. Badania trwałości preparatu NGF przy pH 4 do 10.

Sporządzono wodne preparaty zawierające 100 μ g/ml NGF, 1 mg/ml HSA oraz 9 mg/ml chlorku sodu, buforowane przy pH 4 -10 i przesączono sterylnie przez filtr 0,2 μ (MillexGV Millipore Corp.), w taki sposób jak w przykładzie 1. Preparaty o pH 4 do 5 buforowano przy użyciu octanu, a preparaty o pH 6-10 buforowano przy użyciu Tris. Próbki 1 ml przeniesiono do polipropylenowych fiolek z zakończeniem do wkraplania, które następnie inkubowano przy temperaturze pokojowej (23 do 25°C) albo 3TC. Próbki pobrano w różnych momentach i zanalizowano za pomocą RP-HPLC. Stałe szybkości reakcji pierwszego rzędu, przedstawiające stratę NGF z roztworu, wykreślono w funkcji pH. Stwierdzono, że szybkości degradacji NGF w roztworze zwiększają się przy pH mniejszym niż około 4,5 i większym niż około 6,0. Największa trwałość wystąpiła przy pH 5,2.

Przykład 6. Trwałość preparatu NGF w funkcji stężenia nośnika.

Zbadano wpływ rodzaju i ilości nośników na trwałość NGF. Sporządzono 100 μ g/ml wodnego preparatu, jak opisano w przykładzie 1, oraz wodne preparaty zawierające inne nośniki; są one podane w tabeli 4. Każdy preparat sterylizowano przez sączenie przez filtr 0,2 fi Millipore MIllex-GV. Trwałość NGF w różnych preparatach oznaczono przez inkubowanie preparatu NGF w 37°C w fiolkach polipropylenowych z zakończeniem do wkraplania. Próbki pobrano po 2 tygodniach i zbadano na zawartość protein za pomocą RP-HPLC.

Tabela 4

Trwałość różnych preparatów NGF inkubowanych przez 2 tygodnie w 37°C

Zaróbka	Ilość (% wag./obj.)	%LS po 2 tyg.
Żelatyna	1,0	64 ± 9
Albumina surowicy ludzkiej	0,1	48 ± 7
Albumina surowicy ludzkiej	0,5	99 ± 2
Albumina surowicy ludzkiej	1,0	31 ±36
Tween 80	0,2	77 ±9
Pluronic F-68	0,02	65 ±5

%LS = % moc znacznika = [NGF]próba/[NGF]kontrolne (Liczby RP-HPLC oznaczają wartość średnią ± odchylenie standardowe z 2 - 4 powtórzeń).

Przykład 7. Preparat NGF przeznaczony do liofilizacji.

W temperaturze pokojowej sporządzono wodny preparat zawierający 100 μ g/ml NGF, 30 mg/ml sacharozy, 30 mg/ml mannitu, 5 mg/ml HSA i 0,3 mg/ml kwasu cytrynowego, doprowadzony do pH 6,0 przy użyciu NaOH. Po rozpuszczeniu kwasu cytrynowego i cukrów w około 70% całkowitej objętości, pH nastawiono przy użyciu NaOH/HCl, i dodano HSA i NGF łagodnie mieszając oraz wodę dla uzyskania odpowiedniej objętości.

Przykład 8. Liofilizacja preparatu NGF.

Badano trwałość liofilizacji wodnego NGF w preparacie z przykładu 7. Jeden ml próbek preparatów sporządzonych według przykładu 7 umieszczono w fiolkach szklanych 5 ml typu I przykrytych korkami liofilizacyjnymi. Fiolki zawierające preparaty wprowadzono do komory liofilizacyjnej (FTS Systens Inc.), którą zrównoważono w 5°C przed zapoczątkowaniem krzepnięcia. Następnie temperaturę komory obniżono do - 40°C. Po 2 godzinach utrzymywania w -40°C, komorę opróżniono i utrzymywano ciśnienie 106 - 133 kPa przy

176 387 wymywaniu azotem. Zmiana temperatury wynosiła 4°C na godz. do osiągnięcia końcowej temperatury suszenia 25°C. Końcową zawartość wilgoci między 1 a 2% produktu osiągnięto w przybliżeniu po 30 godzinach cyklu.

Liofilizowany proszek przechowywano w 5°C i rekonstytuowano w temperaturze pokojowej po 3 dniach przy użyciu 1 ml rozcieńczalnika składającego się z 8,7 mg/ml chlorku sodu i 1,1 mg/ml kwasu cytrynowego, buforując do pH 5,2. Próbki zbadano na stężenie NGF za pomocą RP-HPLC. Nie zaobserwowano straty proteiny po liofilizacji.

Przykład 9. Badania trwałości preparatu NGF przy składowaniu w fiolkach szklanych w 2 - 8°C.

Sporządzono wodne preparaty zawierające 100 lub 1000 μ g/ml rhNGF przy użyciu sposobu postępowania z przykładu 1, z wyjątkiem tego, że wielkość szarży zwiększono do 1,5 litra. Próbki 4,2 ml umieszczono w fiolkach ze szkła flintowego typu I z korkami z kauczuku butylowego obłożonymi teflonem i przechowywano w 2 - 8°C. Wyniki, przedstawione w tabeli 5 wskazują, że nie było znaczącej straty zawartości protein (jak zmierzono za pomocą RP-HPLC i ELISA), lub aktywności NGF (jak zmierzono za pomocą biopróby PC-12).

Tabela 5

Trwałość preparatu NGF przy przechowywaniu w 2 - 8°C zmierzona za pomocą RP-HPLC, ELISA i biopróby PC-12

[NGF] nominalne («g/ml)	RP-HPLC %LS+ początkowe	RP-HPLC %LS⁺ 12 mies.	ELISA %LS⁺ 12 mies.	Biopróba PC %;LS+ 12 mies.
100,0	103 ±1	101 ± 1	102 ±3	102 ± 15
1000,0	102 ± 1	101 ± 1	108 ±3	102 ±20

+) %LS — % mocy znacznika = [NGF]w czasie testu/[NGF]początkowe

Identyfikacja i oznaczenie ilościowe NGF przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami

W przykładzie 9, postąpiono jak następuje: NGF zidentyfikowano i oznaczono ilościowo przez analizę próbek 100 μ 1 przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami (Hewlett Packard HP 1090 Liquid Chromatograph) wyposażonego w Bakerbond Wide-Pore Butyl (C4) (4-6 mm x 250 mm, wielkość porów 30,0 nm; J. T. Baker Inc. Phillipsburg NJ, USA) i zestaw detektora UV z układem diod przy 210 nm. Fazami ruchomymi były: (A) 0,2% kwas trifluorooctowy w wodzie oraz (B) 60% acetonitryl w buforze (A), przy czym gradienty zmieniały się od 29% (B) do 75% (B) w 65 minut przy szybkości przepływu 1,0 ml/min oraz ciśnieniu 110 · 10²kPa w temperaturze otoczenia.

Następnie postąpiono jak opisano w sposobach postępowania przy próbach HPLC.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Bezpolisacharydowy wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu (NGF), znamienny tym, że zawiera, w przeliczeniu na wodny preparat, (a) czynnik wzrostu nerwu w ilości 0,0001 - 0,125% wagowych;

(b) biologicznie dopuszczalną sól, zawierającą izotoniczność w ilości 0,5 - 1,0% wagowych;

(c) biologicznie dopuszczalny, rozpuszczalny w wodzie proteinowy nośnik w ilości 0,1 -1,25% wagowych;

(d) bufor w ilości wystarczającej do utrzymania pH preparatu w zakresie 4,5 - 6,0; i (e) wodę.
2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że pH wynosi od 5,0 do 5,4.
3. Preparat według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako nośnik zawiera albuminę surowicy ludzkiej (HSA).
4. Preparat według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera 10 do 500 μ g/ml HSA, 8,7 mg/ml NaCl, 2,1 mg/ml kwasu cytrynowego i wodę, a pH preparatu.jest doprowadzone do około 5,2.
5. Wodny preparat farmaceutyczny czynnika wzrostu nerwu (NGF), nadający się do liofilizacji, znamienny tym, że zawiera:

(a) 1 -1250 μ g/ml czynnika wzrostu nerwu;

(b) 30 - 90 mg/ml biologicznie dopuszczalnego środka spęczniającego;

(c) 1 -12,5 mg/ml biologicznie dopuszczalnego, rozpuszczalnego w wodzie proteinowego nośnika;

(d) bufor w ilości wystarczającej do utrzymania pH preparatu od 5,5 do 6,5; i (e) wodę.
6. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że jako środek spęczniający zawiera cukier.
7. Preparat według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jako środek spęczniający zawiera mieszaninę sacharozy i mannitu, jako bufor zawiera cytrynian, a pH preparatu wynosi 5,8 - 6,2.
8. Preparat według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że jako nośnik zawiera albuminę surowicy ludzkiej (HSA).