NO317627B1 - Vandig, farmasoytiske preparater av nervevekstfaktor - Google Patents

Abstract

s. tabile, vandige, farmasøytiske preparater av human nervevekstfaktor (NGF) i vandige, isotone oppløsninger, bufret for å holde pH fra ca. 4,5 til ca. 6,0, og eventuelt inneholdende en bærer, slik som humant serumalbumin, er tilveiebrakt. Det er også. tilveiebrakt vandige NGF-preparater egnet, for lyofilisering og etterfølgende rekondisjonering, hvor rhNGF er blandet med sukkere, eventuelt HSA, og buffer. Preparatene kan anvendes til behandling av Alzheimers sykdom og andre nervesykdommer.

Description

Oppfinnelsens tekniske område

Denne oppfinnelsen vedrører vandige, farmasøytiske preparater av nervevekstfaktor. Denne oppfinnelsen vedrører også vandige preparater av nervevekstfaktor som er egnet for lyofilisering.

Oppfinnelsens bakgrunn

Et stort antall polypeptider og proteiner regulerer cellers vekst eller overlevelse; slike molekyler kalles "vekstfaktorer". Eksempler på vekstfaktorer omfatter epiderm-vekstfaktor (EGF), sur og basisk fibroblastvekstfaktor {aFGF og bFGF), blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), cilieneurotrof faktor (CNTF) og nervevekstfaktor (NGF). Av disse var NGF den første som ble identifisert og karakterisert (Levi-Montalcini, R. et al., J. Exp. Zool., 116:321, 1951).

NGF fremmer overlevelsen og aktiviteten til visse typer nerveceller. I tillegg fremmer NGF differensieringen av prematur-nerveceller til postmitotiske, fullt ferdige neuroner.

Rensing av NGF fra museunderkjevekjertel resulterte i identifikasjonen av et kompleks som omfatter tre underenheter, a, P og Y- AU neurotrof aktivitet av NGF antas å befinne seg i underenheten, et protein med 118 aminosyrer som har en molekylvekt på ca. 13 000 Da (Varon, S. et al.,- Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 57:1782-1789, 1967; Greene, L.A. et al-, Neurobiol., 1:37-48, 1971). I oppløsning danner p-enheter dimerer med molekylvekt på ca. 26 500 Da.

NGF er blitt foreslått å være effektiv til behandling av visse degenerative sykdommer i både det perifere og sentrale nervesystem. Det er blitt foreslått at administreringen av NGF kan være gunstig ved behandling av sykdommer hvor en mangel på NGF, unormaliteter i dens reseptor, eller endringer i dens transport eller intracellulære prosessering, fører til en reduksjon i nervefunksjon, atrofi eller til og med celledød. Slike sykdommer omfatter arvelige sensor- og motorneuro-

patier, arvelige og sporadisk opptredende systemdegenerering, amyotrof, lateral sklerose, Parkinsons sykdom og Alzheimers sykdom (Goedert M. et al., Mol. Brain Res., 1:85-92, 1986; Mobley, W.C. et al., Soc. Neurosci. Abstr., 13:186, 1987;

Mobley, W.C. et al., Soc. Neurosci. Abstr., 4:302, 1988; Hefti, F. et al., Ann. Neurol. 20:275-281, 1986). NGF antas også å redusere nervecelledød etter eksponering mot visse tok-siner, slik som 6-hydroksydopamin (Aloe, L., Arch. Ital. Biol., 113:326-353, 1975), vinblastin og colchicin (Menesini-Chen, M.G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:5559-5563, 1977; Johnson, E.M., Brain Res., 141:105-118, 1978) og capsai-cin (Otten, U., Nature, 301:515-577, 1983).

Den høye ekspresjonen av NGF-mRNA i hippocampus, et område forbundet med hukommelse og læring, tyder på at klinisk applikasjon av NGF kan være effektiv for behandling av demens (Kaisho, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 174:379-385, 1991). Den intraventrikulære administrering av NGF er blitt rapportert å forhindre død av basalforhjernecholinerge neuroner etter axotomi, noe som tyder på at NGF kan være effektiv når det gjelder å fremme celleoverlevelse etter skade.

(Hefti, F., J. Neurosci., 6:2155-2162, 1986; Williams, L. et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:9231-9235, 1986; Kromer, L., Science, 235:214-216, 1987).

Anvendelsen av NGF til terapi byr på betydelige problemer. Disse problemene er forbundet med 1) opprettholdelse av den biologiske aktiviteten av NGF som kan endres under fremstilling, rensing eller lagring; og 2) administrering av NGF, et forholdsvis stort, hydrofilt molekyl, slik at det når det aktive sete i tilstrekkelige mengder til å være effektivt. Den biologiske aktiviteten av NGF, på samme måte som andre proteiner, er avhengig av dens sekundær- og tertiærstruktur, p-underenheter av NGF har tre interne disulfidbindinger som antas å være viktige for biologisk aktivitet (Kanaya, E. et al., Gene, 83:65-74,. 1989; Iwane, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 171:116-122, 1990; Hu, G.-L. og Neet, K.E., Gene, 70:57-65, 1988). I tillegg reduseres, i den utstrekning noe av proteinet denatureres, den effektive mengde av biologisk aktiv NGF. Proteinintegritet må derfor opprettholdes under fremstilling og lagring samt under administrering. Proteiner er særlig tilbøyelige til nedbrytning ved forhøyede temperaturer.

Lavere temperaturer reduserer generelt proteinned-brytning. Det er imidlertid mer økonomisk å lagre proteinet ved romtemperatur, dvs. ca. 25°C, enn ved kjøleskapstempera-turer på ca. 4°C. Formuleringsstabilitet er derfor ønskelig for lagring ved enten romtemperatur eller kjøling ved omtrent 4°C.

I tillegg til problemene med stabilitet bindes NGF, på samme måte som mange andre proteiner, ikke-spesifikt til overflater. Slik ikke-spesifikk binding kan inntre på mange forskjellige materialer, inkludert glass og plast, f.eks. polyetylen eller polypropylen. Disse materialene kan være i form av ampuller, rør, sprøyter, implanterbare infusjonsanord-ninger eller hvilken som helst annen overflate som kan komme i kontakt med NGF under dens fremstilling, lagring eller administrering.

Andre vanskeligheter ved administrering av proteiner, slik som NGF, som terapeutika, er dårlig absorpsjon av kroppen og nedbrytning ved magesyrer. Oral administrering er derfor generelt uegnet. Injeksjoner og infusjon av slike proteiner kan være nødvendig for å overvinne slike absorpsjonsbarrierer.

Injeksjon kan anvendes når behandlingsstedet er lett tilgjengelig. Dersom stedet er forholdsvis utilgjengelig, slik som CNS, kan imidlertid kontinuerlig infusjon være mer prak-tisk for langvarig administrering. Slik administrering er blitt upraktisk på grunn av forskjellige komplikasjoner. For eksempel kan kontinuerlig infusjon oppnås ved å implantere NGF-pumper i hjernen, men langvarig eksponering av et protein mot kroppstemperatur forårsaker ofte nedbrytning av proteinet. Dessuten kan det være ytterligere tap på grunn av proteinad-sorpsjon til pumpekammeret over tid.

I tillegg til problemene forbundet med administreringen av NGF, er det også problemer forbundet med dens langvarige lagring fra fremstillingstidspunktet til administrering. Lyofilisering er én fremgangsmåte for langvarig lagring av biologiske proteiner, noe som vanskeliggjør nedbrytning, aggregasjon og/eller ikke-spesifikk adsorpsjon. Lyofiliser-ingsprosessen byr imidlertid i seg selv på vanskeligheter. Ettersom volumet av væske avtar under fryseproBessen, øker den effektive saltkonsentrasjon dramatisk, noe som kan denaturere proteinet og derved redusere effektiv terapeutisk aktivitet etter rekondisjonering. I tillegg kan dannelse av iskrystaller under fryseprosessen forårsake denaturering og også redusere den effektive mengde av biologisk aktiv NGF som er tilgjengelig. Formuleringen må da være slik at saltkonsentrasjonsfluk-tuasjoner forhindres og dannelsen av iskrystaller minimalis-eres .

Ett formål ved denne oppfinnelsen er å tilveiebringe vandige preparater av NGF som bibeholder biologisk aktivitet i minst én måned over et temperaturområde fra ca. 4 til ca. 40°C.

Nok et annet formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe preparater av NGF hvor biologisk aktivitet opprettholdes etter lyofilisering og rekondisjonering.

Det er nok et annet formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe et lyofilisert, farmasøytisk preparat.

Oppsummering av oppfinnelsen

Denne oppfinnelsen tilveiebringer stabile preparater av nervevekstfaktor som er i stand til å bli lagret ved underomgivelses-, omgivelses- og forhøyede temperaturer uten ves-entlig tap i mengden av protein eller proteinets aktivitet. Preparatene omfatter vandige oppløsninger av:

(a) nervevekstfaktor,

(b) biologisk akseptabelt salt i en tilstrekkelig mengde til å opprettholde isotonisitet, (c) en biologisk akseptabel, vannoppløselig proteinbærer valgt fra gruppen som består av polysorbater, poloksamerer og proteiner, (d) en buffer i en tilstrekkelig mengde til å opprettholde pH i preparatet fra 4,5 til 6,0, og

(e) vann.

Ved et annet aspekt tilveiebringer denne oppfinnelsen farmasøytiske preparater av NGF som er egnet for lyofilisering.

De farmasøytiske preparatene ifølge denne oppfinnelsen, egnet for lyofilisering, omfatter vandige oppløsninger av:

(a) 1-1250 /xg/ml nervevekstfaktor,

(b) 30-90 mg/ral av et biologisk akseptabelt, volumøkende middel, hvori det volumøkende middelet er et monosakkarid, oligosakkarid eller en sukkeralkohol, (c) en biologisk akseptabel, vannoppløselig proteinbærer valgt fra gruppen som består av polysorbater, poloksamerer og proteiner, (d) en buffer i en tilstrekkelig mengde til å holde pH i preparatet ved 5,5 til 6,5, og

(e) vann.

Et ytterligere aspekt av denne oppfinnelsen er de lyofiliserte, farmasøytiske preparater hvorfra vannet i det vesentlige er blitt fjernet, kjennetegnet ved at de består av 0,001-1,25 deler nervevekstfaktor, 30-90 deler sukrose og mannitol til sammen, og mindre enn 1 del vann. Etter rekondisjonering med en rekondisjonerende bærer, eventuelt inkludert en biologisk akseptabel bærer, er de lyofiliserte preparater ifølge denne oppfinnelsen egnet for administrering til pasienter som trenger behandling.

NGF i de vandige preparatene ifølge oppfinnelsen kan lagres ved temperaturer fra ca. 4 til ca. 40°C.

Preparatene kan anvendes ved en fremgangsmåte for behandling av nervedysfunksjon hos mennesker, omfattende administreringen av en terapeutisk effektiv mengde av et NGF-preparat ifølge oppfinnelsen.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Utviklingen av stabile, parenterale doseringsformer for NGF krever evaluering av en rekke faktorer, inkludert ad-ministrer ingsvei , adsorpsjonsinteraksjoner og forenlighet med bearbeidelsesutstyr og potensielle avleveringsanordninger. En ytterligere vurdering er stabiliteten til NGF i vandige preparater ved underomgivelses-, omgivelses- og forhøyede temperaturer. Én utførelsesform av denne oppfinnelsen er et preparat av NGF i en vandig oppløsning som utviser stabilitet i et temperaturområde, og særlig ved forhøyede (minst ca. 40°C) temperaturer. Dette preparatet omfatter en vandig oppløsning av NGF, et salt og en buffer, med en pH på 4,5 til 6,0. Preparatet kan videre eventuelt omfatte en bærer. Denne kombinasjonen av bestanddeler gir overraskende oppløsningen svært gunstige karakteristika, særlig i forhold til stabilitet ved forhøyede temperaturer. Det tilveiebringes også et preparat av NGF som er egnet for lyofilisering.

Slik det her er brukt, gjelder "biologisk akseptabel" materialer som er kjennetegnet ved fravær av ugunstige, biologiske effekter in vivo. "Romtemperatur" er mellom ca. 22 og ca. 25°C. "Kroppstemperatur" er mellom ca. 36 og ca. 40°C. "Lyofiliserbart preparat" henviser til et vandig preparat av NGF som kan frysetørkes til et vanninnhold som er mindre enn 2%, og som bibeholder minst ca. 70% av den opprinnelige biologiske aktivitet av NGF etter rekondisjonering. "Isoton" henviser til en oppløsning med omtrent det samme osmotiske trykk som blodserum, ca. 300 millimol pr. liter. En "bærer" er hvilket som helst biologisk akseptabelt emulgeringsmiddel, dispergeringsmiddel, overflateaktivt middel eller protein som reduserer adsorpsjon av NGF til en overflate.

"NGF" betegner enhver form av nervevekstfaktor, fortrinnsvis p-underenheten av nervevekstfaktor, som utviser biologisk aktivitet og binder seg til NGF-reseptoren. Uttrykket NGF omfatter også hybridiserte og modifiserte former av NGF som bindes til NGF-reseptoren og bibeholder NGF-bioaktivitet. Modifiserte former av NGF kan omfatte fusjonsproteiner, slik som de som er beskrevet i Iwai, S. et al., Chem. Pharm. Bull., 34:4724-4730, 1986 og Kanaya, E. et al., Gene, 83:65-74, 1989, og NGF-fragmenter og hybrider hvor visse aminosyrer er blitt fjernet eller erstattet, mens tilstrekkelig NGF-bioaktivitet og reseptorbinding til å tilveiebringe terapeutisk aktivitet er blitt opprettholdt.

Den foretrukne form av NGF er human-NGF (hNGF). Den mest foretrukne form av hNGF er rekombinant hNGF (rhNGF). Fremgangsmåter for erholdelse av NGF egnet for bruk i preparatene ifølge denne oppfinnelsen, er kjent for fagfolk innen teknikken. For eksempel kan egnet rhNGF fremstilles ved hjelp av et baculovirus-ekspresjonssystem (Barnett, J. et al., Exp. Neurol., 110:11-24, 1990; EPO 370 171), et gjærekspresjonssys-. tem (Kanaya, E. et al., Gene 83:65-74, 1989), et pattedyrcel-leekspresjonssystem (CHO-ekspresjonssystem) (Iwane, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 171:116-122, 1990), eller et COS-ekspresjonssystem (Bruce, G. et al., Neurobiol. Aging, 10:89-94, 1989) . NGF bør være minst 65% ren, fortrinnsvis minst 85% ren, helst minst 95% ren, og aller helst minst 98%

ren. Renheten til isolert NGF for anvendelse i preparatene kan bestemmes ved hjelp av sølvfarget SDS-PAGE eller på andre måter som er kjent for fagfolk innen teknikken.

I de vandige NGF-preparater som er tilveiebrakt, er

NGF til stede i terapeutisk effektive mengder. Fortrinnsvis omfatter NGF fra 0,0001 til 0,125 vekt% av det vandige preparat, noe som tilsvarer mellom 1 og 1 250 ug/ml. Mer foretrukket er NGF til stede i en mengde fra 0,001 til 0,10 vekt% (10-1 000 ug/ml) av det vandige preparat. Enda mer foretrukket er NGF til stede i en mengde fra 0,01 til 0,10 vekt% (100-1 000 ug/ml) av det vandige preparat. Aller helst er NGF til stede i en mengde fra 0,01 til 0,05 vekt% (100-500 ug/ml) av det vandige preparat.

De vandige NGF-preparater omfatter eventuelt bærere. Tilstedeværelsen av bæreren i preparatet reduserer eller for-hindrer NGF-adsorpsjon til forskjellige overflater. Behovet for bærer avhenger av konsentrasjonen av NGF i det vandige preparat. Ved tilstrekkelig høye (mer enn ca. 500 ug/ml) NGF-konsentrasjoner forblir tilstrekkelig NGF i oppløsning til å oppveie det som går tapt på grunn av overflateadsorpsjon. Egnede bærere omfatter, men er ikke begrenset til, polysorbater, slik som "Tween" 80, poloksamerer, slik som "Pluronic" F68, og proteiner, slik som serumalbumin. Den foretrukne bærer er et protein. Humant serumalbumin (HSA) er særlig foretrukket. Vektforholdet mellom NGF og bærer er fra 0,0001:1 til 1:1. Et mer foretrukket vektforhold er fra 0,01:1 til 1:1. Det mest ■ foretrukne vektforhold mellom NGF og bærer er 0,01:1 til 0,5:1. Når HSA brukes som bæreren, er følgelig den foretrukne konsentrasjon av HSA fra 0,1 til 1,25 vekt% (dvs. 1-12,5 mg/ml) av det vandige preparat. Et foretrukket preparat er 0,3-0,7 vekt% HSA av det vandige preparat, helst 0,4-0,6 vekt% HSA av det vandige preparat. Det mest foretrukne preparat er ca. 0,5 vekt%

(dvs. 5 mg/ml) HSA av det vandige preparat.

NGF-preparatet inneholder også en tilstrekkelig

mengde biologisk akseptabelt salt til å opprettholde væske-tonisitet. Saltet virker også til å opprettholde NGF i oppløs-ning. Fortrinnsvis inneholder NGF-preparatet tilstrekkelig salt til å være isotont, innenfor fysiologisk akseptable

grenser, med menneskeblod eller cerebral spinalvæske. Det foretrukne salt er natriumklorid (NaCl), men andre biologisk akseptable salter kan brukes, slik som kaliumklorid (KCl), kalsiumklorid (CaCl2) og magnesiumklorid (MgCl2) . Saltet kan være ett salt eller en blanding av salter. Et foretrukket preparat omfatter 0,5-1,0 vekt% (dvs. 5-10 mg/ml) salt av det vandige preparat. Et mer foretrukket preparat omfatter 0,6-0,9 vekt% salt av preparatet. Mer foretrukket omfatter preparatet 0,7-0,9 vekt% salt av det vandige preparat. Det mest foretrukne preparat omfatter ca. 0,87 vekt% (dvs. 8,7 mg/ml) salt av det vandige preparat.

NGF-preparatet inneholder videre en biologisk akseptabel buffer for opprettholdelse av pH under lagring. Vi har funnet at NGF er mer stabil ved lav pH. Det stabile NGF-preparat bufres med en biologisk akseptabel buffer inntil en pH mellom 4,5 og 6,0, og helst til mellom 5,0 og 5,4. Den mest foretrukne pH-verdi i preparatet er 5,2. Den foretrukne buffer er sitronsyre, men andre buffere som er i stand til å opprettholde pH innenfor det ønskede område, er også omfattet. Andre egnede buffere omfatter eddiksyre/acetat og maleinsyre/maleat. Den foretrukne mengde buffer vil variere avhengig av typen av buffer som brukes, og dens bufferkapasitet. Bufferen bør være til stede i preparatet i en tilstrekkelig mengde til å opprettholde slutt-pH i preparatet i det foretrukne pH-område. Den foretrukne konsentrasjon av buffer for stabile NGF-preparater er 0,01 til 0,3 vekt% av det vandige preparat (0,1-3,0 mg/ml), en mer foretrukket konsentrasjon er 0,1 til 0,25 vekt% buffer av det vandige preparat (1,0-2,5 mg/ml), og den mest foretrukne bufferkonsentrasjon er ca. 0,2 vekt% buffer av det vandige preparat (2,0 mg/ml).

Preparatet omfatter vann i en tilstrekkelig mengde til å oppnå den passende konsentrasjon av preparatkomponenter.

Foretrukne, stabile, vandige preparater av NGF omfatter 1-1250 ug/ml NGF, 1-12,5 mg/ml HSA, 5-10 mg/ml NaCl, 0,2-3,0 mg/ml sitronsyre og vann, hvor pH-verdien i preparatet er regulert til 4,5 til 6,0, mer foretrukket fra 5,0 til 5,4. De mest foretrukne, stabile preparater av NGF omfatter 10-500 ug/ml NGF, 5 mg/ml HSA, 8,7 mg/ml NaCl, 2,1 mg/ml sitronsyre og vann, hvor pH-verdien i preparatet er regulert til ca. 5,2.

De lyofiliserte preparater ifølge denne oppfinnelsen er særlig anvendbare for tilveiebringelse av langvarig lagring av NGF, spesielt ved forhøyede temperaturer. De lyofiliserbare preparater ifølge denne oppfinnelsen omfatter NGF, et biologisk akseptabelt volumøkende middel, en buffer for opprettholdelse av pH i preparatet fra 5,5 til 6,5, eventuelt et biologisk akseptabelt salt, eventuelt en biologisk akseptabel, vann-oppløselig bærer og vann.

NGF er til stede i de lyofiliserbare preparater over det samme konsentrasjonsområde som i de vandige preparatene.

Det volumøkende middel gir generelt mekanisk støtte slik at matriksen opprettholder sin konformasjon under og etter fryse-tørkingsprosessen. Ett eller flere sukkere kan brukes som det volumøkende middel. Sukkere, slik de her er brukt, omfatter,

men er ikke begrenset til, monosakkarider, oligosakkarider og polysakkarider. Eksempler på egnede sukkere omfatter, men er ikke begrenset til, fruktose, glukose, mannose, sorbose,

xylose, maltose, laktose, sukrose og dekstran. Sukker omfatter også sukkeralkoholer, slik som mannitol, sorbitol, inositol, dulcitol, xylitol og arabitol. Blandinger av sukkere kan også brukes i overensstemmelse med denne oppfinnelse.

Et foretrukket, volumøkende middel omfatter en kombinasjon av sukkere. Det foretrukne, volumøkende middel er en kombinasjon av sukrose og mannitol. Uten å være bundet av teori, antas sukrose å danne et amorft glass etter frysing og påfølgende lyofilisering, noe som muliggjør sterk stabili-tetsøkning for proteinet (f.eks. forhindring av aggregasjon)

ved at det dannes en molekylær dispersjon av NGF i et stivt glass. Stabilitet kan også forbedres ved at sukkeret virker som en erstatning for vanntapet etter lyofilisering. Sukker-molekylene blir bundet til proteinet gjennom hydrogenbindinger

i stedet for vannmolekylene. Mannitol øker, når det blandes i

et masseforhold på 1:1 med sukrose (som har en glassovergangs-temperatur på -36°C), glassovergangstemperaturen til preparatet med 5°C til -31°C. Dette forkorter betydelig den primære tørketid for preparatet under lyofilisering, mens en amorf, glassaktig preparatmatriks fortsatt fås, og anses derfor som en fordel i en storskalaproduksjon. Andre volumøkende midler som også har disse karakteristika, kan erstatte ett av eller

begge disse sukkerne.

Preparatene ifølge denne oppfinnelsen som skal lyofiliseres, har fortrinnsvis en høyere pH-verdi enn preparatene som ikke lyofiliseres, eller som rekondisjoneres. De volum-økende midler (sukkere) som er til stede i de lyofiliserbare preparater ifølge oppfinnelsen, er generelt mer stabile ved høyere pH. pH-verdien i preparatet før lyofilisering er fortrinnsvis mellom 5,5 og 6,5. Helst er pH-verdien i det lyofiliserbare NGF-preparat mellom 5,8 og 6,2. pH-verdien i det mest foretrukne, lyofiliserbare NGF-preparat er ca.

6,0. Når sukrose er til stede som det volumøkende middel, er den foretrukne pH-verdi i det lyofiliserbare preparat ca. 6,0 ettersom sukrose, et ikke-reduserende disakkarid, hydrolyseres ved sur pH til de reduserende sukkere D-fruktose og D-glukose. Sitrat er den mest foretrukne buffer for lyofiliserbare NGF-preparater, men andre biologisk akseptable buffere kan brukes, slik som maleat. Andre buffere enn acetat er foretrukket på grunn av eddiksyrens tilbøyelighet til å fordampe under lyofilisering. Det bør forstås at regulering av slutt-pH-verdien med syre eller base kan være nødvendig. Ethvert tap av langvarig stabilitet av vandig NGF på grunn av den høyere pH-verdi på ca. 6,0 vil sannsynligvis kunne overvinnes ved økningen i stabilitet forbundet med den NGF som lyofiliseres.

Ideelt sett tar valget av buffer i betraktning potensielle pH-skiftninger under lyofilisering forårsaket av sek-vensvis krystallisering av bufferkomponenter. Med fosfatbuf-fere har f.eks. den grunnleggende komponent et høyere eutek-tisk punkt enn den sure komponenten, den utkrystalliserer derfor først, og pH faller. Sitratbuffer er foretrukket ettersom det~menes at begge bufferkomponentene har omtrent det samme eutektiske punkt, noe som resulterer i svært liten pH-fluktua-sjon etter hvert som temperaturen faller. Andre egnede buffere ville ha vært komponenter med de Bamme eller lignende eutektiske punkter.

De lyofiliserbare preparater omfatter eventuelt også

et biologisk akseptabelt salt. Saltet, som kan velges fra de samme saltene som anvendes i de vandige preparater, er til stede i det lyofiliserbare preparat ved de samme eller redus-erte konsentrasjoner som i de vandige preparater. Ettersom

saltkonsentrasjonen kan øke under lyofilisering, kan det være

ønskelig å redusere konsentrasjonen av salt som er til stede i de lyofiliserbare preparater for å forhindre proteindenaturer-ing. Reduksjoner i saltkonsentrasjon i det lyofiliserbare preparat kan kompenseres for under rekondisjonering for å tilveiebringe et sluttpreparat som er tilstrekkelig isotont til å være egnet for administrering til et individ.

De lyofiliserbare preparater omfatter eventuelt en biologisk akseptabel, vannoppløselig bærer. Bærerne og konsentrasjonen av bærere som kan brukes i de lyofiliserbare preparater ifølge denne oppfinnelsen, er de samme som de som er egnet for bruk i de vandige preparater ifølge denne oppfinnelsen.

De foretrukne, lyofiliserbare preparater omfatter 1-1 250 ug/ml NGF, 15-45 mg/ml sukrose, 15-45 mg/ml mannitol, eventuelt 7-9 mg/ml NaCl og 0,1-0,7 mg/ml sitronsyre ved en pH på 5,5-6,5. De mest foretrukne, lyofiliserbare preparater av NGF omfatter 100-1 250 ug/ml NGF, 30 mg/ml sukrose, 30 mg/ml mannitol, 5 mg/ml humant serumalbumin, eventuelt 8,7 mg/ml NaCl og 0,3 mg/l sitronsyre. Den mest foretrukne pH-verdi i det lyofiliserbare preparat er ca. 6,0.

De lyofiliserbare preparater ifølge denne oppfinnelsen lyofiliseres inntil et innhold av restvann på mindre enn 2%, preparater som bibeholder biologisk NGF-aktivitet ved høyere eller lavere mengder av vanninnhold, er imidlertid også omfattet.

Det foretrukne, lyofiliserte preparat omfatter 0,001-1,25 deler nervevekstfaktor, 30-90 deler sukker og mindre enn 1 del vann.

Det lyofiliserte NGF-preparat rekondisjoneres med et fortynningsmiddel inneholdende buffer, slik som sitronsyre, og salt, slik som natriumklorid, etter hva som måtte være krevet for at det resulterende, rekondisjonerte preparat skal være likt det flytende, vandige preparat, 1-1 250 ug/ml NGF, 1-12,5 mg/ml HSA, 5-10 mg/ml NaCl, 0,2-3,0 mg/ml sitronsyre, 1,5-30 mg/sukrose og 1,5-30 mg/ml mannitol, pH 5,2.

Det lyofiliserte NGF-preparat ifølge denne oppfinnelsen kan også anvendes som en komponent i et sett for å tilveiebringe en bekvem og økonomisk måte for frembringelse av stabil, lyofilisert NGF i en form som hurtig og lett kan rekondisjoneres i en passende bærer for administrering til en pasient som trenger behandling. I tillegg til det lyofiliserte NGF-preparat omfatter settene ifølge denne oppfinnelsen også en rekondisjoneringsbærer. Rekondisjoneringsbæreren omfatter sterilt vann og en tilstrekkelig mengde salt til å gjøre det endelige, rekondisjonerte preparat i det vesentlige isotont. Rekondisjoneringsbæreren kan videre omfatte ytterligere buffer. Det totale volum av rekondisjoneringsbærer som er til stede i settet, bør være tilstrekkelig til å oppnå en slutt-NGF-konsentrasjon som er egnet for administrering til et individ som trenger behandling. Ved en foretrukket utførelses-form ifølge denne oppfinnelsen tilveiebringes et sett som omfatter to ampuller. Én ampulle omfatter det sterile, lyofiliserte NGF-preparat ifølge denne oppfinnelsen, og en andre ampulle omfatter steril rekondisjoneringsbærer. For å bruke settet overføres en passende mengde rekondisjoneringsbærer til ampullen som omfatter det lyofiliserte NGF-preparat. Etter oppløsning av det lyofiliserte preparat kan det rekondisjonerte preparat umiddelbart administreres til pasienten.

På grunn av den langvarige stabilitet til det rekon-dis jonerte preparat ifølge denne oppfinnelsen er det også mulig å fremstille tilstrekkelig rekondisjonert preparat til å tilveiebringe flere doser.

Preparatene ifølge denne oppfinnelsen kan anvendes for behandling av individer med tilstander som gir respons på NGF-terapi. Slike preparater er vanligvis sterile og er egnet for intravenøs, intramuskulær, parenteral eller intracerebroventrikulær administrering. Slik terapi kan være nyttig til behandling av nervedysfunksjoner som omfatter nerveskade eller degenerering av neuroner som gir respons på NGF. NGF kan være særlig anvendbar for behandling av sykdom som skyldes tap av sentrale, cholinerge neuroner, slik som Alzheimers sykdom. NGF som en behandling av Alzheimers sykdom og andre former av

• < demens, er beskrevet i EP 0 370 171.

Preparatene ifølge oppfinnelsen som behandlinger for demens, kan administreres ved hjelp av hvilken som helst av mange forskjellige rutiner, avhengig av den bestemte slutt-bruk. Den mest egnede vei vil avhenge av bruken og det invol-

verte individ.

For å overvinne vanskelighetene som fås ved blod-hjerne-barrieren, kan NGF administreres til CNS ved hjelp av direkte, intraventrikulære injeksjoner eller via legemiddel-impregnerte implantater eller pumper. En annen administrer-

ingsvei er ved hjelp av kontinuerlig infusjon gjennom en intracerebroventrikulær kanyleanordning. Alternativt kan det være nødvendig med konjugasjon av NGF-en med bærermolekyler,

slik som transferrin, for å trenge gjennom blod-hjerne-

barrieren.

En terapeutisk effektiv mengde av NGF antas å være

fra ca. 0,001 til ca. 0,5 mg pr. dag, fortrinnsvis fra ca.

0,01 til ca. 0,10 mg pr. dag, aller helst fra ca. 0,02 til ca.

0,06 mg pr. dag. Den nøyaktige dose og det nøyaktige regime for administrering vil avhenge av mange faktorer, slik som administreringsveien og graden av sykdomslidelse hos individet som mottar behandling.

Analvsefremqanasmåter

Identifikasjon og kvantifisering av NGF under anvendelse av reversfase- HPLC

NGF ble identifisert og kvantifisert ved å analysere

100 ul prøver med en reversfase-HPLC (Hewlett Packard HP 1090 væskekromatograf) utstyrt med en 4-6 mm x 25 cm "L Dynamax"

(Rainin Instrument Co., Woburn, MA, USA) 300 Å 5 pm analytisk reversfasekolonne med en "Dynamax" 300 Å5um4,6mmxl,5cm beskyttelseskolonne og en dioderekke-UV-detektor innstilt på

220 nm. De mobile fasene var (A) 0,1% trifluoreddiksyre i vann og (B) 0,1% trifluoreddiksyre i acetonitril, hvor gradientene endret seg fra 25% (B) til 60% (B) i løpet av 45 minutter med en strømningshastighet på 0,5 ml/min ved et trykk på 1 700-

2 000 psi ved omgivelsestemperatur.

Identifikasjon av NGF ble fastslått ved å sammenligne dens retensjonstid i prøven med den respektive retensjonstid for nyfremstilte, kalibrerte standard-NGF-oppløsninger laget fra NGF fra det samme parti. Mengden av NGF i prøvene ble be-regnet ved sammenligning med en standardkurve erholdt med seriefortynninger av kjente konsentrasjoner.

Bestemmelse av NGF- konsentrasion ( ug/ ml) ved hjelp av ELISA

NGF-konsentrasjoner ble også analysert ved hjelp av ELISA. Både standarder og prøver ble analysert in triplo. Hver plate inneholdt en komplett standardkurve for NGF og referan-seblindprøver uten NGF.

Etter at 100 ul belegningsantistoffer (muse-mono-klonale 24 Cl frembrakt mot rhNGF) var tilsatt til hver av brønnene i en 96-brønners analyseplate, ble platene pakket inn i Saran-emballasje med et fuktig papirhåndkle, og det ble inkubert over natten i et kjøleskap ved 2-8°C. Brønnene ble tømt, vasket tre ganger under anvendelse av en Wheaton selv-fyllende sprøyte innstilt på avlevering av 250 ul/brønn av vaskebuffer (inneholdende 500 mM Tris, 2 M natriumklorid, bufret til pH 7) og klappet tørre. Deretter ble 200 ul blok-keringsbuffer (1% oppløsning av bovint serumalbumin) tilsatt til hver brønn for å blokkere ikke-spesifikke seter, 50 ul av prøven ble tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i minst 1 time ved romtemperatur mens det ble blandet på en plattformrister. Brønnene ble på nytt tømt og klappet tørre, og 50 ul standard- og prøveoppløsninger ble tilsatt. Platene ble så tildekket og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Brønnene i platen ble på nytt tømt, vasket fire ganger med vaskebuffer og klappet tørre. Femti (50) ul biotinylert anti-stoff (muse-monoklonalt 8 Cl frembrakt mot rh-NGF) ble tilsatt til hver brønn, platene ble tildekket og inkubert i 2 timer. Brønnene i platene ble tømt, vasket og tørket som beskrevet ovenfor, og 50 ul pepperrotperoksidasekonjugert streptavidin ble tilsatt til hver brønn. Platene ble tildekket og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur mens det ble blandet på en plattformrister. Platene ble vasket fem ganger med vaskebuffer. Etter at 50 ul ortofenylendiamin(OPD)substratbuffer var tilsatt til hver brønn, ble platene tildekket og inkubert i mørket i 1 time.

En "Vmax Kinetic Microplate"- (Molecular Devices, Mountain View) avleser ble brukt til å bestemme absorbansen i hver brønn. For hver brønn ble bakgrunnsabsorbansen ved 650 nm trukket fra toppabsorbansen ved 450 nm, hvorved man fikk nettoabsorbansen. Konsentrasjonen av NGF i prøvene ble bestemt ved sammenligning med en NGF-standardkurve.

Bestemmelse av NGF- aktivitet

Den biologiske aktivitet av NGF ble bestemt ved hjelp av PC-12-bioanalyse. PC-12-bioanalysen er basert på forøkt metabolsk aktivitet av PC-12-feokromocytomceller (Greene, Trends Neurosci. 7:91, 1986) etter eksponering mot NGF. Den metabolske aktivitet av PC-12-celler ble målt ved hjelp av cellulært opptak av 3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (C18H16N5Br) (MTT), som omdannes ved hjelp av cellulær dehydrogenase til uoppløselige, intracellulære, blå krystaller.

Hver brønn i en 96-brønners plate inneholdt ca.

30 000 PC-12-celler i 50 ul RPMI-1640-medium (Sigma). Seriefortynninger av hver prøve og standarder ble fremstilt, hvorved man fikk oppløsninger med 0,006-400 ng rhNGF pr. ml i RPMI-1640 med 0,2% bovint serumalbumin (BSA). 50 ul av hver oppløsning ble så tilsatt til hver brønn, hvorved man fikk konsentrasjoner på 0,003 til 200 ng NGF pr. ml, og hver konsentrasjon ble analysert in triplo. Etter at platene var holdt i 2 dager i 5% C02 ved 37'C, ble 10 ug MTT tilsatt til hver brønn, og platene ble inkubert i ytterligere 4 timer. Ett volum 20% SDS i 50% dimetylformamid (DMF), pH 4,7, ble så tilsatt, og platene ble pakket inn i cellofan, lukket inne i plastposer og inkubert over natten ved 37°C. Platene ble av-lest den neste dag under anvendelse av et "Vmax"-plateavleser-sett ved 575 nm. Forholdet mellom ED50 i prøvekurven og ED50 i en standard-NGF-kurve gir et mål på de relative styrkene til de to preparatene.

Eksempel 1

NGF- preparat

Vandige preparater som omfatter 1, 10, 100 og

1 000 ug/ml rhNGF, 5 mg/ml HSA, 8,7 mg/ml natriumklorid og 2,1 mg/ml sitronsyre og tilstrekkelig vann til å fremstille 10 ml av preparatet, bufret til pH 5,2, ble fremstilt. Etter oppløsning av sitronsyren og saltet i ca. 70% av det totale volum ble pH regulert med NaOH/HCl, og HSA og NGF tilsatt under forsiktig omrøring sammen med vann for å gl volum, og preparatet ble filtrert gjennom et 0,2 u "Millipore Millex-

GV"-filter.

Den rhNGF som ble brukt til å fremstille preparatene, ble uttrykt i insektsceller under anvendelse av en baculo-virusekspresjonsvektor og renset ved ionebytter- og revers-fasekromatografi som beskrevet i Barnett, J. et al., Exp. Neurol., 110:11-24, 1990.

Eksempel 2

Stabilitet av NGF- preparater ved 5" C oa 25 °C

250 ul aliquoter av et 100 ug/ml NGF-preparat ifølge eksempel 1 ble lagret ved 5 og 25"C (RT) i polyetylenampuller med dryppespiss i opptil 6 måneder. RP-HPLC-, ELISA- og biologiske analyser (beskrevet ovenfor) av disse prøvene indi-kerte ikke noe tap av protein over 6 måneder (tabell 1).

(RP-HPLC-tall utgjør gjennomsnittet ± standardavvik for 2-4 replikater. Bioanalysetallene utgjør gjennomsnittet ± 95% sikkerhetsgrenser for 3 bestemmelser).

Eksempel 3

Stabilitet av forskjellige NGF- preparater lagret i polvet<y>l-enkatetere ved 37°C

250 ul aliguoter av NGF-preparater inneholdende fra 1 til 1 000 ug/ral rhNGF erholdt som beskrevet i eksempel 1, ble lagret i ikke-radiopaque-polyetylenkatetere (innvendig diameter 0,76 mm og utvendig diameter 1,22 mm) ved 37"C i opptil 4 uker. Resultatene, som vist i tabell 2, indikerer ikke noe

betydelig tap av proteininnhold (som målt ved hjelp av RP-

i HPLC), eller av NGF-aktivitet (som målt ved hjelp av PC-12-bioanalyse).

(RP-HPLC-tall utgjør gjennomsnittet ± standardavvik for

2-4 replikater. Bioanalysetallene utgjør gjennomsnittet ± 95%

. sikkerhetsgrenser for 3 bestemmelser).

Eksempel 4

Stabilitet av NGF- preparat 1 forskjellige avleverinasanord-ninger

Aliquotene å 100 ug/ml NGF-preparat ifølge eksempel 1 ble fylt i enten en "Infusaid" modell 600 implanterbar infusjonspumpe (Shiley-Infusaid Inc., Norwood, MA), en "Medtronics Synchromed" implanterbar infusjonspumpe (Medtronics Inc., Min-neapolis, MN) eller "Alzet" modell 2ML 4 miniosmotisk infusjonspumpe (Alza Corp., Palo Alto, CA). Pumpene ble plassert i et 37°C vannbad, og preparatstrømmen ut fra pumpen ble startet opp. Ukentlige prøver ble samlet opp over en 4-ukers periode og analysert med hensyn på proteininnhold og aktivitet ved hjelp av RP-HPLC, ELISA og PC-12-bioanalyse.

Dataene i tabell 3 viser at det ikke ble observert noen signifikant reduksjon i NGF-konsentrasjon eller -aktivitet .

(RP-HPLC-tall utgjør gjennomsnittet + standardavvik for 2-4 replikater. Bioanalysetallene utgjør gjennomsnittet 95% sikkerhetsgrenser for 3 bestemmelser).

n.d. =■ ikke bestemt

Eksempel 5

Stabilitetsundersøkelser av NGF- preparater ved pH 4- 10

Vandige preparater som omfatter 100 ug/ral NGF,

1 mg/ml HSA og 9 mg/ml natriumklorid, buf ret ved en pH på 4-10, ble fremstilt og sterilfiltrert gjennom et 0,2 um filter (Millex-GV; Millipore Corp.)/ på måten ifølge eksempel 1. Preparater med pH 4-5 ble bufret med acetat, og preparatene med pH 6-10 ble bufret med Tris. Aliguoter å 1 ml ble overført til polypropylenarapuller med dryppespiss som så ble inkubert ved enten romtemperatur (23'C-25°C) eller 37°C. Prøver ble tatt til forskjellige tidspunkter og analysert ved hjelp av RP-HPLC. Førsteordens reaksjonshastighetskonstanter som viser tap av NGF fra oppløsning, ble plottet som en funksjon av pH. Has-tighetene for NGF-nedbrytning i oppløsning ble funnet å øke ved pH-verdier lavere enn ca. 4,5 og høyere enn ca. 6,0. Den høyeste stabilitet inntrådte ved 5,2.

Eksempel 6

Stabilitet av NGF- preparater som en funksjon av bærerkonsen-trasjon

Typen og mengden av bærere ble testet for å bestemme effekten på NGF-stabilitet. Et 100 ug/ml vandig preparat som beskrevet i eksempel 1 og vandige preparater som omfatter andre bærere, ble fremstilt og er angitt i tabell 4. Hvert preparat ble filtersterilisert gjennom et 0,2 um "Millipore Millex-GV"-filter. Stabilitet av NGF i de forskjellige preparatene ble bestemt ved å inkubere NGF-preparatene ved 37"C i polypropylenampuller med dryppespiss. Prøver ble tatt etter 2 uker og analysert med hensyn på proteininnhold ved hjelp av

RP-HPLC.

(RP-HPLC-tall utgjør gjennomsnittet ± standardavvik for 2-4 replikater).

Eksempel 7

NGF- preparat for lvofilisering

Et vandig NGF-preparat omfattende 100 ug/ml NGF,

30 mg/ml sukrose, 30 mg/ml mannitol, 5 mg/ml HSA og 0,3 mg/ml sitronsyre regulert til pH 6,0 med NaOH, ble fremstilt ved romtemperatur. Etter oppløsning av sitronsyren og sukkerne i ca. 70% av det totale volum, ble pH regulert og HSA og NGF tilsatt med forsiktig omrøring sammen med tilstrekkelig vann til å gi volum.

Eksempel 8

Lvofiliserinq av NGF- preparat

Lyofiliseringsstabiliteten til den vandige NGF i preparatet ifølge eksempel 7 ble testet. 1 ml aliquoter av NGF-preparater fremstilt ifølge eksempel 7, ble plassert i 5 ml glassampuller av type I tildekket med lyofiliseringskorker. De preparatholdige ampuller ble fylt i et frysetørkerkammer (FTS Systems Inc. ) som ble ekvilibrert ved 5°C før oppstartingen av frysingen. Temperaturen i kammeret ble så senket til -40°C. Etter en 2 timers nedsenking ved -40 "C ble kammeret evakuert og trykket regulert til 80-100 milliTorr med en nitrogengjen-nomblåsing. En temperaturøkning på 4°C pr. time ble utført inntil en endelig tørketemperatur på 25°C var oppnådd. Et endelig vanninnhold mellom 1 og 2% av produktet ble oppnådd omtrent 30 timer inn i syklusen.

Det frysetørkede pulver ble lagret ved 5°C og rekon-dis jonert ved romtemperatur etter 3 dager med 1 ml av et fortynningsmiddel bestående av 8,7 mg/ml natriumklorid og 1,1 mg/ml sitronsyre, bufret til pH 5,2. Prøver ble analysert med hensyn på NGF-konsentrasjon ved hjelp av RP-HPLC. Det ble ikke observert noe tap av protein etter lyofilisering.

Eksempel 9

Stabilitetsundersøkelser av NGF- preparatet når det var lagret 1 qlassampuller ved 2- 8" C

Vandige preparater omfattende 100 eller 1 000 ug/ml rhNGF, ble fremstilt ved å bruke fremgangsmåten ifølge eksempel 1, bortsett fra at porsjonsstørrelsen ble økt til 1,5 1. Aliguoter å 4,2 ml ble plassert i flintglassampuller av type I med teflonbelagte butylgummikorker og lagret ved 2-8°C. Resultatene som er vist i tabell 5 nedenunder, indikerer ikke noe betydelig tap av proteininnhold (som målt ved hjelp av RP-HPLC og ELISA), eller av NGF-aktivitet (som målt ved hjelp av PC-12-bioanalyse).

Identifikasjon og kvantifisering av NGF under anvendelse av reversfase- HPLC

I dette eksempel 9 var den anvendte fremgangsmåte som følger: NGF ble identifisert og kvantifisert ved å analysere 100 ul prøver med en reversfase-HPLC (Hewlett Packard HP 1090 væskekromatograf) utstyrt med 4-6 mm x 250 mm, "Bakerbond Wide-Pore Butyl (C4)<n> 300 A porestørrelse (J.T. Baker Inc., Phillipsburg NJ, USA), og en dioderekke-UV-detektor innstilt på 210 nm. De mobile fasene var (A) 0,2% trifluoreddiksyre i vann og (B) 60% acetonitril i buffer (A) hvor gradientene ble endret fra 29% (B) til 75% (B) i løpet av 65 minutter med en strømningshastighet på 1,0 ml/minutt ved et trykk på 110 bar ved omgivelsestemperatur.

Deretter ble fremgangsmåten beskrevet ovenfor under analysefremgangsmåter, HPLC, anvendt.

Claims (10)

1. Vandig, farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det består av: (a) nervevekstfaktor, (b) biologisk akseptabelt salt i en tilstrekkelig mengde til å opprettholde isotonisitet, (c) en biologisk akseptabel, vannoppløselig proteinbærer valgt fra gruppen som består av polysorbater, poloksamerer og proteiner, (d) en buffer i en tilstrekkelig mengde til å opprettholde pH i preparatet fra 4,5 til 6,0, og (e) vann.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at: (a) nervevekstfaktoren utgjør 0,0001 til 0,125 vekt% av det vandige preparat, (b) bæreren utgjør 0,1 til 1,25 vekt% av det vandige preparat, og (c) saltet utgjør 0,5 til 1,0 vekt% av det vandige preparat.

3. Preparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at pH er fra 5,0 til 5,4.

4. Vandig preparat ifølge hvilket som helst av kravene 2-3, karakterisert ved at det består av 10-500 ug NGF, 5 mg/ml HSA, 8,7 mg/ml NaCl, 2,1 mg/ml sitronsyre og vann, og hvor pH i preparatet er regulert til 5,2.

5. Vandig, farmasøytisk preparat av nervevekstfaktor, egnet for lyofilisering, karakterisert ved at det består av: (a) 1-1250 fig/ ral nervevekstfaktor, (b) 30-90 mg/ml av et biologisk akseptabelt, volumøkende middel, hvori det volumøkende middelet er et monosakkarid, oligosakkarid eller en sukkera1kohol, (c) en biologisk akseptabel, vannoppløselig proteinbærer valgt fra gruppen som består av polysorbater, poloksamerer og proteiner, (d) en buffer i en tilstrekkelig mengde til å holde pH i preparatet ved 5,5 til 6,5, og (e) vann.

6. Preparat ifølge krav 5, karakterisert ved at det volumøkende middel består av en blanding av sukrose og mannitol, bufferen er Bitrat, og pH i preparatet er 5,8 til 6,2.

7. Preparat ifølge hvilket som helst av kravene 5-6, karakterisert ved at det er lyofilisert for å redusere vanninnholdet til mindre enn 2%.

8. Lyofilisert, farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det består av 0,001-1,25 deler nervevekstfaktor, 30-90 deler sukrose og mannitol til sammen, og mindre enn 1 del vann.

9. Preparat eller sammensetning ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det er ment for anvendelse ved behandling av nervedysfunksjon hos mennesker.

10. Preparat eller sammensetning ifølge krav 9, karakterisert ved at det foreligger i intracerebroventrikulær infusjonsform, for anvendelse ved behandling av Alzheimers sykdom hos mennesker.