RO114742B1

RO114742B1 - Compozitie farmaceutica cu factor de dezvoltare a nervului

Info

Publication number: RO114742B1
Application number: RO96-00301A
Authority: RO
Inventors: Victoria Knepp; Deborah Lindgate; Richard Maskiewicz; Leo Gu
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1993-08-20
Filing date: 1994-08-16
Publication date: 1999-07-30
Also published as: PL313084A1; TW427905B; KR100341193B1; FI960750A0; HU9600371D0; CA2169834C; BR9407278A; IL110725A; BG100371A; DE69431562T2; CZ292422B6; FI113241B; CA2169834A1; IL124941A; UA43348C2; AU7566894A; NO960651D0; IL110725A0; US20010007662A1; EP0721343B1

Description

Invenția se referă la o compoziție farmaceutică a factorului de dezvoltare a nervului care tratează disfuncțiile neurologice la oameni.

Numeroase polipeptide și proteine reglează dezvoltarea sau supraviețuirea celulelor; astfel de molecule sunt denumite “factori de dezvoltare. Exemple de factori de dezvoltare includ factorul de dezvoltare epidermic (EGF), factorul de dezvoltare acid sau bazic a fibroblastelor (aFGF și bFGF], factorul de dezvoltare derivat plachetar (PDGF), factorul neutrofic ciliar (CNTF) și factorul de dezvoltare a nervului (NGF). □intre aceștia, NGF-ul a fost primul identificat și caracterizat (Levi-Montalcini, R., et al., J.Exp.Zool., 116:321, 1951).

Factorul de dezvoltare a nervului favorizează supraviețuirea și activitatea anumitor tipuri de celule neuronice. In plus, factorul de dezvoltare a nervului favorizează diferențierea celulelor neuronice premature în neuroni maturi post-mitotici.

Purificarea factorului de dezvoltare a nervului din glanda submaxilară de șoarece a condus la identificarea unui complex cuprinzând trei subunități, a, β și γ.

întreaga activitate neutrofică a factorului de dezvoltare a nervului este presupusă a se găsi în subunitatea β, o proteină cu 118 amino acizi, având o greutate moleculară de circa 13.000 Da (Varon, S., et al., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 57: 1782...1789, 1967; Green L.A. etal., Neurobial., 1:37...48,1971). In soluție, subunitățile β formează dimeri cu greutate moleculară circa 26.500 Da.

S-a sugerat că factorul de dezvoltare a nervului este eficient pentru tratarea anumitor boli degenerative atât ale sistemului nervos central, cât și a celui periferic. S-a sugerat că administrarea NGF-ului poate fi benefică la tratarea bolilor în care deficiența de NGF, anormali ale receptorului său sau schimbări în transportul său sau în procesarea sa intracelulară conduc la o descreștere a funcției neuronice, atrofie sau chiar moarte celulară. Astfel de boli includ neuropatiile ereditare senzoriale și motorice, degenerarea sistemi că ereditară sau apărută sporadic, scleroza laterală amiotrofică, boala lui Parkinson și boala lui Alzheimer (Goedert M. et al., Mol. Brain Res., 1:85...92, 1986; Mobley W.C. etal., Soc. Neurosci. Abstr. 13:186, 1987; Mobley W.C. et al., Soc. Neurosci. Abstr., 4:302, 1988; Hefti, F., et al., Aon

Neurol., 20:275...281, 1986). De asemenea, se crede că factorul de dezvoltare a nervului micșorează moartea celulelor neuronice după expunerea la anumite toxine, cum ar fi 6-hidroxi-dopamină (Aloe L., Arch. Ital. Biol., 113:326...353, 1975), vinblastină și colchicină (Menesini-Chen, M.G. et al., Proc. Natl. Acad. Și capsaicin (Otten, U., Nature, 301:515...577, 1983).

In altă exprimare a NGF mARN în hipotalamus, o zonă asociată memoriei și învățării, sugerează că aplicarea clinică a NGF-ului poate fi eficientă pentru tratamentul demenței (Kaisho, Y.etal., Biochem. Biophys. Res. Comm., 174: 379...385, 1991). Administrarea intraventriculară a NGF-ului a fost raportată ca prevenind moartea neuronilor colinergici bazali ai părții frontale a creierului după axotomie ceea ce sugerează că factorul de dezvoltare a nervului poate fi eficient la favorizarea supraviețuirii celulare după vătămare. (Helfti F., J. Neurosci., 6:2155...2162, 1986; Williams L., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:9231...9235, 1986; Kromer L., Science, 235:214...216, 1987).

Utilizarea factorului de dezvoltare a nervului pentru terapie ridică probleme semnificative. Aceste probleme sunt asociate cu 1) menținerea bioactivității NGF, care poate fi alterată în timpul fabricării purificării și depozitării; și 2) administrarea factorului de dezvoltare a nervului, o moleculă hidrofilă relativ mare astfel, încât să ajungă la situsul activ în cantitate suficientă pentru a fi eficient. Bioactivitatea NGF-ului, ca și a altor proteine, este dependentă de structura sa secundară și terțiară. Subunitatea

RO 114742 Bl β a factorului de dezvoltare a nervului are trei legături disulfurice interne, care sunt 50 considerate a fi importante pentru bioactivitate (Kanaya, E.,et al., Gene, 83:65...74.

1989; Iwane M., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 171:116...122, 1990;

Hum G.-L. Și Neet, K.E., Gene, 70:57...65, 1988). In plus, în măsura în care orice proteină este denaturată, cantitatea eficientă de NGF activ din punct de vedere biologic este diminuată. Prin urmare, integritatea proteinei trebuie să fie menținută în 55 timpul fabricării și depozitării ca și în timpul administrării. Proteinele sunt predispuse în mod deosebit la degradare la temperaturi ridicate.

Temperaturile mai scăzute micșorează în general degradarea proteinei. Totuși este mai economic să se depoziteze proteina la temperatura camerei, adică, circa 25°C, decât la temperaturi scăzute de circa 4°C. Prin urmare, este de dorit stabilita- 60 tea formulării pentru depozitare fie la temperatura camerei, fie la răcire de aproximativ 4°C.

In afară de problema stabilității, factorul de dezvoltare a nervului, cu multe alte proteine, se leagă nespecific la suprafețe. Astfel de legare nespecifică poate avea loc pe o diversitate de materiale, incluzând sticlă și materiale plastice, de exemplu polie- 65 tilenă sau polipropilenă. Aceste materiale pot fi sub formă de fiole, tuburi, seringi, dispozitive implantabile de infuzie sau orice alte suprafețe care pot intra în contact cu factorul de dezvoltare a nervului în timpul fabricării sale, depozitării sau administrării sale.

Alte dificultăți la administrarea proteinelor cum ar fi NGF ca produse terapeu- 70 tice sunt slaba absorbție de către corp și degradarea de către acizii din stomac. Prin urmare, în general, administrarea orală nu este de dorit. Pentru a evita astfel de bariere ale absorbției, ar fi necesare injectarea și infuzia.

Injectarea este utilă atunci când locul de tratat este ușor accesibil. Totuși, dacă zona este relativ inaccesibilă cum ar fi CNS, poate fi mai practică infuzia continuă 75 pentru administarea pe termen îndelungat. O astfel de administrare a fost nepractică din cauza unor diverse complicații. De exemplu, infuzia continuă poate fi realizată implantând pompa de NGF în creier, dar expunerea pe termen îndelungat a unei proteine la temperatura corporală provoacă adesea degradarea proteinei. De asemenea, există pierderi suplimentare datorate adsorbției proteinei pe pereții camerei 80 pompei de-a lungul timpului.

In afară de problemele asociate administrării factorului de dezvoltare a nervului, există de asemenea probleme asociate cu depozitarea sa pe termen îndelungat, de la momentul fabricării la cel al administrării. Liofilizarea este o metodă de depozitare pe termen lung a proteinelor biologice, care împiedică degradarea, agregarea și/sau 85 adsorbția nespecifică. Totuși, procedeul de liofilizare în sine prezintă dificultăți. întrucât volumul de lichid descrește în timpul procesului de congelare, concentrația efectivă de sare crește foarte mult, ceea ce poate denatura proteina, reducând activitatea terapeutică la reconstituire. In plus, formarea cristalelor de gheață în timpul procesului de congelare poate provoca denaturarea și de asemenea, descrește cantitatea efectivă 90 accesibilă de factor de dezvoltare a nervului bioactiv. Prin urmare, formularea trebuie să fie astfel, încât să se prevină fluctuațiile concentrației de sare și să se micșoreze formarea cristalelor de gheață.

Un obiect al prezentei invenții este de a se asigura formulări apoase de NGF, care rețin bioactivitatea pe timpul a cel puțin o lună, într-un interval de temperatură 95 de la circa 4 la circa 40°C.

Un obiect al prezentei invenții este de a oferi formulări cu NGF în care bioactivitatea este menținută după liofilizare și reconstituire.

RO 114742 Bl

Această invenție oferă formulări stabile ale factorului de dezvoltare a nervului, care pot fi depozitate la temperatură sub ambiantă, ambiantă și ridicată, fără pierderi substanțiale de cantitate sau activitate a proteinei.

Invenția se referă la o compoziție farmaceutică cu factor de dezvoltare a nervului care conține aproximativ 0,0001 până la aproximativ 0,125% factor de dezvoltare a nervului, de la 0,5 până la 1,0% o sare biologic acceptabilă, apă, un tampon în cantitate suficientă pentru a menține pH-ul compoziției de la circa 4,5 la circa 6 și, opțional, un purtător biologic acceptabil, în cantitate de 0,1 până la 1,25%, toate procentele fiind exprimate în greutate și pentru liofilizare, circa 1 la circa 1250 ug/ml factor de dezvoltare a nervului, circa 30 la 90 mg/ml dintr-un agent de gonflare, apă, un tampon în cantitate suficientă pentru a menține pH-ul compoziției de la 5,5 la 6,5%, și, opțional, un purtător biologic acceptabil, solubil în apă; pH-ul este de preferință cuprins între 5 și 5,4; agentul de gonflare este un zahar; agentul de gonflare cuprinde un amestec de sucroză și manitol, tamponul este un citrat și pH-ul compoziției este de circa 5,8 până la circa 6,2; este liofilizată pentru a reduce conținutul de umiditate la mai puțin de 2%; în scopul obținerii unei compoziții liofilizate, cuprinde 0,001 până la 1,25 părți factor de dezvoltare a nervului, 30 până la 90 părți zahăr și mai puțin de circa o parte apă, părțile sunt exprimate în greutate; tratează disfuncțiile neuronice la oameni; sub formă de infuzie intracerebroventriculară, tratează boala lui Alzheimer la oameni.

Alte întruchipări ale acestei invenții, sunt formulările liofilizate din care a fost îndepărtată substanțial apa. După reconstituire cu un vehicul de reconstituire, incluzând în mod opțional un purtător acceptabil din punct de vedere biologic, formulările liofilizate din această invenție sunt adecvate pentru administrarea la pacienții care au nevoie de terapie.

Se descrie de asemenea o metodă de depozitare a factorului de dezvoltare a nervului în formulările apoase din această invenție, la temperaturi de la circa 4 la circa 40°C și metodă de tratare a disfuncției neuronice la oameni, cuprinzând administrarea unei cantități eficiente din punct de vedere terapeutic dintr-o formulare cu NGF din această invenție.

Dezvoltarea unor forme stabile parenteral de factor de dezvoltare a nervului necesită evaluarea unei multitudini de factori, incluzând calea de administrare, interacțiile adsorptive și compatibilitatea cu echipamentul de procesare și dispozitivele potențiale de eliberare. O considerație suplimentară este stabilitatea factorului de dezvoltare a nervului în formulări apoase la temperaturi sub-ambiante, ambiante și ridicate. O întruchipare a acestei invenții este o formulare cu factor de dezvoltare a nervului într-o soluție apoasă care prezintă stabilitate într-un interval de temperaturi, și în particular, la temperaturi ridicate (cel puțin circa 40°Cj. Această formulare cuprinde o soluție apoasă de factor de dezvoltare a nervului, o sare și un tampon, având un pH de circa

4,5 la circa 6,0. Formularea poate cuprinde în plus, în mod opțional, un purtător. Această combinație de ingrediente oferă în mod surprinzător caracteristici foarte favorabile la temperaturi ridicate. De asemenea, este asigurată o formulare cu factor de dezvoltare a nervului adecvată pentru liofilizare.

Așa cum se utilizează în această invenție, “acceptabil din punct de vedere biologic” se aplică materialelor caracterizate prin absența efectelor biologice adverse in vivo. “Temperatura camerei” este între circa 22 și circa 25°C. “Temperatura corpului” este între circa 36 și circa 40°C. “Formularea liofilizată” se referă la o formulare apoasă cu factor de dezvoltare a nervului care poate fi uscată prin congelare până la un conținut de umiditate mai mic de circa 2% și care reține cel puțin circa 70% din

RO 114742 Bl boactivitatea inițială a factorului de dezvoltare a nervului după reconstituire. “Izotonic” se referă la o soluție care are aproximativ aceeași presiune osmotică ca serul sanguin, circa 3OO milimoli pe litru. Un “purtător” este orice emulgator, agent de dispersare, agent activ de suprafață sau proteină acceptabilă din punct de vedere biologic, care descrește adsorbția factor de dezvoltare a nervului pe o suprafață.

înseamnă orice formă a factorului de dezvoltare a nervului, preferabil subunitatea β a factorului de dezvoltare a nervului, care prezintă activitate biologică și se leagă la receptorul de NGF. Termenul de factor de dezvoltare a nervului include de asemenea forme hibridizate și modificate ale NGF care se leagă la receptorul NGF și reține bioactivitatea NGF-ului. Formele modificate de factor de dezvoltare a nervului pot include proteine de fuziune, cum ar fi cele descrise în Iwai S., et al., Chem. Pharm. Bull., 34; 4724...4730, 1986 și Kanaya E., etal., Gene, 83:65...74,1989, și fragmentele și hibrizii de NGF în care s-a renunțat la anumiți amino acizi sau au fost înlocuiți în timp ce este menținută o suficientă bioactivitate și legare la receptor a NGF pentru a asigura activitatea terapeutică.

Forma preferată a factorului de dezvoltare a nervului este factorul de dezvoltare a nervului uman (hNGF). Cea mai preferată formă de hNGF este hNGF recombinant (rhNGF). Metodele de obținere a NGF adecvat pentru utilizare în formulările din această invenție sunt cunoscute celor specializați în domeniu. De exemplu, un rhNGF adecvat poate fi produs de un sistem de exprimare a baculovirusului (Barnett J. Et al., Exp. Neurol, 110:11...24,2990; EPO 370 171], un sistem de exprimare a fermenților (Kanaya E. et al., Gene 83:65...74, 1989), un sistem de exprimare a celulei mamifere (OHO) (Iwane M. etal., Biochem. Biophys. Res. Comm., 171:116...122, 1990), sau un sistem de exprimare a COS (Bruce G., et al., Neurobiol. Aging. 10:89...94, 1989). NGF-ul trebuie să fie de puritate de cel puțin 65%; preferabil de puritate de cel puțin 85%, mai ales de cel puțin 95% puritate; și cel mai preferat de cel puțin 98% puritate. Puritatea NGF-ului izolat pentru utilizare în formulări poate fi determinată prin SDS-PAGE spotat cu argint sau prin alte mijloace cunoscute celor specializați în domeniu.

In compozițiile apoase cu factor de dezvoltare a nervului, care sunt date, factorul de dezvoltare este prezent în cantități eficient din punct de vedere terapeutic. De preferință, factorul de dezvoltare a nervului este prezent într-o cantitate de la circa 0,0001 la circa 0,125% din greutatea compoziției apoase ceea ce corespunde de la între circa 1 și circa 1250 /zg/ml. Mai ales, factorul de dezvoltare a nervului este prezent într-o cantitate de la 0,001 la circa 0,10% în greutate (10 la 1000 Mg/ml] față de formularea apoasă. Și mai preferat factorul de dezvoltare a nervului este prezent într-o cantitate de circa 0,01 la circa 0,10% (100 la 1000 ^g/ml) din greutatea formulării apoase. Cel mai preferat, factorul de dezvoltare a nervului este prezent întro cantitate de la circa 0,01 la circa 0,05% (100 la 500 ,ug/ml) din greutatea formulării apoase.

Compozițiile apoase cu NGF includ în mod opțional purtători. Prezența purtătorului în formulare reduce sau previne adsorbția factorului de dezvoltare a nervului pe diverse suprafețe. Nevoia de purtător depinde de concentrația factorului de dezvoltare a nervului din compoziția apoasă. La concentrații de NGF suficient de mari (mai mari de circa 500 (ml), în soluție, rămâne suficient factor de dezvoltare a nervului pentru a-l compensa pe cel care se pierde din cauza adsorbției pe suprafață. Purtătorii potriviți includ, dar nu se limitează, la polisorbați cum ar fi Tween^|Rl 80, poloxameri cum ar fi Pluronic^(R) F 68, și proteină cum ar fi albumină serică. Purtătorul preferat este o proteină. In mod particular, este preferată albumina serică umană

150

155

160

165

170

175

180

185

190

195

RO 114742 Bl (HSA). Raportul în greutate al NGF față de purtător este de la circa 0,0001:1 până la circa 1:1. Un raport în greutate mai preferat este de la circa 0,01:1 până la circa 1:1. Cel mai preferat raport în greutate este de la circa 0,01:1 la circa 0,5:1. In consecință, atunci când drept purtător se utilizează HSA, concentrația preferată de HSA este de la circa 0,1 la circa 1,25: din greutatea formulării apoase (adică 1 la 12,5 mg (ml). O formulare preferată este de circa 0,3 la 0,7 la HSA din greutatea formulării apoase, mai ales circa 0,4 la 0,6% HSA din greutatea formulării apoase. Cea mai preferată formulare conține circa 0,5% (adică 5 mg/ml) HSA din greutatea formulării apoase.

Compoziția factorului de dezvoltare a nervului conține de asemenea o cantitate suficientă de sare acceptabilă din punct de vedere biologic, pentru a menține tonicitatea fluidului. Sarea acționează de asemenea pentru menținerea NGF-ului în soluție. Preferabil, compoziția cu NGF conține suficientă sare pentru a fi izotonică, în limite acceptabile din punct de vedere fiziologic, cu sângele sau fluidul cerebrospinal. Sarea preferată este clorură de sodiu (NaCI) dar se pot folosi și alte săruri acceptabile din punct de vedere biologic, cum ar fi clorură de potasiu (KCI), clorură de calciu (CaCI₂) și clorură de magneziu (MgCI₂). Sarea poate fi una singură sau o combinație de săruri. O formulare preferată cuprinde circa 0,5 la 1,0% (adică 5 la 10 mg (ml) sare din greutatea formulării apoase. O formulare mai preferată cuprinde circa 0,6 la 0,9% sare din greutatea formulării. Mai ales, formularea cuprinde circa 0,7 la 0,9% sare din greutatea formulării apoase. Cea mai preferată formulare cuprinde circa 0,87% (adică 8,7 mg/ml) sare din greutatea formulării apoase.

Compoziția cu factor de dezvoltare a nervului mai conține în plus un tampon acceptabil din punct de vedere biologic, petru a menține pH-ul, în timpul depozitării. S-a găsit că NGF-ul este mai stabil la pH scăzut. Formularea stabilă cu NGF, preferată, este tamponată cu un tampon acceptabil din punct de vedere biologic, la un pH între 4,5 și circa 6,0 și mai ales între circa 5,0 și circa 5,4. Cel mai preferat pH al formulării este de circa 5,2. Tamponul preferat este acid citric, dar se au în vedere și alte tampoane care sunt capabile să mențină pH-ul în intervalul dorit. Alte tampoane potrivite includ acid acetic/acetat și acid maleic/maleat. Cantitatea preferată de tampon va varia în funcție de tipul de tampon utilizat și de capacitatea sa de tamponare. Tamponul trebuie să fie prezent în formulare într-o cantitate suficientă pentru a menține pH-ul final al formulării în intervalul preferat de pH.

Compoziția cuprinde apă într-o cantitate suficientă pentru a ajunge la concentrația potrivită a componentelor formulării.

Compozițiile apoase stabile cu NGF, care sunt preferate, cuprind circa 1 la 1250 Mg/ml NGF, 1 la 12,5 mg/ml HSA, 5 la 10 mg/ml NaCI, 0,2 la 3,0 mg/ml acid citric și apă, în care pH-ul formulării este ajustat la circa 4,5 până la circa 6,0 mai ales de la circa 5,0 la circa 5,4. Cele mai preferate formulări stabile cu NGF cuprind 10 la 500 Mg/ml NGF, 5 mg (ml HSA, 8,7 mg/ml NaCI, 2,1 mg/ml acid citric și apă, în care pH-ul formulării este ajustat la circa 5,2.

Compozițiile liofilizate din această invenție sunt deosebit de utile pentru asigurarea unei depozitări pe termen lung a NGF-ului în special la temperaturi ridicate. Formulările liofilizabile din această invenție cuprind NGF, un agent de gonflare acceptabil din punct de vedere biologic, un tampon pentru a menține pH-ul formulării de la circa 5,5 la circa 6,5, opțional, o sare acceptabilă din punct de vedere biologic, opțional un purtător solubil în apă acceptabil din punct de vedere biologic și apă.

Factorul de dezvoltare a nervului este prezent în formulările liofilizabile în același domeniu de concentrații ca și în formulările apoase. Agentul de gonflare asigură în

RO 114742 Bl

250 general suport mecanic pentru a permite ca matricea să-și mențină conformația în timpul și după procesul de uscare prin congelare. Drept agenți de gonflare se pot utiliza unul sau mai multe zaharuri. Zaharurile, așa cum se utilizează aici, includ, dar nu se limitează, la monozaharide, oligozaharide și polizaharide. Exemple de zaharuri potrivite includ, dar nu se limitează la, fructoză, glucoză, manoză, sorboză, xiloză, maltoză, lactoză, sucroză, și dextran. Zaharul include de asemenea alcooli, cum ar fi manitol, sorbitol, inositol, dulcitol, xilitol și arabitol. Pot fi folosite de asemenea amestecuri de zaharuri în conformitate cu această invenție.

Un agent de gonflare preferat cuprinde o combinație de zaharuri. Agentul de gonflare preferat este o combinație de sucroză și manitol. Fără a fi legați de teorie, se crede că sucroză formează o sticlă amorfă la congelare și liofilizare ulterioară, permițând mărirea potențială a stabilității proteinei (de exempiu prevenirea agregării] formând o dispersie moleculară de factor de dezvoltare a nervului într-o sticlă rigidă. Stabilitatea poate fi mărită de asemenea datorită faptului că zaharul acționează prin înlocuirea apei pierdute prin liofilizare. Moleculele de zahar, mai curând decât moleculele de apă, se leagă la proteină prin legături de hidrogen. Manitolul atunci când este amestecat în raport masic de 1; 1 cu sucroză (care are o temperatură de tranziție la sticlă de - 36°C) ridică temperatura de tranziție la sticlă a formulării cu 5°C, adică până la - 31°C. Acest lucru scurtează considerabil timpul primar de uscare a formulării în timpul liofilizării, în timp ce încă permite formarea unei matrici amorfe, sticloase a formulării, și astfel este considerat un avantaj în cazul în care se trece la fabricarea pe scară largă. Alți agenți de gonflare care posedă de asemenea aceste caracteristici pot substitui unul sau ambele aceste zaharuri.

Compozițiile din această invenție care urmează a fi liofilizate au preferabil un pH mai mare decât formulările care nu sunt liofilizate sau care sunt reconstituite. Agenții de gonflare (zaharuri), care sunt prezenți în formulările liofilizabile din invenție, sunt în general mai stabili la pH-uri mai mari. Preferabil pH-ul formulării înainte de liofilizare este între circa 5,5 și circa 6,5. Mai ales, pH-ul formulărilor liofilizabile cu NGF este între circa 5,8 și circa 6,2. PH-ul celor mai preferate formulări liofilizabile cu NGF este de circa 6,0. Atunci când drept agent de gonflare este pr ezentă sucroză, pH-ul preferat al formulării liofilizabile este de circa 6,0, deoarece la pH acid sucroză, o dizaharidă nereducătoare, hidrolizează, formând zaharurile reducătoare D-fructoză și D-glucoză. Citratul este cel mai preferat tampon pentru formulările liofilizabile cu NGF dar se pot folosi și alte tampoane acceptabile din punct de vedere biologic, cum ar fi maleat. Tampoanele altele decât acetatul sunt preferate din cauza tendinței acidului acetic de a se volatiliza în timpul liofilizării. Trebuie recunoscut că ajustarea pH-ului final cu acid sau bază poate fi necesară. Orice pierdere a stabilității pe termen lung a NGFului apos datorată pH-ului mai mare de 6,0 este posibil să fie depășită de stabilitatea mărită asociată NGF-ului care este liofilizat.

In mod ideal, alegerea tamponului ține cont de ridicările potențiale de pH din timpul liofilizării cauzate de cristalizarea secvențială a componentelor tampon. Oe exemplu, în cazul tampoanelor fosfat, componenta bazică are un punct eutectic mai mare decât componenta acidă, și prin urmare aceasta cristalizează prima și pH-ul scade. Tamponul citrat este preferat din cauză că se consideră că ambele componente ale tamponului au aproximativ același punct eutectic, conducând la fluctuații foarte mici ale pH-ului în timp ce scade temperatura. Alte tampoane potrivite vor avea componente cu aceleași puncte eutectice sau similare.

Compozițiile liofilizabile cuprind de asemenea, în mod opțional, o sare acceptabilă din punct de vedere biologic. Sarea, care poate fi selectată din aceleași sări

255

260

265

270

275

280

285

230

RO 114742 Bl care sunt utile în formulări apoase, este prezentă în formularea liofilizabilă în aceleași concentrații sau în concentrații mai reduse decât în formulările apoase. Deoarece concentrația de sare se poate mări pe durata liofilizării, poate fi de dorit să se reducă concentrația de sare prezentă în formulările liofilizabile pentru a perveni denaturarea proteinei. Reducerile concentrației sării în formularea liofilizabilă poate fi compensată în timpul reconstituirii astfel încât să asigure o formulare finală suficient de izotonică pentru a fi adecvată administrării la un individ.

In mod opțional, compozițiile liofilizabile cuprind un purtător solubil în apă, acceptabil din punct de vedere biologic. Purtătorii și concentrația purtătorilor, care pot fi utilizați în formulările liofilizabile din această invenție, sunt aceleași ca cele care sunt adecvate pentru utilizarea în formulările apoase din această invenție.

Compozițiile liofilizabile preferate cuprind circa 1 până la 1250 A/g/ml factor de dezvoltare a nervului 15 la 45 mg/ml sucroză, 15 la 45 mg/ml manitol, opțional 7 la 9 mg/ml NaCI, și 0,1 la 0,7 mg/ml acid citric la un pH de circa 5,5 la circa 6,5. Cele mai preferate formulări liofilizabile cu factor de dezvoltare a nervului cuprind 100 la 1250 /zg/ml factor de dezvoltare a nervului 30 mg/ml sucroză, 30 mg/ml manitol, 5 mg/ml albumină serică umană, opățional 8,7 mg/ml NaCI și 0,3 mg/ml acid citric. Cel mai preferat pH al formulării liofilizabile este de circa 6,0.

Compozițiile liofilizabile din această invenție sunt liofilizate până la un conținut rezidual de umiditate mai mic de circa 2%; totuși, formulările care rețin activitatea biologică a NGF cu cantități mai mari sau mai mici de umiditate sunt de asemenea luate în considerație.

Compozițiile liofilizate preferate cuprind 0,001 la 1,25 părți factor de dezvoltare a nivelului, 30 la 90 părți zahăr, și mai puțin de circa 1 parte apă.

Compozițiile liofilizate cu factor de dezvoltare a nervului sunt reconstituite cu un diluant care conține tampon, cum ar fi acid citric și sare, cum ar fi clorură de sodiu, după cum poate fi necesar astfel încât formularea reconstituită rezultată este similară cu formularea lichidă apoasă, adică circa 1 la 1250 Azg/ml NGF, 1 la 12,5 mg/ml HSA 5 la 10 mg/ml NaCI, 0,2 la 3,0 mg/ml acid citric, 1,5 la 30 mg/ml sucroză și 1,5 la 30 mg/ml manitol pH=5,2.

Compoziția liofilizată cu factor de dezvoltare a nervului din această invenție este utilă de asemenea și drept componentă a unei truse pentru a asigura un mod convenabil și economic de obținere a unui NGF liofilizat stabil într-o formă care poate fi reconstituită rapid și cu ușurință într-un vehicul adecvat pentru administrare la un pacient care are nevoie de tratament. In afară de formularea cu factor de dezvoltare a nervului liofilizată, trusele din această invenție cuprind de asemenea un vehicul de reconstituire. Vehiculul de reconstituire cuprinde apă sterilă și o cantitate suficientă de sare pentru a face formularea finală reconstituită izotonică în esență. Volumul total de vehicul de reconstituire, prezent în trusă, trebuie să fie suficient pentru a atinge o concentrație finală de factor de dezvoltare a nervului potrivită pentru administrarea la un individ care are nevoie de tratament. Intr-o întruchipare preferată a acestei invenții, este asigurată o trusă cuprinzând două fiole. O fiolă cuprinde formularea sterilă liofilizată cu factor de dezvoltare a nervului din această invenție și o a doua fiolă cuprinzând vehicul steril de reconstituire. La dizolvarea formulărilor liofilizate, formularea reconstituită poate fi administrată imediat pacientului.

Din cauza stabilității pe termen lung a formulării reconstituite din această invenție, este posibil de asemenea să se prepare suficientă formulare reconstituită pentru a asigura doze multiple.

Compozițiile din această invenție sunt utile pentru tratarea indivizilor cu afecțiuni

RO 114742 Bl

345 care răspund la terapia cu NGF. In mod tipic, astfel de formulări sunt sterile și sunt adecvate pentru administrare intravenoasă, intramusculară, parenterală sau intracerebroventriculară. O astfel de terapie poate fi utilă pentru a trata disfuncții neuronice, implicând vătămarea neuronului sau degenerarea neuronilor care răspund la factor de dezvoltare a nervului. Factorul de dezvoltare a nervului poate fi deosebit de util pentru tratarea unei afecțiuni datorate pierderii neuronilor colinergici centrali, cum ar fi boala lui Alzheimer. Factorul de dezvoltare a nervului este descris ca tratament al bolii lui Alzheimer și altor forme de demență este descris în EP 370 171.

Compozițiile din invenție ca tratamente pentru demențe pot fi administrate pe orice cale de rutină în funcție de utilizarea specifică țintită. Cea mai potrivită cale va depinde de utilizarea și subiectul implicat.

Pentru a depăși dificultățile prezentate de bariera sânge-creier, factorul de dezvoltare a nervului poate fi administrat în CNS prin injecții intraventriculare directe sau prin intermediul implantator sau pompelor impregnate cu medicament. O altă cale de administrare este prin infuzie continuă printr-un dispozitiv canulă intracerebroventricular. Alternativ, conjugarea factorului de dezvoltare a nervului cu molecule purtătoare, cum ar fi transferin, poate fi necesară pentru a penetra bariera sânge-creier.

□ cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic de factor de dezvoltare a nervului se așteaptă a fi de la circa 0,001 la circa 0,5 mg pe/zi, preferabil de la circa 0,01 la circa 0,10 mg pe zi, mai ales de la circa 0,02 la circa 0,06 mg pe zi. Doza exactă și regimul de administrare va depinde de mulți factori, cum ar fi calea de administrare și gradul de suferință a individului care primește tratamentul.

Se dau, mai jos, exemplele de realizare a invenției.

Exemplul 1. Se prepară compoziții apoase cuprinzând 1, 10, 100 și 1000 Mg/ml rhNGF, 5 mg/ml HSA, 8,7 mg/ml clorură de sodiu și 2,1 mg/ml acid citric și suficientă apă pentru a se prepara 10 ml de formulare, tamponată la pH=5,2. După dizolvarea acidului citric și a sării în circa 70% din volumul total, pH-ul se ajustează cu NaOH/HCI și HSA și NGF se adaugă cu agitare ușoară împreună cu apa pentru a atinge volumul și formularea se filtrează printr-un filtru Millipore Millex - GV de 0,2 ,irhNGF-ul utilizat pentru a prepara este exprimat în celule de insecte, utilizând un vector de expresie baculoviral și este purificat prin schimb ionic și cromatografic cu fază reversă, așa cum au descris Barnett J. et al., Exp. Neurol., 110:11 ...24,

1990.

Exemplul 2. Formulări cu NGF pentru liofilizare. La temperatura camerei, se prepară o formulare apoasă cu NGF, cuprinzând 100 ,ug/ml NGF, 30 mg/ml sucroză, 30 mg/ml manitol, 5 mg/ml HSH și 0,3 mg/ml acid citric ajustată la pH=6,0 cu NaOH. După dizolvarea acidului citric și a zaharurilor în circa 70% din volumul total, pH-ul se ajustează și se adaugă HSH și NGF cu agitare ușoară împreună cu suficientă apă pentru aducere la volum.

Liofilizarea formulării cu NGF. Se testează stabilitatea la liofilizarea NGF-ului apos în formularea din exemplul 7. Alicoturi de un ml, din formulările cu NGF preparate, sunt plasate în fiole de 5 ml Type l acoperite cu dopuri de liofilizare. Fiolele, conținând formularea, sunt închise într-o cameră de uscare prin congelare (FTS Systems Inc.], care se echilibrează la 5°C, înainte de a fi inițiată congelarea. Temperatura camerei este scăzută apoi la - 40°C. După 2 h de absorbție la - 40°C, camera este evacuată și presiunea se controlează la 80 până la 100 miliTorri cu un curent de azot. Se realizează o creștere de 4°C pe oră, până ce se atinge o temperatură finală de uscare de 25°C. După aproximativ 30 h în ciclu, se atinge un conținut final de umiditate între 1 și 2% în produs.

350

355

360

365

370

375

380

385

390

RO 114742 Bl

Pulberea uscată prin congelare se depozitează la 5°C și se reconstituie la temperatura camerei după 3 zile cu 1 ml de diluant, constând din 8,7 mg/ml clorură de sodiu și 1,1 mg/ml acid citric, tamponat la pH=5,2. Probele sunt analizate pentru determinarea concentrației de NGF prin RP-HPLC. După liofilizare, nu se observă nici o pierdere de proteină.

PROCEDURI DE TESTARE. IDENTIFICAREA Șl DETERMINAREA CANTITATIVĂ A NGF UTILIZÂND HPLC CU FAZA REVERSATĂ. NGF-ul se identifică și se determină cantitativ analizând proba de 100 μ\ prin HPLC cu fază reversă (Cromatograf Lichid Hewlett Packard HP 1090] echipat cu o coloană de 4...6 mm x 25 cm L Dynamax (Rainin Instrument Co., Woburn, MA, SUA] de 300 Â 5 μίτι 4,6 mm x 1,5 cm și o diodă detector de rază UV potrivită la 220 nm. Faza mobilă este (A) 0,1 acid trifluoracetic în apă și (B] 0,1% acid trifluoracetic în acetonitril cu gradienții schimbându-se de la 25% (B] la 60% (B) în 45 min, cu o viteză de curgere de 0,5 ml/min, la o presiune de 1700...2000 psi, la temperatura ambiantă.

Identificarea NGF-ului se stabilește comparând timpul său de reținere în probă cu respectivul timp de retenție a soluțiilor de NGF standard calibrate, proaspăt preparate, obținute din același lot. Cantitatea de NGF în probe este calculată în comparație cu o curbă standard obținută prin diluări în serie a concentrațiilor cunoscute. DETERMINAREA CONCENTRAȚIEI DE NGF (Mg/ml] PRIN ELISA. Concentrațiile de NGF sunt determinate de asemenea prin ELISA. Atât standardele, cât și probele sunt testate în triplicate. Fiecare placă conține o curbă standard completă de NGF și probe oarbe fără NGF.

In fiecare adâncitură a unei plăci de testare cu 96 de adâncituri, se adaugă 100 μΙ de anticorpi de acoperire (24 CI monoclonal de șoarece crescut contra rhNGF după care plăcile sunt învelite într-o folie Saran cu un șervet umed de hârtie și sunt incubate peste noapte într-un frigider la 2...8°C. Adânciturile sunt colite, spălate de 3 ori, utilizând un set seringă cu autoumplere pentru a elibera 250 μΙ/adâncitură de tampon de spălare (conținând 500 mM Tris, 2M clorură de sodiu, tamponat la pH=7] și se usucă imediat. Ulterior în fiecare adâncitură se adaugă 200 μΙ de tampon de blocare (1% soluție de albumină serică de bovine] pentru a bloca situsurile nespecifice, în fiecare adâncitură, se adaugă 50 μΙ de probă și plăcile se incubează pe timp de minimum o oră la temperatura camerei, în timp ce se amestecă pe un agitator cu platformă. Adânciturile sunt golite din nou și se usucă prin scuturare, și se adaugă 50 μΙ de soluție standard și probă. Plăcile sunt acoperite apoi și incubate timp de două ore la temperatura camerei. Adânciturile plăcii sunt din nou golite și spălate de patru ori cu tampon de spălare și uscate prin lovire cu mâna. In fiecare adâncitură, se adaugă 50 μΙ de anticorp biotinilat (8 CI monoclonal de șoarece crescut 6 contra rhMGF, plăcile sunt acoperite și incubate timp de două ore. Adânciturile plăcilor sunt golite spălate și uscate ca mai înainte și în fiecare adâncitură, se adaugă 50 μΙ de streptavidin conjugat cu peroxidază de hrean. Plăcile se acoperă și se incubează timp de 20 min, la temperatura camerei, în timp ce se amestecă pe un agitator cu platformă. Plăcile se spală de cinci ori cu tampon de spălare. După ce în fiecare adâncitură se adaugă 50 μΙ de tampon substrat orto-fenilendiamină (OPD], plăcile se acoperă și se incubează la întuneric timp de o oră.

Pentru a determina absorbanța fiecărei adâncituri, se utilizează un cititor V_maxKinetic Microplate (Molecula Devices, Mountain View], Pentru fiecare adâncitură din vârful absorbanței la 450 nm, se scade absorbanța de fond la 650 nm pentru a se obține absorbanța netă. Concentrația de NGF în probe se determină în comparație cu

RO 114742 Bl

445 o curbă standard de NGF.

DETERMINAREA ACTIVITĂȚII FACTORULUI DE DEZVOLTARE A NERVULUI. Bioactivitatea NGF-ului se determină prin biotest PC-12. Biotestul PC-12 se bazează pe activitatea metabolică mărită a celulelor de feocromocitom PC-12 (Greene, Trends Neurosci. 7:91, 1986) după expunerea la NGF. Activitatea metabolică a celulelor PC12 se măsoară prin preluarea celular a bromurii de 3-/4,5-dimetiltiazol-2-il/-2,5difeniltetrlazolin (C₁₀H₁₆H₅Br) (MTT), care este transformat de dehidrogenaza celulară în cristale intracelulare insolubile, bleu.

Fiecare adâncitură a unei plăci cu 96 de adâncituri conține circa 30.000 celule PC-12 în 50 μ\ de medii RPMI-1640 (Sigma). Se prepară diluții în serie a fiecărei probe și a standardelor pentru a produce soluții de 0,006 la 400 mg rhNGF pe ml în RPMI -1640 cz 0,2% albumină serică de bovină (BSA). Apoi, în fiecare adâncitură, se adaugă 50 microlitri din fiecare soluție pentru a da concentrații de 0,003 la 200 ng NGF pe ml și fiecare concentrație se determină în triplicat. După menținerea plăcilor timp de 2 zile în C0_P 5% la 37°C, în fiecare adâncitură, se adaugă 10 ,ug de MTT și plăcile sunt incubate timp de încă 4 h. Apoi se adaugă un volum de SDS 20% în dimetilformamidă (DMF), 50%, pH=4,7 și plăcile se împachetează în celofan, se sigilează în saci de plastic și se incubează peste noapte la 37°C. Plăcile sunt citite în ziua următoare, utilizând un cititor de placă V_max potrivit la 575 nm- Raportul ED₅₀ a curbei probei față de ED₅₀ a unei curbe standard de NGF dă o măsură a potentelor relative ale celor două preparate.

STABILITATEA FORMULĂRILOR CU NGF LA 5 și 25°C. Alicoturi de 250 _Ad dintr-o formulare cu 100 Mg/ml NGF din exemplul 1 se depozitează la 5 și 25°C (TC), în fiole cu vârf de picurare, timp de până la 6 luni. Analizele RP-HPLC, ELISA și biodeterminare (descrise mai sus] a acestor probe, indică că nu există pierdere de proteină după 6 luni (Tabelul 1).

Tabelul 7

450

455

460

465

470

Stabilitatea NGF-ului la 5 și 25°C, măsurată prin RP-HPLC, ELISA șl biodeterminare PC-12

Depozitare Temperatura (°C)	RP.HPLC% LS+1 săptămână	RP-HPLC % LS+2 săptămâni	RP-HPLC % LS + 3 luni	RP-HPLC % LS + 4 luni	RP-HPLC % LS + 6 luni	ELISA % SL + 6 luni	Biodeter- minare Potentă relativă 6 luni
5°C	99 ± 2	99 + 6	96 ±4	100 ± 3	101 ± 3	100 + 6	106 ± 14
T.C(22...25°C)	99 + 2	91+5	95 + 5	103 + 3	99 + 5	104 ±13	123 ± 3

475 + %LS = % Indicator tărie = /NGF/test /NGF/control % Potența relativă = Activitate test Activitate control (Numerele RP-HPLC reprezintă media ± deviația standard a 2...4 replicate. Numerele de biodeterminare reprezintă media ± 95% limitele de siguranță a 3 determinări). STABILITATEA LA DIVERSE FORMULĂRI CU NGF DEPOZITATE ÎN CATETERE DE POLIETILENĂ LA 37°C. Alicoturi de 250 μΙ formulări cu NGF conținând de la 1 la

480

RO 114742 Bl

485

1000 /zG/ml rhNGH , obținute așa cum se descrie în exemplul 1, se depozitează în catetere de polietilenă, care nu sunt radiopace (diametru intern de 0,030 inci (0,076 cm) și diametru exterior 0,048 inci (0,12 cm) la 37°C, timp de până la 4 săptămâni. Rezultatele așa cum se arată în tabelul 2, indică că nu există o pierdere semnificativă de proteină, (măsurat prin RP-HPLC), sau de activitatea NGF-ului (măsurat prin biodeterminare PC-12).

Tabelul 2

Stabilitatea Formulărilor în Catetere de polietilenă la 37°C determinată prin RP-HPLC și biodeterminare PC-12

/NGF la Timp Zero Lzg/ml)	% LS + 1 săptămână RP-HPLC	% LS + 2 săptămâni RP-HPLC	% LS + 4 săptămâni RP-HPLC	% Potență relativă 4 săptămâni PC-12 Biodeterminare
1.0	104 ± 3	87 + 6	85 ± 3	101 + 34
10,0	94 + 14	92 ± 4	100± 1	119 ± 45
100,0	102 ±4	95 ± 6	95 ± 2	129 ± 34
1000,0	107 + 2	92 ±4	86 + 3	108 ± 33

+ % LS = Indicator tărie = /NGF/test /NGF/control % Potență relativă = Activitate test

Activitate control (Numerele RP-HPLC reprezintă media ± deviația standard a 2...4 replicate. Numerele de biodeterminare reprezintă media ± 95%, limitele de siguranță a 3 determinări). STABILITATEA FORMULĂRII CU NGF IN DIVERSE DISPOZITIVE DE ELIBERARE. Alicoturile de 100 ug/ml formulare NGF din exemplul 1 se încarcă fie într-o pompă de infuzie implantabilă Infusaid Model 600 (Shiley - Infusaid Inc. Norwood, MA), o pompă implantabilă cu infuzie Medtronics Dynchromed (Medtronics Inc., Minneapolis, MN) sau minipompă de infuzie osmotică Alzet Model 2ML (alza Corp., Palo Alto, CA). Pompele se plasează într-o baie de apă la 37°C și se inițiază curgerea formulării afară din pompă. De-a lungul unei perioade de 4 săptămâni, se colectează probe săptămânale și se analizează pentru determinarea conținutului de proteină și activității prin RPHPLC, ELISA și biodeterminare PC-12.

Datele din tabelul 3 nu arată că nu se observă o descreștere semnificativă a contracepției sau activității NGF.

RO 114742 Bl

Tabelul 3

Stabilitatea formulărilor cu NGF în diverse dispozitive de eliberare la 37°C, timp de o lună

Sistem de eliberare	% LS + 1 săptămână prin RPHPLC	LS + 2 săptămâni prin RPHPLC	LS + 4 săptămâni prin RPHPLC	LS + 4 săptămâni prin ELISA	% Potența relativă 4 săptămâni prin biodeterminare
Infusaid Model 600 Pompă Implantabilă	91 ± 3	101 ± 3	112 ± 4	90 ± 11	100 ± 36
Medtronics Synchromed Pompă Implantabilă	109 ± 2	92 ± 2	91+3	97 ± 4	90 ± 6
Minipompă Osmotică Alzet 2ML4	96 ±3	95 + 7	90 + 5	n.d.	N.d.

530

535

525 +%LS = % Indicator toric = /NGF/test /NGF/control % Potentă Relativă = Activitate test

Activitate control (Numerele RP-HPLC reprezintă media ± deviația standard a 2...4 replicate. Numerele de biodeterminare reprezintă limitele medii ± limitele de siguranță a 3 determinări], n.d. = nedeterminat.

STUDII DE STABILITATE A FORMULĂRILOR CU NGF LA pH=4 LA 10. In maniera din exemplul 1, se prepară și se filtrează pentru sterilizare printr-un filtru de 0,2 μ (Milex GV; Millipore Corp.) formulări apoase cuprinzând 100 Mg/ml NGF 1 mg/mg HSA și 9 mg/ml clorură de sodiu tamponate la un pH=4...10. Formulările cu pH=4 la 5 se tamponează cu acetat și formulările cu pH=6...1O se tamponează cu Trîs. Alicoturi de 1 ml se transferă în fiole cu vârf de picurare din polipropilenă și se incubează apoi fie la temperatura camerei (23 la 25°C) fie la 37°C. Probele se retrag la diverse perioade de timp și se analizează prin RP-HPLC. Constantele vitezeleor de reacție de prim ordin, reprezentând pierderea de NGF din soluție se reprezintă grafic ca o funcție de pH. Vitezele degradării NGF în soluție sunt găsite crescute la pH mai mic de circa 4,5 și mai mare de circa 6,0. Cea mai mare stabilitate se observă la pH=5,2. STABILITATEA FORMULĂRILOR CU NGF CA □ FUNCȚIE A CONCENTRAȚIEI DE PURTĂTOR. Se testează tipul și cantitatea de purtători, pentru a determina efectul asupra stabilității NGF-ului. Se prepară o formulare apoasă cu 100 Mg/ml, așa cum s-a descris în exemplul 1 și formulări apoase cuprinzând alți purtători și acestea sunt listate în tabelul 4. Fiecare formulare se filtrează pentru sterilizare printr-un filtru Millipore Millex - GV de 0,24. Stabilitatea fiecărei formulări în diversele formulări se determină incubând formulările cu NGF la 375 C în fiole cu vârf picurător din polipropilenă. Probele se retrag după 2 săptămâni și se analizează pentru determinarea conținutului de proteină prin RP-HPLC.

540

545

550

555

560

565

RO 114742 Bl

Tabelul 4

Stabilitatea a diverse formulări cu NGF incubate timp de 2 săptămâni la 37°C

Excipient	Cantitate (% w/v)	% LS la 2 săptămâni
Gelatină	1,0	64 ± 9
Albumină Serică Umană	0,1	48 ± 7
Albumină Serică Umană	0.5	99 ± 2
Albumină Serică Umană	1,0	31 ± 36
Tween 80	0,2	77 ± 9
Pluronic F-68	0,02	65 ± 5

% LS = Indicator tărie = /NGF/test /NGF/ control (Numerele RP-HPLC reprezintă media ± deviația standard a 2...4 replicate]

STUDII DE STABILITATE A FORMULĂRII CU NGF ATUNCI CÂND ESTE DEPOZITATĂ ÎN FIOLE DE STICLĂ LA 2...8°C. Se prepară formulări apoase cuprinzând 100 sau 1000 //g/ml rhNGF, utilizând procedura din exemplul 1, cu excepția că dimensiunea șarjei este mărită la 1,5 I. Alicoturi de 4,2 ml sunt plasate în fiole din sticlă flint cu dopuri din cauciuc - butii cu fețele de teflon, și sunt depozitate la 2,..8°C. Rezultatele, arătate în tabelul 5 de mai jos, indică, că nu există o pierdere semnificativă a conținutului de proteină (măsurat prin RP-HPLC și ELISA), sau a activității NGF-ului (măsurat prin biodeterminare PC-12).

Tabelul 5

Stabilitatea formulării cu NGF la depozitarea la 2... 8°C, măsurată prin RP-HPLC, ELISA și biodeterminare PC-12

Nominal/NGF/	RP-HPLC % LS + Inițial	RP-HPLC % LS + 12 luni	ELISA % LS + 12 luni	BiodeterminarePC + LS + 12 luni
100 ,ug/ml	103 ± 1	101 ± 1	102 ± 3	102 ± 15
1000 Aig/ml	102 ± 1	101 ± 1	108 ± 3	102 ± 20

+% LS = % Indicator tărie = /NGF/la momentul testării /NGF/inițial

IDENTIFICAREA Șl DETERMINAREA CANTITATIVĂ A NGF-ului UTILIZÂND HPLC CU FAZA REVERSĂ. In acest exemplu 9, procedura utilizată este după cum urmează: NGF-ul se identifică și determină cantitativ, analizând probe de 100 μΙ prin HPLC cu fază reversă (Hewlett Packard HP 1090 Liquid Chromotograph] echipat cu coloană de 4...6 mm x 250 mm, Bakerbond Wide - Pore Butyl (04) dimensiunea porului 300 Â (J.T.Baker Inc. Phillipsburg NJ, SUA) și un detector diodă a radiației UV fixat la 210 nm. Fazele mobile sunt (A) 0,2 % acid trifluoracetic în apă și (B) 60% acetonitril în tampon (a), gradientele schimbându-se de la 29 (B) la 75% (B) în 65 min, cu o viteză de curgere de 1,0 ml/min, la o presiune de 110 bar, la temperatura ambiantă.

Apoi, se utilizează procedura descrisă mai sus la procedura de testare HPLC.

Claims

Revendicări

1. Compoziție farmaceutică cu factor de dezvoltare a nervului, caracterizată prin aceea că, ea conține de la aproximativ 0,0001 până la aproximativ 0,125% factor de dezvoltare a nervului, de la 0,5 până la 1,0% o sare biologic acceptabilă, apă, un tampon în cantitate suficientă pentru a menține pH-ul compoziției de la circa 4,5 la circa 6 și, opțional, un purtător biologic acceptabil, în cantitate de 0,1 până la 1,25%, toate procentele fiind exprimate în greutate și pentru liofilizare, circa 1 la circa 1250 ug/ml factor de dezvoltare a nervului, circa 30 la 90 mg/ml dintr-un agent de gonflare, apă, un tampon în cantitate suficientă pentru a menține pH-ul compoziției de la 5,5 la 6,5%, și, opțional, un purtător biologic acceptabil, solubil în apă.
2. Compoziție conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, pH-ul este de preferința cuprins între 5 și 5,4.
3. Compoziție conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, ea conține 10 până la 500 ug factor de dezvoltare a nervului, 5 mg/ml albumină serică umană, 8,7 mg/ml NaCI, 2,1 mg/ml acid citric și apă, pH-ul fiind ajustat la circa 5,2.
4. Compoziție conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, agentul de gonflare este un zahar.
5. Compoziție conform revendicării 1 sau 4, caracterizată prin aceea că, agentul de gonflare cuprinde un amestec de sucroză și manitol, tamponul este un citrat și pH-ul compoziției este de circa 5,8 până la circa 6,2.
6. Compoziție conform revendicării 1,4 sau 5, caracterizată prin aceea că liofilizată pentru a reduce conținutul de umiditate la mai puțin de 2%.
7. Compoziție farmaceutică cu factor de dezvoltare a nervului, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, în scopul obținerii unei compoziții liofilizate, cuprinde 0,001 până la 1,25 părți factor de dezvoltare a nervului, 30 până la 90 părți zahăr și mai puțin de circa o parte apă, părțile sunt exprimate în greutate.
8. Compoziție farmaceutică cu factor de dezvoltare a nervului, conform revendicărilor 1 la 7, caracterizată prin aceea că tratează disfuncțiile neuronice la oameni.
9. Compoziție farmaceutică, conform revendicărilor 1 la 8, caracterizată prin aceea că, sub formă de infuzie intracerebroventriculară, tratează boala lui Alzheimer la oameni.