CN109260147B - 一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂 - Google Patents

一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，包括以下组分：重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105‑1.0×106 IU；蛋白保护剂1.5‑50mg；等渗调节剂0.4‑1.5g；缓冲盐体系0.1‑1.0g；注射用水加至100mL。本发明公开的用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂配方简单，只是在配方中加入了稳定剂和抗氧化剂，并通过控制两者的比例使制备的注射剂稳定性高，该注射剂中没有添加任何防腐剂和抑菌剂，从而有效避免了因为防腐剂或抑菌剂的使用而造成的不良反应，安全性高。

Description

一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长 因子注射剂
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂及其制备方法。
背景技术
周围神经是指中枢神经(脑和脊髓)以外的神经，是由于缺血、损伤出现的传导功能失常、轴索变形及神经断裂等一系列损害。周围神经损伤患者不仅出现躯体运动、感觉及交感障碍，还能影响日常生活能力，大多继发于手术后、外伤后的损伤，如骨科手术后约有5％出现周围神经损害。
周围神经损伤后常导致肢体不同程度的功能障碍，严重影响伤患者的工作和学习能力。迄今为止，损伤后周围神经的再生和修复仍是临床实践中难以凭借手术技术和方法的改进而得以解决的难题。目前，治疗周围神经损伤的方法多种多样，在微环境因素中，生长因子的作用尤为重要，具有维持神经元存活和促进轴突再生的作用，对神经修复意义重大。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种与组织创伤的愈合过程密切相关的内源性活性因子，对组织创伤愈合、及血管再生有显著的促进作用。bFGF是由146个氨基酸组成的单链多肽，分子量为17KD。临床应用表明，rh-bFGF对人体烧伤、创伤、手术伤等具有显著的促进愈合作用，且无局部及全身毒副作用。bFGF不仅可以加速创伤愈合，而且可以减少疤痕的形成，在促进烧伤、创伤和褥疮等组织损伤的再生和修复方面展示了非凡和独到的功效。
例如中国专利申请201510413146.3中公开了一种不含抑菌剂的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂及其制备方法，所述的凝胶剂包括以下组分：重组人碱性成纤维细胞生长因子1×106-9×106IU、蛋白稳定剂0.01-5.0g、增稠剂0.1-20.0g、pH调节剂0.1-10.0g、缓冲剂0.1-10.0g、保湿剂0.1-50.0g，加注射用水定容至1000ml。该发明还提供不含抑菌剂的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的制备方法。该发明提供的不含抑菌剂的重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂无抑菌剂，用完即弃，可避免抑菌剂的存在对眼部产生的刺激，以及使用及储存过程中可能出现的微生物污染。该申请中没有添加抑菌剂，从而避免了抑菌剂对眼部产生的刺激，但是其解决此问题所采用的技术方案是采用独立包装，用完即弃，但是此操作只会在一定程度上解决凝胶剂的稳定性，长期使用可能会造成大量包装瓶的浪费，进而会造成环境污染；并且该申请中对于碱性成纤维细胞生长因子对神经损伤的修复效果并没有涉及。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种多功能细胞生长因子，其对神经损伤修复也有显著地促进作用，对来源于中胚层和神经外胚层的多种细胞具有增殖和分化刺激调节作用，对神经系统的发育和生长也有广泛的促进作用。周围神经损伤后，bFGF对神经再生的促进作用体现在：一方面对神经元细胞有保护作用，对神经胶质细胞(包括施旺细胞和卫星细胞)有促分裂增殖作用，另一方面促进神经纤维再生和血管发生，并改善微循环。
中国专利申请96106458.7中公开了一种神经损伤修复制剂，其主要包括纤维蛋白原、0.05摩尔/升pH值为7.4的三羟甲基胺基甲烷生理盐水缓冲液、纤维蛋白酶、伊格氏MEM培养液、0.025摩尔/升CaCl2水溶液、神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、运动神经生长因子等组分。它是一种简单、易行、能够促进神经再生，促进微血管新生的脊髓及外周神经损伤修复制剂，但是该申请并未解决制剂稳定性的技术问题。
因此，维持外周损伤神经局部微环境中缺乏的bFGF有效浓度是修复损伤神经的重要策略之一，基于上述面临的技术问题，研制一种具有更高稳定性，并且能够有效治疗神经损伤的bFGF药物注射剂有重要的意义。
本发明在面临上述技术问题时，通过采用特殊的制备方法，将特定的蛋白保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系、pH调节剂、稳定剂等用于制备重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，相对于现有技术，获得的注射剂具备稳定性好、活性高的良好性能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定性高，并且能够有效治疗神经损伤的bFGF药物注射剂。
本发明提供的用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，包括以下组分：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
优选地，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，包括以下组分：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
再优选地，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，包括以下组分：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
进一步优选地，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，包括以下组分：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
所述蛋白保护剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、吐温80、吐温20、肝素钠和右旋糖苷一种或多种；
优选地，所述的蛋白保护剂为蔗糖、海藻糖、甘露醇、精氨酸、吐温80和肝素钠一种或多种；
再优选地，所述的蛋白保护剂为蔗糖、精氨酸和肝素钠一种或多种；
其中，蔗糖、精氨酸和肝素钠三者质量比为1-3：2：1。
所述的等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和甘氨酸中的一种；优选的，所述的等渗调节剂为氯化钠、葡萄糖和甘露醇中的一种；再优选地，所述的等渗调节剂为氯化钠和葡萄糖中的一种。
所述的缓冲盐体系为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲体系、硼酸-硼砂缓冲体系、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲体系、枸橼酸-氢氧化钠-盐酸缓冲体系和枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系中的一种或多种。
上述注射液中还含有pH调节剂0.1-0.5g，即所述的注射剂包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
所述的pH调节剂为氢氧化钠、碳酸氢钠、三乙醇胺、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硼酸、醋酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸、硫酸、磷酸、氢氧化钾、碳酸氢钾中的一种或多种。
在一些优选实施方案中，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂还包含抗氧化剂含量0.2-50mg；即所述的注射剂包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
所述的抗氧化剂优选为半胱氨酸、生育酚和无水乙醇的混合物；所述的半胱氨酸和生育酚质量比为2-4：1；所述的无水乙醇的加入量为正好使生育酚完全溶解。
在另一些优选实施方案中，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂还包括稳定剂0.1-30mg，即所述的注射剂包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
所述的稳定剂为胶原蛋白、丝蛋白和人血白蛋白中的一种或多种；
优选地，所述的稳定剂为胶原蛋白、丝蛋白和人血白蛋白，其质量比为1：1：1-2。
在一些具体实施方式中，上述pH调节剂、抗氧化剂和稳定剂可以以相应含量两两搭配或三者同时加入本发明的注射剂中，以实现不仅仅是各自所实现的技术效果的简单组合的更优化的技术效果，例如：
在另一些优选的实施方案中，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
在另一些优选的实施方案中，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
在另一些优选的实施方案中，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂还包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
在另一些优选的实施方案中，上述用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂还包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
在同时含有抗氧化剂和稳定剂的实施方案中，所述的抗氧化剂与稳定剂的质量比为1-5：1；优选为2-4：1。
本发明还提供用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取配方用量的pH调节剂溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)将配方用量的抗氧化剂中加入无水乙醇，使其全部溶解，得到溶液B；
(3)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系、稳定剂和步骤(2)中得到的溶液B溶于注射用水中，得到溶液C；
(4)将步骤(3)中得到的溶液C经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，即得成品。
在具体实施过程中，若配方中不含有上述步骤中提到的具体成分时将省略相应步骤的实施。
本发明相对于现有技术的有益效果在于：
(1)本发明公开的用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂配方简单，只是在配方中加入了稳定剂和抗氧化剂，并通过控制两者的比例使制备的注射剂稳定性高，杂质少，安全性高。
(2)本申请公开的用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂中没有添加任何防腐剂和抑菌剂，从而有效避免了因为防腐剂或抑菌剂的使用而造成的不良反应。
(3)本发明公开的用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂生物利用度高，使用方便，发挥作用迅速，从而可以快速有效的治疗神经损伤。
(4)本申请公开的用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂使用特定的组分作为稳定剂，不仅可以提高注射剂的稳定性，还可以提高药物药物活性的保存时间，可以保证药物长时间有效，从而减少了药物浪费。
说明书附图
图1周围神经损伤术后2周与4周各组的最小刺激电压值(MV)和运动神经传导速度(NCV)；
图2周围神经损伤术后2周和4周各组髓神经纤维直径(NFD)、横截面有髓神经总数(NFC)和髓鞘厚度(MST)。
具体实施方式
本发明中提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所解释的所有特征可与任意组合物形式并用，说明书中揭示的各个特征，可被任何可提供相同、均等或相似目的的取代性特征取代。因此除有特殊说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明具体实施方案中涉及到的药品、材料、溶液等，除特别说明外，其余均有商业途径购得。
实施例1一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂和缓冲盐体系溶于注射用水中，得到溶液A；
(2)将步骤(1)中得到的溶液A经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下罐装，即得成品。
实施例2一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)称取配方用量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系和稳定剂溶于注射用水中，得到溶液B；
(3)将步骤(2)中得到的溶液B经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下灌装，即得成品。
实施例3一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)称取配方用量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系和稳定剂溶于注射用水中，得到溶液B；
(3)将步骤(2)中得到的溶液B经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下灌装，即得成品。
实施例4一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)称取配方用量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系和抗氧化剂溶于注射用水中，得到溶液B；
(3)将步骤(2)中得到的溶液B经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下灌装，即得成品。
实施例5一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)称取配方用量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)向配方用量的生育酚中加入无水乙醇，使其全部溶解，得到溶液B；
(3)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系、抗氧化剂和步骤(2)中得到的溶液B溶于注射用水中，得到溶液C；
(4)将步骤(3)中得到的溶液C经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下灌装，即得成品。
按照实施例1-5的制备方法制备四份重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂Ⅰ-Ⅴ，将其分别置于4℃下，进行稳定性和相对活性考察，数据见下表1。
表1重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂外观及相对活性考察
由上表1数据可知：分别将重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂(Ⅰ-Ⅴ)在4℃条件下放置一年后溶液澄清无任何沉淀或析出，活性比较稳定；区别在于实施例2和实施例3公开的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂中添加了稳定剂，实施例4和实施例5公开的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂中添加了抗氧化剂，其制备的注射剂放置一年后的活性并没有发生太大变化，因此在注射剂中单独加入稳定剂或抗氧化剂对提高注射剂的稳定性没有太大影响，但可以在一定程度上保证使注射剂长时间放置不变质、不失活。
实施例6一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)称取配方用量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系、稳定剂和抗氧化剂溶于注射用水中，得到溶液B；
(3)将步骤(2)中得到的溶液B经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下灌装，即得成品。
实施例7一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)称取配方用量的枸橼酸和磷酸氢二钠溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)向配方用量的生育酚中加入无水乙醇，使其全部溶解，得到溶液B；
(3)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系、稳定剂、抗氧化剂和步骤(2)中得到的溶液B溶于注射用水中，得到溶液C；
(4)将步骤(3)中得到的溶液C经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下灌装，即得成品。
实施例8一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂
制备方法：
(1)称取配方用量的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于注射用水中，灭菌，得到溶液A；
(2)向配方用量的生育酚中加入无水乙醇，使其全部溶解，得到溶液B；
(3)将配方用量的重组人碱性成纤维细胞生长因子、蛋白质保护剂、等渗调节剂、缓冲盐体系、稳定剂、抗氧化剂和步骤(2)中得到的溶液B溶于注射用水中，得到溶液C；
(4)将步骤(3)中得到的溶液C经过0.22-0.45μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)得到的溶液A混合，并用注射用水定容至100mL，搅拌均匀，无菌条件下灌装，即得成品。
将实施例6-8制备的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂Ⅵ-Ⅷ在4℃的条件下放置，进行了相对活性考察，数据见下表2。
表2 4℃的条件下重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂Ⅵ和Ⅶ相对活性考察
从上表2的数据可以明显看出，在注射剂的配方中加入本发明优选的稳定剂和抗氧化剂，并控制稳定剂和抗氧化剂的质量比为本申请优选比例，并加入一定质量的pH调节剂可以明显提高注射剂的活性，可使重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂在4℃条件下放置一年相对活性最高可达到96％，稳定性明显高于实施例1-5制备的注射液，活性持久，稳定性高。
对比例1一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂与实施例7的区别在于改变了稳定剂的的比例，即将胶原蛋白和人血白蛋白的比例改成1:5，即5g的胶原蛋白和25g的人血白蛋白；其他步骤与操作与实施例7相同。
对比例2一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂与实施例7的区别在于改变了稳定剂的的比例，即将胶原蛋白和人血白蛋白的比例改成5:1，即5g的人血白蛋白和25g的胶原蛋白；其他步骤与操作与实施例7相同。
对比例3一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂与实施例7的区别在于改变了稳定剂和抗氧化剂的比例，即将抗氧化剂和稳定剂的质量比改为10:1；其他步骤与操作与实施例7相同。
对比例4一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂与实施例7的区别在于改变了稳定剂和抗氧化剂的比例，即将抗氧化剂和稳定剂的质量比改为0.5:1；其他步骤与操作与实施例7相同。
对上述对比例1-4与实施例7配方制备的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂在4℃的条件下放置，进行了相对活性考察，数据见下表3。
表3 4℃条件下，重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂相对活性考察
实例 0天 10天 30天 60天 90天 180天 360天
实施例7 100％ 100％ 100％ 98％ 97％ 95％ 95％
对比例1 100％ 100％ 98％ 96％ 94％ 88％ 80％
对比例2 100％ 100％ 97％ 96％ 95％ 86％ 79％
对比例3 100％ 99％ 97％ 95％ 92％ 85％ 80％
对比例4 100％ 98％ 98％ 95％ 93％ 86％ 78％
试验数据显示，根据本发明提供的配方使用本发明优选的稳定剂和抗氧化剂，并控制其具体成分和相应质量比，分别使用本发明提供的优选比例(实施例7)，制备的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂相对活性可以保持360天后依然高达95％；而通过改变强化剂和抗氧化剂的比例，通过测定发现180天的时候相对活性以降低到90％左右，360天的时候相对活性已经将到80％以下，已经失去药效，不能正常使用。
动物实验
1、临床前药效研究
(1)rh-bFGF对大鼠损伤的坐骨神经中断性损伤模型
125只大鼠分5组，每组进行周围神经损伤模型制备，手术后使用按实施例5配方制备的注射剂分别按4000U/kg(A组)、1600U/kg(B组)、400U/kg(C组)肌注给药，并以1600U+bFGF McAb 0.2mg/kg(D组)和2ml生理盐水(E组)作为对照。从术后一周到八周观察神经功能指标，例如坐骨神经功能指数(SFI)，电生理指标，形态学指标，包括有髓神经纤维直径(NFD)、横截面有髓神经总数(NFC)和髓鞘厚度(MST)综合评价受损神经再生修复效果。
结果三个剂量组SFI值从第三周开始数值显著高于对照E组，见表4(SFI＝0为正常，-100为完全损伤)。电生理及形态学指标从第2，3周开始均与对照组有显著性差异，表明rh-bFGF能促进损伤周围神经的再生修复。
表4周围神经损伤术后2-8周各组SFI
*与同时间E组比较P＜0.01
#与同时间E组比较P＜0.05
D组和对照E组比较差异无显著性(P＞0.05)
(2)rh-bFGF对灵长类动物损伤周围神经再生修复的影响
采用手术钳夹法，制备猕猴尺神经中断性损伤模型(16只动物分成四组，每组4只动物8个尺神经损伤肢体)。于术后每天按1500U/kg(A组)，600U/kg(B组)，150U/kg(C组)体重的剂量分别肌注rh-bFGF，对照组肌注生理盐水2ml(D组)。于术后二周和四周观察电生理，包括最小刺激电压值(MV)和运动神经传导速度(NCV)和形态指标，包括有髓神经纤维直径(NFD)，横截面有髓神经纤维总数(NFC)和髓鞘厚度(MST)。
结果A组与B组各观察指标均与生理盐水对照组有显著提高，见附图1与附图2。
附图结果表明rh-bFGF能促进灵长类动物损伤周围神经的再生修复。rh-bFGF能显著促进猕猴损伤周围神经的再生修复，由于灵长类从生物进化和基本代谢方面更接近于人类，因此可以预测rh-bFGF能促进人类周围神经再生。
2、临床前安全性评价
1)急性毒性实验
采用SD大鼠100只，经尾静脉和后腿肌肉注射按实施例5配方制备的注射剂rh-bFGF，观察给药后10天大鼠一般行为、体重以及中毒死亡等情况。结果按40000U/kg、80000U/kg、160000U/kg、320000U/kg、800000U/kg相当于70kg成人推荐临床用量25倍、50倍、100倍、200倍、500倍的注射后，大鼠全部存活，体型正常，皮毛浓密有光泽，呼吸正常，表明rh-bFGF对大鼠基本无毒。
表5静脉注射大鼠剂型毒性实验(X±SD)
表6肌肉注射大鼠急性毒性实验(X±SD)
静脉和肌肉注射800000U/kg rh-bFGF(相当70kg成人临床用量的500倍)后，观察10只SD大鼠10天，无一死亡，同时一般行为良好，体重正常增长，表明rh-Bfgf对大鼠基本无毒。
2)长期毒性实验研究
Rh-bFGF静脉注射猕猴的长期毒性试验
本试验用16只实验猕猴静脉注射实施例4制备的注射剂rh-bFGF进行长期毒性观察。实验分为高剂量组10000U/kg、中剂量组4000U/kg、低剂量组680U/kg和生理盐水对照组。临床推荐人用剂量为250U/kg。试验连续静脉给药90天后，每组处死1/2猕猴进行系统尸检，余下1/2猕猴连续观察30天做恢复时期检测。结果静脉注射rh-bFGF外源抗原物质后，16实验猕猴全部存活。各剂量组动物一般行为、体重增长、各项血液学指标和生化指标、重要脏器相对重量与对照组均无显著性差异(P>0.05)。病理检查未发现静脉注射rh-bFGF出现与药物有关的毒性病理损害。
Rh-bFGF肌肉注射对大鼠的长期毒性试验
本试验用120只清洁级SD大鼠肌肉注射实施例4制备的注射剂rh-bFGF进行长期毒性观察。实验分为四个组：高剂量组40000U/kg、中剂量组10000U/kg、低剂量组2000U/kg及生理盐水对照组。每天肌肉注射一次，连续给药90天后，处死2/3动物进行系统尸检，余下1/3动物继续观察30天做恢复时期检测。结果发现给药组与对照组体重增长情况，血液学指标和生化指标，各主要脏器的病理改变无显著性差异(P＞0.05)，说明rh-bFGF肌注大鼠无药物毒性反应。
3、临床前致癌实验研究
使用3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞系)，检测实施例6制备的注射剂rh-bFGF的恶性转化作用，结果表明经阳性致癌对照物3-MCA+TPA(3-甲基胆蒽/肿瘤多肽抗原)处理过的细胞有大量转化灶形成，经双层软琼脂培养法检测有大量克隆形成，而rh-bFGF处理的细胞及未经处理的细胞均无转化灶及软琼脂克隆形成，与阳性对照3-MCA+TPA组有显著差异，显示rh-bFGF无致恶性转化作用。结果见表4及表5。
表7转化病灶数
组别 瓶数 转化灶数(个/瓶)(X±SD)
rh-bFGF(200U/ml) 5 0
rh-bFGF(50U/ml) 5 0
rh-bFGF(10U/ml) 5 0
阴性对照 5 0
3-MCA+TPA 5 32.6±12.3*
*与阴性对照组相比P＜0.01
表8双层软琼脂培养细胞集落计数
组别 瓶数 集落形成数(个/皿)(X±SD)
rh-bFGF(200U/ml) 5 0
rh-bFGF(50U/ml) 5 0
rh-bFGF(10U/ml) 5 0
阴性对照 5 0
3-MCA+TPA 5 79.5±9.33*
*与阴性对照组相比P＜0.01
结果表明200U/ml、50U/ml和10U/ml的rh-bFGF不会使3T3细胞发生恶性转化，rh-bFGF在该剂量下不具有致癌作用，是安全无害的。

Claims (3)

1.一种用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，其特征在于：所述的注射剂包括：
重组人碱性成纤维细胞生长因子2.5×105-1.0×106IU；
所述蛋白保护剂为质量比为1-3：2：1的蔗糖、精氨酸和肝素钠；
所述的抗氧化剂为半胱氨酸、生育酚和无水乙醇的混合物，所述的半胱氨酸和生育酚质量比为2-4：1；
所述的稳定剂为质量比1：1：1-2的胶原蛋白、丝蛋白和人血白蛋白；
所述的抗氧化剂与稳定剂的质量比为1-5：1。
2.根据权利要求1所述的用于治疗或预防神经损伤的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂，其特征在于：所述的缓冲盐体系为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲体系、硼酸-硼砂缓冲体系、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲体系、枸橼酸-氢氧化钠-盐酸缓冲体系和枸橼酸-枸橼酸钠缓冲体系中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的重组人碱性成纤维细胞生长因子注射剂在制备治疗或预防神经损伤药物中的应用。
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