FI113241B - Menetelmä hermon kasvutekijän stabiloimiseksi ja pitkäaikaiseksi varastoimiseksi - Google Patents

Description

113241

MENETELMÄ HERMON KASVUTEKIJÄN STABILOIMISEKSI JA PITKÄAIKAISEKSI VARASTOIMISEKSI

5 Tämä keksintö koskee menetelmää hermon kasvutekijän stabi-loimiseksi ja pitkäaikaiseksi varastoimiseksi.

Useat polypeptidit ja proteiinit säätelevät solujen kasvua tai eloonjäämistä; sellaisia molekyylejä kutsutaan "kasvu-10 tekijöiksi". Kasvutekijöitä ovat esimerkiksi epidermaali-nen kasvutekijä (EGF), hapan ja emäksinen fibroblastien kasvutekijä (aFGF ja bFGF), verihiutalekasvutekijä (PDGF), kiliaarinen neurotrofinen tekijä (CNTF) ja hermon kasvutekijä (NGF). Näistä ensimmäisenä identifioitiin ja karakte-15 risoitiin NGF (Levi-Montalcini, R., et ai., J. Exp. Zool., 116: 321, 1951) .

NGF edistää tietyntyyppisten hermosolujen eloonjäämistä ja aktiivisuutta. Lisäksi NGF edistää kypsymättömien hermoso-20 lujen erilaistumista postmitoottisiksi kypsiksi neuroneiksi .

,,, NGF:n puhdistus hiiren leuanalussylkirauhasesta johti sel- laisen kompleksin identifiointiin, joka sisälsi kolme ala-' 25 yksikköä, cc, β ja γ. Kaiken NGF:n neurotrofisen aktiivi- : *’ suuden oletetaan sijaitsevan β-alayksikössä, joka on 118 aminohapon proteiini, jonka molekyylipaino on noin 13 000 Da (Varon, S., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 57: 1782-1789, 1967; Greene, L.A., et ai., Neurobiol. , 1: 37-30 48, 1971). Liuoksessa β-alayksiköt muodostavat molekyyli- painoltaan noin 26 500 Da:n dimeerejä.

I 1 · < * NGF:n on esitetty olevan tehokas hoitamaan tiettyjä sekä < t · ‘ ääreis- että keskushermoston rappeutumissairauksia. NGF:n 35 annon on esitetty olevan hyödyllistä sellaisten sairauksi-. , . en hoitamisessa, joissa NGF:n puute, sen reseptorin poik- ,; keavuudet tai muutokset sen kuljetuksessa tai solunsisäi- sessä prosessoinnissa johtavat hermosolutoiminnan alene- 2 113241 miseen, surkastumiseen tai jopa solun kuolemaan. Sellaisia sairauksia ovat perinnölliset tunto- ja liikehermojen sairaudet, perinnöllinen ja yksittäisesti esiintyvä järjestelmän rappeutuminen, amyotrofinen lateraaliskleroosi, 5 Parkinsonin tauti ja Alzheimerin tauti (Goedert, M., et ai., Mol. Brain Res., 1: 85-92, 1986; Mobley, W.C., et ai., Soc. Neurosci. Abstr., 13: 186, 1987; Mobley, W.C., et ai., Soc. Neurosci. Abstr., 4: 302, 1988; Hefti, F., et ai., Ann. Neurol., 20: 275-281, 1986). NGF:n arvellaan 10 myös vähentävän hermosolukuolemia tietyille myrkyille, kuten 6-hydroksi-dopamiinille (Aloe, L., Arch. Ital. Biol., 113: 326-353, 1975), vinblastiinille ja kolkisiinille (Me-nesini-Chen, M.G., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74: 5559-5563, 1977; Johnson, E.M., Brain Res., 141: 105-118, 15 1978) sekä kapsaisiinille (Otten, U., Nature, 301: 515- 577, 1983), altistamisen jälkeen.

NGF:n mRNA-.n runsas ilmentyminen aivotursossa, joka on muistiin ja oppimiseen liittyvä alue, viittaa siihen, että 20 NGF:n kliininen käyttö saattaa olla tehokasta dementian hoidossa (Kaisho, Y., et ai. Biochem. Biophys. Res. Comm., 174: 379-385, 1991). NGF-.n intraventrikulaarisen annon on :* : selostettu ehkäisevän etuaivojen pohjan (basal forebrain) •kolinergisten hermosolujen kuolemista aksonin katkaisemi- t « · · j*. 25 sen jälkeen, mikä viittaa siihen, että NGF saattaa olla .···, tehokas solun eloonjäämisen edistämisessä vaurion jälkeen.

(Hefti, F., J. Neurosci., 6: 2155-2162, 1986; Williams, t » · L., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83: 9231-9235, • » · “1 " 1986; Kromer, L., Science, 235: 214-216, 1987).

30 * > * • ·' NGF:n terapiakäytölle on merkittäviä ongelmia. Nämä ongel- ’...· mat liittyvät 1) NGF:n biologisen aktiivisuuden säilyttä- miseen, joka aktiivisuus voi muuttua valmistuksen, puhdis-.*·. tuksen tai varastoinnin aikana; ja 2) NGF:n, joka on suh- 35 teellisen suuri hydrofiilinen molekyyli, antoon niin, että se saavuttaa aktiivisen kohdan riittävinä määrinä ollak-*.'‘: seen tehokas. NGF:n, kuten muidenkin proteiinien, biologi nen aktiivisuus riippuu sen sekundaarisesta ja tertiääri- 3 113241 sestä rakenteesta. NGF ·,η β-alayksikössä on kolme sisäistä disulfidisidosta, joita pidetään tärkeinä biologiselle aktiivisuudelle (Kanaya, E., et ai., Gene, 83: 65-74, 1989; Iwane, M., et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm., 171: 116-5 122, 1990; Hu, G.-L. ja Neet, K.E., Gene, 70: 57-65, 1988). Lisäksi siinä määrin kuin mikä tahansa proteiini denaturoituu, NGF:n biologisen aktiivisuuden tehokas määrä vähenee. Proteiini on sen vuoksi pidettävä ehyenä valmistuksen ja varastoinnin samoin kuin annon aikana. Proteii- 10 nit ovat erityisen alttiita hajoamaan kohotetuissa lämpötiloissa .

Alhaiset lämpötilat vähentävät tavallisesti proteiinin hajoamista. On kuitenkin taloudellisempaa varastoida prote- 15 iini huoneenlämpötilassa, so. noin 25 °C:ssa, kuin jäähdytetyissä noin 4 °C:n lämpötiloissa. Formulaation stabiilisuus on sen vuoksi toivottavaa varastoimiseksi joko huoneenlämpötilassa tai jäähdytyksessä noin 4 °C:ssa.

20 Stabiilisuusongelmien lisäksi NGF, kuten monet muutkin proteiinit, sitoutuu ei-spesifisesti pintoihin. Sellaista ei-spesifistä sitoutumista saattaa esiintyä monille eri materiaaleille, mukaan lukien lasi ja muovit, esimerkiksi • · · ;\· polyeteeni tai polypropeeni. Näitä materiaaleja saattaa * « m a :*. 25 olla pienten lääkepullojen, putkituksen, ruiskujen, im- .···, plantoitavien infuusiolaitteiden muodossa tai missä tahan- sa muussa pinnassa, joka saattaa joutua kosketukseen NGF:n • * · il! kanssa sen valmistuksen, varastoinnin tai annon aikana.

30 Muita vaikeuksia proteiinien, kuten NGF:n, antamisessa te- : .* rapeuttisena aineena on huono imeytyminen kehoon ja hajo- *...· aminen mahahappojen vaikutuksesta. Oraalinen anto on sen vuoksi yleensä epäsopivaa. Näiden proteiinien injektiot ja ,>··, infuusio saattavat olla välttämättömiä sellaisten imeyty- » » 35 misesteiden voittamiseksi.

:,‘’i Injektio on käyttökelpoinen silloin, kun hoitokohta on helppopääsyinen. Kuitenkin mikäli kohta on suhteellisen 4 113241 luoksepääseraätön, kuten CNS (keskushermosto), jatkuva infuusio saattaa olla käytännöllisempi antoon pitkän ajanjakson aikana. Sellainen anto on ollut epäkäytännöllistä monien eri komplikaatioiden vuoksi. Esimerkiksi jatkuva 5 infuusio voidaan aikaansaada implantoimalla NGF-pumppuja aivoihin, mutta proteiinin pitkäaikainen altistuminen ruu-miinlämpötilalle aiheuttaa usein proteiinin hajoamisen. Lisähävikkiä voi esiintyä myös proteiinin adsorboituessa ajan mittaan pumppukammioon.

10 NGF:n antoon liittyvien ongelmien lisäksi on myös ongelmia, jotka liittyvät sen pitkäaikaiseen varastointiin valmistuksen ja annon välillä. Eräs menetelmä biologisten proteiinien pitkäaikaiseen varastointiin on lyofilisointi, 15 joka estää hajoamisen, aggregaation ja/tai ei-spesifisen adsorption. Lyofilisaatioprosessissa itsessään on kuitenkin vaikeuksia. Kun nesteen tilavuus pakastusprosessissa vähenee, vaikuttava suolakonsentraatio kasvaa tavattomasti, mikä saattaa denaturoida proteiinin vähentäen tehol-20 lista terapeuttista vaikutusta uudelleenmuodostamisen jälkeen. Jääkiteiden muodostuminen pakastusprosessin aikana saattaa lisäksi aiheuttaa denaturoitumista ja myös vähen-: tää NGF:n biologisen aktiivisuuden käyttökelpoista vaikut- tavaa määrää. Formulaation täytyy siten olla sellainen, ► « * » 25 että suolakonsentraation vaihtelut estyvät ja jääkiteiden muodostuminen minimoituu.

* ; Eräänä keksinnön kohteena on antaa käyttöön menetelmä NGF:n stabiloimiseksi, jolloin saadaan vesipitoisia formu-30 laatioita, jotka säilyttävät biologisen aktiivisuuden ai-’ nakin yhden kuukauden ajan lämpötila-alueella noin 4 ·,,,* °C: sta noin 40 °C-.seen.

ti» • » · » .···, Vielä eräänä keksinnön kohteena on antaa käyttöön menetel- • · 35 mä sellaisten NGF:n formulaatioiden valmistamiseksi, jois- .* sa säilytetään biologinen aktiivisuus lyofilisoinnin ja uudelleenmuodostuksen jälkeen.

s 113241

Vielä eräänä keksinnön kohteena on antaa käyttöön menetelmät biologisesti aktiivisen NGF:n varastoimiseksi liuoksessa.

5 Tämä keksintö koskee menetelmää hermon kasvutekijän stabiilien formulaatioiden valmistamiseksi, joita pystytään varastoimaan ympäristön lämpötilaa alemmassa, ympäristön lämpötilassa ja kohotetuissa lämpötiloissa ilman, että proteiinin aktiivisuuden määrä oleellisesti vähenee. For-10 mulaatiot sisältävät vesiliuoksia, joissa on: (a) hermon kasvutekijää; (b) valinnaisesti biologisesti hyväksyttävää vesiliukoista kantajaa; (c) riittävä määrä biologisesti hyväksyttävää 15 suolaa isotonisuuden ylläpitämiseksi; (d) puskuria pitämään formulaation pH noin 4,5:n ja noin 6,0:n välillä; ja (e) vettä, kuitenkin siten, että formulaatio ei sisällä vesiliukoista polysakkaridia.

20

Eräässä näkökannassa keksintö koskee menetelmää sellaisten NGF:n farmaseuttisten formulaatioiden valmistamiseksi, jotka sopivat lyofilisaatioon.

• * · » 4 ) ;·. 25 Keksinnön mukaiset, lyofilisaatioon sopivat farmaseuttiset • 1 » ]···, formulaatiot sisältävät vesiliuoksia, joissa on: ·...' (a) hermon kasvutekijää; (b) biologisesti hyväksyttävää täyteainetta; v : (c) puskuria pitämään formulaation pH noin 5,5-.n 30 ja noin 6,5:n välillä; (d) valinnaisesti biologisesti hyväksyttävää ve- , . siliukoista kantajaa; ja (e) vettä.

f < » r > t i k 35 Vielä eräs keksinnön suoritustapa on menetelmä sellaisten lyofilisoitujen formulaatioiden valmistamiseksi, joista ♦ » vesi on pääosin poistettu. Tällaiset lyofilisoidut formulaatiot sopivat hoidon tarpeessa oleville potilaille an- β 113241 6 nettavaksi sen jälkeen, kun ne on uudelleenmuodostettu uu-delleenmuodostusaineella, joka valinnaisesti sisältää biologisesti hyväksyttävää kantajaa.

5 Keksintö koskee myös menetelmää NGF:n varastoimiseksi keksinnön mukaisissa vesipitoisissa formulaatioissa lämpötiloissa noin 4 °C:sta noin 40 °C:seen.

Näitä formulaatioita voidaan käyttää menetelmässä her-10 mosolun toimintahäiriön hoitamiseksi ihmisissä, jossa menetelmässä annetaan terapeuttisesti vaikuttava määrä keksinnön mukaista NGF-formulaatiota.

NGF:n stabiilien parenteraalisten annostusmuotojen kehit-15 täminen edellyttää suuren tekijämäärän arviointia, joihin tekijöihin kuuluvat antotapa, adsorptiovuorovaikutukset ja yhteensopivuus prosessointilaitteiston ja mahdollisten an-tovälineiden kanssa. Edelleen on otettava huomioon NGF:n stabiilisuus vesipitoisissa formulaatioissa ympäristön 20 lämpötilaa alemmissa, ympäristön lämpötiloissa ja kohotetuissa lämpötiloissa. Keksinnön mukaisesti saatava vesi-liuoksessa oleva NGF:n formulaatio on stabiili useilla lämpötila-alueilla, ja erityisesti kohotetuissa (ainakin ; .·, noin 40 °C:n) lämpötiloissa. Tämä formulaatio sisältää ; , ’ 25 NGF:n vesiliuosta, suolaa ja puskuria, jonka pH-arvo on ’ , noin 4,5-6,0. Formulaatio voi lisäksi sisältää valinnai- ' ; sesti kantajaa. Tämä aineosien yhdistelmä antaa liuokselle yllättäen hyvin edullisia ominaisuuksia, erityisesti sel-' laisia, jotka liittyvät stabiilisuuteen kohotetuissa läm- 30 pötiloissa. Käyttöön annetaan myös NGF:n formulaatio, joka i sopii lyofilisaatioon. Keksintö antaa käyttöön myös mene- : _ : telmän NGF:n varastoimiseksi.

Tässä käytettynä "biologisesti hyväksyttävä" koskee mate- « · • » ‘I’ 35 riaaleja, joille on tunnusomaista haitallisten biologisten vaikutusten puuttuminen in vivo. "Huoneenlämpötila" on :’\i noin 22 °C:n ja noin 25 °C:n välillä. "Ruumiinlämpötila" on noin 36 °C:n ja noin 40 °C:n välillä. "Lyofilisoitava 7 113241 formulaatio" tarkoittaa NGF:n vesipitoista formulaatiota, joka voidaan pakastekuivata alle 2 %:n kosteuspitoisuuteen ja joka säilyttää ainakin 70 % NGF:n alkuperäisestä biologisesta aktiivisuudesta uudelleenmuodostuksen jälkeen.

5 "Isotoninen" tarkoittaa liuosta, jolla on suunnilleen sama osmoottinen paine kuin veriseerumilla, noin 300 millimoo-lia/litra. "Kantaja" on mikä tahansa biologisesti hyväksyttävä emulgaattori, dispergointiaine, pinta-aktiivinen aine tai proteiini, joka alentaa NGF:n adsorptiota pin-10 taan.

"NGF" tarkoittaa mitä tahansa hermon kasvutekijän muotoa, edullisesti hermon kasvutekijän β-alayksikköä, jolla muodolla on biologista aktiivisuutta ja joka sitoutuu NGF-re-15 septoriin. Termiin NGF sisältyvät myös NGF:n hybridisoidut ja modifioidut muodot, jotka sitoutuvat NGF-reseptoriin ja säilyttävät NGF:n biologisen aktiivisuuden. NGF:n modifioidut muodot voivat käsittää myös fuusioproteiineja, kuten esimerkiksi niitä, jotka on kuvattu artikkeleissa Iwai, 20 S., et ai., Chem. Pharm. Bull., 34: 4724-4730, 1986, ja

Kanaya, E., et ai., Gene, 83: 65-74, 1989, sekä NGF-frag-mentteja ja -hybridejä, joissa tietyt aminohapot on pois-tettu tai korvattu samalla kun terapeuttisen vaikutuksen < f ; ; tuottamiseen riittävä NGF:n biologinen aktiivisuus ja re- i t i ’ 25 septoriin sitoutuminen säilytetään.

> < » * ♦ * » » ’*; Edullinen NGF:n muoto on ihmis-NGF (hNGF) . Edullisin t » i ’;j>* hNGF:n muoto on yhdistelmä-hNGF (rhNGF) . Alan asiantunti- * i * V * jät tuntevat menetelmät sellaisen NGF-.n saamiseksi, joka 30 sopii käytettäväksi tässä esitetyissä formulaatioissa. So-j V piva rhNGF voidaan tuottaa esimerkiksi bakulovirus-il- ; l mentymissysteemillä (Barnett, J., et ai., Exp. Neurol., 110: 11-24, 1990; EPO 370,171), hiivan ilmentymissystee-millä (Kanaya, E., et ai., Gene, 83: 65-74, 1989), nisä-' ;·’ 35 kässolun (CHO) ilmentymissysteemillä (Iwane, M., et ai., ;Biochem. Biophys. Res. Comm., 171: 116-122, 1990) tai COS- ;ilmentymissysteemillä (Bruce, G., et ai., Neurobiol.

• »

Aging, 10: 89-94, 1989). NGF:n tulisi olla ainakin 65%:i- 8 113241 sesti puhdasta; edullisesti ainakin 85%:isesti puhdasta; vielä edullisemmin ainakin 95%:isesti puhdasta; ja edullisimmin ainakin 98%:isesti puhdasta. Formulaatioissa käytettävän eristetyn NGF:n puhtaus voidaan määrittää hopea-5 värjätyllä SDS-PAGElla tai muilla alan asiantuntijoiden tuntemilla menetelmillä.

Käyttöön annetuissa vesipitoisissa NGF-formulaatioissa on terapeuttisesti vaikuttavia määriä NGF:ää. NGF käsittää 10 vesipitoisesta koostumuksesta edullisesti noin 0,0001- 0,125 paino-%, mikä vastaa pitoisuutta noin välillä 1-1250 pg/ml. Edullisemmin NGF:ää on läsnä määränä noin 0,001-0,10 paino-% (10-1000 pg/ml) vesipitoisesta formulaatios-ta. Vielä edullisemmin NGF:ää on läsnä määränä noin 0,01-15 0,10 paino-% (100-1000 pg/ml) vesipitoisesta formulaatios- ta. Edullisimmin NGFrää on läsnä määränä noin 0,01-0,05 paino-% (100-500 pg/ml) vesipitoisesta formulaatiosta.

Vesipitoiset NGF-formulaatiot sisältävät valinnaisesti 20 kantajia. Kantajan läsnäolo formulaatiossa vähentää tai estää NGF:n adsorptiota eri pintoihin. Kantajan tarve riippuu NGF:n konsentraatiosta vesipitoisessa koostumuk-: * sessa. Riittävän korkeissa (yli noin 500 pg/ml) NGF-kon- ·, j sentraatioissa liuokseen jää tarpeeksi NGF:ää korvaamaan , 25 sitä, mikä pinta-adsorption vuoksi häviää. Sopivia kanta- jia ovat, näihin kuitenkaan rajoittumatta, polysorbaatit, . kuten Tween® 80, poloksameerit, kuten Pluronic® F68, ja , , . proteiinit, kuten seerumin albumiini. Edullinen kantaja on proteiini. Ihmisen seerumin albumiini (HSA) on erityisen 30 edullinen. NGF:n painosuhde kantajaan nähden on välillä noin 0,0001:1 - noin 1:1. Edullisempi painosuhde on välillä noin 0,01:1 - noin 1:1. Edullisin NGF:n painosuhde kan-; : tajaan nähden on välillä noin 0,01:1 - noin 0,5:1. Niinpä silloin, kun kantajana käytetään HSA:ta, edullinen HSA:n 35 konsentraatio on noin 0,1-1,25 paino-% (so. 1-12,5 mg/ml) t t ; ‘ vesipitoisesta formulaatiosta. Edullisessa formulaatiossa '· ϊ HSA:ta on noin 0,3-0,7 paino-% vesipitoisesta formulaa tiosta, edullisemmin HSA:ta on noin 0,4-0,6 paino-% vesi- 9 113241 pitoisesta formulaatiosta. Edullisimmassa formulaatiossa HSA:ta on noin 0,5 paino-% (so. 5 mg/ml) vesipitoisesta formulaatiosta.

5 NGF-formulaatio sisältää myös riittävän määrän biologisesti hyväksyttävää suolaa nesteen osmoottisen paineen ylläpitämiseen. Suola vaikuttaa myös NGF:n säilymiseen liuoksessa. Edullisesti NGF-formulaatio sisältää riittävästi suolaa, jotta se olisi isotoninen, fysiologisesti hyväk-10 syttävissä rajoissa, ihmisen veren tai aivo-selkäydinnesteen kanssa. Edullinen suola on natriumkloridi (NaCl), mutta voidaan käyttää muita biologisesti hyväksyttäviä suoloja, kuten kaliumkloridia (KC1), kalsiumkloridia (CaCl2) ja magnesiumkloridia (MgCl2) . Suolana voi olla yk-15 si suola tai suolojen yhdistelmä. Edullinen formulaatio sisältää suolaa noin 0,5-1,0 paino-% (so. 5-10 mg/ml) vesipitoisesta formulaatiosta. Edullisempi formulaatio sisältää suolaa noin 0,6-0,9 paino-% formulaatiosta. Vielä edullisemmin formulaatio sisältää suolaa noin 0,7-0,9 pai-20 no-% vesipitoisesta formulaatiosta. Edullisimmin formulaatio sisältää suolaa noin 0,87 paino-% (so. 8,7 mg/ml) vesipitoisesta formulaatiosta.

1 i I

j NGF-formulaatio sisältää vielä biologisesti hyväksyttävää : 25 puskuria pitämään pH samana varastoinnin aikana. Olemme havainneet NGF:n olevan stabiilimpi alhaisessa pH:ssa. Edullinen stabiili NGF-formulaatio puskuroidaan biologisesti hyväksyttävällä puskurilla pH-arvoon välille noin 4,5-6,0 ja edullisemmin välille 5,0-5,4. Edullisimmin for-: . 30 mulaation pH on noin 5,2. Edullinen puskuri on sitruuna- happo, mutta voidaan kuvitella myös muita puskureita, jot-' ’ ka pystyvät pitämään pH-arvon halutulla alueella. Muita t ' ί#ί : sopivia puskureita ovat etikkahappo/asetaatti ja maleiini- happo/maleaatti. Puskurin edullinen määrä vaihtelee riip- I I f \ 35 puen käytetyn puskurin tyypistä ja sen puskurikapasitee- tista. Formulaatiossa tulisi olla puskuria määränä, joka '· ’· riittää pitämään formulaation lopullisen pH-arvon edulli sella pH-alueella. Puskurin edullinen konsentraatio sta- 10 1 13241 biileihin NGF-formulaatioihin on noin 0,01-0,3 paino-% vesipitoisesta formulaatiosta (0,1-3,0 mg/ml), edullisempi konsentraatio on noin 0,1-0,25 paino-% puskuria vesipitoisesta formulaatiosta (1,0-2,5 mg/ml) ja edullisin puskuri-5 konsentraatio on noin 0,2 paino-% puskuria vesipitoisesta formulaatiosta (2,0 mg/ml).

Formulaatio sisältää vettä riittävän määrän aikaansaamaan formulaation aineosille sopivat konsentraatiot.

10 NGF:n edulliset stabiilit vesipitoiset formulaatiot sisältävät noin 1-1250 pg/ml NGF:ää, 1-12,5 mg/ml HSArta, 5-10 mg/ml NaCl:ää, 0,2-3,0 mg/ml sitruunahappoa ja vettä, ja formulaation pH on säädetty välille noin 4,5-6,0, edulli-15 semmin välille noin 5,0-5,4. Edullisimmat NGF:n stabiilit formulaatiot sisältävät 10-500 pg/ml NGF:ää, 5 mg/ml HSArta, 8,7 mg/ml NaClrää, 2,1 mg/ml sitruunahappoa ja vettä, ja formulaation pH on säädetty arvoon noin 5,2.

20 Keksinnön mukaisesti valmistetut lyofilisoidut formulaatiot ovat erityisen käyttökelpoisia NGF:n pitkän ajanjakson varastoinnin turvaamiseksi, erityisesti kohotetuissa läm- ! ·

Potiloissa. Lyofilisoitavat formulaatiot sisältävät ; : | NGFrää, biologisesti hyväksyttävää täyteainetta, puskuria 25 pitämään formulaation pH-arvo noin välillä 5,5-6,5, valin-naisesti biologisesti hyväksyttävää suolaa, valinnaisesti biologisesti hyväksyttävää vesiliukoista kantajaa ja vettä.

30 NGFrn konsentraatioalue on lyofilisoitavissa formulaa- ; tioissa sama kuin vesipitoisissa formulaatioissa. Täyte- aine antaa tavallisesti mekaanisen tuen, jonka avulla mat- :Y: riisi säilyttää konformaationsa sekä pakastekuivauspro- sessin aikana että sen jälkeen. Täyteaineena voidaan käyt- \ 35 tää yhtä tai useampaa sokeria. Sokereihin kuuluu, tässä ;**, käytettynä, näihin rajoittumatta, monosakkaridit, oligo- * » » ’· sakkaridit ja polysakkaridit. Esimerkkejä sopivista so kereista ovat, näihin rajoittumatta, fruktoosi, glukoosi, u 113241 mannoosi, sorboosi, ksyloosi, maltoosi, laktoosi, sakkaroosi ja dekstraani. Sokereihin sisältyvät myös sokerial-koholit, kuten esimerkiksi mannitoli, sorbitoli, inosito-li, dulsitoli, ksylitoli ja arabitoli. Keksinnön mukaises-5 ti voidaan käyttää myös sokerien seoksia.

Edullinen täyteaine sisältää sokerien yhdistelmää. Edullinen täyteaine on sakkaroosin ja mannitolin yhdistelmä. Sakkaroosin arvellaan, ilman teorian antamaa vahvistusta, 10 muodostavan amorfista lasia pakastuksen ja sen jälkeisen lyofilisoinnin jälkeen, jolloin se kohottaa proteiinin mahdollista stabiilisuutta (esim. estämällä aggregaatiota) muodostamalla jäykkään lasiin NGF:n molekyylidispersion. Myös sokeri voi nostaa stabiilisuutta toimimalla lyofili-15 soinnissa häviävän veden korvikkeena. Sokerimolekyylit pikemmin kuin vesimolekyylit sitoutuvat proteiiniin vetysi-doksin. Kun mannitolia sekoitetaan 1:1 massasuhteessa sakkaroosin (jonka lasittumislämpötila on -36 °C) kanssa, se nostaa formulaation lasittumislämpötilaa 5 °C:lla -31 °C:-20 seen. Tämä lyhentää huomattavasti formulaation pääkuivaus-aikaa lyofilisoinnin aikana mahdollistaen samalla amorfisen, lasisen formulaatiomatriisin muodostumisen, ja sen 1 r · ,.· vuoksi sitä pidetään etuna suuren mittakaavan valmistuksen : j perustamisessa. Toinen tai molemmat näistä sokereista voi- j ·.. 25 daan korvata muilla täyteaineilla, joilla myös on näitä ominaisuuksia.

t

Keksinnön mukaisesti valmistettavilla lyofilisoitavilla formulaatioilla on edullisesti korkeampi pH kuin ei-30 lyofilisoitavilla tai uu-delleenmuodostettavilla formulaa-tioilla. Lyofilisoitavissa formulaatioissa olevat täyteai-' *’ neet (sokerit) ovat tavallisesti stabiilimpia korkeammassa : pH-arvossa. Edullisesti formulaation pH on ennen lyofi- lisointia välillä noin 5,5-6,5. Edullisemmin lyofilisoita- * * ( 35 van NGF-formulaation pH-arvo on välillä noin 5,8-6,2.

» »

Edullisimman lyofilisoitavan NGF-formulaation pH-arvo on

• i I

’ * · noin 6,0. Silloin kun täyteaineena on sakkaroosia, lyofi- lisoitavan formulaation edullinen pH-arvo on noin 6,0, i2 1 13241 koska happamassa pH:ssa sakkaroosi, joka on ei-pelkistävä disakkaridi, hydrolysoituu pelkistäviksi sokereiksi D-fruktoosiksi ja D-glukoosiksi. Sitraatti on edullisin puskuri lyofilisoitaviin NGF-formulaatioihin, mutta voidaan 5 käyttää myös muita biologisesti hyväksyttäviä puskureita, kuten maleaattia. Muut puskurit kuin asetaatti ovat edullisia, koska etikkahapolla on taipumus haihtua lyofi-lisoinnin aikana. On todettava, että lopullisen pH:n säätäminen hapolla tai emäksellä saattaa olla välttämätöntä. 10 Kaikki sellainen hävikki vesipitoisen NGF:n pitkän ajanjakson stabiilisuudessa, joka aiheutuu noin pH-arvoa 6 korkeammasta pH:sta, on todennäköisesti vältettävissä lyo-filisoitavaan NGF:ään liittyvän kohonneen stabiilisuuden ansiosta.

15

Ihannetapauksessa puskurin valinnassa otetaan huomioon lyofilisoinnin aikaiset mahdolliset pH-muutokset, joita aiheuttaa puskurin aineosien peräkkäinen kiteytyminen. Esimerkiksi fosfaattipuskurien yhteydessä emäksisellä kom-20 ponentilla on korkeampi eutektinen piste kuin happamalla komponentilla, näin ollen se kiteytyy ensin ja pH laskee. Sitraattipuskuri on edullinen, koska molemmilla puskuri-,,,·' komponenteilla arvellaan olevan sama eutektinen piste, mi- : kä johtaa hyvin vähäiseen pH:n muutokseen lämpötilan alen- 25 tuessa. Muiden sopivien puskurien komponenteilla tulee ol-la samat tai samankaltaiset eutektiset pisteet.

4 * · t « · > » · ,Lyofilisoitavat formulaatiot sisältävät valinnaisesti myös * · · biologisesti hyväksyttävää suolaa. Suola, joka voi olla :Vi 30 joku vesipitoisissa formulaatioissa käyttökelpoinen suola, on läsnä lyofilisoitavassa formulaatiossa samoin tai alem-pina konsentraatioina kuin vesipitoisissa formulaatioissa.

• I 4 *.‘ 1 Koska suolakonsentraatio saattaa nousta lyofilisoinnin ai- to kana, saattaa olla toivottavaa alentaa lyofilisoitavissa :35 formulaatioissa olevan suolan konsentraatiota proteiinin :*·,· denaturoitumisen estämiseksi. Suolakonsentraation alen-

• I

tamiset lyofilisoitavassa formulaatiossa voidaan kompen- 13 1 13241 soida uudelleenmuodostuksen aikana siten, että lopullinen formulaatio on riittävän isotoninen soveltuakseen annettavaksi yksilölle.

5 Lyofilisoitavat formulaatiot sisältävät valinnaisesti biologisesti hyväksyttävää vesiliukoista kantajaa. Kantajat ja kantajien konsentraatiot, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisissa lyofilisoitavissa formulaatioissa, ovat samoja kuin ne, jotka sopivat käytettäväksi keksinnön mukai-10 sissa vesipitoisissa formulaatioissa.

Edulliset lyofilisoitavat formulaatiot sisältävät noin 1-1250 pg/ml NGF:ää, 15-45 mg/ml sakkaroosia, 15-45 mg/ml mannitolia, valinnaisesti 7-9 mg/ml NaClrää ja 0,1-0,7 15 mg/ml sitruunahappoa pH-arvossa noin 5,5-6,5. Edullisimmat lyofilisoitavat NGF:n formulaatiot sisältävät 100-1250 pg/ml NGF:ää, 30 mg/ml sakkaroosia, 30 mg/ml mannitolia, 5 mg/ml ihmisen seerumin albumiinia, valinnaisesti 8,7 mg/ml NaCl:ää ja 0,3 mg/ml sitruunahappoa. Lyofilisoitavan for-20 mulaation edullisin pH-arvo on noin 6,0.

» ;* Keksinnön mukaisesti valmistettavat lyof ilisoitavat formu- ; : laatiot lyofilisoidaan noin alle 2 %:n jäännöskosteuteen; myös sellaiset formulaatiot ovat kuitenkin mahdollisia, * 25 jotka säilyttävät NGF:n biologisen aktiivisuuden korkeam- » missä tai alemmissa kosteusmäärissä.

Edullinen lyofilisoitu formulaatio sisältää 0,001-1,25 ; ,·' osaa hermon kasvutekijää, 3 0-90 osaa sokeria ja noin alle 30 1 osan vettä.

» » * » * » ,···, Lyofilisoitu NGF-formulaatio muodostetaan uudestaan sel- ·_ laisella laimennusaineella, joka sisältää puskuria, kuten sitruunahappoa, ja suolaa, kuten natriumkloridia, siten ’· 35 kuin tarvitaan, jotta tuloksena saatu uudelleenmuodostettu 14 113241 formulaatio on samanlainen kuin nestemäinen vesipitoinen formulaatio, so. noin 1-1250 pg/ml NGF:ää, 1-12,5 mg/ml HSA:ta, 5-10 mg/ml NaCl:ää, 0,2-3,0 mg/ml sitruunahappoa, 1,5-30 mg/ml sakkaroosia ja 1,5-30 mg/ml mannitolia, pH-5 arvo 5,2.

Keksinnön mukaisesti valmistettu lyofilisoitu NGF-formulaatio on käyttökelpoinen myös pakkauksen osana, jolloin saadaan helppo ja taloudellinen keino antaa käyttöön 10 stabiili lyofilisoitu NGF muodossa, joka voidaan nopeasti ja helposti muodostaa uudelleen tarkoituksenmukaisessa apuaineessa hoidon tarpeessa olevalle potilaalle antoa varten. Pakkaukset sisältävät lyofilisoidun NGF-formulaation lisäksi myös uudelleenmuodostusaineen. Uudel-15 leenmuodostusaine käsittää steriiliä vettä ja riittävän määrän suolaa, jotta lopullinen uudelleen muodostettu formulaatio on pääosin isotooninen. Edelleen uudelleenmuo-dostusaine voi sisältää lisäksi puskuria. Pakkauksessa olevan uudelleenmuodostusaineen kokonaistilavuuden tulee 20 olla riittävä, jotta saadaan hoidon tarpeessa olevalle henkilölle annettavaksi sopiva lopullinen NGF-konsentraatio. Pakkaus sisältää edullisesti kaksi pientä • : lasipulloa. Toinen lasipullo sisältää steriiliä lyofili- soitua NGF-formulaatiota, ja toinen lasipullo sisältää 25 steriiliä uudelleenmuodostusainetta. Pakkauksen käyttöä varten sopiva määrä uudelleenmuodostusainetta siirretään • siihen lasipulloon, joka sisältää lyofilisoitua NGF- formulaatiota. Lyofilisoidun formulaation laimentamisen jälkeen uudelleen muodostettua formulaatiota voidaan antaa 30 välittömästi potilaalle.

* * Tällaisen uudelleen muodostetun formulaation pitkäaikaisen stabiilisuuden vuoksi on myös mahdollista valmistaa uudel-leen muodostettua formulaatiota riittävästi useiden annos-'· ’! 35 ten saantia varten.

is 113241

Keksinnön mukaisesti valmistetut formulaatiot ovat käyttökelpoisia hoitamaan yksilöitä, joiden tilat ovat alttiita NGF-hoidolle. Tyypillisesti sellaiset formulaatiot ovat steriilejä ja sopivat intravenoosiseen, intramuskulaari-5 seen, parenteraaliseen tai intraserebroventrikulaariseen antoon. Sellainen terapia saattaa olla hyödyllistä hoitamaan hermosolujen toimintahäiriöitä, joihin kuuluu hermosoluvaurio tai NGF:lie reagoivien neuronien rappeutuminen. NGF saattaa olla erityisen käyttökelpoinen hoitamaan 10 sairautta, joka aiheutuu keskeisten kolinergisten neuronien häviämisestä, kuten esimerkiksi Alzheimerin tauti. EP-patentissa 0 370 171 kuvataan NGF Alzheimerin taudin ja muiden dementiamuotojen hoitona.

15 Näitä formulaatioita voidaan antaa dementian hoitoon millä tahansa monista eri tavoista spesifisestä loppukäytöstä riippuen. Sopivin tapa riippuu käytöstä ja ko. kohteesta.

Veri-aivoesteen aiheuttamien vaikeuksien voittamiseksi NGF 20 voidaan antaa keskushermostoon välittömillä intraventri-kulaarisilla injektioilla tai lääkkeellä täytettyjen implanttien tai pumppujen välityksellä. Eräs antotapa on » : jatkuva infuusio intraserebroventrikulaarisen johtoputki- laitteiston välityksellä. Vaihtoehtoisesti NGF:n konjugaa- ♦ 25 tio kantajamolekyylien, kuten transferriinin, kanssa saat-taa olla välttämätöntä veri-aivoesteen läpäisemiseksi.

t · • · NGF:n terapeuttisesti vaikuttavan määrän oletetaan olevan ; V noin 0,001-0,5 mg päivässä, edullisesti noin 0,01-0,10 mg 30 päivässä, edullisimmin noin 0,02-0,06 mg päivässä. Täsmäl-linen annos ja anto-ohjeet riippuvat monista tekijöistä, ,··. kuten esimerkiksi antotavasta ja hoitoa saavan yksilön ·_ sairauden asteesta.

« t « f I » 16 113241

MÄÄRITYSMENETELMÄT

NGF:n identifiointi ja kvantitatiivinen määritys käänteis-faasi-HPLC:tä käyttämällä 5 NGF identifioitiin ja määritettiin kvantitatiivisesti analysoimalla 100 μ1:η näytteet käänteisfaasi-HPLC:llä (Hewlett Packard HP 1090 Liquid Chromatograph), joka oli varustettu 4-6 mm x 25 cm L Dynamax (Rainin Instrument Co., Woburn, MA, USA) 300 Ä 5 μιη analyyttisellä käänteis-10 faasipylväällä, jossa oli Dynamax 300 Ä 5 μι 4,6 m x 1,5 cm suojapylväs (guard column) ja diodiantenni-UV-ilmaisu-laite 220 nm:ssä. Liikkuvat faasit olivat (A) 0,l%:inen trifluorietikkahappo vedessä ja (B) 0,l%:inen trifluori-etikkahappo asetonitriilissä, jossa gradientit muuttuivat 15 25%:isesta (B) 60%:iseen (B) 45 minuutissa virtausnopeudella 0,5 ml/min 1700-2000 psi:n paineessa ympäristön lämpötilassa.

NGF:n identifiointi varmistettiin vertaamalla sen reten-20 tioaikaa näytteessä juuri valmistettujen kalibroitujen standardien NGF-liuosten, jotka oli tehty samasta erästä peräisin olevasta NGFtstä, vastaavan retentioajan kanssa. Näytteissä oleva NGF:n kvantitatiivinen määrä laskettiin vertaamalla standardikäyrään, joka oli saatu tunnettujen • 25 konsentraatioiden sarjalaimennuksilla.

NGF-konsentraation (Mg/ml) määritys ELISA-menetelmällä

Myös NGF-konsentraatiot määritettiin ELISA-menetelmällä.

' 30 Sekä standardit että näytteet määritettiin kolmena kappa leena. Jokainen levy sisälsi NGF:n täydellisen standardi-käyrän sekä vertailukohdat ilman NGF:ää.

Kun 100 μΐ kiinnitysvasta-aineita (hiiren monoklonaalinen 35 24C1, muodostettu rhNGF:ää vastaan) oli lisätty jokaiseen _·] · 9 6-koloisen määrityslevyn koloon, levyt käärittiin Saran- !,. kääreeseen kostean paperipyyheliinan kanssa ja inkuboitiin 113241 17 yli yön jäähdyttimessä 2-8 °C:ssa. Kolot tyhjennettiin, pestiin 3 kertaa käyttämällä Wheatonin itsetäyttyvää ruisku järjestelmää jakamaan 250 μΐ/kolo pesupuskuria (joka sisälsi 500 mM Tris-puskuria, 2 M natriumkloridia, puskuroi-5 tu pH-arvoon 7), ja naputeltiin kuiviksi. Tämän jälkeen 200 μΐ estopuskuria (l%:inen naudan seerumin albumiiniliu-os) lisättiin jokaiseen koloon estämään ei-spesifisiä kohtia, 50 μΐ näytettä lisättiin jokaiseen koloon ja levyjä inkuboitiin vähintään 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 10 samalla sekoittaen tasoravistimella (platform shaker). Kolot tyhjennettiin jälleen ja naputeltiin kuiviksi ja lisättiin 50 μΐ standardi- ja näyteliuoksia. Sitten levyt peitettiin ja niitä inkuboitiin kahden tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Levyn kolot tyhjennettiin jälleen, pes-15 tiin neljä kertaa pesupuskurilla ja naputeltiin kuiviksi. Jokaiseen koloon lisättiin 50 μΐ biotinoitua vasta-ainetta (hiiren monoklonaalinen 8C1, muodostettu rh-NGF:ää vastaan) , levyt peitettiin ja niitä inkuboitiin kahden tunnin ajan. Levyjen kolot tyhjennettiin, pestiin ja kuivattiin, 20 kuten edellä on kuvattu, ja jokaiseen koloon lisättiin 50 μΐ piparjuuriperoksidaasikonjugoitua streptavidiiniä. Levyt peitettiin ja niitä inkuboitiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa samalla sekoittaen tasoravistimella. Le-vyt pestiin viisi kertaa pesupuskurilla. Sen jälkeen, kun ·.: 25 jokaiseen koloon oli lisätty 50 μΐ ortofenyleenidiamiini- : ·. (OPD) -substraattipuskuria, levyt peitettiin ja niitä in- . kuboitiin pimeässä yhden tunnin ajan.

,·. Kunkin kolon absorbanssin määrittämiseen käytettiin Vmax 30 Kinetic Microplate (Molecular Devices, Mountain View) -lukijaa. Kunkin kolon kohdalla tausta-absorbanssi 650 nm:ssä vähennettiin huippuabsorbanssista 450 nmtssä, jolloin saatiin nettoabsorbanssi. Näytteissä oleva NGF:n konsentraa-•:· tio määritettiin NGF:n standardikäyrään vertaamalla.

35 18 113241 NGF-aktiivisuuden määrittäminen NGF:n biologinen aktiivisuus määritettiin PC-12-biomääri-tyksellä. PC-12-biomääritys perustuu PC-12-feokromosytoo-5 masolujen kohonneeseen metaboliseen aktiivisuuteen (Greene, Trends Neurosci. 7: 91, 1986) NGFrlle altistuksen jälkeen. PC-12-solujen metabolinen aktiivisuus mitattiin 3-[4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli]-2,5-difenyylitetratsolium-bromidin (C18H16N5Br) (MTT) soluun otosta, jonka yhdisteen 10 solun dehydrogenaasi muuttaa liukenemattomiksi solunsisäi-siksi sinisiksi kiteiksi.

Kukin 96-koloisen levyn kolo sisälsi noin 30 000 PC-12-solua 50 ^l:ssa RPMI-1640-elatusainetta (Sigma). Kunkin 15 näytteen sarjalaimennukset ja standardit valmistettiin, jotta saatiin liuokset, joissa oli 0,006-400 ng rhNGF:ää millilitrassa RPMI-1640-elatusainetta ja 0,2 % naudan seerumin albumiinia (BSA). Sen jälkeen jokaiseen koloon lisättiin 50 μΐ kutakin liuosta, jolloin saatiin konsentraa-20 tiot 0,003-200 ng NGF/ml, ja jokainen konsentraatio määritettiin kolmena kappaleena. Sen jälkeen, kun levyjä oli pidetty 2 päivän ajan 5%:isessa C02:ssa 37 °C:ssa, jokaiseen koloon lisättiin 10 μg MTT:tä ja levyjä inkuboitiin vielä 4 tunnin ajan. Sitten lisättiin yksi tilavuusosa : : 25 20%:ista SDSrää 50%:isessa dimetyyliformamidissa (DMF), pH

4,7, ja levyt käärittiin sellofaaniin, suljettiin muovi-pussien sisälle ja inkuboitiin yli yön 37 °C:ssa. Levyt tulkittiin seuraavana päivänä käyttämällä Vmax-levynluki-,·.· jalaitetta 575 nm:ssä. Näytteen käyrän ED50:n suhde NGF- 30 standardikäyrän ED50-arvoon antaa mitan kahden valmisteen suhteellisille vaikutustehoille.

ESIMERKKI 1 NGF-formulaatio V 35

Valmistettiin vesipitoiset formulaatiot, jotka sisälsivät 1, 10, 100 ja 1000 μg/ml rhNGF:ää, 5 mg/ml HSA:ta, 8,7 19 113241 mg/ml natriumkloridia ja 2,1 mg/ml sitruunahappoa sekä riittävän määrän vettä muodostamaan 10 ml:n formulaatio, joka oli puskuroitu pH-arvoon 5,2. Sen jälkeen, kun sitruunahappo ja suola olivat liuenneet noin 70 %:iin koko-5 naistilavuudesta, pH säädettiin käyttämällä NaOH/HCl, ja HSA ja NGF lisättiin varovaisesti sekoittaen, ja vettä lisättiin lopullisen tilavuuden muodostamiseksi, ja formulaatio suodatettiin 0,2 μιη:η Millipore Millex-GV-suodat-timen läpi.

10

Formulaatioiden valmistamiseen käytetty rhNGF ilmennettiin hyönteissoluissa käyttämällä bakulovirusperäistä ilmenty-misvektoria ja puhdistettiin ioninvaihto- ja käänteisfaa-sikromatografiällä, kuten ovat kuvanneet Barnett, J. et 15 ai., Exp. Neurol.. 110: 11-24, 1990.

ESIMERKKI 2 NGF-formulaatioiden stabiilisuus 5 °C:ssa ja 25 °C:ssa 20 250 μ1:η erät esimerkin 1 mukaista 100 /xg/ml sisältävää NGF-formulaatiota varastoitiin 5 °C:ssa ja 25 °C:ssa (huoneenlämpötila) polyeteenitippapulloissa (drop-tip vials) 6 kuukauteen asti. Näiden näytteiden RP-HPLC, ELISA- ja bio-• määritysanalyysit (kuvattu edellä) eivät osoittaneet pro- : 25 teiinin häviämistä 6 kuukauden aikana (taulukko l).

Taulukko 1. NGF:n stabiilisuus 5 °C:ssa ja 25 °C:ssa RP-, HPLC:llä, ELISAlla ja PC-12-biomäärityksellä mitattuna.

; ; Biomääritys 3 0 Varastointi- RP- RP-HPLC RP-HPLC RP-HPLC RP-HPLC ELISA suhteellinen lämpötila HPLC %LSt %LSt %LSt %LSt %LSt vaikutusteho (°C) %LSt 2 viikkoa 3 kk 4 kk 6 kk 6 kk 6 kk 1 viikko 5 °C__99 ± 2 99 ± 6 96 ± 4 100 ±3 101 ± 3 100 ± 6 106 ± 14 , ,' Huoneen *: · 35 lämpötila (22-25 °C) 99 ± 2 91 ± 5 95 ± 5 103 ± 3 99 ± 5 104 ± 13 123 ± 3 i · ) t 20 113241 t%LS = % tutkittavan aineen vahvuus = [NGFHesti [NGFjkontrolli % suhteellinen vaikutusteho = Testiformulaation aktiivisuus 5 Kontrollin aktiivisuus (RP-HPLC-luvut edustavat 2-4 toistokokeen keskiarvoa ± keskihajonta. Biomääritysluvut edustavat 3 määrityksen keskiarvoa ± 95 %:n luottamusvälit.) 10 ESIMERKKI 3

Polyeteenikatetreissa säilytettyjen eri NGF-formulaatioi-den stabiilisuus 37 °C:ssa 15 250 μ1:η erät esimerkissä 1 kuvatulla tavalla saatuja NGF- formulaatioita, jotka sisälsivät 1-1000 Mg/ml rhNGFiää, varastoitiin röntgensäteitä läpäiseviin polyeteenikatet-reihin (sisähalkaisija 0,76 mm (0,030 tuumaa) ja ulkohal-kaisija 1,23 mm (0,048 tuumaa)) 37 °C:ssa 4 viikkoon asti. 20 Tulokset, kuten taulukossa 2 esitetään, eivät osoittaneet proteiinipitoisuuden (RP-HPLC:llä mitattuna) tai NGF-ak-tiivisuuden (PC-12-biomäärityksellä mitattuna) merkittävää häviämistä.

25 Taulukko 2. Polyeteenikatetreissa säilytetyn NGF-formulaa-; tion stabiilisuus 37 °C:ssa RP-HPLC:llä ja PC-12-biomääri- ; ,* tyksellä määritettynä.

! [NGFJ ajankohdas- %LSt 1 viikko %LSt 2 viikkoa %LSt 4 viikkoa % suhteellinen vai- *., , sa nolla RP-HPLC RP-HPLC RP-HPLC kutus:teho, 4 viikkoa *, 3 0 (/yg/ml) PC-12 biomääritys s v » t i — " ' ;;; hO__104 ± 3__87 ± 6__85 + 3__101 ± 34_ 10.0 __94 ± 14__92 ± 4__100 ± 1__118 ± 45_ 100.0 __102 ± 4__95 ± 2__95 ± 2__129 ±34_ 35 1000,0__107 ± 2__92 ± 4__86 ± 3__108 ± 33_ t%LS = % tutkittavan aineen vahvuus = [NGFltesti , .1 [NGFjkontrolli * ; ‘ 40 % suhteellinen vaikutusteho = Testiformulaation aktiivisuus

Kontrollin aktiivisuus f i 21 113241 (RP-HPLC-luvut edustavat 2-4 toistokokeen keskiarvoa ± keskihajonta. Biomääritysluvut edustavat 3 määrityksen keskiarvoa ± 95 %:n luottamusvälit.) 5 ESIMERKKI 4 NGF-formulaation stabiilisuus eri antolaitteissa

Esimerkin 1 mukaisen 100 βg/^al sisältävän NGF-formulaation näytteet täytettiin joko implantoitavaan infuusiopumppuun 10 Infusaid Model 600 (Shiley-Infusaid Inc., Norwood, MA), implantoitavaan infuusiopumppuun Medtronics Synchromed (Medtronics Inc., Minneapolis, MN) tai osmoottiseen mini-infuusiopumppuun Alzet Model 2ML 4 (Alza Corp., Palo Aito, Kalifornia). Pumput pantiin 37 °C:n vesihauteeseen ja for-15 mulaation virtaus pumpusta aloitettiin. Viikottaiset näytteet otettiin 4 viikon aikana ja niistä analysoitiin proteiinipitoisuus ja aktiivisuus RP-HPLC:llä, ELISAlla ja PC-12-biomäärityksellä.

20 Tiedot taulukossa 3 osoittavat, että merkittävää laskua NGF-konsentraatiossa tai aktiivisuudessa ei havaittu.

Taulukko 3. NGF-formulaatioiden stabiilisuus eri antolaitteissa 37 °C:ssa 1 kuukauden ajan.

: 25

Antojärjestel- %LSt 1 LSt 2 viikkoa LSt 4 viikkoa LSt 4 viikkoa % suhteellinen mä viikko RP-HPLC RP-HPLC ELISA vaikutusteho RP-HPLC 4 viikkoa • biomääritys

Infusaid 91 ± 3 101 ± 3 112 ± 4 90 ± 11 100 + 36 , . Model 600 ' 30 implantoitava pumppu

Medtronics 109 ± 2 92 ± 2 91 ± 3 97 ± 4 90 ± 6

Synchromed implantoitava 3 5 pumppu , ;.: Alzet 2ML4 96 ± 3 95 ± 7 90 ± 5 n.d. n.d.

osmoottinen minipumppu 22 113241 t%LS = % tutkittavan aineen vahvuus = fNGFltesti [NGF]kontrolli % suhteellinen vaikutusteho = Testiformulaation aktiivisuus 5 Kontrollin aktiivisuus (RP-HPLC-luvut edustavat 2-4 toistokokeen keskiarvoa ± keskihajonta. Biomääritysluvut edustavat 3 määrityksen keskiarvoa ± 95 %:n luottamusvälit.) 10 n.d. = ei määritetty ESIMERKKI 5 NGF-formulaatioiden stabiilisuustutkimukset pH-arvoissa 4-15 10

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettiin pH-arvoon 4-10 puskuroidut vesipitoiset formulaatiot, jotka sisälsivät 100 Mg/ml NGF:ää, 1 mg/ml HSA:ta ja 9 mg/ml natriumkloridia, 20 ja steriilisuodatettiin 0,2 /ra:n suodattimen läpi (Millex-GV; Millipore Corp.). Formulaatiot, joiden pH-arvo oli 4-5, puskuroitiin asetaatilla, ja formulaatiot, joiden pH-arvo oli 6-10, puskuroitiin Tris-puskurilla. Yhden milli-litran näytteet siirrettiin polypropeenitippapulloihin, 25 joita inkuboitiin sitten joko huoneenlämpötilassa (23-25 °C) tai 37 °C:ssa. Näytteet otettiin eri ajankohtina ja analysoitiin RP-HPLC:llä. Ensimmäisen asteen reaktiono-peusvakiot, jotka edustivat NGF:n häviämistä liuoksesta, merkittiin pH:n funktiona. NGF:n hajoamisnopeuksien ha-30 valttiin liuoksessa nousevan pH-arvoissa, jotka olivat alle noin 4,5 ja yli noin 6,0. Korkein stabiilisuus esiintyi pH-arvossa 5,2.

ESIMERKKI 6 35 NGF-formulaatioiden stabiilisuus kantajakonsentraation funktiona

Kantajien tyyppi ja määrä tutkittiin vaikutuksen määrittä-miseksi NGF-stabiilisuuteen. Valmistettiin esimerkissä 1 23 113241 kuvattu 100 Mg/ml sisältävä vesipitoinen formulaatio ja vesipitoiset formulaatiot, jotka sisälsivät muita kantajia, ja ne luetellaan taulukossa 4. Jokainen formulaatio steriilisuodatettiin 0,2 μηι:η Millipore Millex-GV-suodat-5 timen läpi. NGF:n stabiilisuus eri formulaatioissa määritettiin inkuboimalla NGF-formulaatioita 37 °C:ssa polypro-peenitippupulloissa. Näytteet otettiin 2 viikon kuluttua ja niistä analysoitiin proteiinipitoisuus RP-HPLC:llä.

10 Taulukko 4. Kahden viikon ajan 37 °C:ssa inkuboitujen eri NGF-formulaatioiden stabiilisuus.

Täyteaine Määrä (% w/v) % LS 2 viikossa 15 Gelatiini 1,0 64 ± 9

Ihmisen seerumin albumiini 0,1 48 ± 7

Ihmisen seerumin albumiini 0,5 99 ± 2

Ihmisen seerumin albumiini 1,0 31 ± 36

Tween 80 0,2 77 ± 9 20 Pluronic F-68 0,02 65 ± 5 [NGF]testi % LS = Tutkittavan aineen vahvuus (%) _ (% Label Strength) [NGF]kontrolli 25 (RP-HPLC-luvut edustavat 2-4 toistokokeen keskiarvoa ± keskihajonta.) ESIMERKKI 7 30 NGF-formulaatio lyofilisointia varten

Valmistettiin huoneenlämpötilassa vesipitoinen NGF-formu-laatio, joka sisältää 100 μg/ml NGF:ää, 30 mg/ml sakkaroosia, 30 mg/ml mannitolia, 5 mg/ml HSA:ta ja 0,3 mg/ml sit-35 ruunahappoa, säädettynä pH-arvoon 6,0 NaOH:lla. Sen jälkeen, kun sitruunahappo ja sokerit olivat liuenneet noin 70 %:iin kokonaistilavuudesta, pH säädettiin ja HSA ja NGF

24 113241 lisättiin varovaisesti sekoittaen, ja vettä lisättiin riittävästi lopullisen tilavuuden muodostamiseksi.

ESIMERKKI 8 5 NGP-formulaation lyofilisointi

Tutkittiin vesipitoisen NGF:n lyofilisaatiostabiilisuus esimerkin 7 mukaisessa formulaatiossa. Yhden ml:n erät NGF-formulaatioita, jotka oli valmistettu esimerkin 7 mu-10 kaisesti, pantiin 5 ml:n tyypin I lasipulloihin, jotka oli suljettu lyofilisointitulpilla. Formulaatiota sisältävät pullot pantiin pakastekuivauskammioon (FTS Systems Inc.), joka oli tasapainotettu 5 °C:ssa ennen pakastuksen aloittamista. Sitten kammion lämpötila laskettiin -40 °C:seen. 15 Kun kammiota oli pidetty 2 tunnin ajan -40 °C:ssa, se tyhjennettiin ja paine säädettiin 80-100 millitorriin typpi-puhalluksella. Lämpötilaa nostettiin 4 °C tunnissa, kunnes saavutettiin lopullinen 25 °C:n kuivauslämpötila. Tuotteen lopullinen 1-2 %:n välinen kosteuspitoisuus saavutettiin 20 noin 30 tuntia jakson (alkamisesta).

Pakastekuivattu jauhe varastoitiin 5 °C:ssa ja uudelleen-muodostettiin huoneenlämpötilassa 3 päivän kuluttua 1 ml:11a laimennusainetta, joka koostui 8,7 mg/ml natrium-25 kloridista ja 1,1 mg/ml sitruunahaposta, puskuroitu pH- arvoon 5,2. Näytteistä analysoitiin NGF-konsentraatio RP-• ’ HPLC:llä. Proteiinin häviämistä ei havaittu lyofilisoinnin jälkeen.

'·'/ 30 ESIMERKKI 9

Lasiputkissa 2-8 °C:ssa varastoidun NGF-formulaation stabiili suustutkimukset

Valmistettiin vesipitoiset formulaatiot, jotka sisälsivät 35 100 tai 1000 Mg/ml rhNGF:ää, esimerkin 1 mukaista menetel- '·. mää käyttämällä paitsi että eräkoko nostettiin 1,5 lit- \ · raan. 4,2 ml:n erät pantiin tyypin I piilasipulloihin, 25 113241 joissa oli teflonpäällysteiset butyylikumitulpat, ja varastoitiin 2-8 °C:ssa. Tulokset, jotka esitetään jäljempänä taulukossa 5, eivät osoita proteiinipitoisuuden (RP-HPLC: llä ja ELISAlla mitattuna) tai NGF-aktiivisuuden (PC-5 12-biomäärityksellä mitattuna) merkittävää häviämistä.

Taulukko 5. 2-8 °C:ssa varastoidun NGF-formulaation stabiilisuus RP-HPLC:llä, ELISAlla ja PC-12-biomäärityksellä mitattuna.

10 _ RP-HPLC RP-HPLC ELISA PC-biomääritys % LSf % LSj % LSf % LSf

Nimellis[NGF] Alku 12 kk 12 kk 12 kk 15 100 Mg/ml 103 ± 1 101 ± 1 102 ± 3 102 ± 15 1000 /xg/ml 102 ± 1 101 ± 1 108 ± 3 102 ± 20 [NGF] testin aikana 20 % LSf = % tutkittavan aineen vahvuus = _ (% Label Strength) alku-[NGF] NGF:n identifiointi ja kvantitatiivinen määritys käyttä-25 mällä käänteisfaasi-HPLC:tä Tässä esimerkissä 9 käytettiin seuraavaa menetelmää: NGF identifioitiin ja määritettiin kvantitatiivisesti analysoimalla 100 μ1:η näytteet käänteisfaasi-HPLC:llä 30 (Hewlett Packard HP 1090-nestekromatografi), joka oli v varustettu 4-6 mm x 250 mm (kolonnilla), Bakerbond Wide-

Pore Butyl (C4) 300 Ä:n huokoskoko (J.T. Baker Inc. Phil-lipsburg NJ, USA), ja diodiantenni-UV-ilmaisulaitteella 210 nmtssä. Liikkuvat faasit olivat (A) 0,2%:inen trifluo-, 35 rietikkahappo vedessä ja (B) 60%:inen asetonitriili pus kurissa (A), jossa gradientit muuttuivat 29%:isesta (B) 75%:iseen (B) 65 minuutissa virtausnopeudella 1,0 ml/min 110 bar paineessa ympäristön lämpötilassa.

26 113241 Tämän jälkeen käytettiin menetelmää, joka on kuvattu kappaleessa MÄÄRITYSMENETELMÄT HPLC-kohdassa.

Claims (11)

1. 27 113 2 41
2. 1. Menetelmä hermon kasvutekijän stabiloimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä sekoitetaan: 5 (a) hermon kasvutekijää, (b) biologisesti hyväksyttävää suolaa, jota on läsnä riittävä määrä ylläpitämään isotonisuuden, (c) puskuria, jota on läsnä riittävä määrä ylläpitämään saatavan formulaation pH välillä noin 4,5 - noin 6,0 10 ja (d) vettä; edellyttäen, että formulaatio ei sisällä vesiliukoista polysakkaridia .
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että formulaatioon lisätään vielä biologisesti hyväksyttävää vesiliukoista kantajaa.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että menetelmässä sekoitetaan (a) hermon kasvutekijää, joka käsittää noin 0,0001 - noin ’ 0,125 paino-% saatavasta vesipitoisesta formulaa- > * tiosta; (b) kantajaa, joka käsittää noin 0,1 - noin 1,25 paino-% 25 saatavasta vesipitoisesta formulaatiosta; (c) suolaa, joka käsittää noin 0,5 - noin 1,0 paino-% saatavasta vesipitoisesta formulaatiosta; ja (d) puskuria, jota on läsnä riittävä määrä ylläpitämään saatavan vesipitoisen formulaation pH välillä noin * t » . 3 0 4,5 - noin 6,0.
5. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tun- : nettu siitä, että pH on noin 5,0 - noin 5,4. 113241
6. 5. Jonkin patenttivaatimuksista 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä sekoitetaan 10-500 yg NGF:ää, 5 mg/ml HSA:ta, 8,7 mg/ml NaCl:ää, 2,1 mg/ml sitruunahappoa ja vettä, ja säädetään saatavan formulaation pH arvoon noin 5 5,2.
7. 6. Menetelmä hermon kasvutekijän pitkäaikaiseksi varastoimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä lyofilisoidaan vesipitoinen koostumus, joka sisältää 10 (a) 1-1250 yg/ml hermon kasvutekijää; (b) 30-90 mg/ml biologisesti hyväksyttävää täyteainetta; (c) puskuria riittävänä määränä ylläpitämään formulaation pH välillä noin 5,5 - noin 6,5; ja (d) vettä. 15
8. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täyteaineena on sokeri.
9. 8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu 20 siitä, että täyteaine sisältää sakkaroosin ja mannitolin ’’ seosta, puskuri on sitraatti, ja formulaation pH on noin 5,8 ,, ’ - noin 6,2.
10. 9. Patenttivaatimuksen 6, 7 tai 8 mukainen menetelmä, tun- !!!_ 25 nettu siitä, että kosteuspitoisuus on alennettu alle noin 2 % :n. t · *·, 10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii- > tä, että menetelmässä lyofilisoidaan 0,001-1,25 osaa hermon i 30 kasvutekijää, 30-90 osaa sokeria ja vähemmän kuin noin 1 osan vettä. i 5 113241
11. 11. Jonkin patenttivaatimuksista 6-10 mukainen menetelmä, jossa lyofilisoitava koostumus lisäksi sisältää biologisesti hyväksyttävää vesiliukoista kantajaa.