PL154026B1

PL154026B1 - Method of obtaining derivativies of methylene dioxyphenanthrene

Info

Publication number: PL154026B1
Application number: PL1986268178A
Authority: PL
Priority date: 1985-08-28
Filing date: 1986-08-27
Publication date: 1991-06-28
Also published as: NO863434L; AT398568B; NO863434D0; YU147586A; ZA866487B; YU43998B; GB8619644D0; DD266800A5; HU895304D0; SE8603589D0; IE59239B1; AR242568A1; MX3550A; GB2179347B; US4835178A; PL148757B1; DK168705B1; DE3530718A1; SU1731053A3; FR2586681A1

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	OPIS PATENTOWY	154 026
Patent dodatkowy do patentu nr---	Int. Cl⁵ C07D 317/70
0	Zgłoszono: 86 08 27 /P. 268178,/ Pierwszeństwo: 85 08 28 Republika Federalna Niemiec	CYTEiEl
URZĄD PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 88 10 13	3 GÓHU
RP	Opis patentowy opublikowano: 1991 11 29

Twórca wynalazku —-Uprawniony z patentu: Madaus Akkiengesellschaft,

Klonia /Republika Federalna Niemiec/

SPOSOB WYTWHRZNIA PO CHO CN YCH METYLEiODIOKSYFENANTRENU

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych metylenodioksyfenantrenu.

Jako środki immunnotyrnulujące w profilaktyce i leczeniu chorób zakaźnych znane są kwasy Arlstolochia /kokoraak/ o wzorze 3 /R = H,OCH₃/, które wykazują działanie zwiększające fagocytozę i przeciwwirusowe i zwiększają rezultaty leczenia w ogólnych zakażeniach, a także mogą być aplikowane z powodzeniem do leczenia zapaleń ropnych i owrzodzeń.

A badaniach farmakologicznych w wyższych zakresach dawek stwierdzono jednak niedawno zwyrodnienie komórkowe w żołądku szczura tak, że pojawia się potrzeba zachowania powśśiągliwosci w podawaniu tych, samych w sobie bardzo cennych, substancji czynnych.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że związki o ogólnym wzorze 1, w którym oznacza atom wodoru, hydroksyl, grupę metoksy albo etoksy, a R3 i R< razem tworzą aromatyczne wiązanie C-C, nawet przy bardzo wysokim dozowaniu /w porównaniu z przyjętą w leczeniu człowieka dawką 1-10 /ig/kg/ u szczurów /10 mggkg/ nie powod^a, ani makroskopowo ani histologicznie, oznak przerostu nabłonka płaskiego. Nie stwierdzono tak samo efektów powod^ących mua^aję.

Nadają się one bardzo dobrze do profilaktyki i leczenia chorób zakaźnych, ponieważ wykazują one działanie zwiększające fagocytozę i przeciwwirusowe.

Z tych związków znany Jest wprawddie l-karboksy-3,4~metylenodilksy-8-metlksyfenantren z J.Nat. Products 46 /1983/ 507 i następne, o który® donosi się, że w dawkach 90 mg/kg /u kró lika/ działa poronnie i w dawkach 60 mg/kg /u rnyzj^,/ powstrzymuje inplantację. Jego działania immunnltyιnululącego nie było można się według tego domyśśaó. Autorzy zastosowali metodę denitrowania nitrozwiązku za pomocą borowodorku sodowego w 1% wodnym roztworze amoniaku, jednak w tej metodzie powstają kompleksowe mieszaniny substancji, bowiem w przypadku zastosowania środków redukujących o niższym potencjale redukcyjnym niż dla wielosiarczku i w innych warunkach, niż według niniejszego wynalazku, grupa nitrowa zostaje tylko częściowo rozszczepiona i pozostają trudne do rozdzielenia mieszaniny substancji wyjściowej i produktu końcowego.

154 026

Nieoczekiwanie okazało się, że przy zastosowaniu sposobu według niniejszego wynalazku, w którym denitrowanie przeprowadza się w słabo alkalCznnyo roztworze wodnym za pomocą wielosiarczku, otrzymuje się związki jednolite, nie osiągalne dotychczas w świetle znanego stanu techniki.

Według wynalazku pochodne metylenodioksyienantrenu o ogólnym wzorze 1, w którym R, Rg i R mają wyżej podane znaczenie, oraz loh farmaceutycznie dopuszczalne sole, otrzymuje się w ten sposób, że nitrozwiązek o wzorze 2, w którym R oznacza wodór albo grupę 0CH₃, denitruje się w słabo alkalicznym roztworze wodnym za pomooą wielosiarczku, korzystnie wielosiarczku a^t^nu, do związku o wzorze 1 i Jeśli R oznacza OCR, przekształca się w razie potrzeby grupę OCHg przez rozszczepianie eterowe, w grupę OH.

Do dezitrowanla jako wielosiarczek stosuje się korzystnie wielosiarozek amonowy w słabo alkalizznym roztworze wodnym.

Związek 8-metoksy- lub 8-etoksyfenantrenu /Rg 1 R3 tworzą razem aromatyczne wiązanie C-C-; Rj oznacza grupę metoksy albo etoksy/ można przeprowadzić przez rozszczepianie eterowe w odpowwednie związki 8-hydroksylowe, np. przez hydrolizę za pomocą chlorowodorku pirydyny.

Związki, otraymane sposobem według wynalazku służą do zwiększenia obrony przed zakażeniem. Powodują one znaczne uaktywnnenle fagocytozy leukocytów. Zwwązki otrzymane sposobem według wynalazku nadają się dlatego do leozenia ogólnych zakażeń, np. przez prątki kwasoodporne albo pneumokoki i do leczenia zakażeń miejscowych. Związki otrzymane sposobem według wynalazku można również stosować, Jeśli występuje depresja fagocytozy, np. po zastosowaniu kortykosterydów albo oytostatyków. Przez zastosowanie związków otrzymanych sposobem według wynalazku moina ponownie znormalizować depresję fagocytozy.

Poza tym znaleziono działanie przeoiwwlrusowe związków otrzymonyoh sposobem według wynalazku.

Związki otrzymane sposobem według wynalazku zbadano między innymi pod względem ich działania uaktywnnającego histiooyty. Jako parametrem posłużono się stymulacją monocytów 1 histiocytów w jamie brzusznej myszy.

Dla przedstawienia chemotaktycznego wohodzenia monocytów do Jawy brzusznej i różnicowania monocytów do hlsttocytów o zwiększonej zdolności do fagocytozy celowa jest aplikacja śródotreewiOwa substancji próbnej.

Stymulacja jest prooesem, który wymaga określonego czasu. Badanie aktywności fagocytozy przeprowadzono dlatego jako zwykły wzorzec farmakologiczny po trzydnoowym traktowaniu wstępnym myszy za pomooą związków otrzymanych sposobem według wynalazku. V kilku grupach próbnych pobrano bezpośrednio po podaniu substancji śródttΓZiwntwą populację komórkową, aby wykazać, że obserwowana stymulacja wystąpiła dopiero po pewnym okresie wylęgania.

Substancje 1 maatriały.

Badane substancje rozpuszczono w wodzie 0,5 m&Zml i rozcieńczono według potrzeby.

NRCl-tris-bufor:

NH4C1 : 8,5 g/1

Tris ftri8-^hh^ddooksyme^tylo/aaminomet^an^j : ^4,119 g^/2°° ml; p^H » ^7,65 mieszanina : 1 część tris + 9 części NRCl, nastawić na pH 7,2 za pomocą 2 N HC1

PBS/BSA

40,0	g	NaCl
1,0	g	KC1	napełnić R0 do 5
7,2	g	^2^04x2^0	pH = 7,4
1,0	g	kh₂po₄

+ 0,2 g BSA = albumina, serum wołu /Sigma, nr A-9647/ na 100 ml PBS

DMEM = zmodyfikowane przez D^ubecco środowisko Eegle z L-glutaminą bez czerwieni fenolowej /Gibco; Cat nr 041-1885;/

154 026 + 5% FCS lub ♦ 5% FCS ♦ 0,2% heparyny.

FCS = płodowa surowica cielęca /Gibco, Cat nr 011-6290/.

Roztwór May-Griuiwald^ modyfikowany /Merck, Art. 1424/.

Krew barania nr 5, 30.08.84, UPI Freiburg.

Surowica odpornościowa zawierająca przeciwciała - baranie krwinki czerwone - surowica odpornościowa królkków nr 308, IKA 468/6-11 dni; 18.07.78, UPI Freiburg.

Zwierzęta doświadczalne.

Badania przeprowadzono z zastosowaniem 18-tygodniowyoh żeńskich mieszańców myszy /Balb/ cxC57B16/ Fl. Z^ke^i^izęta przed rozpoczęciem doświadczenia dostosowano w ciągu 5 dni do warunków laboratoryjnych. Otrzymywały one tablekkowaną karmę znormalizowaną dla szczurów i myszy /Altromln nr 1324/ i wodę wodociągową ad llbUim. Badano je za pomooą wzorca tiomerkaptooctanu na trzy zdolności stymulowania histlocyóów i wykazały one przy tym dobre reakoje pozytywne.

Dawkowtuide 1 aplikacja.

Substancje aplkkowano w roztworze wodnym /0,5 mg/ml/ w następujących dawkach: dootrzewnowo: 20 mc&/kg

500 mc&/kg 5 mg/kg.

Rooleńczenie roztworu macierzystego do aplikacji różnych dawek wynooiło przy 20 mejg/kg i mog/ml

500 nog/kg 25 mcfg/ml mg/kg 250 mog/ml, z tego każdorazowo 0,4 ml.

Schemat aplikacji.

grupa * 5 myszy

Traktowanie wstępne:

a/ 3 aplikacje w 3 kolejnyoh dniach; w czwartym dniu uzyskanie histlieyóów b/ aplikacja bezpośrednio przed uzyskiwaniem histoocytów.

Otrzymywanie zawiesiny komórkowej hisHocytów i fagocytozy.

Zasada próby.

Po aplikacji immluololicznie uaktywnnających substancji stymuluje się w zwierzętach doświadczalnych histiocyty i pobudza montjcyty dla różnicowania w histiocytach. Wyyóónicowane, stymulowane histiocyty są w stanie również po wyizolowaniu fagocytować in vltm z odpowiednimi przeciwciałem! opsoninowane struktury antygenu, w tym przypadku erytrocyty baranie.Fagliytowaoe erytrocyty m^^na rozpoznać mikroskopowo.

Przeprowaddenne.

Po odpowiednim traktowaniu uśmierca się myszy przez złamanie kręgów szyjnych.

Odsłania się otrzewną i aplikuje dootrzewnowe 4 ml DMEM /5% płodowej surowicy cieląt, 0,2% heparyny/. Po około 30 sekundach masażu odciąga się 3 ml zawiesiny komórkowej za pomocą strzykawki i w rurze ^polipropylenowej wprowadza si^ę do kąpieli. ^Uodzą^j /0^oC/. ^{Z ka}żd^ej grupy próbnej wzięto Jedną mysz do oznaczenia stężenia komórek w wysięku; ustalono w przybliżeniu stężenie otoło 4 x 1°^ kmńóek/ml.

Izolowanie przyrośniętych hiitlocytów:

Histiocyty i monocyty selekcjonuje się z wyodrębnionej populacji komórek w ten sposób, że przeprowadza się ich wylęganie na szkiełkach przykrywkowych; histiocyty i monocyty zrastają przy tym, inne komórki nie. W naczynkach hodowlanych o 24 miseczkach /polistyren, firma ιl:nlesziza się okrągłe szkiełka przykrywkowe i przewarstwia 0,25 ml DMEM

154 026 /z 5% płodowej surowicy cieląt,/. Dla równomiernego rozdzielenia komórek umieszcza się naczynka na wstrząsaroe i do każdego wsadu, przy jednoczesnym wstrząsaniu /5 min. około 200 obrotów na minutę/ pipetuje się 0,25 ml zawiesiny komórek. Następnie poddaje się naczynka hodowlane tkanki inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C i przy 8% tttj w ciepiarce. Po inkubacji odsącza się nie przyrośnięte komórki, następnie przemywa dwukrronie za pomocą 0,25 ml DMEM /plus 5% płodowej surowicy cieląt/.

Przysposabianie do fagocytozy baranich krwinek czerwonych.

ml krwi baraniej przemywa się dwukrotnie za pomocą 4 ml PBS/BSA /odwirowanie, 10 minut przy około 500 x g. Przemytą krew rozcieńcza się 1:50 za pomocą FBS/BSA. Surowicę odpornościową zawierającą przeciwciała przeciw baranim krwinkom czernionym rozcieńcza się za pomocą PBS/BSA 1:200. Rzcieńczoną krew baranią i rozcieńczoną surowicę odpornościową zawierającą przeciwciała łączy się 1:1 i poddaje inkubacji w ciągu 1,5 godziny przy chronionym wstrząsaniu /około 80 obrotów na

Fagocytoza.

Do każdej miseczki naczynek hodowlanych tkanki ze zrośniętymi histiocytami na szkiełkach przykrywkowych pipetuje się 0,5 ml przysposobionej do fagocytozy zawiesiny krwinek czerwonych. Naczynka poddaje się inkubacji w ciągu 20 minut w temperaturze 37°C i przy 8% (X>2· Następnie odsącza się nadmiar krwinek czerwonych i szkiełka przykrywkowe przemywa się dwukkronle za pomocą DMEM /0,5% FC/,

W celu rozpuszczenia nie fagocytowanyoh krwinek czerwonych traktuje się je każdorazowo za pomocą i ml NHHCl-trrs-buforu /oznaczono czas oddziaływania 3,75 minut jako odpowiednn/. Po odsączeniu buforu przemyto szkiełka przykrywkowe dwukrotnie za pomooą PBS/BSA.

Opis fagocytozy /metoda barwienia/.

Po fagocytozie zabarwia się histiocyty według Pappenheim*a kombinowaną metodą toy-Grimwald-Giemsa. Barwwenie przeprowadza się w miseczkach naczynek hodowlanych tkanki.

- 5 min May-Grllnwald stęż., odsączyć

- 3 min podwóónie destytowana HgO, nastawiona za pomocą H^POc min 85% na pH 7,O;odsączyć

- 9 min roztwór Giemsa rozcieńczono 1:40 i odsączony przed użyciem; odsączyć

- przemyć dodatkowo wodą destylowaną z tryskawki.

Jądra komórek są po barwieniu czerwonsOioletowe, zaródź komórkowa jasnoniebieska. Fagocytowane krwinki czerwone można rozpoznać jako bladoróżowe. Po wysuszeniu na powwetrzu przykleja się preparaty mikroskopowe za pomooą ^ηΕυΚΐΐ’η^η na szkiełkach przedmiotowych /3 preparaty /mysz/.

Ocena mikroskopowa.

Z trzech preparatów mikroskopowych Jednej myszy obliczono dwa. Zastosowano mikroskop

Zeiss’a przy 1000-kroSnom powwększeniu i imersji olejowe,]. Trzeci preparat stosowano, gdy wynik z dwóch preparatów nic był jednoznaczny. Na preparat obliczono 300 komórek i w zależności od aktywności fagocytozy podzielono na klasy o rosnącej liczbie krwinek czerwonych,/ histiocyt.

Klasa	Krwinki czerwots//istiocct
1	0
2	1
3	2
4	3
5	4
6	5
7	6
8	7
9	8
10	9
11 12	¹⁰ x/ 11-20^x/

^X/ZD^o Zliczeń przyjęto^, że przy ^c 11 ^krwine^k czeiwon^ych /hi^stiooyt rozdział w klasie 12 wykazuje środek ciężkości około 12 krwinek czerwonch/biesiccyt. Histiocyty klasy 12 występowały stosιslkowt rzadko.

154 026

Opracowanie danych i przedstawienie graficzne.

Obliczenie preparatów mikroskopowych wykonano na urządzeniu liczącym WaNG LVP 2200 ze spe cjalnym progresem wejściowym, który pozwalał na oddzielne ujęcie klas licibowych. Uśrednianie poszczególnych danych przeprowadzono za pomocą programu MA 1, przedstawienia graficzne za pomocą programu NPL.

Efekt stymulacji dla każdej substancji próbnej przedstawiono dwoma sposobami:

1. Rzdzlał histoocyóów na klasy /krwinki izerwoce/hi^tiocyt/ w %, w odniesieniu do 300 komórek jako 100%. Wohoozl przy tym również do przedstawienia graficznego liczba histlocytów, które nie fagocytowały żadnej krwinki czerwonej.

2. Rozddiał fagocytowanych krwinek czerwonych /icezba NPH w jednej klasie z liczba krwinek czerwfonych/MPH/ na klasy w %, w odniesieniu do ogólnej liczby fagocytowanych krwinek czerwonych jako 100%. Przy tym liczba histoocytów, które nie fagocytowały żadnej krwinki czerwonej, pozostaje nleuwzględniona.

Parametr.

Jako parametr stymuuacji históocytów rozpatrywano wzrost aktywności fagohytizy, wyrażony Jako liczba fagocytowanych krwinek czerwonych na histiocyt /=klasa/. Stymiui^cja przejawia się w spadku histćooytów, które nie fagocytowały wcale albo niewole krwinek czerwonych i we wzroście histćocyóów z większą liczbą krwinek czerwonych.

gyniki.

StymMacja /PH przez l-karboksy-3,4-metyltnodioksy-8·.metoksyfenantren /i.p./.

Fig. 1 : 3 x 20 mcg/kg i.p.

Stymuuacja /PH po 3 dniach /z - SE/.

Fig. la/ - Rozdział 300 komórek na klasy 1 do 12 w %.

Fig. lb/ - Rtzdział fagocytowanych krwinek czerwonych na klasy 1 do 12 w %.

Tablioa I

3x20 mcjg/kg i.p.

Stymuuacja /PH po 3 dniach a/ Rzdział 300 komórek na klasy 1 do 12%

Tablica la
n	klasa	mysz 1	mysz 2	mysz 3	mysz 4	x-śred- dnio	SD	SE	MD
1	1.00	75.67	71.33	66.50	72.17	71.417	3.777	1.889	71.750
2	2.00	12.67	17.00	20.00	15.50	16.292	3.056	1.528	16.250
3	3.00	6.83	6.17	8.67	7.67	7.333	1.080	0.540	7.250
4	4.00	2.17	3.33	3.50	2.50	2.875	0.644	0.322	2.917
5	5.00	0.67	1.67	1.17	1.17	1.167	0.408	0.204	1.167
6	6.00	1.33	0.17	0.17	0.17	0.458	0.593	0.292	0.167
7	7.00	0.17	0.33	0.00	0.50	0.250	0.215	0.108	0.250
8	8.00	0.00	0.00	0.00	0.17	0.042	0.083	0.042	0.000
9	9.00	0.17	0.00	0.00	0.00	0.042	0.083	0.042	0.000
10	10.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.000	0.000	0.000	0.000
11	11.00	0.33	0.00	0.00	0.17	0.125	0.160	0.080	0.033
12	12.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.000	0.000	0.000	0.000

154 026 b/ Rzdział fagocytonanych krwinek czerwonych na klasy 1 do 12%

Tablica Ib
n	klasa	mysz 1	mysz 2	^sz 3	mysz 4	x-śred- dnio	SD	SE	MD
1	1.00	0.0	0.0	0.0	0.0	0.00	0.00	0.00	0.00 ;
2	2.00	26.5	34.8	37.5	31.2	32.50	4.77	2.38	33.01 ;
3	3.00	28.6	25.3	32.5	30.9	29.30	3.14	1.57	29.72
4	4.00	13.6	20.5	19.7	15.1	17.21	3.39	1.69	17.39
5	5.00	5.6	13.7	8.8	9.4	9.34	3.32	1.66	9.07
6	6.00	13.9	1.7	1.6	1.7	4.72	6.14	3.07	1.69
7	7.00	2.1	4.1	0.0	6.0	3.06	2.60	1.30	3.09
8	8.00	0.0	0.0	0.0	2.3	0.59	1.17	0.59	0.00
9	9.00	2.8	0.0	0.0	0.0	0.70	1.39	0.70	0.00
10	10.00	0.0	0.0	0.0	0.0	0.00	0.00	0.00	0.00
11	11.00	7.0	0.0	0.0	3.4	2.58	3.33	1.66	1.68
12	12.00	0.0	0.0	0.0	0.0	0.00	0.00	0.00	0.00

Fig. 2: 5 z 500 mcg/kg i.p.

Stymulacja MPH po 3 dniach /x - SEM.

Fig. 2a/ - Rzddiał 300 komórek na klasy 1 do 12 * %.

Fig, 2b/ - Rzdział fagocytonanych krwinek czerwonych na klasy 1 do 12 w %.

Tablica II z 500 mojg/kg i.p.

Stymulacja MFH po 3 dniach a/ Rzddiał 300 komórek na klasy 1 do 12 w %

Tablica Iia
n	klasa	mysz 1	mysz 2	mysz 3	mysz 4	mysz 5	x-śred- nio	SD	SŁ	MD
1	1.00	63.00	52.83	53.83	47.33	51.33	53.667	5.775	2.583	52.833
2	2.00	13.90	19.67	20.50	17.83	15.67	17.333	3.053	1.365	17.833
3	3.00	8.00	11.83	13.33	16.00	12.17	12.267	2.893	1.294	12.167
4	4.00	5.00	6.00	5.83	7.83	8.67	6.667	1.523	0.681	6.000
5	5.00	4.33	3.33	3.00	5.00	5.50	4.333	0.979	0.438	4.333
6	6.00	2.83	2.83	1.33	2.50	2.67	2.433	0.630	0.282	2.667
7	7.00	1.17	1.33	0.83	1.17	2.17	1.333	0.500	0.224	1.167
8	8.00	0.83	0.50	0.50	0.83	0.50	0.633	0.183	0.082	0.500
9	9.00	1.17	0.67	0.17	1.00	0.67	0.733	0.384	0.172	0.667
10	10.00	0.00	0.17	0.33	0.00	0.00	0.100	0.149	0.067	0.000
11	11.00	0.67	0.33	0.17	0.50	0.50	0.433	0.190	0.085	0.500
12	12.00	0.00	0.00	0.17	0.00	0.17	0.067	0.091	0.041	0.000

154 026 b/ Rozdział fagocytowanych krwinek czerwonych na klasy 1 do 12 w %

Tablica Ilb
n	klasa	mysz 1	mysz 2	mysz 3	mysz 4	mysz 5	z-śred- nlo	SD	SE	MD
1	1.00	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.00	0.00	0.00	0.00
2	2.00	12.5	17.5	20.3	13.5	11.9	15.15	3.60	1.61	13.54
3	3.00	15.3	21.0	26.4	24.3	18.5	21.11	4.41	1.97	21.04
4	4.00	14.4	16.0	17.3	17.8	19.8	17.06	2.02	0.90	17.30
5	5.00	16.6	13.6	11.9	15.2	16.7	14.80	2.07	0.93	15.19
6	6.00	13.6	12.6	6.6	9.5	10.1	10.48	2.75	1.23	10.14
7	7.00	6.7	7.1	4.9	5.3	9.9	6.79	1.95	0.87	6.71
8	8.00	5.6	3.1	3.5	4.4	2.7	3.85	1.17	0.52	3.46
9	9.00	8.9	4.7	1.3	6.1	4.1	5.03	2.79	1.25	4.74
10	10.00	0.0	1.3	3.0	0.0	0.0	0.86	1.31	0.59	0.00
11	11.00	6.4	3.0	1.6	5.8	3.8	3.72	1.73	0.77	3.80
12	12.00	0.0	0.0	3.3	0.0	2.5	1.17	1.62	0.72	0.00

Fig. 3: 3 z 5 mg/kg i.p.

Stymulacja MPH po 3 dniach /z - SEM.

Fig. 3a/ - Rodział 300 komórek na klasy 1 do 12 w 4.

Fig. 3b/ - Rzddiał fagocytowanych krwinek czerwonych na klasy i do 12 w S.

T a b 1 i o a III z 3 mg/kg i.p.

Stymulacja MPH po 3 dniach a/ Rzdział 300 komórek na klasy 1 do 12 w %

Tablica III a
n	klasa	mysz 1	mrsz 2	mysz 3	nysz 4	mysz 5	z-óred- nio	SD	SE	MD
1	1.00	69.33	50.33	52.17	49.50	56.17	55.500	S.149	3.644	52.167
2	2.00	9.33	16.17	18.00	23.33	22.17	17.900	5.381	2.406	18.000
3	3.00	8.00	12.17	11.50	14.67	11.17	11.500	2.389	1.06S	11.500
4	4.00	4.S3	7.17	5.83	6.50	5.33	5.933	0.925	0.414	5.833
5	5.00	2.83	6.00	5.17	2.67	3.00	3.933	1.539	0.6S8	3.000
6	6.00	2.00	2.33	4.17	1.83	1,67	2.400	1.018	0.455	2.000
7	7.00	0.67	2.67	1.33	0.50	0.17	1.067	0.990	0.443	0.667
8	8.00	0.67	1.00	0.00	0.33	0.00	0.400	0.435	0.194	0.333
9	9.00	0.67	1.17	0.83	0.17	0.17	0.600	0.435	0.194	0.667
10	10.00	0.33	0.17	0.50	0.17	0.17	0.267	0.149	0.067	0.167
11	11.00	0.17	0.67	0.17	0.17	0.00	0.233	0.253	0.113	0.167
12	12.00	0.67	0.17	0.33	0.17	0.00	0.267	0.253	0.113	0.167

154 026 b/ Rozddiał fagocy tonanj ch krwinek czerwonych na klasy 1 do 12 w J

Tablica III b
n	klasa	mysz 1	DySZ 2	mysz 3	mysz 4	mysz 5	x-śred- nio	SD	SE	MD
1	1.00	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.00	0.00	0.00	0.00
2	2.00	10.5	11.4	14.1	22.2	26.2	16.88	6.94	3.10	14.12
3	3.00	17.1	17.2	18.0	27.9	26.4	21.32	5.35	2.39	18.04
4	4.00	15.5	15.2	13.7	18.5	18.9	16.37	2.25	1.01	15.48
5	5.00	12.1	17.0	16.2	10.1	14.2	13.92	2.83	1.27	14.17
6	6.00	10.7	8.2	16.3	8.7	.9.8	10.76	3.26	1.46	9.84
7	7.00	4.3	11.3	6.3	2.9	1.2	5.18	3.90	1.75	4.27
8	8.00	5.0	4.9	0.0	2.2	0.0	2.43	2.49	1.11	2.22
9	9.00	5.7	6.6	5.2	1.3	1.6	4.07	2.47	1.11	5.23
10	10.00	3.2	1.1	3.5	1.4	1.8	2.20	1.10	0.49	1.77
11	11.00	1.8	4.7	1.3	1.6	0.0	1.88	1.73	0.77	1.58
12	12.00	14.2	2.4	5.2	3.2	0.0	5.00	5.49	2.46	3.17

Zależność dawki efektu stymulacji.

Grupy kontrolne po podaniu i.p. lub p.o. fizjologccznego roztworu NaCl wykazują, że sama aplikacja i.p. powodiUe już słabą aktywizację histoocytów. Wyyoka zawartość histoocytów fagocytowała dwie krwinki czerwone.

Wzzaatanie bistoocytćw z więcej niż dwoma krwinkami ozerwonyml należy zatem interpretować jako działanie eub8tωtcJi. Sumę % krwinek czerwonych od 4 klasy /hlstiooyty z 3 krwinkami czerwonymi i więoej/ przedstawiono dlatego w relaoji do dawki.

Fig.4: Zależność sumy % krwinek czerwonych od 4 klasy i powyżej od dawki po podaniu i.p. 20 mcg, 500 mcg i 5 mg/kg. Kontrola wynosi 45% i 6% /x i SEM. Na rysunku zakres - SEM przy wartości średniej podany Jest przez linię przerywaną.

Tablioa IV

Zależność od dawki w stymiuf^cji bistoocytów po podaniu i.p. x = dawka /mcg/kg/ y = suma % fagocytowanych krwinek czerwonych

SEM = błąd standardowy środków

nr	wartości x	wartości y	wartości SE	N
1	20.0000	38.2000	2.7800	4
2	500.0000	63.7600	3.3200	5
3	5000.0000	61.8000	5.41200	5

Ocena.

Substancja powoduje wzrost aktywowcoiia históocytów z 38% przy 20 mc{g/kg do 64% przy 500 mcMkg. Dalsze zwiększenie dawki do 5 mg/kg prowadzi do nieznacznego osłabienia slyna^eci. Uaktywnnanie histoocytów przebiega w wybranym zakresie dozowania nieMnoowo.

Grupa próbna, którą zaaplkkowano przed uzyskaniem histo^yti^ jednorazowo dootrzewnowo wykazała, że obseraowane efekty występują tylko po okresie inkuba^ i. Ten wynik wskazuje na to, że substancja in vivo indukowała w histiocytach mechanizmy odpootwedzialne za wzrost fagocytozy.

154 026

To «skazuje na następujące efekty:

1. Stymulacja szybkości internalizowania błony

2. zwiększenie gęstości receptorów Fo i/albo

3. zwląkszenie ruchliwości receptorów C 3b.

Inne związki otrzymane sposobem według wynalazku wymazują porównywalne działanie farmakologiczne. Działanie zostało potwierdzone za pomocą innych moddli farmakologicznych oraz klinicznie.

Następujący przykład wyjaśnia sposób wytwarzania związków według wynalazku.

Przykład. Wytwwrranla l-karbok8y-3,4-mltylenodilksy-8-metoksy-fenantrenu przez redukcję grupy nitrowej.

g kwasu Aristllolhia o wzorze 2 rozpuszcza się w 1500 ml 1-procentowego wodnego roztworu węglanu sodu i następnie sączy do kolby o pojemności 5 1.

Do tego klarownego roztworu soli dodaje się 1500 ml handlowego roztworu wielosiarczku amonu. Mieszaninę miesza się w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej /wyciągi/ 1 przechowuje zamkkiętą w ciągu nocy. Następnie dodaje się 1500 ml odmineralizowanej wody i zakwasza się kroplami przy Jednoczesnym mieszaniu za pomocą około 500 ml stężonego kwasu solnego mieszaninę reakcyjną. Powstający przy tym strącony produkt odsącza się i przemywa dodatkowo wodą. Fazę wodną ekstrahuje się za pomocą 1500 ml octanu etylu. Tę fazę octanu etylu daje się do wyn^eszenia produktu strącania 1 powtarza następnie dwuUoolnie wyn^dz^nie każdorazowo z 1500 ml octanu etylu. Fazy organiczne łączy się i przemywa dwutorowe każdorazowo za pomocą 500 ml wody. Następnie ekstrahuje się roztwór w octanie etylu czterokrotnie każdorazowo za pomocą 750 ml 2-polcentosegl wodnego ługu sodowego. Fazę organiczną odrzuca się, a alkaϋο^ς^ιιοά^ roztwór nastawia się za pomocą stężonego kwasu solnego na pH 4-5 i następnie znów wytrząsa się czterokrotnie każdorazowo z 100 ml octanu etylu. Połączone fazy organiczne przemywa się trzykrotnie każdorazowo za pomocą 750 ml wody. Przemytą fazę organiczną suszy się nad siarczanem sodu 1 następnie doprowadza się, po sączeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, do sucha /temperatura kąpieli około 30°C/. Wyyajność: 3,1 g; temperatura topnienia: 285°C /rozkład/. W celu oczyszczenia przekrystalizowuje się substancję z octanu etylu.

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania pochodnych melyllnlailksyfeiantrenu o ogólnym Morze 1, w którym oznacza atom wodoru, hydroksyl, grupę metoksy albo etoksy, a Ł, i R3 razem tworzą aromatyczne wiązanie C-C, oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, przez denitrowanle ietrozwiązku za pomooą środka redukującego, znamienny tym, że iitrozseązek o wzorze 2, w którym Rj oznacza wodór albo grupę OCH,*, denKr^e się w słabo alkalie^ym roztworze wodnym za pomocą wielosiarczku, korzystnie wielosiarczku amonu, do związku o wzorze 1 i w przypadku, gdy Rt oznacza grupę 0CH3, lseniuaanil tę grupę 0CH3, przez rozszczepianie eterowe, przekształca się w grupę OH.

COOH h₂c:

NO2

Rl

WZÓR 2

WZÓR 3

COOH

WZÓR 1

154 026

KLASA

154 026

KLASA

154 026

MPH/ KLASA w %

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

Cena 3000 zł