Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania pochodnych metylenodioksyfenan- trenu.Jako srodki immunostymulujace w profilaktyce i leczeniu chorób zakaznych znane sa kwasy Aristolochia /kokornak/ o wzorze 6 /R1=H, OCH^/, które wykazuja dzialanie zwiek¬ szajace fagocytoze i przeciwwirusowe i zwiekszaja rezultaty leczenia w ogólnych zakaze¬ niach a takze moga byc aplikowane z powodzeniem do leczenia zapalen ropnych i owrzodzen.W badaniach farmakologicznych w wyzszych zakresach dawek stwierdzono jednak niedaw¬ no zwyrodnienie komórkowe w zoladku szczura tak, ze pojawia sie potrzeba zachowania pow¬ sciagliwosci w podawaniu tych, samych w sobie bardzo cennych substancji czynnych.Nieoczekiwanie stwierdzono, ze zwiazki fenantrenu o ogólnym wzorze 1, w którym R^ oznacza atom wodoru, grupe metoksy, etoksy albo hydroksyl, nawet przy bardzo wysokim dozowaniu /w porównaniu z przyjeta w leczeniu czlowieka dawka 1-10 /Ug/kg/ u szczurów 10 mg/kg/ nie wykazaly ani makroskopowo, ani histologicznie oznak przerostu nablonka plaskiego. Nie stwierdzono tak samo efektów powodujacych mutacje.Nadaja sie one bardzo dobrze do profilaktyki i leczenia chorób zakaznych, poniewaz wykazuja one dzialanie zwiekszajace fagocytoze i przeciwwirusowe.Z tych zwiazków znany jest wprawdzie l-karboksy-3,4-metylenodioksy-8-metoksyfenan- tren z J.Nat.Products 46 /1983/ 507 i nastepne, o którym donosi sie, ze w dawkach 90 mg/kg/ /u królika/ dziala poronnie i w dawkach 60 mg/kg /u myszy/ powstrzymuje implan- tacje. Jego dzialanie immunostymulujacego nie bylo mozna sie wedlug tego domyslac.Kwas Aristolochia znaleziono w ekstraktach Aristolochia indica L w mniejszych ilos¬ ciach. S.Mukkopadhy, S.Funayama, G.A.Gordell, H.S. Fong w Journal of Natural Products, 46, 507 /19£3/ opisuja ekstrakty rosliny Aristolochia indica, zawierajace kwas aristo- 148 7572 148 757 liowy oraz Jego ester metylowy w Ilosciach niewystarczajacych do badan biologicznych.Zbadano mozliwosc przeprowadzenia kwasu aristolochiowego w kwas aristoliowy za pomoca borowodorku sodu. Calkowita synteza zwiazku o ogólnym wzorze 1 nie Jest dotychczas znana.Zwiazki o ogólnym wzorze 1 wytwarza sie wedlug wynalazku w ten sposób, ze bromek 6-bromopiperonylowy o wzorze 2 poddaje sie reakcji z trójfenylofosfina w bezwodnym roz¬ puszczalniku do bromku 6-bromopiperonylotróJfenylofoafoniowego o wzorze 3, ten ostatni zwiazek poddaje sie reakcji z benzaldehydem, O-metoksybenzaldehydem albo orto-etoksy- benzaldehydem w obecnosci silnej zasady do pochodnej l-bromo-3,4-metylenodioksystylbenu o wzorze 4, w którym R, oznacza H, OCH- albo OC^H^, powyzszy bromek stylbenu przez napro¬ mieniowanie nadfioletowe przeprowadza sie w pochodna fenantrenu o wzorze 5 i ten zwiazek za pomoca cyjanku metalu, w szczególnosci cyjanku miedzi, w polarnym aprotycznym roz¬ puszczalniku, w szczególnosci w dwumetyloformamidzie, przeksztalca sie w odpowiedni ni¬ tryl i ten przez hydrolize przeprowadza sie w kwas o wzorze 1, lub powyzszy bromek fe- nantrenu za pomoca n-butylolitu i dwutlenku wegla przeprowadza sie w kwas o wzorze 1 i ewentualnie zwiazek o wzorze 1, w którym R1 oznacza grupe OCH~, przez rozszczepianie eterowe przeksztalca sie w zwiazek, w którym R-, oznacza hydroksyl.Przy bromowaniu alkoholu piperonylowego jako niskoalkilowy kwas karboksylowy sto¬ suje sie korzystnie kwac octowy.Przy wytwarzaniu soli fosfoniowej jako bezwodny rozpuszczalnik stosuje sie np. ben¬ zen albo alkllobenzen, korzystnie toluen albo ksylen.Przy kondensacji soli fosfoniowej jako silna zasade stosuje sie np. alkoholan meta¬ lu alkalicznego, korzystnie metanolan litu. Otrzymany w ten sposób stylben wystepuje w 85 % w postaci Z i w 15 % w postaci E. Obydwa izomery rozdziela sie przez obróbke ete¬ rem etylowym. Zwiazek trans przechodzi do eteru; zadany zwiazek cis pozostaje nierozpusz- czony.Przy napromieniowaniu nadfioletowym bromku stylbenu obróbke przeprowadza sie np. w mieszaninie rozpuszczalników zlozonej z absolutnego 1,2,3,4-czterowodoro-9-fluorenonu i absolutnego cykloheksanu w stosunku np. 1:12 z dodatkiem jodu i doplywem azotu.Zwiazek 8-metoksy- lub 8-atoksyfenantrenu mozna przeprowadzic przez rozszczepianie eterowe w odpowiednie zwiazki 8-hydroksylowe, np. przez hydrolize za pomoca chlorowodor¬ ku pirydyny.Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku sluza do zwiekszenia obrony przed zaka¬ zeniem. Powoduja one znaczne uaktywnienie fagocytozy leukocytów. Zwiazki otrzymane sposo¬ bem wedlug wynalazku nadaja sie dlatego do leczenia ogólnych zakazen, np. przez pratki kwasoodporne albo pneumokoki i do leczenia zakazen miejscowych. Zwiazki otrzymane sposo¬ bem wedlug wynalazku mozna równiez stosowac, jesli wystepuje depresja fagocytozy, np. po zastosowaniu kortykosterydów albo cytostatyków. Przez zastosowanie zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku mozna ponownie znormalizowac depresje fagocytozy. Poza tym znaleziono dzialanie przeciwwirusowe zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku.Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku zbadano miedzy innymi pod wzgledem ich dzialania uaktywniajacego histiocyty. Jako parametrem posluzono sie stymulacja monocytów i histiocytów w jamie brzusznej myszy.Dla przedstawienia chemotaktycznego wchodzenia monocytów do jamy brzusznej i róznico¬ wania monocytów do histiocytów o zwiekszonej zdolnosci do fagocytozy celowa jest aplika¬ cja sródotrzewnowa substancji próbnej.Stymulacja jest procesem, który wymaga okreslonego czasu. Badanie aktywnosci fagocy¬ tozy przeprowadzono dlatego jako zwykly wzorzec farmakologiczny po trzydniowym traktowa¬ niu wstepnym myszy za pomoca zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku. W kilku gru¬ pach próbnych pobrano bezposrednio po podaniu substancji sródotrzewnowa populacje komór¬ kowa, aby wykazac, ze obserwowana stymulacja wystapila dopiero po pewnym okresie wyle¬ gania.Substancje i materialy. Badane substancje rozpuszczono w wodzie 0,5 mg/ml i rozcien¬ czono wedlug potrzeby.148 757 3 NH^Cl-tris-bufor: 4 NH4C1 : 8, 3 g/l Tris ^~tris-/hydroksymetylo/- -aminometan7 : 4,119 g/200 ml; pH = 7,65 mieszanina : 1 czesc tris + 9 czesci NH,C1, nastawic na pH 7,2 za pomoca 2 N HC1.PBS/BSA 40,0 g NaCl 1,0 g KC1 napelnic H20 do 5 1, 7,2 g Na2HP04x2H20 pH = 7,4 1,0 g KH2P04 + 0,2 g BSA = albumina, serum wolu /Sigma, nr A-9647/ na 100 ml PBS.DMEM = zmodyfikowane przez Dulbecco srodowisko Eegle z L-glutamina bez czerwieni fe¬ nolowej /Gibco nr 041-1885/ ? 5 % FCS lub + 5 % FCS + 0,2 % heparyny.FCS = plodowa surowica cieleca /Gibco, Cat nr 011-6290/.Roztwór May-Grunwald#a modyfikowany /taerek, Art. 1424/.Krew barania nr 5, 30.08.84, MPI Freiburg.Surowica odpornosciowa zawierajaca przeciwciala - baranie krwinki czerwone - surowica odpornosciowa królików nr 308, IKA 468/6-11 dni; 18.07.78, MPI Freiburg.Zwierzeta doswiadczalne. Badania przeprowadzono z zastosowaniem 18-tygodniowych zen¬ skich mieszanców myszy /Balb/cxC57B16/ FI. Zwierzeta przed rozpoczeciem doswiadczenia do¬ stosowano w ciagu 5 dni do warunków laboratoryjnych. Otrzymywaly one tabletkowana karme znormalizowana dla szczurów i myszy /Altromin nr 1324/ i wode wodociagowa ad libitum. Ba¬ dano je za pomoca wzorca tiomerkaptooctanu na trzy zdolnosci stymulowania histiocytów i wykazaly one przy tym dobre reakcje pozytywne.Dawkowanie i aplikacja. Substancje aplikowano w roztworze wodnym /O,5 mg/ml/ w naste¬ pujacych dawkach: dootrzewnowo: 20 mcg/kg 500 mcgAg 5 mg/kg.Rozcienczenie roztworu macierzystego do aplikacji róznych dawek wynosilo przy 20 mcg/kg 1 mcg/ml 500 mcgAg 25 mcg/ml 5 mg/kg 250 mcg/ml, z tego kazdorazowo 0,4 ml.Schemat aplikacji. 1 grupa= 5 myszy Traktowanie wstepne: a/ 3 aplikacje w 3 kolejnych dniach; w czwartym dniu uzyskanie histiocytów, b/ aplikacja bezposrednio przed uzyskiwaniem histiocytów.Otrzymane zawiesiny komórkowej histiocytów i fagocytozy.Zasada próby. Po aplikacji immunologicznie uaktywniajacych substancji stymuluje sie w zwierzetach doswiadczalnych histiocyty i pobudza monocyty dla róznicowania w histiocy- tach. Wyróznicowane, stymulowane histiocyty sa w stanie równiez po wyizolowaniu fagocyto-4 148 757 wac in vitro z odpowiednimi przeciwcialami opsoninowane struktury antygenu, w tym przy¬ padku erytrocyty baranie. Fagocytowane erytrocyty mozna rozpoznac mikroskopowo.Przeprowadzenie. Po odpowiednia traktowaniu wstepnym usmierca sie myszy przez zlama¬ nie kregów szyjnych. Odslania sie otrzewna i aplikuje dootrzewnowo 4 ml DMEM /5 % plodo¬ wej surowicy cielat, 0,2 % heparyny/. Po okolo 30 sekundach masazu odciaga sie 3 ml zawie¬ siny komórkowej za pomoca strzykawki i w rurze polipropylenowej wprowadza sie do kapieli chlodzacej /0°C/. Z kazdej grupy próbnej wzieto jedna mysz do oznaczenia stezenia komó¬ rek w wysieku; ustalono w przyblizeniu stezenie okolo 4 x 10 komórek/ml.Izolowanie przyrosnietych histiocytów: Histiocyty i monocyty selekcjonuje sie z wy¬ odrebnionej populacji komórek w ten sposób, ze przeprowadza sie ich wyleganie na szkiel¬ kach przykrywkowych; histiocyty i monocyty zrastaja przy tym, inne komórki nie. W naczynr kach hodowlanych o 24 miseczkach /polistyren firma Costar/ umieszcza sie okragle szkiel¬ ka przykrywkowe i przewarstwia 0,25 ml DMEM /z 5 % plodowej surowicy cielat/. Dla równo¬ miernego rozdzielenia komórek umieszcza sie naczynka na wstrzasarce i do kazdego wsadu przy jednoczesnym wstrzasaniu /5 min, okolo 200 obrotów na minute/ pipe tuje sie 0,25 ml zawiesiny komórek. Nastepnie poddaje sie naczynka hodowlane tkanki inkubacji w ciagu 1 godziny w temperaturze 37°C i przy 8 % C02 * cieplarce. Po inkubacji odsacza sie nie przy¬ rosniete komórki, nastepnie przemywa dwukrotnie za pomoca 0,25 ml DMEM /plus 5 % plodo¬ wej surowicy cielat/.Przysposabianie do fagocytozy baranich krwinek czerwonych: 1 ml krwi baraniej przemy¬ wa sie dwukrotnie za pomoca 4 ml PBS/BSA /odwirowanie, 10 min, przy okolo 500 x g/. Prze¬ myta krew rozciencza sie 1:50 za pomoca PBS/BSA. Surowice odpornosciowa zawierajaca przeciwciala przeciw baranim krwinkom czerwonym rozciencza sie za pomoca PBS/BSA 1:200.Rozcienczona krew barania i rozcienczona surowice odpornosciowa, zawierajaca przeciwcia¬ la laczy sie 1:1 i poddaje inkubacji w ciagu 1,5 godziny przy chronionym wstrzasaniu /okolo 80 obrotów na minute/.Fagocytoza: Do kazdej miseczki naczyniek hodowlanych tkanki ze zrosnietymi histiocy- tami na szkielkach przykrywkowych pipetuje sie 0,5 ml przysposobionej do fagocytozy za¬ wiesiny krwinek czerwonych. Naczynka poddaje sie inkubacji w ciagu 20 min w temperaturze 37°C i przy 8 % C02» Nastepnie odsacza sie nadmiar krwinek czerwonych i szkielka przy¬ krywkowe przemywa sie dwukrotnie za pomoca DMEM /O,5 % FCS/.W celu rozpuszczenia nie fagocytowanych krwinek czerwonych traktuje sie je kazdora¬ zowo za pomoca 1 ml NH.Ck-tris-buforu /oznaczono czas oddzialywania 3,75 min jako odpo¬ wiedni/. Po odsaczeniu buforu przemyto szkielka przykrywkowe dwukrotnie za pomoca PBS/ BSA.Opis fagocytozy /metoda barwienia/. Po fagocytozie zabarwia sie histiocyty wedlug Pappenheim#a kombinowana metoda May-Grunwald-Giemsa. Barwienie przeprowadza sie w misecz¬ kach naczynek hodowlanych tkanki. - 5 min May-Grunwald stez., odsaczyc - 3 min podwójnie destylowana H20, nastawiona za pomoca H«P04 min 85 % na pH 7,0; odsaczyc - 9 min roztwór Giemsa rozcienczenie 1:40 i odsaczony przed uzyciem; odsaczyc - przemyc dodatkowo woda destylowana z tryskawki.Jadra komórek sa po barwieniu czerwonofioletowe, zaródz komórkowa jasnoniebieska. Fa¬ gocytowane krwinki czerwone mozna rozpoznac jako bladorózowe. Po wysuszeniu na powietrzu przykleja sie preparaty mikroskopowe za pomoca "Eukitt#un na szkielkach przedmiotowych /3 preparaty/mysz/.Ocena mikroskopowa. Z trzech preparatów mikroskopowych jednej myszy obliczono dwa.Zastosowano mikroskop Zeiss'a przy 1000-krotnym powiekszeniu i inersji olejowej. Trzeci preparat stosowano, gdy wynik z dwóch preparatów nie byl jednoznaczny. Na preparat obli¬ czono 300 komórek i w zaleznosci od aktywnosci fagocytozy podzielono na klasy o rosna¬ cej liczbie krwinek czerwonych/histiocyt.148 757 Klas§ Krwinki czerwone^histioc^t 1 | 0 2 ! 1 _ J. . 4 ! 3 5 ! 4 —4 - 7 J 6 8 J 7 9 10 H 8 11 12 9 10 11-20 *7" *' Do obliczen przyjeto, ze przy 11 krwinek czerwonych/hi atiocyt rozdzial w kla¬ sie 12 wykazuje srodek ciezkosci okolo 12 krwinek czerwonych/histiocyt. Hietiocyty kla¬ sy 12 wystepowaly stosunkowo rzadko* Opracowanie danych 1 przedstawienie graficzne. Obliczenie preparatów mikroskopowych wykonano na urzadzeniu liczacym WANG LVP 2200 ze specjalnym programem wejsciowym, który pozwalal na oddzielne ujecie klas liczbowych. Usrednianie poszczególnych danych przepro¬ wadzono za pomoca programu "MA 1", przedstawienia graficzne za pomoca programu "NPL".Bfekt stymulacji dla kazdej substancji próbnej przedstawiono dwoma sposobami: 1. Rozdzial histiocytów na klasy Arwinki czerwoneAistiocyt/ w %f w odniesieniu do 300 komórek jako 100 %. Wchodzi przy tym równiez do przedstawienia graficznego liczba histiocytów, które nie fagocytowaly zadnej krwinki czerwonej. 2. Rozdzial fagocytowanych krwinek czerwonych /liczba NPH w jednej klasie x liczba krwinek czerwonych /MPH/ na klasy w %$ w odniesieniu do ogólnej liczby fagocytowanych krwinek czerwonych jako 100 %. Przy tym liczba histiocytów, które nie fagocytowaly zad¬ nej krwinki czerwonej, pozostaje nieuwzgledniona.Parametr. Jako parametr stymulacji histiocytów rozpatrywano wzrost aktywnosci fago- cytozy, wyrazony jako liczba fagocytowanych krwinek czerwonych na histiocyt /=klasa/.Stymulacja przejawia sie w spadku histiocytów, które nie fagocytowaly wcale albo nie¬ wiele krwinek czerwonych i we wzroscie histiocytów z wieksza liczba krwinek czerwonych.Wyniki. Stymulacja MPH przez l-karboksy~3,4-metylenodwuhydroksy-8-metoksyfenan- tren /i.p.A Fig. 1: 3x20 mcg/kg i.p.Stymulacja MPH po 3 dniach /x + SEM/.Fig.la/ - Rozdzial 300 komórek na klasy 1 do 12 w % Fig.lb/ - Rozdzial fagocytowanych krwinek czerwonych na klasy 1 do 12 w %.6 148 757 i § ¦1— i io I ir\ • t- I I ON I GD !°2 W a o wi r4 X • H ¦ • *- ¦ V £ O -S d •o o ' • a o • a ** cv* H Ó •O H *J OD 0 i CD c * a H O J4 I® I O c •o 9 •*• I f—l —I— i i o i o ir\ I ir\ CM I CM • I • — ' — I I I I CD CM O I • ! o £18 Ol O (^Irt I i e- I r-i i *¦ i i i e- V© I iH I • 4 t- 9 vp u' I • ! o i i I 00 I O I ^ I • IO I •I—l- II! I CM I r I if\ I O I GO -rl- a i #*4I .O" :8 <^N O CD O N ¦3 § fl « CO fl) „l.-J—J-—L l O i H I I Al M 19 CO I • CMI iH H I t*- r—t—t M3 I I I I I I I—i I —+- I I o CO I O GO CM l#H -+--h H I v£ O I Q O I O • I • CM I C I I O I O !8 18 o j o I I I I I I I CN I I -I I J.sisi • i OIOIO lilii s i i i i I CM :° I ¦I I I 4-4-4- CM I O i -l_4.-4.-j.I 818 . GO •O o i Si 18 1 O • 1 I O 1 O i : i i §! o 1 vO I H • 1 • O IO 8 I I I c\ 8 8 o i h • i • o.o 81 ^ i I I 1 I ~4 I O t 8 8! 8 O I I O O l~l- t- I H I °i I I "I* I 18 18.I • I • I jolo.o, i i i i i I I I I -I I I I i o _ i o i o i • o i i i 1 CM I CN I 1 I 1 I 1 I I L 1 ir\ I \o OD O 1 O 4-4- I 1 I VO j C- 1 1 I L—4.. 00 I I I O I l O i i4 i ol °.l O I I o O J—U.i-1148 757 tt s CM H O TJ H 8? co H M CO c Xl o 1 d i o l ! CD 1 N 1 O I M 1 o 1 d i ¦H 1 * j £ | £ i O 1 1 d i co l £ 1 O 1 4* 1 & 1 O 1 feO 1 CD 1 * 1 •2 1 •H 1 •O 1 N 1 £ 1 1 1 1 1 1 1 1 ¦ 1 1 1 1 1 L i | e CD O •H H ^ CO En |g ! w i p ! w I O 1 «H i d 1 *3 1 C0 1 b 1 X0 1 1 1 X 1-—- 1 N 1 CO IO 1 H 1 (VI 1 CM ^ IO IOIMPMO 1 • 1 • 1 • 1 • 1 • 1 O 1 r\ l on i t^- i on 1 1 PNI (M 1 H I 1 O 1 00 1 ^ 1 ON 1 VO 1 O 1 rN 1 itn I vo 1 vc 1 O 1 (\l 1 H 1 H 1 H ~n r—t~t—i 1 O 1 f- 1 ^ 1 ON I CU 1 O 1 r- 1 iH l rN 1 rN 1 . 1 ¦ 1 • l • 1 • 1 O 1 o 1 rN 1 rN 1 rN 1 O 1 O 1 O 1 H 1 o 1 O 1 tfN 1 PN 1 C\l 1 rN 1 • 1 • 1 • 1 • 1 • 1 O 1 CNJ 1 ON | f- 1 ON 1 I PM CM 1 H 1 -H 1-—+—4 H-— 1 O 1 CU ICMH 1 ^ 1 B %—— 1 1 N 1 co 1 O 1 rH 1 O 1 ITN I ON 1 iPNlPMH 1 „J j J. J L l O l m i itn i c*- l co 1 ,r\ l • l • I • l • i • 1 H r-— 1 N 1 CO 1 P^CNJ i a 1 N 1 03 ji?H L-._ 1 I CO I « 1 co 1 H 1 M i d L - 1 O 1 C- 1 CU 1 ON 1 00 1 1 IPM P 1 rl 1 1 !!!!!! "1 i""!""! T"! i i i i i i i i i i i i 1 1 1 1 1 1 1 O 1 CO 1 rN 1 itn 1 c- 1 1 • 1 *l - 1 • 1 • 1 IO l^ltfMO IPM 1 1 r i cu 1 cu l H i 1 1 1 I 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 i 1 i l l i l l l 1 O 1 UN 1 VO 1 VD 1 VO 1 1 • | • 1 •» 1 *l • 1 1 O 1 vo 1 00 1 r\ 1 irv 1 1 1 CNJ 1 CU 1 H 1 1 1 I 1 1 I ! J| L _ 1 _, J„ 1 1 i iX 1 1 " i ii:::: i o i o i o i o i o i 1 O 1 O 1 O 1 O 1 O 1 1 H 1 f\J 1 PN 1 ^ 1 in 1 1 H 1 w 1 n 1 ^ i ml 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l 1 1 1 1 1 1 1 1 On 1 on | Ol O 1 O 1 00 1 Q 1 IsoIOIOIOIOInoIOI 1 • 1 • 1 • 1 • 1 • 1 • 1 • 1 IHlPN IO 1 O 1 O 1 H 1 O 1 II 1 1 1 II 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 i i i i i i i i i i i i i i i i IMOIOMOIO IsOlO 1 1 O ipn lirM MO lvo IO 1 1 rN 1 H 1 O 1 O 1 O 1 H 1 O 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l 1 1 1 1 1 i 1 1 1 l J 1 r"~r—i—i—f—T""n"""i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i KIOIMOMOIPMOI IHlvolHlrNlOlrNlOI 1 • 1 • l *l * 1 • 1 • 1 • 1 lyolwIHIHIOIPMOI 1 1 1 1 1 1 1 1 i i i i i i i i ! ! ! ¦ ! » ' i i i i i i i i ¦ ¦¦•••• cnjivoionioioiooioi IMO l un i r- 1 O IitnIOI 1 .1 .1 *l *l •! • 1 • 1 ^IfMOIOlO IWIOI !!!!!!! 1 1 II 1 1 1 k—4—-1 1- 4 1 1 1 ii i a i • ¦ i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i MOIPMOIOHIOI HlVOlCUlOlOlPIOI 1 1 1 1 1 1 1 1 1 f 1 1 1 1 ...|— j—-j --,— ,— j —j i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i NOIOIOIOIOIOIOI • 1 • 1 . 1 .1 • 1 • 1 • 1 HIOIOIOIOIOIOI 1 1 1 1 1 1 1 !!!!]!! 1 1 1 1 1 1 1 i i i i i i i i i i i i i i ¦ ¦¦¦¦¦¦ c-ihioioioioioj • 1 • 1 • 1 .1 . 1 • 1 .1 HIOIOIOIOIOIOI 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ¦ ¦tlili 1 1 1 1 1 1 1 ONIHIOJCOIOIOIOI • i .i • i .i . i • i • i CNlCUlOlCMlOIC^lOI H 1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 .' I I 1 —r—r—i—+—i—i—: i i i i i i i oioioioioioioi oioioioioioioi VO^I(DICMOIHICMI 1 1 1 1 H 1 H 1 H 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 VOlC"-IC0IONlOIHICNjl 1 1 1 1 H 1 H 1 H 1 1 1 1 1 1 1 1148 757 ¦—r— i i pn i pn pn I pn 03 I OD * I * CM I t- IfN I t-i I I I pn I icn 00 I vo ir\ I pn • I • CM I iH I I—i- I ITN I PN t- i ir\ t- i O • i * ir\ I pn ¦| T~ I I i I I ni t*- " pn l \o V I I I I L I vO I I I ! *- I vO T— I I I I O !8 T" I I O i"? I O I ia t— i— !B I—h-f I O I H-i ! c I *G I I fc I * I I J X I— I PN * pn pn .1 L_.I I I t- I O so I Q iH I O • I • I I I I ^ I i-l On I CO CM I VO • I • r-i I O -4-. i pn Ipn on l cm 00 I ITN • I • CM I H I I I I O O I n I vo I H I U lvO I I Tf I CM I; II I I II I X J- II I I I I II I I I O I I I 1° I L -A 1* I I 00 I CM I ^ I CM I CM I O I CO I CM I 00 I f- I <*- I CM I CM I O I H I • I • I • I • I • i o i o i o i o i o II I I I l~l-H—l—f- III I I I I ON I O I O IMPMO ~ I M3 I IfN I I I I I I I t- I I NO I I O I IfN I iH CD I «*¦ O I O O1! O I O I ¦l—l- 1° I O : : : i ni pm pn I PM PM P\ I PM ^Ip\ I • I • I • I^INIH I II I I I I I PN I <*¦ 100 I 00 * H I PN • I • O I O 4—:—i—4- ! i PN | PN PN I PN vo i e- • i • O I O I I ON I I ««¦ I [H. l i°! 4-H- I I I I 18 ! I H I I • I O I ON O I I I I I l—l-H—I—h- H—t ; ; pn i f- i PN I \D I -«- i o i —i—t148 757 S T" i i §1^1^10 I ON j «M O I rM H l <*n I H I O O I r-l I—+—H+- P I I I I CNJ H O •O i? CO CD e Xi o s u 9 N O l M Xi O c co s co »o N O MD I H O -t—--t 0 o 5 CO B O I 13 K—i—1—f- I I I o 1 u H I l I tf\ N!Hi I I I I I O I CN " OA I 0\ ó j o JM * 8 00 1 r- co I CNJ I 1 m \. |-~j-_-j..N co cni B H~I co co co I 1 1 t- I H CNJ H—f l O I m O I CNJ I H L—J—-L-_J. I. o 1 g o 1 o 1 1 -i— I I H I CNJ I I I I I L—J I t* l 8 r -l~h- 8 H I ON • i I I <* I H iH I !• Ol VO C\ I t- CNJ I CO •H I O r-t- 1TN I ITN l- I ON l—l~+~h- CNJ I 1 I I —Ir« I I I I CD ¦1* +-4- I ON I • ON SO I ON I I ItUO I Ss ,^.0 1 1 I c\ I I ! I ITN I ON I CNJ I tf I • I • ¦ rH.O 1 o I I I I I I I ON I 1 r- 1 cn . 1 • 1 .H I CNJ I r-l I I I I I V I CN M O • I • V* I ITN I • I O 1 1 <* I H I \D \r\ I o I \o 1 \o • 1 • r% I (nj H I H I l I I I I vo I vo • l • VD I CN i-l I H „-L- I I I O I O O I O • I • ITN I VO I L-.• I I* l- I I I ITN I VO I ¦ L-^ 1 o 1 1 l- 1 1 1 1 o- 1 1 i ! H I I O I H ! o l cn 1 • 1 H l l 1 I I I I I ON I O I • I • ,«0,O I I O o CNI I I I —* I I I I I I ITN • I CNJ 00 I O c I O 1 : 1 1 VO l PN I H I e\ I I ! -4-i PN I O NO I I I I I I i°! I I J 1 8IO IQ IOIO CD O 1° 1 o\ 1 I •H I III 00 1 1 1 1 I ON I O I I I H I I I I .L-_I„J. i i 1 1 8!8! • I • I H I CNI I H I H I ¦H I I I I H I CNJ I r-l I H I I I I I148 757 w CM H O •O H 8? m Si M l m o M 8 M O OS 4148 757 tt* * CM H O ¦O H S? CD 33 CD C A O ony i 9 O M 9 c •H l M A CD W O 4* ocy to CD Vi iM CD "8 O CC \ & 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 1 | 1 | 1 | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i i i i i* 1 M 1 ** 1 M 1 1 CD 1 O 1 -H 1 H 1 & 1 | 1 1 1 1 1" 1 1 I 1 i 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 i 1 I 1 1 i ] 1 1 II 1 1 1 1 j 1 1 L~l i ;s {*-—. i" i i i i \ i * i ° \ ° I o 1 ° 1 1 r— i i 1 CM 1 H | • 1 *- 1 H 1 h""' 1 O 1 H 1 en 1 r™^* 1 1 1 I O l@ 1 o «H i c 1 -0 IK 1* i K 1- h——l 1 !» I 09 I ITN 1 B 1 1 1 1 1 1 j 1 1 l l M ! CS 1 **i i i N 1 • 1 ^j 1 ° • O |# • r~".1 8 • O »M! O o .... o • ° ¦ :l O 1 1 «* on I • l \o 1 r 1 00 i • lVJ \fk \ i CM 1 \D I CM 1 CM • CM CM 1 T 1 ^ 1 O 1 * 1 00 1 H 1 t~~*a 1 ON 1 1 CM 1 1 irs en } • 1 if\ [ ,- e. 1 CM l en l ? H 1 CM1 1 *- 1 MD CM 1 L.— o\ • CM • 1 HlOi • 1*1 ol^i 1 H l 1 ! s hi &Ni°] i i N I O I CD 1 • 1 ^h ; o , 1 1 1 i : CD 1 O 1 O 1 O 1 CD 1 • s iHj i i c Im! 1 1 -^ 1 • i H i H 1 1 1 ir\ i • i O I H 1 1 1 O 1 O 1 • 1 • 1 00 I H 1 CM 1 1 i • 1 IfN | H 1"*"" ! «-• 1 ° 1 H 1 1 ir\ 1 CM i * * 1 CM f i i i. r i | H I • 1 <* 1 H j f~ 1 t*- 1 CM 1 r-l P"^" 1 en 1 00 • i CM 1 ¦,* 1 '* 1 "•- [ t** 1 CM no L • • • f H 1 H ! ' 1 O 1 CM 1 00 1 1 H L..i ITN 1 ' • 00 1 H 1 1 1 —4 1 i t- 1 • | H 1 1 1 1 CM 1 • 1*1 *¦" J 1 H I * 1 fr- H i ir\ 1 H.J ITN 1 ^ H • a a a 1 ^ 1 ^- I cm i e\ 1 00 1 CM I CM 1 CM | • 1 • I . 1 • 1 o 1 ^ j c\j i ir\ 1 1 1 1 f—1~+-4~ i i i : 1 SO 1 V\ 1 H I H I^IMHlH Id IH IH IH 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 r~r~T~r~" i i i i ho 1 O ICM t- 1 (VI 1 ON 1 • 1 • nlc\ 1 l 1 t 1 i 1 VO J 00 ft- 1 H 1 ^ ' • O i ir\ i Hi"- i i L_ [T r»TcM J 1 ON _4^ ,H • S i CM i • | SD H 1 1 e- •' 00 --*- r • M3 H °. h r- i oo r*l i i rH 1 irvl cm H IH 1 1 1 ! 1 818:8! • l • 1 • 1 CM | CN 1 *• 1 lf\ 1 1 1 1 ! i l i i en Li ITN 1 1 1 1 1 II 1 1 1 ¦¦ \ ri i [ 1 i c\ ! i • i l«j i i u—- 1 f*\ 1 1 <* 1 -* 1 • 1 • 1 CM 1 CM ! 1 L_l„, r~t"i !' . 1 . I f 1 n--- 1 ^» ¦; ? CM 1' ¦• _¦ 1 O o ^... r. {y CM • CM —— O 1 • 1 • 1 IvOJO ! ! i t- i oo i t- i itn i • i • i-ih ii l—l— ii i on 1 r- i ^ i r- 1 O I O | i i i i t^ i i H 1 1 • 1 1 CN 1 ! I • !~4 ! 1 1 VO I i cm l ¦ iii i ii i i i i i iii; i i i i lOlntOM 1 H 1 ^ U 1 1 • 1 • 1 • 1 1 H 1 H 1 ITN 1 i ! i 1 1 1 1 1 !"T"r"7 III! I&ISIS 8 r • t • i • i • i «* i cm h 1 !»•—« »¦¦¦ L ... 1 H h-fOv L-*'^ i. e\ • ' 1 H J CM • ITN 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ! 1 1 'iii CN 1 ON 1 \0 1 • 1 • 1 • H l^lvO 1 Hf I ! 1 1 1 M pn j O I O\ * 1 U 1 H! 1 1 II 1 1 i 1 8j • 1 vO 1 •J IV£ 1 1 1 1 1 O 1 O 1 o i o i • i*i r- i oo j l 1 ¦ ¦ ^" ! • i ITN 1 I 8-1 • 1 ON 1 1 1 ! 1 h- 1 00 1 OM \—~mi \ \ ¦ ['OO 1 H r^^ r- -j : <+ • ' 1 H —_ IfN • CA i H • -1 H 1 I 1 H 1 IfN 1 |_M _, 1 ! ° i° r^^l i: ^i vO \ '¦ • 1 i i l l l O O ;%'. 1 «! • i H IPM i 1 1 1 1 1 i i l-t-l 1 1 cn i • h i 1 1 1 1 1 c- ! • i <*- 1 1 1 | 1 I 1 1 CM 1 00 1 • 1 • 1 'en 1 H 1 | 1 1 i J ^i ir 1 .^« • CM CM • •* H 1 1 o 1 o i o o i o i o • i • i • O IH IN H 1 H j H i 1 i : i O 1 H 1 CM . 1 1 1 1 H 1 H | H 1 1 1 1 1 i 1 1 1 1 \ 1 1 1 ¦12 148 757 Zaleznosc dawki afektu stymulacji. Grupy kontrolne po podaniu i.p. lub p.o. fizjolo¬ gicznego roztworu NaCl wykazuja, ze sama aplikacja i.p. powoduje juz slaba aktywizacje histiocytów. Wysoka zawartosc histiocytów fagocytowala dwie krwinki czerwone.Wzrastanie histiocytów z wiecej niz dwoma krwinkami czerwonymi nalezy zatem interpre¬ towac jako dzialanie substancji. Sume % krwinek czerwonych od 4.klasy /histiocyty z 3 krwinkami czerwonymi i wiecej/ przedstawiono dlatego w relacji do dawki.Figura 4: Zaleznosc sumy % krwinek czerwonych od 4.klasy i powyzej od dawki po poda¬ niu i.p. 20 mcg, 500 mcg i 5 mg/kg. Kontrola wynosi 45 % ± SEM/. Na rysunku zakres + SEM przy wartosci sredniej podany jest przez linie przerywana.Tablica IV Zaleznosc od dawki w stymulacji histiocytów po podaniu i.p. x = dawka /mcgAg/ y = suma % fagocytowanych krwinek czerwonych SEM = standarderror of the means /blad standardowy srodków/ nr "T r 1 1 1 J wartosci x J wartosci y j wartosci SE j N | I ! i r , i i . ™- .. _ _ _ _ . j 1 j 20.0000 j 38.2000 I 2.7800 [ 4 { 2 I 500.0000 j 63.7600 J 3.3200 | 5 ! 3 i 5000.0000 ! 61.8000 J 5.4200 ' 5 I X _ 1 J L I Ocena. Substancja powoduje wzrost aktywowania histiocytów z 38 % przy 20 mcg/kg do 64 % przy 500 mcg/kg. Dalsze zwiekszenie dawki do 5 ag/kg prowadzi do nieznacznego osla¬ bienia stymulacji. Uaktywnienie histiocytów przebiega w wybranym zakresie dozowania nie¬ liniowo.Grupa próbna, która zaaplikowano przed uzyskaniem histiocytów jednorazowo dootrzew- nowo wykazala, ze obserwowane efekty wystepuja tylko po okresie inkubacji. Ten wynik wska¬ zuje na to, ze substancja in vivo indukowala w histiocytach mechanizmy odpowiedzialne za wzrost fagocytozy.To wskazuje na nastepujace efekty: 1. stymulacje szybkosci internalizowania blony, 2. zwiekszenie gestosci receptorów Fe i/albo 3. zwiekszenie ruchliwosci receptorów C 3b.Inne zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku wykazuja porównywalne dzialanie far¬ makologiczne. Dzialanie zostalo potwierdzone za pomoca innych modeli farmakologicznych oraz klinicznie.Nastepujace przyklady wyjasniaja sposób wytwarzania zwiazków wedlug wynalazku.Przyklad I. Wytwarzanie l-karboksy-3,4-metylenodioksy-2-metoksy-fenantrenu. a/ Wytwarzanie bromku 6-bromo-piperonylu /schemat 1/.Chemikalia: alkohol piperonylowy /EGA-Chemie lub Aldrich/ = 120 g, brom 48 ml w m20 ml kwasu octowego, kwas octowy 240 ml.W kolbie kulistej z trzema szyjkami o pojemnosci 1 1, zaopatrzonej we wkraplacz, rur¬ ke osuszajaca i termometr wewnetrzny, umieszcza sie alkohol piperonylowy w kwasie octo¬ wym i oziebia w kapieli lodowej. Do tego roztworu wkrapla sie powoli, przy jednoczesnym mieszaniu, brom rozpuszczony w kwasie octowym tak, ze utrzymuje sie temperatura 15-25°C.Mieszanine reakcyjna pozostawia sie w spokoju w ciagu nocy i wytracone krysztaly odsacza sie na nuczy, przemywa woda i przekrystalizowuje z metanolu. Temperatura topnienia: 92- 93°C. wydajnosc: 174 g, 75%.143 757 13 b/ Wytwarzanie bromku 6-bromopiperonylotrójfenylofosfoniowego /schemat 2/.Chemikalia: bromek 6-bromopiperonylu 294 g, trójfenylofosfina 262 g, toluen.W kolbie kulistej z trzema szyjkami o pojeanosci 3 lf zaopatrzonej w chlodnice zwrot¬ na i mieszadlo, umieszcza sie bromek 6-bromopiperonylowy i trójfenylofosfine i rozpuszcza w absolutnym toluenie przy jednoczesnym mieszaniu. Mieszanine reakcyjna ogrzewa sie, mie¬ szajac, w ciagu 2 godzin i miesza w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojowej. Utworzona sól trójfenylofosfoniowa odsacza sie na nuczy, przemywa niewielka iloscia toluenu i su¬ szy w eksykatorze. Wydajnosc: 500 g, 95%. c/ Wytwarzanie l-bromo-3,4-metylenodioksy-2'-metoksystylbenu /schemat 3A Chemikalia: lit /drut/, metanol /absolutny/, sól trójfenylofosfoniowa, alhedyd o-any- zowy, dwumetyloformamid /absolutny/.Przepis reakcji: Drobno pokrojony lit /O,98 g, 0,14 g atom/ dodaje sie do absolutne¬ go metanolu, umieszczonego pod azotem. Po zakonczeniu reakcji wkrapla sie ten roztwór w ciagu 2,5 godziny do mieszanego w temperaturze 90°C roztworu, zlozonego z soli trójfe¬ nylofosfoniowa j /76,96 g, 0,14 mola/ i aldehydu o-anyzowego /17,68 g, 0,13 mola/ rozpusz¬ czonych w absolutnym dwumetyloformamidzie /200 ml/.Roztwór reakcyjny miesza sie dalej w ciagu godziny w temperaturze 90°C. Po oziebie¬ niu do temperatury pokojowej wlewa sie mieszanine reakcyjna do wody /700 ml/ i osad od¬ sacza sie i 8uszy.Wysuszony produkt ekstrahuje sie w aparacie Soxhleta za pomoca eteru naftowego /w temperaturze 30-50°C/ dotad, az pozostalosc w gilzie nie zawiera juz stylbenu /DC; zel krzemionkowy: CHgC^A Eter naftowy zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc /64,82 g/ przekrystalizowuje z etanolu /przez to zostaje oddzielona najwieksza czesc za¬ nieczyszczen lub nieprzereagowanego produktu/. Wytracony osad /31,13 g/ szlamuje sie w eterze /300 ml/ i gotuje w ciagu 2 godzin /rozdzielenie mieszaniny cis- i trans-/. Po oziebieniu odsacza sie substancje stala i suszy. Wydajnosc: 23,87 g /52%/, czysty zwia¬ zek cis, badany przez DC i NMR. Temperatura topnienia: 112°C. d/ Fotochemiczne przeksztalcenie pochodnej stylbenu w odpowiednia pochodna fenan- trenu l-bromo-3,4-metoksy-2 #-me toksyfenantren /schemat 4/.Chemikalia: bromek stylbenu /zwiazek cis/, l,2,3,4-czterowodoro-9-fluorenon, cyklo¬ heksan, jod.Bromek stylbenu /cis/ /3,3 g, 0,01 mola/ rozpuszcza sie w absolutnym 1,2,3,4-cztero- wodoro-9-fluorenonie A00 ml/. Ten roztwór rozciencza sie za pomoca absolutnego cyklo- heksanonu /1200 ml/ i zadaje jodem A,7 g/. Roztwór przy wprowadzaniu azotu naswietla sie za pomoca laboratoryjnej lampy zanurzeniowej z rura chlodzaca typu TQ 150 /Hanau/ w ciagu 12-14 dni. Reakcje kontroluje sie za pomoca DC /CH2C12/PE 30-50°C 1:2/. Faze organiczna wytraca sie z wodnym roztworem tiosiarczanu /3 x 300 ml/, aby usunac nadmiar jodu. Po wysuszeniu nad MgSO. odwirowuje sie faze organiczna. Produkt surowy przekrysta¬ lizowuje sie z eteru naftowego w temperaturze 60-90°C. Wydajnosc: 1,55 g /47% wydajnosci teoretycznej/. e/ Wytwarzanie 1-cyjano-3,4-metylenodioksy-8-metoksyfenantrenu z bromku fenantrenu /schemat 5A Przeksztalcenie bromku fenantrenu w nitryl.Chemikalia: bromek fenantrenu wedlug wzoru /schemat 5/, cyjanek miedzi /II/, N,N- dwumetyloformamid /DMF/.Mieszanine zlozona z wysuszonego wstepnie bromku fenantrenu /3 g/, cyjanku miedzi /II/ /4 g/ i dwumetyloformamidu /30 ml/ gotuje sie w ciagu 8-12 godzin pod chlodnica zwrotna, dotad, az w DC /dwuchlorometan-eter naftowy A:2/ / nie jest wykrywalny bromek.Po oziebieniu mieszanine reakcyjna wprowadza sie do roztworu chlorku zelaza /III/ /4 g/, HC1 A ml/ i wody /10 ml/ i mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w temperaturze 70°C w ciagu 20 min. /odciag: wywiazywanie sie HCN!/. Nastepnie oziebiona mieszanine reakcyjna14 148 757 ekstrahuje sie za pomoca chloroformu /5 x 40 ml/, przemywa woda /2 x 20 ml/ i suszy nad chlorkiem wapnia. Po usunieciu rozpuszczalnika przekrystalizowuje sie pozostalosc z eta¬ nolu. Wydajnosc: 2,0 g /70 %/; temperatura topnienia: 215°C f/ Hydroliza nitrylu kwasu fenantronowego do kwasu fenantrenowego /schemat 6/.Chemikalia: nitryl kwasu fenantrenowego wedlug wzoru /schemat 6/ NaOH.Nitryl kwasu fenantrenowego /l g/ rozpuszcza sie w mozliwie niewielkiej ilosci eta¬ nolu /30-50 ni/ przy jednoczesnym ogrzewaniu i zadaje roztworem wodorotlenku sodu /10 g w 15 ni HpO/. Mieszanine reakcyjna gotuje sie przy silnym powrocie pod chlodnica zwrot¬ na, dotad az DC /eter/ nie wykazuje juz cyjanku A8-20 godzin/. Etanol odciaga sie pod zmniejszonym cisnieniem i do pozostalosci dodaje sie wode /50-100 ml/. Faze wodna ekstra¬ huje sie za pomoca eteru /2 x 30 ml/ i zobojetnia za pomoca 6N HC1. Wytracajacy sie klacz- kowaty osad pozostaje w najwiekszej czesci jako koloid w roztworze. Roztwór ogrzewa sie krótko i pozostawia w spokoju w ciagu 24 godzin.Skoagulowany osad odsacza sie na nuczy i przekrystalizowuje z etanolu. Wydajnosc: 0,53 g /50$/.Przyklad II. Wytwarzanie l-karboksy-3*4-metylenodioksy-8-hydroksy-fenan- trenu. 1,0 g l-karboksy-3,4-me tylenodioksy-8-metoksy-fenantrenu doprowadzono do topnienia w kapieli olejowej w temperaturze 170°C z 2,0 g chlorowodorku pirydyny i przy gazowaniu azotem utrzymywano w ciagu 1 godziny w tej temperaturze. Po oziebieniu zestalona mase po¬ brano w 10 1 5-procentowe go HC1 i ekstrahowano 3 razy za pomoca po 10 1 chloroformu. Po¬ laczono ekstrakty, przemyto woda neutralnie i saczono do wysuszenia przez silanowany pa¬ pier filtracyjny /Whatman 1 PS/. Po odparowaniu rozpuszczalnika w temperaturze 30°C na wyparce rotacyjnej mieszanine zlozona z materialu wyjsciowego i hydrolizatu zestryfiko- wano do rozdzielenia, przy czym destylowano pod chlodnica zwrotna za pomoca mieszaniny zlozonej z 2,5 1 metanolu i 0,1 1 stezonego H2S0. w ciagu 3 godzin. Nastepnie wlano do 10 1 wody i faze wodno-metanolowa wytrzasano 3 razy kazdorazowo z 10 1 eteru dwuizopro- pylowego. Rozpuszczalnik organiczny, po kilkakrotnym przemyciu woda, ekstrahowano za pomoca 10 1 NaOH, przy czym ester metylowy 8-metoksy-zwiazku pozostawal w warstwie orga¬ nicznej, a 8-hydroksy-zwiazek przy jednoczesnej hydrolizie estru, zostal przeprowadzony w faze wodna. Po wymyciu za pomoca swiezego eteru dwuizopropylowego faze alkaliczna za¬ kwaszono i wytrzasano kilkakrotnie z chloroformem, wysuszono przez papier do rozdziela¬ nia faz Whatman 1 PS i odciagnieto rozpuszczalnik na wyparce rotacyjnej. 1-karboksy- 3,4-metylenodwuhydroksy-8-hydroksyfenantren pozostal w postaci stalej jako zwiazek jed¬ nolity w badaniu metoda chromatografii cienkowarstwowej. Fluorescencja: /taeOH; vL , nm/ : wzbudzenie: 261, 302, 318, 329, 358, 377; emisja: 386, 402. Wydajnosc: 0,714 g /75$/.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania pochodnych metylenodioksyfenantrenu o ogólnym wzorze 1, w któ¬ rym R^ oznacza atom wodoru, grupe metoksy, etoksy albo hydroksyl, oraz ich farmaceutycz¬ nie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze bromek 6-bromopiperonylowy o wzo¬ rze 2 poddaje sie reakcji z trójfenylofosfina w bezwodnym rozpuszczalniku, a utworzona sól fosfoniowa o wzorze 3 poddaje sie reakcji z benzaldehydem, 0-metoksybenzaldehydem albo ortoetoksybenzaldehydem w obecnosci silnej zasady, po czym otrzymany bromek stylbe- nu o wzorze 4, w którym R1 oznacza H, OCH^ albo OC2H,-, poddaje sie napromieniowaniu nad¬ fioletowemu, a otrzymana pochodna fenantrenu o wzorze 5, za pomoca cyjanku metalu, w szczególnosci cyjanku miedzi, w polarnym aprotycznym rozpuszczalniku, w szczególnosci w dwumetyloformamidzie, przeksztalca sie w odpowiedni nitryl i ten przez hydrolize prze¬ prowadza sie w kwas o wzorze 1 i ewentualnie zwiazek o wzorze 1, w którym R, oznacza grupe OCH-*, przez rozszczepienie eterowe przeksztalca sie w zwiazek, w którym R, oznacza hydroksyl.148757 15 2. Sposób wytwarzania pochodnych metylenodioksyfenantrenu o ogólnym wzorze 1, w którya R, oznacza atom wodoru, grupe metoksy, etoksy albo hydroksyl, oraz ich farmaceutycznie do¬ puszczalnych soli, znamienny tym, ze bromek 6-bromopiperonylowy o wzorze 2 poddaje sie reakcji z trójfenylofosfina w bezwodnym rozpuszczalniku, a utworzona sól fos- foniowa o wzorze 3 poddaje sie reakcji z benzaldehydem, O-metoksy-benzaldehydem albo orto- etoksybenzaldehydem w obecnosci silnej zasady, po czym otrzymany bromek stylbenu o wzorze 4, w którym R, oznacza H, OCH^ albo OCpH^, poddaje sie napromieniowaniu nadfioletowe¬ mu, a otrzymana pochodna fenantrenu o wzorze 5, za pomoca n-butylolitu i kwasu weglowego przeprowadza sie w kwas o wzorze 1 i ewentualnie zwiazek o wzorze 1, w którym R^ oznacza grupe OCIU, przez rozszczepienie eterowe przeksztalca sie w zwiazek, w którym R, oznacza hydroksyl.WZdR 1 COOH h2c; WZtfR l.H2C. -0—r^—B CH2Br WZÓR 2 0—l\^J— CH2P(Ph)3Br WZÓR 3 HoC: R=H,0CH3 WZ0R 6148 757 100-, Fi G. 1a t—f—•—T—•—T 6 8 10 12 KLASA ±< 2: co fc< U* z °£ O N 55 5 I00n 80H 60H FiG. 1b KLASA < co < CL FiG. 2a » T *—T 8 10 12 KLASA148 757 FiG. 2b 10 12 KLASA 5 * 100-, LU < Z -i o o et O UJ < N LL O 80H 60H £0-^ FiG. 3b 10 12 KLASA148 757 • ^ SI O -1 O Z) <2! U-Z) w, z'- oz LJJ ^o w* Nq. 5^ er o *i- 80-. ¦ 70- _ 60- 50- 40- on_ 3Un 1 0 yl jS ff /^ y^ / / —i 1—r i i i " i| \ 1 r- 100 hib. k ' i ' '' i 1 1000 h ' tH ~~I l l 1 11 l| 10000 DAWKA /meg/kgs I. P. / •tf^O-cH^u*^ HOAc "* H2c:°3rVBr -H20H - - ^0-^^-CH2Br (ciezar czasteczkowym152) (cieza r czasteczkowy = 294) SCHEMAT 1 <^CcH2Br-^—» (ciezar czqsteczkowy=29A) Br CH2P(Ph)3Br" ciezar czasteczkowy =556) SCHEMAT 2 Z 0-A^—CH2P(Ph)3Br OHC-1^^ -CH2P(Ph)3Br (ciezar czasteczkowy - 556 ) (ciezar czasteczkowy=136) -OCH 3 (ciezar czqsteczkowy= 333) SCHEMAT 3148 757 h2c; -Br h2c: .Br *OCH3 Iciezar czastecz¬ kowy = 333) ^ '0CH3 [ciezar czastecz¬ kowy = 331 ) SCHEMAT U Cu(CN)/DMF/A ^0CH3 ^^0CH3 (ciezar czastecz- (ciezar czastecz- kowy=331) kowy=277) SCHEMAT 5 CO OH OCH3 (ciezar czastecz- kowy=277) OCH3 (ciezar czastecz- kowy = 296 ) SCHEMAT 6 PL PL PL PL PL