NO317552B1 - Nye substituerte purinylderivater med immunomodulerende aktivitet - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse omfatter substituerte purinylforbindelser. Spesielt angår den foreliggende oppfinnelse 6-substituerte purinyl alkoksikarbonyl aminosyreforbindelser, med spesielt argininderivater, og farmasøytiske sammensetning.

Den primære funksjon til immunsystemet angår beskyttelse av kroppen mot

sykdom. Immunsystemet beskytter mot ikke bare de sykdommer som resulterer fra et angrep av bakterier, viruser og andre patogener, men også kreft såvel som sykdomstilstander som resulterer fra immunitetsubalanse, opportunistiske infeksjoner eller autoimmune lidelser.

Modulering av immunsystemet gjennom farmasøytisk indusert stimulering eller undertrykkelse er en viktig tilnærming til kontroll av sykdom. Forbindelser som ikke spesifikt stimulerer immunsystemet er av potensielt betydelig medisinsk . viktighet og har blitt gjenstand for en langvarig forskningsanstrengelse. Ofte viser forskningsresultatene at immunomodulerende forbindelser er enten svake immunostimulerende midler og derfor ikke særlig effektive eller kraftige immunostimulerende midler og derfor effektive, men toksiske på grunn av sin kraftige immunstimulerende virkning.

Blant de mange klasser av forbindelser som ikke spesifikt stimulerer immunsystemet er nukleosider som er velkjent på området. For eksempel, 7-thia-8-oksoguanosin er blitt beskrevet av D.F. Smee et al. i Journal of Boiological Response Modifiers, 9, 24-32, 1990 som et antivirusmiddel i mus. Aktiviteten av denne forbindelse er avledet fra dens evne til å aktivere NK og B celler i immunsystemet og å indusere interferon. Imidlertid har påfølgende antivirale undersøkelser i mennesker som rapportert av P.G. Higgins et al. i Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 2, 61-63, 1991, beskrevet få oppmuntrende

resultater. Et problem har vært mangel på oral biotilgjengelighet.

Andre nukleosider har blitt syntetisert og studert i en anstrengelse for å utvikle forbedret medikasjon. For eksempel rapporterer D.F. Smee et al. i Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 35, 152-157, 1991, at 7-deasaguanosin har signifikant immunostimulerende og antivirusaktivitet etter oral administrering. Disse resultatene er imidlertid preliminære. Med mange nukleosidforbindelser er toksisitet et viktig trekk som også må analyseres nærmere.

En spesiell klasse av nukleoside immunostimulanter har kommet fra inosin og andre lignende hypoxantinholdige forbindelser. Et velkjent eksempel er isoprinosin, et in,osinholdig kompleks. Isoprinosin er blitt grundig studert som en immunomodulator og refert til som en, "gullstandard" av CD. Simone et al. i Thymus, 19, 51-55, 1992. Rationalebak aktiviteten til hypoxantin- (inosin)holdige forbindelser kommer fra observasjonen at en mangel på adenosin-deaminase, ensymet som konverterer adenosin til inosin, resultarer i alvorlig kombinert immunosviktsykdom (SC1D).

Skjønt meget ikketoksisk er isoprinosin en effektiv immunomodulator, og for å forbedre dens immunofarmakologiske egenskaper har tallrike analoger blitt syntetisert som rapportert av J.W. Hadden et al. i International Journal of Immunopharmacology, 13,49-54, 1991 (Suppl. 1). Særlig beskriver de et promedikament i form av inosin 5' -monofosfat (inosin, hvis ikke kompleksert, har liten in vivo aktivitet) og metylinosin monofosfat (MIMP). MIMP er imidlertid ikke en meget aktiv immunomodulator.

I en anstrengelse for å bibeholde de ikketoksiske egenskaper til isoprinosin, men øke den immunostimulerende aktivitet ble en immunomodulator syntetisert som inneholdt både hypoxantin og aminosyren L-arginin kovalent bundet ved en pentametylenbro. Forbindelsen, ST 789 (hypoxantin pentyloksikarbonyl L-arginin, tidligere PCF 39) er blitt grundig beskrevet i en senere utgave av Thymus, 19, Sl-Sl 12 (1992). L-arginin ble selektert fordi det er kjent for å spille en rolle i imunaktivering og er til stede i enden av mange immunomodulerende peptider, så som tuftsin, substans P, tymopentin og splenopentin. ST 789 er videre beskrevet i Europeisk Patentsøknad nr. 91830284, publikasjon nr. 464,009, publisert 2. januar 1992. Analoger av ST 789 er også beskrevet i den europeiske publikasjonen hvor oligopeptider sammensatt av naturlig forekommende L aminosyrer erstatter L-arginin. Purinbasedelen av molekylet forblir imidlertid hypoxantin.

Mens ingen immunologe sammenligning er blitt gjort med isoprinosin, fremsteg et lignende mønster. Forbindelsene er ikketoksiske men på det beste moderate immunostimulerende midler. For eksempel var det ingen angivelse at ST 789'eller analoger derav kunne stimulere en viktig immuncellelinje, så som cytotoksiske T lymfocytter (CD8<+> T celler). Denne linje spiller en nøkkelrolle i forsvaret av organismen mot virusinfeksjoner og kreft.

P.Cornaglia-Ferraris beskriver enda en annen analog av ST 789 i International Journal of Immunopharmacology, 13, 1005-1012, 1991.1 den publiserte forbindelse er L-arginin erstattet med bombesin-karboksi-ende- dipepid-L-leukyl-L-metonin. Purinbladbasen forblir hypoxantin. Faktum er at i denne klasse av forbindelser hvor en purinbase er koalent bundet med en metylenkjede til en aminosyre eller et oligopepid er svært lite data blitt rapportert for forbindelser som inkluderer purinbaser andre enn hypoxantin. Videre på grunn av kravet om fysiologisk aktive aminosyrer i pattedyrsystemer beskriver alt rapportert arbeid opp til dags dato aminosyrer med den (naturlige) L-konfigurasjon. En kort beskrivelse av erstatning av hypoxantin med naturlig forekommende purinbaser adenin og guanin er rapportert av R. Stradi et al. i Fl. Farmaco, 45, 39-47, 1990, men det er ingen angivelse av signifikant biologisk aktivitet.

Som beskrevet ovenfor er adenosin deaminase og ved implikasjon inosin, nødvendig for å opprettholde normal immunstatus. Derfor rapporterer M. Marzi et al. i US Patent 5 272 151, av 21.desember 1993 at i ST 789 er hypoxantin erstattet med xantinoksidase inhibitor allopurinol. Resultatet er ST 689, allopurinol pentanol. Denne subsitusjon er ventet å øke konsentrasjonen av inosin in vivo siden inosin blir katabolisert til xantin og deretter urinsyre i pattedyr i nærvær av xantinoksidaseenzym. Imidlertid var alopyrinol bemerket å være immunosuppressiv og ST 689 var ikke signifikant mer immunostimulerende enn ST 789 i de fleste immunologiske assay rapportert i 151-patentet.

Levamisol er et annet immunoregulatorisk middel brukt mot malignt melanom. Det er nå blitt funnet at levamisol induserer alvorlig trombocytopeni etter å starte med adjuvant levamisol-terapi for malignt melanom (Med. Pediatr. Oncol. Apr. 1995, 24 (4), 262-4).

Kjent teknikk angir at det er et behov for forbindelser som har evnen til på stimulere et antall immuncellelinjer og derved innehar betydelig immunomodulerende aktivitet men på samme tid mangler toksisitet.

Hensikten er derfor å tilveiebringe slike forbindelser. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en forbindelse som har betydelig immunostimulerende kapasitet både in vitro og in vivo.

Det er vist av noen av oppfinnerne ved å sammenlikne den CTL stimulerende aktiviteten til de foreliggende forbindelser med andre forbindelser i henhold til kjent teknikk, at de foreliggende forbindelser induserer en signifikant stimulering av cytotoksiske T lymfocytter og har en bedre aktivitet enn sammenliknbare forbindelser i kjent teknikk (Zacharie, B., Gagnun, L., Aattardo, G., Connolly, T.P., St-Denis, Y., Penney, L.; J. Med. Chem., Vol 40 (18)', 2883-2894,1997).

Det er demonstrert av noen av oppfinnerne ved å sammenligne CTL stimuleringsaktiviteten til foreliggende forbindelser med andre sammenlignbare forbindelser i kjent teknikk, at de foreliggende forbindelser induserer en signifikant stimulering av cytotoksiske T-lymfocytter og har en bedre aktivitet enn sammenlignbare forbindelser i kjent teknikk (Zacharie, B, Gagnon, L. Attardo, G., Connoly, T.P, St-Denis, Y., Penney, C.L.: J.Med. Chem., Vol 40 (18), 2883-2894, 1997).

Spesifikt er det tilveiebrakt en forbindelse som har aktivitet til å øke mengden av cytotoksiske T celler in vitro og in vivo.

I en annen side av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en immunomodulerende forbindelse som ikke er signifikant toksisk og særlig ikke har den toksisitet som er assosiert med signifikant eller kraftig immunostimulering.

I en annen side av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en immunomodulerende forbindelse som har et purinderivat som ikke er en naturlig base.

I en ytterligere side av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en forbindelse som virker som en kontroll mot tumorvekst.

Den foreliggende oppfinnelse inkluderer forbindelser med formel (I):

eller farmasøytisk akseptable derivater derav,

hvori Ri er substituert amino representert ved formelen NRSR6 hvori R<5> og R<6> er uavhengig valgt fra gruppen som består av H, Ci.4 alkyl og usubstituert amino med det forbehold at R5 og R6 ikke begge er H;

R2 og Rj er uavhengig valgt fra gruppen som består av hydrogen; Cm alkyl;

substituert eller usubstituert amino; substituert eller usubstituert ti ol; og halogen; og R4 er representert av formelen R<12->X<12> hvori R<12> er en mettet lineær . hydrokarbonkjede med 5-20 karbonatomer som eventuelt inneholder én eller flere =0, =N, eller =S og X<12> er valgt fra gruppen som består av en amino Cj-galkyl og en kjent aminosyre bundet ved sin a-aminogruppe, valgt fra gruppen som består av arginin, glysin, alanin, glutaminsyre, valin, ornitin, citrullin, leucin, prolin eller isoleucin.

De følgende definisjoner er brukt heri:

betegnelsen; "alkyl" som anvendt heri inkluderer både rette og forgrenede kjederadikaler, f.eks. metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl, t-butyl. isobutyl, pentyl, heksyl, isoheksyl, heptyl, 4,4-dimentylpentyl, oktyl, 2,2,4-trimetylpentyl, nonyl. desyl, undesyl, dodesyl, og de forskjellige forgrenede kjedeisomerer derav. Kjeden kan være mettet eller umettet og inneholde for eksempel dobbelt- eller trippelbindinger. Alkylet kan være avbrutt eller substituert med for eksempel et eller flere halogen, oksygen, hydroksi, silyl, amino eller andre akseptable substituenter.

Betegnelsen "aromatisk eller ikke-aromatisk ring" som brukt heri inkluderer 5 og 6-leddete aromatiske og ikke-aromatiske ringer, uavbrutte eller avbrutte med en eller flere heteroatom, for eksempel O, S, SO, SO2, og N, eller ringen kan være usubstituert eller substituert med for eksempel halogen, alkyl, acyl, hydroksi, aryl og amino, hvor nevnte heteroatom og substituent også kan substitueres med for eksempel alkyl, acyl, aryl eller aralkyl.

Betegnelsen "acyl" som brukt heri refererer seg til karbonylgrupper med formel-COR hvori R kan være enhver egnet substituent, så som f.eks. alkyl, amino, halogen, tiol, oksygen,-hydroksi og hydrogen.

Betegnelsen "aryl" som anvendt heri refererer seg til monosykliske eller bisykliske aromatiske grupper som inneholder fra 6 til 10 karbonatomer i ringdelen, så som fenyl, naftyl, substituert fenyl, naftyl, substituert fenyl eller substituert naftyl, hvori substituenten på enten fenyl eller naftyl kan være for eksempel Cm alkyl, halogen,

. Cm alkoksi, hydroksi eller nitro.

Betegnelsen "aralkyl" som brukt heri refererer seg til alkylgrupper som diskutert ovenfor som har en arylsubstituent, så som bensyl, p-nitrobensyl, fenetyl, difenylmetyl, og trifenylmetyl.

Betegnelsen "substituert amino" som brukt heri refererer seg til en av amino som kan være substituert med en eller flere substituenter, for eksempel Cj.g alkyl, C|-s acyl, C6.12 aryl, hydroksi og hydrogen.

Betegnelsen "aminosyre" som anvendt heri inkluderer og omfatter alle de naturlige forekommende aminosyrer, de aminosyrer i sin D- og L-konfigurasjoner og de kjente ikke-native, syntetiske og modifiserte aminosyrer, så som homocystein, ornitin, norleukin og p-alalin. Liste av ikke naturlige aminosyrer kan finnes i "The Peptides" vol 5, 1983,

Academic Press, Chapter 6 by D.C: Roberts and F. Vellaccio.

Betegnelsen "lineær eller syklisk" når den brukes heri inkluderer for eksempel en lineær kjede som evt. kan avbrytes av en aromatisk eller ikke-aromatisk ring. Sykliske kjeder omfatter for eksempel en aromatisk eller ikke-aromatisk ring som kan være forbundet med for eksempel en karbonkjede som enten forutgår eller etterfølger ringen.

Betegnelsen "farmasøytiske akseptabelt derivat" som anvendt heri inkluderer et hvert farmasøytisk akseptabelt salt, ester eller salt av slik ester av en forbindelse av formel I eller enhver annen forbindelse som ved administrering til en mottager er i' stand til å tilveiebringe (direkte eller indirekte) en forbindelse med formel I eller en aktiv metabolitt eller rest derav. Figur 1 illustrerer variasjonene av tumorvekst for mus behandlet med syklofosfamid eller forbindelse nr. 1 eller begge. Figur 2 illustrerer.kroppsvektvairasjoner hos mus behandlet med det samme regime som i Figur 1. Figur 3 illustrerer variasjonene i tumorvolum hos mus behandlet med Cytoksan eller forbindelse I, eller begge. Figur 4 illustrerer kroppsvektvariasjoner hos mus behandlet med det samme regime som i Figur 3. Figur 5 illustrerer variasjoner i tumorvolum hos mus behandlet med 5FU, 5FU med levamisol og 5FU med forbindelse nr. 1.

Figur 6 illustrerer vekstkurver hos hann Fisher rotter behandlet med forbindelse nr.

1 i høye doser.

Figur 7 illustrerer vekstkurver hos hunn Fisher rotter behandlet med forbindelse nr.

1 i høye doser.

I en side av den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en forbindelse med

formel (I) hvori R4 er (CH2)-L-0-CO-X<12>, hvori L er valgt fra gruppen som består av (CH2)n, og (CH2)m-Q-(CH2)m, og ytterligere hvori Q er O, S, eller NH, n er et helt tall mellom 1 og 6, og m er et helt tall mellom 1 og 3.

Fortrinnsvis kan X<12> være (CH2)mNH2 hvor m er en helt tall mellom 1 og 6. Mer fortrinnsvis er m lik 2.

Mer fortrinnsvis kan X<12> være et naturlig forekommende aminosyre i D- eller L-konfigurasjon. Fortrinnsvis kan disse aminosyrer velges fra gruppen som består av: arginin, glysin, alanin, glutaminsyre, valin, ornitin eller sitrulin leucin, prolin eller isoleucin.

Enda mer fortrinnsvis er aminosyren L-arginin. Enda mer fortrinnsvis er aminosyren D-arginin.

R] er representert av formelen NR<5>R<6> hvori R<5> og R<6> er uavhengig valgt fra

gruppen som består av hydrogen, Cm alkyl, og usubstituert amino og Cé-io aryl med det forbehold at R<5> og R6 ikke begge er H.

Fortrinnsvis kan Ri velges fra gruppen som består av:

Enda mer foretrukket, kan Rj være: -N(CH3)2.

Enda mer foretrukket, kan Ri være: -NHNH2.

Enda mer foretrukket, kan Rj være: -NHCHj,

Enda mer foretrukket, kan R] være: -NH2 og

Enda mer foretrukket, kan Rj være: -N(NH2)Cri3.

Mest foretrukket, kan Ri være -N(CH3)2.

I en ytterligere alternativ utforming av oppfinnelsen kan R2 og R3 uavhengig velges fra gruppe som består av : Cl, Br, I, og F.

Fortrinnsvis kan R2 og R3 uavhengig være Cl eller Br.

Mer fortrinnsvis kan R2 være H, Cl, eller NH2.

Mer fortrinnsvis kan R3 være H, Br, eller SH eller SCH3.

Mest fortrinnsvis er forbindelsen i henhold til oppfinnelsen representert av formel (I) hvori Ri er N(CH3)2; R2 og R3 er begge hydrogen og R4 er pentyloksikarbonyl-D-arginin, eller farmasøytisk akseptable derivater derav.

Foretrukne forbindelsen i henhold til oppfinnelsen er valgt fra:

Forbindelse nr 1 N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl D-Arginin; Forbindelse nr 2 N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl L-Arginin;

Forbindelse nr 3 N-Monometylaminopurinyl

Pentoksykarbonyl D-Arginin;

Forbindelse nr 4 N-Monometylaminopurinyl

Pentoksykarbonyl L-Arginin;

Forbindelse nr 5 Aminopurinyl Pentoksykarbonyl D-Arginin; Forbindelse nr 7 Hydraxinpurinyl Pentoksykarbonyl D-Arginin;

Forbindelse nr 8 Hydrazinpurinyl Pentoksykarbonyl

L-Arginin;

Forbindelse nr 14 N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl

Glycin;

Forbindelse nr 15 N,N-(6-DimetyIaminopurin-9-yl)-7'-etoksy-etoksykarbonyl-D-Arginin;

Forbindelse nr 16 (2S, 4S)-2-(N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4-(metyloksykarbonyl-D-Arginin)-l,3-dioksolan; Forbindelse nr 17 N-(6-Dimetylamino-8-brompurinyl-Pentoksykarbonyl L-Arginin;

Forbindelse nr 18 N-(6-dimetylamino-8-brompurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-D-arginin;

Forbindelse nr 20 N-9-purinyl-7-pentyloksykarbonyI-D-arginin; Forbindelse nr 21 N-9-purinyl-7-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse nr 22 N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl L-Valyl L-Prolyl L-Leucin;

Forbindelse nr 23 N,N-D im etyl aminopurinyl Pentoksykarbonyl L-Isoleucyl L-Prolyl L-Isoleucin,

Forbindelse nr 25 N-(6-Cyklopropylaminopurin-9-yl)-7-p entyl oksykarbonyl-D - argi ni n;

Forbindelse nr 26 N-(6-cyklopropylaminopurin-9-yl)-7-pen tyloks ykarbonyl - L-argi nin;

Forbindelse nr 28 N-(6-Azetidinpurin-9-yl)-7-pentyloksikarbonyl-D-arginin;

Forbindelse nr 29 N-(6-Azetidinpurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyl-L-arginin;

Forbindelse nr 32 trans-(N-6-dimetylaminopurin-9-yl)-4-metyl-heksyl-metyloksikarbonyl-D-arginin); Forbindelse nr 36 cis-(N-6-dimetylaminopurin-9-yl)-4-metyl-cykloheksyl-metyloksykarbonyl-Darginin; Forbindelse nr 37 N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 7-Pentoksykarbonyl-D-citruIlin;

Forbindelse nr 38 N-(6-metylaziridinpurin-9-yl)-5-pentanol; Forbindelse nr 39 Rasemisk N-(6-metylaziridin purin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyl-D-arginin;

Forbindelse nr 40 N,N-(6-Dimetylaminopurinyl-9-yl)-7-tioetoksy-etoksykarbonyl-D-arginin;

Forbindelse nr 50 N-(6-dimetylamino-8-metyltiopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-D-arginin);

Forbindelse nr 54 N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl -

. D-ornitin;

Forbindelse nr 55 N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 7-pantiksykarbonyl-L-ornitin;

Forbindelse nr 56 N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-L-valin;

Forbindelse nr 57 N-(6-dimetylamino-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-D-valin;

Forbindelse nr 58 N(N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyletylamin hydroklorid;

Forbindelse nr 62 N-(6-dimetylaminopurin:9-yl) 4-butanol;

Forbindelse nr 63 N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-6-butoksykarbonyl-D-arginin;

Forbindelse nr 64 N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-6-butoksykarbonyl-L-arginin;

Forbindelse nr 66 N-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-6-heksanol; Forbindelse nr 67 N-(6-N)N-dimetylaminopurin-9-yl)-8-heksyloksykarbonyl-D-argiriin;

Forbindelse nr 68 N(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-8-heksyloksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse nr 72 N-(6-N,N dimetylaminopurin-9-yl)-5-pentylamin

hydrokloridsalt;

Forbindelse nr 73 N-(6-metylaziridinpurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyl-L-arginin;

Forbindelse nr 74 (2SJ4S)-2-(N,N-Dimetylaminopurin-9-yl)-4-hydroksymetyl-1,3-dioksolan;

Forbindelse nr 75 (1S,3R) og (lR.SSJ-l-fN-e-Dimetylaminopurin^-yl)metyl-3-cyklopentan metanol;

Forbindelse nr 76 (1 S,3R) og (lE,3S)-l-(N-6-Dimetylaminopurin-9-yl)metyl-3-(metyl oksykarbonyl-D-

arginin)cyklopentan;

Forbindelse nr 77 N,N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-7-

etylaminoetanol;

Forbindelse nr 78 N,N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse nr 79 N,N-(6-DimetyIaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetoksykarbonyl-L-arginin;

Forbindelse nr 82 N,N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-7-tioetoksy-

etanol;

Forbindelse nr 83 N)N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-7-tioetoksi-etoksykarb onyl - L- arginin;

Forbindelse nr 84 (2S,4S) og ^R^R^-CRN-Dimetylaminopurin-g<->

yl)-4-(Metoksikarbonyl-D-arginin)-l,3-oksatiolan; Forbindelse nr 86 N,N-(6-Dimetylaminopurin-9-yI)-7-etoksy-etoksykarbonyl-D-arginin;

Forbindelse nr 87 N3N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-7-etoksy-etoksykarbonyl-D-arginin og

Mer fortrinnsvis er forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse valgt fra: Forbindelse nr 1 N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl D- arginin;

Forbindelse nr 2 N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl L-arginin;

Forbindelse nr 3 N-Monometylaminopurinyl Pentoksykarbonyl D-arginin;

Forbindelse nr 5 Aminopurinyl Pentoksykarbonyl D-arginin; Forbindelse nr 7 Hydrazinpurinyl Pentaksykarbonyl D-arginin; Forbindelse nr 8 Hydrazinpurinyl Pentoksykarbonyl L-arginin; Forbindelse nr 20 N-9-purinyl-7-pentyloksykarbonyl-D-arginin;

Mest fortrinnvis er forbindelsen i den nåtid forliggende oppfinnelse N,N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-pentoksykarbonyl-D-arginin.

De følgende forkortelser og definisjoner er brukt heri:

PHA - fytohemagglutinin

Con A - concanavalin A

CY - cyclofosfamid

PWM - kermesbær mitogen

LPS - lipopolysakarid

DEAD - dietylazodikarboksylat

PBS - fosfat buferet saltoppløsning

TBDPSCI - tert-butyldifenylsilyl klorid

CTX - Cytoxan

Betegnelsen "konservativ substitusjon" som anvent heri refererer seg til modifikasjoner og substitusjoner av aminosyrer som er konservative dvs. de som har en minimal influens på den sekundære struktur og hydropatiske natur til aminosyre eller peptid. Disse inkluderer substitusjoner slik som de beskrevet av Dayhoff i Atlas of Protein Sequence and Structure 5 ,1978, og av Argos i EMBO J., 8, 779-785, 1989. For eksempel vil aminosyrer som hører til følgende grupper representere konservative forandringer: ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, his; og phe, tyr, trp, his. De foretrukkede substitusjonene inkluderer også substitusjoner av D-isomerer for de tilsvarende L-amino syrer.

Det er blitt overraskende oppdaget at i motsetning til den veletablerte kjente teknikk behøver hypoxantin eller andre naturlig forekommende purinbaser så som adenin eller guanin ikke anvendes i konstruksjon av et immunostimulerende middel av typen lik ST 789. Faktum er at erstatning av hyposantin med en 6-substituert purinbase som ikke skjer i biologiske systemer kan tilveiebringe en like stor og til og med større grad av immunostimulering. Videre er det blitt overraskende oppdaget at aminosyren behøver ikke å være av den (naturlige) L-konfigurasjon.

Det skal erkjennes at konstruksjon av en naturlig forekommende aminosyre utelukker ikke anvendelse av rasemiske blandinger eller D-enantiomérer og i en side av oppfinnelsen er det spesielt ■ foretrukket å anvende aminosyrer i D-konfigurasjon.

Det er overraskende blitt oppdaget at forbindelse i henhold til oppfinnelsen har in vitro og in vivo aktivitet til å øke antall cytotoksiske T lymfocytter i pattedyret som blir behandlet.

Det er videre blitt oppdaget at forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse er overraskende aktive mot tumorvekst. Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen representerer en ikke-toksisk substitutt til levamisol i behandlingen av malignt melanom.

Når det blir testet-på mus mot eh kontrollgruppe inhiberer forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse signifikant tumorvekst når den brukes i kombinasjon med syklofosfamid eller 5-fluorurasil, spesielt mot brystkarsinom og kolonkarsinom.

Forbindelsene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved anvendelse av syntetiske fremgangsmåter som er velkjent på området. Således er det for eksempel mulig å følge den syntetiske prosedyren beskrevet av R. Stradi et al. i II Farmaco, 45, 39-47, 1990, med det unntak at kloratomet fra klorpurin mellom produktet må fjernes av en passende substituent forkjellig fra hydroksyl. Det er imidlertid foretrukket å utføre en modifikasjon av denne syntetiske prosedyre, som beskrevet i de følgende eksempler, hvori purinringen allerede er konstruert ved anvendelse av 6-klorpurin som et utgangsmateriale. Dette fjerner behovet for å bygge purinringen og tilveiebringer derfor en mer effektiv fremstilling med høyere utbytte av det ønskede immunostimulerende middel. Denne foretrukkende syntetiske vei er beskrevet i skjema 1.

I skjema 1 blir Pm' som er (CH0-2)i-8-O-CO-X<12> som definert ovenfor omsatt med en beskyttende gruppe i nærvær av en base, så som NaH/THF for å fremstille forbindelsen V. L representerer en avspaltningsgruppe som er velkjent for de med kunnskap på området. Enhver egnet avspaltningsgruppe kan anvendes. Pg er en beskyttende gruppe velkjent på området. Enhver egnet beskyttende gruppe kan anvendes.

Forbindelse V er koblet med forbindelse IV, for eksempel i nærvær av DEAD and PPh3/THF for å gi forbindelsen III. Forbindelse IV kan fremstilles ved å bruke kjente teknikker på fagområdet. Likeså kan Ri tilsettes før dette trinn eller på et senere trinn ved å bruke teknikker velkjent på området.

Forbindelse III blir avbeskyttet ved å bruke metoder velkjent for de med kunnskap på området, for eksempel med (C4H9)4NF/THF og AcOH for en OTBDPS beskyttende gruppe, for å gi forbindelse med II. Denne forbindelse ér videre evt. omsatt med en aminosyre eller en peptidgruppe av 1 -8 aminosyrers lengde, for eksempel i nærvær av C1COC1/THF og HjO. Den resulterende forbindelse er en forbindelse med formel I.

De med kunnskap på området vil vite at forbindelse med formel 1 hvori R4 ikke er en aminosyre eller peptidkjede kan syntetiseres ved å utnytte trinn 1-3 uten tillegg av trinn 4.

Det vil være kjent for de med kunnskap på området at forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer alle farmasøytiske akseptable derivater og analoger derav, såvel som alle isomerer og enantiomerer.

En annen side av oppfinnelsen er anvendelse av forbindelsen med formel 1 eller farmasøytiske preparat for fremstilling av et medikament.

En annen side av oppfinnelsen er fremgangsmåten til behandling av et pattedyr, fortrinnvis et menneske, som omfatter trinnet å administrere en forbindelse med formel I, en farmasøytisk blanding eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav for behandling av immunsvikt eller kontroll av tumorvekst.

Det vil være kjent av de med kunnskap på området at referensen heri til behandling strekker seg til profylakse såvel som behandling av etablerte infeksjoner eller symptomer og inkluderer derfor kontroll av tumorutvekst.

Det vil videre være kjent at mengden av en forbindelse i henhold til oppfinnelsen som er nødvendig for anvendelse i behandling vil variere ikke bare med den spesielle forbindelse valgt men også med administrasjonsveien, typen av lidelse som blir behandlet og alder og tilstand til pasienten og vil til slutt være et valg av den behandlende lege eller veterinær.

Generelt vil imidlertid en egnet dose være i området fra ca. 0,1 til ca.

250 mg/kg kroppsvekt per dag. Fortrinnvis vil dosen variere fra ca. 1 til ca 1 QOmg/kg/dag. Mer fortrinnsvis ca 2 til ca 20 mg/kg. Mest fortrinnsvis ca 2,5 mg/kg. Enda mer fortrinnsvis ca. 450mg/m<2>.

Den ønskede dose kan passende være presentert i en enkel dose eller som oppdelte doser administrert med egnede intervaller, for eksempel som to, tre, fire eller fler underdoser per dag.

Forbindelsen er egnet administrert i enhetsdoseform, for eksempel som inneholder 10 til 1500 mg, passende 20 til 1000 mg, mest passende 50 til 700 mg av aktiv ingrediens per enhetsdoseform.

Ideelt bør den aktive ingrediens administreres for å oppnå topp plasmakonsentrasjoner av den aktive forbindelse. Dette kan oppnås for eksempel ved intravenøs injeksjon av en oppløsning av den aktive ingrediens, i saltoppløsning, eller administrert som en bolus. Ønskede blodnivåer kan . oppretholdes ved en kontinuerlig infusjon eller ved avbrutte infusjoner.

Mens det er mulig at en forbindelse i henhold til oppfinnelsen, for anvendelse i terapi, kan administreres som det rå kjemikalium er det fordelaktig å presentere den aktive ingrediens som en farmasøytisk formulering.

Oppfinnelsen tilveiebringer således videre en farmasøytisk formulering som omfatter forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere og evt. andre terapeutiske ingredienser. Bæreren(ene) må være "akseptable" i den betydning at de er kompatible med de andre ingredienser i formuleringen og ikke skadelig for mottakeren.

Farmasøytiske formuleringer inkluderer de egnet for topisk, oral, rektal, nasal eller parenteral (inkludert intramuskulær, subkutant og intravenøs) administrering eller i en fonn egnet for administrering ved innhalasjon eller insuflasjon. Formuleringen kan hvor det er egnet være passende presentert i adskilte doseenheter og kan fremstilles ved enhver av de metoder som er velkjent i farmasiområdet. Alle fremgangsmåter inkluderer trinnene å bringe den aktive forbindelse, i assosiasjon med flytende bærere eller fint oppdelte faste bærere eller begge deler og deretter hvis nødvendig forme produktet i en ønsket formulering.

For topisk administrering på huden kan forbindelsen i henhold til oppfinnelsen formuleres som salver, kremer eller hudvann eller som et transdermalt plaster. Slike transdermale plaster kan inneholde penetrasjonsøkere, så som linalol, karvakrol, tymol, sitral, mentol og t-anetol. Salver og kremer kan for eksempel være formulert med en vandig eller oljeaktig base med en tilsetting av egnet fortykningsmiddel og/eller geleringsmiddel. Hudvann kan formuleres med en vandig eller oljeaktig base og vil generelt også inneholde en eller flere emulgeringsmidler, stabiliseringsmidler, dispergeringsmidler, suspansjonsmidler, fortykningsmidler eller fargemidler.

Farmasøytiske formuleringer som er egnet for oral administrering kan passende presenteres som adskilte enheter, så som kapsler eller tabletter. Hver trykkpakke kan omfatte et egnet drivmiddel, så som diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetrafluonnetan, karbondioksid eller andre egnede gasser. I tilfelle av en trykk aerosol kan doseenheten være bestemt av å tilveiebringe en ventil som leverer en utmålt mengde.

Alternativt for administrering for inhalasjon eller insuflasjon kan forbindelsen i henhold til oppfinnelsen være i form av en tørr pulversammensetning, for eksempel en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase så som laktose eller stivelse. Pulverblandingen kan presenteres i enhetsdoseform i for eksempel kapsler eller magasiner eller for eksempel gelatinpakker eller blisterpakker fra hvilke pulveret kan administreres ved hjelp av en inhalator eller insuflator.

Hvis ønsket kan det anvendes de ovenfor beskrevne formuleringer adaptert til å gi en opprettholdt frigjøring av den aktive ingrediens.

Forbindelsen i henhold til oppfinnelsen kan også brukes i kombinasjon med andre terapeutiske midler, for eksempel andre immunomodulatorer eller tumorkontrollmidler.

Oppfinnelsen tilveiebringer således i en ytterligere side, en kombinasjon som omfatter en forbindelse med formel (I) eller et fysiologisk akseptabelt eller et fysiologisk akseptabelt derivat derav sammen med et annet terapeutisk aktivt middel.

Slike terapeutisk aktive midler inkluderer cytotoksiske midler brukt til å behandle tumører. Slike cytotoksiske midler inkluderer syklofosfamid eller 5-fluorurasil (5-FU).

Fortrinnsvis varierer syklofosfamid-doser brukt i behandling av tumører fra ca. 10 til ca. 1000 mg/m<2>. Mer fortrinnsvis fra ca. 100 til ca. 500 mg/m<2>. Mest fortrinnvis ca. 350 mg//m2/dag.

I tillegg varierer 5-fluorurasildoser brukt i behandling av tumører fortrinnsvis fra ca. 0,1 til ca. 2540 mg/kg. Fortrinnsvis mellom ca. 1 til ca. 50 mg/kg. Mer fortrinnsvis mellom ca. 5 til ca. 20 mg/kg. Mest fortrinnsvis ca. 12 mg/kg (500 mg/m<2>).

Som vil erkjennes av folk med kunnskap på området for kreftbehandling vil slike do,ser variere med typen av sykdom som behandles, sydomstrinnet, i responsen til tumoren osv..

Kombinasjonen referert til ovenfor kan passende presenteres for anvendelse i form av en farmasøytisk sammensetning og således omfatter den farmasøytiske sammensetning i en kombinasjon som definert ovenfor sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer derav og omfatter en ytterligere side av oppfinnelsen.

De individuelle komponenter i en slik sammensetning kan administreres enten etter hverandre eller samtidig i adskilte eller kombinerte farmasøytiske formuleringer.

Når en forbindelse med formel (I) eller et farmasøytisk akseptabelt derivat derav er brukt i kombinasjon med et annet terapeutisk middel kan dosen til hver forbindelse være enten det samme eller avvike fra den når forbindelse er brukt alene. Egnede doser vil lett være kjent av de med kunnskap på området.

I en ytterligere utforming av oppfinnelsen er det tilveiebrakt en fremgangsmåte til behandling av immunsvikt eller for kontroll av tumorvekst som omfatter trinnene og administrere en farmasøytisk akseptabel mengde av en forbindelse i henhold til oppfinnelsen.

Fortrinnsvis inkluderer slike tumører malingt melanom, brystkarsinom og kolonkarsinora.

Mer fortrinnsvis er det tilveiebrakt en fremgangsmåte forbehandling av brystkarsinom som omfatter trinnet å administrere en famasøytisk akseptabel mengde av en forbindelse i henhold til oppfinnelsen i kombinasjon med syklofosfamid.

Mest fortrinnsvis er det tilveiebrakt en fremgangsmåte for behandling av kolonkarsinom som omfatter trinnet å administrere en farmasøytisk akseptabel mengde av en forbindelsen i henhold til oppfinnelsen, I kombinasjon med 5-fluorurasil.

Forbindelsen vil videre beskrives ved de følgende eksemplene som ikke skal begrense oppfinnelsen på noen måte. Alle temperaturer er i grader celsius.

EKSEMPLER

Forbindelsen i henhold til formel 1 ble syntetisert og testet for immunologisk aktivitet ved å bruke fremgangsmåtene beskrevet nedenfor.

EKSEMPEL la Syntese av N,N-bimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl D-Arginin -

t

Forbindelse nr. 1

Trinn 1: a) Syntese av beskyttet 1,5 - pentandiol

4.0 g.s 36,3 mmol av pentandiol ble oppløst i 75 ml tørr tetrohydrofuran og omrørt under argongjennomstrømning. Natriumhydrid (1,4 g., 57,8 mmol) ble tilsatt og suspensjonen ble omrørt i 30 minutter og deretter ble tert-butyldifenylsilylklorid (8,0 ml, 30,8 mmol) oppløst i 25 mml tørr tetrahydrofuran tilsatt dråpevis til dioloppløsningen. Reaksjonen ble omrørt ved omgivelsestemperatur og under argon natten over. Suspensjonen ble deretter heilt på 100 ml eter. Etersuspansjonen ble vasket med 10% kaliumkarbonat (100 ml), saltoppløsning (100 ml) og tørket med magnesiumsulfat. Fjerning av oppløsningsmiddelet under våkum ga 10,3 g., 30,1 mmol av produktet i en 98% utbytte som ble brukt uten ytterligere rensing.

b) Kobling av forbindelsen I med 6-klorpurin.

Til en omrørt oppløsning av trifenylfosfin (4,7 g., 17.9 mmol), og 6-klorpurin (2,3

g., 15,1 mmol) i 100 ml tørr tetrahydrofuran, under argongjennomstrømning, ble tilsatt dietylazodikarboksylat (DEAD, 2,8 ml, 17,9 mmol). Etter 10 minutter ble forbindelse 1 (4,7 g., 13,7 mmol) oppløst i 20 ml tørr tetrahydrofuran tilsatt dråpevis til reaksjonen, som ble deretter omrørt ved omgivelsestemperatur og under argon natten over. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i våkum og det rå produkt ble renset ved flash-silikagelkromatografi ved å bruke 30% etylacetat-heksan som evalueringsmiddel (R = 0,30). Produktet, forbindelse II,

3.7 g., 7,6 mmol ble oppnådd med 55% utbytte som en fargeløs olje.

Trinn 2: Fjerning av den silylbeskyttende gruppe

2,3 g., 4,4 mmol av forbindelse II ble oppløst i 40 ml tørr tetrahydrofuran og omrørt under argon-gjennorhstrømning. Tetrabutylammoniumfluorid (5,3 ml, 5,1 mmol) ble tilsatt og reaksjonen ble omrørt ved omgivelsestemperatur under argon natten over. Til oppløsningen ble det satt eddiksyreis (90,31 ml, 5,3 mmol) og oppløsningsmiddelet ble fjernet i våkum. Det rå produkt ble renset ved flash silikagelkromatografi ved å bruke 10% metanol-etylacetat som elueringsmiddel (Rf = 0,20). Produktet ble tatt opp i minimalt metylenklorid og filtrert gjennom celitt for å fjerne silika. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i våkum og produktet tørket og det gav forbindelse III, 1,0 g, 4,2 mmol med 95% utbytte.

Trinn 3: Kobling av forbindelse III med D-arginin.

1,0 g, 4,2 mmol av 6-klorpurinylpentanol, forbindelse III, ble oppløst i 75 ml tørr tetrahydrofuran og omrørt under argongjennomstrømning. Toluenisk fosgen (4,4 ml, 8/3 mmol) ble tilsatt og reaksjonen ble overvåket ved TLC (utviklet i metanol) og fortsatt inntil mellomproduktet klorformat var det dominerende produkt (6-10 timer). Oppløsningsmiddelet ble fjernet i våkum og resten ble tatt opp i 50 ml tørr tetrahydrofuran. D-arginin (0,94 g, 5,4 mmol), oppløst i 5 ml vann ble satt til

klorformatsuspensjon. En annen 5 ml porsjon av vann ble brukt for å rense begeret som inneholdt argininoppløsningen og deretter tilsatt reaksjonen. Reaksjonen ble omrørt natten over ved omgivelsestemperatur og deretter ekstrahert med toluen (60 ml). Toluen ble tilbakeekstrahert med vann (60 ml) og de kombinerte vandige porsjoner ble brakt til en alkalisk pH verdi ved tilsetting av 5% natriumbikarbonat. Vann ble fjernet i våkum og resten ble oppløst i metanol (10 ml). Etter filtrering ble den metanoliske oppløsning tilsatt dråpevis til 500 ml kraftig omrørt aceton.

Bunnfallet ble oppsamlet ved filtrering og vasket flere ganger med aceton. Filtratet inneholdt ureagert III. Bunnfallet ble tørket og deretter oppløst i vann (150 ml). Til den vandig oppløsning ble det tilsatt dimetylamin (40% vandig oppløsning, 5,0 ml, 40 mmol) og reaksjonen ble omrørt i 3 timer ved omgivelsestemperatur. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i våkum og det rå produkt ble renset ved flash silikagelkromatografi, ved å bruke metanol som elueringsmiddel (Rf = 0,25). De kombinerte produktfraksjoner ble redusert i volum (tilnærmet 5 ml)og lagret ved 4°C i 2 timer. Oppløsningen ble sentrifugert i 10 minutter (375 x g) for å fjerne silika, og supernatanten ble tilsatt dråpevis til 500 ml kraftig omrørt eter. Bunnfallet ble oppsamlet ved filtrasjon og tørket for å gi N,N-dimetylarninopurinyl pentoksykarbonyl D-arginin, forbindelse nr 1, 0,79 g, 1,8 mmol med 43% utbytte.

Sp (mykner ved 119°C) = 123° - 125°C

Rf silika (metanol) = 0,30

<*>HNMR CDMSO - dt, 300 MHZ, 5 in ppnt> ; 9.40 (1H, br, s,

COQH); 8.20 (1H, s, purin ); 8.15 (1H, sr purin 8.0

- 7.3 (4H, b, guanldia ); 6.33 (1H, d, MH),- 4.13 (2H,

t, N-CHjJ; 3.8S (2H,t, O-CH,); 3.63 (IS. m, .C"H); 3.36

(6H, s, b, N-(CT,)j); 3.02 (2H, b, C^B) ; l. B-1.2 (10H, m,

C<*>H. C<T>H,-(CHjJj -). MS (high-cesolution FAB, glycerol);

m/e, 450.25780; calculated for M+H<*>, (CuH„0«N|),

450.25773.

EKSEMPEL lb Alternativ syntese av N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarboonyl D-arginin - forbindelse nr 1.

Trinn 1: En modifisert syntese av forbindelse nr 1 ble foretatt ved reaksjon av beskyttet 6-kIorpurinylpentanol, forbindelsen II (fremstilt som beskrevet i eksempel la) med vandig dimetylamin, fulgt av avbeskyttelse for å gi forbindelse V og kobling med D-arginin (koblingreaksjonen er som beskrevet i eksempel 1 a) for å gi produktet. De spektrale kromatografiske egenskaper var identiske til produktet . oppnådd fra syntesen beskrevet i eksempel 1 a.

Et typisk eksempel på reaksjonen med beskyttet 6-kloropurinyl pentanol, forbindelse II, med dimetylamin er som følger; til 0,13 g, 0,26 mmol av forbindelse II oppløst i 20 ml tetrahydrofuran ble det satt dimetylamin (40% vandig oppløsning, 0,5 ml, 10,0 mmol) Reaksjonen ble omrørt i 18 timer ved omgivelsestemperatur og oppløsningsmiddelet ble fjernet i våkum. Råproduktet ble renset ved flash silikagelkromatografi ved å bruke 50% etylacetat-heksan som elueringsmiddel (Rf = 0,27). Produktet forbindelsen V, 0,12 g, 0,30 mmol ble oppnådd med 94% utbytte.

EKSEMPEL 2 Syntese av N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl

L-arginin - forbindelse nr 2.

L-enantiomer av forbindelse nr 1, forbindelse nr 2, ble syntetisert som beskrevet ovenfor i eksempel lb for å gi 50 mg av produktet som et hvitt faststoff.

Sp (mykner 118°C) = 123° - 125°C.

Spektralegenskaper var identiske med forbindelse nr 1.

EKSEMPEL 3 Syntese av N-Monometylaminopurinyl Pentoksykarbonyl

D-arginin - forbindelse nr 3.

Forbindelse nr 3 ble syntetisert som beskrevet ovenfor i eksempel lb, med unntagelse av at dimetylamin var estattet med metylamin (40% vandig oppløsning) for å gi 6-metylaminopurinyl pentanolforbindelse nr 3a. Denne ble deretter koblet med D-arginin som beskrevet i eksempel 1 a for å gi 32 mg av produktet.

Sp (mykner ved 127°C) = 133°C.

Rf silika (metanol) = 0,20

'HNMR (DMSO-d6, 30 Mhz, 5, i ppm);

9.30 tlH, b, COOH), 8.21 (IK. s, purin.); 8.13 (1H, s, purla );

7.8-7.2 (4H, b, guanidia 6.29 (1H. a. Nn); 4.13 (2H, t. N-

. CHj) ; 3.86 (2H, t, O-CHj) ; 3.6r(lH, m, C"H}; 3.17 <1H, m, CHj-N-

E); 3.02 (3H, b, HN-CTj) ; 2.97 {2H, b, C^J ; 1.9-1.2 (10H, m.

EKSEMPEL 4 Syntese av N-Monometylaminopurinyl Pentoksykarbonyl

L-arginin - forbindelse nr 4.

L-enantiomeren av forbindelse nr 3 og forbindelse nr 4, ble syntetisert som beskrevet ovenfor i eksempel 3 og ga 44 mg av produktet som et hvitt faststoff.

Sp (mykner ved 123°C) = 132° - 134°C.

Rf silika (metanol) = 0,20.

Spektralegenskaper var identiske med forbindelsen nr 3.

EKSEMPEL 5 Syntese av Aminopurinyl Pentoksykarbonyl D-arginin -

forbindelse nr 5.

Forbindelsen nr 5 ble syntetisert som beskrevet ovenfor i eksempel lb med unntagelse av at 6-klorpurinyl pentanol, forbindelsen II, ble omsatt med ammoniakkgass i steden for dimetylamin. 6-aminopurinyl (adenin) produktet ble deretter avbeskyttet for å gi alkoholforbindelsen nr 5a. Denne ble igjen koblet med D-arginin og for å gi 260 mg av produktet som et hvitt faststoff. Et typisk eksempel på reaksjonen til forbindelse II med ammoniakk er som følger; 0,42 g, 0,88 mmol av forbindelse II ble oppløst i 75 ml absolutt etanol og oppløsningen ble plassert på et isbad. Ammoniakkgass ble boblet igjennom den avkjølte oppløsningen i 10 minutter og den mettede oppløsning ble overført til en bombe (150 ml sylinder). Ammoniakkgass ble boblet igjennom oppløsningen i enda et minutt, bomben forseglet og bomben ble oppvarmet natten over i 120°C oljebad. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i våkum og ga 0,40 g, 0,88 mmol av produktet med 95% utbytte. Dette produkt ble brukt uten ytterligere rensing. Egenskaper til forbindelse nr 5:

Sp (mykner ved 143°C) - 150°C.

Rf silika (metanol) = 0,20

yon rt*so-d.. 3oo «Hz, s i M! 9.40 (1H( b( Qx^ j 8 ^

UH. s. purin ); 8.13 Uh, s, purin ,, a.o - 7.0 (6H, m

* TT' H* i' 6'36 (1H' ^ m! i- 12 i2E-'' -<*)"..7

<«. t. O-CH,,; 3.65 <1H. «. 3.03 (2H. b, rt,; 1.9-A

HOH, m, <£S,)a-).

EKSEMPEL 6 Syntese av Hydrazinpurinyl Pentoksykarbonyl D-arginin -

forbindelsen nr 7.

Forbindelse nr 7 ble syntetisert som beskrevet ovenfor i eksempel 1 a med unntagelse av at dimetylamin ble erstattet med hydrazin fra den tilsvarende alkoholiske forbindelse nr 7a. Således i et typisk eksempel ble 50 mg, 0,11 mmol av 6-klorpurinyl pentoksykarbonyl D-arginin opplost i 5 ml 95% etanol omsatt med hydrazinhydrat (12 jaI, 0,40 mmol) ved omgivelsestemperatur natten over. Reaksjonen ble deretter langsomt avkjølt til 0°C i 3 timer, og de resulterende krystaller ble oppsamlet ved filtrering og vasket med kald etanol. Det hvite faststoffproduktet, 32 mg, 0,07 mmol ble oppnådd med 65% utbytte,

mp (mykner ved 130°C) = 134°C

Rf silika (metanol) = 0,27

<l>HNMR (DMSO-cU, .300 MHz, 6 i ppaj ; 9-20 {1H, b, COOH) ,- 8.23

(1H, s, purin. ),- 8.14 (1H, s, purin ); 7.4 (3H, b, guanidin );

6.6 (2H, b, HR,); 6.43. (1E, d, NH) ; 4.14 (2H, t, N-CHj); 3.87

<2H, t, O-CH,); 3.64 (1H, rt> ; 3.04 (2H, b, C*B) ; l.B-1.3

(10B. m, C^H, C<1>^, - (CHj))-) .

EKSEMPEL 7 Syntese av Hydrazinpurinyl Pentoksykarbonyl L-Arginin

- forbindelse nr 8.

L-enantiomeren av forbindelse nr 7, forbindelse nr 8 ble syntetisert som beskrevet i eksempel 7, for å gi 40 mg av produktet som et hvitt faststoff.

Sp (mykner ved 130°C) = 134°C.

Rf (silika) metanol = 0,27

Spektralegenskaper var identiske med forbindelse nr 7.

EKSEMPEL 8 Syntese av N.N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl

Glysin - Forbindelse nr 14

Forbindelse nr 14 ble syntetisert som beskrevet overfor i eksempel lb med unntagelse av at koblingsreaksjonen ble foretatt i mindre skala med glysin, 68 mg, 0,91 mmol, isteden for arginin og den fri glysinbasen ble dannet in situ ved tilsetting av 3 ekvivalenter natriumkarbonat (relativt til alkoholen). Råproduktet ble renset ved flash silikagelkromatografi, ved å benytte 50% metanol-etylacetat som elueringsmiddel (Rf = 0,35). Silika ble fjernet ved å oppløse produktet i metylenklorid, etterfulgt av filtrering. Fjerning av oppløsningsmiddelet i våkum ga 30 mg av produktet som et hvitt faststoff.

Smeltepunkt (mykner ved 100°C) = 126°C.

Rf silika (1:1 metanol-etylasetat) = 0,35.

<1>HNMR (DMSO-d6, 300 MHz, 5 i ppm); 8.20 (s, 1E, purin ); 8.16

<S, 1H, purin ); 6.05 UH, t, UH); 4.14 (2H, C, N-CHj); 3-86

(2H, t, 0-CH3);3.33 (6H, S, b, N-{CH,)2>; 3.18 (2H, d, C^Hj);

1.8D (2H, m, CBy) ; 1.55 [2H, m, CHS); 1.26 (2E, in, CHj);

EKSEMPEL 9 N,N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-7'-etyloksyetoksykarbonyl-D-arginin - Forbindelse nr 15

Trinn 1: N,N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-5-etoksyetoksy-t-butyldifenylsilan.

Til en oppløsning av alkohol (0,201 g, 1 ekv) i vannfri THF (2,9 ml), ved værelsestemperatur under argon ble det tilsatt påfølgende 6-klorpurin (90 mg, 0,58 mmol), Ph3P (0,199 g, 1,3 ekv) og DE AD (0,12 ml, 1,3 ekv). Den gule oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer. THF ble inndampet og resten ble kromatografert (6:4, Heksan/EtOAc) for å gi en blanding av (EtC>2CNH)2 og den koblede purin. Til en oppløsning av denne blanding i THF (6 ml), ved romtemperatur ble det tilsatt 40% Me2NH/H20 (0,70 ml, 10 ekv). Oppløsningn ble omrørt ved romtemperatur i 45 minutter og ble deretter heilt i mettet vandig NaHC03/CH2Cl2. Fasene ble separert og den vandige vase ble ekstrahert med CH2CI2 (2x). De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over MgSO*, faststoffet filtrert og oppløsningsmidlene inndampet. Resten ble renset ved flashkromatografi (silika gel, 2:8 HexMcOEt) for å gi 0,16 g (55%) av den koblede dimetylaminopurin.

Trinn 2: N,N-(6-Dimetylaminopurinyl-9-yl)-5-etoksyetanol - forbindelse nr 85.

Til en oppløsning av silan (0,16 g, 0,32 mmol) i vannfritt THF (3.2 ml), ved romtemperatur, under argon ble det tilsatt nBu4NF 1.0 M/THF (0,32 ml, 1,1 ekv). Oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer og oppløsningsmiddelet ble inndampet i våkum. Resten ble øyeblikkelig renset ved flashkromatografi (silika gel, 4:1 AcOEt/MeOH) for å gi 72 mg (89%) av alkoholforbindelsen nr 85 som en klar olje.

'HrødR (CDClj): 6 6.29 is, 1H, purin ), 7.80 Is, 1H.

purin >, 4.33 (t, 2H, Oi2) , 3.82 (t, 2H. CH2) , 3.68 (t,

2H, CH,), 3.55 (t, 2H, CB,J, 3.50 (m, 6H, N{CH3)2).

Trinn 3: N,N-(6-Dimetylaminopurin-9-yl)-7-etoksyetoksykarbonyl-D-arginin - Forbindelse nr 15

Til en oppløsning av alkoholen , forbindelse nr 85 (72 mg, 0,29 mmol) i vannfri THF (4,8 ml), ved romtemperatur, under argon, ble det tilsatt COCl2/Tolouen 1,93 M"(0,30 ml, 2 ekv) og oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 5 timer. THF ble inndampet i våkum og resten ble gjenoppløst i THF (3.6 ml). Til denne oppløsningen ble det tilsatt en oppløsning av D-arginin i vann (65 mg, 1,3 ekv/0,5 ml H2O). Beholderen som inneholder D-arginin oppløsning ble vasket med 0,5 ml H20 og reaksjonsblåndingen ble omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Den ble deretter ekstrahert med toluen og toluenfasen ble tilbakeekstrahert med H20. De kombinerte vandige lag ble brakt til ph-verdi 7,5-0,8 (NaHC03 5%) og vannet ble inndampet. Resten ble renset ved flashkromatografi (silikagel, 100% MeOH). Fraksjonene som inneholder forbindelsen ble inndampet og resten ble oppløst i en minimumsmengde av MeOH. Et20 ble deretter tilsatt og oppløsningsmidlene ble dekantert for å gi en hvit gummi som ble tørket under høyt våkum. Forbindelsen ble oppnådd som et hvitt faststoff (42 mg, 33%).

lB NMR (DMSO-d,) : 5 8.25 (s, 1H, purin ), 8.14 (s, 1H,

puxine), 6.5 (bd, 1H. KM). 4.37 (t, 2H, CS, linker),

4.03 (m, 2H, CH, linker)3-81 (m, 2H, CHj linker), 3.72

(m, 1H, C"H>, 3.60 (m, 23, CH, linker), 3.55-3.69 (m,

6H, N(qj,)j), 3.05 (m, 2H, C"H,), 1.78-1.39 (m, 4H, C<*>H,. CTHi) .

EKSEMPEL 10 (2S, 4S)-2-(N,N-dimetylaminopurin-9-yI)-4-(metyloksykarbonyl-D-arginin)-l,3-dioksolan - Forbindelse nr 16

Trinn 1: (4S)-2,2-dimetyl-ls3-dioksolan-4-t-butyldifenylsilylmetanol.

Til en oppløsning av (4S)-2,2-dimetyI-I,3-dioksolan-4-metanol (lg, 7,57 mmol) i vannfritt CH2CI2 (76 ml), ved romtemperatur under argon ble det tilsatt suksessivt imidazol (] ,03 g, 2 ekv) og t-BuPh2SiCl (1,95 ml, 1,1 ekv). Et hvitt bunnfall ble dannet øyeblikkelig. Denne suspensjon ble omrørt ved romtemperatur i 1 time og deretter helt i mettet vandig NaHC03- Fasene ble separert og det vandige lag ble ekstrahert med CH2CI2 (2x). De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over MgS04, faststoffene ble filtrert og oppløsningsmidlene inndampet for å gi 2,80 g (100%) av silan som en klar olje.

Trinn 2: (2S)-3-t-Butyldifenylsilylpropantriol

Til en oppløsning av silanet (1,01 g, 2,73 mmol) i en 4:1 blanding av THF/H2O (15 ml) ved romtemperatur ble det.tilsatt TFAA (0.5 ml, 2,4 ekv) og oppløsningen ble oppvarmet ved 50°C i 5 timer. Den ble deretter helt i mettet vandig NaHC03/CH2Cl2 og fasene ble separert. Det vandige lag ble ekstrahert med CH2CI2 (2x) og de kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over MgS04. Oppløsningsmidlene ble inndampet og resten ble renset ved flashkromatografi (silikagel, 1:1 Hex/EtOAc) for å gi 0,62 g (70%) av diolen som en klar olje.

Trinn 3: (2S, 4S)-2-bensoyloksymetyl-4-t-Butyldifenylsilyloksymetyl-l,3-dibksolan.

Til en oppløsning av diolen (0,62 g, 1,89 mmol) og av aldehydet (0,31 g, 1 ekv) i vannfritt toluen (19 ml), ved romtemperatur under argon ble det tilsatt en kat. mengde av PPTS. Oppløsningen ble underkastet tilbakeløp i 18 timer etter hvilken tid den ble helt i mettet vandig NaHC03/CH2Cl2. Fasene ble separert og det vandige lag ble ekstrahert med CH2CI2 (2x). De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over MgS04 og oppløsningsmidlene ble inndampet. Resten ble renset ved flashkromatografi (silikagel, 9:1 Hex/EtOAc) for å gi 0,49 g (55%) av en 5:1 (cis/trans) blanding av dioksolaner.

Trinn 4: (2S,4S)-2-Hydroksymetyl-4-t-butyldifenyIsilyloksymetyl-l,3-dioksolan.

Til én oppløsning av bensoatet (0,49 g, 1,03 mmol) i vannfritt MeOH (10.3 ml) ved romtemperatur under argon ble det tilsatt MeONa/MeOH 4,37 M

(24 u, 0,1 ekv). Oppløsningen ble omrørt i 18 timer etter hvilke den ble helt i mettet vandig NH4CI/CH2CI2. Fasene ble separert og den vandige fase ekstrahert med CH2C12 (2x). De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over MgSO«, faststoffene ble filtrert og oppløsningsmiddelet ble inndampet. Resten ble renset ved flashkromatografi (silikagel, 3:1 Hex/EtOAc) for å gi cis-alkoholen (0,26 G, 67%) som en klar olje.

Trinn 5: (2Sf 4S)-2-(N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4-t-butyldifenylsilyloksymetyl-1,3-dioksolan.

Forbindelsen ble fremstilt ved å bruke en lignende metode som i eksempel 15, trinn 1

Trinn 6: (2S, 4R)-2-(N,N-dimet<y>laminopurin-9-yl)-4-hydroksymetyl-l,3-dioksolan.

Forbindelsen ble fremstilt ved å bruke lignende metode som i eksempel 15, trinn 3.

Rensing: 10% MeOH/EtoAc.

,BUMR (CDCl,): S 8.32 is, 1H, purin.), 7.7S is, 1H,

purin ), 5.33 (dd, 1H, J=2.0, 6.6, H-2-dioxolan ,

5.33 tbs, ia, OH), 4.45 (dd, 1H. J-6-6. 14.3» CTj-

purin), 4.20 (dd, 1H, J=2.0, 14.3, CTi-purin ), 4.20

(m, 1H, H-4-dioxolan ), 4.05 (d; 2H, JO.2, H-5) ,

3.78 (d, 1H, J=13.0; CTj-OH) 3.53 (bs, 6H, (CTj)jN),

3.40 (d, IH, J-13.0, CHa-OH) .

Trinn 7: (2S, 4S)-2-(N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4-(metyloksykarbonyI-D-arginin)-],3-dioksolan - Forbindelse nr 16.

Forbindelsen nr 16 ble fremstilt ved å bruke en lignende metode som i eksempel 15, trinn 3.

Rensing: MeoH 100%

<1>HNMR UJMSO-d,): 5 6.43 (s, lfl, purine), 8.11 (S, lH,

^puriae), .6.6 (mi, ih, rø). 5.28. (m, ih, b-2-

"■^l^0^^.*. *'39 (m« 2a'<q>jj-purine). 4.26 (m, ln, H-

..4-^oxolane), <*;" 3H, Cs, C^-bco-a-

..^1^/3.71 2H. 1-5^,, 3.3, å.

«*>*>. 3.07 »,"<*,.lto-^s

CTI,) . -''

EKSEMPEL 11 Syntese av N-(6-Dimetylamino-8-brompurinyl-9-yl)-Pentoksykarbonyl L-Arginin.-

Forbindelse nr 17.

lH NMR (DMSO-di, 400 MHz, 6 in ppm): 9.5 (IH, s, b, COOH), 8.19 (1H, s, purine), 8.1-7.2 (4H, b, guanldine), 6-30 (IB, d, NH), 4.11 {2H, t, N-CHj). 3.B7 (2H, t, CTj-O) , 3.'64 (lfl, m, C*H) , 3.39 (6H, 3, b, N-(CH,),), 3.02 (2H, m, C*H) , 1.8-1.2 (10H, m, c"H,

CTH, -'(Ola)!-).

m.p. (softens 115-118<»>) = 124-127°C.

Rf silica (70% methanol-ethyl acetate) = 0.2 5

Sp (mykner 115-118°)= 124-127°C.

Ri silika (70% metanol-etylacetat) = 0.25

EKSEMPEL 12 Syntese av N-(6-dimetylamino-8-brompurin-9-yl)-7-pentoksykarbonyl-D-arginin - Forbindelse nr 18.

<X>H NMR {DMSO - dg, 400 MHz, 8 i ppm); 9.08 (IB, br s, COOH) ;

8.18 (IH, s, purin ); 7.9-7.3 (4H, br s, guanidin ); 6.34 (IH, d, UH); 4.10 (2H, t, N-CHj); 3.86 (2B, m, O-CE2); 3.55 (IB, ln, C^H);

3.35 (br S, N-(q33)2); 3.03 (2H, m, C^); 1.9-1.2 (10B, m,

(CH2)3, CTH2, CPH2).

Sp (mykner ved I16°C) = 122-125°C

Rf silika (70% metanol-etylacetat) = 0,25

EKSEMPEL 13 N-9-purinyl-7-pentyloksykarbonyl-D-arginin-Forbindelse nr 20.

NMR. 5 (EMSO i Ppm) : 9-10 <s- IB, purin ), B.93 (S, IH, purin. ), 8.64 (s, 12, purin. ), 7.77 (bfi, 4H, ffuanidin ). 6.25

Ibs, IB, NR), 4.28 (t, 2H, CHj-O-) , 3.B7 (t, 2H, q^-S) , 3.58

(m, IH, C°H), 3.09 (m, 2H, CB^-N), 1.20-1.90 (m, 10H, SaO^).

Rensing: metanol

Rf (silika) = 0,23 (metanol)

EKSEMPEL 14 N-9-purinyI-7-pentoksykarbonyl-L-arginin -

Forbindelse nr 21

<l>H NMR 8 (DMSO i ppm): 9.13 (s, IH. purin ), 8.94 (s, IH,

purin }, 8.66 (s, IH, purin ), B.25 (bs, IH, NE), 7.44 (bs, 3H, Sruanidin ), 6.82-(bs, IH, VB), 4.28 (t, 2H, CH2-0) , 3.88 (t, 2H,

CHj-N), 3.72 (mf IH, C°H), 3.07 (m, 2H, CHj-N), 1.19-1.95 (m,

10H, SxCBj) .

<13>c NMR (5 CD3OD i ppm): 179.47, 159-21, 158.95, 153.79,

153:41, 140.07, 135.42, 66.06, 57.37, 45.38, 42.66, 31.88,

30.93, 30.11, 26.67, 24.65.

Rensing: metanol

Rj (silika) = 0,23 (metanol)

EKSEMPEL 15 Syntese av N,N-Dimetylaminopurinyl Pentoksykarbonyl L-Valyl L-Prolyl L-Leukin - Forbindelse nr 22

(CD30D, 400 MHz,8 i ppm) 8.22 (IH, s, purla ); 8.05 (IH,

s, purin ); 4.60 (IH, t, 0%) ,-. 4 .3-3 .6 {8H, n, N-CH^, , (

CH2-0, 2 x ( fla)- 3.51 (SH. S< b, N-<CH3)2,; 2.2-1.2 (14H, m, -

(<CH2>)3-, 2 x cP<h>j, c%, cTHj,, C7h) ,- 1.0-0.B (12H, m, 2 x cP-CHj ,

2 x CT-ch,.

Smeltepunkt = 168 °C

Rf silika (40% metanol-etylacetat) = 0,40

EKSEMPEL 16 Syntese av N,N-Dim etyl aminopurinyl Pentoksykarbonyl L-Isoleukyl L-Prolyl L-Isoleukin - Forbindelse nr 23

<1>HNMR (CD3OD, 400 MHz, 5 ln ppm); B.21 {IH, s, purin ); 8.03

(IH, S. purin.); 4.62 (1 H, t, C°S) ; 4. 22 (4H, m); 4.03 (2H, m);

3.85 (IB, m, Cs) ; 3.67 (IH. d, CPBY; 3.50 (6H, s, b. K-

(CH3)2); 2.1-1.0 (16H, a, -(CH2)3-, cft^, , 2 x C&H, 3 x Cffi^) ;

0.95 (6H, d, 2 x cPcHj); 0.87 (6 H, t. 2 x CT-CHj).

Smeltepunkt (mykner 83-86°C) = 93°C

Rf silika (40% metanol-etylenacetat) = 0,35

Eksempel 17

Syntese av N-(6-cyklopropylaminopurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyI-D-arginin - forbindelse nr. 25.

<3->5 NMR (8 DMS0 i ppm): 8.22 ts, IH, purin ), B.14 (s, IH,

purin ), (bs, 4H, guanidin .), 6.28 (d, IH, NB), 4.13 (t, 2H,

CHj), 3l87 (m. 2H, CHj), 3.62 (tn, IH, 0°<$>) , 3.02 (m, 2H, CHj), 1.2-1.8 (ffl, 11H, 5xCH2 and CH), 0.69 (m, 2H. CH2>. 0.67 (m, 2H,

CH2)

<13>c NMR (5, DMSO i ppm): 175.53, 158.20, 157.63, 155.79,

152.62, 150.91, 141.03, 119.92. 63.69, 55.38, 43.12, 41.14,-

30.10, 29.44, 28.49, 25.49, 24.38, 22.91, 6.78.

Smeltepunkt (mykner) ved 147°C smelter ved 151°C.

Rr= 0,34 (MeOH)

Massespektrum: H+ = 462 (HRMS)

Eksempel 18

Syntese av N-(6-cyklopropylaminopurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr. 26.

<!>h NMR. (S DMSQ i Ppm): 8.23 (s, IH, purin ), 8.14 (s, IH,

purin..), 7-51 (bs, 4H, guanidin ), 6.31 (d, IH, NH), 4.16 (t.

2H, CHj). 3.87 (t, 2H, CHj), 3.62 (m, IH, C<*>%), 3.02 (m, 2H,

CHjj) , 1.2-1.85 (m, 11H, SxCEj and CH). 0.72 (m, 2H. CHj), 0.68

(in. -2H, CHj) .

<13>C NMR (5, CD3OD i ppm): 179.41, 159.19, 158.95, 157.66,

154.09, 3.51.00, 143.00. 121.10, 66.12, 57.34, 45.33, 42.67, 31.90, 31.25, 30.14, 26.63, 25.11, 24.61, 8.14.

Smeltepunkt 144-146°C.

Rf =0,35 (MeOH)

Massespektrum: M<+> = 462 (HRMS).

Eksempel 19

Syntese av N-(6-azetidinpurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 28.

<X>H NMR (5, CD3OD i ppm): 7.96 (s, IH, purin }, 7.69 (s, IH,

purin ), 4.27 (m, 4H, 2xCE_2}, 4.02 <t, 2H, CHj), 3.79 {m, 3H,

C<H>2 og C<«>H), 2.99 (m, 2H, CHj) , 2.32 (m, 2H, CHj) , 1.17-1.71

(m, 10H, 5xCH2)..

13C NMR (6, CD3OD i ppm): 181.56, 159.38, 159.14, 156.16,

153.89, 151.22, 143.21, 120.92, 66.30, 57.15, 48.71 45.24,

42.66, 31.51, 31.26, 30.15, 26.96, 24.64. 18.87.

Smeltepunkt: 190-192°C.

Rf: 0,25 (metanol).

Massespektrum: M<+> = 462 (HRMS).

Eksempel 20

Syntese av N-(6-azetidinpurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr. 29.

<I>H NMR (6, CD3OD i ppm): 7.93 (s, IH, purin ), 7.88 (s, IH, purin ), 4.27 <m, 4H, 2xCBj2), 4.01 (t, 2H, CHj). 3.79 (m, 3H,

CH2 and C°H) , 2.97 (m, 2H, CHjj) , 2.32 On, 2H, CHj), 1.15-1.74 (m, 10H, 5xCfij2).

UC NMR (5, CD3OD i ppm): 179.44, 159.18, 158.95, 156.16, 153.89, 151.21, 143.20, 120.93, 66.12, 57.33, 48.69. 45.26, 42.65, 31.88, 31.33, 31.23, 30.16, 26.63, 24.61, 18.50.

Smeltepunkt: (mykner ved 175°C) smelter ved 187°C.

Rf= 0,27 (metanol)

Massespektrum: M<+> = 462 (HRMS).

Eksempel 21

Syntese av trans-(N-6-dimetylaminopuirn-9-yl)-4-metyI-cykloheksyl-metyloksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 32.

<I>h NMR (EMSO-ds, 400MHz, 8 in ppm); 9.4 (IH, br s, COOH); 8.19 (IR, s, purin ); 8.11 (1E, s, purin.); 8.0-7.2 (4H, br, guanldin ); 6.28 (IH, d, NH); 3.98 (2H, d, N-CHj); 3.69 (2H, d, O-CHj); 3.61 (IH, m. C°K); 3.43 (6H, br S, N-CHj^); 3.00 (2H, br, C5^); 1.9-0.8 (14H, m, cPhj2, tffø, 2 x OT-cykloheksai., 4 x CHj-cyfclohe.kssn) .

<13>c NMR (DMSO-dg, 400MHz, 5 in ppm); 174.8, 156.8, 155.0, 153.8, 151.2, 150.0, 139.6, 118.7, 78.7, 67.9, 54.6, 48.2, 4B.1, 37.1, 36.5, 29.3, 28.8, 27.8, 24.6.

Smeltepunkt (mykner ved 157°C) = 164-166°C.

Rf = 0,35 (metanol).

Eksempel 22

Syntese av cis-(N-6-dimetylaminopurin-9-yl)-4-metyI-cykloheksyl-metyloksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 36.

NMR (EMSO-dg, 400MHz, 5 ln ppm) ; 9.28 (IH, br 6, COOH); 8.19

(IB, s, purin ); 8.13 (lb, s, purin ); 8.0-7.2 (4H, br,

guanidin ); 6.34 (IH, d, NH); 4.10 (2H, d, N-CBj); 3.85 (2H, d,

0-CH2>' "3.65 (IH, m, C°H) f 3.44 (6H, br s, N-fCHjj^); 3.02 (2H,

m, C<5>^); 2.09 UH, m, ■ CH) ; 1.8-1.2 (14H, oi, CYHjj, 2 x CH-cykloheksan, 4 x CH2-cykloheJsén). ■

<13>C NHR (DMSO-d6, 400MHz, 5 in ppm); 175.2, 157.7, 155.2, 154.1, 151.8, 150.2, 139.9, 119.3, 66.4, 55.3, 46.1, 48.0, 34.9, 34.7, 29.9, 25.5, 25.1, 24.4.

Smeltepunkt (mykner ved 153°C) = 168-170°C.

Rf = 0,35 (metanol).

Eksempel 23

Syntese av N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-D-citrullin - forbindelse nr. 37.

<*>H NMR (DMSO - dg, 400 MHz, 5 in ppm); 8.19 UH, s, purin );

8.15 UH, s, purin ); 6.21 (IH, d, NH) ; 6.11 (15, S, NCO-NH);

5.42 (2H, S, NHj) 4.14 (2H, t, N-CHj); 3.86 (2H, m, O-CHj); 3.56

UH, m, C<a>E); 3.35 (6H, br s, NHCEjjj); 2.87 <2H, m.C<5>!^);

1.9-1.2 U0H, m, (CH2)3, Clfø, CØH2)-

<13>C NMR (CD3OD, 400 MHz, 6 in ppm) ; 173.6, 158.4, 155.0, 153.8, 151.2, 149.7, 139.3, 118.7, 62.8, 54.8, 42.3, 37.4, 29.8, 28.5, 27.6, 25.7, 22.0-

r'

Smeltepunkt (mykner ved 172-176°C) = 178-181°C.

Rf = 0,20 (40% metanol-etylacetat).

Eksempel 24

Syntese av N-(6-metylaziridinpuirn-9-yl)-5-pentanol - forbindelse nr. 38.

<*>H NMR (5, CDCI3 i ppm): 8.54 (s, IH, purin), 7.90 fs, IH,

purin ), 4.22 (t, 2H, CH2) , 3.61 (c, 2H, CHj), 2.78 (m, IH, CH), 2.65 fd, IH, CH2), 2.40 (d, IH, CHj), 2.39 (bs, IH, 0H), 1.94

lm, 2H, CHjj) , 1-59 (Bl, 2H, CB2), 1.50 (d, 3H, CH3) , 1.40 (m, 2H, CH2)..

<i3>C NMR (8, CDCI3 in ppm): 163.30, 152.99, 151.99, 142.80,' 126.11, 62.81, 44.48, 35.97, 34.89, 32.51, 30.3B, 23.50, 18.48.

Lavt smeltepunkt.

Rf = 0,4 (20% MeOH/AcOEt).

Massespektrum: M<+> = 262.

Eksempel 25

Syntese av N-(6-metylaziridinpurin-9-yI)-7-pentyloksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 39.

<*>H NMR (CD3OD i ppm): 8.29 (s, IH, purin ), 8.14 (s, IH,

purin ), 4.10 (t, 2H, CHa), 3-79 (rn, 3H, lxCH, and C"E) , 2.97 <m, 2H, OJj). 2.62 (m, IH, CH) , 2.45 (d, IH, <CB>J),-2.19 (d, IH. CHj) 1.2-1.76 (ia, 13E, 5xCHj and lxCH,) .

Smeltepunkt (mykner ved 190°C) smelter ved 200°C.

Rf. 0,4 (metanol).

Massespektrum: M<+> = 462.

Eksempel 26

N,N-(6-dimetylaminopyrinyl-9-yl)-7-tioetoksyetoksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 40.

Eksempel 27

Syntese av N-(6-dimetylamino-8-metyltiopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-D-arginin

- forbindelse nr. 50.

J-H NMR (DMSO-d-g, 400MHz, 5 i ppm); 8.13 (IH, s, purin. ),- 8.0-7-

2 (4H, br, guanidin- ); 6.32 (IH, d. NH); 4.01 (2H, t, N-CBj);

3.86 (2B, t, O-CH2); 3.65 (IH, m, C<*H) ; 3.41 (6H, br s, N-(C<H>3)2); 3.02 (2H, br, C5^); l.B-1.2 (10H, m, cPjHj, C7H2, -

(CH_2) - ).

<13>C NMR (CDCI3, 400MHz, 8 i ppm);175.09, 156.83, 155.01,

1S2.01, 151.87, 150.46, 146.70, 118.84, 62.82, 54.61, 41.66, 39.91, 37.32, 29.26, 27.80, 27.69, 24.62, 22.05, 13.38.

Eksempel 28

Syntese av N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-D-ornitin - forbindelse nr. 54.

<3->H NMR (DMSO-d6, 400MHz, 6 i'. ppm) ; 8.20 (IH, s, purin ); B.12

(IH, s, purin ); 6.21 (IH, cJ, NH); 4.10 (2H, t, N-CH_2) ; 3.87

(2H, t, O-CT2); 3.59 flH, m, CaH); 3.4 {br, N-(CHj)2, NHj), 2.70

(2H, ro, c<S>hj); 1.9-1.2 (10H, m, (C<H>^. <CØH>j, CTH2) .

<13>C NMR (CD3OD, 400MHz, 8 i ppm);176.3, 156.2, 153.8, 150.7, 148.B, 138.9, 118.5, 63.5, 54.2, 42.5, 38.0, 37.0, 28.6, 28.3,

27.2, 22.4, 21.7.

Smeltepunkt (mykner ved 185°C) = 189-190°C.

Rf = 0,20 (metanol).

Eksempel 29

Syntese av N-(dimetylaminopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-L-ornitin - forbindelse nr. 55.

Spektralegenskaper var identiske med forbindelse nr. 54.

Eksempel 30

Syntese av N-(6-dimetylaminpurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-L-valin - forbindelse nr. 56.

!h NMR (DMS0 - dg, 400 MHz, 5 in ppm); 8.19 {IB, s, purin );

8.16 (IH, s, purin ) ; 6.30 (IH, d, NH); 4.13 (2H, t, N-CH2);

3.87 (2H. m, O-CH2); 3.64 (IH, m, C<O>fl); 3.4 (br s, NHCHj^);

1.B0 (2H, <p>,' CHj, ) ; 1-25 (2H, p, CHj,) ; 0.79 (3H, d, CTh3) ; 0.75

(3H, d, C7H3).

<13>C NMR (CD3OD, 400-MHz, 5 i: ppm); 174.6, 156.7, 153.7, 150.5,

148.9, 138.6, 118.6, 63.4, 59.2, 42.3, 36.729.6, 23.3, 27.3,

21.7, 17.5, 15.9.

Smeltepunkt (mykner ved 140°C) = 172-176°C.

Rf = 0,20 (30% metanol-etylacetat).

Eksempel 31

Syntese av N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 7-pentoksykarbonyl-D-valin - forbindelse nr. 57.

Spektralegenskaper var identiske med forbindelse nr. 56.

Eksempel 32

Syntese av N(N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyletylaminhydroklorid - forbindelse nr. 58.

<X>HNMR (5 i DMSO ppm): 8,40 (s, IH, purin ), 8.43 (s, IH,

purin ), 8.04 (bs, 3B, NH3), 4.24 (t, 2H, CHj), 4.02 (t, 2H, CH_2) , 2.99 (m, 2H, CHj ) , 2.67 (t, 2E, Cg2 ) , 1.83 (m, 2H, CB^ I . 1.62 (m, 2H.CH2), 1.2B (m, 2H, CHj).

Rf: 0,3 10% metanol/etylacetat.

Massespektrum: M<+> = 321.

Eksempel 33

Syntese av N-(6-dimetylaminopurin-9-yl) 4-butanol - forbindelse nr. 62.

<l>H NMR (CDClj, 400 MHz, S 1 ppm): 8.24 (IH, s, purin ), 7.68

(IH, a, purin J, 4.33 (2H, t; N-CH,), 3.89 (IH, br s 0H) , 3.64

(2H, t. O-CHj), 3.46 (6H, br, «-(CB,),.). 1.92 (2H, p, CH,) , 1.53

<2H, p, CHj).

Smeltepunkt = 78°C.

Eksempel 34

Syntese av N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-6-butoksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 63.

'H NMR (DMSO-eU, 400 MHz, 5 i ppm); 8.20 (IH, s, purin ), 8.16

<1H, s, purin j, 8.1-7.3 (4B, br, guanidin ), 6.40 (IK', d, NH) , 4.16 (2H, t, N-CJBj), 3.91 (2H, t, O-CH,) , 3.65 (IH, M, C*H) , 3.4 (6H, br. N-(CH3),), 3.02 (2E, m, A), 1.9-1.3 (BH, m. c"h, C% -

(CH,),-).

Smeltepunkt (mykner ved 85°C) = 140-142°C.

Eksempel 35

Syntese av N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-6-butoksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr. 64.

Spektrale egenskaper var identiske med forbindelse nr. 63.

Smeltepunkt (mykner ved 85°C) = 139-142°C.

Eksempel 36

Syntese av N-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-6-heksanol - forbindelse nr. 66.

<l>H NMR {6, CDC1, i-, ppa) : 8.35 <s, IH, purin 7.71 (s, IH,

purin )( 4.17 (t, 2H. CH,), 3.61 (t, 2H, CHS), 3.53 (bs, 6H,

2xCHj), 1.89 (rn, 2H, CB,), 1.71 (bs. IH. OH) , 1,55 (m, 2H, CE,),

1-45 (m, 4H. 2xCHil .

UC NMR (fi, CDC1, lppm): 154.44, 152.90, 150.95, 138.72,

120.53, 63.04, 44.08, 39.28. 32.95. 30.61, 26.80, 25.64.

Smeltepunkt: 75-77°C.

Rf = 0,48 10% metanol/etylacetat

Massespektrum: M<+> = 264.

Eksempel 37

Syntese av N-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-8-heksylkarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 67.

<*>H NMR (6, CDjOP i ppm): 7.98 (s, IH, purin ), 7.JJ. (s, IH,

purin }, 3.98 (tf 2H, CH,), 3.78 (m, 3H, CBj og C"H) , 3.27 (bs,

6H, 2xCH,), 2.96 (t, 2H, CE,). 1.1-1.7B (m, 12H, 6xCH,) .

Eksempel 38

Syntese av N-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-8-heksyloksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr. 68.

lE NMR (6, CDjOD i .ppm): 8-00 (JB, 12, purin ), 7.82 (S, IH, purin ), 4.00 (t, 2H, CH,) , 3.80 (m, 3E, CB, og- C"H), 3.29 (bs, 6H, 2xCBi), 2.97 (t, 2H, CR,), 1.13-1.72 (m, 12H, 6xCB,).

Eksempel 39

Syntese av trans-(N-6-hydroksypurin-9-yl)-4-metyl-cykloheksyl-metyloksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 71.

<l>H NMR (CD,0D, 300 MHz, 6 i- ppm): 8.09 (2H, s, purin ), 4.12

<2H, d, N-CH,) . 3.68 (IH. m, C*H] , 3.36 (2H, d, 6-CH,) , 3.01 (2H,

m, C%), 2.0-0.9 (14H, m, 2xCH-CykLobeksan, 4xCH,-cy]<loheksan.,

C^, CTH,) .

Smeltepunkt > 200°C.

Rf = 0,2 (metanol).

Eksempel 40

Syntese av N-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-5-pentylaminhydrokloridsalt - forbindelse nr. 72.

'H NMR (5, DMSO i Ppm): 8.20 (s, IB, purin-), 8.16 (s, IH, purin.), 7.84 (bs, 3H, NH,), 4.14 (t, 2H, CB,), 3.44 (bs, 6H, 2xCH,), 2.73 It, 2H, C3,), 1.81 (m, 2H, CH,) , 1.56 (a, 2H, CH,), 1.25 (m, 23, CB2) .

Eksempel 41

Syntese av N-(6-metylaziridinpurin-9-yl)-7-pentyloksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr. 73.

Spektraldata til forbindelse nr. 73 var sammenlignbare med de rapportert for forbindelse nr. 39.

Eksempel 42

(2SJ4S)-2-(NJN-dimetylaminopurin-9-yl)-4-hydroksymetyl-l,3-dioksolan - forbindelse nr. 74.

^■H NMR (CDCI3):- 8 8.32 (s, IH, purin ), 7.75 (s, IH, purin ), 5.33 (dd, IH, J = 2.0, 6.6, H-2-dioxolan ), 5.33 (bs, IH, 0H>, 4.45 (dd, IH, J 6.6, 14.3, CH_2-purin ), 4.20 (dd, IH, J = 2.0, 14.3, CHj2-pur±n ), 4.20 (m, IH, H-4-dioxolan ), 4.05 (d, 2H, J = 7.2, H-5), 3.78 (d, IH, J * 13.0, CEj-OH) , 3.53 (bs, 6H, (CHj J2N) ,■ 3 .40 (d, IH, 3 = 13-0, CHj-OH) .

Eksempel 43

(1S,3R) og (lR,3S)-l-(N-6-dimetylaminopurin-9-yl)metyl-3-cyklopentanmetanol - forbindelse nr. 75.

<*>H NMR (CDCI3, 300 MHz) : 5 8.32 <s, IH, purin ), 7.71 (s, IH,

purin ), 4.18 (dd, IH, J= 8.6, 13.7), 4.06 (dd, 1E. J= 6.7,

13.7), 3.61-3.53 .(m, 8H] , 3.00 (bs, IH, OE), 2.48 (m, IH) , 2.17

<n>, 1E), 1.88-1.68 (ta, 3H), 1.53 (m, IH), 1.43 (m, 1E) , 1.08 (m,

IH) .

Eksempel 44

(1 S,3R) og (1 R,3S)-1 -(N-6-dimetylaminopurin-9-yl)metyl-3-(metyloksykarbonyl-D-arginin)cyklopentan - forbindelse nr. 76.

Eksempel 45

N,N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetanol - forbindelse nr. 77.

<X>B NMR (CDC1„ 400 MHz} : 5 8.34 (s, IH, purin ), 7.79 fs. IH, purin ), 4.29 ;t, 2H, J= 5.S, -CH,-) , 3.62 (m, 2H, -CH,-), 3.54 (bs, 6H, (CH,)aN), 3.11 (t. 2H, J=5.B, -CH,-) , 2.81 (t, 2H, J= 5.2, -CH,-), 2.05 (bs, 2E, HB og Di) ..

Eksempel 46

N,N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetoksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 78.

<*>H NMR (CDC1,, 300 MHz): 8 9.36 (m, IH), 8.19 (s, IH, purin ),

8.11 (s, IH, purin ), 6.38 (<S</> IH, J-7.0, NH kartana*), 4.17

{t. 2H. J«= 6.1, -CH,-), 3.91-3.87 (in, 2H, -CH,-) , 3.65 (m, IH, CH-C00H), 3.43 (bs, 6H, (CHjJJM) , 3.03-3.01 (m, 2B, CH,-NHC(NH)NHj), 2.90 (t, 2H, J» 6.1, -CS,-) , 2.68 (t, 2H, J- 5.6, -

CH,-), 1.64-1.44 (m. 4H, CHjJ-CH^-CHjNHCtNH)^,) .

Eksempel 47

N,N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetoksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr. 79.

Spektralegenskapene var identiske med forbindelse nr. 78.

Eksempel 48

N,N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-tioetoksy-etanol - forbindelse nr. 82.

I<f>J NMR (CDCI3): fi 8.30 (s, IB, purin ), 7.75 (s, IB, purin ).

4.41 (t, 2H, J * 6.5, CHj linker), 4.11 (bs, IB, 0H), 3.73 (t,

2H, J = 6.5, CHj linker), 3.51 (bs. 6E, (CSj^N), 2.99 (t, 2H, J

= 6.5. CB_2 linker), 2.68 (t, 2H, J » 6.5, CHj linker).

Eksempel 49

N,N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-tioetoksyetoksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr. 83.

Spektralegenskapene var identiske med forbindelse nr. 40.

Eksempel 50

(2S,4R)-2-(N,N-dimetyIaminopurin-9-yl)-4-(metoksykarbonyl-D-arginin)-l,3- - oksatiolan - forbindelse nr. 84.

<I>H NMR (CDCI3, 300 MHz): 6 8.49 (,," lH. purin ), 8.47 (S, ih,

purin ), 6.60 (bs, Ih, NH karbamat ), 6.22 fm, ih, h-2-

oxathiolan ), 4.26-4.03 (m, 3H), 3.63-3.00 (m; uh». 2.78-2.69

(». 2H, H-5-oxatMolan ). 1.53-1.40 (m, 4H. CSl^- CH^-

C(NH)NH2).

Eksempel 51

NsN-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etoksyetoksykarbonyl-D-arginin - forbindelse nr. 86.

<I>h NMR (DHSO-dg): 5 8.25 (s, IH, purin >, 8.14 (s, IH, purin ),

6.5 (bd, IH, NH karbamat ), 4.37 (t, 2Hr CHjj linker), 4.03 .(m,

2Hr CH2 linker), 3.81 (m, 2Hr CHj linker), 3.72 (m, IH, CH-

COOH), 3.60 (m, 2H, CHj linker), 3.55-3.89 (m, 6H, N(CH3)2),

3.05 (ai, 2B. CH2-NH-C(NH)NH2) , 1.78-1.39 (m, 4H, CH^-CHj-^NH-C(NH)NH2).

Eksempel 52

N5N-(6-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etoksyetoksykarbonyl-L-arginin - forbindelse nr.

87.

Spektralegenskaper var identiske med forbindelse nr. 86.

BIOLOGISKE DATA

IN VITRO SCREENING:

Eksempel 53

Mitogen proliferasjon på miltcellesuspensjon.

Mitogen lektin (mitogen) er et protein som binder og tverrbinder spesifikke celléoverflatekarbohydratdeterminanter og vil polyklonisk stimulere lymfoidceller. Lymfocyttaktivering av enten antigener eller mitogener resulterer i intracellulære forandringer og den påfølgende utvikling til en lymfoblast. Mitogen stimulering av lymfocytter in vitro er ment å kopiere serien av hendelser som skjer in vivo etter deres stimulering med spesifikke antigener. PHA, ConA og PWM, LPS mitogener kan anvendes som mål på T-celle- og B-celleaktivitet.

Kort forklart ble miltmononukleære leukocytter fra C57BL/6-mus inkubert i nærvær eller fravær av mitogener med eller uten de undersøkte medikamenter. Etter 72 timer eller 5 dager ble 3H tymidininkorporering registrert som en indikasjon på celletransformasjon og proliferasjon.

100 ul av en suspensjon av 2x10<6> celler/ml (2xl0<5> celler/brønn) ble inkubert i nærvær av PHA eller ConA eller PWM eller LPS i følgende konsentrasjoner:

PHA = 0,01% endelig konsentrasjon - 0,001%

ConA = 2 jig/ml - 1 ug/ml

PWM = 0,2x - 0,02x

LPS = 5 ug/ml - 2 ug/ml

Celler ble inkubert i nærvær eller fravær av medikamenter i 72 timer. 0,5 eller 1 uCi av tritiert tymidin ( H) ble tilsatt pr. brønn henholdsvis de siste 18 eller 6 tinier av inkubasjon. Celler ble høstet og telt på en betateller.

Eksempel 54

Cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og blandet lymfocytreaksjon (MLR) assayer Blandet lymfocyttreaksjon er en in vitro motpart av allograftavstøtning. Kort

beskrevet ble T-celleresponsen oppnådd når celler tatt fra to innavlede stammer fra to utavlede individer av enhver art ble blandet in vitro i kultur. For å få en ensrettet reaksjon kan proliferasjon av hver celletype blokkeres med røntgenbestråling eller mitomycin C-behandling.

Etter 4 dagers inkubasjon ble <3>H-tymidinopptak og cytotoksisitetsassay (CTL) utført. 3 C57Bl/6-mus og 3 DB A/2-mus ble drept og lymfocytter preparert ved å bruke lymfolyt M. Cellekonsentrasjonen.ble justert til lOxlO<6> celler/ml for hver lyse. DBA/2-celler ble bestrålt med 3000 Rad. 1 ml av C57-celler + 1 ml av DBA/2-celler + 1 ml av medikamentet i tre forskjellige konsentrasjoner ble inkubert sammen i 5 dager. Positiv kontroll var IL-2 på 15 ng/ml avsluttende. Etter 5 dager ble CTL- og MLR-tester utført.

MLR

Cellene ble resuspendert i 100 ul cellesuspensjon og ble plassert i hver av 96 brønner i platen, 50 ul tymidin med 20 uCi/ml ble tilsatt i 6 timer. Cellene ble deretter innsamlet og telt ved å bruke en betateller.

CTL

P815-målceller ble merket med Cr<51>. Etter merking ble cellene resuspendert til 5xl0<4> celler/ml. Effektorceller ble justert til 2,5x10<6> celler/ml og deretter fortynnet 1:2 og 1:4 for å oppnå den nødvendige effektor til målforholdene:

50:1 (2,5xl0<6> celler/ml: 5xl0<4> celler/ml)

25:1 (1,25x10<6> celler/ml: 5x10<4> celler/ml)

12,5:1 (0,625xl0<6>celler/ml: 5x10<4> celler/ml)

100 ul av målcellene + 100 ul T-celler ble inkubert i 4 timer og deretter ble 100 ul av supernatanten telt ved å bruke en gammateller.

IN VIVQ/ EX VIVO SCREENING:

Eksempel 55

Immunofenotyping.

Etter in vitro medikamentanalyser ble medikamentene evaluert på fullblod for medikamentstabilitet og toksisitet. Videre ble in vivo/ex vivo-analyse utført på normale og cyklofosfamidimmunoundertrykkede dyr pluss 5Fu-behandlede dyr. Celleimmunofenotyping ble utført på musébehandlet blod og milt. De følgende celleoverflateantigener ble analysert: CD3 (alle T-celler), CD4 (T hjelper/induksjon, binder klasse 11-restrikterte T-celler), CD8a (cytotoksiske T-celler, CTL-adhesjon), CD1 la (T, B, NK, noen stamceller, CTL-adhesjon anti-LFA-la), MAC-1 (monocytt/makrofag), NK (naturlige dreperceller), Ly5 (B-celler), CD45 (alle leukocytter, proteintyrosinfosfater) og TCR (T-cellereseptor).

C57BL/6-mus 86-8 uker gamle) ble injisert daglig i 4 påfølgende dager, ofret på dag 5 og immunofenotyping ble utført på blod og miltceller.

Cellene ble vasket to ganger i PBS, resuspendert i 1 ml RPMI 2% FBS, og inkubert i 45 minutter på is med monoklonalt antistoff. Cellene ble vasket en.gang, fiksert med 1 % parafonnaldehyd og deretter analysert ved å bruke XL Coulter-teller. Resultatene er presentert i tabell 3a og 3b.

ANTITUMORVURDERINGSPROTOKOLL

Forbindelsen ble testet for tumorvekstkontroll ved å bruke følgende prosedyrer.

Eksempel 56

Virkningen av forbindelse nr. 1 på vekst av brystkarsinom i kombinasjon med cyklofosfamid.

Balb/C-mus (n-5/Gr) ble brukt sammen med DA-3 brystkarsinomcellelinje. Musene ble behandlet fra -2 til 13 dager. Dyrene ble overvåket for

tumorforekomst/tumorstørrelse og kroppsvekter i 3 uker fra dag 0 til dag 21. DO var dagen for tumorcelleinokkulering og D21 var dagen for eksperimentavslutning.

Virkningsparametere ble målt ved inhibisjon av tumorutvekst og vekstrate [tumører målt langs den lengste akse (lengde) og den perpendikulært korteste akse (bredde) og tumorvolum (T.V. + S.E.) ble regnet ut ved formelen T.V.=lengde (cm x (bredde cm)2 12] og vurdering av kroppsvekttap.

Den statistiske signifikansen til forskjellen mellom tumorforekomst og tumorstørrelse på kontroll-ubehandlede og medikamentbehandlede grupper er vurdert ved å bruke Chi-square og Students t-test med signifikans bestemt på p<0,05.

Musene ble delt i følgende 5 grupper:

Gr. 1 - Normal saltoppløsning (0,2 ml/mus i.p. starte på D2)

Gr. 2 - CY (100 mg/kg enkelbolus i.v. på DO)

Gr. 3 - Forbindelse nr. 1 (25 mg/kg i.p. start på D2)

Gr. 4 - Forbindelse nr. 1 (50 mg/kg i.p. start på D2)

Gr. 5 - CY (100 mg/kg i.v. på DO + forbindelse nr. 1 50 mg/kg i.p., start D2).

Resultater er presentert i tabell 6 og fig. 1 og 2.

Eksempel 57

Evaluering av forbindelse nr. 1 i kombinasjon med cyklofosfamid (cytoksan) (CTX, 20 mg/kg) mot DA-3 brystkarsinom.

Kombinasjon av forbindelse nr. 1 (25 og 50 mg/kg i.p. daglig) pluss CTX (20 mg/kg i.v. enkeltbolus) ble evaluert mot dag 4 etablerte DA-3-tumører.

Resultater viser ingen signifikant virkning av kombinasjonsbehandling av forbindelse nr. 1 (på 25 mg/kg) pluss CTX. Imidlertid ble det observert en signifikant men forbigående virkning med CTX pluss forbindelse nr. 1 på 50 mg/kg fra dag 9 inntil dag 18 (fig. 3). Reduksjonen av den positive antitumorvirkning er muligens dannelse av T-supressorceller i et senere trinn av tumorvekst. Intet signifikant kroppsvekttap ble observert (fig. 4).

Eksempel 58

Evaluering av forbindelse nr. 1 i kombinasjon med cyklofosfamid (cytoksan) (CTX, 28 mg/kg) mot DA-3 brystkarsinom.

I et annet eksperiment ble CTX-behandling forlenget. Balb/c-mus ble injisert s.c. med 5xl0<5> DA-3-tumorceller på dag 0. På dag 4 når etablert tumører kom til syne, ble tumorbærende dyr randomisert (n=l l/gr) og injisert med CTX (på 28 mg/kg) i.v. bolusinjeksjon på dag 4, 11 og 18. Behandling med forbindelse nr. 1 ble igangsatt ved å bruke standard behandlingsregime med daglig i.p. injeksjoner på

50 mg/kg som starter fra dag 2 inntil dag 28.

Resultater av dette eksperiment (tabell 7) viser en meget statistisk signifikant (p>0,001-p<0,005) antitumorvirkning av forbindelsen nr. 1 (BCH-1393) + CTX kombinasjonsbehandling fra dag 11 inntil dag 30 av tumorvekst. Intet signifikant kroppsvekttap ble observert (tabell 8).

Eksempel 59

Evaluering av forbindelse nr. 1 i kombinasjon med 5FU mot kolon adenomkarsinom.

C57BL/6-mus 6-8 uker gamle (n=7-9/gr) ble injisert med 3x10<5> MC38 kolon adenokarsinomceller s.c. på dag 0. På dag 7, ble tumorbærende mus randomisert og injisert med 5FU på 20 mg/kg.enten alene eller i kombinasjon med levamisol på 20 mg/kg i.p. eller med forbindelse nr. 1 på 25 og 50 mg/kg i.p. over en fire ukers periode. I løpet av denne perioden ble dyrene behandlet i fem påfølgende dager, ubehandlet for to dager, og deretter behandlet igjen i fem påfølgende dager pr. uke i fire uker.

Resultater av dette eksperimentet viser en signifikant doseavhengig antitumorvirkning etter forbindelse nr. 1 (på 50 og 25 mg/kg) + 5FR (20 mg/kg) sammenlignet med kontroll ubehandlet gruppe (fig. 5). Antitumorvirkningen av 5FU + forbindelse nr. 1 (på 50 mg/kg) ble markert bedre enn den til 5FU + levamisol. En moderat antitumorrespons ble observert etter behandling med 5FU (20 mg/kg) alene eller med 5FU (20 mg/kg) + levamisol (20 mg/kg). Dette kan skyldes det faktum at 20 mg/kg representerer en suboptimal dose av 5FU for MC38 kolon adenokarsinom.

Eksempel 60

ln vivo toksisitet av forbindelse nr. 1.

Hensikten med dette studiet var å finne den toksiske dose til forbindelse nr 1 etter gjentatte intravenøse injeksjoner i Fisher han- og hunrotter.

Gruppe på tre hanrotter og tre hunrotter ble injisert daglig i.v. i fem påfølgende dager. En første gruppe mottok 500 mg/kg, en andre gruppe 250 mg/kg og en tredje gruppe 125 mg/kg. I tillegg ble en hann og en hunn injisert med 1000 mg/kg. En ubehandlet gruppe (hann og hunn) ble inkludert i eksperimentet. For alle doser ble et konstant volum på 0,1 ml/100 g benyttet. Injeksjoner ble startet på dag 0 og fortsatt inntil dag 4 (5 dager). Under behandling ble vektforandringer registrert daglig og rottene ble observert minst 1 time etter injeksjon for tegn på medikamentell virkning. På dag 8 ble rottene avlivet og en makroskopisk undersøkelse av de indre organer ble utført.

Begge rotter (1 hann og 1 hunn) injisert med 1000 mg/kg i.v. viste alvorlige kolonkonvulsjoner og døde etter 10 minutter. Med 500 mg/kg ble alle rotter observert å ha rykninger i brystområdet, skjelvinger på forpotene og hoppeepisoder. Disse tegn varte mindre enn 1 time og var sammenlignbare etter hver av de fem injeksjoner. Vekstkurvene til dyrene var ikke affisert sammenlignet med kontrollene. Med de to lavere doser (250 mg/kg og 125 mg/kg) ble ingen unormale tegn observert på noe tidspunkt under dosering og vekstkurvene var normale (fig. 6 og 7). Ingen medikamentinduserte forandringer ble notert ved obduksjon av disse, dyrene.

Forbindelse nr. 1 blir godt tolerert når den injiseres intravenøst i Fisher-rotter. En dose på 250 mg/kg injisert i fem påfølgende dager produserte intet tegn på toksisitet. Forbindelsen forårsaket tarmkonvulsjoneT og var letal i en dose på

1000 mg/kg. En dose på 500 mg/kg frembragte noen kortvarige unormale tegn men ingen letalitet eller virkninger på dyrenes vekst.

KONKLUSJONER

Fra dataene, in vitro, synes forbindelsene i henhold til oppfinnelsen, særlig forbindelse nr. 1 å aktivere T-celler (inkludert CTL) og B-celler.

In vivo, øker forbindelsen i henhold til oppfinnelsen spesielt forbindelse nr. 1, antall

CTL.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen, særlig forbindelse nr. 1, synes å være godt tolerert.

Forbindelse nr. 1 synes å inhibere tumorvekst i kombinasjon med cyklofosfamid mot mus brystkarsinom in vivo.

Forbindelse nr. 1 synes å inhibere tumorvekst i kombinasjon med 5FU mot musekolon adenokarsinom in vivo

Claims (20)

1. Forbindelse, karakterisert ved formel I: hvori R] er substituert amino representert ved formelen NR5R6 hvori R<5> og R<6> er uavhengig valgt fra gruppen som består av H, C1-4 alkyl og usubstituert amino med det forbehold at R<5> og R6 ikke begge er H; R2 og R3 er uavhengig, valgt fra gruppen som består av hydrogen; Cm alkyl; substituert eller usubstituert amino; substituert eller usubstituert tiol; og halogen; og R4 er representert av formelen R<i2->X<12> hvori R<12> er en mettet lineær hydrokarbonkjede med 5-20 karbonatomer som eventuelt inneholder én eller flere =0, =N, eller =S og X<12> er valgt fra gruppen som består av en amino Ci.galkyl og en kjent aminosyre bundet ved sin a-aminogruppe, valgt fra gruppen som består av arginin, glysin, alanin, glutaminsyre, valin, ornitin; citrullin, leucin, prolin eller isoleucin.

2. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved atR4er (CH2)-L-0-CO-X12, hvori L er valgt fra gruppen som består av (CH2)n, og (CH2)m-Q-(CH2)m, og ytterligere hvori Q er O, S, eller NH, n er et helt tall mellom 1 og 6, og m er et helt tall mellom 1 og 3.

3. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at X12 er (CH2)mNH2 hvori m er et helt tall mellom 1 og 6.

4/ Forbindelse som angitt i krav 3, karakterisert ved at m er 2.

5. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at X<12> er en naturlig forekommende L-alfa aminosyre eller dens D-stereoisomer.

6. Forbindelse som angitt i krav 5, karakterisert ved at nevnte aminosyre er valgt fra gruppen som består av arginin, glysin, alanin, glutaminsyre, valin, ornitin eller citrullin.

7. Forbindelse som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte aminosyre er D-arginin.

8. Forbindelse som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte aminosyre er L-arginin.

9.. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at Ri er valgt fra gruppen som består av: -N(CH3)2, .NHNH2, -NHCH3, -N(NH2)CH3.

10. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at R2 og R3 er uavhengig valgt fra gruppen som består av. Cl, Br, I og F.

11. Forbindelse som angitt i krav 10, karakterisert ved atR2 0gR3er uavhengig Cl, eller Br.

12. Forbindelse som angitt i krav 11, karakterisert ved at R2 er Cl.

13. Forbindelse som angitt i krav 11, karakterisert ved at R3 er Br.

14. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved atR2er>5H2.

15. Forbindelse som angitt i krav 1, karakterisert ved atR3er SH, eller SCH3.

16. Forbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen som består av: Forbindelse # 1 N-5-(6-N,N-dimetyIaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyI-D-arginin; Forbindelse # 2 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 3 N-5-(6-N-metylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 4 N-5-(6-N-metylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 5 N-5-(6-N-aminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 7 N-5-(6-N-hydrazinopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 8 N-5-(6-N-hydazinopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 14 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-glysin; Forbindelse # 15 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7<*->etoksy-etoksykarbonyl-D- arginin; Forbindelse # 16 (2S,4S)-2-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4-(metyloksykarbonyl-D- arginin)-1,3-dioksolan; Forbindelse # 17 N-5-(6-N,N-dimetylamino-8-brompurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L- arginin; Forbindelse # 18 N-5-(6-N,N-dimetylamino-8-brompurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D- arginin; Forbindelse #' 20 N-5-(purin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 21 N-5-(purin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 22 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-valyl-L- prolyl-L-leukin; Forbindelse # 23 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-isoleucyl- L-prolyl-L-isoleukin; Forbindelse # 25 N-5-(6-N-syklopropylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 26 N-5-(6-N-syklopropylaminopurin-9'yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 28 N-5-(6-N-azetidinpurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 29 N-5-(6-N-azetidinpurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 32 trans-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4-metyl-sykloheksyl- metyloksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 36 cis-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4-metyl-sykloheksyl- metyloksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 37 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-citrullin; Forbindelse # 38 N-5-(6-N-metylaziridinpurin-9-yl)-pentanol; Forbindelse # 39 N-5-(6-N-metylaziridinpurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 40 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-tioetoksy-etoksykarbonyl-D- arginin; Forbindelse # 50 N-5-(6-N,N-dimetylamino-8-metyltiopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl- D-arginin; Forbindelse # 54 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-omitin; Forbindelse #55 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-omitin; Forbindelse # 56 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-valin; Forbindelse # 57 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyI-D-valin; Forbindelse # 58 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)- pentoksykarbonyletylaminhydroklorid; Forbindelse # 62 N-4-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-butanol; Forbindelse # 63 N-4-(6-r45N-dimetylaminopurin-9-yl)-butoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 64 N-4-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yI)-butoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 66 N-6-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-heksanol; Forbindelse # 67 N-6-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-heksyloksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 68 N-6-(6-N)N-dimetylaminopurin-9-yI)-heksyloksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 72 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentylaminhydrokloridsalt; Forbindelse # 73 N-5-(6-metylaziridinpurin-9-yl)-pentyloksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 74 (2S54S)-2-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4-hydroksymetyl-l,3- dioksolan; Forbindelse # 75 (1S,3R) og (lR,3S)-l-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-inetyl-3- syklopentanm etanol; Forbindelse # 76 (1S,3R) og (lR,3S)-l-(6-NsN-dimetylaminopurin-9-yl)-metyl-3- (metyl oks ykarbonyl -D -argi nin)- sykl opentan; Forbindelse #77 (6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetanol; Forbindelse # 78 (6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetoksykarbonyl-D- arginin; Forbindelse # 79 (6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etylaminoetoksykarbonyl-L- arginin; Forbindelse # 82 (6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-tioetoksy-etanol; Forbindelse # 83 (6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-yioetoksy-etoksykarbonyl-L- arginin; Forbindelse # 84 (2S,4S) og (2R,4R)-2-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-4- (metoksykarbonyl-D-arginin)-l,3-oksatiolan; Forbindelse # 86 (6-N3N-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etoksy-etoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 87 (6-N,>J-dimetylaminopurin-9-yl)-7-etoksy-etoksykarbonyl-L-arginin; og

17. Forbindelse som angitt i krav 16, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen som består av: Forbindelse # 1 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 2 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 3 N-5-(6-N-metylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 5 N-5-(6-N-aminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 7 N-5-(6-N-hydrazinopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin; Forbindelse # 8 N-5-(6-N-hydazinopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-L-arginin; Forbindelse # 20 N-5-(purin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-arginin;

18. Forbindelse som angitt i krav 17, karakterisert ved at det er forbindelse #1 N-5-(6-N,N-dimetylaminopurin-9-yl)-pentoksykarbonyl-D-argin\n.

19. Farmasøytisk sammensetning til behandling av kreft, karakterisert ved at den omfatter en forbindelse som angitt i krav 1,16 eller 18.

20. Farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 19, karakterisert ved at nevnte kreft er kolonkarsinom eller brystkarsinom.