CN100345545C - 6－氨基－α(R)－羟基－9H－嘌呤－9－丁酸乙酯的免疫抑制作用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DZ2002对免疫系统的抑制作用。DZ2002是一个S-腺苷-L高半胱氨酸水解酶(S-Adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH)的可逆抑制剂。在多种体外实验系统和体内实验动物模型中的研究结果证实：DZ2002选择性的抑制巨噬细胞的功能和活化及B细胞功能，抑制细胞免疫和体液免疫反应。DZ2002在毒性剂量和治疗剂量间有较宽的距离，具有较高的治疗指数。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物的医学用途，更具体地指6-氨基-α(R)-羟基-9H嘌呤-9-丁酸乙酯作为S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的抑制剂，从而进一步在制备治疗预防由免疫系统功能紊乱而引起的疾病的药物中应用。
背景技术
化学名6-氨基-α(R)-羟基-9H-嘌呤-9-丁酸乙酯(DZ2002)是一种已知化合物，其化学结构式如下：
DZ2002，6-氨基-α(R)-羟基
嘌呤-9-丁酸乙酯
DZ2002是一个III类S-腺苷-L高半胱氨酸水解酶(S-Adenosyl-L-homocysteine hydrolase，SAHH)抑制剂。SAHH是一种细胞内广泛存在的酶，它催化水解S-腺苷-L高半胱氨酸(S-Adenosyl-L-homocysteine，SAH)生成腺苷(adenosine，Ado)和高半胱氨酸(homocysteine，Hcy)。抑制SAHH导致细胞内SAH的堆积和Hcy浓度的减小，通过影响S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosylmethionine，SAM)依赖的转甲基化反应和氧化还原状态，SAHH抑制剂可发挥多种功能，如抗病毒、抗肿瘤、抗炎、免疫抑制和心血管保护等。
根据对酶的抑制机制的不同，SAHH抑制剂可分为三类。I类抑制剂被研究得最多，并且在炎症、器官移植、自身免疫病等方面显示了广泛的生物活性。但是由于此类化合物使酶不可逆的失活，具有较大的细胞毒性，限制了它们进一步的发展和应用。II类抑制剂对酶的抑制作用也是不可逆的。因此研究者的注意力正逐渐转向可与酶可逆结合的毒性小的III类SAHH抑制剂。但目前已经报道的III类SAHH抑制剂的酶抑制及免疫抑制的效果都不理想，它们在减小毒性的同时往往伴随着效用的降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种已知化合物DZ2002作为S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶[SAHH]抑制剂。
本发明的另一目的是化合物DZ2002在制备由免疫系统功能紊乱引起的疾病的药物中应用。
[一]DZ2002对lipopolysaccharide(LPS)刺激的小鼠脾脏淋巴细胞的增殖也有抑制作用。它对concanavalin A(Con A)刺激的小鼠脾脏淋巴细胞的增殖和IL-2的产生无明显抑制作用，但能显著抑制混合淋巴细胞反应中小鼠脾脏淋巴细胞的增殖。
[二]DZ2002显著抑制Staphylococcus aureus strain Cowan(Sac)刺激的小鼠脾脏淋巴细胞IL-12的产生，但对IL-10和IFN-γ的产生无影响。
[三]DZ2002对小鼠脾脏淋巴细胞的毒性较低，其IC50为1085.7±91.7μM，要明显大于I类SAHH抑制剂DHCaA(IC50＝98.7±34.9μM)。
[四]DZ2002抑制活化的小鼠腹腔巨噬细胞和THP-1细胞IL-12、TNF-α的产生。
[五]DZ2002也能抑制活化巨噬细胞表面与抗原提呈功能相关的分子的表达。DZ2002剂量依赖性的抑制小鼠腹腔巨噬细胞被IFN-γ活化后MHC-II分子的表达；也能显著抑制DMSO分化的THP-1被LPS和IFN-γ活化后CD80和CD86分子的表达。
[六]在体内实验中，腹腔注射DZ2002显著抑制迟发型超敏反应(Delayed-Type Hypersensitivity，DTH)中的小鼠耳肿胀程度，表现出对机体细胞免疫反应的抑制作用。
[七]腹腔注射DZ2002显著抑制绵羊红细胞定量溶血(quantitativehemolysis of SRBC，QHS)反应中特异性抗羊红细胞抗体分泌细胞的产生，说明它对体液免疫反应有抑制作用。
本发明采用DZ2002化合物进行各种免疫学试验，对小鼠T、B淋巴细胞增殖、细胞因子产生、巨噬细胞功能、DTH反应，以及QHS反应的影响进行了研究，结果表明：DZ2002可通过抑制抗原提呈细胞和B细胞的功能，明显抑制细胞介导免疫反应和体液介导免疫反应。
免疫应答过程的效应表现主要是由以B细胞介导的体液免疫反应和T细胞介导的细胞免疫反应组成。B淋巴细胞分泌的抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能的最重要的免疫分子，用以中和侵入机体的抗原和微生物。T淋巴细胞是重要的免疫效应细胞，主要包括T辅助性淋巴细胞(TH)和T杀伤性淋巴细胞(CTL)两大类，负责清除入侵体内的病毒，细菌等微生物及肿瘤；但T淋巴细胞的激活，取决于抗原提呈细胞(包括树突状细胞，单核-巨噬细胞等)的抗原提呈和辅助作用。在参与抗原提呈的过程中，抗原提呈细胞必须在其表面表达一系列的相关分子，包括MHC和B7共刺激分子。抗原提呈细胞和T细胞活化时，产生分泌的细胞因子可根据引起的免疫效应的不同分为：Th1型(IL-12，IFN-γ，IL-2等)和Th2型(IL-10等)。Th1型细胞因子可促进机体免疫系统产生细胞介导免疫反应，而Tn2型细胞因子则抑制细胞介导免疫反应，促进体液免疫反应。巨噬细胞等分泌的IL-12可促进T细胞IFN-γ的产生也可归为Th1型细胞因子。
DTH模型是经典的反映T细胞介导免疫反应的实验动物模型，巨噬细胞是其主要的效应细胞之一。
QHS反应是一种体液免疫反应的模型。它反映了B细胞对抗羊红细胞特异性抗体产生的能力。
研究药物对淋巴细胞增殖、细胞因子产生、巨噬细胞功能及整体DTH动物模型和QHS模型的影响可以科学有效地评价其对机体免疫系统的作用。
化合物DZ2002的免疫抑制作用：
DZ2002在体外实验体系中对小鼠淋巴细胞的免疫抑制作用研究
1.1 DZ2002对LPS刺激的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的影响
Escherichia coli 055:B5菌株的膜脂多糖LPS模拟抗原信号刺激小鼠全脾细胞，诱导B细胞的增殖。B细胞的增殖能力的强弱变化可作为体液免疫反应能力的一个指标。用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法测定LPS刺激的小鼠脾脏淋巴细胞增殖。由表1可见，DZ2002 10μg/ml可抑制LPS刺激的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应，表明它可以抑制丝裂原刺激的B淋巴细胞的增殖反应。
1.2 DZ2002对ConA刺激的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应和IL-2产生的影响
在免疫反应中，T细胞功能发挥是通过细胞增殖而实现的。伴刀豆蛋白ConA能直接引起T细胞活化分裂增殖，T细胞的增殖能力的强弱变化可作为细胞介导免疫反应能力的一个指标。IL-2是活化T淋巴细胞产生的细胞因子，同时IL-2对T淋巴细胞的增殖具有促进作用，因此检测ConA刺激下淋巴细胞的增殖能力和IL-2的产生情况，可反映药物对细胞介导免疫反应的影响。如表1所示，DZ2002在浓度为0.1-10μM时，对Con A刺激的小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应和IL-2产生无明显抑制作用。说明DZ2002对丝裂原刺激的T淋巴细胞的增殖及IL-2产生并无显著影响。
表1 DZ2002对正常小鼠免疫细胞功能的影响(X±S)
| DZ2002浓度(μM) | T淋巴细胞增殖(CPM×10-3) | B淋巴细胞增殖(CPM×10-3) | IL-2(pg/mL) |
| 00.1110 | 168.7±8.0150.6±13.9159.9±11.2136.2±21.9 | 87.7±2.275.6±10.181.1±8.867.9±1.9*** | 1805.8±43.31837.7±88.41792.9±58.21730.7±36.4 |
***P＜0.001，与对照组比较。
1.3 DZ2002对混合淋巴培养中异体抗原刺激的淋巴细胞增殖功能的影响
异体抗原为病理状态下怀孕母亲排斥胎儿，以及输血、器官移植后引起机体排异反应的主要原因。体外混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte reaction，MLR)可模拟这种免疫反应。应答淋巴细胞和异源性淋巴细胞共同培养时，表达在异源性淋巴细胞上的异体抗原，主要是组织相容性抗原(MHC-I或MHC-II分子)，刺激应答T细胞引发免疫增殖反应，我们同样以其增殖功能的变化来反应免疫系统应答异体抗原刺激的水平。
如图1所示，DZ2002显著抑制MLR中应答淋巴细胞的增殖，在浓度为0.1，1和10μM时，抑制率分别为40.2，36.9和42.3％。以上结果表明DZ2002可显著抑制异体抗原刺激的淋巴细胞增殖功能。
1.4 DZ2002对Sac刺激小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ，IL-12和IL-10产生的影响
实验采用一种金黄色葡萄球菌的菌体Sac作为抗原，刺激脾脏淋巴细胞中抗原提呈细胞，分泌IL-12，IL-10等细胞因子，并引起T细胞活化分泌IFN-γ，IL-10等细胞因子。研究药物作用下抗原刺激这三个淋巴细胞因子的产生趋向，可反映药物对免疫反应的总体影响。如表2所示，Sac(0.01％)刺激下，小鼠脾脏细胞产生大量的IFN-γ，IL-12p40，IL-12P70和IL-10；在我们所选用的作用浓度下，DZ2002能显著抑制IL-12p40和p70的产生，但对IFN-γ和IL-10的产生无明显影响。IL-12是抗原提呈细胞产生的Th1型细胞因子，DZ2002抑制Th1型细胞因子可导致机体内Th1/Th2平衡偏向Th2反应，抑制免疫系统产生细胞介导免疫反应。
表2 DZ2002对Sac刺激小鼠脾脏淋巴细胞IFN-γ、IL-12p70、IL-12p40和
IL-10产生的影响
| DZ2002(μM) | ELISA方法检测的细胞因子(pg/ml) | |||
| IFN-γ | IL-12(p40) | IL-12(p70) | 1L-10 | |
| 00.1110 | 3127±1613357±253290±02788±153 | 1151±197844±172823±0558±98 | 344±11178±11174±24178±26 | 1429±131341±1121420±251314±25 |
1.5 DZ2002对小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性(MTT法)
III类SAHH抑制剂较之于I类抑制剂的优势在于它们的细胞毒性相对较小。本研究中，我们用MTT掺入法比较了DZ2002(III类SAHH抑制剂)和DHCaA(I类SAHH抑制剂)对小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性。如图2所属示：DZ2002对小鼠脾脏淋巴细胞的IC50为1085.7±91.7μM，要明显大于DHCaA(IC50＝98.7±34.9μM)。这表明，DZ2002对小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒性要明显小于DHCaA。
DZ2002对巨噬细胞表型和功能的抑制作用研究
2.1 DZ2002对小鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子的影响
LPS和IFN-γ能诱导巨噬细胞的活化，启动许多细胞因子的产生。在本实验中，TG诱导的小鼠腹腔巨噬细胞在LPS(1μg/mL)，IFN-γ(2.5ng/mL)及不同浓度DZ2002的共同作用下培养24小时后检测培养上清中细胞因子的分泌水平。如表3所示：DZ2002抑制IL-12p40，p70和TNF-α的产生，对IL-10的产生无明显影响。DZ2002抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α的产生，可抑制炎症反应的发生和发展。DZ2002还能抑制Th1型细胞因子IL-12的产生，导致机体内Th1/Th2平衡偏向Th2反应，抑制免疫系统产生细胞介导免疫反应。
表3 DZ2002对小鼠腹腔巨噬细胞产生细胞因子的影响
| DZ2002(μM) | ELISA方法检测的细胞因子(pg/ml) | |||
| IL-10 | IL-12(p40) | IL-12(p70) | TNF-α | |
| 00.1110 | 181±14176±35171±0171±0 | 1737±01145±161975±358885±100 | 1203±45777±24836±3971±2 | 3603±2501868±4602090±3642079±480 |
2.2 DZ2002对THP-1细胞产生细胞因子的影响
DMSO可诱导THP-1细胞的分化，分化后的细胞不再增殖，细胞因子分泌增加。如表4所示，本实验中DZ2002抑制分化的THP-1细胞在IFN-γ和LPS刺激后IL-12p40、IL-12p70和TNF-α的产生。同对小鼠巨噬细胞细胞因子产生的影响一样，DZ2002也能抑制THP-1细胞炎性因子TNF-α和Th1型细胞因子IL-12的产生。
表4 DZ2002对THP-1细胞产生细胞因子的影响
| DZ2002(μM) | ELISA方法检测的细胞因子(pg/ml) | ||
| IL-12(p70) | IL-12(p40) | TNF-α | |
| 00.1110 | 186±3857±4539±3047±6 | 13671±05363±3864953±6572302±0 | 154±46178±61128±3591±6 |
2.3 DZ2002对小鼠腹腔巨噬细胞表面分子表达的影响
IFN-γ促进巨噬细胞表面分子的表达，本研究中，TG诱导的小鼠腹腔巨噬细胞在IFN-γ(10ng/mL)及不同浓度DZ2002的共同作用下培养48小时后检测细胞表面分子的表达。如表5所示，DZ2002剂量依赖性的降低MHC-II分子的表达，在剂量为0.1-10μM时，MHC-II的几何平均荧光强度从对照组的65.5分别下降到59.9、45.1和37.3。DZ2002对其它表面分子，如MHC-I、CD80、CD86的表达水平无明显影响。MHC-II是巨噬细胞表面参与抗原提呈过程的重要分子，DZ2002可通过抑制MHC-II分子的表达来影响抗原提呈过程和T细胞的活化。
表5 DZ2002对小鼠腹腔巨噬细胞表面分子表达的影响
| DZ2002(μM) | Geo Mean Fluorescence | |||
| H-2kd(MHC class I) | I-Ad(MHC class II) | CD80(B7.1) | CD86(B7.2) | |
| -0.1110 | 162.3168.1158.5175.9 | 65.659.945.137.3 | 82.693.290.290.5 | 41.142.248.248.6 |
2.4 DZ2002对DMSO分化的THP-1细胞表面分子表达的影响
单核细胞在LPS和IFN-γ的作用下，在表型、功能和生化上会发生许多改变。IFN-γ能促进许多细胞表面分子的表达， 包括MHC-I、MHC-II和B7共刺激分子等。如图3所示，DZ2002能轻微地抑制LPS和IFN-γ共同刺激的THP-1细胞表面MHC-I和MHC-II分子的表达，它对CD80和CD86分子的表达呈现剂量依赖性的显著抑制。共刺激通路也是巨噬细胞将抗原提呈给T细胞并引起T细胞活化所必需的，DZ2002可通过抑制共刺激分子的表达来影响抗原提呈过程和T细胞的活化。
DZ2002在体内实验中对小鼠免疫反应实验研究
3.1 DZ2002对DNFB诱发的小鼠DTH反应耳肿胀的影响
为进一步证实DZ2002在细胞水平得到的免疫抑制这一实验结果，是我们采用了免疫学上经典的DTH反应模型来评价DZ2002的体内效用。DTH是经典的反映T细胞介导免疫反应的实验动物模型，巨噬细胞是其主要的效应细胞之一。如表6所示，DZ2002在2.5、5、10mg/kg三个剂量时都能显著地抑制小鼠的耳肿胀，与溶剂对照组相比其抑制率分别为22.7、11.6和3 1.5％。表明DZ2002可以抑制细胞介导的免疫反应。
表6 DZ2002对DNFB诱发的小鼠DTH反应耳肿胀的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 耳重差(mg) |
| VehicleDZ2002 | -2.5510 | 14.23±2.5611.00±1.92**11.70±1.84*10.34±2.20** |
*P＜0.05，**P＜0.01 compared with vehicle.
n＝9.Mean±SD.
3.2 DZ2002对SRBC诱导的抗体生成反应的影响
采用SRBC引起的抗体生成反应(QHS assay)模型来评价DZ2002在体内对于体液免疫反应的影响。QHS分析是溶血空斑形成和玫瑰花结实验的改进，可以作为这两种实验的替代。它反映了浆细胞对特异性抗SRBC抗体产生的能力。
DZ2002(0.08和2mg/kg)连续7天给药，在体内用SRBC致敏小鼠，在体外用SRBC再次致敏时，检测到B细胞抗体分泌功能受到显著抑制。如图4所示，0.08mg/kg的DZ2002即能显著抑制B细胞分泌的特异性抗SRBC抗体所介导的补体溶血反应，提示DZ2002在体内对B细胞激活和/或抗体分泌有显著的抑制作用。
附图说明
图1是DZ2002混合淋巴培养中异体抗原刺激的淋巴细胞增殖功能的影响、***P＞0.001(与对照组比较)。
图2是DZ2002(图2A)和DHCaA(图2B)对小鼠脾脏淋巴细胞的毒性。
图3是DZ2002对DMSO分化的THP-1细胞表面分子表达影响。
图4中DZ2002对SRBC诱导的抗体生成反应的影响***P＞0.001(与对照组比较)。
DZ2002通过调控巨噬细胞的细胞因子分泌和抑制巨噬细胞表面与抗原提呈功能相关的分子的表达来抑制机体免疫系统产生细胞介导免疫反应。DZ2002也能抑制B细胞的免疫反应功能。体内给药时，DZ2002对机体细胞和体液免疫反应都有抑制作用。
IV型超敏反应和许多自身免疫疾病及移植排斥反应都是主要由细胞免疫反应介导的。自身免疫疾病中一个共同的特点表现为机体内免疫平衡由Th1/Th2平衡转向Th1反应亢进，以及炎性细胞因子(如TNF-α等)的过表达。DZ2002抑制Th1免疫反应，并降低炎性细胞因子的产生，所以具有预防和治疗以上疾病的潜力。DZ2002还能抑制B细胞产生抗体，可以抑制I-III型超敏反应中的抗体产生和自身免疫疾病中自身抗体的产生，抑制疾病的发生和进程。
DZ2002的淋巴细胞毒性远低于DHCaA，DZ2002体外实验结果表明其免疫抑制活性的有效剂量明显低于其毒性剂量。我们首次发现了一个在细胞毒性降低的同时仍然具有较强免疫抑制活性的III类SAHH抑制剂。
本发明中的DZ2002是一个III类SAHH抑制剂，它与酶的开放状态可逆结合，这种使酶失活的方式是可逆的，在药物作用消退后，酶的活性还可以恢复。本发明研究表明DZ2002能抑制B淋巴细胞的增殖、巨噬细胞功能和表型，对细胞免疫和体液免疫反应都有抑制作用，并且细胞毒性较低。DZ2002是第一个被发现的具有良好免疫抑制活性和较低细胞毒性的III类SAHH抑制剂。
具体实施方式
下面给出本发明实验方法，进一步阐述本发明，但不限制本发明。
药物：DZ2002，由美国圣地亚哥General Atomics袁重生博士提供，为无定形白色粉末，略带棕色。先溶于DMSO，然后用生理盐水配成4×10-3M的贮备液，-20℃保存备用。使用前用含10％ FBS的RPMI-1640培养液稀释至所需浓度。DMSO的终浓度在整个实验过程中均低于0.01％，此浓度下DMSO对我们所检测的各个指标均无明显影响。
试验动物：实验采用Balb/c和C57BL/6纯系小鼠，6-8周龄，购于中科院上海实验动物中心，动物合格证书号：中科沪动管第99-003号。动物饲养于中科院上海药物所清洁级动物房，12小时光/暗循环，24℃室温，50-60％湿度。
细胞株：THP-1(American Type Culture Collection，Manassas)，是人单核细胞白血病细胞。THP-1细胞用含10％FBS的RPMI1640培养液培养。细胞放置于37℃，5％CO2，饱和水蒸汽的恒定条件中培养。每4-5天更换一次培养液。
试剂：
注射用地塞米松磷酸钠注射液，5mg/mL，购自上海信谊金珠药业有限公司。批号：020601
2，4-二硝基氟苯(2，4-Ditrofluorobenzene，DNFB)是Merck(NJ，USA)公司产品。
绵羊红细胞(sheep red blood cell，SRBC)购自上海江南生物技术工程有限公司。
巯基乙酸(Thioglycollate，TG)是WAKO(Tokoyo，Japan)产品，用蒸馏水配成3％溶液，煮沸后热压灭菌。室温储存6个月，如发现混浊则弃之不用。
RPMI 1640培养液：为GIBCO产品配制(批号：1120708)，含10％灭活的胎牛血清，HEPES缓冲液10mmol/L，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，谷氨酰胺2mmol/L，α-巯基乙醇50μmol/L，PH 7.2。
伴刀豆蛋白(Concanavalin A，ConA，From Canavalia Ensiformis)，批号：64H7090，细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)和二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)均为Sigma公司产品。
PANSORBIN(Staphylococcus aureus Cowan strain I，Sac)批号：B27016，Calbiochem-Novabiochem Corporation。
MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide]批号：51K5312，Sigma公司。用时生理盐水配成5mg/ml，避光保存。
ELISA测定试剂盒：购自PharMingen公司
[3H]-胸腺嘧啶核苷为上海原子能研究所产品，其余试剂均为国产分析纯。
实验方法：
小鼠脾脏淋巴细胞的制备：
无菌取小鼠脾脏，用常规方法破红细胞，用含2％FCS的PBS洗三遍后，制备成单个脾细胞悬液，用含10％FCS的RPMI-1640培养液调整至所需细胞浓度。
3H-胸腺嘧啶核苷掺入法：
小鼠脾细胞5×105/ml加入96孔培养板中，药物及丝裂原(ConA终浓度5μg/mL，LPS终浓度10μg/mL)同时加入，对照组加入1640培养液，终体积200μL。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中培养，培养结束前8小时，每孔加入25μL3H-胸腺嘧啶核苷酸(1.9×1010Bq)，继续培养至实验结束，然后将培养板冻存于-20℃冰箱；测定时将冻融的细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta记数仪上读取掺入细胞DNA的[3H]-胸腺嘧啶核苷量，以cpm值代表细胞增殖的情况。
MTT法：
小鼠脾细胞浓度调至4×105/ml，每孔加入90μl的细胞悬液，45μl的样品(对照加45μl的培养液)和45μl的培养液于96孔板中，总体积180μl。细胞于37℃，5％CO2孵箱中培养48小时，结束培养前4-5小时加入MTT 18μl。培养结束时，加入溶解液90μM，放置6-7小时左右，用酶标仪于570nm处测OD值。
混合淋巴细胞培养：
雄性Balb/c小鼠，无菌条件下取脾脏，制成浓度为1×107/mL的脾细胞悬液，离心沉淀，去上清后，加入终浓度50μg/mL mitomycin C(RPMI1640配置)，细胞终浓度仍为1×107/mL，37℃孵育1-2小时。取雄性C57BL/6小鼠脾脏淋巴细胞，将细胞浓度调节至5×106/mL，实验时每孔加入50μl。将处理后的Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞，用RPMI1640清洗2次，调细胞浓度至5×106/mL，每孔加入50μL。实验时，细胞共设3个对照组，
Balb/c小鼠组，
C57BL/6组以及
Balb/c 和C57BL/6混合培养组。同时加入50μL的不同浓度DZ2002(对照加50μL的培养液)和50μL的含10％FCS的RPMI-1640培养液，每孔总体积200μL。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中培养96小时。结束培养前24小时每孔加入25μL[3H]-胸腺嘧啶核苷酸(3.8×1010Bq)，继续培养至实验结束，收集及测量方法同[3H]-胸腺嘧啶核苷掺入法测定T，B淋巴细胞增殖。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备：
每只小鼠腹腔注射0.5mL 3％经高压灭菌的TG，4天后用PBS(含2％FBS)洗出腹腔渗出液，离心，含2％FBS的PBS洗一遍后，重悬在含10％FBS的RPMI-1640培养液调整到合适的细胞浓度。
细胞因子产生的诱导：
小鼠脾脏淋巴细胞浓度为5×106/mL，加入24孔培养板中(1mL)，不同浓度DZ2002或DHCaA及ConA(5μg/mL，IL-2诱导)或Sac(1∶10000，IL-12、IL-10、IFN-γ诱导)同时加入，对照组以1640培养液代替，终体积2mL。细胞于37℃培养箱中培养24小时后，收集离心后收上清，-20℃冻存，IL-2，IL-12p40，IL-12p70，IL-10，IFN-γ等细胞因子的产生采用ELISA法检测。
小鼠腹腔巨噬细胞浓度为6.25×105cells/mL，加于24孔板中，每孔1mL；37℃，5％CO2的培养箱中孵育2小时后，用PBS洗去非粘附细胞，剩下粘附细胞。LPS(1μg/mL)和IFN-γ(2.5ng/mL)及不同浓度DZ2002同时加入，总体积2mL，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时后，收取无细胞培养上清，冻存于-20℃，待测细胞因子。
THP-1细胞浓度为1.2×106cells/mL，加于24孔板中，每孔1mL。1.2％DMSO(使THP-1细胞分化)及不同浓度DZ2002同时加入，总体积为2mL，37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时后，加入IFN-γ(500U/mL)，又16小时后，加入LPS(1μg/mL)。再培养24小时后，收取无细胞培养上清冻存于-20℃，待测细胞因子。
双夹心抗体酶联免疫吸附法(ELISA法)测定细胞因子：
一抗用包被稀释液将抗体按试剂盒上要求比例稀释，加入96孔板，每孔50μL，4℃冰箱封闭过夜。在室温下将抗体溶液倒掉，用PBS/Tween洗三遍，加入200μL封闭液(含10％小牛血清的磷酸盐缓冲液)，在室温下放置1-2小时后，洗三遍；加入50μL标准品或样品(封闭液稀释)。密封平板，在室温放置2小时或4℃孵育过夜。用PBS/Tween溶液洗4次后，每孔加入50μL稀释后的二抗。密封酶标板，在室温放置1小时。用PBS/Tween溶液洗4次。将辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)按1∶800用封闭液稀释，每孔加入100μL。密封酶标板，在室温放置1小时。然后用PBS/Tween溶液洗4次后，用0.1M柠檬酸-0.2M NaH2PO4缓冲液PH5.4稀释成0.1mg/Ml，加入0.075％H2O2，每孔加入50ul，在室温放置30分钟。加入25ul终止液终止现色反应。测定450nm处吸光度值，根据标准曲线换算出培养上清中细胞因子含量。
流式细胞仪检测细胞表面抗原表达：
小鼠腹腔巨噬细胞浓度为2×106cells/mL，加于低粘性螺旋帽培养器中(PIERCE，Rockford，USA)中，每孔1.5mL，IFN-γ(10ng/mL)及不同浓度DZ2002同时加入，终体积3mL，细胞于37℃，5％CO2的培养箱中培养24小时后收集细胞。
THP-1细胞浓度为1.2×106cells/mL，加于低粘性螺旋帽培养器中(PIERCE，Rockford，USA)中，每孔2mL，终体积3mL其他处理同细胞因子的诱导，培养结束后收集细胞。
收集的细胞(2-10×105/管)用冰冷的洗液(PBS，含0.1％ NaN3，1％FBS，PH 7.2)洗后，重悬于洗液中。小鼠腹腔巨噬细胞用5％Balb/c小鼠血清封闭Fc受体30分钟后，洗液洗1次。待染色的细胞加入适宜浓度荧光标记的抗体并于4℃，避光孵育30分钟。染色后用2.0mL洗液洗两次，重悬于0.5mL洗液中，用流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析，数据用CellQuestTMSoftware(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行分析。
DNFB诱发的迟发性超敏反应(DTH)：
6-8周龄雌性Balb/c小鼠按体重随机分组，每组8只。第1天用以丙酮-橄榄油(4∶1)配制的0.5％的2，4-二硝基氟苯(DNFB)20μL涂于小鼠两后足致敏，第2天以同样剂量加强致敏。第一次致敏9天后，用0.4％DNFB-丙酮-橄榄油(4∶1)各10μL涂于小鼠右耳两侧攻击；DZ2002(2.5，5，10mg/kg)在攻击前1小时和攻击后24小时各腹腔注射给药一次，对照组给以溶剂对照。攻击后40小时，脱颈臼处死小鼠，用特制的8mm打孔器沿耳片外沿相同部位打下圆形耳片，称重，以左右耳片重量差作为小鼠DTH反应的指标。
绵羊红细胞定量溶血分析(Quantitative hemolysis of sheep red bloodcells assay，QHS assay)：
6-8周雌性Balb/c小鼠按体重随机分组，每组9只。DZ2002(0.08和2mg/kg)从第1天开始每天一次腹腔注射给药，连续7天，对照组给以溶剂对照。在第4天以1∶6稀释的新鲜绵羊红细胞(SRBC)0.2mL腹腔注射免疫小鼠。第8天脱颈臼处死小鼠，取脾脏制成2×106cells/mL单细胞悬液。取细胞悬液、0.5％SRBC和1∶10稀释的豚鼠血清各1mL混合，37℃孵育1小时。3000g，3分钟离心取上清液，在520nm处测定溶血OD520值(UV/vis-754型分光光度计，上海第三分析仪器厂)。
统计方法：
实验数据基本上以X±SD形式给出；统计分析采用Student’s t-test，p＜0.05时认为有显著性差异。
Claims (2)
1、化学名为6-氨基-α(R)-羟基-9H-嘌呤-9-丁酸乙酯结构式如下的化合物在制备免疫抑制剂药物中的用途
2、根据权利要求1所述的6-氨基-α(R)-羟基-9H-嘌呤-9-丁酸乙酯化合物的用途，其特征在于在制备预防治疗由Th1介导细胞免疫反应亢进引起的自身免疫性疾病的药物中应用。
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