NO316731B1

NO316731B1 - Fremgangsmate for fremstilling av emulsjonsformulering, emulsjon, samt anvendelse derav og fiskefôrpreparat

Info

Publication number: NO316731B1
Application number: NO19995802A
Authority: NO
Inventors: Maurice M Moloney; Harm M Deckers; Gijs Van Rooijen; Joseph Boothe; Janis Goll; Soheil Sayed Mahmoud
Original assignee: Sembiosys Genetics Inc
Priority date: 1997-05-27
Filing date: 1999-11-26
Publication date: 2004-04-19
Also published as: CA2291274A1; NO995802L; US6146645A; AU7517898A; JP3869861B2; KR20040101211A; EP0986309A1; IL132908A0; PT986309E; CN1258198A; NO995802D0; DE69839148T2; CA2291274C; DK0986309T3; BR9809691A; HK1027487A1; DE69839148D1; ES2301197T3; JP2002503268A; WO1998053698A1

Description

Oppfinnelsesområde

Foreliggende opprinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av emulsjonsformulering, emulsjon, samt anvendelse derav og fiskeforpreparat. Emulsjonene kan anvendes i diverse husholdningsblandinger og industriblandinger.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Emulsjoner er blandinger som fremstilles fra to gjensidig uløselige komponenter. Det er mulig å frembringe blandinger av homogent makroskopisk utseende fra disse komponentene gjennom riktig valg og håndtering av blandingsbetingelsene. Den vanligste type av emulsjoner er de hvor det benyttes en vandig komponent og en lipofil komponent og som på dette felt omtales som olje-i-vann- og vann-i-olje-emulsjoner. I olje-i-vann-emulsjoner er den lipofile fase dispergert i den vandige fase, mens i vann-i-olje-emulsjoner er den vandige fase dispergert i den lipofile fase. Vanlig kjente eksempler på emulsjonsbaserte formuleringer for husholdningsformål er majones, margarin, iskrem, kosmetika og maling. Emulsjonssystemer har også utstrakt anvendelse innen industrien, som f.eks. i den farma-søytiske og agrokjemiske industri, hvor det ofte er ønskelig å formulere virkestoffer i emulsjoner.

Generelt fremstilles emulsjoner i nærvær av en rekke andre substanser for å oppnå en ønskelig balanse mellom emulgering, viskositet, stabilitet og utseende. For eksempel fordrer formuleringen av emulsjoner vanligvis minst ett, og ofte en kombinasjon av flere, emulgeringsmidler. Disse midlene letter dispergeringen av en ikke-blandbar fase inn i en annen og bidrar til å stabilisere emulsjonen. Emulgeringsmidler omfatter et stort utvalg syntetiske og naturlige komponenter. For eksempel benyttes monoglycerider og kjemiske derivater derav, i stor utstrekning som emulgeringsmidler for næringsmidler, som f.eks. margariner og bake/stékeprodukter. Et eksempel på et naturlig emulgeringsmiddel er lecitin, et fosfolipid som forekommer i eggeplomme, som er vanlig anvendt ved fremstillingen av majones. Det er også mulig å inneslutte virksomme ingredienser i emulsjoner. Dette er spesielt ønskelig for blandinger som omfatter virkemidler som er vanskelige å løse i vandige løsningsmidler, som f.eks. visse vitaminer og nukleotider. Aktive ingredienser formuleres også som emulsjoner for å øke deres stabilitet. Ett eksempel på et emulsjonssystem som omfatter et farmasøytisk middel, er dokumentert i US-patent 5.602.183, som beskriver en sårtilhelingsblanding som omfatter et antiinflammatorisk middel. De nevnte eksempler utgjør bare noen få av de myriader av komponenter som inngår i formuleringer av kjente emulsjoner. En omfattende oversikt over emulgeringsmidler og deres anvendelser finnes hos Becher, P. Encyclopedia of Emulsion Technology, Dekker Ed. 1983.

I frøene til oljevekster, som innbefatter økonomisk viktige nyttevekster som soyabønne, raps, solsikke og palme, lagres den vann-uløselige oljefraksjon i diskrete subcellulære strukturer som går under forskjellige navn som oljelegemer, oleosomer, lipidlegemer eller sfærosomer (Huang 1992, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43:177-200). Foruten blandinger av oljer (triacylglycerider) som kjemisk er definert som glycerolestere av fettsyrer, omfatter oljelegemer fosfolipider og en rekke assosierte proteiner, betegnet oljelegemeproteiner. Ut fra strukturen ansees oljelegemer å være en triacylglyceridmatriks innkapslet av et monolag av fosfolipider som det er innleiret oljelegemeproteiner i (Huang, 1992, Ann. Rev. Plant Mol. Biol. 43:177-200). Frøoljen som forekommer i oljelegemefraksjonen av plantearter, er en blanding av forskjellige triacylglycerider, hvor den nøyaktige sammensetning avhenger av den planteart som oljen skriver seg fra. Det er gjennom en kombinasjon av klassisk formering og genetisk manipulering blitt mulig å manipulere oljeprofilen av frø og utvide det naturlig tilgjengelige repertoar av planteolje-blandinger. Angående en oversikt over pågående arbeid på dette området, se Designer Oil Crops/Breeding, Processing and Biotechnology, D.J. Murphy, red. 1994, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Tyskland.

Plantefrøoljer inngår i en rekke industrielle anvendelser, særlig innen næringsmiddel-, detergent- og kosmetikkindustrien. For å oppnå de planteoljene som benyttes på disse felt, knuses eller presses frø og raffineres deretter ved å benytte prosesser som ekstraksjon med organiske løsningsmidler, degummiering, nøytralisering, bleking og filtrering. Vandig ekstraksjon av oljevekstfrø er også beskrevet (for eksempel Embong & Jelen, 1977, Can. Inst. Food Sei. Technol. J. 10:239-243). Siden formålet med de tidligere kjente prosesser er å oppnå ren olje, mister oljelegemene i løpet av disse produksjonsprosesser deres strukturelle integritet. Tidligere kjente emulsjoner formulert fra planteoljer, omfatter i alminnelighet ikke intakte oljelegemer.

Selv om mineraloljebaserte produkter for mange anvendelser dominerer markedet, er olje avledet fra plantekilder, og fossile kilder i direkte konkurranse på andre anvendelsesområder. Laurinoljer for eksempel, som har utstrakt anvendelse innen fremstillingen av detergenter, oppnås fra mineralolje så vel som fra kokosolje og i det senere fra genetisk manipulert rapsfrø (Knauf, V.C., 1994, Fat. Sei. Tech. 96:408). Det er imidlertid for tiden økende etterspørsel etter bionedbrytbare råmaterialkilder. Emulsjoner basert på planteoljelegemer i henhold til foreliggende oppfinnelse, byr på en fordel fremfor lignende mineraloljebaserte formuleringer, ved at oljefraksjonen skriver seg fra en fornybar og miljømessig vennlig kilde.

US-patent 5.683.710 og 5.613.583 omtaler emulsjoner som omfatter lipidvesikler fra oljeholdige planter. Emulsjonene omtalt i disse patentene fremstilles fra relativt rå frøekstrakter og omfatter mange frøkomponenter, inklusivt glykosylerte og ikke-glykosylerte proteiner. Det er en ulempe ved de emulsjoner som disse patenter vedrører, at de omfatter kontaminerende frøkomponenter som gir emulsjonene en rekke uønskede egenskaper som kan innbefatte allergenitet og uønsket lukt, smak, farve og organoleptiske karakteristika. Som følge av nærværet av frø-kontaminanter, har fremstillingene av lipidvesikler omtalt i disse patentene, begrensede anvendelser.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig fremgangsmåte for fremstilling av en emulsjonsformulering, kjennetegnet ved at den omfatter: 1) oppnåelse av oljelegemer fra en celle; 2) vasking av oljelegemene for å oppnå et vasket oljelegemepreparat som omfatter intakte oljelegemer av tilnærmet ensartet størrelse, form og tetthet; og

3) formulering av det vaskede oljelegemepreparat til en emulsjon.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også nye emulsjonsformuleringer som inneholder oljelegemer. Det er også beskrevet emulsjon, kjennetegnet ved at den omfatter et vasket oljelegeme-preparat omfattende intakte oljelegemer av tilnærmet ensartet størrelse, form og tetthet. Emulsjonsformuleringene ifølge oppfinnelsen kan oppnås i ugiftige former og næringsmiddelkvaliteter. I tillegg kan emulsjonsformuleringene med fordel fremstilles fra et oljelegemepreparat som har kremaktig tekstur og således lett kan benyttes innen en rekke husholdnings- og industrianvendelser. Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at oljelegemefraksjonen av levende celler er egnet for formuleringen av en rekke nye emulsjonsbaserte næringsmidler, kosmetiske, farmasøytiske og industrielle produkter. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en emulsjonsformulering som omfatter vaskede oljelegemer utvunnet fra en celle.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelsen av en emulsjon fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 19 for å fremstille et kroppspleieprodukt, et næringsmiddel- eller forprodukt, et industrielt produkt eller et farmasøytisk produkt. Det er videre beskrevet et fiskeforpreparat kjennetegnet ved at det er belagt med en emulsjon ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 25.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av emulsjonsformuleringer som omfatter: 1) oppnåelse av oljelegemer fra en celle; 2) vasking av oljelegemene; og 3) formulering av de vaskede oljelegemer til en emulsjon.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen oppnås den vaskede oljelegeme-tilberedning fra plantefrø, inklusivt frø som kan oppnås fra rapsfrø, soyabønne, mais og solsikke. Oppfinnelsen tilveiebringer således en fremgangsmåte for fremstilling av emulsjonsformuleringene fra plantefrø, som omfatter: (1) oppnåelse av oljelegemer fra plantefrø ved hjelp av en fremgangsmåte som

omfatter:

(a) oppmaling av plantefrø;

(b) fjerning av faststoff fra de oppmalte frø; og

(c) separering av oljelegemefasen fra den vandige fase; (2) vasking av oljelegemefasen for å oppnå et vasket oljelegemepreparat omfattende intakte oljelegemer av tilnærmet jevn størrelse, form og tetthet; og

(3) formulering av det vaskede oljelegemepreparat til en emulsjon.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tilsettes en flytende fase til frøene før eller etter oppmaling av frøene.

I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter formulering av emulsjonene (e) tilsetning av en flytende fase til det vaskede oljelegeme-preparat.

Emulsjonene ifølge foreliggende oppfinnelse kan inngå i et stort utvalg av anvendelser, herunder ved fremstillingen av næringsmiddel- og forprodukter, farmasøytiske produkter, produkter for personlig pleie og industriprodukter. Emulsjonsformuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt egnet for fremstilling av produkter av næringsmiddelkvalitet, ved at det er ugiftig, kremaktig av tekstur og bionedbrytbart.

Andre formål, fordeler og trekk ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå gjennom vurdering av de ledsagende tegninger og den etterfølgende detaljerte beskrivelse av . oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er en coomassieblått-farvet gel av et vasket oljelegemepreparat fra hvit sennep, raps ( Brassica napus), soyabønne, jordnøtt, squash, lin, solsikke, safflor og mais. Figur 2A-C er coomassieblått-farvede gel som viser proteinprofilene av forskjellige frøfraksjoner oppnådd fra Brassica napus (Canola) (A), solsikke (B) og mais (C). Gelene viser følgende fraksjoner (1) totalt frøprotein (TSP), (2) dekantert væskefase (DL), (3) uvaskede oljelegemer (LP1), (4) tre vaskinger med vann (LP4), (5) fire vaskinger med vann og én vask med 100 mM Na2C03 (vasket).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Som nevnt ovenfor vedrører foreliggende oppfinnelse emulsjonsformuleringer som omfatter oljelegemer fra en celle. I henhold til én utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en emulsjonsformulering som omfatter vaskede oljelegemer.

I henhold til en annen utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av en emulsjonsformulering som omfatter: 1) oppnåelse av oljelegemer fra en celle; 2) vasking av oljelegemene; og 3) formulering av de vaskede oljelegemer til en emulsjon.

Cellen kan være en hvilken som helst celle som inneholder oljelegemer (eller strukturer som ligner oljelegemer) inklusivt planteceller, dyreceller, soppceller og bakterieceller. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen oppnås oljelegemene fra en plantecelle. Oljelegemene kan oppnås fra en plantecelle ved å ødelegge plantecellemembranen og celleveggen ved å benytte en hvilken som helst metode som frigjør cellebestanddeler uten i vesentlig grad å ødelegge oljelegemenes strukturelle integritet. Mer foretrukket oppnås oljelegemene fra plantefrø.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen tilsettes en væskefase til frøene før eller etter oppmaling av frøene.

I henhold til en ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter formuleringen av emulsjonene (e) tilsetning av en flytende fase til det vaskede olj elegemepreparat.

Betegnelsen «oppmaling» betyr i denne sammenheng maling, knusing, kverning eller granulering av frøene, og disse betegnelsene kan benyttes om hverandre i denne beskrivelse. Ved denne prosess brytes frøcellene opp.

Betegnelsen «faststoffer» betyr her et hvilket som helst materiale som ikke er løselig i den vandige fase eller i oljefasen, som f.eks. frøskall.

Uttrykket «vasking av oljelegemene» betyr her en hvilken som helst prosess som fjerner cellulære kontaminanter fra oljefasen, særlig eventuelle kontaminanter som gir emulsjonsformuleringen uønskede egenskaper, så som allergene egenskaper, uønsket farve, lukt, smak eller organoleptiske karakteristika eller en eventuell annen uønsket egenskap. Eksempler på vaskemetoder er tyngdekratfbaserte separasjonsmetoder, som f.eks. sentrifugering og størrelseseksklusjons-baserte separasjonsteknikker, så som membran-ultrafiltrering og kryss-strøms mikrofiltrering. Vaskemetoder og betingelser velges i henhold til ønsket renhet av oljelegeme-preparatet.

Uttrykket «vasket oljelegemepreparat» betyr her en tilberedning av oljelegemer hvorfra en betydelig mengde cellemateriale er blitt fjernet, herunder kontaminanter som gir emulsjonsformuleringen uønskede egenskaper, så som allergene egenskaper, uønsket farve, lukt, smak eller organoleptiske karakteristika eller en eventuell annen uønsket egenskap. Fortrinnsvis inneholder det vaskede oljelegemepreparat mindre enn 10% av de andre frøproteiner.

Med «formulering av oljelegemene til en emulsjon», menes at det vaskede oljelegemepreparat om nødvendig blandes eller homogeniseres inntil det dannes en emulsjon. I henhold til en foretrukket utførelsesform tilsettes en ytterligere komponent, så som en vaskefase, og det vaskede oljelegemepreparat og væskefasen blandes inntil det oppnås en homogen blanding.

De vaskede oljelegemepreparatene er særlig egnet for formulering av emulsjoner som følge av de nedenfor skisserte fordelaktige egenskapene.

OLJELEGEMENES EGENSKAPER

Emulsjonsformuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter intakte vaskede oljelegemer av tilnærmet jevn størrelse, fasong og tetthet. Betraktet under elektronmikroskopet viser oljelegemer seg å være mer eller mindre kuleformede strukturer (se for eksempel Murphy, D.J. & Cummins, I., 1989, Phytochemistry, 28:2063-2069; Jacks, T.J. et al., 1990, JAOCS, 67:353-361). Typiske størrelser av oljelegemer varierer fra 0,4 nm til 1,5 um (Murphy, D.J. & Cummins, I., 1989, Phytochemistry, 28:2063-2069). Ved analyse under bruk av en Malvern Size Analyzer, ble det funnet at oljelegemer i et vasket oljelegemepreparat isolert fra rapsfrø, var symmetrisk og ensartet fordelt omkring 1 nm. Ved å benytte en Malvem Size Analyzer kunne et vasket oljelegemepreparat klart skjelnes fra kommersielt tilgjengelige olje-i-vann-emulsjoner, inkusivt soyamelk, majones (Kraft Real Mayonnaise) og to kokos-melkepreparater (Tosca, Aroy-D). Den eksakte størrelse og tetthet av oljelegemene avhenger i det minste delvis av den nøyaktige proteir^fosfolipidVtriacylglycerid-sammensetning som er tilstede. Fremstilling av vaskede oljelegemer i henhold til foreliggende oppfinnelse resulterer ikke i vesentlig endring i oljelegemenes fasong når de i elektronmikroskop sammenlignes med de som forekommer i hele frø.

Etter oppbrytning av en celle som inneholder oljelegemer, kan oljelegeme-fraksjonen hurtig og enkelt separeres fra vandige løsninger, siden oljelegemerfaksjonen i vandige løsninger vil flyte opp etter at de er utsatt for sentrifugalkraft. I løsninger hvor tettheten av oljelegemerfaksjonen er større enn løsningsmidlets, så som i 95% etanol, vil oljelegemene sedimentere under de samme betingelsene. Oljelegemefraksjonen kan også separeres fra den vandige fraksjon gjennom størrelseseksklusjons-baserte separasjonsteknikker, så som membranfiltrering, noe som kan være fordelaktig ved at det oppnås oljelegemer med en mer jevn størrelse.

Oljelegemene som forekommer i de vaskede oljelegemepreparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, er resistente mot eksponering for sterke syrer og baser, inklusivt langvarig eksponering for sure betingelser i det minste så lave som pH 2 og alkaliske betingelser i det minste så høye som pH 10. Ved eksponering for pH 12, ble det observert et svakt tap av olje, hvilket tydet på et tap av integriteten av oljelegemets struktur. Ekstraksjon med forskjellige organiske løsningsmidler, inklusivt metanol, etanol, heksan, isopropylalkohol og etylacetat, ødelegger dessuten ikke, eller bare svakt, oljelegemene i det vaskede oljelegemepreparat. Oljelegemene i det vaskede oljelegemepreparat viste seg også å motstå blanding med det anioniske overflateaktive middel, natriumdodecylsulfat (SDS), det kationiske overflateaktive middel heksadecyltrimetylbromid, samt Tween-80, et ikke-ionisk overflateaktivt middel. Koking av det vaskede oljelegemepreparat i nærvær av SDS viste seg å resultere i det minste delvis, i disintegrasjon av oljelegemets struktur. Oljelegemer i det vaskede oljelegemepreparat er stabilt ved 2 timers opphold ved opptil minst 100°C. En langsom frysing og tining av vaskede oljelegemepreparater resulterte i en endring i deres fysikalske utseende karakterisert ved dannelse av klumper i stedet for en homogen emulsjon. Klumping av oljelegemer etter en frysing-opptining kunne også i stor grad forhindres ved enten a) bråfrysing i flytende nitrogen i stedet for langsom frysing ved -20°C eller b) glyceroltilsetning på mer enn 5 vol% til oljelegemepreparatet før frysing. Motstandsdyktigheten mot relativt sterke kjemiske og fysikalske betingelser er et enestående karakteristikum ved oljelegemer i det vaskede oljelegemepreparat ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer emulsjonsformuleringer som omfatter oljelegemer, hvorfra en betydelig mengde av frøkontaminanter er blitt fjernet. Disse kontaminantene innbefatter proteiner, flyktige forbindelser og andre forbindelser som kan gi uønsket farve, lukt, smak, organoleptiske karakteristiska eller andre uønskede karakteristika. En rekke frøproteiner har vært rapportert å forårsake allergene reaksjoner. For eksempel rapporterer Ogawa et al., (1993, Biosci. Biotechnol. Biochem., 57:1030-1033) om allergenitet av soyaglykoproteinet P34 (alternativt omtalt som Gly m Bd 30K). Allergene reaksjoner mot raps-, hvete- og bygg-proteiner har også vært rapportert (Armentia et ai, 1993, Clin. Exp. Allergy 23:410-415; Monsalve et al., 1993, Clin. Exp. Allergy, 27:833-841). Fjerning av kontaminerende frøproteiner er således fordelaktig. Vaskebetingelsene kan velges slik at det oppnås et i det vesentlige rent oljelegemepreparat. I så fall forekommer i det vesentlige bare oljelegemets proteiner i preparatet.

For mange anvendelser ansees det også ønskelig at det oppnås et renere, bedre definert oljelegemepreparat, idet dette muliggjør mer kontroll med formuleringsprosessen av den endelige emulsjon. For at det vaskede oljelegemepreparat skal inkluderes i diverse sett av emulsjoner, er det ønskelig at flyktige forbindelser holdes på et minimum og at farven fortrinnsvis er lys eller hvit. Vasking av oljelegemepreparatet resulterer i lysere farvede preparater. Dessuten fjernes en vesentlig mengde flyktige forbindelser. Ved vaskingen fjernes også forbindelser som fremmer veksten av mikroorganismer, idet det ble registrert at et vasket oljelegemepreparat hadde lengre lagringsbestandighet enn et uvasket preparat. Andre forbindelser som fjernes ved vaskingen er glukosinilater uten næringsverdi og/eller nedbrytningsprodukter derav, samt fibrøst materiale. Ved varmebehandling til 60°C eller 80°C, ble det observert at store mengder vann forble absorbert av det vaskede oljelegemepreparat sammenlignet med et uvasket preparat. Etter avkjøling ned til romtemperatur og sentrifugering, ble det observert at det vaskede oljelegemepreparat forble stabilt, mens det i det uvaskede preparat inntrådte faseseparasjon. Med vaskede oljelegemers forbedrede stabilitet er disse å foretrekke når formuleringsprosessen innebærer varmetilførsel. Ved oppvarming til 40°C, var det vaskede oljelegemepreparat i stand til å absorbere en større mengde eksogent tilsatt vann uten at dette resulterte i faseseparasjon. Ved formulering av vandige emulsjoner er således vaskede oljelegemer å foretrekke. Evnen til å absorbere eksogent tilsatte oljer, ble også sammenlignet mellom et preparat av vaskede oljelegemer og et uvasket preparat. Større mengder eksogen olje kunne tilsettes til det vaskede oljelegemepreparat før det ble dannet en ustabil emulsjon. Dette er fordelaktig i formuleringer hvor eksogene oljer eller voks tilsettes under formuleringsprosessen, som f.eks. når det fremstilles smøremidler eller kosmetika. Ved sammenligning av viskositeten av et vasket oljelegemepreparat med et uvasket preparat, viste det seg at det vaskede preparat var mer viskøst. Et mer viskøst preparat av oljelegemer er ønskelig ved at dette eliminerer behovet for tilsetning av fortykningsmidler under formuleringsprosessen.

Det her frembragte vaskede oljelegemepreparat er således i mange henseender et uvasket preparat overlegent. Det vaskede oljelegemepreparat ifølge foreliggende oppfinnelse er et bedre definert preparat med en lengre holdbarhet og mer foretrukne farve-, lukt- og viskositetskarakteristika. Det vaskede oljelegemepreparat har også overlegne vann- og oljeabsorpsjonskarakteristika. Som følge av fjerningen av en betydelig andel frøproteiner er det dessuten mindre sannsynlig at allergene reaksjoner skal forekomme. Disse karakteirstikaene tillater anvendelse av det vaskede oljelegemepreparat ved formulering av en rekke emulsjoner benyttet i husholdningen og industrien.

De ovennevnte observasjoner ble gjort ved bruk av vaskede og uvaskede oljelegemepreparater oppnådd fra raps, og er fremstillet som mer detaljert beskrevet senere i Eksempel 2. Det antas at motstandsdyktigheten mot relativt strenge kjemiske og fysikalske betingelser vil være et kjennetegn ved oljelegemer i de vaskede oljelegemepreparatene ifølge oppfinnelsen uansett opphavskilden til oljelegemene. Det er imidlertid sannsynlig at én eller flere av de foran dokumenterte egenskaper ved rapsoljelegemer vil variere noe, avhengig av de celler hvorfra det vaskede oljelegemepreparat er oppnådd. Ikke desto mindre er det klart at foreliggende oppfinnelse er rettet mot et oljelegemepreparat som kan oppnås fira en hvilken som helst celle som omfatter oljelegemer.

I henhold til én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse oppnås oljelegemene fra plantefrø. Forekomsten av intakte oljelegemer i emulsjonen og de beskrevne karakteristika for disse oljelegemene skiller klart emulsjonsformuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse fra andre materialer som kan fremstilles fra plantefrø.

KILDER OG FREMSTILLING AV OLJELEGEMENE

Det vaskede oljelegemepreparat ifølge oppfinnelsen kan oppnås fra en hvilken som helst celle som inneholder oljelegemer eller oljelegeme-lignende organeller. Dette omfatter dyreceller, planteceller, soppceller, gjærceller (Leber, R, et al., 1994, Yeast 10:1421-1428), bakterieceller (Pieper-Fiirst et al., 1994, J. Bacterol. 176:4328-4337) og algeceller (Rossler, P.G., 1988, J. Physiol. (London) 24:394-400). I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen oppnås oljelegemene fira en plantecelle, inklusivt celler fra pollen, sporer, frø og vegetative planteorganer, hvor oljelegemer eller oljelegeme-lignende organeller forekommer (Huang, 1992, Ann. Rev. Plant Physiol. 43:177-200). Mer foretrukket ér det at det vaskede oljelegemepreparat ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås fra plantefrø og mest foretrukket fra gruppen av plantearter som omfatter: rapsfrø ( Brassica spp.), soya ( Glycine max), solsikke ( Helianthus annuus), oljepalme ( Elaeis guineeis), bomullsfrø ( Gossypium spp.), jordnøtt

( Arachis hypogaea), kokos ( Cocus nucifera), ricinus ( Ricinus communis), safflor ( Carthamus tinctorius), sennep ( Brassica spp. og Sinapis alba), koriander ( Coriandrum sativum), squash ( Cucurbita maxima), linfrø/lin ( Linum usitatissimum), paranøtt ( Bertholletia excelsa), jojoba ( Simmondsia chinensis) og mais ( Zea mays). Planter dyrkes og far sette frø ved anvendelse av velkjent landbruksmessig dyrkningspraksis. Etter høsting av frøene og eventuelt fjerning av materiale som stener eller frøskall (avskalling) for eksempel ved sikting eller rensing, og eventuelt tørking av frøene, behandles frøene deretter ved mekanisk pressing, oppmaling eller knusing. I henhold til en foretrukket utførelsesform tilsettes en flytende fase før oppmaling av frøene. Dette er kjent som våtmaling. Fortrinnsvis er væsken vann, men andre organiske

løsningsmidler, så som etanol, kan også benyttes. Våtmaling i oljeekstraksjonsprosesser har vært.rapportert for frø fra en rekke plantearter, inklusivt: sennep (Aguilar et ai, 1990, Journal of Texture studies 22:59-84), soya (US-patent 3.971.856; Carter et al., 1974, J. Am. Oil Chem. Soc. 51:137-141), jordnøtt (US-patent 4.025.658; US-patent 4.362.759), bomullsfrø

(Lawhon et al, 1977, J. Am. Oil Chem. Soc. 63:533-534) og kokosnøtt (Kumar et al., 1995, INFORM 6 (11); 1217-1240). Det kan også være fordelaktig å bløte frøene i et tidsrom på fra ca. 15 minutter til ca. 2 dager i en flytende fase før oppmaling. Bløting kan mykne celleveggene og lette oppmalingsprosessen. Bløtlegging over lengre tidsrom kan etterligne spiringsprosessene og resultere i visse fordelaktige endringer i sammensetningen av frøets bestanddeler. I henhold til en annen utførelsesform tilsettes den flytende fase etter at frøene er oppmalt. Dette er kjent som tørrmaling. Fortrinnsvis er den tilsatte væskefase vann.

Frøene males fortrinnsvis ved å benytte en kolloidmølle, så som MZ130 (Fryma Inc.). Ved siden av kolloidmøller kan det i henhold til den her beskrevne oppfinnelse også benyttes annet mølle- og oppmalingsutstyr som er i stand til å håndtere frømengder i industriell skala, inklusivt: avskallingsvalser, platemøller, kolloidmøller, stiftemøller, orbitalmøller, HCA-møller og homogenisatorer av industriell skala. Valget av møllen kan avhenge av kravene til frøgjennomstrømming så vel som av den anvendte frøkilde. Det er av avgjørende betydning at frøenes oljelegemer forblir intakte under oppmalingsprosessen. Driftsbetingelser som vanligvis benyttes ved oljefrøbehandling, som har tendens til å rive opp oljelegemer, er derfor uegnet forbruk forprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse. Oppmalihgstemperaturene er fortrinnsvis mellom 10°C og 90°C, mer foretrukket mellom 26°C og 30°C, mens pH fortrinnsvis holdes mellom 2,0 og 10.

Hårde kontaminanter, så som frøskall, fibermateriale, uløste karbohydrater, samt proteiner og andre uløselige kontaminanter, fjernes fra den knuste frøfraksjonen. Separasjonen av faste kontaminanter kan oppnås ved å benytte en dekanteringssentrifuge, så som en HASCO 200 2-fase dekanteringssentrifuge eller en NX310B (Alfa Laval). Avhengig av kravene til frøgjennomstrømming, kan kapasiteten av dekanteringssentrifugen varieres ved å benytte andre modeller av dekanteringssentrifuger, så som 3-fase dekanteringsinnretninger. Driftsbetingelsene varierer med den bestemte sentrifuge som benyttes og må innrettes slik at uløselige kontaminerende materialer sedimenterer og forblir sedimentert etter dekantering. Det kan under disse betingelsene iakttas en delvis separering av oljelegemefasen og væskefasen.

Etter fjerning av uløselige kontaminanter separeres oljelegemefasen fra den vandige fase. Ifølge en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen benyttes en «tubular bowl» sentrifuge. I henhold til andre utførelsesformer kan det benyttes hydrocykloner, tallerkensentrifuger eller utfelling av faser under naturlig tyngdekraft eller en hvilken som helst annen tyngdekraft-basert separasjonsmetode. Det er også mulig å skille oljelegemefraksjonen fra den vandige fase ved å benytte størrelseseksklusjonsmetoder, som f.eks. membran-ultrafiltrering og kryss-strøms mikrofiltrering. I henhold til foretrukne utførelsesformer er «tubular bowl» sentrifugen en Sharples modell AS-16 (Alfa Laval) eller en AS-46 Sharples (Alfa Laval). En avgjørende parameter er størrelsen av ringdemningen som benyttes til sentrifugedriften. Ringdemninger er avtagbare ringer med en sentral sirkulær åpning som varierer, når det gjelder AS-16, fra 28 til 36 mm, og regulerer separasjonen av den vandige fase fra oljelegemefasen og således styrer renheten av den oljelegemefraksjon som oppnås. I foretrukne utførelsesformer benyttes en ringdemningstørrelse på 29 eller 30 mm når AS-16 anvendes. Den nøyaktige ringdemningstørrelse som benyttes avhenger av typen av oljefrø som benyttes, så vel som av den ønskede endelige konsistens av oljelegemepreparatet. Separasjonseffektiviteten påvirkes dessuten av strømningshastigheten. Når AS-16 benyttes, er strømningshastigheten typisk mellom 750-1000 mL/min. (ringdemningstørrelse 29) eller mellom 400-600 mL/min. (ringdemningstørrelse 30) og temperaturene holdes fortrinnsvis mellom 26°C og 30°C. Avhengig av hvilken sentrifugemodell som benyttes tilpasses strømningshastigheter og ringdemningstørrelser stik at det oppnås en optimal separasjon av oljelegemefraksjonen fra den vandige fase. Disse justeringene vil fagmannen lett innse.

Separasjonen av hårdt materiale og separasjon av den vandige fase fra oljelegemefaksjonen kan også foretas samtidig ved å benytte en tyngdekraft-basert separasjonsmetode, så som en 3-fase «tubular bowl» sentrifuge eller en dekanteringsbeholder eller en hydrocyklon eller en størrelsesekskulsjons-basert separasjonsmetode.

Blandingene oppnådd på dette prosesstrinn er i alminnelighet relativt rå og omfatter tallrike frøproteiner, som innbefatter glykosylerte og ikke-glykosylerte proteiner og andre kontaminanter, så som stivelse eller glukosinolater eller nedbrytningsprodukter av disse. Foreliggende oppfinnelse omfatter fjerningen av en betydelig andel frøkontaminanter. For å fjerne kontaminerende frømateriale vaskes det oljelegemepreparat som er oppnådd etter separasjon fra den vandige fase, minst én gang ved resuspendering av oljelegemefraksjonen og sentrifugering av den resuspenderte fraksjon. Denne prosess fører til hva som i denne sammenheng omtales som et vasket oljelegemepreparat. Antall vaskinger vil i alminnelighet avhenge av den ønskede renhet av oljelegemefraksjonen. Avhengig av de anvendte vaskebetingelser, kan det oppnås et tilnærmet rent oljelegemepreparat. I et slikt preparat vil de eneste proteiner som forekommer være oljelegemets proteiner. For å vaske oljelegemefraksjonen kan det benyttes «tubular bowl» sentrifuger eller andre sentrifuger, som f.eks. hydrocykloner eller tallerkensentrifuger. Vasking av oljelegemene kan foretas ved å benytte vann, buffersystemer, for eksempel natriumklorid i konsentrasjoner på mellom 0,01M og minst 2M, 0,1M natriumkarbonat ved høy pH (11-12), lav saltbuffer, så som 50 mM Tris HCI, pH 7,5, organiske løsningsmidler, detergenter eller annen væskefase. I foretrukne utførelsesformer foretas vaskingene ved høy pH (11-12). Væskefasen benyttet for vasking, så vel som vaskebetingelsene, så som pH og temperatur, kan varieres ut fra den type frø som benyttes. Vasking med en rekke forskjellige pH på mellom pH 2 og pH 11-12, kan være fordelaktig, idet dette vil muliggjøre trinnsvis fjerning av kontaminanter, særlig proteiner. Vaskebetingelsene velges slik at vasketrinnet resulterer i fjerning av en betydelige del av kontaminantene uten at det går på bekostning av oljelegemenes strukturelle integritet. I utførelsesformer hvor det foretas mer enn ett vasketrinn, kan vaskebetingelsene varieres for de ulike vasketrinn. SDS-gelelektroforese eller andre analytiske teknikker kan hensiktsmessig benyttes for å overvåke fjerningen av frøproteiner og andre kontaminanter etter vasking av oljelegemene. Det er ikke nødvendig å fjerne hele den vandige fase mellom vasketrinnene, og det endelige vaskede oljelegemepreparat kan suspenderes i vann, et buffersystem, for eksempel 50 mM TrisHCl, pH 7,5, eller en hvilken som helst annen væskefase, og pH kan eventuelt justeres til en hvilken som helst pH mellom pH 2 og pH 10.

Prosessen for å fremstille det vaskede oljelegemepreparat kan foretas i satsvise operasjoner eller i en kontinuerlig prosess. Særlig når det benyttes «tubular bowl» sentrifuger, opprettes et system av pumper som opererer mellom trinnene (a) og (b), (b) og (c) og (c) og (d) som gir en kontinuerlig strøm gjennom prosesseringssystemet. I en foretrukket utførelsesform er pumpene 1" M2 Wilden trykkluftdrevne doble membranpumper. I andre utførelsesformer kan det benyttes hydrauliske eller peristaltiske pumper. For å opprettholde en tilførsel av homogen konsistens til dekanteringssentrifugen og til «tubular bowl» sentrifugen, kan det tilkobles homogenisatorer, så som en IKA-homogenisator mellom separasjonstrinnene. Rørmonterte homogenisatorer kan også tilføyes mellom forskjellige sentrifuger, eller kan det benyttes størrelseseksklusjons-basert separasjonsutstyr for å vaske oljelegemepreparatene. Ringdemningstørrelser, buffersammensetninger, temperatur og pH kan variere i hvert vasketrinn fra ringdemningstørrelsen benyttet i det første separasjonstrinn.

I utførelsesformer ifølge oppfinnelsen hvor oljelegemene isoleres fra mykere vev, for eksempel mesocarp-vevet i oliven, kan teknikker som benyttes for å bryte opp cellene variere noe i forhold til de som benyttes for å bryte hårdere frø. For eksempel kan pressbaserte teknikker være å foretrekke fremfor knuseteknikker. Metodikken for å isolere oljelegemer i liten skala har vært rapportert for isolering av oljelegemer fra mesocarp-vev i oliven ( Olea europaea) og avokado ( Persea americand) (Ross et al., Plant Science, 1993, 93:203-210) og fra mikrospore-avledede embryoer av raps ( Brassica napus) (Holbrook et al., Plant Physiol., 1991,97:1051-1058).

I utførelsesformer ifølge oppfinnelsen hvor oljelegemer oppnås fra ikke-planteceller, isoleres det vaskede oljelegemepreparat etter lignende fremgangsmåter som skissert ovenfor. Metodikken for å isolere oljelegemer fra gjær er dokumentert (Ting et al., 1997, Journal Biol. Chem. 272:3699-3706).

De kjemiske og fysikalske egenskapene av oljefraksjonen kan varieres på minst to måter. For det første kan ulike plantearter inneholde oljelegemer med forskjellig oljesammensetning. For eksempel er kokosnøtt rik på laurinoljer (C12), mens erukasyreoljer (C22) er rikelige forekommende enkelte i Brassica arter. For det andre kan de relative oljemengder modifiseres i en bestemt planteart ved å anvende kjente formerings- og genetiske manipuleringsteknikker. Begge disse teknikker tar sikte på å endre den relative aktivitet av enzymer som kontrollerer de metabolismeveier som er involvert i oljesyntese. Gjennom anvendelsen av disse teknikker kan det oppnås frø med et sofistikert sett av ulike oljer. For eksempel har foredlingsforsøk resultert i utvikling av et rapsfrø med lavt erukasyreinnhold (Canola) (Bestor, T.H., 1994, Dev. Genet. 15:458) og plantelinjer med oljer med endringer i posisjoneringen og antallet dobbeltbindinger, variasjon i fettsyrekjedelengde og innføring i ønskede funksjonelle grupper som er frembragt gjennom genetisk manipulering (Topfer et ai, 1995, Science, 268:681-685). Ved å benytte lignende tilnærminger vil fagmannen være i stand til ytterligere å utvide de kilder av oljelegemer som for tiden står til disposisjon. Varierende oljeblandinger vil resultere i varierende fysikalske og kjemiske egenskaper i oljelegemene. Ved å velge oljefrø eller blandinger derav fra ulike arter eller plantelinjer som kilde for oljelegemer, kan det således oppnås et bredt repertoar av emulsjoner med forskjellige teksturer og viskositeten

FORMULERING AV EMULSJONEN

Det vaskede oljelegemepreparat kan formuleres til en emulsjon ved å benytte kjente teknikker. Fortrinnsvis tilsettes minst en ytterligere ingrediens til det vaskede

oljelegemepreparat. Den ytterligere ingrediens kan tilsettes som en løsning, suspensjon, en gel eller faststoff, og mengdene av den ytterligere ingrediens vil avhenge av formuleringen. Den ytterligere ingrediens kan etter formulering bli forbundet med oljelegemene, forbli suspendert i løsning eller danne en suspensjon som oljelegemene er dispergert i. Ingrediensene kan også penetrere fosfolipid-monolaget som omgir oljelegemet eller triacylglyceirdmatriksen. Ingredienser som kan penetrere oljelegemet omfatter oljer, voks og farvestoffet Nile Red. I en foretrukket utførelsesform er den ytterligere ingrediens en væskefase. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er væskefasen vann. Vann kan tilsettes enten direkte eller gjennom fuktighet forbundet med en annen ingrediens. Den endelige vannmengde er ikke avgjørende bare det etter blanding dannes en stabil emulsjon. Generelt vil blandingen inneholde minst 1% vann og opp til 99% vann. I alminnelighet vil det fordres blanding for å oppnå en passende emulsjon, og det kan være nødvendig å anvende varme eller trykk.

I henhold til en annen foretrukket utførelsesform er den ytterligere ingrediens en olje eller en voks. Oljer eller voks kan fordele seg til oljelegemenes triacylglyceridmatriks og på denne måte kan lipidløselige ingredienser, så som lipidløselige vitaminer, avgis til oljelegemematriksen. Når oljer eller voks utgjør den tilsatte ingrediens, kan oljelegemene forbli suspendert i den lipofile fase eller det kan dannes dobbeltemulsjoner.

Den endelige sammensetning kan være i fast eller flytende form eller av en hvilken som helst annen ønsket viskositet. Emulsjonen kan fortykkes ved å benytte gelerende midler, så som cellulose og derivater, Carbopol og derivater, carob, karragenaner og derivater, xantangummi, sklerangummi, langkjedede alkanolamider og benton og derivater, som i alminnelighet forekommer i konsentrasjoner på mindre enn 2 vekt%.

Emulsjonen kan ytterligere omfatte overflateaktive midler for å fukte, skumme, penetrere, emulgere, solubilisere og/eller dispergere et valgt materiale. For eksempel kan det etter behov tilsettes anioniske overflateaktive midler, så som natrium-kokosmonoglyceridsulfonat, kationiske overflateaktive midler, så som lauryltrimetylammoniumklorid, cetylpyridiniurnklorid og trimetylammoniumbromid, ikke-ioniske overflateaktive midler, inklusivt pluronics og polyetylenoksyd-kondensater av alkylfenoler, samt zwitterioniske overflateaktive midler, så som derivater av alifatiske kvatemære ammonium-, fosmonium- og sulfoniumforbindelser.

Chelaterende midler som er i stand til å binde metallioner, så som vinsyre, EDTA, sitronsyre, alkalimetallcitrater, pyrofosfatsalter eller anioniske polymere polykarboksylater kan om ønskes også inkluderes i emulsjonsformuleringen.

I alminnelighet vil emulsjonsformuleringene bli behandlet slik at kontaminering med bakterier, sopp, mykoplasma, virus og lignende, eller uønskede kjemiske reaksjoner, så som oksydasjonsreaksjoner, forhindres. I foretrukne utførelsesformer oppnås dette ved tilsetning av konserveringsmidler, for eksempel natrium-métabisulfitt eller andre kjemiske tilsetninger eller ved bestråling, for eksempel ved

ioniserende bestråling, som f.eks. kobolt-60 eller cesium-137-bestråling eller ved ultrafiolett bestråling.

I tillegg kan virkestoffer tilsettes til det vaskede oljelegemepreparat. For eksempel kan kosmetiske blandinger formuleres som stabile suspensjoner ved å benytte foreliggende emulsjonsformulering, og vitaminer og fuktemidler kan inkluderes i hudkremer. En særlig fordelaktige måte som et virkestoff kan inkluderes i

emulsjoner ifølge oppfinnelsen på, er gjennom konstruksjon av oleosin-genfusjoner som utførlig beskrevet i WO 96/21029.1 korthet beskriver WO 96/21029 en fremgangsmåte for fremstilling av proteiner og peptider som fusjonsproteiner av oleosiner. Disse fusjonsproteinene dannes ved genetisk å sammenkoble genet som koder for oleosin til et gen som koder for et peptid eller protein av interesse. Ekspresjon av fusjonsgenet, for eksempel i en oljefrøplante, resulterer i syntese av et fusjonsprotein som så rettes mot oljelegemet.

Isolering av oljelegemefraksjonen resulterer i gjenvinning av fusjonsproteinet. Prinsipielt kan et hvilket som helst ønsket protein eller peptid produseres ved å benytte denne teknologi. For eksempel kan man se for seg at polar fisks frosthindrende peptider (Davies, P.L., et al., 1990, FASEB J. 4:2460-2468) produseres som oleosinfusjonsproteiner. Det vaskede oljelegemepreparat kan deretter benyttes for å fremstille iskrem, milkshake eller andre frosne materialer av næringsmiddelkvalitet med forbedrede fryseegenskaper ved å inhibere eller forhindre iskrystalldannelse. I et annet eksempel kan et terapeutisk protein produseres som en oleosinfusjon. Oljelegemene kan deretter benyttes til å formulere en ønsket suspensjon som kan være for peroralt inntak eller for lokal påføring på huden. Denne utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er ytterligere eksemplifisert i Eksempel lii foreliggende beskrivelse, hvor det fremstilles et fiskefor (fish food) som omfatter oljelegemer omfattende en oleosin-carpe veksthormon-fusjon.

Det kan også formuleres en emulsjon med filmdannende egenskaper. En slik emulsjon danner et overtrekk når den påføres en overflate og tørkes. Et eksempel på en emulsjon hvor det påføres en oljelegemefilm, er i fiskefor, hvor oljelegemene kan påføres fiskeforet for å øke næringsverdien. En filmdannende emulsjon er særlig anvendelig i utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, hvor kontrollert frigjøring av et virkestoff ønskes, som f.eks. ved avlevering av farmasøytika eller flyktige forbindelser som velluktende dufter. Frigjøringstiden for virkestoffet fra en

emulsjonsfilm, som skjer under tørking, avhenger blant andre faktorer, av filmtykkelsen. Når det påføres et tykkere overtrekk, vil en lengre tørketid resultere i en langsommere frigjøring av virkestoffet. I tenkelig variantformuleringer skjer frigjøring av midlet bare når filmen er tørr. Andre faktorer, som f.eks. sammensetningen av emulsjonen og typen og konsentrasjonen av virkestoffet, bestemmer også frigjøringskarakteristikaene. For eksempel kan med-løsningsmidler som etanol, inkluderes i formuleringen og påvirke frigjøringstiden. Frigjøring av et virkestoffer også ønskelig ved anvendelse i næringsmiddelsammenheng, hvor et aromastoff innleiret i en emulsjon, frigjøres under konsumeringen. Frigjøringen av aromastoffet kan, avhengig av den eksakte formulering av emulsjonen, utløse en plutselig intens fornemmelse eller en lettere blanding av aromaer og essenser.

Emulsjonsformuleringen kan også benyttes i spray og aerosoler. For dette formål benyttes fortrinnsvis små oljelegemer, for eksempel med diameter på 1 um eller mindre, som f.eks. de som finnes i B. napus. Flyktige forbindelser som alkoholer og aromastoffer, kan inkluderes i slike spray. Emulsjoner av denne type kan også dusjes på overflater av tørkede næringsmiddelpreparater, så som potetchips og suppepulver. Emulsjonen kan innbefatte et aromastoff og ha konserverende betydning eller bidra til å opprettholde det riktige fuktighetsnivå i næringsmidlet.

ANVENDELSER AV EMULSJONSFORMULERINGEN

Oppfinnelsen er rettet mot fremstillingen av emulsjoner som er egnet i industri- og husholdningsblandinger. Det skal bemerkes at emulsjonene kan benyttes for blandinger som varierer betydelig med hensyn til fysikalske egenskaper og anvendelse. Bestemte utførelsesformer inkluderer således slike anvendelser som næringsmiddel- og forprodukter, farmasøytiske produkter, kroppspleieprodukter og industrielle produkter.

Næringsmiddel- og foranvendelser er bl.a. erstatninger for melkeprodukter, så som ost eller yoghurt, margariner, majoneser, vinaigretter, glasurer, iskrem, salatdressinger, syntetisk sennep, sukkertøy, tyggegummi, pudding, bakeprodukter, kryddere, saft-sløringsmidler, barnemat, aromabærere, teksturgivende midler (bakefett), kjæledyrfSr, fiskefor og husdyrfor. Produkter for kroppspleie innbefatter såper, kosmetika, hudkremer, ansiktskremer, tannpasta, leppestift, parfymer, makeup, «foundation», rouge, maskara, øyenskygge, solfaktorlotions, hårspray og hårfarvemidler. Farmasøytiske produkter som kan formuleres ved bruk av det vaskede oljelegemepreparat ifølge oppfinnelsen, er bl.a. terapeutiske midler, diagnostiske midler og avleveringsmidler. Som et terapeutisk eller diagnostisk middel vil emulsjonen dessuten inneholde et virkestoff. Virkestoffet kan være hva som helst som man ønsker å avgi til en vert. I en utførelsesform kan virkestoffet være et protein eller peptid som har terapeutisk eller diagnostisk betydning. Slike peptider innbefatter antigener (for vaksineformuleringer), antistoffer, cytokiner, blodkoaguleirngsfaktorer og veksthormoner. Industrielle anvendelser for emulsjonene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer malinger, overtrekk, smøremidler, filmer, gel, boreoljer, papirlim, lateks, bygnings- og veikonstruksjonsmaterialer, blekk, farvestoffer, voks, poleringsmidler og landbrukskjemikalieformuleringer. I henhold til en foretrukket utførelsesform er oppfinnelsen rettet mot blandinger som kan inntas av dyr og mennesker. Siden blandingene skal kunne tas inn må de være av næringsmiddelkvalitet. Det spesielle produkt og den bestemte form som emulsjonen benyttes i er imidlertid ikke av avgjørende betydning. Det skal her betones at emulsjonen formulert med det vaskede oljelegemepreparat kan anvendes i et hvilket som helst husholdnings- eller industriprodukt.

Stabiliteten av foreliggende emulsjonsformulering ved lav pH kan undersøkes i formuleringer av sure emulsjoner. For eksempel kan emulsjonsformuleringen benyttes ved fremstilling av majoneslignende næringsmidler, som foruten det vaskede oljelegemepreparat, eventuelt omfatter en vegetabilsk olje, sennep, eddik og eggeplomme. Hellbare emulsjoner, som f.eks. salatdressinger, kan tilberedes ved å øke den relative mengde eddik og/eller ved tilsetning av vann.

Et eksempel på en anvendelse hvor det kan tilføres varme uten tilsynelatende ugunstige virkninger, er ved fremstillingen av en savory sauce, som f.eks. hvit grunnsaus (bechamel sauce) eller i søte sauser, som f.eks. sjokoladesauser. For disse anvendelsene benyttes det vaskede oljelegemepreparat som stekefetterstatning. For å fremstille en bechamelsaus tilsettes til 1 del av det oppvarmede vaskede oljelegemepreparat, 1 vektdel mel som omrøres til det dannes en tykk suspensjon. Ved moderat varme tilsettes gradvis melk inntil det oppnås en saus med ønsket viskositet.

Emulsjonsformuleringen i kan også benyttes som en erstatning for smør. I så fall tilsettes små mengder vann til det vaskede oljelegemepreparat, for eksempel mindre enn 10%, inntil ønsket viskositet oppnås. Naturlige smøraromaer og fortykningsmidler kan eventuelt tilsettes. Smørerstatningen kan benyttes på mais, brød, i kakeblandinger eller ved brødbaking. Salt som bidrar til smak og virker som et konserveringsmiddel, kan tilsettes, typisk til ca. 2,5% (vekt/vol). FarvestofFer, for eksempel ekstrakter av orelanfrø eller karoten kan tilsettes for eventuelt å gjøre farven mørkere. En fordel ved denne anvendelse er at det oljelegemebaserte smør ikke inneholder hydrogenerte fettsyrer, som benyttes i formuleringer for margariner og lignende for å oppnå en ønsket konsistens, men som også er assosiert med kardiovaskulære sykdommer.

Bakefett kan fremstilles til forskjellige stivhetsgrader, fra et skum til et hellbart fett. Ved slik anvendelse piskes luft inn i emulsjonsformuleringen, og emulsjonsformuleringen kan betraktes som dispergert i den kontinuerlige fase, luft. Slike fett kan benyttes til blandinger hvor kreming og hevelse ønskes. Disse blandingene innbefatter glasurer, syntetiske kremer, iskrem og kakedeig.

En fruktsafterstatning kan fremstilles fra kunstige eller naturlige aromastoffer og næringsmidler. Slike safterstatninger har ikke det riktige utseende og synes som følge av gjennomsiktigheten å være svake eller fortynnede. Ved å tilsette en liten mengde, for eksempel 0,1 til 1 vol% av det vaskede oljelegemepreparat eller en emulsjon derav, kan det inntre sløring som gir saften et fyldigere utseende. Foreliggende oljelegemepreparat kan således benyttes som et sløringsmiddel.

For en annen anvendelse hvor det inngår safter, kan det vaskede oljelegemepreparat eller en emulsjon derav, tilsettes til safter med sedimenterbare faststoffer, som f.eks. tomatjuice. Tilsetning av en liten mengde av det vaskede oljelegemepreparat, for eksempel 0,1 til 1 vol%, kan minske sedimenteringshastigheten av faststoffene i saften og bidra til å opprettholde det fyldige utseende.

Lokale anvendelser av det vaskede oljelegemepreparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være aktuelle. I denne utførelsesform formuleres emulsjonen som en dermatologisk akseptabel emulsjon, som for eksempel kan benyttes for å bløtgjøre ansikts- og/eller kroppshud, inklusivt negler-og lepper, eller ha egenskaper som motvirker aldring av huden, akne, pigmentering, hårtap eller bidrar til fjerning av hår eller letter sårtilheling og/eller restmkturering av hudvevet. Det vaskede oljelegemepreparat utgjør fortrinnsvis 1-99 vekt% av den endelige blanding.

De kosmetiske blandingene kan omfatte ytterligere hydrokarbonforbindelser, så som plante-, dyre-, mineral- eller syntetiske oljer eller voks eller blandinger derav. De omfatter parafin, vaselin, perhydroskvalen, «arara» olje, mandelolje, «calphyllum» olje, avokadoolje, sesamolje, ricinusolje, «jojoba» olje, olivenolje eller hvetekimolje. Det kan også inngå estere, som f.eks. lanolinsyre, oljesyre, laurinsyre, stearinsyre, myristinsyre. Det er også mulig å inkludere alkoholer, som for eksempel oleoylalkohol, linoleylalkohol eller linolenylalkohol, isostearylalkohol eller oktyldodecanol, alkohol eller polyalkohol. Ytterligere hydrokarboner som kan inkluderes er oktanoater, dekanoater, ricinoleater, kapryl/kaprin-triglycerider som Cio til C22 fettsyretriglycerider. Tilsetning av disse midlene kan resultere i dannelse av dobbeltemulsjoner.

Hydrogenerte oljer, som er faste ved 25°C, så som hydrogenert ricinusolje, palmeolje eller kokosolje, eller hydrogenert talg; mono-, di-, tri- eller sukroglycerider; lanoliner og fettsyrer som er faste ved 25°C, kan også inngå i de kosmetiske formuleringene. Vokstyper som kan inngå er animalsk voks, så som bivoks; plantevoks som karnaubaboks, «candelilla» voks, «ouricurry» voks, japanvoks eller voks fra korkfibre eller sukkerrør; mineralvoks, for eksempel parafinvoks, lignittvoks, mikrokrystallinske voks eller ozokeriter og syntetiske voks.

Pigmenter kan inkluderes og kan være hvite eller farvede, uorganiske eller organiske og/eller «paerlescent». Disse pigmentene omfatter titandioksyd, sinkoksyd, zirkonium-dioksyd, sorte, gule, røde og brune jernoksyder, ceriumdioksyd, kromoksyd, jemblått, kjønrøk, barium-, strontium-, kalsium- og aluminiumlakk og glimmer dekket med titanoksyd eller med vismutoksyd.

Virkestoffer som vanligvis benyttes i hudkremer, så som vitaminer, for eksempel vitamin A eller C og alfa-hydroksysyrer, som sitronsyre, glykolsyre, melkesyre og vinsyre, kan inkluderes i kosmetiske og/eller dermatologiske blandinger. For eksempel fremgår det av US-patent 5.602.183 at vitamin C eller askorbinsyre, fremmer veksten av bindevev, særlig i hud, ved å styrke huden mot eksterne aggresjoner, som f.eks. fra røk og UV-bestråling. Mykgjøringsmidler som kan inngå i hudkremer og kosmetika er for eksempel mineralolje og urea. Antioksydanter som f.eks. de naturlig forekommende tokoferoler og polyfenoler eller butylert hydroksytoluen og hydroksyanisol, kan også tilsettes. Solfiltere så som oktylmetoksycinnamat (Parsol MCX), 3-benzofenon (Uvinul M40) og butylmetoksy-dibenzoylmetan (Parsol 1789) kan benyttes for å fremstille en solbadlotion. Farmasøytiske virkestoffer som kan benyttes for å formulere kosmetiske blandinger innbefatter for eksempel antibiotika, fungicider og antiinflammatoriske midler.

Det endelige kosmetiske produkt kan være i form av et fritt, hellbart eller sammenpresset pulver («foundation», rouge eller øyenskygge), et relativt fettaktig produkt som leppestift, maskara eller en olje eller lotion for kroppen eller ansiktet.

Det vaskede oljelegemepreparat kan også benyttes for å tjene som en oralt aksepterbar bærer i tannpasta som ytterligere kan omfatte silika, overflateaktive midler, chelateringsmidler, et fluorid, fortykningsmidler, søtningsmidler, aromastoffer, for eksempel som peppermynteolje, enzymer og biocider.

Et eksempel på et industrielt produkt som kan formuleres som maling, hvor hovedharpiksen, som f.eks. de som er basert på silikontype forbindelser, akryl forbindelser, polyester, alkyd, fluor, epoksy, polyuretan, kan være delvis eller helt erstattet med det vaskede oljelegemepreparat ifølge foreliggende oppfinnelse. Ytterligere tilsetningsstoffer som pigmenter, farvestoffer, glassflak og aluminiumflak, pigmentdispergeringsstoffer, fortykningsmidler, utjevningsmidler, herdekatalysatorer, herdemidler, så som diisocyanater, herdekatalysatorer, geleringsinhibitorer, ultrafiolett absorberende midler, midler mot frie radikaler, etc, kan etter behov formuleres i malingsblandinger.

Det vaskede oljelegemepreparat kan også benyttes til å formulere smøremidler. For eksempel kan det vaskede oljelegemepreparat benyttes til delvis eller fullstendig å erstatte smøreoljer som animalske oljer, vegetabilske oljer, petroleum-smøreoljer, syntetiske smøreoljer eller smørefett, så som litium-basert fett, ureafett og kalsiumfett. Andre komponenter som benyttes i en smøremiddelformulering er antioksydanter, detergent-dispergeringsmidler, smøringsforbedrende midler, friksjonsdempere, viskositetsindeks-forbedrende midler, stivnepunkts-nedsettende midler, faste smøremidler, rusthindrende midler og antiskum.

Vokstyper kan også fremstilles ved å benytte det vaskede oljelegemepreparat ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse omfatter rensevokstyper, som f.eks. de som gir en stabil hydrofob filmfinish på biler, samt andre beskyttende belegg. Andre blandinger som benyttes ved fremstillingen av voks, er overflateaktive midler, mineraloljer, så som blandede parafiniske og aromatiske/nafteniske oljer, parfymer, biocider og farvestoffer som eventuelt kan tilsettes i forlikelige mengder.

Når industrielle produkter som malinger eller smøremidler formuleres, kan renheten av oljelegemefasen eventuelt være mindre avgjørende, og det behøver ikke være nødvendig å vaske oljelegemene. En industriell emulsjon kan fremstilles ved (i) oppnå oljelegemer fra en celle og (ii) formulere oljelegemene til en industriell emulsjon. Oljelegemene kan oppnås ved (a) oppmaling av plantefrø; (b) fjerning av hårdt materiale fra de oppmalte frø og (c) separering av oljelegemefasen fra den vandige fase.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Oppnåelse av et vasket oljelegemepreparat fra raps, soyabønne, solsikke, hvit sennep, jordnøtt, squash, lin, safflor og mais - laboratorieskala.

Tørre modne frø av Brassica napus cv Westar, soyabønne, solsikke, hvit sennep, jordnøtt, squash, lin, safflor og mais ble homogenisert i 5 volumer kald oppmalingsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0.4M sukrose og 0,5M NaCl) ved å benytte en polytron-homogenisator med høyt turtall. Homogenatet ble sentrifugert ved 10 x g i 30 minutter for å fjerne partikkelmateriale og for å separere oljelegemene fra den vandige fase som inneholdt størstedelen av det løselige frøprotein. Oljelegemefraksjonen ble skummet av fra supematantoverflaten med en metallspatel og tilsatt til 1 volum oppmalingsbuffer. For å oppnå effektiv vasking i etterfølgende trinn, ble det funnet nødvendig å redispergere oljelegemene grundig i oppmalingsbufferen. Dette ble gjort ved forsiktig å homogenisere oljelegemene i oppmalingsbuffer under bruk av en polytron-homogenisator med lavt turtall. Ved bruk av en sprøyte ble de redispergerte oljelegemene forsiktig anbragt som et lag under 5 volumer kald 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, og sentrifugert som ovenfor. Etter sentrifugering ble oljelegemene fjernet og vaskeprosessen gjentatt to ganger. Det endelige vaskede oljelegemepreparat ble resuspendert i 1 volum kald Tris-HCl, pH 7,5, redispergert med polytron-mikseren.

Oljelegemeprøvene ble løst i SDS-prøvebuffer og deretter analysert ved SDS-gelelektroforese. Resultatene er vist i Figur 1. Det således oppnådde materialet var dermed klårt til anvendelse i diverse formuleringer.

Eksempel 2

Oppnåelse av et vasket oljelegemepreparat fra raps, solsikke og mais i stor skala.

Dette eksempel beskriver gjenvinningen av oljelegemefraksjonen fra canola-, solsikke-og maisfrø i stor skala. Det resulterende preparat inneholder intakte oljelegemer og er med hensyn til renhet sammenlignbart med et preparat oppnådd ved å benytte prosesser i laboratorieskala.

Oppmaling av frø. Totalt 10-15 kg tørre canolafrø ( Brassica napus cv, Westar), solsikke ( Helianthus annuus) eller mais ( Zea mays) ble helt gjennom trakten på en

kolloidmølle (Colloid Mill, MZ-130 (Fryma); kapasitet: 500 kg/time) som var forsynt med et MZ-120 tverrtannet rotor/stator-oppmalingssett og en trakt for påfylling ovenfra. Ca. 50-75 L vann ble tilført gjennom en utvendig tilsluttet slange før oppmaling. Oppmalingen ble foretatt med en spalteinnstilling på IR, valgt for å oppnå en partikkelstørrelse på mindre enn 100 mikron, ved 18°C og 30°C. Etter oppmaling av frøene, ble det tilsatt springvann til frøoppslemmingen til et endelig volum på 90 L.

Fjerning av faststoffer. Den resulterende oppslemmingen ble pumpet inn i en dekanteringssentrifuge (Hasco 200 2-fase dekanteringssentrifuge med maksimal arbeidshastighet 6000 rpm) etter at sentrifugen var bragt opp på en arbeidshastighet på 3500 rpm. Overføring fra møllen til dekanteringssentrifugen skjedde ved bruk av en 1" M2 Wilden trykkluftdrevet dobbelt membranpumpe under en strømningshastighet på 360 L/time. I løpet av 15-20 minutter ble det avdekantert ca. 15 kg frø.

Oljelegeme-separasjon. Separasjon av oljelegemefraksjonen ble oppnådd ved å benytte en Sharples Tubular Bowl Centrifuge Model AS-16 (Alfa Laval) forsynt med en tre-fase separeringsbeholder og uttagbare ringdemningsrekker; kapasitet: 150 L/time; ringdemning: 30 mm. Arbeidshastigheten var 15.000 rpm. (13.200 x g). En Watson-Marlow (Model 704) peristaltisk pumpe ble benyttet for å pumpe den avdekanterte væskefase (DL) over i «tubular bowl» sentrifugen etter at sentrifugen var bragt opp til arbeidshastighet. Dette resulterte i separasjon av den avdekanterte væskefase inn i en tung fase (HP) omfattende vann og løselige frøproteiner og en lett fase (LP) omfattende oljelegemer. Den oljelegemefraksjon som ble oppnådd etter denne første sentrifugering omtales her som et uvasket oljelegemepreparat. Oljelegemerfaksjonen ble deretter sendt gjennom sentrifugen treganger til. Mellom hver passasje gjennom sentrifugen, ble konsentrerte oljelegemer blandet med ca. 5 volumer nytt vann. Hele prosessen ble foretatt ved romtemperatur. Preparatene oppnådd etter den andre separeringen er alle omtalt som det vaskede oljelegemepreparat. Etter tre vaskinger ble meget av det kontaminerende løselige protein fjernet, og de oppnådde oljelegemeproteinprofiler etter SDS-gelelektroforese, var av lignende utseende som de oppnådd ved bruk av prosesser i laboratorieskala.

Eksempel 3

Fjerning av frøproteiner ved vasking av oljelegemefasen

Dette eksempel beskriver gjenvinningen av en vasket oljelegemefraksjon fra canola, mais og solsikkefrø. Ved å benytte forskjellige vaskebetingelser vises det at vaskingene resulterer i fjerning av betydelige mengder frøproteiner fra oljelegemepreparatet. Disse proteinene inkluderer proteiner som kan være allergene.

Totalt 10-15 kg tørre canolafrø ( Brassica napus cv, Westar), mais ( Zea mays) eller solsikke ( Helianthus annuus) ble helt gjennom trakten på en kolloidmølle (Colloid Mill, MZ-130 (Fryma)), som var forsynt med et MZ-120 tverrtannet rotor/stator-oppmalingssett og en trakt for påfylling ovenfra. Ca. 50-75 L vann ble tilført gjennom en utvendig tilsluttet slange før oppmaling. Oppmalingen ble foretatt med en spalteinnstilling på IR, valgt for å oppnå en partikkelstørrelse på mindre enn 100 mikron, ved 18<*>0 og 30°C. Etter oppmaling av frøene, ble det tilsatt springvann til frøoppslemmingen til et endelig volum på 60-90 L, og en prøve av frøoppslemmingen ble uttatt for SDS-gelelektroforese. Oppslemmingen ble deretter pumpet inn i en dekanteringssentrifuge (Hasco 200 2-fase dekanteringssentrifuge med maksimal arbeidshastighet 6000 rpm) etter at sentrifugen var bragt opp på en arbeidshastighet på 3500 rpm. Overføring fra møllen til dekanteringssentrifugen skjedde ved bruk av en 1" M2 Wilden trykkluftdrevet dobbelt membranpumpe. I løpet av 15-20 minutter ble det avdekantert ca. 15 kg frø.

En prøve av den avdekanterte væskefase ble uttatt for SDS-gelelektroforese. Separasjon av oljelegemefraksjonen ble oppnådd ved å benytte en Sharples Tubular Bowl Centrifuge Model AS-16 (Alfa Laval) forsynt med en tre-fase separeringsbeholder og uttagbare ringdemningsrekker; kapasitet: 150 L/time; ringdemning: 29 mm. Arbeidshastigheten var 15.000 rpm. (13.200 x g). En Watson-Marlowe (Model 704) peristaltisk pumpe ble benyttet for å pumpe den avdekanterte væskefase over i «tubular bowl» sentrifugen etter at sentrifugen var bragt opp til arbeidshastighet. Den uvaskede oljelegemefasen som ble oppnådd, ble blandet med ca. 5 volumer vann. Denne prosess ble gjentatt i alt tre ganger til. Den oljelegemefase som ble oppnådd etter denne første sentrifugering omtales her som et uvasket oljelegemepreparat. Alle andre preparater er vaskede oljelegemepreparater. Prøver for analyse ved SDS-gelelektroforese, ble uttatt etter den første og den fjerde separasjon.

Etter at den fjerde vask var fullført, ble en 0,9 mL prøve av oljelegemepreparatet homogenisert i 0,1 mL IM Na2C03 og satt tilside ved romtemperatur i 30 minutter under agitasjon. Den vaskede oljelegemefraksjon ble gjenvunnet etter sentrifugering, vasket én gang med vann og preparert for SDS-gelelektroforese.

Alle prøvene ble løst i SDS-prøvebuffer, og prøvene ble analysert ved SDS-gelelektroforese. Resultatene er vist i Figur 2.

Eksempel 4

Effekten av vasking av oljelegemefasen på vannretensjons-karakteristika

Et vasket oljelegemepreparat og en uvasket oljelegemefase ble fremstillet fra rapsfrø som i Eksempel 2. For å bestemme forskjellen i vannretensjonskapasitet mellom den uvaskede oljelegemefasen og det vaskede oljelegemepreparat, ble 30 mL oljelegemepreparat grundig blandet ved omvirvling (vortex). Preparatene ble deretter inkubert i 2 timer i et vannbad ved 40,60 eller 80°C, hvorpå prøvene ble sentrifugert ved 1500 x g i 20 minutter (ufortynnede prøver). Et annet prøvesett ble fremstillet ved å blande 15 g vasket eller uvasket oljelegemepreparat med 15 mL vann. Prøvene ble vortex-blandet og deretter inkubert ved 40, 60 eller 80°C i 2 timer, hvorpå vanninnholdet i prøvene ble bestemt etter sentrifugering ved 1500 x g i 20 minutter (fortynnede prøver). Massetapet som kunne tilskrives fordampningen, ble målt ved 80°C og 60°C.

Ved 80°C mistet de ufortynnede preparatene som inneholdt oljelegemene, betydelige mengder vann gjennom fordampning. Preparatet av uvaskede oljelegemer tapte 26% av deres masse, mens det vaskede preparat tapte 16%. Etter sentrifugering frigjorde det uvaskede preparat ca. 2,5 mL vandig fase, mens de vaskede oljelegemene forble i samme fase. Begge fortynnede preparater absorberte vann. Volumet av oljelegemene øket i begge tilfeller til 18,5 ± 1 mL.

Ved 60°C tapte de ufortynnede preparatene ca. 10% vann gjennom fordampning. Etter sentrifugering frigjorde det vaskede preparat ca. 0,5 mL vandig fase, mens det vaskede oljelegemepreparat forble i samme fase. Begge fortynnede preparater absorberte vann. Ved 60°C øket volumet av oljelegemene i begge tilfellene ti 118 + 1 mL.

Ved 40°C frigjorde de ufortynnede prøvene begge ca. 2 mL vandig fase. Når de fortynnede prøvene ble sammenlignet, absorberte det uvaskede preparat ca. 3 mL vann slik som ved 60 eller 80°C. Det vaskede preparat absorberte imidlertid 8 mL vann ved 40°C.

Disse forsøkene viser at vannet i et vasket oljelegemepreparat oppvarmet til 60°C eller 80°C, forblir sterkere assosiert med oljelegemepreparatet enn i et uvasket preparat. Ved nedkjøling syntes det vaskede oljelegemepreparat å være mer stabilt enn den uvaskede emulsjon. Ved oppvarming til 40°C var det vaskede oljelegemepreparat i stand til å absorbere et større volum eksogent tilsatt vann uten at det resulterte i faseseparasjon.

Eksempel 5

Effekten av vasking av oljelegemer på oljeabsorpsjonskarakteristika

Et vasket oljelegemepreparat og en uvasket oljelegemefase ble fremstillet fra rapsfrø som i Eksempel 2. For å bestemme forskjellen i oljeabsorpsjonskapasitet mellom den uvaskede oljelegemefase og det vaskede oljelegemepreparat, ble 2 g av oljelegemepreparatet dispergert i 12 mL raffinert, bleket, deodorisert canolaolje i et 50 mL rør. Innholdet ble omrørt i 30 sekunder hvert 5. minutt i løpet av 30 minutter. Rørene ble deretter sentrifugert ved 4400 rpm. i 25 minutter. Den frie oljen ble avdekantert, og prosentandelen absorbert olje ble bestemt ved vektdifferanse. Tre preparater av vaskede oljelegemer ble testet, og tre preparater av uvaskede oljelegemer ble testet.

Oljeabsorpsjonskapasiteten av uvaskede oljelegemer ble funnet å variere signifikant mellom de tre satsene og varierte fra 18,7% til 28%. Vaskede oljelegemer hadde en reproduserbar oljeabsorpsjon på 32 ± 1%. Det vaskede oljelegemepreparat ble dermed funnet å være bedre siden (1) en større mengde olje ble funnet å bli absorbert og (2) absorpsjonen foregikk på en mer reproduserbar måte.

Eksempel 6

Fremstilling av en majones-lignende emulsjon som omfatter et vasket oljelegemepreparat

Et vasket oljelegemepreparat ble fremstillet fra rapsfrø som i Eksempel 2, og en majones-lignende emulsjon ble dannet ved å blande følgende komponenter med en elektrisk kjøkkenmikser.

Det ble oppnådd et produkt med en majones-lignende tekstur. Det majones-lignende produkt var stabilt i minst 1 dag ved 4°C.

Eksempel 7

Fremstilling av en kolesterol-fri majones-lignende emulsjon

Et vasket oljelegemepreparat ble fremstillet fra rapsfrø som i Eksempel 2, og en majones-lignende emulsjon ble dannet ved å blande følgende komponenter:

Det ble oppnådd et produkt med majones-lignende tekstur. Siden majonesen er fremstillet uten eggeplomme, en ingrediens som vanligvis benyttes i kommersielt tilgjengelige majoneser, er produktet fremstillet ved å benytte vaskede oljelegemer, fritt for kolesterol. Majonesen ble funnet å være like stabil som en kommersiell majones når stabiliteten ble bestemt ved bruk av sentrifugering.

Eksempel 8

Fremstilling av en vinaigrette-lignende emulsjon omfattende et vasket oljelegemepreparat

Et vasket oljelegemepreparat ble fremstillet fra rapsfrø som i Eksempel 2, og en vinaigrette-lignende emulsjon ble fremstillet ved manuell blanding av følgende komponenter:

Det ble oppnådd et produkt med en vinaigrette-lignende tekstur. Det vinaigrette-lignende produkt var stabilt i minst flere dager ved 4°C.

Eksempel 9

Fremstilling av et smørbart senneps-lignende produkt

Et vasket oljelegemepreparat ble oppnådd fra rapsfrø som angitt i Eksempel 2. Følgende ingredienser ble blandet for å oppnå et senneps-lignende produkt:

Den resulterende emulsjonsformulering er et senneps-lignende produkt som lett kan smøres ut, og som har en mer kremaktig, mindre sandet smakskarakteristikk enn sennep.

Eksempel 10

Fremstilling av en bechamel-lignende saus

Et vasket oljelegemepreparat ble oppnådd fra rapsfrø som angitt i Eksempel 2. Det vaskede oljelegemepreparat ble oppvarmet under moderat oppvarming, og en tilsvarende del mel ble tilsatt og blandet med det oppvarmede, vaskede oljelegemepreparat. Under manuell omrøring ble det gradvis tilsatt melk til denne blandingen.

Det ble oppnådd en bechamel-Iignende saus. Konsistensen av sausen kan tilpasses ved hjelp av den tilsatte melkemengde. Ytterligere aromastoffer kan også tilsettes etter behov. Fraværet av hydrogenerte fettsyrer gir dette produkt en fordel fremfor en saus fremstillet fra vanlig husholdningsmargarin.

Eksempel 11

Fremstilling av en farmasøytisk emulsjon for belegging av fiskefor

Et vasket oljelegemepreparat fra en transgen B. napus plante som uttrykker carpe-veksthormon (cGH) fusjonert til oleosin, hvor fusjonsproteinet ble rettet mot oljelegemene, ble oppnådd som følger. Et DNA-fragment inneholdende den cGH-kodende region som manglet dens 22 aminosyrers signalsekvens, ble amplifisert fra et plasmid som i et innskudd inneholdt vanlig carpe ( Cyprinus carpio) veksthormon cDNA (Koren et al., 1989, Gene, 67:309-315) ved å benytte polymerasekjedereaksjonen i kombinasjon med to cGH-spesifikke primere. Det amplifiserte cGH-fragment ble fusjonert i riktig leseramme og 3' for Arabidopsis thaliana oleosinet ved å benytte pOThromb (vån Rooijen, 1993, PhD Thesis, University of Calgary) som parentalt plasmid og ved å benytte kjente kloningsstrategier. I pOThromb ble et trombin-spaltningssetetinnsatt 3' forden oleosin-kodende sekvens. Oleosin-cGH-fusjonsgenet ble innført i den binære vektoren pCGN1559 (McBride & Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol. 14:269-276), og den resulterende konstruksjon ble benyttet til å transformere A. tumefaciens. Agrobakteirum-stammen ble benyttet for å transformere B. napus cv Westar-frøplanter. Frø fra transgene planter ble oppnådd, og oljelegemer ble isolert fra transgene frø som skissert i Eksempel 1.

Oljelegemene ble deretter tatt opp i en sprøyte og sprøytet over på fiskefor, ved å benytte ca. 2,5 ug oljelegemeprotein per 1 mg fiskefor. Fiskeforet dekket med oljelegemene ble deretter satt tilside for tørking over natten. I alt 50 mg fiskefor ble deretter blandet med 10 mL vann og inkubert i 0, 30,45 eller 60 minutter. Foret ble deretter samlet opp og resuspendert i 0,2 mL 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) og preparert for analyse ved SDS-gelelektroforese etter koking i 2,5% SDS. Forekomsten av oljelegemene på fiskeforet ble fastslått ved å benytte western-blotting og monoklonale antistoffer mot cGH.

På bakgrunn av intensiteten av signalet og av det enkeltband som ble observert i hver bane på western-blottet, forble oljelegemene som omfattet cGH, nært assosiert med fiskeforet etter inkubering av oljelegemene i vann. Fiskefor som var inkubert i 30,45 eller 60 minutter i vann, viste seg å inneholde omtrent den samme mengde cGH som kontroll fiskefor som ikke var inkubert i vann.

Dette eksempel viser at det kan fremstilles en transgen plantevarietet som gir en emulsjon spesifikt ønskede egenskaper. Eksemplet viser videre at det kan fremstilles en emulsjon fra et vasket oljelegemepreparat som kan benyttes som et overtrekk eller film. Endelig viser dette eksempel at det vaskede oljelegemepreparat kan benyttes til å formulere en farmasøytisk blanding.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en emulsjonsformulering, karakterisert ved a t den omfatter:

1) oppnåelse av oljelegemer fra en celle;

2) vasking av oljelegemene for å oppnå et vasket oljelegemepreparat som omfatter intakte oljelegemer av tilnærmet ensartet størrelse, form og tetthet; og

3) formulering av det vaskede oljelegemepreparat til en emulsjon.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte celle er en plantecelle.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte plantecelle oppnås fra sporer, pollen, frø eller vegetative planteorganer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at oljelegemene oppnås fra plantefrø.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en emulsjonsformulering ifølge krav 4, karakterisert ved at den omfatter: (1) oppnåelse av oljelegemer fra plantefrø ved hjelp av en fremgangsmåte som omfatter: (a) oppmaling av plantefrø; (b) fjerning av faststoff fra de oppmalte frø; og (c) separering av oljelegemefasen fra den vandige fase; (2) vasking av oljelegemefasen for å oppnå et vasket oljelegemepreparat omfattende intakte oljelegemer av tilnærmet jevn størrelse, form og tetthet; og (3) formulering av det vaskede oljelegemepreparat til en emulsjon.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at en flytende fase tilsettes før eller etter oppmalingstrinnet.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at nevnte formulering omfatter blanding av de vaskede oljelegemer inntil det dannes en emulsjon.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at den flytende fase tilsettes de vaskede oljelegemer og den flytende fase og vaskede oljelegemer blandes inntil det dannes en emulsjon.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 8, karakterisert ved at den flytende fase er vann.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at den flytende fase forekommer i en emulsjon i en mengde varierende fra ca. 1% til ca. 99% volumdeler.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte plante er en oljefrøplante.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte plante er . valgt fra gruppen bestående av rapsfrø ( Brassica spp.), soya ( Glycine max.), solsikke ( Helianthus annuus), oljepalme ( Elaeis guineeis), bomullsfrø ( Gossypium spp.), jordnøtt ( Arachis hypogaea), kokos ( Cocus nucifera), ricinus ( Ricinus communis), safflor ( Carthamus tinctorius), sennep ( Brassica spp. og Sinapis alba), koriander ( Coriandrum sativum), squash ( Cucurbita maxima), linfrø/lin ( Linum usitatissimum), paranøtt ( Bertholletia excelsa), jojoba ( Simmondsia chinensis) og mais ( Zea mays).

13. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte faststoff fjernes ved sentrifugering eller filtrering av det oppmalte frø.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte oljelegeme-fase separeres fra den vandige fase ved en tyngdekraft-basert metode eller en størrelses-eksklusjonsbasert metode.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det vaskede oljelegemepreparat er tilnærmet fritt for frøproteiner som ikke skriver seg fra oljelegemer, og tilnærmet fritt for forbindelser uten næringsverdi, stivelse, glukosinilater eller nedbrytningsprodukter derav og fibrer.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at nevnte frøproteiner er glykosylerte.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16, karakterisert ved at nevnte formulering omfatter tilsetning av et konserveringsmiddel.

18. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16, karakterisert ved at nevnte emulsjon er et næringsmiddel- eller forprodukt, et kroppspleieprodukt, et farmasøytisk produkt eller et industrielt produkt.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at frøene nedsenkes i en flytende fase før oppmaling i ca. 15 minutter til ca. 2 dager.

20. Emulsjon, karakterisert ved at den omfatter et vasket oljelegeme-preparat omfattende intakte oljelegemer av tilnærmet ensartet størrelse, form og tetthet.

21. Emulsjon ifølge krav 20, karakterisert ved at den omfatter en flytende fase.

22. Emulsjon ifølge krav 21, karakterisert ved at den flytende fase er vann.

23. Emulsjon ifølge krav 20, karakterisert ved at den ytterligere omfatter et konserveringsmi ddel.

24. Emulsjon ifølge krav 20, karakterisert ved at oljelegemene er oppnådd fra en plante.

25. Emulsjon ifølge krav 24, karakterisert ved at oljelegemene er oppnådd fra en plante valgt fra gruppen bestående av rapsfrø ( Brassica spp.), soya ( Glycine max.), solsikke ( Helianthus annuus), oljepalme ( Elaeis guineeis), bomullsfrø ( Gossypium spp.), jordnøtt ( Arachis hypogaea), kokos ( Cocus nucifera), ricinus ( Ricinus communis), safflor ( Carthamus tinctorius), sennep ( Brassica spp. og Sinapis alba), koriander ( Coriandrum sativum), squash ( Cucurbita maximd), linfrø/lin ( Linum usitatissimum), paranøtt ( Bertholletia excelsd), jojoba ( Simmondsia chinensis) og mais ( Zea mays).

26. Emulsjon ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 25, karakterisert ved at nevnte emulsjon er et næringsmiddelprodukt, et forprodukt, et kroppspleieprodukt, et farmasøytisk produkt eller et industrielt produkt.

27. Emulsjon ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte næringsmiddel-eller forprodukt er valgt fra gruppen bestående av meierisurrogater, surrogat-ost eller surrogat-yoghurt, margarin, majones, vinaigrette, glasur, iskrem, salatdressing, syntetisk sennep, sukkertøy, tyggegummi, pudding, bakeprodukter, kryddere, saft, barnemat, aromabærere, teksturgivende midler, kjæledyrfor og husdyrfor.

28. Emulsjon ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte næringsmiddel- eller forprodukt er en majones, en kolesterol-fri majones, en bechamel-saus, en vinaigrette, en sennep eller et fiskefor.

29. Emulsjon ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte kroppspleie-produkt er valgt fra gruppen bestående av såpe, kosmetisk produkt, hudkrem, ansiktskrem, tannpasta, leppestift, parfyme, makeup, «foundation», rouge, maskara, øyenskygge, solfilterlotion og et hårpleieprodukt.

30. Emulsjon ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte farmasøytiske produkt er valgt fra gruppen bestående av et terapeutisk middel, et diagnostisk middel og et avleveringsmiddel.

31. Emulsjon ifølge krav 30, karakterisert ved at nevnte terapeutiske middel innbefatter et veksthormon.

32. Emulsjon ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte industrielle produkt er valgt fra gruppen bestående av maling, belegg, smøremiddel, film, gel, boreolje, papirlim, lateks, bygnings- og veikonstruksjonsmateriale, blekk, farvestoff, voks, poleringsmiddel og landbrukskjemikalieformuleringer.

33. Anvendelse av en emulsjon fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 19 for å fremstille et kroppspleieprodukt, et næringsmiddel- eller forprodukt, et industrielt produkt eller et farmasøytisk produkt.

34. Anvendelse av en emulsjon ifølge krav 33, hvor nevnte næringsmiddel- eller forprodukt omfatter meierisurrogater, ostesurrogat, yoghurtsurrogat, margarin, majones, vinaigrette, glasur, iskrem, salatdressing, syntetisk sennep, sukkertøy, tyggegummi, pudding, bakeprodukt, krydder, juice, barnemat, aromabærer, teksturgivende middel, kjæledyrfor og husdyrfor.

35. Anvendelse av en emulsjon ifølge krav 33, hvor nevnte næringsmiddel- eller forprodukt er en majones, en kolesterol-fri majones, en bechamel-saus, en vinaigrette, en sennep eller et fiskefor.

36. Anvendelse av en emulsjon ifølge krav 33, hvor kroppspleieproduktet omfatter såpe, kosmetisk produkt, hudkrem, ansiktskrem, tannpasta, leppestift, parfyme, make-up, «foundation», rouge, maskara, øyenskygge, solfilterlotion, hårpleieprodukt.

37. Anvendelse av en emulsjon ifølge krav 33, hvor nevnte industrielle produkt omfatter maling, belegg, smøremiddel, film, gel, boreolje, papirlim, lateks, bygnings- og veikonstruksjonsmateriale, blekk, farvestoff, voks, poleringsmiddel og landbruks-kjemikalie-formuleringer.

38. Anvendelse av en emulsjon ifølge krav 33, hvor nevnte farmasøytiske produkt er et terapeutisk middel, et diagnostisk middel eller et avleveringsmiddel.

39. Anvendelse av en emulsjon ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 19, som et belegg, en film eller en aerosol.

40. Fiskeforpreparat, karakterisert ved at det er belagt med en emulsjon ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 25.

41. Fiskeforpreparat ifølge krav 40, hvor nevnte emulsjon i tillegg inneholder et terapeutisk peptid.

42. Fiskeforpreparat ifølge krav 41, hvor nevnte terapeutiske peptid er et hormon.